特表 2024-511642 新規ＴＮＦＲ２結合分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-14

(54)【発明の名称】新規ＴＮＦＲ２結合分子

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240307BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20240307BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240307BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240307BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240307BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20240307BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240307BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20240307BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240307BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240307BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240307BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240307BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C12N5/071

A61K39/395 U

A61P37/02

A61P37/06

A61P7/00

A61P1/04

A61P9/10 101

A61P17/00

A61P21/04

A61P3/10

G01N33/53 D

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023560278

(86)(22)【出願日】2022-04-01

(85)【翻訳文提出日】2023-11-27

(86)【国際出願番号】 EP2022058788

(87)【国際公開番号】W WO2022207921

(87)【国際公開日】2022-10-06

(31)【優先権主張番号】21166756.3

(32)【優先日】2021-04-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】506261534

【氏名又は名称】ユリウス－マクシミリアンズ－ウニヴェルジテート ウュルツブルグ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(72)【発明者】

【氏名】ワジャント，ハラルド

(72)【発明者】

【氏名】ベイルハック，アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】メドラー，ジュリアン

(72)【発明者】

【氏名】スタインファト，ティム

(72)【発明者】

【氏名】ファン ロンパエイ，ルク

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065BB19

4B065CA46

4C085AA14

4C085BB36

4C085CC04

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA30

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA29

4H045EA50

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA22

4H045GA26

(57)【要約】

本開示は、ＴＮＦＲ２に特異的に結合するがＴＮＦＲ１には結合しない結合分子を提供する。好ましくは、結合分子は、ＴＮＦＲ２のＦｃγＲ非依存的アゴニストであり、より好ましくはＴＮＦＲ２の結合に関して少なくとも２価を有する。結合分子は、診断および治療を含む多様な用途を有する。結合分子が免疫応答をモジュレートすることができる能力は、それらが自己免疫疾患または炎症状態の処置にとって特に好適であることを意味する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＮＦＲ２に特異的に結合するが、ＴＮＦＲ１には結合しない結合分子であって、ＴＮＦＲ２のＦｃγＲ非依存的アゴニストであり、ＴＮＦＲ２の結合に関して少なくとも２価を有する結合分子。

【請求項2】

少なくとも４価を有する、請求項１に記載の結合分子。

【請求項3】

（ａ）ＴＮＦＲ２に関して６価を有する；または
（ｂ）ＴＮＦＲ２に関して４価を有する、
請求項１または２に記載の結合分子。

【請求項4】

前記結合分子のＴＮＦＲ２に対して特異的な少なくとも１つの抗原結合ドメインが、ＴＮＦＲ２に対して特異的な単一ドメイン結合体（ｓｄＢ）、好ましくはＴＮＦＲ２に対して特異的な単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項5】

ＴＮＦＲ２に対して特異的な少なくとも１つのｓｄＢｒ（単一ドメイン結合体）がＶＨＨである、請求項４に記載の結合分子。

【請求項6】

各々がＴＮＦＲ２に対して特異的なＶＨＨ抗原結合ドメインである、６個のＴＮＦＲ２特異的抗原結合部位を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項7】

（ａ）６個のＶＨＨ抗原－結合ドメインおよびＦｃ領域を含み、好ましくは６価抗体である；
（ｂ）２つのポリペプチドを含み、各ポリペプチドがＴＮＦＲ２に対して特異的な３個のＶＨＨ結合ドメインを含み、好ましくは６価抗体である；
（ｃ）２つのポリペプチドを含み、各ポリペプチドがＴＮＦＲ２に対して特異的な３個のＶＨＨ結合ドメインを含み、各ポリペプチドが、さらにそのＣ末端部分でＣＨ２－ＣＨ３を含むがＣＨ１を含まない重鎖定常領域配列を含み、好ましくは６価抗体である；または
（ｄ）２つのポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、ＴＮＦＲ２に対して特異的な３個のＶＨＨ結合ドメインを含み、各ポリペプチドが、さらにそのＣ末端部分でＣＨ２－ＣＨ３を含むがＣＨ１を含まない重鎖定常領域配列を含み、およびＦｃドメインが低減されたエフェクター機能を有することを意味する改変を含み、好ましくは６価抗体である、
請求項６に記載の結合分子。

【請求項8】

（ａ）配列番号２１３／２１４／２１５；２１６／２１７／２１８；２１９／２２０／２２１；２２２／２２３／２２４；２２５／２２６／２２７；２２８／２２９／２３０；２３１／２３２／２３３；２３４／２３５／２３６；２３７／２３８／２３９；２４０／２４１／２４２；２４３／２４４／２４５；２４６／２４７／２４８；２４９／２５０／２５１；２５２／２５３／２５４のセットから選択されるＣＤＲ３個のセット；もしくは全体で最大５個のアミノ酸配列変化を有するそれらの任意のセットのＣＤＲのバリアントセットを含むＶＨＨドメインを含む抗原結合部位を含み、バリアント抗原結合部位がＴＮＦＲ２に対する結合能を保持している；
（ｂ）配列番号１５４／１５５／１５６の３個のＣＤＲ、もしくは全体で最大５個のアミノ酸配列変化を有するそれらのＣＤＲ３個のバリアントセットを含むＶＨＨドメインを含む抗原結合部位を含み、バリアント抗原結合部位がＴＮＦＲ２との結合能を保持している；
（ｃ）１５４／１５５／１５６；１６０／１６１／１６２；１６３／１６４／１６５；１６６／１６７／１６８；１６９／１７０／１７１；１８１／１８２／１８３；１８７／１８８／１８９；１９３／１９４／１９５から選択されるＣＤＲ３個のセット、もしくは最大５個のアミノ酸配列変化を有するそのいずれかのバリアントセットを含む抗原結合部位を含み、抗原結合部位がＴＮＦＲ２の結合能を保持している；
（ｄ）全て同じであり、（ａ）～（ｃ）のいずれかに定義される抗原結合部位である６個のＶＨＨ抗原結合部位を含む６価である；
（ｅ）２つのポリペプチドを含む６価であり、各々が３個のＶＨＨ抗原結合部位を含み、６個全ての抗原結合部位が（ａ）～（ｃ）のいずれかに定義される同じ抗原結合部位である；
（ｆ）６個のＶＨＨ抗原結合部位を含む６価であり、ＶＨＨ抗原結合部位の少なくとも２つがＴＮＦＲ２に関して異なる特異性を有し、それらの特異性の少なくとも１つが（ａ）～（ｃ）のいずれかに定義されるＶＨＨ抗原結合部位によって付与される；
（ｇ）６個のＶＨＨ抗原結合部位を含む６価であり、ＶＨＨ抗原結合部位の少なくとも３個がＴＮＦＲ２に関して異なる特異性を有し、それらの特異性の少なくとも１つが（ａ）～（ｃ）のいずれかに定義されるＶＨＨ抗原結合部位によって付与される；または
（ｈ）６個のＶＨＨ抗原結合部位を含む６価であり、６個全てのＶＨＨ抗原結合部位が、ＴＮＦＲ２に関して異なる特異性を有し、それらの特異性の少なくとも１つが（ａ）～（ｃ）のいずれかに定義されるＶＨＨ抗原結合部位によって付与される、
請求項１から７のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項9】

（ａ）配列番号１９８～２１１の少なくとも１つのＶＨＨ抗原結合ドメイン、もしくはなおもＴＮＦＲ２に結合することができる少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む；
（ｂ）配列番号１４０から選択される少なくとも１つのＶＨＨ抗原結合ドメインもしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するそのいずれかのバリアントを含む；
（ｃ）配列番号１４０、１４２～１４５、１４９、１５１、１５３のドメインから、もしくはなおもＴＮＦＲ２に結合することができる少なくとも９０％の配列同一性を有するそのいずれかのバリアントから選択される少なくとも１つのＶＨＨ抗原結合ドメインを含む；
（ｄ）各々が、（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）に定義される少なくとも１つのＶＨＨ抗原結合ドメインを含む２つのポリペプチドを含む；
（ｅ）各々が（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）に定義される３個のＶＨＨ抗原結合ドメインを含む２つのポリペプチドを含む；
（ｆ）各々が、（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）に定義される３個のＶＨＨ抗原結合ドメインを含む２つのポリペプチドを含み、ＴＮＦＲ２に対して特異的な結合分子の抗原結合ドメインが全て同じである；または
（ｇ）各々が、（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）に定義される３個のＶＨＨ抗原結合ドメインを含む２つのポリペプチドを含み、ＴＮＦＲ２に対して特異的な結合分子の必ずしも全てのＶＨＨ抗原－結合ドメインが同じではない、
請求項１から８のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項10】

（ａ）各々が、
（ｉ）その配列内の配列番号１４０に対応するＶＨＨドメインがその代わりに配列番号１９８～２１１の１つの配列であることを除き、配列番号１９７のアミノ酸配列；もしくは
（ｉｉ）（ｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有し、なおもＴＮＦＲ２に結合することができるバリアントアミノ酸配列；
を有する２つのポリペプチドを含む；
（ｂ）各々が、配列番号１９７のアミノ酸配列、もしくはなおもＴＮＦＲ２に結合することができる少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含み、好ましくは各ポリペプチドが３個のそのようなＶＨＨ結合ドメインを含む；
（ｃ）各々が、
（ｉ）配列内の配列番号１４０に対応するＶＨＨドメインが、その代わりに配列番号１４０、１４２～１４５、１４９、１５１、もしくは１５３の１つの配列であることを除く、配列番号１９７のアミノ酸配列；
（ｉｉ）（ｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有し、なおもＴＮＦＲ２に結合することができるアミノ酸配列
を有する２つのポリペプチドを含む；
（ｄ）前記バリアントアミノ酸配列が前記特異的配列と比較して１～５個のアミノ酸配列変化を有し、前記結合分子がＴＮＦＲ２に対する結合能を保持し、好ましくは前記バリアントが前記特異的配列と比較して１個のみ、２、もしくは３個、より好ましくは１個のアミノ酸配列変化を有する、（ａ）～（ｃ）のいずれか１つである；または
（ｅ）前記バリアントアミノ酸配列が、配列番号３２７のアミノ酸配列に交換された配列番号１９７のアミノ酸３０２～４０５の配列を有する、（ａ）～（ｃ）のいずれか１つである、
請求項１から７のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項11】

（ａ）配列番号３３０のアミノ酸配列、もしくはなおもＴＮＦＲ２に結合することができる少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを有するポリペプチドを含む；
（ｂ）配列番号３３１のアミノ酸配列、もしくはなおもＴＮＦＲ２に結合することができる少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを有するポリペプチドを含む；または
（ｃ）（ａ）の３個のポリペプチドもしくは（ｂ）の３個のポリペプチドを含む、
請求項１から７のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項12】

ＴＮＦＲ２の「Ｎ末端」および「Ｃ末端」方向の両方の結合部位を有する、４価を有する抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項13】

（ａ）ＣＤＲ６個のセットを含む抗原結合部位を含み：
（ｉ）軽鎖ＣＤＲが、配列番号２６６／２６７／２６８；２６９／２７０／２７１；２７２／２７３／２７４；２７５／２７６／２７７から選択されるＣＤＲ１／ＣＤＲ２／ＣＤＲ３のセットから選択され、重鎖ＣＤＲが２８２／２８３／２８４；２８５／２８６／２８７；２８８／２８９／２９０；もしくは２９１／２９２／２９３から選択されるＣＤＲ１／ＣＤＲ２／ＣＤＲ３のセットから選択され；または
（ｉｉ）前記ＣＤＲ６個のセットが、特異的な６個のＣＤＲと比較して全体で５個以下のアミノ酸変化を有する（ｉ）のＣＤＲ６個のセットのバリアントであり、前記抗原結合部位がＴＮＦＲ２の結合能を保持している；
（ｂ）ＣＤＲ６個のセットを含む抗原結合部位を含み、
（ｉ）前記軽鎖ＣＤＲ１／ＣＤＲ２／ＣＤＲ３が配列番号６９／７０／７１であり、前期重鎖ＣＤＲ１／ＣＤＲ２／ＣＤＲ３が配列番号１０２／１０３／１０４である；
（ｉｉ）前記ＣＤＲ６個のセットが、特異的な６個のＣＤＲと比較して全体で５個以下のアミノ酸変化を有する（ｉ）のＣＤＲ６個のセットのバリアントであり、前記抗原結合部位がＴＮＦＲ２の結合能を保持している；
（ｃ）表５に記載のものからの軽鎖ＣＤＲ３個のセットおよび／または重鎖ＣＤＲ３個のセットを含む抗原結合部位を含む；
（ｄ）表５に記載の６個のセットからのＣＤＲ６個のセット、またはＴＮＦＲ２の結合能を保持している５個以下のアミノ酸配列変化を有するＣＤＲ６個のバリアントセットを含む；
（ｆ）４個全ての抗原結合部位が同じである、（ａ）～（ｄ）のいずれか１つに記載の４つの抗原結合部位を含む；
（ｇ）４個全ての抗原結合部位が同じである、（ａ）～（ｄ）のいずれか１つに記載の４つの抗原結合部位を含み、前記抗体がＴＮＦＲ２に関して４価である；あるいは
（ｈ）４個全ての抗原結合部位が同じである、（ａ）～（ｄ）のいずれか１つに記載の４つの抗原結合部位を含み、前記抗体がＴＮＦＲ２に関して４価であり、２つのＮ末端指向性抗原結合部位および２つのＣ末端指向性抗原結合部位を含む、
請求項１から３または１２のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項14】

（ａ）（ｉ）各々の軽鎖ポリペプチドが、配列番号２９５に対応するアミノ酸配列が配列番号２６２～２６５の１つから選択される配列に交換されていることを除き、配列番号２６１の配列を有するアミノ酸配列を含む２つの軽鎖ポリペプチド；または
（ｉｉ）各々が（ｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有する２つのバリアント軽鎖ポリペプチド；
である２つの軽鎖ポリペプチド；および
（ｂ）（ｉｉｉ）各々の重鎖ポリペプチドが、配列番号２９６に対応するアミノ酸配列が配列番号２７８～２８１の１つから選択される配列に交換されていることを除き、配列番号２５９の配列を有するアミノ酸配列を含む２つの重鎖ポリペプチド；または
（ｉｖ）各々が（ｉｉｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有する２つのバリアント重鎖ポリペプチド
である２つの重鎖ポリペプチド、を含む抗体である、
請求項１から３または１２のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項15】

（ａ）配列番号２６１の配列、もしくは配列番号２６１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する２つの軽鎖ポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２５９の配列、もしくは配列番号２５９と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する２つの重鎖ポリペプチド、
を含む抗体である、請求項１から３または１２のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項16】

（ａ）配列番号３３２の軽鎖および配列番号３３３の重鎖、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み、なおもＴＮＦＲ２アゴニストとして作用することができる；
（ｂ）配列番号３３４の軽鎖および配列番号３３５の重鎖、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み、なおもＴＮＦＲ２アゴニストとして作用することができる；
（ｃ）配列番号３３６の軽鎖および配列番号３３７の重鎖、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み、なおもＴＮＦＲ２アゴニストとして作用することができる；または
（ｄ）全て（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）に定義される２つの軽鎖および２つの重鎖を含む
請求項１から３または１２のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項17】

（ａ）ＴＮＦＲ２を発現する細胞の表面上でＴＮＦＲ２をオリゴマー形成して、好ましくは前記細胞表面上で６個もしくはそれより多くのＴＮＦＲ２分子をクラスター化する；
（ｂ）ＴＮＦＲ２シグナル伝達を誘発する；および／または
（ｃ）白血球、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激する
ことができる、請求項１から１６のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項18】

（ａ）血清中半減期を変更する部分であって、好ましくはＦｃテール、血清アルブミン、血清アルブミンの結合体である部分、およびＰＥＧからなる群から選択される部分を含む；
（ａ）ＴＮＦＲ２結合に関して２価である；
（ｂ）ＴＮＦＲ２結合に関して３価である；
（ｃ）ＴＮＦＲ２結合に関して４価である；または
（ｄ）ＴＮＦＲ２結合に関して少なくとも４価を有する、
請求項１に記載の結合分子。

【請求項19】

（ａ）抗体である；
（ｂ）ＴＮＦＲ２のリガンドを含む抗体である；
（ｃ）抗体定常領域の少なくとも一部、好ましくはＦｃ領域を含む；または
（ｄ）ＴＮＦＲ２のリガンドであって、好ましくはＴＮＦαもしくはリンフォトキシン－アルファに由来するリガンドを含む、
好ましくは、
（ａ）抗体の１つもしくは複数の重鎖のＮ末端およびＣ末端の両方でＴＮＦＲ２結合部位を含む抗体；または
（ｂ）抗体の１つもしくは複数の軽鎖のＮ末端およびＣ末端の両方でＴＮＦＲ２結合部位を含む抗体である、
請求項１に記載の結合分子。

【請求項20】

（ａ）前記抗体が、２価抗体である；
（ｂ）前記抗体が、３価抗体である；
（ｃ）前記抗体が、４価抗体である；
（ｄ）前記抗体が、６価抗体である；
（ｅ）前記抗体が、重鎖のみの抗体である；
（ｆ）前記抗体が、単一ドメイン抗体、例えば単一ドメインＡｂ（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨ、またはナノボディである；
（ｇ）前記抗体が、少なくとも２つの抗体の多量体である；
（ｈ）前記抗体が、多量体形成部分、好ましくはテナシン－ｃペプチド（ＴＮＣ）、を含むかまたはそれに連結され、好ましくは前記テナシン－ｃペプチド配列を通して会合する少なくとも２つの抗体の多量体である；
（ｉ）前記抗体が、ＴＮＦＲ２のリガンドに由来する、好ましくはＴＮＦ－αまたはリンフォトキシンアルファに由来する１つまたは複数の分子に連結されている、
請求項１９に記載の結合分子。

【請求項21】

（ａ）前記抗体がＦｃ領域を欠如する；
（ｂ）前記抗体が、Ｆｃ受容体に結合することができない改変Ｆｃ領域を含む；または
（ｃ）前記抗体が、ＣＨ１を欠如する重鎖定常領域を含む、
請求項１９または２０に記載の結合分子。

【請求項22】

－ Ｆｃ受容体結合を除去するＦｃ改変を有するＩｇＧ；
－ ＩｇＧがＦｃ受容体結合を除去するＦｃ改変を有する、ｓｃＦｖ：ＩｇＧ；
－ ＩｇＧがＦｃ受容体結合を除去する改変を有する、ＩｇＧ－ＨＣ：ＴＮＣ；
－ ＩｇＧがＦｃ受容体結合を除去する改変を有する、ｓｃＦｖ：ＩｇＧ－ＨＣ：ＴＮＣ；
－ ６量体ＩｇＧ；
－ ３（ＶＨＨ－ＴＮＣ）
から選択される抗体フォーマットの抗体であり；
－ ＨＣがＩｇＧの重鎖を表し；
－ ＬＣがＩｇＧの軽鎖を表し；
－ ｓｃＦｖ：ＩｇＧが、ＩｇＧ分子に連結されたまたはその一部を形成するｓｃＦｖを表し；
－ ＨＣ：ＴＮＣが、テナシン－ｃ三量体形成ドメインペプチド（ＴＮＣ）を含むかまたはそれに連結された重鎖（ＨＣ）を示し；
－ ＶＨＨ－ＴＮＣが、ＶＨＨに連結されたまたはそれに結合したテナシンを示す、
請求項１に記載の結合分子。

【請求項23】

－ Ｆａｂ－ＬＣ：ｓｃＦｖ；
－ ＩｇＧが、Ｆｃ受容体結合を除去する改変、好ましくはＮ２９７Ａを有する、ＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖ；
－ ＩｇＧが、Ｆｃ受容体結合を除去する改変、好ましくはＮ２９７Ａを有する、ＩｇＧ－ＬＣ：ｓｃＦｖ；
－ ＩｇＧ－ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ；
－ ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ－ＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖ；
－ ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ－ＩｇＧ－ＬＣ：ｓｃＦｖ；
－ ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ－ＩｇＧ－ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ；および
－ ＩｇＧ－ＨＣ－ＴＮＣ－ｓｃＦｖ；
－ ｓｄＡｂ／ＶＨＨ；
－ ３（ＶＨＨ－ＴＮＣ）、
からなる群から選択される抗体フォーマットの抗体であり、
－ ＨＣがＩｇＧの重鎖を表し；
－ ＬＣがＩｇＧの軽鎖を表し；
－ ＬＣ：ｓｃＦｖが、軽鎖に連結されたまたはその一部を形成するｓｃＦｖを示し；
－ ＨＣ：ｓｃＦｖが、重鎖に連結されたまたはその一部を形成するｓｃＦｖを示し；
－ ＨＣ：ＴＮＣが、テナシン（ＴＮＣ）を含むかまたはそれに連結された重鎖（ＨＣ）を示し；
－ ＴＮＣ－ｓｃＦｖが、ｓｃＦｖに連結されたまたはそれに結合したテナシンを示し；
－ ＴＮＣ－ＶＨＨが、ＶＨＨに連結されたまたはそれに結合したテナシンを示し；
－ ｓｄＡｂが単一ドメイン抗体を示し；
－ ＶＨＨが、ラクダ科抗体の可変領域を示し；
－ ＶＨＨ－ＴＮＣが、ＶＨＨに連結されたまたはそれに結合したテナシンを示し、
好ましくは、抗体であり、
－ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ；
－ ＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖ；
－ ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１；および
－ ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１－ＴＮＣ
から選択される抗体フォーマットの抗体である、
請求項１に記載の結合分子。

【請求項24】

（ａ）ＴＮＦＲ２に関して異なる特異性を有する少なくとも２つの抗原結合部位を含む；
（ｂ）ＴＮＦＲ２に対して特異的な前記結合分子の全ての前記抗原結合部位が、各々ＴＮＦＲ２に関して異なる特異性を有する；
（ｃ）２つのポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、ＴＮＦＲ２に対して特異的な３個のＶＨＨ抗原－結合ドメインを含み、それらの３個のＶＨＨ抗原結合ドメインの少なくとも２つがＴＮＦＲ２に関して異なる特異性を有する；または
（ｄ）２つのポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、ＴＮＦＲ２に対して特異的な３個のＶＨＨ抗原結合ドメインを含み、前記３個のＶＨＨ抗原－結合ドメインがＴＮＦＲ２に関して異なる特異性を有する、
請求項１に記載の結合分子。

【請求項25】

ＴＮＦＲ２に特異的に結合するが、ＴＮＦＲ１には結合しない結合分子であって、ＴＮＦＲ２のＦｃγＲ非依存的アゴニストであり、ＴＮＦＲ２の結合に関して少なくとも２価を有し、ならびにＴＮＦＲ２に結合するが、ＴＮＦＲ１には結合しない突然変異体ＴＮＦ－アルファ、およびＦｃ領域、またはポリペプチドをオリゴマー形成するテナシンペプチド配列、または両方を含むポリペプチドを含み、
好ましくは、
（ａ）抗体配列を含まない；
（ｂ）ＴＮＦＲ２に結合するが、ＴＮＦＲ１には結合しない突然変異体ＴＮＦ－アルファ、およびテナシンペプチドを含むポリペプチドを含む；
（ｃ）ＴＮＦ－アルファ突然変異体がＴＮＦ８０である；ならびに／または
（ｄ）ＴＮＦＲ２に関して少なくとも３価、好ましくはＴＮＦＲ２に関して６価を有する、
結合分子である、結合分子。

【請求項26】

医薬として使用するための、請求項１から２５のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項27】

自己免疫障害または炎症障害を処置または防止する方法に使用するための、請求項１から２５のいずれか一項に記載の結合分子であって、好ましくは、
（ａ）前記障害が移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）であり、好ましくは前記結合分子が、細胞、組織、もしくは臓器の移植の前、移植と同時、もしくは移植の後に投与される方法に使用するためである；または
（ｂ）前記障害が白血球、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＴｒｅｇ細胞の機能障害もしくは望ましくない増殖を伴う障害である；または
（ｃ）前記障害が、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、もしくはセリアック病）、アテローム性動脈硬化症、狼瘡、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、および水疱性類天疱瘡から選択される、結合分子。

【請求項28】

ＴＮＦＲ２を発現する標的細胞を、請求項１から２５のいずれか一項に記載の結合分子と接触させることを含む、細胞増殖を刺激する方法。

【請求項29】

請求項１から２５のいずれか一項に記載の結合分子、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項30】

試験試料を、請求項１から２５のいずれか一項に記載の結合分子と接触させること、およびＴＮＦＲ２に対する前記結合分子の結合を検出することを含む、ＴＮＦＲ２を検出する方法であって、
好ましくは、前記結合分子が標識され、ＴＮＦＲ２に対する結合分子の結合が標識を介して検出される、方法。

【請求項31】

診断方法に使用するための請求項１から２５のいずれか一項に記載の結合分子であって、前記方法が請求項１から２３のいずれか一項に記載の結合分子を対象に投与すること、およびＴＮＦＲ２に対する結合分子の結合を検出することを含み、
好ましくは、前期結合分子が標識され、ＴＮＦＲ２に対する結合分子の結合が前記標識を介して検出される、結合分子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＴＮＦＲ２（腫瘍壊死因子受容体２、ＴＮＦＲＳＦ１ＢおよびＣＤ１２０Ｂとしても公知である）に対して特異的な結合分子に関する。結合分子は、典型的にＴＮＦＲ２に結合し、ＦｃγＲ（Ｆｃガンマ受容体）結合とは無関係にＴＮＦＲ２シグナル伝達を誘発することができる。結合分子は、ＴＮＦＲ２を発現する細胞を標的とするために使用され得る。本発明はまた、処置および診断の方法、特に炎症障害および自己免疫疾患などの障害を処置する方法における結合分子の使用にも関する。

【背景技術】

【0002】

ＴＮＦαは、炎症、分化、および組織恒常性において広範囲の役割を果たすサイトカインであり、可溶性および膜貫通型として存在する。これは、炎症および自己免疫状態における望ましくない免疫応答を抑制するために、臨床においてＴＮＦ遮断試薬によって標的化される重要な炎症メディエーターである。ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２は、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦα）の別個の受容体であり、各受容体を通してのシグナル伝達は異なる効果を誘発する。ＴＮＦＲ１を介するシグナル伝達は、強く多様な炎症促進効果を誘発するが、ＴＮＦＲ２を介するシグナル伝達は、免疫の刺激から免疫応答の抑制、組織再生に及ぶ広範囲の効果を有する。２つの受容体はまた、それらが発現される細胞に関しても互いに異なる。ＴＮＦＲ１は遍在性に発現されるが、ＴＮＦＲ２は、より限定的な細胞群、特に免疫細胞のサブセット、内皮細胞、およびニューロンにおいて見出される。ＴＮＦＲ２を発現する免疫細胞は、免疫抑制細胞型、例えば制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）、およびＭＤＳＣ（骨髄由来サプレッサー細胞）、ならびに他の細胞タイプ、例えばＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。

【0003】

ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２は、４つの特徴的なシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を含有する細胞外ドメイン、膜貫通セグメント、および細胞内ドメインを有する。ＴＮＦＲ１とは異なり、ＴＮＦＲ２は、細胞質デスドメインを含まないが、なおもＴＲＡＦ２およびｃＩＡＰなどの細胞死調節因子を制御することによってアポトーシスにおいて役割を果たし得る。ＴＮＦＲ２分子は、互いに会合して、ＴＮＦＲ２の二量体および三量体複合体を形成することができ、これらは高親和性でＴＮＦαに結合することができ、それによって細胞内シグナル伝達が可能な三量体ＴＮＦ－ＴＮＦＲ２複合体のオリゴマーの形成をもたらす。ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の両方が、同じ細胞タイプの表面上に発現され得るが、両者は互いに複合体を形成しない。ＴＮＦＲ２は、可溶性および膜結合型ＴＮＦαの両方に結合することができる。膜ＴＮＦαの結合は、ＴＮＦＲ２を有効に活性化することができるが、可溶性ＴＮＦαでは、リガンドが結合したＴＮＦＲ２三量体の六量体または高次複合体へのオリゴマー化は、不適切であり、このように有効なＴＮＦＲ２活性化を誘発することができない。ＴＮＦαと同様に、リンフォトキシン－アルファ（ＬＴα）もまた、ＴＮＦＲ２のリガンドとして作用すると考えられる。

【0004】

ＴＮＦＲ２が、膜ＴＮＦαによって活性化されると、受容体の細胞内ドメインは、既に存在する細胞質ＴＲＡＦ２三量体を動員すると考えられ、これによってＥ３リガーゼｃＩＡＰ１およびｃＩＡＰ２のＴＮＦＲ２複合体への動員をもたらし、これは古典的ＮＦκＢシグナル伝達をもたらす。ＴＲＡＦ２動員はまた、非古典的ＮＦκＢシグナル伝達経路を活性化することにも関連する。膜ＴＮＦαのＴＮＦＲ２に対する結合もまた、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を通してのシグナル伝達を誘発すると考えられ、生存を維持し、増殖を増強し、ならびに細胞接着および遊走などの他の機能を促進する。ＴＮＦＲ２ノックアウトマウスは、炎症疾患に対してより感受性が高いが、それらはＴｒｅｇ細胞を有し、より応答性が低い。ＴＮＦＲ２の天然に存在する多型もまた存在し、広く多様な自己免疫疾患に関連する。

【0005】

Ｔｒｅｇ細胞に及ぼすＴＮＦＲ２の発現および機能により、特にＴＮＦＲ２は、ＴＮＦＲ１より限定的なサブセットの細胞上で見出されることから、免疫系をモジュレートするための望ましい標的となる。Ｔｒｅｇ細胞を刺激する能力は、免疫応答を抑制する能力が有用であり得る広範囲の状態、例えばアレルギー、自己免疫、移植、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および感染疾患における望ましくない免疫応答を制御する方法を提供する。Ｔｒｅｇ細胞と同様に、ＴＮＦＲ２を発現する他の細胞タイプを、所望の機能をもたらすために標的化してもよい。したがって、ＴＮＦＲ２を標的として活性化する作用剤が現在必要である。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインに結合することができる結合分子を提供する。好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２に結合して受容体を通してシグナル伝達を誘発し、このようにアゴニストとして作用することができる。さらに特に好ましい実施形態では、結合分子は、ＦｃγＲ結合とは無関係にＴＮＦＲ２のアゴニストとして作用し得る。特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、抗体または抗体断片である。本発明のさらに特に好ましい実施形態では、結合分子は、ＴＮＦＲ２に特異的に結合するが、ＴＮＦＲ１には結合しないという点で選択的である。

【0007】

結合分子は、診断的応用から治療的使用まで多様な用途を有し得る。結合分子は、免疫系をモジュレートする能力を有することから、それらは自己免疫状態および炎症状態を処置するために特に有用である。結合分子を使用して、Ｔｒｅｇ細胞に及ぼすその作用により免疫系を下方調節してもよく、それによって特に移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を含むそのような状態の処置において特に有用である。

【0008】

したがって、一実施形態では、本発明は、ＴＮＦＲ２に特異的に結合するが、ＴＮＦＲ１には結合しない結合分子であって、ＴＮＦＲ２のＦｃγＲ非依存的アゴニストであり、ＴＮＦＲ２の結合に関して少なくとも２価を有する結合分子を提供する。特に好ましい実施形態では、結合分子は、ＴＮＦＲ２に関して少なくとも４価を有する。さらに特に好ましい実施形態では、結合分子は、ＴＮＦＲ２に関して４価を有する。特に好ましい実施形態では、結合分子は、ＴＮＦＲ２に関して少なくとも６価を有する。さらに特に好ましい実施形態では、結合分子は、ＴＮＦＲ２に関して６価を有する。

【0009】

別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２に対して特異的なＶＨＨ結合ドメインであるＴＮＦＲ２の少なくとも１つの結合ドメインを含む。別の特に好ましい実施形態では、ＴＮＦＲ２に対して特異的な結合ドメインは全て、ＴＮＦＲ２に対して特異的なＶＨＨ結合ドメインである。さらに特に好ましい実施形態では、結合分子は、ＴＮＦＲ２に対して特異的な６個のＶＨＨ結合ドメインを含む６価抗体である。

【0010】

本発明はまた、以下も提供する。
・ 医薬として使用するための本発明の結合分子。
・ 自己免疫障害または炎症障害を処置または防止する方法に使用するための本発明の結合分子。
・ 障害に罹患するまたは障害のリスクがある対象に、本発明の結合分子を投与することを含む、自己免疫障害または炎症障害を処置または防止する方法。
・ 自己免疫障害または炎症障害を処置または防止する方法に使用するための医薬の製造のための本発明の結合分子の使用。
・ ＴＮＦＲ２を発現する標的細胞を、本発明の結合分子と接触させることを含む、細胞増殖を刺激する方法。
・ 本発明の結合分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
・ 試験試料を本発明の結合分子と接触させること、および存在する場合、ＴＮＦＲ２に対する結合分子の結合を検出することを含む、ＴＮＦＲ２を検出する方法。
・ 本発明の結合分子を対象に投与すること、および存在する場合、ＴＮＦＲ２に対する結合分子の結合を検出することを含む診断方法。
・ 診断方法に使用するための本発明の結合分子であって、方法が、本発明の結合分子を対象に投与すること、およびＴＮＦＲ２に対する結合分子の結合を検出することを含む、方法。

【0011】

配列表
本出願は、提出された本出願の一部を形成する電子形態の配列表を含む。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】Ｎ末端が組織化されたＴＮＦＲ２結合部位（ＦａｂまたはｓｃＦｖドメイン）を有する例示的な抗ＴＮＦＲ２抗体バリアントのドメイン構造の命名およびスキームを示す図である。ＣＩ＝親抗ＴＮＦＲ２抗体のクローン識別子、例えば、マウス抗ヒトＴＮＦＲ２抗体Ｃ４、Ｃ１９、Ｃ９、Ｃ４０等；Ｎ２９７Ａは、ＦｃγＲ相互作用を低減させるヒトＩｇＧ１の重鎖における対応する突然変異を指す；Ｎ－ＲＧＹは、Ｎ２９７Ａ突然変異プラスＩｇＧ１六量体形成を促進する突然変異を指す。

【図2】Ｎ末端単一方向指向性ＴＮＦＲ２結合部位を有する抗ＴＮＦＲ２抗体Ｃ４のバリアントのウェスタンブロット分析を示す図である。表記のＣ４構築物のＦｌａｇタグ付けバリアント（２００ｎｇ）を、抗ヒトＩｇＧおよび抗Ｆｌａｇ抗体によるウェスタンブロッティングによって分析した。

【図3】単一方向に組織化されたＮ末端ＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ４バリアントによる処置後のＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞におけるＴＮＦＲ２媒介ＩＬ８産生を示す図である。ヒトＴＮＦＲ２を安定に発現するＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の濃度の様々なＣ４構築物を含有する上清によって刺激した。翌日、上清を採取し、そのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。示されるデータは、並列処理した実験に由来し、よりよい解像度のために３つのダイアグラムで示した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）陽性対照によって誘導された最大応答を点線で示す。

【図4】単一方向指向性Ｎ末端ＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ４バリアントによる処置後のＫｙｍ－１細胞におけるＴＮＦＲ２媒介細胞死を示す図である。Ｋｙｍ－１細胞を、表記の濃度の様々なＣ４構築物を含有する上清によって刺激した。翌日、細胞生存率を、クリスタルバイオレット染色を使用して決定した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）（ｏｌｉｇｏ ＴＮＦ８０）を、ＴＮＦＲ２エンゲージメントに関する陽性対照とした。

【図5】単一方向指向性Ｎ末端ＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ４バリアントによる処置後のＫｙｍ－１細胞におけるＴＮＦＲ２媒介ｐ１００プロセシングを示す図である。Ｋｙｍ－１細胞を、表記の濃度の様々なＣ４バリアントを含有する上清によって一晩刺激した。処置を、ＴＮＦＲ２誘導細胞死を防止するために２０μＭ ＺＶＡＤの存在下で実施した。ヒトおよびマウスＴＮＦＲ２を強力に活性化するマウスＴＮＦの九量体ＴＮＦＲ２特異的突然変異体（ｏｌｉｇｏ ＴＮＦ８０）を、陽性対照として使用した。

【図6】単一方向指向性Ｎ末端ＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ１９、Ｃ２７、およびＣ４０バリアントによる処置後のＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞におけるＴＮＦＲ２媒介ＩＬ８産生を示す図である。ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の濃度の様々な構築物を含有する上清によって刺激した。翌日、上清を採取し、そのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）陽性対照によって誘導された最大応答を点線で示す。注意：低親和性抗体Ｃ２７に由来する構築物さえも、有意なアゴニスト活性を示した（下のパネル）。

【図7】Ｎ末端およびＣ末端が組織化されたＴＮＦＲ２結合部位（ＦａｂまたはｓｃＦｖドメイン）を有する抗ＴＮＦＲ２抗体バリアントのドメイン構造の命名法およびスキームを示す図である。ＣＩ＝クローン識別子、例えばＣ４、Ｃ１９等；Ｎ２９７Ａは、ＦｃγＲ結合を低減させるヒトＩｇＧ１の重鎖における対応する突然変異を指す。

【図8】Ｎ末端およびＣ末端融合ＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ４バリアントのウェスタンブロット分析を示す図である。表記のＣ４構築物（２００ｎｇ）のＦｌａｇタグ付けバリアントを、抗ヒトＩｇＧおよび抗Ｆｌａｇ抗体によるウェスタンブロッティングによって分析した。Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４の重鎖は、Ｆｌａｇタグを含有しないことに注意されたい。

【図9】Ｎ末端およびＣ末端ＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ４構築物による処置後のＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞におけるＴＮＦＲ２媒介ＩＬ８産生を示す図である。ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の濃度の様々なＣ４構築物を含有する上清によって刺激した。翌日、上清を採取し、そのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。示されるデータは、並列処理した実験に由来し、よりよい解像度のために３つのダイアグラムで示した。陽性対照（ｏｌｉｇｏ ＴＮＦ８０；高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ））によって誘導された最大応答を点線で示す。Ｎ末端結合部位のみを有する対応する構築物を、比較のために並行して分析した。

【図10】Ｎ末端およびＣ末端組織化ＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ４構築物による処置後のＫｙｍ－１細胞におけるＴＮＦＲ２媒介細胞死を示す図である。Ｋｙｍ－１細胞を、表記の概略濃度の様々なＣ４構築物を含有するＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞からの上清によって刺激した。翌日、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイを使用して決定した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）を陽性対照として使用した。

【図11】ＴＮＦＲ２特異的抗体の結合特性を示す図である。（Ａ）ヒトＴＮＦＲ２を発現する細胞に対する表記の抗ＴＮＦＲ２抗体ＧｐＬ融合タンパク質の３７℃での平衡結合。（Ｂ）ＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２細胞を表記の量の抗ＴＮＦＲ２抗体によって前処置したか、または無処置のままとした。５ｎｇ／ｍｌ ＧｐＬ－ＴＮＦを添加して、１時間インキュベーション後に結合を測定した。様々な構築物の非トランスフェクトＨｅＬａ細胞に対する結合を分析して、非特異的結合値を得た。

【図12】αＴＮＦＲ２抗体の競合を示す図である。ＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２細胞を、３～１０μｇ／ｍｌの表記の抗ＴＮＦＲ２抗体によって前処置したか、または無処置のままとした。５０ｎｇ／ｍｌの様々なαＴＮＦＲ２－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＬＣ：ＧｐＬバリアントを添加し、１時間後に結合を測定した。

【図13】４価ｍＡｂ結合ＴＮＦＲ２分子が、従来の２価ｍＡｂバリアントが結合するＴＮＦＲ２分子よりはるかに強いＩＬ８誘導を誘発することを示す図である。（Ａ、Ｂ）ＴＮＦＲ２陰性Ｈｅｌａ細胞およびＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２細胞を対にして、表記の濃度のＴＮＦＲ２特異的ｍＡｂ Ｃ４の２価および４価型のＧｐＬ融合タンパク質によって８時間刺激した（スキームの挿入図を参照されたい）。次に、ＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２細胞の上清を、ＴＮＦＲ２誘導ＩＬ８産生に関して分析し（Ｂ）、繰り返し洗浄した細胞（ＨｅＬａ、およびＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２）を、細胞関連ＧｐＬ活性に関して分析した。（Ａ）に示したＴＮＦＲ２に対する特異的結合は、ＨｅＬａ細胞から得た非特異的結合値を、ＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２細胞に由来する総結合値から減算することによって計算した。ルシフェラーゼ活性を、ＧｐＬレポータードメイン数の、２つのｍＡｂバリアント内のＴＮＦＲ２結合ドメイン数に対する比（１対０．５）に従って正規化したことに注意されたい。（Ｃ）ｍＡｂバリアントによるＩＬ８産生を、その特異的結合の関数として直接プロットした。後者を、アッセイにおける細胞数およびＧｐＬ構築物の測定された比活性（ＲＬＵ／分子）の助けによって「占有された受容体／細胞」に変換した。Ａから得た２つの構築物の最大結合を、点線の垂直線によって示す。点線は、受容体占有の関数としてＩＬ８産生の線形回帰を示す。

【図14】ヒト、マウス、およびカニクイザルＴＮＦＲ２に対するＴＮＦＲ２特異的抗体の結合を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞に、ヒト、マウス、およびカニクイザルＴＮＦＲ２、または空ベクターを一過性にトランスフェクトした。次に、表記の抗ＴＮＦＲ２抗体ＧｐＬ融合タンパク質の平衡結合を、３７℃で決定した。空ベクターをトランスフェクトした細胞に対する結合を決定して、非特異的結合値を得た。

【図15】ＴＮＦＲ２のドメイン構造、ならびに抗ＴＮＦＲ２抗体Ｃ４、Ｃ１９、Ｃ２７、およびＣ４０によって認識される細胞外ＴＮＦＲ２ドメインの表示、ならびにそれに由来する４価ＣＩ－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣＩバリアントのスキームを示す図である。ＣＩ、抗ＴＮＦＲ２クローン識別子；ＣＲＤ、システインリッチドメイン。

【図16】単特異性および二特異性ＴＮＦＲ２特異的ＣＩ－ＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖＣＩバリアントのウェスタンブロット分析を示す図である。表記の抗体構築物のＦｌａｇタグ付けバリアント（２００ｎｇ）を、抗ヒトＩｇＧ（下のパネル）および抗Ｆｌａｇ抗体（上のパネル）によるウェスタンブロッティングによって分析した。従来のＩｇＧバリアントを比較のために含めた。ｉ）Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）、Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４、およびＣ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ１９の重鎖は、Ｆｌａｇタグを含有しないこと、ｉｉ）使用した従来のＣ１９バリアントがマウスＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）アイソフォームであったことに注意されたい。

【図17】モノ（上のパネル）およびバイパラトピック（下のパネル）ＴＮＦＲ２特異的ＣＩ－ＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖＣＩバリアントによる処置後のＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞におけるＴＮＦＲ２媒介ＩＬ８産生を示す図である。２００ｎｇ／ｍｌの高アゴニスト性のオリゴマー形成ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦバリアントによって誘導された応答を示す（点線）。上のパネルにおいて、より低い親和性を有するＣ２７抗体は、なおも四量体型で何らかのアゴニスト活性を与えたことに注意されたい。

【図18】単特異性（上のパネル）および二特異性（下のパネル）ＴＮＦＲ２特異的ＣＩ－ＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖＣＩバリアントによる処置後のＫｙｍ－１細胞におけるＴＮＦＲ２媒介細胞死を示す図である。Ｋｙｍ－１細胞を、表記の概略濃度の様々な構築物を含有する上清によって刺激した。翌日、細胞生存率を、クリスタルバイオレット染色を使用して決定した。従来の抗体（上のパネル）を、比較のために並行して分析した。

【図19】単特異性（Ａ）および二特異性（Ｂ）ＴＮＦＲ２特異的ＣＩ－ＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖＣＩバリアントによる処置後のＫｙｍ－１細胞におけるＴＮＦＲ２媒介ｐ１００プロセシングを示す図である。細胞を、表記の概略濃度の様々な構築物を含有する上清によって一晩刺激した。処置は、ＴＮＦＲ２誘導細胞死を防止するために２０μＭ ＺＶＡＤの存在下で実施した。

【図20】Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４、Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＬＣ：ｓｃＦｖＣ４、およびＣ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＬＣ：ｓｃＦｖＣ４－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４の精製および機能解析を示す図である。（Ａ）銀染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル。（Ｂ）ゲル濾過分析。（Ｃ）ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞におけるＩＬ８誘導。（Ｄ）Ｋｙｍ－１細胞における細胞死誘導。（Ｅ）Ｋｙｍ－１細胞におけるｐ１００プロセシングの誘導。細胞死を防止するためにＺＶＡＤを添加した。

【図21】４価ＴＮＦＲ２アゴニストによる処置後のＴｒｅｇおよびＴｃｏｎ細胞のエクスビボ評価を示す図である。ＰＢＭＣを、ドナーから収集して培養し、採取した後、４価抗体（単特異性または二特異性；Ｆａｂ－ＨＣ－ｓｃＦｖフォーマット）によって処置した。無処置陰性対照細胞もまた、Ｓｔａｒ２（ＴＮＣ－ｓｃ（ｍｕ）ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）ＴＮＦＲ２アゴニスト（ｏｌｉｇｏ ＴＮＦ８０）とも呼ばれる、オリゴマー形成した非常に強力なＴＮＦＲ２選択的ＴＮＦバリアント（Chopra et al., 2016））による陽性対照と同様に評価した。上のパネルは、Ｔｒｅｇにおけるパーセンテージ倍率変化を示し、下のパネルはＴｃｏｎ細胞におけるパーセンテージ倍率変化を示す。

【図22】ヒト－マウス交差反応性４価ＴＮＦＲ２アゴニストＣ１９－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ１９による同系ＦｏｘＰ３－ルシフェラーゼトランスジェニックマウスにおけるＴｒｅｇの用量依存的増加を示す図である。トランスジェニックＦｏｘＰ３－Ｌｕｃｉマウスに、８用量のＴＮＦＲ２アゴニスト（Ｎ＝１）を投与した後、生物発光イメージングによって毎日評価した。４日後、マウスを屠殺し、脾臓からの細胞を分析した。パネル（Ａ）は、実験のタイムラインを示す。パネル（Ｂ）は、脾細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。

【図23】ヒト－マウス交差反応性４価ＴＮＦＲ２アゴニストＣ１９－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ１９による同系ＦｏｘＰ３－ルシフェラーゼトランスジェニックマウスにおけるＴｒｅｇの用量依存的増加を示す図である。トランスジェニックＦｏｘＰ３－ルシフェラーゼマウスに、異なる用量のＣ１９－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ；ｓｃＦｖＣ１９を投与した後、生物発光イメージングによって毎日評価した。４日後、マウスを安楽死させ、脾臓からの細胞をフローサイトメトリーによって分析した。

【図24】ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ構築物の産生および分析を示す図である。パネル（Ａ）：ＴＮＦベースの分子のドメイン構造。ＴＮＦ８０は、可溶性ＴＮＦのＴＮＦＲ２特異的突然変異体を指す。パネル（Ｂ）：マウス可溶性ＴＮＦ８０ベースの構築物を、全ての構築物に含有されるＦｌａｇタグの助けを借りて抗Ｆｌａｇアフィニティ精製によって精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析した。パネル（Ｃ）：「Ｂ」に示される精製タンパク質のゲル濾過解析。

【図25】可溶性マウスＴＮＦ８０の異なるフォーマットのアゴニスト活性を示す図である。パネル（Ａ）：Ｋｙｍ－１細胞を、表記の濃度の様々なｍｕＴＮＦ８０バリアントによって刺激した。翌日、細胞生存率を、クリスタルバイオレット染色を使用して決定した。パネル（Ｂ）：ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、図２４に示した表記の濃度の様々なＴＮＦ８０バリアントによって刺激した。翌日、上清を採取し、そのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。示したデータは、４つの独立した実験に由来する。

【図26】Ｆｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＣ－ｍｕＴＮＦ８０によるインビボＴｒｅｇ増大を示す図である。Ｆｏｘｐ３プロモーターの制御下でルシフェラーゼを有するマウスに、表記の量のＦｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＣ－ｍｕＴＮＦ８０を１回ｉ．ｖ．注射し、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって毎日分析した（上のパネル）。０日目および４日目のＢＬＩ写真を中央のパネルに示す。下のパネルは、４日目にＴｒｅｇ頻度のフローサイトメトリー分析に基づく定量を示す。

【図27】本発明の結合分子がＴＮＦＲ２に選択的結合を実証するが、ＴＮＦＲ１には結合しないことを実証する図である。ＨＥＫ２９３細胞に、（ｉ）ＴＮＦＲ２発現プラスミド；（ｉｉ）ＧＰＩアンカードメインを有するＴＮＦＲ１の細胞外ドメインをコードする発現プラスミド；または（ｉｉｉ）空ベクター（ｅｖ）を一過性にトランスフェクトした。翌日、表記のＧｐＬタグ付け結合分子を、表記の濃度で細胞に添加した。３７℃で１時間インキュベーション後、ＰＢＳによって２回洗浄し、残存する細胞結合ＧｐＬ活性を決定した。ＧｐＬ－ＴＮＦを、両方のＴＮ受容体タイプに結合する陽性対照とした。

【図28】国際公開第２０２０／０８９４７４号パンフレットからの００５－Ｂ０８のＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖ、ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ＴＮＣ、およびＩｇＧ１（Ｎ－ＲＧＹ）バリアントが、ＩＬ－８放出を使用して測定した場合に強いＴＮＦＲ２アゴニストであることを示す図である。陽性対照としてＣ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：Ｃ４によって誘導された最大応答を点線で示す。

【図29】ｓｃＦｖにおける重鎖と軽鎖の間のリンカーの長さの変動、およびＣ４－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）－ｓｃＦｖ：Ｃ４バリアントの重鎖または軽鎖に融合したｓｃＦｖが、ＴＮＦＲ２アゴニズム活性に影響を及ぼさないことを示す図である。（Ａ）構築物のドメイン構造。「Ｇ４Ｓ」は、リンカー配列ＧＧＧＧＳを指し、「Ｄｕｒｖ」は、抗体デュルバルマブの定常領域配列を示す。（Ｂ）精製Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４（Ｇ４Ｓ）４およびＣ４－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）－ＬＣ：ｓｃＦｖＣ４（Ｇ４Ｓ）４のゲル濾過。（Ｃ）ＩＬ－８放出アッセイ。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）陽性対照によって誘導された最大応答を点線で示した。

【図30】配列最適化が、Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）－ＨＣ／ＬＣ：ｓｃＦｖＣ４バリアントの活性に影響を及ぼさないことを示す図である。（Ａ）精製Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）－ＨＣ／ＬＣ：ｓｃＦｖＣ４バリアントのゲル濾過分析。（Ｂ）ＴＮＦＲ２活性化の測定としてのＩＬ８放出アッセイ。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）陽性対照によって誘導された最大応答を点線で示す。

【図31】ＴＮＦＲ２特異的ｓｄＡｂのＴＮＦＲ２結合を示す図である。ヒトＴＮＦＲ２を発現する細胞に対する表記のＴＮＦＲ２特異的ＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬＶＨＨ構築物の３７℃での平衡結合。特異的結合を、ヒトＴＮＦＲ２を発現するトランスフェクタント（総結合）から非特異的結合値（Ｈｅｋ２９３細胞）を減算することによって得た。

【図32】ヒトおよびマウスＴＮＦＲ２に対するＴＮＦＲ２特異的６価３ｘＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬ構築物の結合を示す図である。ヒトＴＮＦＲ２を発現する細胞に対する表記のＴＮＦＲ２特異的３ｘＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬ ＶＨＨ構築物の３７℃での平衡結合。ＧｐＬレポータードメインは、ＦｃドメインのＣ末端にクローニングされている。白丸＝非特異的結合；白四角＝総結合；黒丸＝特異的結合。

【図33】ＶＨＨ：Ｃ１８、ＶＨＨ：Ｃ７４、ＶＨＨ：Ｃ１８８、およびＶＨＨ：Ｃ２３８の３ｘＶＨＨ－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）バリアントが、ＴＮＦＲ２に対するＴＮＦαの結合を遮断することを示す図である。ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の量のＴＮＦＲ２特異的ＶＨＨ構築物、または陰性対照としてのＣＤ４０特異的構築物３ｘＶＨＨ：ＣＤ４０（Ｖ１２ｔ）－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）によって前処置したか、または無処置のままとした。５ｎｇ／ｍｌ ＧｐＬ－ＴＮＦを添加し、３７℃で１時間インキュベーション後に結合を測定した。

【図34】ＴＮＦＲ２特異的ＶＨＨがＴＮＦＲ１に結合しないことを示す図である。ＨＥｋ２９３細胞に、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２をコードする発現ベクターを一過性にトランスフェクトした後、表記のタンパク質の結合に関して分析した。空ベクターをトランスフェクトした細胞に対する結合を、非特異的結合の陰性対照とした。ＴＮＦ－ＧｐＬを、ＴＮＦＲ１結合の成功の陽性対照とした。黒丸＝総結合；ｘ＝非特異的結合；白丸＝特異的結合。

【図35】ＶＨＨ：Ｃ１８、ＶＨＨ：Ｃ１８８、およびＶＨＨ：Ｃ２３８がＴＮＦＲ２のＣＲＤ４に結合し、ＶＨＨ：Ｃ７４がＣＲＤ３に結合することを示す図である。（Ａ）黒色９６ウェルプレートをプロテインＧによってコーティングした後、表記のＴＮＦＲ２特異的ナノボディの３ｘＶＨＨ－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）型をロードした。非結合タンパク質を除去後、固定した抗体構築物を、ＴＮＦＲ２のＧｐＬタグ付け欠失突然変異体（ｅｄ）の結合に関して分析し、これを右のパネルのウェスタンブロットに示す。最後に、これらのＧｐＬ融合タンパク質の結合を定量した。（Ｂ）クローンＣ１８８およびＣ４は、ヒトＴＮＦＲ２に対する結合に関してＴＮＦと競合する。ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の量のＴＮＦＲ２特異的ＶＨＨ構築物もしくは陰性対照としてのＣＤ２０特異的ｍＡｂリツキシマブによって前処置したか、または無処置のままとした。５ｎｇ／ｍｌ ＧｐＬ－ＴＮＦを添加し、３７℃で１時間インキュベーション後に結合を測定した。

【図36】４つのＮ末端のみのＴＮＦＲ２結合部位を有するＶＨＨベースの構築物による処置後のＴＮＦＲ２媒介ＩＬ８放出を示す図である。ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を表記の構築物を含有する上清によって刺激し、得られた上清を翌日、ＩＬ－８放出に関して分析した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）（上のパネル）またはＣ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：Ｃ４（中央および下のパネル）によって誘導された最大応答を陽性対照とし、点線で示す。

【図37】６個のＮ末端のみのＴＮＦＲ２結合部位を有するＶＨＨベースの構築物による処置後のＴＮＦＲ２媒介ＩＬ８放出およびＫｙｍ－１細胞死を示す図である。（Ａ）ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の構築物によって刺激し、ＩＬ－８の放出を条件培地中で測定した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）陽性対照によって誘導された最大応答を点線で示す。（Ｂ）Ｋｙｍ－１細胞を、様々な６価バリアントによって刺激し、翌日、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイを使用して決定した。２００ｎｇ／ｍｌの高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）によって誘導された最大殺滅を再度、点線で示す。

【図38】ＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ、２ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ－ＧｐＬおよび３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃのアゴニスト活性を並べて比較する図である。（Ａ、Ｂ）精製タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ａ）およびゲル濾過（Ｂ）によって分析した。（Ｃ）ＴＮＦＲ２活性化の指標としてのＩＬ－８放出の測定。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）陽性対照によって誘導された最大応答を点線で示す。（Ｄ）Ｋｙｍ－１細胞を様々なＶＨＨ：Ｃ１８８バリアントによって刺激した後の細胞生存率アッセイ。Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４によって誘導された最大殺滅を点線で示す。

【図39】ＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬ、２ｘＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬ、ならびにＣ１８およびＣ７４の３ｘＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬバリアントのＩＬ８放出およびＫｙｍ－１細胞死誘導活性を並べて比較する図である。（Ａ）ＩＬ－８放出アッセイ。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）によって誘導された最大応答を示す。

【図40】３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）バリアントのＶＨＨドメイン間のリンカーの長さがＴＮＦＲ２アゴニズムに影響を及ぼさないことを示す図である。３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）バリアントのＶＨＨドメイン間のリンカーの長さはＴＮＦＲ２アゴニズムに影響を及ぼさない。（Ａ）構築物のドメイン構造。（Ｂ）精製構築物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（Ｃ）ゲル濾過分析。（Ｄ）ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の構築物を含有する上清によって刺激した。翌日、上清を、そのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）によって誘導された最大応答を点線で示す。親分子３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）を、比較のために含めた。

【図41】４、６、または９個のＶＨＨ：Ｃ１８８ドメインを有する異なるドメイン構造の構築物が、強いＴＮＦＲ２アゴニズムを誘発することを示す図である。（Ａ）構築物のドメイン構造。ＴＮＣは、テナシン－Ｃの三量体形成ドメインを指す。（Ｂ）ＩＬ－８放出アッセイ。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）によって誘導された最大応答を点線で示す。

【図42】プロテインＧが、抗ＴＮＦＲ２ ｍＡｂ Ｃ４の配列最適化バリアントのアゴニスト活性を増強することを示す図である。（Ａ）表記の抗体バリアントの軽鎖および重鎖をコードする発現プラスミドを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清の抗ヒトＩｇＧ１抗体によるウェスタンブロット分析。（Ｂ）ＨＴ１０８０－ＴＮＦＲ２細胞に、５００ｎｇ／ｍｌプロテインＧ（ＰＧ）の存在下および非存在下で表記の濃度のＣ４バリアントをチャレンジした。翌日、細胞上清を、ＩＬ８産生に関してＥＬＩＳＡによって分析した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）によって誘導された最大応答を点線で示す。プロテインＧの存在下での増強された活性は、適切なドメイン構造を有する構築物の生成によって実現することができる潜在的アンタゴニズムの存在を示している。

【図43】３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（Ｄｕｒｖ）の配列最適化バリアントのＴＮＦＲ２アゴニズムを示す図である。（Ａ）表記の３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（Ｄｕｒｖ）バリアントをコードする発現プラスミドを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清の抗ヒトＩｇＧ１抗体によるウェスタンブロット分析。（Ｂ）ＨＴ１０８０－ＴＮＦＲ２細胞に、表記の濃度の３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（Ｄｕｒｖ）バリアントおよび親３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）分子をチャレンジした。翌日、細胞上清を、ＩＬ８産生に関してＥＬＩＳＡによって分析した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）によって誘導された最大応答を点線で示す。

【図44】ＴＮＦＲ２アゴニストが、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）においてＦｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増加させることを示す図である。同じドナーの無処置対照と比較した、表記のＴＮＦＲ２アゴニストによる刺激の４日後のヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）のＴｒｅｇ頻度の倍率変化。試料をフローサイトメトリーによって測定し、Ｔｒｅｇを、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞として定義した。個々のドナーの数をｎで示す。有意性を、仮説値１とする１群ｔ検定によって試験し、^＊Ｐ＝０．０５、^＊＊Ｐ＝０．０１、^＊＊＊Ｐ＝０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１によって示す。

【図45】Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）Ｈｃ－ｓｃＦｖＣ４抗体によるＴｒｅｇの活性化を示す図である。ヒトＰＢＭＣを、１００ｎｇ／ｍｌ Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）Ｈｃ－ｓｃＦｖＣ４によって４日間刺激し、Ｔｒｅｇ活性に関連するマーカーの発現をフローサイトメトリーによって測定した。同じドナーの無処置対照と比較した倍率変化発現を示す。Ｔｒｅｇを、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^＋ Ｔ細胞として定義した。平均値±ＳＤおよび各ドットは個々のドナーを表す。

【図46】３ｘＶＨＨＣ１８８（Ｇ４Ｓ）１－Ｆｃ（Ｄｕｒｖ）抗体によるＴｒｅｇの活性化を示す図である。ヒトＰＢＭＣを、表記の濃度の３ｘＶＨＨＣ１８８（Ｇ４Ｓ）１－Ｆｃ（Ｄｕｒｖ）によって４日間刺激し、Ｔｒｅｇ活性に関連するマーカーの発現をフローサイトメトリーによって測定した。同じドナーの無処置対照と比較した発現の倍率変化を示す。Ｔｒｅｇを、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^＋ Ｔ細胞として定義した。平均値±ＳＤおよび各ドットは個々のドナーを表す。

【図47】ＴＮＦＲ２アゴニストが、ヒトＴＮＦＲ２発現ＣＤ４ Ｔ細胞をインビトロで増大させることを示す図である。ヒトＴＮＦＲ２ノックインマウスから得た濃縮されたＣＤ４ Ｔ細胞を、異なる濃度の（Ａ）Ｃ４－Ｃ４（Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４）または（Ｂ）３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）によって刺激し、それぞれのアゴニストによって４日間培養後にＴｒｅｇ頻度が増加した。データは、無処置（アイソタイプ対照）試料と比較したＣＤ２５^ｈｉｇｈＦｏｘＰ３^ｈｉｇｈＣＤ４ Ｔ細胞の増加の倍率変化を表した。データを一元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。^＊ ｐ≦０．０５、^＊＊ ｐ≦０．００５。

【図48】Ｆｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＣ－ｍｕＴＮＦ８０の血清中保持を示す図である。７５μｇ Ｆｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＣ－ｍｕＴＮＦ８０またはアイソタイプ対照抗体を０時間に注射した野生型マウスからの血清の異なる希釈液（所定の時点で末梢血から単離）によって刺激したＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞培養上清のＥＬＩＳＡによって、ＩＬ－８濃度を測定した。ダイアグラム中の時点は、血液試料を収集した注射後のデルタｔを指す。ｘ軸は、ＴＮＦＲ２アゴニスト活性の決定のためのインビトロアッセイにおけるこれらの試料の希釈を与える。

【図49】ＴＮＦＲ２アゴニストが、Ｔｒｅｇをインビボで増大させ、活性化マーカーを上方調節することを示す図である。（Ａ）野生型マウスにおいて７５μｇ Ｆｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＣ－ｍｕＴＮＦ８０による刺激後４日目に単離した脾臓中の生存細胞のＴｒｅｇ頻度。（Ｂ）アイソタイプ対照抗体試料に対して正規化したＴｒｅｇの平均蛍光強度として定義した所定の細胞外マーカーの倍率変化。

【図50】ＴＮＦＲ２アゴニストが、脾臓Ｔｒｅｇをインビボで増大させることを示す図である。（Ａ）３００、１０００μｇ ３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）または１０００μｇアイソタイプ対照抗体による刺激後４日目に単離したｈｕＴＮＦＲ２発現マウスからの脾臓における生存細胞のＴｒｅｇ頻度の倍率変化。倍率変化を、アイソタイプ対照と比較して計算した。処置群とアイソタイプ対照との間の平均値の比較を、対応のないｔ検定を通して行った。^＊ｐ≦０．０５、ｎｓ＝有意差なし。（Ｂ）４０μｇ、１００μｇ、または２５０μｇ Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖ：Ｃ４による刺激後４日目に単離したｈｕＴＮＦＲ２発現マウスからの脾臓におけるＣＤ４＋ＣＤ３＋ Ｔ細胞のＴｒｅｇ頻度（Ｆｏｘｐ３＋）の倍率変化。倍率変化を、無処置対照と比較して計算した。処置群とアイソタイプ対照との間の平均値の比較を、対応のないｔ検定を通して行った。^＊ｐ≦０．０５、ｎｓ＝有意差なし。

【図51】ＴＮＦＲ２アゴニストが、同種造血細胞移植（アロ－ＨＣＴ）誘導性の急性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）後の生存を増加させることを示す図である。（Ａ）マウスにおけるアロ－ＨＣＴ誘導性実験的急性ＧｖＨＤ（ＦＶＢ／Ｎ Ｈ－２ｑ→Ｃ５７ＢＬ／６ Ｈ－２ｂ、ＭＨＣ主要組織適合抗原ミスマッチモデル）後の生存頻度。統計学的有意性を、Ｃ１９－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ；ｓｃＦｖＣ１９とアイソタイプ対照抗体との間のログランク検定によって評価した。^＊ｐ≦０．０５。（Ｂ）免疫細胞浸潤物および腸陰窩傷害に基づくアロ－ＨＣＴ後６日目に単離した腸試料の病理スコア。（Ｃ）アイソタイプ対照抗体によって処置したマウスからのシグナルに対して正規化した表記の臓器における同種ドナーＴ細胞からの相対的生物発光シグナルの６日目のエクスビボ解析。

【図52】Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４が、アフリカミドリザル（ベルベットモンキー）末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）からのＴｒｅｇを増大させることを示す図である。同じドナーの無処置対照と比較した表記のＣ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４による刺激５日後のベルベットモンキーＰＢＭＣのＴｒｅｇ頻度の倍率変化および総変化。試料をフローサイトメトリーによって測定し、Ｔｒｅｇを、ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３＋ Ｔ細胞として定義した。増大を、ｎ＝１のベルベットモンキー試料において試験した。

【図53】Ｃ１８８親および配列最適化バリアント１４に基づく３ｘＶＨＨ－Ｆｃ（ｄｕｒｖ）（６価）フォーマットのアミノ酸配列を示す図である。したがって、図は、好ましい６価結合分子のポリペプチドを例証する。示されるＣＤＲ、ＣＤＲ３個のセット全体、可変領域、およびポリペプチド全体は、本明細書においてさらに考察するその任意のバリアントと同様に好ましい実施形態を表す。

【図54】Ｃ４親に基づくＣ４－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４（Ｇ４Ｓ）４（４価）フォーマットのアミノ酸配列を示す図である。したがって、図は、好ましい４価結合分子のポリペプチドを例証する。示されるＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ３個のセット、重鎖ＣＤＲ３個のセット、ＣＤＲ６個のセット全体、可変領域、可変領域対、およびポリペプチド全体は、本明細書においてさらに考察するその任意のバリアントと同様に好ましい実施形態を表す。

【図55】配列最適化バリアント７およびバリアント１６にそれぞれ基づく４価Ｃ４ｖａｒ７－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４ｖａｒ７（Ｇ４Ｓ）４およびＣ４ｖａｒ１６－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）－ＬＣ：ｓｃＦｖＣ４ｖａｒ１６（Ｇ４Ｓ）４のアミノ酸配列を示す図である。したがって、図は、好ましい４価結合分子のポリペプチドを例証する。示されるＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ３個のセット、重鎖ＣＤＲ３個のセット、ＣＤＲ６個のセット全体、可変領域、可変領域対、およびポリペプチド全体は、本明細書においてさらに考察するその任意のバリアントと同様に好ましい実施形態を表す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

ＴＮＦＲ２およびＴＮＦＲ２標的細胞
本発明は、ＴＮＦＲ２に結合する、特にＴＮＦＲ２の細胞外ドメインに結合する結合分子を提供する。ＴＮＦＲ２は、特徴的な細胞外ドメイン、膜貫通セグメント、および細胞内ドメインを含む。細胞外領域は、反復される４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を含有する。本発明の結合分子が結合するＴＮＦＲ２は、典型的に哺乳動物ＴＮＦＲ２である。特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子が結合するＴＮＦＲ２はヒトＴＮＦＲ２である。ヒトＴＮＦＲ２のアミノ酸配列を配列番号１として提供する。配列番号１に提供されるヒトＴＮＦＲ２アミノ酸配列は、アミノ酸１～２２を含むシグナルペプチド；アミノ酸２３～２５７の細胞外ドメイン；およびアミノ酸２５８～２８７の膜貫通領域に細分される。本発明の結合分子は、典型的にＴＮＦＲ２の細胞外ドメインに結合する。

【0014】

一実施形態では、本発明の結合分子は、ヒトＴＮＦＲ２に結合し得るが、異なる種のＴＮＦＲ２、例えばマウスＴＮＦＲ２および／またはサルＴＮＦＲ２にも結合し得る。一実施形態では、結合分子は、ヒト、マウス、およびサルＴＮＦＲ２に結合する。一実施形態では、結合分子は、ヒトおよびカニクイザルＴＮＦＲ２に結合し得る。一実施形態では、結合分子は、ヒトおよびアフリカミドリザルＴＮＦＲ２に結合し得る。別の実施形態では、結合分子は、ヒト、カニクイザル、およびアフリカミドリザルＴＮＦＲ２に結合し得る。別の実施形態では、結合分子は、ヒトおよびマウスＴＮＦＲ２に結合し得る。別の実施形態では、結合分子は、ヒト、マウス、およびアフリカミドリザルＴＮＦＲ２に結合し得る。別の実施形態では、結合分子は、ヒト、マウス、およびカニクイザルＴＮＦＲ２に結合し得る。別の実施形態では、結合分子は、ヒト、マウス、カニクイザルおよびアフリカミドリザルＴＮＦＲ２に結合し得る。別の実施形態では、結合分子は、少なくともそれらの種のＴＮＦＲ２に結合する。

【0015】

本発明の結合分子は、典型的に、標的細胞、特にＴＮＦＲ２を発現する標的細胞に結合するために使用される。標的細胞は、ＴＮＦＲ２を発現する任意の細胞タイプであり得る。一実施形態では、標的細胞は、免疫細胞、内皮細胞、間葉幹細胞、またはニューロンである。特に好ましい実施形態では、標的細胞は免疫細胞である。特に好ましい実施形態では、標的細胞はＴｒｅｇ細胞である。一実施形態では、ＴＮＦＲ２を発現する免疫細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、制御性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）、およびＭＤＳＣ（骨髄由来サプレッサー細胞）から選択される。一実施形態では、標的細胞は、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞であるＴｒｅｇ細胞であり得る。

【0016】

結合分子
本発明は、ＴＮＦＲ２に結合する結合分子を提供する。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２に結合し、ＴＮＦＲ２を通してシグナル伝達を刺激する。好ましい一実施形態では、結合分子は、ＴＮＦＲ２に対するアゴニスト抗体または抗体融合タンパク質、または抗体断片、または抗体断片融合タンパク質であり、そのため受容体を活性化する。好ましい実施形態では、結合分子は、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体であり、好ましくは、それらはＴＮＦＲ２に特異的に結合して、ＦｃｇＲ結合がなくともそのアゴニストとして作用する抗体である。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ１より大きい程度にＴＮＦＲ２に結合する。例えば、ＴＮＦＲ２に関する結合強度は、ＴＮＦＲ１と比較して少なくとも１０、５０、１００、５００、１０００、またはそれより高くあり得る。一実施形態では、ＴＮＦＲ２の結合強度はＴＮＦＲ１と比較して少なくとも１０，０００、または少なくとも１００，０００倍高い強度であり得る。一実施形態では、結合分子は、ＴＮＦＲ１に全く結合しない。好ましい一実施形態では、結合分子、特に本発明の抗体または抗体断片またはその融合タンパク質の結合分子は、結合のＫＤが、１０^-６Ｍ、１０^-７Ｍ、１０^-８Ｍ、１０^-９Ｍ、または１０^-１０Ｍより低い値を有する場合に、ＴＮＦＲ２に特異的に結合すると言われる。一実施形態では、ＫＤ値は、ＴＮＦＲ２を発現する細胞、例えばＴＮＦＲ２を発現するＨｅＬａトランスフェクタントを使用して測定される。好ましい一実施形態では、ＫＤ値は、Kums J, Nelke J, Ruth B, Schafer V, Siegmund D, Wajant H.MAbs. 2017 Apr;9(3):506-520に記載されるアプローチを使用して決定される。したがって、一実施形態では、結合分子とレポータードメインとしてのガウシア・プリンセプス（Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ）ルシフェラーゼとの融合体を使用して、Kums et al.、前記に記載されるように結合分子のＫＤ値を測定する。一実施形態では、ＴＮＦＲ２を発現する細胞株、例えばその表面にＴＮＦＲ２を安定に発現するＨｅＬａまたはＨＥＫ２９３細胞を、そのような測定に使用してもよい。典型的に、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２に結合してＴＮＦＲ２シグナル伝達を誘発する。一実施形態では、結合分子、特に抗体は、ＴＮＦＲ２に対してアゴニスト性であるが、ＴＮＦＲ１に対してはアゴニスト性ではない。一実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２に結合するが、任意の他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに結合しない。

【0017】

特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、抗体である。「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、参照により本明細書に組み込まれる、Paul, W.E.(Ed.).: Fundamental Immunology 2nd Ed. Raven Press, Ltd., New York 1989の第７章に一般的に概要されているように、または“Periodic Table of Antibodies“(https://absoluteantibody.com/periodic-table-of-antibodies/)に示されているように、典型的に目的の抗原に特異的に結合することが可能な任意の機能的抗体または抗体融合タンパク質または抗体断片を指す。本明細書において抗体という言及は、特に述べていない限り、抗体断片を含む。本発明の抗体は、典型的にＴＮＦＲ２に特異的に結合する。抗体という言及は、ヒトにおいて認められる抗体の天然に存在する４本鎖構造を有しない抗体を含む、本明細書で考察されている様々な抗体フォーマットの全てを含み、例えば好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、一本鎖抗体であってもよく、または一本鎖抗体を含んでもよい。本発明の抗体はまた、ＴＮＦＲ２に結合するリガンドベースの分子などの非抗体配列も含み得る。一実施形態では、本発明の抗体は、抗体配列と非抗体配列の融合体、例えば、本明細書において考察されるＴＮＣペプチドとＴＮＦ－アルファポリペプチド（特にＴＮＦＲ２特異的突然変異体、例えばＴＮＦ８０（またはＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）））の融合体であるポリペプチド（複数可）を含み得る。特に好ましい一実施形態では、結合分子は、ＴＮＦＲ２に対して特異的ないかなる非抗体結合部位も含まない抗体である。

【0018】

本明細書に記載される抗体はいずれも、１つまたは複数のリガンドベースの分子、特にＴＮＦＲ２に対して特異的なリガンドベースの分子をさらに含み得る。例として、本出願は、分子の価数を、本明細書に記載されるそれらのいずれかなどのＴＮＦＲ２の１つまたは複数のリガンドベースの結合分子を含めることによって、６個より多くまで増加させ得る様々な６価抗体を記載する。一実施形態では、本明細書に記載される抗体のいずれも、ポリペプチドの一部である、ポリペプチドに連結されている、またはポリペプチドにコンジュゲートされているＴＮＦＲ２の少なくとも１つのリガンドベースの結合分子をさらに含み得る。一実施形態では、ＶＨＨドメインを含む６価結合分子は、ポリペプチドの一部である、ポリペプチドに連結されている、またはポリペプチドにコンジュゲートされている少なくとも１つのリガンドベースの結合分子を含むようにさらに改変され得る。一実施形態では、結合分子は、２つのポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、ポリペプチドの一部である、ポリペプチドに連結されている、またはポリペプチドにコンジュゲートされているリガンドベースのＴＮＦＲ２結合分子と共に、連続する３個のＶＨＨドメイン、ＣＨ１領域を欠如する重鎖定常領域を含む。一実施形態では、本発明の結合分子は、各重鎖が、ポリペプチドの一部である、ポリペプチドに連結されている、またはポリペプチドにコンジュゲートされているリガンドベースのＴＮＦＲ２結合分子を有するように改変されている。一実施形態では、結合分子の軽鎖はそのように改変され得る。好ましい実施形態では、結合分子は、ポリペプチドの一部である、ポリペプチドに連結されている、またはポリペプチドのＣ末端半分でコンジュゲートされているＴＮＦＲ２に基づくリガンドベースの分子リガンドを有し得る。本発明はまた、様々な４価結合分子も提供し、そのような結合分子では、結合分子は、「サウス」もしくは「Ｃ末端」部分でｓｃＦｖまたは他の抗体ベースのＴＮＦＲ２結合部位ではなく、リガンドベースの分子を有するであろう。このように、例えば様々なＣ４およびＣ４バリアント抗原結合部位が本明細書に記載され、本発明は、「ノース」抗原結合部位がＣ４またはＣ４バリアント抗原結合部位であり、「サウス」抗原結合部位がリガンドベースのＴＮＦＲ２抗原結合分子である結合分子を提供する。

【0019】

本発明の抗体はまた、抗体の部分または断片も含み得る。例えば、本発明の抗体は、それがＦｃ受容体に結合しないように改変された単なる抗体Ｆｃ領域およびＦｃ領域に連結したリガンドベースの結合分子をまさに含み得る。一実施形態では、本発明の抗体に存在するリガンドベースの分子は、ＴＮＦＲ２のＴＮＦベースのリガンド、例えばＴＮＦプロモーターまたはその突然変異体である。一実施形態では、抗体は、ＴＮＦ三量体の一本鎖型である。

【0020】

結合分子の「価数」は、本明細書で使用される場合、結合分子が有する結合部位の数を意味し、ＴＮＦＲ２の価数は、結合分子が有するＴＮＦＲ２の結合部位の数を意味する。結合部位の「特異性」は、それが何に結合するかを意味し、例えば、結合分子がどの標的分子に結合するかを意味し得るが、同様にそれが標的のどこに結合するかも意味し得る。抗体に関して、抗体の特異性は、どの標的に抗体が結合するかも意味し、同様に、標的分子上に結合したエピトープに関してそれが結合する抗原上の場所も意味するために使用され得る。結合分子は、それらが異なる標的分子（抗原）上のエピトープに結合するという意味で異なる特異性を有し得る。しかし、結合分子は、同じ標的分子（抗原）上の異なるエピトープに結合するという意味で異なる特異性を有し得る。例えば、二特異性結合分子は、それが２つの異なる標的分子に結合することができるという意味で二特異性であり得るが、あるいはそれは同じ標的分子、特にＴＮＦＲ２の２つの異なるエピトープに結合することができるという意味で二特異性であり得る。

【0021】

一実施形態では、本発明の結合分子の結合部位は全て、同じ標的に結合する。一実施形態では、本発明の結合分子が抗体である場合、抗体の抗原結合部位は全て、ＴＮＦＲ２の同じエピトープに結合するであろう。別の実施形態では、本発明の結合分子は、各々がＴＮＦＲ２上の異なる標的部位に結合する、例えば各々がＴＮＦＲ２の異なるエピトープを認識する少なくとも２つの異なる標的結合部位を含むであろう。一実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２の異なるエピトープに結合する少なくとも２つの抗原結合部位を含む抗体である。一実施形態では、分子の結合部位の少なくとも１つは、ＴＮＦＲ２以外の標的に結合する。例えば、一実施形態では、本発明の結合分子は、異なる細胞タイプの標的を認識する異なる特異性を有する結合部位を含み得る。例えば、異なる特異性をホーミング実体として使用して、標的を、異なる細胞タイプと共にＴＮＦＲ２を発現する細胞と結びつけることができる。一実施形態では、本発明の結合分子は、結合分子の血清中半減期を変更する標的に結合する少なくとも１つの結合部位を含んでもよく、例えば一実施形態では、結合分子は血清アルブミンに結合してもよい。一実施形態では、分子の結合部位の１つのみがＴＮＦＲ２以外のものを標的とする。一実施形態では、２つのそのような部位が存在し得る。

【0022】

本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２に関して少なくとも２価を有する。一実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２に関して２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２価、または少なくともそれらの価数を有する。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、２価を有する。別の好ましい実施形態では、本発明の結合分子は３価を有する。一実施形態では、本発明の結合分子は三特異性である。別の好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、少なくとも４価を有する。したがって、好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、４価である。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、４価を有する。一実施形態では、本発明の結合分子は、少なくとも６価を有する。好ましい実施形態では、本発明の結合分子は６価を有する。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、１２価を有する。一実施形態では、本発明の結合分子は、例えば本発明の結合分子は、少なくとも２価、好ましくは少なくとも４価を有するために、多特異性である。特に好ましい実施形態は、４価抗体である。さらに特に好ましい実施形態は、６価抗体である。好ましい６価抗体は、ＴＮＦＲ２結合部位がＴＮＦＲ２に特異的な単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である抗体である。特に好ましい６価抗体は、ＴＮＦＲ２結合部位がＴＮＦＲ２に特異的なＶＨＨ結合ドメインである抗体である。ＳｄＡｂおよびＶＨＨを、以下にさらに考察する。

【0023】

本発明の結合分子の「価数」と共に、さらなる点は、結合分子の結合部位の方向／局在化である。これは図１および７で示される抗体の例を使用して最もよく考慮され得る。図１は、（Ｎ末端）単一方向指向性の抗原結合部位を有する抗体を表し、これは単に「ノース」方向の抗体であると考えることができ、例えば一実施形態では、そのような結合分子は、従来の４本鎖抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端部分であると考えられる場所でＴＮＦＲ２に結合する抗原結合部位を有すると考えることができ、それらは結合分子のポリペプチドのＮ末端部分に位置し得る。結合部位の方向はまた、「平行な」結合部位と同じ方向の結合部位に言及することによっても定義してもよく、例えば結合部位の全てが抗体鎖のＮ末端部分であるか、または全てが抗体鎖のＣ末端部分である場合、結合部位は、平行であると考えられ得る。そのような結合部位はまた、単一方向指向性であるとも考えられ得る。本出願の図７は、「ノース」＋「サウス」方向または「逆」方向であると考えられ得る二重のＮ末端およびＣ末端抗原結合部位を有する抗体を表す。一実施形態では、そのような結合部位は、１つより多くの平面または１つより多くの方向に抗原結合部位を有すると考えられ得る。一実施形態では、本発明の構築物は、抗原結合部位が「ノース」方向のみに存在する構築物であり、そのため抗原結合部位はＮ末端である。一実施形態では、本発明の結合分子は、ＨＣおよびＬＣの可変ドメインがｓｃＦｖと交換されるノース構築物、例えば（ｓｃＦｖ－ＩｇＧ（Ｎ２９７Ａ）およびｓｃＦｖ－ＩｇＧ（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ＴＮＣ）である。別の実施形態では、本発明の結合分子は、「ノース」および「サウス」方向の両方に結合部位を有してもよく、それによってＮ末端およびＣ末端位置の両方で抗原結合部位を有効に有する。

【0024】

一実施形態では、抗原結合部位に面する「ノース」または「Ｎ末端」は、従来の単量体ＩｇＧ分子の結合部位と同じ方向または平面である、特にそのような従来のＩｇＧ分子の軽鎖および重鎖可変領域のＮ末端部分であると通常考えられるものであると考えられ得る。一実施形態では、抗原結合部位に面する「サウス」または「Ｃ末端」は、従来の単量体ＩｇＧ分子が抗原結合部位を有しない方向または平面におけるそれらであると考えられ得る。一実施形態では、方向は従来の単量体ＩｇＧ分子におけるＦａｂサブドメイン（ＶＨ＋ＶＬ）の方向とは逆であり、このように抗原発現細胞の隣接する細胞に向かうＦｃドメインＣ末端でＴＮＦＲ２結合ドメインを有する。そのような結合部位は、抗体におけるＦａｂドメインの「通常の」方向とは逆であると考えることができる。図１に表される六量体ＩｇＧ分子は、六量体の上部および下部に抗原結合部位を有するが、これは、抗原結合部位の全てが従来の単量体ＩｇＧ分子と同じフォーマットで存在することから、例えば従来の単量体ＩｇＧ分子のＣ末端部分であると考えられる場所で抗原結合部位を有しないという意味で、「ノース」および「サウス」または「逆」指向性の抗原結合部位を有しないと考えられる。好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、抗体を構成するポリペプチドのＮ末端で抗原結合部位を含む。一実施形態では、本発明の結合分子は、抗体のポリペプチド鎖のＮ末端およびＣ末端の両方で抗原結合部位を有するという意味で抗体であろう。特に好ましい一実施形態では、結合分子は、ＴＮＦＲ２の２つのＮ末端（「ノース」）および２つのＣ末端（「サウス」）結合部位を有する４価抗体である。好ましい実施形態では、抗体は、各軽鎖のＣ末端でｓｃＦｖを有するＩｇＧである。さらに好ましい実施形態では、抗体は、各重鎖のＣ末端でｓｃＦｖを有するＩｇＧである。さらに好ましい実施形態では、抗体は、各重鎖および各軽鎖のＣ末端でｓｃＦｖを有するＩｇＧであり、そのような抗体は６価である。

【0025】

好ましい一実施形態では、使用される結合分子は、個々のサブユニットの多量体である。例えば、好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は二量体である。本発明の一実施形態では、二量体は、２つのｓｃＦｖ－Ｆａｂ分子の形態である。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は三量体である。別の好ましい実施形態では、本発明の結合分子は六量体である。一実施形態では、使用される結合分子は抗体であり得る。一実施形態では、使用される結合分子は、抗体融合タンパク質六量体である抗体であり得る。好ましい一実施形態では、六量体を構成する個々のＩｇＧ分子の重鎖は、ＲＧＹペプチドモチーフを含み、特にそのＣ末端で含み得る。特に好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖において、特にＦｃテールにおいてＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０ＹであるＲＧＹモチーフの突然変異を含む。ＲＧＹモチーフは、例えばその全体が参照により組み込まれる、de Jong et al(2016)PLOSBiology |DOI:10.1371/journal.pbio.1002344によって記載され、ならびに特にＲＧＦモチーフ、および六量体の形成におけるその使用に関連して記載されている。

【0026】

典型的に、本発明の結合分子が多量体またはより小さい単位のアセンブリを含む場合、これは、例えば、たとえ個々に抗体であると考えられ得るいくつかのサブユニット、例えばＩｇＧおよびｓｃＦｖを含み得る場合であってもなおも、本発明の「結合分子」または「抗体」であると考えられる。そのため、例えば本発明の「抗体」は、本発明の「抗体」全体の一部としての抗体断片または複数の断片を含み得る。以下に考察するように、これはＴＮＦＲ２のリガンドなどの他の実体、例えばＴＮＦ－アルファ、特にＴＮＦ８０および他のＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体を含み得る。本明細書に記載されるいかなる特異的フォーマットも、ＴＮＦ２のリガンドをさらに含むように改変され得る。

【0027】

抗体六量体は、本発明の一実施形態を表す。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｅ３４５での少なくとも重鎖改変、特にＥ３４５Ｒを含む。別の実施形態では、本発明の抗体は、Ｅ４３０での少なくとも重鎖改変、特にＥ４３０Ｇを含み得る。別の実施形態では、本発明の抗体は、Ｓ４４０での少なくとも重鎖改変、特にＳ４４０Ｙを含み得る。別の実施形態では、本発明の抗体は、Ｅ３４５およびＥ４３０での少なくとも重鎖改変、特にＥ３４５ＲおよびＥ４３０Ｇを含み得る。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、Ｅ３４５、Ｅ４３９、およびＳ４４０での少なくとも重鎖改変、特にＥ３４５Ｒ、Ｅ４３９Ｇ、およびＳ４４０Ｙを含み得る。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、そのような改変を含み、ＩｇＧ単位の六量体を含む。さらに好ましい実施形態では、本発明の抗体は、それがＴＮＦＲ２に結合すると、オンターゲット六量体形成を受ける。

【0028】

好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、三量体形成をもたらす配列を含み得る。そのような配列の例は、コラーゲンの三量体形成ドメイン、ロイシンジッパー、Ｔ４フィブリチン、およびＴＲＡＦファミリーメンバーの三量体形成ドメインを含む。本発明の結合分子は、一部の実施形態では、そのような三量体形成配列を含み得る。一実施形態では、本発明の結合分子は、そのようなドメインの存在により三量体を含んでもよく、または三量体であってもよい。好ましい一実施形態では、三量体形成配列は、テナシン－Ｃ（ＴＮＣ）由来の配列であり得る。しかし、ＴＮＣについて言及される本明細書で考察される実施形態のいずれにおいても、一般的な三量体形成配列を使用してもよく、例えば単にＴＮＣではない本明細書において言及される任意の特異的配列を使用してもよいが、好ましい実施形態では、ＴＮＣを使用する。好ましい一実施形態では、使用されるＴＮＣ配列は、ニワトリＴＮＣ由来である。別の好ましい実施形態では、使用されるＴＮＣ配列は、哺乳動物ＴＮＣ由来である。さらに好ましい実施形態では、ＴＮＣはヒトＴＮＣである。一実施形態では、本発明の結合分子はＴＮＣを含まない。

【0029】

別の好ましい実施形態では、テナシン－Ｃ（ＴＮＣ）三量体形成ドメインを使用して、個々の抗体または他のサブユニットを多量体へとアセンブルしてもよい。したがって、結合分子、特に本発明の抗体は、配列番号２のペプチドなどのＴＮＣ三量体形成ドメインペプチドを含み得る。本発明の抗体は、バリアントＴＮＣペプチド、例えば配列番号２と比較して５、４、３、２、または１個のアミノ酸配列変化を有するが、なおも多量体の形成をもたらすことができるペプチドを含み得る。好ましい一実施形態では、抗体の重鎖のＣ末端は、ＴＮＣペプチド配列を含むかまたはそれに連結されている。一実施形態では、そのようなアプローチを使用して、抗体サブユニット抗体、および／またはリガンドなどの個々のＴＮＦＲ２結合部分の三量体をもたらす。本明細書に記載される結合分子のいずれも、特に述べていない限り、個々の単位の会合を可能にする方法として、特に多量体を形成する方法としてＴＮＣペプチドを含み得る。

【0030】

一実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２のＦｃγＲ非依存的アゴニストである。例えば、結合分子が抗体である例では、抗体はＦｃ領域を欠如し、そのためその領域のＦｃγＲに結合しないであろう。あるいは、別の実施形態では、抗体はＦｃ領域を有するが、ＦｃγＲに結合することができないように改変されているであろう。様々なＦｃ改変が本明細書で考察されており、それらを使用して改変を達成してもよい。

【0031】

一実施形態では、本発明の結合分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ抗体から選択される抗体であるか、またはそのような抗体を含む。本発明の結合分子は、それをＦｃガンマ受容体非依存的にする、本明細書で考察されるＦｃ改変を含み得る。特に好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、ＩｇＧ抗体であるかまたはそれを含むか、またはそのような抗体を含む。特に好ましい一実施形態では、本発明の結合分子はＩｇＧ１抗体であるか、またはそのような抗体を含む。抗体は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であり得るか、またはそのような抗体を含み得る。特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は単一ドメイン抗体、例えばＶＨＨ単一ドメイン抗体を含み得る。一実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも２つのそのようなｄＡｂ、特にＶＨＨを含む。

【0032】

好ましい実施形態では、提供される結合分子はＴＮＦＲ２に特異的に結合するが、ＴＮＦＲ１には結合しない。さらに好ましい実施形態では、提供される結合分子は、ＴＮＦＲ２のＦｃγＲ非依存的アゴニストである。結合分子は、ＴＮＦＲ２の結合に関して少なくとも２価を有する。

【0033】

好ましい実施形態では、本発明の結合分子の結合部位は、抗体抗原結合部位およびＴＮＦＲ２に結合するリガンドから選択され得る。特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、抗体であるか、または抗体の少なくとも一部を含む。本明細書で定義される場合、抗体は、抗原結合部位を含む様々なフォーマットを含むが、天然に存在する抗体フォーマットではない。抗体は、必ずしも抗体全体である必要はなく、例えば本発明の抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ２抗体断片であってもよく、またはそれを含んでもよい。本発明の抗体は、抗体断片を含んでもよく、例えば好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、抗体の一部としてｓｃＦｖ断片またはＦａｂによって提供される抗原結合部位を含み得る。本発明の抗体は、一本鎖抗体であってもよく、またはそれを含んでもよい。

【0034】

抗体という言及は、それ自身が抗体ベースの配列に由来しない部分を含む、それに連結されている、またはそれにコンジュゲートされている抗体分子を含む。このため、例えば本明細書で抗体という言及は、ＴＮＦＲ２リガンドまたはＴＮＦＲ２リガンドの改変型に連結またはコンジュゲートされている抗体を含む。使用され得る、または使用されるように改変され得るＴＮＦＲ２リガンドの例としては、ＴＮＦαおよびＬＴα、ならびにそのバリアントが挙げられる。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、多量体形成をもたらす配列を含み得る。そのような配列の一例は、本発明の抗体が、例えば多量体形成をもたらすＲＧＹ突然変異を含むことによって、多量体形成をもたらす配列を有する重鎖を含み得ることである。好ましい一実施形態では、これは六量体形成をもたらすＲＧＹ改変を含むＦｃテールピースである。別の特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、重鎖のＣ末端でテナシン－Ｃ三量体形成ドメインペプチド配列（ＴＮＣ）を含み得る。したがって、一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、配列番号２として提供されるテナシン－Ｃからのペプチド配列、またはなおも多量体形成をもたらすことができるバリアントＴＮＣペプチドを含み得る。別の実施形態では、抗体は、三量体形成をもたらすヒトＴＮＣ配列を含み得る。別の実施形態では、抗体は、本明細書で言及した特異的ドメインのいずれかなどの三量体形成ドメインを含み得る。

【0035】

一実施形態では、本発明のＴＮＦＲ２結合分子の結合部位は全て、抗体抗原結合部位であり得る。別の実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２の少なくとも１つの抗体抗原結合部位、およびＴＮＦＲ２に結合する少なくとも１つのリガンドまたはリガンド誘導体を含み、言い換えれば、本発明の結合分子はそのような結合部位の混合物を含み得る。一実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２のリガンドベースの結合部位をさらに含む抗体を含む。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、リガンドベースのＴＮＦＲ２結合部位を含まない。結合分子が抗体であるかまたは抗体を含む実施形態では、抗原結合部位は一般的に、６個のＣＤＲ、すなわち３個の軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）、および３個の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を含む。しかし、以下でさらに考察するように、本発明の結合分子は、特にＴＮＦＲ２のＶＨＨ結合ドメイン、および他の単一ドメイン結合体を含み得る。そのようなＶＨＨドメインは、３個のＣＤＲ、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。本発明は、ＴＮＦＲ２の抗原結合部位において本明細書で記載したＣＤＲ６個または３個の特異的セットのいずれかを有する結合部位を含む結合分子を提供する。別の実施形態では、結合分子は、本明細書に記載されるＶＨおよびＶＬ領域の任意の対を含み得る。さらなる実施形態では、結合分子は、本明細書に記載されるＶＨＨのいずれかを含むまたはそれからなる結合部位を含み得る。そのような特異的配列を、本出願の表に記載する。そのようなＣＤＲセットはまた、配列番号を参照することによって本明細書に記載される。そのようなＣＤＲセット、ＶＬおよびＶＨの対、またはＶＨＨドメインを、図面で示され、実施例で使用される構造を含む、本明細書に記載される構造のいずれに使用してもよい。本明細書に記載される特異的配列のいずれのバリアント配列もまた、使用され得る。

【0036】

好ましい一実施形態では、抗体の抗原結合部位およびリガンドベースの結合部位は、異なる方向であり、そのため２つは逆方向であり得る、例えば抗原結合部位は「ノース」方向であってもよく、リガンドベース結合部位は「サウス」または「逆」方向であってもよい。別の実施形態では、結合分子は、「ノース」および「サウス」方向の両方に抗体抗原結合部位を有し得るが、リガンドベース結合部位は、１つの方向のみ、例えば「サウス」方向のみに結合部位を有し得る。「ノース」および「サウス」は、抗原結合部位がポリペプチドのＮ末端部分に存在するかまたはＣ末端部分に存在するかを意味する。このため、例えば従来の抗体では、抗体の可変領域によって提供される抗原結合部位は、重鎖および軽鎖ポリペプチドのＮ末端部分に存在する。これに対し、提供される結合分子の一部は、抗原結合部位がポリペプチドのＣ末端またはそれに向かって存在する抗体、例えばｓｃＦｖが、軽鎖および重鎖ポリペプチドのＣ末端部分であるかまたはそれらに連結されている抗体を表す。一部の結合分子は、Ｎ末端およびＣ末端抗原結合部位の両方を含む。

【0037】

本発明の一実施形態では、「ノース」指向性の結合部位のみを有する抗体を使用する。本出願の図１は、好ましいＴＮＦＲ２結合分子、ならびに１価を有し、単独では本発明の結合分子ではないＦａｂの例示的な例を示す。

【0038】

図面、特に図１、７、２４、２９、４０、および４１に示すフォーマットにおいて、親ＴＮＦＲ２特異的ＩｇＧ分子について言及される場合、構造は「ＣＩ」または「クローン識別子」で示され、クローン識別子は、ＩｇＧ抗原結合部位のＣＤＲが実施例で考察したどのクローンに由来するかを示す。本明細書においてそのような構造に言及するが、クローン識別子が使用されていない場合、構造は、特異的クローンに対する言及に限定されず、そのため、実施例からの特定のクローンに由来するＣＤＲに限定されず、抗原結合部位は、任意の好適なＴＮＦＲ２抗体に由来し得る。そのため、例えばｓｃＦｖ－Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）という言及は、クローン４のクローン識別子（ＣＩ）を含むが、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）と言及される場合、そのようなフォーマットの結合分子を示すが、特定のクローンに由来する配列に限定されない抗原結合部位を有する。特定のクローンに関連して本明細書で記載されるフォーマットのいずれに関しても、本明細書で提供される他の抗原結合部位の１つをその代わりに使用してもよく、特定のクローンに限定されないフォーマットも同様に提供される。重鎖および軽鎖可変領域を含む抗原結合部位を含む任意の結合分子に関して、Ｃ４およびＣ４バリアントＣＤＲ、ＣＤＲセット、可変領域、および可変領域対（表１０を参照されたい）が、好ましい実施形態において使用され得る。

【0039】

好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、以下から選択される：
ｉ． 両方の特異性がＴＮＦＲ２に特異的であるＦａｂ２抗体。
ｉｉ． Ｆｃ受容体を活性化することができない、特にＦｃγＲを結合することができないＦｃ領域を含むＩｇＧ抗体。分子の両方の価数は、ＴＮＦＲ２に対して特異的であり、「ノース」指向性であると考えられ得る。一実施形態では、抗体のＦｃ領域は、それがＦｃ受容体に結合しないことを意味する改変、例えば本明細書に記載される特異的改変のいずれかを含む。一実施形態では、抗体はＩｇＧ１抗体である。好ましい実施形態では、抗体は図１に示すフォーマットＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）を有するが、特異的クローンに限定されない。
ｉｉｉ． 全てが「ノース」指向性であるＴＮＦＲ２に特異的な４つの抗原結合部位を含む４価抗体分子であって、各軽鎖および重鎖がそのＮ末端でそれに連結される抗原結合部位を有するように改変されたＩｇＧ分子の基本構造を有する４価抗体分子。一実施形態では、各抗原結合部位は、基本の４本鎖ＩｇＧ構造の軽鎖または重鎖に連結した重鎖および軽鎖可変領域（ｓｃＦｖドメイン）対を含む。一実施形態では、抗体は、抗体鎖の各Ｎ末端がそれに連結したｓｃＦｖを有する基本ＩｇＧ分子の重鎖および軽鎖定常領域を含む。抗体は、典型的にＦｃγＲに結合しないように改変されているＦｃ領域を含む。一実施形態では、抗体は、ＦｃγＲ結合を防止または低減する本明細書に考察される任意の改変を含む。一実施形態では、抗体は、図１に示されるフォーマットｓｃＦｖ－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）を有するが、特定のクローンを起源とする配列に限定されない。
ｉｖ． ３個のＩｇＧ抗体サブユニットの多量体である６価の抗体であって、各個々のＩｇＧサブユニットのＦｃ領域が、ＦｃγＲに結合することができない抗体。６個全ての抗原結合部位は、「ノース」指向性であると考えられ得る。一実施形態では、Ｆｃ領域は、それらが本明細書に開示される改変のいずれかなどの改変を含むことから、Ｆｃガンマ－受容体群の受容体に結合することができない。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎ２９７Ａ改変を含む。任意の好適な方法を使用して、個々のＩｇＧサブユニットを多量体形成してもよい。特に好ましい実施形態では、サブユニットは、テナシン－Ｃペプチド（ＴＮＣ）の使用を通して、特に配列番号２のペプチド配列などのＴＮＣに由来するペプチドの存在を通して会合する。例えば、一実施形態では、ＩｇＧサブユニットの重鎖は、テナシンペプチドを含むかまたはそれに連結され、テナシンペプチドとの会合は、多量体のアセンブリをもたらす。好ましい実施形態では、ペプチドは、配列番号２の配列、またはなおも多量体を形成することができるそのバリアント配列を有する。一実施形態では、抗体は、図１に示すフォーマットＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ＴＮＣを有するが、特定のクローンの配列に限定されない。
ｖ． ３個のサブユニットの多量体を表す１２価の抗体。一実施形態ではＩｇＧ構造を含むサブユニットは、可変領域が各々ＴＮＦＲ２に特異的なｓｃＦｖに交換されており、抗原結合部位の全てが「ノース」に面している、例えばｓｃＦｖ－ＩｇＧ１（２９７Ａ）－ＨＣ：ＴＮＣであると考えられ得る。抗体は、Ｆｃ受容体に結合することができない。一実施形態では、Ｆｃ領域は、結合することができないように改変されていることから、抗体は、ＦｃγＲに結合せず、例えば本明細書で考察した任意の改変が使用されている。好ましい実施形態では、Ｎ２９７Ａ改変が使用される。任意の好適な方法を使用して３個のサブユニットをまとめてもよく、一実施形態ではＴＮＣ三量体形成ドメインを使用する。好ましい実施形態では、各重鎖のＣ末端は、ＴＮＣ三量体形成ドメインを含むかまたはそれに連結されて、例えば配列番号２の場合のようにいくつかのＦａｂ２またはＩｇＧの多量体形成をもたらす。一実施形態では、抗体は、図１に示されるフォーマットｓｃＦｖ：ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ＴＮＣを有するが、特定のクローンからの配列に限定されない。
ｖｉ． 六量体ＩｇＧ抗体。典型的に、抗体の抗原結合部位は全て、抗体が１２価を有するようにＴＮＦＲ２に対して特異的である。各個々のＩｇＧサブユニットのＦｃ領域は、ＦｃγＲに対する結合を防止する改変を有する。本明細書に考察される改変のいずれを使用してもよいが、好ましい一実施形態では、改変はＮ２９７Ａである。オンターゲットまたはオフターゲットのいずれかで六量体形成を達成する任意の好適な方法が使用され得る。特に好ましい一実施形態では、個々のＩｇＧサブユニットの各重鎖は、ＲＧＹ突然変異を含み、六量体形成を可能にする。一実施形態では、抗体は、ＲＧＹ突然変異プラスＮ２９７Ａ突然変異（図１に示されるＩｇＧ１（Ｎ－ＲＧＹ））を含み、そのため両方の突然変異がＦｃ受容体結合を防止し、突然変異は六量体形成をもたらす。したがって、一実施形態では、結合分子は、図１に示されるフォーマットＩｇＧ１（Ｎ－ＲＧＹ）を有するが、特定のクローンからの配列に限定されない。

【0040】

特に好ましい一実施形態では、結合分子は、上記の（ｉｉｉ）～（ｖｉ）に記載される分子の１つである。別の好ましい実施形態では、結合分子は、４価結合分子、例えば（ｉｖ）に記載される分子である。さらに好ましい実施形態では、結合分子は、例えば上記の（ｖ）および（ｖｉ）に記載される価数から選択される１２価を有する分子である。

【0041】

本発明の一実施形態では、平行方向の鎖を有する抗体足場上にＮ末端およびＣ末端が位置する結合部位の両方を有する抗体（Ｆｃ、ＩｇＧ、Ｆｃ－ＴＮＣ、ＴＮＣ－Ｆｃ、ＩｇＧ－ＴＮＣ）を使用する。したがって、「逆」指向性の結合部位を有する抗体を使用する。本出願の図７は、「逆」方向であると考えられ得る結合部位を有する特に好ましいＴＮＦＲ２結合分子の例示的な例を示す。好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、以下に記載される群から選択される：
ｉ． ｓｃＦｖに連結したＦａｂ領域を含む抗体であって、ＴＮＦＲ２のＦａｂの結合部位とｓｃＦｖの方向が逆方向であり、このようにｓｃＦｖドメインがＬＣまたは切断されたＨＣのＣ末端に連結される抗体。好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｆａｂの軽鎖のＣ末端に連結する。したがって、一実施形態では、本発明の抗体は、図７に示されるフォーマットＦａｂ－ＬＣ：ｓｃＦｖであるが、特定のクローンからの配列に限定されない。
ｉｉ． 各重鎖のＣ末端に結合したｓｃＦｖ、およびＦｃ受容体、特にＦｃγＲに結合しないように改変されたＦｃ領域を有するＩｇＧ分子である抗体。Ｆｃ領域は、Ｆｃ結合を除去する本明細書で考察される改変のいずれか、特にＮ２９７Ａ重鎖改変を含み得る。一実施形態では、抗体は、図７に示されるフォーマットＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖの抗体であるが、特定のクローンからの配列に限定されない。
ｉｉｉ． 各軽鎖のＣ末端に結合したｓｃＦｖ、およびＦｃ受容体、特にＦｃγＲに結合しないように改変されたＦｃ領域を有するＩｇＧ分子である抗体。Ｆｃ領域は、Ｆｃ結合を除去する本明細書に考察される改変のいずれか、特にＮ２９７Ａ重鎖改変を含み得る。一実施形態では、抗体は、図７に示されるフォーマットＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＬＣ：ｓｃＦｖの抗体であるが、特定のクローンからの配列に限定されない。
ｉｖ． 各軽鎖および重鎖のＣ末端に結合したｓｃＦｖ、およびＦｃ受容体、特にＦｃγＲに結合しないように改変されたＦｃ領域を有するＩｇＧ分子である抗体。Ｆｃ領域は、Ｆｃ結合を除去する本明細書に考察される改変のいずれか、特にＮ２９７Ａ重鎖改変を含み得る。一実施形態では、抗体は、図７に示されるフォーマットＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖの抗体であるが、特定のクローンからの配列に限定されない。
ｖ． 重鎖および軽鎖可変領域が各々、ＴＮＦＲ２特異的ｓｃＦｖに交換されており、およびＩｇＧ分子の重鎖が各々、それらに連結したＴＮＦＲ２特異的ｓｃＦｖを有するように改変されているＩｇＧ分子である抗体。したがって、そのような抗体は、ＴＮＦＲ２に関して６価を有する。抗体のＦｃ領域は、それがＦｃ受容体、特にＦｃγＲに結合しないように改変されている。Ｆｃ領域は、Ｆｃ結合を除去する本明細書に考察される改変のいずれか、特にＮ２９７Ａ重鎖改変を含み得る。一実施形態では、抗体は、図７に示されるフォーマットＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖの抗体であるが、特定のクローンからの配列に限定されない。
ｖｉ． 重鎖および軽鎖可変領域が各々ｓｃＦｖに交換されており、ＩｇＧ分子の軽鎖が各々それらに連結したｓｃＦｖを有するように改変されているＩｇＧ分子である抗体。したがって、そのような抗体はＴＮＦＲ２に関して６価を有する。抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体、特にＦｃγＲに結合しないように改変されている。Ｆｃ領域は、Ｆｃ結合を除去する本明細書に考察される改変のいずれか、特にＮ２９７Ａ重鎖改変を含み得る。一実施形態では、抗体は、図７に示されるフォーマットＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＬＣ：ｓｃＦｖの抗体であるが、特定のクローンからの配列に限定されない。
ｖｉｉ． 重鎖および軽鎖可変領域が各々ｓｃＦｖに交換されており、ＩｇＧ分子の軽鎖および重鎖が各々それらに連結したｓｃＦｖを有するように改変されているＩｇＧ分子である抗体。したがって、そのような抗体は、ＴＮＦＲ２に関して８価を有する。抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体、特にＦｃγＲ受容体に結合しないように改変されている。Ｆｃ領域は、Ｆｃ結合を除去する本明細書に考察される改変のいずれか、特にＮ２９７Ａ重鎖改変を含み得る。一実施形態では、抗体は、図７に示されるフォーマットＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖの抗体であるが、特定のクローンからの配列に限定されない。
ｖｉｉｉ． 重鎖のＣ末端でテナシン－Ｃ（ＴＮＣ）三量体形成ペプチドを含む３個の個々のＩｇＧ抗体分子を含む多量体であって、各テナシンペプチドが、そのＣ末端でｓｃＦｖに連結している多量体。抗体分子は、ＴＮＦＲ２に関して１２価を有する。抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体、特にＦｃγＲに結合しないように改変されている。Ｆｃ領域は、Ｆｃ結合を除去する本明細書に考察される改変のいずれか、特にＮ２９７Ａ重鎖改変を含み得る。一実施形態では、抗体は、図７に示されるフォーマットＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ＴＮＣ－ｓｃＦｖであるが、特定のクローンからの配列に限定されない。

【0042】

上記で考察したように、図１で示した上記で考察したフォーマットが提供され、それらは特定のクローンを起源とする配列に限定されない。一実施形態では、実施例に提供される特異的クローンからの配列、または本明細書に考察されるバリアント配列を有しない特異的フォーマットも提供される。Ｆｃ領域を有するフォーマットに関する一実施形態では、重鎖は、本明細書で考察される重鎖改変、例えば本明細書で考察されるＤＡＮＡ改変を含み、単なるＮ２９７Ａ改変を含まない。

【0043】

特に好ましい一実施形態では、本明細書に提供されるＣ４クローンもしくはＣ４クローンの特異的バリアントの１つからのＣＤＲ６個のセット、またはＶＬおよびＶＨ配列を、図１および７に示すフォーマットの１つに使用する。それらをまた、図２９に表されるフォーマットにも使用してもよい。一実施形態では、表５に記載されるＣＤＲ６個のセット、または表６に記載される可変領域の対のいずれかを、本明細書に記載される任意のフォーマット、特に図１および７に示されるそれらのフォーマットに使用してもよい。ＣＤＲのバリアントセットまたは可変領域の対もまた、本明細書においてさらに考察されるように使用してもよい。使用される特に好ましいＣＤＲ、ＣＤＲセット、および可変領域は、本明細書で記載されるＣ４およびＣ４バリアントに関して記載されたものである。

【0044】

特に好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、以下のフォーマットの１つから選択された抗体であり、フォーマットの利点の一部を括弧内に言及する：
・ Ｆａｂ１－ｓｃＦｖ（高い組織浸透性、短命）；
・ ＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖ（多様な抗体に関して試験される、二特異性バリアントの容易な生成）；
・ ｓｃＦｖ－ＩｇＧ（二特異性バリアントの容易な生成）；
・ ＩｇＧ－ＴＮＣ（経路の識別において潜在的に有用）；および
・ ｓｃＦｖ－ＩｇＧ－ＴＮＣ（非常に活性、二特異性バリアントの容易な生成）。

【0045】

特に好ましい一実施形態では、上記でＩｇＧに言及される場合、ＩｇＧ１が使用される。あるいは、別の実施形態では、ＩｇＧ１が特定のフォーマットで言及される場合、ＩｇＧが任意のＩｇＧサブタイプであり得る同じフォーマットが同様に提供される。

【0046】

一実施形態では、本発明の結合分子は、
（ａ）抗体の１つもしくは複数の重鎖のＮ末端およびＣ末端の両方でＴＮＦＲ２結合部位を含む；ならびに／または
（ｂ）抗体の１つもしくは複数の軽鎖のＮ末端およびＣ末端の両方でＴＮＦＲ２結合部位を含む
抗体である。

【0047】

好ましい一実施形態では、結合分子は、結合分子の重鎖のＣ末端部分でｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖはＴＮＦＲ２に結合する。別の実施形態では、本発明の結合分子は、分子において軽鎖のＣ末端部分でｓｃＦｖを含む。

【0048】

特に好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、重鎖のＣ末端部分でＴＮＦＲ２に特異的なリガンドを有する、またはそれに連結された、またはそれにコンジュゲートされたＦｃ領域をまさに含む抗体である。一実施形態では、各重鎖は、重鎖のＣ末端部分に存在する３個のそのようなリガンドを有する。

【0049】

特に好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、Ｃ末端ＴＮＣ三量体形成の後にＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体、特にＴＮＦ８０が続く抗体またはＦｃ領域である。一実施形態では、ポリペプチドは、３個のＴＮＦ８０単位などの三量体形成することができる３個のＴＮＦ－アルファ配列を含む一本鎖ポリペプチドを含み得る。

【0050】

好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、空間的に移動可能なＣ末端およびＮ末端に位置する抗原結合部位を有する２価である。

【0051】

一実施形態では、本発明の抗体は、ＴＮＦＲ２に特異的なＦａｂを含む２価抗体であり、抗体のＦａｂ部分の重鎖または軽鎖は、ＴＮＦＲ２に特異的なｓｃＦｖを含む。そのような低分子の１つの利点は、高い組織浸透を示し得る点である。好ましい一実施形態では、抗体は、Ｆａｂの軽鎖に連結したｓｃＦｖを含んでもよく、例えば２つは同じポリペプチドの一部である。好ましい一実施形態では、抗体は、図７に示されるフォーマットＦａｂ－ＬＣ：ｓｃＦｖであるが、本発明の実施例に提供されるクローンからの配列に限定されず、ＴＮＦＲ２に関する抗体からの任意の好適な配列であり得る。ＦａｂおよびｓｃＦｖドメインは、例えば、これらの実施形態では、同じまたは異なるＴＮＦＲ２エピトープを認識し得る。

【0052】

好ましい一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は４価である。一実施形態では、本発明の結合分子は、フォーマットＦａｂ－ＨＣ－ｓｃＦｖであり、抗体は、Ｆｃ受容体結合を除去するまたは低減させるＦｃ領域改変を含み、抗体は、各重鎖のＣ末端でｓｃＦｖを含む。別の好ましい実施形態では、抗体は、フォーマットＦａｂ－ＨＣ－ｓｃＦｖであり、抗体は、ＴＮＦＲ２に対して２つの異なる特異性を有するという意味で二特異性である。例えば、好ましい一実施形態では、存在するｓｃＦｖは、ＩｇＧの抗原結合部位とは異なるエピトープに結合する。代替の実施形態では、ＴＮＦＲ２結合部位は全て、ＴＮＦＲ２の同じエピトープを認識する。さらに好ましい実施形態では、本発明の抗体は、フォーマットｓｃＦｖ：ＩｇＧであり、抗体の軽鎖および重鎖は、Ｎ末端部分でｓｃＦｖを含むように改変されており、抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体に結合しないように改変されている。Ｆｃ結合を低減させるまたは除去する、本明細書で考察した任意の改変が使用され得る。そのような抗体は、重鎖ポリペプチド上で発現されたｓｃＦｖがＴＮＦＲ２の１つのエピトープに結合し得ること、および軽鎖上で発現されたｓｃＦｖがＴＮＦＲ２の別の特異性を有するという意味で二特異性であり得る。代替の実施形態では、ｓｃＦｖ領域は全て、ＴＮＦＲ２の同じエピトープに結合し得る。

【0053】

一実施形態では、本発明の結合分子は６価である。一実施形態では、抗体は、フォーマットＩｇＧ－ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖであり、同様にＦｃ受容体に結合しないように改変されたＦｃ領域を有する、例えばＦｃγ受容体に対する結合を除去するまたは低減させる本明細書に考察されるＦｃ改変のいずれかを有する。好ましい実施形態では、ＩｇＧはＩｇＧ１である。別の好ましい実施形態では、抗体は６価であり、これは、抗体Ｆｃ領域を含み、重鎖の各々はＣ末端部分でＴＮＦ－αの三量体またはそのバリアントに連結される。

【0054】

別の好ましい実施形態では、本発明の結合分子は１２価である。好ましい一実施形態では、１２価結合分子は、抗体の重鎖および軽鎖可変領域がｓｃＦｖ分子に交換されている３個の個々の抗体サブユニットの多量体である。好ましい実施形態では、３個の抗体サブユニットは、各抗体の重鎖がＴＮＣの三量体形成ドメインを含むＣ末端でテナシン－Ｃペプチドを含むことから会合する。結合分子は、Ｆｃ受容体に結合せず、好ましい実施形態では、本明細書に記載される改変のいずれかを有するＦｃ領域を含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、６個のＩｇＧ分子を含むヘキサボディであり得る。例えば、結合分子は、６個のＩｇＧ抗体のヘキサボディであり得て、Ｆｃ領域は、ＲＧＹヘキサボディ突然変異を含み、同様にそれらがＦｃ受容体に結合しないことを意味する改変、例えば本明細書に記載される特定の改変のいずれかも含む。好ましい実施形態では、ＩｇＧはＩｇＧ１である。

【0055】

好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２に関して４または１２価である。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、フォーマットｓｃＦｖ－ＩｇＧ（^＊）－ＨＣ－ＴＮＣおよびｓｃＦｖ－ＩｇＧ（^＊）（式中、^＊は、Ｆｃ受容体結合を除去するまたは低減させるＦｃ領域改変を示す）から選択される抗体である。特に好ましい実施形態では、結合分子のＩｇＧ部分は、ＩｇＧ１である。ＨＣ－ＴＮＣは、ＩｇＧの重鎖が、テナシンペプチド、例えば配列番号２のペプチドまたはそのバリアントを含むことを示す。別の実施形態では、本発明の結合分子は、フォーマットｓｃＦｖ－ＩｇＧ（^＊）－ＨＣ－ＴＮＣ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ（^＊）、およびＩｇＧ（^＊）－ＨＣ：ＲＧＹから選択される抗体である。ＩｇＧ（^＊）－ＨＣ：ＲＧＹフォーマットに関して、この場合も分子の好ましいＩｇＧ部分はＩｇＧ１抗体である。

【0056】

特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、細胞の表面上にＴＮＦＲ２分子の六量体、または少なくとも六量体の形成をもたらすことができる。一実施形態では、本発明の結合分子は、同じ細胞の表面上の複数のＴＮＦＲ２受容体に結合するシスでＴＮＦＲ２受容体に結合し得る。一実施形態では、結合分子は、同じ細胞の表面上のＴＮＦＲ２の六量体の形成を少なくとももたらすことができる。別の実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２分子にトランスで結合することができ、すなわち、結合分子は１つの細胞の表面上の少なくとも１つのＴＮＦＲ２分子に結合し、別の細胞の表面上の少なくとも１つのＴＮＦＲ２分子に結合する。一実施形態では、結合分子は、ＴＮＦＲ２にシスおよびトランスで結合することができる。例えば、結合分子はシスおよびトランスで結合する能力を有し得て、別の実施形態では実際にシスおよびトランスで結合し得る。一実施形態では、本発明の結合分子は、トランス結合が起こる場合、両方の細胞上でＴＮＦＲ２の六量体の形成をもたらす。一実施形態では、結合部位の方向は、抗体がＴＮＦＲ２にシスおよび／またはトランス様式で結合するのかに影響を及ぼし得る。一実施形態では、本発明の結合分子は、互いと比較して逆方向を有する少なくとも２つのＴＮＦＲ２結合部位を有する分子であり、好ましくは、結合分子は、抗体抗原結合部位である少なくとも２つのそのようなＴＮＦＲ２結合部位を有する。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、トランス結合を可能にする異なる細胞上のＴＮＦＲ２分子に結合することができる少なくとも２つのＴＮＦＲ２結合部位を有する分子であり、好ましくは、結合分子は、抗体抗原結合部位である少なくとも２つのそのようなＴＮＦＲ２結合部位を有する。別の好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、少なくとも４価を有し、同じ細胞の表面上のＴＮＦＲ２の複数の異なる分子に結合することができ、好ましくは、結合分子は少なくとも６価を有する。

【0057】

別の実施形態では、本発明の結合分子は、ダイアボディであり得る。ダイアボディは、典型的に小さい２価の抗原結合抗体部分であり、多様なダイアボディフォーマットが存在し、そのいずれを使用してもよく、例えばダイアボディは、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるペプチドリンカーによって連結された同じポリペプチド鎖上の軽鎖可変ドメインに連結された重鎖可変ドメインを含み得る。これは、別の鎖の相補的ドメインとの対形成およびＴＮＦＲ２の２つの抗原結合部位を有する二量体分子のアセンブリをもたらす。

【0058】

広く多様な抗体フォーマットが存在し、本発明の抗体として、またはその一部として使用してもよく、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、（ＳｃＦｖ）２、（ＳｃＦｖ２）、二特異性（ｓｃＦｖ２）、トリアボディ、テトラボディ、二特異性ｓｃ（Ｆｖ）２、タンデムジ－ｓｃＦｖ、タンデムトリ－ｓｃＦｖ、およびトリアボディは全て、本発明の可能な抗体フォーマットを表す。上記で考察したように、本発明の結合分子は、少なくとも２価を有する。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、少なくとも２つの空間的に移動可能な潜在的な細胞－細胞接続ＴＮＦＲ２結合部位、または少なくとも６個の「平行な」または「単一方向」指向性のシス作用結合部位を有する。本明細書で言及されたフォーマットが１価を有する実施形態では、それらは抗体全体よりはむしろ、そのようなフォーマットにおける本発明の抗体の一部として使用され得る。

【0059】

一実施形態では、本発明の結合分子は、本明細書で記載されるＴＮＦＲ２の特異的結合部位の１つを含むのではなく、ＴＮＦＲ２のバリアント結合部位を含み得る。好ましい一実施形態では、ＴＮＦＲ２のバリアント結合分子は、本明細書に記載されるＴＮＦＲ２の特異的結合分子の１つが、ＴＮＦＲ２に対する結合を交差遮断するその能力によって定義される。交差遮断する能力は、ＴＮＦＲ２に対する結合分子の結合、およびさらなる結合分子がＴＮＦＲ２に対するそのような結合を交差遮断する能力を測定する結合アッセイを使用して評価され得る。一実施形態では、交差遮断する能力は、ＴＮＦＲ２の結合部位の１コピーを単に含む一価分子を使用して試験される。例えば、結合部位を含むｓｃＦｖが、本明細書に記載される特異的結合分子の１つとはＴＮＦＲ２の結合部位を有することのみが異なるｓｃＦｖを交差遮断する能力を試験する。別の実施形態では、実際の結合分子が互いに交差遮断する能力は、それらをｓｃＦｖ分子に変換することなく試験される。さらなる実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦαのＴＮＦＲ２に対する結合を遮断または低減することができる。別の実施形態では、本発明の結合分子は、リンフォトキシン－アルファのＴＮＦＲ２に対する結合を低減または遮断することができる。

【0060】

一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体におけるＴＮＦＲ２に対する結合ドメインの親和性は、約４００ｎＭまたはそれより低い、２００ｎＭまたはそれより低い、例えば約１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、またはそれより低いＫ_Ｄを有する。一実施形態では、結合親和性は、５０ｐＭまたはそれより低い。例えば、一実施形態では、本発明の結合分子における個々のＴＮＦＲ２結合部位は、結合分子に対する全体的な親和性ではなくて、ＴＮＦＲ２に対してそのような親和性を示す。一実施形態では、そのような親和性は、ＴＮＦＲ２に関する抗体の全体的なアビディティである。一実施形態では、本発明の結合分子の個々の抗原結合部位の親和性は、１μΜ未満、７５０ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、１０ｐＭ未満、１ｐＭ未満、または０．１ｐＭ未満であり得る。一部の実施形態では、Ｋｄは、約０．１ｐＭ～約１μΜである。

【0061】

一実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。一実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４抗体であるか、または抗体のそのクラスの重鎖定常領域を含む。特に好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体であるか、またはそのような抗体を含む。好ましい一実施形態では、使用される定常領域は、ヒトＩｇＧ定常領域である。特に好ましい実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域を使用する。これは、本明細書に記載される任意の改変を有し得る。特に限定されないが、「抗体」という用語は、ニワトリ、サメ、および哺乳動物、例えばマウス、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウシ、ラマ、非ヒト霊長類、およびヒトを含む任意の適切な起源種からの抗体を包含する。好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、ヒト化抗体である。別の好ましい実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、完全にヒトである。ヒト化抗体を生成するための方法の非限定的な例は、例えばRiechmann et al.(Nature. 1988 Mar 24; 332(6162):323-7)またはJones et al.(Nature. 1986 May 29-Jun 4; 321(6069):522-5)から当技術分野で公知である。さらに好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ヒト抗体である。本明細書で考察されるように、本発明の結合分子、特に抗体は、非ヒト配列、例えばテナシン－ｃペプチドを含み得るが、好ましい一実施形態では、抗体の抗体ベースの配列は全て、テナシンペプチド配列の存在にもかかわらず、ヒトである。「抗体」という用語は、単量体抗体（例えば、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ）またはオリゴマー抗体（例えば、ＩｇＡまたはＩｇＭ）を包含する。「抗体」という用語はまた、特に限定されないが、単離抗体および改変抗体、例えば遺伝子操作抗体、例えばキメラまたはヒト化抗体も包含する。

【0062】

好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２に対して唯一の特異性を有する。したがって、好ましい一実施形態では、ＴＮＦＲ２に対して特異的である本発明の抗体の抗原結合部位は全て、ＴＮＦＲ２の同じエピトープに対して特異的である。別の実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２に対して１つより多くの特異性を含む。例えば、このことは、結合分子が両方の抗体抗原結合部位のみならず、リガンドベースのＴＮＦＲ２結合部位も含むためであり得る。好ましい一実施形態ではあるが、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２の１つより多くのエピトープを認識する抗原結合部位を含む抗体である。例えば、好ましい一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体はＴＮＦＲ２に対して二特異性である。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子では、ＴＮＦＲ２に対する結合分子の１つの特異性は、軽鎖および重鎖可変領域の対によって提供されるが、他方は、結合分子全体の一部として存在するｓｃＦｖ断片によって提供される。別の実施形態では、結合分子、特に抗体のＴＮＦＲ２結合部位は全て、その各々が異なる特異性を有するｓｃＦｖを含む、２つの異なるポリペプチドから形成された結合分子を有するｓｃＦｖによって提供される。

【0063】

一実施形態では、本発明の結合分子は、無関係な特異性を有するＦｃ領域または抗体分子を含んでもよく、ＴＮＦＲ２に対する結合能は結合分子の他の部分によって提供される。例えば、一実施形態では、本発明の結合分子は、重鎖のＣ末端部分で、ＴＮＦ－アルファ分子である、特にＴＮＦＲ２に対して選択的な突然変異体ＴＮＦ－アルファ分子、例えばＴＮＦ８０突然変異体であるＦｃ領域を含む。一実施形態では、本発明の結合分子は、無関係な特異性を有する免疫グロブリンを含んでもよく、重鎖のＣ末端部分は、ＴＮＦ－アルファ分子、特に突然変異体ＴＮＦ－アルファ分子、例えばＴＮＦ８０であり得る。一実施形態では、Ｆｃまたは無関係な抗体の重鎖は、同じポリペプチドの一部としてＴＮＦ－アルファ、特にＴＮＦ８０突然変異体を含み得る。一実施形態では、それらは、３個のＴＮＦ－アルファポリペプチド、特に３個のＴＮＦ８０ポリペプチドを含む一本鎖ポリペプチドを含み得る。別の実施形態では、ポリペプチドのＴＮＦ－アルファ部分の前に、重鎖は、ＴＮＣペプチドまたはそのバリアントを含み得る。さらに好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、可変領域を有するのではなく、単一のポリペプチドの一部としてＦｃ領域の２つの重鎖部分を有するＦｃ領域を含み得る。

【0064】

ＴＮＦリガンドを含む好ましい結合分子の例は、図２４に表されるＦｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＣ－ＴＮＦ８０であり、ＤＡＮＡは、Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ａ突然変異を含むＦｃ領域の重鎖を示し、ＴＮＣは、テナシン三量体形成ドメインペプチド配列を示す。したがって、本発明の好ましい結合分子は、各重鎖が、Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７ＡのＤＡＮＡ改変を有する３個のＦｃ領域を含む。さらに好ましい実施形態では、それらの重鎖ポリペプチドの各々は、ＴＮＣペプチドを含む。さらに好ましい実施形態では、各Ｆｃ領域の各重鎖ポリペプチドは、ＴＮＣペプチド配列の後にＴＮＦ－アルファ配列、特にＴＮＦ８０配列を含む。

【0065】

本発明のさらに好ましい結合分子は、各重鎖ポリペプチドがＤ２６５ＡおよびＮ２９７ＡのＤＡＮＡ改変ならびにＴＮＦ－アルファ、特にＴＮＦ８０配列を含む３個のＦｃ領域を含むＦｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＦ８０である。本発明はまた、結合分子として、図２４に示されるＦｃ－ＴＮＣ－ＴＮＦ８０およびＦｃ－ＴＮＦ８０フォーマット分子も提供する。

【0066】

別の実施形態では、ＴＮＦＲ２に特異的に結合するが、ＴＮＦＲ１には結合しない結合分子であって、ＴＮＦＲ２のＦｃγＲ非依存的アゴニストであり、ＴＮＦＲ２の結合に関して少なくとも２価を有し、ＴＮＦＲ２に結合するが、ＴＮＦＲ１には結合しない突然変異体ＴＮＦ－アルファ、およびポリペプチドをオリゴマー形成するテナシンペプチド配列を含むポリペプチドを含む、結合分子が提供される。一実施形態では、そのような結合分子は、抗体配列を含まない。一実施形態では、分子は、各々が突然変異体ＴＮＦ－アルファ配列をテナシンペプチド、例えば本明細書に開示される任意のテナシンポリペプチドと共に含むポリペプチドを含む。好ましい一実施形態では、テナシンペプチド配列は、そのようなポリペプチドのオリゴマー形成をもたらす。一実施形態では、突然変異体ＴＮＦ－アルファは、１４３Ｎ／１４５Ｒ改変を有し、ＴＮＦＲ１と比較してＴＮＦＲ２に対する選択的結合をもたらす。そのようなＴＮＦ突然変異体はまた、ＴＮＦ８０とも呼ばれ得る。

【0067】

ＴＮＦＲ２に対して１つより多くの特異性を有する結合分子
好ましい実施形態では、ＴＮＦＲ２に特異的な結合分子の全ての抗原結合結合部位は、ＴＮＦＲ２に関して同じ特異性を有する。特に、それらは全て、同じアミノ酸配列を有してもよく、したがって同じエピトープに結合してもよい。一実施形態では、抗原結合部位は全て、ＴＮＦＲ２の同じエピトープに対して特異的である。別の実施形態では、ＴＮＦＲ２抗原結合部位は全て、ＴＮＦＲ２に対する他のＴＮＦＲ２抗原結合部位の結合を交差遮断することが可能である。

【0068】

しかし、さらに好ましい実施形態では、結合分子は、ＴＮＦＲ２に結合する抗原結合部位を有し得るが、それらの抗原結合部位の少なくとも２つは、ＴＮＦＲ２に関して異なる特異性を有する。一実施形態では、結合分子は、同じＴＮＦＲ２分子の異なるエピトープに結合するＴＮＦＲ２の少なくとも２つの抗原結合部位を含む。別の実施形態では、少なくとも２つの抗原結合部位は、ＴＮＦＲ２に対する互いの結合を交差遮断しない。一実施形態では、結合分子は、それがＴＮＦＲ２の少なくとも２つの異なるエピトープを認識する抗原結合部位を含むという意味でＴＮＦＲ２に関してバイパラトピックである。別の実施形態では、ＴＮＦＲ２に関する少なくとも２、３、４、５、または６つの異なる特異性が、抗原結合部位によって付与される。一実施形態では、ＴＮＦＲ２に特異的な結合分子の抗原結合部位は全て、ＴＮＦＲ２に関して異なる特異性を有する。

【0069】

一実施形態では、結合分子は、各々の個々のポリペプチドが、ＴＮＦＲ２に関して異なる特異性を有する少なくとも２つの異なる抗原結合部位を含む２つのポリペプチドを含む６価結合分子である。一実施形態では、各ポリペプチドは、３つのそのような特異性を含む。一実施形態では、２つのポリペプチドは、同じポリペプチド上で異なる特異性を含むが、２つのポリペプチドは同一である。別の実施形態では、２つのポリペプチドは同一ではなく、各ポリペプチドは、ＴＮＦＲ２に関して３つの異なる特異性を含み、全体でＴＮＦＲ２に関して６つの異なる特異性が存在する。

【0070】

抗体が、「ノース」および「サウス」指向性の抗原結合部位を含む別の実施形態では、「ノース」および「サウス」指向性の抗原結合部位は、ＴＮＦＲ２に関して互いに異なる特異性を付与する。例えば、一実施形態では、本明細書で記載される任意の４価抗原結合分子が、ＴＮＦＲ２に関して１つの特異性を有する２つの抗原結合部位、および別の特異性を有する２つの抗原結合部位を含み得る。一実施形態では、２つの「サウス」指向性のｓｃＦｖは、「ノース」指向性の抗原結合部位とはＴＮＦＲ２に関して異なる特異性を有し得る。

【0071】

ｓｄＢ、ＳｄＡｂ、およびＶＨＨ結合ドメイン
特に好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、単一ドメイン結合体（ｓｄＢ）を含む。単一ドメイン結合体は、例えば非Ｉｇ操作タンパク質足場、例えばｄａｒｐｉｎ、アフィボディ、アドネクチン、アンチカリンタンパク質、またはペプチドおよびその他を含む。そのため、ｓｄＢ、ｓｄＡｂ、ＨＣＡｂ、およびＶＨＨに関して言及する場合は常に、ｄａｒｐｉｎ、アフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、またはＴＮＦＲ２に結合することができるペプチドを使用することが可能であり得て、ｓｄＢという用語は、使用されるそのような結合実体を包含する。

【0072】

単一結合ドメイン結合体（ｓｄＢ）の例としては、特に単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、例えば重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）、特にＶＨＨドメイン抗体が挙げられる。ＶＨＨ抗原結合ドメインを使用することは、特に好ましい実施形態である。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。抗体全体と同様に、ｓｄＡｂは、特異的抗原に選択的に結合することができる。ｓｄＡｂは、ラクダ科の重鎖抗体（ＶＨＨ）もしくは軟骨魚のＩｇＮＡＲ（ＶＮＡＲ）のいずれかの単一単量体可変ドメインから操作することができるか、またはラクダ化ヒト抗体から開発することができる抗体断片であり得る。そのような任意のｓｄＡｂを使用してもよい。特に好ましいｓｄＡｂはＶＨＨドメインである。一実施形態では、本発明の結合分子は、少なくとも２つのｓｄＡｂドメインを含み得る。一実施形態では、結合分子は、同じポリペプチド上の少なくとも２つのｓｄＡｂドメインを含み得る。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、単一ドメイン抗体または結合分子の全価数が少なくとも２である単一ドメイン抗体を含む分子であり得る。例えば、本発明の抗体は、抗体全体の一部として共に連結した２つのそのような単一ドメイン抗体を含み得る。

【0073】

別の好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、ｓｄＡｂとしてＶＨＨ結合ドメインを含み得る。重鎖のみの抗体を産生するラクダ科、サメ、および他の軟骨魚などの生物からのＳｄＡｂを使用してもよい。これらの重鎖のみの抗体の単一ドメイン可変断片は、ＶＨＨまたはナノボディまたはｓｄＡｂと呼ばれる。ＶＨＨは、３個の超可変ループ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を使用して抗体によって共有される免疫グロブリンフォールドを保持し、その標的に結合する。ＶＨＨ断片（例えば、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標））は、ラクダ科重鎖抗体に由来する組換え、抗原特異的、単一ドメイン、可変断片である。

【0074】

本発明の結合分子は、好ましくはＴＮＦＲ２に関して少なくとも２価を有し、結合分子がＶＨＨ断片を含む一実施形態では、これは少なくとも２つのそのようなＶＨＨ断片を含む。個々のＶＨＨ断片を、例えばリンカーの使用を通して共に連結してもよく、したがって一実施形態では、各々がＴＮＦＲ２に特異的に結合することができる少なくとも２つのＶＨＨ断片を全体として含む単一のポリペプチドとして発現させてもよい。ＶＨＨ断片は、Ｆｃ領域を有さず、ＶＨＨ断片が本発明の結合分子の一部として存在する一実施形態では、結合分子は、Ｆｃ領域を欠如し、その理由からＦｃ受容体に結合しない。一実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２に特異的な３、４、５、６個、またはそれより多くのＶＨＨ断片を含むか、または少なくとも含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、単一のＶＨＨドメイン抗体を含む。特に好ましい実施形態では、抗体は、少なくとも４個のｓｄＡｂを含む。特に好ましい実施形態では、抗体は、４個のｓｄＡｂを含む。特に好ましい実施形態では、抗体は、少なくとも６個のｓｄＡｂを含む。特に好ましい実施形態では、抗体は、６個のｓｄＡｂを含む。さらに好ましい実施形態では、ｓｄＡｂはＶＨＨである。一実施形態では、結合分子は、その数のｓｄＢｒを含む。

【0075】

一実施形態では、本発明の結合分子は、Ｆｃ領域を含むがＣＨ１領域は含まず、軽鎖が関与することなくＴＮＦＲ２に結合することができる。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、１つまたは複数のＶＨＨを含み、Ｆｃ領域を含み、軽鎖が関与することなくＴＮＦＲ２に結合することができる。別の実施形態では、本発明の結合分子は、図４１に示される構造の一部に表されるように、１つまたは複数のＶＨＨを含み、ＴＮＣ三量体形成ドメインまたはＦｃ領域、または両方を含む。

【0076】

抗体定常領域およびＦｃ領域機能
好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、Ｆｃ受容体に結合せず、特にＦｃγＲ受容体に結合しない。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、抗体であり、それがＦｃ領域を含まないためにまたはあるいはＦｃ受容体に結合しないように改変されたＦｃ領域を有するために、Ｆｃ受容体に結合しない。Ｆｃドメインは、本明細書で使用される場合、特に本文が明確に示していない限り、一般的に－（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２を指し、式中ＣＨ２は重鎖ＣＨ２ドメインであり、ＣＨ３は重鎖ＣＨ３ドメインであり、および各重鎖からの１つを有する２つのＣＨ_２ＣＨ_３が存在する。一実施形態では、本発明の抗体は、－ＣＨ_２ＣＨ_３断片を含まない。一実施形態では、本発明の抗体は、ＣＨ_２ドメインを含まない。一実施形態では、本発明の抗体は、ＣＨ_３ドメインを含まない。

【0077】

一実施形態では、本発明の結合分子はＦｃガンマ受容体に結合するが、非改変Ｆｃ領域を含む同一の抗体のＦｃｇＲに対する結合と比較すると実質的に減少した程度（例えば、測定された非改変Ｆｃ領域を含む同一の抗体のＦｃγＲに対する結合と比較して、ＦｃγＲに対する結合の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の減少）で結合する。特に好ましい実施形態ではあるが、結合分子は、ＦｃγＲに対して検出可能な結合を全く有しない。結合の存在または非存在を含む結合は、当技術分野で公知の多様な技術、例えばこれらに限定されないが平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）； KinExA, Rathanaswami et al. Analytical Biochemistry, Vol. 373:52-60, 2008；またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または表面プラズモン共鳴アッセイまたは速度論に基づくアッセイの他の機構（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析またはＯｃｔｅｔ（商標）分析（ｆｏｒｔｅＢＩＯ））、および他の方法、例えば間接的結合アッセイ、競合結合アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）を使用して決定することができる。

【0078】

一実施形態では、Ｆｃ領域が存在する場合、使用されるＦｃ領域は、突然変異している、特に本明細書に記載される突然変異を含む。一実施形態では、突然変異は、Ｆｃ受容体、特にＦｃγＲに対する結合を除去するためである。好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃ受容体に結合しないように突然変異している。

【0079】

一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃ領域を含み得るが、天然に存在する４本鎖抗体に通常見出される可変領域を含まない。好ましい一実施形態では、そのようなＦｃ領域は、Ｆｃ領域の重鎖を含むポリペプチドの一部として他の配列、特にＴＮＣペプチドおよび／またはＴＮＦ－アルファ（特にＴＮＦ８０）、および好ましくは両方を、特にポリペプチドのＣ末端部分に含み得る。

【0080】

一実施形態では、本発明の抗体は、例えば低減されたＦｃ機能、特にほぼＦｃ－ヌル表現型をもたらすために、アグリコシルＩｇＧを含み得る。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｎ２９７で改変および特にＮ２９７Ａを有する。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆ２４３および／またはＦ２４４で改変、特に抗体がアグリコシルＩｇＧを含むことを意味する改変を有する。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆ２４３Ａおよび／またはＦ２４４Ａ重鎖改変を含み得る。別の実施形態では、Ｆ２４１、Ｆ２４３、Ｖ２６２、およびＶ２６４の１つまたは複数を、特にグリコシル化に影響を及ぼすアミノ酸に改変してもよい。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆ２４１Ａ、Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６２Ｅ、およびＶ２６４Ｅの改変を有し得る。そのような改変は、その全体が参照により組み込まれる、Yu et al(2013)135(26): 9723-9732において、特にその中で考察される改変に関連して考察されている。そのような改変は、例えばＦｃ受容体結合をモジュレートする方法を提供する。抗体のグリコシル化に影響を及ぼす改変が存在し得る。さらに、本発明の抗体を、糖鎖工学のさらなるアプローチとしてグリコシル化に影響を及ぼす細胞タイプにおいて産生してもよい。一実施形態では、本発明の抗体のフコシル化、シアリル化、ガラクトシル化、および／またはマンノシル化を、抗体を産生するために使用される配列改変によっておよび／または細胞のタイプを介してのいずれかによって変更してもよい。

【0081】

一実施形態では、本発明の抗体は、２９７および／または２９９位で改変を有する。例えば、一実施形態では、本発明の抗体は、その重鎖にＮ２９７Ａ改変、好ましくはＮ２９７Ｑ、または２９９位でのＳｅｒまたはＴｈｒの他の残基への突然変異を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、それらの改変の両方を有する。

【0082】

一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、２つの異なる重鎖を含み、重鎖は、同一の重鎖に会合する重鎖と比較して、異なる重鎖が優先的に会合することを可能にする改変を含む。そのようなアプローチは特に、抗体がＴＮＦＲ２に関して１つより多くの特異性を有する場合、例えば抗体がＴＮＦＲ２の２つの異なるエピトープに結合する場合に使用され得る。一実施形態では、２つの異なる重鎖は、ノブイントゥホール突然変異を含む。ある特定の態様では、ノブイントゥホール突然変異は、１つの重鎖定常領域におけるＴ３６６Ｗ突然変異であり、他のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ突然変異である。ある特定の態様では、改変は、電荷対突然変異を含む。ある特定の態様では、電荷対突然変異は、重鎖定常領域の１つにおけるＴ３６６Ｋ突然変異であり、他のドメインにおける対応するＬ３５１Ｄ突然変異である。代替の実施形態では、異なる重鎖の優先的対形成をもたらす改変を有するのではなくて、重鎖は、２つの重鎖を含むヘテロ二量体を、重鎖の１つのタイプのみを含むホモ二量体から優先的に精製することができることを意味する改変を含む。例えば、改変は、プロテインＡに対する親和性を変更してもよく、１つの重鎖はなおもプロテインＡに結合することができるが、改変重鎖は結合することができず、２つの異なる重鎖のヘテロ二量体を、プロテインＡに対するその親和性に基づいて精製することができることを意味する。

【0083】

他の実施形態では、重鎖および軽鎖は、それらの間にジスルフィド架橋が形成されるか否かによって変化する改変を含み得る。多様な実施形態において、改変は、軽鎖と重鎖の間に操作されたジスルフィド架橋を生成する突然変異を含む。本明細書で記載されるように、「操作されたジスルフィド架橋」は、２つまたはそれより多くのドメインが会合する場合に、非天然のジスルフィド結合が形成されるように、２つまたはそれより多くのポリペプチドにおける非内因性システインアミノ酸を提供する突然変異である。操作されたジスルフィド架橋は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Merchant et al.(Nature Biotech(1998)16:677-681)により詳細に記載されている。特定の実施形態では、操作されたジスルフィド架橋を生成する突然変異は、第１または第２のＣＨ３ドメインの１つにおけるＫ３９２Ｃ突然変異であり、他のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｃである。好ましい実施形態では、操作されたジスルフィド架橋を生成する突然変異は、第１または第２のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ突然変異であり、他のＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃである。別の好ましい実施形態では、操作されたジスルフィド架橋を生成する突然変異は、ＫＳＣトリペプチド配列を組み入れるＣＨ３ドメインのＣ末端の伸長によって提供される第１および第２のＣＨ３ドメインの両方における４４７Ｃ突然変異である。

【0084】

一実施形態では、本発明の結合分子は、結合分子の血清中半減期を変更する改変を含み得る。したがって、別の実施形態では、本発明の抗体は、抗体の半減期を変更するＦｃ領域改変（複数可）を有する。そのような改変ならびにＦｃ機能を変更する改変が存在し得る。好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、抗体の血清中半減期を変更する改変（複数可）を有する。特に好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、そのような改変を欠如する抗体と比較して、抗体の血清中半減期を変更する改変（複数可）を有する。一実施形態では、改変は、血清中半減期の増加をもたらす。別の実施形態では、それらは血清中半減期の減少をもたらす。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、そのような改変を欠如する抗体と比較して、集合的にＦｃ領域を沈黙化し、かつ抗体の血清中半減期を減少させる１つまたは複数の改変を含む。

【0085】

特に好ましい実施形態では、抗体は、例えばＦｃ改変Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓを有するＦＤＡが承認した抗体デュルバルマブに由来する抗体などの、軽微なエフェクター機能を有することから全くエフェクター機能を有しないことまでの定常領域を有する。デュルバルマブにおけるＦｃ改変は、Ｆｃ機能を除去するために役立ち、そのため、軽鎖および重鎖定常領域またはデュルバルマブの使用は、Ｆｃ機能の望ましい欠如を有する定常領域を提供するために特に有効な方法である。デュルバルマブは、その定常領域の使用が特に好ましい実施形態を表す理由をさらに表す臨床承認を獲得している。したがって、好ましい一実施形態では、結合分子は、デュルバルマブのＦｃ領域を含む。

【0086】

好ましい一実施形態では、結合分子がＶＨＨ結合ドメインを含む場合、ＶＨＨドメインを含むポリペプチドは、デュルバルマブのＣＨ２およびＣＨ２ドメインをさらに含む。さらに好ましい実施形態では、結合分子は、重鎖および軽鎖を含み、抗体はデュルバルマブの軽鎖および重鎖定常領域を含む。いずれの実施形態においても、結合分子がデュルバルマブに由来する定常領域配列を含む場合、それらは本明細書で考察する任意の定常領域改変を含み得る。デュルバルマブは、ヒトＩｇＧ１骨格を有する。したがって、さらに好ましい実施形態では、結合分子が定常領域を含む場合、これはヒトＩｇＧ領域を含み得る。好ましい実施形態では、結合分子はヒトＩｇＧ１領域を含み得る。そのような領域を改変してＦｃ機能を除去してもよい。一実施形態では、定常領域は、特に抗原結合ドメインがｓｄＢｒである場合、ＣＨ１領域を欠失させるように改変され得る。

【0087】

デュルバルマブの重鎖および軽鎖定常領域配列をそれぞれ、配列番号１３５および１３６として提供する。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、そのような軽鎖および重鎖可変配列またはそのような配列のバリアントを含む。好ましい一実施形態では、バリアント配列または複数の配列は、関連する特異的配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。別の実施形態では、バリアントは、少なくとも９５％の配列同一性を有する。一実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号１３５および１３６の重鎖および軽鎖定常領域配列を含むが、本明細書に考察される１つまたは複数の定常領域配列改変を含む。好ましい一実施形態では、そのような重鎖および軽鎖定常領域は、本明細書に提供される４価結合分子で使用される。

【0088】

ＣＨ１領域が欠失したデュルバルマブ配列の重鎖定常領域のバリアントを、配列番号３１６として提供する。好ましい一実施形態では、そのような定常領域は、結合分子がｓｄＡｂベースの抗原結合部位、好ましくはＶＨＨ抗原結合部位を含む場合に使用される。そのような配列、しかし本明細書に考察する他の定常領域改変の１つまたは複数を使用してもよい。一実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号３１６または少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。別の実施形態では、バリアントは、少なくとも９５％の配列同一性を有し得る。そのような実施形態におけるバリアントは、なおもＣＨ１が欠失している。ＣＨ１欠失を有するそのような重鎖定常領域は、好ましくは、抗原結合部位の少なくとも１つがＴＮＦＲ２に対して特異的なＶＨＨ抗原結合ドメインである一実施形態において使用される。

【0089】

例示的な好ましい高次価数のＴＮＦＲ２結合分子
好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２に関して少なくとも４価を有する。一実施形態では、結合分子の価数は、ＴＮＦＲ２に関して４～９である。特定の理論に拘束されることを望まないが、限定的な空間内のＴＮＦＲ２結合部位がより高密度であることは、ＴＮＦＲ２アゴニスト活性を促進するために役立ち得ると考えられる。驚くべきことに、本発明者らは、抗体を、特に４価またはそれより高い価数を有する本明細書に記載されるフォーマットに再フォーマットすることを通して、既知のＴＮＦＲ２アンタゴニスト抗体をＴＮＦＲ２アゴニスト分子に変換することが可能であることを見出した。

【0090】

特に好ましい一実施形態では、提供される結合分子は、ＴＮＦＲ２に関して４価である。４価フォーマットの例を、本出願の実施例に提供する。本発明は、本明細書に開示される特異的結合ドメインの１つを含む任意のそれらのフォーマットを提供する。好ましいフォーマットの例としては：ｓｃＦｖ－ＩｇＧ（図１を参照されたい）；ＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖ（図７を参照されたい）；ＩｇＧ－ＬＣ：ｓｃＦｖ（図７を参照されたい）が挙げられる。ＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖは、特に好ましいフォーマットを表す。ＩｇＧ－ＬＣ：ｓｃＦｖはまた、特に好ましい実施形態を表す。一実施形態では、ｓｃＦｖ基を、リンカーによってそのようなフォーマットで重鎖または軽鎖に連結する。したがって、好ましい一実施形態では、Ｇ４Ｓリンカーを使用してｓｃＦｖを連結する。別の実施形態では、抗体は、結合ドメインの少なくとも２つを隔てるリンカーを含むであろう。好ましい４価フォーマットの例を、図２９に例証する。図２９に示される構築物は、Ｃ４結合ドメインを含み、これは好ましい結合ドメインを表す。しかし、各結合部位のＶＨおよびＶＬ領域が本明細書に記載されるバリアントＣ４配列のいずれかである、図２９に表されるフォーマットもまた提供される。図２９に示されるフォーマットはまた、結合部位が、本明細書に記載されるＣＤＲ６個のセットのいずれかを含む結合分子である場合に使用され得る。

【0091】

本発明のさらに特に好ましい結合分子フォーマットは、６価結合分子、特に６個の特異的ＴＮＦＲ２結合部位を有する結合分子である。本発明者らは予想外にも、六量体フォーマットにおける結合分子が、異なるＴＮＦＲ２抗原結合ドメインを使用してそれ以外は同一の６価分子を生成する場合より少ないＴＮＦＲ２アゴニスト活性の変動を示すことを見出した。

【0092】

例示的な６価フォーマットは、本出願の実施例または図面に使用される任意のフォーマットを含む。好ましい一実施形態では、６価抗体は、同じポリペプチド上でＴＮＦＲ２に対して特異的な少なくとも２つの結合部位を含む。特に好ましい一実施形態では、６価抗体は、各ポリペプチドがＴＮＦＲ２の３個の結合部位、特に３個のＶＨＨ、特に本明細書に記載される特定のＶＨＨを有する２つのポリペプチドを含む。

【0093】

一実施形態では、６価結合分子中のＶＨＨ抗原結合部位は全て同じである。別の実施形態では、結合分子は、例えば異なるエピトープに結合する、ＴＮＦＲ２に関して異なる特異性を有する少なくとも２つの抗原結合部位を有し得る。別の実施形態では、ＴＮＦＲ２に対して特異的な結合分子の抗原結合部位は全て、ＴＮＦＲ２に関して異なる特異性を有し得る、すなわち異なるエピトープに結合し得る。別の実施形態では、抗原結合部位は、ＴＮＦＲ２に結合する場合にそれらが互いに交差遮断しないという意味で異なり得る。

【0094】

好ましい６価結合分子フォーマットの例としては、本出願の実施例および図に記載されるフォーマットが挙げられる。図または実施例が特定のＴＮＦＲ２結合ドメインを有する抗体フォーマットを記載する例では、本発明はまた、同じフォーマット抗体を提供するが、本明細書に記載される他のＴＮＦＲ２結合ドメインの１つを有する抗体も提供する。特に好ましい実施形態では、ＴＮＦＲ２結合ドメインはＶＨＨドメインである。好ましい実施形態では、使用されるＶＨＨドメインは、本明細書に記載される特異的ＶＨＨドメインまたはそのバリアントの１つである。好ましい一実施形態では、結合分子は、図４０に表される６価フォーマットの１つに存在する。さらに好ましいフォーマットおよび特異的配列を、図５４および５５に提供する。特に好ましいフォーマットは、各々３個のＶＨＨドメインが存在する２つのポリペプチドを含む。さらに特に好ましいフォーマットでは、結合分子は、フォーマット３ｘＶＨＨ－Ｆｃである。例えば、特に好ましいフォーマットは、３ｘＶＨＨ－Ｆｃである。さらに好ましいフォーマットは、３ｘＶＨＨ－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）である。本発明の結合分子に使用される特に好ましいＶＨＨドメインは、Ｃ１８８である。さらに好ましいＶＨＨドメインは、本明細書に記載されるＣ１８８の特異的バリアントの１つである。したがって、３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃは、特に好ましい結合分子である。さらに好ましい結合分子は、３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）である。あるいは、それらのフォーマットのいずれにおいてもＣ１８８は、本明細書に記載される他のＶＨＨドメインの１つの代わりに置換され得る。

【0095】

さらに特に好ましい実施形態では、６価結合分子がＦｃ領域を含む場合、これは抗体デュルバルマブのＦｃ領域を含む。代替の実施形態では、結合分子は、デュルバルマブのＦｃ領域を含むが、本明細書に記載される任意のＦｃ領域を含む。

【0096】

結合分子の生成およびスクリーニング
一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体を突然変異させて、標的抗原または複数の抗原、特にＴＮＦＲ２に対して改善された親和性を提供する。そのようなバリアントは、ＣＤＲを突然変異させること（Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、鎖シャッフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異株の使用（Low et al J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996）、ＤＮＡシャッフリング（Patten et al Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997）、ファージディスプレイ（Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996）、および性別ＰＣＲ（Crameri et al Nature, 391, 288-291, 1998）を含む、多数の親和性成熟プロトコールによって得ることができる。Vaughan et al（上記）は、これらの親和性成熟方法を考察している。本発明で使用するための結合ドメインを、当技術分野で公知の任意の好適な方法によって生成してもよく、例えばＣＤＲを、市販の抗体を含む非ヒト抗体から得て、ヒトフレームワークに移植してもよく、またはあるいは非ヒト可変領域およびヒト定常領域によってキメラ抗体を調製することができる等である。本発明の抗体は、天然に存在するフォーマットでなくてもよいことから、そのようなスクリーニングを使用してＴＮＦＲ２の結合に関して望ましい特性を有する抗体抗原結合部位を同定し、それによってそれらが本明細書で記載されるフォーマットの１つであるように再フォーマットされるであろう。

【0097】

当業者は、当技術分野で公知の任意の好適な方法を使用して、本発明の抗体に使用するための抗体を生成してもよい。抗体の生成に使用するための、例えば宿主を免疫するために使用するため、またはパニング、例えばファージディスプレイにおいて使用するための抗原ポリペプチドを、当技術分野で周知のプロセスによって発現系を含む遺伝子操作宿主細胞から調製してもよく、またはそれらを天然の生物起源から回収してもよい。本出願において、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を含む。これらは特に指定していない限り、互換的に使用される。抗原ポリペプチドは、一部の例では、例えば親和性タグまたは類似のものに融合された融合タンパク質などのより大きいタンパク質の一部であり得る。一実施形態では、宿主は、ＴＮＦＲ２をトランスフェクトした細胞、例えばその表面上にＴＮＦＲ２を発現する細胞によって免疫され得る。

【0098】

動物の免疫が必要である場合、ポリペプチドを動物、好ましくは非ヒト動物に、周知のおよび通常のプロトコールを使用して投与することによって抗原ポリペプチドに対して生成された抗体を得てもよい、例えばHandbook of Experimental Immunology, D. M. Weir(ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986)を参照されたい。多くの温血動物、例えばウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ、またはブタを免疫してもよい。しかし、マウス、ウサギ、ブタ、およびラットが、一般的に最も好適である。モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の任意の方法、例えばハイブリドーマ技術（Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al 1983, Immunology Today, 4:72）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985）によって調製され得る。抗体はまた、例えば、Babcook, J. et al 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l；国際公開第９２／０２５５１号パンフレット；国際公開第２００４／０５１２６８号パンフレット、および国際公開第２００４／１０６３７７号パンフレットに記載される方法によって特異的抗体の産生のために選択された単一のリンパ球から生成された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングおよび発現させることによって、単一リンパ球抗体法を使用して生成され得る。本発明において使用するための抗体はまた、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使用して生成することができ、Brinkman et al.(J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50において), Ames et al.(J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al.(Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al.(Gene, 1997 187 9-18), Burton et al.(Advances in Immunology, 1994, 57:191-280)、および国際公開第９０／０２８０９号パンフレット；国際公開第９１／１０７３７号パンフレット；国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；国際公開第９２／１８６１９号パンフレット；国際公開第９３／１１２３６号パンフレット；国際公開第９５／１５９８２号パンフレット；国際公開第９５／２０４０１号パンフレット；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；同第５，５８０，７１７号明細書；同第５，４２７，９０８号明細書；同第５，７５０，７５３号明細書；同第５，８２１，０４７号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，４２７，９０８号明細書；同第５，５１６，６３７号明細書；同第５，７８０，２２５号明細書；同第５，６５８，７２７号明細書；同第５，７３３，７４３号明細書；同第５，９６９，１０８号明細書、および国際公開第２００１１／３０３０５号パンフレットに開示される抗体を含む。

【0099】

一例において、本発明の抗体は完全にヒトであり、特に可変ドメインの１つまたは複数は完全にヒトである。完全なヒト分子は、重鎖および軽鎖の両方の可変領域および定常領域（存在する場合）が全てヒト起源であるか、または必ずしも同じ抗体に由来しないヒト起源の配列と実質的に同一である分子である。完全なヒト抗体の例としては、例えば上記のファージディスプレイ法によって産生された抗体、ならびにマウス免疫グロブリン可変領域および任意選択で定常領域遺伝子が、そのヒト相対物に交換されている、マウスによって産生された抗体が挙げられ得、例えば一般的用語は、参照により組み込まれる、欧州特許第０５４６０７３号明細書、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、米国特許第５，６２５，１２６号明細書、米国特許第５，６３３，４２５号明細書、米国特許第５，６６１，０１６号明細書、米国特許第５，７７０，４２９号明細書、欧州特許第０４３８４７４号明細書、および欧州特許第０４６３１５１号明細書に記載されている。

【0100】

一例では、本発明に従う抗体の抗原結合部位、特に可変領域はヒト化されている。本明細書で使用されるヒト化（ＣＤＲグラフト抗体を含む）は、非ヒト種の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子のフレームワーク領域を有する分子を指す（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５８５，０８９号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレットを参照されたい）。これは、ＣＤＲ全体ではなくてＣＤＲの特異性決定残基を移入させるためにのみ必要であり得ると認識される（例えば、Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34を参照されたい）。好ましい実施形態ではあるが、ＣＤＲ全体または複数のＣＤＲが移植される。ヒト化抗体は、任意選択でＣＤＲが由来する非ヒト種に由来する１つまたは複数のフレームワーク残基をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体分子」という用語は、重鎖および／または軽鎖がアクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖および／または軽鎖可変領域フレームワークに移植されているドナー抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）からの１つまたは複数のＣＤＲ（望ましければ、１つまたは複数の改変ＣＤＲを含む）を含有する、抗体分子を指す。論評に関しては、Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998を参照されたい。一実施形態では、ＣＤＲ全体が移入されるのではなく、本明細書で上記のＣＤＲのいずれかの１つからの特異性決定残基の１つまたは複数のみがヒト抗体フレームワークに移入される（例えば、Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34を参照されたい）。一実施形態では、本明細書で上記のＣＤＲの１つまたは複数からの特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークに移入される。別の実施形態では、本明細書で上記のＣＤＲの各々からの特異性決定残基のみがヒト抗体フレームワークに移入される。

【0101】

ＣＤＲまたは特異性決定残基を移植する場合、マウス、霊長類、およびヒトフレームワーク領域を含む、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプに関して任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列を使用してもよい。好適には、本発明に従うヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域を含む可変ドメインならびに本明細書に提供されるＣＤＲの１つまたは複数を有する。本発明において使用することができるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、およびＰＯＭ（Kabat et al、前記）である。例えば、ＫＯＬおよびＮＥＷＭを重鎖のために使用することができ、ＲＥＩを軽鎖のために使用することができ、ならびにＥＵ、ＬＡＹ、およびＰＯＭを、重鎖および軽鎖の両方のために使用することができる。あるいは、ヒト生殖系列配列を使用してもよい；これらは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｍｒｃ－ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／ｌｉｓｔ２．ｐｈｐ．で利用可能である。

【0102】

本発明のヒト化抗体分子において、アクセプター重鎖および軽鎖は必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、望ましければ、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでもよい。フレームワーク領域は、アクセプター抗体と必ずしも正確に同じ配列を有する必要はない。例えば、異常な残基を、そのアクセプター鎖のクラスまたはタイプに関してより頻繁に起こる残基に交換してもよい。あるいは、アクセプターフレームワーク領域における選択された残基を、それらがドナー抗体における同じ位置で見出される残基に対応するように変化させてもよい（Reichmann et al 1998, Nature, 332, 323-324を参照されたい）。そのような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するために必要な最小限にとどめるべきである。変化させる必要があり得るアクセプターフレームワーク領域における残基を選択するためのプロトコールは、国際公開第９１／０９９６７号パンフレットに記載されている。フレームワークの誘導体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くのアミノ酸が、代替のアミノ酸、例えばドナー残基に交換されていてもよい。ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち、ＣＤＲが当初由来する抗体からの残基であり、特にドナー配列からの対応する位置の残基が採用される。ドナー残基を、ヒト受容体フレームワークに由来する好適な残基（アクセプター残基）によって交換してもよい。

【0103】

抗体可変ドメインにおける残基は、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従って慣例的に番号を付けられる。このシステムは、Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA（本明細書において以降、「Kabat et al.（上記）」）に記載されている。特に示されていない限り、このナンバリングシステムが本明細書で使用される。Ｋａｂａｔの残基指定は、アミノ酸残基の直線のナンバリングに必ずしも直接対応していない。実際の線形アミノ酸配列は、厳密なＫａｂａｔナンバリングより少ないまたは追加のアミノ酸を含有し得るが、これは基本の可変ドメイン構造のフレームワークまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）によらず、構造構成要素の短縮または挿入に対応する。残基の正確なＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列と「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列との相同性の残基のアライメントによって、所定の抗体に関して決定され得る。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って残基３１～３５（ＣＤＲ－Ｈ１）、残基５０～６５（ＣＤＲ－Ｈ２）、および残基９５～１０２（ＣＤＲ－Ｈ３）に位置する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ（Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917(1987)）に従うと、ＣＤＲ－Ｈ１と等価のループは残基２６から残基３２まで伸長する。このように、特に示していない限り、本明細書で使用される「ＣＤＲ－Ｈ１」は、ＫａｂａｔナンバリングシステムとＣｈｏｔｈｉａの位相幾何学ループ定義の組合せによって記載されるように残基２６～３５を指すと意図される。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基２４～３４（ＣＤＲ－Ｌ１）、残基５０～５６（ＣＤＲ－Ｌ２）、および残基８９～９７（ＣＤＲ－Ｌ３）に位置する。

【0104】

一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される抗体配列に拡大される。別の実施形態では、本発明は、そのような抗体のヒト化型に拡大される。

【0105】

当業者は、本明細書に記載されるアッセイなどの任意の好適なアッセイにおいてＣＤＲのバリアントまたはヒト化配列を試験して、活性が維持されていることを確認することができる。

【0106】

一実施形態では、バリアント結合分子は、本明細書に記載される特異的結合分子を交差遮断することができるそのような結合分子を同定することによって同定され得る。交差遮断抗体は、当技術分野で任意の好適な方法を使用して、例えば抗原（ＴＮＦＲ２）に対する交差遮断抗体の結合が本発明の抗体の結合を防止するか、またはその逆である競合的ＥＬＩＳＡまたはＢＩＡｃｏｒｅアッセイを使用することによって同定することができる。そのような交差遮断アッセイは、ＴＮＦＲ２を発現する細胞を標的として使用してもよい。一実施形態では、フローサイトメトリーを使用して、ＴＮＦＲ２を発現する細胞に対する結合を評価する。

【0107】

本発明の結合分子の所望の特性をなおも保持しているバリアント結合分子を使用してもよい。したがって、結合分子および特に本明細書に記載される特定の分子に対してある程度の配列同一性を有する抗体も同様に提供される。配列同一性は、ポリペプチドの全長にわたってでもよく、または例えば可変領域にちょうどわたってもしくはＣＤＲ配列にちょうどわたってなどの特定の部分に関連してもよい。同一性および類似性の程度は、容易に計算することができる（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141;Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656）。本発明はまた、本明細書に開示されるポリペプチド配列およびそれと少なくとも８０％類似または同一である配列、例えば８５％またはそれより高い、例えば９０％またはそれより高い、特に９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれより高い類似性または同一性を有する配列にも拡大される。一実施形態では、バリアントは、少なくとも８０％の配列同一性を有する。別の実施形態では、バリアントは、少なくとも９０％の配列同一性を有する。別の実施形態では、バリアントは、少なくとも９５％の配列同一性を有する。一実施形態では、配列は、本明細書に提供される特異的配列の少なくとも１つに対して少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。本明細書においてバリアントと言及される場合は常に、バリアントは、そのような程度の配列同一性を有してもよく／「同一性」は、本明細書に使用される場合、整列させた配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。「類似性」は、本明細書で使用される場合、整列させた配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が、配列間で類似のタイプの残基であることを示す。例えば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンの代わりに置換してもよい。互いにしばしば置換することができる他のアミノ酸としては、これらに限定されないが以下が挙げられる：
－ フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
－ リシン、アルギニン、およびヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
－ アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
－ アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；ならびに
－ システインおよびメチオニン（イオウ含有側鎖を有するアミノ酸）。

【0108】

一実施形態では、バリアントは、バリアントがなおもＴＮＦＲ２に特異的に結合することができる限り、好ましくは以前に記載したフォーマットでそのアゴニストとして作用することができる限り、１～１０個、例えば１、２、３、４、５個、または最大でそれらの値のアミノ酸配列変化、または少なくともそれらの値、または最大でそれらの値の変化を有し得る。別の実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載される特異的抗体の１つのＣＤＲと比較して少なくとも５、６、７，８，９、１０、１１、または１２個のアミノ酸配列変化を有してもよく、例えば抗原結合部位を構成する６個のＣＤＲにおいてその数の配列変化を有してもよい。一実施形態では、結合分子がＶＨＨドメインを含む場合、ＶＨＨドメインは、本明細書に提供されるＶＨＨに関してＣＤＲ３個の特異的セットと比較して上記の数のアミノ酸変化を有するＣＤＲ３個のセットを含み得る。本発明の抗体は、本明細書に記載される特異的抗体と比較してＣＤＲにおいてその数の配列変化を有してもよい。これは、最大でその数の配列変化を有してもよい。これは、少なくともその数のアミノ酸配列変化を有してもよい。そのようなバリアント抗体分子は典型的に、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する能力を保持している。それらはまた、本明細書に記載される他の機能以上を保持し得る。

【0109】

好ましい一実施形態では、可変領域のバリアント対を使用する場合、それらは、本明細書に記載の特異的対と少なくとも９０％の配列同一性を有する。別の実施形態では、それらは少なくとも９０％の配列同一性を有する。別の実施形態では、それらは少なくとも９５％の配列同一性を有する。一実施形態では、それらは１０個以下のアミノ酸配列変化を有する。別の実施形態では、それらは、特異的配列と比較して５個以下のアミノ酸配列変化を有する。一実施形態では、それらは、特異的配列と比較して１、２、または３個の配列変化を有する。バリアントは、ＴＮＦＲ２の結合能を保持している。例えば、バリアントは、特異的配列の結合活性の少なくとも５０％を有し得る。別の実施形態では、バリアントは、結合活性の少なくとも７５％を有する。一実施形態では、バリアントは、少なくとも同じ結合活性を有する。一実施形態では、配列変化は、フレームワーク領域のみに存在する。別の実施形態では、配列変化は、保存的アミノ酸変化である。

【0110】

ＣＤＲセットを同定する実施形態では、バリアントセットを使用してもよい。例えば、全体で最大１０個のアミノ酸変化を有するセット。例えば、最大５個のアミノ酸配列変化を有するバリアント。一実施形態では、１、２、または３個のアミノ酸変化が存在してもよい。アミノ酸配列変化は、一実施形態では全て保存的であってもよい。バリアントＣＤＲは、なおも抗原結合部位がＴＮＦＲ２に結合するのを可能にする。例えば、バリアントは、特異的配列の結合活性の少なくとも５０％を有し得る。別の実施形態では、それらは、結合活性の少なくとも７５％を有する。一実施形態では、それらは少なくとも同じ結合活性を有する。

【0111】

一実施形態では、バリアント配列は、特異的配列を含む結合部位の結合を遮断する能力を有する。一実施形態では、バリアント配列は、結合に関して競合する。本出願の実施例は、結合、したがって遮断／競合を測定するために使用され得る例示的なアッセイを含む。

【0112】

本発明のこの態様はまた、特異的結合分子のバリアント、特にヒト化型および改変型、例えばアミノ酸が、本明細書において上記の１つまたは複数の異性体化、脱アミド化、グリコシル化部位、またはシステイン残基を除去するためにＣＤＲにおいて突然変異している抗体を含む抗体にも拡大されると認識される。

【0113】

配列同一性について言及される好ましい実施形態では、これは、比較される２つの配列の完全な長さに関する。例えば、指定される配列同一性のレベルは、ＣＤＲの長さにわたり得る。これは可変領域の長さにわたり得る。これは配列の全長にわたり得て、例えば２つの配列のより短いほうの全長にわたり得る。

【0114】

特異的配列が示されている場合は常に、バリアント、例えば上記または下記で定義したバリアントを使用してもよい。バリアントＣＤＲセットであり得るバリアントＣＤＲを使用してもよい。そのような可変領域の対であり得るバリアント可変領域を使用してもよい。バリアントヒンジ領域を使用してもよい。バリアント定常領域を使用してもよい。一実施形態では、バリアントは、ポリペプチド全体のバリアントであり得る。一実施形態では、そのようなバリアントは、特異的配列と比較して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一実施形態では、それらは、少なくとも９５％の配列同一性を有する。バリアント抗原結合部位は、なおもＴＮＦＲ２結合活性を保持している。バリアントは、本明細書に記載される任意の機能を保持し得る。バリアント結合分子は、典型的にＴＮＦＲ２アゴニスト活性を保持している。バリアントは、本明細書に記載される任意の機能を保持し得る。好ましいバリアントは、１～１０個のアミノ酸変化を有する。さらなるバリアントは、１～５個のアミノ酸変化を有する。好ましいバリアントは、１、２、または３個のアミノ酸変化を有する。他のバリアントは、特定の配列と比較して１つのみのアミノ酸変化を有する。一実施形態では、バリアントは、本明細書に記載される結合分子のバイオシミラーであり得る。

【0115】

さらなる例示的な抗体およびＣＤＲ配列
本出願の実施例は、本発明およびその利点の例証を助けるために、その構造の一部としてＴＮＦリガンドを有する分子を含む様々な特異的抗体分子を含む。本発明は、それらの配列に限定されない。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、それらの例示的な抗体からの特異的配列またはそれらのバリアントを含み得る。本明細書に定義されるバリアント、特にＦｃγＲ非依存的にＴＮＦＲ２に特異的に結合するが、ＴＮＦＲ１には結合しないバリアントを含むバリアント抗体もまた、提供される。

【0116】

本発明の表３は、特定の抗体を発現させるために使用した発現構築物の様々な対を記載する。表はまた、ベクターの対によって発現されるポリペプチドも記載する。一実施形態では、本発明は、表３に記載されるポリペプチドの対応のある組合せの１つを含む結合分子を提供する。実施例において非ＶＨＨベースの抗体を生成するために使用される元の抗体クローンは、マウス抗体である。一実施形態では、本発明は、表３に記載されるポリペプチドの対応のある組合せの１つを含む結合分子であって、マウスＣＤＲ配列が保持されたが、抗体の残りはヒト化されている結合分子を提供する。別の実施形態では、本発明の結合分子は、マウス配列全体が、ＴＮＦＲ２に特異的に結合することができるヒト抗体の配列と交換されていることを除き、表に記載されるポリペプチドの対応のある組合せの１つを含む。一実施形態では、表３に記載されるポリペプチドの対応のある組合せに起因する結合分子を交差遮断する結合分子を使用する。別の実施形態では、表３に記載されるポリペプチドの対応のある組合せに起因する結合分子と交差反応する結合分子を使用する。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、本出願の表３に記載される重鎖および軽鎖の対応のある組合せのそれらからのＣＤＲ６個のセットを含む抗原結合部位を含む。別の実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、表３に記載される対からの軽鎖および重鎖可変領域対の１つの対を含む。

【0117】

本出願の表４は、本出願の実施例に使用される発現ベクターによって発現される様々なポリペプチドの配列番号を記載する。一実施形態では、本発明の結合分子は、それらのポリペプチドの少なくとも１つを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、それらのポリペプチドの少なくとも１つを含み、ポリペプチドは、ヒト化されていて、マウスＣＤＲ配列が保持されているが、マウス配列の残りはヒト配列に交換されている。好ましい実施形態では、結合分子は、マウスＣＤＲを除く全てが対応する配列に交換されている、それらのポリペプチドの２つ、またはヒト化型を含み得る。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、本出願の表４に記載される重鎖および軽鎖配列番号の対応のある組合せのそれらからＣＤＲ６個のセットを含む抗原結合部位を含む。別の実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、表４に記載される配列番号における可変領域からの軽鎖および重鎖可変領域対の１つの対を含む。

【0118】

本出願の表５は、本出願に記載される抗体フォーマットに関して開始点として使用される特異的抗体からのＣＤＲ配列を記載する。軽鎖からの３個のＣＤＲを共にグループにし、同様に重鎖からの３個のＣＤＲをグループにし、軽鎖および重鎖も共にグループにした。一実施形態では、本発明の結合分子は、表５に記載される軽鎖ＣＤＲ３個のセットを含む。別の実施形態では、これは、表６に記載される重鎖ＣＤＲ３個のセットを含み、そのためそのような配列のクローンまたは機能的バリアントの１つからの両方の軽鎖および重鎖ＣＤＲ配列を含む。一実施形態では、本発明の結合分子は、１つより多くの特異性に関するＣＤＲを含み、そのため、結合分子は、例えば表５に記載される抗体の１つからの６個のＣＤＲを集合的に含む２つのポリペプチドを含み得るが、結合分子は、例えば結合分子の一部であるｓｃＦｖとして存在する、抗体の別のさらなるＣＤＲ６個のセットを含み得る。一実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２に関してトリパラトピックであり、ＴＮＦＲ２に対して３個の異なる特異性を有する。一実施形態では、特異性の少なくとも１つは、表５からのＣＤＲ６個のセットおよびそれらのＣＤＲのバリアントによって付与される。別の実施形態では、特異性の少なくとも２つは、表のＣＤＲ６個のセット、またはそのバリアントによって付与される。さらなる実施形態では、特異性の３個全てが同様である。別の実施形態では、本発明の結合分子は、テトラパラトピックであってもよく、例えば少なくとも１、２、または３個の特異性は、表５に記載されるＣＤＲ６個のセットまたはそのバリアントによって付与される。一実施形態では、４つ全ての特異性は、表５からのＣＤＲ６個のセットまたはそのバリアントによって付与され得る。

【0119】

好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、Ｃ４０クローンからのＣＤＲ６個のセットを含む抗原結合部位を含む。別の好ましい実施形態では、結合分子は、Ｃ１９クローンに由来するＣＤＲ６個のセットを含む抗原結合部位を含む。さらに好ましい実施形態では、抗体は、Ｃ４０クローンからのＣＤＲ６個のセットを含む抗原結合部位、および同様にＣ１９クローンからのＣＤＲ６個のセットを含むさらなる抗原結合部位の両方を有する。好ましい一実施形態では、ＣＤＲは、Ｃ４クローンに由来する。一実施形態では、本発明の抗体の全ての抗原結合部位は、同じＣＤＲ６個のセットを含む。別の実施形態では、抗体の異なる抗原結合部位は、異なるＣＤＲ６個のセットを含む。一実施形態では、Ｃ４０、Ｃ１９、またはＣ４からの６個のＣＤＲではなくて、本明細書に考察される任意のバリアントなどのＣＤＲ６個のバリアントセットを使用してもよい。

【0120】

一実施形態では、抗原結合部位の６個のＣＤＲがＣ４０のＣＤＲである、本明細書に考察される任意の抗体フォーマットが提供され得る。別の実施形態では、それらはＣ１９のＣＤＲである。別の実施形態では、それらはＣ４のＣＤＲである。別の実施形態では、ＣＤＲは、ＴＮＦＲ２に対する結合能をなおも保持しているＣ４０、Ｃ１９、またはＣ４からのそれらのバリアントである。

【0121】

本発明はまた、実施例で使用される上記の結合分子および特異的結合分子のバリアントも提供する。例えば、一実施形態では、バリアントは、セットとして表５に記載される６個のＣＤＲと比較して、抗原結合部位のＣＤＲ配列において１、２、３、４、５、６個、またはそれより多くのアミノ酸配列変化を有してもよく、それでもなおＴＮＦＲ２のアゴニストとして作用することができる。別の実施形態では、バリアントは、６個またはそれより多くのそのようなアミノ酸変化を有してもよく、例えばバリアントは６～１５個のそのような変化、例えば６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのそのような変化を有し得る。一実施形態では、本発明の抗体は、指定されたアミノ酸配列変化の少なくともその数を有し得る。別の実施形態では、本発明の抗体は、最大で列挙された数を有し得る。さらなる実施形態では、本発明の抗体は、列挙された数のアミノ酸配列変化を有し得る。一実施形態では、配列変化は、保存的アミノ酸配列変化であり得る。別の実施形態では、配列変化は、非保存的配列変化を含み得る。様々な特異的改変が本明細書において考察され、それらは、そのようなバリアント分子に存在し得る。特定の抗体フォーマットについて言及される本明細書で記載されるいずれの実施形態においても、さらなる実施形態では、本出願の実施例からのそのフォーマットの抗体であるがマウス以外の全てのＣＤＲ配列をヒトＣＤＲ配列と交換するように改変されている結合分子が提供または使用され得る。

【0122】

好ましいＣ４およびＣ４バリアント抗原結合部位
特に好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、Ｃ４クローンの配列またはそのバリアント配列を含む抗原結合部位を含む。例えば、結合分子は、Ｃ４クローンからの軽鎖および重鎖可変領域を含む抗原結合部位を含み得る。結合分子は、Ｃ４クローンの６個のＣＤＲを含み得る。バリアントＣ４可変領域およびＣＤＲ配列もまた、それらの好ましい実施例を記載する本出願と共に使用され得る。

【0123】

Ｃ４クローンの軽鎖および重鎖可変領域はそれぞれ、配列番号２９５および２９６に記載され、抗原結合部位において使用され得る。Ｃ４クローンの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号６９／７０／７１に記載され、それらの３個のＣＤＲは、抗原結合部位において使用され得る。Ｃ４クローンの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列はそれぞれ、配列番号１０２／１０３／１０４として提供され、それらの３個のＣＤＲは抗原結合部位において使用され得る。好ましい実施形態では、抗原結合部位は、ＣＤＲからの６個全てのＣＤＲを含み、そのため配列番号６９／７０／７１の軽鎖ＣＤＲおよび配列番号１０２／１０３／１０４の重鎖ＣＤＲを含む。バリアントＣ４配列もまた使用され得る。一実施形態では、特異的ＣＤＲの配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸配列変化を有するそれらのＣＤＲ６個のバリアントセットを使用してもよい。一実施形態では、バリアントセットは、最大で５個のアミノ酸配列変化を有する。一実施形態では、バリアントセットは、ＣＤＲ６個の特異的セットの配列と比較して１、２、または３個のアミノ酸配列変化を有し得る。

【0124】

特に好ましいＣ４バリアント軽鎖可変領域は、配列番号２６２～２６５として提供され、使用され得る。それらの軽鎖可変領域からのＣＤＲは、配列番号２６６～２７７として提供され、使用され得る。バリアントＣＤＲセットは、特異的軽鎖可変ＣＤＲの配列と比較して最大１０個のアミノ酸配列変化を有し得る。例えば、バリアントセットは、特異的軽鎖可変ＣＤＲと比較して最大５個のアミノ酸配列変化を有し得る。特に好ましい重鎖可変領域は、配列番号２７８～２８１として記載され、使用され得る。それらの重鎖可変領域からのＣＤＲは、配列番号２８２～２９３に記載され、使用され得る。重鎖ＣＤＲに関して最大１０個のアミノ酸配列変化を有するバリアントが使用され得る。一実施形態では、重鎖ＣＤＲセットの配列と比較して最大５個のアミノ酸配列変化を有するバリアントセットが使用され得る。

【0125】

好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２９５、２６２～２６５の１つから選択される軽鎖可変領域、またはそのいずれかのバリアント、および配列番号３０６、２７８～２８１の１つから選択される重鎖可変領域、またはそのいずれかのバリアントを含む抗原結合部位を含む。好ましい一実施形態では、結合分子は、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、またはそのバリアント、ならびに配列番号１０２、１０３、および１０４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、またはそのバリアントを含む抗原結合部位を含む。さらに好ましい実施形態では、結合分子は、配列番号２６６／２６７／２６８；２６９／２７０／２７１；２７２／２７３／２７４；２７５／２７６／２７８から選択されるＣＤＲ１／ＣＤＲ２／ＣＤＲ３に関する軽鎖ＣＤＲ３個のセット、またはそのバリアントを含む抗原結合部位を含む。さらに好ましい実施形態では、結合分子は、配列番号２８２／２８３／２８４；２８５／２８６／２８７；２８８／２８９／２９０；２９１／２９２／２９３から選択されるＣＤＲ１／ＣＤＲ２／ＣＤＲ３に関する重鎖ＣＤＲ３個のセット、またはそのバリアントを含む抗原結合部位を含む。一実施形態では、結合部位は、そのような軽鎖および重鎖ＣＤＲの両方を含む。例えば、一実施形態では、結合分子は、本明細書に提供される特異的Ｃ４バリアントの１つからの軽鎖、重鎖、または両方のＣＤＲを含む。

【0126】

Ｃ４およびＣ４バリアントベースの結合部位は、軽鎖および重鎖可変領域を含む抗原結合部位を含む本明細書において考察される抗体フォーマットのいずれにおいても使用され得る。好ましい一実施形態では、そのような抗原結合部位は、本発明の４価結合分子において使用される。特に好ましい一実施形態では、Ｃ４クローンまたは本明細書に提供されるＣ４クローンの特異的バリアントの１つからのＣＤＲ６個のセット、またはＶＬおよびＶＨ配列対が、図面に示されるフォーマット、特に図１および７に示されるフォーマットの１つにおいて使用される。それらはまた、図２９Ａに示されるフォーマットにおいても使用され得る。特定の配列のバリアントもまた使用され得る。

【0127】

本発明の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２５９の配列を有するポリペプチドおよび配列番号２６１の配列を有するポリペプチドを含む。一実施形態では、結合分子は、各々のそのようなポリペプチドの２つからなる。さらに好ましい実施形態では、結合分子は、２つのそのようなポリペプチドを含むが、配列番号２６１の軽鎖可変領域は、配列番号２６２～２６５の１つの可変領域またはそのバリアントと交換されている。さらに好ましい実施形態では、結合分子は、２つのそのようなポリペプチドを含むが、配列番号２５９の重鎖可変領域は、配列番号２７８～２８１の１つの可変領域またはそのバリアントに交換されている。好ましい一実施形態では、重鎖および軽鎖可変領域の両方がそのように交換されている。

【0128】

さらに好ましい実施形態では、結合分子は、図５４または５５に記載される配列を有するポリペプチドを含む。一実施形態では、結合分子は、
（ａ）配列番号３３２に記載の配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアント配列を有するポリペプチド；および
（ｂ）配列番号３３３の配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアント配列を有するポリペプチド
を含む。

【0129】

一実施形態では、結合分子は、（ａ）に定義される２つのポリペプチドおよび（ｂ）に定義される２つのポリペプチドを含む。

【0130】

一実施形態では、結合分子は、配列番号３３２および３３３に存在する軽鎖および重鎖可変領域、または少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列を含み、ＴＮＦＲ２アゴニストとして作用することができる結合分子である。

【0131】

一実施形態では、結合分子は、
（ｃ）配列番号３３４の配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアント配列を有するポリペプチド；および
（ｄ）配列番号３３５の配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアント配列を有するポリペプチド
を含む。

【0132】

一実施形態では、結合分子は、（ａ）に定義される２つのポリペプチドおよび（ｂ）に定義される２つのポリペプチドを含む。

【0133】

一実施形態では、結合分子は、配列番号３３４および３３５に存在する軽鎖および重鎖可変領域、または少なくとも１０％の配列同一性を有するそのバリアント配列を含み、ＴＮＦＲ２アゴニストとして作用することができる結合分子である。

【0134】

一実施形態では、結合分子は、
（ｅ）配列番号３３６の配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアント配列を有するポリペプチド；および
（ｆ）配列番号３３７の配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアント配列を有するポリペプチド
を含む。

【0135】

一実施形態では、結合分子は、（ａ）に定義される２つのポリペプチドおよび（ｂ）に定義される２つのポリペプチドを含む。

【0136】

一実施形態では、結合分子は、配列番号３３６および３３７に存在する軽鎖および重鎖可変領域、または少なくとも１０％の配列同一性を有するそのバリアント配列を含み、ＴＮＦＲ２アゴニストとして作用することができる結合分子である。

【0137】

好ましい一実施形態では、本発明の結合分子においてＴＮＦＲ２に対して特異的な抗原結合部位は全て、本明細書において考察されるＣ４またはＣ４バリアントベースの結合部位の１つである。

【0138】

表１０は、Ｃ４バリアント結合抗原結合部位の好ましい軽鎖および重鎖対形成の例を記載する。好ましい一実施形態では、表１０に示される配列の対は、抗原結合部位として使用され得る。別の実施形態では、配列のそれらの対の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列対が使用され得る。９５％の配列同一性を有するバリアントが使用され得る。

【0139】

本明細書で記載されるＣ４および特異的Ｃ４バリアントを、本明細書に記載される結合フォーマットのいずれにおいても使用してもよく、同様に、そのＣＤＲのバリアント、軽鎖ＣＤＲセット、重鎖ＣＤＲセット、ＣＤＲ６個のセット、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、および可変領域対も使用され得る。使用され得るＣ４バリアントの特異的対を、表１０に記載し、それらの特異的対のバリアント配列もまた使用され得る。図５４および５５は、使用され得る特に好ましいＣ４バリアントベースのポリペプチドを示し、特に重鎖および軽鎖を示す。

【0140】

好ましいＶＨＨ配列
特に好ましい一実施形態では、本発明の結合分子のＴＮＦＲ２結合ドメインは、ＶＨＨドメインである。したがって、好ましい一実施形態では、結合分子におけるＴＮＦＲ２結合ドメインは全て、ＶＨＨドメインである。本出願の例は、その配列が配列番号１４０～１５３に提供される、ＴＮＦＲ２に対して特異的な１４個のＶＨＨ領域の生成を記載する。それらの特異的ＶＨ領域の各々は、本明細書に記載される任意の結合分子フォーマットを含む、本発明の結合分子において使用される好ましいＶＨＨドメインを表す。バリアントがＴＮＦＲ２になおも結合することができ、結合分子がＴＮＦＲ２のアゴニストとして作用する限り、そのような特異的ＶＨＨドメインのバリアント配列を使用してもよい。

【0141】

結合分子において使用される特に好ましいＶＨＨドメインは、配列番号１４０のＣ１８８ ＶＨＨ結合ドメインまたはそのバリアントである。Ｃ１８８の３個のＣＤＲを、配列番号１５４／１５５／１５６として提供する。好ましい一実施形態では、結合分子は、それらの３個のＣＤＲを含む抗原結合部位を含む。好ましい一実施形態では、ＴＮＦＲ２に特異的な抗原結合部位は全て、それらの３個のＣＤＲを含む。加えて、結合部位がＴＮＦＲ２になおも結合することができる限り、バリアントＣＤＲを使用してもよい。

【0142】

本出願の実施例において記載されるように、Ｃ１８８の特異的バリアント配列は、Ｃ１８８－ＶＨＨ＿１～Ｃ１８８－ＶＨＨ＿１５として生成されており、その配列をそれぞれ、配列番号１９８～２１２に記載する。したがって、一実施形態では、本発明の結合分子のＴＮＦＲ２結合ドメインは、配列番号１９８～２１２の１つのＶＨＨドメインを有する。好ましくは、ＴＮＦＲ２結合ドメインは全て、同じ配列を有する。特に好ましい実施形態では、バリアントは、配列番号１９８～２１１の１つの配列を有する。この場合も、好ましくは、結合ドメインは全て、同じ配列を有する。一実施形態では、配列番号１９８～２１１の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントＶＨＨ結合ドメインを使用してもよい。別の実施形態では、配列同一性レベルは少なくとも９５％である。そのようなバリアントは、ＴＮＦＲ２アゴニストとしてなおも作用することができる。

【0143】

さらに好ましい実施形態では、結合分子は、配列番号１９８～２１１として提供される特異的Ｃ１８８ ＶＨＨバリアントの１つであるか、またはそのような配列のバリアントである抗原結合部位を含む。一実施形態では、ＴＮＦＲ２特異的結合部位は全て、そのようなＶＨＨバリアント結合ドメインである。一実施形態では、結合分子は、それらのＣ１８８バリアントＶＨＨ結合ドメインの１つからのＣＤＲ３個のセットを含む。例えば、一実施形態では、結合分子は、２１３／２１４／２１５；２１６／２１７／２１８；２１９／２２０／２２１；２２２／２２３／２２４；２２５／２２６／２２７；２２７／２２９／２３０；２３１／２３２／２３３；２３４／２３５／２３６；２３７／２３８／２３９；２４０／２４１／２４２；２４３／２４４／２４５；２４６／２４７／２４８；２４９／２５０／２５１；２５２／２５３／２５４；２５５／２５６／２５７から選択されるＣＤＲ３個のセット；またはそのバリアントセットを含む抗原結合ドメインを含む。好ましい実施形態では、結合分子は、２１３／２１４／２１５；２１６／２１７／２１８；２１９／２２０／２２１；２２２／２２３／２２４；２２５／２２６／２２７；２２７／２２９／２３０；２３１／２３２／２３３；２３４／２３５／２３６；２３７／２３８／２３９；２４０／２４１／２４２；２４３／２４４／２４５；２４６／２４７／２４８；２４９／２５０／２５１；２５２／２５３／２５４から選択されるＣＤＲ３個のセット；またはそのバリアントセットを含む抗原結合ドメインを含み、バリアントは、全体で最大で１０個のアミノ酸配列変化を有するが、ＶＨＨは、なおもＴＮＦＲ２に結合することができる。一実施形態では、バリアントは、最大５個のアミノ酸配列変化を有するが、なおもＴＮＦＲ２に結合することができる。

【0144】

特に好ましい実施形態では、そのようなＶＨＨドメインを使用する結合分子は、そのようなＶＨＨに関して４価または６価結合、例えば本明細書に記載されるフォーマットの１つである。配列番号１４０～１５３および１９８～２１２の特異的ＶＨＨ領域を、図および実施例に示されるものを含む、本明細書に記載される任意の結合分子フォーマットにおいて使用してもよい。一実施形態では、配列番号１４０、１４２～１４５、１４９、１５１、および１５３の特異的ＶＨＨ領域を、図および実施例に示されるものを含む、本明細書に記載される任意の結合分子フォーマットにおいて使用してもよい。特に好ましい実施形態では、結合分子は、配列番号１９８～２１１のそれらの１つから選択される可変領域を有するＶＨＨ、またはなおもＴＮＦＲ２に結合することができる少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む抗原結合部位を含み得る。一実施形態では、実施例または図における結合分子フォーマットの１つを、そのような抗原結合部位を使用するために改変してもよい。

【0145】

図４０および４１は、ＶＨＨ抗体の特に好ましいフォーマットを例証する。示される６価フォーマットは、特に好ましい。本明細書に記載されるＶＨＨドメインのいずれかまたはそれらのＶＨＨドメインからのＣＤＲ３個のセットを、ＶＨＨベースの結合分子、特に本明細書に記載されるＣ１８８または特異的Ｃ１８８バリアントの結合分子に使用してもよい。特に好ましいフォーマットは、３ｘＶＨＨ－Ｆｃフォーマットであり、任意選択でＶＨＨ結合ドメインの間にリンカーが存在する。特に好ましい結合分子は、配列番号１９７の２つのポリペプチドを含む。さらに特に好ましい結合分子は、ＶＨＨドメインが配列番号１９８～２１２の１つのドメインであることを除き、配列番号１９７に対応する配列の２つのポリペプチドを含む。さらに特に好ましい結合分子は、ＶＨＨドメインが異なり、配列番号２１３～２５７の１つからのＣＤＲ３個のセットを含むことを除き、配列番号１９７に対応する配列の２つのポリペプチドを含む。

【0146】

一実施形態では、結合分子は、配列番号３３１のアミノ酸配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、結合分子は、３個のそのようなポリペプチドを含む。一実施形態では、結合分子は、異なるヒンジ領域を有する配列番号３３１のアミノ酸配列のバリアントであり、バリアントが少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、これは３個のそのようなポリペプチドを含む。別の実施形態では、結合分子は、配列番号３３１に存在する可変領域またはなおもアゴニストとして作用することができる少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントを含む抗原結合部位を含む。一実施形態では、結合分子は、配列番号３３１のアミノ酸配列に存在する３個のＣＤＲを含む抗原結合部位を含む。

【0147】

一実施形態では、結合分子は、本明細書に考察される特異的ＶＨＨ領域のバリアント、例えば上記のバリアントの１つを含む。例えば、バリアントは、特異的配列の１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するバリアントであり得る。バリアントは、少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。バリアントは、少なくとも９５％の配列同一性を有し得る。バリアントは、少なくとも９８％の配列同一性を有し得る。バリアントは、少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。一実施形態では、バリアントは、１～１０個のアミノ酸配列変化を有する。一実施形態では、バリアントは、１～５個のアミノ酸配列変化を有し得る。バリアントは、特異的配列と比較して、１、２、３、４、または５個のアミノ酸配列変化を有し得る。バリアントは、特異的配列と比較して１、２、または３個のアミノ酸配列変化を有し得る。所定の配列の可能なバリアントは、本明細書において他所で考察され、任意のそのようなタイプのバリアントを使用してもよい。バリアントは、好ましくは少なくとも同じＴＮＦＲ２結合活性を保持する。例えば、バリアントは、少なくとも同じアゴニスト活性を有し得る。一実施形態では、バリアントは、元の分子の活性の少なくとも５０％を有し得る。一実施形態では、バリアントは、元の分子の活性の少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは同じ活性の少なくとも９０％を有し得る。１つの好ましい結合分子は、配列番号１９７の配列を含むが、本明細書で言及した任意のタイプのバリアントなどのその配列のバリアントを使用してもよい。配列番号１９８～２１２のＶＨＨドメインもまた好ましく、本明細書において考察される任意のタイプのバリアントを含むそれらのバリアントを使用してもよい。

【0148】

一実施形態では、結合分子は、ｓｄＢｒ結合ドメインおよび他の非ｓｄＢｒ結合ドメインの両方を含み得る。一実施形態では、結合分子は、非ＶＨＨ抗原結合ドメインと組み合わせて両方のＶＨＨ結合ドメイン、例えばＣ１８８およびＣ１８８バリアント抗原結合ドメインを含み得る。一実施形態では、結合分子は、Ｃ１８８、Ｃ１８８バリアント結合ドメイン、およびＣ４またはＣ４バリアント抗原結合ドメインである結合ドメインの両方を含み得る。

【0149】

本明細書に記載されるＣ１８８および特異的Ｃ１８８バリアントは、本明細書に記載される任意の結合フォーマットにおいて使用され、同様にそのＣＤＲ、そのＣＤＲセット、または可変領域も使用され得る。図５３は、使用され得る特に好ましいポリペプチドを示し、同様にそれらの特異的配列のバリアントであり得るポリペプチドを示す。

【0150】

さらに好ましい結合分子
特に好ましい結合分子フォーマットは４価である。結合分子、特に４価結合分子において使用するための１つの特定の好ましいＶＨドメインは、Ｃ４ ＶＨドメインである。特に好ましいフォーマットは、ＩｇＧ１－ＨＣ：ｓｃＦｖまたはＩｇＧ１－ＨＣ：ｓｃＦｖである。好ましいフォーマットにおいて、そのようなフォーマットにおけるＶＨおよびＶＬドメインは、Ｃ４のドメインである。１つの特に好ましいフォーマットは、Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４（Ｇ４Ｓ）４である。特に好ましい実施形態では、そのような結合分子は、２つのポリペプチド、配列番号２６１の軽鎖配列、および配列番号２５９の重鎖配列を含む。一実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬ領域が本明細書に記載される特異的なそのような領域の１つであることを除き、そのようなポリペプチドを含む結合分子が提供される。実施例に記載するように、配列番号２６２～２６５に記載される配列を有するＣ４ ＶＬ配列のバリアントを生成し、それらのＶＬ配列のいずれかをＣ４－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４（Ｇ４Ｓ）４分子における配列と交換してもよい。実施例で記載するように、配列番号２７８～２８１に記載される配列を有するＣ４ ＶＨ配列のバリアントを生成し、それらのＶＨ配列のいずれかを、Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４（Ｇ４Ｓ）４分子における配列を交換してもよい。一実施形態では、ＶＬおよびＶＨ領域配列はいずれも、軽鎖に関して配列番号２６２～２６５、および重鎖に関して配列番号２７８～２８１から選択される配列である。好ましい一実施形態では、使用されるＶＬおよびＶＨ配列はそれぞれ、配列番号２９５および２９６の配列である。

【0151】

アッセイ
一実施形態では、機能的アッセイを使用して、本発明の結合分子が特定の特性または複数の特性、例えば本明細書に言及した特性のいずれかを有するか否かを決定してもよい。したがって、本発明の結合分子、特に抗体を評価するために機能的アッセイを使用してもよい。一実施形態では、本出願の実施例に記載されるアッセイの１つまたは複数を使用して、特定の結合分子を評価してもよく、それが望ましい特性または複数の特性を有するか否かを評価してもよい。特に好ましい実施形態では、実施例１に記載されるアッセイの１つを使用してもよい。

【0152】

本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２に結合することができる。本発明の結合分子、または候補結合分子がＴＮＦＲ２に結合する能力は、多様な方法で評価され得る。例えば、一実施形態では、結合分子がＴＮＦＲ２に結合する能力は、ＴＮＦＲ２タンパク質を使用することによって、例えばチップに結合したＴＮＦＲ２またはその一部を使用する表面プラズモン共鳴などの技術を使用することによって評価される。特に好ましい実施形態では、結合分子がＴＮＦＲ２に結合する能力は、その表面上にＴＮＦＲ２を発現する細胞を使用して評価される。一実施形態では、候補分子を標識し、その後、ＴＮＦＲ２を発現する細胞への結合能に関してＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーなどの技術を使用してスクリーニングする。別の実施形態では、候補分子を、ＴＮＦＲ２を発現する細胞と共にインキュベートした後、結合した候補分子を、二次作用剤、例えば候補分子の種に対して特異的な標識抗体を使用して検出してもよい。一実施形態では、本発明の結合分子は、例えばKums et al., MAbs. 2017 Apr;9(3):506-520)に記載されるように、例えば結合分子、特に抗体または融合タンパク質のルシフェラーゼタグ付け（例えば、ガウシア・プリンセプス（Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ）ルシフェラーゼ（ＧｐＬ））バリアントを使用して標識する。そのようなタグ付け結合分子をまた、競合結合アッセイに使用してもよい。

【0153】

一実施形態では、本発明の結合分子は、（ａ）ＴＮＦＲ２を発現する細胞の表面上でＴＮＦＲ２をオリゴマー形成し、好ましくは細胞表面上でＴＮＦＲ２の六量体またはＴＮＦＲ２三量体の高次クラスターを形成すること；（ｂ）ＴＮＦＲ２シグナル伝達を誘発すること；および／または（ｃ）白血球、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激することができる。一実施形態では、本発明の結合分子は、細胞表面上でＴＮＦＲ２受容体の既存の高次複合体、特に細胞表面上でのＴＮＦＲ２の三量体に結合し得る。例えば一実施形態では、本発明の結合分子は、同じ細胞上、または２つの細胞を架橋する、または両方でＴＮＦＲ２受容体のスーパークラスターの形成をもたらし得る。

【0154】

一実施形態では、候補分子が、ＴＮＦＲ２を発現する細胞の表面上で個々のＴＮＦＲ２分子のオリゴマー形成をもたらす能力を測定する。一実施形態では、本発明の結合分子は、そのようなオリゴマー形成をもたらすことができる。例えば、一実施形態では、本発明の結合分子は、六量体、またはＴＮＦＲ２三量体の他のオリゴマーの形成をもたらすことができる。一実施形態では、そのようなオリゴマーの形成は、高解像度顕微鏡を使用して検出され得る。一実施形態では、ＴＮＦＲ２のオリゴマーの形成は、ＰＡＬＭ、ｄＳＴＱＲＭ、化学的架橋、またはＦＲＥＴなどの技術を使用して検出され得る。

【0155】

好ましい一実施形態では、本発明の結合分子がＴＮＦＲ２を活性化する能力は、結合そのものを直接測定するのではなく、ＴＮＦＲ２活性化の下流の効果を測定することによって評価される。例えば、一実施形態では、結合分子がＩＬ－８産物を誘導するか否かを、所定の結合分子がＴＮＦＲ２シグナル伝達を誘導することができるか否かを確立する方法として使用してもよい。ＴＮＦＲ２シグナル伝達に応答したＮＦκＢ活性化は典型的に、ＩＬ－８の産生をもたらし、それによって所定の結合分子が望ましい実施形態においてＴＮＦＲ２シグナル伝達を活性化することができるか否か、本発明の結合分子がそのようなシグナル伝達を活性化することができるか否かを評価する１つの方法として使用され得る。一実施形態では、ＴＮＦＲ２シグナル伝達を活性化することが公知の分子、例えば本発明の結合分子を、陽性対照として使用してもよい。結合分子が、ＴＮＦＲ２に結合して、ＩＬ－８産生を刺激する能力を評価するために使用され得る好ましい細胞株の例は、ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２である。一実施形態では、機能的アッセイは、評価される結合分子を、ＴＮＦＲ２を発現する細胞、例えばＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞と接触させること、両者を一晩インキュベートすること、次に上清試料をＩＬ－８の存在に関して分析することを含む。一実施形態では、ＥＬＩＳＡ、例えばＢＤ ＯｐｔＥＩＡ（商標）ＩＬ８ ＥＬＩＳＡキットを、そのような評価のために使用する。一実施形態では、そのような方法は、ＴＮＦＲ２シグナル伝達を刺激することが公知の陽性対照も含み得る。一実施形態では、そのようなアッセイを使用して、１つまたは複数の結合分子が、結合してＩＬ－８産生を活性化する能力に関してスクリーニングしてもよく、例えば潜在的結合分子のライブラリをスクリーニングしてＩＬ－８産物を活性化する結合分子を同定してもよい。一実施形態では、そのようなアッセイを使用して、本発明の結合分子のバリアントがなおも活性であるか、または本出願の特異的結合分子より活性であるかをチェックしてもよい。

【0156】

本発明の結合分子を評価するために使用され得る別のアッセイは、生存率アッセイであり、ＴＮＦＲ２は、生存タンパク質（ＴＲＡＦ２、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２）の阻害および内因性に産生されたＴＮＦ誘発ＴＮＦＲ１の同時の上方調節により、一部の細胞株／細胞タイプの細胞死を誘導することができる。好ましい実施形態では、Ｋｙｍ－１細胞（Schneider et al., 1999）をそのような評価のために使用する。例えば、ＴＮＦＲ２を発現する細胞、特にプレートまたはウェルに播種したＫｙｍ－１細胞を、試験結合分子と共にインキュベートした後、クリスタルバイオレット染色を行い、次に５９５ｎｍでのＯＤを測定してもよい。細胞殺滅、例えば「細胞死」を誘導することが公知である陽性対照、例えば対照混合物（その一例は、２００ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ、２００ｎｇ／ｍｌ ＴＲＡＩＬ、２００ｎｇ／ｍｌ ＣＤ９５Ｌ、２５μｇ／ｍｌ ＣＨＸ、１％（重量／体積）アジ化ナトリウムである）を使用してもよい。認められた値を、無処置細胞および「死混合物」によって処置した細胞と比較して正規化してもよい。この場合も、そのような方法を使用して、所望の特性を有する結合分子に関してスクリーニングしてもよい。

【0157】

好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、例えば上記のアッセイで評価した場合にＩＬ－８産生を誘導し、同様に例えば上記のアッセイで評価した場合に細胞死を誘導することができる。別の好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、例えば本出願の実施例におけるアッセイを使用して測定した場合に、ＩＬ－８産生を誘導するが、細胞死を有意に誘導しない。

【0158】

好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦＲ２に結合し、非古典的ＮＦκＢ経路の活性化を通してシグナル伝達を開始することができる。特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、ｐ１００のｐ５２へのプロセシングによって示される非古典的ＮＦκＢ経路を活性化することができる。一実施形態では、ＴＮＦＲ２を発現する細胞を、評価される結合分子と接触させ、その後細胞を採取し、細胞の溶解物を評価して、ｐ１００およびｐ５２レベルを測定する。一実施形態では、ｐ１００およびｐ５２に対する抗体を使用して、ｐ１００がｐ５２にプロセシングされたか否かを調べるために、細胞溶解物にウェスタンブロッティングを実施する。任意の好適な細胞を使用してもよいが、好ましい実施形態では、Ｋｙｍ－１細胞を評価のために使用する。陽性対照、例えば活性であることが公知の結合分子を使用してもよい。陰性対照、例えば結合分子の非存在下でインキュベートして同じように評価する細胞も実施され得る。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、例えばＩＬ－８産生によって測定した場合に古典的ＮＦκＢ経路を活性化することができ、同様に例えばｐ１００がｐ５２にプロセシングされたか否かを評価することによって、非古典的ＮＦκＢ経路を活性化することもできる。別の好ましい実施形態では、結合分子はまた、例えば上記の細胞生存率アッセイを使用して評価した場合に細胞殺滅を活性化することもできる。

【0159】

典型的に、本発明の結合分子は、ＦｃγＲに結合しない。好ましい一実施形態では、候補結合分子は、そのＴＮＦＲ２に結合して活性化する能力のみならず、ＦｃγＲに結合せず、活性化しない能力に関しても評価される。一実施形態では、本発明の結合分子がＦｃ受容体、特にＦｃγＲに結合する能力を評価する。Ｆｃ受容体に対する結合の欠如を評価して、例えばＣＤＣまたはＡＤＣＣ活性が示されるか否か、好ましくは本発明の結合分子によるものでないかを決定してもよい。

【0160】

別の実施形態では、本発明の結合分子は典型的にＴ細胞などの細胞の活性化および／または増大をもたらすことができることから、本発明の結合分子が、細胞の活性化および／または増大を刺激する能力、例えば特定の免疫細胞をそのように刺激する能力を評価する。一実施形態では、本発明の結合分子がＰＢＭＣからＴｒｅｇ細胞を刺激する能力を評価する。一実施形態では、結合分子がＴｒｅｇを増大させる能力は、
－ ＰＢＭＣを単離した後、ＰＢＭＣを培養すること（例えば、高い密度、例えば１０００万個／ｍｌで）；
－ 細胞を採取した後、ＰＢＭＣを播種すること（例えば、１００万個／ｍｌのより低い密度で）；
－ 細胞を、候補結合分子と４日間インキュベートすること；および
－ 分析を行って、細胞数を決定すること
を含む方法によって評価される。

【0161】

好ましい実施形態では、候補結合分子と接触させずに細胞を培養する陰性対照を実施する。細胞を、特にＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞に関して染色するフローサイトメトリーを使用して評価してもよい。好ましい実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞集団内のＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋細胞数を測定する。細胞をまた、ＣＤ３および／またはＣＤ８に特異的な抗体によって染色してもよい。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、結合分子の非存在下でのインキュベーションと比較してより多数のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞を生じる。別の実施形態では、候補結合分子をまた、本発明の特異的結合分子と比較して、例えばバリアント結合分子が、本発明の特異的結合分子と同じまたはそれより大きい程度にＴｒｅｇを増大させることができるか否かを評価してもよい。

【0162】

別の好ましい実施形態では、マウスＦｏｘＰ３プロモーターの制御下でＴｒｅｇ細胞のマーカーとして作用するルシフェラーゼを発現するＦｏｘＰ３－Ｌｕｃｉマウスを使用して、Ｔｒｅｇ細胞増大を調べる。例えば、そのようなマウスに、候補ＴＮＦＲ２アゴニストを注射してもよく、その後生物発光イメージングを使用してＴｒｅｇ細胞をイメージングする。公知のＴＮＦＲ２アゴニストによる陽性対照もまた、陰性対照と同様に実施してもよい。一実施形態では、バリアントまたは候補結合分子が、本明細書で記載される公知のＴＮＦＲ２アゴニストと比較して、生物発光イメージングによって評価した場合に等価のまたはより高いＴｒｅｇレベルをもたらす場合、好ましい実施形態では、バリアントまたは候補結合分子は、それ自身本発明の結合分子として分類される。そのような評価をまた、例えば後に動物を屠殺し、細胞を単離し、次にＴｒｅｇ数を調べることによって、エクスビボ評価と組み合わせてもよい。

【0163】

別の好ましい実施形態では、ヒト特異的分子を試験するために、例えばヒトＴＮＦＲ２ ｃＤＮＡをマウスゲノムに、またはより具体的にはマウスＴＮＦＲ２遺伝子座にランダム挿入後に得られた、ヒトＴＮＦＲ２または特にヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメインを発現するトランスジェニックマウスを使用して、Ｔｒｅｇレベル、特に増大を調べる。そのようなトランスジェニックマウスを、Ｔｒｅｇ増大のインビボイメージングのためにＦｏｘＰ３－Ｌｕｃｉトランスジェニックマウスと交雑させることができる。屠殺時に、個別の組織をまた、陰性対照動物と比較してＴｒｅｇレベルの変化に関するイメージングを介して処理することできる。Ｔｒｅｇ増大および／またはＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比もまた、脾細胞、血液または他の組織中の白血球を起源とするフローサイトメトリーを使用して定量することができる。あるいは、ＮＳＧマウスなどの免疫欠損マウスに、ヒトＰＢＭＣまたはヒトＴｒｅｇを注射して、Ｔｒｅｇの増大を、フローサイトメトリーを介して決定することができる。

【0164】

特定の結合分子の有効性を、動物モデルなどのインビボ系において評価してもよい。例えば、様々な移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）モデルを使用してもよく、結合分子をそのような動物モデルに投与した後、同じＧｖＨＤの動物モデルであるが結合分子を投与されていない対照動物と比較してもよい。一実施形態では、本発明の結合分子は、動物モデルにおいてＧｖＨＤを呈するか、または低減させる。他の動物モデル、例えば乾癬、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、狼瘡、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、神経疾患、およびアテローム性動脈硬化症などの状態のモデルを同じ方法で使用してもよい。インビボ試験をまた使用して、所定の結合分子がインビボでＴｒｅｇを増大させることができるか否かを調べてもよい。

【0165】

コンジュゲート、融合タンパク質、およびエフェクター分子
本発明の結合分子、特に抗体を、エフェクター分子にコンジュゲートさせてもよい。したがって、望ましければ、本発明において使用するための結合分子、および特に抗体を、１つまたは複数のエフェクター分子（複数可）にコンジュゲートしてもよい。エフェクター分子は、単一のエフェクター分子、または本発明の結合分子、特に抗体に結合することができる単一の部分を形成するように連結された２つもしくはそれより多くの分子を含み得ると認識される。エフェクター分子に連結された本発明に従う結合分子、特に抗体を得ることが望ましい場合、これは、結合分子、特に抗体が、エフェクター分子に直接またはカップリング剤を介して連結される標準的な化学または組換えＤＮＡ技法によって調製され得る。そのようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートする技術は、当技術分野で周知である（Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123を参照されたい）。特定の化学技法は、例えば国際公開第９３／０６２３１号パンフレット、国際公開第９２／２２５８３号パンフレット、国際公開第８９／００１９５号パンフレット、国際公開第８９／０１４７６号パンフレット、および国際公開第０３／０３１５８１号パンフレットに記載される技法を含む。あるいは、エフェクター分子がタンパク質またはポリペプチドである場合、連結は、国際公開第８６／０１５３３号パンフレットおよび欧州特許第０３９２７４５号明細書に記載されるように組換えＤＮＡ技法を使用して達成され得る。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、エフェクター分子を含み得る。エフェクター分子という用語は、本明細書で使用される場合、例えば薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば酵素、抗体、または抗体断片、合成または天然に存在するポリマー、核酸およびその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子、ならびにレポーター基、例えば蛍光化合物またはＮＭＲもしくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物を含む。

【0166】

エフェクター分子の例としては、細胞に対して有害である（例えば殺滅する）任意の作用剤を含む細胞毒または細胞傷害剤が挙げられ得る。例としては、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（Tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログもしくはホモログが挙げられる。エフェクター分子としてはまた、これらに限定されないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス－ジクロロジアミン白金塩（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアミシン、またはデュオカルマイシン）、および分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。

【0167】

他のエフェクター分子としては、キレート化放射性核種、例えば^１１１Ｉｎおよび^９０Ｙ、Ｌｕ^１７７、ビスマス^２１３、カリホルニウム^２５２、イリジウム^１９２、およびタングステン^１８８／レニウム^１８８；または薬物、例えばこれらに限定されないがアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド、およびスラミンが挙げられ得る。他のエフェクター分子は、タンパク質、ペプチド、および酵素を含む。目的の酵素としては、これらに限定されないが、タンパク質分解酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが挙げられる。目的のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドとしては、これらに限定されないが免疫グロブリン、毒素、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス内毒素、またはジフテリア毒素、タンパク質、例えばインスリン、腫瘍壊死因子、α－インターフェロン、β－インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、または組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓剤、または抗血管新生剤、例えばアンジオスタチンまたはエンドスタチン、または生物応答修飾剤、例えばリンフォカイン、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、または他の成長因子および免疫グロブリンが挙げられる。

【0168】

他のエフェクター分子は、例えば診断において有用な検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射活性核種、陽電子放出金属（陽電子放出断層撮影で使用するため）、および非放射活性常磁性金属イオンが挙げられる。一般的に、診断剤として使用するための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンに関して米国特許第４，７４１，９００号明細書を参照されたい。好適な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族としては、ストレプトアビジン、アビジン、およびビオチンが挙げられる；好適な蛍光材料としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン、フルオレセイン、塩化ダンシル、およびフィコエリスリンが挙げられ；好適な発光材料としてはルミノールが挙げられ；好適な生物発光材料としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；ならびに好適な放射性核種としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、および^９９Ｔｃが挙げられる。

【0169】

別の実施形態では、エフェクター分子は、インビボで結合分子、特に抗体の半減期を増加もしくは減少させ得る、および／または免疫原性を低減させ得る、および／または免疫系に対する上皮障壁を越える送達を増強し得る。このタイプの好適なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、またはアルブミン結合化合物、例えば国際公開第０５／１１７９８４号パンフレットに記載される化合物が挙げられる。エフェクター分子がポリマーである場合、これは、一般的に合成または天然に存在するポリマー、例えば任意選択で置換された直鎖もしくは分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマー、または分岐もしくは非分岐多糖、例えばホモもしくはヘテロ多糖であり得る。上記で言及した合成ポリマーに存在し得る特異的な任意選択の置換基は、１つまたは複数のヒドロキシ、メチル、またはメトキシ基を含む。合成ポリマーの特定の例としては、任意選択で置換された直鎖もしくは分岐鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、またはその誘導体、特に任意選択で置換されたポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体が挙げられる。

【0170】

本発明の結合分子、特に抗体を、血清中半減期をモジュレートまたは変更する分子にコンジュゲートしてもよい。本発明の結合分子、特に抗体を、例えば血清中半減期をモジュレートするためにアルブミンに結合させてもよい。別の実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体はアルブミン結合ペプチドであるペプチドリンカーを含み得る。アルブミン結合ペプチドの例は、その全体が参照により組み込まれる、国際公開第２０１５／１９７７７２号パンフレットおよび国際公開第２００７／１０６１２０号パンフレットに含まれる。

【0171】

別の実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、エフェクター分子にコンジュゲートされない。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、毒素にコンジュゲートされない。別の実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、放射性同位体にコンジュゲートされない。別の実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、造影剤にコンジュゲートされない。

【0172】

エフェクター分子に本発明の抗体分子を連結させるためにコンジュゲーションを使用することと共に、抗体全体の異なる部分を連結すること、または例えばリガンドベースのＴＮＦＲ２結合部位を、本発明の分子の抗体部分に連結させることが使用され得る。

【0173】

一実施形態では、本発明の結合分子は融合タンパク質であり得る。「融合タンパク質」は、本明細書で言及される場合、融合タンパク質の一部が共有結合によって融合される限り、特定のタイプの融合タンパク質に限定されない。例えば、融合タンパク質の一部を、１つもしくは複数の単一のポリペプチド鎖（複数可）における発現によって、１つまたは複数のジスルフィド連結によって、化学コンジュゲーションによって（好ましくはクリックケミストリーを使用する化学コンジュゲーションによって）、および／またはタンパク質の好適な連結として当技術分野で公知である任意の他の共有結合による連結によって融合させることができる。好ましくは、融合タンパク質の一部は、１つもしくは複数の単一のポリペプチド鎖（複数可）における発現および／または１つもしくは複数のジスルフィド連結によって融合される。例えば、結合分子、特に抗体は、ｓｃＦｖのポリペプチド配列に融合された重鎖または軽鎖定常領域を含むポリペプチドを含み得る。別の実施形態では、ポリペプチドは、テナシンペプチド配列、特にポリペプチドのＣ末端でテナシンペプチド配列に融合された重鎖定常領域配列を含み得る。他の実施形態では、融合は、１つもしくは複数のジスルフィド連結によって、化学コンジュゲーションによって（好ましくはクリックケミストリーを使用する化学コンジュゲーションによって）、および／またはタンパク質の好適な連結として当技術分野で公知の任意の他の連結によるものあり得る。

【0174】

一実施形態では、本発明の結合分子は、分子の血清中半減期に影響を及ぼす部分を含む。例えば、本発明の結合分子は、Ｆｃテール、血清アルブミン、および／または血清アルブミンの結合体である部分、およびＰＥＧを含み得る。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、血清アルブミンの結合部位を含むか、それにコンジュゲートされているか、またはそれを有する。一実施形態では、結合分子は、結合分子の血清中半減期を変更するために血清アルブミンまたはそのバリアントにコンジュゲートされている。別の実施形態では、結合分子は、血清アルブミンの抗原結合部位を含む抗体である。別の実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、血清アルブミンに結合するペプチド配列を含み得る。

【0175】

一実施形態では、本発明の結合分子は、リンカーまたは複数のリンカーを含み得る。リンカーは、結合分子の一部を共に連結するために使用され得る。一実施形態では、結合部分は、リンカーによって隔てられる。結合分子が少なくとも１つのリンカーを含む好ましい一実施形態では、結合分子はグリシン／セリンリンカー、例えばＧＳまたはＧ４Ｓ（ＧＧＧＧＳ）、または１つもしくは両方のそのようなリンカーの複数のコピーを含む。一実施形態では、単一のＧ４Ｓリンカーを使用してもよい。一実施形態では、リンカーは、例えば各リンカーがその配列の１～７個の反復配列を有する、複数のＧ４Ｓ単位を含んでもよい。一実施形態では、１～５個のＧ４Ｓリンカー単位を連続して使用する。任意の好適なリンカーを本発明に使用してもよく、例えば特異的Ｇ４Ｓリンカーを使用するそれらの実施形態では、リンカーはＧ４Ｓリンカー配列に限定されず、任意の好適なリンカーであり得る代替の実施形態が提供される。３個のＶＨＨドメインが連続して同じポリペプチドに存在する一実施形態では、例えば他のＶＨＨドメインから中央のＶＨＨを分離するために、中央のＶＨＨのいずれかの側面に存在するリンカーを使用してＶＨＨドメインを分離してもよい。

【0176】

一実施形態では、本発明の結合分子は、ヒンジ領域を含み得る。ＶＨおよびＶＬを含む（４価）ＩｇＧフォーマットの場合、そのようなヒンジ領域は典型的に、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに接続する。ＶＨＨの場合、そのようなヒンジ領域は典型的に、最もＣ末端のｓｄＡＢ／ＶＨＨをＦｃ部分に接続する。一実施形態では、ヒンジは、ＩｇＧ１のヒンジ領域であり得るか、または２、もしくは３、もしくは４個のヒンジ領域であり得る。これはそのようなヒトヒンジ領域であり得る。一実施形態では、ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１コンセンサス配列のヒンジ領域である。一実施形態では、ヒンジ領域は、デュルバルマブのヒンジ領域である。一実施形態では、ヒンジ領域は、デュルバルマブヒンジ領域のバリアントであり得る。

【0177】

本明細書に提示される多くのポリペプチドは、シグナルまたはリーダー配列を含む。当てはまる場合、特に好ましいポリペプチドは、シグナルまたはリーダー配列が除去されているポリペプチドである。

【0178】

医薬組成物
一実施形態では、本発明は、（ａ）本発明の結合分子、特に抗体；および（ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、抗体である本発明の結合分子を含む。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の結合分子ならびに担体、安定化剤、賦形剤、希釈剤、溶解剤、界面活性剤、乳化剤、保存剤、および／または補助剤を含む。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、固体または液体形態である。一実施形態では、医薬組成物は、散剤、錠剤、液剤、またはエアロゾルの形態であり得る。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、凍結形態で提供される。

【0179】

本発明の組成物は通常、滅菌医薬組成物として供給される。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される補助剤をさらに含み得る。別の実施形態では、そのような補助剤は、本発明の医薬組成物には存在しない。本発明はまた、本発明の結合分子、特に抗体を、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体と共に添加および混合することを含む、医薬組成物または薬剤組成物を調製するプロセスも提供する。

【0180】

治療組成物中の薬学的に許容される担体は、さらに、水、食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体を含有し得る。そのような担体は、例えば医薬組成物が、患者が摂取するための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリーおよび懸濁剤として製剤化されるように使用され得る。「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、本明細書で使用される場合、典型的に本発明の組成物の所望の特徴を増強するための薬学的に許容される製剤担体、溶液、または添加剤を指す。賦形剤は、当技術分野で周知であり、緩衝剤（例えば、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、および重炭酸緩衝剤）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールを含む。溶液または懸濁液を、リポソームまたは生体分解可能なミクロスフェアに封入することができる。好適な担体は、大きい徐々に代謝される高分子、例えばタンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子であり得る。薬学的に許容される塩、例えば無機酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、および硫酸塩、または有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、および安息香酸塩を使用することができる。

【0181】

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、組成物のある特定の特徴、例えばｐＨ、浸透圧、粘度、明度、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、解離または放出速度、吸収または浸透を改変、維持、または保存する目的で製剤材料を含有し得る。薬学的に許容される担体の十分な考察は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company, N.J. 1991)において利用可能である。追加の医薬組成物は、持続送達または制御送達製剤中に本発明の結合分子を含む製剤を含む。多様な持続送達または制御送達手段を製剤化する技術が当業者に公知である。本発明の結合分子はまた、例えばコアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセルに、コロイド薬物送達システムに、またはマクロエマルジョンに捕捉され得る。そのような技術もまた、Remington's Pharmaceutical Sciencesに開示されている。

【0182】

対象は、典型的に、医薬組成物、したがって本発明の結合分子の治療有効量を投与される。「治療有効量」という用語は、典型的に、標的となる疾患もしくは状態を処置、改善、または防止するために必要な、または検出可能な治療効果もしくは防止効果を示すために必要な治療剤の量を指す。ヒト対象の正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、対象の全身健康、対象の年齢、体重、および性別、食事、投与時間および回数、薬物の組合せ（複数可）、反応感受性、ならびに治療に対する認容性／応答に依存する。この量は、通常の実験によって決定することができ、医師の判断内である。一般的に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ／日である。あるいは、用量は、１～５００ｍｇ／日、例えば１０～１００、２００、３００、または４００ｍｇ／日であり得る。一実施形態では、所定の用量の量は、特定の機能をもたらすために少なくとも十分である。

【0183】

一実施形態では、本発明の結合分子は、処置される状態の別の処置、特にＴＮＦ－アルファ遮断剤との組合せで投与され得る。一実施形態では、本発明の結合分子が共に使用される第２の薬物は抗炎症剤である。例えば、本発明の結合分子は、そのような追加の作用剤と同時、連続的、または個別に提供され得る。別の実施形態では、本発明の結合分子は、第２の治療剤と同じ医薬組成物中で提供され得る。本発明の結合分子と同じ組成物中で提供され得る、または共に使用され得る薬物の例としては、ＴＮＦ－アルファ遮断剤、ラパマイシン、ウステキヌマブ、または自己免疫疾患もしくは炎症疾患において標準治療として使用される作用剤が挙げられる。本発明の結合分子と共に使用され得るＴＮＦ－アルファ遮断剤の例としては、これらに限定されないが、インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、およびセルトリズマブが挙げられる。一実施形態では、第２の薬物は、ＴＮＦ－アルファに特異的な抗体である。一実施形態では、投与される第２の薬物は、ステロイドであり得る。

【0184】

好ましい一実施形態では、本発明の治療剤は、医薬調製物中にある場合、単位投薬剤形で存在し得る。好適な用量は、患者の体重に従って患者に関して計算され得るが、例えば好適な用量は、０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１～２０ｍｇ／ｋｇ、例えば１～２０ｍｇ／ｋｇ、例えば１０～２０ｍｇ／ｋｇ、または例えば１～１５ｍｇ／ｋｇ、例えば１０～１５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。状態を有効に処置するために、本発明においてヒトにおいて使用するための好適な用量は、本発明の二重標的化タンパク質の０．０１～１０００ｍｇ、例えば０．１～１０００ｍｇ、例えば０．１～５００ｍｇ、例えば５００ｍｇ、例えば０．１～ｌ００ｍｇ、または０．１～８０ｍｇ、または０．１～６０ｍｇ、または０．１～４０ｍｇ、または例えば１～１００ｍｇ、または１～５０ｍｇの範囲であり得、これは非経口投与、例えば皮下、静脈内、または筋肉内に投与され得る。そのような用量は、必要であれば、医師が適切であると選択した適切な間隔で繰り返される。本発明の結合分子は、例えば貯蔵のために凍結乾燥され、使用前に好適な担体中で再構成されてもよい。凍結乾燥および再構成技術を使用することができる。

【0185】

本発明の結合分子および医薬組成物は、これらに限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経真皮、経皮（例えば、国際公開第９８／２０７３４号パンフレットを参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所適用、舌下、膣内、または直腸経路を含む任意の数の経路によって投与され得る。ハイポスプレーもまた、本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る。組成物の直接送達は一般的に、皮下、腹腔内、静脈内、もしくは筋肉内注射によって、または組織の間質腔への送達によって達成され得る。好ましい一実施形態では、投与は、静脈内投与を介してであり、例えば好ましい一実施形態では、投与は静脈内注射を介してである。別の好ましい実施形態では、投与は、皮下投与を介してであり、例えば、皮下注射を介してである。組成物はまた、目的の特定の組織に投与することができる。一部の実施形態では、本発明の結合分子は、部位特異的または標的化局所送達技術を介して投与される。部位特異的または標的化局所送達技術の例としては、結合分子の様々な植込み可能デポー起源、または局所送達カテーテル、例えば注入カテーテル、留置カテーテル、または針カテーテル、合成グラフト、外膜ラップ、シャントおよびステント、または他の植込み可能デバイス、部位特異的担体、直接注射、または直接適用が挙げられる。

【0186】

投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。産物が注射または注入のためである場合、これは、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液、または乳液の形態を取り得て、懸濁剤、保存剤、安定化剤、および／または分散剤などの処方剤を含有し得る。あるいは、結合分子、特に抗体は、使用前に適切な滅菌液体によって再構成するための乾燥形態であり得る。一実施形態では、本発明の結合分子を含む医薬組成物は、凍結乾燥形態で提供される。組成物が消化管を使用する経路によって投与される場合、組成物は、結合タンパク質を分解から保護し、それが消化管から吸収されると結合分子を放出する作用剤を含有する必要がある。別の実施形態では、本発明に従う噴霧可能な製剤は、例えばホイルエンベロープに充填された単一用量単位（例えば、密封されたプラスチック容器またはバイアル）として提供され得る。各バイアルは、溶媒／溶液緩衝剤の体積、例えば２ｍｌ中に単位用量を含有する。

【0187】

本発明の医薬組成物は、対象に投与するための手段を提供する容器として提供され得る。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、充填済みシリンジとして提供され得る。したがって、本発明は、そのようなロードされたシリンジを提供する。同様に、本発明は、本発明の医薬組成物をロードしたオートインジェクターも提供する。

【0188】

一実施形態では、製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。好適な吸入調製物は、吸入可能な粉末、推進剤ガスを含有する一定用量エアロゾル、または推進剤ガスを含まない吸入溶液を含む。活性物質を含有する本発明に従う吸入可能な粉末は、上述の活性物質のみ、または上記の活性物質と生理的に許容可能な賦形剤との混合物からなり得る。これらの吸入可能な粉末は、単糖（例えば、グルコースまたはアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖および多糖（例えば、デキストラン）、ポリアルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、またはこれらと互いとの混合物を含み得る。単糖および二糖は好適に使用され、ラクトースまたはグルコースは、特に、排他的ではないがその水和物の形態で使用される。

【0189】

肺における沈着のための粒子は、粒子サイズが１０ミクロン未満、例えば１～９ミクロン、例えば１～５μｍである必要がある。活性成分（例えば、抗体または断片）の粒子サイズは、特に重要である。吸入可能エアロゾルを調製するために使用することができる推進剤ガスは、当技術分野で公知である、好適な推進剤ガスは、炭化水素、例えばｎ－プロパン、ｎ－ブタン、またはイソブタン、およびハロ炭化水素、例えば、メタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン、またはシクロブタンの塩素化および／またはフッ化誘導体から選択される。上記の推進剤ガスは、単独で、またはその組合せで使用され得る。特に好適な推進剤ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ、およびＴＧ２２７から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素の中で、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２－テトラフルオロエタン）およびＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３－ヘプタフルオロプロパン）、およびその混合物は特に好適である。推進剤ガス含有吸入可能エアロゾルはまた、他の成分、例えば共溶媒、安定化剤、界面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、潤滑剤、およびｐＨを調整する手段も含有し得る。これらの成分は全て当技術分野で公知である。本発明に従う推進剤ガス含有吸入可能エアロゾルは、最大で５重量％の活性物質を含有し得る。本発明に従うエアロゾルは、例えば０．００２～５重量％、０．０１～３重量％、０．０１５～２重量％、０．１～２重量％、０．５～２重量％、または０．５～１重量％の活性成分を含有する。

【0190】

あるいは、肺への局所投与もまた、例えばネブライザー、例えばコンプレッサーに接続されたネブライザー（例えば、Ｐａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．によって製造されたＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）コンプレッサーに接続されたＰａｒｉ ＬＣ－Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）ネブライザー）などの装置を使用する液体溶液または懸濁液製剤の投与であり得る。

【0191】

本発明に従うネブライザー製剤は、ホイルエンベロープに充填された単一用量単位（例えば、密封プラスチック容器またはバイアル）として提供され得る。各バイアルは、溶媒／溶液緩衝液の体積、例えば２ｍＬ中に単位用量を含有する。本発明はまた、本発明の結合分子、特に抗体を含む組成物をロードしたシリンジも提供する。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体の単位用量をロードした充填済みシリンジが提供される。別の実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体をロードしたオートインジェクターが提供される。さらなる実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体をロードしたＩＶバッグが提供される。同様に、バイアル中で凍結乾燥型の、または類似の容器中の凍結乾燥形態の本発明の結合分子、特に抗体も提供する。

【0192】

同様に、本発明の結合分子は、遺伝子治療を使用することによって投与され得ることが想像される。これを達成するために、必要なポリペプチド、例えば抗体分子の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列を、適切なＤＮＡ構成要素の制御下で、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現され、インサイチューでアセンブルされるように、患者に導入する。

【0193】

製剤化した後、本発明の組成物を、対象に直接投与することができる。処置される対象は動物であり得る。しかし、１つまたは複数の実施形態では、組成物は、ヒトに投与するために適合される。特に好ましい実施形態では、対象はヒトである。

【0194】

一実施形態では、本発明の結合分子が別の作用剤と共に投与される場合、両者は、同時に、連続的に、または個別に投与され得る。一実施形態では、両者は、同じ医薬組成物中で投与され得る。

【0195】

一実施形態では、本発明の医薬組成物は、移植の前、移植と同時、および／または投与される。例えば、医薬組成物は、本明細書に言及されるそれらのいずれかなどの、細胞、組織、または臓器の移植と同時に投与され得る。別の実施形態では、対象に移植される材料は、移植前にエクスビボで処置されるであろう。一実施形態では、本発明の結合分子を使用して、移植された材料の拒絶を防止または低減させてもよい。一実施形態では、本発明の結合分子を使用して、移植した材料に対する免疫応答を防止、処置、または改善してもよい。特に好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、移植片対宿主病に関連する目的のために使用される。

【0196】

本発明はまた、本発明の結合分子を含むキットにも拡大される。一実施形態では、本発明の結合分子のいずれかを、任意選択で投与のための使用説明書と共に含むキットが提供される。なお別の実施形態では、キットはさらに、１つまたは複数の機能的アッセイを実施するための１つまたは複数の試薬を含む。別の実施形態では、単一チャンバーまたはマルチチャンバーの充填済みシリンジを含有するキットが提供される。本発明はまた、単一用量投与単位のためのキットも提供する。

【0197】

病的状態、医療、および診断での使用
同様に、医薬として使用するための本発明の結合分子の使用も提供する。別の実施形態では本発明の結合分子は、ヒトまたは動物の体の治療方法において使用するために提供される。結合分子に言及する本明細書に記載される様々な治療的使用では、特に述べていない限り、結合分子を含む医薬組成物を使用してもよく、その逆も同様であることに注意されたい。本発明の結合分子はまた、インビボ診断および同様にインビトロ診断、例えば対象からの試料について実施されるそのような診断の両方を含む診断において使用され得る。

【0198】

以下にさらに考察されるように、本発明の結合分子を使用して、状態を処置してもよい。本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置」という用語は、目的が、望ましくない生理的変化または障害を防止または遅らせる（弱める）ことである、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指す。有益なまたは望ましい臨床結果は、これらに限定されないが、検出可能であるかまたは検出不能であるかによらず、症状の軽減、疾患の程度の減損、疾患状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅延または遅らせること、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分または完全のいずれか）を含む。「処置」はまた、処置を受けていない場合に予想される生存と比較して生存の延長も意味し得る。処置を必要とする対象は、状態もしくは障害を既に有する対象、ならびに状態もしくは障害を有する傾向がある対象、または状態もしくは障害を防止すべき対象を含む。

【0199】

特に好ましい一実施形態では、本発明の結合分子を使用して、免疫系をモジュレートしてもよい。例えば、本発明の結合分子を使用して、免疫系の細胞を刺激、例えば免疫系の特定の細胞を活性化してもよい。一実施形態では、細胞を刺激して増殖させてもよい。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子を使用してその表面上にＴＮＦＲ２を発現する細胞を活性化させる。例えば、当該細胞は、白血球、特にＴ細胞であり得る。特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子を使用して、Ｔｒｅｇ細胞を活性化する。例えば、本発明の結合分子を使用して、Ｔｒｅｇ細胞を刺激してもよく、次に免疫応答を抑制、低減、または防止すする。

【0200】

本発明が、免疫系をモジュレートする能力は、それが例えば自己免疫障害または炎症障害を標的とするために特に良好な方法を表すことを意味する。したがって、本発明は、自己免疫障害または炎症障害を処置または防止する方法に使用するための本発明の結合分子または医薬組成物を提供する。本発明は、そのような方法に使用するための結合分子または医薬組成物であって、
（ａ）障害が、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）であり、好ましくは、結合分子が、それが細胞、組織、もしくは臓器の移植の前、移植と同時、もしくは移植の後に投与される方法において使用するためである；または
（ｂ）障害が、白血球、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＴｅｆｆ細胞の機能障害または望ましくない増殖を伴う障害であり、そのような障害が、例えばＴｒｅｇの数および／または免疫抑制特性の平衡ではないＴｅｆｆの数または活性の増加により、Ｔｅｆｆ細胞と比較してＴｒｅｇの不均衡を呈し得て、一部の実施形態では、本発明がＴｒｅｇを促進し、特に、エフェクター細胞の正常細胞に対する、または正常細胞に向かう平衡をシフトさせる；
（ｃ）障害が、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、およびセリアック病）、多発性硬化症、重症筋無力症、皮膚自己免疫疾患、例えば尋常性天疱瘡、または水疱性類天疱瘡、およびＩ型糖尿病、およびアテローム性動脈硬化症から選択される、
結合分子または医薬組成物を提供する。

【0201】

本発明は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置するために使用され得る。一実施形態では、本発明は、細胞、組織、または臓器移植前にＴｒｅｇ活性を促進するために使用される。例えば、一実施形態では、本発明は、細胞の移植前、特に幹細胞の移植前、好ましくは造血幹細胞の移植前にＴｒｅｇ活性を促進するために使用される。別の実施形態では、移植前のレシピエントにおいてＴｒｅｇを刺激するのではなく、本発明は、宿主に移植される細胞、組織、または臓器においてＴｒｅｇを増大させるために使用される。さらなる実施形態では、それらは、非悪性造血疾患の処置の一部として使用される。

【0202】

本発明は、移植体に対する、例えば移植された細胞、組織、または臓器に対する免疫応答を低減、防止、または処置するために使用され得る。したがって、本発明は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を低減、防止、または処置するために使用され得る。一実施形態では、本発明は、移植される材料が細胞集団などの細胞である方法で使用され得る。一実施形態では、移植される材料は、造血幹細胞（ＨＳＣ）であるか、またはそれを含む。別の実施形態では、移植される材料は臓器または組織、例えば心臓、肺、腎臓、角膜、または他の臓器の移植体であり得る。別の実施形態では、移植される材料は、移植片、例えば皮膚移植片であり得る。一実施形態では、本発明は、移植した細胞、組織、または臓器に対する望ましくない免疫応答を処置、防止、または改善するために本発明の結合分子を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、方法は実際に、移植を実施することをさらに含み得る。別の実施形態では、本発明の結合分子は、移植の前、移植の間、および／または移植の後に対象に投与される。さらなる実施形態では、結合分子を対象に投与するのではなくて、方法は、移植される前に、移植される材料をエクスビボで結合分子によって処置することを含む。

【0203】

一実施形態では、疾患そのものを処置、防止、または改善するのではなくて、本発明は、疾患の処置、すなわち移植した細胞、組織、または臓器が、ＧｖＨＤの重症度を防止または低減することによって確実に有効となることを助けるために使用される。したがって、本発明は、細胞、組織、または臓器を移植することによって疾患が処置される多様な実施形態において使用され得る。好ましい一実施形態では、状態は、幹細胞移植、例えば造血幹細胞（ＨＳＣ）移植を介して処置される状態であり得る。一部の実施形態では、対象は、移植によって処置すべき代謝性蓄積症を有するかまたはそれ以外の方法で罹患している。対象は、グリコーゲン蓄積症、ムコ多糖症、ゴーシェ病、ハーラー病、スフィンゴリピドーシス、異染性白質ジストロフィー、または本明細書に開示される処置および治療から利益が得られ得る他の任意の疾患もしくは障害からなる群から選択される代謝障害に罹患してもよく、またはそれ以外の方法で罹患してもよく、障害は、これらに限定されないが、重度複合免疫不全症、ウィスコット－アルドリッチ症候群、高免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）症候群、チェディアック－東病、遺伝性リンパ組織球症、大理石骨病、骨形成不全症、蓄積症、サラセミアメジャー、鎌状赤血球病、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、若年性リウマチ性関節炎、および造血幹細胞移植治療の投与によって処置され得る病態に関連することからその開示のその全体が参照により本明細書に組み込まれる、"Bone Marrow Transplantation for Non-Malignant Disease, "ASH Education Book, 1 :319-338(2000)に記載されるそれらの疾患または障害を含む。一実施形態では、本発明が移植に関する場合、移入は、同種細胞、組織、または臓器の移入であり得る。一実施形態では、移入される細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞であり得る。一部の実施形態では、対象は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）治療を必要としている。例えば、そのような治療は、本発明の方法の一部を形成し得る。別の好ましい実施形態では、本発明は、細胞集団、組織、または臓器に対する免疫応答を処置する、低減する、または防止することによって対象における前記集団、組織、または臓器の定着を促進する方法を提供する。

【0204】

本発明の結合分子が、免疫系をモジュレートする能力はまた、自己免疫疾患を標的化するための特に貴重なアプローチとなる。したがって、別の実施形態では、処置される対象は、自己免疫障害を有する。特に好ましい一実施形態では、自己免疫障害は、多発性硬化症である。さらに特に好ましい実施形態では、対象は潰瘍性大腸炎を有する。別の特に好ましい実施形態では、状態は強皮症である。一実施形態では、処置される状態は狼瘡である。自己免疫疾患のさらなる例としては、強皮症、クローン病、１型糖尿病、または本明細書で記載される別の自己免疫病態が挙げられる。一実施形態では、処置される自己免疫疾患は、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、狼瘡、グレーヴス病、および１型糖尿病から選択される。一実施形態では、対象は１型糖尿病を有し、処置される。一実施形態では、状態はアテローム性動脈硬化症である。

【0205】

好ましい一実施形態では、処置される状態は、望ましくない炎症を伴う状態である。好ましい一実施形態では、状態は関節炎である。例えば、本発明は、リウマチ性関節炎または変形性関節症を処置するために使用され得る。処置され得る疾患の例の非限定的なタイプとしては、リウマチ性関節炎、多関節型若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、および若年性関節炎が挙げられる。別の好ましい実施形態では、処置される状態は、多発性硬化症、強直性脊椎炎、クローン病、および潰瘍性大腸炎から選択される。

【0206】

一実施形態では、本発明が、Ｔｒｅｇ細胞を刺激する能力は、アレルギーを処置する方法として使用される。別の実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞を刺激する能力は、喘息を処置する方法として使用され得る。

【0207】

検出および診断
本発明の結合分子を使用して、ＴＮＦＲ２を検出してもよい。例えば、本発明は、本発明の結合分子を試験試料と接触させること、および結合分子の任意の結合を検出することを含む方法を提供する。本発明の結合分子を標識してもよく、または結合分子の検出を可能にし、したがって検出分子が結合する酵素に連結してもよい。一実施形態では、そのような検出方法は、例えば、試験試料中の細胞がその表面上にＴＮＦＲ２を発現するか否かを検出する方法としてのＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーであり得る。本発明の結合分子を、インビトロ検出に使用してもよく、同様に、インビボであるＴＮＦＲ２の検出に使用してもよい。

【0208】

一実施形態では、本発明は、本発明の標識結合分子を投与すること、次いで対象の体における抗体の位置を検出することを含む、ＴＮＦＲ２を検出するインビボ方法を提供する。別の実施形態では、本発明の結合分子を、状態の診断に、例えばＴＮＦＲ２を発現する細胞の低減を同定するために、特にＴＮＦＲ２を発現する細胞の特定のサブセットの低減を同定するために使用してもよい。好ましい一実施形態では、本発明は、ＴＮＦＲ２のレベルに基づいて、例えばＴＮＦＲ２を発現する特定の細胞タイプのレベルに基づいて患者を細分類することを含む、患者を層別化する方法を提供する。

【0209】

本発明はまた、本発明の結合分子、および任意選択でＴＮＦＲ２を検出する方法において結合分子を使用するための使用説明書を含む、ＴＮＦＲ２を検出するためのキットも提供する。

【0210】

一実施形態では、本発明は、コンパニオン診断としての、例えばＴＮＦＲ２、例えばＴＮＦＲ２レベル、例えばＴＮＦＲ２を発現する特定の細胞タイプの数、またはその位置の検出に基づいて、対象に薬物を投与すべきか否かを決定するための、本発明の結合分子を提供する。

【0211】

本発明の結合分子は、イメージングに使用され得る。一実施形態では、結合分子は、インビボでのイメージングに使用され得る。したがって、同様に本発明の標識結合分子を対象に投与すること、次に標識を検出することを含む、イメージング方法も提供される。一実施形態では、イメージングはまた、インビボでＴＮＦＲ２を発現する細胞の検出を可能にし得る。一実施形態では、そのような方法を使用して、そのような細胞の位置または構成を同定してもよい。別の実施形態では、結合分子を、インビトロイメージング方法に使用してもよい。

【0212】

本明細書で考察されるように、本発明を使用して対象を処置してもよい。「対象」、または「個体」、または「動物」、または「患者」、または「哺乳動物」は、その診断、予後判定、または治療が望ましい任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、ヒト、家畜動物、農場動物、および動物園の動物、競技用動物、またはペット動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシなどを含む。特に好ましい実施形態では、対象はヒトである。

【0213】

本発明の結合分子はまた、Ｔ細胞増殖、特にＴｒｅｇ細胞増殖を刺激するために使用され得る。一実施形態では、そのような方法は、インビトロまたはエクスビボで、例えばＴｒｅｇ細胞を本発明の結合分子と接触させることによって実施される。別の実施形態では、本発明は、例えばＴｒｅｇ集団を増大させた後に、または結合分子と接触させた後に、細胞を対象に移入することをさらに含んでもよく、それによって細胞が対象に移入された後に増殖がインビボで起こる。

【0214】

さらなる実施形態
本発明はまた、本発明の自己免疫障害または炎症障害を、障害に罹患しているまたは障害のリスクがある対象に処置または防止する方法も提供する。

【0215】

本発明はまた、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を処置または防止するためのそのような方法であって、結合分子を対象に投与すること、および細胞、組織、または臓器を対象に移植することを含み、結合分子が移植の前、間、または後に投与される方法も提供する。

【0216】

本発明は、以下のような方法をさらに提供する：
（ａ）障害が、白血球、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＴｒｅｇ細胞の数の低減、機能障害、望ましくない増殖を伴う障害であり；または
（ｂ）障害が、Ｔｒｅｇの数の増加および／もしくは機能の増加により利益が得られ得る障害であり
（ｃ）障害が、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、およびセリアック病）、アテローム性動脈硬化症、狼瘡、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、および水疱性類天疱瘡から選択される。

【0217】

本発明はまた、自己免疫障害または炎症障害を処置または防止する方法に使用するための医薬を製造するための、本発明の結合分子の使用も提供する。

【0218】

本発明はさらに、医薬が、以下を処置する方法に使用するためである、そのような使用も提供する：
（ａ）障害が、白血球、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＴｒｅｇ細胞の機能障害もしくは望ましくない増殖を伴う障害であり；または
（ｂ）障害が、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、またはセリアック病）、狼瘡、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、および水疱性類天疱瘡から選択される。

【0219】

本発明はまた、本発明の結合分子を対象に投与すること、およびＴＮＦＲ２に対する結合分子の結合を検出することを含む診断方法であって、好ましくは結合分子が標識され、ＴＮＦＲ２に対する結合分子の結合が標識を介して検出される方法も提供する。

【0220】

番号を付けた実施形態
以下は、本発明のさらに好ましい実施形態を表す。

【0221】

［１］．ＴＮＦＲ２に特異的に結合するがＴＮＦＲ１には結合しない結合分子であって、ＴＮＦＲ２のＦｃγＲ非依存的アゴニストであり、ＴＮＦＲ２の結合に関して少なくとも２価を有する、結合分子。

【0222】

［２］．（ａ）ＴＮＦＲ２を発現する細胞の表面上でＴＮＦＲ２をオリゴマー形成し、好ましくは細胞表面上で６個もしくはそれより多くのＴＮＦＲ２分子をクラスター化する；
（ｂ）ＴＮＦＲ２シグナル伝達を誘発する；および／または
（ｃ）白血球、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激する
ことができる。［１］に記載の結合分子。

【0223】

［３］．（ａ）血清中半減期を変更する部分、好ましくはＦｃテール、血清アルブミン、血清アルブミンの結合体である部分、およびＰＥＧからなる群から選択される部分を含む；
（ａ）ＴＮＦＲ２結合に関して２価である；
（ｂ）ＴＮＦＲ２結合に関して３価である；
（ｃ）ＴＮＦＲ２結合に関して４価である；または
（ｄ）ＴＮＦＲ２結合に関して少なくとも４価を有する、
［１］または［２］に記載の結合分子。

【0224】

［４］．（ａ）抗体である；
（ｂ）ＴＮＦＲ２のリガンドを含む抗体である；
（ｃ）抗体定常領域、好ましくはＦｃ領域の少なくとも一部を含む；または
（ｄ）ＴＮＦＲ２のリガンドであって、好ましくは、ＴＮＦαまたはリンフォトキシン－アルファに由来するリガンドを含む、
好ましくは、
（ａ）抗体の１つもしくは複数の重鎖のＮ末端およびＣ末端の両方でＴＮＦＲ２結合部位を含む抗体；または
（ｂ）抗体の１つもしくは複数の軽鎖のＮ末端およびＣ末端の両方でＴＮＦＲ２結合部位を含む抗体である、
［１］～［３］のいずれか１つに記載の結合分子。

【0225】

［５］．（ａ）抗体が２価抗体である；
（ｂ）抗体が３価抗体である；
（ｃ）抗体が４価抗体である；
（ｄ）抗体が６価抗体である；
（ｅ）抗体が重鎖のみの抗体である；
（ｆ）抗体が単一ドメイン抗体、例えば単一ドメインＡｂ（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨ、またはナノボディである；
（ｇ）抗体が少なくとも２つの抗体の多量体である；
（ｈ）抗体が多量体形成部分、好ましくはテナシン－ｃペプチド（ＴＮＣ）を含むかまたはそれに連結され、好ましくは、抗体が、テナシン－ｃペプチド配列を通して会合する少なくとも２つの抗体の多量体である；
（ｉ）抗体が、ＴＮＦＲ２のリガンド、好ましくはＴＮＦ－αまたはリンフォトキシンアルファに由来する１つまたは複数の分子に連結されている、
［４］に記載の結合分子。

【0226】

［６］．（ａ）抗体がＦｃ領域を欠如する；または
（ｂ）抗体がＦｃ受容体に結合することができない改変Ｆｃ領域を含む
請求項［４］または［５］に記載の結合分子。

【0227】

［７］．結合分子が、
－ Ｆｃ受容体結合を除去するＦｃ改変を有するＩｇＧ；
－ ＩｇＧがＦｃ受容体結合を除去するＦｃ改変を有するｓｃＦｖ：ＩｇＧ；
－ ＩｇＧがＦｃ受容体結合を除去する改変を有するＩｇＧ－ＨＣ：ＴＮＣ；
－ ＩｇＧがＦｃ受容体結合を除去する改変を有するｓｃＦｖ：ＩｇＧ－ＨＣ：ＴＮＣ；および
－ 六量体ＩｇＧ
から選択される抗体フォーマットの抗体であり；
－ ＨＣがＩｇＧの重鎖を表し；
－ ＬＣがＩｇＧの軽鎖を表し；
－ ｓｃＦｖ：ＩｇＧがＩｇＧ分子に連結されるかまたはその一部を形成するｓｃＦｖを表し；および
－ ＨＣ：ＴＮＣが、テナシン－ｃ三量体形成ドメインペプチド（ＴＮＣ）を含むかまたはそれに連結された重鎖（ＨＣ）を示す、
先行請求項のいずれか一項に記載の結合分子。

【0228】

［８］．結合分子が、
－ Ｆａｂ－ＬＣ：ｓｃＦｖ；
－ ＩｇＧがＦｃ受容体結合を除去する改変、好ましくはＮ２９７Ａを有するＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖ；
－ ＩｇＧがＦｃ受容体結合を除去する改変、好ましくはＮ２９７Ａを有するＩｇＧ－ＬＣ：ｓｃＦｖ；
－ ＩｇＧ－ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ；
－ ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ－ＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖ；
－ ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ－ＩｇＧ－ＬＣ：ｓｃＦｖ；
－ ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ－ＩｇＧ－ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ；および
－ ＩｇＧ－ＨＣ－ＴＮＣ－ｓｃＦｖ；
－ ｓｄＡｂ／ＶＨＨ
からなる群から選択される抗体フォーマットの抗体であり、
－ ＨＣがＩｇＧの重鎖を表し；
－ ＬＣがＩｇＧの軽鎖を表し；
－ ＬＣ：ｓｃＦｖが、軽鎖に連結されたまたは軽鎖の一部を形成するｓｃＦｖを示し；
－ ＨＣ：ｓｃＦｖが、重鎖に連結されたまたは重鎖の一部を形成するｓｃＦｖを示し；
－ ＨＣ：ＴＮＣが、テナシン（ＴＮＣ）を含むかまたはそれに連結された重鎖（ＨＣ）を示し；
－ ＴＮＣ－ｓｃＦｖがｓｃＦｖに連結されたまたは結合したテナシンを示し；
－ ｓｄＡｂが単一ドメイン抗体を示し；および
－ ＶＨＨがラクダ科抗体の可変重鎖領域を示し、
好ましくは、結合分子が、抗体であり、抗体が、
－ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ；
－ ＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖ；
－ ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１；および
－ ＬＣ：ｓｃＦｖ－ＨＣ：ｓｃＦｖ－ＩｇＧ１－ＴＮＣ
から選択される抗体フォーマットである、
［１］～［７］のいずれか１つに記載の結合分子。

【0229】

［９］．ＴＮＦＲ２に特異的に結合するがＴＮＦＲ１には結合しない結合分子であって、ＴＮＦＲ２のＦｃγＲ非依存的アゴニストであり、ＴＮＦＲ２の結合に関して少なくとも２価を有し、ならびにＴＮＦＲ２に結合するがＴＮＦＲ１には結合しない突然変異体ＴＮＦ－アルファ、およびＦｃ領域、またはポリペプチドをオリゴマー形成するテナシンペプチド配列、または両方を含むポリペプチドを含み、
好ましくは、
（ａ）抗体配列を含まない；
（ｂ）ＴＮＦＲ２に結合するが、ＴＮＦＲ１には結合しない突然変異体ＴＮＦ－アルファ、およびテナシンペプチドを含むポリペプチドを含む；
（ｃ）ＴＮＦ－アルファ突然変異体がＴＮＦ８０である；ならびに／または
（ｄ）ＴＮＦＲ２に関して少なくとも３価、好ましくはＴＮＦＲ２に関して６価を有する、
結合分子である、結合分子。

【0230】

［１０］．医薬として使用するための［１］～［１０］のいずれか１つに記載の結合分子。

【0231】

［１１］．自己免疫障害または炎症障害を処置または防止する方法に使用するための［１］～［９］のいずれか１つに記載の結合分子であって、好ましくは、
（ａ）障害が移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）であり、好ましくは結合分子が、細胞、組織、もしくは臓器の移植の前、移植と同時、もしくは移植の後に結合分子が投与される方法に使用するためである；または
（ｂ）障害が、白血球、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＴｒｅｇ細胞の機能障害もしくは望ましくない増殖を伴う障害である；または
（ｃ）障害が、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、もしくはセリアック病）、アテローム性動脈硬化症、狼瘡、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、および水疱性類天疱瘡から選択される、結合分子。

【0232】

［１２］．ＴＮＦＲ２を発現する標的細胞を、［１］～［９］のいずれか１つに記載の結合分子と接触させることを含む、細胞増殖を刺激する方法。

【0233】

［１３］．［１］～［９］のいずれか１つに記載の結合分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【0234】

［１４］．試験試料を、［１］～［９］のいずれか１つに記載の結合分子と接触させること、およびＴＮＦＲ２に対する結合分子の結合を検出することを含む、ＴＮＦＲ２を検出する方法であって、
好ましくは、結合分子が標識され、ＴＮＦＲ２に対する結合分子の結合が標識を介して検出される、方法。

【0235】

［１５］．請求項１～１５のいずれか１つに記載の結合分子を対象に投与すること、およびＴＮＦＲ２に対する結合分子の結合を検出することを含み、
好ましくは結合分子が標識され、ＴＮＦＲ２に対する結合分子の結合が標識を介して検出される、
診断方法に使用するための［１］～［９］のいずれか１つに記載の結合分子。

【0236】

本明細書において言及した全ての文書は参照により組み込まれる。「１つ（ａ）」、および「１つ（ａｎ）」などの用語を使用する本明細書における単数形への言及は、特に述べていない限り複数形も包含する。本明細書においてあるものが「含む」と言及される場合、別の実施形態では、本発明は、記載されているもの「から本質的になり」得る。別の実施形態では、本発明は、記載されているもの「からなり」得る。特に定義していない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。

【実施例】

【0237】

［実施例１］
材料および方法
緒言
以下は、その後の実験に記載される実験を実施する場合に使用した材料および方法の概要を提供する。

【0238】

細胞株および細胞培養条件
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２（Weiss et al., 1997）細胞、ＨＴ１０８０－ＴＮＦＲ２（Gerspach et al., 2006, Cell Death Differ., 13(2): 273-284）、およびＫｙｍ－１細胞を、１０％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ、ＥＵ Ａｐｐｒｏｖｅｄ、Ｓｏｕｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）中で培養した。細胞を、標準的な条件（５％ＣＯ_２、３７℃）で培養した。

【0239】

抗体のクローニング、産生、および精製
施設内で生成したＴＮＦＲ２特異的抗体（Medler et al., 2019）の重鎖および軽鎖コードｃＤＮＡ断片を生成し、シーケンシングし、その後標準的なＰＣＲおよびクローニング技術を使用してｐＣＲ３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。抗体鎖のバリアント（突然変異体、融合タンパク質）を、目的のアミノ酸配列をコードする合成ＤＮＡ断片および標準的なクローニング技術を使用して生成した。ＴＮＦＲ２特異的抗体の発現プラスミドは典型的にＦＬＡＧ－タグを含有する。

【0240】

抗体および抗体バリアントを、例えばMedler and Wajant(2021)に記載されるように、トランスフェクション試薬ＰＥＩ（ポリエチレンイミン；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生させた。上清に分泌されたタンパク質の量を定量するために、施設内で産生したＦＬＡＧタグ付け標準タンパク質（抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）によるＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび抗ＦＬＡＧウェスタンブロッティングを実施した。

【0241】

産生されたＴＮＦＲ２特異的抗体を含有する上清を、抗ＦＬＡＧアガロースアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。ＦＬＡＧ－タグ付け抗体が抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティゲル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）に結合後、抗体を、過剰量のＦＬＡＧ－ペプチド（１００μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）を使用して溶出させ、分画を収集した。精製をＴＢＳ緩衝系で実施した。ＴＢＳをＰＢＳに対して交換するために、タンパク質をその後＋４℃で一晩透析した。

【0242】

非ＦＬＡＧタグ付け抗体を、プロテインＡクロマトグラフィーの後にサイズ除去クロマトグラフィーを介して精製した。精製したタンパク質／抗体の純度および濃度を、既知分子量のタンパク質の定義された量を含有するＡｍｅｒｓｈａｍ社の「ＳＤＳ電気泳動用低分子量較正キット」（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）と比較してＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび銀染色によって決定した。銀染色キットを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）から購入した。

【0243】

抗体フォーマット
図１は、ＴＮＦＲ２結合部位が、単一方向指向性Ｎ末端である抗体フォーマットを示し、各々の命名およびドメイン構造を示す。図面の様々な抗体フォーマットに関して与えられた名称で使用した略語は、ＣＩ＝クローン識別子、例えばＣ４、Ｃ１９等であり；Ｎ２９７Ａは、ＦｃγＲ相互作用を低減するヒトＩｇＧ１の重鎖における対応する突然変異を指し；Ｎ－ＲＧＹは、Ｎ２９７Ａ突然変異プラスＩｇＧ１六量体形成を促進する突然変異を指し；およびＴＮＣは、重鎖のＣ末端に存在して３個の個々の抗体を共に三量体型にするように作用するテナシン－Ｃ三量体形成ドメインペプチドを指す。抗体フォーマットおよび各々のＮ末端抗原結合数を以下の表に要約する。

【0244】

情報を要約する表

【0245】

【表1】

【0246】

図７は、ＴＮＦＲ２結合部位がＮ末端およびＣ末端の両方で組織化される抗体フォーマットを示し、各々に関する命名およびドメイン構造を示す。クローン識別子、Ｎ２９７Ａ改変の存在、およびテナシン三量体形成ペプチドの存在に関して同じ略語を図１と同様に使用する。

【0247】

【表2】

【0248】

以下の表３は、各抗体のポリペプチドを発現させるために使用した２つの発現ベクターを含む、図１～２６において言及され、その後の実施例で考察される結合分子を要約する。

【0249】

【表3-1】

【0250】

【表3-2】

【0251】

【表3-3】

【0252】

以下の表４は、上記の表３で言及した発現構築物によってコードされる軽鎖および重鎖ポリペプチドの配列番号を示す。

【0253】

【表4-1】

【0254】

【表4-2】

【0255】

【表4-3】

【0256】

以下の表５は、その軽鎖および重鎖可変領域ならびにＣＤＲ配列が以降の実施例で考察されるＶＨＨベースの抗体以外の本実施例で使用された様々な抗体フォーマットの抗原結合部位の開始点として使用した、特異的抗体クローンのＣＤＲ配列を提供する。影を付けた部分は、単に同じクローンからの軽鎖および重鎖ＣＤＲを示すのを助けるために含まれる。

【0257】

【表5-1】

【0258】

【表5-2】

【0259】

【表6】

【0260】

表７は、さらに関連するタンパク質の配列番号を提供する。

【0261】

【表7】

【0262】

【表8】

【0263】

【表9】

【0264】

【表10】

【0265】

ゲル濾過
精製抗体融合タンパク質（５０～２００μｇ）を、ＭａｂＰａｃ ＳＥＣ－１カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上でＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）および水性ＳＥＣ－１カラム性能チェック標準物質（＃ＡＬ０－３０４２、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用するゲル濾過によって、その天然の重量および潜在的タンパク質凝集に関して分析した。あるいは、ＧｒａｖｉｔｒａｐまたはＭＡｂＳｅｌｅｃｔカラムを使用した。

【0266】

細胞結合試験
ヒト、カニクイザル、およびマウスＴＮＦＲ２に対するＴＮＦＲ２標的化抗体の親和性（Ｋ_Ｄ値）を、細胞平衡結合試験によって評価した。したがってＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＰＥＩ法を使用して、ヒト、カニクイザル、またはマウスＴＮＦＲ２コード発現プラスミド、または空ベクター対照（ＥＶ）を一過性にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクタントのアリコートを、増加濃度の表記のＧｐＬ（ガウシア・プリンセプス（Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ）ルシフェラーゼ）－タグ付け抗ＴＮＦＲ２抗体によって処置し、標準的な細胞培養条件で１時間インキュベートした後、氷冷ＰＢＳによって２回洗浄した。細胞を、最終的に、０．５％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地５０μｌに再浮遊させ、黒色９６ウェルプレートに移した。細胞に関連するルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ；相対光単位）を、基質１．５μＭセレンテラジン（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の添加直後にＬＵｍｏルミノメーター（ａｎｔｈｏｓ Ｍｉｋｒｏｓｙｓｔｅｍｅ ＧｍｂＨ、Ｆｒｉｅｓｏｙｔｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって検出した。

【0267】

ＴＮＦＲ２特異的抗体および抗体バリアントの親和性をまた、ＨｅＬａ細胞およびヒトＴＮＦＲ２を安定に発現するＨｅＬａ細胞において評価した。ＨｅＬａおよびＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２細胞を、２４ウェルプレートに播種した。翌日、細胞に、表記の濃度のＧｐＬ標識ＴＮＦＲ２抗体を３７℃で１時間チャレンジした。非結合抗体を除去するために、細胞を、氷冷ＰＢＳによって１０回洗浄した。次に細胞を、掻き取り、培地（ＲＰＭＩ、０．５％ＦＣＳ）５０μｌ中に収集し、上記のように測定するために黒色９６ウェルプレートに移した。異なるＴＮＦＲ２特異的抗体／抗体バリアントの特異的結合は、非特異的結合（ＨｅＬａ細胞から得た値）を、総結合（ＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２から得た値）から減算することによって計算した。得られた値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５の非線形回帰分析選択肢を使用してフィットさせた。

【0268】

ＩＬ８誘導の解析
サイトカイン誘導は、ＴＮＦＲ２シグナル伝達に応答したＮＦκＢ活性化に関する十分に確立された読み出しである。本発明者らは、市販のＩＬ８ ＥＬＩＳＡキット（ＩＬ８ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ（商標）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）の助けを借りてＴＮＦＲ２刺激後のＩＬ８の量を測定することによってＮＦκＢ活性化の強度を分析した。

【0269】

強いＩＬ８誘導によるＴＮＦＲ２刺激に応答したＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、９６ウェルプレート（細胞２０．０００個／ウェル）に播種した。翌日、細胞を目的のＴＮＦＲ２標的化試薬および陽性対照としての非常に強力なＴＮＦＲ２選択的ＴＮＦバリアントであるオリゴマー形成ＴＮＦ８０（＝ＴＮＣ－ｓｃ（ｍｕ）ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ））（Chopra et al., 2015）によって刺激した。一晩インキュベーション後、上清５０μｌをＢＤ ＯｐｔＥＩＡ（商標）ＩＬ８ ＥＬＩＳＡキットの助けを借りて、製造元のマニュアルに記載されるように分析した。

【0270】

生存率アッセイ
ＴＮＦＲ２は、生存タンパク質（ＴＲＡＦ２、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２）の阻害、および同時のＴＮＦ誘発ＴＮＦＲ１の上方調節によって、一部の細胞株／細胞タイプにおいて細胞死を誘導することができる。このタイプの応答は中でも、Ｋｙｍ－１細胞（Schneider et al., 1999）において実証されている。ＴＮＦＲ２標的化構築物が、このＴＮＦＲ２応答を誘発できるか否かを試験するために、Ｋｙｍ－１細胞を、９６ウェルプレート（細胞２０．０００個／ウェル）に播種し、翌日、目的のＴＮＦＲ２標的化試薬によって刺激した。完全な細胞殺滅を定義するために、細胞のアリコートをまた、「細胞死」対照混合物（（２００ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ、２００ｎｇ／ｍｌ ＴＲＡＩＬ、２００ｎｇ／ｍｌ ＣＤ９５Ｌ、２５μｇ／ｍｌ ＣＨＸ、１％（重量／体積）アジ化ナトリウム））によって処置した。残存するプラスチック付着細胞を最終的にクリスタルバイオレット溶液７０μｌによって染色した。２０分後、プレートをｄＨ_２０によって１回洗浄し、風乾させた。メタノールに溶解後、５９５ｎｍでのＯＤをＰＨＯｍｏ光度計（ａｎｔｈｏｓ Ｍｉｋｒｏｓｙｓｔｅｍｅ ＧｍｂＨ、Ｆｒｉｅｓｏｙｔｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって測定し、生存率を定量した。値を、無処置細胞（１００％生存率）および細胞傷害剤混合物によって処置した細胞（０％生存率）に従って正規化した。

【0271】

非古典的ＮＦκＢ経路の活性化
ｐ１００のｐ５２へのプロセシングは、非古典的ＮＦκＢ経路の活性の主な特徴である。抗ＴＮＦＲ２抗体がｐ１００のプロセシングを誘導する能力を評価するために、Ｋｙｍ－１細胞１×１０^６個を、６ウェル組織培養プレートの各ウェルに播種した。翌日、細胞を、目的のＴＮＦＲ２標的化試薬によって刺激した。標準的な細胞培養条件で一晩インキュベーション後、総細胞溶解物を調製した（ＰＢＳによる１回の洗浄、ＰＢＳ １ｍｌ中に細胞を掻き取り、遠心分離（２分間、１２０００ｒｐｍ）し、細胞沈降物を４×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で溶解し、最大振幅で２５秒間超音波処理し（ＵＰ１００Ｈ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、９５℃で５分間加熱し、遠心分離（２分間、１２０００ｒｐｍ）によってデブリを除去した）。ｐ１００プロセシングを評価するために、標準的な技術および標準的な装置によるウェスタンブロッティングを、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の抗ｐ１００／ｐ５２抗体を使用して実施した。

【0272】

材料および方法の参考文献

【0273】

【表11】

【0274】

［実施例２］
平行に組織化された（単一方向指向性）Ｎ末端ＴＮＦＲ２結合部位を有する抗ＴＮＦＲ２抗体Ｃ４のバリアントのウェスタンブロット分析
単一方向指向性（平行に組織化された）Ｎ末端ＴＮＦＲ２結合部位を有する抗ＴＮＦＲ２抗体Ｃ４のＦｌａｇタグ付けバリアントを、実施例１に記載するようにＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させた。評価した抗体フォーマットは、図１に示されるフォーマットであり、使用した特異的抗体は、クローン４ ＴＮＦＲ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域を有し、図面で示される「クローン識別子」は「Ｃ４」である。様々なＣ４構築物の各々の鎖（ＨＣ、ＬＣ）をコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトした。抗体バリアント含有上清を、様々な量の既知濃度の抗体標準物質と共に、ＷＢによって分析し、上清中の抗体バリアントの濃度を、標準的な抗体シグナルから結論した。各抗体バリアント２００ｎｇを含有する上清の体積を、再度、抗ヒトＩｇＧおよび抗Ｆｌａｇ抗体によるウェスタンブロッティングに供した。得られた結果を図２に示し、抗体フォーマットの全てが、細胞から回収した上清中に首尾よく発現され、見出された。

【0275】

［実施例３］
単一方向指向性（平行に組織化された）Ｎ末端ＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ４バリアントによる処置後のＴＮＦＲ２媒介ＩＬ８産生
単一方向指向性（平行に組織化された）Ｎ末端ＴＮＦＲ２結合部位を有する抗体バリアントの能力を、ＴＮＦＲ２に対して特異的な元のクローン４抗体からの重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体バリアントを使用して評価した。この場合も、バリアントの構造は図１に示す構造であるが、「クローン識別子」は抗原結合部位の起源を示すＣ４である。陽性対照は、ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）の非常に活性なオリゴマー型を使用して実施した。

【0276】

評価を実施するために、ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、図３に示した様々なＣ４構築物の濃度を含有する上清によって刺激した。翌日、上清を採取し、そのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。得られた結果を図３に示す。誘導された最大応答は、陽性対照として含められた高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）によって得られ、結果を、グラフにおいて点線で示す。

【0277】

図３から認められ得るように、アッセイにおいて最も活性な抗体バリアントは、複数の単一方向指向性（平行）に組織化されたＮ末端ＴＮＦＲ２結合部位を有するバリアントであった。最低レベルのＩＬ－８産生が、２つまたはそれより少ないＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ４－Ｆａｂ、Ｃ４－Ｆａｂ２、およびＣ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）バリアントについて認められた。

【0278】

［実施例４］
単一方向指向性（平行に組織化された）Ｎ末端ＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ４バリアントによる処置後のＫｙｍ－１細胞におけるＴＮＦＲ２媒介細胞死
次に、Ｎ末端ＴＮＦＲ２結合部位を有する抗体フォーマットがＫｙｍ－１細胞において細胞死を誘発する能力を、再度、ＴＮＦＲ２に対する特異性を付与するクローン４軽鎖および重鎖可変領域を使用して評価した。得られた結果を図４に示し、使用した略語は再度、「Ｃ４」の使用が抗原結合部位の起源を意味することを除き、図１からの略語である。

【0279】

Ｋｙｍ－１細胞を、図４に示される様々なＣ４構築物の濃度を含有する上清によって刺激した。翌日、細胞生存率を、クリスタルバイオレット染色を使用して決定した。得られた結果を、図４に示す。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）を再度、ＴＮＦＲ２エンゲージメントの陽性対照とした。アポトーシスの誘導において最も有効な抗体バリアントは、ｓｃＦｖ：Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）およびｓｃＦｖ：Ｃ４－ＩｇＧ１－（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ＴＮＣバリアントであり、その結果を図４の中央のパネルに示す。クローンＣ１９、Ｃ２７、およびＣ４０からの結合部位に基づく結合分子の結果を図６に示す。

【0280】

［実施例５］
単一方向指向性（平行）に組織化されたＮ末端ＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ４バリアントによる処置後のＫｙｍ－１細胞におけるＴＮＦＲ２媒介ｐ１００プロセシング
単一方向指向性（平行）に組織化されたＮ末端ＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ４バリアントが、ｐ１００のｐ５２へのプロセシングを誘発する、したがってＴＮＦＲ２を通してシグナル伝達の誘発を示す能力を評価した。Ｋｙｍ－１細胞を、図５に示す様々なＣ４バリアントの濃度を含有する上清によって一晩刺激した。使用したバリアントの構造を図１に示し、「Ｃ４」は、「クローン識別子」を意味する。処置は、ＴＮＦＲ２誘導細胞死を防止するために２０μＭ ＺＶＡＤの存在下で実施した。マウスＴＮＦの九量体ＴＮＦＲ２特異的突然変異体（ｏｌｉｇｏ ＴＮＦ８０）を、陽性対照として使用した。ウェスタンブロッティングを、表記のタンパク質、ｐ１００、ｐ５２、および対照としてのβ－アクチンに対して特異的な抗体を使用して実施した。得られた結果を図５に示す。

【0281】

［実施例６］
Ｎ末端およびＣ末端組織化ＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ４バリアントのウェスタンブロット分析
単一方向指向性（平行に組織化された）Ｎ末端ＴＮＦＲ２結合部位を有する抗体バリアントに関して実施例２に記載した実験をまた、Ｎ末端およびＣ末端ＴＮＦＲ２結合部位の両方を有する図７に表されるＣ４抗体バリアントについても実施した。バリアントは、Ｆｌａｇタグを含有しないＣ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４バリアントの重鎖を除き、重鎖および軽鎖においてＦＬＡＧタグを含んだ。

【0282】

各Ｃ４構築物を、細胞にトランスフェクトし、抗体バリアントを、細胞の上清から精製した。各抗体バリアント２００ｎｇを、ウェスタンブロッティングに使用した。Ｆｌａｇタグ付けバリアントを含有する上清を、抗ヒトＩｇＧおよび抗Ｆｌａｇ抗体によるウェスタンブロッティングによって分析した。得られた結果を図８に示し、抗体フォーマットは全て、細胞から回収した上清において首尾よく発現され、見出された。

【0283】

［実施例７］
Ｎ末端およびＣ末端組織化ＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ４構築物による処置後のＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞におけるＴＮＦＲ２媒介ＩＬ８産生
実施例３に記載した実験と等価の実験を、図７に示すＮ末端およびＣ末端組織化ＴＮＦＲ２結合部位の両方を有するＣ４バリアントについても実施した。比較を提供するために、Ｎ末端ＴＮＦＲ２結合部位のみを有する複数の抗体バリアントをまた、Ｎ末端およびＣ末端ＴＮＦＲ２結合部位の両方を有するバリアントと並べて試験した。

【0284】

ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、図９に示される様々なＣ４構築物の濃度を含有する上清によって刺激した。翌日、上清を採取し、そのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。得られた結果を図９に示す。示されるデータは、並列処理した実験に由来するが、よりよい解像度のために３つのダイアグラムで示す。陽性対照（高活性オリゴマー型のＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ））によって誘導された最大応答を点線で示す。

【0285】

図９に示したように、Ｎ末端およびＣ末端ＴＮＦＲ２結合部位の両方を有する抗体バリアントは、最も陽性の結果を生じる傾向があったが、価数もまた影響を及ぼした。例えば、中央のパネルにおける結果は、そのような抗体フォーマットが、Ｎ末端のみのＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）バリアントより高レベルのＩＬ８産生を誘発することを示している。

【0286】

［実施例８］
Ｎ末端およびＣ末端組織化ＴＮＦＲ２結合部位を有するＣ４構築物による処置後のＫｙｍ－１細胞におけるＴＮＦＲ２媒介細胞死
実施例４で実施した実験と等価の実験をまた、抗体がＮ末端およびＣ末端ＴＮＦＲ２結合部位の両方を有するＣ４抗体バリアントについても行った。Ｋｙｍ－１細胞を、図１０に示す様々なＣ４構築物の濃度を含有する上清によって刺激した。翌日、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイを使用して決定した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）を、陽性対照として使用した。得られた結果を図１０に示す。

【0287】

［実施例９］
ヒトＴＮＦＲ２を発現するＨｅＬａ細胞に対するＴＮＦＲ２特異的抗体の結合特性
様々なクローンに由来する複数のＴＮＦＲ２特異的抗体の結合特性を、ＴＮＦＲ２を発現するＨｅｌａ細胞を使用して評価した。ＴＮＦＲ２を発現する細胞に対する抗ＴＮＦＲ２抗体ＧｐＬ融合タンパク質の平衡結合を３７℃で評価し、得られた結果を図１１Ａに示した。特異的、非特異的、および総結合レベルを各抗体について示す。第１のグラフは、ＴＮＦＲ２に対する結合に関するＧｐＬ－Ｆｌａｇ－ＴＮＦｗｔ陽性対照の結果を示す。

【0288】

さらなる実験を、ＧｐＬ標識抗体ではなくてＧｐＬ標識ＴＮＦを使用して実施した。ＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の量の抗ＴＮＦＲ２抗体によって前処置したか、または無処置のままとした。５ｎｇ／ｍｌ ＧｐＬ－ＴＮＦを添加し、３７℃で１時間インキュベーション後に結合を測定した。次に、非トランスフェクトＨｅＬａ細胞に対する結合を分析して、非特異的結合値を得た。得られた結果を、図１１Ｂに示す。

【0289】

［実施例１０］
αＴＮＦＲ２抗体の競合
ＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２細胞を、図１２に示すように抗ＴＮＦＲ２抗体３～１０μｇによって前処置したか、または無処置のままとした。５０ｎｇ／ｍｌの様々なαＴＮＦＲ２－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＬＣ：ＧｐＬバリアントを添加し、実施例１の材料および方法において考察されるように、結合を１時間後に測定した。得られた結果を図１２に示す。

【0290】

［実施例１１］
４価ｍＡｂ占有ＴＮＦＲ２分子は、従来の２価ｍＡｂバリアントによって占有されるＴＮＦＲ２分子よりかなり強いＩＬ８誘導を誘発する
ＴＮＦＲ２陰性Ｈｅｌａ細胞およびＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２細胞を対にして、２価型および４価型のＴＮＦＲ２特異的ｍＡｂ Ｃ４（スキームの挿入図を参照されたい）のＧｐＬ融合タンパク質の図１３の（Ａ）および（Ｂ）で示される濃度によって８時間刺激した。次に、ＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２の上清を、ＴＮＦＲ２誘導ＩＬ８産生に関して分析し、結果を（Ｂ）に示す。繰り返し洗浄した細胞（ＨｅＬａ、およびＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２）を、細胞関連ＧｐＬ活性に関して分析した。ＴＮＦＲ２に対する特異的結合を、ＨｅＬａ細胞から得られた非特異的結合値をＨｅＬａ－ＴＮＦＲ２細胞に由来する総結合値から減算することによって計算し、得られた結果を（Ａ）に示す。ルシフェラーゼ活性を、ＧｐＬレポータードメインの数の、２つのｍＡｂバリアント内のＴＮＦＲ２結合ドメインの数に対する比（１対０．５）に従って正規化したことに注意されたい。

【0291】

ｍＡｂバリアントによるＩＬ８産生を、その特異的結合の関数として直接プロットした。後者を、アッセイ中の細胞数およびＧｐＬ構築物の測定された比活性（ＲＬＵ／分子）の助けを借りて「占有受容体／細胞」に変換した。結果を（Ｃ）に示す。Ａから得られた２つの構築物の最大結合を、破線の垂直線で示す。点線は、受容体占有度の関数としてのＩＬ８産生の線形回帰を示す。

【0292】

［実施例１２］
ヒトＴＮＦＲ２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するＴＮＦＲ２特異的抗体の結合特性
異なるクローンからの抗ＴＮＦＲ２抗体の結合特性を評価した。ＨＥＫ２９３細胞に、ヒト、マウス、およびカニクイザルＴＮＦＲ２または空ベクターを一過性にトランスフェクトした。次に、表記の抗ＴＮＦＲ２抗体ＧｐＬ融合タンパク質の平衡結合を、３７℃で決定した。空ベクターをトランスフェクトした細胞に対する結合を決定して、非特異的結合値を得た。得られた結果を、図１４に示す。ヒト、マウス、およびカニクイザルＴＮＦＲ２の３個全てに特異的に結合する抗体は、Ｃ１９－ＩｇＧ１－ＬＣ－ＧｐＬ抗体であった。Ｃ４－ＩｇＧ１－ＬＣ－ＧｐＬ抗体は、ヒトＴＮＦＲ２に結合したが、サルまたはマウスＴＮＦＲ２に結合しなかった。Ｃ４０－ＩｇＧ１－ＬＣ－ＧｐＬ抗体は、ヒトおよびサルＴＮＦＲ２に結合したが、マウスＴＮＦＲ２には結合しなかった。

【0293】

図１５は、ＴＮＦＲ２のドメイン構造を示し、抗ＴＮＦＲ２抗体Ｃ４、Ｃ１９、Ｃ２７、およびＣ４０、およびそれに由来する４価ＣＩ－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣＩバリアントによって認識される細胞外ＴＮＦＲ２部分を示す。

【0294】

加えて、抗ＴＮＦＲ２ ＶＨＨであるＶＨＨ：Ｃ１８、ＶＨＨ：Ｃ７４、ＶＨＨ：Ｃ１８８、およびＶＨＨ：Ｃ２３８クローン、ならびにそれに由来する構築物によるＴＮＦＲ２の細胞外部分の認識を、図３５に基づいて概略図で表す。

【0295】

［実施例１３］
単特異性および二特異性ＴＮＦＲ２特異的ＣＩ－ＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖＣＩバリアントのウェスタンブロット分析
複数の異なる抗体バリアントを発現させ、実施例２および６で使用されるアプローチと等価の方法でウェスタンブロッティングによって分析した。分析した１１個のバリアントは、異なるクローンからのＴＮＦＲ２結合部位、異なる重鎖改変を有し、それらの多くが、Ｃ末端ＴＮＦＲ２結合部位を同様に有し、試験されたバリアントを図１６に示した。バリアントを、実施例２および６に記載される等価の方法で発現させ、分析した。

【0296】

図１６の上のパネルは、抗体がそれによって標識されたＦＬＡＧタグに対する抗ＦＬＡＧ抗体のブロッティングの結果を示す。ｉ）Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）、Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４、およびＣ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ１９の重鎖が、Ｆｌａｇタグを含有しないこと；およびｉｉ）使用した従来のＣ１９バリアントが、マウスＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）アイソフォームであったことに注意されたい。図１６の下のパネルは、抗ｈＩｇＧによるウェスタンブロットの結果を示す。

【0297】

［実施例１４］
ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞におけるＴＮＦＲ２媒介ＩＬ８産生
抗ＴＮＦＲ２抗体がＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞においてＩＬ８産生を刺激する能力の分析を、実施例３および７と等価の方法で実施した。複数の単特異的抗体バリアント、ならびにＴＮＦＲ２に対して２つの異なる特異性を有する複数の二特異性抗体を評価した。評価を実施するために、ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、図１７に示される様々な構築物の濃度を含有する上清によって刺激した。翌日、上清を採取し、そのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。得られた結果を図１７に示し、上のパネルは、単特異性抗体の結果を示し、下のパネルは、二特異性抗体の結果を示す。

【0298】

上のパネルは、各々の例において、Ｎ末端およびＣ末端ＴＮＦＲ２結合部位の両方を有する抗体バリアントが、Ｎ末端のＴＮＦＲ２結合部位のみを有する対応する抗体バリアントより高レベルのＴＮＦ産生を刺激したことを示している。Ｃ４０－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４０結合分子の結果は、上のパネルに示した結果において特に陽性であった。

【0299】

［実施例１５］
単特異性および二特異性ＴＮＦＲ２特異的ＣＩ－ＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖＣＩバリアントによる処置後のＫｙｍ－１細胞におけるＴＮＦＲ２媒介細胞死
単特異性および二特異性抗体が、細胞死を誘導する能力を、実施例４および８で使用したアプローチと等価の方法で評価した。Ｋｙｍ－１細胞を、図１８に示す様々なＣ４構築物の濃度を含有する上清によって刺激した。翌日、細胞生存率を、クリスタルバイオレット染色を使用して決定した。得られた結果を図１８に示す。単特異性抗体の結果を上のパネルに示し、バイパラトピック抗体の結果を下のパネルに示す。

【0300】

［実施例１６］
単特異性および二特異性ＴＮＦＲ２特異的ＣＩ－ＩｇＧ－ＨＣ：ｓｃＦｖＣＩバリアントによる処置後のＫｙｍ－１細胞におけるＴＮＦＲ２媒介ｐ１００プロセシング
単特異性および二特異性抗体が、ＴＮＦＲ２を通してシグナル伝達をもたらす能力を、実施例５および９と等価の方法でｐ１００プロセシングを調べることによって評価した。Ｋｙｍ－１細胞を、図１９に示す様々なＣ４バリアントの濃度を含有する上清によって一晩刺激した。処置は、ＴＮＦＲ２誘導細胞死を防止するために、２０μＭ ＺＶＡＤの存在下で実施した。マウスＴＮＦの九量体ＴＮＦＲ２特異的突然変異体（ｏｌｉｇｏ．ＴＮＦ８０）を陽性対照として使用した。表記のタンパク質、ｐ１００、ｐ５２、および対照としてのβ－アクチンに対して特異的な抗体を使用してウェスタンブロッティングを実施した。得られた結果を図１９に示す。

【0301】

［実施例１７］
Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４、Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＬＣ：ｓｃＦｖＣ４、およびＣ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＬＣ：ｓｃＦｖＣ４－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４の精製および機能解析
図２０に示した構築物を、実施例１で考察したおよび先の実施例で使用した方法を使用して評価した。得られた結果を図２０に示す。（Ａ）銀染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル。（Ｂ）ゲル濾過分析。（Ｃ）ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞におけるＩＬ８誘導。（Ｄ）Ｋｙｍ－１細胞における細胞死誘導。（Ｅ）Ｋｙｍ－１細胞におけるｐ１００プロセシングの誘導。細胞死を防止するためにＺＶＡＤを添加した。

【0302】

［実施例１８］
活性
以下の表７は、実施例１の材料および方法の節に記載したように産生した先の実施例で使用した様々な抗体フォーマットの活性を要約する。評価した抗体フォーマットは、Ｃ４クローンに由来する抗原結合部位を有するフォーマットであり、表における「Ｂｓ」は、抗体の「ノース」および「サウス」抗原結合部位の数を示す。表は、ＩＬ－８アッセイにおいて認められた活性を要約する（活性Ｉ－古典的ＮＦκＢ経路＞ＩＬ８）または活性ＩＩ（ＴＲＡＦ２枯渇＞非古典的ＮＦκＢ経路（＝ｐ１００プロセシング）およびＫｙｍ－１殺滅））

【0303】

【表12】

【0304】

［実施例１９］
Ｔｒｅｇ増大のエクスビボ評価
特定のＴＮＦＲ２結合分子が制御性Ｔ細胞を増大させる能力を評価した。Ｆａｂ－ＨＣ－ｓｃＦｖフォーマットの４価抗体は、Ｆｃ領域の重鎖が、Ｆｃ機能を除去するためのＮ２９７Ａアミノ酸突然変異、およびＩｇＧ１ Ｆａｂの基本Ｆａｂを有した。ＰＢＭＣを、４人のドナーから単離し、各ドナーからの細胞を個別に評価した。ＰＢＭＣを、細胞１０^７個／ｍｌの密度で２日間培養した。次にＰＢＭＣを採取し、マルチウェルプレートに細胞１０^６個／ｍｌの密度、細胞５００，０００個／ウェルで播種した。細胞を、（ａ）無処置対照細胞；（ｂ）１００ｎｇ／ｍｌ ＳＴＡＲ２アゴニスト分子によって処置した細胞；（ｃ）１つのみの特異性を有する４価抗体（１０００～０．３ｎｇ／ｍｌ）によって処置した細胞；および（ｄ）ＴＮＦＲ２に関して２つの特異性を有する４価抗体（１０００～０．３ｎｇ／ｍｌ）によって処置した細胞に細分した。４日間培養後、細胞の生存率を評価した。細胞を、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３に対して特異的な抗体によって染色した。次に、細胞を、フローサイトメトリーを介して評価した。図２１は、Ｔｒｅｇ細胞およびその増大を測定するための、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞中のＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋細胞に関して上のパネルで得られた結果を示す。図２１の下のパネルは、Ｔｃｏｎ細胞を測定するためのＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞中のＦｏｘｐ３－細胞を示す。いずれも、４日間インキュベーション前の細胞数と比較したパーセンテージ変化を示す。

【0305】

［実施例２０］
インビボＴｒｅｇ増大
提供されたＴＮＦＲ２アゴニストが、Ｔｒｅｇ細胞を増大させる能力をまた、同系ＦｏｘＰ３－Ｌｕｃｉマウスを使用して評価した。ＦｏｘＰ３－Ｌｕｃｉマウスは、ＦｏｘＰ３とルシフェラーゼの融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスである。このことは有効に、Ｔｒｅｇ細胞の部位をインビボでイメージングすることが可能であることを意味する。マウスに、ＴＮＦＲ２アゴニストを投与し、毎日生物発光イメージングを行った。４日後、マウスを屠殺し、マウスの脾臓から単離した細胞についてエクスビボ分析を実施し、フローサイトメトリーを使用してＦｏｘｐ３、ＣＤ３、およびＣＤ４を評価した。実験のタイムラインを図２２の上のパネル（Ａ）に要約する。エクスビボ分析の結果を図２２の下のパネル（Ｂ）に示す。実験を、図２３に示すように処置群に関して複数のマウスについて繰り返した。

【0306】

［実施例２１］
ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ構築物の産生および解析
図２４のパート（Ａ）に示すＴＮＦ－アルファベースの分子を生成した。分子は全て、ＴＮＦＲ１結合を失い、このようにＴＮＦＲ２に対して特異的であるＴＮＦ－アルファの突然変異型を表すＴＮＦ８０分子を含んだ。パート（Ａ）の左から右に示した構造は、以下である：
－ Ｆｃ－ＴＮＣ－ＴＮＦ８０－各ポリペプチドのＣ末端領域がテナシンペプチド（ＴＮＣ）の後に単一のＴＮＦ８０配列（ＴＮＦ８０は、ＴＮＦＲ２特異的突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）に対応する）を含む３個のＦｃ領域を含む。テナシンペプチドは、三量体を形成し、次に、このことは突然変異体ＴＮＦ－アルファの２つの三量体が存在することを意味する。
－ Ｆｃ－ＴＮＦ８０－各ポリペプチドのＣ末端領域が単一のＴＮＦ８０配列を含む３個のＦｃ領域を含み、これによって突然変異体ＴＮＦ－アルファの２つの三量体が分子に存在することをもたらす。
－ Ｆｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＣ－ＴＮＦ８０－重鎖改変Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ａ（ＤＡＮＡ）を有するＦｃ－ＴＮＣ－ＴＮＦ８０に対応する。
－ ＴＮＦ８０－三量体型の基本ＴＮＦ８０突然変異体に対応する。
－ ＴＮＣ－ｓｃＴＮＦ８０－３個のＴＮＦ８０突然変異体分子を含む一本鎖分子に対応し、鎖は、３個の一本鎖ポリペプチドの三量体形成をもたらすＴＮＣペプチドをさらに含む。

【0307】

上記の各々のマウス可溶性ＴＮＦ８０ベースの構築物を使用して、分子を発現させた。次に、構築物を、全ての構築物に含有されるＦｌａｇタグを利用する抗Ｆｌａｇアフィニティ精製によって精製した。次にそれらを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析し、得られた結果を図２４、パート（Ｂ）に示す。次に、図２４、パネル（Ｂ）に示す精製されたタンパク質のゲル濾過分析を実施して、得られた結果を図２４、パネル（Ｃ）に示す。ゲル濾過の結果は、発現された結合分子が凝集せず、均一なタンパク質種を表すことを示している。本実施例で使用した方法論は、上記の実施例１の材料および方法に記載されたとおりであった。

【0308】

［実施例２１］
可溶性マウスＴＮＦ８０の異なるフォーマットのアゴニスト活性
次に、実施例２０で考察した構築物が、ＴＮＦＲ２のアゴニストとして作用する能力を、Ｋｙｍ－１細胞を使用して評価して結合分子が細胞死を誘導する能力を決定し、ＨＴ１０８０－ＴＮＦＲ２細胞を使用して評価して結合分子がＩＬ－８放出を誘導する能力を決定した。実施例１の材料および方法で上記の方法論を使用した。得られた結果を図２５に示す。

【0309】

図２５の上のパネルは、表記の濃度の様々なｍｕＴＮＦ８０バリアントによって刺激したＴＮＦＲ２を発現するＫｙｍ－１細胞の結果を示し、次に、翌日にクリスタルバイオレット染色を使用して、構築物が細胞死を誘導する能力を決定するために評価した。認められ得るように、ＴＮＣ－ｓｃ（ｍｕ）ＴＮＦ８０結合分子は、細胞生存率の最大の低下を与え、次いでＦｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＣ－ＴＮＦ８０結合分子の順であった。

【0310】

図２５の下のパネルは、ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞の結果を示す。ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、図１に示す表記の濃度の様々なＴＮＦ８０バリアントによって刺激した。翌日、上清を採取し、そのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。示したデータは、４つの独立した実験に由来する。認められ得るように、基本のマウスＴＮＦ８０は、最低レベルのＩＬ８の誘導を与えたが、他の結合分子は、より高いレベルのＩＬ－８放出を刺激した。

【0311】

［実施例２２］
Ｆｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＣ－ｍｕＴＮＦ８０によるインビボＴｒｅｇ増大
ＴＮＦ８０を含む結合分子が、ＴＮＦＲ２のアゴニストとして作用する能力を示すために、次に、インビボ実験をＦｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＣ－ｍｕＴＮＦ８０結合分子を使用してマウスにおいて実施した。得られた結果を図２６に示す。Ｆｏｘｐ３プロモーターの制御下でルシフェラーゼを有するマウスに、表記の量のＦｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＣ－ｍｕＴＮＦ８０を１回ｉ．ｖ．注射し、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって毎日分析し、同様にＦＡＣＳ分析を使用して４日目にＴｒｅｇ頻度に関しても評価した。ＢＬＩ分析の結果を、図２６の上のパネルに示す。０日目および４日目のＢＬＩの写真を、図２６の中央のパネルに示す。４日目に実施したＦＡＣｓ分析の結果を、図２６の下のパネルに示す。

【0312】

［実施例２２］
ＴＮＦＲ２に関する特異的結合の実証
提供される結合分子がＴＮＦＲ２に結合するが、ＴＮＦＲ１には結合しない能力を例証する実験を実施した。ＨＥＫ２９３細胞に、（ｉ）ＴＮＦＲ２発現プラスミド；（ｉｉ）ＴＮＦＲ１の細胞外ドメインをＧＰＩアンカードメインと共にコードする発現プラスミド；または（ｉｉｉ）空ベクター（ｅｖ）を一過性にトランスフェクトした。翌日、ＧｐＬタグを有する様々な結合分子を、ＴＮＦＲ２に結合するがＴＮＦＲ１に有意に結合しないその能力に関して評価した。得られた結果を図２７に示す。図２７に示したタンパク質を、表記の濃度でＨＥＫ２９３細胞に添加した。３７℃で１時間インキュベーション後、ＰＢＳによって２回洗浄し、残存する細胞結合ＧｐＬ活性を決定した。ＧｐＬ－ＴＮＦを、両方のＴＮＦ受容体タイプに結合する陽性対照とした。

【0313】

［実施例２３］
公知の００５－Ｂ０８抗体の再フォーマッティング
公知の抗ＴＮＦＲ２抗体を「再フォーマット」して、それらを、本明細書に考察されるフォーマットにすることがＴＮＦＲ２に対して有用なアゴニストをもたらすことを例証するために、たとえ公知の抗体が抗ＴＮＦＲ２アンタゴニスト抗体である場合であっても、公知のＴＮＦＲ２アンタゴニストを、提供される４価フォーマットの一部へと再フォーマットした。国際公開第２０２０／０８９４７４号パンフレットに開示される００５－Ｂ０８抗体を、本明細書に記載されるフォーマットのいくつかへと再フォーマットした。したがって、全ての抗原結合部位が００５－Ｂ０８抗体を起源とするフォーマットＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖ、ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ＴＮＣ、およびＩｇＧ１（Ｎ－ＲＧＹ）の抗体を生成した。ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、抗体を含有する上清によって刺激した。翌日、上清を、アゴニスト活性の測定としてそのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。得られた結果を図２８にグラフで提示する。陽性対照としてのＣ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：Ｃ４によって誘導された最大応答をグラフにおいて点線で示す。元の００５－Ｂ０８抗体がＴＮＦＲ２のアンタゴニストである場合であっても、驚くべきことに、再フォーマットされた４価構築物は全て、良好なアゴニスト活性を示し、抗体フォーマットの影響を示している。

【0314】

［実施例２４］
４価フォーマットにおける様々なリンカーの長さおよびｓｃＦｖの位置
ｓｃＦｖ内のリンカーの長さの起こり得る影響および「サザン」ｓｃＦｖ基が軽鎖または重鎖のＣ末端に連結されるかを、図２９Ａに示す「ノース」および「サウス」抗体構造に関して試験した。異なる抗体バリアントは、ｓｃＦｖの可変重鎖および軽鎖を連結させるリンカーの長さが異なり、基本のＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）リンカーの３個（（Ｇ４Ｓ）３）または４個（（Ｇ４Ｓ）４）の反復配列のいずれかが存在し、ならびにｓｃＦｖ基が抗体骨格軽鎖または重鎖に連結されたか否かが異なった。

【0315】

精製Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４（Ｇ４Ｓ）４およびＣ４－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）－ＬＣ：ｓｃＦｖＣ４（Ｇ４Ｓ）のゲル濾過を実施し、得られた結果を図２９Ｂに示した。構築物がＴＮＦＲ２のアゴニスト作用を示す能力もまた、アゴニスト活性の測定としてＩＬ－８放出を使用して試験し、得られた結果を図２９Ｃに示す。それらの結果を得るために、ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の構築物をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの上清によって刺激した。翌日、上清を、そのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）陽性対照によって誘導された最大応答を点線で示す。４価構築物は、リンカーの長さおよびｓｃＦｖ基が重鎖または軽鎖に連結されたか否かによらず良好に作用し、提供された４価抗体フォーマットの強健な性質を例証している。

【0316】

［実施例２５］
Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）－ＨＣ／ＬＣ：ｓｃＦｖＣ４フォーマットにおけるＣ４バリアント配列の比較
Ｃ４可変領域のバリアントを、インシリコで生成し、配列をさらに最適化することを助けるために、ヒト化、脱免疫およびＰＴＭ不安定性の除去に関して配列を最適化した。Ｃ４バリアント配列をＣ４－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）－ＨＣ／ＬＣ：ｓｃＦｖＣ４フォーマットで使用した。タンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞を使用して産生し、プロテインＡおよびサイズ除去クロマトグラフィーを介して精製した。精製バリアントを、ゲル濾過クロマトグラフィー（結果を図３０、パネルＡに示す）およびＴＮＦＲ２アゴニスト活性の測定としてのＩＬ－８放出（結果を、図３０、パネルＢに示す）を使用して評価した。ＩＬ－８放出を測定するために、ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の構築物によって刺激した。親構築物Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４を比較のために含めた。翌日、上清をそのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）陽性対照によって誘導された最大応答を、点線で示す。図３０に示す結果から認められ得るように、Ｃ４バリアントは、ＩＬ－８アッセイにおいて非常に有効であった。

【0317】

［実施例２６］
ＶＨＨ抗体の生成および評価
ＴＮＦＲ２抗体を生成するためのさらなる選択肢を提供するために。ＶＨＨ発見キャンペーンを開始した。２つのＴＮＦＲ２標的タンパク質（ヒト－ＥＣＤ－ＦｃおよびマウスＥＣＤ－Ｆｌａｇ－Ｆｃ）および対照タンパク質を、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）ライブラリ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ ｌｉｂｒａｒｙ ＣａＶＨＨＬ－４）のファージディスプレイスクリーニングのために使用した。代替のバイオパニングを、両方の標的について４ラウンド実施し、特異的ＶＨＨを両方の標的について同定したが、対照Ｆｃタグに関する陰性結合体を除去した。ＤＮＡシーケンシングを、１５３個のクローンについて実施し、１４個の一意的陽性配列を同定した。

【0318】

クローン１４個中８個が、細胞表面上に発現されたヒトＴＮＦＲ２に対して特異的結合を実証した。ＶＨＨ抗体がＴＮＦＲ２に結合する能力を、存在する特異的ＶＨＨが各々異なるＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬ フォーマットタンパク質を使用して試験し、得られた結果を図３１に示す。ＧｐＬレポータードメインを、抗体のＦｃドメインのＣ末端にクローニングした。ＴＮＦＲ２特異的ＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬ ｓｄＡｂ構築物の平衡結合アッセイを、ヒトＴＮＦＲ２を発現する細胞を使用して３７℃で実施し、ＨＥＫ２９３細胞を、非トランスフェクト対照細胞として使用した。得られた結果を、図３１に示す。特異的結合（白丸）を、ヒトＴＮＦＲ２を発現するトランスフェクタントの結合値から非特異的結合値（Ｈｅｋ２９３細胞－クロス）を減算することによって得た（総結合－黒丸）。特異的結合を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアの「一部位特異的結合に対する非線形回帰曲線」関数によって分析した。図３１から認められ得るように、バリアントは、ＴＮＦＲ２に対して良好な特異的結合を示した。

【0319】

平衡実験はまた、異なる種からの、すなわちＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）、およびＣｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｓａｂａｅｕｓ（アフリカミドリザル）からのＴＮＦＲ２を使用して実施し、ＶＨＨ領域が異なる種からのＴＮＦＲ２に結合する能力を試験した。異なる種からのＴＮＦＲ２に交差反応する能力は、ヒト患者における評価の前に様々なモデルにおいて抗体を試験することを可能にするために役立ち得る。実験から得られた結果を、以下の表８に提示し、表における「ｎ．ｓ．ｂ．」は、特異的結合なしを示す。

【0320】

【表13】

【0321】

［実施例２７］
ＶＨＨ抗体ドメインを使用する６価抗体
結合親和性に及ぼす抗体フォーマットの影響を調べるために、次にＶＨＨドメイン抗体を使用して、複数のＶＨＨ抗体ドメインについて生成した３ｘＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬフォーマット抗体によって６価抗体を作製した。所定の６価抗体内のＶＨＨドメインは全て同じであった。次に、それらの抗体の平衡結合を、実施例２６と同じアプローチを使用して調べた。図３２は、ヒトＴＮＦＲ２を発現する細胞に対する表記のＴＮＦＲ２特異的３ｘＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬ ｓｄＡｂ構築物の３７℃での平衡結合の結果を示す。ＧｐＬレポータードメインは、ＦｃドメインのＣ末端にクローニングされている。得られた結果は、６価フォーマット抗体が高い親和性結合を示し、異なるＶＨＨの間のＫｄの変動が、図３１に示した二価抗体の結果と比較して一般的にかなり小さいことを際立って示した。６価および高次価数フォーマットにおける密接な空間的近位性で複数の結合部位を有する結果は、結合親和性に関して特異的（二価）ＶＨＨより重要であり得ると考えられ、６価フォーマットの強固な結合性質を例証している。

【0322】

［実施例２８］
ＴＮＦＲ２に対するＴＮＦαの結合を遮断する評価
ＶＨＨ：Ｃ１８、ＶＨＨ：Ｃ７４、ＶＨＨ：Ｃ１８８、またはＶＨＨ：Ｃ２３８ ＶＨＨドメインを結合部位として有するＶＨＨ－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）６価フォーマット抗体を、ＴＮＦＲ２に対するＴＮＦαの結合を遮断する能力に関して比較した。得られた結果を図３３に示す。ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の量のＴＮＦＲ２特異的ｓｄＡｂ構築物、またはＣＤ４０に対して特異的であるがＴＮＦＲ２に対しては特異的でない陰性対照としてのＣＤ４０特異的構築物３ｘＶＨＨ：ＣＤ４０（Ｖ１２ｔ）－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）によって前処置した。５ｎｇ／ｍｌのＧｐＬ－ＴＮＦを全ての試料に添加し、次いで３７℃で１時間のインキュベーション後に結合を測定した。図３３の左の棒グラフは、陽性対照、すなわち別の構築物の非存在下、したがってＴＮＦＲ２に対するＴＮＦαの１００％結合の結果を示す。次の棒グラフは、陰性対照の値のパーセンテージとして表記される活性を有する表記の構築物の結果を示す。６価抗体フォーマットのＶＨＨ：Ｃ１８、ＶＨＨ：Ｃ７４、ＶＨＨ：Ｃ１８８、およびＶＨＨ：Ｃ２３８の３ｘＶＨＨ－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）バリアントは全て、ＴＮＦＲ２受容体に対するＴＮＦの結合を強力に遮断する能力を示した。Ｖ１２ｔ ＣＤ４０－ＶＨＨは、“A Bispecific Antibody Antagonizes Prosurvival CD40 Signaling and Promotes Vg9Vd2 T cell-Mediated Antitumor Responses in Human B-cell Malignancies A. C Iris de Weerdt, Roeland Lameris, George L. Scheffer, Jana Vree, Renate de Boer, Anita G. Stam, Rieneke van de Ven, Mark-David Levin, Steven T. Pals, Rob C. Roovers, Paul W.H.I. Parren, Tanja D. de Gruijl, Arnon P. Kater, and Hans J. van der Vliet”に由来する。

【0323】

［実施例２９］
６価構築物がＴＮＦＲ２に特異的に結合するが、ＴＮＦＲ１には結合しない能力
ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２をコードする発現ベクターを一過性にトランスフェクトした後、様々な６価構築物の結合に関して分析し、得られた結果を図３４に示した。評価した６価構築物を図３４に示す。空ベクターをトランスフェクトした細胞に対する結合を、非特異的結合の陰性対照とした。ＴＮＦ－ＧｐＬを、ＴＮＦＲ１結合成功の陽性対照とした。ＴＮＦＲ１結合に関する左側のグラフの結果を、ＴＮＦＲ２結合に関する右側の対応するグラフと比較することによって、６価構築物が全て、ＴＮＦＲ１と比較してＴＮＦＲ２に対して特異的結合を示し、ＴＮＦＲ２に対する選択的標的化を可能にし得ることが認められ得る。

【0324】

［実施例３０］
ＶＨＨ：Ｃ１８、ＶＨＨ：Ｃ１８８、およびＶＨＨ：Ｃ２３８は、ＴＮＦＲ２のＣＲＤ４に結合し、ＶＨＨ：Ｃ７４は、ＣＲＤ３に結合する
黒色９６ウェルプレートを、プロテインＧによってコーティングした後、表記のＴＮＦＲ２特異的ＶＨＨの３ｘＶＨＨ－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）型をロードした。非結合タンパク質の除去後、固定した抗体構築物を、ＴＮＦＲ２（ｅｄ）のＧｐＬタグ付け欠失突然変異体の結合に関して分析し、右のパネルのウェスタンブロットに示した。最後に、これらのＧｐＬ融合タンパク質の結合を、図３５に示すように定量した。異なるＣＲＤドメインに対するＶＨＨクローンの結合を、図１５に概略図で表す。

【0325】

［実施例３１］
４価Ｎ末端のみのＶＨＨベースの構築物は、強力なＴＮＦＲ２アゴニストである
次に、４価の「ノースのみ」のＴＮＦＲ２特異的ｓｄＡｂバリアントがＴＮＦＲ２アゴニストとして作用する能力を調べ、得られた結果を図３６に示す。ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記のモノまたはバイパラトピック構築物を含有する上清によって刺激した。翌日、上清を、そのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）（上のパネル）またはＣ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：Ｃ４（中央および下のパネル）によって誘導された最大応答を陽性対照とし、点線で示す。４価の「ノース」のみの構築物は、強力なアゴニストであった。

【0326】

［実施例３２］
６価Ｎ末端のみのＴＮＦＲ２特異的ｓｄＡｂバリアントは、強力なＴＮＦＲ２アゴニストである
次に、６価の「ノースのみ」のＶＨＨ抗体がＴＮＦＲ２アゴニストとして作用する能力を、マーカーとしてＩＬ－８放出および細胞生存率の両方を使用して調べた。得られた結果を、図３７に示す。パネル（Ａ）に示した結果に関して、ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の構築物によって刺激した。翌日、上清を、そのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）陽性対照によって誘導された最大応答を、陽性対照として点線で示す。パネル（Ｂ）に示した結果に関して、Ｋｙｍ－１細胞を、様々な６価バリアントによって刺激し、翌日、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイを使用して決定した。２００ｎｇ／ｍｌ高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）によって誘導された最大殺滅を、再度点線で示す。このアッセイは、ＩＬ－８放出を測定することによって評価される経路とは個別の経路を介して、ＴＮＦＲ２活性化およびシグナル伝達を測定する。全体として、結果は、６価の「ノースのみ」フォーマットが、ＶＨＨドメインによって強力なＴＮＦＲ２活性を示すことを示している。

【0327】

［実施例３３］
ＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ、２ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ－ＧｐＬ、および３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃのアゴニスト活性の並べた比較
同じＶＨＨドメインを使用する異なる抗体フォーマットの能力を比較した。各々がＣ１８８ ＶＨＨドメインを使用するＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ、２ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ－ＧｐＬ、および３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃフォーマットを比較し、得られた結果を図３８に示す。図３８、パネル（Ａ）および（Ｂ）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ａ）およびゲル濾過（Ｂ）によって分析した精製タンパク質の結果を示す。パネル（Ｃ）は、ＩＬ－８放出の結果を示す。ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の構築物によって刺激した。翌日、上清を、そのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）陽性対照によって誘導された最大応答を点線で示す。パネル（Ｄ）は、表記の様々なＶＨＨ：Ｃ１８８バリアントによって刺激したＫｙｍ－１細胞における細胞生存率の結果を示す。刺激後、翌日、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイを使用して決定した。Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４によって誘導された最大殺滅を点線で示す。３個のフォーマットの中で最も強力なものは、６価３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ抗体フォーマットであり、ＩＬ－８放出の最大の刺激および細胞生存率の低減を示した。

【0328】

［実施例３４］
Ｃ１８およびＣ７４のＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬ、２ｘＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬ、および３ｘＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬバリアントのＩＬ８および細胞死誘導活性の並べた比較
同じＶＨＨ結合ドメインを有する異なる抗体フォーマットのさらなる比較を、Ｃ１８およびＣ７４のＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬ、２ｘＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬ、および３ｘＶＨＨ－Ｆｃ－ＧｐＬバリアントについて、先の実施例と同じＩＬ－８および細胞生存率アッセイを使用して実施した。得られた結果を図３９に示す。ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の構築物によって刺激した。パネル（Ａ）は、そのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した上清の結果を示す。パネル（Ｂ）は、Ｋｙｍ－１細胞を様々なバリアントによって刺激し、翌日、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイを使用して決定した細胞生存率アッセイの結果を示す。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）によって誘導された最大応答を示す。興味深いことに、６価フォーマットは、Ｃ１８バリアントの両方のアッセイにおいて最も活性であった。Ｃ７４の６価フォーマットは、ＩＬ－８放出を刺激するための最善のフォーマットであったが、いずれのフォーマットも細胞生存率の顕著な低下を誘発しなかった。このことは、Ｃ７４ ＶＨＨ抗体が、両方のＴＮＦＲ２媒介シグナル伝達経路を誘発せず、ＩＬ－８放出をもたらす経路におけるシグナル伝達を単に刺激すると考えられる。

【0329】

［実施例３５］
３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）バリアントのＶＨＨドメイン間のリンカーの長さはＴＮＦＲ２アゴニズムに影響を及ぼさない
次に、ＶＨＨドメインを進行性により長いリンカーによって分離する影響を、進行性に長いリンカーを使用して３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－ＩｇＧ１（Ｄｕｒｖ）抗体フォーマットについて調べた。比較した異なる抗体は、ＶＨＨドメインの間に単一のＧ４Ｓリンカー（ＧＳＳＳＳ）、ドメイン（Ｇ４Ｓ）３の間に３個のリンカー、またはドメイン（Ｇ４Ｓ）５の間に５個のリンカーを有した。得られた結果を、図４０に示す。パネル（Ａ）は、構築物のドメイン構造を示す。パネル（Ｂ）は、精製構築物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示し、パネル（Ｃ）は、ゲル濾過分析の結果を示す。パネル（Ｄ）は、ＩＬ－８放出アッセイの結果を示し、ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の構築物を含有する上清によって刺激した。翌日、上清を、そのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）によって誘導された最大応答を点線で示す。親分子３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）を、比較のために含めた。図４０から認められ得るように、パネル（Ｄ）は、全体的なリンカーの長さの増加が、ＩＬ－８放出によって測定した場合にＴＮＦＲ２アゴニズムに影響を及ぼさなかったことを示し、６価フォーマットの強固な性質をさらに例証している。

【0330】

［実施例３６］
２、３、４、６、または９個のＶＨＨ：Ｃ１８８ドメインを有する異なるドメイン構造の構築物は、強いＴＮＦＲ２アゴニズムを誘発する
異なる抗体フォーマットを、Ｃ１８８ ＶＨＨドメインを使用してさらに比較した。得られた結果を図４１に示す。パネル（Ａ）は、抗体のドメイン構造を示す。ＴＮＣは、テナシン－Ｃの三量体形成ドメインを指す。パネル（Ｂ）は、ＩＬ－８放出によって測定した場合のＴＮＦＲ２アゴニズム活性の結果を示す。ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の構築物によって刺激した。翌日、上清をそのＩＬ８含有量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）によって誘導された最大応答を点線で示す。少なくとも４つのＶＨＨドメインを有する構築物、特に少なくとも２つのＶＨＨドメインが同じポリペプチドに存在するそれらの抗体は一般的に、最もよい結果をもたらした。

【0331】

［実施例３７］
プロテインＧは、抗ＴＮＦＲ２ ｍＡｂ Ｃ４の配列最適化バリアントのアゴニスト活性を増強する
図４２に示されるように、プロテインＧの存在下で増強された活性は、Ｃ４バリアントＡｂに関して得られ、このことはモノクローナル抗体の多量体化によって実現することができる潜在的アゴニズムの存在を示している。（Ａ）表記の抗体バリアントの軽鎖および重鎖をコードする発現プラスミドを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清の抗ヒトＩｇＧ１抗体によるウェスタンブロット分析。（Ｂ）ＨＴ１０８０－ＴＮＦＲ２細胞に、５００ｎｇ／ｍｌプロテインＧの存在下および非存在下で表記の濃度のＣ４バリアントをチャレンジした。翌日、細胞上清を、ＩＬ８産生に関してＥＬＩＳＡによって分析した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）によって誘導された最大応答を点線で示す。

【0332】

［実施例３８］
３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（Ｄｕｒｖ）の配列最適化バリアントのＴＮＦＲ２アゴニズム
１５個のバリアントを、ヒト化、脱免疫、ＰＴＭ不安定性の除去に関して最適化した配列によってインシリコで生成した。１つのバリアント（バリアント１４）に関して、異なるＶＨＨ間で多様なリンカーの長さを有する構築物も作製した。図４３、パネル（Ａ）に示すように、全てのバリアント構築物が首尾よく産生された：表記の３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（Ｄｕｒｖ）バリアントをコードする発現プラスミドを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清の抗ヒトＩｇＧ１抗体によるウェスタンブロット解析。３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（Ｄｕｒｖ）フォーマットでは、全てのバリアントが、ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を表記の構築物を含有する上清によって刺激するＩＬ－８放出アッセイの結果を示すパネル（Ｂ）において認められ得るように、生物活性であった：ＨＴ１０８０－ＴＮＦＲ２細胞に、表記の濃度の３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（Ｄｕｒｖ）バリアント、および親３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）分子をチャレンジした。翌日、細胞上清をＩＬ８産生に関してＥＬＩＳＡによって分析した。高活性オリゴマー型ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ突然変異体ＴＮＦ（１４３Ｎ／１４５Ｒ）によって誘導された最大応答を点線で示す。

【0333】

［実施例３９］
ＴＮＦＲ２アゴニストは、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）内のＴｒｅｇを増大させる
特定のＴＮＦＲ２結合分子が制御性Ｔ細胞を増大する能力、および異なるＴＮＦＲ２結合部位が末梢血単核球細胞を増大させる能力を評価した。Ｆａｂ－ＨＣ－ｓｃＦｖフォーマットの４価抗体（Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４、Ｃ１９－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ１９、およびＣ４０－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４０）、および３ｘＶＨＨ－Ｆｃフォーマットの６価ＶＨＨ構築物（３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（Ｄｕｒｖ））について得られた結果を図４４に示し、増大に関するデータを図２１に示す。ＰＢＭＣを、状態あたり表記の数のドナーから単離し、各ドナーからの細胞を個別に評価した。ＰＢＭＣを、細胞１０^７個／ｍｌの密度で２日間培養した。次に、ＰＢＭＣを採取し、マルチウェルプレートに細胞１０^６個／ｍｌの密度、細胞５００，０００個／ウェルで播種した。４日間培養後、細胞を、フローサイトメトリー分析のために、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３に対して特異的な抗体によって染色した。図４４は、表記のＴＮＦＲ２アゴニストによる４日間の刺激後の同じドナーの無処置対照と比較したヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）のＴｒｅｇ頻度の倍率変化を示す。試料を、フローサイトメトリーによって測定し、Ｔｒｅｇを、ＦｏｘＰ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ３^＋ Ｔ細胞として定義した。個々のドナーの数をｎで示す。有意性を、仮説値１とする１群ｔ検定によって試験し、^＊Ｐ＝０．０５、^＊＊Ｐ＝０．０１、^＊＊＊Ｐ＝０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１によって示す。

【0334】

［実施例４０］
Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４はＴｒｅｇを活性化する
Ｃ４ ＴＮＦＲ２結合部位を有するＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖフォーマット抗体がＴｒｅｇを活性化する能力をさらに調べた。得られた結果を図４５に示す。ヒトＰＢＭＣを、１００ｎｇ／ｍｌ Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４によって４日間刺激し、Ｔｒｅｇ活性に関連するマーカーの発現をフローサイトメトリーによって測定した。同じドナーの無処置対照と比較した倍率変化発現を示す。Ｔｒｅｇは、ＦｏｘＰ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ３^＋Ｔ細胞として定義した。平均値±ＳＤおよび各ドットは個々のドナーを表す。

【0335】

［実施例４１］
３ｘＶＨＨＣ１８８（Ｇ４Ｓ）１－Ｆｃ（Ｄｕｒｖ）はＴｒｅｇを活性化する
ＶＨＨドメインを含む６価抗体フォーマットが、Ｔｒｅｇを活性化する能力を、３ｘＶＨＨＣ１８８（Ｇ４Ｓ）１－Ｆｃ（Ｄｕｒｖ）フォーマット抗体を使用して調べた。得られた結果を図４６に示す。ヒトＰＢＭＣを、表記の濃度の３ｘＶＨＨＣ１８８（Ｇ４Ｓ）１－Ｆｃ（Ｄｕｒｖ）によって４日間刺激し、Ｔｒｅｇ活性に関連するマーカーの発現をフローサイトメトリーによって測定した。同じドナーの無処置対照と比較した倍率変化発現を示す。Ｔｒｅｇは、ＦｏｘＰ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ３^＋Ｔ細胞として定義した。平均値±ＳＤおよび各ドットは個々のドナーを表す。

【0336】

［実施例４２］
ＴＮＦＲ２アゴニストは、インビトロでヒトＴＮＦＲ２発現ＣＤ４ Ｔ細胞を増大させる
ヒトＴＮＦＲ２ノックインマウスから得た濃縮されたＣＤ４ Ｔ細胞を、異なる濃度の（Ａ）Ｃ４－Ｃ４（Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４）または（Ｂ）３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）によって刺激し、それぞれのアゴニストによる培養４日後にＴｒｅｇ頻度が増加した。図４７のデータは、無処置（アイソタイプ対照）試料と比較したＣＤ２５^ｈｉｇｈＦｏｘＰ３^ｈｉｇｈＣＤ４ Ｔ細胞の増加の倍率変化として表す。

【0337】

［実施例４３］
Ｆｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＣ－ｍｕＴＮＦ８０の血清中での保持
次に、Ｆｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＣ－ｍｕＴＮＦ８０の血清中の保持を調べ、得られた結果を図４８に示す。０時間でＦｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＣ－ｍｕＴＮＦ８０またはアイソタイプ対照抗体７５μｇを注射した野生型マウスから所定の時点で末梢血から単離された血清によって刺激されたＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞培養の上清のＥＬＩＳＡによって測定したＩＬ８濃度。データを図４８に示す。

【0338】

［実施例４４］
リガンドベースのＴＮＦＲ２アゴニストは、インビボでＴｒｅｇを増大させ、活性化マーカーを上方調節する
次に、リガンドベースのＴＮＦＲ２アゴニストがインビボでＴｒｅｇを増大させ、活性化マーカーを上方調節する能力を調べ、得られた結果を図４９に示す。（Ａ）野生型マウスにおいてＦｃ（ＤＡＮＡ）－ＴＮＣ－ｍｕＴＮＦ８０ ７５μｇによる刺激後４日目に単離した脾臓中の生存細胞のＴｒｅｇ頻度。（Ｂ）Ｔｒｅｇに関して測定した平均蛍光強度（ＭＦＩ）として定義され、アイソタイプ対照抗体試料に対して正規化した選択された細胞外マーカーの倍率変化。データを図４９に示す。

【0339】

［実施例４５］
ＴＮＦＲ２アゴニストはインビボで脾臓Ｔｒｅｇを増加させる
Ｔｒｅｇ頻度を、３ｘＶＨＨ：Ｃ１８８－Ｆｃ（ＤＡＮＡ）、またはアイソタイプ対照抗体、またはＣ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖ：Ｃ４によるマウスの処置後４日目に単離したｈｕＴＮＦＲ２発現マウスからの脾臓において決定した。倍率変化を、同じ実験におけるアイソタイプ対照または無処置対照と比較して計算した。図５０に示されるように、ＴＮＦＲ２アゴニストは、インビボでヒトＴＮＦＲ２ ＫＩマウスの脾臓においてＴｒｅｇを増大させることができる。対応のないｔ検定を通しての処置群と対照群の間の平均値の比較。^＊ ｐ≦０．０５、ｎｓ＝なし。

【0340】

［実施例４６］
ＴＮＦＲ２アゴニストは同種造血細胞移植（アロ－ＨＣＴ）誘導急性移植片対宿主病後の生存を増加させる
移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）モデルにおけるＴＮＦＲ２アゴニストの影響を調べ、得られた結果を図５１に示す。パネル（Ａ）は、マウス（ＦＶＢ／Ｎ Ｈ－２^ｑ→Ｃ５７ＢＬ／６ Ｈ－２^ｂ、ＭＨＣ主要組織適合抗原ミスマッチモデル）におけるアロ－ＨＣＴ誘導実験的急性ＧｖＨＤ後の生存頻度を示す。それぞれのＴＮＦＲ２アゴニスト処置群と、アイソタイプ対照抗体の間の統計学的有意性を、ログランク検定によって評価した、^＊ ｐ≦０．０５。パネル（Ｂ）は、免疫細胞浸潤物および腸陰窩傷害に基づくアロ－ＨＣＴ後６日目に単離した腸試料の病理スコアを示す。

【0341】

［実施例４７］
ＴＮＦＲ２アゴニストは、アフリカミドリザル（ベルベットモンキー）末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）からのＴｒｅｇを増大させる
アフリカミドリザルの凍結末梢血単核球細胞を融解し、細胞２×１０^５個／ウェルで培養し、無処置のままとしたか、または１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬ Ｃ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－ＨＣ：ｓｃＦｖＣ４によって３７℃で５日間処置した。試料をフローサイトメトリーによって測定し、Ｔｒｅｇを、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ Ｔ細胞として特徴付けた。図５２に示すように、ＴＮＦＲ２アゴニスト処置は、アフリカミドリザルＰＢＭＣからのＴｒｅｇの用量依存的増大をもたらす。

【0342】

［実施例４８］
クローンＣ１８８およびＣ４は、ヒトＴＮＦＲ２に対する結合に関してＴＮＦと競合する
ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞を、表記の量のＴＮＦＲ２特異的ＶＨＨ構築物もしくは陰性対照としてのＣＤ２０特異的ｍＡｂリツキシマブによって前処置したか、または無処置のままとした。５ｎｇ／ｍｌ ＧｐＬ－ＴＮＦを添加し、３７℃で１時間インキュベーション後に結合を測定した。ＨＴ１０８０－Ｂｃｌ２－ＴＮＦＲ２細胞に対するＴＮＦ－ＧｐＬの結合量は、図３５、パネルＢに示されるように、Ｃ１８８－ＶＨＨ－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）ＶＨＨ－ＦｃフォーマットとしてのクローンＣ１８８およびＣ４－ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）抗体フォーマットとしてのクローンＣ４の存在下で排除される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【配列表】

2024511642000001.app

【国際調査報告】