(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-14
(54)【発明の名称】合成プロモーターを使用する多重遺伝子発現の制御
(51)【国際特許分類】
C12N 15/85 20060101AFI20240307BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20240307BHJP
C12N 15/83 20060101ALI20240307BHJP
C12N 15/70 20060101ALI20240307BHJP
C12N 15/74 20060101ALI20240307BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240307BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240307BHJP
C12N 15/82 20060101ALN20240307BHJP
【ＦＩ】
C12N15/85 Z ZNA
C12N15/86 Z
C12N15/83 Z
C12N15/70 Z
C12N15/74 Z
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/82 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023556871
(86)(22)【出願日】2022-03-15
(85)【翻訳文提出日】2023-11-13
(86)【国際出願番号】 IB2022052323
(87)【国際公開番号】W WO2022195475
(87)【国際公開日】2022-09-22
(31)【優先権主張番号】63/200,577
(32)【優先日】2021-03-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】391008951
【氏名又は名称】アストラゼネカ・アクチエボラーグ
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】パテル，ヤシュ ダナンジャイ
(72)【発明者】
【氏名】ギブソン，スザンヌ ジェーン
(72)【発明者】
【氏名】ハットン，ダイアン
(72)【発明者】
【氏名】ジュー，ジエ
(72)【発明者】
【氏名】ジェイムズ，デイビッド シー
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
(57)【要約】
本発明は、予測可能な相対化学量論で多重遺伝子の発現を媒介し得る哺乳動物の合成プロモーターを含む発現ベクターに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
目的のヌクレオチド配列をコードする核酸配列に作動可能に連結された合成プロモーターを含む、転写単位を含む多重遺伝子発現ベクター。
【請求項2】
目的の第２のヌクレオチド配列をコードする核酸配列に作動可能に連結された第２の合成プロモーターを含む第２の転写単位をさらに含む、請求項１に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項3】
目的の第３のヌクレオチド配列をコードする核酸配列に作動可能に連結された第３の合成プロモーターを含む第３の転写単位をさらに含む、請求項１又は２に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項4】
前記第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、及び第３の合成プロモーターは、低い、中程度の、又は高い転写活性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項5】
前記第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、又は第３の合成プロモーターの前記転写活性は、単一遺伝子ベクターからの共発現からの転写活性と比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％抑制されている、請求項４に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項6】
前記合成プロモーターのうちの２つは、同一レベルの転写活性を有する、請求項４に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項7】
前記第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、及び第３の合成プロモーターは、異なるレベルの転写活性を有する、請求項４に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項8】
前記第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、及び第３の合成プロモーターは、同一レベルの転写活性を有する、請求項４に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項9】
前記転写活性は、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定されている、請求項４に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項10】
前記第１の合成プロモーター、前記第２の合成プロモーター、及び前記第３の合成プロモーターは、１つ又は複数の転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項11】
前記数のＴＦＲＥは、前記転写活性を制御する、請求項９に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項12】
前記低強度の合成プロモーターは、１～３個のＴＦＲＥを含む、請求項１０に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項13】
前記中強度の合成プロモーターは、４～７個のＴＦＲＥを含む、請求項１０に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項14】
前記高強度の合成プロモーターは、７～１１個のＴＦＲＥを含む、請求項１０に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項15】
前記第１の合成プロモーターは、３個のＴＦＲＥを含み、前記第２の合成プロモーターは、７個のＴＦＲＥを含み、且つ前記第３の合成プロモーターは、１１個のＴＦＲＥを含む、請求項１０に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項16】
前記ＴＦＲＥは、ＥＴＳ結合部位（ＥＢＳ）、ＣＣＡＡＴ－エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）、抗酸化調節エレメント（ＡＲＥ）、ジオキシン調節エレメント（ＤＲＥ）、ＧＣ－ボックス、及び核因子カッパＢ（ＮＦｋＢ）からなる群から選択される、請求項９に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項17】
前記低強度の合成プロモーターは、２つのＥＢＳ及び１つのＣ／ＥＢＰ ＴＦＲＥを含む核酸配列を含む、請求項１５に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項18】
前記中強度の合成プロモーターは、１つのＧＣ－ボックス、１つのＣ／ＥＢＰ、２つのＡＲＥ、１つのＤＲＥ、１つのＥＢＳ、及び１つのＮＦｋＢ ＴＦＲＥを含む核酸配列を含む、請求項１５に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項19】
前記高強度の合成プロモーターは、２つのＧＣ－ボックス、３つのＡＲＥ、３つのＮＦｋＢ、２つのＤＲＥ、及び１つのＥＢＳ ＴＦＲＥを含む核酸配列を含む、請求項１５に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項20】
前記発現ベクターは、前記第１の転写単位、前記第２の転写単位、及び前記第３の転写単位を、任意の配向で含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項21】
前記目的の第１のヌクレオチド配列、目的の第２のヌクレオチド配列、及び目的の第３のヌクレオチド配列は、異なる、請求項１～３のいずれか一項に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項22】
前記第１の転写単位、第２の転写単位、及び第３の転写単位は、核酸リンカーにより連結されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項23】
前記核酸リンカーは、配列番号３０～４６からなる群から選択される、請求項２１に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項24】
前記発現ベクターは、哺乳動物、細菌、又はウイルスの発現ベクターである、請求項１に記載の多重遺伝子発現ベクター。
【請求項25】
請求項１～２４のいずれか一項に記載の多重遺伝子発現ベクターを含む細胞。
【請求項26】
前記細胞は、哺乳動物、細菌、又は植物の細胞である、請求項２４に記載の細胞。
【請求項27】
細胞中での目的の多重遺伝子の発現を調節する方法であって、前記細胞に、請求項１に記載の発現ベクターを導入すること、及び目的のヌクレオチド配列の発現を促進する条件下で、前記細胞をインキュベートすることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２００，５７７号の米国特許法第１１９条（ｅ）下の優先権の利益を主張するものである。
本出願は、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２００，５７７号の米国特許法第１１９条（ｅ）下の優先権の利益を主張するものである。
【0002】
電子的に提出された配列表に対する参照
本願と共に提出されるＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：ＳＹＮＰＲＯ－１０１－Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：１０，８４０バイト；及び作成日：２０２２年３月１１日）中の電子的に提出された配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本願と共に提出されるＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：ＳＹＮＰＲＯ－１０１－Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：１０，８４０バイト；及び作成日：２０２２年３月１１日）中の電子的に提出された配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
哺乳動物細胞は、複雑で細かく調整された遺伝子ネットワークを利用して、必須の細胞機能を維持している。生物医学及び治療への応用のためにこのネットワークを遺伝的に操作すべく、最終的には、複数の組換え遺伝子の共発現を同時に正確に制御する必要があるだろう。複数の転写単位（ＴＵ）を順番にコードする単一プラスミドを、比較的容易にＧｉｂｓｏｎ又はＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ組立技術を使用して構築し得るが、いくつかの個々の遺伝子が構成的に発現される相対レベルを制御して所望の化学量論を達成することは、はるかに困難である。哺乳類動物細胞中における組換え遺伝子の制御された発現を達成するための現在の方法は、誘導可能な系及び複雑な遺伝子スイッチを使用して協調的に機能する複数の単一遺伝子合成回路を用いる。しかしながら、このアプローチには、制御され得る様々な遺伝子の数が限定されており、安定した哺乳動物細胞操作のためには多数のプラスミドを共トランスフェクトしなければならないという問題がある。
【0004】
合成回路内での組換え遺伝子発現を、振動ループ、ロジックゲートループ、及びフィードバックループの組み合わせを使用して正確に制御し得る。しかしながら、これは、同族プロモーターを誘導するための合成転写因子（例えば、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ジンクフィンガー、キメラ転写因子、又はＣＲＩＳＰＲ転写因子）の適用を頻繁に伴う。或いは、化学シャペロン、アプタマー、代謝産物、及び他の外部刺激の全ても、合成遺伝子回路発現を誘導して制御するために用いられている。この精密な生物学的制御系は、有用であり得るが、リガンド（合成転写因子及び化学シャペロン）の濃度依存的な転写活性化又は抑制により決定される発現レベル、及び不正確で漏れやすい発現の可能性により、複雑で扱いにくいものでもある。さらに、リガンドは、宿主細胞に代謝負担又は細胞ストレスを与える可能性があり、このことは、遺伝子治療及び細胞工学への応用には望ましくない。複雑でプログラム可能な遺伝子発現系が多くの用途で必要されることとなるが、一般的には、構成的に固体された化学量論で作動している「ハードワイヤード」コンポーネントが全ての操作された系の基礎を形成している。
【0005】
組換え遺伝子発現の化学量論を制御する代替手段は、転写活性が規定されている合成プロモーターの使用である。この場合には、プロモーターは、宿主細胞の既存のトランス活性化因子のレパートリーを様々な程度で利用して所望のレベルの転写活性を達成するように特別に設計され得る。従って、多重遺伝子発現の化学量論を制御するための手段としての、ベクターコンストラクト中での明確に定義された合成プロモーターの使用は、潜在的に魅力的な解決策である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、目的のヌクレオチド配列をコードする核酸配列に作動可能に連結された合成プロモーターを含む転写単位を含む多重遺伝子発現ベクターに関する。いくつかの態様では、この発現ベクターは、目的の第２のヌクレオチド配列をコードする核酸配列に作動可能に連結された第２の合成プロモーターを含む第２の転写単位を含む。いくつかの態様では、この発現ベクターは、目的の第３のヌクレオチド配列をコードする核酸配列に作動可能に連結された第３の合成プロモーターを含む第３の転写単位を含む。
【0007】
いくつかの態様では、第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、及び第３の合成プロモーターは、低い、中程度の、又は高い転写活性を有する。いくつかの態様では、第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、又は第３の合成プロモーターの転写活性は、単一遺伝子ベクターからの共発現からの転写活性と比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％抑制されている。いくつかの態様では、合成プロモーターのうちの２つは、同一レベルの転写活性を有する。いくつかの態様では、第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、及び第３の合成プロモーターは、異なるレベルの転写活性を有する。いくつかの態様では、第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、及び第３の合成プロモーターは、同一レベルの転写活性を有する。いくつかの態様では、転写活性は、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定されている。
【0008】
いくつかの態様では、第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、及び第３の合成プロモーターは、１つ又は複数の転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ）を含む。いくつかの態様では、この数のＴＦＲＥは、転写活性を制御する。いくつかの態様では、低強度の合成プロモーターは、１～３個のＴＦＲＥを含む。いくつかの態様では、中強度の合成プロモーターは、４～７個のＴＦＲＥを含む。いくつかの態様では、高強度の合成プロモーターは、７～１１個のＴＦＲＥを含む。いくつかの態様では、第１の合成プロモーターは、３個のＴＦＲＥを含み、第２の合成プロモーターは、７個のＴＦＲＥを含み、且つ第３の合成プロモーターは、１１個のＴＦＲＥを含む。
【0009】
いくつかの態様では、ＴＦＲＥは、ＥＴＳ結合部位（ＥＢＳ）、ＣＣＡＡＴ－エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）、抗酸化調節エレメント（ＡＲＥ）、ジオキシン調節エレメント（ＤＲＥ）、ＧＣ－ボックス、及び核因子カッパＢ（ＮＦｋＢ）からなる群から選択される。いくつかの態様では、低強度の合成プロモーターは、２つのＥＢＳ及び１つのＣ／ＥＢＰ ＴＦＲＥを含む核酸配列を含む。いくつかの態様では、中強度の合成プロモーターは、１つのＧＣ－ボックス、１つのＣ／ＥＢＰ、２つのＡＲＥ、１つのＤＲＥ、１つのＥＢＳ、及び１つのＮＦｋＢ ＴＦＲＥを含む核酸配列を含む。いくつかの態様では、高強度の合成プロモーターは、２つのＧＣ－ボックス、３つのＡＲＥ、３つのＮＦｋＢ、２つのＤＲＥ、及び１つのＥＢＳ ＴＦＲＥを含む核酸配列を含む。いくつかの態様では、発現ベクターは、第１の転写単位、第２の転写単位、及び第３の転写単位を任意の配向で含む。
【0010】
いくつかの態様では、目的の第１のヌクレオチド配列、目的の第２のヌクレオチド配列、及び目的の第３のヌクレオチド配列は、異なる。
【0011】
いくつかの態様では、第１の転写単位、第２の転写単位、及び第３の転写単位は、核酸リンカーにより連結されている。いくつかの態様では、核酸リンカーは、配列番号３０～４６からなる群から選択される。
【0012】
いくつかの態様では、発現ベクターは、哺乳動物、細菌、又はウイルスの発現ベクターである。いくつかの態様では、細胞は、本発現ベクターを含む。いくつかの態様では、この細胞は、哺乳動物、細菌、又は植物の細胞である。
【0013】
本開示のある特定の態様は、細胞中での目的の多重遺伝子の発現を調節する方法であって、前記細胞に本発現ベクターを導入すること、及び目的のヌクレオチド配列の発現を促進する条件下で、この細胞をインキュベートすることを含む方法を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】［図１Ａ－Ｏ］合成プロモーターの活性を評価するための３種の蛍光レポータータンパク質の共発現を示す。図１Ａは、哺乳動物の合成プロモーターの転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ）の組成を示す略図である。ＡＲＥ：抗酸化調節エレメント；Ｃ／ＥＢＰ：ＣＣＡＡＴ－エンハンサー結合タンパク質；ＤＲＥ：ジオキシン調節エレメント；ＥＢＳ：ＥＴＳ結合部位；ＮＦｋＢ：核因子カッパＢ。図１Ｂは、ＭＧＥＶを構築するためにＴＵの分類を組み立てるバックボーンとして使用された、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）カセット、哺乳動物のエピソーム複製起点、アンピシリン耐性のためのβ－ラクタマーゼ遺伝子、及び微生物の複製起点を含むｐＥｘｐ－Ｖｅｃ－ＧＧベクターの略図である。図１Ｃ～Ｅは、低強度合成プロモーター（図１Ｃ）、中強度合成プロモーター（図１Ｄ）、及び高強度合成プロモーター（図１Ｅ）の制御下でｅＧＦＰをコードするＴＵを収容するシャトルプラスミドの略図である。図１Ｆ～Ｈは、低強度合成プロモーター（図１Ｆ）、中強度合成プロモーター（図１Ｇ）、及び高強度合成プロモーター（図１Ｈ）の制御下でｍＣｈｅｒｒｙをコードするＴＵを収容するシャトルプラスミドの略図である。図１Ｉ～Ｋは、低強度合成プロモーター（図１Ｉ）、中強度合成プロモーター（図１Ｊ）、及び高強度合成プロモーター（図１Ｋ）の制御下でタグＢＦＰをコードするＴＵを収容するシャトルプラスミドの略図である。図１Ｌは、３種の蛍光レポーター（ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びタグＢＦＰ）の上流の低プロモーター、中プロモーター、及び高プロモーターの略図である。図１Ｍは、相対蛍光レポーター発現の倍数変化により決定された合成プロモーターの活性のグラフである。この倍数変化は、低強度プロモーターに対して、中強度プロモーター及び高強度プロモーターを利用する各レポーターの積分蛍光強度の中央値（ｉＭＦＩ）を正規化することにより導かれた。発現の倍数変化は、トランスフェクトされた各総ＤＮＡ負荷（１００～８００ｎｇ）に関して導かれており、ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びタグＢＦＰの平均倍数変化をそれぞれ、白色、灰色、及び黒色のバーで表す。エラーバーは、３回の独立した実験でトランスフェクトされた全ての総ＤＮＡ負荷全体にわたるレポーター発現の倍数変化の標準偏差を示す。図１Ｎは、様々な蛍光レポーターｍＲＮＡコピーの外部校正曲線のグラフである。この校正曲線は、低強度データセットに対して正規化しつつ、各ＤＮＡ負荷（１００～８００ｎｇ）及び様々なプロモーター強度で検出されたｍＲＮＡコピーを算術的に組み合わせることにより、導かれた。三次多項式回帰曲線をフィットさせて、ｅＧＦＰ（緑色）、ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色）、及びタグＢＦＰ（青色）の様々なｍＲＮＡ動態をモデル化し、各プロモーター－レポーターの組み合わせに関して正規化された相対転写活性（ＲＴＡ）を得た。ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びタグＢＦＰの三次多項式曲線のｒ２はそれぞれ、０．９７６、０．９８８、及び０．９６４であった。図１Ｏは、１００～８００ｎｇの範囲の各トランスフェクトされたプラスミド負荷での、低強度プロモーターにより媒介される発現に対する、中強度合成プロモーター及び高強度合成プロモーターを利用する３種全ての蛍光タンパク質レポーターの相対転写活性（ＲＴＡ）の平均倍数変化のグラフである。
【図2】［図２Ａ－Ｃ］組換え遺伝子発現の化学量論を制御するために哺乳動物の合成プロモーターを利用する多重遺伝子発現ベクター（ＭＧＥＶ）を示す。図２Ａは、全ての可能な組み合わせを包含する各位置で低、中、及び高強度の哺乳動物の合成プロモーターを利用する、固定されたタンデム系列でｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びタグＢＦＰをコードする２７種のＭＧＥＶバリアントのライブラリを示す略図である。コアプロモーター及び非翻訳領域（ＵＴＲ）は、ＭＧＥＶ－ｈＣＭＶ－ＭＩＥコア、５’ＵＴＲ、及びＳＶ４０ポリＡ内の各転写単位（ＴＵ）中で同一であった。図２Ｂは、ＭＧＥＶライブラリの一過性発現中に示された、低強度合成プロモーター、中強度合成プロモーター、及び高強度合成プロモーターの平均転写抑制を示すグラフである。各合成プロモーターの転写抑制率を、ＭＧＥＶ発現中に観察されたＲＴＡと、ほぼ同等の遺伝子コピーでのＳＧＶ共発現から導かれた、予期されるＲＴＡとの間の差違を比較することにより算出した。個々のバー及びエラーバーは、３回の独立した実験にわたるＭＧＥＶ（１つのプロモーターバリアント当たりの２７種の個別のＲＴＡ）内の全ての位置にわたる低強度プロモーター、中強度プロモーター、及び高強度プロモーターの平均転写抑制率及び標準偏差それぞれを表す。Ｔｕｋｅｙ補正を伴う一元ＡＮＯＶＡ統計的検定を実施して、低強度プロモーター及び中強度プロモーター、並びに中強度プロモーター及び高強度プロモーターの間の平均転写抑制率の有意差を示し、ｐ＜０．０００１の場合は「＊＊＊＊」で表された。図２Ｃは、位置に関係なく２７種の個別のＭＧＥＶバリアントで利用された低強度合成プロモーター、中強度合成プロモーター、及び高強度合成プロモーターの平均ＲＴＡを示すグラフである。エラーバーは、３回の独立した実験にわたる各プロモーターの２７種の個別のＲＴＡの標準偏差を表す。Ｔｕｋｅｙ補正を伴う一元ＡＮＯＶＡ統計分析を実施して、低強度合成プロモーター、中強度合成プロモーター、及び高強度合成プロモーターの間の有意差を示し、ｐ＜０．０００１の場合は「＊＊＊＊」で表された。
【図3】［図３Ａ－Ｂ］多重遺伝子発現ベクター（ＭＧＥＶ）環境内での転写活性の概要である。図３Ａは、全ての組み合わせ及びＭＧＥＶ内の位置で低強度合成プロモーター、中強度合成プロモーター、及び高強度合成プロモーターを利用する２７種の個別のＭＧＥＶバリアントに関して、ｘ軸、ｙ軸、及びｚ軸それぞれにわたり１位、２位、及び３位での相対転写活性（ＲＴＡ）を示しており且つ赤色の点で表される三次元プロットである。低強度合成プロモーター、中強度合成プロモーター、及び高強度合成プロモーターに関するＲＴＡのセットは、ほぼ同等の遺伝子コピーでの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）共発現から得られ、ＭＧＥＶの各位置での予期される転写活性をシミュレートするためにコンパイルされた。これらのＲＴＡを、このプロット上では青色の点で表した。図３Ｂは、（図３Ａ）で示された２７種のＭＧＥＶバリアントの１位、２位、及び３位で同一のＲＴＡを表す拡大プロットである。このクラスターは、ＭＧＥＶの環境内で、低強度合成プロモーター、中強度合成プロモーター、及び高強度合成プロモーターの転写活性の経験的に導かれる限界を表す。
【図4】［図４Ａ－Ｂ］多重遺伝子発現ベクター（ＭＧＥＶ）環境内での転写抑制の傾向を示す。図４Ａは、２７種のＭＧＥＶバリアントのライブラリ内の３箇所全ての位置にわたる転写抑制の程度を表す頻度分布のグラフである。ＭＧＥＶ内で検出されたＲＴＡを、転写活性の他の寄与している偏りを特定するために、２位及び３位それぞれで観察された１５％及び１４％の抑制を補償することにより、遺伝子位置効果全体に関して正規化した。各位置及び全ての合成プロモーターの組み合わせ（低強度、中強度、及び高強度）に関するこれらの位置効果の正規化されたＲＴＡを、予期されるＲＴＡ（ほぼ同等の遺伝子コピーでの単一遺伝子ベクター共発現（図１Ｌ）から得られる）と直接比較して、転写抑制率を得た。次いで、抑制の程度を、個々のビンの中心として０～１００％の範囲の一定の区間に分類し、各区間に関して頻度を算出して分布を形成した。図４Ｂは、合成プロモーターの組み合わせと２７種の個別のＭＧＥＶバリアント内の位置とに従って配置された、（図４Ａ）で算出された抑制の程度を示す勾配ヒートマップである。紫色の色合いは、高い抑制を表しており、逆に、灰色の色合いは、低い抑制を表す。特定の位置で利用される合成プロモーターが重ね合わされており、低強度、中強度、及び高強度それぞれを表す「Ｌ」、「Ｍ」、及び「Ｈ」と略される。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本開示のある特定の態様は、（ａ）目的のヌクレオチド配列をコードする核酸配列に作動可能に連結された合成プロモーターを含む転写単位を含む多重遺伝子発現ベクターを対象とする。いくつかの態様では、この発現ベクターは、目的の第２のヌクレオチド配列をコードする核酸配列に作動可能に連結された第２の合成プロモーターを含む第２の転写単位をさらに含む。いくつかの態様では、この発現ベクターは、目的の第３のヌクレオチド配列をコードする核酸配列に作動可能に連結された第３の合成プロモーターを含む第３の転写単位をさらに含む。
【0016】
いくつかの態様では、第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、及び第３の合成プロモーターは、低い、中程度の、又は高い転写活性を個々に有する。いくつかの態様では、これら３つのプロモーターは、同一の転写活性を引き起こす。いくつかの態様では、これら３つのプロモーター転写活性は、異なる。いくつかの態様では、転写活性は、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定されている。
【0017】
いくつかの態様では、第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、及び第３の合成プロモーターは、１つ又は複数の転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ）を含む。いくつかの態様では、この数のＴＦＲＥは、転写活性を制御する。いくつかの態様では、低強度の合成プロモーターは、１～３個のＴＦＲＥを含む。いくつかの態様では、中強度の合成プロモーターは、４～７個のＴＦＲＥを含む。いくつかの態様では、高強度の合成プロモーターは、７～１１個のＴＦＲＥを含む。いくつかの態様では、第１の合成プロモーターは、３個のＴＦＲＥを含み、第２の合成プロモーターは、７個のＴＦＲＥを含み、且つ第３の合成プロモーターは、１１個のＴＦＲＥを含む。
【0018】
いくつかの態様では、ＴＦＲＥは、ＥＴＳ結合部位（ＥＢＳ）、ＣＣＡＡＴ－エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）、抗酸化調節エレメント（ＡＲＥ）、ジオキシン調節エレメント（ＤＲＥ）、ＧＣ－ボックス、及び核因子カッパＢ（ＮＦｋＢ）であり得る。いくつかの態様では、低強度の合成プロモーターは、２つのＥＢＳ及び１つのＣ／ＥＢＰ ＴＦＲＥを含む核酸配列を含む。いくつかの態様では、中強度の合成プロモーターは、１つのＧＣ－ボックス、１つのＣ／ＥＢＰ、２つのＡＲＥ、１つのＤＲＥ、１つのＥＢＳ、及び１つのＮＦｋＢ ＴＦＲＥを含む核酸配列を含む。いくつかの態様では、高強度の合成プロモーターは、２つのＧＣ－ボックス、３つのＡＲＥ、３つのＮＦｋＢ、２つのＤＲＥ、及び１つのＥＢＳ ＴＦＲＥを含む核酸配列を含む。
【0019】
いくつかの態様では、発現ベクターは、第１の転写単位、第２の転写単位、及び第３の転写単位を、任意の配向で含む。いくつかの態様では、目的の第１のヌクレオチド配列、目的の第２のヌクレオチド配列、及び／又は目的の第３のヌクレオチド配列は、異なる。いくつかの態様では、目的の第１のヌクレオチド配列、目的の第２のヌクレオチド配列、及び／又は目的の第３のヌクレオチド配列は、同一である。
【0020】
いくつかの態様では、発現ベクターは、哺乳動物、細菌、又はウイルスの発現ベクターである。いくつかの態様では、細胞は、この発現ベクターを含む。いくつかの態様では、この細胞は、哺乳動物、細菌、又は植物の細胞である。
【0021】
本開示のある特定の態様は、細胞中での目的の多重遺伝子の発現を調節する方法であって、前記細胞に本発現ベクターを導入すること、及び目的のヌクレオチド配列の発現を促進する条件下で、この細胞をインキュベートすることを含む方法を対象とする。
【0022】
Ｉ．定義
本開示をより容易に理解し得るために、ある特定の用語を最初に定義する。追加の定義は、詳細な開示全体にわたり記載される。
本開示をより容易に理解し得るために、ある特定の用語を最初に定義する。追加の定義は、詳細な開示全体にわたり記載される。
【0023】
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼを指示してＤＮＡに結合させ且つＲＮＡ合成を開始することにより転写の開始を媒介する調節性ＤＮＡ配列を定義する。プロモーターは、一般に、遺伝子の上流に位置する。プロモーターは、例えば、コアプロモーター及び転写因子調節エレメントを含み得る。
【0024】
「合成プロモーター」は、転写因子調節エレメントを含む人工的な、操作された、及び／又は組み立てられたプロモーターを指す。
【0025】
「転写因子調節エレメント」（ＴＦＲＥ）は、転写因子のための結合部位であるヌクレオチド配列である。例示的なＴＦＲＥを、表１に示す。
【0026】
「転写因子」（ＴＦ）は、ＴＦＲＥに結合するタンパク質であり、遺伝子の転写速度に（正又は負のいずれかで）影響を及ぼす。
【0027】
「コアプロモーター」は、転写を開始するのに必要なプロモーターの最小の部分であるヌクレオチド配列を指す。コアプロモーター配列は、例えばＣＭＶ最初期遺伝子プロモーター又はＳＶ４０を含む原核生物遺伝子又は真核生物遺伝子に由来し得る。コアプロモーターは、例えば、ＴＡＴＡボックスを含み得る。コアプロモーターは、例えば、イニシエーターエレメントを含み得る。コアプロモーターは、例えば、ＴＡＴＡボックス及びイニシエーターエレメントを含み得る。
【0028】
「エンハンサー」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子の転写、遺伝子の同一性に依存しないこと、遺伝子に関連した配列の位置、及び配列の配向を増強するために作用するヌクレオチド配列を定義する。
【0029】
「機能上連結された」及び「作動可能に連結された」という用語は、互換的に使用され、２種以上のＤＮＡセグメント（例えば、発現される遺伝子及び遺伝子の発現を制御する配列）間の機能的関係性を指す。例えば、シス作用性転写調節エレメントの任意の組み合わせを含むプロモーター及び／又はエンハンサー配列は、適切な宿主細胞又は他の発現系におけるコード配列の転写を刺激するか又は調節する場合に、コード配列に作動可能に連結される。転写される遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモーター調節配列は、転写される配列に物理的に隣接している。
【0030】
「配向」は、所与のＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの順序を指す。例えば、別のＤＮＡ配列に対して逆方向にあるＤＮＡ配列の配向とは、別の配列に対して配列の５’～３’の順序が、配列が得られたＤＮＡ中の基準点と比較した場合に反転される配向である。そのような基準点には、供給源であるＤＮＡの他の指定されたＤＮＡ配列の転写方向、及び／又はこの配列を含む複製可能なベクターの複製起点が含まれ得る。
【0031】
「発現ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、適切な宿主細胞へとトランスフェクションされると、宿主細胞内で組換え遺伝子産物の発現をもたらす単離ＤＮＡ分子及び精製ＤＮＡ分子を含む。組換え体又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に加えて、発現ベクターは、宿主細胞株における、ＤＮＡコード配列のｍＲＮＡへの効率的な転写、及び任意選択的な、ｍＲＮＡのタンパク質への効率的な翻訳に必要となる制御性ＤＮＡ配列を含む。
【0032】
「宿主細胞」又は「宿主細胞株」という用語は、本明細書で使用される場合、培養物中で増殖可能であり且つ所望の組換え産物であるタンパク質を発現可能な任意の細胞（特に、哺乳動物細胞）を含む。
【0033】
「発現カセット」という用語は、本明細書で使用される場合、発現されるポリペプチドと、この発現を制御する配列（例えば、シス作用性転写調節エレメントの任意の組み合わせを含む、プロモーター及び任意選択的なエンハンサー配列）とをコードするポリヌクレオチド配列を含む。遺伝子の発現（即ち、その転写及び転写産物の翻訳）を制御する配列は、一般に、調節単位と呼ばれる。調節単位の大部分は、遺伝子のコード配列の上流に位置しており、且つコード配列に作動可能に連結されている。発現カセットはまた、ポリアデニル化部位を含む下流の３’側非翻訳領域も含み得る。本発明の調節単位は、発現される遺伝子（即ち、転写単位）に作動可能に連結されているか、又は介在するＤＮＡ（例えば、異種遺伝子の５’非翻訳領域）により、この発現される遺伝子から隔てられている。発現カセットのベクターへの挿入及び／又はベクターからのその切出しを可能にするために、発現カセットは、１つ又は複数の好適な制限部位に隣接され得る。発現カセットは、様々な遺伝子エレメント（即ち、ＴＦＲＥ、目的の核酸配列、プロモーター、ターミネーター等）の挿入又は欠失を可能にするために、１つ又は複数の好適な制限部位を含み得る。そのため、本発明に係る発現カセットは、発現ベクター（特に、哺乳動物の発現ベクター）を構築するために使用され得る。本発明の発現カセットは、プロモーターの下流に、１つ又は複数（例えば、２個、３個、又はさらに多い）非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含み得る。
【0034】
「ポリヌクレオチド」及び「ヌクレオチド配列」という用語は、細胞から単離され得る天然に存在する核酸分子又は組換えで発現される核酸分子、及び、例えば、化学合成方法又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の酵素的方法により調製され得る合成分子を含む。
【0035】
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドを発現する遺伝子（好ましくは、異種遺伝子）をコードするＤＮＡを含む。
【0036】
「異種コード配列」、「異種遺伝子配列」、「異種遺伝子」、「組換え遺伝子」、又は「遺伝子」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、宿主細胞（好ましくは、哺乳動物細胞）中で発現させて回収しようとする組換え体（特に、組換え異種タンパク質産物）をコードするＤＮＡ配列を指す。遺伝子産物は、ポリペプチドであり得る。異種遺伝子配列は、天然では宿主細胞内に存在せず、同じ種又は異なる種の生物に由来し、且つ遺伝的に改変されている場合がある。
【0037】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用されて、隣接残基のα－アミノ基及びカルボキシ基間のペプチド結合により他方に連結される一連のアミノ酸残基を含む。
【0038】
「高強度合成プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、プロモーターコンストラクトのある範囲にわたり得られる発現の平均レベルと比べて高い発現レベルと定義される「高」レベルの発現で、組換え遺伝子、組換えタンパク質、又はレポータータンパク質を発現可能なプロモーターを指す。
【0039】
「中強度合成プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、プロモーターコンストラクトのある範囲にわたり得られる発現の平均レベル以上の発現レベルと定義される「中」レベルの発現で、組換え遺伝子、組換えタンパク質、又はレポータータンパク質を発現可能なプロモーターを指す。
【0040】
「低強度合成プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、プロモーターコンストラクトのある範囲にわたり得られる発現の平均レベルと比べて低い発現レベルと定義される「低」レベルの発現で、組換え遺伝子、組換えタンパク質、又はレポータータンパク質を発現可能なプロモーターを指す。
【0041】
「目的のヌクレオチド配列」という用語は、本明細書で使用される場合、宿主細胞中での発現（例えば、標的細胞中でのタンパク質又は他の生物学的分子（例えば、治療用細胞産物）の産生）に望ましいタンパク質又は他の分子をコードする任意の核酸であり得る。
【0042】
「化学量論」という用語は、本明細書で使用される場合、発現ベクターにより発現されるタンパク質の相対量を指す。
【0043】
「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」の実体という用語は、この実体の１つ又は複数を指しており；例えば、「１つの核酸配列」は、別途明記されない限り、１つ又は複数の核酸配列を表すことに留意すべきである。従って、「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ又は複数」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書中では互換的に使用され得る。
【0044】
さらに、本明細書において使用される「及び／又は」は、他のものと共に、又は他のものなしに、２つの規定の特徴又は構成要素のそれぞれの具体的開示と解釈すべきである。そのため、「及び／又は」という用語は、本明細書中で「Ａ及び／又はＢ」等の語句で使用される場合、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、並びに「Ｂ」（単独）を含むものとする。同様に、「及び／又は」という用語は、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」等の語句で使用される場合、下記の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）の各々を包含するものとする。
【0045】
態様が、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／又は「～から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語で説明されている別の類似の態様も提供されることが理解される。
【0046】
「約」という用語は、本明細書では、およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）、おおよそ（ｒｏｕｇｈｌｙ）、およそ（ａｒｏｕｎｄ）、又はその領域内を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲と組み合わせて使用される場合には、「約」は、示される数値の上下に境界を拡大することによって、この範囲を変更する。一般に、「約」という用語は、示された値の上下の数値を、例えば１０パーセント上下（より高いか又はより低い）の変動により変更し得る。
【0047】
数値又は一連の数値の前の「少なくとも」という用語は、文脈から明らかなように、「少なくとも」という用語に隣接する数値、及び論理的に含まれ得る全ての後続の数値又は整数値を含むことが理解される。例えば、核酸分子中のヌクレオチドの数は、整数でなければならない。例えば、「２１個のヌクレオチドの核酸分子の内の少なくとも１８個のヌクレオチド」は、１８、１９、２０、又は２１個のヌクレオチドが、示された特性を有することを意味する。少なくともが、一連の数値又は範囲の前に表されている場合には、「少なくとも」は、この一連又は範囲中の数値のそれぞれを変更し得ることが理解される。「少なくとも」はまた、整数には限定されない（例えば、「少なくとも５％」は、有効数字の数値を考慮することなく５．０％、５．１％、５．１８％を含む）。
【0048】
本明細書で使用される場合、「以下」又は「未満」は、この語句に隣接する値、及び文脈から論理的にゼロまでの論理的に低い値又は整数として理解される。「以下」が、一連の数値又は範囲の前で表されている場合には、「以下」は、この一連又は範囲中の数値のそれぞれを変更し得ることが理解される。
【0049】
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、ある分子を別の分子に連結する化学的部分を指す。このリンカーは、２つの分子又は部分間に間隙を空けて、これらが意図した方法で機能可能であるようになる。
【0050】
本明細書で使用される場合、「転写単位」という用語は、目的のヌクレオチド配列（即ち、発現される遺伝子）に作動可能に連結された調節単位（即ち、合成プロモーター）を含む核酸配列を指す。
【0051】
ＩＩ．発現ベクター
本明細書で提供される方法を使用して、哺乳動物発現ベクターを、予測可能な相対化学量論で目的の複数のヌクレオチド配列の発現を媒介する合成プロモーターを含んで設計し得る。例示的な合成プロモーターは、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６０１２５号で説明されている。目的のヌクレオチド配列は、宿主細胞中での発現が望ましいタンパク質又は他の分子をコードする任意のヌクレオチド配列であり得る。いくつかの態様では、発現ベクターは、目的の核酸配列をコードする核酸配列を含む転写単位を含む。いくつかの態様では、発現ベクターは、目的の第１の核酸配列をコードする第１の核酸配列を含む第１の転写単位、及び目的の第２の核酸配列をコードする第２の核酸配列を含む第２の転写単位を含み得る。いくつかの態様では、発現ベクターは、目的の第１の核酸配列をコードする第１の核酸配列を含む第１の転写単位、目的の第２の核酸配列をコードする第２の核酸配列を含む第２の転写単位、及び目的の第３の核酸配列をコードする第３の核酸配列を含む第３の転写単位を含み得る。いくつかの態様では、発現ベクターは、３個超の転写単位を含む。いくつかの態様では、発現ベクターは、少なくとも３個の転写単位、少なくとも４個の転写単位、少なくとも５個の転写単位、少なくとも６個の転写単位、少なくとも７個の転写単位、又は少なくとも８個の転写単位を含む。いくつかの態様では、目的の第１のヌクレオチド配列、目的の第２のヌクレオチド配列、及び／又は目的の第３のヌクレオチド配列は、異なる。いくつかの態様では、目的の第１のヌクレオチド配列、目的の第２のヌクレオチド配列、及び／又は目的の第３のヌクレオチド配列は、同一である。いくつかの態様では、発現ベクターは、第１の転写単位、第２の転写単位、及び第３の転写単位を、任意の配向で含む。
本明細書で提供される方法を使用して、哺乳動物発現ベクターを、予測可能な相対化学量論で目的の複数のヌクレオチド配列の発現を媒介する合成プロモーターを含んで設計し得る。例示的な合成プロモーターは、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６０１２５号で説明されている。目的のヌクレオチド配列は、宿主細胞中での発現が望ましいタンパク質又は他の分子をコードする任意のヌクレオチド配列であり得る。いくつかの態様では、発現ベクターは、目的の核酸配列をコードする核酸配列を含む転写単位を含む。いくつかの態様では、発現ベクターは、目的の第１の核酸配列をコードする第１の核酸配列を含む第１の転写単位、及び目的の第２の核酸配列をコードする第２の核酸配列を含む第２の転写単位を含み得る。いくつかの態様では、発現ベクターは、目的の第１の核酸配列をコードする第１の核酸配列を含む第１の転写単位、目的の第２の核酸配列をコードする第２の核酸配列を含む第２の転写単位、及び目的の第３の核酸配列をコードする第３の核酸配列を含む第３の転写単位を含み得る。いくつかの態様では、発現ベクターは、３個超の転写単位を含む。いくつかの態様では、発現ベクターは、少なくとも３個の転写単位、少なくとも４個の転写単位、少なくとも５個の転写単位、少なくとも６個の転写単位、少なくとも７個の転写単位、又は少なくとも８個の転写単位を含む。いくつかの態様では、目的の第１のヌクレオチド配列、目的の第２のヌクレオチド配列、及び／又は目的の第３のヌクレオチド配列は、異なる。いくつかの態様では、目的の第１のヌクレオチド配列、目的の第２のヌクレオチド配列、及び／又は目的の第３のヌクレオチド配列は、同一である。いくつかの態様では、発現ベクターは、第１の転写単位、第２の転写単位、及び第３の転写単位を、任意の配向で含む。
【0052】
いくつかの態様では、発現ベクターは、１つ又は複数の合成プロモーターを含む。いくつかの態様では、転写単位は、１つ又は複数の合成プロモーターを含む。いくつかの態様では、発現ベクターは、３つの合成プロモーターを含む。いくつかの態様では、第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、及び第３の合成プロモーターは、低い、中程度の、又は高い転写活性を有する。いくつかの態様では、第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、又は第３の合成プロモーターの転写活性は、単一遺伝子ベクターからの共発現からの転写活性と比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％抑制されている。いくつかの態様では、合成プロモーターの内の２つは、同一レベルの転写活性を有する。いくつかの態様では、第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、及び第３の合成プロモーターは、異なるレベルの転写活性を有する。いくつかの態様では、第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、及び第３の合成プロモーターは、同一レベルの転写活性を有する。いくつかの態様では、転写活性は、ｑＲＴ－ＰＣＲ又はＲＮＡ配列決定で測定されている。いくつかの態様では、転写活性は、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定されている。
【0053】
いくつかの態様では、発現ベクターは、目的の核酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結された合成プロモーターを含む転写単位を含む。いくつかの態様では、発現ベクターは、目的の第１の核酸配列をコードする第１の核酸配列を含む第１の核酸に作動可能に連結された第１の合成プロモーターを含む第１の転写単位、及び目的の第２の核酸配列をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結された第２の合成プロモーターを含む第２の転写単位を含み得る。いくつかの態様では、発現ベクターは、目的の第１の核酸配列をコードする第１の核酸配列に作動可能に連結された第１の合成プロモーターを含む第１の転写単位、目的の第２の核酸配列をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結された第２の合成プロモーターを含む第２の転写単位、及び目的の第３の核酸配列をコードする第３の核酸配列に作動可能に連結された第３の合成プロモーターを含む第３の転写単位を含み得る。いくつかの態様では、第１の合成プロモーター、第２の合成プロモーター、及び第３の合成プロモーターは、１つ又は複数の転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ）を含む。いくつかの態様では、この数のＴＦＲＥは、転写活性を制御する。
【0054】
合成プロモーターは、ＴＦＲＥの任意の数及び任意の組み合わせを含み得る。いくつかの態様では、低強度の合成プロモーターは、１～３個のＴＦＲＥを含む。いくつかの態様では、低強度の合成プロモーターは、３個のＴＦＲＥを含む。いくつかの態様では、中強度の合成プロモーターは、４～７個のＴＦＲＥを含む。いくつかの態様では、中強度の合成プロモーターは、７個のＴＦＲＥを含む。いくつかの態様では、高強度の合成プロモーターは、７～１１個のＴＦＲＥを含む。いくつかの態様では、高強度の合成プロモーターは、１１個のＴＦＲＥを含む。いくつかの態様では、第１の合成プロモーターは、３個のＴＦＲＥを含み、第２の合成プロモーターは、７個のＴＦＲＥを含み、且つ第３の合成プロモーターは、１１個のＴＦＲＥを含む。
【0055】
例示的な転写因子調節エレメントとして、ＥＴＳ結合部位、ＣＣＡＡＴ－エンハンサー結合タンパク質、抗酸化調節エレメント（ＡＲＥ）、ジオキシン調節エレメント（ＤＲＥ）、核因子カッパＢ（ＮＦｋＢ）、ＧＣ－ボックス、及び表１で列挙されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
【0056】
【表1】
【0057】
いくつかの態様では、転写単位は、核酸リンカーにより連結されている。いくつかの態様では、第１の転写単位は、核酸リンカーにより、第２の転写単位に連結されている。いくつかの態様では、第２の転写単位は、核酸リンカーにより、第３の転写単位に連結されている。いくつかの態様では、核酸リンカーは、１～１０個の塩基対の長さ、２～８個の塩基対の長さ、又は３～６個の塩基対の長さである。いくつかの態様では、核酸リンカーは、４個の塩基対の長さである。核酸リンカーとして、表２で列挙されているリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【0058】
【表2】
【0059】
いくつかの態様では、低強度の合成プロモーターは、２つのＥＢＳ及び１つのＣ／ＥＢＰ ＴＦＲＥを含む核酸配列を含む。いくつかの態様では、低強度のプロモーターは、配列番号３０に対して少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様では、中強度の合成プロモーターは、１つのＣ／ＥＢＰ、１つのＧＣ－ボックス、２つのＡＲＥ、１つのＤＲＥ、１つのＥＢＳ、及び１つのＮＦｋＢ ＴＦＲＥを含む核酸配列を含む。いくつかの態様では、中強度のプロモーターは、配列番号３１に対して少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様では、高強度の合成プロモーターは、３つのＡＲＥ、３つのＮＦｋＢ、２つのＤＲＥ、２つのＧＣ－ボックス、及び１つのＥＢＳ ＴＦＲＥを含む核酸配列を含む。いくつかの態様では、高強度のプロモーターは、配列番号３２に対して少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む。
【0060】
【表3】
【0061】
本発明のベクターは、ウイルスベクター及び非ウイルス（例えば、プラスミドＤＡＮ）ベクターを包含する。好適な非ウイルスベクターとして、プラスミド、例えば、ｐＥｘｐ－Ｖｅｃ－ＧＧ、ｐＥｘｐ－Ｖｅｃ－ＧＧ（ＧＳ単独）、ｐＥｘｐ－Ｖｅｃ－ＧＧ（ＯｒｉＰ単独）、ｐＥｘｐ－Ｖｅｃ－ＧＧ（ＴＩ）、ｐＥｘｐ－Ｖｅｃ－ＧＧ（Ｈｙｇｒｏ）、及びｐＥｘｐ－Ｖｅｃ－ＧＧ（ＧＳ＋ＵＣＯＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。「ウイルスベクター」は、本明細書では、その当該技術分野で認識されている意味に従って使用される。これは、ウイルス複製起点の少なくとも１つのエレメントを含む任意のベクターを指しており、例えば、完全ウイルスゲノム、その一部、又は下記で説明するように改変されたウイルスゲノム、及びこれから生成されたウイルス粒子（例えば、感染性ウイルス粒子を生成するためにウイルスカプシドにパッケージ化されたウイルスベクター）を含む任意のベクターを指す。本発明のウイルスベクターは、複製可能であり得るか、又は複製欠損若しくは複製障害であり得るように遺伝的に無効にされ得る。いくつかの態様では、発現ベクターは、哺乳動物、細菌、又はウイルスの発現ベクターである。
【0062】
細胞は、本明細書で提供されるプロモーター、又は本明細書で提供されるベクターを含み得る。この細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞であり得る。このＣＨＯ細胞は、例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、又はＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞であり得る。この細胞は、例えば、ヒト細胞であり得る。この細胞はまた、例えば、非ヒト細胞（例えば、非ヒト哺乳動物細胞）でもあり得る。本明細書で提供されるプロモーター又はベクターを含む細胞は、一過的にトランスフェクトされ得るか、又は安定的にトランスフェクトされ得る。本明細書で提供される細胞は、単離細胞（即ち、生物内に含有されない細胞）又は培養細胞（即ち、培養物中の細胞）であり得る。
【実施例】
【0063】
実施例１：プラスミドベクターフォーマット毎に単一遺伝子で合成プロモーターを使用したレポーター遺伝子の一過性共発現
合成プロモーター転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ）の組成を、図１Ａに示す。プロモーターは、ＣＨＯ細胞中で既にキャラクタライズされたように、転写活性が異なる最大７つの異なるＴＦＲＥの選択で構成された。各プロモーターの転写活性を変化させるために、２ｂｐのスペーサーで区切られたＴＦＲＥブロックを、低強度、中強度、及び高強度のプロモーター用に特異的に選択し、ヒトサイトメガロウイルス主要中間初期（ｈＣＭＶ－ＭＩＥ）コアの上流に配置した。低強度、中強度、及び高強度の合成プロモーターのおおよその活性は、それぞれ、ｈＣＭＶ－ＭＩＥ発現強度の０．１、０．８、及び２．２倍であった。
合成プロモーター転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ）の組成を、図１Ａに示す。プロモーターは、ＣＨＯ細胞中で既にキャラクタライズされたように、転写活性が異なる最大７つの異なるＴＦＲＥの選択で構成された。各プロモーターの転写活性を変化させるために、２ｂｐのスペーサーで区切られたＴＦＲＥブロックを、低強度、中強度、及び高強度のプロモーター用に特異的に選択し、ヒトサイトメガロウイルス主要中間初期（ｈＣＭＶ－ＭＩＥ）コアの上流に配置した。低強度、中強度、及び高強度の合成プロモーターのおおよその活性は、それぞれ、ｈＣＭＶ－ＭＩＥ発現強度の０．１、０．８、及び２．２倍であった。
【0064】
合成プロモーターの転写活性を確認し、ＭＧＥＶからの遺伝子発現との後の比較のために単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）からの組換え遺伝子発現を定量的に評価するために、各合成プロモーターを、３種のスペクトル的に不連続の蛍光レポータータンパク質ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びタグＢＦＰの上流に挿入して、９種のＳＶＧのライブラリを作成した（図１Ｃ～１Ｌ）。これらを、３群で共トランスフェクトし、各群は、１００～８００ｎｇの範囲の総プラスミドＤＮＡ負荷にて、低（群１）、中（群２）、又は高（群３）のいずれかで同一の転写活性があるプロモーターの制御下で各蛍光タンパク質をコードする３種のＳＧＶからなる（図１Ｌ）。各レポーター遺伝子のＳＧＶにより媒介される一過性発現により、用いた合成プロモーターに応じて、蛍光タンパク質の細胞含有量が、比較的低くなるか、中程度になるか、又は高くなった。全レポーターにわたり、正規化された（低強度プロモーターに対して正規化された）積分蛍光強度の中央値は、１：７．７：３１．２（低：中：高強度合成プロモーター）の比であり、予期されるプロモーター機能が裏付けられた（図１Ｍ）。
【0065】
しかしながら、低発現レベルでの蛍光タンパク質のフローサイトメトリー検出の感度には限界があったことから、且つ転写活性をより直接的に定量的に比較するために、組換え細胞レポーターｍＲＮＡ含有量を、絶対定量ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して測定した。各レポーターの転写活性のばらつきに対してｍＲＮＡコピーの測定値を外部校正するために、トランスフェクトされたＳＧＶ総プラスミドＤＮＡ負荷の範囲（１．８６×１０６個の細胞当たり１００～８００ｎｇの範囲）から得られる組換えｍＲＮＡコピーを、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定した。各実験に関して、低強度プロモーター、中強度プロモーター、又は高強度プロモーターのいずれかを利用した等質量のｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びタグＢＦＰ ＳＧＶを、トランスフェクション前に混合して、全レポーターを、既に説明した低強度合成プロモーター群、中強度合成プロモーター群、又は高強度合成プロモーター群のいずれかとして共トランスフェクトした（図１Ｌ）。各レポーター遺伝子は同様の長さであった（ｅＧＦＰ，７２０ｂｐ；ｍＣｈｅｒｒｙ，７１１ｂｐ；タグＢＦＰ，７０２ｂｐ）ことから、各実験で共トランスフェクトされた各レポーター遺伝子のコピー数は、類似していた（例えば、総プラスミドＤＮＡ ６００ｎｇは、１つの細胞当たりの各蛍光レポーター遺伝子の２６９８３～２７８６８個のコピーと等しい）。各総ＳＧＶ ＤＮＡ負荷にて、レポーターｍＲＮＡコピーを、ｑＲＴ－ＰＣＲにより、トランスフェクションの２４時間後に測定した。各レポーターｍＲＮＡの転写活性の測定値の直接比較を可能にするために、各ＤＮＡ負荷で測定されたｍＲＮＡコピー及び様々なプロモーター強度を算術的に組み合わせ、低強度プロモーターのデータセットに関して正規化しており、レポーター特異的ｍＲＮＡ動態は転写後に変化すると可能性が高い（即ち、ｍＲＮＡ半減期、ｍＲＮＡ二次構造、翻訳効率等）が、所与のプロモーターにより媒介される転写速度は、各レポーター遺伝子に関して一定であるという仮定が組み込まれている。これにより、レポーター特異的な外部校正曲線を作成することが可能となり、測定されたｍＲＮＡコピーが、クロスレポーターの比較可能な相対転写活性（ＲＴＡ）に関連付けられた。それぞれの場合で、三次多項式回帰により、ベストフィット線が得られた（ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びタグＢＦＰ校正それぞれに関して、０．９７６、０．９８８、及び０．９６４のｒ２；図１Ｎ）。当然のことながら、測定されたｍＲＮＡコピーとＲＴＡとにはレポーター特異的な差違は明らかであり、このことは、それぞれの場合での共通の５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの使用にもかかわらず、ｍＲＮＡ動態の差違を示す。全ＳＧＶデータにわたり（全ての総ＤＮＡ負荷を考慮する）、合成プロモーターにより、低１：中４．６（±１．１）：高７．２（±１．１）の正規化平均（±ＳＥ）比でＲＴＡが得られた。合成プロモーター活性の比は、総プラスミドＤＮＡ負荷にある程度依存しており、その結果、低強度プロモーターと比較して、中及び高の比は、トランスフェクトされたＤＮＡの質量に対して直線的に増加し（図１Ｏ）、このことは、より高いＤＮＡ負荷でのプロモーターの複雑さの増大による自己阻害（プロモーター干渉とも称される）の低下を潜在的に示す。
【0066】
実施例２：組換え遺伝子発現の化学量論を制御するために合成プロモーターを利用する多重遺伝子発現ベクターの構築及び性能
合成プロモーターを、ＭＧＥＶ中で直列に配置された組換え遺伝子の発現の相対レベルを予想通りに制御するために使用し得るかどうかを確認するために試験した。様々な位置における合成プロモーター（低、中、及び高）の全ての可能な組み合わせを利用する固定された直列でｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びタグＢＦＰをコードする２７種のＭＧＥＶのライブラリを構築した（図２Ａ）。各ＭＧＥＶを、デノボで合成されたＴＵ及びプラスミドベクター骨格ｐＥｘｐ－Ｖｅｃ－ＧＧを使用して、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリにより構築した（図１Ｂ～１Ｋ）。
合成プロモーターを、ＭＧＥＶ中で直列に配置された組換え遺伝子の発現の相対レベルを予想通りに制御するために使用し得るかどうかを確認するために試験した。様々な位置における合成プロモーター（低、中、及び高）の全ての可能な組み合わせを利用する固定された直列でｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びタグＢＦＰをコードする２７種のＭＧＥＶのライブラリを構築した（図２Ａ）。各ＭＧＥＶを、デノボで合成されたＴＵ及びプラスミドベクター骨格ｐＥｘｐ－Ｖｅｃ－ＧＧを使用して、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリにより構築した（図１Ｂ～１Ｋ）。
【0067】
各ＭＧＥＶバリアントを、１．８６×１０６個の細胞当たり６００ｎｇの総ＭＧＥＶ質量にて、ＳＧＶの組み合わせ（図１Ｌ）に従って２４時間にわたりＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。これらの条件下で、トランスフェクトされた蛍光遺伝子コピーの数（１つの細胞当たり各蛍光レポーター遺伝子の２９１１３±２１２個のコピー）は、組み合わされたＳＧＶベクタープラスミドＤＮＡ ６００ｎｇを使用してトランスフェクトした遺伝子コピーの数（１つの細胞当たり各レポーターの２７４８９個のコピー、上記を参照されたい）とほぼ同等であった。従って、用いた同一プラスミドＤＮＡ負荷でのＳＧＶ発現データから、低強度合成プロモーター、中強度合成プロモーター、及び高強度合成プロモーターの予期されるＲＴＡはそれぞれ、５５２（±２０）、２９１５（±２８４）、及び４３８４（±８７４）、１：５．３：７．９の比であった。各ＭＧＥＶに関して、レポーターｍＲＮＡコピーをｑＲＴ－ＰＣＲで測定し、ＳＧＶ外部校正を使用してＲＴＡを得た（図１Ｎ）。これらのデータを、表４に列挙する。単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）の外部校正曲線に対して内挿して（図１Ｎ）レポーター発現の直接比較を可能にすることにより、ＲＴＡを得た。ＭＧＥＶバリアントの各位置で利用された低強度プロモーター、中強度プロモーター、及び高強度プロモーターをそれぞれ、「Ｌ」、「Ｍ」、及び「Ｈ」と略した。２７種のＭＧＥＶバリアント全体にわたる１位、２位、及び３位の平均ＲＴＡを算出し、１位に対して２位及び３位の平均ｍＲＴＡを正規化することにより、全体的な遺伝子位置効果の比を得た。
【0068】
【表4】
【0069】
【表5】
【0070】
観察される一般的な傾向は、ＳＧＶを使用して観察されたものと比較して、レポーター遺伝子転写が実質的に全体的に抑制された（ＳＧＶにより媒介される転写と比較して６９．９％の全体平均）。この抑制は、図２Ｂにおいて合成プロモーター毎に定量化されており、相対的なプロモーター媒介性転写活性の比較を図２Ｃに示す（両方の場合で、利用された全ての組み合わせにわたる）。これらのデータから、ＭＧＥＶ環境では、合成プロモーターにより、一般的に、予期される転写傾向が得られた（即ち、Ｌ＜Ｍ＜Ｈ；図２Ｃ）が、実際の比（１：２．８：６．７）は、ＳＧＶを使用して得られたもの（１：５．３：７．９）とは異なっていたことが分かる。まとめると、このデータから、中強度合成プロモーターのより顕著な抑制が分かる（図２Ｂ）。全体的な転写抑制は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡポリＩＩ）転写伸長後のプラスミド立体構造が上流の遺伝子転写を妨げる可能性がある負の超らせんによるプラスミド構造の変化に起因している可能性があることが推測され得る。加えて、固定されたタンデム系列におけるプロモーターの潜在的な双方向挙動は、アンチセンス転写と、ＲＮＡポリＩＩとの衝突を引き起こし得、次いで、隣接するＴＵの転写が阻害される。これら両方のメカニズムは、ＭＧＥＶ環境内での全体的抑制に同時に寄与している可能性がある。
【0071】
ベクターのライブラリ内の遺伝子位置効果を、１位、２位、及び３位に由来する全ＲＴＡの合計（即ち、全合成プロモーターの組み合わせの使用：表４）により単純に定量化した。これにより、レポーターの最大発現が１位で起こることが明らかとなった。１位と比較して、２位及び３位はそれぞれ、レポーター遺伝子転写の１５％及び１４％の減少を示した。従って、遺伝子位置効果は、ＲＮＡポリＩＩ伸長複合体の隣接するＴＵへの転写リードスルーを引き起こす上流のＴＵの非効率的な転写終結の結果であり得る。これにより、転写開始を阻害するＴＵのプロモーター領域における立体障害により、転写因子の結合又は開始前複合体の構築が制限される。このメカニズムは、閉塞により媒介される転写干渉（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と称される。或いは、ＲＮＡポリＩＩ伸長複合体はまた、下流のプロモーターのエンハンサー領域に結合している転写因子をも除去し得、その結果、転写が抑制される。標準的なベクター又はレンチウイルスベクター内でタンデムに配置された他の二重プロモーター系もまた、両方とも転写干渉により引き起こされる予測不能な遺伝子発現を示している。同様に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で合成経路を構築する三重遺伝子カセットもまた、転写干渉に起因する予期される発現との実質的な矛盾を示した。
【0072】
実施例３：多重遺伝子ベクター環境における組換え遺伝子転写での偏り
２７種のＭＧＥＶバリアントのそれぞれに関して観察されたＲＴＡ（表４）をさらに分析して、多重遺伝子環境内における組換え遺伝子転写での特定の偏りを識別した。このことを、ＭＧＥＶ内での「観察されたＲＴＡ」と、ほぼ同等の遺伝子コピーでのＳＧＶ共発現に由来する「予期されるＲＴＡ」のセットとを比較することにより達成した。
２７種のＭＧＥＶバリアントのそれぞれに関して観察されたＲＴＡ（表４）をさらに分析して、多重遺伝子環境内における組換え遺伝子転写での特定の偏りを識別した。このことを、ＭＧＥＶ内での「観察されたＲＴＡ」と、ほぼ同等の遺伝子コピーでのＳＧＶ共発現に由来する「予期されるＲＴＡ」のセットとを比較することにより達成した。
【0073】
ＭＧＥＶ内の各位置で観察されたＲＴＡを、図３に示す三次元プロット（各軸が、ＭＧＥＶ内の３箇所の位置の内の１箇所を表している）内の予期されるＲＴＡカウンターパートと比較した。図３Ａは、予期されるＲＴＡの立方体構造（５５１．９～４３８３．５の範囲）と比較された、観察されたＲＴＡのクラスター化立体構造（９６．２～２６５５．２の範囲）により示されるように、各ＭＧＥＶの全ての位置における実質的な転写抑制をあらためて示す。ＭＧＥＶ ＲＴＡのクラスター（図３Ｂ）は、非対照的であり、２７種の個別のバリアント（７３４．０の平均ＲＴＡ）全体において２位で観察される全体的な転写活性がより低く、１位及び３位と比較して全体的な転写抑制の増加が再度強調された。図３Ｂは、一連の潜在的な転写干渉メカニズムを説明する低強度合成プロモーター、中強度合成プロモーター、及び高強度合成プロモーターを利用する固定されたタンデム系列における３種の組換え遺伝子の達成可能な転写活性のために経験的に導かれる設計空間を示す。
【0074】
ＭＧＥＶライブラリ内の他の転写抑制傾向を特定するために、観察された全体的な遺伝子位置効果（２位及び３位それぞれでの１５％及び１４％抑制）を、各ＭＧＥＶの２位及び３位で検出されたＲＴＡに関して正規化した。ＭＧＥＶ発現からのこれらの位置効果の正規化ＲＴＡを、予期されるＲＴＡ（ほぼ同等の遺伝子コピーでのＳＧＶ共発現から得られる）と比較し、各位置での転写抑制の割合を得た。転写抑制の分布は、位置に関係なく、発現の大部分（９０．１％）が５０％超抑制されており、且つ転写抑制の中央値が６８．６％であることを示した（図４Ａ）。
【0075】
位置又はプロモーターに特異的な遺伝子抑制傾向を、図４Ｂで強調した。カラー勾配ヒートマップは、ＭＧＥＶライブラリ全体わたり各位置に関する予期されるＲＴＡに対する抑制の程度を示す。中強度合成プロモーターは、抑制された活性を一貫して示しており、平均転写抑制が７６．５％であった（観察された平均転写抑制と比べて１２％高かった）。逆に、低強度合成プロモーターは、高強度の合成プロモーターと隣接した場合に、転写活性の増強を示し、抑制の程度（４８．２％）は、平均（６４．５％）と比べて低かった。プロモーター活性は、２位で特に高く、平均転写抑制は３１．７％であった。一般に、高強度プロモーターは、特定の転写傾向を全く示さなかったが、広範な環境特異的変動が明らかであり、抑制が３９．４～８１．９％の範囲であった。
【0076】
（全体的抑制の考慮後の）プロモーター活性の逸脱は、プロモータースケルチング（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｑｕｅｌｃｈｉｎｇ）が転写に影響を及ぼしている可能性があるＭＧＥＶ内の局所的環境に対して環境特異的である。プロモータースケルチングは、遺伝子発現活性の偏りをもたらすプロモーターバリアント間の転写の調節に関与する転写因子及び関連補因子の競合を指す。低強度合成プロモーター、中強度合成プロモーター、及び高強度合成プロモーターのＴＦＲＥ組成を参照すると、６種全ての転写因子及びその同族ＴＦＲＥが、プロモーターバリアント間で共有されている（図１Ａ）。中強度合成プロモーターは、転写因子の競合の増加を示す低強度合成プロモーター（ＥＢＳ及びＣ／ＥＢＰ）並びに高強度合成プロモーター（ＧＣ－ボックス、ＡＲＥ、ＤＲＥ、ＥＢＳ、ＮＦｋＢ）の両方とＴＦＲＥブロックを共有する。このことは、中強度プロモーターの抑制状態がスケルチングにより潜在的に引き起こされることを示唆するだろう。高強度合成プロモーターバリアントに隣接している低強度合成プロモーターの活性の増強は、転写因子間の相互作用に起因している可能性がある。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図1-6】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】