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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-14
(54)【発明の名称】ウシ初乳由来抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/04 20060101AFI20240307BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240307BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240307BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240307BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20240307BHJP
C07K 16/10 20060101ALN20240307BHJP
【ＦＩ】
C07K16/04 ZNA
A61P31/12
A61K39/395 Y
A61P31/14
A61K39/215
A61K39/395 N
A61K39/395 D
C07K16/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023579871
(86)(22)【出願日】2022-03-14
(85)【翻訳文提出日】2023-11-10
(86)【国際出願番号】 IB2022052282
(87)【国際公開番号】W WO2022195455
(87)【国際公開日】2022-09-22
(31)【優先権主張番号】63/160,833
(32)【優先日】2021-03-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523347475
【氏名又は名称】イコサゲン セル ファクトリー オーユー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】プラース，マリオ
(72)【発明者】
【氏名】コガーマン，カリン
(72)【発明者】
【氏名】ズシナイト，エヴァ
(72)【発明者】
【氏名】ティーラッツ，トーマス
(72)【発明者】
【氏名】アースメー，ヴァージット
(72)【発明者】
【氏名】カヴァック，アンツ
(72)【発明者】
【氏名】ポイカライネン，ヴェイネ
(72)【発明者】
【氏名】レパサル，レンビット
(72)【発明者】
【氏名】ピースコプ，サンダー
(72)【発明者】
【氏名】ロム，シーム
(72)【発明者】
【氏名】オルトジャー，ルース
(72)【発明者】
【氏名】カングロ，カドリ
(72)【発明者】
【氏名】サンコブスキ，イヴ
(72)【発明者】
【氏名】ジャーホルド，ジョアキム
(72)【発明者】
【氏名】プランケン，アヌ
(72)【発明者】
【氏名】パート，レイニ
(72)【発明者】
【氏名】メンニク，アンドレス
(72)【発明者】
【氏名】トバー，アンドレス
(72)【発明者】
【氏名】ミハイル クラシン，ミハイル
(72)【発明者】
【氏名】ウスタヴ，マート
(72)【発明者】
【氏名】ウスタヴ，マート ジュニア
(72)【発明者】
【氏名】ギルデマン，キーラ
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085AA14
4C085BA71
4C085BB31
4C085BB33
4C085BB36
4C085CC16
4C085CC22
4C085DD88
4C085EE01
4C085GG10
4H045AA11
4H045CA43
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA71
(57)【要約】
呼吸経路を介して広がるヒトにおけるウイルス感染に対する免疫グロブリン調製物を産生する方法を提供する。この方法は、少なくとも１つのウイルス株に由来する抗原タンパク質で、少なくとも第１の妊娠期間の第３期中に乳牛を免疫するステップと、ウイルスの様々な株の抗原タンパク質に対して有効な免疫グロブリンを含む高度免疫ウシ初乳を収集するステップと、初乳から乳清を調製するステップと、乳清から免疫グロブリン分子を単離するステップと、鼻腔内治療に使用するための免疫グロブリン調製物を調製するステップと、を含む。本発明の一態様は、高濃度の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的な高度免疫ウシ初乳を産生することである。ヒトにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを減少するための鼻腔内送達システムを提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
呼吸経路を介して広がるヒトにおけるウイルス感染に対する免疫グロブリン調製物を産生する方法であって、少なくとも１つのウイルス株に由来する抗原タンパク質で、少なくとも第１の妊娠期間の第３期中に、乳牛を免疫するステップと、
前記ウイルスの様々な株の前記抗原タンパク質に対して有効な免疫グロブリンを含む高度免疫ウシ初乳を収集するステップと、
前記初乳から乳清を調製するステップと、
前記乳清から免疫グロブリン分子を単離するステップと、鼻腔内治療に使用するための免疫グロブリン調製物を調製するステップと、を含む、方法。
【請求項2】
免疫グロブリン調製物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するものであり、ウシは、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質、及び少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質で第１の妊娠期間の第３期中、任意選択的に、その後の任意の妊娠期間の第３期中に免疫され、任意選択的に、前記妊娠期間の間に少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質で更に少なくとも１回再免疫され、任意の分娩後に収集された前記高度免疫ウシ初乳は、ＡＣＥ２受容体を介する侵入を遮断することにより任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して有効な免疫グロブリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ウシは、配列番号２～６から選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似性を有する少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質、及び配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む少なくとも１つのブースターで、第１の妊娠期間の第３期中に少なくとも１回免疫され、任意選択的に、配列番号２と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似性を有する少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質で、第１の分娩の後、少なくとも３回前記ウシを再免疫し、かつ配列番号２～６から選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、好ましくは９５％の類似性を有する少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質、及び配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、好ましくは９５％の類似性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む少なくとも１つのブースターで、第２の妊娠期間の第３期中、少なくとも１回前記ウシを免疫し、
免疫された前記ウシの前記第１の分娩及び／又は第２の分娩後に、前記高度免疫初乳を収集し、
改変された前記高度免疫初乳は、５０～１５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７０～１００ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ又はＩｇＡ型抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
第１の妊娠期間中、前記ウシは、予想される分娩の４０～７０日前、好ましくは５０～７０日前、最も好ましくは５５～６５日前に、前記ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質で第１回目の免疫をされ、前記第１回目の免疫の１５～２５日後に第２回目の免疫をされ、ブーストは、前記第２回目の免疫の１０～１５日後に提供される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記ウシは、予想される分娩の３０～５０日、好ましくは３５～４５日、最も好ましくは４２日前の第２の妊娠期間中に免疫され、前記ブーストは、最後の免疫の１０～２０日後、より好ましくは１２～１５日後、最も好ましくは１４日後に投与される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項6】
前記ウシは、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓ２１ ＲＢＤタンパク質で、前記第１の妊娠期間と前記第２の妊娠期間との間に少なくとも３回再免疫される、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
前記ウシは、筋肉内又は粘膜組織を介して免疫される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的な高度免疫ウシ初乳であって、請求項１～４のいずれか一項に記載により産生され、第１又は第２の分娩後に収集され、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して有効であるＩｇＧ又はＩｇＡ型抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を７０～１００ｍｇ／ｍｌ含む、高度免疫ウシ初乳。
【請求項9】
前記初乳は、少なくとも２つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ株に対して有効な抗体を含み、前記株は、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、及びオミクロン株から選択される、請求項８に記載の高度免疫ウシ初乳。
【請求項10】
初乳免疫グロブリン調製物を作る方法であって、請求項８又は９に記載の高度免疫ウシ初乳を供給するステップと、
前記初乳から脂肪及びカゼインを除去することによって、乳清を調製するステップと、
前記乳清を濾過するステップと、
前記乳清を接線流濾過で濃縮するステップと、
前記濃縮乳清を親和性クロマトグラフィーで精製し、免疫グロブリン分子をＧタンパク質マトリックスに結合させるステップと、
前記マトリックスを洗浄するステップと、
前記免疫グロブリン分子をｐＨ２．７のグリシンで溶出させるステップと、
得られた初期免疫グロブリン調製物を中和するステップと、
前記初期調製物を濃縮するステップと、
接線濾過システム上で緩衝液交換を実行するステップと、
前記初期調製物を滅菌及び濾過して、前記免疫グロブリン調製物を得るステップと、を含む、方法。
【請求項11】
請求項１０に記載の方法によって作られた初乳免疫グロブリン調製物。
【請求項12】
前記調製物は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して有効な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を０．０１～１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５～０．８ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１～０．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．１５～０．２５ｍｇ／ｍｌ含むように希釈される、請求項１１に記載の初乳免疫グロブリン調製物。
【請求項13】
少なくとも２つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に有効である、請求項１１又は１２に記載の初乳免疫グロブリン調製物。
【請求項14】
前記株は、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、オミクロン及び任意の新規のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２株から選択される、請求項１３に記載の初乳免疫グロブリン調製物。
【請求項15】
請求項１１～１４のいずれか一項に記載の初乳免疫グロブリン調製物を含む、粘膜鼻腔内送達システム。
【請求項16】
前記システムは、鼻腔内スプレーである、請求項１５に記載の粘膜鼻腔内送達システム。
【請求項17】
ヒトがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染するリスクを減少するための、請求項１６に記載の鼻腔内スプレーの使用。
【請求項18】
ヒトがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染するリスクを減少する方法であって、請求項１６に記載のスプレーを投与することを含む、方法。
【請求項19】
前記方法は、呼吸経路を介して広がるウイルスによって引き起こされる将来のパンデミック又は戦争に対するツールの開発のための抗ウイルス保護調製物を生成するためのものであり、前記方法は、乳牛においてポリクローナル免疫応答を生じるために、既知のウイルス株から得られた抗ウイルス抗原で前記乳牛を免疫することと、
前記ウシの初乳を収集することと、
前記初乳から脂肪及びカゼインを除去することによって、乳清を調製することと、
前記乳清を濾過し、濃縮することと、
前記濃縮乳清を精製することと、
前記精製乳清から免疫グロブリンを単離することと、
鼻腔内送達システムのための免疫グロブリン調製物を調製することと、を含み、前記鼻腔内送達システムは、前記ウイルスの多数の株に対して有効な免疫グロブリンを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
Ｍａｒｉｏ Ｐｌａａｓ、Ｋａｒｉｎ Ｋｏｇｅｒｍａｎｎ、Ｅｖａ Ｚｕｓｉｎａｉｔｅ、Ｔｏｏｍａｓ Ｔｉｉｒａｔｓ、Ｂｉｒｇｉｔ Ａａｓｍａｅ、Ａｎｔｓ Ｋａｖａｋ、Ｖａｉｎｏ Ｐｏｉｋａｌａｉｎｅｎ、Ｌｅｍｂｉｔ Ｌｅｐａｓａｌｕ、Ｓａｎｄｅｒ Ｐｉｉｓｋｏｐ、Ｓｉｉｍｕ Ｒｏｍ、Ｒｕｔｈ Ｏｌｔｊｅｒ、Ｋａｄｒｉ Ｋａｎｇｒｏ、Ｅｖｅ Ｓａｎｋｏｖｓｋｉ、Ｋｉｉｒａ Ｋｉｌｄｅｒｍａｎ、Ｊｏａｃｈｉｍ Ｇｅｒｈｏｌｄ、Ｒａｉｎｉ Ｐｅｒｔ、Ａｎｄｒｅｓ Ｍａｎｎｉｋ、Ａｎｕ Ｐｌａｎｋｅｎ、Ａｎｄｒｅｓ Ｔｏｖｅｒ、Ｍｉｈｈａｉｌ Ｋｕｒａｓｉｎ、Ｍａｒｔ Ｕｓｔａｖ、Ｍａｒｔ Ｕｓｔａｖ Ｊｒ．
【0002】
優先権
本出願は、２０２１年３月１４日に出願された米国仮出願第６３／１６０，８３３号の優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年３月１４日に出願された米国仮出願第６３／１６０，８３３号の優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
配列表
本出願は、コンピュータ可読フォーマットで提供される配列表を含有する。
本出願は、コンピュータ可読フォーマットで提供される配列表を含有する。
【背景技術】
【0004】
ＣＯＶＩＤ１９－パンデミックは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされた、２０１９年のコロナウイルス病のパンデミックである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒトに感染する新規ウイルスであり、最初のヒトＣＯＶＩＤ－１９症例は、２０１９年１２月に中国の武漢で確認された。
【0005】
現在までに、このウイルスは３億９０００万人以上に感染し、少なくとも５７０万人が死亡している。新規コロナウイルスは、壊滅的な世界的健康及び経済的影響をもたらしており、いくつかのワクチン候補が開発中ではあるとしても、ウイルス感染の治療法及び予防法はまだ開発されていない。
【0006】
ＣＯＶＩＤ－１９の徴候及び症状は、曝露から２～１４日後に現れることがある。曝露後及び症状が現れる前のこの時間を潜伏期間と呼ぶ。一般的な徴候及び症状としては、発熱、咳、疲労感が挙げられ得る。その他の症状としては、息切れ又は呼吸困難、筋肉痛、悪寒、のどの痛み、鼻水、頭痛、胸痛などが挙げられ得る。ＣＯＶＩＤ－１９の症状の重症度は、非常に軽度から重度まで様々である。症状が少ない人もいれば、まったく症状がない人もいる場合がある。一部の人は、症状が始まってから約１週間後に、息切れ及び肺炎の悪化など、症状の悪化を経験し得る。
【0007】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、２５～１００種類の範囲のホモ三量体スパイク（Ｓ）タンパク質をウイルス膜上に示しており、ホモ三量体スパイクタンパク質は、宿主細胞表面タンパク質であるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）、ニューロピリン－１、及びセリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２と相互作用して、細胞へのウイルス侵入を促進する（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０、Ｃａｎｔｕｔｉ－Ｃａｔｅｌｖｅｔｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０、Ｄａｉｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０２０、Ｓｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０２０）。Ｓタンパク質上の様々なエピトープに結合し、細胞へのウイルス侵入を遮断する多量の抗体が報告されてきた（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２０、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０、Ｎｏｙ－Ｐｏｒａｔ ｅｔ ａｌ．，２０２０、Ａｌｓｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０、Ｚｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０２０、Ｔｒｏｔｏｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。ほとんどの抗体はＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合し、このドメインは上向きのＡＣＥ２アクセス可能な配座又は下向きのＡＣＥ２アクセス不可能な配座のいずれかにおいて発見され得（Ｗａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）、ＡＣＥ２との相互作用を遮断する。ＡＣＥ２は、肺、動脈、心臓、腎臓、及び腸に位置する細胞の細胞膜に結合する酵素である。膜貫通タンパク質として、ＡＣＥ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むいくつかのコロナウイルスの細胞への主要な侵入地点として機能する。より具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＳ１タンパク質の細胞表面上のＡＣＥ２の酵素ドメインへの結合は、ウイルス及び酵素の両方の飲食作用及び細胞内に位置するエンドソームへの移行をもたらす。
【0008】
中和抗体は、病原体の細胞への侵入を遮断し、それにより、病原体が体に感染するのを防ぐことができる。ＡＣＥ２はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の主要な侵入地点であるため、侵入を遮断する可能性のある効率的な中和抗体を見つけることは、パンデミックと戦うための予防的及び治療的手段を開発するための有望なアプローチと思われる。中和抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体による受動的免疫化は、高齢者、免疫不全者、老人ホーム及び長期介護施設の患者など、最も苦しんでいる特定の集団に特に有効であり得る。
【0009】
哺乳類における初乳を介した保護免疫の伝達は、自然に進化したプロセスであり、新生児に最初の数日から数ヶ月の間、外来病原体に対する保護免疫を提供する。ウシ初乳を栄養補助食品として使用することは、広く実装され、腸管病原体に対する有益な効果を引き出すことが実証されている。ウシ初乳において、存在する主なタンパク質は、免疫グロブリンであり、主な免疫グロブリンアイソタイプはＩｇＧであり、続いてＩｇＡ及びＩｇＭである。ウシ初乳中のＩｇＧレベルは約５０～１００ｍｇ／ｍｌであり、これは、ウシが胎盤を越えてＩｇＧを移動できず、最初の保護免疫を発達させる際に初乳に依存するため、子ウシにとって重要である。母親の血清免疫グロブリンは、分娩前に急速に減少し、初乳及び乳に移行するため、それらは免疫グロブリンの優れた供給源である。高度免疫ウシ初乳の発達は、特異的抗ウイルス抗体の優れた供給源であり得る。インフルエンザの場合、ＢＡＬＢ／ｃマウスにインフルエンザ高度免疫初乳から得たＩｇＧを経鼻的に予め処置したところ、亜致死量の場合でもマウスの感染発症を防いだことが実証されている。予め処置された動物は、致死的な感染用量の場合にも保護された。高度免疫初乳由来保護の同様の移行は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に対しても実証されている。
【0010】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対する防御のための予防的治療及び組成物、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの拡散を防止するための方法を提供することは、非常に必要である。ワクチンが必要であるだけでなく、ウイルス変異に応答として迅速かつ容易に改変することができる予防手段が必要である。将来のパンデミックの場合及び、呼吸経路を介してウイルス株が広がる可能性のある生物戦の場合であっても、迅速に対応する必要がある。本発明は、そのようなウイルス感染からヒトを保護するための方法及び生成物を提供する。
【発明の概要】
【0011】
したがって、呼吸経路を介して広がるヒトにおけるウイルス感染に対する免疫グロブリン調製物を産生する方法を提供することが本発明の目的であり、本方法は、少なくとも１つのウイルス株に由来する抗原タンパク質で、少なくとも第１の妊娠期間の第３期中に、乳牛を免疫するステップと、ウイルスの様々な株の抗原タンパク質に対して有効な免疫グロブリンを含む高度免疫ウシ初乳を収集するステップと、初乳から乳清を調製するステップと、乳清から免疫グロブリン分子を単離するステップと、鼻腔内治療に使用するための免疫グロブリン調製物を調製するステップと、を含む。
【0012】
本方法の特定の態様によれば、免疫グロブリン調製物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するものであり、ウシは、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質、及び少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質で第１の妊娠期間の第３期中、任意選択的に、その後の任意の妊娠期間の第３期中に免疫され、任意選択的に、妊娠期間の間に少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質で更に少なくとも１回再免疫され、任意の分娩後に収集された高度免疫ウシ初乳は、ＡＣＥ２受容体を介する侵入を遮断することにより任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して有効な免疫グロブリンを含む。
【0013】
本方法のある特定の態様によれば、ウシは、配列番号２～６から選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似性を有する少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質、及び配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む少なくとも１つのブースターで、第１の妊娠期間の第３期中に少なくとも１回免疫され、任意選択的に、配列番号２と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似性を有する少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１ ＲＢＤタンパク質で、第１の分娩の後、少なくとも３回ウシを再免疫し、かつ配列番号２～６から選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、好ましくは９５％の類似性を有する少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質、及び配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、好ましくは９５％の類似性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む少なくとも１つのブースターで、第２の妊娠期間の第３期中、少なくとも１回ウシを免疫し、免疫されたウシの第１の分娩及び／又は第２の分娩後に、高度免疫初乳を収集する。
【0014】
本方法の特定の態様によれば、改変された高度免疫初乳は、５０～１５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７０～１００ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ又はＩｇＡ型抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含む。
【0015】
ウイルス感染、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対する上気道粘膜における保護免疫のための手段を提供することが、本発明の目的である。
【0016】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的な高度免疫初乳由来抗体を提供及び使用することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する保護に使用するためのヒトの鼻腔内治療を提供することが、本発明の目的である。
【0017】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に特異的な高度免疫ウシ初乳を産生する方法を提供することが本発明の目的であり、この方法は、乳牛を少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質バリアント及び少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントで免疫するステップと、子ウシの出生後に改変されたウシ初乳を収集するステップとを含み、改変されたウシ初乳は、５０～１５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７０～１００ｍｇ／ｍｌの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含む。
【0018】
本発明の特定の態様によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に特異的な高度免疫ウシ初乳を産生する方法が提供され、この方法は、
配列番号２と少なくとも９５％の類似性を有する少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質、及び配列番号４と少なくとも９５％の類似性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む少なくとも１つのブースターで、第１の妊娠期間の第３期中、少なくとも１回乳牛を免疫するステップと、任意選択的に、配列番号２と少なくとも９５％の類似性を有する少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質で、第１の出産後、少なくとも３回ウシを再免疫するステップと、配列番号２と少なくとも９５％の類似性を有する少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質、及び配列番号４と少なくとも９５％の類似性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む少なくとも１つのブースターで、第２の妊娠期間の第３期中、少なくとも１回ウシを免疫するステップと、免疫されたウシの第１及び／又は第２の分娩後に、高度免疫初乳を収集するステップと、を含み、高度免疫初乳は、５０～１５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７０～１００ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ又はＩｇＡ型抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含む。
配列番号２と少なくとも９５％の類似性を有する少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質、及び配列番号４と少なくとも９５％の類似性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む少なくとも１つのブースターで、第１の妊娠期間の第３期中、少なくとも１回乳牛を免疫するステップと、任意選択的に、配列番号２と少なくとも９５％の類似性を有する少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質で、第１の出産後、少なくとも３回ウシを再免疫するステップと、配列番号２と少なくとも９５％の類似性を有する少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質、及び配列番号４と少なくとも９５％の類似性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む少なくとも１つのブースターで、第２の妊娠期間の第３期中、少なくとも１回ウシを免疫するステップと、免疫されたウシの第１及び／又は第２の分娩後に、高度免疫初乳を収集するステップと、を含み、高度免疫初乳は、５０～１５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７０～１００ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ又はＩｇＡ型抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含む。
【0019】
高度免疫初乳を産生する方法の特定の態様によれば、ウシは、予想される分娩の４０～７０日前、好ましくは５０～７０日前、最も好ましくは５５～６５日前に、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質で第１回目の妊娠期間中に第１回目の免疫をされ、第１回目の免疫の１５～２５日後に第２回目の免疫をされ、ブーストは、第２回目の免疫の１０～１５日後に提供される。
【0020】
高度免疫初乳を産生する方法の特定の態様によれば、ウシは、予想される分娩の３０～５０日、好ましくは３５～４５日、最も好ましくは４２日前の第２の妊娠期間中に免疫され、ブーストは、最後の免疫の１０～２０日後、より好ましくは１２～１５日後、最も好ましくは１４日後に投与される。
【0021】
高度免疫初乳を産生する方法の特定の態様によれば、ウシは、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓ２１ ＲＢＤタンパク質を用いて、第１の妊娠期間と第２の妊娠期間との間に少なくとも３回再免疫される。
【0022】
高度免疫初乳を産生する方法の特定の態様によれば、ウシは、筋肉内又は粘膜組織を介して免疫される。
【0023】
ある特定の態様によれば、高度免疫初乳のＩｇＧ又はＩｇＡ型抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、デルタバリアント武漢単離株、ＵＫ単離株、南アフリカ単離株、ブラジル単離株、及びオミクロンバリアントから選択される１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対して有効である。
【0024】
少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質バリアント及び少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントで免疫されたウシから収集されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的な高度免疫ウシ初乳であって、子ウシを出産した後６～１０日以内に収集される初乳であり、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対する５０～１５０ｇ／ｍｌ、好ましくは７０～１００ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ又はＩｇＭ型抗体を含む初乳を提供することは、本発明の別の目的である。
【0025】
ある特定の態様によれば、初乳は、少なくとも２つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して有効な抗体を含み、その株は、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、及びオミクロン株から選択される。
【0026】
少なくとも２つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して有効である免疫グロブリンを含む初乳免疫グロブリン調製物を作る方法を提供することが、本発明の更に別の目的であり、その株は、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ及びオミクロン株から選択される。
【0027】
ある特定の態様によれば、初乳免疫グロブリン調製物を作る方法は、免疫されたウシから得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質高度免疫ウシ初乳を供給するステップと、初乳から脂肪及びカゼインを除去することによって乳清を調製するステップと、乳清を濾過するステップと、乳清を接線流濾過で濃縮するステップと、濃縮乳清を親和性クロマトグラフィーで精製し、免疫グロブリン分子をＧタンパク質マトリックスに結合するステップと、マトリックスを洗浄するステップと、免疫グロブリン分子をｐＨ２．７のグリシンで溶出するステップと、得られた初期免疫グロブリン調製物を中和するステップと、初期調製物を濃縮するステップと、接線濾過システムで緩衝液交換を実行するステップと、初期調製物を滅菌及び濾過して、免疫グロブリン調製物を得るステップと、を含む。
【0028】
ある特定の態様によれば、本方法によって作られる免疫グロブリン調製物は、少なくとも２つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して有効な抗体を含み、その株は、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ及びオミクロン株から選択される。
【0029】
ある特定の態様によれば、免疫グロブリン調製物は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して有効な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を０．０１～１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５～０．８ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１～０．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．１５～０．２５ｍｇ／ｍｌ含むように希釈される。
【0030】
免疫グロブリン調製物を含む鼻腔内送達システムを提供することが、本発明の更に別の目的である。ある特定の態様によれば、鼻腔内送達システムは、鼻腔内スプレーである。
【0031】
ヒトがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染するリスクを減少するのに使用するための鼻腔内送達システムを提供することが、本発明の更なる目的である。
【0032】
特定の態様によれば、鼻腔内送達システムは、０．００６～０．６ｍｇの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含む用量をスプレーするために使用される鼻腔内スプレーである。
【0033】
本発明は、ＡＣＥ２受容体に結合することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して有効な大量の免疫グロブリンを産生する方法を提供する。高速タイムラインは、ウイルスの新しい株が出現した場合、鼻腔内送達システムの改変の迅速な産生を可能にする。
【0034】
特定の態様によれば、本発明は、任意の更なるパンデミックと戦うための抗ウイルス保護調製物を調製するための方法及びツールを提供する。
【0035】
呼吸経路を介して広がるウイルスによって引き起こされる将来のパンデミック又は戦争に対するツールを開発するための抗ウイルス保護調製物を生成する方法であって、乳牛においてポリクローナル免疫応答を生じるために、既知のウイルス株から得られた抗ウイルス抗原で乳牛を免疫することと、ウシの初乳を収集することと、請求項８に記載の免疫グロブリン調製物を単離することと、ウイルスの多数の株に対して有効な免疫グロブリン調製物を含む鼻腔内送達系を提供することと、を含む、方法を提供することが、本発明の更なる目的である。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】高度免疫初乳由来抗体含有調製物を得るためのワークフローの概略図である。最初のステップから最後のステップまでにかかり得るタイムラインは、わずか２～３ヶ月である。
【図2】抗体力価を示し、抗体中和能力の描写を含む。中和力価は、灰色の点線及び灰色のアスタリスクで示される。ウシ３６４の力価は１６００倍であり、ウシ１０２０及び２２７９の力価の範囲は約２００倍である。残りの４頭（２２６１、６５０２、２２６１、及び６５３６）は、約８００倍の力価を示す。
【図3A】免疫化タイムラインによる、免疫されたウシ６５３６（Ｂ、Ｄ）及び２２７９（Ｃ、Ｅ）の血清由来の抗体の免疫化及び分娩タイムライン（ａ）及び中和効果を示す。グラフＢ及びＣは、５０倍希釈の血清上で実行したＥＬＩＳＡアッセイの相対ＯＤ４５０シグナルを示す。グラフＤ及びＥは、１００倍希釈倍率の初乳上で実行したＥＬＩＳＡアッセイの相対ＯＤ４５０シグナルを示す。
【図3B】免疫化タイムラインによる、免疫されたウシ６５３６（Ｂ、Ｄ）及び２２７９（Ｃ、Ｅ）の血清由来の抗体の免疫化及び分娩タイムライン（ａ）及び中和効果を示す。グラフＢ及びＣは、５０倍希釈の血清上で実行したＥＬＩＳＡアッセイの相対ＯＤ４５０シグナルを示す。グラフＤ及びＥは、１００倍希釈倍率の初乳上で実行したＥＬＩＳＡアッセイの相対ＯＤ４５０シグナルを示す。
【図3C】免疫化タイムラインによる、免疫されたウシ６５３６（Ｂ、Ｄ）及び２２７９（Ｃ、Ｅ）の血清由来の抗体の免疫化及び分娩タイムライン（ａ）及び中和効果を示す。グラフＢ及びＣは、５０倍希釈の血清上で実行したＥＬＩＳＡアッセイの相対ＯＤ４５０シグナルを示す。グラフＤ及びＥは、１００倍希釈倍率の初乳上で実行したＥＬＩＳＡアッセイの相対ＯＤ４５０シグナルを示す。
【図3D】免疫化タイムラインによる、免疫されたウシ６５３６（Ｂ、Ｄ）及び２２７９（Ｃ、Ｅ）の血清由来の抗体の免疫化及び分娩タイムライン（ａ）及び中和効果を示す。グラフＢ及びＣは、５０倍希釈の血清上で実行したＥＬＩＳＡアッセイの相対ＯＤ４５０シグナルを示す。グラフＤ及びＥは、１００倍希釈倍率の初乳上で実行したＥＬＩＳＡアッセイの相対ＯＤ４５０シグナルを示す。
【図3E】免疫化タイムラインによる、免疫されたウシ６５３６（Ｂ、Ｄ）及び２２７９（Ｃ、Ｅ）の血清由来の抗体の免疫化及び分娩タイムライン（ａ）及び中和効果を示す。グラフＢ及びＣは、５０倍希釈の血清上で実行したＥＬＩＳＡアッセイの相対ＯＤ４５０シグナルを示す。グラフＤ及びＥは、１００倍希釈倍率の初乳上で実行したＥＬＩＳＡアッセイの相対ＯＤ４５０シグナルを示す。
【図4】初乳から最終的な免疫グロブリン生成物までのプロセスステップ。
【図5】初乳由来免疫グロブリン調製物が、ＡＣＥ２とスパイクタンパク質との結合を遮断する可能性を示している。黒い正方形は、ウシ６５３６の中和抗体値を示し、黒い円は、ウシ２２７９の中和抗体値を示し、黒い三角形はウシ１０２０の中和抗体値を示し、空の円は、免疫されていないウシの値を示す（対照）。遮断は、０．７５の相対光学密度（ＯＤ）未満で生じると考えられる。相対ＯＤが小さいほど、中和効果が強くなる。ウシ６５３６からの初乳由来免疫グロブリン調製物は３２ｕｇ／ｍｌの濃度で、ウシ２２７９由来のものは７８ｕｇ／ｍｌの濃度で、ウシ１０２０由来のものは１２５ｕｇ／ｍｌの濃度で、依然として中和能力を示す。免疫していないウシからの初乳由来免疫グロブリン調製物は、高濃度（２５００ｕｇ／ｍｌ～１０，０００ｕｇ／ｍｌ）で非特異的中和を示す。
【図6】初乳からの初乳由来免疫グロブリンの機能的特徴を例示する。左パネルは、競合ＥＬＩＳＡアッセイの原理を示す。右のパネルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なる三量体スピークタンパク質バリアントに対する初乳免疫グロブリンの結合を示す。バリアントのＩＣ５０値も示す。初乳免疫グロブリン生成物は、ＢＯＳＳ Ｉｇ００１、すなわち、最初の分娩後に初乳から得られた生成物であった（図３Ａのタイムラインを参照）。
【図7】競合ＥＬＩＳＡによって決定される、ＢＯＳＳ Ｉｇ００１（第１の分娩後に初乳から得られる生成物）及びＢＯＳＳ Ｉｇ００３（第２の分娩後に得られる初乳）（タイムラインについては図３Ａを参照）の機能的特徴を例示する。ＩＣ５０値も示す。
【図8】偽型ウイルスアッセイの結果を示す。アッセイは、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２株Ｂ－１－３５１ＬＡＶ（ベータバリアント）、Ｐ１ブラジル（ガンマバリアント）、ＵＫ２０２０１２（アルファバリアント）及び武漢で実施した。完全中和は、発光シグナルが検出されない、又は実質的に検出されない濃度で考慮される。これは、約１００ｕｇ／ｍｌの濃度で４つの株全てに当てはまり、これは、試験した４つの株全ての中和が等しく良好であることを示している。ＩＣ５０値も示す。試験は、ＢＯＳＳ Ｉｇ００１免疫グロブリン生成物を用いて実施した。
【図9】別の一連の偽型ウイルスアッセイの結果を示す。ここで、試験した株には、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、カッパ、及び野生型バリアントが含まれた。試験は、ＢＯＳＳ Ｉｇ００１免疫グロブリン生成物を用いて実施した。
【図10】更に別の組の偽型ウイルスアッセイの結果を示す。ここで、試験には、デルタ及びオミクロンのバリアントが含まれた。試験は、ＢＯＳＳ Ｉｇ００１及びＢＯＳＳ Ｉｇ００３生成物を用いて実施した。
【図11】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を初乳由来抗体で連続希釈処理した後、ウイルス－抗体混合物でＶＥＲＯ Ｅ６細胞を感染させた結果とを例示する。ウイルス誘発性細胞障害性効果が視覚的に決定されない最終的な抗体濃度を、最終的なＩＣ１００濃度として得る。実験を別々の重複で実行し、両方の独立した実験の結果を実証した。
【図12】７日間にわたる異なる条件において得られた初乳由来調製物のＡＣＥ２遮断活性の安定性及び保持を示す。活性の有意な変化は検出されない。
【図13】異なるタンパク質濃度でのＳＡＲＳ－ＣＯＶ２免疫グロブリン生成物の単一感染前鼻腔内投与（７０ｕｌ）のウイルス量変化を例示する。１０５ｐｆｕの感染性ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２ウイルスを使用して、動物を感染させた。
【発明を実施するための形態】
【0037】
定義：
本開示において、「免疫グロブリン」及び「抗体」という用語は、互換的に使用される。
本開示において、「免疫グロブリン」及び「抗体」という用語は、互換的に使用される。
【0038】
本開示において、「ＢＯＳＳ００１Ｉｇ」という用語は、第１の分娩後に免疫されたウシの初乳から得られたウシＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質免疫グロブリン生成物を意味する（免疫化及び分娩のタイムラインについては図３Ａを参照）。「ＢＯＳＳ００３Ｉｇ」という用語は、第２の出産後に免疫されたウシの初乳から得られたウシＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質免疫グロブリン生成物を意味する（免疫化及び出産のタイムラインについては図３Ａを参照）。本開示において、別段の指示がない限り、使用される免疫グロブリン生成物は、ＢＯＳＳ００１Ｉｇである。
【0039】
本開示において、「初乳」という用語は、分娩後の最初の８～１０回の搾乳中にウシから得られた乳白色の流体を意味する。その後、通常は分娩後７日目以降に得られる乳を、ここでは「普通の乳」と呼ぶ。
【0040】
ここでは、呼吸経路を介して広がるヒトにおけるウイルス感染に対する免疫グロブリン調製物を産生する方法を提供する。本方法は、少なくとも１つのウイルス株に由来する抗原タンパク質で、少なくとも第１の妊娠期間の第３期中に、乳牛を免疫するステップを含む。抗原タンパク質は、限定されないが、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶなどの呼吸経路を介して広がる任意のウイルスから選択され得る。この方法は、ウイルスの様々な株の抗原タンパク質に対して有効な免疫グロブリンを含む高度免疫ウシ初乳を収集することを含む。高度免疫ウシ初乳の免疫グロブリンは、免疫化に使用されたものよりも他の株に対して有効であり得る。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のアルファ、ベータ、ガンマ、デルタ又はカッパ株に由来するタンパク質でウシを免疫する場合、収集された初乳は、ウシが免疫されなかったオミクロン株に対しても有効である。収集した初乳から乳清を調製し、鼻腔内治療として使用するための免疫グロブリン調製物を調製するために、免疫グロブリン分子を乳清から単離する。好ましくは、調製物は鼻腔内スプレーである。
【0041】
本明細書で提供する方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対する免疫グロブリン調製物の調製に特に好適である。この場合、ウシは、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質、及び少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質で第１の妊娠期間の第３期中、任意選択的に、その後の任意の妊娠期間の第３期中に免疫され、任意選択的に、妊娠期間の間に少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質で少なくとも１回再免疫される。任意の分娩後に収集された高度免疫ウシ初乳は、ＡＣＥ２受容体を介する侵入を遮断することにより任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して有効な免疫グロブリンを含む。高度免疫初乳は、５０～１５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７０～１００ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ又はＩｇＡ型抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含み得る。
【0042】
本方法の一態様によれば、ウシは、配列番号２～６から選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似性を有する少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１ ＲＢＤタンパク質、及び配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む少なくとも１つのブースターで、第１の妊娠期間の第３期中に少なくとも１回免疫され、任意選択的に、配列番号２と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似性を有する少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質を用いて、第１の分娩の後、少なくとも３回ウシを再免疫し、かつ配列番号２～６から選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、好ましくは９５％の類似性を有する少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質、及び配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、好ましくは９５％の類似性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含む少なくとも１つのブースターを用いて、第２の妊娠期間の第３期中、少なくとも１回ウシを免疫する。高度免疫初乳は、免疫されたウシの第１の分娩及び／又は第２の分娩後に収集され、５０～１５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７０～１００ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ又はＩｇＡ型抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含み得る。驚くべきことに、抗体は、任意の既知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株に対して、免疫化に使用されなかった株に対してさえ、有効である。
【0043】
本開示は、ウイルス感染、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に対する上気道粘膜における保護免疫のための手段を提供する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する保護において使用されるヒトのための鼻腔内治療は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的な高度免疫初乳由来抗体を使用することによって提供される。
【0044】
本開示は、高度免疫初乳を産生するための好ましい免疫スケジュールを提供する。ウシは、好ましくは、予想される分娩の４０～７０日前、好ましくは５０～７０日前、最も好ましくは５５～６５日前に、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質を用いて第１回目の妊娠期間中に第１回目の免疫をされ、第１回目の免疫の１５～２５日後に第２回目の免疫をされ、ブーストは、第２回目の免疫化の１０～１５日後に提供される。ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ ＲＢＤタンパク質は、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、カッパ又はオミクロン株を含む、任意のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２株から得ることができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質は、配列番号２～６から選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似性を有することが好ましい。免疫スケジュールは、ウシにおいて免疫反応を誘導し、それは、２つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ株に対して、ウシが免疫されなかった株に対してさえも、有効である免疫グロブリンを含む初乳をもたらす。したがって、この方法は、まだ知られていない新しい株によって引き起こされる将来のＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２感染症の減少に適している。
【0045】
ウシの免疫のタイムラインは、予想される分娩の３０～５０日前、好ましくは３５～４５日前、最も好ましくは４２日前の第２の妊娠期間又はそれ以上の妊娠期間中の免疫を含むことができ、ブーストは最後の免疫の１０～２０日後、より好ましくは１２～１５日後、最も好ましくは１４日後に投与される。免疫化に使用されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質は、好ましくは、配列番号２～６から選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似性を有する。免疫スケジュールは、ウシにおいて免疫反応を誘導し、それは、２つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ株に対して、ウシが免疫されなかった株に対してさえも、有効である免疫グロブリンを含む初乳をもたらす。
【0046】
免疫化タイムラインは、任意の２つの妊娠期間の間に、任意のＳＡＲＳ Ｃｏｖ－２株から得られたＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓ２１ ＲＢＤタンパク質で、少なくとも１回、より好ましくは少なくとも３回の再免疫化を含み得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質は、配列番号２～６から選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の類似性を好ましくは有する。
【0047】
ウシは、高度免疫初乳を産生するための本開示に記載の免疫化のいずれも、筋肉内又は粘膜組織を介してであってもよい。
【0048】
本開示は、ＳＡＲＳ－、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染症等の呼吸器ウイルス感染症に対して有効な免疫グロブリンを単離するのに好適な高度免疫ウシ初乳を提供する。本開示は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質バリアント及び少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントで免疫したウシから収集されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的な高度免疫ウシ初乳を提供する。初乳は、好ましくは、分娩後の最初の８～１０回の搾乳から、好ましくは、子ウシを出産した後４～１０日以内に収集され、初乳は、５０～１５０ｇ／ｍｌ、好ましくは７０～１００ｍｇ／ｍｌの少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対するＩｇＧ又はＩｇＭ型抗体を含むことができる。初乳は、好ましくは、免疫化のための抗原が由来する株とは異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して有効な抗体を含む。初乳は、好ましくは、少なくとも２つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して有効な抗体を含み、その株は、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、オミクロン株、及び任意の将来の株から選択される。
【0049】
本開示は、免疫グロブリンを含む初乳免疫グロブリン調製物を作る方法を提供し、この初乳免疫グロブリン調製物は、少なくとも２つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して有効であり、その株は、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ及びオミクロン株から選択される。免疫グロブリン調製物を作る方法は、好ましくは、免疫されたウシから得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質高度免疫ウシ初乳を提供するステップと、初乳から脂肪及びカゼインを除去することによって乳清を調製するステップと、乳清を濾過するステップと、乳清を接線流濾過で濃縮するステップと、濃縮乳清を親和性クロマトグラフィーで精製し、免疫グロブリン分子をＧタンパク質マトリックスに結合させるステップと、マトリックスを洗浄するステップと、免疫グロブリン分子をｐＨ２．７のグリシンで溶出させるステップと、得られた初期免疫グロブリン調製物を中和するステップと、初期調製物を濃縮するステップと、接線濾過システムで緩衝液交換を実行するステップと、初期調製物を滅菌及び濾過して、免疫グロブリン調製物を得るステップとを含む。この調製物は、少なくとも２つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して有効な抗体を含み、その株は、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、オミクロン株、及び任意の将来の染色から選択される。免疫グロブリン調製物は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して有効な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を０．０１～１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５～０．８ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１～０．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．１５～０．２５ｍｇ／ｍｌ含むように希釈され得る。免疫グロブリン調製物は、鼻腔内送達システム、例えば、鼻腔点滴剤、ナノゲル剤、鼻腔内泡剤又は溶解性パッキン剤、乾燥鼻腔粉末スプレー、鼻腔軟膏剤、及び鼻腔内スプレーとして提供され得る。鼻腔内送達システムは、ヒトがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染するリスクを減少するために使用される。鼻腔内送達システムは、０．００６～０．６ｍｇの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含有する用量の使用のための鼻腔内スプレーであることが好ましい。
【0050】
本発明は、ＡＣＥ２受容体に結合することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して有効な大量の免疫グロブリンを産生する方法を提供する。高速タイムラインは、ウイルスの新しい株が出現した場合、鼻腔内送達システムの改変の迅速な産生を可能にする。特定の態様によれば、本発明は、任意の更なるパンデミックと戦うための抗ウイルス保護調製物を調製するための方法及びツールを提供する。本開示は、呼吸経路を介して広がるウイルスによって引き起こされる将来のパンデミック又は戦争に対するツールの開発のための抗ウイルス保護調製物を生成する手段を提供し、本方法は、乳牛においてポリクローナル免疫応答を生じるために、既知のウイルス株から得られた抗ウイルス抗原で乳牛を免疫することと、ウシの初乳を収集することと、免疫グロブリン調製物を単離することと、多数のウイルス株に対して有効な免疫グロブリン調製物を含む鼻腔内送達システムを提供することとを含む。
【0051】
次に、本明細書に添付された図面を参照して、本発明をより詳細に説明する。高度免疫ウシ初乳由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質特異的濃縮免疫グロブリンの開発及び抽出のため、妊娠中のウシを、第１の妊娠期間の第３期中に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ドメインで３回免疫した。いくつかの場合において、ウシは、第１の分娩と第２の分娩との間に再免疫され、２回の免疫化は、第２の妊娠期間の第３期中に投与された（免疫化タイムラインについては図３Ａを参照）。
【0052】
免疫化のための抗原を、無血清の化学的に定義された培地中で増殖させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ－Ｓ）細胞において、ＱＭＣＦ技術（Ｉｃｏｓａｇｅｎ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ ＯＵ、米国特許第７，７９０，４４６号、参照により本明細書に組み込まれる）を使用して組み換え的に産生し、親和性クロマトグラフィーを使用してＣ末端Ｈｉｓタグを介して精製した。子ウシが生まれた後、初乳を収集し、続いて脂質を除去し、キモシンでカゼインを凝固させた。得られた乳清を更に遠心分離し、分画を沈殿させ、熱処理し、濾過し、その結果、製剤化することができるウシ初乳由来の免疫グロブリン含有溶液を得た。図４は、最終製剤を調製するプロセスを例示する。次いで、得られた溶液を、生化学的アッセイでＡＣＥ２結合を遮断し、偽型ウイルス感染アッセイでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を中和し、細胞障害性効果アッセイ（ＣＰＥアッセイ）でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを中和する効能について更に特徴付けた。更に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＡＣＥ２結合遮断抗体溶液を調合し、鼻腔内スプレーディスペンサーボトル中に滅菌分注した。一般的なプロセスの概要を図１に示す。
【0053】
妊娠中のウシの免疫化
合計８頭のウシ（エストニアホルスタイン牛）を、アジュバント溶液中の武漢単離株（配列番号２）から改変されたＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質で、２回免疫した。また、アルファバリアント（配列番号３）、ベータバリアント（配列番号４）、ガンマバリアント（配列番号５）、及びデルタバリアント（配列番号５）から改変されたＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質を使用した。Ｎ末端に加えられたＡＳ配列と、Ｃ末端に加えられたＨＨＨＨＨＨ配列を有するように、使用した全てのドメインタンパク質を同様に改変した。２回の免疫化の後、１つのブースターを、アジュバント溶液中の武漢バリアント（配列番号８）又はデルタバリアント（配列番号９）からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ドメインとともに投与した。第１の免疫化は、各動物の予想される分娩日の４０～７０日前、好ましくは５０～７０日前、より好ましくは５５～６５日前、最も好ましくは６０日前に行われた。第２の免疫化は、第１の免疫の１５～２５日後、より好ましくは２０～２２日後に実行し、ブーストは、第２の免疫の１０～１６日後、より好ましくは１４日後に実行した。注射は筋肉内で行い、免疫化のため０．１ｍｇの抗原を使用し、ブーストのため１回の注射あたり０．５ｍｇの抗原を使用した。アジュバントとして、Ｑｕｉｌ－Ａ（０．５ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）＋Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ（１０ｍｇ／ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ）の混合物を使用（３頭のウシ）し、又はＱｕｉｌ－Ａ（０．５ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）単独で使用した（５頭のウシ）。筋肉内注射の代わりに、免疫化は、粘膜スプレーとして提供することもできる。
合計８頭のウシ（エストニアホルスタイン牛）を、アジュバント溶液中の武漢単離株（配列番号２）から改変されたＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質で、２回免疫した。また、アルファバリアント（配列番号３）、ベータバリアント（配列番号４）、ガンマバリアント（配列番号５）、及びデルタバリアント（配列番号５）から改変されたＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質を使用した。Ｎ末端に加えられたＡＳ配列と、Ｃ末端に加えられたＨＨＨＨＨＨ配列を有するように、使用した全てのドメインタンパク質を同様に改変した。２回の免疫化の後、１つのブースターを、アジュバント溶液中の武漢バリアント（配列番号８）又はデルタバリアント（配列番号９）からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ドメインとともに投与した。第１の免疫化は、各動物の予想される分娩日の４０～７０日前、好ましくは５０～７０日前、より好ましくは５５～６５日前、最も好ましくは６０日前に行われた。第２の免疫化は、第１の免疫の１５～２５日後、より好ましくは２０～２２日後に実行し、ブーストは、第２の免疫の１０～１６日後、より好ましくは１４日後に実行した。注射は筋肉内で行い、免疫化のため０．１ｍｇの抗原を使用し、ブーストのため１回の注射あたり０．５ｍｇの抗原を使用した。アジュバントとして、Ｑｕｉｌ－Ａ（０．５ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）＋Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ（１０ｍｇ／ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ）の混合物を使用（３頭のウシ）し、又はＱｕｉｌ－Ａ（０．５ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）単独で使用した（５頭のウシ）。筋肉内注射の代わりに、免疫化は、粘膜スプレーとして提供することもできる。
【0054】
第１の分娩後に初乳を収集した後、牛乳中へのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２中和抗体の分泌は停止し、乳中で非常に低いレベルであった。また、動物の血清中の中和抗体の力価は、非常に低いレベルであった。したがって、追加の免疫化スキームが開発された。第１の分娩後、ウシはｘｘ週間ごとに、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質で再免疫された。第２の妊娠期間中、ウシは、予想される分娩日の３０～５０日前、より好ましくは３５～４５日前、最も好ましくは４２日前に免疫された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ドメインを用いたブーストを、最後の免疫化の１０～２０日後、より好ましくは１２～１５日後、最も好ましくは１４日後に与えた。
【0055】
図３Ａは、免疫化タイムラインを示す。
【0056】
ＣＨＯ細胞におけるタンパク質産生のために遺伝子配列及びそれぞれの発現ベクター（ＱＭＣＦベクター及びＱＭＣＦ技術；Ｓｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｖｏｌ．７９，Ｎｏ．２４；米国特許第７，７９０，４４６号）を生成することによって、ＲＢＤ、Ｓ１及び三量体Ｓタンパク質を産生した。各ウイルス単離株の産生されたタンパク質を均質に精製し、泌乳中のウシの更なる免疫化に使用した。乳牛は、泌乳期間中に２回又は３回の投与で免疫化を受けた。全てのウシは、アジュバント溶液中の抗原として等量のアルファ、ベータ及びガンマ株ＲＢＤタンパク質の混合物を受けた。一部のウシは、アジュバント溶液中の抗原としてデルタ株Ｓ１タンパク質を受けた。第２の妊娠期間の最終期に、ウシをアジュバント溶液中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ株ＲＢＤタンパク質で１回免疫し、続いて、アジュバント溶液中のデルタ株Ｓ１タンパク質で１回ブーストした。免疫応答は、２～３週間ごとに血清を収集し、それを競合ＥＬＩＳＡアッセイで分析して、中和抗体、三量体Ｓタンパク質とその受容体分子ＡＣＥ－２との間の相互作用を遮断できる抗体を検出することによって、監視した。競合ＥＬＩＳＡアッセイの原理を、図６、左パネルに示す。
【0057】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対して免疫された動物の第１の免疫化後の血清応答
第１の免疫化後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質特異的免疫応答の発生を監視するために、試験動物からの血清を、出産までの間、免疫化の前及び間に得た。図２に示されるように、免疫化後２５日目から開始し、４０日目頃にピークを迎えるスパイク特異的免疫応答の強い開始が観察された。７頭のウシについて結果を示す。検出された血清免疫応答の大部分はＩｇＧ免疫グロブリンであり、４０日目に一部の試験動物でＩｇＭ血清抗体がわずかに検出された。得られた血清応答がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する可能性があるかどうかを調べるために、生化学的ＡＣＥ２ブロッキングアッセイを実行した。Ｓタンパク質（例えば、配列番号４）を、２．５μｇ／ｍＬとなるように、ＭａｘｉＳｏｒｐ高容量結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳ）上にコーティングした。異なる時点で試験動物から得られた連続希釈血清とともにＳタンパク質をインキュベートし、続いて洗浄し、ビオチン化ＡＣＥ２－Ｆｃとともにインキュベートし、ストレパビジン－ＨＲＰによって検出した。ＡＣＥ２遮断が明白になった最小希釈倍率は、図２の右Ｙ軸に示される。
第１の免疫化後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質特異的免疫応答の発生を監視するために、試験動物からの血清を、出産までの間、免疫化の前及び間に得た。図２に示されるように、免疫化後２５日目から開始し、４０日目頃にピークを迎えるスパイク特異的免疫応答の強い開始が観察された。７頭のウシについて結果を示す。検出された血清免疫応答の大部分はＩｇＧ免疫グロブリンであり、４０日目に一部の試験動物でＩｇＭ血清抗体がわずかに検出された。得られた血清応答がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する可能性があるかどうかを調べるために、生化学的ＡＣＥ２ブロッキングアッセイを実行した。Ｓタンパク質（例えば、配列番号４）を、２．５μｇ／ｍＬとなるように、ＭａｘｉＳｏｒｐ高容量結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳ）上にコーティングした。異なる時点で試験動物から得られた連続希釈血清とともにＳタンパク質をインキュベートし、続いて洗浄し、ビオチン化ＡＣＥ２－Ｆｃとともにインキュベートし、ストレパビジン－ＨＲＰによって検出した。ＡＣＥ２遮断が明白になった最小希釈倍率は、図２の右Ｙ軸に示される。
【0058】
完全な免疫スケジュール中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する免疫された動物の血清応答
図３Ａ～Ｅは、完全な免疫スケジュールに従って、２頭の免疫されたウシ（６５３６のＢ及び２２７９のＣ）の血清からの免疫化及び分娩タイムライン（Ａ）並びに抗体の中和効果を示す。グラフＢ及びＣは、５０倍希釈の血清で実行したＥＬＩＳＡアッセイの相対ＯＤ４５０シグナルを示し、最も低いシグナルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の三量体Ｓタンパク質と結合する能力の高い抗体を意味し、その結果、ＡＣＥ受容体との相互作用を遮断する。グラフＤ（ウシ６５３６）及びＥ（ウシ２２７９）は、初乳を１００倍希釈倍率の初乳上で実行したＥＬＩＳＡアッセイの相対ＯＤ４５０シグナルを示す。
図３Ａ～Ｅは、完全な免疫スケジュールに従って、２頭の免疫されたウシ（６５３６のＢ及び２２７９のＣ）の血清からの免疫化及び分娩タイムライン（Ａ）並びに抗体の中和効果を示す。グラフＢ及びＣは、５０倍希釈の血清で実行したＥＬＩＳＡアッセイの相対ＯＤ４５０シグナルを示し、最も低いシグナルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の三量体Ｓタンパク質と結合する能力の高い抗体を意味し、その結果、ＡＣＥ受容体との相互作用を遮断する。グラフＤ（ウシ６５３６）及びＥ（ウシ２２７９）は、初乳を１００倍希釈倍率の初乳上で実行したＥＬＩＳＡアッセイの相対ＯＤ４５０シグナルを示す。
【0059】
この結果は、免疫及び再免疫が、免疫されたウシの血清からの抗体の中和効果に明らかな効果があることを示している。抗原の各投与後、ＡＣＥ２－三量体Ｓ－タンパク質相互作用を遮断する測定可能な抗体能力が明らかに増加した。再免疫化のプラスの効果は、初乳にも見ることができる（図３Ｄ及びＥ）。中和抗体は、ウシ６５３６の５回目の搾乳及びウシ２２７９の最初の３回目の搾乳でも検出された。ウシの再免疫化は、より高い中和効果をもたらした。
【0060】
また、５～７週間ごとの再免疫化の継続が、通常の乳の濃縮乳清中の中和抗体の検出につながることも見出された（結果は図示せず）。
【0061】
したがって、本開示は、ＡＣＥ２－三量体Ｓタンパク質を遮断することができ、免疫された乳牛の初乳から効率的な中和抗体を得る方法を提供する。高度免疫（改変）ウシ初乳を産生する方法が提供され、この方法は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質バリアント及び少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントで乳牛を免疫するステップと、子ウシの出生後に改変ウシ初乳を収集し、更には分娩後に最大３～５回のウシの乳を収集するステップを含む。好ましい実施形態では、得られた高度免疫初乳は、ＩｇＧ免疫グロブリンとして、７０～１００ｍｇ／ｍｌの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含む。
【0062】
本開示に提供される方法によれば、ウシは、予想される分娩の４０～７０日前、好ましくは５０～７０日前、最も好ましくは５５～６５日前にＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質で１回目の免疫をされ、１回目の免疫から１５～２５日後に２回目の免疫をされ、２回目の免疫から１０～１５日後にＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質ブーストを与えられる。
【0063】
免疫グロブリンを含有することが証明された改変（高度免疫）初乳を、以下に記載するように更に処理した。
【0064】
ウシ初乳からの免疫グロブリン濃縮溶液の調製
初乳は、子ウシの出生後４～６日間収集した。出生後の最初の初乳は、抗体濃度が７０～１００ｍｇ／ｍｌと最も高く、乳量は約２０リットルであった。脂肪及びカゼインをキモシンで凝固させることによって乳から除去し、得られた乳清を以下に記載され、図４に例示されるように更に処理した。
初乳は、子ウシの出生後４～６日間収集した。出生後の最初の初乳は、抗体濃度が７０～１００ｍｇ／ｍｌと最も高く、乳量は約２０リットルであった。脂肪及びカゼインをキモシンで凝固させることによって乳から除去し、得られた乳清を以下に記載され、図４に例示されるように更に処理した。
【0065】
牛乳から分離した乳清を最初に０．４５μＭのフィルターで濾過し、酵母、より大きな細菌、及び他の粒子を除去する。次に、３０ｋＤａのカットオフカセットを用いる接線流濾過法を使用して、乳清を最大１０回濃縮する。次に、濃縮乳清を、Ｇタンパク質マトリックスを使用して、親和性クロマトグラフィーで精製する。クロマトグラフィー精製中、抗体をマトリックスに結合させ、マトリックスを１ｘＰＢＳ溶液で洗浄して、任意の乳清残留分を除去する。１ｘＰＢＳ溶液中の８５０ｍＭ ＮａＣｌで第２の洗浄を実行して、非特異的相互作用（タンパク質－タンパク質、タンパク質－表面）を弱め、汚染物質を除去する。免疫グロブリン画分をｐＨ２．７の０．１Ｍのグリシンで溶出する。存在する可能性のあるウイルスを調製物から排除するために、精製された物質をグリシン緩衝液中に３０分間放置することによって、低ｐＨ処理を実行する。次いで、ＩｇＧ調製物をｐＨ７．５の１．５Ｍトリス緩衝液で中和する。次に、精製した抗体溶液を濃縮し、５０ｋＤａのカットオフフィルターを備えた接線流濾過システム上で緩衝液交換を実行する。次に、最終生成物を滅菌濾過し、５８℃で３０分間熱処理する。次いで、０．２２μｍフィルターを通して滅菌濾過し、最終配合物を得た。濾過製剤は、ここではＢＯＳＳ Ｉｇ（ウシＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質免疫グロブリン）と呼ばれる。
【0066】
代わりに、脱脂カゼイン消耗乳清を－２０℃で凍結し、精製工程まで保持した。カゼイン残渣を除去するために、乳清を＋４℃で溶かし、次いで、１ＭのＨＣｌを使用してｐＨを４．２～４．５に調節し、乳清を室温で１時間、マグネットスターラーを使用して連続的に混合しながら放置した。その後、１ＭのＨＣｌでｐＨを３．３に調整し、乳清を室温で１時間放置して、可能性のあるウイルス汚染物質を不活性化した。ｐＨ処理した初乳清を、１．５ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）を使用して、ｐＨ値６．７～７．０に中和し、５μｍ及び０．２２μｍのフィルターを通して濾過した。濾過した溶液を硫酸アンモニウムと混合して最終濃度２Ｍとし、初乳タンパク質の沈殿を開始し、沈殿手順を＋４℃で一晩行った。翌日、タンパク質沈殿物を、４℃で１５分間、７０００Ｘｇでの遠心分離によって、上清から分離した。沈殿した初乳タンパク質を１×ＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）溶液中に再懸濁し、１００ｍｇ／ｍＬに濃縮した。濃度は、２８０ｎｍでの読み取り吸光度、及び０．１％溶液のＩｇＧ吸光度（Ａ２８０
０．１％）＝１．３７を用いて測定した。濃縮免疫グロブリン濃縮溶液を、接線流濾過（ＴＦＦ）の方法によって１×ＤＰＢＳに対して透析した。ＴＦＦを、５０ｋＤａのカットオフナンバーを有するＳａｒｔｏｃｏｎカセットを使用して、Ａｋｔａ Ｆｌｕｘ６上で実行した。透析した初乳タンパク質を０．２２μｍ濾過し、続いて低温殺菌した。低温殺菌ステップは、溶液を６３℃で３０分間加熱した後、０．２２μｍのフィルターを通して無菌濾過することによって行った。次いで、得られた濾過生成物を更に試験した。ＢＯＳＳ Ｉｇの微生物学的質は、欧州薬局方１０．３の方法２．６．１に従って試験した。滅菌試験及び２．６．１２．微生物検査試験。試験では微生物の増殖は認められず、ＢＯＳＳ Ｉｇ調製物は試験に合格し、無菌試験に適合した（結果は図示せず）。
【0067】
次に、以下に記載されるように、ＢＯＳＳ Ｉｇ生成物をＡＣＥ２遮断活性について更に試験した。
【0068】
ウイルススパイクタンパク質及びヒト細胞受容体ＡＣＥ２相互作用の抑制を測定するための生化学的アッセイを使用する、初乳由来免疫グロブリン調製物のＡＣＥ２遮断活性の特性評価。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質は、ウイルス受容体の結合領域を含み、この結合領域はヒト受容体ＡＣＥ２を介したウイルスの吸着及び細胞への侵入を媒介する。したがって、ウイルス侵入の阻害は、Ｓタンパク質とＡＣＥ２との間の相互作用の阻害によって達成できる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質は、ウイルス受容体の結合領域を含み、この結合領域はヒト受容体ＡＣＥ２を介したウイルスの吸着及び細胞への侵入を媒介する。したがって、ウイルス侵入の阻害は、Ｓタンパク質とＡＣＥ２との間の相互作用の阻害によって達成できる。
【0069】
図６（左パネル）は、追加された免疫グロブリン調製物によるＡＣＥ２－三量体Ｓタンパク質相互作用を決定するために使用される、競合ＥＬＩＳＡアッセイの原理を示す。図６（右パネル）は、最初に得られた免疫グロブリン調製物（ＢＯＳＳ Ｉｇ００１）のＡＣＥ２－三量体スパイクタンパク質相互作用遮断能力のグラフを示す。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡプレートウェルを、それぞれの懸念されるバリアント（ＶＯＣ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質でコーティングした。次いで、目的の試料（ここでは初乳免疫グロブリン調製物）を加え、事前にインキュベートして、抗体が結合することを可能にした。次に、ＡＣＥ２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが細胞に侵入するためのヒト受容体）のビオチン標識細胞外ドメイン及びＨＲＰ標識ストレプトアビジンを含有する酵素複合体を、その間に何ら洗浄することなく加え、３０分間インキュベートした。非結合ＡＣＥ２を洗い流した後、ＴＭＢ基質を使用して、スパイク－ＡＣＥ２相互作用を検出した。競合ＥＬＩＳＡ結果の解釈において、より高いシグナルは、ウイルススパイクタンパク質とヒトＡＣＥ２受容体との間のより多くの相互作用を示し、したがって、より低いシグナルは、ＡＣＥ－三量体Ｓ－相互作用の遮断、したがって、中和抗体の存在の可能性を示す。初乳免疫グロブリン調製物によるこの相互作用の阻害は、相対光学密度（ＯＤ）単位で表され、目的の試料中のＯＤ値を、阻害剤を含まない試料中のＯＤ値で割った比として計算される。したがって、相対ＯＤ値が低いほど、ウイルススパイクタンパク質とヒトＡＣＥ２受容体との間の相互作用がより阻害されることを示す。システムの較正のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する十分に特徴付けられたモノクローナル抗体及びＣＯＶＩＤ－１９から回復した個体からのヒト回復期血漿を使用し、０．７５未満の相対ＯＤ値が阻害を示すとみなした。
【0070】
図５において、武漢変バリアント由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質で免疫されたウシの初乳由来の３つの異なる免疫グロブリン調製物（ウシ６５３６、２２７９、１０２０）の阻害特性を上述のアッセイで分析した場合の結果を示す。図６右側のパネルは、武漢、ベータ、ガンマ、デルタ及びカッパバリアントで試験した免疫グロブリン調製物の同様の結果を示す。重要なことに、ここでは、ウシには武漢変異体のＣｏＶ－２スパイクタンパク質のみで免疫したが、得られた免疫グロブリン調製物の中和能力は、効率は異なるが、試験した全てのバリアントで検出された。図６に示されるように異なるバリアントのＩ５０値は、武漢、アルファ及びデルタバリアントはおおよそ１００ｕｇ／ｍｌ、カッパバリアントは１３０ｕｇ／ｍｌ、並びにベータ及びガンマバリアントは２５０～３００ｕｇ／ｍｌである。明らかに、調製物は、スパイクタンパク質とＡＣＥ２との間の相互作用を濃度依存的に阻害し、したがって、ヒト細胞へのウイルス侵入を遮断する効果を有する。対照的に、このような阻害活性は、非免疫化ウシの初乳由来の対照製剤を使用した場合には観察されなかった（図５に示す）。
【0071】
更に、免疫グロブリン調製物が、免疫化に使用されるもの以外のバリアントに対して有効であることは明らかである。本発明のこの態様を更に評価するために、実験を最近到着したオミクロンバリアントに拡大した。
我々は、ＢＯＳＳ Ｉｇ００１免疫グロブリン生成物及びＢＯＳＳ Ｉｇ００３を、アルファ、デルタ及びオミクロンスパイクタンパク質で試験した。その結果を図７に示す。アルファ及びデルタに対するＢＯＳＳ Ｉｇ００１のＩＣ５０値はそれぞれ１２６及び１６８ｕｇ／ｍｌであったが、オミクロンバリアントに対するＩＣ５０値は６９０ｕｇ／ｍｌと高かった。しかし、ＢＯＳＳ Ｉｇ００３では、アルファ、デルタ及びオミクロンのＩＣ５０値は、それぞれ１９ｕｇ／ｌ、１８．５ｕｇ／ｍｌ及び１０．５ｕｇ／ｍｌであった。これは、動物の継続的な免疫が、明らかに、調製物のポリクローナル効力を増加させたことを示す。
我々は、ＢＯＳＳ Ｉｇ００１免疫グロブリン生成物及びＢＯＳＳ Ｉｇ００３を、アルファ、デルタ及びオミクロンスパイクタンパク質で試験した。その結果を図７に示す。アルファ及びデルタに対するＢＯＳＳ Ｉｇ００１のＩＣ５０値はそれぞれ１２６及び１６８ｕｇ／ｍｌであったが、オミクロンバリアントに対するＩＣ５０値は６９０ｕｇ／ｍｌと高かった。しかし、ＢＯＳＳ Ｉｇ００３では、アルファ、デルタ及びオミクロンのＩＣ５０値は、それぞれ１９ｕｇ／ｌ、１８．５ｕｇ／ｍｌ及び１０．５ｕｇ／ｍｌであった。これは、動物の継続的な免疫が、明らかに、調製物のポリクローナル効力を増加させたことを示す。
【0072】
したがって、本開示は、免疫された乳牛から高度免疫初乳を得る方法を提供する。一態様によれば、この方法は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤタンパク質バリアント及び少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で乳牛を免疫するステップと、第１の分娩後に高度免疫初乳を収集するステップと、任意選択的に、第１の分娩後５～７週間ごとに免疫化を継続するステップと、第２の妊娠期間の第３期中に更なる免疫化を提供するステップと、第２の分娩後に初乳を更に収集するステップと、第１の分娩後及び／又は第２の分娩後に初乳から免疫グロブリン生成物を調製するステップと、を含む。好ましい実施形態において、生成物は、２つ以上のバリアントのＡＣＥ２三量体タンパク質の高い中和効果を有し、バリアントのＩＣ５０値は、２００～２０ｕｇ／ｍｌの範囲である。本発明の一態様によれば、この初乳は、多数のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２バリアントのＡＣＥ２－三量体Ｓタンパク質を遮断するのに有効な免疫グロブリンを含む。本発明の特定の態様によれば、この初乳は、ウシの免疫化に使用されたバリアント以外のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２バリアントのＡＣＥ２－三量体Ｓタンパク質を遮断することができる免疫グロブリンを含む。
【0073】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染中のウイルス侵入を模倣する偽型ウイルスアッセイにおける初乳製剤の抗ウイルス活性の特徴付け
初乳免疫グロブリン調製物のウイルス中和能力を更に特徴付けるために、偽型ウイルス中和アッセイを実行した。偽型ウイルスは、ゲノムがレトロウイルス自体の特性を保持しながら、別のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を保持するか、又は別のウイルスのエンベロープ糖タンパク質で偽型化されて、外因的なウイルスエンベロープを有するウイルスを形成するレトロウイルスを指す。ここで、プロウイルスのＤＮＡに組み込まれたルシフェラーゼマーカー遺伝子を含有するＨＩＶベースの偽型ウイルスを使用して、初乳製調製物の抗ウイルス活性を特徴付けた。
初乳免疫グロブリン調製物のウイルス中和能力を更に特徴付けるために、偽型ウイルス中和アッセイを実行した。偽型ウイルスは、ゲノムがレトロウイルス自体の特性を保持しながら、別のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を保持するか、又は別のウイルスのエンベロープ糖タンパク質で偽型化されて、外因的なウイルスエンベロープを有するウイルスを形成するレトロウイルスを指す。ここで、プロウイルスのＤＮＡに組み込まれたルシフェラーゼマーカー遺伝子を含有するＨＩＶベースの偽型ウイルスを使用して、初乳製調製物の抗ウイルス活性を特徴付けた。
【0074】
単一ラウンドでＡＣＥ２を含有するＨＥＫ２９３細胞に感染するＨＩＶベースの偽型ウイルスの能力は、偽型ウイルス粒子の表面上の偽型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の存在に厳密に依存することが示された。量子化可能なルシフェラーゼマーカー遺伝子は、感染後に標的細胞ゲノムに組み込まれる。したがって、スパイクタンパク質依存性感染の有効性は、偽型ウイルスの感染に成功した後に標的細胞で検出可能になるルシフェラーゼ活性によって測定することができ、細胞へのウイルス侵入の阻害は、ルシフェラーゼシグナルのレベルの低下に相関する。一般に、そのようなアッセイは、免疫グロブリンのような異なる化合物の抗ウイルス特性を評価することと非常に関連していると考えられている。
【0075】
図８において、上記の偽型ウイルスアッセイの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質免疫化ウシ（６５３６）の初乳又は未免疫化ウシに由来する免疫グロブリン調製物を使用して、示される。２０２０／２０２１シーズンに広範かつ急速に拡散した異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスバリアント（南アフリカ系統Ｂ．１．３５１、ブラジル系統Ｐ１、ＵＫバリアントＵＫ２０２０１２／０１、及び元の武漢ウイルス）のスパイクタンパク質を伴う偽型である、異なる偽型ウイルスを使用した。明らかに、免疫されたウシに由来する調製物は、ここで試験された全ての偽型ウイルスの侵入を効率的に阻害し、完全な阻害は、約１００μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で観察された。対照的に、未免疫のウシ由来の初乳免疫グロブリンは効果がない。図９は、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ及びカッパバリアントからのスパイクタンパク質を用いた同様の実験を示す。この試験におけるアルファバリアントのＩＣ５０値は８．７３３であり、ベータについては３０．９６、ガンマについては３５．３６、デルタについては１４，６９、及びカッパについては１７．４２であった。非免疫化ウシ由来の初乳免疫グロブリンは、阻害効果を示さなかった。
【0076】
実験を新しいオミクロンバリアントに再び拡張した。図１０は、デルタ及びオミクロンバリアントに対するＢＯＳＳ００１及びＢＯＳＳ００３のアッセイを示す。ＢＯＳ００１の調製において、ウシをアルファ、ベータ、ガンマ及びデルタバリアントで再免疫したが、オミクロンでは再免疫しなかった。図に示すように、再免疫されたウシの第２の分娩後に初乳から得られた免疫グロブリン調製物ＢＯＳ００３は、デルタ及びオミクロンバリアントの両方に対して有意により効果的であり、それぞれのＩＣ５０値は５及び３μｇ／ｍｌである。したがって、ＢＯＳＳ００３は、ＢＯＳＳ００１と比較して、オミクロンバリアントで約１０倍の効率を示す。ウシがオミクロンタンパク質で免疫されたことがない場合でも、オミクロンバリアントで阻害が明確に見られたという事実は、継続的な再免疫化がはるかに成熟した免疫応答を提供し、その結果としてポリクローナル応答を提供することを示している。
【0077】
したがって、本開示は、多数のウイルスバリアントに対して有効な免疫化ウシの高度免疫初乳から免疫グロブリン生成物を産生する方法を提供する。本発明の一態様において、本開示は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ウイルス単離株における一般的なエピトープに対する免疫応答を誘導するために、再免疫されたウシの初乳から免疫グロブリン生成物を産生する方法を提供し、免疫応答は、ウシを免疫するためには使用されていないバリアントに拡張することができ、それによって、本発明は、現在及び将来のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２変異型に対して有効な免疫グロブリン生成物を提供する方法を提供する。したがって、本開示は、既知のＳＡＲＳ Ｃｏｖ－２単離株に対して有効であるが、今でも未知のバリアントに対しても有効である抗体を産生する方法を提供する。その最も広い範囲において、本発明は、更なるパンデミックを回避するために、又は生物兵器に対する保護のためにさえ、免疫グロブリン生成物を製造する方法を提供する。
【0078】
ＶＥＲＯ Ｅ６アッセイを使用する生ウイルス中和力の同定
初乳免疫グロブリン調製物のウイルス中和能力を、スパイク－ＡＣＥ２相互作用に依存する細胞侵入の開始に関してだけでなく、より一般的に標的細胞集団における本物のウイルス複製に関しても更に特徴付けるために、細胞ベースの生ウイルス中和アッセイについて、よく知られているＶｅｒｏ Ｅ６アッセイを使用した。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株は、アフリカミドリザルの腎臓に由来し、この細胞は、高レベルでＡＣＥ２を発現し、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対してとても感染しやすい。したがって、これらのアッセイでは、最小限の感染でさえ、細胞培養におけるウイルスの複製及び拡散につながり、細胞障害性効果は顕微鏡で容易に検出可能であった。対照的に、抗ウイルス剤（例えば、ウイルス中和免疫グロブリン）の存在下での細胞障害性効果の欠如は、アッセイにおける完全な中和及び保護を示す。
初乳免疫グロブリン調製物のウイルス中和能力を、スパイク－ＡＣＥ２相互作用に依存する細胞侵入の開始に関してだけでなく、より一般的に標的細胞集団における本物のウイルス複製に関しても更に特徴付けるために、細胞ベースの生ウイルス中和アッセイについて、よく知られているＶｅｒｏ Ｅ６アッセイを使用した。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株は、アフリカミドリザルの腎臓に由来し、この細胞は、高レベルでＡＣＥ２を発現し、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対してとても感染しやすい。したがって、これらのアッセイでは、最小限の感染でさえ、細胞培養におけるウイルスの複製及び拡散につながり、細胞障害性効果は顕微鏡で容易に検出可能であった。対照的に、抗ウイルス剤（例えば、ウイルス中和免疫グロブリン）の存在下での細胞障害性効果の欠如は、アッセイにおける完全な中和及び保護を示す。
【0079】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質で免疫されたウシ（６５３６、２２７９）の初乳に由来する免疫グロブリンのウイルス中和特性を、Ｖｅｒｏ Ｅ６アッセイで特徴付けた。簡潔に述べると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（エストニア単離株３５４２）をＤＭＥＭ／０．２％ＢＳＡ／Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐで希釈し、１０２ｐｆｕのウイルスを連続希釈した初乳免疫グロブリン調製物に加えた。混合物を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞の懸濁液を、最終体積が１００ｕｌ／ウェルとなるように、３連で９６ウェル組織培養プレートのウェルに加えた（４×１０ｅ４細胞／ウェル）。ウイルス処理細胞を３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。次に、細胞障害性効果の出現を検出することによって、中和アッセイの結果を顕微鏡的に評価した。細胞障害性効果がなかった最初の希釈（調製物の総タンパク質濃度によって測定）を、完全中和濃度と決定した。異なる実験において、完全ウイルス中和は、０．８～２．２ｎｇ／ｍｌの低い濃度で観察された。図１１は、２つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス中和アッセイの結果を例示し、その結果は、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２誘導細胞障害性効果が見られず、それぞれ１．６６ｎｇ／ｍｌ及び４．９５ｎｇ／ｍｌの試料濃度で完全なウイルス中和が観察された、最小の試験試料濃度を決定する。
【0080】
動物実験
開発した免疫グロブリン含有製剤のインビボにおける有効性を評価するため、ＳＡＲＳ ＶｏＶ－２製剤ＢＯＳＳ Ｉｇ００１を異なる濃度でシシリアンゴールデンハムスターに経鼻投与した後、１０５ｐｆｕのＳＡＲＳ－ＣＯｖ－２ウイルスを感染させる、予防研究を実行した。感染した動物を４日間監視した後、それらを屠殺し、肺ウイルス力価を決定した。図１３に見られるように、非高度免疫抗体調製物（初乳Ｉｇ非免疫化ウシ）は、ウイルス力価の低下に影響を及ぼさなかった。ＢＯＳＳ Ｉｇ００１（０．１ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌ）の両方の試験濃度は、単回鼻腔内投与後であっても、高ウイルス量を低減する有効性を有した。
開発した免疫グロブリン含有製剤のインビボにおける有効性を評価するため、ＳＡＲＳ ＶｏＶ－２製剤ＢＯＳＳ Ｉｇ００１を異なる濃度でシシリアンゴールデンハムスターに経鼻投与した後、１０５ｐｆｕのＳＡＲＳ－ＣＯｖ－２ウイルスを感染させる、予防研究を実行した。感染した動物を４日間監視した後、それらを屠殺し、肺ウイルス力価を決定した。図１３に見られるように、非高度免疫抗体調製物（初乳Ｉｇ非免疫化ウシ）は、ウイルス力価の低下に影響を及ぼさなかった。ＢＯＳＳ Ｉｇ００１（０．１ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌ）の両方の試験濃度は、単回鼻腔内投与後であっても、高ウイルス量を低減する有効性を有した。
【0081】
したがって、本発明の態様は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染を低減する保護効果を提供するための、経鼻投与システムとして使用するために、免疫されたウシの高度免疫初乳から得られた免疫グロブリン製剤を提供することである。
【0082】
様々な条件での抗体調製物の経時的な機能的安定性の評価
得られた初乳免疫グロブリン製剤の安定性を評価するために、免疫グロブリン含有溶液を４℃、２５℃、及び４０℃の３つの異なる温度で７日間にわたってインキュベートし、インキュベーションから４８時間及び７日後にＡＣＥ２遮断活性を測定した。図１２からわかるように、ＡＣＥ２遮断活性の有意な変化は、経時的には決定されず、得られた抗体調製物の高い機能的安定性を示した。更なる実験において、ＢＯＳＳ Ｉｇ－生成物は、＋４℃又は－２０℃で保管した場合、少なくとも１１ヶ月間安定したままであることが判明した。（結果は図示せず）。更なる実験では、最終鼻腔内スプレーにおける抗体が少なくとも９ヶ月間有効であることが示されている（結果は示されていない）。したがって、本開示は、＋４℃で少なくとも１１ヶ月間安定したままである初乳免疫グロブリン調製物を提供する。
得られた初乳免疫グロブリン製剤の安定性を評価するために、免疫グロブリン含有溶液を４℃、２５℃、及び４０℃の３つの異なる温度で７日間にわたってインキュベートし、インキュベーションから４８時間及び７日後にＡＣＥ２遮断活性を測定した。図１２からわかるように、ＡＣＥ２遮断活性の有意な変化は、経時的には決定されず、得られた抗体調製物の高い機能的安定性を示した。更なる実験において、ＢＯＳＳ Ｉｇ－生成物は、＋４℃又は－２０℃で保管した場合、少なくとも１１ヶ月間安定したままであることが判明した。（結果は図示せず）。更なる実験では、最終鼻腔内スプレーにおける抗体が少なくとも９ヶ月間有効であることが示されている（結果は示されていない）。したがって、本開示は、＋４℃で少なくとも１１ヶ月間安定したままである初乳免疫グロブリン調製物を提供する。
【0083】
ヘルスケアにおける初乳由来抗体の使用
本発明の特定の態様は、ヒトにおけるＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２感染のリスクを低下させるために使用するための、初乳免疫グロブリン調製物を含む。好ましい実施形態によれば、初乳免疫グロブリン調製物は、鼻腔内送達システムにおける使用のためのものである。初乳免疫グロブリン又はそれらの組み合わせの好ましい鼻腔内送達システムは、溶液スプレーである。ある特定の態様によれば、初乳免疫グロブリン生成物は、鼻腔点滴剤、ナノゲル剤、鼻腔内泡剤又は溶解性パッキン剤、乾燥鼻腔粉末スプレー、鼻腔軟膏剤から選択されてもよい。
本発明の特定の態様は、ヒトにおけるＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２感染のリスクを低下させるために使用するための、初乳免疫グロブリン調製物を含む。好ましい実施形態によれば、初乳免疫グロブリン調製物は、鼻腔内送達システムにおける使用のためのものである。初乳免疫グロブリン又はそれらの組み合わせの好ましい鼻腔内送達システムは、溶液スプレーである。ある特定の態様によれば、初乳免疫グロブリン生成物は、鼻腔点滴剤、ナノゲル剤、鼻腔内泡剤又は溶解性パッキン剤、乾燥鼻腔粉末スプレー、鼻腔軟膏剤から選択されてもよい。
【0084】
鼻腔内送達システムのための免疫グロブリン調製物を作る際に、初乳から得られ、上記のように精製された初乳免疫グロブリン生成物を出発物質として使用する。最終生成物において、ｐＨを調節し、免疫グロブリン濃度を所望に応じて、例えば、ＤＰＢＳ ｐＨ７．４で調節する。溶液は低温殺菌され、滅菌され、使用のために梱包される。鼻腔内送達システムは、例えば、０．０１～１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５～０．８ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１～０．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．０１５～０．２５ｍｇ／ｍｌの抗ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２抗体を含み得る。
【0085】
初乳鼻腔内送達システムが鼻粘膜にどれくらい存続するかを決定するために、健康な個体を臨床試験に招待した。８人の個体に、０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度を有するＢＯＳＳＩｇ００１を含有する鼻腔内スプレー製剤を投与した。各鼻孔は、それぞれ約１００ｕｌの２回用量で投与され、それにより、合計４０ｕｇの初乳免疫グロブリンが投与された。その後、投与後５分、１時間及び４時間後に、体積容量１５ｕｌの濾過紙片を鼻粘膜上に置いた。その紙片を１０分間保持して、粘膜からウシＩｇＧを吸収した。対照として、スプレーの投与前に試料を採取した。試料を、ウシ－ＩｇＧ特異的キット（Ａｂｃａｍ、Ｃｏｗ Ｉｇ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ、カタログ番号ａｂ１９０５１７）を使用して解析した。ウシＩｇＧは、１時間後に全ての個体で検出可能であり、ＩｇＧの平均濃度は５．６５ｕｇ／ｌであることが観察された。４時間後には、２．３６ｕｇ／ｌが検出可能であった。このため、本発明の一態様に従って、初乳免疫グロブリン生成物、好ましくは鼻腔内スプレーを提供し、この生成物は、０．０１～１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５～０．８ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１～０．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．１５～０．２５ｍｇ／ｍｌの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含む。予防的に鼻腔内スプレーを使用することは、感染のリスクが高い状況に対処する前に、０．００６～０．６ｍｇの免疫グロブリンを含む用量をスプレーすることを含み得る。調製物の使用は、８～１５時間の保護を提供する。
【0086】
本開示において、高濃度の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含む初乳を製造する方法が、特に鼻腔内スプレーで使用するために、提供される。免疫グロブリンスプレー生成物は、例えば、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ及びオミクロン変異体を含む様々なウイルス単離株のＲＢＤ、Ｓ１及び／又は三量体Ｓタンパク質で１回又は複数回免疫された乳牛の初乳から単離された抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を０．２ｍｇ／ｍｌ含んでもよい。本生成物は、複数のウイルス株に対して有効な抗体を含有してもよい。実験部分では、少数のウイルス株からの抗原によるウシの免疫が記載されている。しかしながら、当業者は、本発明が、ウイルスの任意の新しい株を使用して、ウシを免疫するための配列を単離又は化学的に合成することを含むことを理解する。この柔軟性は、ウイルスの急速な進化に迅速に対応する方法を提供する。更に、本明細書に記載の方法及び生成物は、まだ知られていない新しいバリアントを阻害するためのツール、したがって、新しいパンデミックと戦うためのツールを提供する。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】