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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-14
(54)【発明の名称】新規のＰＤ－１結合ドメイン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240307BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240307BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240307BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240307BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240307BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240307BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240307BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240307BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240307BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240307BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P37/04
A61P35/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 U
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023555837
(86)(22)【出願日】2022-03-31
(85)【翻訳文提出日】2023-11-02
(86)【国際出願番号】 NL2022050178
(87)【国際公開番号】W WO2022211629
(87)【国際公開日】2022-10-06
(31)【優先権主張番号】2027892
(32)【優先日】2021-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】NL
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510340757
【氏名又は名称】メルス ナムローゼ フェンノートシャップ
(71)【出願人】
【識別番号】506130045
【氏名又は名称】インサイト コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100113376
【弁理士】
【氏名又は名称】南条 雅裕
(74)【代理人】
【識別番号】100179394
【弁理士】
【氏名又は名称】瀬田 あや子
(74)【代理人】
【識別番号】100185384
【弁理士】
【氏名又は名称】伊波 興一朗
(74)【代理人】
【識別番号】100137811
【弁理士】
【氏名又は名称】原 秀貢人
(72)【発明者】
【氏名】プライト シモン エドワード
(72)【発明者】
【氏名】メイズ パトリック
(72)【発明者】
【氏名】ナストリ ホラシオ ジー．
(72)【発明者】
【氏名】ストゥワート シャウン エム．
(72)【発明者】
【氏名】ブオンパネ レベッカ エー．
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB31
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4H045AA11
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、参照ＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有する新規のＰＤ－１結合ドメインに関連する。本開示のＰＤ－１結合ドメインは、参照ＰＤ－１抗体と比較して、同等の、またはそれ以上の、ヒトＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力を、さらに提供する。本開示はさらに、そのようなＰＤ－１結合ドメインを含む結合部位に関連する。また、疾患を、具体的には癌などの抑制された免疫系に関連する疾患を、本開示のＰＤ－１結合ドメインまたは結合部位を用いて治療するための方法も、提供される。本開示はさらに、ＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸、および、そのような核酸を含むベクターおよび細胞に関連する。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項2】
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、２価抗体中に１価で存在する場合、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を与え、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項3】
請求項１または２に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、少なくとも重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
および
前記軽鎖可変領域は、好ましくは、異なるエピトープ特異性を有する複数の重鎖と対合可能である軽鎖の、軽鎖可変領域である
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項4】
請求項１または３に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記結合親和性は、表面プラズモン共鳴により測定される
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対して少なくとも１０倍高い結合親和性を有する
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項6】
請求項１～４のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対して１０倍高い結合親和性を有する
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、ヒトＰＤ－１に対して、約０．１～１．０ｎＭの範囲の、具体的には約０．３～０．８ｎＭの範囲の、より具体的には約０．３８～０．７８ｎＭの範囲の結合親和性を有する
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項8】
請求項１、および３～７のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記結合親和性は、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインおよび前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの両方を用いて、２価の単一特異性ＩｇＧフォーマットで測定される
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項9】
請求項１、および３～７のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記結合親和性は、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを用いて、２価の二重特異性ＩｇＧフォーマットで
および
前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを用いて、２価の単一特異性ＩｇＧフォーマットで
測定される
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項10】
請求項２、３、または５～９のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、ここでＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する前記効力は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイで測定される
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項11】
請求項２、３、または５～１０のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、ここでＰＤ－１活性へのリガンド結合を阻害する同等の効力とは、前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力の５倍の範囲内の効力であり、前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する前記効力から５、４、３、および２倍の偏差を含む
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記重鎖可変領域は、以下を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｅ）それぞれ、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｆ）それぞれ、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｇ）それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｈ）それぞれ、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｉ）それぞれ、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい；
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号１～９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、
または
これらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、
重鎖可変領域を含む
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項14】
請求項３～１３のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、ＣＨ１およびＣＬ領域をさらに含む
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項15】
重鎖可変領域を含む抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記重鎖可変領域は、
配列番号１～９からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、
配列番号１～９からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、
および
配列番号１～９からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）
を含む
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項16】
請求項１５に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記重鎖可変領域は、以下を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｅ）それぞれ、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｆ）それぞれ、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｇ）それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｈ）それぞれ、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｉ）それぞれ、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい；
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項17】
請求項１５または１６に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号１～９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、
または
これらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、
重鎖可変領域を含む
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項18】
請求項１５～１７のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、ＣＨ１およびＣＬ領域をさらに含む
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項19】
請求項１～１８のいずれか一項に記載された抗ＰＤ－１結合ドメインを含む、結合部位。
【請求項20】
請求項１９に記載された結合部位であって、前記結合部位が、単一特異性結合部位、好ましくは２価の単一特異性抗体である
結合部位。
【請求項21】
請求項１～１８のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの、または請求項１９または２０に記載された結合部位の有効量と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項22】
治療に使用するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、請求項１９または２０に記載された結合部位、または請求項２１に記載された医薬組成物。
【請求項23】
抑制された免疫系に関連する疾患の治療に使用するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、請求項１９または２０に記載された結合部位、または請求項２１に記載された医薬組成物。
【請求項24】
癌の治療に使用するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、請求項１９または２０に記載された結合部位、または請求項２１に記載された医薬組成物。
【請求項25】
疾患を治療するための方法であって、請求項１～１８のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、請求項１９または２０に記載された結合部位、または請求項２１に記載された医薬組成物の有効量を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む
方法。
【請求項26】
抑制された免疫系に関連する疾患を治療するための方法であって、請求項１～１８のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、請求項１９または２０に記載された結合部位、または請求項２１に記載された医薬組成物の有効量を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む
方法。
【請求項27】
癌を治療するための方法であって、請求項１～１８のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、請求項１９または２０に記載された結合部位、または請求項２１に記載された医薬組成物の有効量を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む
方法。
【請求項28】
請求項１～１８のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの前記重鎖可変領域をコードする、核酸配列。
【請求項29】
請求項２８に記載された核酸配列を含む、ベクター。
【請求項30】
請求項２９に記載されたベクターであって、前記ベクターは、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列をさらに含む
ベクター。
【請求項31】
請求項２９または３０に記載されたベクターであって、前記ベクターは、軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１の核酸配列をさらに含む
ベクター。
【請求項32】
請求項３１に記載されたベクターであって、前記軽鎖可変領域は、異なるエピトープ特異性を有する複数の重鎖と対合可能である軽鎖の、軽鎖可変領域である
ベクター。
【請求項33】
請求項１～１８のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの前記重鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、細胞。
【請求項34】
請求項３３に記載された細胞であって、前記細胞は、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列をさらに含む
細胞。
【請求項35】
請求項３３または３４に記載された細胞であって、前記細胞は、軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１の核酸配列をさらに含む
細胞。
【請求項36】
請求項１～１８のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、または請求項１９または２０に記載された結合部位を産生する、細胞。
【請求項37】
請求項３６に記載された細胞であって、前記細胞は、組換え細胞であり、請求項２９～３２のいずれか一項に記載されたベクターで形質転換された
細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、抗体の分野に関連する。具体的には、異常細胞（ａｂｅｒｒａｎｔ ｃｅｌｌｓ）が関わる疾患の治療のための、治療用抗体の分野に関連する。さらに具体的には、ヒトＰＤ－１に結合する新規の結合ドメイン、およびそのような結合ドメインを含む結合部位に関連する。
【背景技術】
【0002】
癌は、その疾患の治療において多くの進歩がなされ、癌に至る分子事象についての知識が増加したにもかかわらず、依然として世界における主要な死因である。従来、癌の創薬のほとんどは、細胞に不可欠な機能を阻害し、分裂中の細胞を死滅させる薬剤に焦点を当ててきた。しかしながら、進行癌の場合、患者が治療により生命を脅かす副作用に苦しむほどまで、どんなに積極的に適用しても、化学療法によって完全治癒することはほとんどない。ほとんどの場合、患者の腫瘍は増殖を止めるか、または一時的に縮小する（寛解と呼ばれる）が、再び、時にはより急速に増殖を開始し（再発と呼ばれる）、ますます治療が困難になる。過去数年間、癌の医薬品開発の焦点は、広範な細胞毒性化学療法から、毒性のより少ない標的細胞増殖抑制療法へと移ってきた。標的療法による進行癌の治療は、白血病および他のいくつかの癌で臨床的に検証されている。しかしながら、大多数の癌腫において、標的アプローチは、大多数の患者で癌を完全に消滅させるのに十分な効果がないことが、依然として証明されている。
【0003】
癌の標的化は、例えば、癌が生存および／または増殖のために依存するシグナル伝達タンパク質に向ける小分子；腫瘍特異性タンパク質を用いたワクチン；腫瘍細胞を積極的に死滅させる免疫細胞を用いた細胞療法、および、細胞傷害性分子を腫瘍へ標的とし、シグナル伝達を妨げる抗体、および／またはホストの免疫系を腫瘍細胞へ（再度）向ける抗体、などを含む、様々な異なる方法を使用して達成されてきた。
【0004】
例えばＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、およびＴＩＭ－３のような免疫チェックポイントタンパク質は、抗体療法の興味深い標的である。現在までに、ＰＤ－１を標的とする多くの単一特異性抗体が、ＰＤ－１標的結合ドメインを含むある二重特異性抗体と同様に、報告されている。しかしながら、これらの抗体の各々は、効果的な治療薬の産生において独自の課題を有する。従って、効果的なＰＤ－１標的治療用抗体を産生するために、新規のＰＤ－１結合ドメインの開発が、依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本開示の目的のひとつは、ヒト疾患の治療のための、具体的には癌の治療のための新たな医薬品を提供することである。この目的は、新規の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの提供によって、具体的にはそのような抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む抗体などの結合部位によって、満たされる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
ある実施形態において、本開示は、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを提供する。
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを提供する。
【0007】
ある実施形態において、本開示は、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、２価抗体中に１価で存在する場合、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、少なくとも同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を与え、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを提供する。
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、２価抗体中に１価で存在する場合、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、少なくとも同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を与え、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを提供する。
【0008】
ある実施形態において、本開示は、本明細書に記載されたＰＤ－１結合ドメインを含む結合部位を、具体的には単一特異性または多重特異性結合部位を、例えばそのようなＰＤ－１結合ドメインを含む単一特異性または多重特異性抗体などを提供する。
【0009】
ある実施形態において、本開示は、本明細書に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは結合部位の有効量を含む、医薬組成物を提供する。
【0010】
ある実施形態において、本開示は、（ａ）治療に、または（ｂ）抑制された免疫系に関連する疾患の治療に、または（ｃ）癌の治療に使用するための、本明細書に記載されたＰＤ－１結合ドメイン、ＰＤ－１結合ドメインを含む結合部位、および医薬組成物を提供する。
【0011】
ある実施形態において、本開示は、疾患を治療するための方法であって、本明細書に記載されたＰＤ－１結合ドメイン、ＰＤ－１結合ドメインを含む結合部位、または医薬組成物の有効量を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む方法を提供する。
【0012】
ある実施形態において、本開示は、癌を治療するための方法であって、本明細書に記載されたＰＤ－１結合ドメイン、ＰＤ－１結合ドメインを含む結合部位、または医薬組成物の有効量を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む方法を提供する。
【0013】
ある実施形態において、本開示は、本明細書に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列、そのような核酸配列を含むベクターおよび細胞、および、本明細書に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは結合部位を産生する細胞を、提供する。
【0014】
ある実施形態において、本開示は、本明細書に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを産生する方法、およびそれらのバリアントを産生する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイにおける、親和性成熟バリアントのスクリーニング結果を示す。Ａ）配列番号１、配列番号２、および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する親和性成熟重鎖可変領域を含むＩｇＧが；配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む親抗体（ｐａｒｅｎｔａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、陽性対照としてニボルマブアナログ（配列番号１１／配列番号１４）、および陰性対照（配列番号１５／配列番号１６）と比較された。Ｂ）配列番号３、配列番号４、および配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する親和性成熟重鎖可変領域を含むＩｇＧが；配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む親抗体、陽性対照としてニボルマブアナログ（配列番号１１／配列番号１４および配列番号１２／配列番号１４）、および陰性対照（配列番号１５／配列番号１６）と比較された。
【図2】配列番号１、配列番号６、または配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むＰＤ－１結合ドメインの結合親和性を、２価の単一特異性フォーマットで示す。２価の単一特異性ニボルマブアナログ１（配列番号１１／配列番号１４；４通り）、および２価の二重特異性抗体（配列番号１１／配列番号１４×配列番号１５／配列番号１６）の一部としてのニボルマブアナログ１のＰＤ－１結合ドメインと、比較された。
【図3】配列番号７とアッセイで試験されたＰＤ－１結合に影響を与えない任意選択抗原に対する結合ドメイン、および配列番号８とアッセイで試験されたＰＤ－１結合に影響を与えない任意選択抗原に対する結合ドメインを含む二重特異性抗体の、ヒトおよびカニクイザルＰＤ－１に対する結合親和性を示す。ニボルマブアナログ（配列番号１３／配列番号１４）と比較された。
【発明を実施するための形態】
【0016】
ある実施形態において、本開示は、重鎖可変領域が配列番号１～９に示されるアミノ酸配列を有する、いくつかの抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを提供する。ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号１～９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のうち、いずれか１つの重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む。
【0017】
プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ－１）は、受容体のＣＤ２８ファミリーに属する細胞表面受容体であり、Ｔ細胞およびプロＢ細胞上に発現する。ＰＤ－１は現在、２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に結合することが知られている。ＰＤ－１は、免疫チェックポイントとして機能し、Ｔ細胞の活性化を阻害することによって免疫系をダウンレギュレーションさせる際に重要な役割を果たし、その結果、自己免疫を減少させ、自己寛容を促進する。ＰＤ－１の阻害効果は、リンパ節の抗原特異性Ｔ細胞におけるアポトーシス（プログラム細胞死）を促進すると同時に、制御性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞）におけるアポトーシスを減少させるという、二重のメカニズムを通じて達成されると考えられている。ＰＤ－１はまた、ＰＤＣＤ１；プログラム細胞死１；全身性エリテマトーデス感受性２；タンパク質ＰＤ－１；ＨＰＤ－１；ＰＤ１；プログラム細胞死１タンパク質；ＣＤ２７９抗原；ＣＤ２７９；ＨＰＤ－Ｌ；ＨＳＬＥ１；ＳＬＥＢ２；およびＰＤ－１などの、多くの異なる別名でも知られている。ＰＤ－１の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：８７６０；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：５１３３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８８３８９；ＯＭＩＭ：６００２４４；およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１５１１６である。ＰＤ－１の活性を阻害する新しいクラスの薬剤、ＰＤ－１阻害剤は、腫瘍を攻撃する免疫系を活性化し、それゆえある種の癌の治療に一定の成功を収めている。
【0018】
ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、少なくとも重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。軽鎖可変領域は、本明細書でさらに説明されるように、任意の適切な軽鎖可変領域でありうる。ある実施形態において、軽鎖可変領域は、好ましくは、異なるエピトープ特異性を有する複数の重鎖と対合可能である軽鎖の、軽鎖可変領域である。そのような軽鎖はまた、当該技術分野では「一般的な軽鎖」とも呼ばれる。ある実施形態において、本開示は、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを提供する。
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを提供する。
【0019】
ある実施形態において、本開示は、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む２価の単一特異性結合部位であって、
前記結合部位は、参照抗ヒトＰＤ－１抗体よりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
２価の単一特異性結合部位、例えば単一特異性ＰＤ－１抗体ニボルマブ、またはニボルマブの可変領域を含む単一特異性ＰＤ－１抗体などを、提供する。
前記結合部位は、参照抗ヒトＰＤ－１抗体よりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
２価の単一特異性結合部位、例えば単一特異性ＰＤ－１抗体ニボルマブ、またはニボルマブの可変領域を含む単一特異性ＰＤ－１抗体などを、提供する。
【0020】
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインが、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有するかどうかを決定するには、両方の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの結合親和性を、同じタイプのアッセイで、同じアッセイ条件を使用して、測定することにより行うことができる。従って、ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの、または２価の単一特異性結合部位の結合親和性、および、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの、または参照抗ヒトＰＤ－１抗体の結合親和性は、同じタイプのアッセイで、同じアッセイ条件を使用して、測定される。ある実施形態において、アッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）のバイオセンサーシステム、または溶液平衡滴定（ＳＥＴ）などの、結合親和性を測定するために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用するアッセイである（Friguet B et al. (1985) J. Immunol Methods; 77(2): 305-319、およびHanel C et al. (2005) Anal Biochem; 339(1): 182-184参照）。本明細書で提供される、ＰＤ－１結合ドメインの、または２価の単一特異性結合部位の結合親和性値は、実施例３に記載された方法で得られる。簡単に言うと、実施例３は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置を使用して２５℃で、ＳＰＲを行うことを記載する。抗ヒトＦｃ抗体は、ＳシリーズセンサーチップＣＭ５のフローセル上にアミンカップリングを介して固定化され、固定化レベルは～９０００ＲＵである。抗ＰＤ－１抗体の所望の捕捉レベル（１００～１５０ＲＵ）は、予め決められた濃度の抗ＰＤ－１抗体を、各チャンネルのアクティブフローセルを通して１０μＬ／分の流速で６０秒間流すことにより、達成される。ＰＤ－１の３倍連続希釈濃度シリーズ（合計７濃度、最高３００ｎＭ）およびランニングバッファは、２４０秒間（結合時間）注入され、すぐに４８０秒間（解離時間）４５μＬ／分の流速でランニングバッファが続く。３０μＬ／分の流速で３Ｍ ＭｇＣｌ２を３０秒間注入し、表面が再生される。結合キネティクス（ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）および親和性パラメータは、１対１結合モデルへのデータのグローバルフィッティングから得られる。
【0021】
好ましくは、ＳＰＲはＩｇＧフォーマットで抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを用いて行われ、ＰＤ－１との１価相互作用の結合親和性を測定する。
【0022】
ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは２価の単一特異性結合部位は、本明細書に記載されるＳＰＲによって測定されるように、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは参照抗ヒトＰＤ－１抗体よりも、ヒトＰＤ－１に対して少なくとも１０倍高い結合親和性を有する。ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは２価の単一特異性結合部位は、本明細書に記載されるＳＰＲによって測定されるように、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは参照抗ヒトＰＤ－１抗体よりも、ヒトＰＤ－１に対して１０～５０倍、１０～４０倍、１０～３０倍、または１０～２０倍高い結合親和性を有する。ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは２価の単一特異性結合部位は、本明細書に記載されるＳＰＲによって測定されるように、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは参照抗ヒトＰＤ－１抗体よりも、ヒトＰＤ－１に対して１０倍高い結合親和性を有する。
【0023】
ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは２価の単一特異性結合部位は、本明細書に記載されるＳＰＲによって測定されるように、約０．１～１．０ｎＭの範囲の、具体的には約０．３～０．８ｎＭの範囲の、より具体的には約０．３８～０．７８ｎＭの範囲の、ヒトＰＤ－１に対する結合親和性を有する。ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは２価の単一特異性結合部位は、本明細書に記載されるＳＰＲによって測定されるように、０．１～１．０ｎＭの範囲の、具体的には０．３～０．８ｎＭの範囲の、より具体的には０．３８～０．７８ｎＭの範囲の、ヒトＰＤ－１に対する結合親和性を有する。ある実施形態において、結合親和性は、ＰＤ－１との１価相互作用の結合親和性である。
【0024】
ある実施形態において、結合親和性は、本開示の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインおよび参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの両方を用いて、２価の単一特異性ＩｇＧフォーマットで測定される。ある実施形態において、結合親和性は、本開示の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインおよび参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの両方を用いて、２価の二重特異性ＩｇＧフォーマットで測定される。ある実施形態において、結合親和性は、本開示の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを用いて、２価の二重特異性ＩｇＧフォーマットで、および参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを用いて、２価の単一特異性ＩｇＧフォーマットで、測定される。２価の二重特異性ＩｇＧフォーマットは、例えば、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、または参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、および任意選択された無関係な標的と結合する結合ドメインを含みうる。
【0025】
本開示はまた、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、２価抗体中に１価で存在する場合、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、少なくとも同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力を与え、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを提供する。
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、２価抗体中に１価で存在する場合、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、少なくとも同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力を与え、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを提供する。
【0026】
本開示はまた、２価の単一特異性抗ヒトＰＤ－１結合部位であって、
前記結合部位は、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、少なくとも同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
２価の単一特異性抗ヒトＰＤ－１結合部位を提供する。
前記結合部位は、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、少なくとも同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
２価の単一特異性抗ヒトＰＤ－１結合部位を提供する。
【0027】
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは２価の単一特異性抗ヒトＰＤ－１結合部位が、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力を与えるかどうかを決定するには、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは部位、および参照抗ヒトＰＤ－１抗体の両方の効力を、同じタイプのアッセイで、同じアッセイ条件を使用して、測定することにより行うことができる。従って、ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの、または２価の単一特異性結合部位の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力、および参照抗ヒトＰＤ－１抗体の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力は、同じタイプのアッセイで、同じアッセイ条件を使用して、測定される。ある実施形態において、アッセイは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイである。本明細書で提供される、ＰＤ－１結合ドメインの、またはＰＤ－１結合ドメインを含む結合部位の効力データは、実施例２に記載されるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイを用いて得られる。
【0028】
簡単に言うと、実施例２に記載されるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイは、ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ヒトＰＤ－Ｌ１と、抗原非依存的にコグネートＴＣＲを活性化するように設計された改変細胞表面タンパク質とを発現する、ＣＨＯ－Ｋ１細胞である）、およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ヒトＰＤ－１と、ＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーターとを発現する）を使用して、行われる。ＰＤ－Ｌ１細胞またはＰＢＳを含むアッセイプレートは、３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度９５％で、一晩インキュベートされる。インキュベート後、ウェルは空にされ、試験および対照ＩｇＧが連続希釈で加えられ、１０μｇ／ｍｌから始めて、６段階４倍滴定を行う。ＩｇＧ無しの対照であるベース対照もまた、調製される。活性が直接比較される必要のあるＩｇＧは、同じプレート上でインキュベートされる。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞が加えられ、アッセイプレートは、３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度９５％で、６時間インキュベートされる。６時間のインキュベートに続き、プレートは室温で１０分間放置され、ルシフェラーゼ活性が測定される。
【0029】
好ましくは、本開示の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインおよび参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、同じ濃度で、好ましくは両方とも２価の単一特異性ＩｇＧフォーマットで使用される。
【0030】
ある実施形態において、ＰＤ－１－リガンド阻害活性における同等の効力とは、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは抗ヒトＰＤ－１結合部位のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力の５倍の範囲内の効力であり、参照抗ヒトＰＤ－１抗体のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力から５、４、３、および２倍の、好ましくは３倍の、偏差を含む。
【0031】
ある実施形態において、ＰＤ－１－リガンド阻害活性におけるより高い効力とは、参照抗ヒトＰＤ－１抗体のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力よりも、５、４、３、または２倍、好ましくは３倍高い効力である。ある実施形態において、ＰＤ－１－リガンド阻害活性におけるより高い効力とは、参照抗ヒトＰＤ－１抗体のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力よりも、１．１～２．０倍、好ましくは１．２～１．８倍または１．２～１．６倍、より好ましくは１．２～１．４倍高い効力である。
【0032】
参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、ニボルマブアナログ抗体のＰＤ－１結合ドメインであり、好ましくは比較の対象となる抗ヒトＰＤ－１結合ドメインと同じ産生方法を使用して、産生される。参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、ニボルマブアナログ抗体であり、好ましくは比較の対象となる抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む２価の単一特異性結合部位と同じ産生方法を使用して、産生される。ニボルマブアナログ抗体は、ニボルマブと同じ重鎖可変領域配列（配列番号２０）を有する。ニボルマブアナログ抗体は、ニボルマブと同じ軽鎖可変領域配列（配列番号２１）を有する。
【0033】
ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号１～９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のうちの１つの、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む。
【0034】
ＣＤＲ配列は、以下を含む様々な方法を使用して定義されうるが、これらに限定されない：Ｋａｂａｔナンバリングスキーム（Kabat et al., J. Biol. Chem.252:6609-6616 (1977)；および／またはKabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)）、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム（Chothia et al., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)；Chothia et al., Nature 342: 877-883, 1989；および／またはAl-Lazikani B. et al., J. Mol. Biol., 273: 927-948 (1997)）、ＨｏｎｅｇｇｅｒとＰｌｕｃｋｔｈｕｎのナンバリングシステム（Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001)）、ＭａｃＣａｌｌｕｍのナンバリングシステム（MacCallum et al., J. Mol. Biol.262:732-745 (1996)；および／またはAbhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008)）、Ｌｅｆｒａｎｃのナンバリングシステム（Lefranc M.P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77 (2003)；および／またはHonegger and Pluckthun, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001)）、またはＩＭＧＴに従う（Giudicelli et al., Nucleic Acids Res. 25: 206-21 1 (1997)で議論される）。
【0035】
これらのナンバリングスキームの各々は、重鎖または軽鎖可変領域のアミノ酸残基が抗原結合に寄与すると予測されることに基づいて、ＣＤＲを定義する。従って、ＣＤＲを同定する各方法は、本開示の結合ドメインのＣＤＲを同定するために使用されうる。ある実施形態において、本開示の結合ドメインの重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＩＭＧＴに従う。ある実施形態において、本開示の結合ドメインの重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従う。ある実施形態において、本開示の結合ドメインの重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。ある実施形態において、本開示の結合ドメインの重鎖ＣＤＲは、ＩＭＧＴに従う。
【0036】
ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、重鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、
配列番号１～９からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；
配列番号１～９からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；
および
配列番号１～９からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）
を含む。
前記重鎖可変領域は、
配列番号１～９からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；
配列番号１～９からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；
および
配列番号１～９からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）
を含む。
【0037】
Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲは、本明細書で提供される配列リスト中で、太字および下線で示される。
【0038】
ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域は、以下を含み：
－それぞれ、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
－それぞれ、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。
－それぞれ、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
－それぞれ、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。
【0039】
ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域は、以下を含む：
－それぞれ、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
－それぞれ、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）。
－それぞれ、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
－それぞれ、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）。
【0040】
ある実施形態において、本開示のＰＤ－１結合ドメインはまた、ＰＤ－１結合ドメインバリアントをも含み、ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、１つまたは２つのＨＣＤＲのみが、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。
【0041】
例えば、アミノ酸バリエーションを導入するための適切な位置には、ＨＣＤＲ１の第１、第２、および／または第４アミノ酸；ＨＣＤＲ２の第３、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１３、第１４、および／または第１６アミノ酸；および／または、ＨＣＤＲ３の第６および／または第１３アミノ酸を含むが、それらに限定されない。Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲ配列は、本明細書で提供される配列リスト中で、太字および下線で示される。
【0042】
ある実施形態において、本開示は従ってまた、以下を含む抗ヒトＰＤ－１結合ドメインをも提供する：
－アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＦＸ３Ｓを有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ１は、Ｆ、Ｙ、Ｔ、またはＨであってもよく；
Ｘ２は、Ｙ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、またはＤであってもよく；
Ｘ３は、Ｗ、またはＹであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＹＩＸ１ＹＳＧＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＰＸ７Ｘ８ＫＸ９を有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ１は、Ｙ、Ｖ、またはＩであってもよく；
Ｘ２は、Ｓ、またはＧであってもよく；
Ｘ３は、Ｔ、Ｙ、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｗ、Ｌ、またはＱであってもよく；
Ｘ４は、Ｓ、またはＮであってもよく；
Ｘ５は、Ｆ、Ｖ、またはＬであってもよく；
Ｘ６は、Ｎ、またはＳであってもよく；
Ｘ７は、ＳまたはＡであってもよく；
Ｘ８は、ＦまたはＬであってもよく；
Ｘ９は、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、またはＮであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＧＧＹＴＧＸ１ＧＧＤＷＦＤＸ２を有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ１は、Ｙ、Ｈ、Ｖ、またはＡであってもよく；
Ｘ２は、Ｐ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、またはＳであってもよい。
－アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＦＸ３Ｓを有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ１は、Ｆ、Ｙ、Ｔ、またはＨであってもよく；
Ｘ２は、Ｙ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、またはＤであってもよく；
Ｘ３は、Ｗ、またはＹであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＹＩＸ１ＹＳＧＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＰＸ７Ｘ８ＫＸ９を有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ１は、Ｙ、Ｖ、またはＩであってもよく；
Ｘ２は、Ｓ、またはＧであってもよく；
Ｘ３は、Ｔ、Ｙ、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｗ、Ｌ、またはＱであってもよく；
Ｘ４は、Ｓ、またはＮであってもよく；
Ｘ５は、Ｆ、Ｖ、またはＬであってもよく；
Ｘ６は、Ｎ、またはＳであってもよく；
Ｘ７は、ＳまたはＡであってもよく；
Ｘ８は、ＦまたはＬであってもよく；
Ｘ９は、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、またはＮであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＧＧＹＴＧＸ１ＧＧＤＷＦＤＸ２を有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ１は、Ｙ、Ｈ、Ｖ、またはＡであってもよく；
Ｘ２は、Ｐ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、またはＳであってもよい。
【0043】
アミノ酸バリエーションを導入するための他の適切な位置には、ＨＣＤＲ１の第２、第３、第４、および／または第５アミノ酸；ＨＣＤＲ２の第３、第４、第５、第６、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、および／または第１７アミノ酸；および／または、ＨＣＤＲ３の第１、第２、第６、第７、第９、第１０、第１４、第１５、第１６および／または第１８アミノ酸を含むが、それらに限定されない。Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲ配列は、本明細書で提供される配列リスト中で、太字および下線で示される。
【0044】
ある実施形態において、本開示は従ってまた、以下を含む抗ヒトＰＤ－１結合ドメインをも提供する：
－アミノ酸配列ＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ１は、Ｆ、またはＹであってもよく；
Ｘ２は、Ｔ、Ａ、またはＶであってもよく；
Ｘ３は、Ｍ、Ｌ、またはＶであってもよく；
Ｘ４は、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｖ、またはＴであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＷＩＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４を有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ１は、Ｎ、またはＤであってもよく；
Ｘ２は、Ｐ、Ｓ、またはＴであってもよく；
Ｘ３は、Ｎ、またはＱであってもよく；
Ｘ４は、Ｔ、またはＤであってもよく；
Ｘ５は、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｌ、またはＥであってもよく；
Ｘ６は、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｈ、またはＦであってもよく；
Ｘ７は、Ｔ、またはＳであってもよく；
Ｘ８は、Ｙ、Ｆ、またはＨであってもよく；
Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｖ、またはＦであってもよく；
Ｘ１０は、Ｑ、Ｒ、Ｎ、Ｌ、Ｔ、またはＳであってもよく；
Ｘ１１は、Ｄ、Ａ、Ｇ、またはＳであってもよく；
Ｘ１２は、Ｆ、Ｖ、またはＡであってもよく；
Ｘ１３は、Ｔ、Ｋ、Ｈ、Ｇであってもよく；
Ｘ１４は、Ｇ、Ｎ、Ｅ、またはＤであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＧＹＣＸ３Ｘ４ＤＸ５ＣＹＰＮＸ６Ｘ７Ｘ８ＤＸ９を有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ１は、Ｉ、Ｓ、またはＶであってもよく；
Ｘ２は、Ｌ、Ｑ、またはＮであってもよく；
Ｘ３は、Ｎ、Ｇ、Ｓ、またはＤであってもよく；
Ｘ４は、Ｔ、Ｓ、Ｐ、Ｎ、またはＥであってもよく；
Ｘ５は、Ｎ、またはＩであってもよく；
Ｘ６は、Ｗ、Ｇ、Ｑ、Ｈ、Ｗ、Ａ、またはＬであってもよく；
Ｘ７は、Ｉ、Ｖ、またはＬであってもよく；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、またはＩであってもよく；
Ｘ９は、Ｙ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｒ、Ｈ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ａ、またはＬであってもよい。
－アミノ酸配列ＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ１は、Ｆ、またはＹであってもよく；
Ｘ２は、Ｔ、Ａ、またはＶであってもよく；
Ｘ３は、Ｍ、Ｌ、またはＶであってもよく；
Ｘ４は、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｖ、またはＴであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＷＩＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４を有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ１は、Ｎ、またはＤであってもよく；
Ｘ２は、Ｐ、Ｓ、またはＴであってもよく；
Ｘ３は、Ｎ、またはＱであってもよく；
Ｘ４は、Ｔ、またはＤであってもよく；
Ｘ５は、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｌ、またはＥであってもよく；
Ｘ６は、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｈ、またはＦであってもよく；
Ｘ７は、Ｔ、またはＳであってもよく；
Ｘ８は、Ｙ、Ｆ、またはＨであってもよく；
Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｖ、またはＦであってもよく；
Ｘ１０は、Ｑ、Ｒ、Ｎ、Ｌ、Ｔ、またはＳであってもよく；
Ｘ１１は、Ｄ、Ａ、Ｇ、またはＳであってもよく；
Ｘ１２は、Ｆ、Ｖ、またはＡであってもよく；
Ｘ１３は、Ｔ、Ｋ、Ｈ、Ｇであってもよく；
Ｘ１４は、Ｇ、Ｎ、Ｅ、またはＤであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＧＹＣＸ３Ｘ４ＤＸ５ＣＹＰＮＸ６Ｘ７Ｘ８ＤＸ９を有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ１は、Ｉ、Ｓ、またはＶであってもよく；
Ｘ２は、Ｌ、Ｑ、またはＮであってもよく；
Ｘ３は、Ｎ、Ｇ、Ｓ、またはＤであってもよく；
Ｘ４は、Ｔ、Ｓ、Ｐ、Ｎ、またはＥであってもよく；
Ｘ５は、Ｎ、またはＩであってもよく；
Ｘ６は、Ｗ、Ｇ、Ｑ、Ｈ、Ｗ、Ａ、またはＬであってもよく；
Ｘ７は、Ｉ、Ｖ、またはＬであってもよく；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、またはＩであってもよく；
Ｘ９は、Ｙ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｒ、Ｈ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ａ、またはＬであってもよい。
【0045】
ある実施形態において、本開示の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号１～９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、
または
これらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する
重鎖可変領域を含む。
配列番号１～９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、
または
これらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する
重鎖可変領域を含む。
【0046】
ある実施形態において、本開示のＰＤ－１結合ドメインはまた、ＰＤ－１結合ドメインバリアントをも含み、これは、上記で言及されたＨＣＤＲにおけるバリエーションに加えて、フレームワーク領域における１または複数のバリエーションを含む。ある実施形態において、本開示のＰＤ－１結合ドメインバリアントは、ＣＤＲ領域におけるバリエーションを含まないが、フレームワーク領域における１または複数のバリエーションを含む。そのようなバリアントは、本明細書で開示される配列に対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有し、ＰＤ－１結合特異性を保持することが期待される。従って、ある実施形態において、本開示のＰＤ－１結合ドメインは、以下を含む：
－配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号２５に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２６に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２７に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２９に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３０に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号３１に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３２に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３３に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号３４に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３５に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３６に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号３７に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３８に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３９に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号４０に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４１に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４２に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号７に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号４３に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４４に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４５に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号４６に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４７に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４８に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
または
－配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号２２に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２３に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２４に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
－配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号２５に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２６に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２７に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号２８に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２９に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３０に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号３１に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３２に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３３に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号３４に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３５に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３６に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号３７に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３８に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３９に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号４０に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４１に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４２に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号７に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号４３に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４４に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４５に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号４６に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４７に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４８に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
または
－配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号２２に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２３に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２４に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【0047】
ある実施形態において、本開示のＰＤ－１結合ドメインは、軽鎖可変領域を含む。適切な軽鎖可変領域の例は、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域であり、それぞれ配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有し、ここで前記ＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、適切な軽鎖可変領域は、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域であり、それぞれ配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、そのような軽鎖可変領域は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含んでもよい。これらのＬＣＤＲおよび／または軽鎖可変領域を含む、軽鎖または軽鎖可変領域は、当該技術分野においてＶＫ１－３９／ＪＫ１と呼ばれる軽鎖である。これは一般的な軽鎖である。
【0048】
ある実施形態において、本開示のＰＤ－１結合ドメインは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含み、この軽鎖可変領域は、配列番号４９に示されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号５０に示されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号５１に示されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【0049】
本発明による「一般的な軽鎖」という用語は、複数の異なる重鎖、すなわち異なる抗原またはエピトープ結合特異性を有する重鎖と、対合可能である軽鎖を指す。一般的な軽鎖は、例えば二重特異性抗体の作製において特に有用であり、両方の結合ドメインが同じ軽鎖を含む場合、抗体産生はより効率的になる。「一般的な軽鎖」という用語は、同一であるか、またはアミノ酸配列にいくつかの差異を有するが、全長抗体の結合特異性に影響を与えない軽鎖を包含する。例えば保存的なアミノ酸変化、すなわち重鎖と対合したときに結合特異性に寄与しないか部分的にしか寄与しない領域のアミノ酸の変化などを、導入し試験することにより、同一ではないが機能的には同等である軽鎖を調製または見出すことは、本明細書で使用される一般的な軽鎖の定義の範囲内で、例えば可能である。
【0050】
上記で言及されたＬＣＤＲおよび／または軽鎖可変領域を含む一般的な軽鎖とは別に、当該技術分野で知られる他の一般的な軽鎖が使用されうる。そのような一般的な軽鎖の例には、以下を含むが、これらに限定されない：
ＶＫ１－３９／ＪＫ５は、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む；
ＶＫ３－１５／ＪＫ１は、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む；
ＶＫ３－２０／ＪＫ１は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む；
および
ＶＬ３－２１／ＪＬ３は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む。
ＶＫ１－３９／ＪＫ５は、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む；
ＶＫ３－１５／ＪＫ１は、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む；
ＶＫ３－２０／ＪＫ１は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む；
および
ＶＬ３－２１／ＪＬ３は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む。
【0051】
ＶＫ１－３９は、免疫グロブリン可変カッパ１－３９遺伝子の略である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変１－３９；ＩＧＫＶ１３９；ＩＧＫＶ１－３９；ＩｇＶκ１－３９としても知られる。この遺伝子の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：５７４０；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９３０；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４２３７１である。ＶＫ１－３９の好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６として与えられる。これは、Ｖ領域の配列である。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと結合しうる。２つの好ましい結合配列は、ＶＫ１－３９／ＪＫ１およびＶＫ１－３９／ＪＫ５として示され；別名は、ＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１またはＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ５＊０１である（ＩＭＧＴデータベース（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従った命名法）。これらの名称は典型的なものであり、遺伝子セグメントのアレルバリアントを包含する。
【0052】
ＶＫ３－１５は、免疫グロブリン可変カッパ３－１５遺伝子の略である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変３－１５；ＩＧＫＶ３１５；ＩＧＫＶ３－１５；ＩｇＶκ３－１５としても知られる。この遺伝子の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：５８１６；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９１３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４４４３７である。ＶＫ３－１５の好ましいアミノ酸配列は、配列番号５７として与えられる。これは、Ｖ領域の配列である。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと結合しうる。好ましい結合配列は、ＶＫ３－１５／ＪＫ１として示され；別名は、Ｖκ３－１５＊０１／ＩＧＪκ１＊０１である（ＩＭＧＴデータベース（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従った命名法）。この名称は典型的なものであり、遺伝子セグメントのアレルバリアントを包含する。
【0053】
ＶＫ３－２０は、免疫グロブリン可変カッパ３－２０遺伝子の略である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変３－２０；ＩＧＫＶ３２０；ＩＧＫＶ３－２０；ＩｇＶκ３－２０としても知られる。この遺伝子の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：５８１７；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９１２；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２３９９５１である。ＶＫ３－２０の好ましいアミノ酸配列は、配列番号５８として与えられる。これは、Ｖ領域の配列である。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと結合しうる。好ましい結合配列は、ＶＫ３－２０／ＪＫ１として示され；別名は、ＩｇＶκ３－２０＊０１／ＩＧＪκ１＊０１である（ＩＭＧＴデータベース（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従った命名法）。この名称は典型的なものであり、遺伝子セグメントのアレルバリアントを包含する。
【0054】
ＶＬ３－２１は、免疫グロブリン可変ラムダ３－２１遺伝子の略である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンラムダ可変３－２１；ＩＧＬＶ３２１；ＩＧＬＶ３－２１；ＩｇＶλ３－２１としても知られる。この遺伝子の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：５９０５；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８７９６；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２１１６６２．２である。ＶＬ３－２１の好ましいアミノ酸配列は、配列番号５９として与えられる。これは、Ｖ領域の配列である。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと結合しうる。好ましい結合配列は、ＶＬ３－２１／ＪＬ３として示され；別名は、ＩｇＶλ３－２１／ＩＧＪλ３である（ＩＭＧＴデータベース（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従った命名法）。この名称は典型的なものであり、遺伝子セグメントのアレルバリアントを包含する。
【0055】
さらに、当該技術分野において利用可能なＰＤ－１抗体の任意の軽鎖可変領域が、使用されうるか、または、本発明のＰＤ－１結合ドメインと対合したとき抗原結合活性を示すことによる、例えば抗体ディスプレイライブラリなどから容易に入手されうる任意の他の軽鎖可変領域が、使用されうる。
【0056】
ある実施形態において、本開示のＰＤ－１結合ドメインは、ＣＨ１およびＣＬ領域をさらに含みうる。任意のＣＨ１ドメイン、具体的にはヒトＣＨ１ドメインが、使用されうる。適切なＣＨ１ドメインの例は、配列番号１７として提供されるアミノ酸配列によって提供される。任意のＣＬドメイン、具体的にはヒトＣＬが、使用されうる。適切なＣＬドメインの例は、配列番号６０として提供されるアミノ酸配列によって提供される。
【0057】
本開示のＰＤ－１結合ドメインは、結合部位中の結合ドメインとして使用されうる。「結合部位」とは、タンパク質性分子を指し、例えば以下のような、当該技術分野において利用可能なすべての抗体フォーマットを含む：完全長ＩｇＧ抗体、免疫複合体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、ＢｉＴＥ、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体（ＶＨＨおよびＶＨなど）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ－ジッパー、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）、ＤＡＲＴ分子、ＴａｎｄＡｂ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）′２、Ｆ（ａｂ）′２－ｓｃＦｖ２、およびイントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）。
【0058】
一実施形態において、本開示の結合部位は、単一特異性結合部位であり、具体的には単一特異性抗体である。本開示に記載された単一特異性抗体は、単一の標的に対して特異性を有する、１または複数の結合ドメインを含む、任意の抗体フォーマットの抗体である。ある実施形態において、本開示の単一特異性結合部位は、Ｆｃ領域またはその一部をさらに含みうる。ある実施形態において、本開示の単一特異性結合部位は、ＩｇＧ１抗体である。
【0059】
一実施形態において、本開示の結合部位は、多重特異性結合部位であり、具体的には多重特異性抗体である。本開示に記載された多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる標的またはエピトープに対して特異性を有する、少なくとも２つの結合ドメインを含む、任意の抗体フォーマットの抗体である。ある実施形態において、本発明の多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。ある実施形態において、本開示の多重特異性抗体は、Ｆｃ領域またはその一部をさらに含みうる。ある実施形態において、本開示の多重特異性抗体は、ＩｇＧ１抗体である。
【0060】
本開示は、本明細書に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは結合部位の重鎖可変領域をコードする核酸配列を、さらに提供する。
【0061】
本明細書でさらに提供されるのは、本開示のＰＤ－１結合ドメインまたは結合部位を産生するために有用な、ベクターである。ある実施形態において、そのような発現ベクターは、本明細書に記載される抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、本開示のベクターは、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を、さらにコードしうる。ある実施形態において、本開示のベクターは、軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１のポリヌクレオチドをさらに含みうる。ある実施形態において、軽鎖可変領域は、本明細書に記載される一般的な軽鎖可変領域でありうる。
【0062】
本開示はまた、本明細書に記載される抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、細胞を提供する。ある実施形態において、本開示の細胞は、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列をさらに含みうる。ある実施形態において、本開示の細胞は、軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１の核酸配列をさらに含みうる。ある実施形態において、軽鎖可変領域は、本明細書に記載される一般的な軽鎖可変領域でありうる。
【0063】
本明細書でさらに提供されるのは、本明細書に記載される抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは結合部位を産生する細胞である。ある実施形態において、そのような細胞は、本開示のベクターで形質転換された、組換え細胞でありうる。
【0064】
本明細書でさらに提供されるのは、本開示の抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、または抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む結合部位を産生するための方法であり、前記方法は、本明細書に記載される細胞を培養するステップ、および抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、または抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む結合部位を、細胞または上澄みから回収するステップを含む。
【0065】
本明細書でさらに提供されるのは、本開示の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインのバリアントを産生するための方法であり、前記方法は、以下の各ステップを含む：
－本明細書に記載される重鎖可変領域の配列バリアントを、作製するステップ；
および
－本明細書に記載される配列バリアントおよび軽鎖可変領域を、細胞内で発現させるステップ。
－本明細書に記載される重鎖可変領域の配列バリアントを、作製するステップ；
および
－本明細書に記載される配列バリアントおよび軽鎖可変領域を、細胞内で発現させるステップ。
【0066】
配列バリアントを作製する方法は、当該技術分野でよく知られている。配列バリアントの作製にはランダムアプローチ、または標的アプローチを取ることができ、例えば、結合親和性を増減させると思われるバリエーションを導入することを目的としうる。抗体結合ドメインを親和性成熟させるための通常の方法は、当該技術分野で広く知られており、例えばTabasinezhad M. et al. Immunol Lett. 2019; 212: 106-113参照。また、結合ドメイン、またはそのような結合ドメインを含む部位を大規模に産生することを視野に入れ、発展性リスクを軽減するバリエーションを導入することも目的としうる。結合特異性の喪失を引き起こさず、および／または結合親和性に影響しないと思われるバリエーションが、導入されうる。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域内のアミノ酸残基が、例えば保存的アミノ酸残基で、結合特異性および／または親和性を失うことなく、または実質的に失うことなく置換されうるかどうかは、当該技術分野でよく知られた方法により決定されうる。実験例には、例えば以下を含むが、これらに限定されない：アラニンスキャニング（Cunningham BC, Wells JA. Science. 1989; 244(4908): 1081-5）および深層変異スキャニング（Araya CL, Fowler DM. Trends Biotechnol. 2011; 29(9): 435-42）。例えばSruthi CK, Prakash M. PLoS One. 2020; 15(1): e0227621、Choi Y. et al. PLoS One. 2012; 7(10): e46688、およびMunro D, Singh M. Bioinformatics. 2020; 36(22-23): 5322－9に記載されるような、アミノ酸バリエーションの効果を予測できる計算手法もまた、開発されている。
【0067】
本明細書でさらに提供されるのは、上記方法によって産生される任意のバリアント抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン；前記バリアント結合ドメインのいずれかを含む、抗体などの結合部位；前記バリアント抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは結合部位のいずれかを含む、医薬組成物；前記バリアント結合ドメインのいずれかをコードする核酸；前記核酸を含むベクターおよび細胞；および、癌の治療のための前記バリアント結合ドメインまたは医薬組成物の使用である。
【0068】
［医薬組成物および方法］
本開示の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは本開示の結合部位は、薬学的に許容される担体とともに医薬組成物中で使用されて、疾患を、好ましくは抑制された免疫系に関連する疾患を、具体的には癌を効果的に治療しうる。治療には、ＰＤ－１結合ドメイン、結合部位、または医薬組成物の有効量の、それを必要とする対象への投与を含む。
本開示の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは本開示の結合部位は、薬学的に許容される担体とともに医薬組成物中で使用されて、疾患を、好ましくは抑制された免疫系に関連する疾患を、具体的には癌を効果的に治療しうる。治療には、ＰＤ－１結合ドメイン、結合部位、または医薬組成物の有効量の、それを必要とする対象への投与を含む。
【0069】
ある実施形態において、本開示は、治療に使用するための、本明細書に記載される抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、結合部位、または医薬組成物を提供する。
【0070】
ある実施形態において、本開示は、抑制された免疫系に関連する疾患の、具体的には癌の治療における使用のための、本明細書に記載される抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、結合部位、または医薬組成物を提供する。
【0071】
ある実施形態において、本開示は、疾患を治療するための方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載される抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、結合部位、または医薬組成物の有効量を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む。
【0072】
ある実施形態において、本開示は、抑制された免疫系に関連する疾患を、具体的には癌を治療するための方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載される抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、結合部位、または医薬組成物の有効量を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む。
【0073】
本明細書で使用される「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」および「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」という用語は、互換的に使用され、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物（例えば、癌を有するヒト患者などの、患者）を指す。
【0074】
本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、疾患またはその症状を治癒または改善する目的で、対象に対して行われる任意のタイプの介入または過程、または、活性薬剤または活性薬剤の組合せを対象へ投与することを指す。これには、疾患に関連する症状、合併症、状態または生化学的兆候を逆転させ、緩和し、改善し、阻害しまたは減速させること、および、疾患に関連する症状、合併症、状態または生化学的兆候の、発症、進行、進展、重症化または再発を予防することを含む。
【0075】
本明細書で使用される「有効な治療（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「肯定的な治療反応（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」とは、有益な効果を、疾患または障害の、例えば癌の、例えば少なくとも１の症状の改善を、生み出す治療を指す。有益な効果は、ベースラインに対する改善の形をとることができ、本方法に従った治療の開始前に行われた測定または観察に対する改善を含む。例えば、有益な効果は、疾患の臨床的または診断的症状の、または癌のマーカーの、減少または消失によって証明されるように、任意の臨床段階において、対象における癌の進行を遅らせ、安定化し、停止し、または逆転させる形をとることができる。有効な治療は、例えば、腫瘍の大きさの減少、循環腫瘍細胞の存在の減少、腫瘍の転移の減少または予防、腫瘍増殖の遅延または阻止、および／または、腫瘍の再発または再燃の予防または遅延でありうる。
【0076】
「治療量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｍｏｕｎｔ）」または「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」という用語は、所望の生物学的、治療的、および／または予防的結果を与える、薬剤または薬剤の組合せの量を指す。その結果は、疾患の１または複数の徴候、症状、または原因の、減少、改善、緩和（ｐａｌｌｉａｔｉｏｎ）、軽減、遅延、および／または緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）、または、生物学的システムの任意の他の所望の変化でありうる。いくつかの実施形態において、治療量は、腫瘍の進展を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態において、治療量は、腫瘍の再発を予防または遅延させるのに十分な量である。
【0077】
薬剤または組成物の有効量は、以下のことをしうる：（ｉ）癌細胞の数を減少させる；（ｉｉ）腫瘍の大きさを減少させる；（ｉｉｉ）癌細胞の末梢器官への浸潤を阻害し、妨害し、ある程度遅らせ、および停止する；（ｉｖ）腫瘍転移を阻害する；（ｖ）腫瘍増殖を阻害する；（ｖｉ）腫瘍の発生および／または再発を予防または遅延させる；および／または（ｖｉｉ）癌に関連する１または複数の症状をある程度除去する。
【0078】
有効量は、治療される個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、および、個体における所望の反応を誘発する薬剤または薬剤の組合せの能力などの因子に従って、変化しうる。
【0079】
有効量は、１または複数回投与で、投与されうる。
【0080】
有効量はまた、薬剤または薬剤の組合せによる任意の毒性または有害な影響と、治療上有益な影響とのバランスをとる量をも含む。
【0081】
「薬剤（ａｇｅｎｔ）」という用語は、治療上の活性物質を指し、本開示の場合、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、本開示の結合部位、または本開示の医薬組成物を指す。
【0082】
［一般用語］
本明細書で使用される「含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその活用形は、その単語の後に続く項目が含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）が、特に言及されていない項目が除外されないことを意味する、非限定的な意味で使用される。
本明細書で使用される「含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその活用形は、その単語の後に続く項目が含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）が、特に言及されていない項目が除外されないことを意味する、非限定的な意味で使用される。
【0083】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１または複数を指すために、本明細書で使用される。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」とは、１または複数の要素を意味する。
【0084】
本明細書における特許文書または他の事項への言及は、その文書または事項が公知であったこと、またはそれが含む情報が請求項のいずれかの優先日における技術常識の一部であったことを認めるものとして、受け取られるべきではない。
【0085】
本明細書中で引用されるすべての特許および参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0086】
なお本明細書において、特に断りのない限り、抗体または抗体フラグメントの可変領域においてＣＤＲおよびフレームワークに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔのナンバリングに従って特定される（Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991）参照）。定常領域におけるアミノ酸は、ＥＵナンバリングシステムに従って示される。
【0087】
アクセッション番号は主に、標的を同定するさらなる方法を提供するために与えられ、結合するタンパク質の実際の配列は、例えばいくつかの癌などで起こるようなコード遺伝子における変異のために、変化しうる。抗原結合サイトは、いくつかの抗原陽性の免疫細胞または腫瘍細胞により発現されるものなど、抗原およびその様々なバリアントと結合する。
【0088】
本明細書で遺伝子、タンパク質に対して言及がなされる場合、その言及は、好ましくは遺伝子またはタンパク質のヒト型に対してなされる。本明細書で遺伝子またはタンパク質に対して言及がなされる場合、その言及は、天然の遺伝子またはタンパク質に対して、および腫瘍、癌などで検出されうるような、好ましくはヒト腫瘍、癌などで検出されうるような、遺伝子またはタンパク質のバリアント型に対してなされる。
【0089】
ＨＧＮＣとは、ＨＵＧＯ遺伝子命名法委員会（ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の略である。略語に続く番号は、アクセッション番号であり、その番号で遺伝子および遺伝子によりコードされるタンパク質に関する情報が、ＨＧＮＣデータベースから検索できる。Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅは、アクセッション番号または遺伝子ＩＤを提供し、その番号で遺伝子または遺伝子によりコードされるタンパク質に関する情報が、ＮＣＢＩ（アメリカ国立生物工学情報センター、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースから検索できる。Ｅｎｓｅｍｂｌｅは、アクセッション番号を提供し、その番号で遺伝子または遺伝子によりコードされるタンパク質に関する情報が、Ｅｎｓｅｍｂｌｅデータベースから入手できる。Ｅｎｓｅｍｂｌは、ＥＭＢＬ－ＥＢＩとＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの共同プロジェクトであり、選択された真核生物ゲノムについて、自動アノテーションを作成および維持するソフトウェアシステムを開発している。
【0090】
［図面の簡単な説明］
図中において、２価の単一特異性抗体は、配列番号Ａのフォーマットで示され、配列番号Ａは、両結合ドメインの重鎖可変配列を指す。単一特異性抗体の各結合ドメインは、軽鎖を含む。本開示を説明するために使用されるが、本開示を何ら限定することを意図するものではない実施例において、単一特異性抗体の各結合ドメインは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む。単一特異性抗体は、好ましくはＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む、ＩｇＧ１抗体である。本開示を説明するために使用されるが、本開示を何ら限定することを意図するものではない実施例において、単一特異性抗体は、ＩｇＧ１フォーマットでスクリーニングされ、ＰＤ－１結合重鎖は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ１、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ２、および配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ３を含む。
図中において、２価の単一特異性抗体は、配列番号Ａのフォーマットで示され、配列番号Ａは、両結合ドメインの重鎖可変配列を指す。単一特異性抗体の各結合ドメインは、軽鎖を含む。本開示を説明するために使用されるが、本開示を何ら限定することを意図するものではない実施例において、単一特異性抗体の各結合ドメインは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む。単一特異性抗体は、好ましくはＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む、ＩｇＧ１抗体である。本開示を説明するために使用されるが、本開示を何ら限定することを意図するものではない実施例において、単一特異性抗体は、ＩｇＧ１フォーマットでスクリーニングされ、ＰＤ－１結合重鎖は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ１、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ２、および配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ３を含む。
【0091】
２価の単一特異性ニボルマブアナログ抗体は、配列番号Ａ／配列番号Ｂのフォーマットで示され、配列番号Ａはそれぞれの重鎖配列を指し、配列番号Ｂはそれぞれの軽鎖配列を指す。この参照抗体アナログは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４フォーマットで使用され、各結合ドメインは軽鎖を含む。
【0092】
２価の二重特異性抗体は、配列番号Ａ×抗原Ａのフォーマットで示され、配列番号ＡはＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変配列を指し、抗原Ａは無関係の任意選択抗原の重鎖可変配列を指す。二重特異性抗体の各結合ドメインは、軽鎖を含む。二重特異性抗体は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む、ＩｇＧ１抗体である。
【0093】
以下の実施例は、本開示を説明するが、本開示を何ら限定することを意図するものではない。
【実施例】
【0094】
［実施例１ － 抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの作製］
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、例えばＷＯ２０１９／００９７２８に記載されるような、当該技術分野において知られる方法により入手されうる。一般的なＩＧＫＶ１－３９軽鎖を含むトランスジェニックマウス（ＭｅＭｏ（登録商標）マウス）をヒトＰＤ－１抗原部位で免疫化する（ＤＮＡ、タンパク質、および細胞ベースの抗原送達の様々な形の使用を含む）ことにより、重鎖可変領域の大きいパネルが得られた。配列番号９および配列番号１０の重鎖可変領域が、親和性成熟のために選択された。その結果、２０２の親和性成熟バリアントが得られ、そのうちのいくつかが、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイでのさらなる特性評価のために選択された。
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、例えばＷＯ２０１９／００９７２８に記載されるような、当該技術分野において知られる方法により入手されうる。一般的なＩＧＫＶ１－３９軽鎖を含むトランスジェニックマウス（ＭｅＭｏ（登録商標）マウス）をヒトＰＤ－１抗原部位で免疫化する（ＤＮＡ、タンパク質、および細胞ベースの抗原送達の様々な形の使用を含む）ことにより、重鎖可変領域の大きいパネルが得られた。配列番号９および配列番号１０の重鎖可変領域が、親和性成熟のために選択された。その結果、２０２の親和性成熟バリアントが得られ、そのうちのいくつかが、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイでのさらなる特性評価のために選択された。
【0095】
［実施例２ － ＰＤ－１ ＩｇＧの効力］
ＩｇＧフォーマットでの親和性成熟ＰＤ－１重鎖可変領域が、それらの親ＩｇＧと少なくとも同程度の効力があることを確認するために、親和性成熟バリアントが、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイでスクリーニングされた。またアッセイには、親抗ＰＤ－１ ＩｇＧ、陽性対照として、ニボルマブの重鎖可変領域（配列番号１１）と軽鎖可変領域（配列番号１４）とを含む抗ＰＤ－１抗体（Ｆｃ－ｓｉｌｅｎｃｅｄ ＩｇＧ１ニボルマブアナログ１）、およびニボルマブの重鎖可変領域（配列番号１２）と軽鎖可変領域（配列番号１４）とを含む抗ＰＤ－１抗体（ＩｇＧ４ニボルマブアナログ２）、および、陰性対照として、配列番号１５を有する重鎖可変領域と配列番号１６を有する軽鎖可変領域とを含む抗ＲＳＶ－Ｇ抗体も含まれた。このカラムの最後の２ウェルは、ベースレベル対照としてＩｇＧ無しで残された。
ＩｇＧフォーマットでの親和性成熟ＰＤ－１重鎖可変領域が、それらの親ＩｇＧと少なくとも同程度の効力があることを確認するために、親和性成熟バリアントが、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイでスクリーニングされた。またアッセイには、親抗ＰＤ－１ ＩｇＧ、陽性対照として、ニボルマブの重鎖可変領域（配列番号１１）と軽鎖可変領域（配列番号１４）とを含む抗ＰＤ－１抗体（Ｆｃ－ｓｉｌｅｎｃｅｄ ＩｇＧ１ニボルマブアナログ１）、およびニボルマブの重鎖可変領域（配列番号１２）と軽鎖可変領域（配列番号１４）とを含む抗ＰＤ－１抗体（ＩｇＧ４ニボルマブアナログ２）、および、陰性対照として、配列番号１５を有する重鎖可変領域と配列番号１６を有する軽鎖可変領域とを含む抗ＲＳＶ－Ｇ抗体も含まれた。このカラムの最後の２ウェルは、ベースレベル対照としてＩｇＧ無しで残された。
【0096】
ＰＤ－１―ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイは、製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１２５５）に従って行われ、以下の２つの細胞株を使用する：ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ヒトＰＤ－Ｌ１と、抗原非依存的にコグネートＴＣＲを活性化するように設計された改変細胞表面タンパク質とを発現する、ＣＨＯ－Ｋ１細胞である）（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１０９Ａ）；および、ＰＤ－１エフェクター細胞：Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ヒトＰＤ－１と、ＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーターとを発現する）（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１１５Ａ）。
【0097】
１日目に、ＰＤ－Ｌ１細胞のための細胞回収培地が、室温で調製された：１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ２４４２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２１７６５）中。必要な数のＰＤ－Ｌ１細胞バイアル（Ｊ１０９Ａ；試験される３２のＩｇＧにつき１バイアル）が冷凍庫から取り出され、３７℃で急速解凍され、細胞が５０ｍｌチューブに移された。細胞回収培地は、１４．５ｍｌ／バイアル、体積が毎分２倍になるように、ゆっくりと細胞に加えられた。ハーフエリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３６８８）のウェルは、この細胞懸濁液で５０μｌ／ウェル、または５０μｌ ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１００１０）で満たされた。アッセイプレートは、３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度９５％で、一晩インキュベートされた。
【0098】
２日目に、２倍濃縮アッセイバッファが、室温で調製された：４％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ２４４２）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｐｒｏｍｅｇａ ｋｉｔまたはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２１８７５）中。２倍濃縮の試験および対照ＩｇＧ溶液が、ＰＢＳ中に調製された。試験および対照ＩｇＧの連続希釈がまた、Ｕ底プレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号２６８１５２）中のＰＢＳ中で行われ、１０μｇ／ｍｌから始めて、６段階４倍滴定を行った。陽性および陰性対照ＩｇＧ連続希釈液は、別々のディープウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、カタログ番号７８０２７０）上のＰＢＳ中に、調製された。ＩｇＧ無しの対照であるベース対照もまた、調製された。活性が直接比較される必要のあるＩｇＧは、プレート間の変動を避けるため、できるだけ同じプレート上でインキュベートされた。
【0099】
アッセイプレートは、インキュベータから取り出され、空のウェルに移された。２０μｌのＩｇＧ溶液が、アッセイプレートに加えられ、同じピペットチップを用いて、最低濃度のＩｇＧから移し始めて、順に高濃度になるようにした。
【0100】
必要な数のＰＤ－１エフェクター細胞（Ｊ１１５Ａ；試験される３２のＩｇＧにつき１バイアル）が冷凍庫から取り出され、３７℃で急速解凍され、上下にピペッティングすることにより静かに混合された。すべてのバイアルからの細胞が、５０ｍｌチューブに移された。２倍濃縮アッセイバッファ（細胞１バイアルあたり５．９ｍｌ）が、体積が毎分２倍になるように、ゆっくりと細胞に加えられた。２０μｌのエフェクター細胞懸濁液が、アッセイプレート上のウェルに加えられた。プレートは、３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度９５％で、６時間インキュベートされた。６時間のインキュベートに続き、プレートは室温で１０分間プレインキュベートされた。
【0101】
ルシフェラーゼ活性は、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標） ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７９４１）を使用して、測定された。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（遮光）は、一晩室温に平衡化され、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅと十分に混合された。４０μｌのＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼが、アッセイプレート上の各ウェルに加えられ、５～１０分後にＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｍｏｄｅｌ ２１０４－００４０Ａ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｍｏｄｅ）上で、発光が測定された。読み出しは、相対光単位（ＲＬＵ）値で得られた。対照活性に対する実験活性の比であるＦｏｌｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎが、ＩｇＧ－ＸのＲＬＵ値／ＩｇＧ無しのＲＬＵ値として、計算された。Ｆｏｌｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎは、対数ＩｇＧ濃度に対してプロットされ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、非線形回帰およびｌｏｇ（阻害剤）ｖｓ．応答（３パラメータ）式を使用して、シグモイド曲線がフィッティングされた。
【0102】
結果は図１に示される。すべての対照は、期待された活性を示し、異なるプレートにおいても一貫していた。親和性成熟バリアントは、それらの親ＩｇＧと少なくとも同程度の効力があり、ニボルマブアナログ１以上の効力があった。親和性成熟バリアントおよび親抗体のＥＣ５０値は、表１に示される。
【0103】
【0104】
［実施例３ － 結合特性］
選択された親和性成熟ＰＤ－１結合ドメインの結合親和性は、ＳＰＲを使用して決定された。ヒトＰＤ－１に対する結合親和性は、２価の単一特異性ＩｇＧフォーマットで決定され、参照抗体ニボルマブの２価の単一特異性アナログの結合親和性、および、参照抗体ニボルマブの配列を有する結合ドメインおよび無関係な標的と結合する結合ドメインを含む２価の二重特異性抗体の結合親和性と、比較された。
選択された親和性成熟ＰＤ－１結合ドメインの結合親和性は、ＳＰＲを使用して決定された。ヒトＰＤ－１に対する結合親和性は、２価の単一特異性ＩｇＧフォーマットで決定され、参照抗体ニボルマブの２価の単一特異性アナログの結合親和性、および、参照抗体ニボルマブの配列を有する結合ドメインおよび無関係な標的と結合する結合ドメインを含む２価の二重特異性抗体の結合親和性と、比較された。
【0105】
ＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、２５℃で行われた。ＳＰＲランニングバッファ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ７．４）は、１０倍ＨＢＳ－ＥＰ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から調製された。抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、ＳシリーズセンサーチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の全１６のフローセル上に、アミンカップリングを介して固定化された。固定化レベルは、すべてのフローセルで～９０００ＲＵである。抗ＰＤ－１抗体の所望の捕捉レベル（１００～１５０ＲＵ）は、適切な濃度の抗ＰＤ－１抗体を、各チャンネルのアクティブフローセルを通して１０μＬ／分の流速で６０秒間流すことにより、達成された。次に、ＰＤ－１ストック（Ｒ＆Ｄ ８９８６－ＰＤ）から調製されたＰＤ－１の３倍連続希釈濃度シリーズ（合計７濃度、最高３００ｎＭ）およびランニングバッファ（０濃度）は、２４０秒間（結合時間）注入され、すぐに４８０秒間（解離時間）４５μＬ／分の流速でランニングバッファが続いた。３０μＬ／分の流速で３Ｍ ＭｇＣｌ２を３０秒間注入し、表面が再生された。結合キネティクスおよび親和性パラメータは、１対１結合モデルへのデータのグローバルフィッティングから得られた。
【0106】
データは図２に示される。本開示のＰＤ－１結合ドメインを含むＩｇＧは、参照抗体のアナログよりも少なくとも１０倍高い結合親和性（ＫＤ）を有する。
【0107】
結合親和性はまた、ＢＩＡｃｏｒｅ－Ｔ２００装置上でＳＰＲを使用して、ＣＭ５シリーズＳセンサーチップ上に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して、二重特異性ＩｇＧフォーマットで決定された。また２つのヒトタンパク質が、二重特異性抗体によって同時にエンゲージされうるかどうかも評価された。配列番号７を有する重鎖可変領域を含むＰＤ－１結合ドメイン、または配列番号８を有する重鎖可変領域を含むＰＤ－１結合ドメインを含む二重特異性抗体の、ヒトＰＤ－１およびカニクイザルＰＤ－１に対する結合親和性が、決定された。使用された抗体フォーマットは、ＰＤ－１×抗原Ａであり、抗原Ａは、ＰＤ－１と反応せずアッセイで試験されたＰＤ－１結合に影響を与えない、任意選択抗原である。二重特異性抗体の各結合ドメインは、重鎖および軽鎖を含む。二重特異性抗体の結合親和性は、２つの抗ＰＤ－１結合ドメインを含む参照抗体ニボルマブのアナログの結合親和性と、比較された。
【0108】
使用された参照抗体は：ニボルマブアナログ（配列番号１３／配列番号１４）および抗原Ａに対する参照抗体であった。無関係な標的に対する抗体が、結合の陰性対照として使用された。試験抗体は、配列番号７×抗原Ａおよび配列番号８×抗原Ａであった。
【0109】
使用された単量体組換え抗原は、以下の通りであった：ヒト抗原Ａ、カニクイザル抗原Ａ、ヒトＰＤ－１（ｈｕＰＤ－１－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０３７７－Ｈ０８Ｈ）およびカニクイザルＰＤ－１（ｃｙＰＤ－１－Ｈｉｓ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８５０９－ＰＤ）。
【0110】
［固定化：］
ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；カタログ番号ＢＲ－１００５－３０）の４つのフローチャンネル上への、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＪＩＲ、カタログ番号１０９－００５－０９８）の固定化は、１０ｍＭ酢酸ｐＨ５．０に希釈された４０μｇ／ｍｌの抗体を使用して、アミンカップリングにより行われた。以下の条件が使用された：活性化時間４２０秒、不活性化時間４２０秒、不活性化バッファ：１ＭエタノールアミンｐＨ８．５。９１５８～９４２８ＲＵの範囲である、高い固定化密度が達成された。
ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；カタログ番号ＢＲ－１００５－３０）の４つのフローチャンネル上への、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＪＩＲ、カタログ番号１０９－００５－０９８）の固定化は、１０ｍＭ酢酸ｐＨ５．０に希釈された４０μｇ／ｍｌの抗体を使用して、アミンカップリングにより行われた。以下の条件が使用された：活性化時間４２０秒、不活性化時間４２０秒、不活性化バッファ：１ＭエタノールアミンｐＨ８．５。９１５８～９４２８ＲＵの範囲である、高い固定化密度が達成された。
【0111】
［親和性決定：］
親和性決定のために、試験および対照抗体は、ＣＭ５センサーチップ上に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体により、３０μｌ／分の流速で６０秒間、１つのフローセルのみで捕捉された。捕捉抗体濃度は、ＰＤ－１親和性決定には２０ｎＭ、抗原Ａ親和性決定には１０ｎＭであった。この後、流速３０μｌ／分のバッファで、６０秒の安定化時間が続いた。抗原の５段階２倍連続希釈液が、捕捉抗体を含むフローセルと参照フローセル（捕捉抗体無し）との両方に、３０μｌ／分で６０秒間注入された。抗原濃度は、ヒトＰＤ－１およびカニクイザルＰＤ－１には８０ｎＭ～２．５ｎＭ、ヒト抗原Ａおよびカニクイザル抗原Ａには４０～１．２５ｎＭであった。バッファ効果に対するバックグラウンド補正は、バッファのみの注入により行われ、バックグラウンド除去のために、参照フローセルが使用された。
親和性決定のために、試験および対照抗体は、ＣＭ５センサーチップ上に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体により、３０μｌ／分の流速で６０秒間、１つのフローセルのみで捕捉された。捕捉抗体濃度は、ＰＤ－１親和性決定には２０ｎＭ、抗原Ａ親和性決定には１０ｎＭであった。この後、流速３０μｌ／分のバッファで、６０秒の安定化時間が続いた。抗原の５段階２倍連続希釈液が、捕捉抗体を含むフローセルと参照フローセル（捕捉抗体無し）との両方に、３０μｌ／分で６０秒間注入された。抗原濃度は、ヒトＰＤ－１およびカニクイザルＰＤ－１には８０ｎＭ～２．５ｎＭ、ヒト抗原Ａおよびカニクイザル抗原Ａには４０～１．２５ｎＭであった。バッファ効果に対するバックグラウンド補正は、バッファのみの注入により行われ、バックグラウンド除去のために、参照フローセルが使用された。
【0112】
抗体－抗原相互作用に続き、３０μｌ／分で３００秒のオフレート洗浄が行われた。サイクル間の再生は、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の注入を、３０μｌ／分で１５μｌずつ２回使用して行われ、その後９０μｌ／分で９０秒の安定化ステップが続いた。全再生およびアッセイの一貫性を確認するために、アッセイの終了時に、試験されたすべての抗原について、試験されたすべての抗原濃度で、参照抗体の繰り返し実行が行われた。
【0113】
ＰＤ－１親和性決定には、ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファが使用され、一方抗原Ａには、非特異性結合を避けるために、ＨＢＳ－ＥＰ＋は、最終濃度５００ｍＭ ＮａＣｌまでＮａＣｌが加えられた。
【0114】
結果は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅで分析された。未処理のＲＵシグナルは、ブランク減算され（捕捉抗体無しのチャンネルで）、バッファ効果に対してバックグラウンド補正された（２回目の注入で抗原の代わりにバッファを使用し、捕捉抗体による実行を減算した）。１：１結合ラングミュアフィッティングが、試料曲線の組に適用され、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅの同時フィッティングオプションを使用して、結合率（ｋａ）、解離率（ｋｄ）、および親和性（ＫＤ）を計算した。
【0115】
捕捉された二重特異性および参照抗体は、それぞれの組換え抗原への結合を示した。陰性対照抗体への抗原の結合は、観察されなかった。
【0116】
データの概要は図３に示される。ヒトＰＤ－１では、２つの二重特異性抗体は同様の親和性を有し、両方とも参照抗体ニボルマブアナログに対して１０倍を超えるＫＤの改善を示したが、解離が遅いことが主因であった。ｃｙＰＤ－１－Ｈｉｓでは、配列番号７×抗原Ａは、ニボルマブアナログに対して約１０倍の改善を示したが、解離が遅いことが主因であった。
【0117】
［同時結合：］
二重特異性抗体のヒト抗原ＡおよびヒトＰＤ－１への同時結合は、親和性決定と同様のセットアップでアッセイされた。固定化された抗ヒトＩｇＧは、二重特異性抗体を捕捉するために使用された。陽性対照としてニボルマブアナログおよび抗原Ａ参照抗体の混合物が含まれ、陰性対照として無関係な標的に対する抗体が含まれた。次に、抗原の１つが飽和濃度（ヒトＰＤ－１には８０ｎＭ、ヒト抗原Ａには４０ｎＭ）で３００秒間注入され、すべての抗原結合サイトを占有させた。第２の抗原は、注入１で使用されたのと同じ濃度で、（すべての結合サイトが占有されたままであることを確認するために）単独または第１の抗原と併用して、順次注入された。ヒト抗原Ａ非特異性結合を防ぐために、全工程で高塩バッファが使用された。
二重特異性抗体のヒト抗原ＡおよびヒトＰＤ－１への同時結合は、親和性決定と同様のセットアップでアッセイされた。固定化された抗ヒトＩｇＧは、二重特異性抗体を捕捉するために使用された。陽性対照としてニボルマブアナログおよび抗原Ａ参照抗体の混合物が含まれ、陰性対照として無関係な標的に対する抗体が含まれた。次に、抗原の１つが飽和濃度（ヒトＰＤ－１には８０ｎＭ、ヒト抗原Ａには４０ｎＭ）で３００秒間注入され、すべての抗原結合サイトを占有させた。第２の抗原は、注入１で使用されたのと同じ濃度で、（すべての結合サイトが占有されたままであることを確認するために）単独または第１の抗原と併用して、順次注入された。ヒト抗原Ａ非特異性結合を防ぐために、全工程で高塩バッファが使用された。
【0118】
［配列表］
配列番号１－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＮＧＳＬＧＦＤＦＷＳＷＩＲＱＰＰＧＲＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＷＳＬＮＰＳＦＫＧＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＮＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＮＧＳＬＧＦＤＦＷＳＷＩＲＱＰＰＧＲＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＷＳＬＮＰＳＦＫＧＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＮＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0119】
配列番号２－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＮＧＳＬＧＦＥＦＷＳＷＩＲＱＰＰＧＲＧＬＥＷＩＧＹＩＶＹＳＧＳＨＳＶＳＰＳＬＫＴＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＮＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＴＧＨＧＧＤＷＦＤＴＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＮＧＳＬＧＦＥＦＷＳＷＩＲＱＰＰＧＲＧＬＥＷＩＧＹＩＶＹＳＧＳＨＳＶＳＰＳＬＫＴＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＮＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＴＧＨＧＧＤＷＦＤＴＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0120】
配列番号３－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＦＡＬＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＹＡＱＤＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＴＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＬＧＹＣＧＳＤＩＣＹＰＮＧＩＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＦＡＬＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＹＡＱＤＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＴＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＬＧＹＣＧＳＤＩＣＹＰＮＧＩＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0121】
配列番号４－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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【0122】
配列番号５－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＦＡＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＦＡＱＧＶＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＴＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＬＧＹＣＤＳＤＩＣＹＰＮＷＩＦＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
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【0123】
配列番号６－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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【0124】
配列番号７－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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【0125】
配列番号８－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＦＡＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＦＡＱＧＶＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＴＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＬＧＹＣＤＳＤＩＣＹＰＮＷＩＦＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
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【0126】
配列番号９－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＮＧＳＬＧＦＹＦＷＳＷＩＲＱＰＰＧＲＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＳＦＮＰＳＬＫＳＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＮＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
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【0127】
配列番号１０－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＦＴＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＴＧＮＰＴＹＡＱＤＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＴＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩＬＧＹＣＮＴＤＮＣＹＰＮＷＩＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
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【0128】
配列番号１１－重鎖ニボルマブアナログ１
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【0129】
配列番号１２－重鎖ニボルマブアナログ２
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【0130】
配列番号１３－重鎖ニボルマブアナログ４
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＤＣＫＡＳＧＩＴＦＳＮＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＫＲＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＮＤＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
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【0131】
配列番号１４－軽鎖ニボルマブ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＳＮＷＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
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【0132】
配列番号１５－重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＴＫＹＳＡＤＳＬＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＫＥＧＷＳＦＤＳＳＧＹＲＳＷＦＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴ
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【0133】
配列番号１６－軽鎖可変領域－ＣＤＲはＩＭＧＴに従って太字および下線で示される
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
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【0134】
配列番号１７－ＣＨ１ ＷＴ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶ
【0135】
配列番号１８－ＣＨ２
ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ
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【0136】
配列番号１９－ＣＨ３
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0137】
配列番号２０－ニボルマブアナログ重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＤＣＫＡＳＧＩＴＦＳＮＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＫＲＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＮＤＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
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【0138】
配列番号２１－ニボルマブアナログ軽鎖可変領域
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＳＮＷＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
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【0139】
配列番号２２－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＦＹＦＷＳ
ＦＹＦＷＳ
【0140】
配列番号２３－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＹＩＹＹＳＧＳＴＳＦＮＰＳＬＫＳ
ＹＩＹＹＳＧＳＴＳＦＮＰＳＬＫＳ
【0141】
配列番号２４－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ
【0142】
配列番号２５－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＦＤＦＷＳ
ＦＤＦＷＳ
【0143】
配列番号２６－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＹＩＹＹＳＧＳＷＳＬＮＰＳＦＫＧ
ＹＩＹＹＳＧＳＷＳＬＮＰＳＦＫＧ
【0144】
配列番号２７－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ
【0145】
配列番号２８－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＦＥＦＷＳ
ＦＥＦＷＳ
【0146】
配列番号２９－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＹＩＶＹＳＧＳＨＳＶＳＰＳＬＫＴ
ＹＩＶＹＳＧＳＨＳＶＳＰＳＬＫＴ
【0147】
配列番号３０－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＧＧＹＴＧＨＧＧＤＷＦＤＴ
ＧＧＹＴＧＨＧＧＤＷＦＤＴ
【0148】
配列番号３１－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＲＦＡＬＳ
ＲＦＡＬＳ
【0149】
配列番号３２－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＹＡＱＤＦＴＧ
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＹＡＱＤＦＴＧ
【0150】
配列番号３３－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＳＬＧＹＣＧＳＤＩＣＹＰＮＧＩＬＤＮ
ＳＬＧＹＣＧＳＤＩＣＹＰＮＧＩＬＤＮ
【0151】
配列番号３４－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＲＦＡＶＮ
ＲＦＡＶＮ
【0152】
配列番号３５－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＹＡＱＧＶＴＮ
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＹＡＱＧＶＴＮ
【0153】
配列番号３６－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＳＬＧＹＣＳＳＤＩＣＹＰＮＬＩＦＤＮ
ＳＬＧＹＣＳＳＤＩＣＹＰＮＬＩＦＤＮ
【0154】
配列番号３７－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＲＦＡＬＨ
ＲＦＡＬＨ
【0155】
配列番号３８－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＦＡＱＧＶＴＧ
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＦＡＱＧＶＴＧ
【0156】
配列番号３９－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＳＬＧＹＣＤＳＤＩＣＹＰＮＷＩＦＤＮ
ＳＬＧＹＣＤＳＤＩＣＹＰＮＷＩＦＤＮ
【0157】
配列番号４０－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＹＨＦＷＳ
ＹＨＦＷＳ
【0158】
配列番号４１－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＹＩＶＹＳＧＳＹＮＶＮＰＳＬＫＴ
ＹＩＶＹＳＧＳＹＮＶＮＰＳＬＫＴ
【0159】
配列番号４２－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ
【0160】
配列番号４３－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＹＨＦＷＳ
ＹＨＦＷＳ
【0161】
配列番号４４－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＹＩＶＹＳＧＳＹＮＶＮＰＳＬＫＴ
ＹＩＶＹＳＧＳＹＮＶＮＰＳＬＫＴ
【0162】
配列番号４５－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ
【0163】
配列番号４６－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＲＦＡＬＨ
ＲＦＡＬＨ
【0164】
配列番号４７－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＦＡＱＧＶＴＧ
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＦＡＱＧＶＴＧ
【0165】
配列番号４８－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＳＬＧＹＣＤＳＤＩＣＹＰＮＷＩＦＤＮ
ＳＬＧＹＣＤＳＤＩＣＹＰＮＷＩＦＤＮ
【0166】
配列番号４９－ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲ１
ＱＳＩＳＳＹ
ＱＳＩＳＳＹ
【0167】
配列番号５０－ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲ２
ＡＡＳ
ＡＡＳ
【0168】
配列番号５１－ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲ３
ＱＱＳＹＳＴＰＰＴ
ＱＱＳＹＳＴＰＰＴ
【0169】
配列番号５２－軽鎖可変領域－ＣＤＲはＩＭＧＴに従って太字および下線で示される
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ
【0170】
配列番号５３－軽鎖可変領域－ＣＤＲはＩＭＧＴに従って太字および下線で示される
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＮＷＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＮＷＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【0171】
配列番号５４－軽鎖可変領域－ＣＤＲはＩＭＧＴに従って太字および下線で示される
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【0172】
配列番号５５－軽鎖可変領域－ＣＤＲはＩＭＧＴに従って太字および下線で示される
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＴＣＧＧＤＮＩＧＲＫＳＶＹＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＧＳＳＤＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＴＣＧＧＤＮＩＧＲＫＳＶＹＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＧＳＳＤＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【0173】
配列番号５６－Ｖ領域
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰ
【0174】
配列番号５７－Ｖ領域
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＮＷＰ
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＮＷＰ
【0175】
配列番号５８－Ｖ領域
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰ
【0176】
配列番号５９－Ｖ領域
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＴＣＧＧＤＮＩＧＲＫＳＶＹＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＧＳＳＤＨ
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＴＣＧＧＤＮＩＧＲＫＳＶＹＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＧＳＳＤＨ
【0177】
配列番号６０－軽鎖定数領域
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-11-02
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖可変領域を含む抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記重鎖可変領域は、
配列番号１～９からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、
配列番号１～９からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、
および
配列番号１～９からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）
を含む
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項2】
請求項１に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記重鎖可変領域は、以下を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｅ）それぞれ、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｆ）それぞれ、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｇ）それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｈ）それぞれ、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｉ）それぞれ、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい；
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項3】
請求項１または２に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号１～９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、
または
これらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、
重鎖可変領域を含む
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項4】
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含み、
具体的には前記結合親和性は、表面プラズモン共鳴により測定される、
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項5】
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、２価抗体中に１価で存在する場合、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を与え、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含み、
具体的にはＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する前記効力は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイで測定される、
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項6】
請求項４または５に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、少なくとも重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
および
前記軽鎖可変領域は、好ましくは、異なるエピトープ特異性を有する複数の重鎖と対合可能である軽鎖の、軽鎖可変領域である
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項7】
請求項４～６のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対して少なくとも１０倍高い結合親和性を有する、
または
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対して１０倍高い結合親和性を有する、
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項8】
請求項４～７のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、ヒトＰＤ－１に対して、約０．１～１．０ｎＭの範囲の、具体的には約０．３～０．８ｎＭの範囲の、より具体的には約０．３８～０．７８ｎＭの範囲の結合親和性を有する
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項9】
請求項４および６～８のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記結合親和性は、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインおよび前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの両方を用いて、２価の単一特異性ＩｇＧフォーマットで測定される、
または
前記結合親和性は、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを用いて、２価の二重特異性ＩｇＧフォーマットで
および
前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを用いて、２価の単一特異性ＩｇＧフォーマットで
測定される、
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項10】
請求項５～９に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、ここでＰＤ－１活性へのリガンド結合を阻害する同等の効力とは、前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力の５倍の範囲内の効力であり、前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する前記効力から５、４、３、および２倍の偏差を含む
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項11】
請求項４～１０のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記重鎖可変領域は、以下を含み：
ａ）それぞれ、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｅ）それぞれ、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｆ）それぞれ、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｇ）それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｈ）それぞれ、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｉ）それぞれ、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい；
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項12】
請求項４～１１のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号１～９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、
または
これらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、
重鎖可変領域を含む
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインであって、ＣＨ１およびＣＬ領域をさらに含む
抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載された抗ＰＤ－１結合ドメインを含む結合部位であって、具体的には前記結合部位が、単一特異性結合部位、好ましくは２価の単一特異性抗体である
結合部位。
【請求項15】
請求項１～１３のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの、または請求項１４に記載された結合部位の有効量と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項16】
治療に使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、請求項１４に記載された結合部位、または請求項１５に記載された医薬組成物。
【請求項17】
抑制された免疫系に関連する疾患の治療に使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、請求項１４に記載された結合部位、または請求項１５に記載された医薬組成物。
【請求項18】
癌の治療に使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、請求項１４に記載された結合部位、または請求項１５に記載された医薬組成物。
【請求項19】
請求項１～１３のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの前記重鎖可変領域をコードする、核酸配列。
【請求項20】
請求項１９に記載された核酸配列を含む、ベクター。
【請求項21】
請求項２０に記載されたベクターであって、前記ベクターは、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列をさらに含み、
具体的には前記ベクターは、軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１の核酸配列をさらに含む、
ベクター。
【請求項22】
請求項２１に記載されたベクターであって、前記軽鎖可変領域は、異なるエピトープ特異性を有する複数の重鎖と対合可能である軽鎖の、軽鎖可変領域である
ベクター。
【請求項23】
請求項１～１３のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの前記重鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、細胞。
【請求項24】
請求項２３に記載された細胞であって、前記細胞は、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列をさらに含み、
具体的には前記細胞は、軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１の核酸配列をさらに含む、
細胞。
【請求項25】
請求項１～１３のいずれか一項に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、または請求項１４に記載された結合部位を産生する細胞であって、具体的には前記細胞は、組換え細胞であり、請求項２０～２２のいずれか一項に記載されたベクターで形質転換された、
細胞。
【国際調査報告】