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▶ キエシ・フアルマチエウテイチ・ソチエタ・ペル・アチオニの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-14
(54)【発明の名称】脳損傷のための併用療法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/16 20060101AFI20240307BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240307BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240307BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240307BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20240307BHJP
A61K 47/20 20060101ALI20240307BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240307BHJP
C07K 14/48 20060101ALN20240307BHJP
【ＦＩ】
A61K38/16
A61P25/00
A61P9/10
A61K9/08
A61K47/12
A61K47/20
A61P43/00 121
C07K14/48 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023558354
(86)(22)【出願日】2022-03-25
(85)【翻訳文提出日】2023-11-21
(86)【国際出願番号】 EP2022057881
(87)【国際公開番号】W WO2022200550
(87)【国際公開日】2022-09-29
(31)【優先権主張番号】21165013.0
(32)【優先日】2021-03-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591095465
【氏名又は名称】キエシ・フアルマチエウテイチ・ソチエタ・ペル・アチオニ
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(74)【代理人】
【識別番号】100221578
【弁理士】
【氏名又は名称】林 康次郎
(72)【発明者】
【氏名】インビンボ，ブルーノ ピエトロ
(72)【発明者】
【氏名】ビッレッティ，ジーノ
(72)【発明者】
【氏名】ファッキネッティ，ファブリツィオ
(72)【発明者】
【氏名】ランドゥッチ，エリーザ
(72)【発明者】
【氏名】マンゴ，ダリラ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076CC01
4C076CC11
4C076DD41Z
4C076DD55Z
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA21
4C084CA59
4C084NA05
4C084ZA021
4C084ZA022
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZA451
4C084ZA452
4C084ZC751
4C084ZC752
4H045AA30
4H045BA09
4H045DA21
4H045EA20
4H045EA21
(57)【要約】
本発明は、脳損傷、特に、限定されないが、低酸素虚血性脳症を含む虚血性および／または低酸素脳傷害の処置および予防における使用のための、併用療法に関し、好ましくは正期産または早産の新生児(neonate)対象における、併用療法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳動物対象における外傷性脳傷害または虚血性低酸素脳傷害の処置および／または予防に使用するための、配列番号１のポリペプチドと低体温法の併用。
【請求項2】
ポリペプチドが２０μｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１に記載の使用のための併用。
【請求項3】
外傷性脳傷害が低酸素虚血性脳症である、請求項１または２に記載の使用のための併用。
【請求項4】
哺乳動物対象がヒトであり、好ましくは対象が新生児(neonate)または新生児(newborn)対象または早産の新生児(newborn)対象であり、好ましくは新生児(neonate)または新生児(newborn)対象が中程度から重度の低酸素虚血性脳症の影響を受けている、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための併用。
【請求項5】
ポリペプチドが鼻腔内投与されるか、またはポリペプチドが、好ましくは１～３０日、好ましくは２～１４日の期間、反復して投与される、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための併用。
【請求項6】
ポリペプチドが１日１～７回で反復して投与されるか、またはポリペプチドが一方または両方の鼻孔に投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための併用。
【請求項7】
ポリペプチドが０.０１～１.００ｍｇ／日の用量で投与される、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための併用。
【請求項8】
ポリペプチドが０.０６～０.１２ｍｇ／日の用量で投与される、請求項７に記載の使用のための併用。
【請求項9】
ポリペプチドが０.０６ｍｇ／日の用量で投与される、請求項７に記載の使用のための併用。
【請求項10】
ポリペプチドが反復して投与され、各々の用量が０.０１～１.００ｍｇ／日である、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のための併用。
【請求項11】
ポリペプチドの各々の用量が０.０６～０.１２ｍｇ／日である、請求項１０に記載の使用のための併用。
【請求項12】
各々の用量が０.０６ｍｇ／日である、請求項１０に記載の使用のための併用。
【請求項13】
ポリペプチドが脳傷害後約１時間～２４時間以内に投与される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の使用のための併用。
【請求項14】
前記ポリペプチドが、酢酸緩衝液および／またはメチオニンを含む組成物中に含まれる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の使用のための併用。
【請求項15】
ポリペプチドが低体温法と同時に投与される、および／または低体温法後２４時間以内に投与される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の使用のための併用。
【請求項16】
低体温法が低酸素虚血性(ＨＩ)傷害後１時間～１０時間以内に開始される、好ましくは低体温法が低酸素虚血性(ＨＩ)傷害後２時間～８時間以内に開始される、好ましくは低体温法が低酸素虚血性(ＨＩ)傷害後４時間～６時間以内に開始される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の使用のための併用。
【請求項17】
低体温法が低酸素虚血性(ＨＩ)傷害後約１～約７２時間維持される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の使用のための併用。
【請求項18】
哺乳動物の体温が約３２℃～約３６℃の温度で維持される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の使用のための併用。
【請求項19】
哺乳動物の体温が約３２℃～約３５℃の温度で維持される、請求項１８に記載の使用のための併用。
【請求項20】
ポリペプチドが０.０６～０.１２ｍｇ／日の用量で投与され、哺乳動物の体温が約３２℃～約３５℃の温度で維持される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の使用のための併用。
【請求項21】
ポリペプチドが２０μｇ／ｋｇの用量で投与され、哺乳動物の体温が約３２℃～約３５℃の温度で維持される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の使用のための併用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、脳損傷、特に、限定されないが、低酸素虚血性脳症を含む虚血性および／または低酸素脳傷害の処置および予防における使用のための、併用療法に関し、好ましくは正期産または早産の新生児(neonate)対象における、併用療法に関する。
【背景技術】
【0002】
神経増殖因子(ＮＧＦまたはｈＮＧＦ)は神経活性タンパク質であり、その発見にはノーベル医学賞(1986年、Rita Levi-Montalcini)が与えられた。数十年にわたり、特に慢性／変性疾患において、その治療可能性が広く研究されてきた。近年、組換えヒトＮＧＦ(ｒｈＮＧＦ)の眼用製剤が、希少な眼疾患である神経栄養性角膜炎の処置のために、ＥＭＡおよびＦＤＡにより承認された。中枢神経系(ＣＮＳ)の急性病変におけるｈＮＧＦの神経保護能についての研究は少ない。いくつかの科学出版物では、内因性神経栄養因子の産生不足が、新生児(neonate)低酸素虚血性損傷後に見られる長期的な神経障害の重症度を決定する一因となる可能性があることが示されており(Wang et al., Int J Neurosci 2013; 123: 191-195)、病変の急性期にそれらを投与することが示唆されている（Acta Cir Bras 2017; 32: 270-279, Int J Clin Exp Med 2013; 6: 951-955)。特に、ＮＧＦ投与は、幼少期に評価される複雑な行動の発達と成熟における欠損を制限する。残念ながら、ｈＮＧＦには強力な痛覚過敏作用もある(Nat Med 1995; 1: 774-780)。(野生型)ＮＧＦは、(ａ)神経細胞の生存を促進する受容体チロシンキナーゼＡ(ＴｒｋＡ)および(ｂ)細胞死の制御に関与するｐ７５ニューロトロフィン受容体という２つの別個の受容体に結合することで標的細胞に影響を及ぼすことが知られているため(Mesentier-Louro et al., 2017, Int. J. Mol. Sci., vol. 18(98))、視神経挫滅後の野生型ＮＧＦが有するポリペプチド配列もまた、アポトーシスの刺激により網膜変性症を悪化させる効果を有する可能性がある。Mesentier-Louro et al., 2018, Mol. Neurobiol., vol. 56, p. 1056-1069を参照。野生型ヒトＮＧＦの残基Ｒ１００がＮＧＦのｐ７５への結合に関与し、その残基の変異がｐ７５への結合に影響することもまた知られており、例えば国際公開第２００８／００６８９３Ａ１号を参照されたい。野生型ＮＧＦとは対照的に、本発明のポリペプチドであるｈＮＧＦは、ｐ７５に対してより低い結合親和性を有する(例えば、Malerba et al., 2015, PlosOne, 10(9): e0136425を参照)。ヒトＮＧＦ Ｐ６１ＳＲ１００Ｅは、ＣＨＦ６４６７(配列番号１)とも命名された配列番号１のポリペプチドに対応する。
【0003】
低酸素虚血性脳症(ＨＩＥ)または新生児仮死は、重篤な神経障害および周産期死亡の主な原因である。西欧および米国において、その発生率は生産児１,０００人中１.５～２例と推定され、未熟児での有病率が高い(Pediatr Res 2013; 74, Suppl 1, 50-72)。ＨＩＥに続く神経細胞の死滅は、プログラムされた細胞死メカニズムが介在するオートファジーにより、または最も可能性が高いのは、連続したアポトーシス－ネクローシス細胞死により生じ(Ann Neurol 2011; 69: 743-758)、これは興奮毒性グルタミン酸の放出、ＮＭＤＡおよびＡＭＰＡ受容体の活性化、細胞内Ｃａ２＋過負荷、ミトコンドリア障害、酸化ストレス、カスパーゼ活性化、炎症を含む一連の事象によって引き起こされる(Lancet Neurol 2011; 10: 372-382)。
【0004】
疑うまでもなく、ＨＩ傷害後の脳損傷は、複数の寄与するメカニズムと経路を持つ複雑な過程であり、早期損傷と遅延損傷の両方をもたらす(Patel, S. et al. (2014). Biochem. Soc. Trans. 42, 564-568)。したがって、現在の標準的な治療である治療的低体温法に追加すべき新規処置が、神経保護を高めるために緊急に必要とされている(Davidson, J. O., et al., (2015). Front. Neurol. 6.)。さらに、治療的低体温法が重度の低酸素虚血性脳症より中程度の低酸素虚血性脳症に効果的であるという根拠が存在する(Sabir, H., et al., (2012). Stroke 43, 3364-3370)。新生児(neonatal)脳損傷の主な病原性因子の一つは、中枢および末梢免疫系の活性化により誘発される炎症であるとの認識が増え続けている(Hagberg et al., (2015). Nat. Rev. Neurol. 11, 192-208)。免疫応答が数分以内に誘発され、傷害後数週間、さらには数か月間継続し得る(Fleiss et al., 2015 Dev. Med. Child Neurol. 57, 17-28)。低酸素虚血性傷害後のゴールドスタンダード介入である低体温法は、全ての処置された新生児(newborn)において有益ではない(Bainbridge et al., 2012. Brain 136, 90-105)。神経増殖因子(ＮＧＦ)は、そのシグナル伝達受容体であるｔｒｋＡを発現する特定の神経細胞を多様な障害から保護することが示されている(Holtzman et al., 1995 J. Neurosci. 15)。特に、脳の発達においては、ＮＧＦが神経細胞以外にも及ぶ神経保護効果を有することを示すデータが存在する(Fodelianaki et al., 2019 Exp. Cell Res. 377)。実際に、ＮＧＦは新生児(newborn)低酸素虚血性脳症の動物モデルにおいて神経保護効果を有し、新生児(neonate)の脳を低酸素虚血性傷害から保護する有望な物質であることが以前から示唆されている(Holtzman et al., 1996, Ann. Neurol. 39. doi:10.1002/ana.410390117)。
【0005】
治療的低体温法は、中程度から重篤な低酸素虚血性脳症(ＨＩＥ)を有する新生児(neonate)における生存率を改善し、かつ神経発達の後遺症を軽減するための標準的な治療である。出生後６時間の治療ウィンドウ内に開始する、選択的な頭部冷却または全身冷却により、約７２時間にわたり中心温度を３３.５℃にすることにより、ＨＩＥを有する新生児(neonate)の生存率と神経学的転帰が改善する(J Pediatr 2015; 91: S78-S83)。複数の低体温治療温度を比較した前臨床研究は比較的少ないが、近年、ＨＩＥの新生仔(neonate)ラットモデルにおいて、３３.５℃未満の冷却はさらなる神経保護をもたらさないと考えられるため、今後の臨床試験では比較的穏和な冷却を考慮すべきであるという提案がされている(Sci Rep 2016; 6: 23430)。低体温療法は、大きな合併症とは関連しないが、比較的少ない割合のＨＩＥを有する乳児にのみ有益であると考えられる(Int J Mol. Sci 2015; 16: 22368-22401)。具体的には、治療的低体温法を用いた処置は現在、正期産または正期産に近い新生児(newborn)(＞１８００ｇ)のために確保されており、通常、特定の専門知識と設備を有するリファレンスセンターに限定されている。
【0006】
国際公開第２０１８０８７６５６号は、鼻腔内投与による外傷性脳損傷、特に、外傷性脳傷害または限定されないが、低酸素虚血性脳症を含む虚血性低酸素脳傷害の処置に使用するための、ＮＧＦまたはＮＧＦ様活性を有する分子を含む医薬組成物に関する。
【0007】
Ｈｏｕら(Chinese Journal of Primary Medicine and Pharmacy 2017;24(3):338-341)は、新生児(neonate)の中等度の重度ＨＩＥの処置のために頭部低体温法とマウス神経増殖因子療法を組み合わせると、保護作用が得られることを報告している。上記のとおり、新生児仮死の処置における低体温法の使用は、先行文献に多く記載されている(例えば、Volpe, 2001; Gunn et al, 2000を参照)。しかしながら、現在までのところ、低体温法と変異型ＮＧＦ、ＣＨＦ６４６７の投与が組み合わせて使用され得るという教示や示唆は、当技術分野ではなされていない。また、このような併用療法が、得られた神経保護効果におけるこのような驚くべき予期せぬ増強をもたらし得るという示唆もない。
【0008】
したがって、ＨＩＥの処置のための薬剤の必要性が現在も存在する。特に、低体温法の効果を増強することのできる薬剤は、現在の臨床診療にきわめて高い価値を加え得る。
【発明の概要】
【0009】
ＣＨＦ６４６７(ｈＮＧＦｐ、配列番号１)は野生型ヒト神経成長因子(ＮＧＦ)と同様の神経栄養活性を有するが、その疼痛感作活性は１０倍低い(Cattaneo, A., and Capsoni, S. (2019). Pharmacol. Res. 139. doi:10.1016/j.phrs.2018.10.028.)。
【化1】
【0010】
本発明は、哺乳動物対象における外傷性脳傷害または虚血性低酸素脳傷害の処置および／または予防に使用するための、配列番号１のポリペプチドおよび低体温法の併用を提供する。
【0011】
好ましい実施態様において、ポリペプチドは、２０μｇ／ｋｇの用量で投与される。
【0012】
好ましい実施態様において、外傷性脳傷害は低酸素虚血性脳症である。
【0013】
好ましい実施態様において、哺乳動物対象はヒトであり、好ましくは対象は新生児(neonate)または新生児(newborn)または早産新生児対象であり、好ましくは新生児(neonate)または新生児(newborn)対象は中程度から重度の低酸素虚血性脳症に罹患している。
【0014】
好ましい実施態様において、ポリペプチドは鼻腔内投与されるか、またはポリペプチドは、好ましくは１～３０日、好ましくは２～１４日の期間、反復して投与される。処置のサイクルの反復もまた、予測される。
【0015】
好ましい実施態様において、ポリペプチドは反復して１～７回／日投与されるか、またはポリペプチドは一方または両方の鼻孔に投与される。
【0016】
好ましい実施態様において、ポリペプチドは０.０１～１.００ｍｇ／日の用量で、好ましくは０.０６～０.１２ｍｇ／日の用量で、好ましくは０.０６ｍｇ／日の用量で投与される。
【0017】
好ましくは、０.０６ｍｇ／日の量は、約３ｋｇの体重の新生児(neonate)または新生児(newborn)に対するものである。
【0018】
好ましい用量は、特に、より体重が重い対象については、３～３３３μｇ／ｋｇである。
【0019】
好ましい用量は、約２０μｇ／ｋｇ～約４０μｇ／ｋｇ、好ましくは２０μｇ／ｋｇである。
【0020】
好ましい実施態様において、ポリペプチドが反復して投与されるとき、ポリペプチドの各用量は０.０１～１.００ｍｇ／日、好ましくはポリペプチドの各用量は０.０６～０.１２ｍｇ／日、好ましくはポリペプチドの各用量は０.０６ｍｇ／日である。
【0021】
好ましい実施態様において、ポリペプチドは、脳傷害後１時間～２４時間以内に投与される。
【0022】
好ましい実施態様において、ポリペプチドは、酢酸塩緩衝液および／またはメチオニンを含む組成物中に含まれる。
【0023】
好ましい実施態様において、ポリペプチドは、低体温法と同時に、および／または低体温法後２４時間以内に投与される。
【0024】
好ましい実施態様において、低体温法は低酸素虚血性(ＨＩ)傷害後１時間～１０時間以内に開始され、好ましくは、低体温法は低酸素虚血性(ＨＩ)傷害後２時間～８時間以内に開始され、好ましくは、低体温法は低酸素虚血性(ＨＩ)傷害後４時間～６時間以内に開始される。
【0025】
好ましい実施態様において、低体温法は、低酸素虚血性(ＨＩ)傷害後約１時間～約７２時間、好ましくは少なくとも約４時間、より好ましくは少なくとも約６時間、より好ましくは少なくとも約１２時間維持される。
【0026】
好ましくは、低体温法は出生後、少なくとも約４時間、より好ましくは少なくとも約６時間または１２時間維持される。
【0027】
好ましい実施態様において、哺乳動物の体温は約３２℃～約３６℃の温度で、好ましくは約３２℃～約３５℃の温度で維持される。
【0028】
本発明の別の態様は：
(ａ)分娩前および／または分娩中に哺乳動物の母体に治療有効量のＣＨＦ６４６７を投与すること；および
(ｂ)出生後に哺乳動物を低体温法に供すること
による、処置を必要とする哺乳動物における新生児仮死の処置に関する。
(ａ)分娩前および／または分娩中に哺乳動物の母体に治療有効量のＣＨＦ６４６７を投与すること；および
(ｂ)出生後に哺乳動物を低体温法に供すること
による、処置を必要とする哺乳動物における新生児仮死の処置に関する。
【0029】
低体温法は、体温を意図的に維持するのではなく、体温が下がるに任せることによって受動的に生じ得る。新生児は体温が変化しやすいため、急速に周囲の温度になる。あるいは、意図的に環境温度を低下させることで、患者を積極的に低体温にすることもできる。
【0030】
本発明のさらなる態様は：
(ａ)治療有効量のＣＨＦ６４６７を哺乳動物に投与すること；および
(ｂ)哺乳動物を低体温法または低体温条件に供すること
による、処置を必要とする哺乳動物における新生児仮死の処置に関する。
(ａ)治療有効量のＣＨＦ６４６７を哺乳動物に投与すること；および
(ｂ)哺乳動物を低体温法または低体温条件に供すること
による、処置を必要とする哺乳動物における新生児仮死の処置に関する。
【0031】
好ましい実施態様において、哺乳動物は、生後４週間内の新生児(newborn)対象である。より好ましくは、哺乳動物は生後２週間内、さらにより好ましくは生後１週間内のものである。
【0032】
好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【0033】
本発明の第二の態様についての好ましい実施態様は、第一の態様についての上記実施態様と同様である。
【0034】
本発明の別の態様は、処置を必要とする哺乳動物に低体温法と組み合わせて治療有効量のキセノンを投与することによる、哺乳動物における新生児仮死の処置に関する。
【0035】
本発明のさらに別の態様は、新生児仮死の処置のための医薬の製造におけるＣＨＦ６４６７の使用であって、前記処置がＣＨＦ６４６７を低体温法と組み合わせて同時に、逐次的にまたは別々に対象へ投与することを含むものである、使用に関する。
【0036】
本発明のさらなる態様は、新生児仮死を処置するための、ＣＨＦ６４６７と低体温法との組合せの使用に関する。
【0037】
好ましい実施態様において、哺乳動物対象における外傷性脳傷害または虚血性低酸素脳傷害の処置および／または予防における使用のための併用において、ポリペプチドは０.０６～０.１２ｍｇ／日の用量で投与され、哺乳動物の体温は約３２℃～約３５℃に維持される。
【0038】
好ましい実施態様において、哺乳動物対象における外傷性脳傷害または虚血性低酸素脳傷害の処置および／または予防における使用のための併用において、ポリペプチドは約２０μｇ／ｋｇ～４０μｇ／ｋｇの用量で投与され、哺乳動物の体温は約３２℃～約３５℃の温度で維持される。
【0039】
次の図面および非限定的な例は、範囲を限定することなく、本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】ＣＡ１海馬シナプスでのベースライン伝達に対するＣＨＦ６４６７の効果。
【図2】ＣＨＦ６４６７はＯＧＤにより誘発される低下を回復させた(予防的措置)。正規化されたプールデータは、興奮性シナプス後場電位(ｆＥＰＳＰ)に対するＯＧＤの影響、およびＯＧＤ中に異なる濃度(０.０３および０.１μｇ／ｍＬ)で灌流されたＣＨＦ６４６７の保護効果を示す。
【図3】ＯＧＤにより誘発されるＥＰＳＣ低下は、ＣＨＦ６４６７灌流により回復する(治療的措置)。パネルＡは、ＯＧＤのみ(黒丸)およびＯＧＤ＋ＣＨＦ６４６７(白丸)で処置した後の正規化されたＥＰＳＣデータの時間経過を示す。ヒストグラムは、ＯＧＤのみ、およびＯＧＤ＋ＣＨＦ６４６７で処置した後の最後の１０分間の記録における平均の正規化ＥＰＳＣデータを示す。パネルＢは、ＯＧＤが存在しないとき、ＣＨＦ６４６７はベースライン伝達に全く変化を誘発しないことを示す。
【図4】ＯＧＤに対するＣＨＦ６４６７と低体温法の相乗効果。１５分間のＯＧＤの後の低体温法およびＣＨＦ６４６７灌流の相乗効果を示す、正規化されたプールデータ。
【図5】新生児低酸素虚血性脳症のラットモデルの実験プロトコル図。ＴＴＣ＝塩化２，３，５－トリフェニルテトラゾリウム。
【図6】１０日齢での低酸素虚血性傷害後７２時間の幼若ラットにおける、対数変換した脳梗塞体積に対する鼻腔内投与ＣＨＦ６４６７(２０および４０μｇ／ｋｇ)単独、および低体温法との組み合わせの効果。動物の数を各カラム上に示す。
【図7】擬似処置した、ビークル処置低酸素虚血性脳症(ＨＩＥ)、ＣＨＦ６４６７、２０μｇ／ｋｇで処置したＨＩＥ(ＨＩＥ＋ＣＨＦ ２０μｇ／ｍｌ)、低体温法で処置したＨＩＥ(ＨＩＥ＋ＩＰＯ)、ＣＨＦ６４６７および低体温法で処置したＨＩＥ(ＨＩＥ＋ＩＰＯ＋ＣＨＦ)のラットサイトカインおよびケモカインの一群の海馬ｍＲＮＡレベル。平均±標準誤差(ＳＥＭ)とともに示した散布図。＊＊ｐ＜０.０１および＊ｐ＜０.０５対ＨＩＥ。
【図8】擬似処置、低酸素虚血性脳症(ＨＩＥ)、ＨＩＥをＣＨＦ６４６７、２０μｇ／ｋｇで処置(ＨＩＥ＋ＣＨＦ２０μｇ／ｍｌ)、ＨＩＥを低体温法で処置(ＨＩＥ＋ＩＰＯ)、ＨＩＥをＣＨＦ６４６７および低体温法で処置(ＨＩＥ＋ＩＰＯ＋ＣＨＦ)したときのラット集団のサイトカインおよびケモカインの皮質ｍＲＮＡレベル。平均±標準誤差(ＳＥＭ)とともに示した散布)。＊＊ｐ＜０.０１および＊ｐ＜０.０５対ＨＩＥ。
【図9】処置群単位のｌｏｇ１０変換した脳梗塞体積の平均の統計的解析。
【図10】ＳＳＳＨＰＩＦＨＲ(配列番号２)ペプチドの定量により決定した、対照幼若ラットにおける鼻腔内投与後のＣＨＦ６４６７の脳浸透。
【図11】低酸素虚血性傷害の幼若ラットにおける鼻腔内投与後のＣＨＦ６４６７の脳浸透。種々のラット脳領域における、ＣＨＦ６４６７特異的ペプチド、ＳＳＳＨＰＩＦＨＲ(配列番号２)(Ａ)およびＱＡＡＷＥＦＩＲ(配列番号３)(Ｂ)および非特異的ペプチド、ＱＹＦＦＥＴＫ(配列番号４)(Ｃ)の軽対重比。
【発明を実施するための形態】
【0041】
発明の詳細な説明
低酸素虚血性脳症(ＨＩＥ)のインビトロおよびインビボ実験モデルを用いて、ＣＨ６４６７または配列番号１のポリペプチドの神経保護効果を試験した。低酸素虚血性脳損傷の確立されたインビトロモデルである酸素－グルコース欠乏(ＯＧＤ)させた急性海馬スライスにおいて、ＣＨＦ６４６７は異常な興奮性シナプス後電流(ＥＰＳＣ)を有意に抑制した。予期せぬことに、ＣＨＦ６４６７と低体温法の併用は異常ＥＰＳＣを完全に回復させた(図４)。新生児低酸素虚血性脳症の確立されたモデルである、左総頸動脈永久閉塞後に低酸素状態にした新生仔(neonate)ラットにおいて、ＣＨＦ６４６７(２０および４０μｇ／ｋｇ)の鼻腔内投与は、ビークル処置した動物と比較して、脳梗塞体積を有意に減少させた。驚くべきことに、ＣＨＦ６４６７と低体温法の併用は、平熱のビークル処置した動物と比較して、脳梗塞体積を８６％まで劇的に減少させた。予期せぬことに、ＣＨＦ６４６７と低体温法の併用の神経保護効果は、単剤(ＣＨＦ６４６７または低体温法)のみのものより極めて高く、相乗効果を示した(図６)。特に、インビボでの好ましい用量(２０μｇ／ｋｇ)のＣＨＦ６４６７の効果は、神経保護効果の提供において、低体温法と相乗的であった。ＣＨＦ６４６７処置による死亡、臨床的徴候または体重減少は観察されず、ＣＨＦ６４６７の寛容性が高いことが示唆された。
低酸素虚血性脳症(ＨＩＥ)のインビトロおよびインビボ実験モデルを用いて、ＣＨ６４６７または配列番号１のポリペプチドの神経保護効果を試験した。低酸素虚血性脳損傷の確立されたインビトロモデルである酸素－グルコース欠乏(ＯＧＤ)させた急性海馬スライスにおいて、ＣＨＦ６４６７は異常な興奮性シナプス後電流(ＥＰＳＣ)を有意に抑制した。予期せぬことに、ＣＨＦ６４６７と低体温法の併用は異常ＥＰＳＣを完全に回復させた(図４)。新生児低酸素虚血性脳症の確立されたモデルである、左総頸動脈永久閉塞後に低酸素状態にした新生仔(neonate)ラットにおいて、ＣＨＦ６４６７(２０および４０μｇ／ｋｇ)の鼻腔内投与は、ビークル処置した動物と比較して、脳梗塞体積を有意に減少させた。驚くべきことに、ＣＨＦ６４６７と低体温法の併用は、平熱のビークル処置した動物と比較して、脳梗塞体積を８６％まで劇的に減少させた。予期せぬことに、ＣＨＦ６４６７と低体温法の併用の神経保護効果は、単剤(ＣＨＦ６４６７または低体温法)のみのものより極めて高く、相乗効果を示した(図６)。特に、インビボでの好ましい用量(２０μｇ／ｋｇ)のＣＨＦ６４６７の効果は、神経保護効果の提供において、低体温法と相乗的であった。ＣＨＦ６４６７処置による死亡、臨床的徴候または体重減少は観察されず、ＣＨＦ６４６７の寛容性が高いことが示唆された。
【0042】
よって、本発明は、脳損傷、外傷性脳傷害または虚血性低酸素脳傷害、好ましくは低酸素虚血性脳症の処置における、ＣＨＦ６４６７と低体温法の併用を提供する。特にＣＨＦ６４６７および低体温法の併用は、下記の実験の部に報告されるとおり、特に適切な投与量が考慮されたとき、低体温法単独と比較して、中程度から重度の低酸素虚血性脳症の乳児および新生児(neonate)において、死亡率および重度の神経発達障害を有意に減少させ得る。
【0043】
さらに、ＣＨＦ６４６７単独または低体温法との組み合わせの、低酸素虚血性脳損傷状態にした仔ラットの皮質および海馬に対する一群の神経炎症マーカーもまた、試験した。
【0044】
海馬および前頭頭頂皮質におけるいくつかのサイトカインおよびケモカインのｍＲＮＡレベルの、擬似処置のラットと比較した顕著な増加が、低酸素虚血性傷害を受けたラットで測定された。ＣＨＦ６４６７(２０μｇ／ｋｇ、鼻腔内)は、低酸素虚血性傷害を受けたラットの海馬領域におけるいくつかの神経炎症マーカーの上方調節に有意に対抗したが、低体温法そのものはＣＨＦ６４６７ほど有効ではなかった。皮質において、ＣＨＦ６４６７(２０μｇ／ｋｇ)そのものは、低酸素虚血性傷害により誘発されたいくつかの神経炎症マーカーの上方調節に対抗するのに効果的であり、このような効果はたいくつかの場合低体温法との組み合わせにより増強された。
【0045】
本明細書で引用される文献(全ての特許、特許出願、科学出版、製造者の仕様書、説明書、発表などを含む)の各々は、上記のものまたは下記のものにかかわらず、その全体の参照により本明細書に包含させる。本明細書のいかなる内容も、本発明が特定の教示に先行する権利がないことを認めるもの、および／または共通の一般知識以外の特定の文献が当業者が実施するのに十分明確かつ完全な情報を含んでいることを認めるものとして解釈されるものではない。
【0046】
表現「および／または」、例えば「Ｘおよび／またはＹ」は、「ＸおよびＹ」または「ＸまたはＹ」を意味すると解されるものとし、かつ「および」、「または」および両方の意味(「および」または「または」)の明確な開示を提供すると考えられるものとする。
【0047】
特に示されない限り、用語「約(about)」、「約(ca.)」および「実質的に」は全て、「およそ」または「ほぼ」を意味し、本明細書に記載される数値または範囲の文脈において、好ましくは、記載または請求される数値または範囲の±１０％、より好ましくは±５％を指定する。
【0048】
特に示されない限り、用語「含む(comprise)」、または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などの変化形が、「含む(comprising)」により導入される一覧の要素に加えてさらなる要素が場合により存在してよいことを示すために、本明細書の文脈で使用される。しかしながら、それは用語「含む(comprising)」がさらなる要素が存在しない可能性を包含する、すなわち本実施態様は「含む(comprising)」が「からなる(consisting of)」の意味を有するものとして理解されることが、本発明の特定の実施態様として企図される。
【0049】
特に示されない限り、本発明に関する相対量の表示は重量／重量基準でされる。総称により特徴付けられる成分の相対量の表示は、前記の総称に含まれる全ての特定の変異体またはメンバーの総量を示すことを意味する。総称により定義される特定の成分が特定の相対量で存在し、かつその成分がそのvariantに含まれる特定の変異体またはメンバーであることがさらに特徴付けられるならば、その異体に含まれる成分の総相対量が特定の相対量を超えるように、その異体に含まれる他の変異体またはメンバーが追加的に存在しないことを意味し；より好ましくは、その異体に含まれる特定の変異体またはメンバーが全く存在しないことを意味する。
【0050】
文脈で特に示されない限り、用語、神経増殖因子は野生型ＮＧＦのみを示し、配列番号１のポリペプチドを含まない。
【0051】
用語「ＮＧＦムテイン」および「ＮＧＦのムテイン」、またはＮＧＦについての「そのムテイン」は、本明細書において相互交換可能に使用され、本明細書でさらに詳細に記載されるとおり、野生型ＮＧＦと比較して、少なくとも１つの変異により特徴付けられるポリペプチドをいう。配列番号１のポリペプチドはＮＧＦのムテインである。それは任意の種、好ましくは哺乳動物種を指すが、ヒトＮＧＦのムテインが常に好ましい。好ましくは、ＮＧＦのムテインは、ＮＧＦ、特にヒトＮＧＦと８０～９９.５％の配列同一性を有し、より好ましくは、ムテインは、ＮＧＦ、特にヒトＮＧＦと９０～９９％の配列同一性を有する。
【0052】
本明細書で使用される用語「低体温法」とは、受動的または能動的技術により、例えば体温を、好ましくは３～５℃低下させることにより、特定の対象(例えば、新生児(neonate)対象)を低体温条件に供することをいう。好ましい低体温法の温度は、３２℃～３６℃、好ましくは３２℃～３５℃、好ましくは３２℃または３３℃である。
【0053】
本明細書で使用される用語「同時に」は、ＣＨＦ６４６７が低体温法と同時に投与されることを意味するために使用されるが、一方で用語「組み合わせて」は、ＣＨＦ６４６７が、同時でないならば、ＣＨＦ６４６７および低体温法の両方が治療効果を示す時間枠内、すなわちそれらの両方が同一の時間枠で治療的に作用させるために利用可能である時間枠で、その後「逐次的に」投与されることを意味するために使用される。したがって、新生児(neonate)対象を低体温条件に曝露するとき、ＣＨＦ６４６７の循環半減期または標的組織滞留時間が、ＣＨＦ６４６７が治療有効量で存在するようなものであれば、「逐次的な」投与は、低体温法の前後５分以内、１０分以内または数時間以内でもよい。
【0054】
用語「患者」および「対象」は、本明細書において相互交換可能に使用され、特に本明細書に記載の眼障害により特徴付けられる患者／対象について使用される。
【0055】
本発明の内容において、用語「予防する」は広義に理解され、それは脳損傷の予防の開始のみならず、脳損傷の進行の予防も含む。特に、脳損傷および／または脳障害を含む障害の内容において、用語「予防する」はまた、脳損傷のさらなる進行を予防することを含む。
【0056】
本発明の内容において、用語「処置する」は広義に理解され、限定されないが、障害の症状の改善を含む。
【0057】
本発明によれば、「有効量」は単独の用量で、またはさらなる用量と合わせて所望の反応または所望の効果を達成する量または用量である。
【0058】
用語「薬学的に許容される」は、一般に、特定の物質が対象に、場合によりおよび好ましくは薬剤と組み合わせて投与され得て、その薬剤が使用される投与量で耐容できない有害作用を引き起こさないことを示す。
【0059】
用語「薬学的に許容される担体」および「薬学的に許容される賦形剤」は、生理学的に適合可能であり、かつ本明細書に記載の対象への投与に適切であるか、またはこのような投与に干渉しない溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのいずれか１以上を示すために使用される。このような薬学的に許容される担体は、限定されないが、水、食塩水、リン酸緩衝化食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、ポリソルベート８０等ならびにそれらの組み合わせの１以上を含む。特に液体医薬組成物については、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールもしくはソルビトールなどのポリアルコールまたは塩化ナトリウムを含むことが好ましいこともある。
【0060】
薬学的に許容される担体は、薬剤の保存期間や有効性を高める湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝液などの補助物質をさらに含み得る。薬学的に許容される担体は、典型的に、本発明による組成物に含まれる。
【0061】
用語「薬学的に活性な薬剤」とは、例えば、疾患または障害の症状の改善に有益である場合に対象への投与に使用され得る薬剤をいう。さらに、「薬学的に活性な薬剤」は、治療有効量で対象に投与されるとき、対象の状態または疾患状態に対して肯定的または有利な効果を有し得る。好ましくは、薬学的に活性な薬剤は治癒的特性を有し、疾患または障害の１以上の症状を改善、緩和、軽減、退行、発症を遅延または重症度を軽減するために投与され得る。薬学的に活性な薬剤は、予防特性を有し得て、疾患の発症遅延またはこのような疾患もしくは病態の重症度の軽減のために使用され得る。例えば、本発明の薬剤は、請求するとおり、嚢胞性線維症の処置のための薬学的な活性成分として考慮される。別の例において、薬学的に活性なタンパク質は、通常タンパク質を発現しないか、または所望のレベルで発現しない、またはタンパク質を正確に発現しない細胞または個体を処置するために使用され得て、例えば、薬学的に活性なタンパク質は、所望のタンパク質を供給することにより、変異または十分に高い発現の欠如を補い得る。用語「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」はタンパク質またはポリペプチド全体を含み、その薬学的に活性なフラグメントもまた示し得る。それはまた、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質のアナログを含む。
【0062】
本明細書で使用される用語「対象」および「患者」は、哺乳動物に関する。例えば、本発明の文脈における哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、限定されないが、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマなどを含む家畜動物、限定されないが、マウス、ラット、ウサギなどを含む実験動物、および動物園の動物のような捕獲された動物である。本明細書で使用される用語「対象」および「患者」は特に、ヒトを含む。対象(ヒトまたは動物)二対の染色体を有する；すなわち、対象は二倍体である。用語「患者」とは、ある状態を有する、ある状態を有するリスクがある、ある状態を有している、またはある状態を有すると予想される対象、および治療、例えば薬剤の投与に供され得る対象をいう。患者の状態は、慢性および／または急性であり得る。したがって、「患者」は治療に供されるおよび／または処置を必要とする対象として記載され得る。
【0063】
用語「治療」は広義に理解され、対象における状態を予防または処置するための目標を伴う対象の処置をいう。好ましい実施態様において、治療は、具体的には対象への薬剤の投与を含む。
【0064】
本明細書において「配列番号１のポリペプチド」とも記載される、本発明による薬剤についてより詳細に記載する。用語「配列番号１のポリペプチド」および類似の用語は本明細書において、配列番号１で定義されるアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび／または同等の生物学的活性を有する薬剤を示す。したがって、これらの用語の中には、このようなポリペプチドの機能的に等価な部分またはアナログも含まれる。ポリペプチドの生物学的に等価な部分の一例は、配列番号１のポリペプチドのドメインまたは部分配列であって、完全長の配列番号１のポリペプチドと実質的に同じ生物学的活性を発揮することを可能にする結合部位を含むドメインまたは部分配列、またはそのようなポリペプチドをコードする遺伝子を含み得る。用語「実質的に同一の生物活性」とは、実施例１～３に記載のアッセイにおいて、配列番号１のポリペプチドの活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を有する等価部分またはアナログポリペプチドをいう。ポリペプチドの生物学的に等価なアナログの一例は、配列番号１のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一部を含む融合タンパク質であり得るが、ポリペプチドの相同アナログでもあり得る。また、配列番号１のポリペプチドの特異的な生物活性を模倣する完全な合成分子は、「生物学的に等価なアナログ」を構成すると考えられる。
【0065】
より好ましくは、用語「配列番号１のポリペプチド」および類似の用語は本明細書において、配列番号１で定義されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを示し；このような薬剤は場合により、とりわけ配列番号１で定義されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質であってもよい。好ましくは、用語「配列番号１のポリペプチド」および類似の用語は本明細書において、配列番号１で定義されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを示し；本実施態様において、薬剤は配列番号１で定義される順序の１１８個のアミノ酸残基から成るポリペプチドから成る。本実施態様および他の実施態様において、ポリペプチドは、システイン(Ｃｙｓ、Ｃ)残基が互いに共有結合して分子内ジスルフィド架橋を形成するように、場合により１個または２個または３個のシステイン結合を有していてよい。システイン結合は好ましくは野生型ヒトＮＧＦにおけるものと同等である。
【0066】
本発明のポリペプチドは、場合により、さらなる翻訳後修飾によって特徴付けられていてよい。このような翻訳後修飾は、場合によりグリコシル化および／またはリン酸化を含んでよい。しかしながら、好ましくは、本発明のポリペプチドは、グリコシル化および／またはリン酸化されていない。実際、本明細書における試験例は、脳損傷、特に外傷性脳傷害または虚血性低酸素性脳傷害(限定されないが、低酸素虚血性脳症を含む)の治癒に対する有益な効果および有益な利益－有害作用の比を示し、それにより使用されたポリペプチドは、典型的に、グリコシル化および／またはリン酸化をもたらさない細菌における細胞質組換え発現によって得られたことを考慮すると、本発明の有益な効果がそのようなタイプの翻訳後修飾に依存しないと考えるのが妥当である。
【0067】
典型的に、本発明によるポリペプチドは、ポリペプチドを投与される対象により自発的に産生されない非天然ポリペプチドである。
【0068】
好ましくは、本発明によるポリペプチドは単離されたポリペプチドである。より好ましくは、本発明によるポリペプチドは本質的に宿主細胞タンパク質、分解生成物(例えば、ｄｅｓ－ｎｏｎａ変異体)およびプロテアーゼ(例えば、トリプシンなど)を含まない。本発明によるポリペプチドが本質的に宿主細胞タンパク質、分解生成物(例えば、ｄｅｓ－ｎｏｎａ変異体)およびプロテアーゼ(例えば、トリプシンなど)を含まないとき、それは「純粋なポリペプチド」とも称され得る。好ましくは、本発明によるポリペプチド純粋なポリペプチドとして投与される。より好ましくは、配列番号１から成る純粋なポリペプチドは、組成物中の総タンパク質に対して、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、より好ましくは９９.２％以上、より好ましくは９９.４％以上、より好ましくは９９.６％以上、より好ましくは９９.８％以上、より好ましくは９９.９％以上の重量パーセントを有する。最も好ましくは、本発明による純粋なポリペプチドは医薬品適正製造基準(ＧＭＰ)に適合した純度を有する。
【0069】
配列番号１から成るポリペプチドは、ヒト神経増殖因子(ＮＧＦ、野生型ヒトＮＧＦまたは野生型ＮＧＦとも称される)のアミノ酸配列と２つの箇所が異なる。本発明によるポリペプチドと野生型ポリペプチドの差異は、本明細書で詳細に記載され、かつ本明細書における試験例により支持されるとおり、脳損傷、特に外傷性脳傷害または限定されないが、低酸素虚血性脳症を含む虚血性低酸素脳傷害の処置または予防に顕著な効果を有し、副作用を有さない。
【0070】
ヒトＮＧＦのいくつかの変異体(ｈＮＧＦ変異体)の中で、変異体ヒトＮＧＦ Ｐ６１ＳＲ１００Ｅは、脳損傷の処置に最も有望であると考えられる。しかしながら、本発明による処置および／または予防の具体的な使用は、それらの文献により示されておらず、それらの文献はまた、それぞれのポリペプチドがヒトにおけるその医学的使用を可能にするのに十分な高純度で利用可能であることを示していない。したがって、本明細書において記載され、提供される本発明による使用のためのポリペプチドは、野生型ヒトＮＧＦを上回る、いくつかの予期しない利点を提供する。本発明による薬剤の投与は、脳梗塞体積の減少を引き起こし(例えば、実施例２を参照)、かつ前記投与は痛みを伴わない。
【0071】
配列番号１のポリペプチドは天然に存在せず、非天然ポリペプチドとも称され得る。本発明による薬剤は、野生型ＮＧＦではなく、特に野生型ヒトＮＧＦではない。
【0072】
好ましくは、本発明による非天然ポリペプチドは、高純度で提供される。場合により、ポリペプチドは水性媒体に可溶であってもよい。
【0073】
好ましくは、処置および／または予防はポリペプチドを投与されているまたは投与された対象において副作用または有害作用をもたらさない。好ましくは、本発明のポリペプチドの投与は、哺乳動物対象においてあらゆる望ましくない作用を引き起こさない。
【0074】
本文脈において好ましくは存在しないある副作用または有害作用は、痛覚過敏または疼痛である。本発明による処置および／または予防は哺乳動物対象において痛覚過敏をもたらさないことが特に好ましい。したがって、好ましくは、本発明の薬剤の投与は、あらゆる痛覚過敏反応症候群(疼痛)を誘発しない。
【0075】
痛みがないことは、単に、疼痛を伴う参照化合物(野生型ＮＧＦなど)の投与よりも心地よい(または不快感が少ない)処置をもたらすだけではなく、脳損傷、特に外傷性脳傷害または限定されないが、低酸素虚血性脳症それ自体を含む虚血性低酸素脳傷害の処置または予防の成功に少なくとも一部、因果関係があることに注目することが重要である。本発明によるポリペプチドが好ましくは鼻腔投与されることを考慮すると、疼痛がないことにより、対象は、疼痛を避けるためにポリペプチドをこすり取ったり、洗い流したり、または他の方法で除去するなどの有害な反応なしにポリペプチドの投与を受け入れることができ、その結果、ポリペプチドは、脳損傷、特に、限定されないが、低酸素虚血性脳症を含む虚血性脳傷害の処置または予防などの治療上有益な効果を発揮する。したがって、本発明のポリペプチドに関連する疼痛を伴わないことは、消費者の介護者の躊躇や規制当局の懸念を克服するのに適している。換言すると、痛みを伴わないことは、痛みを伴う薬剤と比較して、利益－リスク比の大幅な増加に関連する。
【0076】
特に、好ましくは、処置および／または予防は哺乳動物対象において痛覚過敏をもたらさない。ある実施態様において、本発明のポリペプチドを投与される対象は、機械的な異痛を有さない。より詳細には、機械的な異痛はポリペプチドを投与される対象において誘発されず、その結果、ポリペプチドを投与される対象は、機械的な異痛を有さない。
【0077】
典型的には、本発明の薬剤の投与対象により十分に許容される。特に、好ましくは、本発明によるポリペプチドの投与は、対象における薬物を中和する抗薬物抗体の形成に関連しない。実際に、本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列は野生型ヒトＮＧＦとアミノ酸の位置が２箇所しか異ならないため、ヒトにおける免疫学的寛容性は特に有利であると考えるのが妥当であり、本発明のポリペプチドの投与がヒトにおける抗薬物抗体の形成と関連しないことと考えるのが妥当である。
【0078】
好ましくは、本発明による投与は、次の１以上に肯定的な影響を与える：炎症、神経支配および血管形成。
【0079】
本発明による病態は、一般に、神経細胞間結合の機械的および／または病理学的破壊(例えば、変性)、およびそのような破壊により影響を受けた部位の神経細胞、膠細胞、および場合により血管組織の死滅によって特徴付けられる。本発明による病態または状態の非限定的な例は、中枢神経系に関与する外傷性事象、例えば脳損傷または外傷性脳損傷(ＴＢＩ)またはそれらに関連する病態／状態、またはこれらに直接的に由来する病態／状態、例えば低酸素性／虚血性脳損傷(ＨＩＢＩ)または好ましくは特に新生児(neonate)患者における低酸素虚血性脳症(ＨＩＥ)、小児脳性麻痺、または機械的外傷または低酸素／虚血脳症によって引き起こされるその他の病態／状態により構成される。
【0080】
低酸素性／虚血性脳症(原発性または二次的損傷)、出生時損傷、小児脳性麻痺、脳動脈瘤破裂、脳動静脈奇形および脳静脈洞血栓症を含む様々なタイプの脳虚血により引き起こされる脳損傷などの損傷もまた、含まれる。
【0081】
本発明によれば、血管／循環系の変化により引き起こされる病態は、例えば、外傷性傷害；出血性傷害；アテローム動脈硬化性傷害；心原性傷害；高血圧性傷害を含む低酸素虚血性症候群を含む。
【0082】
本発明によれば、真菌、細菌、ウイルス、プリオンまたはその他の病因にかかわらず、髄膜炎／脳炎などの感染性原因による炎症性損傷により引き起こされる病態が対象となる。
【0083】
小児レベルでは、このような病態は、例えば、胎児および／または新生児低酸素症／仮死；頭部大外傷；急性脳出血、中毒症(一酸化炭素、シアン化物)；脳静脈洞血栓症；凝固因子欠乏症；または遺伝子疾患も含む疾患。
【0084】
本発明によれば、配列番号１のポリペプチドは、そのような投与を必要とする対象に投与され得る。そのような投与を必要とする対象は、本明細書に記載の障害を有する対象、そのような障害を有する危険のある対象、またはそうでなければそのような障害に苦しんでいる対象であり得る。薬剤は、治療有効量で対象に投与される。治療有効量は本明細書の開示に照らして、医師により決定され得る。
【0085】
特に、本発明によるポリペプチドは哺乳動物対象に投与される。対象は、「患者」とも称され得る。最も好ましくは、哺乳動物対象はヒトである。
【0086】
対象は出産時から１２週齢までの子として定義される新生児(newborn)であり得るが、新生児(neonate)は出産時から４週齢までの子として定義される。新生児(newborn)および新生児(neonate)の処置が、本発明において考慮される。未熟児とは、妊娠満期より前に生まれた子をいい、早産児とは、妊娠満期の３週間以上前に生まれた子をいう。
【0087】
本発明の文脈において、例えば脳梗塞の(部分的な)減少または状態もしくは障害の他の改善もしくは改善などの予防が、ここで請求される本発明の好ましい不可欠な部分であることが好ましく、また本明細書に記載の試験例においても示される。実際、請求された治療的効果を達成することは、本発明の機能的な技術的特徴である。本明細書の実施例は、前記機能的な技術的特徴が本発明のポリペプチドの投与の直接的結果として達成可能であることを説得力のあるものとしている。換言すると、本発明者らは、本発明のポリペプチドが、特に低体温法との組み合わせで、脳損傷を有する対象おいて改善を達成するための要因であることを特定した。脳損傷は好ましくは、脳損傷および／または脳障害もしくは脳機能不全により特徴付けられる。
【0088】
特に、脳への投与は、鼻腔の独特な解剖学的関係性と機能を利用して実施され得る。前鼻腔上部の篩板領域に適用される治療物質(生物学的製剤を含む)が、嗅神経を頭蓋から鼻腔に通す穿孔を介して中枢神経系に到達できることは、長い間認識されている。さらに、神経組織により取り込まれ、軸索投射に沿って輸送される薬物については、嗅神経そのものおよびそれに関連するもの、三叉神経の鼻枝を経由する補助的な経路が存在し、それにより治療上適切な濃度の薬物が脳の多くの領域に到達し得る。
【0089】
本発明の場合、鼻腔内投与は、好ましくは鼻粘膜を介して薬物を吸収するように作用する局所投与に適切なデバイスにより、好ましくは１０～５０マイクロメートルの直径を有する微粒子製剤により実施される。
【0090】
本発明の組成物の鼻腔内投与に適切なデバイスの例は、ＭＡＤ(粘膜アトマイザーデバイス)型のデバイスにより、または同様の仕組みで作動し、かつ商業的に入手可能なデバイスにより構成される。ＭＡＤをシリンジに装着することで、薬物全体の霧化が可能となり、鼻粘膜での最適な吸収が保証され、外部環境や肺構造への拡散を最小限に低減される。その構造により、ＭＡＤは使用が容易であり、極めて効果的なデバイスとなっている。
【0091】
ＭＡＤデバイスによる本発明のポリペプチドの鼻腔内投与は、この有効成分をＣＮＳレベルでアクセスできるようにする有効で利用しやすい方法である。
【0092】
したがって、本明細書に記載の組成物を充填したデバイスは、嗅経路および／または神経末端を通して脳実質へ向かって運ぶことを目的として、鼻粘膜および嗅上皮に本発明のポリペプチドを投与するために使用され得る。したがって、薬物と組み合わせたデバイスは、脳における神経細胞再生を誘発する目的で、例えば、低酸素虚血性脳損傷または疾患の結果を処置し、現在薬理学的に処置できない病態や状態を処置するために、診療で使用され得る。本明細書に記載の組成物は、１日１回以上で投与され得て、その総量は患者一人あたり、０.０１～１.００ｍｇ／日の範囲のである。
【0093】
一般に、本発明によるポリペプチドは反復的に、または単回投与で投与される。
【0094】
ある実施態様において、ポリペプチドは単回投与で投与される。その実施態様において、ポリペプチドは単回投与で投与され、その単回投与の後、投与は継続されない。
【0095】
別の実施態様において、ポリペプチドは、１、２または３～３０日間、好ましくは７～１４日間、反復的に投与される。適切な休薬期間の後の最大３０日間の反復投与もまた、慢性的に進行するまたは再発性の病態の処置を可能にするために想定される。
【0096】
ある実施態様において、ポリペプチドは反復的に投与される。ある実施態様において、ポリペプチドは、例えば脳損傷が完全に治癒するまで、または少なくとも傷害の症状の改善が観測されるまで、反復的に投与される。あるいは、ポリペプチドは３～３０日、好ましくは７～１４日の期間、反復的に投与される。場合により、前記期間の後、投与は継続されない。特に好ましい実施態様において、ポリペプチドは少なくとも１日３回、反復的に投与される。
【0097】
好ましくは、ポリペプチドは脳損傷後に投与される。あるいは、ポリペプチドは、脳損傷が予想されるまたは脳損傷の可能性がある(神経外科的介入または炎症性脳疾患の発症など)状況下で予防的に使用され得る。
【0098】
好ましくは、ポリペプチドは、脳細胞死の程度を最小限にするために、脳損傷の診断後、可能な限りすぐに投与される。「可能な限りすぐに」は、脳損傷または傷害の診断後１日以内の実施態様を含む。しかしながら、ポリペプチドは脳損傷の発生から数日後に投与しても神経保護効果がある。好ましくは、ポリペプチドは脳損傷の誘発から少なくとも３日後に投与される。
【0099】
本明細書に記載の薬剤および組成物は有効量で投与される。特定の障害の処置の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻害に関連する。これは疾患の進行を遅延させること、および好ましくは、疾患の進行を阻害または退行させることを含む。疾患または状態の処置に対する所望の反応はまた、前記疾患もしくは状態の発症の遅延または予防を含み得る。いくつかの実施態様において、所望の反応は、障害の症状を局所的および／または全身的に完全治癒させることを含む。
【0100】
本明細書に記載の薬剤または組成物の有効量は、処置される状態または障害、障害の重篤度、薬剤を投与される対象の個々のパラメータ、例えば年齢、生理学的条件、付随する状態(存在するならば)、体格および体重、処置期間、付随する治療の種類(存在するならば)、特定の投与経路ならびに他のパラメータに依存する。したがって、本明細書に記載の薬剤の投与量は、このようなパラメータに応じて変化する。初期用量への患者における反応が不十分である場合、より高用量(または別の、より局所的な投与経路により達成される、効果的な高用量)が使用され得る。
【0101】
本発明によれば、脳損傷、特に外傷性脳傷害、または限定されないが、低酸素虚血性脳症を含む虚血性低酸素脳傷害の処置および／または予防のために、ヒト対象に投与するための治療剤の適切かつ治療上有効な投与量は、脳損傷、特に外傷性脳傷害、または限定されないが、低酸素虚血性脳症を含む虚血性低酸素脳傷害の処置および／または予防のために、齧歯類対象、特にマウスに投与するための治療剤の適切かつ治療上有効な投与量に基づいて決定され得る。
【0102】
動物モデル(実施例２および３)は、薬理学的応答の確立および処置剤の潜在的な毒性の評価に有用である。いくつかの実施態様において、対象に投与される用量は、実施例２または実施例３に記載の用量である。
【0103】
好ましくは、ポリペプチドの用量は処置開始時または処置開始前に決定される。ある実施態様において、用量は、処置される状態の進行に応じて、後の投与のために調整される。別の実施態様において、用量は後の投与のために調整されず、その結果、後の投与量は最初の用量と対応する。
【0104】
ポリペプチドは、鼻腔投与および全身投与の両方で活性である。経鼻投与については、対象あたりの好ましい用量／各用量は、鼻孔あたり０.１０～１.００ｍｇ／日、好ましくは０.０６～０.１２ｍｇ／日の量のポリペプチド、さらに好ましくは鼻孔あたり約０.０６ｍｇ／日の量のポリペプチドを有する。これらの用量は、受容者の嗜好、耐容量および鼻孔へのアクセスなどに応じて、片側の鼻孔へまたは両鼻孔へ別々に投与され得る。最も好ましくは、これらの示された投与量は特に、ヒトへの投与のためのものである。
【0105】
以下において、本発明のポリペプチドを含む組成物を記載する。このような組成物は、それ自体、脳損傷、特に外傷性脳傷害、または限定されないが、低酸素虚血性脳症を含む虚血性低酸素脳傷害の予防および／または処置における使用の特定の文脈においても、本発明の一部である。したがって、本発明は、そのような組成物の医学的使用に関する。
【0106】
本発明による組成物において、配列番号１のポリペプチドは、活性成分として含まれる。さらなる成分が含まれていてもよい。
【0107】
ある実施態様において、ポリペプチドは、水性媒体中に含まれる。前記水性媒体は、哺乳動物対象への投与のためのものである。
【0108】
本発明による使用のための特定の水性組成物は、鼻腔内使用に適切な液体組成物である。製剤は、濃度２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ 酢酸緩衝液、２０ｍＭ メチオニン、ｐＨ ５.５を有する。それは０.９％食塩水に溶解され、好ましくは２０μｇ／ｋｇまたは４０μｇ／ｋｇ(総体積４μＬ、２μＬ／鼻孔)の用量を、各鼻孔に交互に、好ましくは１～５分、好ましくは２分の投与間隔で鼻腔内送達され得る。このような組成物を製造する方法は当技術分野で既知である。
【0109】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の配列番号１のポリペプチドは、さらなる１以上の担体および／または１以上の賦形剤を含む組成物、例えば液体組成物中に含まれる。本明細書で使用される用語「担体」とは、活性成分の適用を可能にする、強化する、例えば簡易化するために、活性成分とともに組み合わせられる、天然もしくは合成の有機または無機成分をいう。本明細書で使用される用語「賦形剤」は、本発明の医薬組成物中に存在し得て、かつ活性成分そのものではない全ての物質を示すことが意図される。
【0110】
好ましくは、本発明の組成物は、賦形剤として少なくとも水を含む。いくつかの実施態様において、本発明の組成物は水性媒体を含み、より好ましくは、本発明の組成物は水溶液の形態である。ある実施態様において、ポリペプチドは水性媒体中に含まれ、水性媒体は哺乳動物対象に投与される。水性媒体は、例えば水溶液である。
【0111】
したがって、本明細書に記載の配列番号１のポリペプチドは、組成物、例えば医薬組成物中に存在し得る。本明細書に記載の組成物は、好ましくは無菌であり、好ましくは薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質として配列番号１のポリペプチドを含み、場合により本明細書に記載されるまたは記載されていないさらなる薬剤を含んでよい。組成物は任意の状態、例えば液体、凍結、凍結乾燥などであり得る。
【0112】
本明細書に記載の組成物は、塩、緩衝液物質、防腐剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含み得て、これらの全ては、好ましくは薬学的に許容されるものである。用語「薬学的に許容される」とは、非毒性のおよび／または医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質を示す。
【0113】
本発明において使用される適切な緩衝物質は、２０ｍＭ 酢酸緩衝液を含む。
【0114】
本発明による組成物(製剤)は、限定されないが、１以上の次の実施態様により保護される：
－ 第一の実施態様：上記製剤は－７０℃または－２０℃(データは示していない)で凍結保存され、投与前に解凍され得る。
－ 第二の実施態様：上記製剤は、好ましくは＋２～＋８℃の温度範囲の冷蔵庫で保存され得る(データは示していない)。
－ 第三の実施態様：上記製剤は、乾燥または凍結乾燥に供された後、例えば室温または２～８℃で保管され得る(データは示していない)。それは投与前に再構成され得る。
－ 第一の実施態様：上記製剤は－７０℃または－２０℃(データは示していない)で凍結保存され、投与前に解凍され得る。
－ 第二の実施態様：上記製剤は、好ましくは＋２～＋８℃の温度範囲の冷蔵庫で保存され得る(データは示していない)。
－ 第三の実施態様：上記製剤は、乾燥または凍結乾燥に供された後、例えば室温または２～８℃で保管され得る(データは示していない)。それは投与前に再構成され得る。
【0115】
本発明による組成物における使用のための適切な防腐剤は当分野において既知のものを含み、とりわけ、例示のためであり限定されないが、ベンジルアルコール、ベンザルコニウムおよびその塩、ｍ－クレゾール、フェノール、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールがある。これらおよび他の防腐剤は、場合により、本発明による組成物に含まれていてよい。
【0116】
したがって、本発明は、治療的使用のための、すなわち治療によりヒトまたは動物の身体を処置する方法における使用のための、配列番号１のポリペプチドを提供する。治療は、状態の予防および／または処置を含み得る。治療的使用の可能性の観点において、前記ポリペプチドは、薬学的に活性なタンパク質またはペプチドとも称され得る。
【0117】
場合により、本発明による投与は、例えば炎症、浮腫／腫脹、頭蓋内圧の上昇、感染、発作、疼痛、精神的後遺症に対抗することを意図した薬剤など、少なくとも別の治療剤の投与を伴ってよい。他の治療剤は、本発明によるポリペプチドを含む組成物の一部であり得るか、あるいは、同一のまたは異なる部位へ、同一のまたは異なる投与経路により、対象に別々に投与され得る。
【0118】
担体は等張溶液、場合により緩衝化された溶液、例えば食塩水溶液またはリン酸緩衝液であり得て、必要ならば、鼻腔内投与のための組成物の製剤に適切な防腐剤または他の適切な賦形剤を含む。
【0119】
投与は、患者の必要性に応じて、例えば１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回またはそれ以上実施され得て、各回の用量は、上記のとおり０.０１～１.００ｍｇ／日のＣＨＦ６４６７であり得る。
【0120】
ある実施態様において、例えば、組成物は、各投与あたり０.０２～０.０４ｍｇのＣＨＦ６４６７の用量で、１日２～４回、例えば、１日３回、投与され得る。
【0121】
例えば、組成物は投与一回あたり、０.０２ｍｇのＣＨＦ６４６７および／またはＮＧＦ様作用を有する分子の用量で投与され得る。
【0122】
組成物は、１以上の治療サイクルに対して上記方法および用量のいずれかで投与され得る。
【0123】
このような治療サイクルは例えば、１日～２週間継続され得る。
【0124】
例として、医薬組成物は、予め調整された数(例えば、１０～２０の任意の数)の分割量の形で提供され得て、その各々は、非限定的な例として、０.５～２.０ｍｇのＣＨＦ６４６７が希釈された１ｍｌの生理学的溶液または他のいずれかの適切な担体を含む。このような分割量は、小瓶に含まれ得るか、または特に使いやすい実施形態では、ＭＡＤデバイスに接続するのに適切な予充填(pre-dosed)シリンジにもまた含まれ得る。分割量の実施態様は、０.０１～１.００ｍｇ／日の用量のＣＨＦ６４６７を投与することが可能となるように提供される。可能性のある実施態様により、本発明の組成物は、例えば、１ｍｇのＣＨＦ６４６７を含む１ｍｌの分割量を含み、このタイプの製剤は、１０ｋｇ程度の体重の小児に対して特に適切である。あるいは、組成物は、例えば２０ｋｇ程度の体重の小児などのために、２ｍｇのＣＨＦ６４６７を含む適切な担体の、１ｍｌの分割量を含む。本明細書で助言される用量の知識において、体重範囲により医薬組成物の適切な分割量を調製することは、当業者にとって容易に実施される。
【0125】
血液脳関門をバイパスして脳へ薬物を運ぶ目的で薬物を経鼻投与する可能性は、１０年以上前に既に提案され、現在、いくつかのタイプの鎮静薬や麻酔薬の投与に用いられており、鼻腔内投与により用量を低減し、かつ制限することが可能であり、したがって副作用の可能性も低減することが可能である。
【0126】
さらなる実施態様により、前記１以上の分割量は、小児への投与または成人への投与用に予め調整され得て、適切な量のＣＨＦ６４６７を含む体重範囲ごとの単回用量にさらに分割され得る。
【0127】
別の実施態様において、前記１以上の分割量は、複数回用量の分割量、例えば、「一日」または「一週間」の分割量であり、患者の体重に基づいて適切な用量にさらに分割され得る。
【0128】
上記のとおり既に、ある実施態様により、組成物の投与のための前記１以上のデバイスは、ＭＡＤ(粘膜アトマイザーデバイス)型のデバイスであり得る。
【0129】
非限定的な例として、ＣＨＦ６４６７は、キットの形態であり得る。本発明のキットは、多くの予め調整された数(例えば、１０～２０の任意の数)の分割量で提供され得て、その各々は、非限定的な例として、０.０１～１.００ｍｇのＣＨＦ６４６７が希釈された１ｍｌの生理学的溶液を含み、予充填シリンジについては、０.０１～１.００ｍｇ／対象または３～３３３μｇ／ｋｇのＣＨＦ６４６７を投与することが可能である。このような分割量は、場合によりポリペプチドの鼻腔内投与のためのＭＡＤデバイスを既に備えた無菌シリンジ中に既に含まれていることがある。可能性のある実施態様により、本発明のキットは、例えば、３ｋｇ程度の体重の新生児(neonate)のための０.０１～１ｍｇのＣＨＦ６４６７を含むシリンジを１０個含み得る。本明細書で報告される用量の知識において、体重範囲について適切な医薬キットを調整することは、当業者により容易に実施される。このような方法で、脳のセロトニン作動性およびコリン作動性領域の大部分に存在するＮＧＦの脳内受容体(ＴｒｋＡおよびｐ７５)を刺激することができる適切な量のＣＨＦ６４６７の鼻腔内投与を保護することが可能である。さらに、この種類のキットは、ＣＨＦ６４６７の鼻腔内投与を自宅で、新生児(neonate)の親により実施することを可能にし(方法の簡易性と安全性を考慮すると)、新生児(neonate)のクオリティ・オブ・ライフを顕著に改善する。
【0130】
さらに、本発明の組成物、キットおよび方法は、大きな頭部外傷によって引き起こされる神経学的欠損を有する患者(小児または新生児年齢の患者を含む)のみならず、出生時損傷によりもたらされた低酸素虚血性脳症により引き起こされた脳損傷により影響を受けている全ての小児、および小児脳性麻痺および様々な性質の二次的脳損傷および脳虚血(例えば、脳動脈瘤破裂、脳動静脈奇形および脳静脈洞血栓症)に一般に影響を受けている患者にも使用され得る。
【0131】
本発明の別の好ましい実施態様において、新生児は、ＣＨＦ６４６７を用いた処置の前に、低体温法に供される。
【0132】
ある好ましい実施態様において、ＣＨＦ６４６７は、逐次的に低体温法とともに投与される。
【0133】
ある好ましい実施態様において、ＣＨＦ６４６７は、低体温法の前または後に逐次的に投与される。
【0134】
好ましい実施態様において、ＣＨＦ６４６７は低体温法と同時に投与され、本発明のある好ましい実施態様において、ＣＨＦ６４６７は治療有効量で投与される。
【0135】
別の好ましい実施態様において、ＣＨＦ６４６７は、治療有効量以下で投与される。
【0136】
換言すると、ＣＨＦ６４６７は、低体温条件なしに投与されたならば所望の治療効果を与えるのに不十分な量で投与される。
【0137】
さらにより好ましくは、ＣＨＦ６４６７と低体温法の併用は相乗効果を有する。すなわち、併用は相乗的である。
【0138】
ある特に好ましい実施態様において、ＣＨＦ６４６７は、低酸素性／虚血性傷害そのものの前に、またはそうでなければ、生じたと疑われる低酸素性／虚血性傷害の確定診断前に投与される。このように、ある好ましい実施態様において、ＣＨＦ６４６７は、出生前に母親を介して、例えば分娩前または分娩中に母親に投与することにより、新生児(neonate)に投与される。
【0139】
好ましくは、ＣＨＦ６４６７は、出生の最大約４８時間または２４時間前まで、より好ましくは出生の最大約１２時間前、より好ましくは出生の最大約６時間または３時間または１時間前に投与される。出生後、新生児(neonate)は低体温条件に供される。
【0140】
別の好ましい実施態様において、ＣＨＦ６４６７はが、臨床的に影響の大きな低酸素性／虚血性傷害が生じ得ることが疑われるという臨床的な理由があるが、診断が確定する前である、出生直後に新生児(neonate)または新生児(newborn)に投与される。この状況は、他の重要な臨床活動や介入を妨げることなく、ＣＨＦ６４６７が迅速かつ容易に投与され得ることにより促進される。
【実施例】
【0141】
実施例１：酸素－グルコース欠乏(ＯＧＤ)させた急性海馬スライス
方法
Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウス(３０～５０日齢)を断頭して屠殺し、脳を速やかに摘出し、氷冷した酸素添加(９５％ Ｏ２－５％ ＣＯ２)人工ＣＳＦ(ａＣＳＦ)(０℃)に入れた。傍矢状海馬スライス(２５０～３５０μＭ)をビブラトームで切断し、ａＣＳＦ中、室温で１時間回復させた。単一のスライスをナイロンメッシュ上に置き、記録チャンバーに完全に浸し、酸素を連続的に供給したａＣＳＦで灌流した(３ｍＬ／分、約３０℃)。細胞外電場記録は、シェファー側枝線維に設置した双極性電極を用いて行い、放射層のＣＡ１領域に設置したａＣＳＦで満たされたガラス微小電極で記録した興奮性シナプス後場電位(ｆＥＰＳＰ)を誘発した。全細胞パッチクランプ記録法を用いて、本発明者らは、ＯＧＤにより変化した単一ニューロンパラメータに対するＣＨＦ６４６７の神経保護効果を評価した。具体的には、本発明者らは、自発的な興奮性シナプス後電位(ｓＥＰＳＣ)および膜電位(Ｖｍ)を測定した。本発明者らはまた、興奮性シナプス後電流(ＥＰＳＣ)を記録するＯＧＤ中およびＯＧＤ後のＣＨＦ６４６７の神経保護作用の時間ウィンドウを評価した。インビトロ酸素／グルコース欠乏(ＯＧＤ)は、グルコースを含まないＣＳＦでスライスを灌流し、９５％ Ｎ２－５％ ＣＯ２でガス置換することで達成した。ＯＧＤ後、スライスをグルコースと酸素を含むＣＳＦで再灌流した。低体温法はグルコースを含み、酸素化された(９５％ Ｏ２－５％ ＣＯ２)ａＣＳＦ(＋４℃)でスライスを灌流することで達成した。
方法
Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウス(３０～５０日齢)を断頭して屠殺し、脳を速やかに摘出し、氷冷した酸素添加(９５％ Ｏ２－５％ ＣＯ２)人工ＣＳＦ(ａＣＳＦ)(０℃)に入れた。傍矢状海馬スライス(２５０～３５０μＭ)をビブラトームで切断し、ａＣＳＦ中、室温で１時間回復させた。単一のスライスをナイロンメッシュ上に置き、記録チャンバーに完全に浸し、酸素を連続的に供給したａＣＳＦで灌流した(３ｍＬ／分、約３０℃)。細胞外電場記録は、シェファー側枝線維に設置した双極性電極を用いて行い、放射層のＣＡ１領域に設置したａＣＳＦで満たされたガラス微小電極で記録した興奮性シナプス後場電位(ｆＥＰＳＰ)を誘発した。全細胞パッチクランプ記録法を用いて、本発明者らは、ＯＧＤにより変化した単一ニューロンパラメータに対するＣＨＦ６４６７の神経保護効果を評価した。具体的には、本発明者らは、自発的な興奮性シナプス後電位(ｓＥＰＳＣ)および膜電位(Ｖｍ)を測定した。本発明者らはまた、興奮性シナプス後電流(ＥＰＳＣ)を記録するＯＧＤ中およびＯＧＤ後のＣＨＦ６４６７の神経保護作用の時間ウィンドウを評価した。インビトロ酸素／グルコース欠乏(ＯＧＤ)は、グルコースを含まないＣＳＦでスライスを灌流し、９５％ Ｎ２－５％ ＣＯ２でガス置換することで達成した。ＯＧＤ後、スライスをグルコースと酸素を含むＣＳＦで再灌流した。低体温法はグルコースを含み、酸素化された(９５％ Ｏ２－５％ ＣＯ２)ａＣＳＦ(＋４℃)でスライスを灌流することで達成した。
【0142】
結果
本発明者らは、ＯＧＤに曝露したマウス急性海馬スライスにおいて、ＣＨＦ６４６７と低体温療法の単独または組み合わせの神経保護効果を試験した。
本発明者らは、ＯＧＤに曝露したマウス急性海馬スライスにおいて、ＣＨＦ６４６７と低体温療法の単独または組み合わせの神経保護効果を試験した。
【0143】
初めに、海馬の基底神経伝達に対するＣＨＦ６４６７の効果を試験した。本発明者らは、対照条件で２０分間ｆＥＰＳＣの試験記録を実施し、その後、種々の濃度(０.００１～０.１μｇ／ｍＬ)で１５分間、浴液にＣＨＦ６４６７を添加した。ＣＨＦ６４６７は、０.１μｇ／ｍＬの濃度でｆＥＰＳＣの振幅を増加させることができた(図１)。
【0144】
正常な酸素状態に戻った際にシナプス機能を回復するための海馬スライスの能力は、ＯＧＤの期間に依存する。本発明者らの試験条件において、１０分間のＯＤＧを適用すると不可逆性のｆＥＰＳＰ低下が誘発された(データは示していない)。ＯＧＤ中にＣＨＦ６４６７を浴液に適用することで、対照条件で観察されたｆＥＰＳＰ低下が回復した。ＯＧＤ中にＣＨＦ６４６７で処理したスライスは、ｆＥＰＳＰ振幅の完全な回復を示した(図２)。
【0145】
インビトロモデルにおける治療ウィンドウを検討するために、単一ニューロンに対するＣＨＦ６４６７の神経保護効果を評価する全細胞パッチクランプ法の試験を実施した。本発明者らは、ＯＧＤの１５分後に不可逆的に減少した誘発された興奮性シナプス後電位(ＥＰＳＣ)を記録した。本発明者らは、ＯＧＤ後にＣＨＦ６４６７が適用されたとき、その神経保護効果を観察したが(図３Ａ)、一方で、ＣＨＦ６４６７が通常の条件下で適用されたとき、基底神経伝達に変化はなかった(図３Ｂ)。
【0146】
現在のところＨＩＥに対して承認されている唯一の治療法であるＣＨＦ６４６７と低体温法との間の相乗効果の可能性を検討するために、本発明者らは、ＯＧＤ後にＣＨＦ６４６７と低体温法を適用する試験を実施した。本発明者らの試験条件において、低体温法は、ＯＧＤにより誘発されたＥＰＳＣの減少を一部回復することができた(図４)。低体温法中にＣＨＦ６４６７を共適用することにより、ＥＰＳＣの減少を完全に回復させることができた(図４)。
【0147】
ＣＨＦ６４６７のインビトロおよびインビボ用量ならびに投与プロトコルは、潜在的な臨床適用を支持するための用量－応答試験で選択した。インビトロでの神経細胞損傷の最大減衰は、０.０３μＭのＣＨＦ６４６７で観察された。驚くべきことに、インビトロでのＣＨＦ６４６７の神経保護効果は４℃の低体温法により劇的に増強され、神経細胞の電気生理学的損傷をほぼ完全に回復させるまでに至った。
【0148】
全体として、本電気生理学的データは、虚血により誘発されるいくつかの機能変化に対するＣＨＦ６４６７の神経保護能を支持する。
【0149】
ＣＨＦ６４６７が虚血介在性の興奮毒性から保護することを示す、これらのインビトロの結果(データは示していない)を考慮すると、いかなる理論にも縛られないが、ＣＨＦ６４６７は、低体温法との組み合わせで、脳損傷または外傷性脳傷害または限定されないが、低酸素虚血性脳症を含む虚血性低酸素脳傷害の処置のための、潜在的な神経保護療法として役立つ可能性がある。
【0150】
実施例２：新生児低酸素虚血性脳症のラットモデル
方法
動物。試験および動物の使用方法は、国立衛生研究所のGuide for the Care and Use of Laboratory Animals(ＮＩＨ出版番号８０－２３、１９９６年改訂)に従った。試験プロトコルは、European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes (ETS no. 123)および1986年11月24日のEuropean Communities Council Directive(86/609/EEC)に従って、フィレンツェ大学健康科学部、動物実験委員会により承認された。使用される動物の数およびそれらの苦痛を最小限にするための全ての努力が成された。
方法
動物。試験および動物の使用方法は、国立衛生研究所のGuide for the Care and Use of Laboratory Animals(ＮＩＨ出版番号８０－２３、１９９６年改訂)に従った。試験プロトコルは、European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes (ETS no. 123)および1986年11月24日のEuropean Communities Council Directive(86/609/EEC)に従って、フィレンツェ大学健康科学部、動物実験委員会により承認された。使用される動物の数およびそれらの苦痛を最小限にするための全ての努力が成された。
【0151】
手順。Rice-Vannucciモデル(Ann Neurol 1981; 9: 131-141)に従い、生後７日のＷｉｓｔａｒラット(ハーラン、ＭＩ、イタリア)で外科手術を実施した。簡潔には、仔ラットを酸素：一酸化窒素(１：１)中のイソフルランガス(誘発、４％；維持、１％)で麻酔した。正中線を切開し、４－０シルクを用いて左総頸動脈を結紮した。手術後、全ての仔ラットを、回復と授乳のために１.５時間雌親のもとへ戻した。その後、仔ラットを、一部水浴に浸された、周囲を囲まれた通気性のあるプレキシグラス製チャンバー(Ｗ２０、Ｄ２０、Ｈ１７)に入れ、加温、加湿された気体(８％ 酸素 ９２％ 窒素)に１２０分間曝露させた。損傷後、仔マウスを１時間雌親のもとへ戻し、その後正常体温(３７℃)または低体温(３２℃)のチャンバーに４時間入れた。ＣＨＦ６４６７を、以前の実験で十分に耐容性が示された２０μｇ／ｋｇの用量で、低酸素状態の直後および２４時間後に鼻腔内投与した。その後、全ての仔ラットをそれらの雌親とともに維持し、７２時間後にイソフルラン麻酔下で断頭により屠殺した。梗塞面積と体積を測定するため、厚さ１ｍｍの冠状切片をブレードで切り、２％ 塩化２，３，５－トリフェニル－テトラゾリウム(ＴＴＣ)中、３７℃で２０分間インキュベートし、その後、４％ パラホルムアルデヒドで２４時間固定した。コンピューター画像解析システム(Image-Pro Plus 3.0, シルバースプリング、メリーランド州、米国)を使用して梗塞面積を測定した。梗塞体積を、以前に記載したとおりに測定した(Ann Neurol 1981; 9: 131-141)。
【0152】
ＣＨＦ６４６７鼻腔内製剤および投与。低酸素状態の終了後、ラットを仰臥位に置いた。ＣＨＦ６４６７(バッチ番号ＮＧＦ１８３７０４－ＴＲ１、濃度２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ 酢酸緩衝液、２０ｍＭ メチオニン、ｐＨ ５.５)を０.９％ 食塩水に溶解し、２０μｇ／ｋｇ(総体積４μＬ、２μＬ／鼻孔)の用量で、投与間隔２分で各鼻孔に交互に鼻腔内送達した。
【0153】
統計分析。データを、試験の平均±ＳＥＭとして示す。ヨウ化プロピジウム蛍光強度またはＴＴＣ染色間の差の統計的有意性を、二元配置分散分析、多重比較のためのホルム－シダック検定を用いて分析した。全ての統計計算は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ(バージョン１１.０)を用いて実施した。確率値(Ｐ)＜０.０５を有意であるとみなした。
【0154】
結果
本発明者らは、新生児低酸素虚血性脳症(ＨＩＥ)のラットモデル(Rice-Vannucciモデル；Ann Neurol 1981; 9: 131-141)におけるＣＨＦ６４６７単独または低体温法との組合せの神経保護効果を試験した。試験プロトコルを図に示す(図５)。本モデルにおいて、左頸動脈閉塞後に低酸素(８％ Ｏ２および９２％ 窒素、２時間)に曝露すると、以前に記載したとおりビークル投与したラットでは、同側の脳梗塞が約８０％発症する(Landucci et al., Neurosci Lett. 2018; 668:103-107)。
本発明者らは、新生児低酸素虚血性脳症(ＨＩＥ)のラットモデル(Rice-Vannucciモデル；Ann Neurol 1981; 9: 131-141)におけるＣＨＦ６４６７単独または低体温法との組合せの神経保護効果を試験した。試験プロトコルを図に示す(図５)。本モデルにおいて、左頸動脈閉塞後に低酸素(８％ Ｏ２および９２％ 窒素、２時間)に曝露すると、以前に記載したとおりビークル投与したラットでは、同側の脳梗塞が約８０％発症する(Landucci et al., Neurosci Lett. 2018; 668:103-107)。
【0155】
頸動脈結紮の同側の新鮮な脳半球での観察所見には、線条体、海馬、大脳皮質、視床の蒼白、萎縮、組織喪失が含まれていた(データは示していない)。脳スライスを塩化２，３，５－トリフェニルテトラゾリウム(ＴＴＣ)で染色したとき、本発明者らは、ＨＩＥ群では体積７０.４±７.８ｍｍ３の著しい脳梗塞を観測した(図６)。
【0156】
低酸素状態の終了後、ラットを仰臥位に置いた。ＣＨＦ６４６７を０.９％ 食塩水に溶解し、２０μｇ／ｋｇまたは４０μｇ／ｋｇ(総体積４μＬ、２μＬ／鼻孔)の用量で、投与間隔２分で各鼻孔に交互に鼻腔内送達した。２０および４０μｇ／ｋｇ(３ｋｇの体重のヒト新生児(neonate)に対して約６０～１２０μｇと同等)のＣＨＦ６４６７を低酸素症の直後および２４時間後に鼻腔内投与すると、ビークル群と比較して、梗塞の程度が有意に低減された。
【0157】
低体温法(３２℃、初めに４時間、低酸素状態の終了後に１時間)は、正常体温でビークル処置した動物に対して、程度を有意に低減させた(図６)。２０μｇ／ｋｇのＣＨＦ６４６７と低体温法の併用は、低体温法単独よりも梗塞体積を有意に減少させた(図６)。興味深く、また驚くべきことに、低体温法とＣＨＦ６４６７の併用の神経保護は、単一の薬剤の神経保護効果の合計に取って代わるものとなった。
【0158】
種々の処置後のビークル＋正常体温群の平均Ｌｏｇ変換脳梗塞体積の平均パーセント減少は、次のとおりであった：
－ 正常体温＋ＣＨＦ６４６７ ２０μｇ／ｋｇ：－１３.６％
－ 正常体温＋ＣＨＦ６４６７ ４０μｇ／ｋｇ：－２４.３％
－ 低体温法＋ビークル：－１３.４％
－ 低体温法＋ＣＨＦ６４６７ ２０μｇ／ｋｇ：－４７.９％。
－ 正常体温＋ＣＨＦ６４６７ ２０μｇ／ｋｇ：－１３.６％
－ 正常体温＋ＣＨＦ６４６７ ４０μｇ／ｋｇ：－２４.３％
－ 低体温法＋ビークル：－１３.４％
－ 低体温法＋ＣＨＦ６４６７ ２０μｇ／ｋｇ：－４７.９％。
【0159】
臨床的徴候を調べるために１日１回、死亡率と罹患率を調べるために１日２回、動物をモニタリングした。
【0160】
相互作用効果の分析
以下において、ＳＡＳバージョン９.４(ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ.、ケーリー、ノースカロナイナ、アメリカ合衆国)を用いて統計分析を実施した。ＣＨＦ６４６７と低体温法の相互作用効果の統計分析は、各処置群について別個の分散を仮定したＡＮＯＶＡモデルを用いて、ｌｏｇ１０変換データに基づくものであった。低体温法(あり／なし)、ＣＨＦ６４６７(あり／なし)およびそれらの相互作用の固定効果をモデルに含めた。正常体温＋ＣＨＦ６４６７ ４０μｇ／ｋｇで処置された群からのデータは、相互作用効果の評価に寄与するものではないため(本試験は低体温法＋ＣＨＦ６４６７ ４０μｇ／ｋｇ群を含まないため)、除外した。
以下において、ＳＡＳバージョン９.４(ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ.、ケーリー、ノースカロナイナ、アメリカ合衆国)を用いて統計分析を実施した。ＣＨＦ６４６７と低体温法の相互作用効果の統計分析は、各処置群について別個の分散を仮定したＡＮＯＶＡモデルを用いて、ｌｏｇ１０変換データに基づくものであった。低体温法(あり／なし)、ＣＨＦ６４６７(あり／なし)およびそれらの相互作用の固定効果をモデルに含めた。正常体温＋ＣＨＦ６４６７ ４０μｇ／ｋｇで処置された群からのデータは、相互作用効果の評価に寄与するものではないため(本試験は低体温法＋ＣＨＦ６４６７ ４０μｇ／ｋｇ群を含まないため)、除外した。
【0161】
ＣＨＦ６４６７ ２０μｇ／ｋｇと低体温法の相互作用は、統計的に有意なものであった(ｐ＝０.００６)。この相互作用は、処置群ごとに平均ｌｏｇ１０変換脳梗塞体積を示した図９において明らかである。ＣＨＦ６４６７ ２０μｇ／ｋｇと低体温法の相加効果(相互作用なし)の場合、平行線が予測される。平行性が存在しないことは、ＣＨＦ６４６７ ２０μｇ／ｋｇと低体温法の効果の相互作用を示唆した。ＣＨＦ６４６７ ２０μｇ／ｋｇと低体温法の併用の神経保護効果はＣＨＦ６４６７と低体温法の個々の効果の合計値より大きなものであった。
【0162】
表１は、ＣＨＦ６４６７単独または低体温法との組合せの体重への影響を示す。体重増加に統計的な有意差は存在せず、有害な臨床的徴候は観察されなかった。
表１：ＣＨＦ６４６７単独または低体温法との組合せの体重への影響
表１：ＣＨＦ６４６７単独または低体温法との組合せの体重への影響
【表1】
【0163】
さらに、ＣＨＦ６４６７はＨＩＥを有する新生児(neonate)において、神経保護剤として低体温法との組合せで使用され得る。
【0164】
実施例３：ＣＨＦ６４６７の低酸素虚血性脳損傷の幼若ラットモデルにおける神経炎症マーカー発現への影響
方法
試験動物の手順。試験動物を含む全ての手順と条件は、地元の倫理委員会により審査され、承認され、かつイタリア保健省により承認された(認可番号６７１／２０１９－ＰＲ)。
方法
試験動物の手順。試験動物を含む全ての手順と条件は、地元の倫理委員会により審査され、承認され、かつイタリア保健省により承認された(認可番号６７１／２０１９－ＰＲ)。
【0165】
試験手順は、以前に記載したとおりに実施した(1986, Rita Levi-Montalcini)。簡潔には、生後７日の仔Ｗｉｓｔａｒラットをイソフルランガス(誘発、４～５％；維持、１％)で麻酔した。正中線を切開し、４－０シルクを用いて左総頸動脈を結紮した。手術後、全ての仔ラットを、回復と授乳のために１時間雌親のもとへ戻した。その後、仔ラットを、一部水浴に浸された、周囲を囲まれた通気性のあるプレキシグラス製チャンバー(Ｗ２０、Ｄ２０、Ｈ１７)に入れ、加温、加湿された気体(８％ 酸素 ９２％ 窒素)に１２０分間曝露させた。損傷後、仔マウスを１時間雌親のもとへ戻し、その後正常体温(３７℃)または低体温(３２℃)のチャンバーに４時間入れた。ＣＨＦ６４６７を２０μｇ／ｋｇの用量で、低酸素状態の直後および２４時間後に鼻腔内投与した。その後、全ての仔ラットをそれらの雌親とともに維持し、断頭により屠殺した。
【0166】
ＣＨＦ６４６７鼻腔内製剤および投与。低酸素状態の終了後、ラットを仰臥位に置いた。ＣＨＦ６４６７(バッチ番号ＮＧＦ１８３７０４－ＴＲ１、濃度２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ 酢酸緩衝液、２０ｍＭ メチオニン、ｐＨ ５.５)を０.９％ 食塩水に溶解し、２０μｇ／ｋｇまたは４０μｇ／ｋｇ(総体積４μＬ、２μＬ／鼻孔)の用量で、投与間隔２分で各鼻孔に交互に鼻腔内送達した。
【0167】
海馬および皮質脳領域からのRNA抽出。フェノール／グアニジンによるサンプルの溶解：海馬および皮質の両方について、組織３０ｍｇあたり８００μｌのＱＩＡｚｏｌ溶解試薬を使用した。ビーズおよびTissue Lyser (Qiagen)デバイスを用いて組織サンプルをホモジナイズした。クロロホルムを添加した後、ホモジネートを遠心分離し、水相と有機相に分離した。上部の水層をＱｉａＣｕｂｅ Ｃｏｎｎｅｃｔ自動システム(Ｑｉａｇｅｎ)で抽出した。ｇＤＮＡを除去するために、ＤＮアーゼ工程を含むプロトコルを選択した。ＲＮアーゼを含まない水中でＲＮＡサンプルを溶出し、逆転写工程まで－８０℃で保管した。
【0168】
各サンプルについて１回のＲＴ反応で１０００ｎｇのＲＮＡを転写するために、ＲＮＡサンプルの濃縮をＮａｎｏｄｒｏｐ(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ)分析器で決定し、調整した。ｇＤＮＡを除去するために、ＲＴ反応の前にさらなるｅｚＤＮａｓｅＴＭ酵素工程を実施した。製造者により提示された温度サイクル条件に従って、ＲＴ反応を実施した。
【0169】
一群の神経炎症性マーカー。標的およびハウスキーピング遺伝子のためのプライマーおよびプローブを含む特注設計のアレイプレート(Ｔａｑｍａｎ ｇｅｎｅ ａｒｒａｙ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ)上で、ｃＤＮＡサンプルを試験した。
【0170】
試験中は、次の遺伝子と標的とした：(括弧内はＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒカタログ番号)：ハウスキーピング遺伝子：１８ｓ ｒＲＮＡ(Ｈｓ９９９９９９０１＿ｓ１)、Ｂ２ｍ(Ｒｎ００５６０８６５＿ｍ１)、Ｔｂｐ(Ｒｎ０１４５５６４８＿ｍ１)；標的遺伝子：Ｃｃｌ２(Ｒｎ００５８０５５５＿ｍ１)、Ｃｃｌ２２(Ｒｎ０１５３６５９１＿ｍ１)、Ｃｃｌ１２(Ｒｎ０１４６４６３８＿ｍ１)、Ｔｎｆ(Ｒｎ００５６２０５５＿ｍ１)、Ｃｘｃｌ２(Ｒｎ００５８６４０３＿ｍ１)、Ｃｃｌ７(Ｒｎ０１４６７２８６＿ｍ１)、Ｃｃｒ５(Ｒｎ０２１３２９６９＿ｓ１)、Ｃｃｌ２０(Ｒｎ００５７０２８７＿ｍ１)、Ｉｌ６(Ｒｎ０１４１０３３０＿ｍ１)、Ｃｘｃｌ１０(Ｒｎ０１４１３８８９＿ｇ１)、Ｃｃｌ６(Ｒｎ０１４５６４００＿ｍ１)。
【0171】
ＴａｑＭａｎ(登録商標) Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)および希釈したｃＤＮＡをプレートに添加し；製造者により示された温度サイクル条件に従ってＰＣＲ反応を実施した。ハウスキーピング遺伝子の増幅に基づき、２－ΔΔＣｔ法を用いて結果を計算した。
【0172】
統計分析はＧｒａｐｈ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより実施し；一元配置分散分析検定、その後、比較のためのダネット検定またはテューキー検定を適用した。
【0173】
結果
海馬および前頭頭頂皮質における一群のサイトカインおよびケモカインのｍＲＮＡレベルの、擬似処置ラットと比較して顕著な増加が、低酸素虚血性傷害を受けたラットで測定された(図７および８)。ＣＨＦ６４６７(２０μｇ／ｋｇ、鼻腔内)は、低酸素虚血性傷害を受けたラットの海馬領域においていくつかの神経炎症マーカー(ｃｃｌ２、ｃｘｃｌ２、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ｃｃｌ２０)の上方調節を顕著に阻害し、一方で低体温法そのものは、ｃｃｌ２上方調節を顕著に阻害したが、ＣＨＦ６４６７ほど効果的ではなかった(図７)。
海馬および前頭頭頂皮質における一群のサイトカインおよびケモカインのｍＲＮＡレベルの、擬似処置ラットと比較して顕著な増加が、低酸素虚血性傷害を受けたラットで測定された(図７および８)。ＣＨＦ６４６７(２０μｇ／ｋｇ、鼻腔内)は、低酸素虚血性傷害を受けたラットの海馬領域においていくつかの神経炎症マーカー(ｃｃｌ２、ｃｘｃｌ２、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ｃｃｌ２０)の上方調節を顕著に阻害し、一方で低体温法そのものは、ｃｃｌ２上方調節を顕著に阻害したが、ＣＨＦ６４６７ほど効果的ではなかった(図７)。
【0174】
皮質において、ＣＨＦ６４６７(２０μｇ／ｋｇ)は、低酸素虚血性傷害により誘発されたいくつかの神経炎症マーカーの上方調節を阻害し(しかし、統計的な有意性に達したのはｃｘｃｌ２のみであった)、このような効果は、いくつかの神経炎症マーカー(ｃｃｌ７、ｃｃｌ２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ｃｘｃｌ２)については、低体温法との組合せにより増強された(図８)。
【0175】
さらに、ＣＨＦ６４６７と低体温法の併用は、ｃｃｌ２、ｃｃｌ７、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６に対する単独処置の効果を増強した。そして、ＣＨＦ６４６７は、未成熟の齧歯類の脳において低酸素性虚血により引き起こされる免疫炎症性応答に対して主要な調節効果を発揮し得て、このような効果は、低体温法と組み合わせたとき、重複しない。
【0176】
実施例４：ラット脳におけるＣＨＦ６４６７の定量化
方法
ペプチド選択および重標識標準物質の合成
ＣＨＦ６４６７および／または成熟ラットＮＧＦに対して種々の特異性を示す４種のペプチドを選択し(表２)、それらの対応するＡＱＵＡ(絶対定量)相同体をＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社で合成した。
方法
ペプチド選択および重標識標準物質の合成
ＣＨＦ６４６７および／または成熟ラットＮＧＦに対して種々の特異性を示す４種のペプチドを選択し(表２)、それらの対応するＡＱＵＡ(絶対定量)相同体をＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社で合成した。
【表2】
【0177】
試験動物の手順
試験動物を含む全ての手順と条件は、地元の倫理委員会により審査され、承認され、かつイタリア保健省により承認された(認可番号６７１／２０１９－ＰＲ)。以前に記載したとおり(Landucci et al., 2018, Neurosci. Lett. 668. doi:10.1016/j.neulet.2018.01.023.)、生後７日の仔Ｗｉｓｔａｒラットをイソフルランガス(誘発、４～５％；維持、１％)で麻酔した。正中線を切開し、４－０シルクを用いて左総頸動脈を結紮した。手術後、全ての仔ラットを、１時間の回復と授乳のために雌親のもとへ戻した。その後、仔ラットを、一部水浴に浸された、周囲を囲まれた通気性のあるプレキシグラス製チャンバー(Ｗ２０、Ｄ２０、Ｈ１７)に入れ、加温、加湿された気体(８％ 酸素 ９２％ 窒素)に１２０分間曝露させた。損傷後、仔マウスを１時間雌親のもとへ戻し、その後正常体温(３７℃)または低体温(３２℃)のチャンバーに４時間入れた。ＣＨＦ６４６７を４０μｇ／ｋｇの用量で、低酸素状態の終了直後に鼻腔内投与した。さらに、低酸素虚血性傷害を受けていない動物群に、４０μｇ／ｋｇ鼻腔内投与した。
試験動物を含む全ての手順と条件は、地元の倫理委員会により審査され、承認され、かつイタリア保健省により承認された(認可番号６７１／２０１９－ＰＲ)。以前に記載したとおり(Landucci et al., 2018, Neurosci. Lett. 668. doi:10.1016/j.neulet.2018.01.023.)、生後７日の仔Ｗｉｓｔａｒラットをイソフルランガス(誘発、４～５％；維持、１％)で麻酔した。正中線を切開し、４－０シルクを用いて左総頸動脈を結紮した。手術後、全ての仔ラットを、１時間の回復と授乳のために雌親のもとへ戻した。その後、仔ラットを、一部水浴に浸された、周囲を囲まれた通気性のあるプレキシグラス製チャンバー(Ｗ２０、Ｄ２０、Ｈ１７)に入れ、加温、加湿された気体(８％ 酸素 ９２％ 窒素)に１２０分間曝露させた。損傷後、仔マウスを１時間雌親のもとへ戻し、その後正常体温(３７℃)または低体温(３２℃)のチャンバーに４時間入れた。ＣＨＦ６４６７を４０μｇ／ｋｇの用量で、低酸素状態の終了直後に鼻腔内投与した。さらに、低酸素虚血性傷害を受けていない動物群に、４０μｇ／ｋｇ鼻腔内投与した。
【0178】
ＣＨＦ６４６７鼻腔内製剤および投与
低酸素状態の終了後、ラットを仰臥位に置いた。ＣＨＦ６４６７(濃度２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ 酢酸緩衝液、２０ｍＭ メチオニン、ｐＨ ５.５)を０.９％ 食塩水に溶解し、２０μｇ／ｋｇまたは４０μｇ／ｋｇ(総体積４μＬ、２μＬ／鼻孔)の用量で、投与間隔２分で各鼻孔に交互に鼻腔内送達した。
低酸素状態の終了後、ラットを仰臥位に置いた。ＣＨＦ６４６７(濃度２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ 酢酸緩衝液、２０ｍＭ メチオニン、ｐＨ ５.５)を０.９％ 食塩水に溶解し、２０μｇ／ｋｇまたは４０μｇ／ｋｇ(総体積４μＬ、２μＬ／鼻孔)の用量で、投与間隔２分で各鼻孔に交互に鼻腔内送達した。
【0179】
海馬および皮質脳領域からのタンパク質抽出
解凍した脳サンプルを氷冷し、抽出緩衝液を１０：１(ｖ／ｗ)の比で添加した(５０ｍＭ ＡＢＣ＋２％ ＳＤＳ＋プロテアーゼ阻害剤カクテル、希釈５００×)。ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩビーズミルにより、組織ホモジナイズを３０／秒で２分間実施した。その後、サンプルを７０℃で５分間保持し、室温で冷却した後、２５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼで１５分間処理した。タンパク質含量をＢＣＡアッセイにより定量した。
解凍した脳サンプルを氷冷し、抽出緩衝液を１０：１(ｖ／ｗ)の比で添加した(５０ｍＭ ＡＢＣ＋２％ ＳＤＳ＋プロテアーゼ阻害剤カクテル、希釈５００×)。ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩビーズミルにより、組織ホモジナイズを３０／秒で２分間実施した。その後、サンプルを７０℃で５分間保持し、室温で冷却した後、２５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼで１５分間処理した。タンパク質含量をＢＣＡアッセイにより定量した。
【0180】
タンパク質消化
脳ホモジネートを還元し(５ｍＭ ＤＴＴ、９５℃で５分間)、アルキル化する(１５ｍＭ ＩＡＡ、暗所で２４℃で４５分間)。Ｐｉｅｒｃｅスピンカラムでサンプル緩衝液から界面活性剤を除去する。その後、２０％ ＡＣＮを消化緩衝液に添加した後、トリプシンを１：２０(ｗ／ｗ)の割合で添加し、３７℃で５時間インキュベートし、その後さらにトリプシンを１：２０(ｗ／ｗ)の割合で添加し、３７℃で一晩インキュベートする。全てのサンプルに１.５ｎｇ／ｇのＡＱＵＡペプチドを滴下した後、反応を０.１％ ＴＦＡでクエンチする。
脳ホモジネートを還元し(５ｍＭ ＤＴＴ、９５℃で５分間)、アルキル化する(１５ｍＭ ＩＡＡ、暗所で２４℃で４５分間)。Ｐｉｅｒｃｅスピンカラムでサンプル緩衝液から界面活性剤を除去する。その後、２０％ ＡＣＮを消化緩衝液に添加した後、トリプシンを１：２０(ｗ／ｗ)の割合で添加し、３７℃で５時間インキュベートし、その後さらにトリプシンを１：２０(ｗ／ｗ)の割合で添加し、３７℃で一晩インキュベートする。全てのサンプルに１.５ｎｇ／ｇのＡＱＵＡペプチドを滴下した後、反応を０.１％ ＴＦＡでクエンチする。
【0181】
サンプル分画
消化されたサンプルを、３０％ ＡＣＮ、０.１％ ＴＦＡの直線勾配を用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ３.２／３００カラムおよびＦ９－Ｒコレクターを備えたＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ２５Ｍ系によるサイズ排除クロマトグラフィーにより分画する。
消化されたサンプルを、３０％ ＡＣＮ、０.１％ ＴＦＡの直線勾配を用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ３.２／３００カラムおよびＦ９－Ｒコレクターを備えたＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ２５Ｍ系によるサイズ排除クロマトグラフィーにより分画する。
【0182】
ＣＨＦ６４６７検出および定量化
選択されたＳＥＣ画分を回収し、ＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥させ、３％ ＡＣＮ、０.１％ ＴＦＡに再溶解した後、Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＦｕｓｉｏｎＴＭ ＬｕｍｏｓＴＭ ＴｒｉｂｒｉｄＴＭ質量スペクトロメーターを備えたＵｌｔｉＭａｔｅＴＭ３０００ ＲＳＬＣナノシステムによるナノＬＣ－ＭＳ分析を実施する。ナノＬＣは前濃縮モードで操作し、分離はＥＡＳＹ－Ｓｐｒａｙ ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ Ｃ１８カラム、５０ｃｍ×７５μｍにより実施する。移動相勾配は５～４０％ Ｂ液で１００分間であり、Ｂ液は８０％ ＡＣＮおよび０.１％ ＦＡである。質量分析は、目的のＣＨＦ６４６７ペプチドおよびそれらの対応する重標識ペプチドを検出するためのフルスキャンかつ時間指定のＰＲＭから成る。脳マトリックス中のＣＨＦ６４６７シグナルのレベルを定量するために一時的な検量線を作成した。０.０９～１２ｎｇ／ｇの間の８点の濃度範囲を、対照動物からの組織の分析用に最初に試験し、その後、０.０６～１３.５ｎｇ／ｇの８点の濃度範囲を、ＨＩＥ動物の分析の前に試験した。
選択されたＳＥＣ画分を回収し、ＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥させ、３％ ＡＣＮ、０.１％ ＴＦＡに再溶解した後、Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＦｕｓｉｏｎＴＭ ＬｕｍｏｓＴＭ ＴｒｉｂｒｉｄＴＭ質量スペクトロメーターを備えたＵｌｔｉＭａｔｅＴＭ３０００ ＲＳＬＣナノシステムによるナノＬＣ－ＭＳ分析を実施する。ナノＬＣは前濃縮モードで操作し、分離はＥＡＳＹ－Ｓｐｒａｙ ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ Ｃ１８カラム、５０ｃｍ×７５μｍにより実施する。移動相勾配は５～４０％ Ｂ液で１００分間であり、Ｂ液は８０％ ＡＣＮおよび０.１％ ＦＡである。質量分析は、目的のＣＨＦ６４６７ペプチドおよびそれらの対応する重標識ペプチドを検出するためのフルスキャンかつ時間指定のＰＲＭから成る。脳マトリックス中のＣＨＦ６４６７シグナルのレベルを定量するために一時的な検量線を作成した。０.０９～１２ｎｇ／ｇの間の８点の濃度範囲を、対照動物からの組織の分析用に最初に試験し、その後、０.０６～１３.５ｎｇ／ｇの８点の濃度範囲を、ＨＩＥ動物の分析の前に試験した。
【0183】
結果
天然成熟ヒトおよびラットＮＧＦアイソフォームならびにＣＨＦ６４６７バリアントの配列分析により、本発明者らは長い相同性領域を同定し、いくつかの独特なトリプシンペプチドもまた、同定した(表２)。本発明者らは、本試験の動物モデルを考慮し、ＣＨＦ６４６７変異体のプロテオタイプである２つのペプチド：ＳＳＳＨＰＩＦＨＲ(ｍ／ｚ ５３４.２６５)およびＱＡＡＷＥＦＩＲ(ｍ／ｚ ５１０.７５９)を選択した。また、本発明者らは、外因性アイソフォームと内因性アイソフォームの両方を報告する可能性のあるペプチド：ＱＹＦＦＥＴＫ(ｍ／ｚ ４８１.７２７、配列番号４)の寄与をモニタリングした。最後に、本発明者らは、ラット選択的ペプチド、ＡＬＴＴＤＤＫ(ｍ／ｚ ３８２.１８８、配列番号５)を同定し、潜在的内因性反応を具体的に報告した。
天然成熟ヒトおよびラットＮＧＦアイソフォームならびにＣＨＦ６４６７バリアントの配列分析により、本発明者らは長い相同性領域を同定し、いくつかの独特なトリプシンペプチドもまた、同定した(表２)。本発明者らは、本試験の動物モデルを考慮し、ＣＨＦ６４６７変異体のプロテオタイプである２つのペプチド：ＳＳＳＨＰＩＦＨＲ(ｍ／ｚ ５３４.２６５)およびＱＡＡＷＥＦＩＲ(ｍ／ｚ ５１０.７５９)を選択した。また、本発明者らは、外因性アイソフォームと内因性アイソフォームの両方を報告する可能性のあるペプチド：ＱＹＦＦＥＴＫ(ｍ／ｚ ４８１.７２７、配列番号４)の寄与をモニタリングした。最後に、本発明者らは、ラット選択的ペプチド、ＡＬＴＴＤＤＫ(ｍ／ｚ ３８２.１８８、配列番号５)を同定し、潜在的内因性反応を具体的に報告した。
【0184】
本発明者らは、対照の幼若ラットに鼻腔内投与した後のＣＨＦ６４６７の分布を予備的に試験した。この原理の証明は、少数のサンプル：３つの嗅球、２つの海馬および２つの大脳皮質で実施した。ＣＨＦ６４６７が全てのサンプルで検出され、これは目的の脳領域に浸透するＣＨＦ６４６７の能力を証明した。ＳＳＳＨＰＩＦＨＲ(配列番号２)ペプチドシグナルに基づいて実施した定量測定(図１０)は、平均で数百ピコグラムが皮質領域および海馬で見られ得ることを示した。
【0185】
本発明者らは、低酸素虚血性傷害を受けた幼若ラットに鼻腔内投与したＣＨＦ６４６７の脳浸透の程度の確認により、この試験を追跡調査した(Landucci et al., 2018 Neurosci. Lett. 668. doi:10.1016/j.neulet.2018.01.023.)。６匹の動物からの大脳皮質および海馬を分析し、同側と対側の組織を比較した。チューブに亀裂が入り、サンプル調製中に失われた３つの同側海馬を除いて、ＣＨＦ６４６７分析されたすべてのサンプルで検出され、同じ領域内のサンプル複製間で高い再現性があった(図１１)。定量のために選択された３つの全てのペプチドに基づくと、検出されたＣＨＦ６４６７の量は、試験された定量範囲(０.０６～１３.５ｎｇ／ｇ)から外れていると考えられ、低酸素虚血性傷害を受けたこの動物群内では６０ｐｇ／ｇ未満のレベルであることが示唆された。
【0186】
この試験により、ＣＨＦ６４６７は鼻腔内投与後に実際に脳へ入り、海馬および大脳皮質に到達し、神経保護効果および抗神経炎症効果を示し得ることが示された。
【0187】
質量分析は、複雑なマトリックス中のタンパク質を特異的に検出し定量化するための重要なツールである。全体として、データはＣＨＦ６４６７の鼻腔内投与により、関連する脳領域、特に海馬および皮質において検出可能なレベルのタンパク質が得られることを示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】