特表 2024-511524 遺伝子回路、ＲＮＡ送達システム及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-13

(54)【発明の名称】遺伝子回路、ＲＮＡ送達システム及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20240306BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240306BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240306BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240306BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240306BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240306BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240306BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240306BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240306BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240306BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20240306BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20240306BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240306BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 Z

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N15/88 Z

A61P35/00

A61P11/00

A61P43/00 105

A61P1/04

A61P3/04

A61P9/00

A61P3/10

A61P25/14

A61P25/16

A61P21/04

A61P25/28

A61P37/06

A61K31/7105

A61K31/713

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/761

A61K9/127

A61K9/51

C12N15/113 Z ZNA

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023560200

(86)(22)【出願日】2022-03-29

(85)【翻訳文提出日】2023-11-27

(86)【国際出願番号】 CN2022083591

(87)【国際公開番号】W WO2022206734

(87)【国際公開日】2022-10-06

(31)【優先権主張番号】202110336983.6

(32)【優先日】2021-03-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523368241

【氏名又は名称】ナンキン ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャン、チェンユー

(72)【発明者】

【氏名】チェン、シー

(72)【発明者】

【氏名】フー、ジェン

(72)【発明者】

【氏名】リー、ジン

(72)【発明者】

【氏名】チャン、シアン

(72)【発明者】

【氏名】チョウ、シンヤン

(72)【発明者】

【氏名】チャン、リー

(72)【発明者】

【氏名】ユウ、メンチャオ

(72)【発明者】

【氏名】グオ、ホンユアン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA65

4C076AA95

4C076BB01

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB27

4C076CC01

4C076CC07

4C076CC11

4C076CC15

4C076CC16

4C076CC21

4C076CC26

4C076CC27

4C076FF70

4C084AA13

4C084MA24

4C084MA38

4C084MA52

4C084MA56

4C084MA66

4C084NA13

4C084NA14

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4C084ZA16

4C084ZA36

4C084ZA59

4C084ZA68

4C084ZA70

4C084ZA94

4C084ZB08

4C084ZB21

4C084ZB26

4C084ZC35

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

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4C086MA05

4C086MA24

4C086MA38

4C086MA52

4C086MA56

4C086MA66

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZA16

4C086ZA36

4C086ZA59

4C086ZA68

4C086ZA70

4C086ZA94

4C086ZB08

4C086ZB21

4C086ZB26

4C086ZC35

4C087AA01

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4C087BC83

4C087CA12

4C087MA24

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4C087MA56

4C087MA66

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA16

4C087ZA36

4C087ZA59

4C087ZA68

4C087ZA70

4C087ZA94

4C087ZB08

4C087ZB21

4C087ZB26

4C087ZC35

(57)【要約】

本願は、遺伝子回路、ＲＮＡ送達システム及びその使用を提供する。遺伝子回路は、遺伝子発現を阻害することができる少なくとも１つのＲＮＡ断片及び／又はターゲティング機能を有するターゲティングタグを含み、遺伝子回路は、宿主の体内に送達され、宿主の器官組織内で富化し、自己集合して複合構造を形成し、ＲＮＡ断片が遺伝子の発現を阻害することによって、疾患を治療することができる。送達システムは、上記遺伝子回路と、遺伝子回路を宿主の器官組織に送達して富化させることができる送達ベクターと、を含む。本願による遺伝子回路は、ターゲティング機能と治療機能の両方を持ち、標的器官及び標的組織に効率的かつ正確に送達されて治療作用を発揮することができ、効率が高く、効果が良好である。本願によるＲＮＡ送達システムは、安全性及び信頼性が十分に検証されており、創薬性が良好であり、汎用性が高く、経済的効果や応用の将来性が極めて期待できる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

遺伝子回路であって、
遺伝子発現を阻害することができる少なくとも１つのＲＮＡ断片及び／又は少なくとも１つのターゲティング機能を有するターゲティングタグを含み、宿主の器官組織内で富化し自己集合して複合構造を形成することができる配列であり、
前記ＲＮＡ断片が遺伝子の発現を阻害することによって疾患を治療する、ことを特徴とする遺伝子回路。

【請求項2】

前記ＲＮＡ断片は医療的に意味があってかつ発現可能な１つ、２つ以上のＲＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ配列又はｍｉＲＮＡ配列である、ことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子回路。

【請求項3】

前記遺伝子回路はプロモーターをさらに含み、前記遺伝子回路の種類には、プロモーター－ＲＮＡ断片、プロモーター－ターゲティングタグ、プロモーター－ターゲティングタグ－ＲＮＡ断片が含まれており、
前記遺伝子回路は、遺伝子発現を阻害することができる少なくとも１つのＲＮＡ断片と、ターゲティング機能を有する少なくとも１つのターゲティングタグと、を含み、該ＲＮＡ断片及びターゲティングタグは、同一遺伝子回路又は異なる遺伝子回路にある、ことを特徴とする請求項２に記載の遺伝子回路。

【請求項4】

前記遺伝子回路は、遺伝子回路を正しい構造に折り畳んでかつ発現可能なフランキング配列、ループ配列、及び補償配列をさらに含み、前記フランキング配列は５’フランキング配列及び３’フランキング配列を含み、
前記遺伝子回路の種類には、５’－プロモーター－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列、５’－プロモーター－ターゲティングタグ、５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列が含まれている、ことを特徴とする請求項３に記載の遺伝子回路。

【請求項5】

前記５’フランキング配列は、ｇｇａｔｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｔｇｃｔｇａａｇｇｃｔｇｔａｔｇｃｔｇａａｔｔｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記ループ配列は、ｇｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔｇａｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記３’フランキング配列は、ａｃｃｇｇｔｃａｇｇａｃａｃａａｇｇｃｃｔｇｔｔａｃｔａｇｃａｃｔｃａｃａｔｇｇａａｃａａａｔｇｇｃｃｃａｇａｔｃｔｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～５位の塩基が欠失されている、ことを特徴とする請求項４に記載の遺伝子回路。

【請求項6】

前記ＲＮＡ配列の長さが１５～２５ヌクレオチドである、ことを特徴とする請求項２に記載の遺伝子回路。

【請求項7】

前記ＲＮＡ配列は、ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＫＲＡＳ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＶＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＴＯＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｂ７遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ－β１遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｋ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｌ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＨＬＡ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＧＤＦ１５遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ－２１のアンチセンス鎖、ｍｉＲＮＡ－２１４のアンチセンス鎖、ＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＨＴＴ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｌｒｒｋ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子のｓｉＲＮＡ、上記配列と８０％超の相同性を有するＲＮＡ配列、又は上記ＲＮＡ配列をコードする核酸分子から選択されるいずれか１つ又は複数である、ことを特徴とする請求項６に記載の遺伝子回路。

【請求項8】

前記ターゲティングタグは、ターゲティング機能を有するターゲティングペプチド又はターゲティングタンパク質から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子回路。

【請求項9】

前記ターゲティングペプチドは、ＲＶＧターゲティングペプチド、ＧＥ１１ターゲティングペプチド、ＰＴＰターゲティングペプチド、ＴＣＰ－１ターゲティングペプチド、ＭＳＰターゲティングペプチドを含み、
前記ターゲティングタンパク質は、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＰＴＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＭＳＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質を含む、ことを特徴とする請求項８に記載の遺伝子回路。

【請求項10】

前記ＲＮＡ断片は、ＲＮＡ配列本体と、ＲＮＡ配列本体をリボース修飾した修飾ＲＮＡ配列と、を含み、
好ましくは、前記リボース修飾は、２’フルオロピリミジン修飾である、ことを特徴とする請求項２に記載の遺伝子回路。

【請求項11】

前記器官組織は肝臓であり、前記複合構造はエクソソームである、ことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子回路。

【請求項12】

ＲＮＡ送達システムであって、
請求項１～１１のいずれか１項に記載の遺伝子回路と、前記遺伝子回路を宿主の器官組織に送達して富化させることができる送達ベクターと、を含む、ことを特徴とするＲＮＡ送達システム。

【請求項13】

前記遺伝子回路を含有する送達ベクターは、宿主の器官組織内で富化し、宿主の器官組織内で自己集合して複合構造を形成可能であり、前記ターゲティングタグは前記複合構造の表面に位置し、前記複合構造は、前記ターゲティングタグを介して標的組織を探索し結合し、標的組織に前記ＲＮＡ断片を送達する、ことを特徴とする請求項１２に記載のＲＮＡ送達システム。

【請求項14】

前記送達ベクターは１つ、２つ以上の前記遺伝子回路を担持しており、担持した前記遺伝子回路のすべてのうち、１つのＲＮＡ断片及び１つのターゲティングタグが少なくとも含まれている、ことを特徴とする請求項１２に記載のＲＮＡ送達システム。

【請求項15】

前記送達ベクターが２つ以上の前記遺伝子回路を担持している場合、隣接する前記遺伝子回路は配列１－３からなる配列で連結され、
配列１はＣＡＧＡＴＣであり、配列２は５８０塩基からなる配列であり、配列３はＴＧＧＡＴＣである、ことを特徴とする請求項１４に記載のＲＮＡ送達システム。

【請求項16】

前記送達ベクターが２つ以上の前記遺伝子回路を担持している場合、隣接する前記遺伝子回路は配列４又は配列４と８０％超の相同性を有する配列で連結され、
配列４はＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣである、ことを特徴とする請求項１５に記載のＲＮＡ送達システム。

【請求項17】

前記送達ベクターはウイルスベクター又は非ウイルスベクターであり、
前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターを含み、前記非ウイルスベクターは、プラスミドベクター、リポソームベクター、カチオン性ポリマーベクター、ナノ粒子ベクター、多機能エンベロープナノベクターである、ことを特徴とする請求項１２に記載のＲＮＡ送達システム。

【請求項18】

前記送達システムは、ヒトを含む哺乳動物で使用されるものである、ことを特徴とする請求項１２に記載のＲＮＡ送達システム。

【請求項19】

薬物における請求項１２～１８のいずれか１項に記載のＲＮＡ送達システムの使用。

【請求項20】

前記薬物の投与方式は、経口投与、吸入投与、皮下注射投与、筋肉注射投与、静脈注射投与を含む、ことを特徴とする請求項１９に記載の使用。

【請求項21】

前記薬物は、癌、肺線維症、結腸炎、肥満、肥満に起因する心血管疾患、２型糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、重症筋無力症、アルツハイマー病、又は移植片対宿主病を治療する薬物である、ことを特徴とする請求項１９に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、生物医学の技術分野に関し、特に遺伝子回路、ＲＮＡ送達システム及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）療法は、発明されて以来、人類の疾患を治療する有望な戦略であると考えられてきたが、臨床的には多くの問題に直面しており、この治療法の進歩は予想よりもはるかに遅れている。

【0003】

ＲＮＡは細胞外に長期間安定に存在することはできないと考えられており、ＲＮＡは細胞外に豊富に含まれるＲＮａｓｅに分解されて断片化されるため、ＲＮＡｉ療法の効果を発現するには、ＲＮＡを細胞外に安定に存在させ、特定の組織に標的に取り込める方法を見つけることが必要とされる。

【0004】

現在、ｓｉＲＮＡと関連する特許は多く、主に以下のいくつの方面に焦点を当てている。１．医学効果を有するｓｉＲＮＡを設計する。２．ｓｉＲＮＡを化学修飾し、生体内でのｓｉＲＮＡの安定性を高め、収率を高める。３．種々の人工ベクター（例えば、脂質ナノ粒子、カチオン性ポリマーやウイルス）の設計を改善し、ｓｉＲＮＡの生体内での伝達効率を向上させる。このうち第３方面についての特許が多く、その根本的な原因は、研究者らが、ｓｉＲＮＡを標的組織に安全に、精確に、効率的に送達するための適切なｓｉＲＮＡ伝達システムが不足しており、この問題がＲＮＡｉ療法を制約する核心的な問題になっていることを認識しているからである。

【0005】

公開番号ＣＮ１０８６２４５９０Ａの中国特許は、ＤＤＲ２遺伝子の発現を阻害できるｓｉＲＮＡを開示している。公開番号ＣＮ１０８６２４５９１Ａの中国特許は、ＡＲＰＣ４遺伝子をサイレンシングすることができるｓｉＲＮＡを開示しており、当該ｓｉＲＮＡにα－リン－セレン修飾を施している。公開番号ＣＮ１０８５４６７０２Ａの中国特許は、長鎖非コードＲＮＡ ＤＤＸ１１－ＡＳ１を標的とするｓｉＲＮＡを開示している。公開番号ＣＮ１０６１７７９９０Ａの中国特許は、多種の腫瘍治療に用いることができるｓｉＲＮＡ前駆体を開示している。これらの特許はすべて特定のｓｉＲＮＡを設計しており、遺伝子の変化によって引き起こされるある疾患を対象としている。

【0006】

公開番号ＣＮ１０８２５０２６７Ａの中国特許は、ポリペプチド、ポリペプチド－ｓｉＲＮＡ誘導共集合体を開示しており、ポリペプチドをｓｉＲＮＡのベクターとして使用している。公開番号ＣＮ１０８１１７５８５Ａの中国特許は、ｓｉＲＮＡを標的に導入して、乳癌細胞のアポトーシスを促進するポリペプチドを開示しており、同様にポリペプチドをｓｉＲＮＡのベクターとして使用している。公開番号ＣＮ１０８０９６５８３Ａの中国特許は、化学療法薬を含むと同時に乳癌治療効果を有するｓｉＲＮＡを搭載することができるナノ粒子ベクターを開示している。これらの特許はすべてｓｉＲＮＡベクターに関する発明創造であるが、その技術案には共通の特徴があり、それはベクター及びｓｉＲＮＡがいずれも生体外で予め集合されてから宿主の体内に導入されることである。実際には、現在設計されているほとんどの送達技術は上記と同様である。しかし、これらの人工的に合成された外因性送達システムは、宿主の循環システムによって容易に除去され、免疫原性反応を引き起こす可能性があり、さらには特定の細胞タイプと組織に有毒であるという共通の問題がある。

【0007】

本発明の研究チームは、内因性細胞がｍｉＲＮＡｓを選択的にエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）にカプセル化することができ、エクソソームはｍｉＲＮＡを受容体細胞に伝達し、その分泌されたｍｉＲＮＡが比較的低い濃度で、標的遺伝子の発現を強力にブロックすることができることを発見した。エクソソームは宿主免疫系と生体適合性であり、生体内でｍｉＲＮＡを生物学的バリアを越えて保護及び送達する先天的能力を有するため、ｓｉＲＮＡ送達に関連する問題を克服する潜在的な解決策となる。例えば、公開番号ＣＮ１１０６９９３８２Ａの中国特許は、ｓｉＲＮＡを送達するエクソソームの製造方法を開示しており、血漿からエクソソームを分離し、ｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによりエクソソームにカプセル化する技術を開示している。
しかし、生体外でエクソソームを分離又は製造するこのような技術は、細胞培養を通じて大量のエクソソームを取得し、さらにｓｉＲＮＡカプセル化のステップを追加する必要があり、これは、この製品を大規模に応用する臨床費用が非常に高くなり、一般の患者に負担することができず、さらに、エクソソームの複雑な製造・精製プロセスにより、ＧＭＰ規格に合致することがほぼ不可能となっている。

【0008】

これまで、エクソソームを有効成分とする薬物はＣＦＤＡの承認を受けたことがなく、エクソソーム製品の一貫性が保証されていないことが中心的な問題となっており、このような製品の医薬品製造許可が得られないことに直結している。この問題を解決できれば、ＲＮＡｉ療法を推進する上で非常に意義がある。

【0009】

したがって、安全で正確かつ効率的なｓｉＲＮＡ送達システムの開発は、ＲＮＡｉ治療の効果を高め、ＲＮＡｉ療法を推進するために不可欠なことである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

以上に鑑み、本願の実施例は、従来技術に存在する技術的欠陥を解決するために、遺伝子回路、ＲＮＡ送達システム及びその使用を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本願は、遺伝子発現を阻害することができる少なくとも１つのＲＮＡ断片及び／又は少なくとも１つのターゲティング機能を有するターゲティングタグを含み、宿主の器官組織内で富化し自己集合して複合構造を形成することができる配列であり、前記ＲＮＡ断片でそれに対応する遺伝子の発現を阻害することによって疾患を治療する、遺伝子回路を提供する。

【0012】

任意選択に、前記ＲＮＡ断片は医療的に意味があってかつ発現可能な、１つ、２つ以上のＲＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ配列又はｍｉＲＮＡ配列である。

【0013】

遺伝子回路中のｓｉＲＮＡにターゲティングタグがない場合、各組織での富化効果を有することが、図５４から示されている。

【0014】

任意選択に、前記遺伝子回路はプロモーターをさらに含み、前記遺伝子回路の種類には、プロモーター－ＲＮＡ断片、プロモーター－ターゲティングタグ、プロモーター－ターゲティングタグ－ＲＮＡ断片が含まれており、

【0015】

前記遺伝子回路は、遺伝子発現を阻害することができる少なくとも１つのＲＮＡ断片と、ターゲティング機能を有する少なくとも１つのターゲティングタグと、を含み、該ＲＮＡ断片及びターゲティングタグは、同一遺伝子回路又は異なる遺伝子回路にある。すなわち、宿主の体内に送達された前記遺伝子回路には、１つのＲＮＡ断片及び１つのターゲティングタグが少なくとも含まれている。例えば、宿主の体内に入る遺伝子回路にプロモーター－ＲＮＡ断片が含まれていれば、プロモーター－ターゲティングタグ又はプロモーター－ターゲティングタグ－ＲＮＡ断片が必ず含まれており、宿主の体内に入る遺伝子回路がプロモーター－ターゲティングタグ－ＲＮＡ断片であれば、プロモーター－ＲＮＡ断片及びプロモーター－ターゲティングタグは存在してもよいし、存在しなくてもよい。

【0016】

２種類の異なるＲＮＡ断片と２種類の異なるターゲティングタグを任意に組み合わせた場合の検出結果が、図５５～６２から示されている。

【0017】

任意選択に、前記遺伝子回路は、フランキング配列、ループ配列、及び補償配列をさらに含み、フランキング配列、ループ配列、及び補償配列は、遺伝子回路を正しい構造に折り畳んでかつ発現可能な配列であり、補償配列は対象受容体において発現不可能である。

【0018】

前記遺伝子回路の種類には、５’－プロモーター－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列、５’－プロモーター－ターゲティングタグ、５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列が含まれていえる。

【0019】

プロモーター－ターゲティングタグ－ｓｉＲＮＡ及びプロモーター－ｓｉＲＮＡという２種類の遺伝子回路の富化効果及び治療効果が、図６３から示されている。

【0020】

任意選択に、前記５’フランキング配列は、ｇｇａｔｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｔｇｃｔｇａａｇｇｃｔｇｔａｔｇｃｔｇａａｔｔｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記ループ配列は、ｇｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔｇａｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記３’フランキング配列は、ａｃｃｇｇｔｃａｇｇａｃａｃａａｇｇｃｃｔｇｔｔａｃｔａｇｃａｃｔｃａｃａｔｇｇａａｃａａａｔｇｇｃｃｃａｇａｔｃｔｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記補償配列は、前記ＲＮＡ配列の逆相補配列であって、その中の任意の１～５位の塩基が欠失しており、補償配列が発現しないようにする。

【0021】

様々なフランキング配列及びループ配列によって構築された送達システムの富化効果及び治療効果が、図６４～６６から示されている。

【0022】

好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～３位の塩基が欠失されている。

【0023】

より好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～３位の連続して配列した塩基が欠失されている。

【0024】

最も好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の９位及び／又は１０位の塩基が欠失されている。

【0025】

任意選択に、前記ＲＮＡ配列の長さが１５～２５ヌクレオチドである。例えば、前記ＲＮＡ配列の長さが、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチドであってもよい。好ましくは、前記ＲＮＡ配列の長さが１８～２２ヌクレオチドである。

【0026】

各長さのＲＮＡ配列によって構築される送達システムのいずれには、体内での一定の発現量があることが図６７から示されている。

【0027】

任意選択に、前記ＲＮＡ配列は、ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＫＲＡＳ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＶＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＴＯＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｂ７遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ－β１遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｋ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｌ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＨＬＡ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＧＤＦ１５遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ－２１のアンチセンス鎖、ｍｉＲＮＡ－２１４のアンチセンス鎖、ＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＨＴＴ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｌｒｒｋ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子のｓｉＲＮＡ、又は上記配列と８０％超の相同性を有するＲＮＡ配列、又は上記ＲＮＡ配列をコードする核酸分子から選択されるいずれか１つ又は複数である。なお、ここで「上記ＲＮＡ配列をコードする核酸分子」中のＲＮＡ配列には、それぞれのＲＮＡの相同性が８０％超のＲＮＡ配列も含まれる。

【0028】

ここで、上記各遺伝子のｓｉＲＮＡはいずれもその遺伝子の発現を阻害する機能を持つＲＮＡ配列であり、各遺伝子の発現を阻害する機能を持つＲＮＡ配列は多数存在するので、ここでは一つ一つ挙げることはできないが、効果が優れている以下の配列のみを例示して説明する。

【0029】

ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＧＵＵＧＣＵＵＣＵＣＵＵＡＡＵＵＣＣＵ、ＡＡＡＵＧＡＵＣＵＵＣＡＡＡＡＧＵＧＣＣＣ、ＵＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧＡＵＣＡＵ、ＡＡＵＡＵＵＣＧＵＡＧＣＡＵＵＵＡＵＧＧＡ、ＵＡＡＡＡＡＵＣＣＵＣＡＣＡＵＡＵＡＣＵＵ、ＥＧＦＲ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0030】

ＫＲＡＳ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＧＡＵＵＵＡＧＵＡＵＵＡＵＵＵＡＵＧＧＣ、ＡＡＵＵＵＧＵＵＣＵＣＵＡＵＡＡＵＧＧＵＧ、ＵＡＡＵＵＵＧＵＵＣＵＣＵＡＵＡＡＵＧＧＵ、ＵＵＡＵＧＵＵＵＵＣＧＡＡＵＵＵＣＵＣＧＡ、ＵＧＵＡＵＵＵＡＣＡＵＡＡＵＵＡＣＡＣＡＣ、ＫＲＡＳ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0031】

ＶＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＵＵＵＧＡＡＧＡＧＵＵＧＵＡＵＵＡＧＣＣ、ＵＡＡＵＡＧＡＣＵＧＧＵＡＡＣＵＵＵＣＡＵ、ＡＣＡＡＣＵＡＵＧＵＡＣＡＵＡＡＵＡＧＡＣ、ＵＵＵＡＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＵＵＣＵＣＣＡ、ＡＡＣＡＡＡＡＧＧＵＵＵＵＵＣＡＵＧＧＡＣ、ＶＥＧＦＲ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0032】

ｍＴＯＲ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＧＡＵＡＧＵＵＧＧＣＡＡＡＵＣＵＧＣＣＡ、ＡＣＵＡＵＵＵＣＡＵＣＣＡＵＡＵＡＡＧＧＵ、ＡＡＡＡＵＧＵＵＧＵＣＡＡＡＧＡＡＧＧＧＵ、ＡＡＡＡＡＵＧＵＵＧＵＣＡＡＡＧＡＡＧＧＧ、 ＵＧＡＵＵＵＣＵＵＣＣＡＵＵＵＣＵＵＣＵＣ、ｍＴＯＲ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0033】

ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＡＡＡＣＡＵＡＡＵＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣ、ＵＡＡＡＡＡＡＣＡＵＡＡＵＣＡＡＡＡＧＡＡ、ＡＡＵＡＡＵＡＡＡＵＡＡＵＣＡＣＡＡＧＵＧ、ＵＵＵＵＣＡＣＧＧＡＡＡＡＣＡＵＧＵＣＵＧ、ＡＡＡＣＡＵＡＡＵＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡ、ＴＮＦ－α遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0034】

ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＵＡＡＵＣＡＵＣＵＣＣＡＵＵＡＡＵＧＵＣ、ＡＡＡＣＡＡＵＵＣＣＵＵＵＵＵＵＡＵＣＵＵ、ＡＵＵＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＡＣＵＵＵＧＡＧ、ＡＵＡＡＵＧＡＡＧＧＡＵＡＵＡＣＡＡＣＡＧ、ＵＵＣＵＵＵＡＵＵＣＡＵＡＡＡＡＧＵＣＵＣ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0035】

Ｂ７遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＵＵＵＣＵＵＵＧＧＧＵＡＡＵＣＵＵＣＡＧ、 ＡＧＡＡＡＡＡＵＵＣＣＡＣＵＵＵＵＵＣＵＵ、ＡＵＵＵＣＡＡＡＧＵＣＡＧＡＵＡＵＡＣＵＡ、 ＡＣＡＡＡＡＡＵＵＣＣＡＵＵＵＡＣＵＧＡＧ、ＡＵＵＡＵＵＧＡＧＵＵＡＡＧＵＡＵＵＣＣＵ、Ｂ７遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0036】

ＴＧＦ－β１遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＣＧＧＡＡＡＵＡＡＣＣＵＡＧＡＵＧＧＧＣ、ＵＧＡＡＣＵＵＧＵＣＡＵＡＧＡＵＵＵＣＧＵ、ＵＵＧＡＡＧＡＡＣＡＵＡＵＡＵＡＵＧＣＵＧ、ＵＣＵＡＡＣＵＡＣＡＧＵＡＧＵＧＵＵＣＣＣ、ＵＣＵＣＡＧＡＣＵＣＵＧＧＧＧＣＣＵＣＡＧ、ＴＧＦ－β１遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0037】

Ｈ２－Ｋ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＡＡＡＡＣＡＡＡＵＣＡＡＵＣＡＡＡＣＡＡ、 ＵＣＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＵＣＡＡＵＣＡＡ、ＵＡＵＧＡＧＡＡＧＡＣＡＵＵＧＵＣＵＧＵＣ、ＡＡＣＡＡＵＣＡＡＧＧＵＵＡＣＡＵＵＣＡＡ、ＡＣＡＡＡＡＣＣＵＣＵＡＡＧＣＡＵＵＣＵＣ、Ｈ２－Ｋ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0038】

Ｈ２－Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＡＵＣＵＣＧＧＡＧＡＧＡＣＡＵＵＵＣＡＧ、ＡＡＵＧＵＵＧＵＧＵＡＡＡＧＡＧＡＡＣＵＧ、ＡＡＣＡＵＣＡＧＡＣＡＡＵＧＵＵＧＵＧＵＡ、ＵＧＵＵＡＡＣＡＡＵＣＡＡＧＧＵＣＡＣＵＵ、ＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＵＣＵＡＡＧＣＡＵ、Ｈ２－Ｄ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0039】

Ｈ２－Ｌ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＧＡＵＣＣＧＣＵＣＣＣＡＡＵＡＣＵＣＣＧＧ、 ＡＵＣＵＧＣＧＵＧＡＵＣＣＧＣＵＣＣＣＡＡ、ＵＣＧＧＡＧＡＧＡＣＡＵＵＵＣＡＧＡＧＣＵ、ＵＣＵＣＧＧＡＧＡＧＡＣＡＵＵＵＣＡＧＡＧ、 ＡＡＵＣＵＣＧＧＡＧＡＧＡＣＡＵＵＵＣＡＧ、Ｈ２－Ｌ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0040】

ＨＬＡ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＵＣＵＧＧＡＵＧＧＵＧＵＧＡＧＡＡＣＣＧ、ＵＧＵＣＡＣＵＧＣＵＵＧＣＡＧＣＣＵＧＡＧ、ＵＣＡＣＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＡＡ、 ＵＵＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＡＧＵＣＡＧＧＧＵ、ＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＵＧＣＡ、ＨＬＡ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0041】

ＧＤＦ１５遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＡＵＡＡＡＵＡＣＡＧＣＵＧＵＵＵＧＧＧＣ、ＡＧＡＣＵＵＡＵＡＵＡＡＡＵＡＣＡＧＣＵＧ、ＡＡＵＵＡＡＵＡＡＵＡＡＡＵＡＡＣＡＧＡＣ、ＡＵＣＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＵＣＡＣＣＧＵＣ、ＵＧＣＡＡＣＵＣＣＡＧＣＵＧＧＧＧＣＣＧＵ、ＧＤＦ１５遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0042】

ＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＡＵＧＡＡＡＵＧＵＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡ、ＡＡＵＣＡＵＡＵＣＣＵＵＡＡＡＡＵＧＧＡＡ、ＵＡＡＵＣＡＵＡＵＣＣＵＵＡＡＡＡＵＧＧＡ、ＵＧＡＡＡＡＡＵＣＣＵＵＡＧＵＵＵＵＣＡＵ、ＡＧＡＡＧＵＡＡＡＡＡＡＣＵＡＵＵＧＣＧＡ、ＴＮＣ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0043】

ＰＴＰ１Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＧＡＵＡＵＡＧＵＣＡＵＵＡＵＣＵＵＣＵＵ、ＵＣＣＡＵＵＵＵＵＡＵＣＡＡＡＣＵＡＧＣＧ、ＡＵＵＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＡＵＡＵＧＧＡＧ、ＡＡＵＵＵＵＡＡＵＡＣＡＵＵＡＵＵＧＧＵＵ、ＵＵＵＡＵＵＡＵＵＧＵＡＣＵＵＵＵＵＧＡＵ、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0044】

ｍＨＴＴ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＡＵＧＵＵＵＵＣＡＣＡＵＡＵＵＧＵＣＡＧ、ＡＵＵＵＡＧＵＡＧＣＣＡＡＣＵＡＵＡＧＡＡ、ＡＵＧＵＵＵＵＵＣＡＡＵＡＡＡＵＧＵＧＣＣ、ＵＡＵＧＡＡＵＡＧＣＡＵＵＣＵＵＡＵＣＵＧ、ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＣＵＣＵＵＡＡＵＡＣＡＡ、ｍＨＴＴ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0045】

Ｌｒｒｋ２遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＵＵＡＡＣＡＵＧＡＡＡＡＵＡＵＣＡＣＵＵ、ＵＵＡＡＣＡＡＵＡＵＣＡＵＡＵＡＡＵＣＵＵ、ＡＵＣＵＵＵＡＡＡＡＵＵＵＧＵＵＡＡＣＧＣ、ＵＵＧＡＵＵＵＡＡＧＡＡＡＡＵＡＧＵＣＵＣ、ＵＵＵＧＡＵＡＡＣＡＧＵＡＵＵＵＵＵＣＵＧ、Ｌｒｒｋ２遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0046】

α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＵＡＵＡＵＵＡＡＣＡＡＡＵＵＵＣＡＣＡＡ、ＡＡＧＵＡＵＵＡＵＡＵＡＵＡＵＵＡＡＣＡＡ、ＡＵＡＡＣＵＵＵＡＵＡＵＵＵＵＵＧＵＣＣＵ、ＵＡＡＣＵＡＡＡＡＡＡＵＵＡＵＵＵＣＧＡＧ、ＵＣＧＡＡＵＡＵＵＡＵＵＵＡＵＵＧＵＣＡＧ、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0047】

なお、上記の「８０％超の相同性を有する配列」は、相同性が８５％、８８％、９０％、９５％、９８％などであってもよい。

【0048】

任意選択に、前記ターゲティングタグは、ターゲティング機能を有するターゲティングペプチド又はターゲティングタンパク質から選択される。

【0049】

任意選択に、前記ターゲティングペプチドは、ＲＶＧターゲティングペプチド、ＧＥ１１ターゲティングペプチド、ＰＴＰターゲティングペプチド、ＴＣＰ－１ターゲティングペプチド、ＭＳＰターゲティングペプチドを含み、
前記ターゲティングタンパク質は、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＰＴＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＭＳＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質を含む。

【0050】

任意選択に、前記ＲＮＡ断片は、ＲＮＡ配列本体と、ＲＮＡ配列本体をリボース修飾した修飾ＲＮＡ配列と、を含む。すなわち、ＲＮＡ断片は、少なくとも１つのＲＮＡ配列本体のみから構成されていてもよいし、少なくとも１つの修飾ＲＮＡ配列のみから構成されていてもよいし、ＲＮＡ配列本体と修飾ＲＮＡ配列とから構成されていてもよい。

【0051】

本発明において、前記単離された核酸は、そのバリアント及び誘導体をさらに含む。当業者であれば、一般的な方法を用いて前記核酸を修飾することができる。修飾方式には、メチル化修飾、ヒドロカルビル修飾、グリコシル修飾（例えば、２－メトキシ－グリコシル修飾、ヒドロカルビル－グリコシル修飾、糖環修飾など）、核酸化修飾、ペプチドセグメント修飾、脂質修飾、ハロゲン修飾、核酸修飾（例えば、「ＴＴ」修飾）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の一実施形態では、前記修飾は、ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエート、２'－Ｏメトキシエチル（ＭＯＥ）、２'－フルオロ、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミドエステル、カルボキシメチルエステルおよびそれらの組み合わせから選択される。本発明の一実施形態では、前記修飾はヌクレオチドの修飾であり、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、鎖核酸（ＬＮＡ）、アラビノース－核酸（ＦＡＮＡ）、アナログ、誘導体、及びそれらの組み合わせから選択される。好ましくは、前記修飾は、２’フルオロピリミジン修飾である。２’フルオロピリミジン修飾はＲＮＡ上のピリミジンヌクレオチドの２’－ＯＨを２’－Ｆで置換し、２’－ＦはＲＮＡを生体内のＲＮＡ酵素に認識されにくくすることができ、それによってＲＮＡ断片の体内送達の安定性を高める。

【0052】

任意選択に、前記器官組織は肝臓であり、前記複合構造はエクソソームである。

【0053】

本願はまた、前記遺伝子回路と、前記遺伝子回路を宿主の器官組織に送達して富化させることができる送達ベクターと、を含むＲＮＡ送達システムを提供する。

【0054】

任意選択に、前記遺伝子回路を含有する送達ベクターは、宿主の器官組織内で富化し、宿主の器官組織内で自己集合して複合構造を形成可能であり、前記ターゲティングタグは前記複合構造の表面に位置し、前記複合構造は、前記ターゲティングタグを介して標的組織を探索し結合し、標的組織に前記ＲＮＡ断片を送達する。

【0055】

任意選択に、前記送達ベクターは１つ、２つ以上の前記遺伝子回路を担持しており、担持した前記遺伝子回路のすべてのうち、１つのＲＮＡ断片及び１つのターゲティングタグが少なくとも含まれている。

【0056】

任意選択に、前記送達ベクターが２つ以上の前記遺伝子回路を担持している場合、隣接する前記遺伝子回路は配列１－３からなる配列（配列１－配列２－配列３）で連結され、
配列１はＣＡＧＡＴＣであり、配列２は５～８０塩基からなる配列であり、配列３はＴＧＧＡＴＣである。好ましくは、配列２は１０～５０塩基からなる配列であり、より好ましくは、配列２は２０～４０塩基からなる配列である。

【0057】

任意選択に、前記送達ベクターが２つ以上の前記遺伝子回路を担持している場合、隣接する前記遺伝子回路は配列４又は配列４と８０％超の相同性を有する配列で連結され、
配列４は、ＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣである。

【0058】

配列４及びそれと相同の配列によって構築される送達システムについては、体内で検出した結果、いずれにも一定の富化及び治療効果を有することが、図６８から示される。

【0059】

任意選択に、前記送達ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターであり、
其中、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターを含み、前記非ウイルスベクターは、プラスミドベクター、リポソームベクター、カチオン性ポリマーベクター、ナノ粒子ベクター、多機能エンベロープナノベクターを含む。

【0060】

好ましくは、前記送達ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター又はプラスミドベクターである。前記アデノ随伴ウイルスベクターは、好ましくは、アデノ随伴ウイルスベクター５型（ＡＡＶ５）、アデノ随伴ウイルスベクター８型（ＡＡＶ８）又はアデノ随伴ウイルスベクター９型（ＡＡＶ９）である。

【0061】

任意選択に、前記送達システムは、ヒトを含む哺乳動物で使用されるものであり、すなわち、該送達システムは、ヒトを含む哺乳動物に有用である。

【0062】

本願はまた、薬物における上記の何れかに記載のＲＮＡ送達システムの使用を提供する。

【0063】

任意選択に、前記薬物の投与方式は、経口投与、吸入投与、皮下注射投与、筋肉注射投与、静脈注射投与を含む。すなわち、前記薬物は、経口投与、吸入投与、皮下注射投与、筋肉注射投与又は静脈注射投与により入体に入ってから、上記の何れかに記載のＲＮＡ送達システムによって標的組織に送達され、治療作用を発揮する。

【0064】

任意選択に、前記薬物は、癌、肺線維症、結腸炎、肥満、肥満に起因する心血管疾患、２型糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、重症筋無力症、アルツハイマー病、又は移植片対宿主病を治療する薬物である。

【0065】

前記薬物の剤形は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸薬、座薬、軟膏剤、溶液剤、懸濁剤、ローション剤、ゲル剤、ペースト剤などであってもよい。

【発明の効果】

【0066】

本願の技術的効果は以下のとおりである。
本願による遺伝子回路は、ＲＮＡ断片のみを含んでもよいし、ターゲティングタグのみを含んでもよいし、ＲＮＡ断片とターゲティングタグを組み合わせたものであってもよい。該遺伝子回路は、ＲＮＡ断片のみを含む場合体内に入って遺伝子発現を阻害する作用を発揮し、それによって、疾患の発症及び進行を阻害することができ、ターゲティングタグのみを含む場合、極めて優れたターゲティング機能を持ち、ＲＮＡ断片のみを含む遺伝子回路と併用されて、ＲＮＡ断片が標的器官や標的組織に速く送達されて作用を発揮するようにし、ＲＮＡ断片とターゲティングタグを組み合わせたものである場合、ターゲティング機能と治療機能の両方を持ち、標的器官及び標的組織に効率的かつ正確に送達されて治療作用を発揮することができ、効率が高く、効果が良好であり、大規模な普及や応用に好適である。本願における遺伝子回路は、肝臓など宿主の器官組織内で富化することができ、また、エクソソームなどの複合構造として集合することができ、エクソソームなどの複合構造として集合されてから、遺伝子回路によりガイドされて疾患を治療するものであり、効果が良好であり、従来技術における毒性や副作用が回避され、本願の遺伝子回路は、生物と医薬の分野で大きなブレークスルーであり、記念碑的な重要性を持つ。
本願によるＲＮＡ送達システムは、遺伝子回路を送達ベクターに付着させて、体内に送達し、この遺伝子回路は、宿主の器官組織内でよく富化し、自己集合して複合構造を形成し、最終的に効果を発揮するＲＮＡ断片は該複合構造によって包まれて送達され、免疫反応は一切存在せず、安全性が高い。該送達システムは、各種の小分子ＲＮＡを送達することができ、汎用性が高い。遺伝子回路を付着させる送達ベクターの製造はエクソソームやタンパク質、ポリペプチドなどの物質の製造よりも安価で経済的であり、プロセスがより簡単で、品質の標準化に有利であり、使用時の安定性を向上させ、経済性が高い。
さらに、本願によるＲＮＡ送達システムは、生体内で自己集合された後、ＡＧＯ_２と緊密に結合して富化して複合構造（エクソソーム）になることができ、これにより、その早期分解を防止し、循環中の安定性を維持することができるだけではなく、受容体細胞による吸収、細胞質内での放出、及びリソソームの脱出に有利であり、必要な用量は低い。
本願によるＲＮＡ送達システムは、薬物に使用されると、薬物送達プラットフォームを提供し、このプラットフォームを通じてより多くのＲＮＡ系薬物の研究開発基盤が提供され得、ＲＮＡ系薬物の研究開発及び使用に極めて大きな推進効果をもたらすことができる。

【図面の簡単な説明】

【0067】

【図1】本願の一実施例によるマウスの体内のプラスミド分布及び代謝状況の比較図である。

【図2】本願の一実施例によるマウスの体内のタンパク質発現レベルの比較図である。

【図3】本願の一実施例によるマウスの体内の関連ｓｉＲＮＡレベルの比較図である。

【図4】本願の一実施例によるマウスの各組織における絶対ｓｉＲＮＡレベルの比較図である。

【図5】本願の一実施例による、プラスミド用量がマウスのｓｉＲＮＡレベルに与える影響の比較図である。

【図6】本願の一実施例による、プラスミド注射後のマウスの肝臓における前駆体及び成熟体の代謝状況の比較図である。

【図7】本願の一実施例によるマウスの様々な組織におけるｓｉＲＮＡの動態及び分布の比較図である。

【図8】本願の一実施例による、様々なプロモーターがｓｉＲＮＡに与える影響の比較図である。

【図9】本願の一実施例による、マウスの様々な組織におけるｅＧＦＰ蛍光強度の比較図である。

【図10】本願の一実施例による、マウスのアラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、総ビリルビン、血中尿素窒素、血清アルカリホスファターゼ、クレアチニンの含有量及び胸腺重量、脾臓重量、末梢血球のパーセンテージの比較図である。

【図11】本願の一実施例によるマウスＥＧＦＲ突然変異肺癌腫瘍の治療効果の比較図である。

【図12】本願の一実施例によるマウスのＨＥ染色図、免疫組織染色図及び着色の統計図である。

【図13】本願の一実施例によるマウスＫＲＡＳ突然変異肺癌腫瘍の治療効果の比較図である。

【図14】本発明の一実施例によるマウスのＨＥ染色図、免疫組織染色図及び着色の統計図である。

【図15】本願の一実施例による、ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡに基づくマウス肺癌の治療を示す図である。

【図16】本願の一実施例による、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡに基づくマウス肺癌の治療を示す図である。

【図17】本願の一実施例によるマウスの複数種の酵素含有量の比較図である。

【図18】本願の実施例によるマウス腎癌腫瘍画像の比較図である。

【図19】本願の一実施例によるマウス腎癌腫瘍の進行状況の比較図である。

【図20】本発明の一実施例によるマウスの結腸炎の進行状況の比較図である。

【図21】本発明の一実施例によるマウスの結腸のＨＥ染色の比較図である。

【図22】本発明の一実施例によるマウスの結腸炎の進行状況の比較図である。

【図23】本発明の一実施例によるマウスの結腸のＨＥ染色の比較図である。

【図24】本願の一実施例によるマウスの結腸炎の治療及びＲＮＡ発現レベルの比較図である。

【図25】本願の一実施例によるマウスのサイトカイン濃度及び結腸のＨＥ染色の比較図である。

【図26】本願の一実施例によるマウスの結腸炎の治療の比較図である。

【図27】本願の一実施例によるマウスの疾患活動指数及び複数種のｓｉＲＮＡレベルの比較図である。

【図28】本願の一実施例によるマウスの複数種のｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡレベルの比較図である。

【図29】本願の一実施例によるマウスの結腸のＨＥ染色の比較図である。

【図30】本発明の一実施例によるマウスのヒドロキシプロリン含有量の比較図である。

【図31】本願の一実施例によるマウスの肺の蛍光染色図である。

【図32】本発明の一実施例によるマウスの肺のＭａｓｓｏｎ３色染色図である。

【図33】本発明の一実施例によるマウスの肺のＨＥ染色図である。

【図34】本発明の一実施例によるマウスの一部のタンパク質、ｍＲＮＡレベルの比較図である。

【図35】本願の一実施例によるマウスのヒドロキシプロリン含有量、ｍＲＮＡレベルの比較図である。

【図36】本願の一実施例によるマウスｓｉＲＮＡ関連発現の比較図である。

【図37】本願の一実施例によるマウス膠芽腫の治療状況の比較図である。

【図38】本願の一実施例によるマウスの脳免疫組織染色の比較図である。

【図39】本願の一実施例によるマウスの生存及び腫瘍評価の比較図である。

【図40】本発明の一実施例によるマウスの視床下部及び肝臓の蛍光顕微鏡画像である。

【図41】本発明の一実施例によるマウス肥満の治療状況の比較図である。

【図42】本発明の一実施例によるマウス肥満脂肪肝の治療状況の比較図である。

【図43】本願の一実施例によるマウスの肥満の治療状況の比較図である。

【図44】本願の一実施例によるマウスの各肥満指標の比較図である。

【図45】本発明の一実施例によるマウスのハンチントン病の治療状況の比較図である。

【図46】本発明の一実施例によるマウスの肝臓、皮質、線条体におけるｓｉＲＮＡ、タンパク質の比較図である。

【図47】本願の一実施例によるマウスのハンチントン病の治療状況の比較図である。

【図48】本発明の一実施例によるマウスの線条体及び皮質のｍＨＴＴタンパク質及び毒性凝集体の比較図である。

【図49】本願の一実施例によるマウスのハンチントン病の治療状況の比較図である。

【図50】本願の一実施例によるトランスジェニックマウスのパーキンソン病の治療状況の比較図である。

【図51】本発明の一実施例によるカニクイザルの全血ｓｉＲＮＡ濃度の変化を示す図である。

【図52】本願の一実施例による、化学修飾がマウスのｓｉＲＮＡレベルに与える影響の比較図である。

【図53】本発明の一実施例による回路の構築及び特徴付け図である。

【図54】本願の一実施例による、遺伝子回路にｓｉＲ^Ｅ及びｓｉＲ^Ｔのみが含まれている場合、肝、脳、血漿及びエクソソームでの遺伝子回路の富化効果及びＥＧＦＲ／ＴＮＣの発現量であり、図において、Ａ及びＢは、遺伝子回路にｓｉＲ^Ｅのみが含まれている場合の、肝、脳、血漿及びエクソソーム中での富化効果であり、Ｃ及びＤは、遺伝子回路にｓｉＲ^Ｔのみが含まれている場合の、肝、脳、血漿及びエクソソーム中での富化効果であり、Ｅ及びＦは、遺伝子回路にｓｉＲ^Ｅのみが含まれている場合の、ＥＧＦＲのタンパク質含有量及びｍＲＮＡ含有量であり、Ｇ及びＨは、遺伝子回路にｓｉＲ^Ｔのみが含まれている場合の、ＴＮＣのタンパク質含有量及びｍＲＮＡ含有量である。

【図55】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類の異なるＲＮＡ断片及び２種類の異なるターゲティングタグが含まれている場合の、膵臓、脳、血漿及びエクソソーム中での富化効果であり、図において、Ａ及びＢは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＥＧＦＲ、ターゲティングタグがＰＴＰの場合に示された富化効果であり、Ｃ及びＤは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＴＮＣ、ターゲティングタグがＰＴＰの場合に示された富化効果であり、Ｅ及びＦは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＥＧＦＲ、ターゲティングタグがＲＶＧの場合に示された富化効果であり、Ｇ及びＨは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＴＮＣ、ターゲティングタグがＲＶＧの場合に示された富化効果である。

【図56】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類の異なるＲＮＡ断片及び２種類の異なるターゲティングタグが含まれている場合の、膵臓、脳で検出されたＥＧＦＲ及びＴＮＣの発現量であり、図において、Ａ及びＢは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＥＧＦＲ、ターゲティングタグがＰＴＰの場合の、ＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｃ及びＤは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＥＧＦＲ、ターゲティングタグがＲＶＧの場合の、ＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｅ及びＦは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＴＮＣ、ターゲティングタグがＰＴＰの場合の、ＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｇ及びＨは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＴＮＣ、ターゲティングタグがＲＶＧの場合の、ＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量である。

【図57】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類のＲＮＡ断片が同時に含まれ、かつ２種類の異なるターゲティングタグが含まれる場合の、膵臓、脳、血漿、エクソソーム中での富化効果であり、図において、Ａ及びＢは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＰＴＰの場合の富化効果であり、Ｃ及びＤは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＲＶＧの場合の富化効果である。

【図58】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類のＲＮＡ断片が同時に含まれ、かつ２種類の異なるターゲティングタグが含まれる場合の、膵臓、脳で検出されたＥＧＦＲ及びＴＮＣの発現量であり、図において、Ａ及びＢは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＰＴＰの場合の、ＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｃ及びＤは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＲＶＧの場合の、ＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｅ及びＦは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＰＴＰの場合の、ＴＮＣのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｇ及びＨは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＲＶＧの場合の、ＴＮＣのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量である。

【図59】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類の異なるＲＮＡ断片が含まれ、かつ２種類のターゲティングタグが同時に含まれる場合の、膵臓、脳、血漿、エクソソーム中での富化効果であり、図において、Ａ及びＢは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＥＧＦＲ、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合の富化効果であり、Ｃ及びＤは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＴＮＣ、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合の富化効果である。

【図60】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類の異なるＲＮＡ断片が含まれ、かつ２種類のターゲティングタグが同時に含まれる場合の、膵臓、脳で検出されたＥＧＦＲ及びＴＮＣの発現量であり、図において、Ａ及びＢは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＥＧＦＲ、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合のＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｃ及びＤは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＴＮＣ、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合の、ＴＮＣのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量である。

【図61】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類のＲＮＡ断片が同時に含まれ、かつ２種類のターゲティングタグが同時に含まれる場合の、膵臓、脳、血漿、エクソソーム中での富化効果であり、図において、Ａは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合の、膵臓及び脳中での富化効果であり、Ｂは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合の、血漿及びエクソソーム中での富化効果である。

【図62】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類のＲＮＡ断片が同時に含まれ、かつ２種類のターゲティングタグが同時に含まれる場合の、膵臓、脳で検出されたＥＧＦＲ及びＴＮＣの発現量であり、図において、Ａ及びＢは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合の、ＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｃ及びＤは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合の、ＴＮＣのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量である。

【図63】本願の一実施例による、Ａｌｂｕｍｉｎ－ｓｉＲ^ＥＧＦＲ及びＡｌｂｕｍｉｎ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＥＧＦＲの２種類の遺伝子回路の、血漿及び脳中での富化効果、並びにＥＧＦＲの発現量であり、図において、Ａは、２種類の遺伝子回路の血漿中での富化効果であり、Ｂは、２種類の遺伝子回路の脳中での富化効果であり、Ｃは、２種類の遺伝子回路について検出されたＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量である。

【図64】本願の一実施例による、５’フランキング配列が８０％超の相同性を有する送達システムの肺での富化効果及び治療効果であり、図において、Ａは、８０％超の相同性を有する２つの５’フランキング配列がそれぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、肺での富化効果であり、Ｂは、が８０％超の相同性を有する２つの５’フランキング配列がそれぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、ＥＧＦＲのタンパク質発現量であり、Ｃは、８０％超の相同性を有する２つの５’フランキング配列がそれぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、ＥＧＦＲのｍＲＮＡ発現量である。

【図65】本願の一実施例による、ループ配列が８０％超の相同性を有する送達システムの肺での富化効果及び治療効果であり、図において、Ａは、８０％超の相同性を有する２つのループ配列がそれぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、肺での富化効果であり、Ｂは、８０％超の相同性を有する２つのループ配列がそれぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、ＥＧＦＲのタンパク質発現量であり、Ｃは、８０％超の相同性を有する２つのループ配列がそれぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、ＥＧＦＲのｍＲＮＡ発現量である。

【図66】本願の一実施例による、３’フランキング配列が８０％超の相同性を有する送達システムの肺での富化効果及び治療効果であり、図において、Ａは、８０％超の相同性を有する２つの３’フランキング配列がそれぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、肺での富化効果であり、Ｂは、８０％超の相同性を有する２つの３’フランキング配列がそれぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、ＥＧＦＲのタンパク質発現量であり、Ｃは、８０％超の相同性を有する２つの３’フランキング配列がそれぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、ＥＧＦＲのｍＲＮＡ発現量である。

【図67】本願の一実施例による、長さの異なる３種類のＲＮＡ配列を含有する送達システムの静脈注射後のＥＧＦＲ発現量の検出結果を示す図であり、図において、Ａは、ＥＧＦＲのタンパク質発現量の検出結果であり、Ｂは、ＥＧＦＲのｍＲＮＡ発現量の検出結果である。

【図68】本願の一実施例による、配列４、及び配列４と８０％超の相同性を有する２つの配列４－１、４－２を含有する送達システムの静脈注射９時間後の肺組織のＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ含有量（富化）の検出結果であり、図において、Ａは、配列４の検出結果であり、Ｂは、配列４－１の検出結果であり、Ｃは、配列４－２の検出結果である。

【発明を実施するための形態】

【0068】

以下、図面を参照して、本願の具体的な実施形態について説明する。

【0069】

まず、本発明に係る専門名詞、試験方法などについて説明する。

【0070】

ヘマトキシリン－イオシン染色法（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ）は、ＨＥ染色と略称する。ＨＥ染色は組織学、病理学の教育や科学研究において最も基礎的で、最も広く使用されている技術方法の１つである。

【0071】

ヘマトキシリン染色液は塩基性で、組織の好塩基性構造（例えば、リボソーム、細胞核及び細胞質中のリボ核酸など）を青紫色に染色することができ、イオシンは酸性染料であり、組織の好酸性構造（例えば、レビー小体、アルコール小体及び細胞質の大部分を含む細胞内及び細胞間のタンパク質）をピンク色に染色し、細胞組織全体の形態が鮮明に見られるようにすることができる。

【0072】

ＨＥ染色の具体的なステップには、サンプル組織の固定化と切片化、組織サンプルの脱ろう、組織サンプルの水和、組織切片のヘマトキシリン染色、分化と抗青処理、組織切片のイオシン染色と脱水、組織サンプル切片の風乾とシーリング、顕微鏡での観察及び写真撮影が含まれる。

【0073】

Ｍａｓｓｏｎ染色では、アニオン染料分子の大きさと組織の透過性に関連して、コラーゲン繊維は青（アニリンブルーで染色）又は緑（ブリリアントグリーンで染色）、筋繊維は赤（アシッドマゼンタとポンソーで染色）になる。一連のアニオン水溶性染料で固定化された組織を順次又は混合して染色すると、赤血球は最小分子のアニオン染料で染色され、筋繊維と細胞質は中程度の大きさのアニオン染料で染色され、コラーゲン繊維は大分子のアニオン染料で染色されることが発見された。このことから、赤血球はアニオン染料に対する透過性が最も小さく、筋線維と細胞質はそれに次ぐものであり、コラーゲン線維は最も透過性が大きいことが示された。Ｉ型、ＩＩＩ型コラーゲンは緑色を呈し（ＧＢＭ、ＴＢＭ、メサンギウム基質及び腎間質は緑色を呈する）、フェロヘビン、腎小管細胞質、赤血球は赤色を呈する。

【0074】

Ｍａｓｓｏｎ染色の具体的なステップには、以下が含まれる。

【0075】

組織をＢｏｕｉｎ液に固定化し、流水で一晩リンスし、通常脱水包埋する。切片から水へ脱ろうする（キシレン中の脱ろうを１０ｍｉｎ×３回行い、吸水紙で液体を吸収する。１００％エタノールで脱ろうを５ｍｉｎ×２回行い、吸水紙で液体を吸収する。９５％エタノールで脱ろうを５ｍｉｎ×２回行い、吸水紙で液体を吸収する。水を２ｍｉｎ流して、吸水紙で水分を吸収する）。Ｗｅｉｇｅｒ鉄ヘマトキシリンで５～１０ｍｉｎ染色する。流水で少し洗い、０．５％塩酸アルコールで１５ｓ分化する。流水で３ｍｉｎリンスする。ポンソー酸性フクシン液で８ｍｉｎ染色する。蒸留水で少しリンスする。１％リンモリブデン酸水溶液で約５ｍｉｎ処理する。水洗することなく、アニリンブロー液又はブリリアントグリーン液で５ｍｉｎ再染色する。１％氷酢酸で１ｍｉｎ処理する。９５％エタノールで脱水を５ｍｉｎ×２回行い、吸水紙で液体を吸収する。１００％エタノールで脱水を５ｍｉｎ×２回行い、吸水紙で液体を吸収する。キシレン中で５ｍｉｎ×２回透明化し、吸水紙で液体を吸収する。中性ゴムでシーリングする。

【0076】

ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）は、タンパク質を膜に転写し、抗体を用いて検出するもので、既知の発現タンパク質に対しては、対応する抗体を一次抗体として検出することができ、新規遺伝子の発現産物に対しては、融合部分の抗体を用いて検出することができる。

【0077】

Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔにはポリアクリルアミドゲル電気泳動が使用されており、被検出物はタンパク質、「プローブ」は抗体、「発色」には、標識された二次抗体が使用される。ＰＡＧＥにより分離されたタンパク質サンプルは、非共有結合の形でタンパク質を吸着し、電気泳動で分離されたポリペプチドタイプ及びその生物学的活性を維持することができる固相担体（例えば、硝酸セルロースフィルム）に転写され、固相担体上のタンパク質又はポリペプチドを抗原として、対応する抗体と免疫反応を起こし、酵素又は同位体標識された第２抗体と反応し、基質発色又は自己放射現像を経て、電気泳動で分離された特定の目的遺伝子によって発現されたタンパク質成分を検出する。そのステップには、主に、タンパク質の抽出、タンパク質の定量化、ゲル製造と電気泳動、膜転写、免疫標識と現像が含まれる。

【0078】

免疫組織化学技術（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）又は免疫細胞化学技術（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）と呼ばれる免疫組織化学は、抗原抗体反応、すなわち抗原と抗体が特異的に結合する原理を利用しており、抗体を標識する発色剤（フルオレセイン、酵素、金属イオン、同位体）を化学反応により発色させて組織細胞内抗原（ポリペプチド及びタンパク質）を特定し、その局在化、定性化及び相対的定量化について研究をする。

【0079】

免疫組織化学の主要なステップには、切片浸漬、一晩の乾燥、キシレン脱蝋、勾配アルコール脱蝋（１００％、９５％、９０％、８０％、７５％、７０％、５０％、毎回３ｍｉｎ）、二重蒸留、３％過酸化水素水を滴下してカタラーゼを除去すること、水洗、抗原修復、５％ＢＳＡを滴下して１ｈブロックすること、一次抗体希釈、ＰＢＳ緩衝液による洗浄、二次抗体のインキュベート、ＰＢＳ緩衝液による洗浄、発色液発色、水洗、ヘマトキシリン染色、勾配エタノール脱水、中性ゴムによるシーリングが含まれる。

【0080】

本発明に係るｓｉＲＮＡレベル、タンパク質含有量及びｍＲＮＡ含有量の検出は、いずれも、マウスの体内にＲＮＡ送達システムを注射することにより、マウス幹細胞の生体外モデルを構築する。細胞、組織におけるｍＲＮＡ及びｓｉＲＮＡの発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲを用いて検出する。ｓｉＲＮＡの絶対定量は、標準品を用いて検量線を作成することにより決定する。内部参照に対する各ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡの発現量は２－ΔＣＴで表すことができ、ΔＣＴ＝Ｃサンプル－Ｃ内部参照である。ｓｉＲＮＡを増幅する場合、内部参照遺伝子はＵ６ ｓｎＲＮＡ（組織中）又はｍｉＲ－１６（血清、エクソソーム中）分子であり、ｍＲＮＡを増幅する場合、遺伝子はＧＡＰＤＨ又は１８ｓ ＲＮＡである。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ実験を用いて細胞、組織におけるタンパク質の発現レベルを検出し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてタンパク質の定量分析を行う。

【0081】

本発明において、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、別段の記載がない限り、当業者に一般に理解される意味を有する。また、本明細書で使用される試薬、材料や操作ステップは、すべて、当該分野で広く使用されている試薬、材料や通常のステップである。
実施例１

【0082】

本実施例は、遺伝子発現を阻害することができる少なくとも１つのRNA断片及び/又は少なくとも１つのターゲティング機能を有するターゲティングタグを含み、宿主の体内に送達され、宿主の器官組織内で富化し自己集合して複合構造を形成することができ、前記ＲＮＡ断片が遺伝子の発現を阻害することによって、疾患を治療する、遺伝子回路（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｉｒｃｕｉｔ）を提供する。

【0083】

上記遺伝子とは、疾患の発症又は進行と直接又は間接的に関与する遺伝子のことであり、ＲＮＡ断片は、該遺伝子の発現を阻害することで疾患の発症や進行を阻害し、疾患治療の目的を達成させることができる。ターゲティングタグは、ＲＮＡ断片を病巣領域に正確にガイドして、当該病巣領域に効率的な治療を施すことができる。宿主の器官組織は肝臓であり、複合構造はエクソソームである。

【0084】

具体的には、少なくとも１つの前記遺伝子回路は、宿主の体内に送達され、宿主の体内に送達された前記遺伝子回路には、１つのＲＮＡ断片及び１つのターゲティングタグが少なくとも含まれており、前記ＲＮＡ断片及び前記ターゲティングタグは、同一又は異なる遺伝子回路にある。

【0085】

実際の応用においては、前記遺伝子回路はプロモーターをさらに含み、好ましくはＣＭＶプロモーターである。

【0086】

図５４は、ｓｉＲ^Ｅ（標的遺伝子はＥＧＦＲ）及びｓｉＲ^Ｔ（標的遺伝子はＴＮＣ）にターゲティングタグがない場合の、肝、脳、血漿及びエクソソーム中での遺伝子回路の富化効果及びＥＧＦＲ／ＴＮＣの発現量を示す。

【0087】

前記遺伝子回路の種類には、プロモーター－ＲＮＡ断片、プロモーター－ターゲティングタグ、プロモーター－ターゲティングタグ－ＲＮＡ断片が含まれている。

【0088】

図５５～６２は、２種類の異なるＲＮＡ断片、２種類の異なるターゲティングタグを任意に組み合わせた場合の検出結果を示す。具体的には、ＲＮＡ断片１はｓｉＲ^ＥＧＦＲであり、ＲＮＡ断片２はｓｉＲ^ＴＮＣであり、ターゲティングタグ１はＰＴＰであり、ターゲティングタグ２はＲＶＧである。ＲＮＡ断片とターゲティングタグを任意に組み合わせた後、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ、及びＴＮＣ ｓｉＲＮＡの膵臓、脳、血漿及びエクソソーム中での富化効果及びＥＧＦＲ及びＴＮＣの発現量を検出する。

【0089】

より具体的には、前記遺伝子回路は、フランキング配列、補償配列、及びループ配列をさらに含む。フランキング配列、ループ配列、及び補償配列は、配列を正しい構造に折り畳んで発現させることができる配列である。

【0090】

前記遺伝子回路の種類には、５’－プロモーター－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列、５’－プロモーター－ターゲティングタグ、５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列が含まれている。

【0091】

図６３において、Ａｌｂｕｍｉｎはプロモーター、ＲＶＧはターゲティングタグ、ｓｉＲ^ＥＧＦＲはＥＧＦＲタンパク質を標的とするＲＮＡ断片である。ＲＮＡ断片なしでは、遺伝子回路が機能しないため、Ａｌｂｕｍｉｎ－ｓｉＲ^ＥＧＦＲ及びＡｌｂｕｍｉｎ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＥＧＦＲの２種類の遺伝子回路の血漿及び脳中での富化効果、並びにＥＧＦＲの発現量のみが検出される。

【0092】

前記５’フランキング配列は、好ましくは、ｇｇａｔｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｔｇｃｔｇａａｇｇｃｔｇｔａｔｇｃｔｇａａｔｔｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、ｇｇａｔｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｔｇｃｔｇａａｇｇｃｔｇｔａｔｇｃｔｇａａｔｔｃと８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％の相同性を有する配列などを含む。

【0093】

前記ループ配列は、好ましくは、ｇｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔｇａｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、ｇｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔｇａｃと８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％の相同性を有する配列等を含む。

【0094】

前記３’フランキング配列は、好ましくは、ａｃｃｇｇｔｃａｇｇａｃａｃａａｇｇｃｃｔｇｔｔａｃｔａｇｃａｃｔｃａｃａｔｇｇａａｃａａａｔｇｇｃｃｃａｇａｔｃｔｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、ａｃｃｇｇｔｃａｇｇａｃａｃａａｇｇｃｃｔｇｔｔａｃｔａｇｃａｃｔｃａｃａｔｇｇａａｃａａａｔｇｇｃｃｃａｇａｔｃｔｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇと８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％の相同性を有する配列などを含む。

【0095】

前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～５位の塩基が欠失されている。前記補償配列は、ＲＮＡ断片に１つのＲＮＡ配列のみが含まれる場合、このＲＮＡ配列の逆相補配列であってもよく、その中の任意の１～５位の塩基が欠失されている。

【0096】

好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～３位の塩基が欠失されている。前記補償配列は、ＲＮＡ断片に１つのＲＮＡ配列のみが含まれる場合、このＲＮＡ配列の逆相補配列であってもよく、その中の任意の１～３位の塩基が欠失されている。

【0097】

より好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～３位の連続して配列した塩基が欠失されている。前記補償配列は、ＲＮＡ断片に１つのＲＮＡ配列のみが含まれる場合、このＲＮＡ配列の逆相補配列であってもよく、その中の任意の１～３位の連続して配列した塩基が欠失されている。

【0098】

最も好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の９位及び／又は１０位の塩基が欠失されている。前記補償配列は、ＲＮＡ断片に１つのＲＮＡ配列のみが含まれる場合、このＲＮＡ配列の逆相補配列であってもよく、その中の９位及び／又は１０位が欠失されている。９位と１０位の塩基の欠失が最も効果的である。

【0099】

なお、上記のフランキング配列、補償配列、ループ配列はすべて勝手に選択したのではなく、大量の理論研究と試験に基づいて決定したので、上記の特定のフランキング配列、補償配列、ループ配列の協力の下で、ＲＮＡ断片の発現率を最大限に高めることができる。

【0100】

図６４～６６は、８０％超の相同性を有する２種類の５’フランキング配列、ループ配列及び３’フランキング配列を送達システム（プラスミド）に構築した後、肺中での富化効果及び治療効果をそれぞれ示し、具体的には、図６４は、５’フランキング配列が８０％超の相同性を有するプラスミドの肺での富化効果及び治療効果であり、図６５は、ループ配列が８０％超の相同性を有するプラスミドの肺での富化効果及び治療効果であり、図６６は、３’フランキング配列が８０％超の相同性を有するプラスミドの肺での富化効果及び治療効果である。

【0101】

上記の各配列の詳細を以下の表１に示す。

【表1】

【0102】

ＲＮＡ断片は、１つ、２つ以上の医療的に意味があってかつ発現可能なＲＮＡ配列を含んでもよく、ＲＮＡ配列はｓｉＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ配列又はｍｉＲＮＡ配列であってもよいが、好ましくは、ｓｉＲＮＡ配列である。

【0103】

１つのＲＮＡ配列の長さが、１５～２５ヌクレオチド（ｎｔ）、好ましくは１８～２２ｎｔ、例えば、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔであってもよい。この配列の長さの範囲はランダムに選択されたものではなく、試験を繰り返すことによって決定されたものである。大量の試験により、ＲＮＡ配列の長さが１８ｎｔよりも短く、特に１５ｎｔよりも短い場合、このＲＮＡ配列はほとんど無効で、作用を発揮しないが、ＲＮＡ配列の長さが２２ｎｔよりも長く、特に２５ｎｔよりも長い場合、回路のコストが大幅に向上するだけでなく、効果も長さが１８～２２ｎｔのＲＮＡ配列より優れておらず、経済効果が悪いことが証明された。したがって、ＲＮＡ配列の長さが１５～２５ｎｔ、特に１８～２２ｎｔの場合、コストと作用の両立が最も効果的である。

【0104】

様々な長さのＲＮＡ配列を以下の表２に示す。

【表2】

【0105】

図６７は、様々な長さのＲＮＡ配列によって構築された送達システム（プラスミド）の静脈注射後のＥＧＦＲ発現量の検出をそれぞれ示し、その中で、ＲＮＡ配列の長さがそれぞれ１８、２０、２２のプラスミドはそれぞれＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ（１８）、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ（２０）、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ（２２）に対応している。

【0106】

好ましくは、上記ＲＮＡ配列は、ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＫＲＡＳ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＶＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＴＯＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｂ７遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ－β１遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｋ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｌ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＨＬＡ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＧＤＦ１５遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ－２１のアンチセンス鎖、ｍｉＲＮＡ－２１４のアンチセンス鎖、ＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＨＴＴ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｌｒｒｋ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子のｓｉＲＮＡ、又は上記配列と８０％超の相同性を有するＲＮＡ配列、又は上記ＲＮＡをコードする核酸分子から選択されるいずれか１つ又は複数である。

【0107】

上記の各種遺伝子のｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖はいずれもこの遺伝子、ｍｉＲＮＡの発現又は突然変異を阻害することにより、疾患を阻害する効果を達成することができる。これらの疾患には、癌、肺線維症、結腸炎、肥満、肥満に起因する心血管疾患、２型糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、重症筋無力症、アルツハイマー病、移植片対宿主病、及びこれらに関連する疾患が含まれるが、これらに限定されない。ここで関連疾患とは、上記のいずれか１又は複数の疾患の発症又は進行の過程で発生する関連疾患、合併症、後遺症など、又は上記の疾患と一定の関連性を有する他の疾患をいう。ここで、癌には、胃癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、脳癌、血液癌、腸癌、皮膚癌、リンパ癌、乳癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、血管腫、膠細胞腫、黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。

【0108】

好ましくは、上記ＲＮＡは、その中のＲＮＡ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ）をリボース修飾することによって得られてもよく、２’フルオロピリミジン修飾が好ましい。２’フルオロピリミジン修飾はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ上のピリミジンヌクレオチドの２’－ＯＨを２’－Ｆで置換することであり、２’－Ｆは、人体内のＲＮＡ酵素をｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを識別しにくくすることができ、このようにＲＮＡの体内送達の安定性を高めることができる。

【0109】

ターゲティングタグは、ターゲティング機能を有するターゲティングペプチド、ターゲティングタンパク質又は抗体から選択される１種であってもよい。ターゲティングペプチドには、ＲＶＧターゲティングペプチド（ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１で示される）、ＧＥ１１ターゲティングペプチド（ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２で示される）、ＰＴＰターゲティングペプチド（ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３で示される）、ＴＣＰ－１ターゲティングペプチド（ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４で示される）、ＭＳＰターゲティングペプチド（ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５で示される）が含まれるが、これらに限定されない。ターゲティングタンパク質には、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質（ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６で示される）、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質（ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７で示される）、ＰＴＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質（ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８で示される）、ＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質（ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９で示される）、ＭＳＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質（ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０で示される）が含まれるが、これらに限定されない。

【0110】

その中で、ＲＶＧターゲティングペプチド、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、脳組織を正確に標的化することができる。ＧＥ１１ターゲティングペプチド、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ高発現器官組織、例えばＥＧＦＲ突然変異肺癌組織を正確に標的化することができる。ＰＴＰターゲティングペプチド、ＰＴＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、膵臓、特にヒト由来とマウス由来の膵臓癌組織中に特異的に発現するｐｌｅｃｔｉｎ－１タンパク質を正確に標的化することができる。ＴＣＰ－１ターゲティングペプチド、ＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、結腸を正確に標的化することができる。ＭＳＰターゲティングペプチド、ＭＳＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、筋肉組織を正確に標的化することができる。

【0111】

実際の応用において、ターゲティングタグは各種の異なるＲＮＡ断片と柔軟に組み合わせることができ、異なるターゲティングタグを異なるＲＮＡ断片と組み合わせることにより、様々な作用を果たすことができる。例えば、ＲＶＧターゲティングペプチド、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡ、又は両者の組み合わせと組み合わせて膠芽腫を治療することができ、また、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡと組み合わせて肥満を治療することができ、また、ｍＨＴＴ遺伝子のｓｉＲＮＡと組み合わせてハンチントン舞踏症を治療することができ、また、ＬＲＲＫ２遺伝子のｓｉＲＮＡと組み合わせてパーキンソンを治療することができる。ＧＥ１１ターゲティングペプチド、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡと組み合わせて、ＥＧＦＲ遺伝子の高発現又は突然変異によって誘導される肺癌などの疾患を治療することができる。ＴＣＰ－１ターゲティングペプチド又はＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｂ７遺伝子のｓｉＲＮＡ、又はこれら３つの任意の組み合わせと組み合わせて結腸炎又は結腸癌などを治療することができる。

【0112】

なお、本願による遺伝子回路は、ＲＮＡ断片のみを含んでもよいし、ターゲティングタグのみを含んでもよいし、ＲＮＡ断片とターゲティングタグを組み合わせたものであってもよい。該遺伝子回路は、ＲＮＡ断片のみを含む場合体内に入って遺伝子発現を阻害する作用を発揮し、それによって、疾患の発症及び進行を阻害することができ、ターゲティングタグのみを含む場合、極めて優れたターゲティング機能を持ち、ＲＮＡ断片のみを含む遺伝子回路と併用されて、ＲＮＡ断片が標的器官や標的組織に速く送達されて作用を発揮するようにし、ＲＮＡ断片とターゲティングタグを組み合わせたものである場合、ターゲティング機能と治療機能の両方を持ち、標的器官及び標的組織に効率的かつ正確に送達されて治療作用を発揮することができ、効率が高く、効果が良好であり、大規模な普及や応用に好適である。
実施例２

【0113】

実施例１に基づいて、本実施例は、実施例１に記載の遺伝子回路と、前記遺伝子回路を宿主の器官組織に送達して富化させることができる送達ベクターと、を含むＲＮＡ送達システムを提供する。

【0114】

遺伝子回路を担持した送達ベクターは、宿主の器官組織内で富化し、前記宿主の器官組織内に複合構造を内因的に自発的に形成することができ、ターゲティングタグは複合構造の表面に位置し、前記複合構造は、ターゲティングタグを介して標的組織を探索し結合し、標的組織に前記ＲＮＡ断片を送達する。上記器官組織は肝臓であり、複合構造はエクソソームであり、標的組織は治療が必要となる器官又は組織である。

【0115】

具体的には、肝臓は外因性送達ベクターを飲み込み、９９％までの外因性送達ベクターは肝臓に入るため、外因性送達ベクターには特異性設計をする必要がなく、外因性送達ベクターは肝臓組織中に富化することができ、その後外因性送達ベクターが開かれ、ＲＮＡ断片（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）が放出され、肝臓組織は上記のＲＮＡ断片をエクソソーム内に自発的に包み込み（自己集合）、これらのエクソソームはＲＮＡ送達機構になる。

【0116】

ｓｉＲＮＡ配列前駆体を以下の表３に示す。

【表3】

【0117】

好ましくは、このＲＮＡ送達機構（エクソソーム）に「正確な誘導」能力を持たせるために、送達ベクターの遺伝子回路にターゲティングタグが設計され、このターゲティングタグも肝臓組織によってエクソソームに自己集合され、特にある特定のターゲティングタグを選択すると、ターゲティングタグはエクソソームの表面に挿入され、それによってエクソソームを誘導することができるターゲティング構造となり、例えばターゲティングタグがターゲティングタンパク質である場合、ターゲティングタグは膜タンパク質（好ましくはＬａｍｐ２ｂ）を介してエクソソームの表面にアンカーされ、エクソソームを誘導して標的組織に送達し、これは本発明に記載されたＲＮＡ送達システムの正確性を大幅に向上させ、一方では導入する必要のある外因性送達ベクターの使用量を大幅に減少させることができ、他方では潜在的な薬物送達効率を大幅に向上させることができる。

【0118】

実際の応用において、該送達ベクターは、１つの、２つ以上の実施例１に記載の遺伝子回路を担持してもよい。例えば、神経膠腫を治療する場合、同一の送達ベクターにＥＧＦＲ遺伝子ｓｉＲＮＡを含む遺伝子回路とＴＮＣ遺伝子ｓｉＲＮＡを含む遺伝子回路（ターゲティングタグを含んでもよく、含まなくてもよいが、ターゲティングタグを含む方は効果がより優れた）が併用されてもよく、腸炎を治療する場合、同一の送達ベクターにＴＮＦ－α遺伝子ｓｉＲＮＡを含む遺伝子回路、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子ｓｉＲＮＡを含む遺伝子回路、及びＢ７遺伝子ｓｉＲＮＡを含む遺伝子回路（ターゲティングタグを含んでもよく、含まなくてもよいが、ターゲティングタグを含む方は効果がより優れた）が設置されてもよく、ハンチントン舞踏症を治療する場合、１つの送達ベクターにｍＨＴＴ遺伝子ｓｉＲＮＡを含む遺伝子回路が設置されてもよく、また、ｍＨＴＴ遺伝子ｓｉＲＮＡとターゲティングタグの両方を含む遺伝子回路が設置されてもよく、ｍＨＴＴ遺伝子ｓｉＲＮＡを含む遺伝子回路とターゲティングタグを含む遺伝子回路が設置されてもよい。

【0119】

送達ベクターが２つ以上の遺伝子回路を担持する場合、隣接する遺伝子回路は、配列１－配列２－配列３で連結されてもよく、ここで、配列１はＣＡＧＡＴＣであることが好ましく、配列２は５～８０塩基からなる配列、例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５塩基からなる配列、好ましくは、１０～５０塩基からなる配列、より好ましくは２０～４０塩基からなる配列であってもよく、配列３はＴＧＧＡＴＣであることが好ましい。

【0120】

より好ましくは、送達ベクターが２つ以上の遺伝子回路を担持する場合、隣接する遺伝子回路は、配列４又は配列４と８０％超の相同性を有する配列で連結され、配列４は、ＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣである。

【0121】

図６８は、配列４及び２条与配列４が８０％超の相同性を有する配列４－１、４－２によって構築される送達システムの静脈注射９時間後の肺部組織のＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ含有量の検出結果を示す。

【0122】

配列４の相同配列を以下の表４に示す。

【表4】

【0123】

同一送達ベクターに「ｓｉＲＮＡ１」と「ｓｉＲＮＡ２」を併用する例では、該送達ベクターの機能構造領域は、（プロモーター－ｓｉＲＮＡ１）－連続配列－（プロモーター－ｓｉＲＮＡ２）－連続配列－（プロモーター－ターゲティングタグ）、又は（プロモーター－ターゲティングタグ－ｓｉＲＮＡ１）－連続配列－（プロモーター－ターゲティングタグ－ｓｉＲＮＡ２）、又は（プロモーター－ｓｉＲＮＡ１）－連続配列－（プロモーター－ターゲティングタグ－ｓｉＲＮＡ２）などと表現することができる。

【0124】

より具体的には、該送達ベクターの機能構造領域は、（５’－プロモーター－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ１－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）－連続配列－（５’－プロモーター－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ２－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）－連続配列－（５’－プロモーター－ターゲティングタグ）、又は（５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ１－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）－連続配列－（５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ２－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）、又は（５’－プロモーター－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ１－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）－連続配列－（５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ２－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）、（５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ１－ｓｉＲＮＡ２－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）などと表現することができる。その他の場合は同様に類推することができるので、ここでは詳しく説明しない。上記連結配列は、「配列１－配列２－配列３」又は「配列４」としてもよく、１つの括弧は完全な遺伝子回路を表す。

【0125】

本実施例では、前記送達ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターであってもよく、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターを含み、非ウイルスベクターは、プラスミドベクター、リポソームベクター、カチオン性ポリマーベクター、ナノ粒子ベクター、多機能エンベロープナノベクターを含む。

【0126】

好ましくは、送達ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター又はプラスミドベクターである。アデノ随伴ウイルスベクターは、より好ましくは、アデノ随伴ウイルスベクター５型、アデノ随伴ウイルスベクター８型又はアデノ随伴ウイルスベクター９型である。

【0127】

以上の送達システムは、いずれもヒトを含む哺乳動物で使用され得る。

【0128】

遺伝子回路を構築し、その自己集合及び放出を検証するために、以下の試験を行った。

【0129】

まず、図５３ａに示すように、遺伝子回路のインフラストラクチャを合理的に設計し、異なる機能モジュールを自由に組み合わせることができるようにした。コア回路はプロモーター部分とｓｉＲＮＡ発現部分からなり、ｓｉＲＮＡを産生して組織し、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）のペイロードとすることを目的とする。他の組み合わせ可能なコンポーネント（プラグイン）は、プラグアンドプレイ機能を実現するためにコア回路のフレームワークに統合することができる。例えば、２種類の組み合わせ可能な部分を結合してｓｉＲＮＡの作用を最適化する。一方は、エクソンの膜アンカータンパク質を修飾して組織選択性を実現し、他方は、２つの分子標的を同時に阻害するために、２つ目のｓｉＲＮＡを共発現することができる。

【0130】

コア回路構築物については、図５３ａに示すように、ガイド鎖（ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ）の発現を最大化しながら、望ましくないパッセンジャー鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ）の発現を最小化するために、プロモーター部分の制御下で最適化されたｓｉＲＮＡ発現骨格部分をコード化するスキームを設計した。上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＥＧＦＲ）は、多くのヒト腫瘍（例えば、肺癌や膠芽腫）において頻繁に突然変異し、高発現する癌遺伝子であり、ｓｉＲＮＡ標的として選択された。そして、ヒト胚腎２９３ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）とマウス肝癌細胞（ｈｅｐ１－６）をｓｉＲＮＡ生体外集合用のシャーシ細胞（ｃｅｌｌ ｃｈａｓｓｉｓ）として選択した。ｓｉＲＮＡの産生効率を最適化するために、以下の２種類の設計スキームを比較した。一方は、ＣＭＶプロモーターを用いてｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）を発現し、ｍｉＲＮＡ配列をｓｉＲＮＡで置換することであり、他方は、Ｕ６プロモーターを用いて短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現することである。まず、一連のｍｉＲＮＡ前駆体の構造を研究し、ｓｉＲＮＡを産生する最適な骨格としてｐｒｅ－ｍｉＲ－１５５を選択した。次に、図５３ｂに示すように、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ（ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ）及びＵ６指向性ＥＧＦＲ ｓｈＲＮＡ（Ｕ６－ｓｉＲ^Ｅ）をコードするＣＭＶ指向性（ＣＭＶ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのｓｉＲＮＡ産生効率を比較した。２つのスキームは、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡガイド鎖の転写を駆動する面で類似の効率を持っているが、図５３ｂに示すように、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ法は、ｓｈＲＮＡ法に比べて、生成されたパッセンジャー鎖がより少ないか、又は生成されない（成熟したガイド鎖の生物発生過程で、パッセンジャー鎖は分解されるようである）。そのため、オフターゲット効果を回避するために、ＣＭＶ駆動ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを選択して設計するようにした。

【0131】

次に、コア遺伝子回路がエクソソームに自律的に組み込むようにｓｉＲＮＡを誘導できるか否かを調べる。ＣＭＶ－ｓｃｒＲ又はＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ遺伝子を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、細胞培養液中のエクソソームを観察した。ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）により、各群が分泌したエクソソームは、数が類似し、大きさの分布が類似し、ピーク値が１２８～１３１ｎｍの間であることが示された。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により、精製したエクソソームは典型的な円形小胞形態を呈し、大きさが正確であることを証明した。さらに、特定のエクソンマーカー（ＣＤ６３、ＴＳＧ１０１及びＣＤ９）の富化は、精製エクソームでのみ検出され、細胞培地では検出されなかった。これらの結果は、遺伝子回路トランスフェクションが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が産生するエクソームの大きさ、構造や量に影響を及ぼさないことを示している。最後に、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ回路でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ及びＨｅｐａ１－６細胞由来のエクソソームからは、図５３ｃに示すように、大量のＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡが検出された。図５３ｄ、図５３ｅに示すように、これらのエクソソームは、マウスＬｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）細胞と一緒にインキュベートする時、ＥＧＦＲ発現の用量依存性が低下し、このことから、エクソソームｓｉＲＮＡが生物学的機能を有することが示唆された。

【0132】

遺伝子回路のターゲティングタグを設計するために、図５３ａに示すように、Ｌａｍｐ２ｂタンパク質（典型的なエクソソーム膜タンパク質）のＮ末端に融合したターゲティングタグをコードする配列をＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。このタグはＬａｍｐ２ｂを介してエクソソームの表面にアンカーされ、それによって、複合構造エクソソームを所望の組織に送達するように誘導する。具体的には、ＲＶＧペプチドを標的とする中枢神経系を標識として選択し、エクソソームを脳に導入し（ＲＶＧはエクソソームが血液脳関門を通過して神経細胞に入るのを助けることが証明されている）、まず、プロモーターがＲＶＧ－Ｌａｍｐ２ｂ融合タンパク質の発現を開始する効率を評価した。試験により、ＣＭＶプロモーターはＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＲＶＧ－Ｌａｍｐ２ｂ ｍＲＮＡと標識タンパク質ｅＧＦＰの産生に一定の効果があることが証明されたが、Ｕ６プロモーターには効果がなく、このことから、ＣＭＶプロモーターが遺伝子回路の各部分に連結されたことによる優位性が実証された。次に、免疫沈殿法を用いて、ターゲティングタグがエクソソーム表面で正しく発現していることをガイドして検証した。試験では、抗ＲＶＧ抗体が一時的に不足していたため、ＲＶＧの代わりにＦｌａｇタグを一時的に使用した。図５３ｆに示すように、ＣＭＶガイドＦｌａｇ－Ｌａｍｐ２ｂ回路を用いてＨＥＫ２９３ＴとＨｅｐａ１－６細胞をトランスフェクションした後、抗Ｆｌａｇビーズを用いて完全なエクソソームを免疫沈殿させることに成功し、このことから、ターゲティングタグを正確に位置決めすることが証明された。追加のｓｉＲＮＡ発現部分を設計するために、多くの癌、特に膠芽腫に関連する主要な癌遺伝子ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ（ＴＮＣ）を第２のｓｉＲＮＡ標的として使用した。ＴＮＣ－ｓｉＲＮＡも、図５３に示すように、前ｍｉＲ－１５５骨格に埋め込まれ、ＥＧＦＲ－ｓｉＲＮＡの下流に挿入されている。図５３ｇに示すように、単一（ＣＭＶ ｓｉＲ^Ｅ又はＣＭＶ ｓｉＲ^Ｔ）の転写かタンデム（ＣＭＶ ｓｉＲ^Ｅ）転写かにかかわらず、ＥＧＦＲとＴＮＣ ｓｉＲＮＡの差がほとんど検出されなかった。いずれにせよ、これらの結果は、ｓｉＲＮＡもターゲティングタグも、遺伝子回路においてそれぞれの役割を果たすことを示唆している。

【0133】

さらに、ＡＧＯ２は生体内で広く発現し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体の中核成分であり、エンドリボヌクレアーゼ活性を有し、ｓｉＲＮＡの成熟を促進し、その生合成と機能を調節することにより、標的遺伝子の発現を阻害することができる。
ｓｉＲＮＡの加工はＡｒｇｏｎａｕｔｅ２（ＡＧＯ２）に依存しており、ｓｉＲＮＡをＡＧＯ２に適切に組み込むことでｓｉＲＮＡのターゲティング作用を高めることが期待されることから、ＡＧＯ２とエクソソーム中のｓｉＲＮＡとの関連を評価するために別の免疫沈殿実験を行った。試験により、ＡＧＯ２抗体（ａｎｔｉ－ＡＧＯ２）で沈殿させたエクソソーム中にＥＧＦＲ及びＴＮＣ ｓｉＲＮＡが容易に検出できることが証明され、これは、我々の設計がｓｉＲＮＡをＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードすることを保証し、ＡＧＯ２が結合されるｓｉＲＮＡのエクソソームへの効率的な輸送を促進することを明らかにした。最後に、生体外で集合されたｓｉＲＮＡが機能するか否かを調べるために、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ回路でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のエクソソームをＵ８７ＭＧ膠芽腫細胞と共にインキュベートした。図５３ｉ、図５３ｊに示すように、Ｕ８７ＭＧ細胞においてＥＧＦＲとＴＮＣ発現の用量依存性の低下を実現した。さらに、エクソソームの表面にあるＲＶＧタグは、ＥＧＦＲ及びＴＮＣ ｓｉＲＮＡの標的に対するサイレンシング効果に影響を与えなかった。これらの結果は、回路を複数の組み合わせ可能な部分の有機的な結合として確立し、これらの部分の巧みな結合がＲＮＡの自己集合と放出を可能にした。

【0134】

要するに、本実施例によるＲＮＡ送達システムは、遺伝子回路を送達ベクターに付着させて、体内に送達し、この遺伝子回路は、宿主の器官組織内でよく富化し、自己集合して複合構造を形成し、最終的に効果を発揮するＲＮＡ断片は該複合構造によって包まれて送達され、免疫反応は一切存在せず、安全性が高く、特に、ＲＮＡ断片はＡＧＯ２タンパク質と結合されて、送達効率及び遺伝子阻害効果ヲ高めることもできる。該送達システムは、各種の小分子ＲＮＡを送達することができ、汎用性が高い。遺伝子回路を付着させる送達ベクターの製造はエクソソームやタンパク質、ポリペプチドなどの物質の製造よりも安価で経済的であり、プロセスがより簡単で、品質の標準化に有利であり、使用時の安定性を向上させ、経済性が高い。
実施例３

【0135】

実施例２に基づいて、本実施例は、送達ベクターとしてプラスミドを用いたＲＮＡ送達システムを提供する。

【0136】

図１Ａに示すように、プラスミドの体内での分布を理解するために、マウスに平板試験を行い、図１Ａに示すように、マウスにプラスミドを注射した後、時点（１ｈ、３ｈ、６ｈ、９ｈ、１２ｈ、２４ｈ、７２ｈ、１６８ｈ、７２０ｈ）でサンプリングし、スペクチノマイシンで抽出したプラスミドを用いて形質転換を行い、肝臓、血漿、肺、脳、腎臓、脾臓中のクローンの数を観察した結果、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄに示すように、プラスミドはマウスの肝臓中に最も多く分布し、注射後約３ｈにピークに達し、注射１２ｈ後には、すでに基本的に代謝されていることがわかった。

【0137】

ｅＧＦＰタンパク質とＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡを共発現したＣＭＶ ｅＧＦＰ ｓｉＲ^Ｅ遺伝子回路（ｃｉｒｃｕｉｔ）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに静脈注射した結果、図２に示すように、時間の経過とともにマウスの肝臓内のｅＧＦＰ蛍光は徐々に増強し、約１２時間でピークに達し、４８時間で背景レベルまで低下し、他の組織では明らかなｅＧＦＰシグナルは見られなかった。

【0138】

対照プラスミド（ＣＭＶ－ｓｃｒＲ）、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ発現プラスミド（ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ）をそれぞれマウスに注射し、マウス肝細胞の生体外モデルを作成し、ＣＭＶ－ｓｃｒＲとＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスの肝細胞エクソソーム中のｓｉＲＮＡレベルをそれぞれ検出した結果、図３Ａに示すように、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスの肝細胞エクソソームにｓｉＲＮＡの発現が存在することを認めた。

【0139】

一般に、Ａｇｏ２タンパク質との結合がｓｉＲＮＡの機能に必要な条件であると考えており、すなわち、エクソソーム中のｓｉＲＮＡがＡｇｏ２タンパク質と結合することができるので、Ａｇｏ２免疫沈殿実験を行い、その結果を図３Ｂ、図３Ｃに示す。ここで、Ｉｎｐｕｔは免疫沈殿を介さずにエクソソームを直接開裂して検出したサンプルであり、陽性対照を表している。

【0140】

マウスにプラスミドを静脈注射した後、成熟ｓｉＲＮＡの様々な組織における分布を図４に示す。図４Ａから、血漿、エクソソーム、エクソソームフリーの血漿中のＥＧＦＲ－ｓｉＲＮＡレベルは時間依存的に変化することがわかった。図４Ｂから、マウスＥＧＦＲ－ｓｉＲＮＡの肝、肺、膵臓、脾臓、腎臓への蓄積に時間依存性があることが分かった。

【0141】

対照プラスミド（ＣＭＶ－ｓｃｒＲ）、０．０５ｍｇ／ｋｇのＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミド、０．５ｍｇ／ｋｇのＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミド、５ｍｇ／ｋｇのＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミドをマウスにそれぞれ注射し、マウスの肝臓、脾臓、心臓、肺、腎臓、膵臓、脳、骨格筋、ＣＤ４^＋細胞中の絶対ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ）レベルを検出した結果、図５Ａに示すように、対照プラスミドを注射したマウスの組織では、ｓｉＲＮＡの発現がなく、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミドを注射したマウスでは、各組織におけるｓｉＲＮＡ発現レベルとＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミド濃度は正の相関を示すことが分かった。図５Ｂに示すように、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション試験（ＦＩＳＨ）でも、ｓｉＲＮＡ発現レベルとＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミド濃度は正の相関を示し、すなわちＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡの組織中の分布には用量依存性があることが確認された。

【0142】

プラスミドは体内に入ると前駆体（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）を発現し、成熟体（ｓｉＲＮＡ）に加工されるので、プラスミドを注射した後のマウスの肝臓における前駆体（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）と成熟体（ｓｉＲＮＡ）の代謝を調べ、その結果を図６に示す。プラスミド注射６時間後の時点で、マウスの肝臓における前駆体（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）と成熟体（ｓｉＲＮＡ）の発現レベルがピークに達し、プラスミド注射３６時間後では、マウスの肝臓における成熟体（ｓｉＲＮＡ）の代謝が完了し、プラスミド注射４８時間後では、マウスの肝臓における前駆体（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）の代謝が完了していることがわかった。

【0143】

マウスの総胆管に外因性ｓｉＲＮＡを注射した後、マウスのエクソソームフリー血漿（ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅ）、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、血漿中の絶対ｓｉＲＮＡレベルをそれぞれ検出し、その結果を図７Ａに示す。マウスの総胆管に外因性ｓｉＲＮＡを注射した後、マウスの脾臓、心臓、肺、腎臓、膵臓、脳、骨格筋、ＣＤ４^＋細胞中のｓｉＲＮＡのレベルをそれぞれ検出し、その結果を図７Ｂに示す。この２つの図は、異なる組織におけるｓｉＲＮＡの動態学がほぼ同じであり、異なる組織におけるｓｉＲＮＡの分布には有意差があることを反映している。

【0144】

アルブミンＡＬＢをプロモーターとするｓｉＲＮＡ、ＣＭＶをプロモーターとするｓｉＲＮＡ、プロモーターを含まないｓｉＲＮＡをそれぞれマウスの体内に静脈注射し、注射後０ｈ、３ｈ、６ｈ、９ｈ、１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈにそれぞれマウスの体内の絶対ｓｉＲＮＡレベルを検出し、その結果を図８に示す。マウスの体内では、ＣＭＶをプロモーターとするｓｉＲＮＡのレベルが最も高く、すなわち、ＣＭＶをプロモーターとする効果が最も優れていることがわかった。

【0145】

自己集合したｅＧＦＰ ｓｉＲＮＡによるマウスの体内のｅＧＦＰレベルに対する阻害を以下のように蛍光試験により観察した。ｅＧＦＰトランスジェニックマウスにＰＢＳ又は５ｍｇ／ｋｇ ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｇ又はＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｇプラスミドを静脈注射し、治療２４時間後にマウスを殺し、冷凍切片中でそのｅＧＦＰ蛍光レベルを検出し、図９Ａには代表的な蛍光顕微鏡画像が示されており、ここで、緑色は陽性ｅＧＦＰシグナルを示し、青色はＤＡＰＩ染色の細胞核を示し、縮尺は１００μｍである。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＧプラスミドはマウスのｅＧＦＰに対する阻害効果がより明らかであることが分かった。ｅＧＦＰトランスジェニックマウスにＰＢＳ又はＣＭＶ－ｓｃｒＲ又はＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミドを静脈注射し、治療２４時間後にマウスを殺し、冷凍切片中でそのｅＧＦＰ蛍光レベルを検出し、図９ＢはＰＢＳ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスの心臓、肺、腎臓、膵臓、脳、骨格筋の蛍光強度（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の比較棒グラフであり、マウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓部位での蛍光強度のコントラストはさらに明らかであることが分かった。

【0146】

ＰＢＳ、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスについて、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、血清アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、クレアチニン（ＣＲＥＡ）含有量及び胸腺重量、脾臓重量、末梢血球のパーセンテージ（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）をそれぞれ検出し、それらの結果を図１０に示し、図１０Ａ～Ｆは、それぞれ、ＰＢＳ、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅをそれぞれ注射したマウスのアラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、総ビリルビン、血中尿素窒素、血清アルカリホスファターゼ、クレアチニン含有量の比較図であり、図１０Ｇは、マウスの肝臓、肺、脾臓、腎臓組織の比較図であり、図１０Ｈ～Ｉは、マウスの胸腺、脾臓組織の比較図であり、図１０Ｊは、マウスの末梢血球のパーセンテージ（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）の比較図である。

【0147】

その結果、ＰＢＳ、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスでは、ＡＬＴ、ＡＳＴなどの含有量及び胸腺重量、脾臓重量、末梢血球のパーセンテージはほとんど変わらず、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスは、ＰＢＳを注射したマウスに比べ、肝臓、肺、脾臓、腎臓にも組織損傷がなかった。

【0148】

従って、本実施例によるＲＮＡ送達システムは、プラスミドをベクターとし、プラスミドを成熟した注入物とし、その安全性及び信頼性が十分に検証されており、創薬性が非常に良好である。最終的に効果を発揮するＲＮＡ配列は内因性エクソソームに包み込まれて送達され、免疫反応は一切存在せず、このエクソソームの安全性を検証する必要はない。この送達システムは、各種の小分子ＲＮＡを送達することができ、汎用性が高い。またプラスミドの製造はエクソソームやタンパク質、ポリペプチドなどの物質の製造よりも安価で経済的である。本実施例によるＲＮＡ送達システムは、生体内で自己集合された後、ＡＧＯ_２と緊密に結合して富化して複合構造（エクソソーム）になることができ、これにより、その早期分解を防止し、循環中の安定性を維持することができるだけではなく、受容体細胞による吸収、細胞質内での放出、及びリソソームの脱出に有利であり、必要な用量は低い。
実施例４

【0149】

実施例２に基づいて、本実施例は、ＲＮＡ送達システムを提供し、該送達システムに使用される送達ベクターはウイルスである。該ウイルスは、実施例１に記載の遺伝子回路を担持することができ、宿主の器官組織内で富化し、前記宿主の器官組織内にＲＮＡ断片を含有するとともにターゲティング構造を有する複合構造を内因的に自発的に形成することができ、前記複合構造はターゲティング構造を介して標的組織を探索し結合し、標的組織に前記ＲＮＡ断片を送達することができる。

【0150】

本実施例による、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムは、ウイルスをベクターとし、ウイルスベクターを成熟した注入物とし、その安全性及び信頼性が十分に検証されており、創薬性が非常に良好である。最終的に効果を発揮するＲＮＡ配列は内因性エクソソームに包み込まれて送達され、免疫反応は一切存在せず、このエクソソームの安全性を検証する必要はない。この送達システムは、各種の小分子ＲＮＡを送達することができ、汎用性が高い。またウイルスベクターの製造はエクソソームやタンパク質、ポリペプチドなどの物質の製造よりも安価で経済的である。本実施例による、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムは、生体内で自己集合された後、ＡＧＯ_２と緊密に結合して富化して複合構造（エクソソーム）になることができ、これにより、その早期分解を防止し、循環中の安定性を維持することができるだけではなく、受容体細胞による吸収、細胞質内での放出、及びリソソームの脱出に有利であり、必要な用量は低い。
実施例５

【0151】

実施例１～２に基づいて、本実施例は薬物を提供する。該薬物は送達ベクターを含み、前記送達ベクターは、実施例１に記載の遺伝子回路を担持し、宿主の器官組織内で富化し、前記宿主の器官組織内にＲＮＡ断片を含有するとともにターゲティング構造を有する複合構造を内因的に自発的に形成することができ、前記複合構造はターゲティング構造を介して標的組織を探索し結合し、標的組織に前記ＲＮＡ断片を送達することができる。

【0152】

該薬物は、経口投与、吸入投与、皮下注射投与、筋肉注射投与又は静脈注射投与により人体に入った後、実施例２に記載のＲＮＡ送達システムによって標的組織に送達され、治療作用を発揮することができる。

【0153】

該薬物は、癌、肺線維症、結腸炎、肥満、肥満に起因する心血管疾患、２型糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、重症筋無力症、アルツハイマー病、移植片対宿主病、及びそれらの関連疾患を治療する薬物であってもよい。

【0154】

本実施例の薬物は、希釈剤、緩衝剤、乳剤、カプセル化剤、賦形剤、充填剤、バインダ、スプレー剤、経皮吸収剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、着色剤、矯味剤、アジュバント、乾燥剤、吸着担体などを含むがこれに限定されない、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。

【0155】

本実施例による薬物の剤形は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸薬、座薬、軟膏剤、溶液剤、懸濁剤、ローション剤、ゲル剤、ペースト剤などであってもよい。

【0156】

薬物中の送達ベクター、遺伝子回路、ターゲティングタグなどの説明につては、実施例１および実施例２を参照することができるので、ここでは詳しく説明しない。

【0157】

本実施例では、ＲＮＡ送達システムは、薬物に使用されると、薬物送達プラットフォームを提供し、このプラットフォームを通じてより多くのＲＮＡ系薬物の研究開発基盤が提供され得、ＲＮＡ系薬物の研究開発及び使用に極めて大きな推進効果をもたらすことができる。
実施例６

【0158】

実施例３に基づいて、本実施例は、薬物におけるＲＮＡ送達システムの使用を提供し、該ＲＮＡ送達システムに使用される送達ベクターはプラスミドであり、該薬物は肺癌治療薬である。以下の試験により具体的に説明する。

【0159】

図１１Ａに示すように、マウスを選択し、マウスの体内にマウス肺癌細胞（ＬＬＣ細胞）を注射した後、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅをマウスに２日ごとに注射して治療を行い、マウスの生存分析と腫瘍評価をそれぞれ行い、３０日目に治療を開始し、４４日目に治療を終了した。ここで、ＣＭＶ－ｓｃｒＲは対照プラスミド、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ＥはＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ遺伝子回路を担持したプラスミドを表す。

【0160】

図１１Ｂに示すように、横軸は時間、縦軸は生存率を表しており、この図から、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスは最も生存率が高かったことが分かった。

【0161】

図１１Ｃに示すように、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスの治療前と治療後に、ＣＴ画像に基づいてマウスの肺組織を３Ｄモデル化したところ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスでは、腫瘍が著しく減少することが分かった。

【0162】

図１１Ｄに示すように、この図は、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスの治療前と治療後のマウスの腫瘍体積（ｍｍ^３）の比較図であり、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスでは、腫瘍体積が著しく減少した。一方、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブを注射したマウスでは、腫瘍体積が減少しないだけでなく、程度が異なるが、増加を示すことが分かった。

【0163】

図１１Ｅに示すように、この図は、正常マウス、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブ／ＣＭＶ－ｓｉ^ＲＥを注射したマウスのｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ比較図であり、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブを注射したマウスでは、ＥＧＦＲ遺伝子含有量が有意に高いことが分かった。

【0164】

図１１Ｆに示すように、この図は、正常マウス、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスのＥＧＦＲ ｍｉＲＮＡレベルの比較図であり、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブを注射したマウスでは、関連ＥＧＦＲ ｍｉＲＮＡレベルが高いことが分かった。

【0165】

以上から、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅは、ＥＧＦＲ突然変異肺癌腫瘍に対して顕著な治療効果を有する。

【0166】

ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスのそれぞれにＨＥ染色と免疫組織染色を行った結果、図１２Ａ～図１２Ｂに示すように、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブを注射したマウスでは、ＥＧＦＲはより多く発現していた。マウスにおけるＥＧＦＲとＰＣＮＡの着色面積を統計した結果、図１２Ｃ～図１２Ｄに示すように、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスでは、ＥＧＦＲとＰＣＮＡの着色面積はいずれも最も少なく、ＥＧＦＲ突然変異肺癌腫瘍に対する治療効果が最も良いことが分かった。

【0167】

図１３Ａに示すように、ＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｄｐ５３^－／－マウスを選択し、Ａｄｖ－Ｃｒｅ吸入後５０日目から６４日目まで、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅをマウスに２日ごとに注射して治療を行い、マウスの生存分析と腫瘍評価をそれぞれ行った。ここで、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ＫはＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ遺伝子回路を担持したプラスミドを表す。

【0168】

図１３Ｂに示すように、横軸は感染後の時間、縦軸は生存率を表しており、この図から、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスでは、生存率が高いことが分かった。

【0169】

図１３Ｃに示すように、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスの治療前と治療後にＣＴ画像に基づいてマウスの肺組織を３Ｄモデル化したところ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射することにより、肺癌腫瘍の増殖を著しく阻害することが分かった。

【0170】

図１３Ｄに示すように、この図は、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスの治療前と治療後の腫瘍数の比較図であり、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスでは、腫瘍数の増加が著しく少ないことが分かった。

【0171】

図１３Ｅに示すように、この図は、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスの治療前と治療後の腫瘍数（ｍｍ^３）の比較図であり、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスでは、腫瘍体積の増加が緩慢である。一方、ＣＭＶ－ｓｃｒＲを注射したマウスでは、腫瘍体積の増加が顕著であることが分かった。

【0172】

図１３Ｆに示すように、この図は、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスのｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ比較図であり、ＣＭＶ－ｓｃｒＲを注射したマウスでは、ＫＲＡＳ遺伝子含有量が有意に高いことが分かった。

【0173】

図１３Ｇに示すように、この図は、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスの関連ＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルの比較図であり、ＣＭＶ－ｓｃｒＲを注射したマウスでは、関連ＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルが高いことが分かった。

【0174】

以上から、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋは、ＫＲＡＳ突然変異肺癌腫瘍に対して顕著な治療効果を有する。

【0175】

ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスのそれぞれにＨＥ染色と免疫組織染色を行った結果、図１４Ａ、図１４Ｄ、図１４Ｅに示すように、ＣＭＶ－ｓｃｒＲを注射したマウスでは、ＫＲＡＳ、ｐ－ＡＫＴ、ｐ－ＥＲＫの発現が多く、着色率が高いことが分かった。ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔウエスタンブロット法を用いてマウスの体内の関連タンパク質の発現レベルを検出した結果、図１４Ｂ、図１４Ｃに示すように、ＣＭＶ－ｓｃｒＲを注射したマウスでは、関連タンパク質がより多く発現した。これも、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ＫがＫＲＡＳ突然変異肺癌腫瘍に対して顕著な阻害作用を有することを示唆した。
実施例７

【0176】

実施例４に基づいて、本実施例は、薬物におけるＲＮＡ送達システムの使用を提供し、該ＲＮＡ送達システムに使用される送達ベクターはウイルスであり、該薬物は肺癌治療薬である。本実施例では、肺癌治療におけるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効果について、以下の４つの試験により具体的に説明する。

【0177】

第１の試験では、肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いて、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ）及びＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ）を包み込み、力価１０^１２Ｖ． ｇ／ｍｌのＡＡＶ溶液をマウスの体内に１００μＬ尾静脈注射した。生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした結果、３週間後にＡＡＶシステムが、体内、特に肝臓で安定に発現していることが認められた。

【0178】

第２の試験では、１つの試験群と２つの対照群を設置し、その中で、試験群はＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ群であり、対照群はＰＢＳ群及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0179】

群ごとに同数のマウスを選択し、マウスの体内にマウス肺癌細胞（ＬＬＣ細胞）を注射し、ＣＴスキャン技術によりマウスモデル構築の進行を観察した。３０日後、構築に成功したマウスに２日に１回投与し、すなわち、ＰＢＳ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群のマウスに２日ごとにＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡを注射して治療を行い、マウスの生存分析と腫瘍評価をそれぞれ行い、７回投与後、治療を停止した。

【0180】

各群のマウスの治療後１００日以内の生存状況を統計した結果、図１５Ａに示すように、ＰＢＳ群およびＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、生存率には、ほとんど差がなく、一方、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群のマウスの生存率が最も高いことが分かった。

【0181】

投与前後に、各群のマウスにそれぞれＣＴスキャンを行い、ＣＴ画像に基づいてマウスの肺組織を３Ｄモデル化し、腫瘍体積を計算し、その結果を図１５Ｂに示す。図１５Ｂにおいて、「ＰＢＳ ｐｒｅ」は投与前のＰＢＳ群を示し、「ＰＢＳ ｐｏｓｔ」は投与後のＰＢＳ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ ｐｒｅ」は投与前のＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ ｐｏｓｔ」は投与後のＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ ｐｒｅ」は投与前のＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ ｐｏｓｔ」は投与後のＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群を示す。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群のマウスでは、投与後に腫瘍体積が顕著に減少し、ＰＢＳ群及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、投与後に腫瘍体積が減少しないだけではなく、程度が異なるが、増加を示すことが分かった。

【0182】

ＲＴ－ｑＰＣＲ及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇのそれぞれによって各群のマウスの肺のＫＲＡＳタンパク質及びｍＲＮＡ発現レベルを検出し、その結果を図１５Ｃ、図１５Ｄに示す。その結果から、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群のマウスでは、肺のＫＲＡＳタンパク質及びｍＲＮＡ発現量が対照群よりも低下することが分かった。

【0183】

以上の試験から、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡはマウス肺癌腫瘍に対して顕著な治療効果があることが示唆された。

【0184】

第３の試験では、１つの試験群と２つの対照群を設置し、その中で、試験群はＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群であり、対照群はＰＢＳ群及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0185】

ＥＧＦＲ－ＤＥＬ１９マウスモデルを構築し、ドキシサイクリン飼料を与えて腫瘍の産生を誘導し、３０日後に構築に成功したマウスに２日に１回投与し、すなわち、ＰＢＳ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群のマウスに２日ごとにＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡを注射して治療を行い、マウスの生存分析と腫瘍評価をそれぞれ行い、７回投与後に治療を停止した。

【0186】

各群のマウスの治療１００日後の生存を統計した結果、図１６Ａに示すように、ＰＢＳ群とＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、生存率はほとんど変わらないが、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群のマウスでは、生存率は最も高いことが分かった。

【0187】

投与前後に各群のマウスをそれぞれＣＴスキャンし、ＣＴ画像を図１６Ｅに示し、図１６ＥのＣＴ画像に基づいてマウスの肺組織を３Ｄモデル化し、腫瘍体積を計算し、その結果を図１６Ｂに示す。図１６Ｂにおいて、「ＰＢＳ ｐｒｅ」は投与前のＰＢＳ群を示し、「ＰＢＳ ｐｏｓｔ」は投与後のＰＢＳ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ ｐｒｅ」は投与前のＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ ｐｏｓｔ」は投与後のＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ ｐｒｅ」は投与前のＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ ｐｏｓｔ」は投与後のＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群を示す。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群のマウスでは、投与後に腫瘍体積が有意に減少したが、ＰＢＳ群及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、投与後に腫瘍体積が減少しないだけではなく、程度が異なるが、増加を示したことが分かった。

【0188】

ＲＴ－ｑＰＣＲ及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇのそれぞれによって各群のマウス肺のＥＧＦＲタンパク質及びｍＲＮＡ発現レベルを検出し、その結果を図１６Ｃ、図１６Ｄに示す。その結果、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群のマウスでは、肺のＥＧＦＲタンパク質及びｍＲＮＡ発現量が対照群より低下することが分かった。

【0189】

以上の試験から、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡがＥＧＦＲ突然変異型マウスの肺癌腫瘍に対して顕著な治療効果があることが示唆された。

【0190】

第４の試験では、２つの試験群と２つの対照群を設置し、その中で、試験群はＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群であり、対照群はＰＢＳ群及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0191】

ＥＧＦＲ－ＤＥＬ１９マウスモデルを構築し、ドキシサイクリン飼料を与えて腫瘍の産生を誘導し、３０日後に構築に成功したマウスに２日に１回投与し、すなわち、ＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群のマウスに２日ごとにＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡを注射して治療を行った。

【0192】

治療後、各群のマウス中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、血清アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、クレアチニン（ＣＲＥＡ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）の含有量を検出し、これらの結果を図１７Ａ～図１７Ｆに示し、ＰＢＳ群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群のマウスでは、上記の酵素の含有量はほとんど変わらないことがわかった。

【0193】

以上の試験から、肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いて、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ）とＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ）を包み込むと、安全性が高く、信頼性が高く、マイナス作用がなく、大規模な普及や応用に適していることが示唆された。
実施例８

【0194】

実施例３に基づいて、本実施例は、薬物におけるＲＮＡ送達システムの使用を提供し、該ＲＮＡ送達システムに使用される送達ベクターはプラスミドであり、該薬物は腎臓癌治療薬である。以下の試験により具体的に説明する。

【0195】

異なるマウスにＰＢＳ緩衝液／対照プラスミド／ＶＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡプラスミド／ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡプラスミド／ＭＩＸ ｓｉＲＮＡプラスミド（ＶＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡとｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡを併用）／スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）／エベロリムス（Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）をそれぞれ注射し、マウス腎臓癌腫瘍の進行状況を観察し、これらの結果を図１８、図１９に示す。ＭＩＸ ｓｉＲＮＡプラスミドを注射したマウスでは、腎臓癌の進行が最も顕著に阻害されたが、ＰＢＳ緩衝液／対照プラスミドを注射したマウスでは、腎臓癌の進行が迅速であることが分かった。

【0196】

以上から、ＶＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡとｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡの併用は腎癌腫瘍に対して顕著な治療効果を有する。
実施例９

【0197】

実施例３に基づいて、本実施例は、薬物におけるＲＮＡ送達システムの使用を提供し、該ＲＮＡ送達システムに使用される送達ベクターはプラスミドであり、該薬物は結腸炎治療薬であり、本実施例では、結腸炎治療におけるＲＮＡ送達システムの効果について、以下の２つの試験により具体的に説明する。

【0198】

第１の試験では、３組の試験群と３組の対照群を設置し、試験群は、それぞれ、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（０．５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（２０）群であり、対照群は、それぞれ、モック群、ｓｃｒ－ＲＮＡ群、ＩＦＸ群であった。

【0199】

この中で、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（０．５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（２０）群では、それぞれ、プラスミドを用いてＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ遺伝子回路（ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}）を包み込み、０．５μＬ、５μＬ、２０μＬのＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}の溶液をマウスの体内に尾静脈注射した。

【0200】

モック群は陰性対照群であり、ｓｃｒ－ＲＮＡ群、ＩＦＸ群は、それぞれ、マウスにｓｃｒ－ＲＮＡプラスミドとＩＦＸ（インフリキシマブ）を尾静脈注射した。

【0201】

次に、ＤＳＳ誘導慢性結腸炎モデルの構築を開始し、その間毎日体重を計量して記録した結果、図２０Ａに示すように、ｓｃｒ－ＲＮＡ群では、マウスの体重減少が最も速く、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（０．５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（２０）群では、マウスの体重減少が緩やかであり、ＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ溶液の用量が高いほどマウスの体重減少が緩やかであり、プラスミドに包み込まれたＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡシステムが結腸炎マウスの体重減少を軽減できることが示唆された。

【0202】

モデルの構築が終了すると、生きている小動物を通してプラスミドシステムの体内発現をモニタリングした後、マウスを殺して結腸を観察した結果、図２０Ｂに示すように、ｓｃｒ－ＲＮＡ群では、マウスの結腸長が最も短く、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（０．５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（２０）群のマウスでは、結腸長が比較的長く、ＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ注射用量が高いほど、マウスの結腸長が長いことが分かった。このことは、プラスミドに包み込まれたＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡシステムが慢性炎症による結腸長の短縮に対して、程度が異なるが、改善を示していることを示唆した。

【0203】

マウスの疾患活動指数（Ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）を評価した結果、図２０Ｃに示すように、ｓｃｒ－ＲＮＡ注射群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（０．５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（５）群では、マウスの疾患活動指数が高く、一方、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（２０）群、ＩＦＸ群では、マウスの疾患活動指数が低いことが分かった。

【0204】

マウスの結腸についてＴＮＦ－α ｍＲＮＡを検出した結果、図２０Ｄに示すように、このＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}システムは、結腸のＴＮＦ－αの発現と分泌を低下できることが分かり、マウスの結腸についてＴＮＦ－αを検出した結果、図２０Ｅに示すように、このＡＡＶシステムは、一定量のＴＮＦ－αを産生できることがわかり、結腸内の炎症促進因子であるＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２３を検出した結果、図２０Ｆに示すように、高用量群の炎症因子分泌は全体的に対照群より低いことが分かった。

【0205】

マウスの結腸切片をＨＥ染色して、病理スコアリングを行って統計した結果、図２１Ａ及び図２１Ｂに示すように、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（０．５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（２０）群のマウス、特にａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（２０）群のマウスでは、結腸粘膜の完全性はさらに高く、しかも免疫細胞の浸潤程度はさらに浅く、結腸陰窩膿瘍及び結腸の充血と出血も対照群より顕著に軽減されたことが分かった。

【0206】

以上の試験から、結腸炎の発現改善には、プラスミドを用いてＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡシステムを包み込んで治療を行う場合は、ＩＦＸよりも有効であることが証明された。

【0207】

第２の試験では、４群の試験群と３群の対照群を設置し、試験群は、それぞれ、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α群、ａｎｔｉ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α群、ａｎｔｉ－Ｂ７群、ａｎｔｉ－ｍｉｘ群であり、対照群は、それぞれ、モック群、ＰＢＳ群、ｓｃｒ－ＲＮＡ群であった。

【0208】

ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α群、ａｎｔｉ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α群、ａｎｔｉ－Ｂ７群、ａｎｔｉ－ｍｉｘ群では、それぞれ、プラスミドを用いてＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ遺伝子回路（ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}）、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α ｓｉＲＮＡ遺伝子回路（ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α}）、Ｂ７ ｓｉＲＮＡ遺伝子回路（ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｂ７）、ｍｉｘ ｓｉＲＮＡ遺伝子回路（ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍｉｘ、すなわち、ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α＋ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α＋Ｂ７}）を包み込んだものをマウスの体内に２０μＬ尾静脈注射し、生きている小動物を通してこのシステムの体内発現をモニタリングした結果、上記のシステムが体内、特に肝臓で安定に発現していることがわかった。

【0209】

モック群は陰性対照群であり、ｓｃｒ－ＲＮＡ群、ＰＢＳ群は、それぞれ、ｓｃｒ－ＲＮＡプラスミドとＰＢＳ溶液（リン酸緩衝塩溶液）をマウスに尾静脈注射した。

【0210】

次に、ＤＳＳ誘導慢性結腸炎モデルの構築を開始し、その間毎日体重を計量して記録した結果、図２２Ａに示すように、ａｎｔｉ－ｍｉｘ群では、マウスの体重増加が最も穏やかであり、すなわち、プラスミドに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α＋ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α＋Ｂ７}遺伝子回路は慢性結腸炎マウスの体重減少を顕著に軽減でき、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α群、ａｎｔｉ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α群、ａｎｔｉ－Ｂ７群では、マウスは炎症緩和期の体重回復速度もｓｃｒ－ＲＮＡ群とＰＢＳ群より顕著に速いことが分かった。

【0211】

モデルの構築が終了すると、生きている小動物を通してプラスミドシステムの体内発現をモニタリングした後、マウスを殺して結腸を観察した結果、図２２Ｂに示すように、４つの試験群では、マウスの結腸の発赤は程度が異なるが、軽減があり、慢性炎症による結腸長の短縮も、程度が異なるが、改善があることが分かった。

【0212】

マウスの疾患活動指数（Ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）を評価した結果、図２２Ｃに示すように、ｓｃｒ－ＲＮＡ群及びＰＢＳ群では、マウスの疾患活動指数が高く、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α群、ａｎｔｉ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α群、ａｎｔｉ－Ｂ７群、ａｎｔｉ－ｍｉｘ群では、マウスの疾患活動指数が順に低下することが分かった。

【0213】

マウスの血漿、肝臓及び結腸についてＴＮＦ－α ｍＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｍＲＮＡ及びＢ７ ｍＲＮＡを検出した結果、図２２Ｄ～図２２Ｆに示すように、このシステムは、血漿、肝臓及び結腸内で、安定に発現する一定量のＲＮＡを生成し、また、結腸のＴＮＦ－α、ｉｎｔｅｇｒｉｎ及びＢ７ ｍＲＮＡの発現を著しく低下させていることが分かった。

【0214】

マウスの結腸切片をＨＥ染色した結果、図２３に示すように、４つの試験群のマウス、特にａｎｔｉ－ｍｉｘ群のマウスでは、結腸粘膜の完全性はさらに高く、しかも免疫細胞の浸潤程度はさらに浅く、結腸陰窩膿瘍及び結腸の充血と出血も対照群より顕著に軽減されることが分かった。

【0215】

以上の試験から、肝臓に親和性のプラスミドに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α＋ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α＋Ｂ７}遺伝子回路によれば、ＴＮＦ－α ｍＲＮＡ、Ｂ７ ｍＲＮＡ及びｉｎｔｅｇｒｉｎ ｍＲＮＡの長期的な発現及び複数の標的遺伝子のサイレンシングを可能とし、しかも結腸炎症の程度を著しく緩和することができ、創薬の潜在力及び臨床上の研究価値が極めて期待できた。
実施例１０

【0216】

実施例４に基づいて、本実施例は、薬物におけるＲＮＡ送達システムの使用を提供し、該ＲＮＡ送達システムに使用される送達ベクターはウイルスであり、該薬物は結腸炎治療薬であり、本実施例では、結腸炎治療におけるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効果について、以下の２つの試験により具体的に説明する。

【0217】

第１の試験では、３つの試験群と２つの対照群を設置し、３つの試験群は、それぞれ、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（中）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（高）群であり、対照群は、それぞれ正常群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0218】

試験過程としては、図２４Ａに示すように、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（中）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（高）群では、それぞれ、肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いてＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}）を包み込み、力価１０^１２Ｖ．ｇ／ｍｌのＡＡＶ溶液をマウスに２５μＬ、５０μＬ、１００μＬ尾静脈注射した。

【0219】

生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした結果、図２４Ｂに示すように、３週間後にＡＡＶシステムが体内、特に肝臓で安定に発現していることがわかり、その中で、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（高）群では、平均放射輝度（Ａｖｅｒａｇｅ Ｒａｄｉａｎｃｅ）は８．４２＊１０５（ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ^２／ｓｒ）に達し、発現部位が肝臓であり、このことから、ＡＡＶシステムの発現が用量依存効果を持つことが示された。

【0220】

次に、ＤＳＳ誘導慢性結腸炎モデルの構築を開始し、その間２日ごとに体重を計量して記録した結果、図２４Ｃに示すように、ＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲ ＴＮＦ－αシステムは慢性結腸炎マウスの体重減少を軽減でき、３つの試験群のマウスでは、炎症緩和期の体重回復速度もＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群より有意に速いことが分かった。

【0221】

１０週目にモデル構築を終了し、生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした後、マウスを殺して結腸を観察した結果、図２４Ｄに示すように、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（中）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（高）群のマウスでは、結腸の発赤はある程度軽減し、慢性炎症による結腸長の短縮もある程度改善し、その中で、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（高）群では、炎症の改善が最も顕著であった。

【0222】

各群のマウスの疾患指数をそれぞれスコアリングして統計した結果、図２４Ｅに示すように、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（高）群のマウスでは、マウスの疾患指数はＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（中）群、及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群よりも低かった。

【0223】

各群のマウスの体内のＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡレベルをそれぞれ検出した結果、図２４Ｆに示すように、３つの試験群のマウスでは、体内のＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡレベルはすべて高く、対照群のＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、体内のＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡの発現はほとんどなく、このことから、上記のＡＡＶシステムが一定量のＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡを産生できることが示唆された。

【0224】

各群のマウスの体内のＴＮＦ－α ｍＲＮＡレベルをそれぞれ検出した結果、図２４Ｇに示すように、正常群と３つの試験群のマウスでは、体内のＴＮＦ－α ｍＲＮＡレベルはすべて低く、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、体内のＴＮＦ－α ｍＲＮＡレベルは高く、このことから、ＡＡＶシステムが結腸のＴＮＦ－αの発現と分泌を下げることができることが示唆された。

【0225】

マウス結腸内の炎症促進性サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３を検出した結果、図２５Ａに示すように、正常群とＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（高）群のマウスでは、炎症促進性サイトカインの分泌が最も少なく、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、炎症促進性サイトカインの分泌が最も多かった。

【0226】

マウスの結腸切片をＨＥ染色して、病理スコアリングを行って統計した結果、図２５Ｂ、図２５Ｃに示すように、試験群、特にＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}（高）群のマウスでは、結腸粘膜の完全性はさらに高く、しかも免疫細胞の浸潤程度はさらに浅く、結腸陰窩膿瘍及び結腸の充血と出血もＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群より顕著に軽減されることが分かった。

【0227】

以上の試験から、肝臓に親和性のＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}遺伝子回路によれば、長期的なＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ発現及び長期的なＴＮＦ－αサイレンシングを可能とし、しかも、結腸炎をある程度緩和することができ、創薬の潜在力及び臨床上の研究価値が極めて期待できた。

【0228】

第２の試験では、３つの試験群と２つの対照群を設置した。その中で、試験群は、それぞれＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}（中）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}（高）群であり、対照群は、それぞれ正常群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0229】

ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}（中）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}（高）群では、それぞれ肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いて、ＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ、Ｂ７－ｓｉＲＮＡ及びＩｎｔｅｇｒｉｎα４ ｓｉＲＮＡエレメントタンデム送達システム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}）を包み込み、力価１０^１２Ｖ．ｇ／ｍｌのＡＡＶ溶液をマウスの体内に２５μＬ、５０μＬ、１００μＬ尾静脈注射した。

【0230】

生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした結果、図２６Ａに示すように、３週間後にＡＡＶシステムが体内、特に肝臓で安定して発現しており、ＡＡＶシステムの発現が用量依存効果を持つことが示された。

【0231】

次に、ＤＳＳ誘導慢性結腸炎モデルの構築を開始し、その間２日ごとに体重を計量して記録した結果、図２６Ｂに示すように、ＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}システムは慢性結腸炎マウスの体重減少を軽減でき、３つの試験群のマウスでは、炎症緩和期の体重回復速度もＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群より有意に速いことが分かった。

【0232】

１０週目にモデル構築を終了し、生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした後、マウスを殺して結腸を観察した結果、図２６Ｃに示すように、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}（中）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}（高）群のマウスでは、結腸の発赤はある程度軽減し、慢性炎症による結腸長の短縮もある程度改善し、その中で、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}（高）群では、炎症の改善が最も顕著であることが分かった。

【0233】

各群のマウスの疾患指数をスコアリングして統計した結果、図２７Ａに示すように、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}（高）群のマウスでは、疾患指数はＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}（中）群、及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群よりも低いことが分かった。

【0234】

マウス血漿中のＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ、Ｂ７ ｓｉＲＮＡ及びｉｎｔｅｇｒｉｎα４ ｓｉＲＮＡを検出した結果、図２７Ｂ、図２７Ｃ、図２７Ｄに示すように、ＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}システムは、マウス血漿中に安定に発現するｓｉＲＮＡを一定量で生成し、用量依存性の効果を示すことが分かった。

【0235】

マウス肝臓中のＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ、Ｂ７ ｓｉＲＮＡ及びｉｎｔｅｇｒｉｎα４ ｓｉＲＮＡを検出した結果、図２７Ｅ、図２７Ｆ、図２７Ｇに示すように、ＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}システムは、マウスの肝臓で安定に発現するｓｉＲＮＡを一定量で生成し、用量依存性の効果を示すことが分かった。

【0236】

マウス結腸中のＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ、Ｂ７ ｓｉＲＮＡ及びｉｎｔｅｇｒｉｎα４ ｓｉＲＮＡを検出した結果、図２８Ａ、図２８Ｂ、図２８Ｃに示すように、ＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}システムは、マウスの結腸で安定に発現するｓｉＲＮＡを一定量で生成し、用量依存性の効果を示すことが分かった。

【0237】

マウス結腸中のＴＮＦ－α ｍＲＮＡ、Ｂ７ ｍＲＮＡ及びｉｎｔｅｇｒｉｎα４ ｍＲＮＡを検出した結果、図２８Ｄ、図２８Ｅ、図２８Ｆに示すように、ＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}システムは、マウスの結腸中のＴＮＦ－α、Ｂ７及びｉｎｔｅｇｒｉｎα４ ｍＲＮＡの発現を著しく低下させることが分かった。

【0238】

マウスの結腸切片をＨＥ染色して、病理スコアリングを行って統計した結果、図２９Ａ、及び図２９Ｂに示すように、試験群、特にＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}（高）群のマウスでは、結腸粘膜の完全性はさらに高く、しかも、免疫細胞の浸潤程度はさらに浅く、結腸陰窩膿瘍及び結腸の充血と出血もＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群より顕著に軽減されることが分かった。

【0239】

以上の試験から、肝臓に親和性のＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲ^{Ｔ＋Ｂ＋Ｉ}遺伝子回路によれば、長期的なＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ、Ｂ７ ｓｉＲＮＡ及びｉｎｔｅｇｒｉｎα４ ｓｉＲＮＡ発現、並びに複数の標的遺伝子のサイレンシングを可能とし、しかも、結腸炎症の程度を著しく緩和することができ、創薬の潜在力及び臨床上の研究価値が極めて期待できた。
実施例１１

【0240】

実施例３に基づいて、本実施例は、薬物におけるＲＮＡ送達システムの使用を提供し、該ＲＮＡ送達システムに使用される送達ベクターはプラスミドであり、該薬物は肺線維症治療薬である。本実施例では、肺線維症治療におけるＲＮＡ送達システムの使用について、以下の試験により具体的に説明する。

【0241】

本実施例では、８群の試験群と３群の対照群を設置した。試験群は、それぞれ、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（５ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１０ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（５ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１＋ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群、Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ（３００ｍｇ／ｋｇ）群であり、対照群は、それぞれ、正常群、ＰＢＳ群、ｓｃｒＲＮＡ群であった。

【0242】

その中で、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（５ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１０ｍｇ／ｋｇ）群では、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇのＡｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（ｍｉＲＮＡ ２１のアンチセンス鎖）を担持したプラスミドを肺線維症のマウスに尾静脈注射し、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（５ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群では、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇのＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡプラスミドを肺線維症のマウスに尾静脈注射し、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１＋ＴＧＦ－β１ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群では、１０ｍｇ／ｋｇ Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１とＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡプラスミドを肺線維症のマウスに尾静脈注射し、Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ（３００ｍｇ／ｋｇ）群では、ピルフェニドン３００ｍｇ／ｋｇを肺線維症のマウスに尾静脈注射し、正常群を正常対照群とし、ＰＢＳ群、ｓｃｒＲＮＡ群では、ＰＢＳ溶液と対照プラスミドを肺線維症のマウスにそれぞれ尾静脈注射した。

【0243】

各群のマウスごとにヒドロキシプロリン含有量を検出し、その結果を図３０に示す。ヒドロキシプロリンは、コラーゲンを主成分とし、その含有量が肺線維症の程度を反映しており、図３０から、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（５ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１０ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１＋ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群のマウスでは、ヒドロキシプロリン含有量が比較的低く、肺線維症が阻害されていることが分かった。

【0244】

各群のマウスの肺をそれぞれ蛍光染色した結果、図３１に示すように、図において、緑色の部分はＩ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ）、赤色の部分はα－ＳＭＡ、青色の部分はＤＡＰＩを示した。ＰＢＳ群、ｓｃｒＲＮＡ群のマウスは、Ｉ型コラーゲン、α－ＳＭＡ含有量が多かったが、試験群のマウスは、Ｉ型コラーゲン、α－ＳＭＡ含有量ともに少なく、特にＡｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（５ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１０ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１＋ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群は、Ｉ型コラーゲン、α－ＳＭＡの発現がほとんどないことが分かった。

【0245】

各群のマウスの肺をそれぞれＭａｓｓｏｎ三色染色し、その結果を図３２に示す。ＰＢＳ群とｓｃｒＲＮＡ群のマウスでは、肺胞間隙が著しく破壊され、肺間質コラーゲンが形成されていたが、試験群では、これらの現象が著しく軽減されていることが分かった。

【0246】

各群のマウスの肺をそれぞれＨ＆Ｅ染色し、その結果を図３３に示す。ＰＢＳ群とｓｃｒＲＮＡ群のマウスは肺胞間隙の拡大、炎症性細胞の浸潤、肺胞構造の損傷が見られたが、実験群の肺組織は正常であることが分かった。

【0247】

ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにより、正常群、ＰＢＳ群、ｓｃｒＲＮＡ群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（５ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群、Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ（３００ｍｇ／ｋｇ）群のマウスのＴＧＦ－β１タンパク質レベル、ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡレベルをそれぞれ検出した結果、図３４Ａ～図３４Ｃに示すように、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群のマウスでは、ＴＧＦ－β１タンパク質レベル及びＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡレベルが最も低いことが分かった。これは、対応するｓｉＲＮＡ発現プラスミドを尾静脈注射した後、ＴＧＦ－β１を肺部に送達して機能を発揮できることを示唆した。

【0248】

正常群、ＰＢＳ群、ｓｃｒＲＮＡ群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（５ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１０ｍｇ／ｋｇ）群のマウスの相対ｍｉＲ－２１レベルをそれぞれ検出した結果、図３４Ｄに示すように、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１０ｍｇ／ｋｇ）群のマウスでは、相対ｍｉＲ－２１レベルが最も高いことが分かった。これは、対応するアンチセンス鎖発現プラスミドを尾静脈注射した後、ｍｉＲ－２１のアンチセンス鎖を肺部に送達して機能を発揮できることを示唆した。

【0249】

以上の試験から、肝臓に親和性のプラスミドに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲ^{ｍｉＲ－２１}、ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＧＦ－β１}、ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ｍｉＲ－２１＋ＴＧＦ－β１}遺伝子回路によれば、肺線維症の程度を著しく緩和することができ、創薬の潜在力及び臨床上の研究価値が極めて期待できた。
実施例１２

【0250】

実施例４に基づいて、本実施例は、薬物におけるＲＮＡ送達システムの使用を提供し、該ＲＮＡ送達システムに使用される送達ベクターはウイルスであり、該薬物は肺線維症治療薬であり、本実施例では、肺線維症治療におけるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効果について、以下の試験により具体的に説明する。

【0251】

この試験では、肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いて、抗－ｍｉＲ－２１／ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ／抗－ｍｉＲ－２１＋ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡシステムを包み込み、ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１／ＡＡＶ－ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ／ＡＡＶ－ＭＩＸをそれぞれ得て、力価１０^１２Ｖ．ｇ／ｍｌのＡＡＶ溶液をマウスの体内に１００μＬ尾静脈注射した。生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした結果、３週間後にＡＡＶシステムが、体内、特に肝臓で安定に発現していることが認められた。

【0252】

次に、マウスを選択してモデル化し、モデル化に成功した後、マウスにＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ｓｃｒＲ／ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１／ＡＡＶ－ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ／ＡＡＶ－ＭＩＸ（１０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ注射し、ＰＢＳ群／ＡＡＶ－ｓｃｒＲ群／ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１群／ＡＡＶ－ＴＧＦ－β１ｓｉＲＮＡ群／ＡＡＶ－ＭＩＸ群を作成した。

【0253】

正常マウス、ＰＢＳ群のマウス、ＡＡＶ－ｓｃｒＲ群のマウス、ＡＡＶ－ＴＧＦ－β１ｓｉＲＮＡ群のマウスの相対ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡレベルをそれぞれ検出した結果、図３５Ｂに示すように、ＡＡＶ－ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ群のマウスでは、相対ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡレベルが低いことが分かった。

【0254】

正常マウス、ＰＢＳ群のマウス、ＡＡＶ－ｓｃｒＲ群のマウス、ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１群のマウスの相対ｍｉＲ２１ ｍＲＮＡレベルをそれぞれ検出した結果、図３５Ｃに示すように、ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１群のマウスでは、相対ｍｉＲ２１ ｍＲＮＡレベルが低いことが分かった。

【0255】

ヒドロキシプロリンは、コラーゲンを主成分とし、その含有量が肺線維症の程度を反映しており、各群のマウスのヒドロキシプロリン含有量をそれぞれ検出した結果、図３５Ａに示すように、ＰＢＳ群、ＡＡＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、体内のヒドロキシプロリン含有量が最も高く、ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１群、ＡＡＶ－ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ群、ＡＡＶ－ＭＩＸ群のマウスでは、体内のヒドロキシプロリン含有量がすべて低く、ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１群、ＡＡＶ－ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ群、ＡＡＶ－ＭＩＸ群のマウスの肺線維症が阻害されていることが示唆された。
実施例１３

【0256】

実施例３に基づいて、本実施例は、薬物におけるＲＮＡ送達システムの使用を提供し、該ＲＮＡ送達システムに使用される送達ベクターはプラスミドであり、該薬物は膠芽腫治療薬である。本実施例では、膠芽腫治療におけるＲＮＡ送達システムの使用について、以下の２つの試験により具体的に説明する。

【0257】

第１の試験では、５つの試験群と３つの対照群を設置した。試験群は、それぞれ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ群、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｔ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群、ＣＭＶ－Ｆｌａｇ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群であり、「Ｅ」はＥＧＦＲ、「Ｔ」はＴＮＣを表し、対照群は、それぞれ、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－Ｆｌａｇ－ｓｃｒＲ群であり、具体的な試験過程は図３６Ａを参照する。

【0258】

各群のマウスのＣＤ６３タンパク質発現量、ｓｉＲＮＡ発現レベルをそれぞれ検出した結果、図３６Ｂ～図３６Ｄに示すように、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ遺伝子回路の静脈注射により、ｓｉＲＮＡを脳に伝達できることを示唆した。

【0259】

第２の試験では、２つの試験群と２つの対照群を設置した。試験群は、それぞれ、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群であり、対照群は、それぞれ、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0260】

具体的な試験には、図３７Ａに示すように、マウスを選択し、マウスの体内に膠芽腫細胞（Ｕ－８７ ＭＧ－Ｌｕｃ細胞）を注射し、７日目から２１日目まで、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ（５ｍｇ／ｋｇ）をマウスに２日ごとに注射して治療を行い、マウスの生存分析と腫瘍評価をそれぞれ行った。７日目、１４日目、２８日目、３５日目にそれぞれマウスのＢＬＩ生体内画像形成検出を行った。

【0261】

図３７Ｂに示すように、この図は、７日目、１４日目、２８日目、３５日目のマウスのＢＬＩ生体内画像形成検出の比較図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群のマウスは、膠芽腫阻害効果が最も顕著であることが分かった。

【0262】

図３７Ｃに示すように、この図は、各群のマウスの生存率の比較図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群のマウスは生存時間が最も長いことが分かった。

【0263】

図３７Ｄに示すように、この図は、各群のマウスの蛍光比較図であり、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ生体内イメージングにより得られたものであり、縦座標はｌｕｃｉｆｅｒ蛍光シグナルの強弱を表す。植え付けられた腫瘍にはすでにこの遺伝子が人工的に組み込まれているため、この図は腫瘍の進行状況を表すことができる。対照群のマウスでは、腫瘍の進行はいずれも迅速であったが、試験群のマウスでは、腫瘍はかなり阻害されていることが分かった。

【0264】

図３７Ｅに示すように、この図は、各群のマウスの相対ｓｉＲＮＡの比較図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ群のマウスはＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡレベルが高く、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群のマウスは、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡとＴＮＣ ｓｉＲＮＡレベルはいずれも高いことが分かった。

【0265】

図３７Ｆに示すように、この図は、各群のマウスのｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ比較図であり、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ群のマウスはＥＧＦＲ、ＴＮＣ遺伝子の含有量が高いことが分かった。

【0266】

以上の試験データから、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔプラスミドの静脈内注射により、ｓｉＲＮＡを脳に送達して、膠芽腫の増殖を阻害できることを示唆した。

【0267】

各群のマウスの脳に免疫組織染色をそれぞれ行い、視野ごとにＥＧＦＲ、ＴＮＣ、ＰＣＮＡの着色率を統計し、その結果を図３８に示す。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群のマウスでは、脳のＥＧＦＲ、ＴＮＣ、ＰＣＮＡの含有量が最も低く、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ群のマウスでは、脳のＥＧＦＲ、ＰＣＮＡの含有量が低いことが分かった。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅプラスミドの注射により、脳のＥＧＦＲ、ＰＣＮＡの発現を阻害し、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔプラスミドの注射により、脳のＥＧＦＲ、ＴＮＣ、ＰＣＮＡの発現を阻害できることが分かった。
実施例１４

【0268】

実施例４に基づいて、本実施例は、薬物におけるＲＮＡ送達システムの使用を提供し、該ＲＮＡ送達システムに使用される送達ベクターはウイルスであり、該薬物は膠芽腫治療薬であり、本実施例では、膠芽腫治療における、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効果について、以下の試験により具体的に説明する。

【0269】

この試験では、肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いて、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＥ）及びＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡとＴＮＣ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ）を包み込み、力価１０^１２Ｖ．ｇ／ｍｌのＡＡＶ溶液をマウスに１００μＬ尾静脈注射した。生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした結果、３週間後にＡＡＶシステムが体内、特に肝臓で安定に発現していることが認められた。
次に、マウスを選択し、膠芽腫細胞（Ｕ－８７ ＭＧ－Ｌｕｃ細胞）をマウスに注射し、７日目から２１日目まで、ＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ（５ｍｇ／ｋｇ）をマウスに２日ごとに投与して治療を行い、ＰＢＳ群／ＡＡＶ－ｓｃｒＲ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群を作成した。

【0270】

各群のマウスに生存分析をそれぞれ行い、各群のマウスの治療２０日、４０日、６０日、８０日後の生存率を統計した結果、図３９Ａに示すように、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群のマウスは生存時間が最も長く、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ群はそれに次ぐものであることが分かった。

【0271】

各群のマウスに腫瘍評価をそれぞれ行い、すなわち、７日目、１４日目、２８日目、３５日目にそれぞれマウスに対してＢＬＩ生体内イメージング検出を行った結果、図３９Ｂに示すように、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群のマウスでは、膠芽腫の阻害効果が最も顕著であることが分かった。
実施例１５

【0272】

実施例３に基づいて、本実施例は、薬物におけるＲＮＡ送達システムの使用を提供し、該ＲＮＡ送達システムに使用される送達ベクターはプラスミドであり、該薬物は肥満治療薬である。本実施例では、肥満治療におけるＲＮＡ送達システムの使用について、以下の２つの試験により具体的に説明する。

【0273】

第１の試験では、２つの試験群と１つの対照群を設置した。試験群は、それぞれ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群であり、対照群はＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であり、ここで、「Ｐ」はＰＴＰ１Ｂを表す。

【0274】

ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群では、それぞれ５ｍｇ／ｋｇのＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐプラスミド、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐプラスミド、ＣＭＶ－ｓｃｒＲプラスミドをマウスに注射し、そして、各群のマウスの視床下部、肝臓の蛍光顕微鏡像をそれぞれ取得した結果、図４０に示すように、ＰＴＰ１Ｂ ｓｉＲＮＡが視床下部に伝達され得ることを示した。

【0275】

第２の試験では、２つの試験群と２つの対照群を設置し、試験群は、それぞれ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群であり、対照群は、それぞれ、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0276】

具体的な試験には、図４１Ａに示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを選択し、１２週間後にＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐを注射し、２４日の間、２日ごとに１回注射し、最後にマウスの肥満とエネルギー消費、レプチン感受性、インスリン感受性を統計した。

【0277】

図４１Ｂに示すように、この図は、各群のマウスの体重の比較図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの体重が最も安定していることが分かった。

【0278】

図４１Ｃに示すように、この図は、各群のマウスの精巣上体脂肪体重量の比較図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの精巣上体脂肪体重量が最も軽いことが分かった。

【0279】

代謝ケージを用いて、様々な処理を受けたマウスの酸素消費量、呼吸交換率、活動量、カロリー発生量を７２時間連続して検出し、次に、平均値をプロットして、統計し分析し、その結果を図４１Ｄ～図４１Ｇに示す。その結果、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐプラスミドは、マウスの酸素消費量を効果的に高めることができ、これは、この群のマウスが他の群のマウスに比べて高エネルギー代謝状況にあることを意味する。正常マウスは、主にグルコースを自己のエネルギー源とし、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐプラスミドは、マウスの呼吸交換率を低下させることができ、これは、この群のマウスが他の群のマウスに比べてタンパク質を自身のエネルギー源として利用する傾向が強いことを意味する。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐプラスミドを注射したマウスでは、活動量が有意に増加した。また、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群のマウスでは、カロリー発生量が顕著に高まった。

【0280】

図４１Ｈに示すように、この図は、各群のマウスの初期体重曲線の比較図である。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの体重が最も軽いことが分かった。

【0281】

図４１Ｉに示すように、この図は、各群のマウスの初期食物摂取量曲線の比較図である。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの食物摂取量が最も少ないことが分かった。

【0282】

図４１Ｊに示すように、この図は、各群のマウスの血清レプチン含有量の比較図である。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの血清レプチン含有量が最も低いことが分かった。

【0283】

図４１Ｋに示すように、この図は、各群のマウスのｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ比較図である。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスのＰＴＰ１Ｂタンパク質の含有量が最も低いことが分かった。

【0284】

図４１Ｌに示すように、この図は、各群のマウスの血糖変化曲線の比較図である。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの血糖値が最も低いことが分かった。

【0285】

図４１Ｍに示すように、この図は、各群のマウスの基礎グルコース変化曲線の比較図である。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの基礎グルコースの含有量が最も低いことが分かった。

【0286】

以上の試験から、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐプラスミドの静脈注射により、肥満モデルマウスの肥満を減少させることができる。

【0287】

各群のマウスの血清総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を測定した結果、図４２Ａに示すように、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスのＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬが最も低いことが分かった。

【0288】

各群のマウスの体長を測定した結果、図４２Ｂに示すように、４群のマウスの体長はほとんど変わらないことが分かった。

【0289】

各群のマウスのＨＦＤ食物摂取量を統計した結果、図４２Ｃに示すように、４群のマウスのＨＦＤ食物摂取量はほとんど変わらないことがわかった。

【0290】

各群のマウスにそれぞれ治療後肝組織を採取し、正常対照と比較した結果、図４２Ｄに示すように、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスの肝組織病理切片に明らかな脂肪肝病理的特徴が見られ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの脂肪肝が軽いことが分かった。

【0291】

以上の試験から、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐプラスミドの静脈注射により、肥満マウスの脂肪肝を軽減できることを示唆した。
実施例１６

【0292】

施例４に基づいて、本実施例は、薬物におけるＲＮＡ送達システムの使用を提供し、該ＲＮＡ送達システムに使用される送達ベクターはウイルスであり、該薬物は肥満治療薬であり、本実施例では、肥満治療における、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効果について、以下の試験により具体的に説明する。

【0293】

肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いて、ＰＴＰ１Ｂ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ）を包み込み、力価１０^１２Ｖ．ｇ／ｍｌのＡＡＶ溶液をマウスに１００μＬ尾静脈注射した。生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした結果、３週間後にＡＡＶシステムが体内、特に肝臓で安定に発現していることが認められた。

【0294】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスを選択し、１２週間後にＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐをそれぞれ注射し、ＰＢＳ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群を作成し、２４日以内に２日に１回注射した。各群のマウスにそれぞれ体重変化、脂肪体の重量、初期食物摂取量、血清レプチン含有量、血糖値、基礎グルコース含有量、血清総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、体長、食物摂取量の検出及び統計を行い、その結果を以下に示す。

【0295】

図４３Ａに示すように、この図は、各群のマウスの体重の比較図であり、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群のマウスでは、体重が最も安定していることが分かった。

【0296】

図４３Ｂに示すように、この図は、各群のマウスの精巣上体脂肪体重量の比較図であり、ＡＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群のマウスでは、精巣上体脂肪体の重量が最も軽いことが分かった。

【0297】

図４３Ｃに示すように、この図は、各群のマウスの初期食物摂取量曲線の比較図である。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群のマウスでは、食物摂取量が最も少ないことが分かった。

【0298】

図４３Ｄに示すように、この図は、各群のマウスの血清レプチン含有量の比較図である。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群のマウスでは、血清レプチン含有量が最も低いことが分かった。

【0299】

図４３Ｅに示すように、この図は、各群のマウスの血糖変化曲線の比較図である。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群のマウスでは、血糖値が最も低いことが分かった。

【0300】

図４３Ｆに示すように、この図は、各群のマウスの基礎グルコース変化曲線の比較図である。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群のマウスでは、基礎グルコース含有量が最も低いことが分かった。

【0301】

図４４Ａ～図４４Ｃに示すように、この３つの図は、それぞれ各群のマウスの血清総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の比較図であり、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群のマウスでは、ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬが最も低いことが分かった。

【0302】

図４４Ｄに示すように、この図は、各群のマウスの体長の比較図であり、４群のマウスの体長はほとんど変わらないことがわかった。

【0303】

図４４Ｅに示すように、この図は、各群のマウスのＨＦＤ食物摂取量の比較図であり、４群のマウスのＨＦＤ食物摂取量もほとんど変わらないことがわかった

【0304】

以上の試験から、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐ、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐは、肥満に対してある程度の阻害効果があることが示唆された。
実施例１７

【0305】

実施例３に基づいて、本実施例は、薬物におけるＲＮＡ送達システムの使用を提供し、該ＲＮＡ送達システムに使用される送達ベクターはプラスミドであり、該薬物はハンチントン病治療薬である。本実施例では、ハンチントン病治療におけるＲＮＡ送達システムの使用について、以下の５つの試験により具体的に説明する。

【0306】

第１の試験では、２つの試験群と２つの対照群を設置した。試験群は、それぞれ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群であり、対照群は、それぞれ、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0307】

実験の流れを図４５Ａに示し、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のハンチントン病のマウスのそれぞれにＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミド、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミド、ＰＢＳ溶液、ＣＭＶ－ｓｃｒＲプラスミドを静脈注射した後、血漿エクソソームを分離し、ＰＫＨ２６染料で標識した後、細胞と共培養し、細胞のエクソソームの吸収状況を観察した。

【0308】

図４５Ｂに示すように、この図は、各群のマウスの血漿のエクソソーム中のｓｉＲＮＡレベルの比較図であり、２つの試験群のマウスでは、血漿のエクソソーム中のｓｉＲＮＡレベルが高いことが分かった。

【0309】

各群のマウスにプラスミド／溶液を注射した後に抽出した血漿エクソソームに対して、ＰＫＨ２６で標識し、細胞と共培養し、共焦点顕微鏡を用いて写真撮影を行った。その結果、図４５Ｃに示すように、ｓｉＲＮＡを包み込んだエクソソームが細胞に入ってくることが示された。

【0310】

各群のマウスの血漿エクソソームを抽出して細胞と共培養した後、各群のマウスのＨＴＴタンパク質レベル及びｍＲＮＡレベルの変化を検出した結果、図４５Ｄ～図４５Ｆに示すように、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ及びＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴが、ＨＴＴタンパク質レベルを低下できることを示し、エクソームに組み込まれたｓｉＲＮＡは依然として遺伝子サイレンシング機能を発揮できることを示唆した。

【0311】

抽出したマウス血漿エクソソームを細胞と共培養した後、各群のマウスにおけるＨＴＴタンパク質の凝集を観察して統計した結果、図４５Ｇ～図４５Ｈに示すように、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ及びＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴがハンチントンＨＴＴ凝集細胞モデル中の病理ＨＴＴタンパク質の凝集を低下できることを示し、エクソソームに組み込まれたｓｉＲＮＡは依然として遺伝子サイレンシング機能を発揮でき、また突然変異タンパク質の凝集を効果的に低下できることを示唆した。

【0312】

各群のマウスの肝臓、血漿、皮質、線条体中の絶対ｓｉＲＮＡの発現レベルをそれぞれ検出して統計した。図４６Ａに示すように、この図は、各群のマウスの肝臓のｓｉＲＮＡの絶対レベルの比較図であり、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの絶対ｓｉＲＮＡレベルが比較的高いことが分かった。図４６Ｂに示すように、この図は、各群のマウス血漿中の絶対ｓｉＲＮＡレベルの比較図であり、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの絶対ｓｉＲＮＡレベルが比較的高いことが分かった。図４６Ｃに示すように、この図は、各群のマウスの皮質及び線条体の絶対ｓｉＲＮＡレベルの比較図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲｍＨＴＴを注射したマウスのほうが、絶対ｓｉＲＮＡレベルが高いことが分かった。

【0313】

図４６Ｄに示すように、この図は、各群のマウスの肝臓、皮質、線条体の組織のＩｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション図であり、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの肝臓組織切片に顕著な蛍光、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの皮質、線条体組織切片に明らかな蛍光があることが分かった。ＲＶＧが血液脳関門を通過して機能を発揮するようにエクソソームｓｉＲＮＡを誘導することを示唆した。

【0314】

第２の試験では、２つの試験群と２つの対照群を設置した。試験群は、それぞれ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ＧＦＰ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＧＦＰ群であり、対照群は、それぞれ、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。ＣＭＶ－ｓｉＲ^ＧＦＰ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＧＦＰ群、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のＧＦＰトランスジェニックマウスのそれぞれに、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ＧＦＰプラスミド、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＧＦＰプラスミド、ＰＢＳ溶液、ＣＭＶ－ｓｃｒＲプラスミドを静脈注射した。

【0315】

図４６Ｅ、図４６Ｆに示すように、この図は、各群のマウスの肝、皮質、線条体の組織切片図であり、肝臓にＣＭＶ－ｓｉＲ^ＧＦＰ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＧＦＰを注射したＧＦＰトランスジェニックマウスでは、ＧＦＰ蛍光レベルが低下し、皮質線条体にＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＧＦＰを注射したマウスでは、ＧＦＰ蛍光レベルが低下することが分かった。ＲＶＧが、血液脳関門を通過して機能を発揮するようにエクソソームｓｉＲＮＡを誘導することを示唆した。

【0316】

第３の試験では、２つの試験群と１つの対照群を設置し、試験群は、それぞれ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群であり、対照群はＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0317】

試験には、図４７Ａに示すように、８週齢のＮ１７１８２Ｑマウスを選択し、それぞれＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のハンチントン病のマウスにＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミド、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミド、ＣＭＶ－ｓｃｒＲプラスミドを尾静脈注射し、０日目と１４日目に回転テストを行い、１４日後にマウスを殺して分析した。

【0318】

図４７Ｂに示すように、この図は、野生型マウス、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスの降下潜伏期の比較図であり、０日目には、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの降下潜伏期が一致し、１４日目には、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群では、マウスの降下潜伏期が最も短いことが分かった。

【0319】

図４７Ｃ及び図４７Ｄに示すように、図４７Ｃは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスの線条体のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ図であり、図４７Ｄは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスの線条体の相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルの比較図であり、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群では、マウスの線条体中のＮ１７１－ｍＨＴＴタンパク質の含有量は高く、相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルも同様に高いことがわかった。

【0320】

第４の試験では、１つの試験群と１つの対照群を設置し、試験群はＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群であり、対照群はＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0321】

試験には、図４７Ｅに示すように、３月齢のＢＡＣＨＤマウスを選択し、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のハンチントン病のマウスにＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミド、ＣＭＶ－ｓｃｒＲプラスミドをそれぞれ静脈注射し、１４日後にマウスを殺して分析した。

【0322】

図４７Ｆに示すように、図４７Ｆは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ群^ｍＨＴＴ群のマウスの皮質及び線条体のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの皮質及び線条体の突然変異体ＨＴＴ（Ｍｕｔａｎｔ ＨＴＴ）、内因性ＨＴＴ（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＨＴＴ）の含有量はいずれも少ないことが分かった。

【0323】

図４７Ｇに示すように、図４７Ｇは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスの皮質及び線条体の相対ｍＨＴＴタンパク質レベルの比較図であり、マウスの皮質と線条体を問わず、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの相対ｍＨＴＴタンパク質レベルはいずれも低いことが分かった。

【0324】

図４７Ｈ及び図４７Ｉに示すように、図４７Ｈは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスの免疫蛍光図であり、図４７Ｉは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴマウスの皮質及び線条体の相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルの比較図であり、マウスの皮質と線条体を問わず、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルはいずれも低いことが分かった。

【0325】

以上の試験から、ＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミドの静脈注射により、線条体及び皮質のｍＨＴＴの阻害に寄与し、ＨＤマウスの運動能力の改善と神経病理の緩和につながることを示唆した。

【0326】

第５の試験では、１つの試験群と１つの対照群を設置し、試験群はＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群であり、対照群はＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0327】

試験には、図４８Ａに示すように、６週齢のＹＡＣ１２８マウスを選択し、それぞれＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のハンチントン病のマウスにＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミド、ＣＭＶ－ｓｃｒＲプラスミドを静脈注射し、試験開始０日目、４週目、８週目にそれぞれ回転テストを行った後、マウスを殺して分析した。

【0328】

図４８Ｂに示すように、この図は、野生型マウス、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスの降下潜伏期の比較図であり、０日目には、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群では、マウスの降下潜伏期が一致し、４週目と８週目には、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群では、マウスの降下潜伏期が最も短いことが分かった。

【0329】

図４８Ｃに示すように、この図は、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスの皮質及び線条体のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの皮質には、突然変異体ＨＴＴ及び内因性ＨＴＴの含有量はいずれも低く、その線条体には、突然変異体ＨＴＴの含有量は低く、線条体には内因性ＨＴＴの含有量は高いことが分かった。

【0330】

図４８Ｄ、図４８Ｅに示すように、両図はそれぞれＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスの皮質及び線条体の相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルの比較図、相対ｍＨＴＴタンパク質レベルの比較図であり、皮質と線条体を問わず、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベル、相対ｍＨＴＴタンパク質レベルはいずれも低いことが分かった。

【0331】

図４８Ｆに示すように、この図は、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスの皮質及び線条体の免疫蛍光図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスのＮｅｕＮ、ＥＭ４８発現はＣＭＶ－ｓｃｒＲ群より低いことが分かった。

【0332】

以上の試験から、ＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミドの静脈注射により、線条体及び皮質のｍＨＴＴタンパク質及び毒性凝集体の減少に寄与し、行動欠陥及び線条体や皮質の神経病理学を改善することを示唆した。
実施例１８

【0333】

実施例４に基づいて、本実施例は、薬物におけるＲＮＡ送達システムの使用を提供し、該ＲＮＡ送達システムに使用される送達ベクターはウイルスであり、該薬物はハンチントン病治療薬であり、本実施例では、ハンチントン病治療におけるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効果について、以下の試験により具体的に説明する。

【0334】

この試験では、肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いて、ＨＴＴ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ））を包み込み、力価１０^１２Ｖ．ｇ／ｍｌのＡＡＶ溶液をマウスに１００μＬ尾静脈注射した。生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした結果、３週間後にＡＡＶシステムが体内、特に肝臓で安定に発現していることが認められた。

【0335】

次に、マウスを選択してモデル化を行い、モデル化が完了したマウスにＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴを注射し、ＰＢＳ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群を作成した。上記溶液を尾静脈注射した後、血漿エクソソームを分離し、ＰＫＨ２６染料で標識した後、細胞と共培養し、細胞のエクソソームの吸収状況を観察し、結果を以下に示す。

【0336】

図４９Ａに示すように、この図は、各群のマウス血漿エクソソーム中のｓｉＲＮＡレベルの比較図であり、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスでは、血漿のエクソソーム中のｓｉＲＮＡレベルは高いことが分かった。

【0337】

図４９Ｂに示すように、この図は、マウスの血漿エクソソームと細胞を共培養した後の各群のマウスの相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルの比較図であり、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスでは、相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルが低いことが分かり、これは、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴは、ＨＴＴ ｍＲＮＡレベルを下げることができ、すなわち、エクソソームに組み込まれたｓｉＲＮＡは依然として遺伝子サイレンシング機能を発揮することができることが分かった。

【0338】

図４９Ｃに示すように、この図は、マウスの肝臓ｓｉＲＮＡの絶対レベルの比較図であり、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスでは、絶対ｓｉＲＮＡレベルが高いことが分かった。

【0339】

図４９Ｄに示すように、この図は、マウスの血漿ｓｉＲＮＡの絶対レベルの比較図であり、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスでは、絶対ｓｉＲＮＡレベルが高いことが分かった。

【0340】

図４９Ｅに示すように、この図は、野生型マウス（ＷＴ）、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスの降下潜伏期の比較図であり、０週では、３群のマウスの降下潜伏期が一致し、４週目と８週目では、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、降下潜伏期が最も短いことが分かった。

【0341】

図４９Ｆに示すように、この図は、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ群^ｍＨＴＴのマウスの皮質及び線条体における相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルの比較図であり、皮質でも線条体でも、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスでは、ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルはＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群よりも低いことが分かった。

【0342】

以上の試験から、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴの静脈注射が、線条体及び皮質のｍＨＴＴタンパク質と毒性凝集体の減少に寄与し、ハンチントン舞踏症に対する治療効果を発揮することが示唆された。
実施例１９

【0343】

実施例３に基づいて、本実施例は、薬物におけるＲＮＡ送達システムの使用を提供し、該ＲＮＡ送達システムに使用される送達ベクターはプラスミドであり、該薬物はパーキンソン治療薬物である。本実施例では、パーキンソン治療におけるＲＮＡ送達システムの使用について、以下の試験により具体的に説明する。

【0344】

この試験では、ＬＲＲＫ２Ｒ１４４１Ｇトランスジェニックマウスを選択し、３月齢で試験を行い、試験にはＬＰＳ介入群とＬＰＳ非介入群を設置した。ＬＰＳ介入群では、ＬＰＳ介入７日後、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}の治療を行った。

【0345】

図５０Ａ及び図５０Ｂに示すように、図５０Ａは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}を注射したＬＲＲＫ２Ｒ１４４１Ｇトランスジェニックマウスのｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ図であり、図５０Ｂは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}を注射したＬＲＲＫ２Ｒ１４４１Ｇトランスジェニックマウスのタンパク質グレースケール分析図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉ^{ＲＬＲＲＫ２}を注射したマウスでは、ＬＲＲＫ２タンパク質及びＳ９３５タンパク質レベルが低下することが分かり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＬＲＲＫ２が肝臓でｓｉＲＮＡを放出し、ｓｉＲＮＡがエクソソームに組み込まれると、血液脳関門を通過して脳深部タンパク質の発現を低下させることを示唆した。

【0346】

図５０Ｃに示すように、この図は、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}を注射したＬＲＲＫ２Ｒ１４４１Ｇトランスジェニックマウスの黒質領域ＴＨ＋ニューロンの免疫蛍光図であり、その結果、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}を注射したマウスでは、ＴＨニューロンの消失を防止し、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}が肝臓でｓｉＲＮＡを放出し、ｓｉＲＮＡがエクソソームに組み込まれると、血液脳関門を通過して脳深部に入って機能を発揮できることを示唆した。

【0347】

図５０Ｄに示すように、この図は、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}を注射したＬＲＲＫ２Ｒ１４４１Ｇトランスジェニックマウスのミクログリア活性化レベルの免疫蛍光図であり、その結果、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}を注射したマウスでは、ミクログリアの活性化を阻害でき、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}が肝臓でｓｉＲＮＡを放出し、ｓｉＲＮＡがエクソソームに組み込まれると、血液脳関門を通過して脳深部に入って機能を発揮できることを示唆した。

【0348】

以上の試験から、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}プラスミドの静脈注射により、ドーパミン作動性ニューロンのＬＲＲＫ２の阻害に寄与し、パーキンソンＰＤマウスの神経病理的発達を軽減することを示唆した。
実施例２０

【0349】

この重要な問題をさらに研究し、プラスミドを送達ベクターとした生体内自己集合ｓｉＲＮＡの薬物動態と薬効学を解明するために、安全性評価研究に用いられている有名な非ヒト霊長類モデルであるカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）について、より詳細な研究を行った。倫理学的に認められた成体のアカゲザル４頭に５ｍｇ／ｋｇのＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミドを静脈注射し、注射前又は注射後の異なる時点で血液サンプルを採取した。１ヶ月後、これらのアカゲザルに毎日５ｍｇ／ｋｇのＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミドを合計５回静脈注射し、注射前又は最後の注射後の異なる時点で血液サンプルを採取した。

【0350】

図５１に示すように、図５１Ａは、単回注射の場合のカニクイザルの全血ｓｉＲＮＡ濃度の変化図であり、図５１Ｂは、複数回注射の場合のカニクイザルの全血ｓｉＲＮＡ濃度の変化図であり、単回注射の場合のカニクイザルのｓｉＲＮＡ濃度は、静脈注射６時間後にピークに達し、それ以降低下し、複数回注射の場合のカニクイザルのｓｉＲＮＡ濃度は、静脈注射３時間後にピークに達し、それ以降低下し、複数回注射の場合のカニクイザルのｓｉＲＮＡ濃度の減少速度はより緩やかであることが分かった。

【0351】

以上の実験から、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミドはカニクイザルなどの霊長類に対して安全かつ有効であり、応用の将来性が期待できることを示唆した。
実施例２１

【0352】

本願によるＲＮＡ送達システムは、ＲＮＡ断片を含む遺伝子回路を肝臓部位で自己集合してＲＮＡ断片を包み込み保護するエクソソームを形成することを可能にするが、ＲＮＡ断片を生体外から肝臓部位に送達する際の安全性、安定性を考慮する必要があるため、以下の試験を行った。

【0353】

本実施例では、対照群と試験群１～５を設置し、それぞれの群に同じ数のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを選択し、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡを含むプラスミド（０．５ｍｇ／ｋｇ）をマウスに静脈注射した。その中で、対照群用のＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡはいかなる修飾もしなかった。試験群１用のＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡはチオリン酸修飾（リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子を１つの硫黄原子で置換）して得られた。試験群２用のＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡは、２’オキシメチル修飾（ヌクレオチドペントース２’－ヒドロキシ修飾であって、この位置にメチルを導入）して得られた。試験群３用のＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡは、５’ブロモウラシル修飾（ウラシルの５位に臭素を導入）して得られた。試験群４用のＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡは、疎水性置換基修飾（このｓｉＲＮＡにピリミジン修飾疎水性置換基を持つトリアゾール骨格単位を含ませる）して得られた。試験群５用のＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡは、２’フルオロピリミジン修飾（ｓｉＲＮＡ上のピリミジンヌクレオチドの２’－ＯＨを２’－Ｆで置換）して得られた。

【0354】

各群のマウスの肝臓、肺、脳、腎臓、ＣＤ４^＋細胞におけるＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡの発現レベルをそれぞれ検出した結果、図５２に示すように、実験群５のマウスでは、肝臓、肺、脳、腎臓、ＣＤ４^＋細胞におけるＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡの発現レベルがいずれも最も高いことが分かった。

【0355】

以上の結果により、試験群１～５では、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡに対して化学修飾を行ったが、試験群１～４の修飾方式で得られたｓｉＲＮＡは、安定性の向上が顕著ではなかったが、試験群５では、２’フルオロピリミジン修飾方式で得られたｓｉＲＮＡは、各組織器官での発現がすべて明らかに向上し、それによる効果は最も良く、したがって、２’フルオロピリミジン修飾はＲＮＡの送達過程における安定性を大幅に向上させることができる。

【0356】

本明細書では、「上」、「下」、「前」、「後」、「左」、「右」などは、関連部分間の相対的な位置関係を表すためにのみ用いられ、これらの関連部分の絶対位置を限定するものではない。

【0357】

本明細書では、「第１」、「第２」などは、互いを区別するためのものであって、重要度や順序、相互の存在の前提などを示すものではない。

【0358】

本明細書では、「等しい」、「同じ」などは、厳密には数学的及び／又は幾何学的な意味での制限ではなく、当業者に理解可能であり、製造又は使用などによって許容される誤差も含む。

【0359】

別段の記載がない限り、本明細書における数値範囲は、その２つの端点内の範囲全体だけでなく、その中に含まれるいくつかのサブ範囲も含む。

【0360】

以上、本願の好ましい具体的な実施形態及び実施例については、図面を参照して詳細に説明したが、本願は上記の実施形態及び実施例に限定されるものではなく、当業者が有する知識の範囲内で、本願の構想を逸脱することなく、様々な変更も可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65】

【図66】

【図67】

【図68】

【国際調査報告】