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特表2024-511472ポリヒドロキシアルカノエート産生細菌、並びにその製造方法及び使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-13
(54)【発明の名称】ポリヒドロキシアルカノエート産生細菌、並びにその製造方法及び使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20240306BHJP
C12P 7/625 20220101ALI20240306BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240306BHJP
C08G 63/88 20060101ALI20240306BHJP
C08G 63/06 20060101ALI20240306BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A
C12P7/625 ZNA
C12N1/21
C08G63/88
C08G63/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023558976
(86)(22)【出願日】2022-03-24
(85)【翻訳文提出日】2023-11-27
(86)【国際出願番号】 US2022021773
(87)【国際公開番号】W WO2022204420
(87)【国際公開日】2022-09-29
(31)【優先権主張番号】63/166,150
(32)【優先日】2021-03-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523364298
【氏名又は名称】サン ディエゴ ステート ユニバーシティ （エスディーエスユー）ファウンデーション，ディービーエー サン ディエゴ ステート ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション
(71)【出願人】
【識別番号】523364302
【氏名又は名称】ファックステック，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】カリュシュナヤ，マリナ ジー．
(72)【発明者】
【氏名】ムカルジー，アニンディア
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4J029
【Ｆターム（参考）】
4B064AD61
4B064AD62
4B064AD63
4B064AD64
4B064AD83
4B064BJ04
4B064CA02
4B064CC03
4B064CD04
4B064DA16
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BB04
4B065BC50
4B065CA12
4B065CA60
4J029AA02
4J029AB07
4J029AC01
4J029AE06
4J029AE18
4J029EA02
4J029EA05
4J029KH03
(57)【要約】
他の実施形態では、提供されるのは、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）等のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）及びコポリマー等のバイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを製造するために、メタン資化性細菌等のメタン及び水素酸化性独立栄養生物を選択し、単離し、及び組み換え操作する方法、並びに製品及びキット、並びにこれらを使用して、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを製造する方法である。提供されるのは、ＰＨＡ（例えば、ＰＨＢ及びコポリマー）製造のための効率的なメタン消費性メタン及び水素酸化性独立栄養生物、及びこの使用方法であり、他の実施形態では、メタン資化性細菌は、Ｃ１（メタン又はメタノール）－ＰＨＡ変換パラメータを改善するように遺伝子改変されている。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の群：（ａ）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌；
及び
（ｂ）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌
のそれぞれの少なくとも１つのメンバーを含む細菌の非天然混合物又は共同体。
【請求項2】
前記ＰＨＡは、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を含むか、又は
前記バイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）：ポリ（３－ヒドロキシプロピオネート）（ＰＨＰ若しくはＰ３ＨＰ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ若しくはＰ３ＨＢ）、ポリ（４－ヒドロキシブチレート）（Ｐ４ＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシバレレート）（ＰＨＶ若しくはＰ３ＨＶ）、ポリ（４－ヒドロキシバレレート）（Ｐ４ＨＶ）、ポリ（５－ヒドロキシバレレート）（Ｐ５ＨＶ）、ポリ（３－ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＨｘ若しくはＰ３ＨＨｘ）、ポリ（３－ヒドロキシオクタノエート）（ＰＨＯ若しくはＰ３ＨＯ）、ポリ（３－ヒドロキシデカノエート）（ＰＨＤ若しくはＰ３ＨＤ）、ポリ（３－ヒドロキシウンデカノエート）（ＰＨＵ、Ｐ３ＨＵ）、短鎖長若しくは中鎖長の飽和若しくは不飽和のＰＨＡ、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、又はこれらの任意のコポリマー、又はこれらの任意の組み合わせを含む、
請求項１に記載の細菌の非天然混合物又は共同体。
【請求項3】
前記ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌は、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、メチロサイナス（Methylosinus）属、メチロセラ（Methylocella）属、メチロカプサ（Methylocapsa）属、メチロカルダム（Methylocaldum）属、又はメチロシスチス（Methylocystis）属に属しているか、又はこれらに分類されており（若しくは由来しており）、任意選択的に、メチロシスチス（Methylocystis）種は、メチロシスチス・パルブス（Methylocystis parvus）であり、
任意選択的に、メチロサイナス（Methylosinus）種は、メチロサイナス・スポリウム（Methylosinus sporium）であり、
任意選択的に、メチロシスチス種（Methylocystis sp.）は、ＡＴＣＣ アクセッション番号 ＡＴＣＣ ４９２４２で寄託されており、
任意選択的に、メチロバクテリウム（Methylobacterium）種は、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Methylobacterium extorquens）であり、
任意選択的に、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Methylobacterium extorquens）は、ＡＴＣＣ アクセッション番号 ＡＴＣＣ ５５３６６で寄託されている、
請求項１に記載の細菌の非天然混合物又は共同体。
【請求項4】
メチロシスチス（Methylocystis）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）前記ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：【化1】
【請求項5】
メチロサイナス（Methylosinus）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）前記ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ配列）：【化2】
【請求項6】
メチロカルダム（Methylocaldum）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）前記ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ配列）：【化3】
【請求項7】
前記ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又は前記バイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、メチロベルサチリス（Methyloversatilis）属、ルブリビバキス（Rubrivivax）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、キサントバクター（Xanthobacter）属、ラルストニア（Ralstonia）属、カプリビダス（Cuprividus）属、又はハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属に属しているか、又はこれらに分類されており（若しくは由来しており）、任意選択的に、ハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属細菌は、Ｈ．フラバ（H. flava)であり、
任意選択的に、ラルストニア（Ralstonia）属細菌は、Ｒ．ユートロファ（R. eutropha）であり、
任意選択的に、カプリビダス（Cuprividus）属細菌は、Ｃ．ネカトール（C. necator）である、
請求項１に記載の細菌の非天然混合物又は共同体。
【請求項8】
ハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）前記ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又は前記バイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：【化4】
【請求項9】
キサントバクター（Xanthobacter）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）前記ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又は前記バイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：【化5】
【請求項10】
ラルストニア（Ralstonia）属又はカプリビダス（Cuprividus）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）前記ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又は前記バイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：【化6】
【請求項11】
ルブリビバキス（Rubrivivax）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）前記ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又は前記バイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：【化7】
【請求項12】
メチロベルサチリス（Methyloversatilis）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）前記ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又は前記バイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：【化8】
【請求項13】
ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）前記ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又は前記バイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：【化9】
【請求項14】
前記細菌の非天然混合物又は共同体は、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌
を含む、請求項１に記載の細菌の非天然混合物又は共同体。
【請求項15】
遺伝子操作された細菌であって、前記細菌は、請求項１～１４のいずれか一項に記載の混合物又は共同体中の細菌であるか又はこの細菌に由来しており、バイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマー、又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の合成に関与する酵素をコードする少なくとも１種の異種核酸を中に含んでいる、遺伝子操作された細菌。
【請求項16】
前記少なくとも１種の異種核酸は、β－ケトチオラーゼ又はアセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼをコードする、請求項１５に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項17】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）生合成のための異種オペロンを中に含んでいる請求項１５又は１６に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項18】
（ａ）少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌は、バイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマー、又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の合成に関与する酵素をコードする少なくとも１種の異種核酸を中に含んでいるか；又は（ｂ）少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、バイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマー、又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の合成に関与する酵素をコードする少なくとも１種の異種核酸を中に含んでいる、
請求項１～１７のいずれか一項若しくは請求項１～１４のいずれか一項に記載の細菌の非天然混合物若しくは共同体、又は請求項１５～１７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項19】
請求項１～１８のいずれか一項、若しくは請求項１～１４のいずれか一項、若しくは請求項１８に記載の細菌の非天然混合物若しくは共同体、又は請求項１５～１７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌を中に含むか又は有する製品。
【請求項20】
バイオリアクタ又は細菌培養装置として製作されているか又は構築されている請求項１９に記載の製品。
【請求項21】
前記細菌又は前記細菌の非天然混合物若しくは共同体は、複数のマクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズに付着しているか、又は含まれているか、又は結晶ゲルマトリックス若しくはナノシェル又は等価物中に封入されているか、又はこれら中若しくはこれら上に固定されており、任意選択的に、前記複数のマクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズは、アレイ又はシートとして配置されているか、又は製作されており、
任意選択的に、前記細菌を含む結晶ゲルマトリックス若しくはナノシェル又は等価物は、前記複数のマクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズに付着しているか、又は固定されているか、又は前記細菌を含む結晶ゲルマトリックス若しくはナノシェル又は等価物は、メッシュ若しくは同等の支持構造に付着しているか若しくは固定されている、
請求項１９又は２０に記載の製品。
【請求項22】
前記細菌は、ポリマー、コロイド粒子シェル、寒天若しくはゲル、又はハイドロゲル中にカプセル化されているか、又は封入されているか、又は固定されており、任意選択的に、前記カプセル化された構造は、前記アレイ若しくはシート、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズ上に固定されている、
請求項１９～２２のいずれか一項に記載の製品。
【請求項23】
前記アレイ、シート、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズは、シート、マット、メッシュ、カートリッジ、又は前記アレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズを支持する任意の形態の二次構造若しくは三次構造に含まれているか、又はこれらとして製作されている、請求項１～２２のいずれか一項又は請求項１９～２２のいずれか一項に記載の製品。
【請求項24】
前記アレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズ、又はシート、メッシュ、マット、カートリッジ、又は任意の形態の二次構造は、上部構造又は装置に挿入され得るモジュラーユニット又はカートリッジに加工されており、任意選択的に、前記モジュラーユニット又はカートリッジは、前記上部構造又は装置中に又は上に予め形成された容器に交換されるか又は挿入されるように製作されており、
任意選択的に、前記モジュラーユニット若しくはカートリッジ、又は同等の構造は、ガスの入出力開口部又はオリフィスを有するように製作されており、
任意選択的に、前記上部構造又は装置は、前記製品中への又は前記製品を通る空気流又はガス流の量を制御するポンプ、バルブ、及び／又は圧力ゲージを含む、
請求項１～２３のいずれか一項又は請求項１９～２３のいずれか一項に記載の製品。
【請求項25】
前記細菌又は前記細菌の非天然混合物若しくは共同体、又は前記アレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズ、又はシート、メッシュ、マット、カートリッジ、又は任意の形態の二次構造、又はモジュールユニット若しくはカートリッジ、又は上部構造若しくは装置は、バイオリアクタとして作製されているか、又はバイオリアクタ内に組み込まれるか若しくは統合される、請求項１～２４のいずれか一項又は請求項１９～２４のいずれか一項に記載の製品。
【請求項26】
バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを製造する方法であって、任意選択的に、前記バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を含み、任意選択的に、前記ＰＨＡは、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を含み、
前記方法は、
（ａ）請求項１～２５のいずれか一項若しくは請求項１～１８のいずれか一項に記載の細菌の非天然混合物又は共同体を培養するか、又は請求項１～２５のいずれか一項若しくは請求項１９～２５のいずれか一項に記載の製品中の又は製品中に含まれる又は製品上の細菌の非天然混合物又は共同体を培養すること；及び
（ｂ）前記バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、単離するか、分離するか、精製するか、又は回収すること
を含む、方法。
【請求項27】
前記細菌、又は前記細菌の混合物若しくは共同体を、メタン及び空気、メタン及び酸素、メタン、水素、及び空気、メタン及び水素、及び／又は空気を培養物に添加することを含む条件下で培養し；任意選択的に、メタノール、酢酸塩、ギ酸塩、及び／又はコハク酸塩を含む試薬も、前記培養物に添加する、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記細菌、又は細菌の混合物若しくは共同体を、約２０℃～３７℃の温度を含む条件下で培養する、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項29】
前記バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、分離するか、単離するか、又は精製し、任意選択的に、前記バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、デカンテーション、ろ過、遠心分離、凝集、空気浮上、若しくは沈殿、又はこれらの任意の組み合わせを含む方法又はプロセスにより分離するか、単離するか、又は精製し；
任意選択的に、前記バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、約７０％～９９．５％の純度、又は少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、若しくは９９％の純度で分離するか、単離するか、又は精製し、
任意選択的に、前記バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、米国特許出願公開第２０１７０２５３７１３Ａ１号、又は米国特許第（ＵＳＰＮ）１０，５９７，５０６号若しくはＵＳＰＮ８，８５２，１５７号で説明されているプロセスの使用を含む方法又はプロセスにより分離するか、単離するか、又は精製する、
請求項１～２８のいずれか一項又は請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、溶解工程を含む方法又はプロセスにより分離するか、単離するか、又は精製し、任意選択的に、前記溶解工程は、細菌細胞を溶解させることを含み、任意選択的に、前記細菌細胞の溶解は、１種又は複数種の細胞外酵素の使用を含む、請求項１～２９のいずれか一項又は請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、分離工程又は抽出工程をさらに含む方法又はプロセスにより分離するか、単離するか、又は精製し、タンパク質、ペプチド、若しくはアミノ酸、又はこれらの任意の組み合わせを、前記バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーから分離するか、又は抽出する、請求項１～３０のいずれか一項又は請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
洗浄する工程をさらに含み、任意選択的に、前記洗浄は、得られたバイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを洗浄するための前記抽出、単離、及び／又は分離の後であり、任意選択的に、前記洗浄する工程を、洗浄液として水を含む試薬を使用して実施する、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記抽出プロセス、分離プロセス、又は単離プロセスにおいて、有機溶媒若しくは化学物質、又はこれらの任意の組み合わせを使用しない、請求項１～３２のいずれか一項又は請求項２５～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーは、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）及び／又はそのコポリマーを含む、請求項１～３３のいずれか一項又は請求項２５～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリ（３－ヒドロキシプロピオネート）（ＰＨＰ若しくはＰ３ＨＰ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ若しくはＰ３ＨＢ）、ポリ（４－ヒドロキシブチレート）（Ｐ４ＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシバレレート）（ＰＨＶ若しくはＰ３ＨＶ）、ポリ（４－ヒドロキシバレレート）（Ｐ４ＨＶ）、ポリ（５－ヒドロキシバレレート）（Ｐ５ＨＶ）、ポリ（３－ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＨｘ若しくはＰ３ＨＨｘ）、ポリ（３－ヒドロキシオクタノエート）（ＰＨＯ若しくはＰ３ＨＯ）、ポリ（３－ヒドロキシデカノエート）（ＰＨＤ若しくはＰ３ＨＤ）、ポリ（３－ヒドロキシウンデカノエート）（ＰＨＵ、Ｐ３ＨＵ）、短鎖長若しくは中鎖長の飽和若しくは不飽和のＰＨＡ、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、又はこれらの任意のコポリマー、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～３４のいずれか一項又は請求項２５～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記細菌、又は前記細菌の混合物若しくは共同体は、培養中に、少なくとも５グラム（ｇ）Ｌ－１ｈ－１ＰＨＡを産生するか、又は生成する、請求項１～３５のいずれか一項又は請求項２５～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーから単量体を製造する方法であって、（ａ）請求項１～３６のいずれか一項又は請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法を使用して製造されたか、単離されたか、又は分離されたバイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを準備すること；
（ｂ）脱重合物質又は試薬を準備すること；及び
（ｃ）前記バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーと、前記脱重合物質とを混合することにより、前記バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを脱重合させること
を含み、
任意選択的に、前記脱重合物質又は試薬は、耐熱性細胞外ＰＨＡ解重合酵素を含む、
方法。
【請求項38】
生体適合性製品、生物活性ナノビーズ、生分解性製品、使い捨て製品、若しくは再生可能製品、サーモプラスト、エラストマー製品若しくはポリマー前駆体、コーティング、ホイル、おむつ、廃棄物バッグ、タイヤ、パッケージ、シングルユース物品、タンパク質精製マトリックス、インプラント部品、骨代用品、徐放性薬物、又は肥料、又は農薬担体を製造する方法であって、請求項１～３７のいずれか一項により製造されたか又は請求項１～３７のいずれか一項若しくは請求項２５～３７のいずれか一項に記載の方法を使用して製造されたバイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマー、又はこれらの単量体の使用を含み、
任意選択的に、前記生分解性製品、使い捨て製品、又は再生可能製品は、マルチドーズシリンジ、検体チューブ、メス、ランセット、シャープスコンテナ、又は吸引キャニスタである、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本特許協力条約（ＰＣＴ）国際出願は、２０２１年３月２５日に出願された米国仮出願シリアル番号（ＵＳＳＮ）第６３／１６６，１５０号の米国特許法第１１９条（ｅ）（35 U.S.C. § 119(e)）に基づく優先権の利益を主張する。前述の出願は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、特許出願は、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
本特許協力条約（ＰＣＴ）国際出願は、２０２１年３月２５日に出願された米国仮出願シリアル番号（ＵＳＳＮ）第６３／１６６，１５０号の米国特許法第１１９条（ｅ）（35 U.S.C. § 119(e)）に基づく優先権の利益を主張する。前述の出願は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、特許出願は、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【0002】
技術分野
本発明は、全体として、細菌学、並びにバイオポリマー、再生可能ポリマー、及び生分解性ポリマーの製造に関する。他の実施形態では、提供されるのは、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）等のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）及びコポリマー等のバイオポリマー、再生可能ポリマー、及び生分解性ポリマーを製造するために、メタン資化性細菌等のメタン及び水素酸化性独立栄養生物を選択し、単離し、及び組み換え操作する方法、並びに製品及びキット、並びにこれらを使用してバイオポリマー、再生可能ポリマー、及び生分解性ポリマーを製造する方法である。提供されるのは、ＰＨＡ（例えば、ＰＨＢ）製造のための効率的なメタン消費性メタン及び水素酸化性独立栄養微生物、及びこの使用方法であり、他の実施形態では、メタン栄養生物は、Ｃ１（メタン又はメタノール）－ＰＨＡ変換パラメータを改善するように遺伝子改変されている。
本発明は、全体として、細菌学、並びにバイオポリマー、再生可能ポリマー、及び生分解性ポリマーの製造に関する。他の実施形態では、提供されるのは、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）等のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）及びコポリマー等のバイオポリマー、再生可能ポリマー、及び生分解性ポリマーを製造するために、メタン資化性細菌等のメタン及び水素酸化性独立栄養生物を選択し、単離し、及び組み換え操作する方法、並びに製品及びキット、並びにこれらを使用してバイオポリマー、再生可能ポリマー、及び生分解性ポリマーを製造する方法である。提供されるのは、ＰＨＡ（例えば、ＰＨＢ）製造のための効率的なメタン消費性メタン及び水素酸化性独立栄養微生物、及びこの使用方法であり、他の実施形態では、メタン栄養生物は、Ｃ１（メタン又はメタノール）－ＰＨＡ変換パラメータを改善するように遺伝子改変されている。
【背景技術】
【0003】
背景
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、様々な天然微生物により産生される炭素貯蔵ポリマーであり、そのため自然環境中で生分解可能である。ＰＨＡは、年間２億１，０００万トン（又は７０％）超のプラスチックの需要に対応する上位７つの最もよく売れているプラスチックの有益な特性を備える数百種の異なるポリマーのファミリーである。ＰＨＡは、無毒であり且つ安全であると考えられている。ＰＨＡ原料の完全な分解を、従来の工業用コンポスタ又は嫌気性ダイジェスタで達成し得る。全体として、ＰＨＡは、将来のポリマー製造にとって最も持続可能な解決策と想定されている。
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、様々な天然微生物により産生される炭素貯蔵ポリマーであり、そのため自然環境中で生分解可能である。ＰＨＡは、年間２億１，０００万トン（又は７０％）超のプラスチックの需要に対応する上位７つの最もよく売れているプラスチックの有益な特性を備える数百種の異なるポリマーのファミリーである。ＰＨＡは、無毒であり且つ安全であると考えられている。ＰＨＡ原料の完全な分解を、従来の工業用コンポスタ又は嫌気性ダイジェスタで達成し得る。全体として、ＰＨＡは、将来のポリマー製造にとって最も持続可能な解決策と想定されている。
【0004】
炭水化物からＰＨＡを製造しようとするこれまでの試みは、高い炭素原料コスト、及び競合する石油系ポリマー及び非生分解性ポリマーの低コストが課題となっている。天然ガス及びバイオガスは、費用効果が高い代替手段として論じられているが、ＰＨＡを産生する確立された微生物プラットフォームは全て、メタン炭素の４０％を利用するだけであり、残りはＣＯ２として放出される。ＰＨＡ市場でのブレイクスルーには、高効率の炭素変換に関する新規な解決策が必要である。このことは、従来の発酵、微生物プラットフォーム、及び原料の間でのトレードオフを意味することが多い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
概要
他の実施形態では、提供されるのは、下記の群：
（ａ）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌；
及び
（ｂ）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌
のそれぞれの少なくとも１つのメンバーを含む細菌の非天然混合物又は共同体である。
他の実施形態では、提供されるのは、下記の群：
（ａ）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌；
及び
（ｂ）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌
のそれぞれの少なくとも１つのメンバーを含む細菌の非天然混合物又は共同体である。
【0006】
本明細書で提供される細菌の非天然混合物又は共同体の他の実施形態では、
－ ＰＨＡは、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を含むか、又はバイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）：ポリ（３－ヒドロキシプロピオネート）（ＰＨＰ若しくはＰ３ＨＰ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ若しくはＰ３ＨＢ）、ポリ（４－ヒドロキシブチレート）（Ｐ４ＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシバレレート）（ＰＨＶ若しくはＰ３ＨＶ）、ポリ（４－ヒドロキシバレレート）（Ｐ４ＨＶ）、ポリ（５－ヒドロキシバレレート）（Ｐ５ＨＶ）、ポリ（３－ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＨｘ若しくはＰ３ＨＨｘ）、ポリ（３－ヒドロキシオクタノエート）（ＰＨＯ若しくはＰ３ＨＯ）、ポリ（３－ヒドロキシデカノエート）（ＰＨＤ若しくはＰ３ＨＤ）、ポリ（３－ヒドロキシウンデカノエート）（ＰＨＵ、Ｐ３ＨＵ）、短鎖長若しくは中鎖長の飽和若しくは不飽和のＰＨＡ、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、又はこれらの任意のコポリマー、又はこれらの任意の組み合わせを含み；
－ ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌は、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、メチロサイナス（Methylosinus）属、メチロセラ（Methylocella）属、メチロカプサ（Methylocapsa）属、メチロカルダム（Methylocaldum）属、又はメチロシスチス（Methylocystis）属に属しているか、又はこれらに分類されており（若しくは由来しており）、
任意選択的に、メチロシスチス（Methylocystis）種は、メチロシスチス・パルブス（Methylocystis parvus）であり、
任意選択的に、メチロサイナス（Methylosinus）種は、メチロサイナス・スポリウム（Methylosinus sporium）であり、
任意選択的に、メチロシスチス種（Methylocystis sp.）は、ＡＴＣＣ アクセッション番号 ＡＴＣＣ ４９２４２で寄託されており、
任意選択的に、メチロバクテリウム（Methylobacterium）種は、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Methylobacterium extorquens）であり、
任意選択的に、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Methylobacterium extorquens）は、ＡＴＣＣ アクセッション番号 ＡＴＣＣ ５５３６６で寄託されており；
－ メチロシスチス（Methylocystis）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
に対する少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、若しくは約９８％の、若しくはより高い配列同一性、又は完全な（１００％の）配列同一性を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有しており；
－ メチロサイナス（Methylosinus）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
に対する少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、若しくは約９８％の、若しくはより高い配列同一性、又は完全な（１００％の）配列同一性を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有しており；
－ メチロカルダム（Methylocaldum）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
に対する少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、若しくは約９８％の、若しくはより高い配列同一性、又は完全な（１００％の）配列同一性を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有しており；
－ ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、メチロベルサチリス（Methyloversatilis）属、ルブリビバキス（Rubrivivax）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、キサントバクター（Xanthobacter）属、ラルストニア（Ralstonia）属、カプリビダス（Cuprividus）属、又はハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属に属しているか、又はこれらに分類されており（若しくは由来しており）、
任意選択的に、ハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）細菌は、Ｈ．フラバ（H. flava)であり、
任意選択的に、ラルストニア（Ralstonia）は、Ｒ．ユートロファ（R. eutropha）であり、
任意選択的に、カプリビダス（Cuprividus）は、Ｃ．ネカトール（C. necator）であり、
－ ハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
に対する少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、若しくは約９８％の、若しくはより高い配列同一性、又は完全な（１００％の）配列同一性を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有しており；
－ キサントバクター（Xanthobacter）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
に対する少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、若しくは約９８％の、若しくはより高い配列同一性、又は完全な（１００％の）配列同一性を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有しており；
－ ラルストニア（Ralstonia）属又はカプリビダス（Cuprividus）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
に対する少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、若しくは約９８％の、若しくはより高い配列同一性、又は完全な（１００％の）配列同一性を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有しており；
－ ルブリビバキス（Rubrivivax）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
に対する少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、若しくは約９８％の、若しくはより高い配列同一性、又は完全な（１００％の）配列同一性を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有しており；
－ メチロベルサチリス（Methyloversatilis）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
に対する少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、若しくは約９８％の、若しくはより高い配列同一性、又は完全な（１００％の）配列同一性を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有しており；
－ ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
に対する少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、若しくは約９８％の、若しくはより高い配列同一性、又は完全な（１００％の）配列同一性を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有しており；
－ 細菌の非天然混合物又は共同体は、
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌
を含む。
－ ＰＨＡは、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を含むか、又はバイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）：ポリ（３－ヒドロキシプロピオネート）（ＰＨＰ若しくはＰ３ＨＰ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ若しくはＰ３ＨＢ）、ポリ（４－ヒドロキシブチレート）（Ｐ４ＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシバレレート）（ＰＨＶ若しくはＰ３ＨＶ）、ポリ（４－ヒドロキシバレレート）（Ｐ４ＨＶ）、ポリ（５－ヒドロキシバレレート）（Ｐ５ＨＶ）、ポリ（３－ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＨｘ若しくはＰ３ＨＨｘ）、ポリ（３－ヒドロキシオクタノエート）（ＰＨＯ若しくはＰ３ＨＯ）、ポリ（３－ヒドロキシデカノエート）（ＰＨＤ若しくはＰ３ＨＤ）、ポリ（３－ヒドロキシウンデカノエート）（ＰＨＵ、Ｐ３ＨＵ）、短鎖長若しくは中鎖長の飽和若しくは不飽和のＰＨＡ、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、又はこれらの任意のコポリマー、又はこれらの任意の組み合わせを含み；
－ ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌は、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、メチロサイナス（Methylosinus）属、メチロセラ（Methylocella）属、メチロカプサ（Methylocapsa）属、メチロカルダム（Methylocaldum）属、又はメチロシスチス（Methylocystis）属に属しているか、又はこれらに分類されており（若しくは由来しており）、
任意選択的に、メチロシスチス（Methylocystis）種は、メチロシスチス・パルブス（Methylocystis parvus）であり、
任意選択的に、メチロサイナス（Methylosinus）種は、メチロサイナス・スポリウム（Methylosinus sporium）であり、
任意選択的に、メチロシスチス種（Methylocystis sp.）は、ＡＴＣＣ アクセッション番号 ＡＴＣＣ ４９２４２で寄託されており、
任意選択的に、メチロバクテリウム（Methylobacterium）種は、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Methylobacterium extorquens）であり、
任意選択的に、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Methylobacterium extorquens）は、ＡＴＣＣ アクセッション番号 ＡＴＣＣ ５５３６６で寄託されており；
－ メチロシスチス（Methylocystis）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
【化1】
－ メチロサイナス（Methylosinus）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
【化2】
－ メチロカルダム（Methylocaldum）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
【化3】
－ ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、メチロベルサチリス（Methyloversatilis）属、ルブリビバキス（Rubrivivax）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、キサントバクター（Xanthobacter）属、ラルストニア（Ralstonia）属、カプリビダス（Cuprividus）属、又はハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属に属しているか、又はこれらに分類されており（若しくは由来しており）、
任意選択的に、ハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）細菌は、Ｈ．フラバ（H. flava)であり、
任意選択的に、ラルストニア（Ralstonia）は、Ｒ．ユートロファ（R. eutropha）であり、
任意選択的に、カプリビダス（Cuprividus）は、Ｃ．ネカトール（C. necator）であり、
－ ハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
【化4】
－ キサントバクター（Xanthobacter）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
【化5】
－ ラルストニア（Ralstonia）属又はカプリビダス（Cuprividus）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
【化6】
－ ルブリビバキス（Rubrivivax）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
【化7】
－ メチロベルサチリス（Methyloversatilis）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
【化8】
－ ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属に属しているか又は分類されている（若しくは由来している）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列：
【化9】
－ 細菌の非天然混合物又は共同体は、
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロサイナス（Methylosinus）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌；
メチロセラ（Methylocella）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロカプサ（Methylocapsa）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロカルダム（Methylocaldum）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びメチロベルサチリス（Methyloversatilis）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びルブリビバキス（Rubrivivax）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びキサントバクター（Xanthobacter）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びラルストニア（Ralstonia）属の少なくとも１種の細菌；
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びカプリビダス（Cuprividus）属の少なくとも１種の細菌；又は
メチロシスチス（Methylocystis）属の少なくとも１種の細菌、及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）属の少なくとも１種の細菌
を含む。
【0007】
他の実施形態では、提供されるのは、遺伝子操作された細菌であって、この細菌は、本明細書で提供される混合物又は共同体中の細菌であるか又はこの細菌に由来しており、バイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマー、又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の合成に関与する酵素をコードする少なくとも１種の異種核酸を中に含んでいる、遺伝子操作された細菌である。
【0008】
他の実施形態では、本明細書で提供される細菌の非天然混合物又は共同体中の細菌は、遺伝子操作されており、例えば、
－ ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌が、遺伝子操作されており、及び／又は
－ ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌が遺伝子操作されている。
－ ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌が、遺伝子操作されており、及び／又は
－ ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌が遺伝子操作されている。
【0009】
遺伝子操作された細菌の他の実施形態では、（バイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマー、又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の合成に関与する）酵素をコードする少なくとも１種の異種核酸は、細菌中に一過性に又は安定して移植されており、例えば、
－ 少なくとも１種の異種核酸は、β－ケトチオラーゼ又はアセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼをコードしており、例えば、
－ β－ケトチオラーゼは、例えばＧｅｎＢａｎｋ：ＫＹ２２９１６３．１で記載されている、メチロバクテリウム種（Methylobacterium sp.）株１８０５ベータ－ケトチオラーゼ（ｐｈａＡ）遺伝子に由来しているか；又は
－ 遺伝子操作された細菌は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）生合成のための異種オペロンを中に含んでいるか；又は
－ 遺伝子操作された細菌は、例えば、Zhang et al, Appl Microbiol Biotechnol . 2006 Jun;71(2):222-7で説明されているベータ－ケトチオラーゼ（ＰｈｂＡ）、アセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼ（ＰｈｂＢ）、及び／又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素（ＰｈｂＣ）をコードする配列等のポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）合成遺伝子（ＰｈｂＣＡＢ）又はＰｈｂＣＡＢオペロンを中に含んでいる。
－ 少なくとも１種の異種核酸は、β－ケトチオラーゼ又はアセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼをコードしており、例えば、
－ β－ケトチオラーゼは、例えばＧｅｎＢａｎｋ：ＫＹ２２９１６３．１で記載されている、メチロバクテリウム種（Methylobacterium sp.）株１８０５ベータ－ケトチオラーゼ（ｐｈａＡ）遺伝子に由来しているか；又は
－ 遺伝子操作された細菌は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）生合成のための異種オペロンを中に含んでいるか；又は
－ 遺伝子操作された細菌は、例えば、Zhang et al, Appl Microbiol Biotechnol . 2006 Jun;71(2):222-7で説明されているベータ－ケトチオラーゼ（ＰｈｂＡ）、アセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼ（ＰｈｂＢ）、及び／又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素（ＰｈｂＣ）をコードする配列等のポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）合成遺伝子（ＰｈｂＣＡＢ）又はＰｈｂＣＡＢオペロンを中に含んでいる。
【0010】
本明細書で提供される細菌の非天然混合物又は共同体の他の実施形態では、
（ａ）少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌は、バイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマー、又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の合成に関与する酵素をコードする少なくとも１種の異種核酸を中に含んでいるか；又は
（ｂ）少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、バイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマー、又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の合成に関与する酵素をコードする少なくとも１種の異種核酸を中に含んでいる。
（ａ）少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生メタン資化性細菌、又はバイオポリマー産生メタン資化性細菌、再生可能ポリマー産生メタン資化性細菌、若しくは生分解性ポリマー産生メタン資化性細菌は、バイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマー、又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の合成に関与する酵素をコードする少なくとも１種の異種核酸を中に含んでいるか；又は
（ｂ）少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生好気性化学独立栄養細菌、又はバイオポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、再生可能ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌、若しくは生分解性ポリマー産生好気性化学独立栄養細菌は、バイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマー、又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の合成に関与する酵素をコードする少なくとも１種の異種核酸を中に含んでいる。
【0011】
他の実施形態では、提供されるのは、本明細書で提供される細菌の非天然混合物又は共同体を含む製品である。
【0012】
本明細書で提供される製品の他の実施形態では、
－ 製品は、バイオリアクタとして製作されているか、又は構築されており；
－ 細菌、又は細菌の非天然混合物若しくは共同体は、複数のマクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズに付着しているか、又は含まれているか、又はハイドロゲル、結晶ゲルマトリックス若しくはナノシェル又は等価物中に封入されているか、又はこれら中若しくはこれら上に固定されており、
任意選択的に、複数のマクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズは、アレイ又はシートとして配置されているか、又は製作されており、
任意選択的に、細菌を含む結晶ゲルマトリックス若しくはナノシェル又は等価物は、複数のマクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズに付着しているか、又は固定されているか、又は細菌を含む結晶ゲルマトリックス若しくはナノシェル又は等価物は、メッシュ若しくは同等の支持構造に付着しているか若しくは固定されており；
－ 細菌は、ポリマー、コロイド粒子シェル、デンドリマー、寒天若しくはゲル、又はハイドロゲル中にカプセル化されているか、又は封入されているか、又は固定されており、
任意選択的に、カプセル化された構造は、アレイ若しくはシート、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズ上に固定されており；
－ アレイ、シート、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズは、シート、マット、メッシュ、カートリッジ、又はアレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズを支持する任意の形態の二次構造若しくは三次構造に含まれているか、又はこれらとして製作されており；
－ アレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズ、又はシート、メッシュ、マット、カートリッジ、又は任意の形態の二次構造は、上部構造又は装置に挿入され得るモジュラーユニット又はカートリッジに加工されており、
任意選択的に、モジュラーユニット又はカートリッジは、上部構造又は装置中に又は上に予め形成された容器に交換されるか又は挿入されるように製作されており、
任意選択的に、モジュラーユニット若しくはカートリッジ、又は同等の構造は、ガスの入出力開口部又はオリフィス（orifice）を有するように製作されており
任意選択的に、上部構造又は装置は、製品中への又は製品を通る空気流又はガス流の量を制御するポンプ、バルブ、及び／又は圧力ゲージを含み；及び／又は
－ 細菌、又は細菌の非天然混合物若しくは共同体、又はアレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズ、又はシート、メッシュ、マット、カートリッジ、又は任意の形態の二次構造、又はモジュールユニット若しくはカートリッジ、又は上部構造若しくは装置は、バイオリアクタとして作製されているか、又はバイオリアクタ内に組み込まれるか若しくは統合される。
－ 製品は、バイオリアクタとして製作されているか、又は構築されており；
－ 細菌、又は細菌の非天然混合物若しくは共同体は、複数のマクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズに付着しているか、又は含まれているか、又はハイドロゲル、結晶ゲルマトリックス若しくはナノシェル又は等価物中に封入されているか、又はこれら中若しくはこれら上に固定されており、
任意選択的に、複数のマクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズは、アレイ又はシートとして配置されているか、又は製作されており、
任意選択的に、細菌を含む結晶ゲルマトリックス若しくはナノシェル又は等価物は、複数のマクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズに付着しているか、又は固定されているか、又は細菌を含む結晶ゲルマトリックス若しくはナノシェル又は等価物は、メッシュ若しくは同等の支持構造に付着しているか若しくは固定されており；
－ 細菌は、ポリマー、コロイド粒子シェル、デンドリマー、寒天若しくはゲル、又はハイドロゲル中にカプセル化されているか、又は封入されているか、又は固定されており、
任意選択的に、カプセル化された構造は、アレイ若しくはシート、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズ上に固定されており；
－ アレイ、シート、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズは、シート、マット、メッシュ、カートリッジ、又はアレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズを支持する任意の形態の二次構造若しくは三次構造に含まれているか、又はこれらとして製作されており；
－ アレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズ、又はシート、メッシュ、マット、カートリッジ、又は任意の形態の二次構造は、上部構造又は装置に挿入され得るモジュラーユニット又はカートリッジに加工されており、
任意選択的に、モジュラーユニット又はカートリッジは、上部構造又は装置中に又は上に予め形成された容器に交換されるか又は挿入されるように製作されており、
任意選択的に、モジュラーユニット若しくはカートリッジ、又は同等の構造は、ガスの入出力開口部又はオリフィス（orifice）を有するように製作されており
任意選択的に、上部構造又は装置は、製品中への又は製品を通る空気流又はガス流の量を制御するポンプ、バルブ、及び／又は圧力ゲージを含み；及び／又は
－ 細菌、又は細菌の非天然混合物若しくは共同体、又はアレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズ、又はシート、メッシュ、マット、カートリッジ、又は任意の形態の二次構造、又はモジュールユニット若しくはカートリッジ、又は上部構造若しくは装置は、バイオリアクタとして作製されているか、又はバイオリアクタ内に組み込まれるか若しくは統合される。
【0013】
他の実施形態では、提供されるのは、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを製造する方法であって、
任意選択的に、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を含み、任意選択的に、ＰＨＡは、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を含み、
この方法は、
（ａ）本明細書に記載されている細菌の非天然混合物又は共同体を培養するか、又は本明細書で提供される製品中の又は製品中に含まれる又は製品上の細菌の非天然混合物又は共同体を培養すること；及び
（ｂ）バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、単離するか、分離するか、精製するか、又は回収すること
を含む、方法である。
任意選択的に、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を含み、任意選択的に、ＰＨＡは、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を含み、
この方法は、
（ａ）本明細書に記載されている細菌の非天然混合物又は共同体を培養するか、又は本明細書で提供される製品中の又は製品中に含まれる又は製品上の細菌の非天然混合物又は共同体を培養すること；及び
（ｂ）バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、単離するか、分離するか、精製するか、又は回収すること
を含む、方法である。
【0014】
本明細書で提供される方法の他の実施形態では、
－ 細菌、又は細菌の混合物若しくは共同体を、メタン（ＣＨ４）及び空気；メタン（ＣＨ４）及び酸素（Ｏ２）；メタン（ＣＨ４）、水素、及び空気；メタン（ＣＨ４）及び水素、及び／又は空気；メタン（ＣＨ４）、二酸化炭素（ＣＯ２）；メタン（ＣＨ４）、及び二酸化炭素（ＣＯ２）、及び空気；メタン（ＣＨ４）、二酸化炭素（ＣＯ２）、及び酸素（Ｏ２）；メタン（ＣＨ４）、二酸化炭素（ＣＯ２）、及び水素；及び／又はメタン（ＣＨ４）、二酸化炭素（ＣＯ２）、空気、及び／又は酸素（Ｏ２）、及び水素を培養物に添加することを含む条件下で培養し、任意選択的に、メタノール、酢酸塩、ギ酸塩、及び／又はコハク酸塩を含む試薬も、培養物に添加し；
－ 他の実施形態では、メタン（ＣＨ４）を、天然ガス及び／又はバイオガスの形態で培養物に添加し、
－ 他の実施形態では、培養条件は、密閉された容器又は反応容器の使用を含み、任意選択的に、メタン（ＣＨ４）、二酸化炭素（ＣＯ２）、空気、及び／又は酸素（Ｏ２）、及び水素を、ガスとして添加し、任意選択的に、これらのガスの内の１つ又は全てを、密閉された容器又は反応容器中に加圧下で添加し；
－ 細菌、又は細菌の混合物若しくは共同体を、約２０℃～３７℃又は約１５℃～４０℃の温度を含む条件下で培養し；
－ バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、分離するか、単離するか、又は精製し；
任意選択的に、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、デカンテーション、ろ過、遠心分離、凝集、空気浮上、若しくは沈殿、又はこれらの任意の組み合わせを含む方法又はプロセスにより分離するか、単離するか、又は精製し；
任意選択的に、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、約７０％～９９．５％の純度、又は少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、若しくは９９％の純度で分離するか、単離するか、又は精製し、
任意選択的に、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、米国特許出願公開第２０１７０２５３７１３Ａ１号、又は米国特許第（ＵＳＰＮ）１０，５９７，５０６号若しくはＵＳＰＮ８，８５２，１５７号で説明されているプロセスの使用を含む方法又はプロセスにより分離するか、単離するか、又は精製し；
－ バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、溶解工程を含む方法又はプロセスにより分離するか、単離するか、又は精製し、任意選択的に、溶解工程は、細菌細胞を溶解させることを含み、任意選択的に、細菌細胞の溶解は、１種又は複数種の細胞外酵素の使用を含み；
－ バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、分離工程又は抽出工程をさらに含む方法又はプロセスにより分離するか、単離するか、又は精製し、タンパク質、ペプチド、若しくはアミノ酸、又はこれらの任意の組み合わせを、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーから分離するか、又は抽出し；
－ この方法は、洗浄する工程をさらに含み、任意選択的に、洗浄は、得られたバイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを洗浄するための抽出、単離、及び／又は分離の後であり、任意選択的に、洗浄する工程を、洗浄液として水を含む試薬を使用して実施し；
－ 抽出プロセス、分離プロセス、又は単離プロセスにおいて、有機溶媒若しくは化学物質、又はこれらの任意の組み合わせを使用せず；
－ バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーは、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）及び／又はそのコポリマーを含み；
－ バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリ（３－ヒドロキシプロピオネート）（ＰＨＰ若しくはＰ３ＨＰ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ若しくはＰ３ＨＢ）、ポリ（４－ヒドロキシブチレート）（Ｐ４ＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシバレレート）（ＰＨＶ若しくはＰ３ＨＶ）、ポリ（４－ヒドロキシバレレート）（Ｐ４ＨＶ）、ポリ（５－ヒドロキシバレレート）（Ｐ５ＨＶ）、ポリ（３－ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＨｘ若しくはＰ３ＨＨｘ）、ポリ（３－ヒドロキシオクタノエート）（ＰＨＯ若しくはＰ３ＨＯ）、ポリ（３－ヒドロキシデカノエート）（ＰＨＤ若しくはＰ３ＨＤ）、ポリ（３－ヒドロキシウンデカノエート）（ＰＨＵ、Ｐ３ＨＵ）、短鎖長若しくは中鎖長の飽和若しくは不飽和のＰＨＡ、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、又はこれらの任意のコポリマー、又はこれらの任意の組み合わせを含み；及び／又は
－ 細菌、又は細菌の混合物若しくは共同体は、培養中に、少なくとも５グラム（ｇ）Ｌ－１ｈ－１ＰＨＡを産生するか、又は生成する。
－ 細菌、又は細菌の混合物若しくは共同体を、メタン（ＣＨ４）及び空気；メタン（ＣＨ４）及び酸素（Ｏ２）；メタン（ＣＨ４）、水素、及び空気；メタン（ＣＨ４）及び水素、及び／又は空気；メタン（ＣＨ４）、二酸化炭素（ＣＯ２）；メタン（ＣＨ４）、及び二酸化炭素（ＣＯ２）、及び空気；メタン（ＣＨ４）、二酸化炭素（ＣＯ２）、及び酸素（Ｏ２）；メタン（ＣＨ４）、二酸化炭素（ＣＯ２）、及び水素；及び／又はメタン（ＣＨ４）、二酸化炭素（ＣＯ２）、空気、及び／又は酸素（Ｏ２）、及び水素を培養物に添加することを含む条件下で培養し、任意選択的に、メタノール、酢酸塩、ギ酸塩、及び／又はコハク酸塩を含む試薬も、培養物に添加し；
－ 他の実施形態では、メタン（ＣＨ４）を、天然ガス及び／又はバイオガスの形態で培養物に添加し、
－ 他の実施形態では、培養条件は、密閉された容器又は反応容器の使用を含み、任意選択的に、メタン（ＣＨ４）、二酸化炭素（ＣＯ２）、空気、及び／又は酸素（Ｏ２）、及び水素を、ガスとして添加し、任意選択的に、これらのガスの内の１つ又は全てを、密閉された容器又は反応容器中に加圧下で添加し；
－ 細菌、又は細菌の混合物若しくは共同体を、約２０℃～３７℃又は約１５℃～４０℃の温度を含む条件下で培養し；
－ バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、分離するか、単離するか、又は精製し；
任意選択的に、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、デカンテーション、ろ過、遠心分離、凝集、空気浮上、若しくは沈殿、又はこれらの任意の組み合わせを含む方法又はプロセスにより分離するか、単離するか、又は精製し；
任意選択的に、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、約７０％～９９．５％の純度、又は少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、若しくは９９％の純度で分離するか、単離するか、又は精製し、
任意選択的に、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、米国特許出願公開第２０１７０２５３７１３Ａ１号、又は米国特許第（ＵＳＰＮ）１０，５９７，５０６号若しくはＵＳＰＮ８，８５２，１５７号で説明されているプロセスの使用を含む方法又はプロセスにより分離するか、単離するか、又は精製し；
－ バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、溶解工程を含む方法又はプロセスにより分離するか、単離するか、又は精製し、任意選択的に、溶解工程は、細菌細胞を溶解させることを含み、任意選択的に、細菌細胞の溶解は、１種又は複数種の細胞外酵素の使用を含み；
－ バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを、分離工程又は抽出工程をさらに含む方法又はプロセスにより分離するか、単離するか、又は精製し、タンパク質、ペプチド、若しくはアミノ酸、又はこれらの任意の組み合わせを、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーから分離するか、又は抽出し；
－ この方法は、洗浄する工程をさらに含み、任意選択的に、洗浄は、得られたバイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを洗浄するための抽出、単離、及び／又は分離の後であり、任意選択的に、洗浄する工程を、洗浄液として水を含む試薬を使用して実施し；
－ 抽出プロセス、分離プロセス、又は単離プロセスにおいて、有機溶媒若しくは化学物質、又はこれらの任意の組み合わせを使用せず；
－ バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーは、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）及び／又はそのコポリマーを含み；
－ バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリ（３－ヒドロキシプロピオネート）（ＰＨＰ若しくはＰ３ＨＰ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ若しくはＰ３ＨＢ）、ポリ（４－ヒドロキシブチレート）（Ｐ４ＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシバレレート）（ＰＨＶ若しくはＰ３ＨＶ）、ポリ（４－ヒドロキシバレレート）（Ｐ４ＨＶ）、ポリ（５－ヒドロキシバレレート）（Ｐ５ＨＶ）、ポリ（３－ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＨｘ若しくはＰ３ＨＨｘ）、ポリ（３－ヒドロキシオクタノエート）（ＰＨＯ若しくはＰ３ＨＯ）、ポリ（３－ヒドロキシデカノエート）（ＰＨＤ若しくはＰ３ＨＤ）、ポリ（３－ヒドロキシウンデカノエート）（ＰＨＵ、Ｐ３ＨＵ）、短鎖長若しくは中鎖長の飽和若しくは不飽和のＰＨＡ、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、又はこれらの任意のコポリマー、又はこれらの任意の組み合わせを含み；及び／又は
－ 細菌、又は細菌の混合物若しくは共同体は、培養中に、少なくとも５グラム（ｇ）Ｌ－１ｈ－１ＰＨＡを産生するか、又は生成する。
【0015】
他の実施形態では、提供されるのは、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーから単量体を製造する方法であって、
（ａ）本明細書で提供される方法を使用して製造されたか、単離されたか、又は分離されたバイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを準備すること；
（ｂ）脱重合物質又は試薬を準備すること；及び
（ｃ）バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーと、脱重合物質とを混合することにより、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを脱重合させること
を含み、
任意選択的に、脱重合物質又は試薬は、耐熱性細胞外ＰＨＡ解重合酵素を含む、
方法である。
（ａ）本明細書で提供される方法を使用して製造されたか、単離されたか、又は分離されたバイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを準備すること；
（ｂ）脱重合物質又は試薬を準備すること；及び
（ｃ）バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーと、脱重合物質とを混合することにより、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを脱重合させること
を含み、
任意選択的に、脱重合物質又は試薬は、耐熱性細胞外ＰＨＡ解重合酵素を含む、
方法である。
【0016】
他の実施形態では、提供されるのは、生体適合性製品、生物活性ナノビーズ、生分解性製品、使い捨て製品、若しくは再生可能製品、サーモプラスト、エラストマー製品若しくはポリマー前駆体、コーティング、ホイル、おむつ、廃棄物バッグ、タイヤ、パッケージ、シングルユース物品、タンパク質精製マトリックス、インプラント部品、骨代用品、徐放性薬物、又は肥料、又は農薬担体を製造する方法であって、本明細書で提供される方法により製造されたバイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマー、又はこれらの単量体の使用を含み、任意選択的に、生分解性製品、使い捨て製品、又は再生可能製品は、マルチドーズシリンジ、検体チューブ、メス、ランセット、シャープスコンテナ、又は吸引物である、方法である。
【0017】
他の実施形態では、本明細書で提供される製造品、方法、及び／又は細菌混合物若しくは共同体を使用して製造されたＰＨＡを、バイオ燃料添加剤として使用し得るエチル ３－エトキシブチレート（ＥＥＢ）（ＥＥＢを、エタノール及びＰＨＡから製造し得る）の製造で使用する。
【0018】
本発明の１つ又は複数の例示的な実施形態の詳細は、添付の図面及び下記の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、下記の説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかであるだろう。
【0019】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許、特許出願は、全ての目的のために、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【0020】
図面の説明
本明細書に記載されている図面は、本明細書で提供される例示的な実施形態を示しており、特許請求の範囲に包含されている本発明の範囲を限定することは意図されていない。
本明細書に記載されている図面は、本明細書で提供される例示的な実施形態を示しており、特許請求の範囲に包含されている本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】ＰＨＡ軽減のためのメタン資化性細菌の選択、増殖、及びキャラクタライズのための例示的な方法を模式的に示す。
【図2A】メタン資化性細菌の増殖及びＰＨＡの蓄積を示しており、下記の実施例１でさらに論じる２Ｌ又は４Ｌのバイオリアクタ培養物中でのメタン資化性培養物の増殖を示すグラフである。
【図2B】メタン資化性細菌の増殖及びＰＨＡの蓄積を示しており、下記の実施例１でさらに論じるＰＨＡ調製を模式的に示す。
【図3】下記の実施例１でさらに論じる３－ヒドロキシブチレート標準物質（sigma）、並びにメタン資化性株ＡＭ１、ＯＢＢＰ、及びＲ２４Ｗから抽出されたＰＨＡ調製物のＧＣ／ＭＳクロマトグラムの画像を示す。
【図4A】メタン資化性株及びメチル資化性株により産生された３－ヒドロキシブチレート及びＰＨＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの画像を示しており、下記の実施例１でさらに論じる３－ヒドロキシブチレートの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの画像を示す。
【図4B】メタン資化性株及びメチル資化性株により産生された３－ヒドロキシブチレート及びＰＨＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの画像を示しており、下記の実施例１でさらに論じるＲ２４－共同体（Ｂ）により産生されたＰＨＡを示す。
【図5A】Ｇｆｐタンパク質（左側）又はＲｆｐタンパク質（右が）を発現する寒天培養プレート上で増殖したメタン資化性株及びメチル資化性株を示しており、下記の実施例１でさらに論じるＳＭ２．２Ｗ株を示す。
【図5B】Ｇｆｐタンパク質（左側）又はＲｆｐタンパク質（右が）を発現する寒天培養プレート上で増殖したメタン資化性株及びメチル資化性株を示しており、下記の実施例１でさらに論じるＯＢＢＰ株を示す。
【図5C】Ｇｆｐタンパク質（左側）又はＲｆｐタンパク質（右が）を発現する寒天培養プレート上で増殖したメタン資化性株及びメチル資化性株を示しており、下記の実施例１でさらに論じる下記の実施例１でさらに論じるＲ２４Ｗ株を示す。
【発明を実施するための形態】
【0022】
様々な図面における同様の参照記号は、同様の要素を示す。
【0023】
詳細な説明
他の実施形態では、提供されるのは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生（任意選択的なポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）産生）メタン資化性細菌の混合物又は共同体、並びにこれを使用する方法（例えば、ＰＨＢ等のＰＨＡを含むバイオポリマー、再生可能ポリマー、及び生分解性ポリマーを製造する方法）である。
他の実施形態では、提供されるのは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生（任意選択的なポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）産生）メタン資化性細菌の混合物又は共同体、並びにこれを使用する方法（例えば、ＰＨＢ等のＰＨＡを含むバイオポリマー、再生可能ポリマー、及び生分解性ポリマーを製造する方法）である。
【0024】
他の実施形態では、本明細書で提供される製品（例えば、本明細書で提供されるＰＨＡ産生メタン資化性細菌の混合物又は共同体）は、アレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズとして製造されているか、又は構成されており、或いは、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズが、アレイ状に配置されている。他の実施形態では、任意選択的に好塩性メタン資化性細菌細胞を含む、生きている活性メタン捕捉性生物試薬（living, active methane-capturing bioagent）（例えば、本明細書で提供されるＰＨＡ産生メタン資化性細菌の混合物又は共同体）は、アレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズ、又はナノビーズ、又は等価物中に及び／又は上に含まれているか、又はこれら中に及び／又は上に（直接的に若しくは間接的に、共有結合的に若しくは非共有結合的に）固定されている。
【0025】
他の実施形態では、任意選択的に好塩性メタン資化性細菌細胞を含む、生きている活性メタン捕捉性生物試薬（例えば、本明細書で提供されるＰＨＡ産生メタン資化性細菌の混合物又は共同体）は、反応容器又はバイオリアクタ中に及び／又は上に含まれているか、又はこれら中に及び／又は上に（直接的に若しくは間接的に、共有結合的に若しくは非共有結合的に）固定されている。
【0026】
他の実施形態では、本明細書で提供されるＰＨＡ産生メタン資化性細菌の混合物又は共同体（例えば、メタン捕捉性生物試薬（メタン資化性の細菌、膜、又は酵素、例えば、好塩性メタン資化性細菌）は、結晶ゲルマトリックス、ナノシェル、ナノ粒子、又は等価物中に封入されているか、又はこれら中に若しくは上に固定されている。他の実施形態では、本明細書で提供されるＰＨＡ産生メタン資化性細菌の混合物又は共同体は、ポリマー、コロイド粒子シェル、寒天若しくはゲル（例えばハイドロゲル）、又は等価物中に及び／又は上にカプセル化されているか、又は封入されているか、又は固定されている。他の実施形態では、本明細書で提供されるＰＨＡ産生メタン資化性細菌の混合物又は共同体がカプセル化される構造体（例えば、ナノシェル又はナノ粒子）は、アレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズ、又は等価物上に固定されている。
【0027】
他の実施形態では、ナノシェルは、中空シリカナノシェル等の酸化物ナノシェルであるか、又は金及び銀のナノシェル等の金属ナノシェルである。他の実施形態では、ナノ粒子は、ＣｄＳ又はＺｎＴｅでコーティングされたＣｄＳｅナノ粒子と、ＣｄＳｅでコーティングされたＣｄＴｅナノ粒子とを含む。他の実施形態では、金ナノシェル（ＡｕＮＳｈｓ）は、薄い金金属シェルでコーティングされたシリカコアを含む。
【0028】
他の実施形態では、マイクロ粒子又はナノ粒子は、プラズモン粒子を含むか、又はプラズモン粒子として製造されており、且つマイクロ粒子又はナノ粒子は、下記を含む外部コーティングを含み得るか、又は有し得る：グラフェン、酸化グラフェン、還元型酸化グラフェン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、シリカ、酸化シリカ、ポリビニルピロリドン、ポリスチレン、シリカ、銀、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、クエン酸塩、リポ酸、短鎖ポリエチレンイミン（ＰＩ）、分岐型ポリエチレンイミン、還元型酸化グラフェン、タンパク質、ペプチド、グリコサミノグリカン、又はこれらの任意の組み合わせ。ナノ粒子、結晶ゲルマトリックス、又はナノシェルを、例えば米国特許第９，９９１，４５８号で説明されている任意の方法により製造し得る。
【0029】
他の実施形態では、アレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズは、それ自体が、シート、マット、メッシュ、カートリッジ、又はアレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズを支持する任意の形態の二次構造若しくは三次構造、又は本明細書で提供されるＰＨＡ産生メタン資化性細菌の固定された混合物若しくは共同体に含まれているか、又はこれらとして製作されている。
【0030】
他の実施形態では、アレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズ、又はシート、メッシュ、マット、カートリッジ、又は任意の形態の二次構造は、上部構造又は装置（例えば、バイオリアクタ）に挿入可能なモジュラーユニット又はカートリッジに加工されており、例えば、モジュラーユニット又はカートリッジを、例えば古いユニットを新規の新たなユニット又はカートリッジと置き換えるために、上部構造又は装置中に又はこれら上で予め形成された容器を交換するか又はこの容器に挿入するように製作し得る。他の実施形態では、モジュラーユニット若しくはカートリッジ、又は同等の構造は、ガスの入出力開口部又はオリフィスを有するように製作されており、例えば、メタン含有空気等のガスは、空気又はガスが、モジュラーユニット、カートリッジ、又は同等の構造を通過するように、加圧下で、モジュラーユニット、カートリッジ、又は同等の構造に供給される。
【0031】
他の実施形態では、本明細書で提供されるＰＨＡ産生メタン資化性細菌の固定された活性混合物又は共同体として構成されたアレイ、マクロ粒子若しくはナノ粒子、マイクロファイバ、マイクロチューブ、マイクロリボン、及び／又はマイクロビーズは、メタンを捕捉するための、安価であり、単純であり、スケーラブルな、カートリッジ様のシステムである。
【0032】
他の実施形態では、本明細書で提供されるか又は本明細書で提供される製品中で使用されるメタン資化性細菌の混合物又は共同体は、メチロミクロビウム（Methylomicrobium）属（メチロツビミクロビウム（Methylotuvimicrobium）属、メチロバクター（Methylobacter）属としても既知である）の細菌を含み、例えば、Ｍ．ブリアテンセス（M. buryatenses）、Ｍ．ペラギクム（M. pelagicum）、及び／又はＭ．アルカリフィルム（M. alcaliphilum）を含み得、任意選択的に、Ｍ．アルカリフィルム（M. alcaliphilum）は、種／株Ｍ．アルカリフィルム（M. alcaliphilum）種２０Ｚ又はＭ．アルカリフィルム（M. alcaliphilum）２０ＺＲを含み得、任意選択的に、Ｍ．ブリアテンセス（M. buryatenses）は、種／株Ｍ．ブリアテンセス（M. buryatenses）５Ｇを含み得る。
【0033】
バイオリアクタ
他の実施形態では、提供されるのは、本明細書で提供される細菌の非天然混合物を培養する（cultivating）か又は培養する（culturing）ためのバイオリアクタ、又はバイオポリマー、再生可能ポリマー、及び生分解性ポリマー（例えば、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）等のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ））、及びコポリマーを製造するためのバイオリアクタを含むか又はこのバイオリアクタとして製作された製品である。
他の実施形態では、提供されるのは、本明細書で提供される細菌の非天然混合物を培養する（cultivating）か又は培養する（culturing）ためのバイオリアクタ、又はバイオポリマー、再生可能ポリマー、及び生分解性ポリマー（例えば、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）等のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ））、及びコポリマーを製造するためのバイオリアクタを含むか又はこのバイオリアクタとして製作された製品である。
【0034】
他の実施形態では、例えば、マイクロ流体技術をベースとするバイオリアクタを説明する米国特許第１０，９２６，２６１号；内蔵ガス分配器を有するバイオリアクタを説明する米国特許第１０，８８３，０７４号；モジュラー管状バイオリアクタシステムを説明する米国特許第１０，８７６，０８７号；ガス供給システムを有するバイオリアクタを説明する米国特許第１０，７３１，１１７号；若しくはバイオリアクタの製造及び使用を説明する米国特許第１０，５４４，３８７号、同第１０，４００，２０７号、同第１０，３３５，７５１号、及び同第１０，２８０，３９３号；及び／又はマイクロ流体チャネルの配列を有するマクロサイズのマイクロバイオリアクタを説明する米国特許出願公開第２０２１００７８００５Ａ１号；充填層バイオリアクタシステムを説明する米国特許出願公開第２０２１００２４８６８Ａ１号；又は少なくとも２つのカセットを含む流体ポンプ及びバイオリアクタシステムを説明する米国特許出願公開第２０２１０００９９３６Ａ１号で説明されているように、任意の製品、バイオリアクタ、又はバイオリアクタ構成要素を使用して、本明細書で提供される製品又は方法を実行し得る。
【0035】
他の実施形態では、フェドバッチ（又はフェドバッチ発酵、例えば、Nygaard et al, Heliyon, Vol 7(1), Jan 2021, e05979で説明されている）、連続培養、及び／又は半連続（サイクル）バイオリアクタ及び培養器、エアリフト反応器、連続撹拌タンク反応器（ＣＳＴＲ））並びに関連する操作戦略が使用される。連続培養（例えば、Blunt et al. Polymers 2018, 10(11), 1197で説明されている）では、新鮮な培地がバイオリアクタに連続的に供給され、培養物の一部が同一の速度：希釈速度で除去される。反応器内部の条件（基質、細胞、生成物の濃度）は定常状態で保持され、そのため、連続培養は、「化学的環境が静止している」の省略であるケモスタットと称されることが多い。定常状態の動作には、多くの利点がある。これは、一定の増殖速度に起因して、バイオプロセス生理学を研究し且つ制御戦略を実行するための魅力的なプラットフォームであり、定常状態の動作に達すると、操作及び維持の手間が軽減される。定常状態の動作はまた、非常に動的な条件下での経時的な増速速度の予測を伴うフェドバッチ戦略の最適制御の大きな課題も回避する。
【0036】
バッチプロセス及びフェドバッチプロセスを組み合わせて、それぞれのプロセスにより個々に得られる低ＰＨＡ含有量を相殺し得る。この戦略では、プロセスは、２つの段階に分けられており、第１の段階では、所望のバイオマスが達成され且つＰＨＡ蓄積が開始されるまで、バッチモードで微生物を増殖させる。第２の段階では、発酵がフェドバッチに切り替えられ、通常では、１種又は複数種の必須栄養素（最も一般的なものは窒素である）が、限られた濃度で維持され、炭素源が反応器に連続的に供給されて、細胞中でＰＨＡがさらに産生されて蓄積される。
【0037】
連続培養又はケモスタットは、ＰＨＡ産生の代替操作戦略である。この方法では、培養ブロスが、滅菌培地に連続的に交換される。ケモスタット培養では、炭素源が連続的に且つ過剰に供給され、１種又は複数種の栄養素（例えば、リン又は窒素）が制限された状態に保たれる。ケモスタットは、希釈率を調整することにより特定の増殖速度を維持し得ることから、制御しやすい。従って、適切な増殖条件下では、連続発酵により、最高のＰＨＡ産生レベルが得られる可能性がある。
【0038】
配列同一性による１６Ｓリボソーム核酸配列の同定
他の実施形態では、提供されるのは、本明細書に記載されている特定の例示的な１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列に対する少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、若しくは９８％の、若しくはより高い配列同一性、又は完全な（１００％の）配列同一性を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有することにより同定される細菌の非天然混合物及び細菌の共同体である。
他の実施形態では、提供されるのは、本明細書に記載されている特定の例示的な１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列に対する少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、若しくは９８％の、若しくはより高い配列同一性、又は完全な（１００％の）配列同一性を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有することにより同定される細菌の非天然混合物及び細菌の共同体である。
【0039】
他の実施形態では、基準の核酸配列又はポリペプチド配列に関する「核酸又はアミノ酸の配列同一性のパーセント（％）」は、配列をアラインさせ、配列同一性の最大パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入した後に、且つ配列同一性の一部としてのあらゆる保存的置換を考慮しない、核酸配列中の核酸又はアミノ酸残基と同一である、候補配列中の核酸残基の割合と定義される。核酸配列同一性のパーセントを決定するためのアラインメントを、例えば、GAP（商標）（Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.）（例えば、Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984)を参照されたい）、BLASTP（商標）、BLASTN（商標）、BLAST（商標）、BLAST-2（商標）、WU-BLAST2/BLAST v2.0（例えば、Altschul et al. (1996) Methods Enzymol. 266, 460-480を参照されたい）、FASTA（商標）（例えば、Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-410を参照されたい）、ALIGN（商標）（Genentech）、MEGALIGN（商標）（DNASTAR）ソフトウェア、又はSmith-Watermanアルゴリズム若しくはNeedleman-Wunschアルゴリズムを実行するソフトウェア等の一般に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の技術範囲内である様々な方法で達成し得る。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするのに適したパラメータを決定し得る。
【0040】
他の実施形態では、アライン方法は、（ｉ）各残基に重み付け相同性値を割り当てるスコアリングマトリックス（例えば、BLOSSUM 62（商標）又はPAM 120（商標））、及び（ｉｉ）高度に反復した配列を認識して算出から排除するフィルタリングプログラム（例えば、SEG（商標）又はXNU（商標））を採用するBLAST（商標）解析の使用を含む。他の実施形態では、アライン方法は、フィルタリング設定がｂｌａｓｔａｌｌ－ｐ ｂｌａｓｔｐ－ｄ ”ｎｒ ｐａｔａａ” －Ｆ Ｆに設定されており、且つ他のオプションがデフォルトに設定されているBLASTバージョン2.2.2アルゴリズムを採用するBLAST（商標）解析の使用を含む。
【0041】
他の実施形態では、核酸又は２つのアミノ酸配列をアラインするためのアラインメントスキームでは、２つの配列の短い領域のみが一致する場合があり、このアラインされた小さい領域は、２つの完全長配列間に有意な関係性がないにもかかわらず、非常に高い配列同一性を有する場合がある。そのため、他の実施形態では、例示的なアラインメント方法は、GAPプログラムの使用を含み、このプログラムにより、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続したアミノ酸に及びアラインメントを得ることができる。例えば、コンピュータアルゴリズムGAP（商標）を使用して、配列同一性のパーセントを決定するために２つのポリペプチドをアラインさせて、それぞれのアミノ酸を最適に一致させる（アルゴリズムにより決定される「一致したスパン」）。ある特定の実施形態では、ギャップオープニングペナルティ（平均対角の３倍と算出され；「平均対角」は、使用される比較マトリックスの対角の平均であり；「対角」とは、特定の比較マトリックスにより各完全核酸又はアミノ酸一致に割り当てられるスコア又は数のことである）、及びギャップ伸長ペナルティ（通常は、ギャップオープニングペナルティの１／１０倍である）、並びにPAM 250（商標）又はBLOSUM 62（商標）等の比較マトリックスが、アルゴリズムと併用される。他の実施形態では、標準的な比較マトリックス（例えば、PAM 250比較マトリックスに関するDayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978)；BLOSUM 62（商標）比較マトリックスに関するHenikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992)を参照されたい）も、このアルゴリズムにより使用される。他の実施形態では、核酸又はポリペプチドの配列比較のためのパラメータは、下記を含む：アルゴリズム：Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970)；比較マトリックス：Henikoff et al.（上記参照）(1992)のBLOSUM 62（商標）；ギャップペナルティ：１２；ギャップ長ペナルティ：４；類似性の閾値：０。他の実施形態では、GAP（商標）プログラムが、上記のパラメータと共に使用される。ある特定の実施形態では、上述のパラメータは、GAP（商標）アルゴリズムを使用する核酸又はポリペプチドの比較のためのデフォルトパラメータである（エンドギャップに関するペナルティはない）。
【0042】
遺伝子操作
他の実施形態では、提供されるのは、例えば本明細書で提供される混合物又は共同体での使用のための遺伝子操作された細菌（又は複数の細菌）であり、遺伝子操作された細菌は、バイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマー、又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の合成に関与する酵素をコードする少なくとも１種の異種核酸を中に含んでいる。
他の実施形態では、提供されるのは、例えば本明細書で提供される混合物又は共同体での使用のための遺伝子操作された細菌（又は複数の細菌）であり、遺伝子操作された細菌は、バイオポリマー、再生可能ポリマー、若しくは生分解性ポリマー、又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の合成に関与する酵素をコードする少なくとも１種の異種核酸を中に含んでいる。
【0043】
日常的な遺伝子操作。本明細書で提供される混合物若しくは共同体で使用されるか又は本明細書で提供される方法を実施するために使用される細菌を、任意の既知のプロトコル又は手順を使用して遺伝子操作し得る。
【0044】
例えば、細菌（例えば、メタン資化性株からの細菌）由来の核酸又はＤＮＡを、標準的なフェノール：クロロホルム法により単離し得る。DNEASY PLANT MINI KIT（商標）（Qiagen）又はULTRACLEAN（登録商標）MICROBIAL DNA ISOLATION KIT（商標）（MoBio, USA）をまた、例えば日常的な核酸配列決定又は核酸増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））分析又は検査での使用のための迅速な抽出にも使用し得るか、又は応用し得る。
【0045】
遺伝的取り扱いやすさの評価及び操作。メチル資化性培養物及びメタン資化性培養物の様々な群での使用のために既に開発されている多用途の広宿主域（ＢＨＲ）及びプロモーター－プローブベクター（例えば、Marx, et al Microbiology 147, 2065-2075; Ojala DS, et al Methods Enzymol. 495: 99-118；Puri AW, et al Appl Environ Microbiol. 81(5): 1775-81；Hamilton R, et al (2022) C1-proteins prospect for production of industrial proteins and protein-based materials from methane, In Algal Biorefineries and the Circular Bioeconomy, Ed. Mehariya S, et al, Taylor & Francis/CRCで説明されている）を、本明細書で提供される遺伝子操作された細菌を製造するために使用し得るか、又は本明細書で提供される方法で使用し得る。
【0046】
例えば、広宿主域（ＢＨＲ）ベクター（例えば、クローニングベクターｐＣＭ１３２、ｐＭＫ１０、及びｐＡＷＰ８９（例えば、Marx, et al Microbiology 147, 2065-2075；Ojala DS, et al Methods Enzymol. 495: 99-118；Puri AW, et al Appl Environ Microbiol. 81(5): 1775-81を参照されたい））の使用を含む、ＰＨＡ産生メタン資化性細菌及び水素資化性細菌（hydrogenotroph）を、遺伝子操作により産生するか又は増強するための遺伝子ツールとして使用し得るベクターを、試験した。ドナー株として大腸菌（E. coli）（例えば、大腸菌（E. coli）Ｓ１７－１）を使用するコンジュゲーション、又はエレクトロポレーションにより、プラスミドＤＮＡを導入し得る。このドナー株を、コンジュゲーションに適した抗生物質が補充されたＬＢ寒天培地上で増殖させ得る。Ｐ０％寒天培地上で増殖させたレシピエント株を、１：１のドナー：レシピエント比でドナーと混合して、交配プレート（５％ 栄養ブロスが補充されたＰ０％培地）上に蒔くことができる。プレートを、２４～４８時間にわたりメタン：空気雰囲気（２５：７５）下で３０℃にてインキュベートし得る。次いで、細胞を、交配培地から選択培地（抗生物質（例えば、１００ｕｇ／ｍｌ カナマイシン、３０ｕｇ／ｍｌ ゲンタマイシン）が補充されたＰ０％培地）に移し得る。カナマイシン耐性クローンを、Ｒ２４Ｗ－Ｍ、Ｒ２４Ｙ－Ｈ、及びＳＭ２．２Ｗを含む、試験した全ての株で生成し得、このことは、効率的なプラスミド導入を示す。レポーターとして蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））を使用して、異種遺伝子発現の成功を評価し得る。ＯＢＢＰ、ＬＷ４、Ｒ２４Ｗ、Ｒ２４Ｙ、及びＳＭ２．２株に関して、緑色（ｐＭＧＫ１０－Ｐｔａｃ－ｇｆｐ）及び赤色（ＰＡＷＰ８９－Ｐ８９－ｒｆｐ）蛍光シグナルが観察された。
【0047】
任意の組み換えベースの戦略（例えば、ＳａｃＢ選択又はＣｒｅ－ｌｏｘリコンビナーゼと組み合わされた２段階対立遺伝子交換自殺ベクター交換を使用する）、及びＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９戦略を、本明細書で提供される共同体又は細菌混合物の一方又は両方のメンバーの代謝工学に適用し得、これにより、非標準の微生物工場のエンジニアリングに関連する技術的課題を大幅に低減し得るか、又は排除し得る。
【0048】
下記の戦略を適用して、ＰＨＡコポリマーの産生を改善し得る：
１．ＰＨＡコポリマー（即ち、ポリＰ３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）産生が可能な代謝形質を、１つのメンバーが４－ヒドロキシブチレート（４ＨＢ）の産生及び分泌が可能な共培養物で構築する。
２．対応する酵素の過剰発現及びグリオキシル酸塩シャントの同時発現を介してエチルマロニル経路への炭素流入を強化することにより、発酵経路（特に、プロピオン酸塩産生）を強化する。
３．ＩＩ型ｐｈａ合成の過剰発現によるＰＨＡの産生の強化（例えば、Chek, M.F., et al, Sci Rep 7, 5312 (2017). https://doi.org/10.1038/s41598-017-05509-4を参照されたい）。
１．ＰＨＡコポリマー（即ち、ポリＰ３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）産生が可能な代謝形質を、１つのメンバーが４－ヒドロキシブチレート（４ＨＢ）の産生及び分泌が可能な共培養物で構築する。
２．対応する酵素の過剰発現及びグリオキシル酸塩シャントの同時発現を介してエチルマロニル経路への炭素流入を強化することにより、発酵経路（特に、プロピオン酸塩産生）を強化する。
３．ＩＩ型ｐｈａ合成の過剰発現によるＰＨＡの産生の強化（例えば、Chek, M.F., et al, Sci Rep 7, 5312 (2017). https://doi.org/10.1038/s41598-017-05509-4を参照されたい）。
【0049】
スケールアップ。他の実施形態では、提供されるのは、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを製造する方法であって、任意選択的に、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を含み、任意選択的に、ＰＨＡは、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を含み、この方法は、本明細書に記載されている細菌の非天然混合物又は共同体を培養することを含む、方法である。この方法は、バイオポリマー、再生可能ポリマー、又は生分解性ポリマーを製造するための「スケールアップされた」プロセスを含み、任意のバイオリアクタ設計を、本明細書で提供される製品の構築で使用し得るか、又は本明細書で提供される（例えば、Strong, P.J., et al. Bioresour Technol 215, 314-323. 10.1016/j.biortech.2016.04.099；及びTikhomirova, T. S., et al. Biotechnol Adv 47: 107709で説明されている）方法を実行するために使用し得る。スケールアップ及び高密度発酵のプロセスを、例えばHamilton R, et al, in Algal Biorefineries及びthe Circular Bioeconomy. Ed. Mehariya S, et al Taylor & Francis/CRCで説明されている、単一細胞タンパク質産生用に既に開発された発酵技術（例えば、撹拌機発酵槽（小規模）、気泡及び気泡エアリフト発酵槽、ループ発酵槽、及びエネルギー効率がよい２段階ジェットストリームバイオリアクタ）を実行することにより達成し得る。プロセス最適化は、窒素、硫黄、又はリン酸塩の制限によりＰＨＡの蓄積を誘発し得る制御パラメータの成功利の特定に依存し得る。
【0050】
任意の数の異なる原材料を、ＰＨＡ産生の炭素源として使用し得、例えば、ＰＨＡ産生に使用される廃棄物を、下記の６つのカテゴリ：糖ベースの培地、デンプンベースの培地、セルロース系及びヘミセルロース系の培地、ホエイベースの培地、並びに油及びグリセロールベースの培地に分類し得る。産業廃棄物としての１つの安価な炭素源は、糖蜜であり、この糖蜜を、サトウキビ又はテンサイのいずれかから得ることができる。
【0051】
キット
提供されるのは、シート、マット、カートリッジ、又はアレイ、粒子、シート、マイクロファイバ、及び／又はマイクロビーズを支持するための任意の形態の二次構造若しくは三次構造のいずれかの形態として配置されているか又は製作されている、本明細書で提供される製品（例えば、本明細書で提供されるＰＨＡ産生メタン資化性細菌の固定された活性混合物又は共同体を含むアレイ、シート、マイクロファイバ、及び／又はマイクロビーズ、又は粒子として完全に組み立てられた製品）、又は固定された細菌（任意選択的に、ＰＨＡ産生メタン資化性細胞又は好塩性メタン資化性細胞を含む）を含むキットであって、シート、マット、カートリッジ、及び同類のものを、上部構造又は装置上で容易に置き換えられ得るか又は交換され得るモジュラーユニット等の三次構造へとさらに製作し得る、キットである。
提供されるのは、シート、マット、カートリッジ、又はアレイ、粒子、シート、マイクロファイバ、及び／又はマイクロビーズを支持するための任意の形態の二次構造若しくは三次構造のいずれかの形態として配置されているか又は製作されている、本明細書で提供される製品（例えば、本明細書で提供されるＰＨＡ産生メタン資化性細菌の固定された活性混合物又は共同体を含むアレイ、シート、マイクロファイバ、及び／又はマイクロビーズ、又は粒子として完全に組み立てられた製品）、又は固定された細菌（任意選択的に、ＰＨＡ産生メタン資化性細胞又は好塩性メタン資化性細胞を含む）を含むキットであって、シート、マット、カートリッジ、及び同類のものを、上部構造又は装置上で容易に置き換えられ得るか又は交換され得るモジュラーユニット等の三次構造へとさらに製作し得る、キットである。
【0052】
上記の態様及び実施形態はいずれも、要約、図面、及び／又は詳細な説明のセクションで開示されているあらゆる他の態様又は実施形態と組み合わせ得る。
【0053】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、別途文脈が明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。
【0054】
明記されていないか又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「又は」という用語は、包括的であり且つ「又は」及び「及び」の両方を包含すると理解される。
【0055】
明記されていないか又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当該技術分野での通常の許容範囲内（例えば、平均の２標準偏差以内）と理解される。約（「約」という用語の使用）は、記載値の２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内と理解され得る。別途文脈から明確でない限り、本明細書で提供される全ての数値は、「約」という用語で修飾される。
【0056】
明記されていないか又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「実質的に全て」、「の実質的に大部分」、「の実質的に全て」、又は「の大部分」という用語は、ある構成の基準量の少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％、又はより多くを包含する。
【0057】
本明細書で言及されている各特許、特許出願、刊行物、及び文書の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。上記特許、特許出願、刊行物、及び文書の引用は、上記の内のいずれかが適切な先行技術であることを認めるものではなく、また、これらの刊行物又は文書の内容又は日付についてのいかなる承認を構成するものでもない。これらの文書の参照による組み込みは、単独で、いずれかの文書の内容のいずれかの部分が、特許出願に関するあらゆる国又は地域の法定開示要件を満たすのに不可欠な資料であるとみなされるということ主張するか又は認めると解釈されるべきではない。それにも関わらず、審査当局又は裁判所により、特許請求された主題に不可欠であるとみなされる資料を提供するために、必要に応じて、そのような文書のいずれかに依拠する権利は留保される。
【0058】
本発明の基本的な態様から逸脱することなく、上述に変更を加え得る。本発明を、１つ又は複数の具体的な実施形態を参照して実質的に詳細に説明しているが、当業者は、本願で具体的に開示されている実施形態に変更を加え得、さらにはこれらの変更及び改善が本発明の範囲及び趣旨の範囲内であることを認識するであろう。本明細書で例示的に説明されている本発明を、本明細書で具体的に開示されていない任意の要素が存在しない場合にも好適に実施し得る。そのため、例えば、本明細書のいずれの場合においても、「含む」、「から本質的なる」、及び「からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかに置き換え得る。そのため、採用されている用語及び表現は、説明の用語として使用されており限定の用語として使用されるものではなく、示されており且つ説明されている特徴の等価物、又はその一部は除外されず、本発明の範囲内で様々な改変が可能であることが認識される。本発明の実施形態は、下記の特許請求の範囲に記載されている。
【実施例】
【0059】
実施例
実施例１：ポリヒドロキシアルカノエート産生メタン資化性細菌の単離
本実施例は、バイオポリマー、再生可能ポリマー、及び生分解性ポリマー（例えば、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）等のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ））を製造するために使用される新規のメタン資化性細菌の株の単離及びキャラクタライジングを説明する。
実施例１：ポリヒドロキシアルカノエート産生メタン資化性細菌の単離
本実施例は、バイオポリマー、再生可能ポリマー、及び生分解性ポリマー（例えば、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）等のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ））を製造するために使用される新規のメタン資化性細菌の株の単離及びキャラクタライジングを説明する。
【0060】
新規のメタン資化性細菌培養物の２種の株を単離した。新たに単離した培養物を、メタン資化性細菌の純粋な培養物の１４種の株と並行してスクリーニングした。これらの株を、バッチ式増殖速度論（倍加時間Ｔｄ、増殖速度－μ、及びバイオマス収量Ｙｇ／ｇＣＨ４）、ポリヒドロキシアルカノエート（又はＰＨＡ）産生、及び遺伝的取り扱いやすさの観点で比較した。小規模（５０～２５０ｍｌ）バッチ培養と、大規模（最大５Ｌ）バイオリアクタ培養との両方を実行した。試験した１５種の培養物の内、６種の培養物－メチロシスチス・パルブス（Methylocystis parvus）ＯＢＢＰ、メチロシスチス種（Methylocystis sp.）Ｒｏｃｋｗｅｌｌ（ＡＴＣＣ ４９２４２）、メチロサイナス種（Methylosinus sp.）ＰＷ１、メチロサイナス種（Methylosinus sp.）ＬＷ４、メチロシスチス種（Methylocystis sp.）ＳＭ２．２Ｗ、及びメタン資化性共同体Ｒ２４Ｗは、工業用途に適した増殖速度を示した。これらの内の４つ（ＯＢＢＰ、Ｒｏｃｋｗｅｌｌ、ＳＭ２．２、及びＲ２４Ｗ株）は、許容可能な増殖収量（０．５～１ｇ／ｇＣＨ４）を示した。株を、メタンを炭素源とする大型バイオリアクタ培養物（２～５Ｌ）で増殖させた。メチル資化性ＰＨＢ産生者のモデルであるメチロバクテリウム・エクストルクエンス（Methylobacterium extorquence）ＡＭ１株を、比較試験のために加えた。ＰＨＡ合成を、後期対数期（ＯＤ＝１０～１５）で採取した細胞サンプルで実行した。バイオマスを凍結乾燥させた。ＰＨＡを、標準的なクロロホルム抽出法を使用して抽出して精製した。ＰＨＡ収量を、重量で推定した（ｇ ＰＨＡ／ｇ 細胞乾燥重量、ＣＤＷ）。３種の株（ＯＢＢＰ、ＳＭ２．２Ｗ、及びＲ２４Ｗ）は、魅力的なＰＨＡ産生収量（１５ｗｔ／ｗｔ％超のＰＨＡ含有量）を示した。Ｒ２４ＷのＰＨＡ蓄積量は、他の微生物培養物と比べて２倍超高かった。これらの株から抽出されたＰＨＢポリマーを、ＤＬＳ／ＭＡＬＳ、ＧＣ／ＭＳ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる研究に供した。ＧＣ－ＭＳ及び１３Ｃ－ＮＭＲの両方のスペクトルが、３－ヒドロキシブチレートに典型的なシグネチャを示し、このことから、培養物中に、主要なポリマーとしてポリ－３－ヒドロキシブチレート（Ｐ３ＨＢ）が蓄積されたことが示唆された。ここで、合成されたポリマーの分子量を、光散乱アプローチを使用して評価した。広範囲の宿主発現系（ｐＭＫ１０、ｐＡＷＰ８９、及びＰＣＭ１３２）による遺伝学的研究を実行して、遺伝子操作に適した株を同定した。最初の試験から、ＯＢＢＰ、ＬＷ４、Ｒ２４Ｗ、Ｒ２４Ｙ、及びＳＭ２．２株が遺伝的に扱いやすいことが分かった。さらに、ｐＡＷＰ７８：Ｐｔａｃ－ＧＦＰ（例えば、Ojala DS, et al. (2011) Methods Enzymol. 495: 99-118；及びPuri AW, et al. (2015) Appl Environ Microbiol. 81(5): 1775-81を参照されたい）並びにｐＣＭ１３２：ＲＦＰに基づく広宿主域（ＢＨＲ）ベクターを、Ｒ２４Ｗ及びＲ２４Ｙ共培養の両方のパートナーに組み入れ、このことから、この共培養の同時の遺伝子改変の可能性が示された。増殖速度及び収率、ＰＨＢ蓄積量、並びに遺伝的取り扱いやすさに関する実験的証拠に基づいて、ＯＢＢＰ、Ｒ２４Ｗ、及びＳＭ２．２培養物を、次の開発段階に選択した。
【0061】
株の選択。表１に示すように、初期試験研究用に、メタン資化性細菌の１６種の株、及びメチル資化性細菌の１種の株を選択した。
【0062】
【表1】
【0063】
選択した培養物を、下記の４つの主要なカテゴリに分類し得る：（１）全てにおいてＣ１－基質（メタン又はメタノール）を利用してＰＨＢを産生する能力が実証されている５種の株の微生物培養物を含むモデル培養物；（２）系統発生学的特徴（ＩＩ型メタン資化性細菌）及び遺伝学的特徴（ＰＨＢ生合成遺伝子）に基づいてＰＨＢを産生すると予測される微生物株；（３）アルファプロテオバクテリア（Alphaproteobacterial）メタン資化性細菌（ＩＩ型）に属しており且つＰＨＢを産生すると予測される新規の微生物単離物；並びに（４）新規の単離微生物培養物。
【0064】
圃場が一定期間にわたり浸水した場合に、作物生産中にこの圃場から得た土壌サンプルを使用して、富化及び純粋培養物単離試験を実行した。この富化培養物試験により、２種のさらなる微生物共同体（Ｒ２４Ｗ及びＲ２４Ｙ）が得られ、これらをスクリーニングに含めた。
【0065】
メチロカルダム（Methylocaldum）種０９１７（ガンマプロテオバクテリウム（Gammaproteobacterium）、Ｘ型メタン資化性細菌）を除いて、この試験用に選択した全ての純粋なメタン資化性細菌株は、アルファプロテオバクテリア（Alphaproteobacteria）（ＩＩ型）であった。ほとんどのＩＩ型メタン資化性細菌は、炭素貯蔵化合物であるＰＨＡを蓄積する（１～２）。メタン資化性細菌は、最大５１％のＰＨＡを蓄積し得、メタンからのＰＨＡの産生の有望な微生物プラットフォームとして説明されていることが多い（３）。メタン資化性細菌共同体Ｒ２４Ｗ及びＲ２４Ｙは、メチロシスチス（Methylocystis）種（アルファプロテオバクテリア（Alphaproteobacterial）メタン資化性細菌）及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）（ベータプロテオバクテリア（Betaproteobacterial）メタン資化性細菌）という２種の微生物種の安定した共培養物を表す。メチロシスチス（Methylocystic）種Ｒ２４Ｗ／Ｒ２４Ｙ及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）種Ｒ２４Ｗ／Ｒ２４Ｙは両方とも、既知の微生物クレードとは遠縁の関係にすぎず、培養された純粋培養物と９１％超の１６Ｓ ｒＲＮＡ同一性を共有していた。メチロシスチス（Methylocystic）及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）は両方とも、ＰＨＡを産生することが知られている。
【0066】
メチロバクテリウム・エキストロクエンス(Methylobacterium extorquens)ＡＭ１培養物も、ＰＨＢ抽出／分析試験に含めた。ＡＭ１株は、単一炭素基質からのＰＨＢ生合成を理解するためのモデル系として使用されている（４～５）。ベンチスケールからパイロットスケールまでの株中でのＰＨＢ産生に関して、多くの情報が入手可能である（６～８）。この株は、４０％のＰＨＢを蓄積することが報告されている。メチロバクテリウム・エキストロクエンス(Methylobacterium extorquens)ＡＭ１を、主に比較試験に使用した。
【0067】
富化培養。土壌サンプル（５ｇ）を、硝酸塩生理食塩培地（Ｐ０％） ２５ｍｌが入っており且つメタン ５ｍｌが補充されている１２５ｍｌのフラスコ中に接種した。このフラスコを、振盪しつつ（１２５ｒ．ｐ．ｍ．（ＲＰＭ））室温で２日にわたりインキュベートした。その後の富化では、先の富化培養物 １０ｍｌを、同一の培地で１：１０に希釈し（合計２５ｍｌ）、メタン ２０ｍｌを補充した。フラスコを、１週間にわたり振盪しつつ室温でインキュベートした。細胞培養物を、少なくともさらに２回移した後に、固体培地上に蒔いた。
【0068】
最終富化培養物を固体培地（Ｐ０％及び１．２％のＢａｃｔｏ寒天）上に蒔き、メタン：空気雰囲気（２０：８０）下で１週間にわたり室温にてインキュベートした後に、Ｒ２４Ｗ株及びＲ２４Ｙ株を、個々のコロニー（ＲＺ２４Ｗの場合は白色の外観、及びＲ２４Ｙの場合は黄色のコロニー）として得た。各株を、寒天プレート上で３回画線することにより、さらに精製した。得られた２つの系統に関してコロニーの外観は異なるが、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定分析に基づいて、両方の培養物とも、２つの微生物種メチロシスチス（Methylocystic）及びハイドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）からなっていた。これらの株は、安定した共培養物（共同体）を形成した。
【0069】
株の培養。全ての株を、下記（ｇ／Ｌ）：ＫＮＯ３，１、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．２、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，０．０２、微量元素溶液、１ｍｌ／Ｌを含み且つ５０ｍｌ／Ｌのリン酸塩溶液（ＫＨ２ＰＯ４ ５．４４ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ５．６８ｇ）が補充されている硝酸塩ミネラル培地（Ｐ０％）中で増殖させた。微量元素溶液（１Ｌ）は、Ｎａ２－ＥＤＴＡ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．０ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．３ｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ０．０３ｇ、Ｈ３ＢＯ３ ０．０３ｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １．２ｇ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０５ｇ、Ｎａ２Ｏ４Ｗ×２Ｈ２Ｏ ０．３ｇ、及びＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０５ｇを含んでいた。
【0070】
全ての株（非メタン資化性メチロトローフであるＡＭ１株を除く）を、最初に、小規模バッチ培養物（２５０ｍｌのボトル及び５０ｍｌの増殖培地）を使用して、増殖及びメタン変換速度論に関して試験した。このボトルを、ゴム栓及びアルミニウムキャップで密封し、２００ｍＬのヘッドスペースに、メタン ５０ｍＬを入れた。ボトルを、１～４日にわたり３０℃で２５０ＲＰＭにて振盪した。培養物をまた、バッチ培養物としても増殖させた（３重）。全ての場合において、ヘッドスペース中のＣＨ４、Ｏ２、及びＣＯ２の濃度を測定した。データを解析して、収量（Ｙ）、増殖率、及びＯ２／基質比を評価した（表２）。
【0071】
【表2】
【0072】
メタン資化性培養物の倍加時間は、６．７時間（ｈ）～２７ｈの範囲であった。バイオマス収量も、消費されたメタン １グラム（ｇ）当たり０．３ｇ～１ｇと大きく変動した。酸素：メタン消費量ノデータは、１．３～１．７の典型的な範囲で低下した。バッチ培養物での初期性能に基づいて、メチロシスチス・パルブス（Methylocystis parvus）ＯＢＢＰ株（Ｔｄ＝６．７、Ｙ＝１．３）、メチロシスチス種（Methylocystis sp.）ＡＴＣＣ ４９２４２株（Ｔｄ＝７．２、Ｙ＝０．８）、単離物Ｒ２４Ｗ株（Ｔｄ＝７．４、Ｙ＝０．６）、及びメチロシスチス（Methylocystis）種ＳＭ２．２Ｗ株（Ｙ＝７．１、Ｙ＝０．７）を、次のＰＨＡ合成評価段階用に選択した。
【0073】
２～５Ｌのバイオリアクタ培養物中での発酵。株を、炭素源としてメタンを使用して、増殖培地としてＰ０％を使用して、New Brunswick BioFlo(商標)(BioFlo(商標)) Fermenters (２Ｌ又は４Ｌ培養）中で増殖させた。培養物の増殖曲線を、図２Ａに示す。
【0074】
バイオリアクタの実行の概要を、表３に示す。細胞を、４７００ｒｐｍでの２０分にわたる４℃での遠心分離により回収し、リン酸生理食塩緩衝液（ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、及び１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で洗浄し、５０ｍｌのチューブに移した。細胞を、遠心分離で再度濃縮し、－２０℃で凍結させた後に凍結乾燥させた。湿潤細胞及び凍結乾燥細胞の重量を記録した。ＰＨＢ抽出前に、各株に関してＤＣＷ 少なくとも０．５ｇを得た。ＰＨＡ抽出を、確立されたプロトコル（１）を使用して３重で実行した。精製されたＰＨＡ調製物を再度秤量して、ＰＨＡ収量を推定した（表３）。培養物ＡＭ１、ＯＢＢＰ、ＳＭ２．２Ｗ、及びＲ２４Ｗの場合には、十分なＰＨＡ物質が得られた。共培養物Ｒ２４Ｗは、残りと比べて少なくとも２．５倍多くのＰＨＡを蓄積した（図２Ｂ）。
【0075】
【表3】
【0076】
抽出されたＰＨＢ調製物を、ＧＣ／ＭＳ及び１３Ｃ－ＮＭＲを使用するさらなるキャラクタリゼーションに供して、ポリマーの濃度及び分子組成を推定した。ポリマーの分子サイズを、光散乱プロトコルを使用して測定し得る。
【0077】
【0078】
代謝工学的アプローチは、ポリマー製造の強化を目標とする実証済みの戦略である。しかしながら、代謝工学の成功は、遺伝的取り扱いやすさ又は選択された生産者の遺伝子操作への適合性に依存する。概要が表１でまとめられた全ての株を、遺伝子発現、異種遺伝子の安定性、及び既に利用可能な遺伝子マーカー及びツールの適用性に関して試験した。本発明者らはまた、適用可能な様々な遺伝子マーカー（即ち、抗生物質耐性、及び蛍光タンパク質発現）も評価した。
【0079】
抗生物質耐性試験：ＰＨＡ産生培養の遺伝子操作に適した遺伝子マーカーを特定するために、抗生物質ディスクを使用した抗生物質耐性スクリーニングを実施した。全ての株を、スプレッディングにより固体Ｐ０％培地上に蒔き、次いで、その上に最大４枚の抗生物質ディスクを置いた。プレートを、１週間にわたりメタン：空気下でインキュベートし、次いで評価した。抗生物質耐性試験の結果を、表４に示す。
【0080】
【表4】
【0081】
日常的な遺伝子操作。メタン資化性株からのＤＮＡを、標準的なフェノール：クロロホルム法により単離し得た。DNEASY PLANT MINI KIT（登録商標）（Qiagen）又はULTRACLEAN（登録商標）MICROBIAL DNA ISOLATION KIT（登録商標）（MoBio，USA）も、日常的なＰＣＲ検査用の迅速抽出に適用した。
【0082】
遺伝的取り扱いやすさの評価。様々な多用途の広宿主域（ＢＨＲ）及びプロモーター－プローブベクターが、メチル資化性培養物及びメタン資化性培養物の様々な群での使用のために、既に開発されている（１０～１２）。ＰＨＡ産生メタン資化性細菌の遺伝学的ツールとしてのベクターの適用性を検証するために、クローニングベクターｐＣＭ１３２、ｐＭＫ１０、及びｐＡＷＰ８９（１０～１２）等の既に開発されたＨＨＲベクターを試験した。ドナー株として大腸菌（E. coli)Ｓ１７－１を使用するコンジュゲーションにより、プラスミドＤＮＡを、メタン資化性細菌中に導入した。ドナー株を、適切な抗生物質が補充されたＬＢ寒天培地上で増殖させ、Ｐ０％寒天培地で増殖させたレシピエント株を、１：１のドナー：レシピエント比で混合し、交配プレート（５％栄養ブイヨンが補充されたＰ０％培地）に蒔いた。プレートを、４８時間にわたりメタン：空気雰囲気（２５：７５）下で３０℃にてインキュベートし、次いで、細胞を、交配培地から選択プレート（１００ｕｇ／ｍｌ カナマイシンが補充されたＰ０％培地）に移した。効率的なプラスミド導入を示すＯＢＢＰ、ＬＷ４、Ｒ２４Ｗ、Ｒ２４Ｙ、及びＳＭ２．２Ｗ株に関して、カナマイシン耐性クローンを生成した。レポーターとして蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ））を使用して、異種遺伝子発現の成功を評価した。ＯＢＢＰ、ＬＷ４、Ｒ２４Ｗ、Ｒ２４Ｙ、及びＳＭ２．２株に関して、緑色（ｐＭＧＫ１０－Ｐｔａｃ－ｇｆｐ）及び赤色（ＰＡＷＰ８９－Ｐ８９－ｒｆｐ）蛍光シグナルが観察された（図５）。
【0083】
参考文献：
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【0084】
本発明の多くの実施形態が説明されている。それにもかかわらず、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更を行ない得ることが理解され得る。従って、他の実施形態は、下記の特許請求の範囲に含まれる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】