特表 2024-511525 ＲＮＡプラスミド送達システム及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-13

(54)【発明の名称】ＲＮＡプラスミド送達システム及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/64 20060101AFI20240306BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240306BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240306BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20240306BHJP

   A61K 9/50 20060101ALI20240306BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240306BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240306BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20240306BHJP

【ＦＩ】

C12N15/64 Z

C12N15/63 Z

A61K31/7105

A61K9/127

A61K9/50

A61K47/46

A61P1/04

A61P3/04

A61P11/00

A61P21/04

A61P25/16

A61P25/28

A61P29/00

A61P35/00

A61P37/06

C12N15/113 Z ZNA

C12N5/071

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023560201

(86)(22)【出願日】2022-03-29

(85)【翻訳文提出日】2023-11-17

(86)【国際出願番号】 CN2022083598

(87)【国際公開番号】W WO2022206738

(87)【国際公開日】2022-10-06

(31)【優先権主張番号】202110335617.9

(32)【優先日】2021-03-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523368241

【氏名又は名称】ナンキン ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャン、チェンユー

(72)【発明者】

【氏名】チェン、シー

(72)【発明者】

【氏名】フー、ジェン

(72)【発明者】

【氏名】リー、ジン

(72)【発明者】

【氏名】チャン、シアン

(72)【発明者】

【氏名】チョウ、シンヤン

(72)【発明者】

【氏名】チャン、リー

(72)【発明者】

【氏名】ユウ、メンチャオ

(72)【発明者】

【氏名】グオ、ホンユアン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B065AA99X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA19

4C076AA64

4C076BB01

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB27

4C076CC50

4C076EE57H

4C076FF21

4C076FF36

4C076FF65

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA10

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA24

4C086MA38

4C086MA52

4C086MA56

4C086MA66

4C086NA13

4C086ZA15

4C086ZA16

4C086ZA36

4C086ZA59

4C086ZA66

4C086ZA70

4C086ZA94

4C086ZB08

4C086ZB11

4C086ZB21

4C086ZB26

4C086ZC35

(57)【要約】

ＲＮＡプラスミド送達システム及びその使用を提供する。該ＲＮＡプラスミド送達システムは、送達が必要なＲＮＡ断片を担持したプラスミドであって、宿主の器官組織内で富化し、前記宿主の器官組織内に前記ＲＮＡ断片を含有するエクソソームを内因的に自発的に形成することができ、さらに、標的組織内に進入し結合し、ＲＮＡ断片を標的組織に送達することができるプラスミドを含む。該ＲＮＡ送達システムは、安全で確実であり、創薬性が良好であり、汎用性が高い。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

送達が必要なＲＮＡ断片を担持したプラスミドであって、宿主の器官組織内で富化し、前記宿主の器官組織内に前記ＲＮＡ断片を含有する複合構造を内因的に自発的に形成することができ、前記複合構造が標的組織に進入して結合し、前記ＲＮＡ断片を標的組織に送達することができるプラスミドを含む、ことを特徴とするＲＮＡプラスミド送達システム。

【請求項2】

前記ＲＮＡ断片は、医療的に意味のある１つ又は２つ以上の特定のＲＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ配列は、医療的に意味のあるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ配列である、ことを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡプラスミド送達システム。

【請求項3】

前記プラスミドは、プロモーターと、宿主の器官組織内に前記複合構造のターゲティング構造を形成することができるターゲティングタグとをさらに含み、前記ターゲティング構造は複合構造の表面に位置し、前記複合構造は、前記ターゲティング構造を介して標的組織を探索し結合し、標的組織に前記ＲＮＡ断片を送達可能である、ことを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡプラスミド送達システム。

【請求項4】

前記プラスミドは、プロモーター－ＲＮＡ断片、プロモーター－ターゲティングタグ、プロモーター－ＲＮＡ断片－ターゲティングタグのいずれか１つ又は複数の回路の組み合わせを含み、前記プラスミドのそれぞれは、少なくとも１つのＲＮＡ断片と１つのターゲティングタグとを含み、前記ＲＮＡ断片及びターゲティングタグは、同一回路又は異なる回路にある、ことを特徴とする請求項３に記載のＲＮＡプラスミド送達システム。

【請求項5】

前記プラスミドは、前記回路を正しい構造に折り畳んで発現させることができるフランキング配列、補償配列、及びループ配列をさらに含み、前記フランキング配列は、５’フランキング配列及び３’フランキング配列を含み、
前記プラスミドは、５’－プロモーター－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列、５’－プロモーター－ターゲティングタグ、５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列のいずれか１つ又は複数の回路の組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項４に記載のＲＮＡプラスミド送達システム。

【請求項6】

前記５’フランキング配列は、ｇｇａｔｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｔｇｃｔｇａａｇｇｃｔｇｔａｔｇｃｔｇａａｔｔｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記ループ配列は、ｇｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔｇａｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記３’フランキング配列は、ａｃｃｇｇｔｃａｇｇａｃａｃａａｇｇｃｃｔｇｔｔａｃｔａｇｃａｃｔｃａｃａｔｇｇａａｃａａａｔｇｇｃｃｃａｇａｔｃｔｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～５位の塩基が欠失されている、ことを特徴とする請求項５に記載のＲＮＡプラスミド送達システム。

【請求項7】

前記プラスミドに少なくとも２種類の回路が存在する場合、隣接する回路は配列１～３からなる配列で連結され、
配列１はＣＡＧＡＴＣであり、配列２は５～８０塩基からなる配列であり、配列３はＴＧＧＡＴＣである、ことを特徴とする請求項４に記載のＲＮＡプラスミド送達システム。

【請求項8】

前記プラスミドに少なくとも２種類の回路が存在する場合、隣接する回路は配列４又は配列４と８０％超の相同性を有する配列で連結され、
配列４はＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣである、ことを特徴とする請求項７に記載のＲＮＡプラスミド送達システム。

【請求項9】

前記器官組織は肝臓であり、前記複合構造はエクソソームである、ことを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡプラスミド送達システム。

【請求項10】

前記ターゲティングタグは、ターゲティング機能を有するターゲティングペプチド又はターゲティングタンパク質から選択される、ことを特徴とする請求項３に記載のＲＮＡプラスミド送達システム。

【請求項11】

前記ターゲティングペプチドは、ＲＶＧターゲティングペプチド、ＧＥ１１ターゲティングペプチド、ＰＴＰターゲティングペプチド、ＴＣＰ－１ターゲティングペプチド、ＭＳＰターゲティングペプチドを含み、
前記ターゲティングタンパク質は、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＰＴＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＭＳＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質を含む、ことを特徴とする請求項１０に記載のＲＮＡプラスミド送達システム。

【請求項12】

前記ＲＮＡ配列の長さが１５～２５ヌクレオチドである、ことを特徴とする請求項２に記載のＲＮＡプラスミド送達システム。

【請求項13】

前記ＲＮＡ配列は、ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＫＲＡＳ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＶＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＴＯＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｂ７遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ－β１遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｋ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｌ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＨＬＡ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＧＤＦ１５遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ－２１のアンチセンス鎖、ｍｉＲＮＡ－２１４のアンチセンス鎖、ＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＨＴＴ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｌｒｒｋ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子のｓｉＲＮＡ、又は上記配列と８０％超の相同性を有するＲＮＡ配列、又は上記ＲＮＡをコードする核酸分子から選択されるいずれか１種又は複数種である、ことを特徴とする請求項１２のいずれか１項に記載のＲＮＡプラスミド送達システム。

【請求項14】

前記送達システムは、ヒトを含む哺乳動物で使用されるものである、ことを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡプラスミド送達システム。

【請求項15】

請求項１～１４のいずれか１項に記載のＲＮＡプラスミド送達システムの薬物における使用。

【請求項16】

前記薬物の投与方法は、経口投与、吸入投与、皮下注射投与、筋肉注射投与、静脈注射投与を含む、ことを特徴とする請求項１５に記載の使用。

【請求項17】

前記薬物は、癌、肺線維症、結腸炎、肥満、肥満に起因する心血管疾患、２型糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、重症筋無力症、アルツハイマー病、又は移植片対宿主病を治療する薬物である、ことを特徴とする請求項１５に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、生物医学の技術分野に関し、特にＲＮＡプラスミド送達システム及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）療法は、発明されて以来、人類の疾患を治療する有望な戦略であると考えられてきたが、臨床的には多くの問題に直面しており、この治療法の進歩は予想よりもはるかに遅れている。

【0003】

ＲＮＡは細胞外に長期間安定に存在することはできないと考えられており、ＲＮＡは細胞外に豊富に含まれるＲＮａｓｅに分解されて断片化されるため、ＲＮＡｉ療法の効果を発現するには、ＲＮＡを細胞外に安定に存在させ、特定の組織に標的に取り込める方法を見つけることが必要とされる。

【0004】

現在、ｓｉＲＮＡと関連する特許は多く、主に以下のいくつの方面に焦点を当てている。１．医学効果を有するｓｉＲＮＡを設計する。２．ｓｉＲＮＡを化学修飾し、生体内でのｓｉＲＮＡの安定性を高め、収率を高める。３．種々の人工ベクター（例えば、脂質ナノ粒子、カチオン性ポリマーやウイルス）の設計を改善し、ｓｉＲＮＡの生体内での伝達効率を向上させる。このうち第３方面についての特許が多く、その根本的な原因は、研究者らが、ｓｉＲＮＡを標的組織に安全に、精確に、効率的に送達するための適切なｓｉＲＮＡ伝達システムが不足しており、この問題がＲＮＡｉ療法を制約する核心的な問題になっていることを認識しているからである。

【0005】

公開番号ＣＮ１０８６２４５９０Ａの中国特許は、ＤＤＲ２遺伝子の発現を阻害できるｓｉＲＮＡを開示している。公開番号ＣＮ１０８６２４５９１Ａの中国特許は、ＡＲＰＣ４遺伝子をサイレンシングすることができるｓｉＲＮＡを開示しており、当該ｓｉＲＮＡにα－リン－セレン修飾を施している。公開番号ＣＮ１０８５４６７０２Ａの中国特許は、長鎖非コードＲＮＡ ＤＤＸ１１－ＡＳ１を標的とするｓｉＲＮＡを開示している。公開番号ＣＮ１０６１７７９９０Ａの中国特許は、多種の腫瘍治療に用いることができるｓｉＲＮＡ前駆体を開示している。これらの特許はすべて特定のｓｉＲＮＡを設計しており、遺伝子の変化によって引き起こされるある疾患を対象としている。

【0006】

公開番号ＣＮ１０８２５０２６７Ａの中国特許は、ポリペプチド、ポリペプチド－ｓｉＲＮＡ誘導共集合体を開示しており、ポリペプチドをｓｉＲＮＡのベクターとして使用している。公開番号ＣＮ１０８１１７５８５Ａの中国特許は、ｓｉＲＮＡを標的に導入して、乳癌細胞のアポトーシスを促進するポリペプチドを開示しており、同様にポリペプチドをｓｉＲＮＡのベクターとして使用している。公開番号ＣＮ１０８０９６５８３Ａの中国特許は、化学療法薬を含むと同時に乳癌治療効果を有するｓｉＲＮＡを搭載することができるナノ粒子ベクターを開示している。これらの特許はすべてｓｉＲＮＡベクターに関する発明創造であるが、その技術案には共通の特徴があり、それはベクター及びｓｉＲＮＡがいずれも生体外で予め集合されてから宿主の体内に導入されることである。実際には、現在設計されているほとんどの送達技術は上記と同様である。しかし、これらの人工的に合成された外因性送達システムは、宿主の循環システムによって容易に除去され、免疫原性反応を引き起こす可能性があり、さらには特定の細胞タイプと組織に有毒であるという共通の問題がある。

【0007】

本発明の研究チームは、内因性細胞がｍｉＲＮＡｓを選択的にエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）にカプセル化することができ、エクソソームはｍｉＲＮＡを受容体細胞に伝達し、その分泌されたｍｉＲＮＡが比較的低い濃度で、標的遺伝子の発現を強力にブロックすることができることを発見した。エクソソームは宿主免疫系と生体適合性であり、生体内でｍｉＲＮＡを生物学的バリアを越えて保護及び送達する先天的能力を有するため、ｓｉＲＮＡ送達に関連する問題を克服する潜在的な解決策となる。例えば、公開番号ＣＮ１１０６９９３８２Ａの中国特許は、ｓｉＲＮＡを送達するエクソソームの製造方法を開示しており、血漿からエクソソームを分離し、ｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによりエクソソームにカプセル化する技術を開示している。

【0008】

しかし、生体外でエクソソームを分離又は製造するこのような技術は、細胞培養を通じて大量のエクソソームを取得し、さらにｓｉＲＮＡカプセル化のステップを追加する必要があり、これは、この製品を大規模に応用する臨床費用が非常に高くなり、一般の患者に負担することができず、さらに、エクソソームの複雑な製造・精製プロセスにより、ＧＭＰ規格に合致することがほぼ不可能となっている。

【0009】

これまで、エクソソームを有効成分とする薬物はＣＦＤＡの承認を受けたことがなく、エクソソーム製品の一貫性が保証されていないことが中心的な問題となっており、このような製品の医薬品製造許可が得られないことに直結している。この問題を解決できれば、ＲＮＡｉ療法を推進する上で非常に意義がある。

【0010】

したがって、安全で正確かつ効率的なｓｉＲＮＡ送達システムの開発は、ＲＮＡｉ治療の効果を高め、ＲＮＡｉ療法を推進するために不可欠なことである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

以上に鑑み、本願の実施例は、従来技術に存在する技術的欠陥を解決するために、ＲＮＡプラスミド送達システム及びその使用を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本願の１つの発明点は、送達が必要なＲＮＡ断片を担持したプラスミドであって、宿主の器官組織内で富化し、前記宿主の器官組織内に前記ＲＮＡ断片を含有する複合構造を内因的に自発的に形成することができ、前記複合構造が標的組織に進入して結合し、前記ＲＮＡ断片を標的組織に送達することができるプラスミドを含む、ＲＮＡプラスミド送達システムを提供することである。ＲＮＡ断片を標的組織に送達すると、それに対応する遺伝子の発現を阻害し、標的組織における疾患の進行を阻害することができる。

【0013】

任意選択に、前記ＲＮＡ断片は、医療的に意味のある１つ又は２つ以上の特定のＲＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ配列は、医療的に意味のあるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ配列である。

【0014】

多種類のＲＮＡ断片単独、任意の２種類の組み合わせ、任意の３種類の組み合わせによって構築されたプラスミドはいずれも生体内中での富化、自己集合及び疾患治療の効果を有することが、図３９～４１から示されている。

【0015】

任意選択に、前記プラスミドは、プロモーターと、宿主の器官組織内に前記複合構造のターゲティング構造を形成することができるターゲティングタグとをさらに含み、前記複合構造は、前記ターゲティング構造を介して標的組織を探索し結合し、標的組織に前記ＲＮＡ断片を送達可能である。

【0016】

任意選択に、前記プラスミドは、プロモーター－ＲＮＡ断片、プロモーター－ターゲティングタグ、プロモーター－ＲＮＡ断片－ターゲティングタグのいずれか１つ又は複数の回路の組み合わせを含み、前記プラスミドのそれぞれは、少なくとも１つのＲＮＡ断片と１つのターゲティングタグとを含み、前記ＲＮＡ断片及びターゲティングタグは、同一回路又は異なる回路にある。

【0017】

２種類の異なるＲＮＡ断片、２種類の異なるターゲティングタグを任意に組み合わせて構築した送達システムはいずれも生体内中での富化及び治療効果を有することが、図４２～４９から示されている。

【0018】

任意選択に、前記プラスミドは、前記回路を正しい構造に折り畳んで発現させることができるフランキング配列、補償配列、及びループ配列をさらに含み、前記フランキング配列は、５’フランキング配列及び３’フランキング配列を含み、
前記プラスミドは、５’－プロモーター－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列、５’－プロモーター－ターゲティングタグ、５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列のいずれか１つ又は複数の回路の組み合わせを含む。

【0019】

プロモーター－ｓｉＲＮＡ及びプロモーター－ターゲティングタグ－ｓｉＲＮＡ遺伝子回路の富化効果及びＥＧＦＲの発現量の検出結果が、図５０から示されている。

【0020】

任意選択に、前記５’フランキング配列は、ｇｇａｔｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｔｇｃｔｇａａｇｇｃｔｇｔａｔｇｃｔｇａａｔｔｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記ループ配列は、ｇｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔｇａｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記３’フランキング配列は、ａｃｃｇｇｔｃａｇｇａｃａｃａａｇｇｃｃｔｇｔｔａｃｔａｇｃａｃｔｃａｃａｔｇｇａａｃａａａｔｇｇｃｃｃａｇａｔｃｔｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～５位の塩基が欠失されている。ＲＮＡ逆相補配列の１～５位の塩基を欠失したことは、この配列を発現しないようにすることを目的とする。

【0021】

５’フランキング配列、ループ配列、３’フランキング配列及び三者の相同配列をプラスミドに構築すると、いずれも、富化及び治療効果があることが、図５１～５３から示されている。

【0022】

好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～３位の塩基が欠失されている。

【0023】

より好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～３位の連続して配列した塩基が欠失されている。

【0024】

最も好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の９位及び／又は１０位の塩基が欠失されている。

【0025】

任意選択に、プラスミドに少なくとも２種類の回路が存在する場合、隣接する回路は配列１～３からなる配列（配列１－配列２－配列３）で連結され、
配列１はＣＡＧＡＴＣであり、配列２は５～８０塩基からなる配列であり、配列３はＴＧＧＡＴＣである。好ましくは、配列２は、１０～５０塩基からなる配列であり、より好ましくは、配列２は、２０～４０塩基からなる配列である。

【0026】

任意選択に、プラスミドに少なくとも２種類の回路が存在する場合、隣接する回路は配列４又は配列４と８０％超の相同性を有する配列で連結され、
配列４は、ＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣである。

【0027】

配列４及びその相同配列によって構築された送達システムはいずれも富化及び治療効果を有することが、図５５から示されている。任意選択に、前記プラスミドは、異なる構造を有する複数種類のプラスミドからなり、プラスミドの一方はプロモーター及びターゲティングタグを含み、プラスミドの他方はプロモーター及びＲＮＡ配列を含む。

【0028】

任意選択に、前記器官組織は肝臓であり、前記複合構造はエクソソームである。

【0029】

任意選択に、前記ターゲティングタグは、ターゲティング機能を有するターゲティングペプチド又はターゲティングタンパク質から選択され、前記ターゲティング構造は、複合構造の表面に位置する。

【0030】

任意選択に、前記ターゲティングペプチドは、ＲＶＧターゲティングペプチド、ＧＥ１１ターゲティングペプチド、ＰＴＰターゲティングペプチド、ＴＣＰ－１ターゲティングペプチド、ＭＳＰターゲティングペプチドを含み、
前記ターゲティングタンパク質は、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＰＴＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＭＳＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質を含む。

【0031】

任意選択に、送達が必要なＲＮＡの長さが１５～２５ヌクレオチド（ｎｔ）である。例えば、前記ＲＮＡ配列の長さが、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチドであってもよい。好ましくは、前記ＲＮＡ配列の長さが１８～２２ヌクレオチドである。

【0032】

様々な長さのＲＮＡ配列によって構築された送達システム（プラスミド）はいずれも静脈注射後に生体内中での富化及び治療効果を有することが、図５４から示されている。

【0033】

任意選択に、前記送達が必要なＲＮＡは、ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＫＲＡＳ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＶＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＴＯＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｂ７遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ－β１遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｋ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｌ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＨＬＡ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＧＤＦ１５遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ－２１のアンチセンス鎖、ｍｉＲＮＡ－２１４のアンチセンス鎖、ＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＨＴＴ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｌｒｒｋ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子のｓｉＲＮＡ、又は上記配列と８０％超の相同性を有するＲＮＡ配列、又は上記ＲＮＡをコードする核酸分子から選択されるいずれか１種又は複数種である。なお、ここで「上記ＲＮＡ配列をコードする核酸分子」中のＲＮＡ配列には、それぞれのＲＮＡの相同性が８０％超のＲＮＡ配列も含まれる。

【0034】

ここで、上記各遺伝子のｓｉＲＮＡはいずれもその遺伝子の発現を阻害する機能を持つＲＮＡ配列であり、各遺伝子の発現を阻害する機能を持つＲＮＡ配列は多数存在するので、ここでは一つ一つ挙げることはできないが、効果が優れている以下の配列のみを例示して説明する。

【0035】

ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＧＵＵＧＣＵＵＣＵＣＵＵＡＡＵＵＣＣＵ、ＡＡＡＵＧＡＵＣＵＵＣＡＡＡＡＧＵＧＣＣＣ、ＵＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧＡＵＣＡＵ、ＡＡＵＡＵＵＣＧＵＡＧＣＡＵＵＵＡＵＧＧＡ、ＵＡＡＡＡＡＵＣＣＵＣＡＣＡＵＡＵＡＣＵＵ、ＥＧＦＲ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0036】

ＫＲＡＳ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＧＡＵＵＵＡＧＵＡＵＵＡＵＵＵＡＵＧＧＣ、ＡＡＵＵＵＧＵＵＣＵＣＵＡＵＡＡＵＧＧＵＧ、ＵＡＡＵＵＵＧＵＵＣＵＣＵＡＵＡＡＵＧＧＵ、ＵＵＡＵＧＵＵＵＵＣＧＡＡＵＵＵＣＵＣＧＡ、ＵＧＵＡＵＵＵＡＣＡＵＡＡＵＵＡＣＡＣＡＣ、ＫＲＡＳ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0037】

ＶＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＵＵＵＧＡＡＧＡＧＵＵＧＵＡＵＵＡＧＣＣ、ＵＡＡＵＡＧＡＣＵＧＧＵＡＡＣＵＵＵＣＡＵ、ＡＣＡＡＣＵＡＵＧＵＡＣＡＵＡＡＵＡＧＡＣ、ＵＵＵＡＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＵＵＣＵＣＣＡ、ＡＡＣＡＡＡＡＧＧＵＵＵＵＵＣＡＵＧＧＡＣ、ＶＥＧＦＲ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0038】

ｍＴＯＲ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＧＡＵＡＧＵＵＧＧＣＡＡＡＵＣＵＧＣＣＡ、ＡＣＵＡＵＵＵＣＡＵＣＣＡＵＡＵＡＡＧＧＵ、ＡＡＡＡＵＧＵＵＧＵＣＡＡＡＧＡＡＧＧＧＵ、ＡＡＡＡＡＵＧＵＵＧＵＣＡＡＡＧＡＡＧＧＧ、 ＵＧＡＵＵＵＣＵＵＣＣＡＵＵＵＣＵＵＣＵＣ、ｍＴＯＲ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0039】

ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＡＡＡＣＡＵＡＡＵＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣ、ＵＡＡＡＡＡＡＣＡＵＡＡＵＣＡＡＡＡＧＡＡ、ＡＡＵＡＡＵＡＡＡＵＡＡＵＣＡＣＡＡＧＵＧ、ＵＵＵＵＣＡＣＧＧＡＡＡＡＣＡＵＧＵＣＵＧ、ＡＡＡＣＡＵＡＡＵＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡ、ＴＮＦ－α遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0040】

ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＵＡＡＵＣＡＵＣＵＣＣＡＵＵＡＡＵＧＵＣ、ＡＡＡＣＡＡＵＵＣＣＵＵＵＵＵＵＡＵＣＵＵ、ＡＵＵＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＡＣＵＵＵＧＡＧ、ＡＵＡＡＵＧＡＡＧＧＡＵＡＵＡＣＡＡＣＡＧ、ＵＵＣＵＵＵＡＵＵＣＡＵＡＡＡＡＧＵＣＵＣ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0041】

Ｂ７遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＵＵＵＣＵＵＵＧＧＧＵＡＡＵＣＵＵＣＡＧ、 ＡＧＡＡＡＡＡＵＵＣＣＡＣＵＵＵＵＵＣＵＵ、ＡＵＵＵＣＡＡＡＧＵＣＡＧＡＵＡＵＡＣＵＡ、 ＡＣＡＡＡＡＡＵＵＣＣＡＵＵＵＡＣＵＧＡＧ、ＡＵＵＡＵＵＧＡＧＵＵＡＡＧＵＡＵＵＣＣＵ、Ｂ７遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0042】

ＴＧＦ－β１遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＣＧＧＡＡＡＵＡＡＣＣＵＡＧＡＵＧＧＧＣ、ＵＧＡＡＣＵＵＧＵＣＡＵＡＧＡＵＵＵＣＧＵ、ＵＵＧＡＡＧＡＡＣＡＵＡＵＡＵＡＵＧＣＵＧ、ＵＣＵＡＡＣＵＡＣＡＧＵＡＧＵＧＵＵＣＣＣ、ＵＣＵＣＡＧＡＣＵＣＵＧＧＧＧＣＣＵＣＡＧ、ＴＧＦ－β１遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0043】

Ｈ２－Ｋ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＡＡＡＡＣＡＡＡＵＣＡＡＵＣＡＡＡＣＡＡ、 ＵＣＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＵＣＡＡＵＣＡＡ、ＵＡＵＧＡＧＡＡＧＡＣＡＵＵＧＵＣＵＧＵＣ、ＡＡＣＡＡＵＣＡＡＧＧＵＵＡＣＡＵＵＣＡＡ、ＡＣＡＡＡＡＣＣＵＣＵＡＡＧＣＡＵＵＣＵＣ、Ｈ２－Ｋ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0044】

Ｈ２－Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＡＵＣＵＣＧＧＡＧＡＧＡＣＡＵＵＵＣＡＧ、ＡＡＵＧＵＵＧＵＧＵＡＡＡＧＡＧＡＡＣＵＧ、ＡＡＣＡＵＣＡＧＡＣＡＡＵＧＵＵＧＵＧＵＡ、ＵＧＵＵＡＡＣＡＡＵＣＡＡＧＧＵＣＡＣＵＵ、ＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＵＣＵＡＡＧＣＡＵ、Ｈ２－Ｄ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0045】

Ｈ２－Ｌ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＧＡＵＣＣＧＣＵＣＣＣＡＡＵＡＣＵＣＣＧＧ、 ＡＵＣＵＧＣＧＵＧＡＵＣＣＧＣＵＣＣＣＡＡ、ＵＣＧＧＡＧＡＧＡＣＡＵＵＵＣＡＧＡＧＣＵ、ＵＣＵＣＧＧＡＧＡＧＡＣＡＵＵＵＣＡＧＡＧ、 ＡＡＵＣＵＣＧＧＡＧＡＧＡＣＡＵＵＵＣＡＧ、Ｈ２－Ｌ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0046】

ＨＬＡ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＵＣＵＧＧＡＵＧＧＵＧＵＧＡＧＡＡＣＣＧ、ＵＧＵＣＡＣＵＧＣＵＵＧＣＡＧＣＣＵＧＡＧ、ＵＣＡＣＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＡＡ、 ＵＵＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＡＧＵＣＡＧＧＧＵ、ＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＵＧＣＡ、ＨＬＡ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0047】

ＧＤＦ１５遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＡＵＡＡＡＵＡＣＡＧＣＵＧＵＵＵＧＧＧＣ、ＡＧＡＣＵＵＡＵＡＵＡＡＡＵＡＣＡＧＣＵＧ、ＡＡＵＵＡＡＵＡＡＵＡＡＡＵＡＡＣＡＧＡＣ、ＡＵＣＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＵＣＡＣＣＧＵＣ、ＵＧＣＡＡＣＵＣＣＡＧＣＵＧＧＧＧＣＣＧＵ、ＧＤＦ１５遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0048】

ＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＡＵＧＡＡＡＵＧＵＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡ、ＡＡＵＣＡＵＡＵＣＣＵＵＡＡＡＡＵＧＧＡＡ、ＵＡＡＵＣＡＵＡＵＣＣＵＵＡＡＡＡＵＧＧＡ、ＵＧＡＡＡＡＡＵＣＣＵＵＡＧＵＵＵＵＣＡＵ、ＡＧＡＡＧＵＡＡＡＡＡＡＣＵＡＵＵＧＣＧＡ、ＴＮＣ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0049】

ＰＴＰ１Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＧＡＵＡＵＡＧＵＣＡＵＵＡＵＣＵＵＣＵＵ、ＵＣＣＡＵＵＵＵＵＡＵＣＡＡＡＣＵＡＧＣＧ、ＡＵＵＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＡＵＡＵＧＧＡＧ、ＡＡＵＵＵＵＡＡＵＡＣＡＵＵＡＵＵＧＧＵＵ、ＵＵＵＡＵＵＡＵＵＧＵＡＣＵＵＵＵＵＧＡＵ、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0050】

ｍＨＴＴ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＡＵＧＵＵＵＵＣＡＣＡＵＡＵＵＧＵＣＡＧ、ＡＵＵＵＡＧＵＡＧＣＣＡＡＣＵＡＵＡＧＡＡ、ＡＵＧＵＵＵＵＵＣＡＡＵＡＡＡＵＧＵＧＣＣ、ＵＡＵＧＡＡＵＡＧＣＡＵＵＣＵＵＡＵＣＵＧ、ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＣＵＣＵＵＡＡＵＡＣＡＡ、ｍＨＴＴ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0051】

Ｌｒｒｋ２遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＵＵＡＡＣＡＵＧＡＡＡＡＵＡＵＣＡＣＵＵ、ＵＵＡＡＣＡＡＵＡＵＣＡＵＡＵＡＡＵＣＵＵ、ＡＵＣＵＵＵＡＡＡＡＵＵＵＧＵＵＡＡＣＧＣ、ＵＵＧＡＵＵＵＡＡＧＡＡＡＡＵＡＧＵＣＵＣ、ＵＵＵＧＡＵＡＡＣＡＧＵＡＵＵＵＵＵＣＵＧ、Ｌｒｒｋ２遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0052】

α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＵＡＵＡＵＵＡＡＣＡＡＡＵＵＵＣＡＣＡＡ、ＡＡＧＵＡＵＵＡＵＡＵＡＵＡＵＵＡＡＣＡＡ、ＡＵＡＡＣＵＵＵＡＵＡＵＵＵＵＵＧＵＣＣＵ、ＵＡＡＣＵＡＡＡＡＡＡＵＵＡＵＵＵＣＧＡＧ、ＵＣＧＡＡＵＡＵＵＡＵＵＵＡＵＵＧＵＣＡＧ、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。

【0053】

なお、上記の「８０％超の相同性を有する配列」は、相同性が８５％、８８％、９０％、９５％、９８％などであってもよい。

【0054】

任意選択に、前記ＲＮＡ断片は、ＲＮＡ配列本体と、ＲＮＡ配列本体をリボース修飾した修飾ＲＮＡ配列とを含む。すなわち、ＲＮＡ断片は、少なくとも１つのＲＮＡ配列本体のみから構成されていてもよいし、少なくとも１つの修飾ＲＮＡ配列のみから構成されていてもよいし、ＲＮＡ配列本体と修飾ＲＮＡ配列とから構成されていてもよい。

【0055】

本発明において、前記単離された核酸は、そのバリアント及び誘導体をさらに含む。当業者であれば、一般的な方法を用いて前記核酸を修飾することができる。修飾方式には、メチル化修飾、ヒドロカルビル修飾、グリコシル修飾（例えば、２－メトキシ－グリコシル修飾、ヒドロカルビル－グリコシル修飾、糖環修飾など）、核酸化修飾、ペプチドセグメント修飾、脂質修飾、ハロゲン修飾、核酸修飾（例えば、「ＴＴ」修飾）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の一実施形態では、前記修飾は、ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエート、２’－Ｏメトキシエチル（ＭＯＥ）、２’－フルオロ、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミドエステル、カルボキシメチルエステルおよびそれらの組み合わせから選択される。本発明の一実施形態では、前記修飾はヌクレオチドの修飾であり、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、鎖核酸（ＬＮＡ）、アラビノース－核酸（ＦＡＮＡ）、アナログ、誘導体、及びそれらの組み合わせから選択される。好ましくは、前記修飾は、２’フルオロピリミジン修飾である。２’フルオロピリミジン修飾はＲＮＡ上のピリミジンヌクレオチドの２’－ＯＨを２’－Ｆで置換し、２’－ＦはＲＮＡを生体内のＲＮＡ酵素に認識されにくくすることができ、それによってＲＮＡ断片の体内送達の安定性を高める。

【0056】

任意選択に、前記送達システムは、ヒトを含む哺乳動物で使用されるものである。

【0057】

本願のもう１つの発明点は、上記のいずれか１項に記載のＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供することである。

【0058】

任意選択に、前記薬物の投与方法は、経口投与、吸入投与、皮下注射投与、筋肉注射投与、静脈注射投与を含む。静脈注射が好ましい。

【0059】

任意選択に、前記薬物は、癌、肺線維症、結腸炎、肥満、肥満に起因する心血管疾患、２型糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、重症筋無力症、アルツハイマー病又は移植片対宿主病を治療する薬物である。

【0060】

任意選択に、前記薬物は、上記のプラスミドを含み、具体的には、ここでのプラスミドは、ＲＮＡ断片を担持した、又はＲＮＡ断片及びターゲティングタグを担持したプラスミドを表し、宿主体内に入って、肝臓部位で富化し、自己集合して複合構造エクソソームを形成することができ、この複合構造は、標的組織にＲＮＡ断片を送達し、ＲＮＡ断片を標的組織で発現させ、それに対応する遺伝子の発現を阻害し、疾患を治療する目的を達成することができる。

【0061】

前記薬物の剤形は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸薬、座薬、軟膏剤、溶液剤、懸濁剤、ローション剤、ゲル剤、ペースト剤などであってもよい。

【発明の効果】

【0062】

本願の技術的効果は次のとおりである。
本願によるＲＮＡ送達システムは、プラスミドをベクターとし、プラスミドを成熟した注入物とし、その安全性及び信頼性が十分に検証されており、創薬性が非常に良好である。最終的に効果を発揮するＲＮＡ配列は内因性エクソソームに包み込まれて送達され、免疫反応は一切存在せず、このエクソソームの安全性を検証する必要はない。この送達システムは、各種の小分子ＲＮＡを送達することができ、汎用性が高い。またプラスミドの製造はエクソソームやタンパク質、ポリペプチドなどの物質の製造よりも安価で経済的である。本願によるＲＮＡ送達システムは、生体内で自己集合された後、ＡＧＯ_２と緊密に結合して富化して複合構造（エクソソーム）になることができ、これにより、その早期分解を防止し、循環中の安定性を維持することができるだけではなく、受容体細胞による吸収、細胞質内での放出、及びリソソームの脱出に有利であり、必要な用量は低い。
本願によるＲＮＡ送達システムは、薬物に使用されると、薬物送達プラットフォームを提供し、このプラットフォームを通じてより多くのＲＮＡ系薬物の研究開発基盤が提供され得、ＲＮＡ系薬物の研究開発及び使用に極めて大きな推進効果をもたらすことができる。

【図面の簡単な説明】

【0063】

【図1】本願の一実施例によるマウスの体内のプラスミド分布及び代謝状況の比較図である。

【図2】本願の一実施例によるマウスの体内のタンパク質発現レベルの比較図である。

【図3】本発明の一実施例によるマウスの体内の関連ｓｉＲＮＡレベルの比較図である。

【図4】本発明の一実施例によるマウスの各組織における絶対ｓｉＲＮＡレベルの比較図である。

【図5】本願の一実施例による、プラスミド用量がマウスのｓｉＲＮＡレベルに与える影響の比較図である。

【図6】本願の一実施例による、プラスミド注射後のマウスの肝臓における前駆体及び成熟体の代謝状況の比較図である。

【図7】本発明の一実施例による、マウスの様々な組織におけるｓｉＲＮＡの動態及び分布の比較図である。

【図8】本発明の一実施例による、様々なプロモーターがｓｉＲＮＡに与える影響の比較図である。

【図9】本発明の一実施例による、マウスの様々な組織におけるｅＧＦＰ蛍光強度の比較図である。

【図10】本願の一実施例による、マウスのアラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、総ビリルビン、血中尿素窒素、血清アルカリホスファターゼ、クレアチニンの含有量、及び胸腺重量、脾臓重量、末梢血球のパーセンテージの比較図である。

【図11】本願の一実施例によるマウスＥＧＦＲ突然変異肺癌腫瘍の治療効果の比較図である。

【図12】本発明の一実施例によるマウスのＨＥ染色図、免疫組織染色図及び着色の統計図である。

【図13】本願の一実施例によるマウスＫＲＡＳ突然変異肺癌腫瘍の治療効果の比較図である。

【図14】本発明の一実施例によるマウスのＨＥ染色図、免疫組織染色図及び着色の統計図である。

【図15】本願の実施例によるマウス腎癌腫瘍画像の比較図である。

【図16】本願の一実施例によるマウス腎癌腫瘍の進行状況の比較図である。

【図17】本発明の一実施例によるマウスの結腸炎の進行状況の比較図である。

【図18】本発明の一実施例によるマウスの結腸のＨＥ染色の比較図である。

【図19】本発明の一実施例によるマウスの結腸炎の進行状況の比較図である。

【図20】本発明の一実施例によるマウスの結腸のＨＥ染色の比較図である。

【図21】本発明の一実施例によるマウスのヒドロキシプロリン含有量の比較図である。

【図22】本願の一実施例によるマウスの肺の蛍光染色図である。

【図23】本発明の一実施例によるマウスの肺のＭａｓｓｏｎ３色染色図である。

【図24】本発明の一実施例によるマウスの肺のＨＥ染色図である。

【図25】本発明の一実施例によるマウスの一部のタンパク質、ｍＲＮＡレベルの比較図である。

【図26】本発明の一実施例によるマウスのｓｉＲＮＡ関連発現の比較図である。

【図27】本願の一実施例によるマウス膠芽腫の治療状況の比較図である。

【図28】本願の一実施例によるマウスの脳免疫組織染色の比較図である。

【図29】本発明の一実施例によるマウスの視床下部及び肝臓の蛍光顕微鏡画像である。

【図30】本発明の一実施例によるマウス肥満の治療状況の比較図である。

【図31】本発明の一実施例によるマウス肥満脂肪肝の治療状況の比較図である。

【図32】本発明の一実施例によるマウスハンチントン病の治療状況の比較図である。

【図33】本発明の一実施例によるマウスの肝臓、皮質、線条体におけるｓｉＲＮＡ、タンパク質の比較図である。

【図34】本願の一実施例によるマウスハンチントン病の治療状況の比較図である。

【図35】本発明の一実施例によるマウスの線条体及び皮質のｍＨＴＴタンパク質及び毒性凝集体の比較図である。

【図36】本願の一実施例によるトランスジェニックマウスのパーキンソン病の治療状況の比較図である。

【図37】本発明の一実施例によるカニクイザルの全血ｓｉＲＮＡ濃度の変化を示す図である。

【図38】本発明の一実施例による回路の構築及び特徴付け図である。

【図39】本願の一実施例による、６種類の異なるＲＮＡを含有するプラスミドの血漿中での富化効果、エクソソーム中のｓｉＲＮＡの検出及び対応する遺伝子発現量であり、図において、Ａは、プラスミドの血漿中での富化効果及びエクソソーム中のｓｉＲＮＡの検出結果であり、Ｂ及びＣは、ＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｄ及びＥは、ＴＮＣのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量である。

【図40】本願の一実施例による、６種類の異なるＲＮＡのうちの任意の２種類のＲＮＡ配列からなるＲＮＡ断片を含有するプラスミドの血漿中での富化効果、エクソソーム中のｓｉＲＮＡの検出及び対応する遺伝子発現量であり、図において、Ａは、プラスミドの血漿中での富化効果及びエクソソーム中のｓｉＲＮＡの検出結果であり、Ｂは、ＥＧＦＲ及びＴＮＣのタンパク質発現量であり、Ｃは、ＥＧＦＲ及びＴＮＣのｍＲＮＡ発現量である。

【図41】本願の一実施例による、６種類の異なるＲＮＡのうちの任意の３種類のＲＮＡ配列からなるＲＮＡ断片を含有するプラスミドの血漿中での富化効果、エクソソーム中のｓｉＲＮＡの検出及び対応する遺伝子発現量であり、図において、Ａは、プラスミドの血漿中での富化効果及びエクソソーム中のｓｉＲＮＡの検出結果であり、Ｂは、ＥＧＦＲ及びＴＮＣのタンパク質発現量であり、Ｃは、ＥＧＦＲ及びＴＮＣのｍＲＮＡ発現量である

【図42】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類の異なるＲＮＡ断片及び２種類の異なるターゲティングタグが含まれている場合の、膵臓、脳、血漿及びエクソソーム中での富化効果であり、図において、Ａ及びＢは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＥＧＦＲ、ターゲティングタグがＰＴＰの場合に示される富化効果であり、Ｃ及びＤは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＴＮＣ、ターゲティングタグがＰＴＰの場合に示される富化効果であり、Ｅ及びＦは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＥＧＦＲ、ターゲティングタグがＲＶＧの場合に示される富化効果であり、Ｇ及びＨは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＴＮＣ、ターゲティングタグがＲＶＧの場合に示される富化効果である。

【図43】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類の異なるＲＮＡ断片及び２種類の異なるターゲティングタグが含まれている場合の、膵臓、脳で検出されたＥＧＦＲ及びＴＮＣの発現量であり、図において、Ａ及びＢは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＥＧＦＲ、ターゲティングタグがＰＴＰの場合のＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｃ及びＤは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＥＧＦＲ、ターゲティングタグがＲＶＧの場合のＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｅ及びＦは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＴＮＣ _、ターゲティングタグがＰＴＰの場合のＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｇ及びＨは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＴＮＣ、ターゲティングタグがＲＶＧの場合のＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量である。

【図44】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類のＲＮＡ断片が同時に含まれ、かつ２種類の異なるターゲティングタグが含まれている場合の、膵臓、脳、血漿、エクソソーム中での富化効果であり、図において、Ａ及びＢは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＰＴＰの場合の富化効果であり、Ｃ及びＤは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＲＶＧの場合の富化効果である。

【図45】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類のＲＮＡ断片が同時に含まれ、かつ２種類の異なるターゲティングタグが含まれている場合の、膵臓、脳で検出されたＥＧＦＲ及びＴＮＣの発現量であり、図において、Ａ及びＢは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＰＴＰの場合のＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｃ及びＤは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ} _、ターゲティングタグがＲＶＧの場合のＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｅ及びＦは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＰＴＰの場合のＴＮＣのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｇ及びＨは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＲＶＧの場合のＴＮＣのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量である。

【図46】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類の異なるＲＮＡ断片が含まれ、かつ２種類のターゲティングタグが同時に含まれている場合の、膵臓、脳、血漿、エクソソーム中での富化効果であり、図において、Ａ及びＢは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＥＧＦＲ、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合の富化効果であり、Ｃ及びＤは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＴＮＣ、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合の富化効果である。

【図47】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類の異なるＲＮＡ断片が含まれ、かつ２種類のターゲティングタグが同時に含まれている場合の、膵臓、脳で検出されたＥＧＦＲ及びＴＮＣの発現量であり、図において、Ａ及びＢは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＥＧＦＲ、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合のＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｃ及びＤは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^ＴＮＣ、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合のＴＮＣのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量である。

【図48】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類のＲＮＡ断片が同時に含まれ、かつ２種類のターゲティングタグが同時に含まれている場合の、膵臓、脳、血漿、エクソソーム中での富化効果であり、図において、Ａは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合の膵臓及び脳中での富化効果であり、Ｂは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合の血漿及びエクソソーム中での富化効果である。

【図49】本願の一実施例による、遺伝子回路に２種類のＲＮＡ断片が同時に含まれ、かつ２種類のターゲティングタグが同時に含まれている場合の、膵臓、脳で検出されたＥＧＦＲ及びＴＮＣの発現量であり、図において、Ａ及びＢは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合のＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量であり、Ｃ及びＤは、ＲＮＡ断片がｓｉＲ^{ＥＧＦＲ＋ＴＮＣ}、ターゲティングタグがＰＴＰ－ＲＶＧの場合のＴＮＣのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量である。

【図50】本発明の一実施例による、Ａｌｂｕｍｉｎ－ｓｉＲ^ＥＧＦＲ及びＡｌｂｕｍｉｎ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＥＧＦＲの２種類の遺伝子回路の血漿及び脳中での富化効果、及びＥＧＦＲの発現量であり、図において、Ａは、２種類の遺伝子回路の血漿中での富化効果であり、Ｂは、２種類の遺伝子回路の脳中での富化効果であり、Ｃは、２種類の遺伝子回路について検出して得られたＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量である。

【図51】本願の一実施例による、５’フランキング配列が８０％超の相同性を有する送達システムの肺での富化効果及び治療効果であり、図において、Ａは、それぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、８０％超の相同性を有する２つの５’フランキング配列の肺での富化効果であり、Ｂは、それぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、８０％超の相同性を有する２つの５’フランキング配列のＥＧＦＲのタンパク質発現量であり、Ｃは、それぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、８０％超の相同性を有する２つの５’フランキング配列のＥＧＦＲのｍＲＮＡ発現量である。

【図52】本願の一実施例による、ループ配列が８０％超の相同性を有する送達システムの肺での富化効果及び治療効果であり、図において、Ａは、それぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、８０％超の相同性を有する２つのループ配列の肺での富化効果であり、Ｂは、それぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、８０％超の相同性を有する２つのループ配列のＥＧＦＲのタンパク質発現量であり、Ｃは、それぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、８０％超の相同性を有する２つのループ配列のＥＧＦＲのｍＲＮＡ発現量である。

【図53】本願の一実施例による、３’フランキング配列が８０％超の相同性を有する送達システムの肺での富化効果及び治療効果であり、図において、Ａは、それぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、８０％超の相同性を有する２つの３’フランキング配列の肺での富化効果であり、Ｂは、それぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、８０％超の相同性を有する２つの３’フランキング配列のＥＧＦＲのタンパク質発現量であり、Ｃは、それぞれＲＶＧ連結及び非ＲＶＧ連結のときの、８０％超の相同性を有する２つの３’フランキング配列のＥＧＦＲのｍＲＮＡ発現量である。

【図54】本願の一実施例による、長さの異なる３種類のＲＮＡ配列を含有する送達システムの静脈注射後のＥＧＦＲ発現量の検出結果を示す図であり、図において、Ａは、ＥＧＦＲのタンパク質発現量の検出結果であり、Ｂは、ＥＧＦＲのｍＲＮＡ発現量の検出結果である。

【図55】本願の一実施例による、配列４、及び配列４と８０％超の相同性を有する２つの配列４－１、４－２を含有する送達システムの静脈注射９時間後の肺組織のＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ含有量（富化）の検出結果であり、図において、Ａは、配列４の検出結果であり、Ｂは、配列４－１の検出結果であり、Ｃは、配列４－２の検出結果である。

【発明の実施するための形態】

【0064】

以下、図面を参照して、本願の具体的な実施形態について説明する。

【0065】

まず、本発明に係る専門名詞、試験方法などについて説明する。

【0066】

ヘマトキシリン－イオシン染色法（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ）は、ＨＥ染色と略称する。ＨＥ染色は組織学、病理学の教育や科学研究において最も基礎的で、最も広く使用されている技術方法の１つである。

【0067】

ヘマトキシリン染色液は塩基性で、組織の好塩基性構造（例えば、リボソーム、細胞核及び細胞質中のリボ核酸など）を青紫色に染色することができ、イオシンは酸性染料であり、組織の好酸性構造（例えば、レビー小体、アルコール小体及び細胞質の大部分を含む細胞内及び細胞間のタンパク質）をピンク色に染色し、細胞組織全体の形態が鮮明に見られるようにすることができる。

【0068】

ＨＥ染色の具体的なステップには、サンプル組織の固定化と切片化、組織サンプルの脱ろう、組織サンプルの水和、組織切片のヘマトキシリン染色、分化と抗青処理、組織切片のイオシン染色と脱水、組織サンプル切片の風乾とシーリング、顕微鏡での観察及び写真撮影が含まれる。

【0069】

Ｍａｓｓｏｎ染色では、アニオン染料分子の大きさと組織の透過性に関連して、コラーゲン繊維は青（アニリンブルーで染色）又は緑（ブリリアントグリーンで染色）、筋繊維は赤（アシッドマゼンタとポンソーで染色）になる。一連のアニオン水溶性染料で固定化された組織を順次又は混合して染色すると、赤血球は最小分子のアニオン染料で染色され、筋繊維と細胞質は中程度の大きさのアニオン染料で染色され、コラーゲン繊維は大分子のアニオン染料で染色されることが発見された。このことから、赤血球はアニオン染料に対する透過性が最も小さく、筋線維と細胞質はそれに次ぐものであり、コラーゲン線維は最も透過性が大きいことが示された。Ｉ型、ＩＩＩ型コラーゲンは緑色を呈し（ＧＢＭ、ＴＢＭ、メサンギウム基質及び腎間質は緑色を呈する）、フェロヘビン、腎小管細胞質、赤血球は赤色を呈する。

【0070】

Ｍａｓｓｏｎ染色の具体的なステップには、以下が含まれる。

【0071】

組織をＢｏｕｉｎ液に固定化し、流水で一晩リンスし、通常脱水包埋する。切片から水へ脱ろうする（キシレン中の脱ろうを１０ｍｉｎ×３回行い、吸水紙で液体を吸収する。１００％エタノールで脱ろうを５ｍｉｎ×２回行い、吸水紙で液体を吸収する。９５％エタノールで脱ろうを５ｍｉｎ×２回行い、吸水紙で液体を吸収する。水を２ｍｉｎ流して、吸水紙で水分を吸収する）。Ｗｅｉｇｅｒ鉄ヘマトキシリンで５～１０ｍｉｎ染色する。流水で少し洗い、０．５％塩酸アルコールで１５ｓ分化する。流水で３ｍｉｎリンスする。ポンソー酸性フクシン液で８ｍｉｎ染色する。蒸留水で少しリンスする。１％リンモリブデン酸水溶液で約５ｍｉｎ処理する。水洗することなく、アニリンブロー液又はブリリアントグリーン液で５ｍｉｎ再染色する。１％氷酢酸で１ｍｉｎ処理する。９５％エタノールで脱水を５ｍｉｎ×２回行い、吸水紙で液体を吸収する。１００％エタノールで脱水を５ｍｉｎ×２回行い、吸水紙で液体を吸収する。キシレン中で５ｍｉｎ×２回透明化し、吸水紙で液体を吸収する。中性ゴムでシーリングする。

【0072】

ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）は、タンパク質を膜に転写し、抗体を用いて検出するもので、既知の発現タンパク質に対しては、対応する抗体を一次抗体として検出することができ、新規遺伝子の発現産物に対しては、融合部分の抗体を用いて検出することができる。

【0073】

Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔにはポリアクリルアミドゲル電気泳動が使用されており、被検出物はタンパク質、「プローブ」は抗体、「発色」には、標識された二次抗体が使用される。ＰＡＧＥにより分離されたタンパク質サンプルは、非共有結合の形でタンパク質を吸着し、電気泳動で分離されたポリペプチドタイプ及びその生物学的活性を維持することができる固相担体（例えば、硝酸セルロースフィルム）に転写され、固相担体上のタンパク質又はポリペプチドを抗原として、対応する抗体と免疫反応を起こし、酵素又は同位体標識された第２抗体と反応し、基質発色又は自己放射現像を経て、電気泳動で分離された特定の目的遺伝子によって発現されたタンパク質成分を検出する。そのステップには、主に、タンパク質の抽出、タンパク質の定量化、ゲル製造と電気泳動、膜転写、免疫標識と現像が含まれる。

【0074】

免疫組織化学技術（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）又は免疫細胞化学技術（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）と呼ばれる免疫組織化学は、抗原抗体反応、すなわち抗原と抗体が特異的に結合する原理を利用しており、抗体を標識する発色剤（フルオレセイン、酵素、金属イオン、同位体）を化学反応により発色させて組織細胞内抗原（ポリペプチド及びタンパク質）を特定し、その局在化、定性化及び相対的定量化について研究をする。

【0075】

免疫組織化学の主要なステップには、切片浸漬、一晩の乾燥、キシレン脱蝋、勾配アルコール脱蝋（１００％、９５％、９０％、８０％、７５％、７０％、５０％、毎回３ｍｉｎ）、二重蒸留、３％過酸化水素水を滴下してカタラーゼを除去すること、水洗、抗原修復、５％ＢＳＡを滴下して１ｈブロックすること、一次抗体希釈、ＰＢＳ緩衝液による洗浄、二次抗体のインキュベート、ＰＢＳ緩衝液による洗浄、発色液発色、水洗、ヘマトキシリン染色、勾配エタノール脱水、中性ゴムによるシーリングが含まれる。

【0076】

本発明に係るｓｉＲＮＡレベル、タンパク質含有量及びｍＲＮＡ含有量の検出は、いずれも、マウスの体内にＲＮＡ送達システムを注射することにより、マウス幹細胞の生体外モデルを構築する。細胞、組織におけるｍＲＮＡ及びｓｉＲＮＡの発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲを用いて検出する。ｓｉＲＮＡの絶対定量は、標準品を用いて検量線を作成することにより決定する。内部参照に対する各ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡの発現量は２－ΔＣＴで表すことができ、ΔＣＴ＝Ｃサンプル－Ｃ内部参照である。ｓｉＲＮＡを増幅する場合、内部参照遺伝子はＵ６ ｓｎＲＮＡ（組織中）又はｍｉＲ－１６（血清、エクソソーム中）分子であり、ｍＲＮＡを増幅する場合、内部参照遺伝子はＧＡＰＤＨ又は１８ｓ ＲＮＡである。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ実験を用いて細胞、組織におけるタンパク質の発現レベルを検出し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてタンパク質の定量分析を行う。

【0077】

本発明において、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、別段の記載がない限り、当業者に一般に理解される意味を有する。また、本明細書で使用される試薬、材料や操作ステップは、すべて、当該分野で広く使用されている試薬、材料や通常のステップである。
実施例１

【0078】

本実施例は、送達が必要なＲＮＡ断片を担持したプラスミドであって、宿主の器官組織内で富化し、前記宿主の器官組織内に前記ＲＮＡ断片を含有する複合構造を内因的に自発的に形成することができ、前記複合構造が標的組織に進入して結合し、前記ＲＮＡ断片を標的組織に送達することができるプラスミドを含む、ＲＮＡプラスミド送達システムを提供する。

【0079】

本実施例では、プラスミドは、プロモーター及びターゲティングタグをさらに含む。前記プラスミドは、プロモーター－ＲＮＡ配列、プロモーター－ターゲティングタグ、プロモーター－ＲＮＡ配列－ターゲティングタグのいずれか１つ又は複数の回路の組み合わせを含み、前記プラスミドのそれぞれは、少なくとも１つのＲＮＡ断片及び１つのターゲティングタグを含み、前記ＲＮＡ断片及びターゲティングタグは、同一回路又は異なる回路にある。換言すれば、プラスミドには、プロモーター－ＲＮＡ配列－ターゲティングタグのみが含まれていてもよいし、プロモーター－ＲＮＡ配列、プロモーター－ターゲティングタグの組み合わせ、又はプロモーター－ターゲティングタグ、プロモーター－ＲＮＡ配列－ターゲティングタグの組み合わせが含まれていてもよい。

【0080】

図４２～４９は、２種類の異なるＲＮＡ断片、２種類の異なるターゲティングタグを任意に組み合わせた場合の検出結果を示し、具体的には、ＲＮＡ断片１はｓｉＲ^ＥＧＦＲであり、ＲＮＡ断片２はｓｉＲ^ＴＮＣであり、ターゲティングタグ１はＰＴＰであり、ターゲティングタグ２はＲＶＧである。ＲＮＡ断片とターゲティングタグを任意に組み合わせた後、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡとＴＮＣ ｓｉＲＮＡの膵臓、脳、血漿及びエクソソーム中での富化効果及びＥＧＦＲとＴＮＣ ｓｉＲＮＡの発現量を検出する。

【0081】

さらに、前記プラスミドは、前記回路を正しい構造に折り畳んで発現させることができるフランキング配列、補償配列、及びループ配列をさらに含み、前記フランキング配列は、５’フランキング配列及び３’フランキング配列を含み、前記プラスミドは、５’－プロモーター－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列、５’－プロモーター－ターゲティングタグ、５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列のいずれか１つ又は複数の回路の組み合わせを含んでもよい。

【0082】

図５０において、Ａｌｂｕｍｉｎはプロモーター、ＲＶＧはターゲティングタグ、ｓｉＲ^ＥＧＦＲはＥＧＦＲタンパク質を標的とするＲＮＡ断片である。ＲＮＡ断片なしでは、遺伝子回路が機能しないため、Ａｌｂｕｍｉｎ－ｓｉＲ^ＥＧＦＲ及びＡｌｂｕｍｉｎ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＥＧＦＲの２種類の遺伝子回路の血漿及び脳中での富化効果、並びにＥＧＦＲの発現量が検出される。

【0083】

ここで、前記５’フランキング配列は、好ましくは、ｇｇａｔｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｔｇｃｔｇａａｇｇｃｔｇｔａｔｇｃｔｇａａｔｔｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、ｇｇａｔｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｔｇｃｔｇａａｇｇｃｔｇｔａｔｇｃｔｇａａｔｔｃと８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％の相同性を有する配列などを含む。

【0084】

前記ループ配列は、好ましくは、ｇｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔｇａｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、ｇｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔｇａｃと８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％の相同性を有する配列などを含む。

【0085】

前記３’フランキング配列は、好ましくは、ａｃｃｇｇｔｃａｇｇａｃａｃａａｇｇｃｃｔｇｔｔａｃｔａｇｃａｃｔｃａｃａｔｇｇａａｃａａａｔｇｇｃｃｃａｇａｔｃｔｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、ａｃｃｇｇｔｃａｇｇａｃａｃａａｇｇｃｃｔｇｔｔａｃｔａｇｃａｃｔｃａｃａｔｇｇａａｃａａａｔｇｇｃｃｃａｇａｔｃｔｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇと８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％の相同性を有する配列などを含む。

【0086】

前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～５位の塩基が欠失されている。前記補償配列は、ＲＮＡ断片に１つのＲＮＡ配列のみが含まれる場合、このＲＮＡ配列の逆相補配列であってもよく、その中の任意の１～５位の塩基が欠失されている。

【0087】

好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～３位の塩基が欠失されている。前記補償配列は、ＲＮＡ断片に１つのＲＮＡ配列のみが含まれる場合、このＲＮＡ配列の逆相補配列であってもよく、その中の任意の１～３位の塩基が欠失されている。

【0088】

より好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～３位の連続して配列した塩基が欠失されている。前記補償配列は、ＲＮＡ断片に１つのＲＮＡ配列のみが含まれる場合、このＲＮＡ配列の逆相補配列であってもよく、その中の任意の１～３位の連続して配列した塩基が欠失されている。

【0089】

最も好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の９位及び／又は１０位の塩基が欠失されている。前記補償配列は、ＲＮＡ断片に１つのＲＮＡ配列のみが含まれる場合、このＲＮＡ配列の逆相補配列であってもよく、その中の９位及び／又は１０位が欠失されている。９位と１０位の塩基の欠失が最も効果的である。

【0090】

なお、上記のフランキング配列、補償配列、ループ配列はすべて勝手に選択したのではなく、大量の理論研究と試験に基づいて決定したので、上記の特定のフランキング配列、補償配列、ループ配列の協力の下で、ＲＮＡ断片の発現率を最大限に高めることができる。

【0091】

図５１～５３は、８０％超の相同性を有する２種類の５’フランキング配列、ループ配列及び３’フランキング配列を送達システム（プラスミド）に構築した後、肺部中での富化効果及び治療効果をそれぞれ示し、具体的には、図５１は、５’フランキング配列が８０％超の相同性を有するプラスミドの肺部中での富化効果及び治療効果であり、図５２は、ループ配列が８０％超の相同性を有するプラスミドの肺部中での富化効果及び治療効果であり、図５３は、３’フランキング配列が８０％超の相同性を有するプラスミドの肺部中での富化効果及び治療効果である。

【0092】

上記の各配列の詳細を以下の表１に示す。

【表1】

【0093】

プラスミドが２つ以上の回路を担持する場合、隣接する回路は、配列１－配列２－配列３で連結されてもよく、ここで、配列１はＣＡＧＡＴＣであることが好ましく、配列２は５～８０塩基からなる配列、例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５塩基からなる配列、好ましくは、１０～５０塩基からなる配列、より好ましくは２０～４０塩基からなる配列であってもよく、配列３はＴＧＧＡＴＣであることが好ましい。

【0094】

配列２の詳細を以下の表２に示す。

【表2】

【0095】

より好ましくは、プラスミドが２つ以上の回路を担持する場合、隣接する回路は、配列４又は配列４と８０％超の相同性を有する配列で連結され、ここで、配列４はＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣである。

【0096】

図５５は、配列４及び配列４と８０％超の相同性を有する配列４－１、４－２によって構築された送達システムの静脈注射９時間後の肺部組織のＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ含有量の検出結果を示す。

【0097】

配列４の詳細を以下の表３に示す。

【表3】

【0098】

上記のＲＮＡ断片は、医療的に意味のある１つ又は２つ以上の特定のＲＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ配列は、対象受容体において発現可能であり、前記補償配列は対象受容体において発現不可能である。ＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ配列であってもよく、ｓｉＲＮＡ配列であることが好ましい。

【0099】

１つのＲＮＡ配列の長さが、１５～２５ヌクレオチド（ｎｔ）、好ましくは１８～２２ｎｔ、例えば、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔであってもよい。この配列の長さの範囲はランダムに選択されたものではなく、試験を繰り返すことによって決定されたものである。大量の試験により、ＲＮＡ配列の長さが１８ｎｔよりも短く、特に１５ｎｔよりも短い場合、このＲＮＡ配列はほとんど無効で、作用を発揮しないが、ＲＮＡ配列の長さが２２ｎｔよりも長く、特に２５ｎｔよりも長い場合、回路のコストが大幅に向上するだけでなく、効果も長さが１８～２２ｎｔのＲＮＡ配列より優れておらず、経済効果が悪いことが証明された。したがって、ＲＮＡ配列の長さが１５～２５ｎｔ、特に１８～２２ｎｔの場合、コストと作用の両立が最も効果的である。

【0100】

様々な長さのＲＮＡ配列を以下の表４に示す。

【表4】

【0101】

図５４は、様々な長さのＲＮＡ配列によって構築された送達システム（プラスミド）の静脈注射後のＥＧＦＲ発現量の検出をそれぞれ示し、その中で、ＲＮＡ配列の長さがそれぞれ１８、２０、２２のプラスミドはそれぞれＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ（１８）、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ（２０）、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ（２２）に対応している。

【0102】

前記ＲＮＡ配列は、ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＫＲＡＳ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＶＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＴＯＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｂ７遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ－β１遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｋ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｌ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＨＬＡ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＧＤＦ１５遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ－２１のアンチセンス鎖、ｍｉＲＮＡ－２１４のアンチセンス鎖、ＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＨＴＴ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｌｒｒｋ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子のｓｉＲＮＡ、又は上記配列と８０％超の相同性を有するＲＮＡ配列、又は上記ＲＮＡをコードする核酸分子から選択されるいずれか１種又は複数種である。

【0103】

上記の各種遺伝子のｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖はいずれもこの遺伝子、ｍｉＲＮＡの発現又は突然変異を阻害することにより、疾患を阻害する効果を達成することができる。これらの疾患には、癌、肺線維症、結腸炎、肥満、肥満に起因する心血管疾患、２型糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、重症筋無力症、アルツハイマー病、移植片対宿主病、及びこれらに関連する疾患が含まれるが、これらに限定されない。ここで関連疾患とは、上記のいずれか１又は複数の疾患の発症又は進行の過程で発生する関連疾患、合併症、後遺症など、又は上記の疾患と一定の関連性を有する他の疾患をいう。ここで、癌には、胃癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、脳癌、血液癌、腸癌、皮膚癌、リンパ癌、乳癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、血管腫、膠細胞腫、黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。

【0104】

ＲＮＡ断片中のＲＮＡ配列の数は、１、２又はそれ以上である。例えば、脳膠芽腫を治療する場合、同一プラスミドベクターにＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡとＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡを併用することができ、腸炎を治療する場合、ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、及びＢ７遺伝子のｓｉＲＮＡを併用することができる。

【0105】

同一プラスミドベクターに「ｓｉＲＮＡ１」と「ｓｉＲＮＡ２」を併用する例では、このプラスミドベクターの機能構造領域は、（プロモーター－ｓｉＲＮＡ１）－連結配列－（プロモーター－ｓｉＲＮＡ２）－連結配列－（プロモーター－ターゲティングタグ）、又は（プロモーター－ターゲティングタグ－ｓｉＲＮＡ１）－連結配列－（プロモーター－ターゲティングタグ－ｓｉＲＮＡ２）、又は（プロモーター－ｓｉＲＮＡ１）－連結配列－（プロモーター－ターゲティングタグ－ｓｉＲＮＡ２）などと表現することができる。

【0106】

より具体的には、このプラスミドベクターの機能構造領域は、（５’－プロモーター－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ１－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）－連結配列（５’－プロモーター－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ２－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）－連結配列（５’－プロモーター－ターゲティングタグ）、又は（５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ１－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）－連結配列（５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ２－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）、又は（５’－プロモーター－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ１－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）－連結配列（５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ２－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）、（５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ１－ｓｉＲＮＡ２－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）などと表現することができる。その他の場合は同様に類推することができるので、ここでは詳しく説明しない。上記連結配列は、「配列１－配列２－配列３」又は「配列４」としてもよく、１つの括弧は完全な回路（ｃｉｒｃｕｉｔ）を表す。

【0107】

好ましくは、上記ＲＮＡは、その中のＲＮＡ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ）をリボース修飾することによって得られてもよく、２’フルオロピリミジン修飾が好ましい。２’フルオロピリミジン修飾はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ上のピリミジンヌクレオチドの２’－ＯＨを２’－Ｆで置換することであり、２’－Ｆは、人体内のＲＮＡ酵素をｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを識別しにくくすることができ、このようにＲＮＡの体内送達の安定性を高めることができる。

【0108】

具体的には、肝臓は外因性プラスミドを飲み込み、９９％までの外因性プラスミドは肝臓に入るため、プラスミドをベクターとする場合、特異性設計をする必要がなく、外因性プラスミドは肝臓組織中に富化することができ、その後外因性プラスミドが開かれ、ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）が放出され、肝臓組織は上記のＲＮＡ分子をエクソソーム内に自発的に包み込み（自己集合）、これらのエクソソームはＲＮＡ送達機構になる。

【0109】

好ましくは、このＲＮＡ送達機構（エクソソーム）に「正確な誘導」能力を持たせるために、生体内に注入されたプラスミドにターゲティングタグが設計され、このターゲティングタグも肝臓組織によってエクソソームに組み込まれ、特にある特定のターゲティングタグを選択すると、ターゲティングタグはエクソソームの表面に挿入され、それによってエクソソームを誘導することができるターゲティング構造となり、これは本発明に記載されたＲＮＡ送達機構の正確性を大幅に向上させ、一方では導入する必要のある外因性プラスミドの使用量を大幅に減少させることができ、他方では潜在的な薬物送達効率を大幅に向上させることができる。

【0110】

ターゲティングタグはターゲティング機能を有するターゲティングペプチド、ターゲティングタンパク質又は抗体から選択される１種であり、ターゲティングタグの選択は創造的な労力を必要とするプロセスであり、一方では標的組織に応じて利用可能なターゲティングタグを選択する必要があり、他方ではそのターゲティングタグがターゲティング機能を達成するためにエクソソームの表面に安定的に出現することを保証する必要がある。現在、すでに選別されたターゲティングペプチドには、ＲＶＧターゲティングペプチド（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１で示される）、ＧＥ１１ターゲティングペプチド（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２で示される）、ＰＴＰターゲティングペプチド（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３で示される）、ＴＣＰ－１ターゲティングペプチド（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４で示される）、ＭＳＰターゲティングペプチド（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５で示される）が含まれるが、これらに限定されない。ターゲティングタンパク質には、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６で示される）、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７で示される）、ＰＴＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８で示される）、ＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９で示される）、ＭＳＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０で示される）が含まれるが、これらに限定されない。

【0111】

その中で、ＲＶＧターゲティングペプチド、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、脳組織を正確に標的化することができる。ＧＥ１１ターゲティングペプチド、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ高発現器官組織、例えばＥＧＦＲ突然変異肺癌組織を正確に標的化することができる。ＰＴＰターゲティングペプチド、ＰＴＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、膵臓、特にヒト由来とマウス由来の膵臓癌組織中に特異的に発現するｐｌｅｃｔｉｎ－１タンパク質を正確に標的化することができる。ＴＣＰ－１ターゲティングペプチド、ＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、結腸を正確に標的化することができる。ＭＳＰターゲティングペプチド、ＭＳＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、筋肉組織を正確に標的化することができる。

【0112】

実際の応用において、ターゲティングタグは各種の異なるＲＮＡ断片と柔軟に組み合わせることができ、異なるターゲティングタグを異なるＲＮＡ断片と組み合わせることにより、様々な作用を果たすことができる。例えば、ＲＶＧターゲティングペプチド、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡ、又は両者の組み合わせと組み合わせて膠芽腫を治療することができ、また、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡと組み合わせて肥満を治療することができ、また、ｍＨＴＴ遺伝子のｓｉＲＮＡと組み合わせてハンチントン舞踏症を治療することができ、また、ＬＲＲＫ２遺伝子のｓｉＲＮＡと組み合わせてパーキンソンを治療することができる。ＧＥ１１ターゲティングペプチド、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡと組み合わせて、ＥＧＦＲ遺伝子の高発現又は突然変異によって誘導される肺癌などの疾患を治療することができる。ＴＣＰ－１ターゲティングペプチド又はＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｂ７遺伝子のｓｉＲＮＡ、又はこれら３つの任意の組み合わせと組み合わせて結腸炎又は結腸癌などを治療することができる。

【0113】

そのほか、正確な送達の目的を達成するために、多種のプラスミドベクターの組み込み形態を実験した結果、以下の別の最適化形態を得た。すなわち、前記プラスミドベクターはまた異なる構造を持つ多種のプラスミドで構成されてもよく、その中の１つのプラスミドはプロモーターとターゲティングタグを含み、その他のプラスミドはプロモーターとＲＮＡ断片を含む。すなわち、ターゲティングタグとＲＮＡ断片を異なるプラスミドベクターに組み込み、２種類のプラスミドベクターを体内に注入し、この場合、そのターゲティング効果は同じターゲティングタグとＲＮＡ断片を１つのプラスミドベクターに組み込むことによるターゲティング効果に相当する。

【0114】

より好ましくは、２種類の異なるプラスミドベクターを宿主に注入する際に、まず、ＲＮＡ配列を組み込んだプラスミドベクターを注入し、１～２時間後に、ターゲティングタグを含有するプラスミドベクターを注入してもよく、これにより、より優れたターゲティング効果を達成することができる。

【0115】

上記の送達システムは、いずれも、ヒトを含む哺乳動物で使用され得る。

【0116】

送達システムの実現可能性を検証するために、次のような試験を行った。

【0117】

まず、図３８ａに示すように、コア回路（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｉｒｃｕｉｔ）のインフラストラクチャを合理的に設計し、異なる機能モジュールを自由に組み合わせることができるようにした。コア回路はプロモーター部分とｓｉＲＮＡ発現部分からなり、ｓｉＲＮＡを産生して組織し、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）のペイロードとすることを目的とする。他の組み合わせ可能なコンポーネント（プラグイン）は、プラグアンドプレイ機能を実現するためにコア回路のフレームワークに統合することができる。例えば、２種類の組み合わせ可能な部分を結合してｓｉＲＮＡの作用を最適化する。一方は、エクソンの膜アンカータンパク質を修飾して組織選択性を実現し、他方は、２つの分子標的を同時に阻害するために、２つ目のｓｉＲＮＡを共発現することができる。

【0118】

コア回路構築物については、図３８ａに示すように、ガイド鎖（ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ）の発現を最大化しながら、望ましくないパッセンジャー鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ）の発現を最小化するために、プロモーター部分の制御下で最適化されたｓｉＲＮＡ発現骨格部分をコード化するスキームを設計した。上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＥＧＦＲ）は、多くのヒト腫瘍（例えば、肺癌や膠芽腫）において頻繁に突然変異し、高発現する癌遺伝子であり、ｓｉＲＮＡ標的として選択された。そして、ヒト胚腎２９３ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）とマウス肝癌細胞（ｈｅｐ１－６）をｓｉＲＮＡ生体外集合用のシャーシ細胞（ｃｅｌｌ ｃｈａｓｓｉｓ）として選択した。ｓｉＲＮＡの産生効率を最適化するために、以下の２種類の設計スキームを比較した。一方は、ＣＭＶプロモーターを用いてｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）を発現し、ｍｉＲＮＡ配列をｓｉＲＮＡで置換することであり、他方は、Ｕ６プロモーターを用いて短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現することである。まず、一連のｍｉＲＮＡ前駆体の構造を研究し、ｓｉＲＮＡを産生する最適な骨格としてｐｒｅ－ｍｉＲ－１５５を選択した。次に、図３８ｂに示すように、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ（ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ）及びＵ６指向性ＥＧＦＲ ｓｈＲＮＡ（Ｕ６－ｓｉＲ^Ｅ）をコードするＣＭＶ指向性（ＣＭＶ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのｓｉＲＮＡ産生効率を比較した。２つのスキームは、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡガイド鎖の転写を駆動する面で類似の効率を持っているが、図３８ｂに示すように、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ法は、ｓｈＲＮＡ法に比べて、生成されたパッセンジャー鎖がより少ないか、又は生成されない（成熟したガイド鎖の生物発生過程で、パッセンジャー鎖は分解されるようである）。そのため、オフターゲット効果を回避するために、ＣＭＶ駆動ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを選択して設計するようにした。

【0119】

次に、コア回路がエクソソームに自律的に組み込むようにｓｉＲＮＡを誘導できるか否かを調べる。ＣＭＶ－ｓｃｒＲ又はＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ遺伝子を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、細胞培養液中のエクソソームを観察した。ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）により、各群が分泌したエクソソームは、数が類似し、大きさの分布が類似し、ピーク値が１２８～１３１ｎｍの間であることが示された。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により、精製したエクソソームは典型的な円形小胞形態を呈し、大きさが正確であることを証明した。さらに、特定のエクソンマーカー（ＣＤ６３、ＴＳＧ１０１及びＣＤ９）の富化は、精製エクソームでのみ検出され、細胞培地では検出されなかった。これらの結果は、回路トランスフェクションが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が産生するエクソームの大きさ、構造や量に影響を及ぼさないことを示している。最後に、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ回路でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ及びＨｅｐａ１－６細胞由来のエクソソームからは、図３８ｃに示すように、大量のＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡが検出された。図３８ｄ、図３８ｅに示すように、これらのエクソソームは、マウスＬｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）細胞と一緒にインキュベートする時、ＥＧＦＲ発現の用量依存性が低下し、このことから、エクソソームｓｉＲＮＡが生物学的機能を有することが示唆された。

【0120】

回路のターゲティングタグを設計するために、図３８ａに示すように、Ｌａｍｐ２ｂタンパク質（典型的なエクソソーム膜タンパク質）のＮ末端に融合したターゲティングタグをコードする配列をＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。このタグはＬａｍｐ２ｂを介してエクソソームの表面にアンカーされ、それによって、複合構造エクソソームを所望の組織に送達するように誘導する。具体的には、ＲＶＧペプチドを標的とする中枢神経系を標識として選択し、エクソソームを脳に導入し（ＲＶＧはエクソソームが血液脳関門を通過して神経細胞に入るのを助けることが証明されている）、まず、プロモーターがＲＶＧ－Ｌａｍｐ２ｂ融合タンパク質の発現を開始する効率を評価した。試験により、ＣＭＶプロモーターはＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＲＶＧ－Ｌａｍｐ２ｂ ｍＲＮＡと標識タンパク質ｅＧＦＰの産生に一定の効果があることが証明されたが、Ｕ６プロモーターには効果がなく、このことから、ＣＭＶプロモーターが回路の各部分に連結されたことによる優位性が実証された。次に、免疫沈殿法を用いて、ターゲティングタグがエクソソーム表面で正しく発現していることをガイドして検証した。試験では、抗ＲＶＧ抗体が一時的に不足していたため、ＲＶＧの代わりにＦｌａｇタグを一時的に使用した。図３８ｆに示すように、ＣＭＶガイドＦｌａｇ－Ｌａｍｐ２ｂ回路を用いてＨＥＫ２９３ＴとＨｅｐａ１－６細胞をトランスフェクションした後、抗Ｆｌａｇビーズを用いて完全なエクソソームを免疫沈殿させることに成功し、このことから、ターゲティングタグを正確に位置決めすることが証明された。追加のｓｉＲＮＡ発現部分を設計するために、多くの癌、特に膠芽腫に関連する主要な癌遺伝子ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ（ＴＮＣ）を第２のｓｉＲＮＡ標的として使用した。ＴＮＣ－ｓｉＲＮＡも、図３８に示すように、前ｍｉＲ－１５５骨格に埋め込まれ、ＥＧＦＲ－ｓｉＲＮＡの下流に挿入されている。図３８ｇに示すように、単一（ＣＭＶ ｓｉＲ^Ｅ又はＣＭＶ ｓｉＲ^Ｔ）の転写かタンデム（ＣＭＶ ｓｉＲ^Ｅ）転写かにかかわらず、ＥＧＦＲとＴＮＣ ｓｉＲＮＡの差がほとんど検出されなかった。いずれにせよ、これらの結果は、ｓｉＲＮＡもターゲティングタグも、回路においてそれぞれの役割を果たすことを示唆している。

【0121】

次に、回路がエクソソームに自己集合できるか否かを調べた。ＥＧＦＲ及びＴＮＣ ｓｉＲＮＡｓをコードするＣＭＶガイド回路及びＲＶＧ標識（ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。その結果、細胞培地由来のエクソソームは典型的な形態と大きさの分布を示し、複合コア回路で修飾してもエクソソームの物性は変化しないことを示した。さらに、ＥＧＦＲとＴＮＣ－ｓｉＲＮＡｓとターゲティングタグ（ＣＭＶ－Ｆｌａｇ－ｓｉＲ^Ｅ）を含む完全な回路を構築し、それでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ及びｈｅｐ１－６細胞から産生されるエクソソームを用いて免疫沈殿させることに成功し、図３８ｈに示すように、ＥＧＦＲ及びＴＮＣ ｓｉＲＮＡは、ともに免疫沈殿させたエクソソームに多く存在している。

【0122】

さらに、ＡＧＯ２は生体内で広く発現し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体の中核成分であり、エンドリボヌクレアーゼ活性を有し、ｓｉＲＮＡの成熟を促進し、その生合成と機能を調節することにより、標的遺伝子の発現を阻害することができる。

【0123】

ｓｉＲＮＡの加工はＡｒｇｏｎａｕｔｅ２（ＡＧＯ２）に依存しており、ｓｉＲＮＡをＡＧＯ２に適切に組み込むことでｓｉＲＮＡのターゲティング作用を高めることが期待されることから、ＡＧＯ２とエクソソーム中のｓｉＲＮＡとの関連を評価するために別の免疫沈殿実験を行った。試験により、ＡＧＯ２抗体（ａｎｔｉ－ＡＧＯ２）で沈殿させたエクソソーム中にＥＧＦＲ及びＴＮＣ ｓｉＲＮＡが容易に検出できることが証明され、これは、我々の設計がｓｉＲＮＡをＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードすることを保証し、ＡＧＯ２が結合されるｓｉＲＮＡのエクソソームへの効率的な輸送を促進することを明らかにした。最後に、生体外で集合されたｓｉＲＮＡが機能するか否かを調べるために、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ回路でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のエクソソームをＵ８７ＭＧ膠芽腫細胞と共にインキュベートした。図３８ｉ、図３８ｊに示すように、Ｕ８７ＭＧ細胞においてＥＧＦＲとＴＮＣ発現の用量依存性の低下を実現した。さらに、エクソソームの表面にあるＲＶＧタグは、ＥＧＦＲ及びＴＮＣ ｓｉＲＮＡの標的に対するサイレンシング効果に影響を与えなかった。これらの結果は、回路を複数の組み合わせ可能な部分の有機的な結合として確立し、これらの部分の巧みな結合がＲＮＡの自己集合と放出を可能にした。

【0124】

プラスミドの体内での分布を理解するために、マウスに平板試験を行い、図１Ａに示すように、マウスにプラスミドを注射した後、時点（１ｈ、３ｈ、６ｈ、９ｈ、１２ｈ、２４ｈ、７２ｈ、１６８ｈ、７２０ｈ）でサンプリングし、スペクチノマイシンで抽出したプラスミドを用いて形質転換を行い、肝臓、血漿、肺、脳、腎臓、脾臓中のクローンの数を観察した結果、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄに示すように、プラスミドはマウスの肝臓中に最も多く分布し、注射後約３ｈにピークに達し、注射１２ｈ後には、すでに基本的に代謝されていることがわかった。

【0125】

ｅＧＦＰタンパク質とＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡを共発現したＣＭＶ ｅＧＦＰ ｓｉＲ^Ｅ回路（ｃｉｒｃｕｉｔ）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに静脈注射した結果、図２に示すように、時間の経過とともにマウスの肝臓内のｅＧＦＰ蛍光は徐々に増強し、約１２時間でピークに達し、４８時間で背景レベルまで低下し、他の組織では明らかなｅＧＦＰシグナルは見られなかった。

【0126】

対照プラスミド（ＣＭＶ－ｓｃｒＲ）、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ発現プラスミド（ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ）をそれぞれマウスに注射し、マウス肝細胞の生体外モデルを作成し、ＣＭＶ－ｓｃｒＲとＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスの肝細胞エクソソーム中のｓｉＲＮＡレベルをそれぞれ検出した結果、図３Ａに示すように、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスの肝細胞エクソソームにｓｉＲＮＡの発現が存在することを認めた。

【0127】

一般に、Ａｇｏ２タンパク質との結合がｓｉＲＮＡの機能に必要な条件であると考えており、すなわち、エクソソーム中のｓｉＲＮＡがＡｇｏ２タンパク質と結合することができるので、Ａｇｏ２免疫沈殿実験を行い、その結果を図３Ｂ、図３Ｃに示す。ここで、Ｉｎｐｕｔは免疫沈殿を介さずにエクソソームを直接開裂して検出したサンプルであり、陽性対照を表している。

【0128】

マウスにプラスミドを静脈注射した後、成熟ｓｉＲＮＡの様々な組織における分布を図４に示す。図４Ａから、血漿、エクソソーム、エクソソームフリーの血漿中のＥＧＦＲ－ｓｉＲＮＡレベルは時間依存的に変化することがわかった。図４Ｂから、マウスＥＧＦＲ－ｓｉＲＮＡの肝、肺、膵臓、脾臓、腎臓への蓄積に時間依存性があることが分かった。

【0129】

対照プラスミド（ＣＭＶ－ｓｃｒＲ）、０．０５ｍｇ／ｋｇのＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミド、０．５ｍｇ／ｋｇのＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミド、５ｍｇ／ｋｇのＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミドをマウスにそれぞれ注射し、マウスの肝臓、脾臓、心臓、肺、腎臓、膵臓、脳、骨格筋、ＣＤ４^＋細胞中の絶対ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ）レベルを検出した結果、図５Ａに示すように、対照プラスミドを注射したマウスの組織では、ｓｉＲＮＡの発現がなく、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミドを注射したマウスでは、各組織におけるｓｉＲＮＡ発現レベルとＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミド濃度は正の相関を示すことが分かった。図５Ｂに示すように、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション試験（ＦＩＳＨ）でも、ｓｉＲＮＡ発現レベルとＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミド濃度は正の相関を示し、すなわちＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡの組織中の分布には用量依存性があることが確認された。

【0130】

プラスミドは体内に入ると前駆体（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）を発現し、成熟体（ｓｉＲＮＡ）に加工されるので、プラスミドを注射した後のマウスの肝臓における前駆体（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）と成熟体（ｓｉＲＮＡ）の代謝を調べ、その結果を図６に示す。プラスミド注射６時間後の時点で、マウスの肝臓における前駆体（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）と成熟体（ｓｉＲＮＡ）の発現レベルがピークに達し、プラスミド注射３６時間後では、マウスの肝臓における成熟体（ｓｉＲＮＡ）の代謝が完了し、プラスミド注射４８時間後では、マウスの肝臓における前駆体（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）の代謝が完了していることがわかった。

【0131】

マウスの総胆管に外因性ｓｉＲＮＡを注射した後、マウスのエクソソームフリー血漿（ｅｘｏｓｏｍｅ－ｆｒｅｅ）、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、血漿中の絶対ｓｉＲＮＡレベルをそれぞれ検出し、その結果を図７Ａに示す。マウスの総胆管に外因性ｓｉＲＮＡを注射した後、マウスの脾臓、心臓、肺、腎臓、膵臓、脳、骨格筋、ＣＤ４^＋細胞中のｓｉＲＮＡのレベルをそれぞれ検出し、その結果を図７Ｂに示す。この２つの図は、異なる組織におけるｓｉＲＮＡの動態学がほぼ同じであり、異なる組織におけるｓｉＲＮＡの分布には有意差があることを反映している。

【0132】

アルブミンＡＬＢをプロモーターとするｓｉＲＮＡ、ＣＭＶをプロモーターとするｓｉＲＮＡ、プロモーターを含まないｓｉＲＮＡをそれぞれマウスの体内に静脈注射し、注射後０ｈ、３ｈ、６ｈ、９ｈ、１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈにそれぞれマウスの体内の絶対ｓｉＲＮＡレベルを検出し、その結果を図８に示す。マウスの体内では、ＣＭＶをプロモーターとするｓｉＲＮＡのレベルが最も高く、すなわち、ＣＭＶをプロモーターとする効果が最も優れていることがわかった。

【0133】

自己集合したｅＧＦＰ ｓｉＲＮＡによるマウスの体内のｅＧＦＰレベルに対する阻害を以下のように蛍光試験により観察した。ｅＧＦＰトランスジェニックマウスにＰＢＳ又は５ｍｇ／ｋｇ ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｇ又はＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｇプラスミドを静脈注射し、治療２４時間後にマウスを殺し、冷凍切片中でそのｅＧＦＰ蛍光レベルを検出し、図９Ａには代表的な蛍光顕微鏡画像が示されており、ここで、緑色は陽性ｅＧＦＰシグナルを示し、青色はＤＡＰＩ染色の細胞核を示し、縮尺は１００μｍである。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＧプラスミドはマウスのｅＧＦＰに対する阻害効果がより明らかであることが分かった。ｅＧＦＰトランスジェニックマウスにＰＢＳ又はＣＭＶ－ｓｃｒＲ又はＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミドを静脈注射し、治療２４時間後にマウスを殺し、冷凍切片中でそのｅＧＦＰ蛍光レベルを検出し、図９ＢはＰＢＳ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスの心臓、肺、腎臓、膵臓、脳、骨格筋の蛍光強度（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の比較棒グラフであり、マウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓部位での蛍光強度のコントラストはさらに明らかであることが分かった。

【0134】

ＰＢＳ、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスについて、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、血清アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、クレアチニン（ＣＲＥＡ）含有量及び胸腺重量、脾臓重量、末梢血球のパーセンテージ（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）をそれぞれ検出し、それらの結果を図１０に示し、図１０Ａ～Ｆは、それぞれ、ＰＢＳ、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅをそれぞれ注射したマウスのアラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、総ビリルビン、血中尿素窒素、血清アルカリホスファターゼ、クレアチニン含有量の比較図であり、図１０Ｇは、マウスの肝臓、肺、脾臓、腎臓組織の比較図であり、図１０Ｈ～Ｉは、マウスの胸腺、脾臓組織の比較図であり、図１０Ｊは、マウスの末梢血球のパーセンテージ（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）の比較図である。

【0135】

その結果、ＰＢＳ、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスでは、ＡＬＴ、ＡＳＴなどの含有量及び胸腺重量、脾臓重量、末梢血球のパーセンテージはほとんど変わらず、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスは、ＰＢＳを注射したマウスに比べ、肝臓、肺、脾臓、腎臓にも組織損傷がなかった。

【0136】

従って、本実施例によるＲＮＡ送達システムは、プラスミドをベクターとし、プラスミドを成熟した注入物とし、その安全性及び信頼性が十分に検証されており、創薬性が非常に良好である。最終的に効果を発揮するＲＮＡ配列は内因性エクソソームに包み込まれて送達され、免疫反応は一切存在せず、このエクソソームの安全性を検証する必要はない。この送達システムは、各種の小分子ＲＮＡを送達することができ、汎用性が高い。またプラスミドの製造はエクソソームやタンパク質、ポリペプチドなどの物質の製造よりも安価で経済的である。本実施例によるＲＮＡ送達システムは、生体内で自己集合された後、ＡＧＯ_２と緊密に結合して富化して複合構造（エクソソーム）になることができ、これにより、その早期分解を防止し、循環中の安定性を維持することができるだけではなく、受容体細胞による吸収、細胞質内での放出、及びリソソームの脱出に有利であり、必要な用量は低い。
実施例２

【0137】

実施例１に基づいて、本実施例は薬物を提供する。この薬物は、送達が必要なＲＮＡ断片を担持したプラスミドであって、宿主の器官組織内で富化し、前記宿主の器官組織内に前記ＲＮＡ断片を含有する複合構造を内因的に自発的に形成することができ、前記複合構造が標的組織に進入して結合し、前記ＲＮＡ断片を標的組織に送達することができるプラスミドを含む。

【0138】

任意選択に、前記ＲＮＡ断片は、医療的に意味のある１つ又は２つ以上の特定のＲＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ配列は、医療的に意味のあるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ配列である。

【0139】

図３９～４１において、６種類のＲＮＡは、それぞれ、ｓｉＲ^Ｅ（標的遺伝子はＥＧＦＲ）、ｓｉＲ^Ｔ（標的遺伝子はＴＮＣ）、ｓｈＲ^Ｅ（標的遺伝子はＥＧＦＲ）、ｓｈＲ^Ｔ（標的遺伝子はＴＮＣ）、ｍｉＲ－７（標的遺伝子はＥＧＦＲ）、ｍｉＲ－１３３ｂ（標的遺伝子はＥＧＦＲ）であり、図３９は、提供した６種類の異なるＲＮＡのプラスミドの血漿中での富化効果、エクソソーム中のｓｉＲＮＡの検出及び対応する遺伝子発現量であり、図４０は、以上に提供した６種類のＲＮＡのうちの任意の２種類のＲＮＡ配列からなる４群のプラスミドの血漿中での富化効果、エクソソーム中のｓｉＲＮＡの検出及び対応する遺伝子発現量であり、図４１は、以上に提供した６種類のＲＮＡのうちの任意の３種類のＲＮＡ配列からなる３群のプラスミドの血漿中での富化効果、エクソソーム中のｓｉＲＮＡの検出及び対応する遺伝子発現量である。

【0140】

ＲＮＡ配列の詳細を以下の表５に示す。

【表5】

【0141】

任意選択に、前記プラスミドは、プロモーターと、宿主の器官組織内に前記複合構造のターゲティング構造を形成することができるターゲティングタグとをさらに含み、前記ターゲティング構造は複合構造の表面に位置し、前記複合構造は、前記ターゲティング構造を介して標的組織を探索し結合し、標的組織に前記ＲＮＡ断片を送達可能である。

【0142】

本実施例における上記プラスミド、ＲＮＡ断片、ターゲティングタグなどの説明は、いずれも実施例１を参考にすることができるので、ここでは詳しく説明しない。

【0143】

該薬物は、経口投与、吸入投与、皮下注射投与、筋肉注射投与又は静脈注射投与により人体に投与された後、実施例１に記載のＲＮＡ送達システムによって標的組織に送達され、治療効果を発揮することができる。

【0144】

該薬物は、癌、肺線維症、結腸炎、肥満、肥満に起因する心血管疾患、２型糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、重症筋無力症、アルツハイマー病、又は移植片対宿主病を治療する薬物であってもよい。

【0145】

本実施例の薬物は、希釈剤、緩衝剤、乳剤、カプセル化剤、賦形剤、充填剤、バインダ、スプレー剤、経皮吸収剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、着色剤、矯味剤、アジュバント、乾燥剤、吸着担体などを含むがこれに限定されない、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。

【0146】

本実施例による薬物の剤形は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸薬、座薬、軟膏剤、溶液剤、懸濁剤、ローション剤、ゲル剤、ペースト剤などであってもよい。

【0147】

本実施例による薬物は、プラスミドをベクターとし、プラスミドを成熟した注入物とし、その安全性及び信頼性が十分に検証されており、創薬性が非常に良好である。最終的に効果を発揮するＲＮＡ配列は内因性エクソソームに包み込まれて送達され、免疫反応は一切存在せず、このエクソソームの安全性を検証する必要はない。この薬物は、各種の小分子ＲＮＡを送達することができ、汎用性が高い。またプラスミドの製造はエクソソームやタンパク質、ポリペプチドなどの物質の製造よりも安価で経済的である。本実施例による薬物は、生体内で自己集合された後、ＡＧＯ_２と緊密に結合して富化して複合構造（エクソソーム）になることができ、これにより、その早期分解を防止し、循環中の安定性を維持することができるだけではなく、受容体細胞による吸収、細胞質内での放出、及びリソソームの脱出に有利であり、必要な用量は低い。
実施例３

【0148】

実施例１又は２に基づいて、本実施例はＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物は肺癌治療薬である。

【0149】

ここでは、以下の実験により具体的に説明する。

【0150】

図１１Ａに示すように、マウスを選択し、マウスの体内にマウス肺癌細胞（ＬＬＣ細胞）を注射した後、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅをマウスに２日ごとに注射して治療を行い、マウスの生存分析と腫瘍評価をそれぞれ行い、３０日目に治療を開始し、４４日目に治療を終了した。

【0151】

図１１Ｂに示すように、横軸は時間、縦軸は生存率を表しており、この図から、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスは最も生存率が高かったことが分かった。

【0152】

図１１Ｃに示すように、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスの治療前と治療後に、ＣＴ画像に基づいてマウスの肺組織を３Ｄモデル化したところ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスでは、腫瘍が著しく減少することが分かった。

【0153】

図１１Ｄに示すように、この図は、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスの治療前と治療後のマウスの腫瘍体積（ｍｍ^３）の比較図であり、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスでは、腫瘍体積が著しく減少した。一方、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブを注射したマウスでは、腫瘍体積が減少しないだけでなく、程度が異なるが、増加を示すことが分かった。

【0154】

図１１Ｅに示すように、この図は、正常マウス、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブ／ＣＭＶ－ｓｉ^ＲＥを注射したマウスのｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ比較図であり、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブを注射したマウスでは、ＥＧＦＲ遺伝子含有量が有意に高いことが分かった。

【0155】

図１１Ｆに示すように、この図は、正常マウス、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスのＥＧＦＲ ｍｉＲＮＡレベルの比較図であり、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブを注射したマウスでは、関連ＥＧＦＲ ｍｉＲＮＡレベルが高いことが分かった。

【0156】

以上から、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅは、ＥＧＦＲ突然変異肺癌腫瘍に対して顕著な治療効果を有する。

【0157】

ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスのそれぞれにＨＥ染色と免疫組織染色を行った結果、図１２Ａ～図１２Ｂに示すように、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブを注射したマウスでは、ＥＧＦＲはより多く発現していた。マウスにおけるＥＧＦＲとＰＣＮＡの着色面積を統計した結果、図１２Ｃ～図１２Ｄに示すように、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅを注射したマウスでは、ＥＧＦＲとＰＣＮＡの着色面積はいずれも最も少なく、ＥＧＦＲ突然変異肺癌腫瘍に対する治療効果が最も良いことが分かった。

【0158】

図１３Ａに示すように、ＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｄｐ５３^－／－マウスを選択し、Ａｄｖ－Ｃｒｅ吸入後５０日目から６４日目まで、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ゲフィチニブ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅをマウスに２日ごとに注射して治療を行い、マウスの生存分析と腫瘍評価をそれぞれ行った。

【0159】

図１３Ｂに示すように、横軸は感染後の時間、縦軸は生存率を表しており、この図から、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスでは、生存率が高いことが分かった。

【0160】

図１３Ｃに示すように、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスの治療前と治療後にＣＴ画像に基づいてマウスの肺組織を３Ｄモデル化したところ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射することにより、肺癌腫瘍の増殖を著しく阻害することが分かった。

【0161】

図１３Ｄに示すように、この図は、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスの治療前と治療後の腫瘍数の比較図であり、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスでは、腫瘍数の増加が著しく少ないことが分かった。

【0162】

図１３Ｅに示すように、この図は、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスの治療前と治療後の腫瘍数（ｍｍ^３）の比較図であり、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスでは、腫瘍体積の増加が緩慢である。一方、ＣＭＶ－ｓｃｒＲを注射したマウスでは、腫瘍体積の増加が顕著であることが分かった。

【0163】

図１３Ｆに示すように、この図は、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスのｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ比較図であり、ＣＭＶ－ｓｃｒＲを注射したマウスでは、ＫＲＡＳ遺伝子含有量が有意に高いことが分かった。

【0164】

図１３Ｇに示すように、この図は、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスの関連ＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルの比較図であり、ＣＭＶ－ｓｃｒＲを注射したマウスでは、関連ＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルが高いことが分かった。

【0165】

以上から、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋは、ＫＲＡＳ突然変異肺癌腫瘍に対して顕著な治療効果を有する。

【0166】

ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｋを注射したマウスのそれぞれにＨＥ染色と免疫組織染色を行った結果、図１４Ａ、図１４Ｄ、図１４Ｅに示すように、ＣＭＶ－ｓｃｒＲを注射したマウスでは、ＫＲＡＳ、ｐ－ＡＫＴ、ｐ－ＥＲＫの発現が多く、着色率が高いことが分かった。ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔウエスタンブロット法を用いてマウスの体内の関連タンパク質の発現レベルを検出した結果、図１４Ｂ、図１４Ｃに示すように、ＣＭＶ－ｓｃｒＲを注射したマウスでは、関連タンパク質がより多く発現した。これも、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ＫがＫＲＡＳ突然変異肺癌腫瘍に対して顕著な阻害作用を有することを示唆した。
実施例４

【0167】

実施例１又は２に基づいて、本実施例はＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物は腎臓癌治療薬である。

【0168】

ここでは以下の実験により具体的に説明する。

【0169】

異なるマウスにＰＢＳ緩衝液／対照プラスミド／ＶＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡプラスミド／ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡプラスミド／ＭＩＸ ｓｉＲＮＡプラスミド（ＶＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡとｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡを併用）／スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）／エベロリムス（Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）をそれぞれ注射し、マウス腎臓癌腫瘍の進行状況を観察し、これらの結果を図１５、図１６に示す。ＭＩＸ ｓｉＲＮＡプラスミドを注射したマウスでは、腎臓癌の進行が最も顕著に阻害されたが、ＰＢＳ緩衝液／対照プラスミドを注射したマウスでは、腎臓癌の進行が迅速であることが分かった。

【0170】

以上から、ＶＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡとｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡの併用は腎癌腫瘍に対して顕著な治療効果を有する。
実施例５

【0171】

実施例１又は２に基づいて、本実施例は、ＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物は結腸炎治療薬であり、本実施例では、結腸炎治療におけるＲＮＡ送達システムの効果について、以下の２つの試験により具体的に説明する。

【0172】

第１の試験では、３組の試験群と３組の対照群を設置し、試験群は、それぞれ、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（０．５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（２０）群であり、対照群は、それぞれ、モック群、ｓｃｒ－ＲＮＡ群、ＩＦＸ群であった。

【0173】

この中で、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（０．５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（２０）群では、それぞれ、プラスミドを用いてＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡシステム（ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}）を包み込み、０．５μＬ、５μＬ、２０μＬのＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}の溶液をマウスの体内に尾静脈注射した。

【0174】

モック群は陰性対照群であり、ｓｃｒ－ＲＮＡ群、ＩＦＸ群は、それぞれ、マウスにｓｃｒ－ＲＮＡプラスミドとＩＦＸ（インフリキシマブ）を尾静脈注射した。

【0175】

次に、ＤＳＳ誘導慢性結腸炎モデルの構築を開始し、その間毎日体重を計量して記録した結果、図１７Ａに示すように、ｓｃｒ－ＲＮＡ群では、マウスの体重減少が最も速く、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（０．５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（２０）群では、マウスの体重減少が緩やかであり、ＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ溶液の用量が高いほどマウスの体重減少が緩やかであり、プラスミドに包み込まれたＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡシステムが結腸炎マウスの体重減少を軽減できることが示唆された。

【0176】

モデルの構築が終了すると、生きている小動物を通してプラスミドシステムの体内発現をモニタリングした後、マウスを殺して結腸を観察した結果、図１７Ｂに示すように、ｓｃｒ－ＲＮＡ群では、マウスの結腸長が最も短く、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（０．５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（２０）群のマウスでは、結腸長が比較的長く、ＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ注射用量が高いほど、マウスの結腸長が長いことが分かった。このことは、プラスミドに包み込まれたＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡシステムが慢性炎症による結腸長の短縮に対して、程度が異なるが、改善を示している。

【0177】

マウスの疾患活動指数（Ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）を評価した結果、図１７Ｃに示すように、ｓｃｒ－ＲＮＡ注射群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（０．５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（５）群では、マウスの疾患活動指数が高く、一方、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（２０）群、ＩＦＸ群では、マウスの疾患活動指数が低いことが分かった。

【0178】

マウスの結腸についてＴＮＦ－α ｍＲＮＡを検出した結果、図１７Ｄに示すように、このＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}システムは、結腸のＴＮＦ－αの発現と分泌を低下できることが分かり、マウスの結腸についてＴＮＦ－αを検出した結果、図１７Ｅに示すように、このＡＡＶシステムは、一定量のＴＮＦ－αを産生できることがわかり、結腸内の炎症促進因子であるＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２３を検出した結果、図１７Ｆに示すように、高用量群の炎症因子分泌は全体的に対照群より低いことが分かった。

【0179】

マウスの結腸切片をＨＥ染色して、病理スコアリングを行って統計した結果、図１８Ａ及び図１８Ｂに示すように、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（０．５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（５）群、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（２０）群のマウス、特にａｎｔｉ－ＴＮＦ－α（２０）群のマウスでは、結腸粘膜の完全性はさらに高く、しかも免疫細胞の浸潤程度はさらに浅く、結腸陰窩膿瘍及び結腸の充血と出血も対照群より顕著に軽減されたことが分かった。

【0180】

以上の試験から、結腸炎の発現改善には、プラスミドを用いてＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡシステムを包み込んで治療を行う場合は、ＩＦＸよりも、あるいは少なくともＩＦＸと同様に有効であることが証明された。

【0181】

第２の試験では、４群の試験群と３群の対照群を設置し、試験群は、それぞれ、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α群、ａｎｔｉ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α群、ａｎｔｉ－Ｂ７群、ａｎｔｉ－ｍｉｘ群であり、対照群は、それぞれ、モック群、ＰＢＳ群、ｓｃｒ－ＲＮＡ群であった。

【0182】

ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α群、ａｎｔｉ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α群、ａｎｔｉ－Ｂ７群、ａｎｔｉ－ｍｉｘ群では、それぞれ、プラスミドを用いてＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡシステム（ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α}）、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α ｓｉＲＮＡシステム（ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α}）、Ｂ７ ｓｉＲＮＡシステム（ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｂ７）、ｍｉｘ ｓｉＲＮＡ（ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍｉｘ、すなわち、ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α＋ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α＋Ｂ７}）システムを包み込んだものを２０μＬでマウスの体内に尾静脈注射し、生きている小動物を通してこのシステムの体内発現をモニタリングした結果、上記のシステムが体内、特に肝臓で安定に発現していることがわかった。

【0183】

モック群は陰性対照群であり、ｓｃｒ－ＲＮＡ群、ＰＢＳ群は、それぞれ、ｓｃｒ－ＲＮＡプラスミドとＰＢＳ溶液（リン酸緩衝塩溶液）をマウスに尾静脈注射した。

【0184】

次に、ＤＳＳ誘導慢性結腸炎モデルの構築を開始し、その間毎日体重を計量して記録した結果、図１９Ａに示すように、ａｎｔｉ－ｍｉｘ群では、マウスの体重増加が最も穏やかであり、すなわち、プラスミドに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α＋ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α＋Ｂ７}システムは慢性結腸炎マウスの体重減少を顕著に軽減でき、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α群、ａｎｔｉ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α群、ａｎｔｉ－Ｂ７群では、マウスは炎症緩和期の体重回復速度もｓｃｒ－ＲＮＡ群とＰＢＳ群より顕著に速いことが分かった。

【0185】

モデルの構築が終了すると、生きている小動物を通してプラスミドシステムの体内発現をモニタリングした後、マウスを殺して結腸を観察した結果、図１９Ｂに示すように、４つの試験群では、マウスの結腸の発赤は程度が異なるが、軽減があり、慢性炎症による結腸長の短縮も、程度が異なるが、改善があることが分かった。

【0186】

マウスの疾患活動指数（Ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）を評価した結果、図１９Ｃに示すように、ｓｃｒ－ＲＮＡ群及びＰＢＳ群では、マウスの疾患活動指数が高く、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α群、ａｎｔｉ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α群、ａｎｔｉ－Ｂ７群、ａｎｔｉ－ｍｉｘ群では、マウスの疾患活動指数が順に低下することが分かった。

【0187】

マウスの血漿、肝臓及び結腸についてＴＮＦ－α ｍＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｍＲＮＡ及びＢ７ ｍＲＮＡを検出した結果、図１９Ｄ～図１９Ｆに示すように、このシステムは、血漿、肝臓及び結腸内で、安定に発現する一定量のＲＮＡを生成し、また、結腸のＴＮＦ－α、ｉｎｔｅｇｒｉｎ及びＢ７ ｍＲＮＡの発現を著しく低下させていることが分かった。

【0188】

マウスの結腸切片をＨＥ染色した結果、図２０に示すように、４つの試験群のマウス、特にａｎｔｉ－ｍｉｘ群のマウスでは、結腸粘膜の完全性はさらに高く、しかも免疫細胞の浸潤程度はさらに浅く、結腸陰窩膿瘍及び結腸の充血と出血も対照群より顕著に軽減されることが分かった。

【0189】

以上の試験から、肝臓に親和性のプラスミドに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＮＦ－α＋ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α＋Ｂ７}回路によれば、ＴＮＦ－α ｍＲＮＡ、Ｂ７ ｍＲＮＡ及びｉｎｔｅｇｒｉｎ ｍＲＮＡの長期的な発現及び複数の標的遺伝子のサイレンシングを可能とし、しかも結腸炎症の程度を著しく緩和することができ、創薬の潜在力及び臨床上の研究価値が極めて期待できた。
実施例６

【0190】

実施例１又は２に基づいて、本実施例はＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物は肺線維症治療薬である。本実施例では、肺線維症の治療におけるＲＮＡ送達システムの使用について、以下の試験により具体的に説明する。

【0191】

本実施例では、８群の試験群と３群の対照群を設置した。試験群は、それぞれ、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（５ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１０ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（５ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１＋ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群、Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ（３００ｍｇ／ｋｇ）群であり、対照群は、それぞれ、正常群、ＰＢＳ群、ｓｃｒＲＮＡ群であった。

【0192】

その中で、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（５ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１０ｍｇ／ｋｇ）群では、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇのｍｉＲ－２１ ｓｉＲＮＡプラスミドを肺線維症のマウスに尾静脈注射し、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（５ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群では、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇのＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡプラスミドを肺線維症のマウスに尾静脈注射し、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１＋ＴＧＦ－β１ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群では、１０ｍｇ／ｋｇ Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１とＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡプラスミドを肺線維症のマウスに尾静脈注射し、Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ（３００ｍｇ／ｋｇ）群では、ピルフェニドン３００ｍｇ／ｋｇを肺線維症のマウスに尾静脈注射し、正常群を正常対照群とし、ＰＢＳ群、ｓｃｒＲＮＡ群では、ＰＢＳ溶液と対照プラスミドを肺線維症のマウスにそれぞれ尾静脈注射した。

【0193】

各群のマウスごとにヒドロキシプロリン含有量を検出し、その結果を図２１に示す。ヒドロキシプロリンは、コラーゲンを主成分とし、その含有量が肺線維症の程度を反映しており、図２１から、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（５ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１０ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１＋ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群のマウスでは、ヒドロキシプロリン含有量が比較的低く、肺線維症が阻害されていることが分かった。

【0194】

各群のマウスの肺をそれぞれ蛍光染色した結果、図２２に示すように、図において、緑色の部分はＩ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ）、赤色の部分はα－ＳＭＡ、青色の部分はＤＡＰＩを示した。ＰＢＳ群、ｓｃｒＲＮＡ群のマウスは、Ｉ型コラーゲン、α－ＳＭＡ含有量が多かったが、試験群のマウスは、Ｉ型コラーゲン、α－ＳＭＡ含有量ともに少なく、特にＡｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（５ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１０ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１＋ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群は、Ｉ型コラーゲン、α－ＳＭＡの発現がほとんどないことが分かった。

【0195】

各群のマウスの肺をそれぞれＭａｓｓｏｎ三色染色し、その結果を図２３に示す。ＰＢＳ群とｓｃｒＲＮＡ群のマウスでは、肺胞間隙が著しく破壊され、肺間質コラーゲンが形成されていたが、試験群では、これらの現象が著しく軽減されていることが分かった。

【0196】

各群のマウスの肺をそれぞれＨ＆Ｅ染色し、その結果を図２４に示す。ＰＢＳ群とｓｃｒＲＮＡ群のマウスは肺胞間隙の拡大、炎症性細胞の浸潤、肺胞構造の損傷が見られたが、実験群の肺組織は正常であることが分かった。

【0197】

ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにより、正常群、ＰＢＳ群、ｓｃｒＲＮＡ群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（５ｍｇ／ｋｇ）群、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群、Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ（３００ｍｇ／ｋｇ）群のマウスのＴＧＦ－β１タンパク質レベル、ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡレベルをそれぞれ検出した結果、図２５Ａ～図２５Ｃに示すように、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）群のマウスでは、ＴＧＦ－β１タンパク質レベル及びＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡレベルが最も低いことが分かった。これは、対応するｓｉＲＮＡ発現プラスミドを尾静脈注射した後、ＴＧＦ－β１を肺部に送達して機能を発揮できることを示唆した。

【0198】

正常群、ＰＢＳ群、ｓｃｒＲＮＡ群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（５ｍｇ／ｋｇ）群、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１０ｍｇ／ｋｇ）群のマウスの相対ｍｉＲ－２１レベルをそれぞれ検出した結果、図２５Ｄに示すように、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１（１０ｍｇ／ｋｇ）群のマウスでは、相対ｍｉＲ－２１レベルが最も高いことが分かった。これは、対応するアンチセンス鎖発現プラスミドを尾静脈注射した後、ｍｉＲ－２１のアンチセンス鎖を肺部に送達して機能を発揮できることを示唆した。

【0199】

以上の試験から、肝臓に親和性のプラスミドに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲ^{ｍｉＲ－２１}、ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ＴＧＦ－β１}、ＣＭＶ－ｓｉＲ^{ｍｉＲ－２１＋ＴＧＦ－β１}回路によれば、肺線維症の程度を著しく緩和することができ、創薬の潜在力及び臨床上の研究価値が極めて期待できた。
実施例７

【0200】

実施例１又は２に基づいて、本実施例は、ＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物は膠芽腫治療薬である。本実施例では、膠芽腫の治療におけるＲＮＡ送達システムの使用について、以下の２つの試験により具体的に説明する。

【0201】

第１の試験では、５つの試験群と３つの対照群を設置した。試験群は、それぞれ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ群、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｔ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群、ＣＭＶ－Ｆｌａｇ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群であり、「Ｅ」はＥＧＦＲ、「Ｔ」はＴＮＣを表し、対照群は、それぞれ、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－Ｆｌａｇ－ｓｃｒＲ群であり、具体的な試験過程は図２６Ａを参照する。

【0202】

各群のマウスのＣＤ６３タンパク質発現量、ｓｉＲＮＡ発現レベルをそれぞれ検出した結果、図２６Ｂ～図２６Ｄに示すように、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ回路の静脈注射により、ｓｉＲＮＡを脳に伝達できることを示唆した。

【0203】

第２の試験では、２つの試験群と２つの対照群を設置した。試験群は、それぞれ、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群であり、対照群は、それぞれ、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0204】

具体的な試験には、図２７Ａに示すように、マウスを選択し、マウスの体内に膠芽腫細胞（Ｕ－８７ ＭＧ－Ｌｕｃ細胞）を注射し、７日目から２１日目まで、ＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ（５ｍｇ／ｋｇ）をマウスに２日ごとに注射して治療を行い、マウスの生存分析と腫瘍評価をそれぞれ行った。７日目、１４日目、２８日目、３５日目にそれぞれマウスのＢＬＩ生体内画像形成検出を行った。

【0205】

図２７Ｂに示すように、この図は、７日目、１４日目、２８日目、３５日目のマウスのＢＬＩ生体内画像形成検出の比較図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群のマウスは、膠芽腫阻害効果が最も顕著であることが分かった。

【0206】

図２７Ｃに示すように、この図は、各群のマウスの生存率の比較図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群のマウスは生存時間が最も長いことが分かった。

【0207】

図２７Ｄに示すように、この図は、各群のマウスの蛍光比較図であり、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ生体イメージングにより得られたものであり、縦軸はｌｕｃｉｆｅｒ蛍光シグナルの強弱を表す。植え付けられた腫瘍にはすでにこの遺伝子が人工的に組み込まれているため、この図は腫瘍の進行状況を表すことができる。対照群のマウスでは、腫瘍の進行はいずれも迅速であったが、試験群のマウスでは、腫瘍はかなり阻害されていることが分かった。

【0208】

図２７Ｅに示すように、この図は、各群のマウスの相対ｓｉＲＮＡの比較図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ群のマウスはＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡレベルが高く、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群のマウスは、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡとＴＮＣ ｓｉＲＮＡレベルはいずれも高いことが分かった。

【0209】

図２７Ｆに示すように、この図は、各群のマウスのｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ比較図であり、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ群のマウスはＥＧＦＲ、ＴＮＣ遺伝子の含有量が高いことが分かった。

【0210】

以上の試験データから、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔプラスミドの静脈内注射により、ｓｉＲＮＡを脳に送達して、膠芽腫の増殖を阻害できることを示唆した。

【0211】

各群のマウスの脳に免疫組織染色をそれぞれ行い、視野ごとにＥＧＦＲ、ＴＮＣ、ＰＣＮＡの着色率を統計し、その結果を図２８に示す。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔ群のマウスでは、脳のＥＧＦＲ、ＴＮＣ、ＰＣＮＡの含有量が最も低く、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ群のマウスでは、脳のＥＧＦＲ、ＰＣＮＡの含有量が低いことが分かった。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅプラスミドの注射により、脳のＥＧＦＲ、ＰＣＮＡの発現を阻害し、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｅ＋Ｔプラスミドの注射により、脳のＥＧＦＲ、ＴＮＣ、ＰＣＮＡの発現を阻害できることが分かった。
実施例８

【0212】

実施例１又は２に基づいて、本実施例は、ＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物は肥満治療薬である。本実施例では、肥満治療におけるＲＮＡ送達システムの使用について、以下の２つの試験により具体的に説明する。

【0213】

第１の試験では、２つの試験群と１つの対照群を設置した。試験群は、それぞれ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群であり、対照群はＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であり、ここで、「Ｐ」はＰＴＰ１Ｂを表す。

【0214】

ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群では、それぞれ５ｍｇ／ｋｇのＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐプラスミド、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐプラスミド、ＣＭＶ－ｓｃｒＲプラスミドをマウスに注射し、そして、各群のマウスの視床下部、肝臓の蛍光顕微鏡像をそれぞれ取得した結果、図２９に示すように、ＰＴＰ１Ｂ ｓｉＲＮＡが視床下部に伝達され得ることを示した。

【0215】

第２の試験では、２つの試験群と２つの対照群を設置し、試験群は、それぞれ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群であり、対照群は、それぞれ、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0216】

具体的な試験には、図３０Ａに示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを選択し、１２週間後にＰＢＳ緩衝液／ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐを注射し、２４日の間、２日ごとに１回注射し、最後にマウスの肥満とエネルギー消費、レプチン感受性、インスリン感受性を統計した。

【0217】

図３０Ｂに示すように、この図は、各群のマウスの体重の比較図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの体重が最も安定していることが分かった。

【0218】

図３０Ｃに示すように、この図は、各群のマウスの精巣上体脂肪体重量の比較図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの精巣上体脂肪体重量が最も軽いことが分かった。

【0219】

代謝ケージを用いて、様々な処理を受けたマウスの酸素消費量、呼吸交換率、活動量、カロリー発生量を７２時間連続して検出し、次に、平均値をプロットして、統計し分析し、その結果を図３０Ｄ～図３０Ｇに示す。その結果、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐプラスミドは、マウスの酸素消費量を効果的に高めることができ、これは、この群のマウスが他の群のマウスに比べて高エネルギー代謝状況にあることを意味する。正常マウスは、主にグルコースを自己のエネルギー源とし、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐプラスミドは、マウスの呼吸交換率を低下させることができ、これは、この群のマウスが他の群のマウスに比べてタンパク質を自身のエネルギー源として利用する傾向が強いことを意味する。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐプラスミドを注射したマウスでは、活動量が有意に増加した。また、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群のマウスでは、熱発生が顕著に高まった。

【0220】

図３０Ｈに示すように、この図は、各群のマウスの初期体重曲線の比較図である。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの体重が最も軽いことが分かった。

【0221】

図３０Ｉに示すように、この図は、各群のマウスの初期食物摂取量曲線の比較図である。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの食物摂取量が最も少ないことが分かった。

【0222】

図３０Ｊに示すように、この図は、各群のマウスの血清レプチン含有量の比較図である。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの血清レプチン含有量が最も低いことが分かった。

【0223】

図３０Ｋに示すように、この図は、各群のマウスのｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ比較図である。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスのＰＴＰ１Ｂタンパク質の含有量が最も低いことが分かった。

【0224】

図３０Ｌに示すように、この図は、各群のマウスの血糖変化曲線の比較図である。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの血糖値が最も低いことが分かった。

【0225】

図３０Ｍに示すように、この図は、各群のマウスの基礎グルコース変化曲線の比較図である。ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの基礎グルコースの含有量が最も低いことが分かった。

【0226】

以上の試験から、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐプラスミドの静脈注射により、肥満モデルマウスの肥満を減少させることができる。

【0227】

各群のマウスの血清総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を測定した結果、図３１Ａに示すように、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスのＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬが最も低いことが分かった。

【0228】

各群のマウスの体長を測定した結果、図３１Ｂに示すように、４群のマウスの体長はほとんど変わらないことが分かった。

【0229】

各群のマウスのＨＦＤ食物摂取量を統計した結果、図３１Ｃに示すように、４群のマウスのＨＦＤ食物摂取量はほとんど変わらないことがわかった。

【0230】

各群のマウスにそれぞれ治療後肝組織を採取し、正常対照と比較した結果、図３１Ｄに示すように、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスの肝組織病理切片に明らかな脂肪肝病理的特徴が見られ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｐ群では、マウスの脂肪肝が軽いことが分かった。

【0231】

以上の試験から、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^Ｐプラスミドの静脈注射により、肥満マウスの脂肪肝を軽減できることを示唆した。
実施例９

【0232】

実施例１又は２に基づいて、本実施例は、ＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物はハンチントン病治療薬である。本実施例では、ハンチントン病の治療におけるＲＮＡ送達システムの使用について、以下の５つの試験により具体的に説明する。

【0233】

第１の試験では、２つの試験群と２つの対照群を設置した。試験群は、それぞれ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群であり、対照群は、それぞれ、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0234】

実験の流れを図３２Ａに示し、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のハンチントン病のマウスのそれぞれにＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミド、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミド、ＰＢＳ溶液、ＣＭＶ－ｓｃｒＲプラスミドを静脈注射した後、血漿エクソソームを分離し、ＰＫＨ２６染料で標識した後、細胞と共培養し、細胞のエクソソームの吸収状況を観察した。

【0235】

図３２Ｂに示すように、この図は、各群のマウスの血漿のエクソソーム中のｓｉＲＮＡレベルの比較図であり、２つの試験群のマウスでは、血漿のエクソソーム中のｓｉＲＮＡレベルが高いことが分かった。

【0236】

各群のマウスにプラスミド／溶液を注射した後に抽出した血漿エクソソームに対して、ＰＫＨ２６で標識し、細胞と共培養し、共焦点顕微鏡を用いて写真撮影を行った。その結果、図３２Ｃに示すように、ｓｉＲＮＡを包み込んだエクソソームが細胞に入ってくることが示された。

【0237】

各群のマウスの血漿エクソソームを抽出して細胞と共培養した後、各群のマウスのＨＴＴタンパク質レベル及びｍＲＮＡレベルの変化を検出した結果、図３２Ｄ～図３２Ｆに示すように、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ及びＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴが、ＨＴＴタンパク質レベルを低下できることを示し、エクソームに組み込まれたｓｉＲＮＡは依然として遺伝子サイレンシング機能を発揮できることを示唆した。

【0238】

抽出したマウス血漿エクソソームを細胞と共培養した後、各群のマウスにおけるＨＴＴタンパク質の集積を観察して統計した結果、図３２Ｇ～図３２Ｈに示すように、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ及びＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴがハンチントンＨＴＴ凝集細胞モデル中の病理ＨＴＴタンパク質の凝集を低下できることを示し、エクソソームに組み込まれたｓｉＲＮＡは依然として遺伝子サイレンシング機能を発揮でき、また突然変異タンパク質の凝集を効果的に低下できることを示唆した。

【0239】

各群のマウスの肝臓、血漿、皮質、線条体中の絶対ｓｉＲＮＡの発現レベルをそれぞれ検出して統計した。図３３Ａに示すように、この図は、各群のマウスの肝臓のｓｉＲＮＡの絶対レベルの比較図であり、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの絶対ｓｉＲＮＡレベルが比較的高いことが分かった。図３３Ｂに示すように、この図は、各群のマウス血漿中の絶対ｓｉＲＮＡレベルの比較図であり、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの絶対ｓｉＲＮＡレベルが比較的高いことが分かった。図３３Ｃに示すように、この図は、各群のマウスの皮質及び線条体の絶対ｓｉＲＮＡレベルの比較図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲｍＨＴＴを注射したマウスのほうが、絶対ｓｉＲＮＡレベルが高いことが分かった。

【0240】

図３３Ｄに示すように、この図は、各群のマウスの肝臓、皮質、線条体の組織のＩｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション図であり、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの肝臓組織切片に顕著な蛍光、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの皮質、線条体組織切片に明らかな蛍光があることが分かった。ＲＶＧが血液脳関門を通過して機能を発揮するようにエクソソームｓｉＲＮＡを誘導することを示唆した。

【0241】

第２の試験では、２つの試験群と２つの対照群を設置した。試験群は、それぞれ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ＧＦＰ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＧＦＰ群であり、対照群は、それぞれ、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。ＣＭＶ－ｓｉＲ^ＧＦＰ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＧＦＰ群、ＰＢＳ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のＧＦＰトランスジェニックマウスのそれぞれに、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ＧＦＰプラスミド、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＧＦＰプラスミド、ＰＢＳ溶液、ＣＭＶ－ｓｃｒＲプラスミドを静脈注射した。

【0242】

図３３Ｅ、図３３Ｆに示すように、この図は、各群のマウスの肝、皮質、線条体の組織切片図であり、肝臓にＣＭＶ－ｓｉＲ^ＧＦＰ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＧＦＰを注射したＧＦＰトランスジェニックマウスでは、ＧＦＰ蛍光レベルが低下し、皮質線条体にＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ＧＦＰを注射したマウスでは、ＧＦＰ蛍光レベルが低下することが分かった。ＲＶＧが、血液脳関門を通過して機能を発揮するようにエクソソームｓｉＲＮＡを誘導することを示唆した。

【0243】

第３の試験では、２つの試験群と１つの対照群を設置し、試験群は、それぞれ、ＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群であり、対照群はＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0244】

試験には、図３４Ａに示すように、８週齢のＮ１７１８２Ｑマウスを選択し、それぞれＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のハンチントン病のマウスにＣＭＶ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミド、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミド、ＣＭＶ－ｓｃｒＲプラスミドを尾静脈注射し、０日目と１４日目に回転テストを行い、１４日後にマウスを殺して分析した。

【0245】

図３４Ｂに示すように、この図は、野生型マウス、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスの降下潜伏期の比較図であり、０日目には、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの降下潜伏期が一致し、１４日目には、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群では、マウスの降下潜伏期が最も短いことが分かった。

【0246】

図３４Ｃ及び図３４Ｄに示すように、図３４Ｃは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスの線条体のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ図であり、図３４Ｄは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスの線条体の相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルの比較図であり、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群では、マウスの線条体中のＮ１７１－ｍＨＴＴタンパク質の含有量は高く、相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルも同様に高いことがわかった。

【0247】

第４の試験では、１つの試験群と１つの対照群を設置し、試験群はＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群であり、対照群はＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0248】

試験には、図３４Ｅに示すように、３月齢のＢＡＣＨＤマウスを選択し、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のハンチントン病のマウスにＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミド、ＣＭＶ－ｓｃｒＲプラスミドをそれぞれ静脈注射し、１４日後にマウスを殺して分析した。

【0249】

図３４Ｆに示すように、図３４Ｆは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ群^ｍＨＴＴ群のマウスの皮質及び線条体のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの皮質及び線条体の突然変異体ＨＴＴ（Ｍｕｔａｎｔ ＨＴＴ）、内因性ＨＴＴ（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＨＴＴ）の含有量はいずれも少ないことが分かった。

【0250】

図３４Ｇに示すように、図３４Ｇは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスの皮質及び線条体の相対ｍＨＴＴタンパク質レベルの比較図であり、マウスの皮質と線条体を問わず、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの相対ｍＨＴＴタンパク質レベルはいずれも低いことが分かった。

【0251】

図３４Ｈ及び図３５Ｉに示すように、図３４Ｈは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群のマウスの免疫蛍光図であり、図３５Ｉは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴマウスの皮質及び線条体の相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルの比較図であり、マウスの皮質と線条体を問わず、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルはいずれも低いことが分かった。

【0252】

以上の試験から、ＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミドの静脈注射により、線条体及び皮質のｍＨＴＴの阻害に寄与し、ＨＤマウスの運動能力の改善と神経病理の緩和につながることを示唆した。

【0253】

第５の試験では、１つの試験群と１つの対照群を設置し、試験群はＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群であり、対照群はＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。

【0254】

試験には、図３５Ａに示すように、６週齢のＹＡＣ１２８マウスを選択し、それぞれＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のハンチントン病のマウスにＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミド、ＣＭＶ－ｓｃｒＲプラスミドを静脈注射し、試験開始０日目、４週目、８週目にそれぞれ回転テストを行った後、マウスを殺して分析した。

【0255】

図３５Ｂに示すように、この図は、野生型マウス、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスの降下潜伏期の比較図であり、０日目には、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群では、マウスの低下潜伏期が一致し、４週目と８週目には、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群では、マウスの低下潜伏期が最も短いことが分かった。

【0256】

図３５Ｃに示すように、この図は、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスの皮質及び線条体のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの皮質には、突然変異体ＨＴＴ及び内因性ＨＴＴの含有量はいずれも低く、その線条体には、突然変異体ＨＴＴの含有量は低く、線条体には内因性ＨＴＴの含有量は高いことが分かった。

【0257】

図３５Ｄ、図３５Ｅに示すように、両図はそれぞれＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスの皮質及び線条体の相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルの比較図、相対ｍＨＴＴタンパク質レベルの比較図であり、皮質と線条体を問わず、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスの相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベル、相対ｍＨＴＴタンパク質レベルはいずれも低いことが分かった。

【0258】

図３５Ｆに示すように、この図は、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスの皮質及び線条体の免疫蛍光図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴ群では、マウスのＮｅｕＮ、ＥＭ４８発現はＣＭＶ－ｓｃｒＲ群より低いことが分かった。

【0259】

以上の試験から、ＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^ｍＨＴＴプラスミドの静脈注射により、線条体及び皮質のｍＨＴＴタンパク質及び毒性凝集体の減少に寄与し、行動欠陥及び線条体や皮質の神経病理学を改善することを示唆した。
実施例１０

【0260】

実施例１又は２に基づいて、本実施例は、ＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物はパーキンソン治療薬である。本実施例では、パーキンソン治療におけるＲＮＡ送達システムの使用について、以下の試験により具体的に説明する。

【0261】

この試験では、ＬＲＲＫ２Ｒ１４４１Ｇトランスジェニックマウスを選択し、３月齢で試験を行い、試験にはＬＰＳ介入群とＬＰＳ非介入群を設置した。ＬＰＳ介入群では、ＬＰＳ介入７日後、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}の治療を行った。

【0262】

図３６Ａ及び図３６Ｂに示すように、図３６Ａは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}を注射したＬＲＲＫ２Ｒ１４４１Ｇトランスジェニックマウスのｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ図であり、図３６Ｂは、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}を注射したＬＲＲＫ２Ｒ１４４１Ｇトランスジェニックマウスのタンパク質グレースケール分析図であり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉ^{ＲＬＲＲＫ２}を注射したマウスでは、ＬＲＲＫ２タンパク質及びＳ９３５タンパク質レベルが低下することが分かり、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＬＲＲＫ２が肝臓でｓｉＲＮＡを放出し、ｓｉＲＮＡがエクソソームに組み込まれると、血液脳関門を通過して脳深部タンパク質の発現を低下させることを示唆した。

【0263】

図３６Ｃに示すように、この図は、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}を注射したＬＲＲＫ２Ｒ１４４１Ｇトランスジェニックマウスの黒質領域ＴＨ＋ニューロンの免疫蛍光図であり、その結果、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}を注射したマウスでは、ＴＨニューロンの消失を防止し、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}が肝臓でｓｉＲＮＡを放出し、ｓｉＲＮＡがエクソソームに組み込まれると、血液脳関門を通過して脳深部に入って機能を発揮できることを示唆した。

【0264】

図３６Ｄに示すように、この図は、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}を注射したＬＲＲＫ２Ｒ１４４１Ｇトランスジェニックマウスのミクログリア活性化レベルの免疫蛍光図であり、その結果、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}を注射したマウスでは、ミクログリアの活性化を阻害でき、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}が肝臓でｓｉＲＮＡを放出し、ｓｉＲＮＡがエクソソームに組み込まれると、血液脳関門を通過して脳深部に入って機能を発揮できることを示唆した。

【0265】

以上の試験から、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ^{ＬＲＲＫ２}プラスミドの静脈注射により、ドーパミン作動性ニューロンのＬＲＲＫ２の阻害に寄与し、パーキンソンＰＤマウスの神経病理的発達を軽減することを示唆した。
実施例１１

【0266】

この重要な問題をさらに研究し、生体内自己集合ｓｉＲＮＡの薬物動態と薬効学を解明するために、安全性評価研究に用いられている有名な非ヒト霊長類モデルであるカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）について、より詳細な研究を行った。倫理学的に認められた成体のアカゲザル４頭に５ｍｇ／ｋｇのＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミドを静脈注射し、注射前又は注射後の異なる時点で血液サンプルを採取した。１ヶ月後、これらのアカゲザルに毎日５ｍｇ／ｋｇのＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミドを合計５回静脈注射し、注射前又は最後の注射後の異なる時点で血液サンプルを採取した。

【0267】

図３７に示すように、図３７Ａは、単回注射の場合のカニクイザルの全血ｓｉＲＮＡ濃度の変化図であり、図３７Ｂは、複数回注射の場合のカニクイザルの全血ｓｉＲＮＡ濃度の変化図であり、単回注射の場合のカニクイザルのｓｉＲＮＡ濃度は、静脈注射６時間後にピークに達し、それ以降低下し、複数回注射の場合のカニクイザルのｓｉＲＮＡ濃度は、静脈注射３時間後にピークに達し、それ以降低下し、複数回注射の場合のカニクイザルのｓｉＲＮＡ濃度の減少速度はより緩やかであることが分かった。

【0268】

以上の実験から、ＣＭＶ－ｓｉＲ^Ｅプラスミドはカニクイザルなどの霊長類に対して安全かつ有効であり、応用の将来性が期待できることを示唆した。

【0269】

本明細書では、「上」、「下」、「前」、「後」、「左」、「右」などは、関連部分間の相対的な位置関係を表すためにのみ用いられ、これらの関連部分の絶対位置を限定するものではない。

【0270】

本明細書では、「第１」、「第２」などは、互いを区別するためのものであって、重要度や順序、相互の存在の前提などを示すものではない。

【0271】

本明細書では、「等しい」、「同じ」などは、厳密には数学的及び／又は幾何学的な意味での制限ではなく、当業者に理解可能であり、製造又は使用などによって許容される誤差も含む。

【0272】

別段の記載がない限り、本明細書における数値範囲は、その２つの端点内の範囲全体だけでなく、その中に含まれるいくつかのサブ範囲も含む。

【0273】

以上、本願の好ましい具体的な実施形態及び実施例については、図面を参照して詳細に説明したが、本願は上記の実施形態及び実施例に限定されるものではなく、当業者が有する知識の範囲内で、本願の構想を逸脱することなく、様々な変更も可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【国際調査報告】