特表 2024-511743 標識レベルの制御を備えた金属標識ポリマーマイクロビーズ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-15

(54)【発明の名称】標識レベルの制御を備えた金属標識ポリマーマイクロビーズ

(51)【国際特許分類】

   C08F 212/00 20060101AFI20240308BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240308BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20240308BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20240308BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20240308BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20240308BHJP

   C08J 3/12 20060101ALI20240308BHJP

   C08F 220/02 20060101ALI20240308BHJP

【ＦＩ】

C08F212/00

G01N33/53 P

G01N33/53 U

G01N33/543 525U

G01N33/543 525E

G01N33/543 525W

G01N27/62 V

C12M1/00 A

C12M1/34 F

C08J3/12 Z CER

C08F220/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023555572

(86)(22)【出願日】2022-03-15

(85)【翻訳文提出日】2023-10-30

(86)【国際出願番号】 CA2022050386

(87)【国際公開番号】W WO2022193004

(87)【国際公開日】2022-09-22

(31)【優先権主張番号】63/161,414

(32)【優先日】2021-03-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/319,608

(32)【優先日】2022-03-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518353957

【氏名又は名称】ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロント

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ウィニク，ミッチェル エー

(72)【発明者】

【氏名】リウ，ジエイー

【テーマコード（参考）】

2G041

4B029

4F070

4J100

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041DA14

2G041FA10

2G041FA12

2G041GA06

2G041LA03

4B029AA07

4B029AA21

4B029BB13

4B029BB15

4B029BB20

4B029CC02

4B029FA12

4B029GB09

4F070AA18

4F070AA36

4F070AB01

4F070AC23

4F070AC52

4F070DB03

4F070DC02

4F070DC16

4J100AB02P

4J100AB03P

4J100AB04P

4J100AB07P

4J100AB07Q

4J100AB08P

4J100AB16P

4J100AJ02P

4J100AL01P

4J100AL66Q

4J100AL67Q

4J100AM15P

4J100AM25Q

4J100BA17Q

4J100BA28Q

4J100BA29P

4J100BA34Q

4J100BC43Q

4J100BC73Q

4J100JA53

(57)【要約】

本開示は、マスサイトメトリービーズ系アッセイおよび多重化適用のための金属標識されたポリマーマイクロビーズ、特に、ランタニド標識されたポリマーマイクロビーズに関する。ポリマーマイクロビーズは、構造モノマーおよび金属キレートモノマーを含む、コポリマーを含む。
【選択図】図２Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

構造モノマー、および
金属およびキレート化剤を含む金属キレートモノマー
を含むコポリマー、
を含む金属コード化されたマイクロビーズであって、
前記キレート化剤は、少なくとも３つの部位で前記金属を配位し；および
前記構造モノマーは、前記キレート化剤を含まない、金属コード化されたマイクロビーズ。

【請求項2】

前記構造モノマーは、置換されたもしく置換されないスチレン、α－メチルスチレン、アクリル酸およびそれらのエステルならびにアミド、メタクリル酸およびそれらのエステルならびにのアミド、ならびにそれらの誘導体から選択され、場合により前記構造モノマーは、スチレンである、請求項１に記載のマイクロビーズ。

【請求項3】

前記金属キレートモノマーは、重合の前に式Ｉ：

【化1】

（式中、リガンドは、前記キレート化剤であり、Ｌは、リンカーであり、Ｘは、重合可能な末端基であり、Ｍは、金属であり、およびｎは、１または２以上の整数であり、前記金属キレートモノマーは、重合の前に中性電荷であり、
場合によりＬは、結合、Ｃ３－Ｃ８アルキルアミン、Ｃ３－Ｃ８アルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８ヘテロシクロアルキル、５員または６員アリールまたはヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）Ｏ、またはそれらの混合物から選択され、場合により前記アルキレン、アリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアリール、およびシクロアルキルヘテロアリールのそれぞれは独立に、置換されないかまたはＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アミド、エステル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、ＣＮ、またはそれらの混合物から選択される１個または複数の置換基により置換され、および／または
場合により前記重合可能な末端基は、アリルビニル、スチレン、α－メチルスチレン、アクリル酸塩エステル、メタクリル酸エステル、アクリルアミド、２－メチルアクリルアミド、およびそれらの混合物から選択され、場合により前記重合可能な末端基は、アリルビニルまたはスチレンである）の構造を有する、請求項１または２に記載のマイクロビーズ。

【請求項4】

下記の１つまたは複数である、請求項３に記載のマイクロビーズ：
Ｌは、アミドまたはエステルを介して前記キレート化剤に付着され、および
前記キレート化剤は、４座配位、５座配位、６座配位、７座配位、または８座配位であり、場合により前記キレート化剤は、６座配位または８座配位であり、
場合により前記キレート化剤は、アミノポリ酸部分、またはそれらの誘導体を含み、場合により前記アミノポリ酸部分は、アミノポリカルボン酸、アミノポリホスホン酸、またはそれらの組み合わせから選択され、場合により前記アミノポリ酸部分は、エチレンイミン、プロピレンアミン、またはそれらの混合物の１種または複数の置換されたオリゴマーであり、前記オリゴマーは２種以上のカルボン酸および／またはホスホン酸で置換され、場合により前記オリゴマーは、クラウンエーテルまたはアザクラウンエーテルである。

【請求項5】

前記オリゴマーは、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アミド、エステル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、ＣＮ、またはそれらの混合物から選択される１個または複数の置換基によりさらに置換される、請求項４に記載のマイクロビーズ。

【請求項6】

前記キレート化剤は、ＤＦＯ、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＥＤＤＳ、ＥＤＤＨＡ、ＢＡＰＴＡ、Ｈ４ｎｅｕｎｐａ、Ｈ６ｐｈｏｓｐａ、Ｈ４ＣＨＸｏｃｔａｐａ、Ｈ４ｏｃｔａｐａ、Ｈ２ＣＨＸｄｅｄｐａ、Ｈ５ｄｅｃａｐａ、Ｃｙ－ＤＴＰＡ、Ｐｈ－ＤＴＰＡ、ＴＡＣＮタイプキレート化剤、ＴＡＣＤタイプキレート化剤、サイクレンタイプキレート化剤、サイクラムタイプキレート化剤、（１３）ａｎｅＮ４タイプキレート化剤、１，７－ジアザ－１２－クラウン－４タイプキレート化剤、１，１０－ジアザ－１８－クラウン－６タイプキレート化剤、またはそれらの誘導体から選択される、請求項４に記載のマイクロビーズ。

【請求項7】

前記ＴＡＣＮタイプキレート化剤は、ＮＯＴＡ、ＮＯＰＯ、ＴＲＡＰ、またはそれらの誘導体から選択され、前記サイクレンタイプキレート化剤は、ＤＯＴＡまたはその誘導体から選択され、前記サイクラムタイプキレート化剤は、ＴＥＴＡ、架橋ＴＥＴＡ、ＤｉＡｍＳａｒ、またはそれらの誘導体から選択され、前記（１３）ａｎｅＮ４タイプキレート化剤は、ＴＲＩＴＡまたはその誘導体から選択され、前記１，１０－ジアザ－１８－クラウン－６タイプキレート化剤は、ＭＡＣＲＯＰＡまたはその誘導体から選択され、および／または前記キレート化剤は、ＤＴＰＡ、Ｃｙ－ＤＴＰＡ、Ｐｈ－ＤＴＰＡ、またはそれらの誘導体から選択される、請求項６に記載のマイクロビーズ。

【請求項8】

前記金属キレートモノマーは：

【化2】

、から選択され、場合によりＬは、請求項３で定義される通りであり、
場合により前記金属キレートモノマーは、

【化3】

、またはこれらの混合物から選択される、請求項３に記載のマイクロビーズ。

【請求項9】

前記キレート化剤は、ポルフィリンまたはフタロシアニンを含み、場合により前記キレート化剤は、置換されたまたは置換されないポルフィリンであり、および
場合により重合の前に前記金属キレートモノマーは、

【化4】

、またはこれらの混合物から選択され、かつｎは、１～４の整数であり、場合によりｎは、少なくとも２であり、
場合によりＬは、アニリンである、請求項４に記載のマイクロビーズ。

【請求項10】

前記金属は、複数の金属であり、
場合により下記の１つまたは複数である、請求項１に記載のマイクロビーズ：
前記複数の金属は、１種または複数の濃縮同位体を含み、場合により前記複数の金属は、１種または複数の濃縮された同位体を含み、
前記複数の金属は、少なくとも２種の金属、少なくとも３種の金属、または少なくとも４種の金属を含み、
前記複数の金属の各金属の量は、前記複数の金属の別の金属の量の約２０％または約１０％以内であり、および
前記金属は、前記マイクロビーズ全体にわたり分散され、および
場合により前記金属は、インジウム、ビスマス、または希土類金属を含み、場合により前記希土類金属は、ランタニド金属、イットリウム、またはそれらの混合物から選択され、
場合により前記金属は、Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、それらの別々の同位体、またはそれらの混合物から選択される希土類金属を含み、かつ
場合により前記希土類金属は、８９Ｙ、１３９Ｌａ、１３６Ｃｅ、１３８Ｃｅ、１４０Ｃｅ、１４２Ｃｅ、１４１Ｐｒ、１４２Ｎｄ、１４３Ｎｄ、１４５Ｎｄ、１４６Ｎｄ、１４８Ｎｄ、１４５Ｐｍ、１４４Ｓｍ、１４９Ｓｍ、１５０Ｓｍ、１５２Ｓｍ、１５４Ｓｍ、１５１Ｅｕ、１５３Ｅｕ、１５４Ｇｄ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１６０Ｇｄ、１５２Ｇｄ、１５９Ｔｂ、１５６Ｄｙ、１５８Ｄｙ、１６０Ｄｙ、１６１Ｄｙ、１６２Ｄｙ、１６３Ｄｙ、１６４Ｄｙ、１６５Ｈｏ、１６２Ｅｒ、１６４Ｅｒ、１６６Ｅｒ、１６７Ｅｒ、１６８Ｅｒ、１７０Ｅｒ、１６９Ｔｍ、１６８Ｙｂ、１７０Ｙｂ、１７１Ｙｂ、１７２Ｙｂ、１７３Ｙｂ、１７４Ｙｂ、１７６Ｙｂ、１７５Ｌｕ、またはそれらの混合物から選択される。

【請求項11】

下記の１つまたは複数である、請求項１～３のいずれか１項に記載のマイクロビーズ：
前記マイクロビーズは、約６０℃のもしくは６０℃を超える、場合により約７０℃のもしくは７０℃を超える、約８０℃のもしくは８０℃を超える、約９０℃のもしくは９０℃を超える、約１００℃のもしくは１００℃を超える、約１１５℃のもしくは１１５℃を超える、約１２５℃のもしくは１２５℃を超える、または約１３５℃のもしくは１３５℃を超えるガラス転移温度を有し、および
前記マイクロビーズは、約０．６μｍ～約２０μｍ、約１μｍ～約１５μｍ、約２μｍ～約１０μｍ、約２μｍ～約６μｍの直径を有し、および
前記マイクロビーズは、水中でコロイド的に安定である。

【請求項12】

前記マイクロビーズの表面は、生体分子への付着のための機能化を含み、
場合により下記の１つまたは複数である、請求項１～３のいずれか１項に記載のマイクロビーズ：
前記付着は、共有的付着または非共有的付着であり、
前記マイクロビーズの表面は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはそれらの混合物により機能化され、および
前記マイクロビーズの表面は、前記生体分子にコンジュゲートされ、
場合により前記生体分子は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、小分子、脂質、炭水化物、またはそれらの混合物から選択され、
場合により前記生体分子は、親和性試薬であり、場合により前記親和性試薬は、抗体であり、場合により前記抗体は、サイトカイン、場合によりケモカイン、インターフェロン、リンホカイン、モノカイン、ＩＬ－１～３６などのインターロイキン、腫瘍壊死因子およびコロニー刺激因子に特異的であり、かつ場合により前記抗原は、ウィルス抗原であり、かつ
場合により前記機能化は、前記マイクロビーズの表面上の二酸化ケイ素のコーティングを含み、場合により前記機能化は、二酸化ケイ素の前記コーティングを機能化することをさらに含む。

【請求項13】

前記金属は、前記生体分子を特定するバーコードを提供する、請求項１２に記載のマイクロビーズ。

【請求項14】

場合により下記の１つまたは複数である、請求項１～３のいずれか１項で定義されるマイクロビーズの集団：
前記集団は、約１０％または１０％未満の変動係数（ＣＶ）を有する粒度分布を有し、場合により前記変動係数は、５％未満であり、
各マイクロビーズは、複数の金属を含み、前記複数の金属の各金属の前記マイクロビーズの集団にわたる平均量は、前記複数の金属の別の金属の平均量の約１０％または約１０％以内であり、
場合により前記複数の金属は、１種または複数の濃縮された同位体を含み、
前記マイクロビーズの集団の各金属の量は、約２０％または２０％未満、または約１０％または１０％未満の変動係数の分布を有し、
前記マイクロビーズの集団の１つのマイクロビーズの各金属の量は、前記マイクロビーズの集団の別のマイクロビーズの同じ金属の量の約２０％もしくは２０％以内、または約１０％もしくは１０％以内、または約５％もしくは５％以内であり、かつ
前記マイクロビーズの集団のマイクロビーズは、実質的に同じ量で同じ金属を含み、場合により前記同じ金属は、複数の金属であり、かつ前記マイクロビーズは、実質的に同じ量で前記複数の金属の各金属を含む。

【請求項15】

場合により下記の１つまたは複数である、請求項１４で定義されるマイクロビーズの複数の別個の集団を含むキット：
マイクロビーズの各集団は、前記マイクロビーズの前記金属または複数の金属に基づきマイクロビーズの別の集団から識別でき、および
前記マイクロビーズの少なくとも１つの集団のマイクロビーズは、前記マイクロビーズの別の集団のマイクロビーズの金属または複数の金属とは異なる金属または複数の金属を含むか、または前記マイクロビーズの少なくとも１つの集団のマイクロビーズは、前記マイクロビーズの別の集団のマイクロビーズとは異なる比率で複数の金属を含む。

【請求項16】

前記マイクロビーズの各集団のマイクロビーズは、異なる生体分子にコンジュゲートされる、請求項１５に記載のキット。

【請求項17】

重合された構造モノマー、重合されない構造モノマー、および立体安定剤を含む第１の混合物を得るために核生成段階で前記立体安定剤の存在下にて構造モノマーを重合すること、
第２の混合物を得るために前記第１の混合物を金属および少なくとも１種の重合可能な末端基に付着されたキレート化剤を含む金属キレートモノマーと組み合わせることであって、
前記キレート化剤は、少なくとも３つの部位で金属を配位しおよび前記金属キレートモノマーは、構造モノマーと重合可能である、組み合わせること；および
前記マイクロビーズのコポリマーを形成するために前記第２の混合物を重合することであって、
前記構造モノマーは、前記キレート化剤を含まない、重合すること
を含む、金属コード化されたマイクロビーズを調製する方法。

【請求項18】

下記の１つまたは複数である、請求項１７に記載の方法：
前記金属は、複数の金属であり、
前記構造モノマーは、前記構造モノマーに基づき約５％～約２０％完結まで前記核生成段階で重合され、
前記第２の混合物の重合は、前記構造モノマーに基づき７５％～約１００％完結、約８０％～約９９％完結、約８５％～約９５％完結、約８５％～約９３％完結まで起こる。

【請求項19】

前記マイクロビーズを機能化するステップをさらに含み、
場合により前記マイクロビーズの機能化は、
第３の混合物を得るために前記重合された第２の混合物を第３のモノマーと混合することであって、前記第３のモノマーが反応性官能基を含み；
場合により前記反応性官能基は、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、エポキシド、ビニル、アルキン、マレイミド、またはそれらの混合物から選択される、混合すること、および
前記第３の混合物を重合すること
を含み；および
場合により下記の１つまたは複数である、請求項１７に記載の方法：
前記マイクロビーズの機能化は、二酸化ケイ素で前記マイクロビーズをコートすることを含み、
前記マイクロビーズの機能化は、二酸化ケイ素の前記コーティングを機能化することをさらに含み、および
生体分子に前記マイクロビーズをコンジュゲートすることをさらに含む。

【請求項20】

請求項１７に記載の方法により調製されたマイクロビーズ。

【請求項21】

金属コード化されたマイクロビーズを調製する方法であって、
膨潤可能なシード粒子およびアニオン性界面活性剤の水性分散液を提供すること；
前記水性分散液を構造モノマーと金属キレートモノマーを含むモノマーと接触させることであって、前記金属キレートモノマーは、金属および少なくとも１種の重合可能な末端に付着されたキレート化剤を含み、前記キレート化剤は、少なくとも３つの部位で金属を配位し、かつ前記構造モノマーは、キレート化剤を含まない、接触させること；
膨潤したシード粒子の水性分散液を形成するために前記モノマーをシード粒子中に拡散させること；および
膨潤したシード粒子の前記水性分散液中で前記モノマーの重合を開始すること、
を含む方法。

【請求項22】

下記の１つまたは複数である、請求項２１に記載の方法：
前記構造モノマーは、アクリルモノマー、メタクリレートモノマーおよびスチレン、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）、エチルビニルベンゼン、ビニルピリジン、アミノスチレン、メチルスチレン、ジメチルスチレン、エチルスチレン、エチルメチルスチレン、ｐ－クロロスチレンまたは２，４－ジクロロスチレンからなる群より選択されるビニルモノマーからなる群より選択され、
膨潤したシード粒子の前記水性分散液は、立体安定剤をさらに含み、場合により前記立体安定剤は、ポリビニルピロリドンであり、
膨潤可能なシード粒子の前記水性分散液を提供することは、乳化重合により単分散の膨潤可能なシード粒子を調製することを含み、
膨潤可能なシード粒子の前記水性分散液は、５０００ダルトン未満の分子量および１０^－２ｇ／Ｌ未満の２５℃での水溶性を有する有機化合物；および場合によりその中で前記有機化合物が可溶性である有機溶媒をさらに含み、
前記膨潤可能なシード粒子は、単分散の膨潤可能なシードのオリゴマー粒子であり、および
前記アニオン性界面活性剤は、デシル硫酸ナトリウムである。

【請求項23】

前記構造モノマーは請求項２で定義される通りであり、および／または前記金属キレートモノマーは、請求項１、３、および８のいずれか１項で定義される通りである、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

質量タグを含むレポーターをさらに含み、前記レポーターは、前記異なる生体分子の少なくとも１種により特異的に結合された試料生体分子を特異的に結合し、
場合により下記の１つまたは複数である、請求項１６に記載のキット：
前記試料生体分子は、オリゴヌクレオチドであり、かつ前記異なる生体分子の前記少なくとも１つは、前記試料生体分子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、
前記レポーターは、前記試料生体分子に複数の質量タグ付きオリゴヌクレオチドを間接的に結合させるためにハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドを含み、かつ
前記異なる生体分子の前記少なくとも１つは、抗体などの親和性試薬である。

【請求項25】

下記の１つまたは複数である、請求項２４に記載のキット：
（ｉ）前記試料生体分子は、ウィルス粒子であり、前記異なる生体分子の前記少なくとも１つは、前記ウィルス粒子を特異的に結合する第１の抗体であり、および前記レポーターは、前記ウィルス粒子を特異的に結合する第２の抗体を含み、（ｉｉ）前記試料生体分子は、サイトカインであり、前記異なる生体分子の前記少なくとも１つは、前記サイトカインを特異的に結合する第１の抗体であり、および前記レポーターは、前記サイトカインを特異的に結合する第２の抗体を含み、または（ｉｉｉ）前記試料生体分子は、癌バイオマーカーであり、前記異なる生体分子の前記少なくとも１つは、前記癌バイオマーカーを特異的に結合する第１の抗体であり、および前記レポーターは、前記癌バイオマーカーを特異的に結合する第２の抗体を含み、
前記異なる生体分子の前記少なくとも１つは、ウィルス抗原を含み、前記試料生体分子は、前記ウィルス抗原を特異的に結合する抗体であり、かつ前記レポーターは、前記試料生体分子に結合する二次抗体を含み、かつ
前記キットは、複数の異なるレポーターをさらに含み、前記異なるレポーターのそれぞれは、異なる生体分子により特異的に結合される試料生体分子を結合する。

【請求項26】

下記の１つまたは複数である、請求項２５に記載のキット：
前記複数の異なるレポーターはそれぞれ、同じ質量タグを含み、
前記質量タグは、金属ナノ粒子を含み、および
前記質量タグは、金属キレートポリマーを含む。

【請求項27】

酵素基質が前記試料生体分子により修飾されている場合それに特定的に結合するレポーターをさらに含み、または
酵素基質が試料生体分子により修飾されていない場合それに特異的に結合するレポーターをさらに含み、場合により前記酵素基質は、前記酵素基質が前記試料生体分子により修飾されると除去される質量タグを含む、
請求項２６に記載のキット。

【請求項28】

複数の異なる集団からの前記マイクロビーズは、マイクロビーズの第１の混合物中に存在し、
場合により前記マイクロビーズの第１の混合物と同じ生体分子を含むマイクロビーズの第２の混合物をさらに含み、前記第１の混合物のマイクロビーズは、前記第２の混合物のマイクロビーズとは異なる試料バーコードを含む、
請求項２４に記載のキット。

【請求項29】

前記試料バーコードは、前記マイクロビーズの内部にあり、場合により前記試料バーコードは、前記第１および第２の混合物の前記マイクロビーズの前記金属キレートモノマーによりキレート化された金属のサブセットであり、または
前記試料バーコードは、前記第１および第２の混合物の前記マイクロビーズの表面上に存在する、請求項２８に記載のキット。

【請求項30】

下記の１つまたは複数である、請求項２８に記載のキット：
異なる複数の集団からのマイクロビーズの表面に結合するように機能化される別の区分中の複数の試料バーコードをさらに含み、および
互いの混合物中に質量タグ付き抗体のパネルをさらに含み、前記パネルの少なくともいくつかの抗体は、細胞表面マーカーに特異的であり、場合により前記複数の抗体は、前記キットのマイクロビーズとの混合物中に存在し、および
場合により前記質量タグ付き抗体の少なくともいくつかは、前記キットのマイクロビーズの金属キレートモノマーによりキレート化された金属と同一の金属を含む。

【請求項31】

下記の１つまたは複数である、請求項２４に記載のキット：
前記キットのマイクロビーズとの混合物中に立体安定剤をさらに含み、場合により前記立体安定剤は、ポリビニルピロリドンであり、
前記キットのマイクロビーズは、５および９または５～９のｐＨで緩衝された溶液中に存在する、または前記マイクロビーズは、凍結乾燥され、および
１種または複数の緩衝剤、抗凝固剤、固定試薬、および透過処理試薬をさらに含む。

【請求項32】

前記マイクロビーズは、固体担体に融合され、
場合により前記固体担体は、顕微鏡スライドまたは接着膜である、請求項２４に記載のキット。

【請求項33】

質量分析により請求項１４に記載のマイクロビーズの集団を検出することを含む方法。

【請求項34】

前記マイクロビーズから得られた質量スペクトルに基づき前記マイクロビーズを検出するために使用される質量分析計を較正することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記マイクロビーズから得られた質量スペクトルに基づき複数の質量タグから得られた質量分析シグナルを正規化することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

請求項１４に記載のマイクロビーズの別個の集団を試料と混合することであって、マイクロビーズのそれぞれの集団のマイクロビーズは、異なる生体分子に結合されかつマイクロビーズのそれぞれの集団は、前記マイクロビーズの金属または複数の金属に基づきマイクロビーズの別の集団から識別できる、混合すること；
前記試料の異なる試料生体分子をマイクロビーズの別個の集団の前記異なる生体分子に結合させること；
前記異なる試料生体分子のそれぞれにレポーターを、直接にまたは間接的に、結合させることであって、前記異なる試料生体分子のそれぞれに結合される前記レポーターは、質量タグを含む、結合させること；および
質量分析により個別のマイクロビーズの前記金属および前記質量タグを検出すること、
を含む、質量分析の方法。

【請求項37】

前記マイクロビーズの別個の集団を前記試料と混合するステップの前に前記マイクロビーズの別個の集団のマイクロビーズに前記異なる生体分子を付着させることをさらに含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記異なる試料生体分子は、オリゴヌクレオチド、抗体、サイトカイン、および／または癌バイオマーカーを含む、請求項３６または３７に記載の方法。

【請求項39】

マイクロビーズの別個の集団を試料と混合することであって、マイクロビーズのそれぞれの集団のマイクロビーズは、異なる生体分子に結合されかつマイクロビーズのそれぞれの集団は、マイクロビーズの金属または複数の金属に基づきマイクロビーズの別の集団から識別できる、混合すること；
前記試料の異なる試料生体分子をマイクロビーズの別個の集団の前記異なる生体分子に結合させること；
前記異なる試料生体分子のそれぞれにレポーターを、直接にまたは間接的に、結合させることであって、前記異なる試料生体分子のそれぞれに結合される前記レポーターは、質量タグを含む、結合させること；および
質量分析により個別のマイクロビーズの前記金属および前記質量タグを検出すること、
を含む、請求項２４に記載のキットを用いる質量分析の方法。

【請求項40】

複数の質量タグ付き抗体を提供することであって、前記質量タグ付き抗体の各抗体は、金属またはその濃縮された同位体の複数原子をキレート化するポリマー質量タグにコンジュゲートされる、提供すること；
試料を前記複数の質量タグ付き抗体と接触させること；
質量分析により前記試料および前記マイクロビーズに結合された前記質量タグ付き抗体を検出すること、
を含む、請求項１２に記載のマイクロビーズを用いる細胞試料の質量分析の方法。

【請求項41】

前記検出するステップで使用される前記質量分析計を較正することであって、前記較正は、前記マイクロビーズから得られる質量分析シグナルに基づく、較正すること、
前記マイクロビーズから得られる質量分析シグナルに基づき前記質量タグから得られた質量分析シグナルを正規化することであって、場合により前記マイクロビーズおよび前記質量タグ付き抗体は、同じ金属を含む、正規化すること、または
前記質量タグ付き抗体のそれぞれについての金属原子の平均数および前記質量タグ付き抗体および前記マイクロビーズからの前記検出された質量分析シグナルに基づき前記質量タグ付き抗体を定量化することであって、場合により前記マイクロビーズおよび前記質量タグ付き抗体は、同じ金属を含む、定量化すること、
をさらに含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記検出するステップは、イメージングマスサイトメトリーおよび／またはレーザアブレーションＩＣＰ－ＭＳまたは二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）を含み、
場合により前記マイクロビーズから検出された質量分析シグナルに基づき個別のピクセルでまたは個別の細胞に結合された前記質量タグ付き抗体を定量化することまたは正規化することをさらに含み、および／または
場合により前記マイクロビーズは、前記検出ステップの前に固体表面に対し融解される、請求項３３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は２０２１年３月１５日に出願された米国特許出願第６３／１６１，４１４号、および２０２２年３月１４日に出願された米国特許出願第６３／３１９，６０８号の優先権の利益を主張する。これらの特許仮出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本開示は、マスサイトメトリービーズ系アッセイおよび多重化適用のための金属標識されたポリマーマイクロビーズ、特にランタニド標識されたポリマーマイクロビーズに関する。

【背景技術】

【0003】

マスサイトメトリー（ＭＣ）は、新たに出現した分析技術であり、細胞およびマイクロビーズ試料上の同位体標識のシグナルを解析するために、誘導結合プラズマ飛行時間質量分析計（ＩＣＰ－ＴＯＦ－ＭＳ）を採用する。マスサイトメトリーでのビーズ系の適用は、ＭＣにより個別に特定できる種々の金属イオンによるマイクロビーズの標識を必要とする。

【0004】

ビーズ系アッセイは、高スループット能力を有するマルチプレックスアッセイに対するそれらの高い試料体積効率のために、分析技術として魅力的である。キャプチャーサンドイッチイムノアッセイ、競合免疫測定法、血清学、遺伝子発現プロファイリングおよび遺伝子型判定を含む、様々な用途が、ビーズ系アッセイ技術を用いて開発されてきた^１、２。古典的なプレーナ技術またはＥＬＩＳＡ技術とは対照的に、ビーズ系アッセイは、分析物として異なる分子を標的にできる異なる親和性試薬に対する固体担体として粒子のコロイド懸濁液を用いる。ビーズをコード化すること、および分析物のための分類子としてのビーズのライブラリーを生成することにより、種々の捕捉された分析物を、ある実験にわたり個別のビーズを解読することおよび特定することにより追跡できる。このように、複数の分析物の分析が、異なる親和性分子で機能化された一連のビーズを用いて、１回のアッセイで同時に実施できる。ほとんどの商業的に入手できるビーズ系アッセイは、これらのビーズをバーコード化するための標識として発光タグを使用し、フローサイトメトリーによりこれらの分類子ビーズを高スループットで検査する。Ｌｕｍｉｎｅｘは、１０種の異なる強度レベルの３種の異なる色を有し、生物親和試薬に付着するための表面機能性を備えた、フローサイトメトリーによるビーズ系アッセイのための５００個の別々に標識されたポリスチレンマイクロスフェアのライブラリーを市販した^３－５。

【0005】

マスサイトメトリー（ＭＣ）は、新たに出現した分析技術であり、フローサイトメトリーと元素質量分析の特徴を組み合わせて、単細胞またはビーズ試料の特性を決定する^５。マスサイトメトリーでは、細胞およびビーズ試料は、重金属同位体で標識され、誘導結合プラズマ飛行時間質量分析計（ＩＣＰ－ＴＯＦ－ＭＳ）のプラズマトーチに別々に導入されて、金属同位体標識のシグナルを分析する。ＭＣは、チャネルオーバーラップなしに、かつ生体試料中の重金属同位体の少ない存在量でも、それらの原子質量に基づき異なる金属同位体を正確に分析でき、ＭＣは、フローサイトメトリーに付随する複雑なシグナル補償処理を回避する。それは、蛍光系ビーズアッセイに比べて高められた解像度および感度を有し試料の特徴の検出を大きく改善する。遙かに多くの数の重金属同位体が標識として採用され得るので、ＭＣは、遙かに高い多重化能力を有する高スループットのサイトメトリービーズ系アッセイのための大きな可能性を提供する^７－８。

【0006】

多重化ＭＣアッセイのための金属コード化マイクロビーズを開発するために、Ａｂｄｅｌｒａｈｍａｎらは、異なる濃度レベルの種々の金属同位体でコード化したマイクロビーズのライブラリーを合成する概念を導入した^９。このマイクロビーズライブラリーの理論的最大変動（ｎ）は下記の式で計算できる：
ｎ＝Ｋ^Ｍ－１ （１）
ここで、Ｋは、マイクロビーズの金属濃度レベルのレベル（ゼロ濃度を含む）であり；Ｍは、ビーズにおいてコード化された異なる同位体の数である。項（－１）は、全ての同位体のゼロ金属含量のビーズであり、これは、ＭＣにより検出できない。ランタニド同位体は、ＭＣでのそれらの類似の化学的および物理学的特性、低い天然存在度ならびにそれらの高い検出感度の理由で、ＰＳマイクロビーズをコード化するための質量タグとして魅力的な選択肢である⁸。１５種のランタニド元素が存在し、これらの同位体は、ビーズ標識として採用されるために理論的に利用できる、１３９ａｍｕ～１７６ａｍｕの少なくとも３６個の検出チャネルを含む。例えば、各コード化同位体に対し４種の濃度レベルを用いて、数千の変種を有するビーズのライブラリーを、ＭＣビーズ系アッセイのために原理上作成できる。ＭＣシグナルの品質を確保するために、ＭＣ適用で採用される金属含有マイクロビーズは、非常に狭い粒度分布を有する直径約１～５μｍの範囲のサイズである必要がある。より小さいマイクロビーズは、より少ない金属同位体を含む傾向があり、これは、ＭＣでの単一イベントとして検出されるには十分でない場合があり、一方でより大きなマイクロビーズは、一貫性がなく、ＩＣＰトーチ中で完全に消費されない場合がある。

【0007】

いくつかのタイプの重金属同位体でコード化されたポリマーマイクロビーズの合成が報告されている。Ａｂｄｅｌｒａｈｍａｎらにより採用された手法では、ランタニドコード化ポリスチレン（ＰＳ）マイクロビーズが、立体安定剤としてポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および金属イオン組み込みのためのコモノマーとしてアクリル酸（ＡＡ）の存在下でスチレンの多段分散重合（ＤｉｓＰ）により合成された。いくつかの最適化を用いて、Ａｂｄｅｌｒａｈｍａｎらは、ビーズ当り約１ｘ１０^８個のランタニドイオンでコード化されたＰＳマイクロビーズを達成でき、これは、ＭＣ適用での試薬として使用するための要件を満たす、相対的に小さいビーズ間変動（ＲＣＶ＜１５％）を有するＭＣにおける強力なシグナル強度を生成した^９、１０。

【0008】

Ｌｉａｎｇらは後に、コモノマーＡＡをメタクリル酸（ＭＡＡ）で置換する考えを試験し、類似の結果を得た^１１。シード乳化重合でのスチレン可溶性ランタニドキレートのＰＳビーズ中への吸収、および分散重合でのランタニドナノ粒子のポリマーマイクロビーズ上への共有結合組み込みによる、マイクロビーズ中に金属イオンを組み込むための他の手法も調査されてきた^{１２、１３}。しかし、Ａｂｄｅｌｒａｈｍａｎらにより開発されたＡＡアプローチと比較して、遙かに低い組み込み効率およびより高いビーズ間金属含量変動が、これらの後の試みで観察された。

【0009】

ＡＡ手法はしかし、ＭＣ較正目的のための設計された異なる金属含量を有するビーズのバッチの合成には不十分である。この戦略は、特に多数の異なる金属イオンが第２の段階の一定分量中でＡＡと混合される場合に、ビーズ合成における金属組み込みの制御がうまくできない。例えば、より小さいイオン半径を有するランタニドイオン（例えば、Ｈｏ^３＋およびＬｕ^３＋）は、より大きなイオン半径を有するランタニド（例えば、Ｃｅ^３＋およびＥｕ^３＋）より遙かに効率的にマイクロビーズ中に組み込まれる傾向がある^{１４、１５}。
この制御性の欠如は、特に例えば種々の金属イオンでコード化されかつ各金属について異なるレベルで所定の金属含量を有する複数のマイクロビーズまたはマイクロビーズのライブラリーを合成しようとする場合、時間のかかる難題である。

【0010】

マイクロビーズは、種々の定性的および定量的用途のために、例えば分析物検出のために使用できる。いくつかのサイトカインは、ＣＯＶＩＤ－１９の病態に重要な役割を果たすと考えられている。しかし、サイトカイン生成および作用の機序を完全に調査するためには、現在の研究ツールでは制約が存在する^３４。
サイトカインは、免疫応答を調節し細胞活動を調節するために、ピコモル～ナノモル濃度で細胞により産生される可溶性シグナル伝達タンパク質分子である。それらは、身体中の炎症促進性および抗炎症性の因子の極めて大きく多様な群である^３５。血液試料中のサイトカインの深い特徴付けは、疾患または感染症に対する、またはワクチン、療法および介入に対する免疫応答の重要な細目を提供できる。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、生体試料中のサイトカインの分析のために最も広範に使用されるモノプレックスＡｂ系免疫アッセイ法である。しかし、ＥＬＩＳＡアッセイは、相当量の試料を必要とし、多数のサイトカインが同時に分析される場合、時間がかかる^{３６、３７}。
ビーズ系免疫アッセイ法は、高スループット設定において情報が豊富なマルチメトリック分析を提供する技術プラットフォームである。シグナル検出に蛍光染料を採用するビーズ系アッセイは、多重化サイトカイン分析のための現在の基準試験法であり、サイトカイン分析用のキットが市販されている。このタイプのアッセイでは、ポリマーマイクロビーズは、明確に定義された強度へと種々の濃度で、２または３種の異なる蛍光染料により標識される。良好な抗原検出は、個別の発光を有する色素で標識されたレポーター抗体（Ａｂ）により認識される^{３８－４４}。しかし、２０１５～２０１８年に行われた６件の米国病理医協会のサイトカイン調査からの最近の報告は、４種のサイトカインセット（ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦα）におけるサイトカイン分析の変動性を記載している^４５。この調査は、検査室間の変動性および方法間の、さらに同じ試験室内の変動性を調査した。この報告は、定量的サイトカイン検出における現在の課題のいくつかを強調する。

【発明の概要】

【0011】

本明細書で記載されるのは、多段階分散重合により合成でき、かつ構造モノマーおよび重合に供される前に金属にキレート化されるキレート化剤を含む金属キレートモノマーを含む、金属コード化ポリマーマイクロビーズである。マイクロビーズは、コポリマーを含むポリマーを含み、このポリマーにより形成される。本明細書の実施形態で示されるように、得られるマイクロビーズは、狭い粒度分布を有し、所定量の異なる金属を有する。マイクロビーズ中に組み込まれる金属の量は、ビーズ間で実質的に一致しており、マイクロビーズの実質的に均一な集団が得られることを可能にする。金属は、表面上にのみ存在するのとは対照的に、マイクロビーズ全体にわたり組み込まれ得る。さらに、いくつかの実施形態で記載のように、本開示のマイクロビーズは、マイクロビーズの表面上で機能化でき、かつ抗体などの生体分子または他の親和性試薬にコンジュゲートすることもできる。

【0012】

特に、特定の実施形態で提供されるのは、実質的に制御された金属含量を有するマイクロビーズおよびそれらを作製する方法である。金属コード化されたマイクロビーズは、少なくとも１種の金属元素を含み、複数の金属元素を含んでもよい。金属元素は、元素の天然存在度の同位体を含んでよく、または１種または複数の元素の濃縮された同位体を含んでもよい。実施例で示されるように、ランタニドコード化されたマイクロビーズが、２段階分散重合で、リガンドとして重合可能な金属－錯体を採用することにより作成された。一例では、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）が、ＤＴＰＡ酸二無水物を４－ビニルベンジルアミン（ＶＢＡ）と反応させることにより、重合性モノマーで機能化された。次に、このＤＴＰＡ誘導体の種々のランタニド金属イオン錯体が調製された。金属コード化されたマイクロビーズは、これらの重合可能な金属－ＤＴＰＡ錯体をスチレンなどのモノマーの分散重合反応中に導入することにより合成された。得られたマイクロビーズは、それらのサイズおよび金属含量において極めて小さいビーズ間変動を有する。類似の金属組み込み効率が、この重合可能なキレート化剤に錯化された異なる金属イオンを用いたビーズ合成でも認められた。この手法を用いて調製されたマイクロビーズ中の金属含量は、金属の種類に関係なく、ビーズ合成における金属錯体供給量に一次従属した。３種の異なる濃度で４種のランタニドによりコード化されたマイクロビーズのバッチを、調製した。これらのマイクロビーズは、非常に良好なベースライン解像度を有する３種の異なるレベルのＭＣシグナル強度を生成した。
例示的実施例のように、および本明細書の以降で記載のように、マイクロビーズバッチの表面は、機能化された表面であり、抗体にコンジュゲートされ、かつ標的分析物（例えば、試料生体分子）を検出するために使用された。

【0013】

マスサイトメトリー（ＭＣ）における本開示のマイクロビーズの代表的用途として本明細書で示すように、多重化ビーズ系アッセイを、サイトカインを含む分析物の検出のために開発した。このタイプのアッセイでは、分類子ビーズを、異なる金属組み込みレベルの重金属同位体で標識した。各分類子ビーズは、その表面上に異なるＡｂを保持した。レポーターは、その表面に結合された他の生体識別素子の適切なＡｂを有する金属または金属酸化物ナノ粒子（ＮＰ）であり得る。試料を、誘導結合プラズマ飛行時間型質量分析計のプラズマトーチ中に確率的に注入した。この測定器は、ｍ／ｚ：８５～ｍ／ｚ：２０９の範囲にわたり単一質量分解ができる。従って、示されるように、極めて高いレベルの多重化が可能であった。ＭＣによるビーズ系アッセイでは、サイトカインを、例示的標的として使用した。
本明細書で記載のように、４種のサイトカインの混合物の４プレックス分析を実証する。９プレックスアッセイもまた、同様に例示した。９プレックスアッセイを、非刺激試料をサイトカイン分泌を促進するために刺激された試料と比較して、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料について試験した。

【0014】

従って、一態様では、本開示は、
構造モノマー、および
金属およびキレート化剤を含む金属キレートモノマーを含む、コポリマーであって；
キレート化剤は、少なくとも３つの部位で金属に配位し；および
構造モノマーは、キレート化剤を含まない、コポリマー
を含む、金属コード化されたマイクロビーズを含む。
別の態様では、本開示は、本開示のマイクロビーズの集団を含む。
別の態様では、本開示は、本開示のマイクロビーズの複数の個別の集団を含むキットを含む。

【0015】

別の態様では、本開示は、
重合構造モノマー、非重合構造モノマー、および立体安定剤を含む第１の混合物を得るために核生成段階で立体安定剤の存在下にて構造モノマーを重合すること、
第２の混合物を得るために第１の混合物を金属および少なくとも１種の重合可能な末端基に付着されたキレート化剤を含む金属キレートモノマーと混合すること、キレート化剤は、少なくとも３つの部位で金属を配位し；および金属キレートモノマーは、構造モノマーと重合可能である、混合すること；および
マイクロビーズのコポリマーを形成するために第２の混合物を重合することであって、構造モノマーは、キレート化剤を含まない、重合すること、
を含む金属コード化されたマイクロビーズの調製方法を含む。
別の態様では、本開示は、本開示の方法により調製されたマイクロビーズを含む。

【0016】

別の態様では、本開示は、金属コード化されたマイクロビーズを調製する方法を含み、方法は、
膨潤可能なシード粒子およびアニオン性界面活性剤の水性分散液を提供すること；
水性分散液を、構造モノマーと金属キレートモノマーを含むモノマーと接触させることであって、金属キレートモノマーは、金属および少なくとも１種の重合可能な末端に付着されたキレート化剤を含み、キレート化剤は、少なくとも３つの部位で金属を配位する、接触させること；
膨潤したシード粒子の水性分散液を形成するためにモノマーをシード粒子中に拡散させること；および
膨潤したシード粒子の水性分散液中でモノマーの重合を開始させること、
を含み、構造モノマーは、キレート化剤を含まない。
本開示の例示的実施形態は、図面と関連してさらに説明される。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】Ｄ_２Ｏ中に溶解したＮａ_３（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）分子の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す概略図である。所与のＮａ_３（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）の構造は、示される化学シフトに対応する標識されたプロトンを有する。

【図2】図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ、第２段階で加えられたＣｅ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）金属錯体の存在下で合成された金属含有マイクロビーズＣｅ－１のＳＥＭ像およびサイズのグラフである（ｄ＝２．９μｍ、ＣＶ＝１．２％）。

【図3】Ｍ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）錯体（Ｍ＝Ｙ、Ｃｅ、Ｅｕ、Ｈｏ、およびＬｕ）を用いた、Ｙ－１、Ｃｅ－１、Ｅｕ－１、Ｈｏ－１、Ｌｕ－１および５Ｅ１マイクロビーズ中への（図３Ａ）および４Ｅ１、４Ｅ２および４Ｅ３マイクロビーズ中への（図３Ｂ）５種の金属イオンの組み込み効率を示す一連のグラフである。

【図4】第２段階の一定分量における、Ｍ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）金属錯体（Ｍ＝Ｙ、Ｃｅ、Ｅｕ、Ｈｏ、およびＬｕ）の存在下で調製した５元素コード化マイクロビーズ（５Ｅ１）についてのＭＣシグナル強度（図４Ａ）および金属含量（図４Ｂ）を示すグラフである。ａ）およびｂ）中のエラーバーは、それぞれ、ＭＣシグナル強度のＲＳＤおよびＭＣシグナル強度から求めた金属含量のＳＤを表す。

【図5】第２段階の一定分量における金属錯体の供給量濃度に対するマイクロビーズ中の金属含量濃度の線形依存性を示すグラフである。塗りつぶした記号は、予備的なビーズ合成（Ｙ－１、Ｃｅ－１、Ｅｕ－１、Ｈｏ－１、Ｌｕ－１、および５Ｅ１）からのデータである。実線は、これらの塗りつぶしたデータポイントの線形回帰である。白抜き記号は、ビーズ合成試料４Ｅ１、４Ｅ２、および４Ｅ３からのデータであり、ここでビーズ合成設計のための基準として予備的なビーズ合成で観察された直線関係を使用した。

【図6】第２段階の一定分量における、Ｍ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）金属錯体（Ｍ＝Ｃｅ、Ｅｕ、Ｈｏ、およびＬｕ）の存在下で調製したＰＳマイクロスフェアの３種の異なる集団のＭＣシグナル強度を示し、それぞれ、^１４０Ｃｅ、^１５１Ｅｕ、^１５３Ｅｕ、^１６５Ｈｏ、および^１７５ＬｕのＭＣ強度ヒストグラムを表す。それぞれの図のｘ軸は、同位体のシグナル強度であり、ｙ軸は、１００に正規化されたビーズの数である。第１、第２および第３のヒストグラムは、それぞれ、４Ｅ１、４Ｅ２、および４Ｅ３からのシグナルを表す。

【図7】図７Ａは、Ｍ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）コード化マイクロスフェア（Ｅｕ－１）を用いた抗原検出薬を示す概略図である。このスキームでは、ヤギ抗マウスＩｇＧで表面機能化されたＥｕコード化マイクロビーズを、レポーターとしての^１７５Ｌｕ標識マウスＩｇＧとインキュベートする。洗浄されたマイクロビーズをその後、レポーター検出の証拠として、^１５３Ｅｕおよび^１７５Ｌｕの両方についてＭＣにより検査する。 図７Ｂは、図７Ａの検出薬を用いて生成されたＭＣ測定のヒストグラムを表し、ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）修飾Ｅｕ－１マイクロビーズ（Ｅｕ－１／ＧＡＭ）についての^１７５Ｌｕシグナル強度を示す。第２の実験では、ＧＡＭなしのＮＡｖ－修飾Ｅｕ－１マイクロビーズ（Ｅｕ－１／ＮＡｖ）は、陰性対照としてマゼンタ色で示される弱いシグナルを生じた。

【図8】図８Ａおよび図８Ｂはそれぞれ、Ｄ_２Ｏ中で測定したＮａ_３（ＤＴＰＡ－ＢＡｍ_２）およびＮａ_３（ＤＴＰＡ－ＡＬＡｍ_２）の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。図８Ｃは、Ｎａ_３（ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２）の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。所与のこれらの分子の構造は、示される化学シフトに対応する標識されたプロトンを有する。

【図9】Ｄ_２Ｏ中で測定したＣｅ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）（図９Ａ）、Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＢＡｍ_２）（図９Ｂ）、Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＡＬＡｍ_２）（図９Ｃ）、およびＣｅ（ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２）（図９Ｄ）の^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）スペクトルである。図中の共鳴ピークは、Ｃｅ（ＩＩＩ）が常磁性ＮＭＲシフト試薬であるため、広がりかつシフトした。

【図10】Ｄ_２Ｏ中で測定したＹ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）（図１０Ａ）、Ｅｕ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）（図１０Ｂ）、Ｈｏ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）（図１０Ｃ）、およびＬｕ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）（図１０Ｄ）の^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）スペクトルである。ｂ）およびｃ）中の共鳴ピークは、Ｅｕ（ＩＩＩ）およびＨｏ（ＩＩＩ）が常磁性ＮＭＲシフト試薬であるため、広がりかつシフトした。

【図11】図１１Ａ～１１Ｄは、それぞれ、Ｃｅ－１、Ｃｅ－２、Ｃｅ－３、およびＣｅ－４マイクロビーズにおけるＭＣ ^１４０Ｃｅシグナル強度カウントのヒストグラムである。ｘ軸は、^１４０Ｃｅシグナル強度であり、ｙ軸は、１００に正規化されたビーズの数である。

【図12】図１２Ａは、Ｙ－１のマイクロビーズ試料における同位体シグナル強度カウントのヒストグラムであり、図１２Ｂは、Ｅｕ－１のマイクロビーズ試料における同位体シグナル強度カウントのヒストグラムである。図１２Ｃは、Ｈｏ－１のマイクロビーズ試料における同位体シグナル強度カウントのヒストグラムであり、図１２Ｄは、Ｌｕ－１のマイクロビーズ試料における同位体シグナル強度カウントのヒストグラムである。ｘ軸は、同位体シグナル強度であり、ｙ軸は、１００に正規化されたビーズの数である。

【図13】図１３Ａは、ＩＣＰ－ＭＳにより決定された０．５％固形分含有量での４Ｅ３マイクロビーズ（塗りつぶした記号および実線）からｐＨ３．０緩衝液（５０ｍＭの酢酸ナトリウム）中への、金属イオンＣｅ^３＋（四角）、Ｅｕ^３＋（丸）、Ｈｏ^３＋（上向き三角形）およびＬｕ^３＋（下向き三角形）の放出プロファイルを示すグラフである。 図１３Ｂは、ＩＣＰ－ＭＳにより決定された０．５％固形分含有量での４Ｅ３マイクロビーズ（塗りつぶした記号および実線）からｐＨ７．０緩衝液（１０ｍＭの酢酸アンモニウム）中への、金属イオンＣｅ^３＋（四角）、Ｅｕ^３＋（丸）、Ｈｏ^３＋（上向き三角形）およびＬｕ^３＋（下向き三角形）の放出プロファイルを示すグラフである。 図１３Ｃは、ＩＣＰ－ＭＳにより決定された０．５％固形分含有量での４Ｅ３マイクロビーズ（塗りつぶした記号および実線）からｐＨ１０．５緩衝液（２００ｍＭの炭酸／重炭酸ナトリウム）中への、金属イオンＣｅ^３＋（四角）、Ｅｕ^３＋（丸）、Ｈｏ^３＋（上向き三角形）およびＬｕ^３＋（下向き三角形）の放出プロファイルを示すグラフである。 図１３Ｄは、ＩＣＰ－ＭＳにより決定された０．５％固形分含有量での４Ｅ３マイクロビーズ（塗りつぶした記号および実線）から１％ＰＶＰ溶液中への、金属イオンＣｅ^３＋（四角）、Ｅｕ^３＋（丸）、Ｈｏ^３＋（上向き三角形）およびＬｕ^３＋（下向き三角形）の放出プロファイルを示すグラフである。比較として、白抜き記号および破線は、４Ｅ３ ＤＴＰＡビーズと同じ条件下でＡＡ手法により調製されたマイクロビーズバッチからの金属イオンの放出プロファイルを示す。

【図14】シリカコーティングによりヤギ抗マウス（ＧＡＭ）でマイクロビーズを機能化するための多段戦略の概略図である。

【図15】本開示のマイクロビーズアッセイの概略図である。

【図16】９６ウェルフィルタープレート中で実施されるＭＣによる例示的多重化ビーズ系サンドイッチ免疫アッセイ法を示す概略図である。

【図17】１１種の分類子マイクロビーズ（Ｃ－１～Ｃ－１１）の混合物のドットプロットダイアグラムであり、パネルａは、１１種の分類子マイクロビーズ（Ｃ－１～Ｃ－１１）の混合物の^１４０Ｃｅ～^１４２Ｃｅ同位体ドットプロットダイアグラムを示す。楕円は、１１種のマイクロビーズのシングレットイベントを分離する。パネルｂ～ｋは、ＭＣによりＣ－１～Ｃ－１１マイクロビーズを個別に特定するためのゲーティング戦略を示すドットプロットダイアグラムである。

【図18】種々のＩＬ－４濃度での標準溶液の一連の４プレックスアッセイにおけるＩＬ－４分類子ビーズ（Ｃ－５）についてのレポーターシグナル強度のヒストグラムである。（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）ＡｕＮＰは、それぞれ、０、１．２、および２０ｐｇ／ｍＬの濃度でＩＬ－４を含む標準溶液の４プレックスアッセイでレポーターとして採用された。（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）ＮａｎｏＧｏｌｄは、それぞれ、０、１．２、および２０ｐｇ／ｍＬでＩＬ－４を含む標準溶液の４プレックスアッセイでレポーターとして採用された。

【図19】（ａ）ＩＬ－４、（ｂ）ＩＬ－６、（ｃ）ＩＦＮγ、および（ｄ）ＴＮＦαについての２組の４プレックスアッセイの検量線である。各プロットのｘ軸は、分析物濃度であり、ｙ軸は、対応する分類子ビーズに付着されたＮＰのＭＣシグナル強度中央値である。２種の異なるタイプのストレプトアビジン－結合レポーター（ＡｕＮＰおよびＮａｎｏＧｏｌｄ）を、これらの４プレックスアッセイで調査した。結果を、ＡｕＮＰについて円（●）およびＮａｎｏＧｏｌｄについて四角（■）として示す。１カウント／ビーズ以下の^１９７Ａｕシグナル強度を有するネガティブイベントを、強度中央値の統計解析から除外した。用量反応曲線を、４パラメーターロジスティック回帰分析モデルを用いて実験結果をフィットさせることにより作成した。

【図20】検出Ａｂカクテル中のビオチン化抗ＣＤ１６３および抗ＣＸＣＬ－９の異なる濃度での、（ａ）ＩＬ－１β、（ｂ）ＩＬ－４、（ｃ）ＩＬ－６、（ｄ）ＩＬ－１０、（ｅ）ＩＬ－１８、（ｆ）ＩＦＮγ、（ｇ）ＴＮＦα、（ｈ）ＣＤ１６３および（ｉ）ＣＸＣＬ－９についての４組の９プレックスアッセイの検量線を示す。各プロットのｘ軸は、分析物濃度である。各プロットのｙ軸は、対応するタイプの分類子ビーズに付着されたＡｕＮＰのＭＣシグナル強度中央値である。低分析物濃度でのバックグラウンドノイズを最小化するために、検出Ａｂカクテル中のビオチン化抗ＣＤ１６３および抗ＣＸＣＬ－９の濃度を、２．５から２．０、１．０および０．５μｇ／ｍＬに低減し、一方で他の検出Ａｂの濃度を、カクテル中で２．５μｇ／ｍＬで一定に保持した。これらのアッセイの結果を、２．５μｇ／ｍＬの濃度について塗りつぶした円（●）で、２．０μｇ／ｍＬの濃度について塗りつぶした四角（■）で、１．０μｇ／ｍＬの濃度について塗りつぶした三角（▲）で、および０．５μｇ／ｍＬの濃度について塗りつぶした菱形（◆）でプロットした。１カウント／ビーズ以下の^１９７Ａｕシグナル強度を有するネガティブイベントを、強度中央値の統計解析から除外した。用量反応曲線を、４パラメーターロジスティック回帰分析モデルを用いて実験結果をフィットさせることにより作成した。

【図21】異なる試料希釈比率での刺激されたおよび刺激されないＰＢＭＣ試料中の（ａ）ＩＬ－１β、（ｂ）ＩＬ－４、（ｃ）ＩＬ－６、（ｄ）ＩＬ－１０、（ｅ）ＩＬ－１８、（ｆ）ＩＦＮγ、（ｇ）ＴＮＦα、（ｈ）ＣＤ１６３および（ｉ）ＣＸＣＬ－９の分析のための９プレックスアッセイにおける分類子ビーズに付着されたＡｕＮＰレポーターの^１９７Ａｕシグナル強度中央値を示すヒストグラムである。図中の塗りつぶしたバーは、刺激された試料の分析結果であり、縞模様のバーは、刺激されない試料の分析結果である。

【図22】図２２（ａ）は、２段階ＤｉｓＰにより調製されたＣ－１マイクロビーズのＳＥＭ像である。図２２（ｂ）は、Ｍ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）錯体（Ｍ＝Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｔｂ、Ｈｏ、およびＴｍ）を用いてＣ－１マイクロビーズ中へ組み込まれた６種の金属イオンの効率を示すグラフである。エラーバーは、同じ溶液に対する３回の測定の標準偏差である。

【図23】異なるレポーター（ＮＰ）濃度での（ａ）ＩＬ－４、（ｂ）ＩＬ－６、（ｃ）ＩＦＮγ、および（ｄ）ＴＮＦαについての３組の４プレックスアッセイの検量線である。各プロットのｘ軸は、分析物濃度である。各プロットのｙ軸は、対応する分類子ビーズに付着されたＡｕＮＰのＭＣシグナル強度中央値である。ストック溶液から２００ｘ、４００ｘ、および８００ｘ希釈の３種の濃度のＡｕＮＰを、これらの４プレックスアッセイで調査した。それらの結果を、２００ｘ希釈を円（●）で、４００ｘ希釈を四角（■）で、および８００ｘ希釈を三角（▲）で示す。１カウント／ビーズ以下の^１９７Ａｕシグナル強度を有するイベントを、強度中央値の統計解析から除外した。用量反応曲線を、４パラメーターロジスティック回帰分析モデルを用いて実験結果をフィットさせることにより作成した。

【図24】分析物分子の非存在下（０ｐｇ／ｍＬ）でのブランク試料の一連の９プレックスアッセイにおける分類子ビーズに付着されたＡｕＮＰのＭＣシグナル強度中央値をまとめた図である。

【図25】刺激されたおよび刺激されないＰＢＭＣ試料の分析と同じアッセイ条件を用いた、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＣＤ１６３およびＣＸＣＬ－９についての９プレックスアッセイの検量線である。用量反応曲線を、４パラメーターロジスティック回帰分析モデルを用いて実験結果をフィットさせることにより作成した。

【図26】図２５の用量反応検量線に基づいて計算された、刺激されたおよび刺激されないＰＢＭＣ試料中のサイトカイン濃度を示すグラフである。図２１に示されたいくつかの測定ＭＣ強度値は、図２５に示された４Ｐ－ＬＲモデル化検量線の最小値より小さい。濃度は、これらの値からは計算されない。

【発明を実施するための形態】

【0018】

Ｉ．定義
特に指示がない限り、このおよび他のセクションで記載される定義および実施形態は、当業者により理解されるように適切に本明細書で記載される本開示の全ての実施形態および態様に適用可能であることが意図される。
本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、列挙された項目が個々に、または組み合わせて存在する、または使用されることを意味する。事実上、この用語は、列挙された項目の「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」が使用される、または存在することを意味する。その薬学的に許容可能な塩および／または溶媒和物に関して「および／または」という用語は、本出願の化合物が、本開示の化合物の個々の塩および水和物、ならびに、例えば、本開示の化合物の塩の溶媒和物の組み合わせとして存在することを意味する。
本開示で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数の言及物を含む。例えば、「１種の化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」を含む一実施形態は、１種の化合物、または２種以上の追加の化合物を有する、特定の態様を提示すると理解されるべきである。
追加のまたは第２の化合物などの、「追加の（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ）」または「第２の（ｓｅｃｏｎｄ）」成分を含む実施形態では、本明細書で使用される第２の成分は、他の成分または第１の成分とは化学的に異なる。例えば、第２の成分にキレート化される金属は、第２の成分と第１の成分が同じキレート化剤を有し得る場合、第１の成分にキレート化された金属とは異なり得る。「第３の（ｔｈｉｒｄ）」成分は、他の、第１および第２の成分とは異なり、さらに列挙されるまたは「追加の（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ）」成分は、同様に異なる。

【0019】

本開示および請求項で使用されるように、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（および「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などの、有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）などの、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態）または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（および含む「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」などの、（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態）は包括的または開放型であり、かつ追加の、列挙されない要素または工程ステップを排除しない。
「構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語および本明細書で使用されるその派生語は、明言された特徴、要素、成分、基、整数、および／またはステップの存在を特定し、かつまた、他の明言されない特徴、要素、成分、基、整数および／またはステップの存在を排除する、閉鎖型用語であることが意図される。
本明細書で使用される場合、「から本質的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、明言された特徴、要素、成分、基、整数、および／またはステップならびにこれらの特徴、要素、成分、基、整数、および／またはステップの基本的および新規特性に実質的に影響しないものの存在を明示することが意図される。

【0020】

本明細書で使用される場合、「好適な（ｓｕｉｔａｂｌｅ）」という用語は、特別な化合物または条件の選択は実施される特定の合成操作、変換される分子の素性および／または化合物のための特定用途に依存するが、選択は十分に、当技術分野において訓練された者の技術の範囲内であることを意味する。

【0021】

本開示の実施形態では、本明細書で記載の化合物は、少なくとも１つの不斉中心を有し得る。化合物が２個以上の不斉中心を有する場合、それらはジアステレオマーとして存在し得る。全てのそのような異性体および任意の比率でのこれらの混合物は、本開示の範囲に包含されることを理解されたい。化合物の立体化学は、本明細書に列挙されたいずれかの所与の化合物で示される通りであってよいが、このような化合物は一定量（例えば、２０％未満、適切には、１０％未満、より適切には、５％未満）の別の立体化学を有する本開示の化合物を含んでよいことも、さらに理解されるべきである。分離された、純粋なまたは部分精製された光学異性体またはこれらのラセミ混合物のようないずれの光学異性体も、本開示の範囲内に含まれることが意図される。
本開示の化合物はまた、異なる互変異性型でも存在し得、化合物が形成するいずれの互変異性型、並びにこれらの混合物は、本開示の範囲内に含まれることが意図される。

【0022】

本記述は当業者により使用される多くの化学用語および略語に言及する。それにもかかわらず、選択された用語の定義が、明確さおよび一貫性のために提供される。
本明細書で使用される「約（ａｂｏｕｔ）」、「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、最終結果が顕著に変化しないような、合理的な量の修飾される用語の逸脱を意味する。程度のこれらの用語は、この逸脱が、それが修飾する単語の意味を無効にしない場合、または当業者に文脈が別義を示唆しない限り、修飾される用語の少なくともまたは最大±５％の偏差を含むものとして解釈されるべきである。

【0023】

本明細書で使用される「アルキル」という用語は、単独で使用されるか別の基の一部として使用されるかに関係なく、直鎖または分枝鎖の、飽和のアルキル基を意味する。言及されるアルキル基で含有可能な炭素原子の数は、接頭辞「Ｃｎ１－ｎ２」により示される。例えば、Ｃ１－１０アルキルという用語は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。
「アルキル」という用語は、本明細書では、単独で使用されるか別の基の一部として使用されるかに関係なく、直鎖または分枝鎖の、飽和のアルキル基、即ち、その末端の２つに置換基を含む飽和炭素鎖を意味する。言及されるアルキレン基で含有可能な炭素原子の数は、接頭辞「Ｃｎ１－ｎ２」により示される。例えば、Ｃ２－６アルキレンという用語は、２、３、４、５または６個の炭素原子を有するアルキレン基を意味する。
「利用可能な水素原子」または「利用可能な原子」におけるような、「利用可能な」という用語は、置換基により置換できることが当業者に既知であると想定される原子を指す。
本明細書で使用される「アミン」または「アミノ」という用語は、単独で使用されるか別の基の一部として使用されるかに関係なく、一般式ＮＲ’Ｒ”の基を指しし、式中、Ｒ’およびＲ”はそれぞれ、水素またはＣ１－６アルキルから独立に選択される。
本明細書で使用される「シクロアルキル」という用語は、単独で使用されるか別の基の一部として使用されるかに関係なく、１つまたは複数の環を含む飽和炭素環基を意味する。言及されるシクロアルキル基で可能な炭素原子の数は、数的接頭辞「Ｃｎ１－ｎ２」により示される。例えば、Ｃ３－１０シクロアルキルという用語は、３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素原子を有するシクロアルキル基を意味する。
本明細書で使用される「アリール」という用語は、単独で使用されるか別の基の一部として使用されるかに関係なく、少なくとも１個の環を含む炭素環基を指す。本開示のある実施形態では、アリール基は、フェニル、インダニルまたはナフチルなどの、６、９または１０個の炭素原子を含む。
本明細書で使用される「ヘテロシクロアルキル」という用語は、単独で使用されるか別の基の一部として使用されるかに関係なく、その中の１個または複数の原子がＯ、ＳおよびＮから選択されるヘテロ原子である少なくとも１個の非芳香環を含む環式基を指す。ヘテロシクロアルキル基は、飽和または不飽和（すなわち、１個または複数の二重結合を含む）のいずれかである。ヘテロシクロアルキル基が接頭辞Ｃｎ１－ｎ２を含む場合、この接頭辞は、対応する炭素環基中の炭素原子の数を示し、その中で１個または複数、適切には１～５個の環原子が、上で定義されるヘテロ原子で置換される。
本明細書で使用される「ヘテロアリール」という用語は、単独で使用されるか別の基の一部として使用されるかに関係なく、その中で１個または複数の原子がＯ、ＳおよびＮから選択されるヘテロ原子である少なくとも１個のヘテロ芳香環を含む環式基を指す。ヘテロアリール基が接頭辞Ｃｎ１－ｎ２を含む場合、この接頭辞は、対応する炭素環基中の炭素原子の数を示し、その中で１個または複数、適切には１～５個の環原子が、上で定義のヘテロ原子で置換される。

【0024】

全ての環式基は、アリールおよびシクロ基を含み、１個または２個以上の環を含む（すなわち、多環式である）。環式基が２個以上の環を含む場合、環は融合され、架橋され、スピロ縮合され、または結合手により連結されてよい。
第１の環が第２の環と「融合され」ているということは、第１の環および第２の環がこれらの間で２個の隣接する原子を共有することを意味する。
第１の環が第２の環と「架橋され」ているということは、第１の環および第２の環がこれらの間で２個の非隣接原子を共有することを意味する。
第１の環が第２の環と「スピロ縮合され」ているということは、第１の環および第２の環がこれらの間で１個の原子を共有することを意味する。
本明細書で使用される用語「ハロ」は、ハロゲン原子を指し、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを包含する。

【0025】

用語「任意に置換される」は、置換されないか、または１個または複数の置換基で置換される、基、構造体、分子を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ａｔｍ」は、気圧を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ＭＳ」は、質量分析を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ａｑ．」は、水性を指す。

【0026】

本明細書で使用される「保護基」または「ＰＧ」などの用語は、分子の反応性部分を保護またはマスクして、分子の別の部分を操作するまたは反応させる間に、分子のこれらの反応性部分における副反応を防止する、化学部分を指す。操作または反応が完了した後、保護基は、分子の残りの部分を劣化または分解しない条件下で除去される。好適な保護基の選択は、当業者により実施できる。従来型の多くの保護基が当技術分野で知られており、例えば、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ" ＭｃＯｍｉｅ，Ｊ．Ｆ．Ｗ． Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９７３，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，第３版，１９９９およびＫｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｐ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，第３版，２００３，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｓ）に記載されている。

【0027】

コポリマーの形成では、金属キレートモノマーの特定の重合可能な末端基は、より良好に適合されるか、または特定の構造モノマーと選択的に重合されると理解できる。コモノマーの反応性は、当該技術分野において既知の方法を使用して、例えば反応性比率の測定により、決定できる。例えば、ビニルおよびメチルビニルは、ビニルエーテルと反応し、アリールビニルは、他のスチレンと反応し、アクリレートは、他のアクリレートと反応する。

【0028】

本明細書で使用される用語「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミン四酢酸を指す。
本明細書で使用される用語「ＤＴＰＡ」は、ジエチレントリアミン五酢酸を指す。
本明細書で使用される用語「ＥＧＴＡ」は、エグタズ酸を指す。
本明細書で使用される用語「ＥＤＤＳ」は、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－二コハク酸を指す。
本明細書で使用される用語「ＥＤＤＨＡ」は、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシフェニル酢酸）を指す。
本明細書で使用される用語「ＢＡＰＴＡ」は、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸を指す。
本明細書で使用される用語「ＴＡＣＮ」は、１，４，７－トリアザシクロノナンを指す。
本明細書で使用される用語「ＴＡＣＤ」は、１，５，９－トリアザシクロドデカンを指す。
本明細書で使用される用語「サイクレン」は、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカンを指す。
本明細書で使用される用語「サイクラム」は、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカンを指す。
本明細書で使用される用語「（１３）ａｎｅＮ４」は、１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン（ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｔｒｉｄｅｃａｎｅ）を指す。
本明細書で使用される用語「１，７－ジアザ－１２－クラウン－４」は、１，７－ジオキサ－４，１０－ジアザシクロドデカンを指す。
本明細書で使用される用語「１，１０－ジアザ－１８－クラウン－６」は、１，４，１０，１３－テトラオキサ－７，１６－ジアザシクロオクタデカンを指す。
本明細書で使用される用語「ＤＦＯ」は、デスフェリオキサミンを指す。
本明細書で使用される用語「ＴＡＣＤタイプキレート化剤」、「ＴＡＣＮタイプキレート化剤」、「サイクレンタイプキレート化剤」などは、特定基部構造（すなわち、ＴＡＣＤ、ＴＡＣＮ、サイクレン、など）を含むキレート化剤を指し、特定基部構造は、利用戒能な水素原子の位置でさらに置換できる。

【0029】

本明細書で使用される用語「膨潤可能ポリマーシード」は、体積を増やすことができるポリマー粒子を指す。例えば、膨潤可能なポリマーシードは、膨潤剤と接触されると、体積を増大できる。膨潤剤は、例えばアニオン性界面活性剤および／または有機化合物であり得る。膨潤可能なポリマーシードが膨潤されると、モノマー（例えば、構造モノマーおよび金属キレートモノマー）、立体安定剤、および重合開始剤などの化合物は、膨潤ポリマーシードの内部に拡散できる。続いて、モノマーの重合が起こり得る。

【0030】

本明細書で使用される用語「実質的に無酸素条件」は、酸素含量が低いか、または酸素が存在しない反応条件を指す。例えば、実質的に無酸素条件は、反応が不活性雰囲気下、例えば、希ガス（例えば、ヘリウム、アルゴン）または窒素雰囲気下で実施される反応条件を指し得る。例えば、実質的に無酸素条件は、約０ｐｐｍ～約５ｐｐｍ、約０ｐｐｍ～約３ｐｐｍ、約０ｐｐｍ～約２ｐｐｍ、または約０ｐｐｍ～約１ｐｐｍ、または約０．０１ｐｐｍ～約２ｐｐｍの酸素含量を指し得る。

【0031】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびキメラ抗体およびこれらの結合フラグメントを包含することが意図される。抗体は、組換え源由来であっても、および／または遺伝子導入動物で産生されてもよい。抗体は、従来の技術を使用してフラグメント化できる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することにより生成できる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントは、ジスルフィド架橋を還元してＦａｂ’フラグメントを産生するように処理できる。パパイン消化は、Ｆａｂフラグメントの形成をもたらし得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ディアボディ、二重特異的抗体および他のフラグメントもまた、組換え技術により合成できる。本明細書で使用される抗体フラグメントは、結合フラグメントを意味する。

【0032】

本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然および非天然起源の塩基、糖、および糖間（主鎖）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーの配列を含む核酸を指し、一本鎖および二本鎖分子、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む。オリゴヌクレオチドは、非天然起源モノマーを含み、長いサイズ（例えば、１０００モノマーより大きく～最大で１０Ｋモノマー）、中間サイズ（例えば、２００～１０００（両端を含む）ヌクレオチド）または短いサイズ、例えば２００モノマー、１００モノマー、５０モノマー未満であってよい。用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば、単鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ＲＮＡからの逆転写される）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」および「ｍｉＲＮＡ」ならびにオリゴヌクレオチド類似体、例えば「モルホリノオリゴヌクレオチド」、「ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド」、または当業者に既知の任意のオリゴヌクレオチドまたはその類似体を包含する。

【0033】

本明細書における終端点による数値範囲の列挙は、その範囲内に含まれる全ての数および小数部を包含する（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５を包含する）。全ての数およびその端数は「約」という用語によって修飾されるとみなされることも理解されるべきである。

【0034】

さらに、特定のセクションで記載される定義および実施形態は、当業者により理解され得るように適切に本明細書で記載される他の実施形態に適用可能であることが意図される。例えば、次の節では、開示の異なる態様がより詳細に定義される。そのように定義されたそれぞれの態様は、別義が明確に指示されない限り、いずれかの他の態様と組み合わされてよい。特に、好ましいまたは有利であるとして示されるいずれかの特徴が、好ましいまたは有利であるとして示されるいずれかの他の特徴と組み合わされてよい。

【0035】

本明細書で記載される範囲について、部分的範囲、例えばそれらの間の０．１毎の増分もまた、意図される。例えば、範囲が０ｐｐｍ～５ｐｐｍである場合、０．１ｐｐｍ～約５ｐｐｍ、０ｐｐｍ～約４．９ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ～約４．９ｐｐｍ、などの部分的範囲も意図される。

【0036】

ＩＩ．本開示の化合物、組成物およびキット
従って、一態様では、本開示は、金属コード化マイクロビーズを含み、マイクロビーズは、
構造モノマー、および
金属およびキレート化剤を含む金属キレートモノマーを含むコポリマー、を含み；
キレート化剤は、少なくとも３つの部位で金属を配位し；および構造モノマーは、キレート化剤を含まない。

【0037】

本開示のマイクロビーズは、実質的に均一に分散された金属を含み得る。
例えば、金属キレートモノマーにキレート化された金属は、表面結合に限定されず、むしろ、本開示のマイクロビーズ全体にわたり、および／またはマイクロビーズの内部で分散されると見出され得る。

【0038】

いくつかの実施形態では、キレート化剤は、少なくとも４つの部位で、少なくとも５つの部位で、少なくとも６つの部位で、少なくとも７つの部位で、または少なくとも８つの部位で、金属を配位する。例えば、ＤＴＰＡは、８座配位リガンドである（８つの部位で配位できる）。

【0039】

いくつかの実施形態では、構造モノマーは、いかなるキレート化剤も含まない（例えば、少なくとも２つの部位で金属を配位するいかなるキレート化剤も含まない）。
いくつかの実施形態では、構造モノマーは、金属不含である。例えば、構造モノマーは、キレート化による、共有結合による（例えば、構造モノマーの炭素骨格中のテルル）、または場合によりいずれか他の手段による金属を含み得ない。構造モノマーは、遷移金属または遷移金属の部類を含み得ない。例えば、構造モノマーは、希土類金属（例えば、ランタニド）および／または本明細書で記載の軟金属を含み得ない。マスサイトメトリーへの適用の場合のような、いくつかの実施形態では、金属キレートモノマーは、重金属（例えば、８０ａｍｕ超の）を含み得るが、一方で構造モノマーは、重金属（例えば、８０ａｍｕ超の）を含まない。

【0040】

いくつかの実施形態では、構造モノマーは、置換もしくは非置換スチレン、α－メチルスチレン、アクリル酸およびエステルならびにこれらのアミド、メタクリル酸およびエステルならびにこれらのアミド、ならびにこれらの誘導体から選択される。一実施形態では、構造モノマーは、置換もしくは非置換スチレンおよび／またはまたはこれらの組み合わせから選択される。

【0041】

いくつかの実施形態では、金属キレートモノマーは、重合の前に式（Ｉ）：

【化1】

の構造を有し、式中、リガンドは、キレート化剤であり、Ｌは、リンカーであり、Ｘは、重合可能な末端基であり、Ｍは、金属であり、ｎは、１または２以上の整数であり、金属キレートモノマーは、重合の前に中性電荷である。
金属は、イオン性の非共有結合相互作用を介して、金属キレートモノマーのキレート化剤にキレート化される。従って、金属は、非共有結合相互作用を介して本開示のマイクロビーズ中に組み込まれる。

【0042】

いくつかの実施形態では、Ｌは、結合、Ｃ３－Ｃ８アルキルアミン、Ｃ３－Ｃ８アルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８ヘテロシクロアルキル、５員または６員アリールまたはヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）Ｏ、またはこれらの混合物から選択される。アルキレン、アリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアリール、およびシクロアルキルヘテロアリールのそれぞれは独立に、置換されない、またはＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アミド、エステル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、ＣＮ、またはこれらの混合物から選択できる１個または複数の置換基により置換されてよい。
Ｌは、例えば、アミドまたはエステル基／結合によりキレート化剤に付着できる。

【0043】

構造モノマーおよび金属キレートモノマーが類似の疎水性を有する場合、他方への一方の組み込みまたは混合が好ましいことが、理解され得る。例えば、構造モノマーが疎水性の場合、疎水性金属キレートモノマーは、構造モノマーとより好ましい相互作用を有し得、２種のモノマーのより効率的な混合をもたらす。従って、いくつかの実施形態では、Ｌは、疎水性であり得る。

【0044】

いくつかの実施形態では、重合可能な末端基は、アリルビニル、スチレン、α－メチルスチレン、アクリル酸塩エステル、メタクリル酸エステル、アクリルアミド、２－メチルアクリルアミド、およびこれらの混合物から選択され、場合により重合可能な末端基は、アリルビニルまたはスチレンである。いくつかの実施形態では、重合可能な末端基は、アリルビニルまたはビニルエステルである。

【0045】

キレート化剤は、例えば三座配位であり得る。いくつかの実施形態では、キレート化剤は、４座配位、５座配位、６座配位、７座配位、または８座配位であり、場合によりキレート化剤は、６座配位または８座配位である。
いくつかの実施形態では、キレート化剤は、アミノポリ酸部分、またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、アミノポリ酸部分の誘導体は、アミノポリ酸部分のアミドを含む。
例えば、アミノポリ酸部分は、アミノポリカルボン酸、アミノポリホスホン酸、またはこれらの組み合わせから選択できる。

【0046】

いくつかの実施形態では、Ｌは、結合であり、キレート化剤は、アミノポリ酸であり、重合可能な末端基は、アリルビニルである。例えば、金属キレートモノマーは、金属に配位したビニルベンゼンイミノ二酢酸または金属に配位したジビニルベンゼンイミノ二酢酸であり得る。
他の実施形態では、アミノポリ酸部分は、エチレンイミン、プロピレンアミン、またはこれらの混合物の１種または複数の置換オリゴマーであり、オリゴマーは、２個以上のカルボン酸および／またはホスホン酸で置換されている。オリゴマーは、クラウンエーテルまたはアザクラウンエーテルであり得る。いくつかの実施形態では、アミノポリ酸部分は、エチレンオキシド、エチレンイミン、プロピレンオキシド、プロピレンアミン、エタノールアミン、プロパノールアミン、アミノフェノールシクロヘキサンジアミン、またはこれらの混合物の１種または複数の置換オリゴマーである。
さらに他の実施形態では、オリゴマーは、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８ヘテロシクロアルキル、ハロ、アルコール、アミン、アミド、エステル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、ＣＮ、またはこれらの混合物から選択される１個または複数の置換基によりさらに置換される。

【0047】

いくつかの実施形態では、キレート化剤は、ＤＦＯ、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＥＤＤＳ、ＥＤＤＨＡ、ＢＡＰＴＡ、Ｈ４ｎｅｕｎｐａ、Ｈ６ｐｈｏｓｐａ、Ｈ４ＣＨＸｏｃｔａｐａ、Ｈ４ｏｃｔａｐａ、Ｈ２ＣＨＸｄｅｄｐａ、Ｈ５ｄｅｃａｐａ、Ｃｙ－ＤＴＰＡ、Ｐｈ－ＤＴＰＡ、ＴＡＣＮタイプキレート化剤、ＴＡＣＤタイプキレート化剤、サイクレンタイプキレート化剤、サイクラムタイプキレート化剤、（１３）ａｎｅＮ４タイプキレート化剤、１，７－ジアザ－１２－クラウン－４タイプキレート化剤、１，１０－ジアザ－１８－クラウン－６タイプキレート化剤、またはこれらの誘導体から選択される。
例えば、ＴＡＣＮタイプキレート化剤は、ＮＯＴＡ、ＮＯＰＯ、ＴＲＡＰ、またはこれらのいずれかの誘導体であり得る。
いくつかの実施形態では、サイクレンタイプキレート化剤は、ＤＯＴＡまたはその誘導体である。
いくつかの実施形態では、サイクラムタイプキレート化剤は、ＴＥＴＡ、架橋ＴＥＴＡ、ＤｉＡｍＳａｒ、またはこれらの誘導体から選択される。
他の実施形態では、（１３）ａｎｅＮ４タイプキレート化剤は、ＴＲＩＴＡまたはその誘導体から選択される。
さらに他の実施形態では、１，１０－ジアザ－１８－クラウン－６タイプキレート化剤は、ＭＡＣＲＯＰＡまたはその誘導体から選択される。

【0048】

いくつかの実施形態では、キレート化剤は、ＤＴＰＡ、Ｃｙ－ＤＴＰＡ、Ｐｈ－ＤＴＰＡ、またはこれらの誘導体から選択される。
例えば、ＤＴＰＡの誘導体は、それらの間の原子と一緒に結合されて５員または６員環、場合によりシクロアルキル環、アリールまたはヘテロアリール環、を形成する２個の隣接する炭素原子を有するＤＴＰＡを含み得る。

【0049】

重合の前に、本明細書で記載のモノマーは、未反応であり、即ち、モノマーは、重合に参加できる重合可能な末端基を含む。いくつかの実施形態では、重合の前に、金属キレートモノマーは：

【化2】

であり、式中、ＬおよびＸは、本明細書で記載の通りである。

【0050】

他の実施形態では、重合の前に、金属キレートモノマーは：

【化3】

、またはこれらの混合物から選択される。
例えば、混合物は、異なる金属を有する１種または複数の前記金属キレートモノマーを含み得る。

【0051】

他の実施形態では、キレート化剤は、ポルフィリンまたはフタロシアニンを含む。
例えば、キレート化剤は、置換されたまたは置換されないポルフィリンであり得る。

【0052】

いくつかの実施形態では、ポルフィリンおよびフタロシアニンはそれぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アミド、エステル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、カルボン酸、またはこれらの混合物で置換される。

【0053】

キレート化剤がポルフィリンまたはフタロシアニンであるか、またはこれらを含む場合、金属は、軟金属であり得る。例えば、軟金属は、カドミウム、コバルト、銅、鉄、亜鉛、ニッケル、スズ、オスミウム、パラジウム、白金、金色、タリウム、水銀、または鉛であってよく、これらの同位体、ならびにこれらの混合物を含み得る。いくつかの実施形態では、軟金属は、８０ａｍｕ以上の原子質量を有する。

【0054】

いくつかの実施形態では、重合の前に金属キレートモノマーは：

【化4】

、またはこれらの混合物から選択され、ｎは、１～４の整数である。
例えば、Ｌは、アニリンであり得る。
いくつかの実施形態では、ｎは、２であるか、または少なくとも２である。

【0055】

他の実施形態では、金属キレートモノマーは：

【化5】

、またはこれらの混合物から選択される。

【0056】

本開示のマイクロビーズはまた、立体安定剤をさらに含み得る。立体安定剤は、ＰＶＰ、ポリビニルアルコール、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアクリル酸、アクリル酸エステルの水溶性ホモポリマー、メタクリル酸エステルの水溶性ホモポリマー、アクリルアミドの水溶性ホモポリマー、メタクリルアミドのホモポリマー、水溶性コポリマー立体安定剤、またはこれらの混合物であり得る。

【0057】

いくつかの実施形態では、水溶性コポリマー立体安定剤は、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、アクリルアミドまたはメタクリルアミドと、メチルアクリレートおよび／またはエチルアクリレート、またはこれらの混合物とのコポリマーから選択される。
コポリマーはまた、例えば金属キレートモノマーおよび／または構造モノマーが２つ以上の重合性基を有する場合に達成されるように、架橋されてよい。
例えば、本開示のマイクロビーズは、複数の金属を含み得る。例えば、各金属は、同じタイプまたは異なるタイプの金属キレートモノマーにより組み込まれてよい。金属は、複数の金属であり得る。
いくつかの実施形態では、複数の金属は、１種または複数の濃縮同位体を含む。

【0058】

いくつかの実施形態では、複数の金属は、少なくとも２種の金属、少なくとも３種の金属、または少なくとも４種の金属を含む。
他の実施形態では、複数の金属の各金属の量は、複数の金属の別の金属の量の約２０％または約１０％以内である。例えば、これは、マイクロビーズの集団、または１個のマイクロビーズに対しマスサイトメトリーにより決定できる。
金属は、例えば、遷移金属（すなわち、周期表の３～１２族の金属、またはランタニドまたはアクチニドシリーズの金属）であり得る。金属は、例えば、インジウム、ビスマス、または希土類金属であり得る。希土類金属は、例えば、ランタニド金属、イットリウム、またはこれらの混合物であり得る。いくつかの実施形態では、金属は、インジウム、ビスマス、軟金属、または希土類金属である。軟金属は、カドミウム、コバルト、銅、鉄、亜鉛、ニッケル、スズ、オスミウム、パラジウム、白金、金色、タリウム、水銀、鉛、およびこれらの同位体、ならびにこれらの混合物であり得る。
他の実施形態では、金属は、Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、これらそれぞれの同位体、およびこれらの混合物から選択される希土類金属を含む。
さらに他の実施形態では、金属は、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、これらそれぞれの同位体、およびこれらの混合物から選択される。
さらに他の実施形態では、希土類金属は、８９Ｙ、１３９Ｌａ、１３６Ｃｅ、１３８Ｃｅ、１４０Ｃｅ、１４２Ｃｅ、１４１Ｐｒ、１４２Ｎｄ、１４３Ｎｄ、１４５Ｎｄ、１４６Ｎｄ、１４８Ｎｄ、１４５Ｐｍ、１４４Ｓｍ、１４９Ｓｍ、１５０Ｓｍ、１５２Ｓｍ、１５４Ｓｍ、１５１Ｅｕ、１５３Ｅｕ、１５４Ｇｄ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１６０Ｇｄ、１５２Ｇｄ、１５９Ｔｂ、１５６Ｄｙ、１５８Ｄｙ、１６０Ｄｙ、１６１Ｄｙ、１６２Ｄｙ、１６３Ｄｙ、１６４Ｄｙ、１６５Ｈｏ、１６２Ｅｒ、１６４Ｅｒ、１６６Ｅｒ、１６７Ｅｒ、１６８Ｅｒ、１７０Ｅｒ、１６９Ｔｍ、１６８Ｙｂ、１７０Ｙｂ、１７１Ｙｂ、１７２Ｙｂ、１７３Ｙｂ、１７４Ｙｂ、１７６Ｙｂ、１７５Ｌｕ、またはこれらの混合物から選択される。
金属は、マイクロビーズ全体を通して実質的に均一に分散され得る。それはまた、例えばマイクロビーズの内部で、区分化されてよい。

【0059】

いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、約６０℃もしくは６０℃超、場合により、約７０℃もしくは７０℃超、約８０℃もしくは８０℃超、約９０℃もしくは９０℃超、約１００℃もしくは１００℃超、約１１５℃もしくは１１５℃超、約１２５℃もしくは１２５℃超、または約１３５℃もしくは１３５℃超のガラス転移温度（例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により測定される）を有する。例えば、ＤＳＣの結果は、約１０℃／分～約２０℃／分の走査速度にて、第２または第３の加熱走査で取得される。

【0060】

他の実施形態では、マイクロビーズは、約０．６μｍ～約２０μｍ、約１μｍ～約１５μｍ、約２μｍ～約１０μｍ、または約２μｍ～約６μｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、本開示のマイクロビーズは、マスサイトメトリーに好適なサイズを有する。
さらに他の実施形態では、マイクロビーズは、水中にてコロイド状態で安定である。例えば、本出願のマイクロビーズは、緩衝液中および／または生理的媒体中での貯蔵時に実質的に安定である。例えば、緩衝液中および／または生理的媒体中で実質的に安定は、緩衝液中および／または生理的媒体中の貯蔵時に、金属の顕著な漏出または１％未満の漏出がないことを意味する。

【0061】

いくつかの実施形態では、マイクロビーズの表面は、生体分子への付着のための機能化を含む。機能化は、コーティング層を付加することにより導入できる。
いくつかの実施形態では、付着は共有的付着である。例えば、実施例で示されるように、マイクロビーズは、シリカでコートでき、カルボン酸基などの反応性官能基で機能化できる。生体分子がマイクロビーズに付加されてよい。
生体分子は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、脂質、炭水化物、または小分子として分類され得る。代わりにまたは追加して、生体分子は、その機能により分類され得る。生体分子は特に限定されず、種々の機能化を使って、生体分子をマイクロビーズにコンジュゲートできる。例えば、オリゴヌクレオチドは、単鎖ＤＮＡ分子、場合によりストリンジェントな条件下で標的核酸分析物（例えば、試料核酸生体分子）にハイブリダイズするｃＤＮＡであり得、またはオリゴヌクレオチドは、アプタマーであり得る。例えば、生体分子は、試料に対し内在性の（例えば、試料オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする）標的ｍＲＮＡなどの、標的オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり得る。ハイブリダイゼーションは、８個超、１０個超、１５個超、または２０個超のヌクレオチドである配列のものであってよい。

【0062】

特定の態様では、生体分子は、その機能により分類され得る。例えば、生体分子は、親和性試薬、抗原（例えば、親和性試薬により特異的に結合される分析物）、または酵素基質であり得る。親和性試薬は、抗体（例えば、またはそのフラグメント）、アプタマー、受容体（例えば、またはその一部）、または標的を特異的に結合する任意の他の生体分子（例えば、ビオチンを特異的に結合するストレプトアビジンなどの、アビジン）であり得る。例えば、ビーズは、抗体と結合され、試料中のその標的抗原の存在、例えばサイトカイン、ウィルスタンパク質、癌バイオマーカーなど、の存在を検出するために使用され得る。特定の方法およびキットでは、マイクロビーズは、ビオチンで機能化された別の生体分子の付着のために、アビジンで機能化され得る（例えば、ビーズを多数の異なるアッセイのいずれかに適合可能にするために）。抗原は、抗体などの親和性試薬により特異的に結合されるエピトープを含むタンパク質（またはそのペプチド配列）であり得る。例えば、ビーズは、ウィルス抗原（ウィルスタンパク質配列など）に付着され、本明細書でさらに記載されるように、ウィルス抗原を特異的に結合する試料中の抗体の存在を検出するために使用され得る。酵素基質は、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼまたはリガーゼなどの、特定の酵素の作用を受ける任意の基質であり得る。例えば、基質は、プロテアーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、脱メチル化酵素などの酵素に対する基質であるタンパク質（例えば、またはそのペプチド配列）であり得る。非タンパク質基質は、例えば、制限酵素もしくはＤＮＡ修復のための部位（ニックなど）により切断可能な制限配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチド、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによる標的化配列を含むオリゴヌクレオチド配列、または当業者に既知の任意の非タンパク質基質を含む。例えば、ビーズは、基質に付着され、基質を修飾する酵素を含む試料に曝露され、かつ基質の修飾（またはその欠如）が、検出され得る（例えば、本明細書でさらに記載されるように）。

【0063】

いくつかの実施形態では、親和性試薬は、抗体またはその結合フラグメントであるか、またはこれらを含む。抗体は、例えばビオチン化抗体または結合フラグメントであってよく、マイクロビーズに直接的にまたは間接的に加えることができる。
例えば、実施例で示されるように、ニュートラアビジン（ＮＡｖ）が、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングによりマイクロビーズ表面にコートされたシリカ上のＣＯＯＨ基に共有結合された。ビオチン化抗体は、強力なビオチン－アビジン親和性によりＮＡｖ修飾マイクロビーズ表面に付着された。

【0064】

従って、親和性試薬は、アビジンまたはストレプトアビジン、ニュートラアビジンおよびカプトアビジン（ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ）などの関連ビオチン結合分子であり得る。このような親和性試薬を含むマイクロビーズは、着目している標的分析物に特異的なビオチン化抗体を用いてカスタマイズできる。

【0065】

いくつかの実施形態では、場合により抗体である親和性試薬は、サイトカイン、場合によりケモカイン、インターフェロン、リンホカイン、モノカイン、ＩＬ－１～３６などのインターロイキン、腫瘍壊死因子およびコロニー刺激因子に特異的である。
抗体はまた、ウィルス、細菌または真菌病原体などの病原性タンパク質に特異的であり得る。このようなマイクロビーズは、環境または患者試料などの試料中のこのような病原体またはそれらの産物の存在の検出のために使用できる。
他の実施形態では、抗原は、ウィルス抗原である。ウィルス抗原を含むこのようなマイクロビーズは、例えば患者試料中のウィルス抗体の検出するために使用できる。他の病原体由来のものなどの抗原も同様である。

【0066】

さらに他の実施形態では、マイクロビーズのコポリマーは、第３のモノマーをさらに含み、第３のモノマーは、少なくともマイクロビーズの表面上に存在し、かつ少なくとも１種の反応性官能基を含む。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、第３のモノマー中に含まれる少なくとも１種の反応性官能基により、例えば３段階分散重合により、機能化される。いくつかの実施形態では、第３のモノマーは、置換もしくは非置換アクリル酸またはメタクリル酸である。３段階分散重合の例は、Ａｂｄｅｌｒａｈｍａｎらの、ＪＡＣＳ，２００９，１５２７６に記載され、この文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0067】

例えば、マイクロビーズの表面は、反応性官能基により機能化できる。
いくつかの実施形態では、反応性官能基は、二酸化ケイ素コーティング上にある。
他の実施形態では、反応性官能基は、アミン、チオール、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、エポキシド、ビニル、アルキン、マレイミド、またはクリックケミストリー部分（例えば、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、アジド、トランスシクロオクテンもしくはテトラジン、またはこれらの誘導体）またはこれらの混合物から選択される。
さらに他の実施形態では、機能化は、マイクロビーズの表面の二酸化ケイ素のコーティングを含み、場合により機能化は、二酸化ケイ素のコーティングを官能化することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの表面は、反応性官能基により機能化される。
他の実施形態では、反応性官能基は、二酸化ケイ素コーティング上にある。
例えば、反応性官能基は、アミン、チオール、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、エポキシド、ビニル、アルキン、マレイミド、またはまたはこれらの混合物から選択できる。

【0068】

二酸化ケイ素コーティングの機能化は、当該技術分野において既知の方法を使用して実施できることが、理解される。例えば、二酸化ケイ素コーティングによるマイクロビーズの機能化の方法が、米国特許出願公開第２０１９／００９１６４７号に記載されている。この特許出願公開の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0069】

いくつかの実施形態では、生体分子への付着は、非共有的な付着である。
他の実施形態では、マイクロビーズの表面は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはこれらの混合物により機能化される。
さらに他の実施形態では、マイクロビーズの表面は、生体分子にコンジュゲートされる。

【0070】

いくつかの実施形態では、金属は、生体分子を特定するバーコードを与える。
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの内部構造は、コポリマーを含む。
他の実施形態では、金属キレートモノマーは、単一金属原子をキレート化し、複数の金属原子をキレート化しない。

【0071】

いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、金属キレートモノマーを含まないポリマーシードを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーシードは、ポリマーシードを膨潤することにより形成される内部空間を有し、コポリマーは、少なくともポリマーシードの内部空間内に存在する。
いくつかの実施形態では、ポリマーシードは、構造モノマーを含み、場合によりポリマーシードの構造モノマーは、コポリマーの構造モノマーと同一の構造である。
別の態様では、本開示は、本開示のマイクロビーズの集団を含む。

【0072】

いくつかの実施形態では、集団は、約１０％または１０％未満の変動係数（ＣＶ）を有する粒度分布を有する。
他の実施形態では、変動係数は、５％未満である。

【0073】

いくつかの実施形態では、各マイクロビーズは、複数の金属を含み、複数の金属の各金属のマイクロビーズの集団にわたる平均量は、複数の金属の別の金属の平均量の約１０％または１０％以内である。
他の実施形態では、複数の金属は、１種または複数の濃縮同位体を含む。
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団の１つのマイクロビーズの各金属の量は、マイクロビーズの集団の別のマイクロビーズの同じ金属の量の約２０％もしくは２０％以内または約１０％もしくは１０％以内または約５％もしくは５％以内である。
他の実施形態では、マイクロビーズの集団の各金属の量は、約２０％または２０％未満の変動係数の分布を有する。
さらに他の実施形態では、マイクロビーズの集団の各金属の量は、約１０％または１０％未満の変動係数の分布を有する。
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの集団のマイクロビーズは、実質的に同じ量で同じ金属を含む。
いくつかの実施形態では、同じ金属は、複数の金属であり、かつマイクロビーズは、実質的に同じ量で複数の金属の各金属を含む。

【0074】

さらなる態様は、マイクロビーズまたは複数のマイクロビーズを含む組成物である。組成物は、例えば緩衝液であってよく、例えば約７のｐＨに緩衝化される。緩衝液は、アンモニウム酢酸などの緩衝剤を含み得る。組成物は、ＰＶＰも含み得る。
ある実施形態では、組成物は、水性のコロイド懸濁液である。
組成物は、安定剤、防腐剤、緩衝剤、およびおよびこれらの混合物から選択される１種または複数の成分を含み得る。
別の態様では、本開示は、本開示のマイクロビーズの複数の個別の集団および／または組成物を含むキットを含む。

【0075】

いくつかの実施形態では、マイクロビーズの各集団は、マイクロビーズの金属または複数の金属に基づいて、別のマイクロビーズ集団から識別できる。
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの少なくとも１つの集団（例えば、各集団）のマイクロビーズは、マイクロビーズの別の集団のマイクロビーズの金属または複数の金属とは異なる金属または複数の金属を含む。
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの少なくとも１つの集団（例えば、各集団）のマイクロビーズは、マイクロビーズの別の集団のマイクロビーズとは異なる比率で複数の金属を含む。
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの各集団のマイクロビーズは、異なる生体分子にコンジュゲートされる。例えば、マイクロビーズは、マイクロビーズ中の金属または複数の金属の性質によりマイクロビーズに付着された生体分子に対するバーコーディング剤として使用できる。
別の態様では、本開示は、本開示の方法により調製されたマイクロビーズを含む。

【0076】

いくつかの実施形態では、構造モノマーおよび金属キレートモノマーは、本明細書記載の方法のいずれかの方法により共重合され得る。注目すべきことは、本明細書に記載の方法で使用される構造モノマーおよび／または金属キレートモノマーは、このセクションで記載のいずれかの態様を有し得ることである。

【0077】

本開示のキットは、本明細書で記載のマイクロビーズ、またはマイクロビーズ集団のいずれかを含み得る。マイクロビーズ、またはそれらのキットはまた、本明細書でさらに記載されるように、質量分析アッセイのための追加の態様も含み得る。本開示の態様はまた、本明細書でさらに記載されるように、質量分析アッセイなどの追加の方法も含む。

【0078】

ＩＩＩ．本開示の方法
別の態様では、本開示は、
重合された構造モノマー、重合されない構造モノマー、および立体安定剤を含む第１の混合物を得るために核生成段階で立体安定剤の存在下にて構造モノマーを重合すること、
第２の混合物を得るために第１の混合物を、金属および少なくとも１種の重合可能な末端基に付着されたキレート化剤を含む金属キレートモノマーを組み合わせることあって、
キレート化剤は、少なくとも３つの部位で金属を配位し；および金属キレートモノマーは、構造モノマーと重合可能である、組み合わせること；および
マイクロビーズのコポリマーを形成するために第２の混合物を重合することであって、
構造モノマーは、キレート化剤を含まない、重合すること、
を含む金属コード化されたマイクロビーズを調製する方法を含む。

【0079】

より効率的な重合のために、構造モノマーおよび金属キレートモノマーは反応媒体中で可溶性である必要があることが理解され得る。さらに、モノマーが、例えば重合を妨げる置換基（例えば、ハロ、アミン、アルコール）で置換される場合、置換基は、重合の前に、および／または重合中に、当該技術分野において既知の保護基を用いて一時的に保護されてよいと理解され得る。重合の後で、当該技術分野において既知の方法を使用して、保護基は、選択的に除去されてよく、置換基は、選択的に脱保護されてよい。

【0080】

いくつかの実施形態では、金属は、複数の金属である。
他の実施形態では、構造モノマーは、構造モノマーに基づき約５％～約２０％完結へと核生成段階で重合される。
さらに他の実施形態では、第２の混合物の重合は、構造モノマーに基準づき７５％～約１００％完結、約８０％～約９９％完結、約８５％～約９５％完結、約８５％～約９３％完結へと行われる。

【0081】

いくつかの実施形態では、構造モノマーは、本明細書で定義される通りである。
いくつかの実施形態では、金属キレートモノマーは、本明細書で定義される通りである。
いくつかの実施形態では、立体安定剤は、本明細書で定義される通りである。
いくつかの実施形態では、金属は、本明細書で定義される通りである。

【0082】

いくつかの実施形態では、方法は、マイクロビーズを機能化することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの機能化は、
第３の混合物を得るために重合された第２の混合物を第３のモノマーと混合することであって、第３のモノマーが、反応性官能基を含む、混合すること；および
第３の混合物を重合すること、
を含む。
例えば、反応性官能基は、アミン、チオール、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、エポキシド、ビニル、アルキン、マレイミド、またはまたはこれらの混合物から選択できる。特定の反応性官能基は重合プロセスを妨げる可能性があり、かつ重合の前に、および／または重合中に、当該技術分野において既知の保護基を用いて保護できることが、理解される。例えば、アミンおよびチオールは、保護基により保護できる。例えば、反応性官能基で置換されたモノマーは、保護形態で使用でき、それにより反応性官能基は重合プロセスを妨げないはずである。場合により、保護された反応性官能基は、当該技術分野において既知の方法を使用して脱保護されてよい。

【0083】

いくつかの実施形態では、第３のモノマーは、任意に置換されるアクリル酸、任意に置換されるメタクリル酸、およびこれらの混合物から選択される。

【0084】

他の実施形態では、マイクロビーズの機能化は、二酸化ケイ素によるマイクロビーズのコーティングを含む。
他の実施形態では、マイクロビーズの機能化は、二酸化ケイ素コーティングの機能化をさらに含む。
例えば、二酸化ケイ素コーティングの機能化は、二酸化ケイ素コーティングを有機シランと反応させることを含み得る。例えば、有機シランは、クロロシラン、アルコキシシラン、これらの誘導体、およびこれらの混合物から選択できる。
いくつかの実施形態では、二酸化ケイ素コーティングの有機シランとの反応は、触媒の存在下で実施される。例えば、触媒は、アンモニア、水酸化物、有機アミン、またはこれらの混合物から選択できる。
いくつかの実施形態では、有機シランは、反応性官能基を含む。
いくつかの実施形態では、反応性官能基は、アミン、チオール、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、エポキシド、ビニル、アルキン、マレイミド、またはまたはこれらの混合物から選択される。
いくつかの実施形態では、有機シランは、ＡＰＴＥＳである。

【0085】

他の実施形態では、方法は、生体分子にマイクロビーズをコンジュゲートすることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、生体分子は、本明細書で定義される通りである。
いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、約０．６μｍ～約２０μｍ、約１μｍ～約１５μｍ、約２μｍ～約１０μｍ、約２μｍ～約６μｍの直径を有する。
いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、本開示のマイクロビーズである。
いくつかの実施形態では、マイクロビーズの内部構造は、コポリマーを含む。

【0086】

別の態様では、本開示は、金属コード化されたマイクロビーズを調製する方法を含み、方法は、
膨潤可能なシード粒子およびアニオン性界面活性剤の水性分散液を提供すること；
水性分散液を、構造モノマーと金属キレートモノマーを含むモノマーと接触させることであって、金属キレートモノマーは、金属および少なくとも１種の重合可能な末端に付着されたキレート化剤を含み、キレート化剤は、少なくとも３つの部位で金属を配位する、接触させること；および
膨潤したシード粒子の水性分散液を形成するためにモノマーをシード粒子中に拡散させること；および
膨潤したシード粒子の水性分散液中でモノマーの重合を開始させることであって、構造モノマーは、キレート化剤を含まない、開始させること、
を含む。

【0087】

別の態様では、本開示は、
膨潤可能なポリマーシード、有機化合物、アニオン性界面活性剤、および場合によりその中で有機化合物が可溶性である有機溶媒を含む水性分散液を提供すること；
有機化合物を膨潤可能なポリマーシード中に拡散させること；
水性分散液を構造モノマーおよび金属キレートモノマーを含む混合物と接触させることであって、場合により混合物は、立体安定剤および／または重合開始剤をさらに含む、接触させること；および
マイクロビーズのコポリマーを得るために混合物を重合させること；
を含む、金属コード化されたマイクロビーズを調製する方法を含み、
有機化合物は、５０００Ｄａ未満の分子量および２５℃で１０^－２ｇ／Ｌ未満の水溶性を有する。

【0088】

別の態様では、本開示は、
乳化重合により膨潤可能なポリマーシードを調製することであって、アニオン性界面活性剤が、実質的に無酸素条件下で乳化剤として使用される、調製すること；
膨潤可能なポリマーシードを、有機化合物、アニオン性界面活性剤、および場合によりその中で有機化合物が可溶性である有機溶媒を含む水性分散液と接触させること；
膨潤可能なポリマーシード中に有機化合物を拡散させること；
水性分散液を構造モノマーおよび金属キレートモノマーを含む混合物と接触させることであって、場合により混合物が、立体安定剤および／または重合開始剤をさらに含む、接触させること；および
マイクロビーズのコポリマーを得るために混合物を重合させること；
を含む金属コード化されたマイクロビーズを調製する方法を含み、
有機化合物は、５０００Ｄａ未満の分子量および２５℃で１０^－２ｇ／Ｌ未満の水溶性を有する。

【0089】

いくつかの実施形態では、構造モノマーは、アクリルモノマー、メタクリレートモノマーおよびスチレン、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）、エチルビニルベンゼン、ビニルピリジン、アミノスチレン、メチルスチレン、ジメチルスチレン、エチルスチレン、エチルメチルスチレン、ｐ－クロロスチレンおよび２，４－ジクロロスチレンからなる群より選択されるビニルモノマーからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、膨潤したシード粒子の水性分散液は、立体安定剤をさらに含む。
いくつかの実施形態では、立体安定剤は、ポリビニルピロリドンである。
いくつかの実施形態では、膨潤可能なシード粒子の水性分散液を提供することは、乳化重合により単分散の膨潤可能なシード粒子を調製することを含む。
いくつかの実施形態では、膨潤可能なシード粒子の水性分散液は、５０００ダルトン未満の分子量および２５℃で１０^－２ｇ／Ｌ未満の水溶性を有する有機化合物；および、場合によりその中で上記有機化合物が可溶性である有機溶媒をさらに含む。
いくつかの実施形態では、膨潤可能なシード粒子は、単分散の膨潤可能なシードのオリゴマー粒子である。
例えば、アニオン性界面活性剤は、アルキル硫酸またはアルキルスルホン酸であり得る。いくつかの実施形態では、アニオン性界面活性剤は、Ｃ_８－１６アルキル硫酸またはスルホン酸またはこれらの塩である。例えば、アニオン性界面活性剤は、デシル硫酸、ドデシル硫酸、デシルスルホン酸、ドデシルスルホン酸、またはこれらの塩であり得る。いくつかの実施形態では、アニオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウムまたはデシル硫酸ナトリウムである。
いくつかの実施形態では、構造モノマーは、本明細書で定義される通りである。
いくつかの実施形態では、金属キレートモノマーは、本明細書で定義される通りである。
いくつかの実施形態では、有機化合物は、重合開始剤である。
いくつかの実施形態では、重合開始剤は、過酸化物、アゾ化合物、またはこれらの混合物である。
いくつかの実施形態では、有機溶媒は、アルコール、エーテル、ケトン、ジアルキルスルホキシド（例えば、ＤＭＳＯ）、ジアルキルホルムアミド（例えば、ＤＭＦ）、またはこれらの混合物から選択される非重合性溶媒である。

【0090】

ＩＶ．本開示のモノマーの合成
本開示のモノマーは、種々の合成方法で調製できる。特定の構造特徴および／または置換基の選択は、別の方法に対する１つの方法の選択に影響を与え得る。所与のモノマーの特定の調製方法の選択は、当業者の技量の範囲内にある。本開示で記載の化合物を調製するためのいくつかの出発材料は、市販の化学的供給源から入手可能である。例えば、後述のような、他の出発材料は、当該技術分野において周知の直接的な変換を用いて入手可能な前駆体から容易に調製される。本出願の第２のモノマーの調製を示す下記スキームでは、全ての変数は、別に定める場合を除き、本記述で定義される通りである。

【0091】

式（Ｉ）の化合物は、例えば下のスキームに示される方法により調製できる。下に示す構造式では、変数は、別に定める場合を除き、式（Ｉ）で定義される通りである。当業者は、下のスキーム中に示された反応の多くは、酸素および／または水に感受性であり得ることを理解し、必要に応じて無水の不活性雰囲気下で反応を実施することを知っているであろう。反応温度および時間は、例示のみの目的で提示され、当業者により理解されるように、収率を最適化するために変わる可能性がある。

【0092】

従って、ある実施形態では、式Ｉの化合物は、スキームＡに示されるように調製される。式Ａのキレート化剤またはリガンドは、式Ｂの重合可能な末端基を有する１つまたは複数のリンカーに付着されて、式Ｃの金属キレート化ができるモノマーを形成する。その後、金属Ｄは、式Ｃのモノマーにキレート化されて、式Ｉの金属キレートモノマーを形成できる。
スキームＡ

【化6】

いくつかの実施形態では、式Ａのリガンドは、１個または複数のカルボン酸基を含んでよい。従って、スキームＡ中のステップａは、スキームＢに従って実施できる。式Ｅのリガンドは、式Ｆの金属キレート化可能なモノマーを得るために、アミド結合形成またはエステル化により、式Ｂの重合可能基を有する１つまたは複数のリンカーに付着できる。アミド結合形成は当該技術分野において既知の方法を使用して、例えば活性化エステルの形成により実施できることが、理解される。
スキームＢ

【化7】

金属キレート化ステップｂは当該技術分野において既知の方法を使用して実施できることが、理解される。例えば、いくつかの実施形態では、式ＣまたはＦおよび式Ｉの金属の金属キレート化可能なモノマーは、それぞれ、好適な溶媒中に溶解され得る。好適な溶媒は、当業者により選択でき、水を含み得る。式Ｄの金属は、金属の塩、例えば、金属のハロゲン化物塩であり得る。金属キレート化のできるモノマーおよび金属の溶液は、一緒に混合され得る。例えば、得られた混合物のｐＨは、監視され、かつ好適なｐＨに調節できる。いくつかの実施形態では、好適なｐＨは、約５．５～約７．５、または約６を含む。得られた混合物は、式Ｉの金属キレートモノマーが生じるまで、撹拌され得る。

【0093】

本明細書で記載される方法を通して、適切な場合には、好適な保護基は、様々な反応物および中間体に、当業者により容易に理解される方式で付加され、その後除去されることが理解されるべきである。そのような保護基を使用するための従来の手順、ならびに、好適な保護基の例は、例えば、"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９９）に記載される。化学的操作による基または置換基の別の基または置換基への変換は、最終生成物に向かう合成経路上で任意の中間体または最終生成物に対し実施できることもまた理解されるべきであり、この場合、可能な変換方式は、他の官能基の変換に使用される条件または試薬に対しその段階で分子が有する固有の不適合性によってのみ制限される。そのような固有の不適合性、ならびに好適な順で適切な変換および合成ステップを実施することによりそれらを回避する方法は、当業者に容易に理解されよう。変換の例は、本明細書で提供され、記載される変換は、変換が例示される一般的な基または置換基にのみ制限されないことが、理解されるべきである。他の好適な変換の参考文献および記載は、"Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ－Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ" Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，ＶＨＣ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．（１９８９）で与えられる。他の好適な反応の参考文献および記載は有機化学の教科書、例えば、"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，Ｍａｒｃｈ，第４版 ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ（１９９２）または"Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"，Ｓｍｉｔｈ，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，（１９９４）に記載されている。中間体および最終生成物の精製のための技術としては、例えば、カラムまたは回転プレートによる順相および逆相クロマトグラフィー、再結晶化、蒸留および液－液または固－液抽出が挙げられ、これらは、当業者により容易に理解されるであろう。

【0094】

Ｖ．質量分析法およびキット
上記マイクロビーズおよびキットは、質量分析アッセイでの使用のための追加の態様を含み得る。以下に記載するのは、質量分析アッセイのための方法およびキットであり、これらは、本明細書の別の箇所で記載される任意の好適なマイクロビーズまたはキットを包含または使用し得る。好適なアッセイは、標的オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、サイトカイン、癌バイオマーカー、または特異的抗原に対する抗体）、または酵素（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、またはマイクロビーズに付着された基質生体分子を修飾する任意の他の着目すべき酵素）などの標的または試料生体分子を検出するためのアッセイを含む。アッセイは、標的試料生体分子を検出するために、ハイブリダイゼーションおよび／またはサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットを使用し得る。好適なアッセイはまた、細胞の分析も含む（例えば、マスサイトメトリーアッセイにおける較正、正規化または定量化のための標準としてのマイクロビーズの使用）。

【0095】

本開示のマイクロビーズ（およびキットまたはその方法）は、光学検出（例えば、蛍光系検出）のために使用され得る。あるいは、本開示のマイクロビーズ（およびキットまたはその方法）は、元素分析（例えば、質量分析）により分析され得る。従って、マイクロビーズは、低蛍光を示す可能性がある（例えば、可視および／またはＵＶの範囲にわたり、０．２未満、０．１未満、０．０５未満、または０．０２未満の蛍光量子収率を有し得る）が、それでも、質量分析（例えば、ＩＣＰ－ＭＳによるなどの原子質量分析）または別の形態の元素分析（例えば、ＩＣＰ－ＯＥＳ、Ｘ線分散分光法）による分析に好適であろう。

【0096】

本明細書で記載のアッセイ方法およびキットは、質量分析による試料の分析のためであり得る。好適な試料は、細胞試料（例えば、細胞または組織切片の懸濁液）または生体液（例えば、懸濁状態の試料生体分子を含む）などの任意の生体試料を含む。試料は、細胞株、細胞培養上清であってよく、またはヒト、げっ歯類または他の哺乳動物などの生物から採取されてもよい。試料は、全血、血清、血漿、または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）などの血液試料であってよい。試料は、唾液試料、経鼻綿棒、切除物（例えば、固形組織の生検）であってよい。試料は、全細胞を含んでよく、または全細胞を含む試料から（例えば、溶解物から）ホモジナイズされてもよい。特定の態様では、試料は、本明細書で記載のアッセイにより、またはキットを使って特徴付けられる精製された試料生体分子であり得る。例えば、アッセイまたはキットは、薬物候補である潜在的試料生体分子を選別し得る。注目すべきことは、追加のステップが、マイクロビーズからの非結合試料生体分子、マイクロビーズからの非結合レポーター、または細胞からの非結合質量タグ付き抗体を除去するように、本明細書で記載のいずれかの方法で実施され得ることである。

【0097】

イメージングマスサイトメトリー（ＩＭＣ）では、試料は、質量分析（例えば、ＬＡ－ＩＣＰ－ＭＳまたはＳＩＭＳ）による分析のための質量タグ（例えば、質量タグ付き抗体による）で標識される組織切片であってよい。懸濁液マスサイトメトリー（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｍａｓｓ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）では、懸濁液中の粒子（細胞および／またはビーズなど）が、分析のためにマスサイトメーター（例えば、ＩＣＰ－ＭＳシステム）中に導入され得る。

【0098】

本願の質量分析は、原子質量分析であり得る。本願の質量分析計は、複数の質量チャネルを同時に検出し得る。異なる質量チャネルは、異なる質量タグからの金属またはその同位体に対応し得る。このような同時質量分析計は、例えば、飛行時間質量分析計（ＴＯＦ－ＭＳ）または磁気セクター質量分析計であり得る。質量分析計は、原子質量分析のために試料を微粒化し得る。例えば、ＩＣＰ、レーザアブレーションＩＣＰ、二次イオン（例えば、二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）のための）または任意の好適なイオン化源を用いて試料を微粒化し得る。マスサイトメーターは、本明細書で記載の質量タグおよび／またはマイクロビーズから金属を特異的に検出し、例えば、より軽い原子（例えば、Ｃ、Ｎ、Ｏなどの内在性元素、および軽金属、および、質量分析計がＩＣＰシステムである場合、場合により、アルゴンおよびアルゴン二量体などのさらなるプラズマガス元素）を除去するためのイオン光学を含み得る。例示的マスサイトメーターは、米国特許出願公開第２００５０２１８３１９号および同２０１６００４９２８３号にさらに記載されており、これらの特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0099】

例示的アッセイスキームを図１５に示す。本開示のコポリマーマイクロビーズは、バーコードを含み得る。バーコードは、金属キレートモノマーによりキレート化された複数の金属または濃縮された金属同位体であり得る。バーコードは、アッセイバーコード（すなわち、マイクロビーズが結合するように機能化された試料生体分子を特定するバーコード）であり得る。代わりにまたは追加して、マイクロビーズは、マイクロビーズが混合された、または混合される予定の試料を特定するために使用される試料バーコードを含み得る。マイクロビーズは、試料生体分子に特異的に結合する生体分子（例えば、捕捉生体分子）に付着（例えば、共有結合）され得る。生体分子は、例えば、ウィルス粒子、サイトカイン、癌バイオマーカーなどの目的の試料抗原生体分子を特異的に結合する抗体などの親和性試薬を含み得る。生体分子は、例えば、目的の試料オリゴヌクレオチド生体分子に特異的にハイブリダイズする配列を有するｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドを含み得る。複数のこのようなビーズを試料と混合することは、図１５に示すように、各ビーズの生体分子がそれらそれぞれの試料生体分子へ結合することを可能にし得る。さらに、図１５に示すように、レポーターが、試料生体分子に結合され得る（例えば、ビーズに付着された生体分子へ試料生体分子を結合させるステップの前に、後で、またはその間に）。レポーターは、質量タグを含み得る。従って、本開示の方法は、バーコード化されたマイクロビーズに付着された生体分子（例えば、捕捉生体分子）に試料生体分子を結合させることを含み、および試料生体分子に質量タグ付きレポーターを結合させることをさらに含み得る。バーコードおよび質量タグはその後、本明細書で記載されるように原子マスサイトメトリー（ａｔｏｍｉｃ ｍａｓｓ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により検出され得る。同様に、本明細書で記載される特定のキットは、場合により試料生体分子を特異的に結合する生体分子に付着されたバーコード化されたマイクロビーズを含み、キットは、質量タグを試料生体分子と結合させるレポーターをさらに含み得る。

【0100】

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書のいずれか他の実施形態で記載のように、マイクロビーズの集団、または複数のマイクロビーズの個別の集団を含む。特定の態様では、マイクロビーズの各集団は、マイクロビーズの金属または複数の金属に基づいて、マイクロビーズの別の集団から識別され得る（例えば、原子質量分析により）。例えば、マイクロビーズの少なくとも１つの集団（例えば、各集団）のマイクロビーズは、マイクロビーズの別の集団のマイクロビーズの金属または複数の金属とは異なる金属または複数の金属を含むか、またはマイクロビーズの別の集団のマイクロビーズとは異なる比率で複数の金属を含んでよい。

【0101】

いくつかの実施形態では、キット中のマイクロビーズの各集団のマイクロビーズは、異なる生体分子にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１種の異なる生体分子により特異的に結合される試料生体分子を特異的に結合できるレポーターなどの、質量タグを含むレポーターをさらに含み得る。キットのマイクロビーズに付着された異なる生体分子は、異なる試料生体分子に特異的に結合し得る。試料生体分子は、試料中に存在する本明細書で記載の任意の生体分子であってよい。このような試料生体分子は、タンパク質（例えば、またはそのペプチド）、オリゴヌクレオチド、脂質、炭水化物または小分子であり得る。タンパク質は、例えば、抗体またはサイトカインであり得る。オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列またはｍＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列であり得る。オリゴヌクレオチドはまた、ＤＮＡ ＲＮＡハイブリッドであり得、および／または１種または複数の修飾残基を含み得る。

【0102】

試料生体分子は、オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）を含み得、マイクロビーズの少なくとも１つの異なる生体分子は、試料生体分子（例えば、標的分析物）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｓＤＮＡ）であり得る。例えば、レポーターは、ハイブリダイズして複数の質量タグ付きオリゴヌクレオチドを試料生体分子に間接的に結合させる、複数のオリゴヌクレオチドを含む。あるいは、質量タグを含むレポーターは、試料生体分子に直接ハイブリダイズし得る。特定の態様では、試料生体分子は、抗原（例えば、サイトカインなどのタンパク質）などの、オリゴヌクレオチド以外の生体分子であり得、レポーターは、抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを含み得、この場合、抗体は抗原に結合でき、抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドは、レポーターの質量タグオリゴヌクレオチドに直接または間接的に（例えば、ハイブリダイゼーションにより）結合される。このような間接的ハイブリダイゼーションは、ヘアピン鎖反応、分岐インサイツハイブリダイゼーション、または任意の他の好適な方法などにより、複数の質量タグの試料生体分子との結合を可能にし得る。従って、いくつかの実施形態では、本明細書で記載のレポーターは、質量タグを試料生体分子と一緒に結合させる、別の生体分子のシステムを含み得る（または含み得ない）。

【0103】

いくつかの実施形態では、マイクロビーズに付着された少なくとも１つの異なる生体分子は、抗体（例えば、または、ナノボディなどのそのフラグメント）である。例えば、試料生体分子は、ウィルス粒子であり、ここで少なくとも１つの異なる生体分子は、ウィルス粒子を特異的に結合する第１の抗体であり、レポーターは、ウィルス粒子を特異的に結合する第２の抗体を含む。

【0104】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの試料生体分子は、サイトカインであり、例えば、マイクロビーズに付着された少なくとも１つの異なる生体分子は、サイトカインを特異的に結合する第１の抗体であり、レポーターは、サイトカインを特異的に結合する第２の抗体を含む。
いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１８、ＩＬ－１Ｆ４、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＦＮγ、ＩＬ－４、ＣＤ１６３、ＣＸＣＬ－９／ＭＩＧ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１β、およびこれらの組み合わせから選択される。

【0105】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの試料生体分子は、癌バイオマーカー（例えば、前立腺特異抗原）であり、少なくとも１つの異なる生体分子は、癌バイオマーカーを特異的に結合する第１の抗体であり、レポーターは、癌バイオマーカーを特異的に結合する第２の抗体を含む。

【0106】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異なる生体分子は、ウィルス抗原を含み、試料生体分子は、ウィルス抗原を特異的に結合する抗体であり、レポーターは、試料生体分子に結合する二次抗体を含む。

【0107】

本開示の方法およびキットは、複数の異なるレポーターを含み得、それぞれの異なるレポーターは、異なる生体分子により特異的に結合される試料生体分子を結合できる。複数の異なるレポーターはそれぞれ、同じ質量タグ（同じ質量チャネル中で検出される）、または異なる質量タグ（異なる質量チャネル中で検出される）を含む。質量タグは、金属ナノ結晶（例えば、ナノゴールド粒子）、量子ドット、ポリマーナノ粒子、などの金属ナノ粒子を含み得る。ナノ粒子は、１００ｎｍであるか、または１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、１０ｎｍ未満の直径、例えば、２ｎｍ～１００ｎｍまたは５ｎｍ～５０ｎｍの直径であり得る。質量タグは、金属結合（例えば、金属キレート）ペンダント基を含む直鎖または分岐鎖ポリマーなどの金属キレートポリマーを含み得る。テルル原子がポリマーの炭素原子に共有結合される有機テルルポリマー質量タグなどの、他の質量タグもまた、本開示の範囲内にある。質量タグは、１個または複数の金属元素またはその濃縮された同位体を有し得る。質量タグは、本明細書で記載される、または当業者に既知のいずれかの好適な結合手段により生体分子（例えば、試料生体分子に結合するレポーターの生体分子）にコンジュゲートされ得る。

【0108】

いくつかの実施形態では、マイクロビーズに付着される生体分子は、試料生体分子に対する酵素基質である。本開示の方法またはキットは、酵素基質が試料生体分子により修飾されている場合に酵素基質に特異的に結合する（例えば、特異的に結合できる）レポーター、または酵素基質が試料生体分子により修飾されていない場合に酵素基質に特異的に結合する（例えば、特異的に結合できる）レポーターをさらに含み得る。例えば、酵素基質は、キナーゼ基質を含み、試料生体分子（例えば、標的分析物）は、キナーゼ基質をリン酸化するキナーゼを含み、レポーターは、リン酸化された基質を結合するリン酸化特異的抗体であり得る。別の例では、酵素基質は、酵素基質が、プロテアーゼである試料生体分子により切断されるペプチド配列などの試料生体分子により修飾される場合に除去される、質量タグを含む。いくつかの実施形態では、従って、質量タグのシグナルの非存在は、試料生体分子酵素の存在を示し得る。酵素アッセイの例は、米国特許出願公開第２００７０１９０５８８号に記載され、この特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0109】

本開示のキットおよび方法のいくつかの態様では、複数の異なる集団からのマイクロビーズは、混合物中に（マイクロビーズの第１の混合物中に）存在する。いくつかの態様は、マイクロビーズの第１の混合物と同じ生体分子を含むマイクロビーズの第２の混合物をさらに含み得、第１の混合物のマイクロビーズは、第２の混合物のマイクロビーズとは異なる試料バーコードを含む。試料バーコードは、例えば、マイクロビーズの内部に存在する（例えば、第１および第２の混合物のマイクロビーズの金属キレートモノマーによりキレート化された金属のサブセットであり得る）。あるいは、その場合、試料バーコードは、第１および第２の混合物のマイクロビーズの表面上に存在し得る。方法またはキットは、複数の異なる集団からのマイクロビーズの表面に結合するように機能化される別の区分中の複数の試料バーコードを含み得る（例えば、各区分の試料バーコードが異なる混合物のマイクロビーズに適用される場合）。試料バーコード化マイクロビーズは、一緒に混合されてよく（例えば、それらのそれぞれの試料との混合後であるが、場合によりレポーターとの混合の前に）、その後質量分析により分析され得る。各マイクロビーズの試料バーコードからの質量スペクトルはそれにより、それが由来する試料を特定するために使用され得る。

【0110】

特定の態様では、キットまたは方法は、相互の混合物中に質量タグ付き抗体のパネルをさらに含み得、パネルの少なくともいくつかの抗体は、細胞表面マーカーに特異的である（例えば、細胞試料中の細胞表面タンパク質を結合するために使用される）。複数の抗体は、例えば、緩衝液中で、または凍結乾燥形態（例えば、５体積％未満または１体積％未満の水分）で、キットのマイクロビーズと混合され得る。複数の（例えば、それぞれの）質量タグ付き抗体は、キットのマイクロビーズの金属キレートモノマーによりキレート化される金属と同一の金属を含む。しかし、本明細書で記載の細胞およびマイクロビーズは、原子質量分析により識別可能であり得る。例えば、本明細書で記載の細胞は、天然起源の細胞が通常含まない、細胞のＤＮＡに結合するイリジウムインターカレーターなどの、１種または複数の金属（またはそれらの濃縮された同位体）を含み得る。マイクロビーズは、質量標準として、および／または試料溶液（例えば、細胞培養上清または血清）中の生体分子（例えば、サイトカイン、抗体、癌バイオマーカー）を検出するために、細胞と共に分析されるてよい。

【0111】

いくつかの実施形態では、本明細書で記載のマイクロビーズの１つまたは複数の集団を含むキットは、立体安定剤（例えば、キットのマイクロビーズとの混合物中で）をさらに含む。本明細書で記載のように、立体安定剤は、０．０５重量％、０．１重量％、０．２重量％、０．５重量％、または１重量％超、例えば約０．０５重量％～約１０重量％、約０．１重量％～約５重量％、約０．２重量％～約２重量％などのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）であり得る。代わりにまたは追加して、キットのマイクロビーズは、約４～約１０（両端含む）のｐＨ、約５～約９（両端含む）のｐＨ、約６～約８（両端含む）のｐＨ、約３を超えるｐＨ、約４を超えるｐＨ、または約１０未満のｐＨで緩衝化された溶液中に存在し得る。

【0112】

いくつかの実施形態では、本開示のキットのマイクロビーズは、凍結乾燥される。例えば、キットのマイクロビーズは、１０重量％未満、５重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．２重量％未満、０．１重量％未満、または約０．０５重量％～約５重量％の水分である。

【0113】

いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、本明細書でさらに記載されるように、イメージング質量分析（またはイメージングマスサイトメトリー）における較正（例えば、基準粒子として）、正規化または定量化のために、固体担体に融合される。固体担体は、スライド（例えば、透明ガラスまたは石英スライドなどの、顕微鏡スライド）または接着膜（いずれかの本発明の方法で顕微鏡スライドに適用するために）などの任意の好適な担体であり得る。固体担体は、生体試料をさらに含み得る。

【0114】

いくつかの実施形態では、固体担体は、少なくとも２個、例えば、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、少なくとも５０００個、または少なくとも１００００個の融合されたマイクロビーズを含む。マイクロビーズ（基準粒子）は全て同じであってよく、またはマイクロビーズは、金属またはその含量が異なってよい。異なるマイクロビーズが使用される場合、マイクロビーズの複数のそれぞれの集団が通常存在する。

【0115】

マイクロビーズは、ほぼ全てのマイクロビーズが個別に（即ち、離散して）固体担体上に位置するように、固体担体上に分散され、それにより各融合されたマイクロビーズは、個別に特定されおよびサンプリングされ得る。当業者なら、固体担体は、試料キャリア上に凝集したいくつかの融合されたマイクロビーズをさらに含み、そのためこれらの凝集体は、シグナル強度の較正および正規化のためのサンプリングに好適でない可能性があることを理解するであろう。例えば、約２％まで、例えば、最大で約５％、最大で約８％、最大で約１０％、最大で約１５％、または最大で約２０％の融合されたマイクロビーズが固体担体上に凝集されてよい。換言すれば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、または少なくとも約９５％のマイクロビーズが、個別に分離され得る。光学的照合は、どの位置の固体担体が離散したマイクロビーズを有するかを特定し、かつイメージング質量分析計による取得をガイドできる。

【0116】

固体担体へ少なくとも１つのマイクロビーズを融合するステップは、固体担体を加熱することを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロビーズと試料キャリアまたは固体担体を融合するステップは、マイクロビーズのガラス転移温度を超える温度での試料キャリアまたは固体担体を加熱することおよび次いでマイクロビーズのガラス転移温度未満で試料キャリアまたは固体担体を冷却することを含む。換言すれば、試料キャリアまたは固体担体への少なくとも１つのマイクロビーズの融合は、ガラス化により行われる。いくつかの実施形態では、試料キャリアまたは固体担体は、最大で３００℃、例えば、最大で２７５℃、最大で２５０℃、最大で２２５℃、または最大で２００℃の最高温度に加熱される。

【0117】

本明細書で記載のいずれかの実施形態のキットは、１種または複数の緩衝剤（例えば、ＰＢＳ、赤血球溶解緩衝剤、洗浄剤緩衝剤、染色緩衝剤、および／または凍結乾燥マイクロビーズなどの凍結乾燥試薬を再構成するための緩衝剤、凍結乾燥レポーター、凍結乾燥抗体）、抗凝固剤（例えば、血液試料を処理するための）、固定試薬、透過処理試薬、または本明細書で記載の方法また実施例を実施するための任意の試薬をさらに含み得る。

【0118】

本開示の方法は、質量分析により本明細書で記載のいずれかのマイクロビーズを分析することを含む。例えば、マイクロビーズ（例えば、１つまたは複数のマイクロビーズ集団）は、質量分析計を較正するために、および／または正規化（例えば、質量タグから得られる質量スペクトルの正規化）するためにまたは定量（細胞またはピクセル中の抗体の数を定量）するために使用される元素標準であり得る。

【0119】

いくつかの実施形態では、質量分析の方法は、本開示のマイクロビーズの別個の集団を試料と混合することであって、マイクロビーズの各集団のマイクロビーズが、異なる生体分子に結合され、マイクロビーズの各集団が、マイクロビーズの金属または複数の金属に基づきマイクロビーズの別の集団から識別される、混合すること；試料の異なる試料生体分子をマイクロビーズの個別の集団の異なる生体分子に結合させること；レポーターをそれぞれの異なる試料生体分子に直接にまたは間接的に結合させることであって、それぞれの異なる試料生体分子に結合されるレポーターが、質量タグを含む、結合させること；および質量分析により個別のマイクロビーズの金属および質量タグを検出することを含む。

【0120】

このような方法は、マイクロビーズの別個の集団を試料と混合する前に異なる生体分子をマイクロビーズの別個の集団のマイクロビーズに付着させることをさらに含み得る。１種または複数の試料生体分子は、オリゴヌクレオチド、抗体（または別の親和性試薬）、サイトカイン、癌バイオマーカー（例えば、１種または複数の前立腺特異抗原）などを含み得る。

【0121】

いくつかの実施形態では、質量分析の方法は、本明細書で記載のいずれかの実施形態のキットを使用し、かつ、マイクロビーズの別個の集団を試料と混合することであって、マイクロビーズの各集団のマイクロビーズが、異なる生体分子に結合され、マイクロビーズの各集団が、マイクロビーズの金属または複数の金属に基づきマイクロビーズの別の集団から識別される、混合すること；試料の異なる試料生体分子をマイクロビーズの個別の集団の異なる生体分子に結合させること；レポーターをそれぞれの異なる試料生体分子に直接にまたは間接的に結合させることであって、異なる試料生体分子のそれぞれに結合したレポーターが、質量タグを含む、結合させること；および質量分析により個別のマイクロビーズの金属および質量タグを検出することをさらに含む。

【0122】

いくつかの実施形態では、本明細書で記載のいずれかのマイクロビーズを用いる細胞試料の質量分析のキットまたは方法は、複数の質量タグ付き抗体を提供することであって、質量タグ付き抗体の各抗体が、金属またはそれらの濃縮同位体の複数金属をキレート化するポリマー質量タグにコンジュゲートされる、提供すること；試料を複数の質量タグ付き抗体と接触させるステップ；質量分析により試料およびマイクロビーズに結合された質量タグ付き抗体を検出することを含む。マイクロビーズおよび細胞試料は、質量分析による分析の前に組み合わされ得るか、または別々の試料実験で分析され得る。マイクロビーズは、１種または複数の試料生体分子をアッセイするために使用され得る。代わりにまたは追加して、マイクロビーズは、本明細書でさらに記載されるように、較正、正規化および／または定量化のために使用される元素標準であり得る。

【0123】

マイクロビーズは、本明細書で記載されるように、一貫したサイズおよび／または量の１種または複数の金属を有する単一集団のものであり得る。あるいは、マイクロビーズは、金属の異なるセット、金属の組み合わせ、および／または金属の量によりそれぞれ特徴づけられる異なる集団のものであり得る。例えば、あるセットのマイクロビーズ集団は、１０種を超える別個の元素（例えば、３０種を超える別個の同位体質量）からの金属を一緒に有する。例えば、本願のマイクロビーズは、４を超える、６を超える、１０を超える、２０を超える、または３０を超える個数の質量チャネル（例えば、８０ａｍｕより大きい原子質量チャネル）のシグナルを一緒に提供し得る。マイクロビーズは、懸濁液マスサイトメトリーワークフローにおいて細胞と一緒に添加され得るか、またはイメージングマスサイトメトリーワークフローにおいて組織切片または細胞塗抹標本と同じ担体上で提供され得る。マイクロビーズは、本明細書で記載のアッセイで使用され得るか、または標準（例えば、マスサイトメトリーにより検出される質量タグが検出される、ほとんどまたは全ての質量チャネルでシグナルを与える）であり得る。異なる量の同じ金属（例えば、またはその濃縮された同位体）を有するマイクロビーズの質量スペクトルは、本明細書でさらに記載されるように、較正、正規化または定量化で使用される曲線（例えば、既知の量金属に対するシグナル強度の曲線）を作成するために使用され得る。

【0124】

マイクロビーズは、本明細書で記載されるいずれかの検出ステップで使用される質量分析計を較正するために使用され得る。較正は、質量分解能、質量較正、デュアルカウントキャリブレーション（ｄｕａｌ ｃｏｕｎｔ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）、ｐｒｅ－ｘｙおよびｘｙ最適化（ｐｒｅ－ｘｙ ａｎｄ ｘｙ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）、検出器電圧、ガス較正または電流較正の１種または複数であり得る。質量分解能は、異なる質量のイオン間で十分な分離が存在することを確実にし、特定の同位体からのピークの形状に一部は基づき得る。特定の値を超える質量分解能は、合格を示し得る。質量較正は、１つまたは複数の質量チャネルの値（例えば、マイクロビーズ標準の金属からの値）を検査し、かつその後追加の質量チャネルに対するＴＯＦ値を計算する自動調整を含み得る、および／または各イオンの全シグナルが収集されるように正確なイオンを検出チャネルに整列させることを含み得る。デュアルカウントキャリブレーションは、デュアルカウント係数（パルスカウントおよび強度を相関させるためのデュアルスロープ）を決定し得る（デュアルカウント係数は、類似体シグナルをイオンカウントシグナルに変換する）。この相間は、例えば、細胞のまたはマイクロビーズのイベント中に、イオン濃度が増大し、かつパルスがオーバーラップする場合に重要であり得る。ＸＹ最適化は、それによりトーチと真空境界の最適整列が決定されて質量チャネルに対し最大シグナル（例えば、マイクロビーズ標準の金属からの）を提供する過程である。システムの整列を最適化することは、真空境界中へのイオンの最大伝送のために重要である。検出器電圧較正は、デュアルカウントキャリブレーションを用いて、検出器の寿命を確保しながら最良のシグナルを提供する検出器電圧を決定する。最適検出器電圧は、デュアルカウント係数が０．０３±０．００３である場合に達成され得る。検出器電圧は、－１，１００Ｖよりプラス側であってはならない。ガスおよび／または電流較正は、酸化物形成を制御しながらメイクアップガス流および噴霧器ガス流を変化させることにより達成できる最大質量チャネルシグナル（例えば、マイクロビーズ標準の金属からの）を用いて、噴霧剤ガス流およびメイクアップガス流（および場合により、追加のガス流）を最適化し得る。これは、プラズマ温度がシステム中で最適であり、かつ最小限の金属酸化物が形成されることを保証する。真空境界で印加される電流は、境界を通してイオン雲の移動を促進するために徐々に高められる。最高のシグナルを与える値が次いで、選択され得る。較正は、試料実験中に実施され得る（例えば、感度の変動を説明するために）。

【0125】

マイクロビーズは、マイクロビーズから得られた（例えば、少なくとも１つの質量タグとして１種または複数の同じ金属を含むマイクロビーズ、または類似の質量スペクトル、または異なる量の金属を含む複数のマイクロビーズ集団から生成した検量線から得られた）質量分析シグナルに基づき質量タグ（例えば、本明細書で記載の試料の質量タグ）から得られた質量分析シグナルを正規化するための標準として使用され得る。それぞれのタグは、１つまたは複数の質量チャネルでシグナルをもたらし得る。質量タグシグナルのこのような正規化は、個別の細胞またはアッセイのマイクロビーズイベント（例えば、懸濁液マスサイトメトリーで）に対して、または個別の細胞、アッセイのマイクロビーズまたはピクセル（例えば、イメージングマスサイトメトリーで）に対してであってよい。例えば、細胞塗抹標本の個別の細胞は、ＩＭＣにより検出され得る、または膜染色に基づきアルゴリズムにより分割された固体組織切片の細胞、および単一細胞全体にわたる質量タグシグナルは、本明細書で記載のように正規化または定量化され得る。細胞またはピクセルの質量タグシグナルは、細胞またはピクセルの時間間隔内、例えば、細胞またはピクセルが検出されたときの１０，０００秒以内、５，０００秒以内、２，０００秒以内、１，０００秒以内、５００秒以内、２００秒以内、または１００秒以内に検出されるマイクロビーズからのシグナルに正規化され得る。代わりにまたは追加して、標準として使用されたマイクロビーズが異なる金属を有する別個の集団のマイクロビーズを含む場合、質量タグシグナルの正規化は、その金属が質量タグと同じ質量チャネルで検出される１種または複数のマイクロビーズに基づき得る。代わりにまたは追加して、標準として使用されるマイクロビーズが異なる金属量を有する別個の集団のマイクロビーズを含む場合、同じ金属を含む質量タグからのシグナルの正規化は、同じ質量チャネルに対し類似のシグナル強度（例えば、１０倍またはそれ未満の差異の、５倍またはそれ未満の差異の、２倍またはそれ未満の差異の、など）を与える１種または複数のマイクロビーズに基づき得る。本明細書で記載のように、金属は、濃縮された同位体であり得る。従って、異なる金属および／または異なる金属量を有するマイクロビーズの集団を含むマイクロビーズ標準が、使用されてよい。このような正規化は、マスサイトメトリーデータ（例えば、マスサイトメトリーにより得られるＦＣＳファイルの正規化されたデータ）を正規化するためにＦｌｕｉｄｉｇｍにより提供されるＥＱ４（商標）ビーズと類似であり得る。しかし、本開示のマイクロビーズは、４を超える、６を超える、１０を超える、２０を超える、または３０を超える個数の質量チャネル（例えば、８０ａｍｕより大きい原子質量チャネル）のシグナルを一緒に提供し得る。

【0126】

マイクロビーズは、質量タグからの既知の（または推定される）数の金属原子が抗体（または他の生体分子）と結合される場合などの、１種または複数の質量タグ付き抗体（または他の質量タグ付き生体分子）の量を定量化するための標準として使用され得る。例えば、１つ以上の質量タグの実体を有し得る質量タグ付き抗体（または他の生体分子）と結合される金属原子の数は、質量タグ当りの（例えば、ポリマー質量タグ上の）金属の既知の数およびＵＶ／可視スペクトルまたはＩＣＰ－ＭＳシグナル特性から出発すること；およびＵＶまたは可視スペクトルまたはＩＣＰ－ＭＳにより質量タグ付き抗体（または他の生体分子）の割合をさらに分析すること、により決定され得る。このような分析は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーにより得られる画分上で実施され得る。質量タグ付き抗体を定量することは従って、それぞれの質量タグ付き抗体に対する金属原子の平均数ならびに質量タグ付き抗体およびマイクロビーズから検出された質量分析シグナルに基づき得る。マイクロビーズは、金属原子の既知の数（例えば、本明細書で記載のように決定される）を有し得る。マイクロビーズおよび質量タグ付き抗体（または他の生体分子）は、同じ金属を含み得る。従って、質量タグ付き抗体を定量することは、マイクロビーズ中の金属の数に、マイクロビーズからの金属のシグナルに対する質量タグ付き抗体（または他の生体分子）からのシグナルの比率を乗じ、これを抗体（または他の生体分子）当りの金属原子の平均数により除算したものとして計算され得る。定量化は、個別の細胞、アッセイマイクロビーズ、またはピクセルについて実施され得る。

【0127】

本開示の実施形態は、本明細書で記載の較正、正規化、または定量化の１つまたは複数を実施するように構成されたコンピューター可読性媒体を含む。

【0128】

いくつかの実施形態では、検出するステップは、懸濁液マスサイトメトリーまたはイメージング質量分析のためなどの、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を含み得る。質量分析は、飛行時間質量分析計（ＴＯＦ－ＭＳ）または磁気セクター質量分析計などの、同時質量分析によるものであり得る。
いくつかの実施形態では、マイクロビーズを検出することは、イメージング質量分析（例えば、イメージングマスサイトメトリー）によるものであり得る。マイクロビーズ（例えば、マイクロビーズ標準）は、検出ステップの前に、固体表面に融合され（例えば、融解され）得る。イメージング質量分析は、例えば、レーザアブレーションＩＣＰ－ＭＳまたは二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）によるものであり得る。

【0129】

生体試料は、分析を必要とする生物学的性状の任意の試料を含み得る。例えば、試料は、生体分子、組織、体液、および動物、植物、真菌、または細菌の細胞を含み得る。それらはまた、ウィルス起源の分子も含み得る。典型的試料は、限定されないが、喀痰、血液、血液細胞（例えば、ＰＢＭＣ）、組織または細針生検試料、尿、腹腔液、および胸水、またはそこからの細胞を含。生体試料はまた、組織学的目的のために採取された凍結切片などの組織の切片も含み得る。別の典型的な生体試料源は、ウィルスおよび動物、植物、細菌、真菌の細胞培養物であり、この場合、遺伝子発現の状態が、遺伝子内の関連性を調査するために操作され得る。場合によっては、人工の試料などの他の試料が、調査され得る。本開示の特定の態様は、ヒト起源の試料を調査する場合に、特に有用であり、かつヒト末梢血の試料を調査する場合に、特に有用である。

【0130】

質量タグ付きオリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドに、直接または間接的にハイブリダイズされ得る。例えば、１種または複数の中間体オリゴヌクレオチドは、複数の質量タグ付きオリゴヌクレオチドがハイブリダイズできる骨格を提供し、それによりシグナルを増幅できる。本願のいくつかの態様は従って、ハイブリダイゼーションベースのシグナル増幅のためのオリゴヌクレオチドを含む。

【0131】

いくつかの態様では、試料生体分子は、細胞またはビーズのＤＮＡまたはＲＮＡ分子（コーディングＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、またはミクロＲＮＡなど）などの、標的オリゴヌクレオチドであり得る。標的オリゴヌクレオチドは、一本鎖であり得る。標的オリゴヌクレオチドは、既知の特異的配列（または既知の特異的配列に対する相同性）を有し得る。

【0132】

いくつかの態様では、レポーターは、抗体またはその誘導体などの、非オリゴヌクレオチド生体分子を含み得、これらは、既知の配列を含む合成の単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドなどの、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。このような場合、抗体およびオリゴヌクレオチドの両方は、レポーターの一部と呼ばれてよい。

【0133】

標的オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた非オリゴヌクレオチド生体分子を含むレポーターからのシグナルは、ハイブリダイゼーションスキームにより増幅され得る。ハイブリダイゼーションは、分岐であっても直鎖であってもよい。特定の態様では、ポリメラーゼは、テンプレートに沿って第１のオリゴヌクレオチドを伸長して、元素タグの付着のための追加の部位（元素タグ付きオリゴヌクレオチドのための追加のハイブリダイゼーション部位など）をもたらす。質量タグ付きオリゴヌクレオチドは、単一の標識原子を含むか、または複数の標識原子を含むポリマーを含み、レポーターと呼ばれることもある。質量タグ付きオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドそれ自体の化学構造中に、重金属原子などの標識原子を含み得る。

【0134】

シグナル増幅は、ビーズ系アッセイに特有の利益をもたらし、このアッセイでは、同じレポータータグ（標識金属元素または同位体）が、異なるビーズおよびそれらの標的分析物全体にわたり増幅されおよび使用され得る。

【0135】

アッセイ生体分子がオリゴヌクレオチドである場合、元素タグ付きレポーターオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡまたはＤＮＡの別の部分にハイブリダイズし、それにより標的ＲＮＡまたはＤＮＡがビーズに結合されるとシグナルをもたらす可能性がある。アッセイ生体分子が、第１のエピトープで分析物を結合する抗体などの、親和性試薬である場合、元素タグ付きレポーター親和性試薬（例えば、レポーター抗体）は、分析物上の別のエピトープに結合し、それにより標的分析物がビーズに結合されるとシグナルをもたらす可能性がある。分析物は、元素タグ付きレポーター抗体またはオリゴヌクレオチドなどの、レポーターによりさらに結合され得る。レポーターは、極めて多くの同位体（例えば、５０、１００、２００、５００、１０００コピーの単一同位体）を提供する、高感度の（例えば、高強度の）元素タグを含み、それによりアッセイビーズに結合された、より小さい数の標的分析物の検出を可能にする場合がある。このような高感度の元素タグは、ナノ粒子（例えば、抗体またはオリゴヌクレオチドなどの生体分子を結合するように機能化された金属ナノ結晶表面を含む）または超分岐ポリマーを含み得る。例えば、同じナノゴールド粒子元素タグを含む複数のレポーター生体分子は、高シグナルを提供し、同じ元素タグを含む別のレポーター生体分子はアッセイバーコード（例えば、それらが特異的である分析物を提示するビーズの）により識別できるという事実を利用するはずである。特定の態様では、ナノ粒子タグ（例えば、金ナノ粒子）は、ビオチン－アビジン（例えば、ビオチン－ストレプトアビジン）相互作用を介してレポータープローブと結合され得る。例えば、ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）は、ストレプトアビジンにコンジュゲートされ得る。レポーターはまた、極めて多い同位体とは異なる、少ない存在量の同位体（例えば、１００、５０、３０、２０、１０、または５コピーの同位体）を提供する低感度の元素タグを含み、それにより極めて多い同位体が検出器を飽和させるであろうこのような多い存在量の分析物の量の検出／定量化を可能にする場合がある。特定の態様では、高いおよび低い存在量の同位体は、質量の差異（例えば、５、１０、２０、３０、４０または５０ａｍｕより大きい）を有し、それにより、高い存在量の同位体による検出器の飽和は低い存在量の同位体の検出に影響を与えない。異なる分析物（例えば、異なるアッセイビーズの標的分析物に結合する抗体を含む）に対するレポーターは、分析物がビーズの特有のアッセイバーコードにより識別されるので、同じ同位体または同位体の組み合わせを含み得る。

【0136】

特定の態様では、レポーターは、標的分析物（例えば、試料生体分子）の単一の実体との元素タグの複数の実体の結合によりシグナル増幅を提供する、レポーターシステムを含み得る。シグナル増幅は、酵素沈着、ハイブリダイゼーション（例えば、分岐ハイブリダイゼーション、鎖ハイブリダイゼーション、および／または複数のレポーターオリゴヌクレオチドの単一長中間体オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーション）、伸長（例えば、単一伸長、ローリングサークル伸長）、および／または一連の分岐コンジュゲーション（ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によるものであり得る。特定の態様では、アッセイビーズで検出される複数の（例えば、全ての）分析物は、同じレポーターシステムで検出され得る。特定の態様では、シグナル増幅レポーターシステムは、高感度の元素タグを有し得る。
例えば、酵素基質部分を含む元素タグは、レポーター生体分子に付着された酵素により溶液からビーズ（またはビーズに付着された分子）上に沈着され得る。このような反応は、レポーター生体分子に結合された西洋ワサビペルオキシダーゼにより作用を受けるチラミド元素タグによる共有結合であり得る。

【0137】

いくつかの態様は、ハイブリダイゼーションスキームを含み、それにより複数の元素タグ付きオリゴヌクレオチドは、単一オリゴヌクレオチド標的に間接的に（１種または複数のオリゴヌクレオチド中間体を介して）ハイブリダイズする。例えば、オリゴヌクレオチド標的は、標的ＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば、ｇＤＮＡまたはｃＤＮＡ）配列であってよく、またはレポーター抗体上に存在するオリゴヌクレオチドであってもよい。

【0138】

本明細書で記載のように、マスサイトメトリーは、レポーターのための追加のチャネル（アッセイ標的を検出するための）を可能にしながらビーズ中の試料およびアッセイバーコードの両方を検出するための十分な検出チャネル（質量チャネル）を可能にし得る。従って、本明細書で記載のビーズアッセイは、マスサイトメトリーでの使用のためのバーコード化された試料および／またはアッセイであり得る。例えば、複数の異なる条件（例えば、酵素または１種または複数の酵素の作動薬または拮抗薬などの薬物候補）が、生体試料に適用され、複数の標的に対するその効果が、酵素アッセイビーズで検出され得る。個別の条件は、同じ条件に曝露された異なるアッセイビーズにわたり共通の試料バーコードで特定され得る。アッセイバーコード化ビーズは、分析の前に、例えば、条件への曝露の前に、組み合わされ得る。試料バーコード化ビーズは、分析の前に、組み合わされ得る。

【0139】

特定の態様では、酵素は、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼなどのＤＮＡを修飾するタンパク質であり得る。標的は、酵素により作用を受ける基質であり、レポーター（例えば、本明細書で記載のレポーター生体分子）は、それが酵素により作用を受ける前にまたは後でのみ、標的（例えば、試料生体分子）を結合し得る。例えば、リン酸化型のタンパク質標的を検出するホスホ特異的抗体は、キナーゼ酵素により作用を受けると存在量が増大し、またはホスファターゼにより作用を受けると存在量が減少し得る。酵素がプロテアーゼである場合、レポーターは、ペプチド基質の末端と結合され、基質が切断されるとビーズとの結合から取り外され得る（それにより、レポーター元素タグの減少は、プロテアーゼ活性の増大を示す）。

【0140】

試料バーコードは、多数の酵素（またはそれらの作動薬／拮抗薬）のどれが特定のアッセイで試験されたかを示すために使用され得る。例えば、候補酵素、作動薬、拮抗薬は、細胞ライセートなどの生体液に加えられ、その後試料は、酵素の活性を検出するために、アッセイバーコード化されたビーズと接触させられる。あるいは、候補は、細胞に投与され（例えば、直接に、または遺伝子工学により）、または患者または哺乳動物試験対象などの生物に投与され、その採取源から採取された試料は、アッセイビーズと接触させられ得る。試料バーコーディングは、多くのこのような候補が同時に選別されることを可能にする。いずれの場合でも、試料バーコードは、ビーズについて本明細書で記載されるように添加されて、候補を特定できる。例えば、１０個超、２０個超、５０個超、１００個超、５００個超、または１０００個超の別個の試料が、バーコード化され得る。例えば、６個のユニークな組み合わせで１２種の別個の同位体は、９２４種の別個の組み合わせを与える（例えば、最大で９２４個の試料のバーコード化のために）。別の１２種の別個の同位体は、１０００に近いアッセイのバーコード化のために使用され得る。従って、１０個超、２０個超、５０個超、１００個超、５００個超、または１０００個超の別個のアッセイビーズを、バーコード化できる（例えば、候補剤による作用を受ける異なる基質の量を検出するビーズ）。少なくとも１つのチャネルが、本明細書で記載のように、レポーターによる基質の検出のために残されるであろう。これは、マスサイトメトリーによる即時読み取りを備えた従来にないスクリーニングを可能にする。

【0141】

タンパク質の翻訳後修飾は、生細胞中の酵素により実施される。既知の翻訳後修飾は、タンパク質リン酸化および脱リン酸化ならびにメチル化、プレニル化、硫酸化、およびユビキチン化を含む。タンパク質、特に酵素の上のリン酸基の存在または非存在は、多くの生化学的経路およびシグナル伝達経路で、調節的役割を果たすことが知られている。

【0142】

マスサイトメトリーのためのビーズ系キナーゼアッセイは、米国特許出願公開第２００７０１９０５８８号で考察されており、この特許文献は、参照により本明細書に組み込まれ、下で要約される。しかし、このようなビーズ系アッセイは、試料およびアッセイバーコーディングの両方のために提案されたことはなく、これは、スクリーニングのための利点を提供し、マスサイトメトリーの高い複雑性により独自に可能にされる。

【0143】

キナーゼ機能は、ＡＴＰなどの高エネルギードナー分子から特定の標的分子（基質）へとリン酸基を移動することである（リン酸化）。リン酸基を標的から除去する酵素は、ホスファターゼとして知られる。キナーゼの最大の群は、プロテインキナーゼであり、それは、特定のたんぱく質に作用し、それらの活性を調節する。種々の他のキナーゼは、小分子（脂質、炭水化物、アミノ酸、ヌクレオチド、など）に作用し、多くの場合それらの基質に因んで命名され、アデニル酸キナーゼ、クレアチンキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、ヌクレオチド二リン酸キナーゼ、チミジンキナーゼを含む。

【0144】

タンパク質キナーゼは、セリン、トレオニン、またはチロシン残基でのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）から標的化ペプチドまたはタンパク質基質へのリン酸の移動を触媒する。タンパク質キナーゼは、個別の配列上の基質をリン酸化するそれらの能力により識別される。商業的に入手できるキナーゼは、活性型（供給業者によりリン酸化された）であるか、または不活性型であり別のキナーゼによるリン酸化を必要とする。

【0145】

タンパク質ホスファターゼは、ホスホセリン、ホスホトレオニン、またはホスホチロシン残基でリン酸モノエステルをリン酸イオンおよび遊離ヒドロキシ基を有するタンパク質またはペプチド分子へと加水分解する。この作用は、プロテインキナーゼの作用の正反対である。例は、タンパク質チロシンホスファターゼを含み、これは、ホスホチロシン残基、アルカリホスファターゼ、セリン／トレオニンホスファターゼおよびイノシトール一リン酸分解酵素を加水分解する。

【0146】

本開示の別の態様は、試料中の元素の検出および測定のためのキットを提供することであり、測定される元素は、リン酸化基質に付着された元素タグ、金属イオン配位化合物の元素、および独自に標識された担体の元素を含み、キットは、リン酸化基質に直接にタグ付けするための元素タグ；多数のリン酸化された基質；ユニークに標識された担体；金属イオン配位化合物；および場合により、ホスファターゼ、ホスファターゼ緩衝剤およびＡＤＰを含む。

【0147】

本開示の別の態様は、キナーゼアッセイのための方法を提供することであり、方法は、ＡＴＰ、少なくとも１種のキナーゼ、遊離金属イオン配位化合物、および単一タイプの非リン酸化基質が単一タイプの元素標識担体に付着されるように元素標識担体上に固定された多数の非リン酸化基質を、キナーゼが基質をリン酸化することを可能にする条件下で、インキュベートすること；遊離金属イオン配位化合物および多数の固定化された非リン酸化基質から、付着された金属イオン配位化合物を有する元素標識担体上に固定された多数のリン酸化された基質を分離すること；および元素分析により付着された金属イオン配位化合物を有する元素標識担体上に固定された多数のリン酸化された基質を測定すること、を含む。

【0148】

本開示の別の態様は、試料中の元素の検出および測定のためのキットを提供することであり、測定される元素は、非リン酸化基質および金属イオン配位化合物に付着された元素タグを含み、キットは、非リン酸化基質に直接にタグ付けするための元素タグ；非リン酸化基質；固体担体；金属イオン配位化合物；および場合により、キナーゼ、キナーゼ緩衝剤およびＡＴＰを含む。

【0149】

酵素の薬理学的調節は、可能な治療薬を特定することにおける主要素になってきている。プロテアーゼは、シグナル伝達経路で重要な役割を果たすことが最近示されたサブクラスのタンパク質分解酵素であり、そのシグナル伝達経路の調節不全は、癌、心臓血管疾患、および神経障害をもたらす可能性がある。約４００種の既知のプロテアーゼのうち、数ダースが潜在的薬物候補として調査されている。プロテアーゼの小分子阻害剤は今日では、変性疾患の治療、癌の治療のための有用な治療薬のリード化合物、および抗菌薬、抗ウィルス薬および抗真菌薬として考えられている。マスサイトメトリーのためのビーズ系プロテアーゼアッセイは、米国特許出願公開第２０１７００２３５８３号で考察されており、この特許文献は、参照により本明細書に組み込まれ、下に要約される。しかし、このようなビーズ系アッセイは、試料およびアッセイバーコーディングの両方のために提案されたことはなく、これは、スクリーニングのための利点を提供し、かつマスサイトメトリーの高い複雑性により独自に可能にされる。

【0150】

複数の酵素反応の同時測定を可能とする強力で、高感度で、定量的な酵素アッセイが必要とされている。このようなアッセイは、有用な生体試料および試薬の保存を可能にし、高スループットで短縮されたアッセイ時間、および酵素分析の全体コストの低減を達成できる。

【0151】

本発明の一態様は、生体液中のプロテアーゼ活性を検出する方法である。方法は、固定化されたペプチド基質を形成するためにコード化されたビーズをペプチド基質の第１のアミノ酸に付着させることであって、ペプチド基質が、第１のアミノ酸および最後のアミノ酸を含みかつプロテアーゼ酵素の基質である、付着させること；タグ付きペプチド基質を形成するために元素タグをペプチド基質の最後のアミノ酸に付着させること；固定化されたタグ付きペプチド基質を生体液とインキュベートすること；および元素分析により生体液中の元素タグおよびコード化されたビーズを検出すること、を含み得る。

【0152】

コード化されたマイクロビーズは、本明細書で考察されるように、アッセイおよび試料のバーコード化の両方がなされ得る。

【0153】

プロテアーゼアッセイキットは、ペプチド基質（固定化ペプチド基質）の第１のアミノ酸に付着されたアッセイコード化されたビーズを含み、ペプチド基質は、第１のアミノ酸および最後のアミノ酸を含み、かつプロテアーゼ酵素の基質であり得る。元素タグは、ペプチド基質の最後のアミノ酸またはその近くに付着されて、タグ付きペプチド基質を形成し得る。コード化されたマイクロビーズは、本明細書で考察されるように、アッセイおよび試料のバーコード化の両方がなされ得る。

【0154】

アッセイビーズの混合物は、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００個のまたはそれを超える分析物（試料生体分子）をまとめて標的にし得る。特定の態様では、試料バーコードは、少なくとも５、１０、２０、５０、または１００個の試料から、アッセイバーコードビーズおよび／または細胞を識別し得る。

【0155】

細胞のための試料バーコーディング試薬は、元素タグ付き抗体（試料中の複数の細胞型または大部分の細胞にわたり結合する）、細胞に非特異的に結合するように（例えば、共有結合相互作用により）機能化された元素タグ、および／または溶液中の金属を含み得る。細胞のための試料バーコーディング試薬は、細胞中に試料バーコードを入れるための試薬（例えば、ＤＭＳＯ、洗浄剤またはアルコールなどの細胞透過処理試薬、など）をさらに含み得る。アッセイバーコード化ビーズのための試料バーコーディング試薬は、ビーズ内、ビーズの表面上に存在し得るか、またはビーズに塗布され得る。ビーズへの塗布の場合、試料バーコーディング試薬は、ビーズの表面上に結合するために（例えば、ビーズにより提示される官能基に結合するために、またはビーズ表面上に存在するブロッキング試薬に結合するために）本明細書で記載の官能基を含み得る。所与の試料のための試料バーコーディング試薬は、その試料に対する特異的な同位体の特有の組み合わせを含み得る。特定の態様では、同じ試料（例えば、個別の血液試料）由来の細胞およびアッセイバーコード化ビーズは、同じアッセイバーコードで標識され得る。細胞およびビーズの標識のために使用される同じアッセイバーコードは、同位体の同じ組み合わせ、および／または付着の同じ手段（例えば、官能基）を含み得る。

【0156】

試料バーコーディング試薬は、凍結乾燥抗体パネルなどの抗体パネルとの混合物として、またはそれと一緒に、提供され得る。試料バーコーディング試薬は、アッセイバーコード化ビーズとの混合物でまたはそれと一緒に、提供され得る。アッセイバーコード化ビーズは、抗体パネルとの混合物として、またはそれと一緒に、提供され得る。アッセイバーコード化ビーズおよび試料バーコーディング試薬は、凍結乾燥抗体パネルとの混合物として、またはそれと一緒に提供され得る（例えば、試料バーコーディング試薬が試料中のアッセイバーコード化されたビーズおよび細胞の両方を結合する場合）。上記の特定の実施形態では、試料バーコーディング試薬は、試料および／またはアッセイバーコード化されたビーズ中に、その上に存在し得る、または試料および／またはアッセイバーコード化されたビーズと一緒に提供され得る。
場合によっては、バーコーディング試薬は、バーコーディング試薬をアッセイバーコードと試料バーコードの多数の特有の組み合わせにより調製することにより事前設定された形態で、提供できる。このような場合には、各特有のバーコーディング試薬は、ウェルプレートの別個のウェルなどの別個の容器中に貯蔵できる。一例として、ウェルプレートは、特定の縦列（または横列）に沿った全てのウェルが同じアッセイバーコードを共有し、一方で特定の横列（または縦列）に沿った全てのウェルが同じ試料バーコードを共有するように、設定できる。別の例では、ウェルプレートは、各充填ウェルが特定のユニークな試料バーコードと多数のアッセイバーコードの種々の組み合わせを有するバーコーディング試薬を含むように設定できる。従って、第１のウェルは、全て第１の試料バーコードを有するが、それぞれ異なるアッセイバーコードを有するバーコーディング試薬を含み、第２のウェルは、全て第２のバーコードを有するが、それぞれ異なるアッセイバーコードを有するバーコーディング試薬を含み得る。場合によっては、事前設定されたバーコーディング試薬は、数千の群のユニークなビーズの製造を必要とし得る。
場合によっては、バーコーディング試薬（例えば、ビーズ）は、ユニークなアッセイバーコードおよび試料バーコードを結合するように機能化された表面を有するバーコーディング試薬を調製することによりセミ設定された形態で提供できる。このような場合、各群のバーコーディング試薬は、その群のバーコーディング試薬のアッセイバーコードと関連するアッセイに関連する標的化機能を有する生体分子（例えば、抗体）に結合され得る。

【0157】

セミ設定されたバーコーディング試薬が提供される場合、試料バーコードは、バーコーディング試薬と試料を組み合わせる前にバーコーディング試薬に結合され得る。一例では、異なるバーコーディング試薬を一緒に混合し、その後、一連の容器（例えば、ウェルプレートのウェル）全体にわたり配置できる。その後、ユニークな試料バーコードを、それぞれの容器に加えることができ、その産物を、ユニークな試料と混合して、その試料に対しアッセイバーコードを特定をできるアッセイを実施でき、同時にその試料を試料バーコードで標識できる。

【0158】

セミ設定されたバーコーディング試薬が提供される場合、試料バーコードは、バーコーディング試薬と試料を組み合わせた後でバーコーディング試薬に結合され得る。一例では、セミ設定されたバーコーディング試薬は、一緒に提供され得る、あるいは一緒に混合され得る。その後、バーコーディング試薬は、一連の試料のそれぞれに添加され得る。別々に、バーコーディング試薬が添加される前にまたは後で、ユニークな試料バーコードは、一連の試料のそれぞれと混合されてよい。試料バーコードは、バーコーディング試薬および／または試料の細胞または粒子を標識できる。

【0159】

１つの事例では、バーコーディング試薬は、捕捉抗体の付着のためにポリドーパミンで機能化されたアッセイバーコード化ビーズを含み得る。別の分子（例えば、アビジン）を、捕捉抗体と一緒に加えることができる。捕捉抗体がアッセイバーコード化ビーズに添加された後で、ビーズは、混合され、各試料のために一定分量に分けられてよい。試料バーコードの場合、分子を結合するように機能化された（例えば、ビオチンで）元素タグのユニークな組み合わせを、添加できる。
場合によっては、元素分析は、粒子元素分析として知られる、個別の粒子基準で行われ得る。粒子元素分析は、質量分析計系フローサイトメーターなどを用いて、個別の粒子（例えば、細胞毎）の元素組成を測定することを含む。本開示の特定の態様は、細胞毎基準で粒子元素分析を利用し、これは、サイトメトリー元素分析として知られ得る。場合によっては、元素分析は、バルク元素分析または溶液元素分析として知られる、バルク基準で行うことができる。バルク元素分析は、試料の全体積の元素組成を測定することを含む。

【0160】

元素分析は、生体試料などの試料を調べるために使用できる。試料が既知の元素タグで標識される場合、元素分析中の元素タグの検出は、元素タグに関連する試料の特性を示し得る。

【0161】

本明細書で示すように、マスサイトメトリーは、複数の識別可能な単一細胞解像度を有する質量タグを同時に検出することなどの、生体試料中の元素タグ（質量タグ）を検出するいずれかの方法である。マスサイトメトリーは、細胞から分離した、または細胞に加えた、質量タグ付きビーズの分析を含み得る。いずれかの本キットおよび方法が、マスサイトメトリーを含み得るか、またはマスサイトメトリーに適合され得る。マスサイトメトリーは、懸濁液マスサイトメトリーおよびイメージングマスサイトメトリー（ＩＭＣ）を含む。

【0162】

懸濁液マスサイトメトリーは、質量分析による（例えば、原子質量分析による）懸濁元素タグ付き細胞および／またはビーズの分析を含み、米国特許出願公開第２００５０２１８３１９号、同２０１５０１８３８９５号、同２０１５０１２２９９１号を含む米国特許出願公開広報に記載されている。これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。

【0163】

イメージングマスサイトメトリー（ＩＭＣ）は、組織切片または細胞塗抹標本などの、元素タグ付き生体試料のいずれかのイメージング質量分析（例えば、イメージング原子質量分析）を含む。ＩＭＣは、レーザー照射、イオンビーム照射、電子ビーム放射、および／または誘導結合プラズマの１種または複数により細胞試料の質量タグの微粒化およびイオン化を行い得る。マスサイトメトリーは、例えば飛行時間（ＴＯＦ）または磁気セクター質量分析（ＭＳ）により、単一細胞から別個の質量タグを同時に検出し得る。マスサイトメトリーの例は、細胞が流入する懸濁液マスサイトメトリーならびに細胞試料（例えば、組織切片）が、例えばレーザアブレーション（ＬＡ－ＩＣＰ－ＭＳ）によりまたは一次イオンビーム（例えば、ＳＩＭＳの場合）によりサンプリングされるＩＣＰ－ＭＳおよびイメージングマスサイトメトリーを含む。レーザー系ＩＭＣは、米国特許出願公開第２０１６０１３１６３５号、同２０１７０１４８６１９号、同２０１８０３０６６９５号および同２０１８０３０６６９５号に記載されており、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。特定の態様では、試料がＩＭＣによる分析のための細胞塗抹標本の場合、細胞は、例えば凍結乾燥パネルでの染色、試料バーコーディング、および／またはアッセイバーコーディングにより本明細書で記載のように処理され得る。同様に、本明細書で記載のアッセイビーズは、ＩＭＣにより、別々に、または細胞との混合物中で分析され得る。

【0164】

質量タグは、元素分析の前に、サンプリングされ、微粒化されおよびイオン化され得る。例えば、生体試料中の質量タグは、レーザービーム、イオンビームまたは電子線などの照射により、サンプリングされ、微粒化されおよび／またはイオン化され得る。代わりにまたは追加して、質量タグは、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）などのプラズマにより微粒化されおよびイオン化され得る。懸濁液マスサイトメトリーでは、質量タグを含むホールセルが、ＩＣＰ－ＴＯＦ－ＭＳなどのＩＣＰ－ＭＳ中に流し込まれ得る。イメージングマスサイトメトリーでは、ある種の照射は、質量タグを含む組織試料などの固体生体試料の一部（例えば、目的のピクセル、領域）を除去（および場合により、イオン化および微粒化）し得る。ＩＭＣの例は、質量タグ付き試料のＬＡ－ＩＣＰ－ＭＳおよびＳＩＭＳ－ＭＳを含む。特定の態様では、イオン光学が、質量タグの同位体以外のイオンを枯渇させ得る。例えば、イオン光学は、より軽いイオン（例えば、Ｃ、Ｎ、Ｏ）、有機分子イオンを除去し得る。ＩＣＰ適用では、イオン光学は、例えば、高域通過タイプの四重極フィルターなどにより、Ａｒおよび／またはＸｅなどのガスを除去し得る。特定の態様では、ＩＭＣは、細胞のまたは亜細胞の解像度を有する質量タグ（例えば、質量タグと結合された標的）のイメージを提供し得る。

【0165】

本開示はまた、次の実施形態を提供する：
実施形態１．
構造モノマー、および
金属およびキレート化剤を含む金属キレートモノマー
を含むコポリマーであって；
キレート化剤は、少なくとも３つの部位で金属を配位し；および
構造モノマーは、キレート化剤を含まない、コポリマー
を含む金属コード化されたマイクロビーズ。
実施形態２．構造モノマーは、置換もしくは非置換スチレン、α－メチルスチレン、アクリル酸およびエステルならびにこれらのアミド、メタクリル酸およびエステルならびにこれらのアミド、ならびにこれらの誘導体から選択され、場合により構造モノマーは、スチレンである、実施形態１に記載のマイクロビーズ。
実施形態３．金属キレートモノマーは、重合の前に式（Ｉ）：

【化8】

の構造を有し、式中、リガンドは、キレート化剤であり、Ｌは、リンカーであり、Ｘは、重合可能な末端基であり、Ｍは、金属であり、ｎは、１または２以上の整数であり、金属キレートモノマーは、重合の前に中性電荷である、実施形態１または２に記載のマイクロビーズ。
実施形態４．Ｌは、結合、Ｃ３－Ｃ８アルキルアミン、Ｃ３－Ｃ８アルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８ヘテロシクロアルキル、５員または６員アリールまたはヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）Ｏ、またはこれらの混合物から選択され、場合によりアルキレン、アリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアリール、およびシクロアルキルヘテロアリールのそれぞれは独立に、非置換であるか、またはＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アミド、エステル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、ＣＮ、またはこれらの混合物から選択される１個または複数の置換基により置換される
、実施形態３に記載のマイクロビーズ。
実施形態５．Ｌは、アミドまたはエステルを介してキレート化剤に付着される、実施形態３または４に記載のマイクロビーズ。
実施形態６．重合可能な末端基は、アリルビニル、スチレン、α－メチルスチレン、アクリル酸塩エステル、メタクリル酸エステル、アクリルアミド、２－メチルアクリルアミド、およびこれらの混合物から選択され、場合により重合可能な末端基は、アリルビニルまたはスチレンである、実施形態３～５のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態７．キレート化剤は、４座配位、５座配位、６座配位、７座配位、または８座配位であり、場合によりキレート化剤は、６座配位または８座配位である、実施形態１～６のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態８．キレート化剤は、アミノポリ酸部分、またはその誘導体を含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態９．アミノポリ酸部分は、アミノポリカルボン酸、アミノポリホスホン酸、またはこれらの組み合わせから選択される、実施形態８に記載のマイクロビーズ。
実施形態１０．アミノポリ酸部分は、エチレンイミン、プロピレンアミン、またはこれらの混合物の１種または複数の置換されたオリゴマーであり、オリゴマーは、２個以上のカルボン酸および／またはホスホン酸で置換されており、場合によりオリゴマーは、クラウンエーテルまたはアザクラウンエーテルである、実施形態８または９に記載のマイクロビーズ。
実施形態１１．オリゴマーは、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルケニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３－Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アミド、エステル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルへテロアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、ＣＮ、またはこれらの混合物から選択される１個または複数の置換基によりさらに置換される、実施形態１０に記載のマイクロビーズ。
実施形態１２．キレート化剤は、ＤＦＯ、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＥＤＤＳ、ＥＤＤＨＡ、ＢＡＰＴＡ、Ｈ４ｎｅｕｎｐａ、Ｈ６ｐｈｏｓｐａ、Ｈ４ＣＨＸｏｃｔａｐａ、Ｈ４ｏｃｔａｐａ、Ｈ２ＣＨＸｄｅｄｐａ、Ｈ５ｄｅｃａｐａ、Ｃｙ－ＤＴＰＡ、Ｐｈ－ＤＴＰＡ、ＴＡＣＮタイプキレート化剤、ＴＡＣＤタイプキレート化剤、サイクレンタイプキレート化剤、サイクラムタイプキレート化剤、（１３）ａｎｅＮ４タイプキレート化剤、１，７－ジアザ－１２－クラウン－４タイプキレート化剤、１，１０－ジアザ－１８－クラウン－６タイプキレート化剤、またはこれらの誘導体から選択される、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態１３．ＴＡＣＮタイプキレート化剤は、ＮＯＴＡ、ＮＯＰＯ、ＴＲＡＰ、またはこれらの誘導体から選択される、実施形態１２に記載のマイクロビーズ。
実施形態１４．サイクレンタイプキレート化剤は、ＤＯＴＡまたはその誘導体から選択される、実施形態１２に記載のマイクロビーズ。
実施形態１５．サイクラムタイプキレート化剤は、ＴＥＴＡ、架橋ＴＥＴＡ、ＤｉＡｍＳａｒ、またはこれらの誘導体から選択される、実施形態１２に記載のマイクロビーズ。
実施形態１６．（１３）ａｎｅＮ４タイプキレート化剤は、ＴＲＩＴＡまたはその誘導体から選択される、実施形態１２に記載のマイクロビーズ。
実施形態１７．１，１０－ジアザ－１８－クラウン－６タイプキレート化剤は、ＭＡＣＲＯＰＡまたはその誘導体から選択される、実施形態１２に記載のマイクロビーズ。
実施形態１８．キレート化剤は、ＤＴＰＡ、Ｃｙ－ＤＴＰＡ、Ｐｈ－ＤＴＰＡ、またはこれらの誘導体から選択される、実施形態１２に記載のマイクロビーズ。
実施形態１９．ＤＴＰＡの誘導体は、２個の隣接する炭素原子がそれらの間の原子と一緒に結合して５員または６員環、場合によりシクロアルキル環、アリールまたはヘテロアリール環を形成するＤＴＰＡを含む、実施形態１８に記載のマイクロビーズ。
実施形態２０．重合の前に、金属キレートモノマーは：

【化9】

であり、式中、ＬおよびＸは、実施形態４～６のいずれか１つで定義される通りである、実施形態１８に記載のマイクロビーズ。
実施形態２１．金属キレートモノマーは：

【化10】

、またはこれらの混合物から選択される、実施形態２０に記載のマイクロビーズ。
実施形態２２．キレート化剤は、ポルフィリンまたはフタロシアニンを含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態２３．キレート化剤は、置換されたまたは置換されないポルフィリンである、実施形態２２に記載のマイクロビーズ。
実施形態２４．重合の前に金属キレートモノマーは：

【化11】

、またはこれらの混合物から選択され、ｎは、１～４の整数である、実施形態２２または２３に記載のマイクロビーズ。
実施形態２５．Ｌは、アニリンである、実施形態２４に記載のマイクロビーズ。
実施形態２６．ｎは、少なくとも２である、実施形態２４または２５に記載のマイクロビーズ。
実施形態２７．金属キレートモノマーは：

【化12】

から選択される、実施形態３に記載のマイクロビーズ。
実施形態２８．立体安定剤をさらに含み、場合により立体安定剤は、ＰＶＰ、ポリビニルアルコール、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアクリル酸、アクリル酸エステルの水溶性ホモポリマー、メタクリル酸エステルの水溶性ホモポリマー、アクリルアミドの水溶性ホモポリマー、メタクリルアミドのホモポリマー、水溶性コポリマー立体安定剤、またはこれらの混合物から選択される、実施形態１～２７のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態２９．水溶性コポリマー立体安定剤は、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、アクリルアミドまたはメタクリルアミドと、メチルアクリレートおよび／またはエチルアクリレート、またはこれらの混合物とのコポリマーから選択される、実施形態２８に記載のマイクロビーズ。
実施形態３０．コポリマーは、架橋される、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態３１．金属は、複数の金属である、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態３２．複数の金属は、１種または複数の濃縮された同位体を含む、実施形態３１に記載のマイクロビーズ。
実施形態３３．複数の金属は、少なくとも２種の金属、少なくとも３種の金属、または少なくとも４種の金属を含む、実施形態３１または３２に記載のマイクロビーズ。
実施形態３４．複数の金属の各金属の量は、複数の金属の別の金属の量の約２０％または約１０％以内である、実施形態３１～３３いずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態３５．金属は、インジウム、ビスマス、または希土類金属を含み、場合により希土類金属は、ランタニド金属、イットリウム、またはこれらの混合物から選択される、実施形態１～３４のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態３６．金属は、Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、これらのそれぞれの同位体、およびこれらの混合物から選択される希土類金属を含む、実施形態３５に記載のマイクロビーズ。
実施形態３７．希土類金属は、８９Ｙ、１３９Ｌａ、１３６Ｃｅ、１３８Ｃｅ、１４０Ｃｅ、１４２Ｃｅ、１４１Ｐｒ、１４２Ｎｄ、１４３Ｎｄ、１４５Ｎｄ、１４６Ｎｄ、１４８Ｎｄ、１４５Ｐｍ、１４４Ｓｍ、１４９Ｓｍ、１５０Ｓｍ、１５２Ｓｍ、１５４Ｓｍ、１５１Ｅｕ、１５３Ｅｕ、１５４Ｇｄ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１６０Ｇｄ、１５２Ｇｄ、１５９Ｔｂ、１５６Ｄｙ、１５８Ｄｙ、１６０Ｄｙ、１６１Ｄｙ、１６２Ｄｙ、１６３Ｄｙ、１６４Ｄｙ、１６５Ｈｏ、１６２Ｅｒ、１６４Ｅｒ、１６６Ｅｒ、１６７Ｅｒ、１６８Ｅｒ、１７０Ｅｒ、１６９Ｔｍ、１６８Ｙｂ、１７０Ｙｂ、１７１Ｙｂ、１７２Ｙｂ、１７３Ｙｂ、１７４Ｙｂ、１７６Ｙｂ、１７５Ｌｕ、またはこれらの混合物から選択される、実施形態３６に記載のマイクロビーズ。
実施形態３８．金属は、マイクロビーズ全体にわたり分散される、実施形態１～３７のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態３９．マイクロビーズは、約６０℃もしくは６０℃超、場合により約７０℃もしくは７０℃超、約８０℃もしくは８０℃超、約９０℃もしくは９０℃超、約１００℃もしくは１００℃超、約１１５℃もしくは１１５℃超、約１２５℃もしくは１２５℃超、または約１３５℃もしくは１３５℃超のガラス転移温度を有する、実施形態１～３８のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態４０．マイクロビーズは、約０．６μｍ～約２０μｍ、約１μｍ～約１５μｍ、約２μｍ～約１０μｍ、約２μｍ～約６μｍの直径を有する、実施形態１～３９のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態４１．マイクロビーズは、水中でコロイド的に安定である、実施形態１～４０のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態４２．マイクロビーズの表面は、生体分子への付着のための機能化を含む、実施形態１～４１のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態４３．付着は、共有的付着である、実施形態４２に記載のマイクロビーズ。
実施形態４４．生体分子は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、小分子、脂質、炭水化物、またはこれらの混合物から選択される、実施形態４２または４３に記載のマイクロビーズ。
実施形態４５．生体分子は、親和性試薬であり、場合により親和性試薬は、抗体である、実施形態４２または４３に記載のマイクロビーズ。
実施形態４６．抗体は、サイトカイン、場合によりケモカイン、インターフェロン、リンホカイン、モノカイン、ＩＬ－１～３６などのインターロイキン、腫瘍壊死因子およびコロニー刺激因子に特異的である、実施形態４５に記載のマイクロビーズ。
実施形態４７．抗原は、ウィルス抗原である、実施形態４４に記載のマイクロビーズ。
実施形態４８．機能化は、マイクロビーズの表面上の二酸化ケイ素のコーティングを含み、場合により機能化は、二酸化ケイ素のコーティングを官能化することをさらに含む、実施形態４２～４７のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態４９．生体分子への付着は、非共有的付着である、実施形態４２に記載のマイクロビーズ。
実施形態５０．マイクロビーズの表面は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはこれらの混合物により機能化される、実施形態４２～４９のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態５１．マイクロビーズの表面は、生体分子にコンジュゲートされる、実施形態４２～５０のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態５２．金属は、生体分子を特定するバーコードを提供する、実施形態４２～５１のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態５３．実施形態１～５２のいずれか１つで定義されるマイクロビーズの集団。
実施形態５４．集団は、約１０％または１０％未満の変動係数（ＣＶ）を有する粒度分布を有する、実施形態５３に記載のマイクロビーズの集団。
実施形態５５．変動係数は、５％未満である、実施形態５４に記載のマイクロビーズの集団。
実施形態５６．各マイクロビーズは、複数の金属を含み、複数の金属の各金属のマイクロビーズの集団にわたる平均量は、複数の金属の別の金属の平均量の約１０％または１０％以内である、実施形態５３～５５のいずれか１つに記載のマイクロビーズの集団。
実施形態５７．複数の金属は、１種または複数の濃縮された同位体を含む、実施形態５６に記載のマイクロビーズの集団。
実施形態５８．マイクロビーズの集団の１つのマイクロビーズの各金属の量は、マイクロビーズの集団の別のマイクロビーズの同じ金属の量の約２０％もしくは２０％以内または約１０％もしくは１０％以内または約５％もしくは５％以内である、実施形態５３～５７のいずれか１つに記載のマイクロビーズの集団。
実施形態５９．マイクロビーズの集団の各金属の量は、約２０％または２０％未満の変動係数の分布を有する、実施形態５３～５７のいずれか１つに記載のマイクロビーズの集団。
実施形態６０．マイクロビーズの集団の各金属の量は、約１０％または１０％未満の変動係数の分布を有する、実施形態５９に記載のマイクロビーズの集団。
実施形態６１．マイクロビーズの集団のマイクロビーズは、実質的に同じ量の同じ金属を含む、実施形態５８～６０のいずれか１つに記載のマイクロビーズの集団。
実施形態６２．同じ金属は、複数の金属であり、かつマイクロビーズは、実質的に同じ量の複数の金属の各金属を含む、実施形態６１に記載のマイクロビーズの集団。
実施形態６３．実施形態５３～６２のいずれか１つで定義されるマイクロビーズの複数の別個の集団を含むキット。
実施形態６４．マイクロビーズの各集団は、マイクロビーズの金属または複数の金属に基づいてマイクロビーズの別の集団から識別できる、実施形態６３に記載のキット。
実施形態６５．マイクロビーズの少なくとも１つの集団のマイクロビーズは、マイクロビーズの別の集団のマイクロビーズの金属または複数の金属とは異なる金属または複数の金属を含む、実施形態６３または６４に記載のキット。
実施形態６６．マイクロビーズの少なくとも１つの集団のマイクロビーズは、マイクロビーズの別の集団のマイクロビーズとは異なる比率で複数の金属を含む、実施形態６３または６４に記載のキット。
実施形態６７．マイクロビーズの各集団のマイクロビーズは、異なる生体分子にコンジュゲートされる、実施形態６４～６６のいずれか１つに記載のキット。
実施形態６８．
重合構造モノマー、非重合構造モノマー、および立体安定剤を含む第１の混合物を得るために核生成段階で立体安定剤の存在下にて構造モノマーを重合すること、
第２の混合物を得るために第１の混合物を金属および少なくとも１種の重合可能な末端基に付着されたキレート化剤を含む金属キレートモノマーと組み合わせることであって、
キレート化剤は、少なくとも３つの部位で金属を配位し；および金属キレートモノマーは、構造モノマーと重合可能である、組み合わせること；および
マイクロビーズのコポリマーを形成するために第２の混合物を重合することであって、
構造モノマーは、キレート化剤を含まない、重合すること、
を含む、金属コード化されたマイクロビーズを調製する方法。
実施形態６９．金属は、複数の金属である、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７０．構造モノマーは、構造モノマーに基づき約５％～約２０％完結へと核生成段階で重合される、実施形態６８または６９に記載の方法。
実施形態７１．第２の混合物の重合は、構造モノマーに基づき７５％～約１００％完結、約８０％～約９９％完結、約８５％～約９５％完結、約８５％～約９３％完結まで起こる、実施形態６８～７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７２．構造モノマーは、実施形態２または３で定義される通りである、実施形態６８～７１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７３．金属キレートモノマーは、実施形態２、および４～２６のいずれか１つで定義される通りである、実施形態６８～７２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７４．立体安定剤は、実施形態２７で定義される通りである、実施形態６８～７３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７５．金属は、実施形態２９～３５のいずれか１つで定義される通りである、実施形態６８～７４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７６．方法は、マイクロビーズ機能化することをさらに含む、実施形態６８～７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７７．マイクロビーズの機能化は、
第３の混合物を得るために重合された第２の混合物を第３のモノマーと混合することであって、第３のモノマーが、反応性官能基を含む、混合すること；および
第３の混合物を重合すること、
を含む、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７８．反応性官能基は、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、エポキシド、ビニル、アルキン、マレイミド、またはまたはこれらの混合物から選択される、実施形態７７に記載の方法。
実施形態７９．マイクロビーズの機能化は、二酸化ケイ素でマイクロビーズをコートすることを含む、実施形態７６に記載の方法。
実施形態８０．マイクロビーズの機能化は、二酸化ケイ素コーティングを機能化することをさらに含む、実施形態７６に記載の方法。
実施形態８１．生体分子にマイクロビーズをコンジュゲートすることをさらに含む、実施形態６８～８０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８２．生体分子は、実施形態４４～４７のいずれか１つで定義される通りである、実施形態８１に記載の方法。
実施形態８３．マイクロビーズは、約０．６μｍ～約２０μｍ、約１μｍ～約１５μｍ、約２μｍ～約１０μｍ、約２μｍ～約６μｍの直径を有する、実施形態６８～８２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８４．マイクロビーズは、実施形態１～５２のいずれか１つで定義される通りである、実施形態６８～８３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８５．実施形態６８～８３のいずれか１つの方法により調製されるマイクロビーズ。
実施形態８６．マイクロビーズの内部構造は、コポリマーを含む、実施形態１～５２のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態８７．金属キレートモノマーは、単一金属原子をキレート化し、複数の金属原子をキレート化しない、実施形態１～５２、および８６のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態８８．マイクロビーズは、金属キレートモノマーを含まないポリマーシードを含む、実施形態１～５２、および８６および８７のいずれか１つに記載のマイクロビーズ。
実施形態８９．ポリマーシードは、構造モノマーを含み、場合によりポリマーシードの構造モノマーは、コポリマーの構造モノマーと構造において同一である、実施形態８８のマイクロビーズ。
実施形態９０．マイクロビーズの内部構造は、コポリマーを含む、実施形態６８に記載の方法。
実施形態９１．金属コード化されたマイクロビーズを調製する方法であって、
膨潤可能なシード粒子およびアニオン性界面活性剤の水性分散液を提供すること；
水性分散液を構造モノマーと金属キレートモノマーを含むモノマーと接触させることであって、金属キレートモノマーは、金属および少なくとも１種の重合可能な末端に付着されたキレート化剤を含み、キレート化剤は、少なくとも３つの部位で金属を配位し、構造モノマーは、キレート化剤を含まない、接触させること；
膨潤したシード粒子の水性分散液を形成するためにシード粒子中にモノマーを拡散させること；および
膨潤したシード粒子の水性分散液中でモノマーの重合を開始すること、
を含む、方法。
実施形態９２．構造モノマーは、アクリルモノマー、メタクリレートモノマーおよびスチレン、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）、エチルビニルベンゼン、ビニルピリジン、アミノスチレン、メチルスチレン、ジメチルスチレン、エチルスチレン、エチルメチルスチレン、ｐ－クロロスチレンおよび２，４－ジクロロスチレンからなる群より選択されるビニルモノマーからなる群より選択される、実施形態９１に記載の方法。
実施形態９３．膨潤したシード粒子の水性分散液は、立体安定剤をさらに含む、実施形態９１または９２に記載の方法。
実施形態９４．立体安定剤は、ポリビニルピロリドンである、実施形態９３に記載の方法。
実施形態９５．膨潤可能なシード粒子の水性分散液を提供することは、乳化重合により単分散の膨潤可能なシード粒子を調製することを含む、実施形態９１～９４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９６．膨潤可能なシード粒子の水性分散液は、５０００ダルトン未満の分子量および２５℃で１０^－２ｇ／Ｌ未満の水溶性を有する有機化合物；および、場合によりその中で上記有機化合物が可溶である有機溶媒をさらに含む、実施形態９１～９５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９７．膨潤可能なシード粒子は、単分散の膨潤可能な種オリゴマー粒子である、実施形態９１～９６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９８．アニオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウムである、実施形態９１～９７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９９．構造モノマーは、実施形態２で定義される通りである、実施形態９１～９８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１００．金属キレートモノマーは、実施形態１、および３～２７のいずれか１つで定義される通りである、実施形態９１～９９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０１．質量タグを含むレポーターをさらに含み、レポーターは、少なくとも１種の異なる生体分子により特異的に結合される試料生体分子を特異的に結合する、実施形態６７に記載のキット。
実施形態１０２．試料生体分子は、オリゴヌクレオチドであり、少なくとも１つの異なる生体分子は、試料生体分子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである、実施形態１０１に記載のキット。
実施形態１０３．レポーターは、ハイブリダイズして試料生体分子に複数の質量タグ付きオリゴヌクレオチドを間接的に結合させる複数のオリゴヌクレオチドを含む、実施形態１０２に記載のキット。
実施形態１０４．少なくとも１つの異なる生体分子は、抗体などの親和性試薬である、実施形態１０１～１０３のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１０５．試料生体分子は、ウィルス粒子であり、少なくとも１つの異なる生体分子は、ウィルス粒子を特異的に結合する第１の抗体であり、レポーターは、ウィルス粒子を特異的に結合する第２の抗体を含む、実施形態１０４に記載のキット。
実施形態１０６．試料生体分子は、サイトカインであり、少なくとも１つの異なる生体分子は、サイトカインを特異的に結合する第１の抗体であり、レポーターは、サイトカインを特異的に結合する第２の抗体を含む、実施形態１０４に記載のキット。
実施形態１０７．試料生体分子は、癌バイオマーカーであり、少なくとも１つの異なる生体分子は、癌バイオマーカーを特異的に結合する第１の抗体であり、レポーターは、癌バイオマーカーを特異的に結合する第２の抗体を含む、実施形態１０４に記載のキット。
実施形態１０８．少なくとも１つの異なる生体分子は、ウィルス抗原を含み、試料生体分子は、ウィルス抗原を特異的に結合する抗体であり、レポーターは、試料生体分子に結合する二次抗体を含む、実施形態１０１～１０７のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１０９．複数の異なるレポーターをさらに含み、それぞれの異なるレポーターは、異なる生体分子により特異的に結合される試料生体分子を結合する、実施形態１０１～１０８のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１１０．複数の異なるレポーターはそれぞれ、同じ質量タグを含む、実施形態１０９に記載のキット。
実施形態１１１．質量タグは、金属ナノ粒子を含む、実施形態１０１～１１０のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１１２．質量タグは、金属キレートポリマーを含む、実施形態１０１～１１０のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１１３．少なくとも１つの生体分子は、試料生体分子に対し酵素基質である、実施形態６７に記載のキット。
実施形態１１４．酵素基質が試料生体分子により修飾されている場合それに特異的に結合するレポーターをさらに含む、実施形態１１３に記載のキット。
実施形態１１５．酵素基質が試料生体分子により修飾されていない場合それに特異的に結合するレポーターをさらに含む、実施形態１１３に記載のキット。
実施形態１１６．酵素基質は、酵素基質が試料生体分子により修飾されると除去される質量タグを含む、実施形態１１５に記載のキット。
実施形態１１７．複数の異なる集団からのマイクロビーズは、マイクロビーズの第１の混合物中に存在する、実施形態１０１～１１６のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１１８．マイクロビーズの第１の混合物と同じ生体分子を含むマイクロビーズの第２の混合物をさらに含み、第１の混合物のマイクロビーズは、第２の混合物のマイクロビーズとは異なる試料バーコードを含む、実施形態１１７に記載のキット。
実施形態１１９．試料バーコードは、マイクロビーズの内部に存在する、実施形態１１８に記載のキット。
実施形態１２０．試料バーコードは、第１のおよび第２の混合物のマイクロビーズの金属キレートモノマーによりキレート化された金属のサブセットである、実施形態１１９に記載のキット。
実施形態１２１．試料バーコードは、第１のおよび第２の混合物のマイクロビーズの表面上に存在する、実施形態１１８に記載のキット。
実施形態１２２．複数の異なる集団からのマイクロビーズの表面に結合するように機能化される別の区分中の複数の試料バーコードをさらに含む、実施形態１１８に記載のキット。
実施形態１２３．相互の混合物中の質量タグ付き抗体のパネルをさらに含み、パネルの少なくともいくつかの抗体は、細胞表面マーカーに特異的である、実施形態１０１～１２２のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１２４．複数の抗体は、キットのマイクロビーズと混合されている、実施形態１２３に記載のキット。
実施形態１２５．質量タグ付き抗体の少なくとも一部は、キットのマイクロビーズの金属キレートモノマーによりキレート化された金属と同一の金属を含む、実施形態１２３または１２４に記載のキット。
実施形態１２６．キットのマイクロビーズと混合された立体安定剤をさらに含む、実施形態１０１～１２５のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１２７．立体安定剤は、ポリビニルピロリドンである、実施形態１２６に記載のキット。
実施形態１２８．キットのマイクロビーズは、５および９または５～９のｐＨで緩衝化された溶液中に存在する、実施形態１０１～１２７のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１２９．マイクロビーズは、凍結乾燥される、実施形態１０１～１２５のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１３０．マイクロビーズは、固体担体に融合される、実施形態１０１～１２５のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１３１．固体担体は、顕微鏡スライドである、実施形態１３０に記載のキット。
実施形態１３２．固体担体は、接着膜である、実施形態１３０に記載のキット。
実施形態１３３．１種または複数の緩衝剤、抗凝固剤、固定試薬、および透過処理試薬をさらに含む、実施形態１０１～１３２のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１３４．実施形態５３～６２のいずれか１つに記載のマイクロビーズの集団を検出することを含む方法。
実施形態１３５．マイクロビーズから得られた質量スペクトルに基づきマイクロビーズを検出するために使用される質量分析計を較正することをさらに含む、実施形態１３４に記載の方法。
実施形態１３６．マイクロビーズから得られた質量スペクトルに基づき複数の質量タグから得られた質量分析シグナルを正規化することをさらに含む、実施形態１３４に記載の方法。
実施形態１３７．
実施形態５３～６２のいずれか１つに記載のマイクロビーズの別個の集団を試料と混合することであって、マイクロビーズのそれぞれの集団のマイクロビーズは、異なる生体分子に結合され、マイクロビーズのそれぞれの集団は、マイクロビーズの金属または複数の金属に基づいてマイクロビーズの別の集団から識別される、混合すること；
試料の異なる試料生体分子を、マイクロビーズの別個の集団の異なる生体分子に結合させること；
異なる試料生体分子のそれぞれにレポーターを、直接にまたは間接的に、結合させることであって、異なる試料生体分子のそれぞれに結合されるレポーターは、質量タグを含む、結合させること；および
質量分析により個別のマイクロビーズの金属および質量タグを検出すること、
を含む、質量分析の方法。
実施形態１３８．マイクロビーズの別個の集団を試料と混合するステップの前に、マイクロビーズの別個の集団のマイクロビーズに異なる生体分子を付着させることをさらに含む、実施形態１３７に記載の方法。
実施形態１３９．異なる試料生体分子は、オリゴヌクレオチドを含む、実施形態１３７または１３８に記載の方法。
実施形態１４０．異なる試料生体分子は、抗体を含む、実施形態１３７～１３９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４１．異なる試料生体分子は、サイトカインを含む、実施形態１３７～１４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４２．異なる試料生体分子は、癌バイオマーカーを含む、実施形態１３７～１４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４３．
マイクロビーズの別個の集団を試料と混合することであって、マイクロビーズのそれぞれの集団のマイクロビーズは、異なる生体分子に結合され、マイクロビーズのそれぞれの集団は、マイクロビーズの金属または複数の金属に基づきマイクロビーズの別の集団から識別される、混合すること；
試料の異なる試料生体分子をマイクロビーズの別個の集団の異なる生体分子に結合させること；
異なる試料生体分子のそれぞれにレポーターを、直接にまたは間接的に、結合させることであって、異なる試料生体分子のそれぞれに結合されるレポーターは、質量タグを含む、結合させること；および
質量分析により個別のマイクロビーズの金属および質量タグを検出すること、
を含む、実施形態１０１～１３３のいずれか１つに記載のキットを用いる質量分析の方法。
実施形態１４４．
複数の質量タグ付き抗体を提供することであって、質量タグ付き抗体の各抗体が、金属またはそれらの濃縮された同位体の複数原子をキレート化するポリマー質量タグに結合される、提供すること；
試料を複数の質量タグ付き抗体と接触させること；
質量分析により試料およびマイクロビーズに結合された質量タグ付き抗体を検出すること、
を含む、実施形態６３～７４のいずれか１つに記載のマイクロビーズを用いる細胞試料の質量分析の方法。
実施形態１４５．検出のステップで用いられる質量分析計を較正することをさらに含み、較正することが、マイクロビーズから得られた質量分析シグナルに基づく、実施形態１４４に記載の方法。
実施形態１４６．マイクロビーズから得られた質量分析シグナルに基づき質量タグから得られた質量分析シグナルを正規化することをさらに含む、実施形態１４４に記載の方法。
実施形態１４７．それぞれの質量タグ付き抗体に対する金属原子の平均数ならびに質量タグ付き抗体およびマイクロビーズからの検出された質量分析シグナルに基づき質量タグ付き抗体を定量化することをさらに含む、実施形態１４４に記載の方法。
実施形態１４８．マイクロビーズおよび質量タグ付き抗体は、同じ金属を含む、実施形態１４６または１４７に記載の方法。
実施形態１４９．検出するステップは、イメージングマスサイトメトリーを含む、実施形態１３４～１４８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５０．マイクロビーズから検出された質量分析シグナルに基づき個別のピクセルでの、または個別の細胞に結合された質量タグ付き抗体を定量化するまたは正規化することをさらに含む、実施形態１４９に記載の方法。
実施形態１５１．マイクロビーズは、検出するステップの前に、固体表面に対し融解される、実施形態１４９または１５１に記載の方法。
実施形態１５２．検出するステップは、懸濁液マスサイトメトリーを含む、実施形態１３４～１５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５３．検出するステップは、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を含む、実施形態１３４～１５２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５４．検出するステップは、レーザアブレーションＩＣＰ－ＭＳまたは二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）を含む、実施形態１４９～１５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５５．質量分析は、飛行時間質量分析（ＴＯＦ－ＭＳ）である、実施形態１３４～１５４のいずれか１つに記載の方法。
上記開示は、本開示を広く記載する。より完全な理解は、以下の特定の実施例への参照により得ることができる。これらの実施例は、本開示の例示の目的のためのみに記載されており、本発明の範囲を限定する意図はない。状況により示唆される、または好都合になる場合は、形態の変更および等価物の置換が想定される。本明細書では特定の用語が使用されているが、このような用語は、説明的な意図であり、限定を目的としたものではない。

【0166】

実施例
下記の非限定的実施例は、本開示の実例である。
実施例１
ＤＴＰＡによりキレート化された１個または複数のランタニドを有するポリスチレン（ＰＳ）マイクロビーズ
金属コード化されたマイクロビーズは、第２段階の一定分量としてエタノール中のスチレンの分散重合反応中に重合可能な金属－ＤＴＰＡ錯体を導入することにより合成された。成分およびマイクロビーズの合成ならびに使用した材料が、記載される。

【0167】

材料
ジエチレントリアミン五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ酸二無水物、９８％）、２，２－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ、９８％）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、Ｍｗ 約５５ｋＤａ）、トリトンＸ３０５（ＴＸ３０５、７０％水溶液）、ベンジルアミン（ＢＡ、９９％）、Ｎ－（３－アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡｍ、９８％）、トリエチルアミン（ＴＥＡ、９９％）、酢酸ナトリウム（無水、≧９９％）、酢酸アンモニウム（≧９８％）、炭酸ナトリウム（≧９９％）、過酸化水素溶液（Ｈ_２Ｏ_２、Ｈ_２Ｏ中３０％）、およびイットリウム（ＩＩＩ）クロリド・六水和物（ＹＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）、セリウム（ＩＩＩ）クロリド・七水和物（ＣｅＣｌ_３・７Ｈ_２Ｏ、）、ユウロピウム（ＩＩＩ）クロリド・六水和物（ＥｕＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）、ホルミウム（ＩＩＩ）クロリド・六水和物（ＨｏＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）、ルテチウム（ＩＩＩ）クロリド・六水和物（ＬｕＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）を含む純度≧９９．９９％の金属塩（微量金属基準）、ならびに重水（Ｄ_２Ｏ、９９．９％）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入された。４－ビニルベンジルアミン（ＶＢＡ、≧９２％）は、ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａにより提供された。無水エタノール（ＥｔＯＨ）は、市販のアルコールから製造された。硝酸（微量金属グレード、６８～６９％）、硫酸（微量金属グレード）、水酸化ナトリウムおよびリン酸緩衝食塩水（１ｘＰＢＳ溶液、Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入された。全ての上記化学物質は、さらに精製することなく使用された。スチレン（Ｓｔ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、≧９９％）は、アルミナ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、活性化、中性充填カラム）充填カラムを通過させることにより精製された。誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）較正用の単一元素標準溶液は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｐｕｒｅ Ｐｌｕｓ）から購入された。ビーズ当り、平均で^８９Ｙ（６９ｘ１０^６）、^１１５Ｉｎ（４３ｘ１０^６）、^１４０Ｃｅ（１７ｘ１０^６）、^１５１Ｅｕ（１０ｘ１０^６）、^１５３Ｅｕ（１１ｘ１０^６）、^１６５Ｈｏ（５．８ｘ１０^６）、^１７５Ｌｕ（７．５ｘ１０^６）、および^２０９Ｂｉ（５．８ｘ１０^６）を含む、マスサイトメトリー（ＭＣ）較正および正規化用の７元素コード化マイクロビーズは、Ｌｉｕら、２０２０^１５に記載される通りであった。ＥＱ（商標）４元素（ＥＱ４）マスサイトメトリー（ＭＣ）用較正ビーズは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃａｎａｄａにより厚意で提供された。１８ＭΩ・ｃｍの最小抵抗率を有する脱イオン水は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ精製システムにより生成された。圧縮窒素（９９．９９８％、Ｐｒａｘａｉｒ）が、重合反応のための保護雰囲気として使用された。

【0168】

機能的ＤＴＰＡ－ビス（アミド）誘導体の合成
ＤＴＰＡ金属錯体をポリスチレン（ＰＳ）マイクロビーズ中に組み込むために、ＤＴＰＡを最初に、１：２化学量論的比率で４－ビニルベンジルアミン、ベンジルアミン、アリルアミンまたはアミノプロピルメタクリルアミド（Ｒ－ＮＨ_２＝ＶＢＡ、ＢＡ、ＡＬＡまたはＡＰＭＡｍ）とＤＴＰＡ二無水物を反応させることにより機能化した。合成法を、いくつかの修正を加えてＤＴＰＡ－ビス（ビニルベンジルアミド）（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）についてＺｈａｎｇら^１６により、ＤＴＰＡ－ビス（ベンジルアミド）（ＤＴＰＡ－ＢＡｍ_２）についてＡｉｍｅら^１７により、およびＤＴＰＡ－ビス（アリルアミド）（ＤＴＰＡ－ＡＬＡｍ_２）についてＳｈｕｈｅｎｄｌｅｒら^１８により報告されたプロトコルから開発した。
ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ２を調製するための典型的実験では、ＤＴＰＡ二無水物（１ｍｍｏｌ）を、室温にて無水ＤＭＳＯ（５．０ｍＬ）中で４－ビニルベンジルアミン（２ｍｍｏｌ）と混合し、一晩撹拌した。エタノール中のＮａＯＨ（１Ｍ、３当量）を、反応系に加えて、ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２の三ナトリウム塩を形成し、続いて反応混合物を４５ｍＬのアセトンで希釈して、ＤＴＰＡ塩を析出させた。沈殿したＤＴＰＡ塩を次に、沈降により収集し、エタノールに再溶解した。３サイクルの溶解－析出－沈降を実施して、生成物を精製した。生成物を、減圧下、室温で一晩乾燥して、残留溶媒を除去し、室温にてＤ_２Ｏ溶液中でＶａｒｉａｎ ５００ＭＨｚ測定器（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いるプロトン核磁気共鳴（^１Ｈ－ＮＭＲ）により特徴づけた。

【0169】

ＤＴＰＡ－ビス（アミド）誘導体の金属錯体の合成
ビーズ合成のために使用されるＤＴＰＡ－ビス（アミド）誘導体（Ｍ（ＤＴＰＡ－Ｒ_２））の金属錯体を、水溶液中で金属イオンをＤＴＰＡ－Ｒ_２にロードすることにより調製した。典型的金属キレート化実験では、０．３０ｍｍｏｌのＤＴＰＡ－Ｒ_２三ナトリウム塩および等モル量の金属クロリド（０．３０ｍｍｏｌ）を、水（３ｍＬ）中で別々に溶解した。金属塩溶液を次に、ＤＴＰＡ誘導体溶液に加え、同時にｐＨを監視し、０．０１ＭのＨＣｌおよび０．０１ＭのＮａＯＨ溶液で５．０～６．０に調節した。Ｃｅ^３＋イオンのＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２へのキレート化の間に、混合物の透明溶液は、金属クロリド溶液の添加によりゆっくりと不透明になった。実験中に、１～２ｍＬのエタノールを、混合物に加えて、溶液を透明に保持した。各混合物を、室温で３時間撹拌した。Ｍ（ＤＴＰＡ－Ｒ_２）錯体を、アセトン析出および沈降により単離した。キレート化されない金属イオンはアセトン－水混合物中で可溶であり、一方でＤＴＰＡ誘導体の金属錯体はアセトン中で低溶解度であることに留意されたい。析出物をその後、エタノール中に溶解し、さらなる精製のためにアセトンで析出させた。金属錯体の最終生成物を、沈降により収集し、減圧下にて室温で一晩乾燥した。^１Ｈ－ＮＭＲを用いて、金属錯体の特性を明らかにした。

【0170】

２段階分散重合
２段階分散重合（２段階ＤｉｓＰ）を用いて、立体安定剤としてポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および金属リガンドとしてＤＴＰＡ誘導体金属錯体の存在下で、金属コード化ポリスチレン（ＰＳ）マイクロビーズを調製した。ＰＶＰの存在下にてエタノール中でスチレンの重合を開始した後、エタノール中の目的の量のＤＴＰＡ金属錯体の温溶液を、２時間で第２段階一定分量として導入した。反応を、開始後２４時間で停止し、９０％を超えるスチレン転化率を有した。表１は、マイクロビーズの調製に使用されたこの２段階ＤｉｓＰの典型的な配合を記載する。

【表1】

【0171】

実施例２
１２バッチのビーズ合成を、実施例１の方法および材料ならびに第２段階での供給原料として種々の量のＭ（ＤＴＰＡ－Ｒ_２）錯体を用いて行った。これらの錯体を、表２に記載のように、異なる官能基で修飾し、異なるタイプの金属イオンをロードした。

【表2】

反応を終了させた後、マイクロビーズ分散液を、２回の無水エタノールおよび４回の水を用いる沈降－再分散サイクルにより洗浄して、遊離安定剤、未反応モノマー、および全てのより小さい直径粒子を除去した。これらの洗浄されたマイクロビーズの分散液を、ＭＣキャラクタリゼーションに使用し、一定分量を、固形分含有量を測定するために凍結乾燥した。

【0172】

実施例３
表面修飾および二次抗体付着
マイクロビーズを、シリカシェルでコートし、二次抗体にコンジュゲートした。

【0173】

シリカコーティングおよびバイオコンジュゲーションのための材料
テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ、９９％）、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ、９９％）、無水コハク酸（９９％）、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、９９．９％）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｅｒｉｃｈから購入された。アンモニア溶液２５％（ＮＨ_４ＯＨ）、ＭＥＳ緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ５．５）、リン酸緩衝食塩水（１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ニュートラアビジン（ＮｅｕｔｒａＡｖｉｄｉｎ）（ＮＡｖ）、ビオチン－ｘｘ－ヤギ抗マウス（Ｈ＋Ｌ ＩｇＧ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃに注文した。ＭａｘＰａｒ（登録商標）１７５Ｌｕ－標識マウス抗抗ＴＮＦα（ヒト）（クローンＭＡｂ１１）、細胞染色緩衝剤および細胞取得溶液は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃａｎａｄａにより厚意で提供された。

【0174】

シリカコーティングによりヤギ抗マウス（抗体）で機能化された金属コード化マイクロビーズの調製
金属コード化マイクロビーズ（Ｅｕ－１）を最初に、Ｓｔｏｂｅｒ法によりシリカ（ＳｉＯ_２）でコートした。典型的には、５０ｍｇのビーズ（固体）を含むビーズ分散液の一定分量を、遠心管中で５ｍＬのエタノール－アンモニア溶液（エタノール：アンモニア＝９９：１体積）を用いる沈降－再分散サイクルにより洗浄した。ＴＥＯＳ（７５μＬ）を、ビーズ分散液へ添加して、シリカ縮合反応を開始した。反応系を、試料回転装置で２０分間撹拌（４０ｒｐｍ、周囲温度）し、９８体積％のエタノール（５ｍＬ）を用いる４回の沈降－再分散サイクルによりクエンチした。一定分量のシリカコートＥｕ－１ビーズ（Ｅｕ－１／ＳｉＯ_２）分散液（１ｍＬ、約１０ｍｇの固体）を、超音波処理浴中で５分間処理し、Ｅｕ－１／ＳｉＯ_２ビーズ分散液にＡＰＴＥＳ（５μＬ）を加えることによりアミノ基（ＮＨ_２）でさらに機能化した。ＮＨ_２コーティング反応を、オーブン中にて４０℃で２０時間撹拌し、無水エタノール（１ｍＬ）を用いる４サイクルの沈降－再分散洗浄によりクエンチした。ＮＨ_２修飾マイクロビーズ（Ｅｕ－１／ＮＨ_２）上の官能基をカルボキシル基（ＣＯＯＨ）に変換するために、一定分量の新たに調製したＥｕ－１／ＮＨ_２マイクロビーズ分散液（８００μＬ、約８ｍｇの固体）を、エタノール－ＴＥＡ溶液（１ｍＬ、０．２体積％のＴＥＡ含有）で４回の沈降－再分散サイクルにわたり洗浄し、続いて新たに調製したＤＭＳＯ（１００μＬ、１０重量％無水コハク酸）中の無水コハク酸溶液を加えた。ＣＯＯＨ改質反応物を、試料回転装置（４０ｒｐｍ）上で４０℃にて一晩撹拌し、その後、水（８００μＬ）を用いる４サイクルの沈降－再分散洗浄により終結させた。

【0175】

次に、ＮＡｖを、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングによりＣＯＯＨ修飾Ｅｕ－１ビーズ（Ｅｕ－１／ＣＯＯＨ）にコンジュゲートした。コンジュゲーション反応では、Ｅｕ－１／ＣＯＯＨ分散液の一定分量（１００μＬ、約１％の固体）を、ＭＥＳ緩衝液（１００μＬ。０．１Ｍ、ｐＨ５．５）で４回洗浄して、溶媒を交換した。ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化反応を、洗浄されたＥｕ－１／ＣＯＯＨ分散液に、ＭＥＳ緩衝液中にＥＤＣ（８ｍｇ）およびＮＨＳ（１２ｍｇ）を含むＥＤＣ／ＮＨＳ溶液（１００μＬ）を添加することにより開始した。１５分間のインキュベーションの後、反応溶液を、２サイクルの遠心洗浄により１ｘＰＢＳ緩衝液（１００μＬ；ｐＨ７．４）へと素早く切り替え、その後ＮＡｖ溶液（５０μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）を添加した。ＮＡｖコンジュゲーション反応物を、４時間インキュベートし、続いてＰＢＳ緩衝液（１００μＬ）を用いる４サイクルの遠心洗浄により非結合ＮＡｖを除去した。

【0176】

ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）二次抗体を、２時間ビオチン－ｘｘ－ＧＡＭ（２０μｇ）含有ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液（１００μＬ、ＰＢＳ中の０．５重量％ＢＳＡ）中でＮＡｖ修飾Ｅｕ－１ビーズ（約２百万個のビーズ）をインキュベートすることによりＥｕ－１マイクロビーズに付着させた。過剰ＧＡＭをその後、ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液（１００μＬ）を用いる４サイクルの遠心洗浄により除去した。

【0177】

実施例４
実施例１および２の方法および材料を用いて調製されたマイクロビーズのサイズおよび粒度分布ならびに金属および金属分布の特性を、解析した。

【0178】

マイクロビーズのサイズおよび粒度分布のキャラクタリゼーション
マイクロビーズ分散液の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）像を、日立Ｓ－５２００顕微鏡を用いて収集して、マイクロビーズ直径および直径分布の特性を明らかにした。典型的には、２μＬの希釈したビーズ分散液を、３００メッシュのホルムバール／炭素コート銅グリッド上に滴下し、乾燥させた。マイクロビーズの直径を、複数ＳＥＭ像からＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてマニュアルで測定した。平均直径、標準偏差（ＳＤ）および変動係数（ＣＶ、式２参照）を、少なくとも３００個の測定に基づいて計算した。

【数1】

【0179】

マイクロビーズの酸消化
マイクロビーズ分散液を、ＩＣＰ－ＭＳ測定の前に、硫酸およびＨ_２Ｏ_２で消化した。典型的な消化実験では、硫酸（５００μＬ）およびマイクロビーズ分散液（１００μＬ、０．５～２％固体含量）を、２０ｍＬのガラスバイアル中で混合した。硫酸中のマイクロビーズ分散液をその後、ホットプレート上で２５０℃に加熱し、磁気撹拌しながら４０分間保持し、続いて３０％のＨ_２Ｏ_２溶液（５０μＬ）を添加した。ＩＣＰ－ＭＳ分析のために、消化溶液をその後、２％ＨＮＯ_３で希釈した。

【0180】

計測装置
誘導結合プラズマ－質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）。ＩＣＰ－ＭＳ（ｉＣＡＰ－Ｑ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、試料中の金属イオン濃度を定量した。試料を、運動エネルギー弁別（ＫＥＤ）測定モードで分析した。元素標準溶液を、較正溶液として、２％ＨＮＯ_３で４０、２０、１０、１および０．１ｐｐｂの一連の濃度に系列希釈した。較正フィッティング曲線に基づき、各溶液試料中の金属含量を、決定した。目的の元素の検出限界を、１０ｐｐｔ未満であると推定した。

【0181】

マスサイトメトリー（ＭＣ）。マイクロビーズの金属含量を、マスサイトメトリーシステム（Ｈｅｌｉｏｓ（登録商標）ＣｙＴＯＦ，Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）によりビーズ毎に特徴づけた。Ｌｉｕら、２０２０^１５により報告された、７元素コードマイクロビーズ（７Ｅ１）の試料を、内部標準として採用し、希釈したマイクロビーズ分散液試料と混合した。７Ｅ１基準ビーズおよびマイクロビーズ試料からなる混合物をその後、３０μＬ／分の速度でＭＣシステムに導入し、ビーズを、個別に、しかし確率論的にＩＣＰ中に導入した。シグナル取得後に、シングレットイベントを、特定し、ＭＣにより生成されたドットプロット上でゲートした。シングレットシグナルの平均、中央値、ロバスト標準偏差（ＲＳＤ）およびロバスト変動係数（ＲＣＶ）を、非正規化生データとして報告した。ロバスト統計は、平均、ＳＤ、およびＣＶなどの古典的統計推定器に対する代替手法を提供する。

【0182】

結果
実施例１～３の方法を用いて調製したマイクロビーズのスチレン転化率は、９０％超であった。
下記スキーム１に示すように、４種の異なるタイプのＤＴＰＡ誘導体を、調製した。この組み込み効率を、以下に記載するようにＣｅ（ＩＩＩ）－ＤＴＰＡ錯体を用いて試験した。

【0183】

機能的ＤＴＰＡ－Ｒ_２誘導体の合成
ＤＴＰＡの金属錯体をＰＳマイクロビーズ中に共有結合により組み込むために、ＤＴＰＡを、ＤｉｓＰの間にスチレンと反応できる官能基で修飾した。この設計では、ＤＴＰＡ上の５個のカルボキシレートのうちの２個が、官能基で置換され、そのため機能化されたＤＴＰＡ誘導体中の残りの３個のカルボキシレートは、ランタニド（ＩＩＩ）イオンと電荷中性錯体を形成でき、これは、結合安定性およびＤｉｓＰにおけるそれらの金属錯体のエタノール溶解性を促進する。

【0184】

金属錯体を、スキーム１で概要を示した手法により合成した。ＤＴＰＡ二無水物は、一級アミンと効率的に反応して、ＤＴＰＡビスアミドを産生する^{２１、２２}。ＤＴＰＡのビス（アミド）誘導体は、ランタニドイオンと強力に結合する８座配位キレート化剤である。金属イオンとＤＴＰＡビスアミドの間の結合は、ＤＴＰＡ－ビスアミドの異なるタイプの金属錯体が反応において混合される場合、ビーズ合成中の金属解離および交換に対し高度に安定であることが想定される。
スキーム１ ２段階分散重合のためのＤＴＰＡ誘導体－金属錯体の合成。金属キレート剤ＤＴＰＡを、ＤＭＳＯ中でＤＴＰＡ無水物を官能性分子含有アミンと反応させることにより機能化した。異なるタイプの金属イオンを、ｐＨ５～６でＤＴＰＡ誘導体上にロードした。

【化13】

【0185】

ＤＰＴＡ－ビスベンジルアミド（ＤＴＰＡ－ＢＡｍ_２）のベンジル炭素から、またはＤＴＰＡ－ビスアリルアミン（ＤＴＰＡ－ＡＬＡｍ_２）のアリル炭素^{２５、２６}から、水素引き抜きを介して、連鎖移動反応によりスチレンと反応できる２種のＤＴＰＡ－ビスアミドを、調製した。結果を、４－ビニルフェニル基がスチレンと類似の反応性を有すると予測され得る、ＤＰＴＡ－ビス－４－ビニルベンジルアミド（ＤＴＰＡアリルＡｍ_２）との共重合で得られたものと比較した^{２７－２９}。得られた生成物を、^１Ｈ－ＮＭＲにより特徴づけて、それらの構造を確認した。

【0186】

図１は、Ｎａ_３（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルであり、５．３（ｂ，２Ｈ）、５．８（ａ，２Ｈ）、および６．８（ｃ，２Ｈ）でビニル基中のプロトンの明確に異なる化学シフトを示す。４．４ｐｐｍ（ｆ，４Ｈ）での化学シフトは、アミド結合の形成を示す。ビニル、ベンジル、およびＤＴＰＡ部分からのプロトンの組み込みは、各ＤＴＰＡ分子中のビニルベンジル基のビス置換を確証する。図８ＡおよびＢで示される^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、文献^{１８、１９、３０}で報告されたＤＴＰＡ－ＢＡｍ_２およびＤＴＰＡ－ＡＬＡｍ_２のスペクトルにそれぞれ一致し、これらの２種のＤＴＰＡ－ビス（アミド）誘導体の良好な合成を立証する。

【0187】

Ｃｅ（ＤＴＰＡ－Ｒ_２）金属錯体を有するＰＳマイクロビーズ中への金属組み込みの試験
Ｃｅ（ＤＴＰＡ－Ｒ_２）金属錯体の合成。異なるＤＴＰＡ誘導体の組み込み活性を調べるために、Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）、Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＢＡｍ_２）、およびＣｅ（ＤＴＰＡ－ＡＬＡｍ_２）のＣｅ錯体を、調製した。金属錯体を、１：１のモル比でｐＨ５．０～６．０にて水中のＤＴＰＡ－Ｒ_２にＣｅＣｌ_３の水溶液を加えることにより合成した。Ｃｅ（ＤＴＰＡ－Ｒ_２）錯体を、アセトンの添加により沈殿させ、^１Ｈ－ＮＭＲにより特徴づけて、金属キレート化を検証した。これらのＣｅ錯体の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを、図９Ａ～Ｃに示す。Ｃｅ^３＋は常磁性ＮＭＲシフト試薬であるので、これらのＣｅ錯体からのプロトンの化学シフトは、ある程度ずれて広がり、Ｃｅ^３＋のキレート化相互作用を示す。いくつかのＭ（ＤＴＰＡ－ＢＡｍ_２）錯体（Ｍ＝Ｉｎ、ＹおよびＬｕ）の結晶構造は、何人かの研究者により、錯体中の金属配位を確認するためにＸ線回折を用いて報告された^{１７、３０}。本明細書で記載のＤＴＰＡ－Ｒ_２キレート化剤に対する金属配位は、材料特性の類似性のために、報告されたＭ（ＤＴＰＡ－ＢＡｍ_２）錯体と類似であり得る。

【0188】

Ｃｅ（ＤＴＰＡ－Ｒ_２）金属錯体を用いた２－ＤｉｓＰ。３種のＣｅ（ＤＴＰＡ－Ｒ_２）錯体のＰＳマイクロビーズ中への組み込み効率を、調査した。表２に記載されるように、等モル量のＣｅ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）、Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＢＡｍ_２）およびＣｅ（ＤＴＰＡ－ＡＬＡｍ_２）を、エタノールに溶解し、第２段階の一定分量として、それぞれ、Ｃｅ－１、Ｃｅ－２およびＣｅ－３ビーズ合成に導入した。これらの合成のそれぞれから、水中でそれらのコロイド状態の安定性を保持したコロイド的に安定なマイクロビーズを得た。Ｃｅ－１マイクロビーズの平均直径は、図２で示されるように、２．９μｍであり、狭い粒度分布（ＣＶ＝１．２％）を有した。Ｃｅ－２およびＣｅ－３マイクロビーズもまた、表３で要約されるように、均一のサイズ（ＣＶ＜１．５％）であったが、わずかにより小さい平均直径（それぞれ、ｄ＝２．１および２．５μｍ）を有し、おそらく、ＰＳの連鎖成長を抑制するベンジルおよびアリル基の連鎖移動効果によるものであろう^３１。

【0189】

反応中の金属イオン組み込みを、ＩＣＰ－ＭＳにより測定した。反応物中の総金属イオン含量を、Ｈ_２ＳＯ_４＋Ｈ_２Ｏ_２による試料の消化後に決定した。反応ストック中のマイクロビーズを、遠心沈降により分離した。上清中の金属含量も同様に、ＩＣＰ－ＭＳにより分析して、溶液中に残存する金属イオンを定量した。Ｌｉｕら、２０２０^１５により記載されるように、ビーズ合成の金属組み込み効率を、上清中の非組み込み金属含量と反応物中の総金属含量の間の差異に基づき計算した。このメタル組み込み効率は、ＰＳビーズ中へのＣｅ錯体組み込みを反映する。理由は、Ｃｅは、Ｃｅ－ＤＴＰＡ錯体として反応に供給され、３種全てのＣｅ錯体中のＣｅイオンは、それらの相対的に高い結合安定性のためにビーズ合成中にＤＴＰＡ誘導体とキレート化して残ると予測されるためである^２３。

【0190】

３種のマイクロビーズ合成のＣｅ組み込み効率を、表３に示す。Ｃｅ－１合成では、反応に添加されたＣｅ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）錯体の７４％が、ＰＳビーズに組み込まれた。しかし、９７％のＣｅ（ＤＴＰＡ－ＢＡｍ_２）およびＣｅ（ＤＴＰＡ－ＡＬＡｍ_２）が、反応後に溶液中に残存した。換言すれば、Ｃｅ－２およびＣｅ－３に添加された２．７％のＣｅ（ＤＴＰＡ－ＢＡｍ_２）および２．８％のＣｅ（ＤＴＰＡ－ＡＬＡｍ_２）錯体のみが、それぞれ組み込まれた。

【0191】

Ｃｅ含量の補足的測定として、Ｃｅ－１、Ｃｅ－２およびＣｅ－３マイクロビーズを、定量化標準として既知の量の^１４０Ｃｅを含む較正マイクロビーズを用いて、ビーズ毎基準でＭＣにより調査した。試料ビーズ中のＣｅ含量を、異なるマイクロビーズからのＭＣシグナル強度は同じ測定における金属含量に比例すると仮定して、試料ビーズと較正ビーズの間のシグナル強度を比較することにより評価した^１５。表３は、ＭＣにより測定されたこれら３種のバッチのマイクロビーズのＣｅ含量を要約する。

【0192】

ＭＣでは、Ｃｅ－１マイクロビーズは、ビーズ当り６０００カウントの強度中央値および６．２％のＲＣＶ（図１１Ａ参照）を有する、鋭く、強い^１４０Ｃｅシグナルを生成した（図１１参照）。Ｃｅ－１マイクロビーズ中のＣｅ含量を、ビーズ当り、５．４４ｘ１０^７個のＣｅイオンであると推定した（表３参照）。対照的に、Ｃｅ－２およびＣｅ－３マイクロビーズは、遙かに弱い^１４０Ｃｅシグナル強度を示した（それぞれ、図１１ＢおよびＣ）。Ｃｅ－２およびＣｅ－３マイクロビーズ試料についてのＣｅ含量は、１．６ｘ１０^６個および１．６ｘ１０^６個のＣｅイオン／ビーズで実質的に同一であった。

【0193】

ビーズ合成中の重合可能なＣｅ錯体の組み込み機序を確認するために、別のＣｅ錯体、Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２）を、スチレンと共重合できる官能基としてメタクリルアミドを採用して調製した。Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）の調製でのように、Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２）錯体を、ＤＴＰＡ二無水物をＤＭＳＯ中のＡＰＭＡｍと最初に反応させること、および次いでｐＨ５～６で水中にてＣｅ^３＋イオンをキレート化することにより、合成した。図８（ｃ）および図９（ｄ）中の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、それぞれ、Ｎａ_３（ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２）およびＣｅ（ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２）の構造を確証した。Ｃｅキレート化実験の間、Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２）は、Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）より親水性であるように見えた。理由は、Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２）は、エタノールの添加なしで、キレート化溶液中で完全に可溶であったためである。Ｃｅ－４マイクロビーズを、Ｃｅ－１、Ｃｅ－２およびＣｅ－３合成と類似の条件下でリガンドとして等量のＣｅ（ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２）錯体を用いて調製した。結果として、Ｃｅ－４マイクロビーズはまた、狭い粒度分布（ＣＶ＝１．３％）で２．９μｍの平均直径を有し、ビーズ当り４０００カウントでの強度中央値および５．７％のＲＣＶを有する、明るい^１４０Ｃｅシグナルを生成した（図１１Ｄ参照）。

【0194】

Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）およびＣｅ（ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２）の両錯体は、ビニルベンジルアミド／メタクリルアミドとスチレンの間の反応性共重合に起因して、ＤｉｓＰの間にＰＳビーズ中に効率的に組み込まれた。Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＢＡｍ_２）およびＣｅ（ＤＴＰＡ－ＡＬＡｍ_２）錯体の遙かに低い効率の組み込みは、ビーズ合成条件下での連鎖移動剤としてのベンジルアミド／アリルアミドとスチレンの間の低反応性に起因する。

【表3】

ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２キレート化剤を、他のランタニド金属イオンのＰＳマイクロビーズ中への組み込みについて評価した。

【0195】

Ｍ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）金属錯体を使用する金属コード化されたマイクロビーズの調製
４種の他の金属イオン（Ｙ^３＋、Ｅｕ^３＋、Ｈｏ^３＋およびＬｕ^３＋）を有するＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２の錯体を、調製した。これらの合成は、Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）について上で記載されたものに類似の方法を採用した。Ｙ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）、Ｅｕ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）、Ｈｏ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）およびＬｕ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを、図１０Ａ～Ｄにそれぞれ示す。Ｅｕ^３＋およびＨｏ^３＋は、常磁性ＮＭＲシフト試薬である。Ｅｕ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）およびＨｏ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）のＮＭＲスペクトルの化学シフトは、Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）のスペクトルに類似のシフトプロファイルを示す。対照的に、Ｙ^３＋およびＬｕ^３＋は、反磁性であり、図１０ＳおよびＤ中のＹ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）およびＬｕ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）のスペクトルは、シフト効果を示さない。これらのスペクトル中のビニルベンジル官能基のプロトンの化学シフト（５～８ｐｐｍ）は、キレート化剤のものに類似しているが、一方で脂肪族領域のＤＴＰＡのプロトンの化学シフト（１～４ｐｐｍ）は広がり、これはおそらく、金属キレート化に関連する異なるＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２異性体の相互転換によるものであろう^{３０、３２}。金属キレート化実験において、Ｈｏ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）およびＬｕ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）は、エタノール中でそれほど可溶でなかったが、水中ではＣｅ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）より可溶であったことに留意されたい。理論に束縛されることを意図するものではないが、この観察は、Ｈｏ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）およびＬｕ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）錯体の極性がＣｅ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）の極性より高く、おそらくＨｏおよびＬｕのＤＴＰＡキレート化剤に対するより強力な結合^２３が理由であることを示唆した。全ての金属錯体は、ビーズ合成中の第２段階の一定分量中で完全に溶解されることが好ましいことが、理解される。

【0196】

マイクロビーズ中のこれらの金属錯体の組み込みを調査するために、それぞれのこれらの異なるＭ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）錯体を用いて、表２に記載されるように、それぞれの合成において、単一金属元素（それぞれ、Ｙ、Ｅｕ、ＨｏおよびＬｕ）を含む一連のマイクロビーズ（Ｙ－１、Ｅｕ－１、Ｈｏ－１およびＬｕ－１）を調製した。Ｙ－１、Ｅｕ－１、Ｈｏ－１およびＬｕ－１の合成から得られたマイクロビーズは、均一であり、類似のサイズであった（表４参照）。これらのマイクロビーズからのコード化元素のＭＣシグナル強度は、図１２に示すように、強力で、狭い分布であった。同じ測定における試料マイクロビーズおよび較正ビーズからのＭＣシグナル強度を比較することにより評価された金属含量は、表４で要約されるように、多数の元素が各マイクロビーズ中に組み込まれたことを確証した。上述のように評価されたこれらのビーズ合成での金属の組み込み効率は、全て６５～７２％の範囲にあり、より大きなイオン半径を有するランタニド金属イオンについて、この範囲のわずかな増加があった。（図３Ａ参照）。

【0197】

５元素コード化されたマイクロビーズ（５Ｅ１）のバッチを、ＤｉｓＰ反応のための第２段階の一定分量として５ｍｇの各Ｍ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）錯体（Ｍ＝Ｙ、Ｃｅ、Ｅｕ、ＨｏおよびＬｕ）を１５ｇのエタノール中に溶解することにより合成した。異なる元素を一度の反応で混合する場合の異なる元素間の組み込み妨害を調査するために、ビーズ合成での個別の金属の組み込み効率を、ＩＣＰ－ＭＳにより特徴づけた。

【0198】

５Ｅ１マイクロビーズの平均直径は２．７μｍであり、狭い粒度分布（ＣＶ＝１．２％）を有した。図３Ａで示されるこれらの５種の金属の組み込み効率は、５Ｅ１反応に導入された６３～７０％の金属錯体がビーズ中に組み込まれたことを示す。５Ｅ１ビーズ反応に添加された異なる金属イオンは、類似の効率でマイクロビーズ中に組み込まれた。５Ｅ１ビーズ中のコード化同位体のＭＣシグナル強度を、較正標準としての７元素コード化マイクロビーズ^１５と一緒に測定した。図４Ａは、５Ｅ１ビーズのＭＣシグナル強度中央値を要約し、エラーバーは、シグナル強度のＲＳＤを表す。^１４０Ｃｅ、^{１５１、１５３}Ｅｕ、^１６５Ｈｏおよび^１７５Ｌｕのシグナル強度は、狭いシグナル分布（ＲＣＶ＜１０％）を有する最適ＭＣ感度範囲（＞３００カウント／ビーズ）であった。５Ｅ１ビーズからの^８９Ｙシグナル強度は、ＭＣ^１４中の８９ａｍｕチャネルの低い伝送係数のため、１００カウント未満／ビーズであった。較正ビーズからのＭＣシグナル強度を用いて、５Ｅ１ビーズ当りの金属含量を計算した。結果を図４Ｂに示す。５Ｅ１ビーズ中のＣｅ、Ｅｕ、ＨｏおよびＬｕは、ビーズ当り、３．４～４．０ｘ１０^６個のイオンの類似の範囲内であった。Ｙ含量は、５ｍｇのＹ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）中に５ｍｇの他のＬｎ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）試料中より多いＹ原子が存在する結果として、わずかにより高い（５．７ｘ１０^６個のイオン／ビーズ）。

【0199】

マイクロビーズ合成における金属イオン組み込みの制御
図３Ａは、リガンドとしてＭ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）金属錯体を用いる表２に記載のビーズ合成バッチ（Ｙ－１、Ｃｅ－１、Ｅｕ－１、Ｈｏ－１、Ｌｕ－１および５Ｅ１）中の金属組み込み効率結果を要約する。図３のｘ軸は、組み込まれた金属イオンのイオン半径である。ビーズのこれらのバッチにおける異なる金属の組み込み効率は、これらのビーズ合成において金属供給量が変化したにも関わらず、６２～７４％の非常に狭い範囲で重なり合った。４－ビニルベンジルアミド基の反応性は、キレート化剤に結合された金属イオンとは無関係であるように見える。結果として、ビーズ合成における金属組み込み効率は、リガンドとしてＭ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）金属錯体が採用された場合、一貫していた。

【0200】

Ｍ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）錯体の供給量と得られたマイクロビーズの金属含量の間の関係を、調査した。図５で、マイクロビーズ中で検出された金属含量が、塗りつぶした記号で合成に供給された金属錯体に対しプロットされている。マイクロビーズサイズにおける軽微なバッチ毎の変化を考慮して、図５のｙ軸として示されるマイクロビーズ中の金属濃度として、各マイクロビーズ中の金属含量を、ビーズの体積により除算した。図５の塗りつぶしたデータポイントは、ビーズ合成における金属錯体の供給量に対するマイクロビーズ中の金属含量の線形依存性を示す。これらのデータの線形回帰モデルフィット性は、各反応で導入されるＭ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）の量を変えることにより、金属コード化マイクロビーズ中の金属含量のレベルを設計するための簡便なガイドとして機能する。この状況は、金属含有ＰＳマイクロビーズ調製の手段としての金属塩＋アクリル酸の使用と比較して、実験計画および実行における顕著な改善である。この新しい方法を用いて、ＭＣビーズ系バイオアッセイのための分類子ビーズとして個別に特定され得る、種々のレベルの金属含量を有する金属コード化マイクロビーズのライブラリーを調製できる。

【0201】

異なるレベルの金属含量を有する一連の金属コード化された分類子マイクロビーズの調製
最大変動まで分類子ビーズのライブラリーを調製するために、種々の金属含量のマイクロビーズがＭＣで個別に分離され得るように、精密に制御された金属含量を有するマイクロビーズ中に複数金属同位体をコード化しなければならない。実施例２で記載されるようなベースライン分離を有する３種の別々の金属イオンレベルを含む分類子ビーズの合成を可能にする、一連の反応条件を提供する。３倍異なる強度レベルを、選択した。しかし、他の強度レベルが選択されてよい。例えば、２倍または２．５倍異なる強度レベルが選択されてよい。

【0202】

Ｙ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）（７０μｍｏｌ）は、おそらくその高い極性のために、エタノール（１５ｇ）中に溶解するためにより長い時間を要する。従って、Ｙイオン以外のイオンを、これらの反応で使用した。しかし、Ｙは本開示のマイクロビーズのために好適な金属であり得ることが理解される。例えば、Ｙは、異なる金属キレートモノマーと共に使用できる。例えば、Ｙは、異なる濃度で使用できる。Ｃｅ、Ｅｕ、Ｈｏ、およびＬｕ含有４元素ＰＳマイクロビーズの３種の試料を、３倍異なる濃度レベルで合成した。これらの試料は、表２に示すように、４Ｅ１、４Ｅ２および４Ｅ３と表記される。目的は、７元素コード化マイクロビーズ^１５のＭＣ強度レベルに対して、それぞれ、０．２、０．６および１．８倍である^１４０Ｃｅ、^１５１Ｅｕ、^１５３Ｅｕ、^１６５Ｈｏおよび^１７５ＬｕのＭＣシグナル強度レベルを生成するマイクロビーズを得ることであった。

【0203】

４Ｅ１、４Ｅ２および４Ｅ３の合成から得られたマイクロビーズは、反応ストック中でコロイド的に安定であり、凝塊を含まなかった。沈降－再分散による洗浄後にこれらのマイクロビーズの平均直径は、表４に示すように、２．８～３．０μｍの範囲であり、狭い粒度分布（ＣＶ＜１．５％）を有した。図３Ｂに示すように、これら３種のビーズ合成における異なる金属イオンの組み込み効率は、一貫しており、図３Ａに記載される合成で観察されたレベルに近かった。

【0204】

マイクロビーズのこれらの３種のバッチからの５種のコード化されたランタニド同位体のＭＣシグナル強度を、元素によりソートしたパネルで図６に示す。４Ｅ３ビーズからの^１４０Ｃｅ、^１５１Ｅｕ、^１５３Ｅｕ、^１６５Ｈｏおよび^１７５Ｌｕの平均ＭＣシグナル強度は、ビーズのこれらの３種のバッチ中で最も高く、類似のレベルで、それぞれ、２５６０、２０５３、２５９０、２５４０および２５３０カウント／ビーズあった。４Ｅ３ビーズのシグナル強度分布は、狭く、９％未満のＲＣＶ値を有し、ビーズ中のコード化されたランタニド元素の狭い分布を示した。４Ｅ１および４Ｅ２ビーズもまた、シャープで狭いＭＣシグナル分布を生成し、すべてのコード化同位体で、それぞれ、約２００および７００カウント／ビーズの強度を有した。図６のヒストグラムは、マイクロビーズのこれらの３種のバッチの間の明確なベースライン分離を示す。ビーズのこれらの３種のバッチのシグナル強度は、４Ｅ１から４Ｅ３ビーズへ約３倍増大した。

【0205】

ＭＣシグナル強度を７元素較正ビーズのシグナル強度と比較することにより、これらの３種のマイクロビーズ中の金属含量を、評価した。値を、図５に示す白抜き記号としてビーズ合成における金属供給量に対しプロットした。これらの白抜き記号データ点は、図５に示される以前のビーズ合成から観察された直線の傾向線に従った。

【0206】

これらの３種のマイクロビーズの合成は、ビーズ合成において共重合可能な金属錯体としてＭ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）を用いる３種の異なる濃度レベルで５種のタイプのランタニド同位体でコード化されたビーズのライブラリーの調製の利便性を実証する例として役立つ。式１により、図６で示されるこのビーズライブラリーの最大変動は、１０２３個である。

【0207】

７元素ビーズの合成に対しＬｉｕ ２０２０で以前に使用された方法と比較して、異なる金属間にわたる組み込み効率は、より一貫していることが示された。Ｌｉｕ ２０２０では、組み込み効率は異なる金属間で劇的に変化し、マイクロビーズの制御された標識を困難にした。例えば、Ｌｉｕ ２０２０では、Ｌｕ^３＋は、７元素全ての中で約５０％の最大の組み込みを有し、一方でＣｅ^３＋は、最小の効率を有した。反応混合物に添加されたＣｅ^３＋の約１５％のみが、ビーズに組み込まれた。ランタニドの組み込み効率は一般に、より小さいイオンはより大きい組み込み効率を有するという傾向を示した。

【0208】

本明細書で示されるように、構造Ｍ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）の金属錯体は、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）の存在下でエタノール中の２段階分散重合反応においてスチレンと効率的に共重合する。この反応は、２μｍのオーダーの直径および非常に狭い粒度分布（ＣＶ≒１～２％）を有するＰＳマイクロビーズをもたらす。金属錯体の組み込み効率は、６０～７０％のオーダーであり、より大きなイオン半径を有するランタニド金属イオンについては、この範囲はわずかに増加する。この効率は、試験した濃度の範囲では、反応中に導入された金属錯体の量に無関係であるように見える。この反応の特徴は、ＰＳマイクロビーズの試料について特定の金属含量を調節可能にする。これは、例えば実施例６で記載される、ビーズ系ＭＣアッセイのためのＭＣの較正ビーズおよび分類子ビーズの両方の調製のための有用な戦略である。その表面に結合されたヤギ抗マウス抗体を有するＥｕ標識ビーズは、Ｌｕ標識マウスＩｇＧの検出において効果的であった。

【0209】

実施例５
マイクロビーズからの金属漏出
水性媒体への金属イオンの浸出に関して、実施例１および２に従って調製されたマイクロビーズの安定性を、いくつかの実験条件下で評価した。Ｍ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）を用いて２段階ＤｉｓＰにより調製した試料４Ｅ３ビーズを、この試験に使用した。洗浄したマイクロビーズ（０．５％固体）の試料を、１％のＰＶＰも含んだ３０ｍＬの３種の異なる緩衝液：酢酸ナトリウム（５０ｍＭ、ｐＨ３．０）、酢酸アンモニウム（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）、炭酸ナトリウム（２００ｍＭ、ｐＨ１０．５）中に懸濁した。試料を、４℃で貯蔵した。種々の時間間隔で、各試料を、最初にボルテックスし、その後２ｍＬの一定分量を、採取した。これらの一定分量を、遠心分離し、上清を収集して、ＩＣＰ－ＭＳにより金属含量を測定した。ビーズから浸出した金属の割合を、ビーズ分散液中の金属含量と比較して、上清中の金属含量に基づきＩＣＰ－ＭＳにより測定した。並行して、２段階ＤｉｓＰ ＡＡ手法により調製したマイクロビーズのバッチも、同じ実験条件に供した。

【0210】

貯蔵中および典型的適用条件中の金属浸出に対するＭ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）コード化されたビーズ（４Ｅ３）のバッチの安定性を、試験した。これらのＤＴＰＡビーズは、図１３に記載されるように、３～１０の範囲のｐＨ値の緩衝液中での貯蔵時の金属イオンの損失（＜１．５％）に対し安定であった。

【0211】

組み込まれた金属の浸出安定性
ＭＣに使用される金属コード化マイクロビーズは、貯蔵中および典型的な適用条件下で金属イオン浸出に対して安定でなければならない。０．５重量％のこれらのマイクロビーズの試料を、３種の緩衝水溶液（酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０；酢酸アンモニウム、ｐＨ７．０；炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．５）中に分散させ、４℃で貯蔵した。並行して、別のセットのマイクロビーズ試料を、同じ緩衝液中で試験したが、これらのビーズを、Ａｂｄｅｌｒａｈｍａｎら、２００９^９で報告されたように、金属イオンを組み込むためのリガンドとしてアクリル酸（ＡＡ）使用する２段階ＤｉｓＰにより調製した。４Ｅ３ビーズからの各元素の漏出を、ＩＣＰ－ＭＳにより時間の関数として、これらの溶液中で監視した。
１重量％のＰＶＰの存在下の非緩衝水中で貯蔵されたＭ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）コード化マイクロビーズからの金属浸出もまた、監視した。

【0212】

図１３は、金属浸出実験の結果を示し、塗りつぶした記号は、ＤＴＰＡビーズ（４Ｅ３）を指し、白抜き記号は、比較としてのＡＡビーズを指す。あらゆる組み込まれた元素の極めて小さい検出可能な漏出（＜０．０６％）が、図１３Ｂに記載されるように、１００日を超える期間にｐＨ７緩衝液中の両方のマイクロビーズから観察された。４℃でＰＶＰ溶液中に貯蔵された４Ｅ３ ＤＴＰＡビーズの場合、金属元素のごくわずかな放出（最大０．３％）が１００日にわたり検出され、一方でＡＡビーズは、同じ条件下での貯蔵時に、わずかに多い金属イオン（Ｃｅ^３＋で約１．３％）を失った。酸性（ｐＨ３）および塩基性（ｐＨ１０．５）の緩衝液中で熟成されたマイクロビーズは、より高いレベルのイオン喪失を示した。ここで元素のイオンの漏出は、２０日でプラトー値に到達し、次の８０日間にわたりさらなる損失はなかった。ＤＴＰＡビーズからのＥｕ^３＋、Ｈｏ^３＋およびＬｕ^３＋の損失は、ｐＨ３緩衝液中では小さかった（＜０．２％）が、一方でそれは、Ｃｅ^３＋でより高く（約１．５％）、おそらくＣｅ^３＋とＤＴＰＡキレート化剤の間のより弱い結合安定性によると思われる。概して、ＤＴＰＡビーズは、４種の試験条件下でより少ない金属イオン漏出およびより強力な安定性を示す。

【表4】

【0213】

実施例６
分類子ビーズ
表面修飾および抗体結合
実施例３で記載されるヤギ抗マウス（ＧＡＭ）二次抗体（Ａｂ）で機能化されたＭ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）コード化ビーズを、ＭＣにより^１７５Ｌｕ標識Ａｂレポーターを用いてＧＡＭ修飾Ｅｕ－１マイクロビーズ間の特異的結合に関し調査した。

【0214】

マスサイトメトリーによる分類子ビーズとレポーター間の特異的結合の試験
特異的結合実験のために、分類子としてＧＡＭ修飾マイクロビーズ（Ｅｕ－１／ＧＡＭ）を最初に、ＢＳＡブロッキング溶液（５０μＬ、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ）中に分散させた。３０分のインキュベーション後に、レポーターとして^１７５Ｌｕ標識マウスＩｇＧ（６．２５μｇ）を含む細胞染色溶液（５０μＬ）を、Ｅｕ－１／ＧＡＭ分散液に導入した。分類子およびレポーターの分散液を、２時間インキュベートし、続いて細胞取得溶液（１００μＬ）で２サイクルの遠心洗浄を行って非結合レポーターを除去した。分類子ビーズ上へのレポーターの結合を、ＭＣにより調べた。非特異的結合を試験するために、ＮＡｖ修飾Ｅｕ－１ビーズ（ＧＡＭの結合なし）を、同じ結合実験条件に陰性対照として採用し、またＭＣにより試験した。

【0215】

図１４は、マイクロビーズ試料の表面を機能化し、その後マイクロビーズ表面にＡｂを付着させるために使用される方策を示す。実施例３に記載されるように、マイクロビーズを最初に、薄いシリカシェルでコートし、続いてＡｂｄｅｌｒａｈｍａｎ^３３により報告されるように、２段階シリカゾルゲル反応でアミノ基を導入した。ＴＥＯＳおよびＡＰＴＥＳを、シリカコーティング法に採用した。約１０ｎｍ厚みのシリカシェルおよび表面アミノ基を有するＮＨ_２修飾Ｅｕ－１マイクロビーズを、得た。マイクロビーズ表面上のアミノ基を次に、ＤＭＳＯ中で無水コハク酸と反応させることにより、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）に変換した。カルボキシレート基は、生物親和薬剤を付着するための官能基として機能し、マイクロビーズ表面へのレポーターの非特異的結合を低減することを支援する。ニュートラアビジン（ＮＡｖ）を、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングによりマイクロビーズ表面上のＣＯＯＨ基に共有的にコンジュゲートした。最終的に、ビオチン化ＧＡＭを、強力なビオチン－アビジン親和性によりＮＡｖ修飾マイクロビーズ表面に付着した。

【0216】

分類子としてのＧＡＭ修飾Ｅｕ－１マイクロビーズの官能性を検証するために、レポーターとして^１７５Ｌｕ標識マウスＩｇＧを選択し、Ｅｕ－１／ＧＡＭビーズとインキュベートした。二次Ａｂとして、ＧＡＭは、図７（ａ）に示すように、レポーター中のマウスＩｇＧに対する特異的に高い反応性を有する。抗原認識を試験するために、ＧＡＭ修飾マイクロビーズ（Ｅｕ－１／ＧＡＭ）の懸濁液を最初に、ウシ血清アルブミン含有ブロッキング溶液（５０μＬ、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ）中に分散させた。３０分のインキュベーション後、レポーターとして^１７５Ｌｕ標識マウスＩｇＧ（６．２５μｇ）を含む、細胞染色溶液（５０μＬ）を、導入し、２３℃で２時間インキュベートし、続いて細胞取得溶液（１００μＬ）で２サイクルの遠心洗浄を行って非結合レポーターを除去した。試料を、ＭＣにより調べた。図７Ｂに示すように、４６０カウント／ビーズ（ＲＣＶ＝１５％）の強度を有するＥｕ－１／ＧＡＭマイクロビーズ上のシャープな^１７５Ｌｕシグナルピークは、ＧＡＭ修飾マイクロビーズとレポーターの間の強力な特異的結合を示す。対照的に、ＧＡＭ結合なしのＥｕ－１／ＮＡｖマイクロビーズの試料について得られたシグナルは、ゼロへと統計的に最小化されたシグナルを与えた。

【0217】

実施例７
メタクリルアミド誘導体Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２）を用いるＣｅ／ＤＴＰＡによるコード化されたマイクロビーズ
メタクリルアミドで機能化されたＤＴＰＡキレート化剤を調製するために、Ｎ－（３－アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡｍ）（２ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＳＯ（５．０ｍＬ）に溶解し、続いてトリエチルアミン（ＴＥＡ、５．５ｍｍｏｌ）を加えて、アミン塩酸塩を脱プロトン化した。ＤＴＰＡ二無水物（１ｍｍｏｌ）を次に、ＡＰＭＡｍ－ＤＭＳＯ溶液に導入し、反応系を、室温で一晩撹拌した。エタノール中のＮａＯＨ（１Ｍ、３当量）を、反応系に加えて、ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２の三ナトリウム塩を形成し、続いてシリンジフィルター（０．２μｍ）で濾過した。濾液を、４５ｍＬのアセトンで希釈して、生成物を析出させた。析出したＤＴＰＡ塩を次に、沈降により収集し、エタノールに溶解した。３サイクルの溶解－析出－沈降を実施して、生成物を精製した。生成物を、減圧下にて室温で一晩乾燥して、残留溶媒を除去した。^１Ｈ－ＮＭＲを用いて生成物の構造を確認した。

【0218】

ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２のＣｅ錯体を調製するために、ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２（０．３ｍｍｏｌ）およびＣｅＣｌ_３・７Ｈ_２Ｏ（０．３ｍｍｏｌ）を、それぞれ、５ｍＬおよび１ｍＬのＤＩ・Ｈ_２Ｏに別々に溶解した。Ｃｅ溶液を次に、ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２溶液に加え、その間、ｐＨを監視し、０．０１ＭのＮａＯＨ溶液で、６．０に調節した。混合物を、室温で３時間撹拌した。Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２）錯体を、アセトンによる析出および沈降により単離した。析出物をその後、エタノール中に溶解し、さらなる精製のためにアセトンで２度目の析出を行なった。最終生成物もまた、^１Ｈ－ＮＭＲにより特徴づけた。

【0219】

典型的２段階分散重合を用いて、Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２）錯体でコード化されたポリスチレン（ＰＳ）マイクロビーズを調製した。ＰＶＰ－５５（１．００ｇ）、ＡＩＢＮ（０．２５ｇ）、トリトンＸ３０５（０．３５ｇ）を、フラスコに加え、スチレン（６．２５ｇ）およびエタノール（１８．７５ｇ）の混合物中で完全に溶解した。溶液を、フラスコ中で密閉し、オーバーヘッドミキサーで撹拌した。室温で３０分間の窒素パージ後に、重合反応を、フラスコを７０℃の湯浴中に浸漬することにより開始した。第２段階の一定分量として、エタノール（１５．０ｇ）中のＣｅ（ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２）錯体（５４ｍｇ、約７０μｍｏｌ）の温溶液を、反応の開始の２時間後に反応系中に注入した。反応を、開始後２４時間に停止した。安定な凝塊不含マイクロビーズ分散液を、得て、４℃で貯蔵した。

【0220】

この実施例で得た粒子は、凝塊を含まず、狭い粒度分布（ＣＶ＝１．３％）および２．９μｍの平均直径を有した。マスサイトメトリーにより測定したマイクロビーズ中のＣｅ含量は、約２．７ｘ１０^７イオン／ビーズであった。ＩＣＰ－ＭＳにより評価して、反応において加えたＣｅの４９％が、反応停止後に溶液中に残った。従って、マイクロビーズ中のＣｅ（ＤＴＰＡ－ＡｍＰＭＡｍ_２）錯体の組み込み効率は、５１％であると推定された。

【0221】

類似の方法が、他のＬｎイオンに対し使用されてよい。
スキーム２ ２段階分散重合のためのＤＴＰＡ誘導体－金属錯体の合成。金属キレート剤ＤＴＰＡを、ＤＭＳＯ中でＤＴＰＡ無水物を官能性分子含有アミンと反応させることにより機能化した。異なるタイプの金属イオンを、ｐＨ５～６でＤＴＰＡ誘導体上にロードした。

【化14】

Ｍ＝Ｙ、Ｃｅ、Ｅｕ、ＨｏおよびＬｕなどのＬｎイオン

【0222】

実施例８
マイクロビーズ－核酸のバイオコンジュゲーション
核酸またはオリゴヌクレオチドは当該技術分野で利用できる方法を用いてマイクロビーズにコンジュゲートできることが、理解される。例えば、３’－ヒドロキシル基が、機能化マイクロビーズ上のカルボン酸（コハク酸など）官能基にコンジュゲートされ得る。例えば、ヌクレオチドのホスホラミダイト誘導体が、コンジュゲーションのために使用され得る。オリゴヌクレオチドは、（例えば、本明細書で記載のマイクロビーズまたは生体分子に対する）コンジュゲーションのために機能化されてよく、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から、市販品として容易に入手可能である。例えば、ビオチン（例えば、デスチオビオチン（ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ））、アミン、アルキン修飾剤、チオール修飾剤、アクリダイト（Ａｃｒｙｄｉｔｅ）、またはアジドなどのＮＨＳエステルで機能化されたオリゴヌクレオチドは、本明細書でさらに記載されるように、コンジュゲートされ得る。

【0223】

実施例９ ＭＣによる多重化ビーズ系アッセイ
実験
材料
この実施例で採用された金属コード化されたマイクロビーズの合成およびキャラクタリゼーションを、実施例１０で示す。この実施例で使用された緩衝液は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入された。抗体（Ａｂ）、ビオチン化Ａｂ、およびサイトカイン標準は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄおよびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入された（表５参照）。ストレプトアビジン結合金ナノ粒子（ＡｕＮＰ、１０ｎｍ、１０ＯＤ）は、Ａｂｃａｍから購入された。凍結ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（ＣＴＬ，ＬＰ－１８８ ＨＨＵ２０１３０７１５）から購入された。ＮａｎｏＧｏｌｄ（登録商標）－ストレプトアビジン（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅ）、ＥＱ（商標）４元素較正ビーズ（ＥＱ４）およびＣｅｌｌ－ＩＤ（商標）Ｐｄバーコーディングキットは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃａｎａｄａにより厚意で提供された。

【表5】

【0224】

一連の金属コード化された分類子ビーズの調製
ＭＣでのビーズ系アッセイを開発するために、ＭＣにより個別に特定できる種々の金属イオンで標識されたマイクロビーズのライブラリーを、調製した。２段階分散重合（ＤｉｓＰ）反応で構造Ｍ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）の重合可能な金属錯体を導入することによる、制御されたレベルの金属イオンを有するマイクロビーズをコード化する方法が、本明細書で記載される。金属コード化された分類子ビーズの製剤および処理の実験詳細は、実施例１０で見出される。１１種の２元金属コード化された３μｍのポリスチレン（ＰＳ）マイクロビーズのパネルを、実施例１０に記載される本開示の方法を採用して調製した。

【0225】

免疫アッセイにおいて標的分析物を捕捉できる分類子ビーズを調製するために、各タイプの金属コード化されたビーズを、サイトカイン分析物に特異的なＡｂの１種で修飾した。

【0226】

サイトカイン分泌のためのＰＢＭＣの刺激
凍結された市販ヒトＰＢＭＣ試料（ＣＴＬ Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）を、解凍し、０．５ｍＬのＣＴＬ抗凝集洗浄サプリメント（２０ｘ）を含有する予め温めたＲＰＭＩ無血清培地（１０ｍＬ）に加えた。試料中のＰＢＭＣを、遠心分離（８分、３００ｒｐｍ）により遠心沈降させた。上清を、遠心分離後に吸引した。ＰＢＭＣをその後、温かい血清含有完全ＲＰＭＩ（１０ｍＬ）で再懸濁した。ＲＰＭＩ（４．８ｍＬ、４．８ｘ１０^６個細胞）中のこのＰＢＭＣ懸濁液の一定分量を、ＰＳチューブに移し、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ、２５ｎｍｏｌ）およびイオノマイシン（１００ｎｍｏｌ）を含むＰＢＳ溶液（１００μＬ）で刺激した。刺激剤を含む試料を、５％ＣＯ_２下、３７℃で５時間インキュベートした。刺激されたＰＢＭＣ懸濁液を次に、遠心分離して細胞を沈降させた。上清を、刺激された試料として収集し、ビーズ系アッセイの前に－８０℃で貯蔵した。ＲＰＭＩ培地中のＰＢＭＣ懸濁液の別の一定分量を、刺激剤の添加を除き（ＰＢＳのみ）並行して同じ条件下で処理した。非刺激試料を、この実験では対照として収集した。

【0227】

マスサイトメトリーのためのビーズ系サンドイッチ免疫アッセイ法
アッセイ条件を最適化するために、いくつかの多重化ビーズ系アッセイを、標準試料として既知の濃度のサイトカインおよびケモカインの混合物を含む一連の溶液を用いて実施した。これらの混合物を、ＭＣにより分析して、検量線をプロットした。図１６は、この試験で開発したアッセイ手順を示す。

【0228】

一連の４プレックスアッセイを実施して、１０種の標準試料中のＩＬ－４、ＩＬ－６、ＴＮＦαおよびＩＦＮγを分析した。これらの実験では、４種の捕捉Ａｂコート金属コード化分類子マイクロビーズを、ＢＳＡ溶液中にてほぼ等しい数（ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ）で最初に混合した。分類子ビーズ分散液を次に、９６ウェルフィルタープレート（フィルターカットオフ：０．４５μｍ）の１０個のウェルに移した。分散液（５０μＬ）中に約２百万個のビーズを含む各ウェルは、１種の標準試料を分析できる。０、０．３１、１．２２、４．８８、１９．５、７８．１、３１３、１２５０、５０００、２００００ｐｇ／ｍＬの４種の分析物からなる一連の１０種の標準溶液（各５０μＬ）を、それぞれ、各ウェルに加えた。各ウェル中の標準溶液および分類子ビーズの混合物を、ピペットを用いて最初に撹拌し、その後室温でマイクロプレート震盪機（１２００ｒｐｍで３０秒、その後９００ｒｐｍで２時間）上でインキュベートした。インキュベーション後に、混合物中の溶液を、ウェルの底部で組み込み型フィルターを通す減圧濾過により除去した。それらの表面上に捕捉された分析物を有する分類子ビーズを、洗浄緩衝液（２００μＬ、ＰＢＳ中の０．０２５％ツイーン（登録商標）２０）を用いる２回の再分散－濾過サイクルにより洗浄して、存在する可能性のある非捕捉分析物を除去した。洗浄緩衝液を濾過によりウェルから除去すると、４種のビオチン化Ａｂ（各Ａｂに対し、２．５μｇ／ｍＬ）を含む検出Ａｂカクテル（１００μＬ、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ）を、各ウェルに移した。分類子ビーズを、ピペットによる撹拌により検出Ａｂで再分散した。分類子ビーズと検出Ａｂの混合物を、マイクロプレート震盪機（９００ｒｐｍ）上で室温にて１時間インキュベートした。インキュベーション後に、混合物を、濾過し、洗浄緩衝液による２回の再分散－濾過サイクルにより洗浄して、分類子ビーズ上の非結合検出Ａｂを除去した。フィルター上の分類子ビーズを次に、レポーターとしてのストレプトアビジン－コンジュゲート金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）の分散液（１００μＬ）で再分散させた。レポーター分散液を、０．５％ＢＳＡ緩衝液で供給業者からのＡｕＮＰ分散液を希釈する（例えば、２００倍）ことにより調製した。分類子ビーズとＡｕＮＰレポーターの混合物を、震盪機（９００ｒｐｍ）上で１時間インキュベートし、洗浄溶液による２回の、およびＰＢＳ緩衝液（１００μＬ）による２回の濾過－再分散サイクルにより洗浄した。１回のＭＣ実験で多数のアッセイを測定するために、各ウェル中のアッセイ試料（１００μＬ）を、ユニークなパラジウムバーコーディング溶液（４０μＬ、Ｃｅｌｌ－ＩＤ（商標）Ｐｄバーコーディングキット中のストック溶液の３ｘ希釈）で染色した。バーコーディング染色反応系を、攪拌しながら３０分間インキュベートし、０．５％のＢＳＡ溶液（２００μＬ）による２回の、および水（１００μＬ）による２回の濾過－再分散サイクルによりクエンチした。合計１０種のバーコード化されたアッセイ試料を、１つの試験管中で混合し、較正標準としてＥＱ４ビーズを用いてＭＣにより試験した。

【0229】

未知の分析物濃度の試料の典型的マルチプレックスアッセイにおいて、標的分析物を捕捉できる異なるタイプの金属コード化分類子ビーズを、ＢＳＡ溶液中で同数で最初に混合し、その後９６ウェルフィルタープレートに移した。各ウェル中で、分類子ビーズ分散液（５０μＬ）は、ウェルに一定分量（５０μＬ）の試料溶液を加えることにより１種の未知の試料を分析できる。アッセイをその後、標準試料の上のアッセイで記載されるものと類似の手順でインキュベートし、洗浄し、検出Ａｂおよび検出ＡｕＮＰレポーターにより染色した。

【0230】

計測装置
マスサイトメトリー（ＭＣ）。マイクロビーズ試料を、マスサイトメトリー（Ｈｅｌｉｏｓ（商標）ＣｙＴＯＦ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍ，Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）によりビーズ毎に特徴付けた。典型的ＭＣ測定では、バーコード化免疫アッセイ法試料および内部標準としてのＥＱ４ビーズを、試験チューブ中にプールし、３０μＬ／分の速度でＭＣシステム中に導入した。シグナル取得後に、ＭＣシグナルを、ＥＱ４ビーズからのシグナルを用いて正規化し、脱バーコード化して異なるアッセイからの結果を分離した。１つのアッセイ試料のＭＣ結果を分析するために、アッセイに含まれた全ての分類子ビーズのシングレットを、最初に特定し、^１４０Ｃｅ－^１４２Ｃｅドットプロットでゲートした。各タイプの分類子ビーズをその後、それらの金属コード化のシグネチャーシグナルに基づきゲートした。レポーター、例えばＡｕＮＰの^１９７Ａｕのシグナル強度中央値を、結果として報告する。

【0231】

結果
ＭＣにおいて多重化ビーズ系免疫アッセイ法が、開発された。金属コード化されたマイクロビーズが、免疫アッセイ法のための固体担体として、および金（Ａｕ）ＮＰが、レポーターとして採用された。各免疫アッセイ法の捕捉Ａｂは、マイクロビーズセットの１つに結合され、それらのそれぞれは、均一で、別々の重金属同位体含量を有するマイクロビーズから構成された。捕捉Ａｂと結合されると、分類子としての異なるセットからのマイクロビーズは、多重化アッセイのために一緒にプールされ、データ取得後に分離され得る。データは、ＭＣで取得され、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアにより解析された（実験計画については、図１６参照）。免疫アッセイ法は、各マイクロビーズの表面に結合された分析物の量に比例する、Ａｕ ＮＰレポーターの可変性の^１９７Ａｕシグナル強度をもたらした。ＭＣは各マイクロビーズ中の異なる重金属同位体の量を定量化するので、マイクロビーズのプールは、各ビーズセットに対するＮＰレポーターの^１９７Ａｕシグナル強度中央値を有する個別のビーズセットへと分離され得る。この特徴のために、多くのアッセイが、同時に実施され得、１回の測定で複数の分析物の多重定量化を可能にする。加えて、試料中の分析物の濃度は、内部標準からの外挿により決定され得る。

【0232】

分散重合による金属コード化された分類子ビーズの合成
合成を、０または約１０００（±２０％）カウント／ビーズの強度レベルを有する５種のタイプのランタニド金属イオン（Ｌａ^３＋、Ｐｒ^３＋、Ｔｂ^３＋、Ｈｏ^３＋、およびＴｍ^３＋）の組み込みを変化させることによる３２タイプ（２^５＝３２）の２元コード化される分類子マイクロビーズについて想定した。加えて、Ｃｅ^３＋イオンを、類似のレベルでそれぞれのビーズ中に組み込むことができる。セリウム同位体^１４０Ｃｅおよび^１４２Ｃｅは、ＭＣ結果の分類子シグナルのゲーティングの便宜のためのマイクロビーズ識別子として機能し得る。示したように、ビーズ系アッセイのための一連の１１種の２元金属コード化された３μｍポリスチレン（ＰＳ）マイクロビーズを、本明細書の実施例４で記載のビーズ合成プロトコルに従い一連の２段階分散重合（ＤｉｓＰ）により合成した。

【0233】

ビーズ合成およびキャラクタリゼーションを、実施例１０で記載する。ビーズ試料Ｃ－１（表６参照）の走査電子顕微鏡像を、図２２のパネル（ａ）に示す。それは、これらのマイクロビーズが均一であり、３．０μｍの平均直径および１％のＣＶを有することを示す。コード化された同位体のＭＣシグナルの強度レベル中央値は、１０００～１２００カウント／ビーズの範囲であった。表は、調製されたビーズ、それらの平均直径（およびＣＶ値）ならびにＭＣ検出での標識パターンおよびシグナル強度の要約を提供する。これらの１１タイプのマイクロビーズは、均一（ＣＶ 約１％）であり、２．８～３．０μｍの範囲の平均直径を有する小さいサイズを共有する。抗体結合のために、ビーズを、抗体でコートし、それぞれの分類子ビーズに付着されたＡｂを、表に列挙する。

【表6】

【0234】

加えて、これらのマイクロビーズ中の組み込まれた金属イオンは、８００～１２００カウント／ビーズの類似の強度レベルでＭＣシグナルを生成した。全てのマイクロビーズ（Ｃ１～Ｃ１１）はＭＣで類似のレベルでＣｅシグナルを生成するＣｅ^３＋を保持したので、全てのビーズの混合物を、一回のＭＣ測定で分析し、^１４０Ｃｅ－^１４２Ｃｅドットプロットから１つのゲーティングで１１タイプのマイクロビーズのシングレットを分離した。図１７（ｂ－ｋ）でのドットプロットは、金属コード化のそれらのシグネチャーシグナルに基づき各タイプの分類子マイクロビーズを個別に特定するゲーティング方策を示す。このセットの分類子ビーズ中のマイクロビーズは類似のレベルでＭＣシグナル強度を有し均一であったので、ゲーティングテンプレートを、マルチプレックスアッセイのデータ解析過程を単純化するために、このマイクロビーズゲーティング方策に基づきＦｌｏｗＪｏソフトウェアで作成した。

【0235】

ビーズ系サンドイッチ免疫アッセイ条件の初期最適化
多重化サンドイッチ免疫アッセイ法で使用される試薬および条件を試験しおよび最適化するために、これらの免疫アッセイを用いて、標準溶液として既知のサイトカイン濃度を有する一連の溶液中のサイトカインレベルを測定した。分析結果に対する異なるアッセイ試薬および条件の影響を、これらの測定値からの検量線を調べることにより評価した。アッセイ開発の第一段階で、標準溶液の一連の４プレックスアッセイを用いて、商業的に入手できるストレプトアビジンがコンジュゲートされたナノサイズＡｕレポーターであった、候補レポーターを試験し、アッセイ中のレポーター濃度を最適化した。アッセイをその後、アッセイ性能に対する検出Ａｂ濃度の影響を調査するために、９プレックスアッセイに拡張した。

【0236】

代表的実験では、標準溶液を、０．５％のＢＳＡ緩衝液（ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ）で希釈することにより、既知の濃度の標的サイトカインを含む一連の溶液を調製した。これらの標準溶液（５０μＬ）のそれぞれを、フィルタープレート中で、Ａｂ修飾分類子ビーズ（５０μＬ）と混合した。インキュベーションの間、アッセイ中のＡｂ修飾分類子ビーズに、試料中のそれらの標的分析物を捕捉させた。１時間のインキュベーション後に、これらの分類子ビーズを、濾過により洗浄して、試料中の非結合分子を除去した。ビオチン化検出Ａｂ（１００μＬ）のカクテルを次に、アッセイに加え、続いて分類子ビーズを再分散させた。このステップでは、カクテル中のビオチン化Ａｂは、分類子ビーズ表面上に捕捉された検体分子を認識できる。アッセイ中のこれらの分類子ビーズをその後、フィルター上で洗浄して、非結合検出Ａｂを除去した。次に、ストレプトアビジン結合Ａｕ質量タグ分散液（１００μＬ）を、レポーターとしてアッセイに適用した。これらの質量タグは、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用により、分類子ビーズ上のビオチン化検出Ａｂに付着できた^４７。非結合レポーター粒子を洗い流した後に、アッセイ試料を、個別のマイクロビーズイベントにおける金属含量についてＭＣにより検査した。このビーズ系サンドイッチ免疫アッセイ法の代表的設計を、図１６に示す。

【0237】

シグナル取得後、分析結果を、それらのドットプロットダイアグラムによりＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。図１７は、この試験で採用されたゲーティング方策を示す。全ての分類子ビーズのシングレットイベントを、図１７のパネル（ａ）で最初に分離した。ゲーテッドシングレットイベント中の各分類子ビーズをその後、図１７のパネル（ｂ－ｋ）に示されるドットプロットダイアグラムの一連のゲーティングステップを介して個別に特定した。各分類子イベント中の^１９７Ａｕシグナルをその後、検査し、アッセイシグナルとして報告した。

【0238】

レポーターの選択。分類子ビーズ上の分析物結合を報告するための適切な金属標識質量タグを見つけるために、２種のタイプの商業的に入手できるストレプトアビジン－コンジュゲートレポーター：小さい直径の金クラスター（ＮａｎｏＧｏｌｄ（登録商標）、ｄ≒１．４ｎｍ）および幾分より大きな直径の金ナノ粒子（ＡｕＮＰ、ｄ≒１０ｎｍ）を、調査した。これらを、１２種の濃度の４種の分析物からなる標準溶液を分析する一連の４プレックスアッセイでレポーターとして採用した。

【0239】

図１８に示されるヒストグラムは、４プレックスアッセイでのＩＬ－４－分類子上のレポーターのシグナル強度を示す。ＡｕＮＰを、図１８（ａ－ｃ）に示されるアッセイでのレポーターとして採用した。少数の陽性^１９７Ａｕシグナルが、ブランク対照溶液中にＩＬ－４が存在しなかった図１８（ａ）で記録された。このプロットでの全てのイベントの中央値を、分類子ビーズに対するレポーターＮＰの非特異的結合を反映するために、バックグラウンドノイズ対照として報告した。ＩＬ－４分類子ビーズ上の^１９７Ａｕシグナルの強度ピークは、ＩＬ－４濃度が１．２から２０ｐｇ／ｍＬに増大したので、図１８のパネル（ｂ）および（ｃ）で高磁場にシフトした。１．２ｐｇ／ｍＬで、ビーズ当りほぼ０カウントの^１９７Ａｕシグナル強度を有するいくつかのイベントが、図１８（ｂ）に記録された。これらの「０」イベントは、シグナル取得過程中のアーチファクトによる、またはＭＣ検出限界未満であった小数のレポーターを保持するいくつかの分類子ビーズによる測定器ノイズであり得る。不確実性を取り除きかつデータ分析過程を単純化するために、陽性試料中の陽性イベント（レポーターシグナル強度＞１カウント／ビーズ）の強度中央値を、この試験で報告しプロットした。

【0240】

図１８のパネル（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）に示されるヒストグラムでは、ＮａｎｏＧｏｌｄ（登録商標）をレポーターとして採用して、それぞれ、０、１．２、および２０ｐｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－４を含む標準溶液を分析した。ＩＬ－４分類子ビーズ上のＮａｎｏＧｏｌｄ（登録商標）の^１９７Ａｕに対するレポーターシグナルの遙かに弱い強度が、ＡｕＮＰをレポーターとして用いた分析の結果に比べて、観察された。約０のシグナル強度を有するさらに多くのくイベントが、図１８のパネル（ｂ）に比べて、パネル（ｅ）で示されるヒストグラムにおいて示された。

【0241】

ビーズ系アッセイの典型的なｌｏｇ－ｌｏｇ検量線は、分析物濃度が低い場合、低く、平坦な領域で始まる。曲線はその後、分析物濃度の増大と共に上昇し、より高い濃度でのプラトーが続く^{４１、４３、４８}。この実施例では、アッセイの検出範囲を、検量線の傾斜領域に基づき推定した。この傾斜内で、分析物濃度は通常、測定可能である。

【0242】

図１９は、異なる分析物濃度で分類子ビーズに付着された異なるタイプのＮＰのＭＣシグナル強度中央値の要約である。低い濃度領域（最大約１ｐｇ／ｍＬ）では、両タイプのレポーターのシグナル強度は、低く（約１０カウント／ビーズ）、分析物濃度の増大に対し非感受性であった。１～１０００ｐｇ／ｍＬの範囲の、より高い分析物濃度では、これらのレポーターのシグナル強度は、分析物濃度の増大と共に顕著に高くなった。ＡｕＮＰのシグナル強度は、分析物の濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えるとプラトーに近づき、一方でレポーターとしてＮａｎｏＧｏｌｄ（登録商標）を用いるアッセイの曲線は、類似の傾向を示したが、レポーターとしてＡｕＮＰを用いた場合と比較して、遙かに低い強度であった。遙かにより高い強度がこれらのアッセイにおいてより低い分析物濃度で得られたので、ＡｕＮＰを、検出下限を最適化するためのこの試験における次のビーズ系アッセイのためのレポーター候補として選択した。

【0243】

レポーター濃度の最適化。アッセイシグナル強度レベルに対するＮＰ濃度の影響を次に、調査した。この試験では、ストックＡｕＮＰ分散液を、０．５％ＢＳＡ緩衝液で２００、４００および８００倍に希釈した。これらの希釈液をその後、３セットの４プレックスアッセイで、レポーター溶液として用いて、標準溶液を分析した。図２３は、異なるＡｕＮＰ濃度下で実施された４プレックスアッセイの検量線を示す。全ての３種の希釈でのＡｕＮＰのシグナル強度は、２０ｐｇ／ｍＬを超える分析物濃度で最小限の差異を示した。２００ｘ希釈ＡｕＮＰ分散液で染色されたアッセイの検出限界は、ＩＬ－４、ＩＬ－６およびＴＮＦαの場合、０．３ｐｇ／ｍＬ程度に低かったが、ＩＦＮγの検出限界は、１．２ｐｇ／ｍＬでわずかにより高かった。２００ｘＡｕＮＰ希釈を、この試験でのビーズ系アッセイに使用するために選択した。

【0244】

検出Ａｂ濃度の最適化（９プレックスアッセイにおける）。概念実証実験として一連の４プレックスアッセイを使用した後で、アッセイの多重化能力を、パネルにＩＬ－１β、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、ＣＤ１６３、およびＣＸＣＬ－９の分析を追加することにより、９種の分析物に拡張した。４プレックスアッセイで開発された実験条件を、９種の分析物を含む一連の標準溶液の分析に適合した。第１のセットの９プレックスアッセイでは、検出Ａｂカクテル中の各タイプのビオチン化Ａｂの濃度は、２．５μｇ／ｍＬであった。結果を、図２０で塗りつぶした円（●）としてプロットする。低い分析物濃度（≦１．２２ｐｇ／ｍＬ）での全てのタイプの分類子ビーズ上のＡｕＮＰシグナルの強度中央値レベルは、４プレックスアッセイに比べて、より高い（約１００カウント／ビーズ）ことが観察された。理論に束縛されることを意図するものではないが、低い分析物濃度でのこれらの相対的により高いレベルのシグナル強度は、おそらく非特異的結合の結果と思われる、アッセイ中のバックグラウンドノイズが原因であろう。

【0245】

９プレックスアッセイでの非特異的結合を最小化するために、３セットの９プレックスアッセイを実施し、このアッセイでは、ビオチン化抗ＣＤ１６３および抗ＣＸＣＬ－９の濃度を、２．０、１．０および０．５μｇ／ｍＬに低減し、一方で他の検出Ａｂの濃度を、検出Ａｂカクテル中で２．５μｇ／ｍＬにて維持した。検出抗ＣＤ１６３および抗ＣＸＣＬ－９の濃度を、これらのアッセイでは低減した。それは一部には、高いＡｂ濃度でのＣＸＣＬ－９およびＣＤ１６３に対する検出Ａｂのインターロイキン（ＩＬ）との起こり得る交差反応性および干渉が、より多くの非特異的結合をもたし得るからである。これらの９プレックスアッセイの検量線を、図２０でプロットした。低い濃度（≦１．２２ｐｇ／ｍＬ）の分析物を含む標準溶液のアッセイの場合、低い濃度（０．５および１．０μｇ／ｍＬ）のビオチン化抗ＣＤ１６３および抗ＣＸＣＬ－９ Ａｂを用いたアッセイでのシグナル強度中央値は、より高い濃度（２．０および２．５μｇ／ｍＬ）の検出Ａｂを用いて得た値より有意に低かった。高い分析物濃度（≧１２５０ｐｇ／ｍＬ）の標準溶液のアッセイでは、シグナル強度レベルおよびアッセイ感度は、全ての実験条件下で類似であった。全体として、低分析物濃度での検出感度および分析物に対する検出範囲は、検出Ａｂカクテル中のビオチン化抗ＣＤ１６３および抗ＣＸＣＬ－９の濃度が０．５および１．０μｇ／ｍＬに低減された場合、改善された。図２４に示すように、ブランク溶液のこれらの９プレックスアッセイでのバックグラウンドノイズもまた、ビオチン化抗ＣＤ１６３および抗ＣＸＣＬ－９ Ａｂの濃度が２．０から０．５μｇ／ｍＬに低減されると、大幅に低減された。これらの結果に基づき、分類子ビーズへのビオチン化抗ＣＤ１６３および抗ＣＸＣＬ－９の非特異的結合は、アッセイでのそれらの検出Ａｂ濃度を減らすことにより、最小化できるようである。

【0246】

生体試料中のサイトカインのビーズ系サンドイッチ免疫アッセイ法
生体試料に対する９プレックスアッセイの性能を調査するために、市販のＰＢＭＣ試料（健康なドナーからの）を使用した。細胞培養培地（ＲＰＭＩ）中に懸濁されたＰＢＭＣの１種の試料を、ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激し、上記の最適化されたアッセイ条件を用いて９プレックスアッセイにより刺激されたＰＢＭＣ懸濁液の上清中のサイトカインの細胞外放出について分析した。ＰＭＡは、ジアシルグリセロールに類似の構造を有し、細胞膜を通って細胞質中に拡散できる。細胞質中で、ＰＭＡは、プロテインキナーゼＣを活性化する。カルシウム放出を誘発するカルシウムイオノフォアであるイオノマイシンと組み合わせて使用されると、中程度のレベルのサイトカインが、細胞から放出される。非刺激試料を、非刺激ＰＢＭＣ懸濁液の上清から収集し、この実験での対照として分析した。アッセイの前に、刺激された試料および刺激されない試料を、アッセイのいくつかが検量線の範囲内のＭＣ強度値を生成するように、測定中の分析物濃度を変えるためにアッセイにおける２ｘ、４ｘ、１６ｘ、６４ｘおよび２５６ｘに希釈した。これらのアッセイで分類子ビーズに付着されたＡｕＮＰの^１９７Ａｕシグナル強度中央値を、図２１に示す。典型的アッセイでは、希釈なし、または１：２、１：８、１：３２または１：１２８の比率で希釈した試料溶液（５０μＬ）を、分類子分散液（５０μＬ）に加えた。このアッセイにおける抗ＣＤ１６３および抗ＣＸＣＬ－９の検出Ａｂ濃度は、０．５μｇ／ｍＬおよび１．０μｇ／ｍＬであり、一方で他の検出Ａｂの濃度は、カクテル中で２．５μｇ／ｍＬであった。刺激されない試料からのシグナルよりも大幅により高い^１９７Ａｕシグナルが、全ての希釈度で刺激された試料のアッセイにおいてＩＬ－４、ＩＦＮγおよびＴＮＦα分類子ビーズから検出された。この結果は、刺激過程はＰＢＭＣによるＩＬ－４、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの放出の上昇をもたらし得るという事実と一致し、およびＡｉら^１８により報告された、類似の過程により刺激された使用に関する知見と概ね一致する。

【0247】

同じアッセイ条件を用いて、既知の濃度を有する９種の標的サイトカインを含む一連の標準溶液を測定した。一連の検量線をその後、４パラメーターロジスティック回帰分析（４Ｐ－ＬＲ）モデルを用いて標準溶液のアッセイ結果をフィットさせることにより作成した（図２５参照）。これらの検量線を使用して、刺激されないおよび刺激された試料中のこれらのサイトカインの濃度を評価した。しかし、図２１のいくつかのアッセイ結果は、図２５で示された検量線の最小値より小さかった。従って、濃度は、これらの値から導かれなかった。図２６は、図２１に示された分析結果を図２５で示された検量線にフィットさせることによるサイトカイン濃度の予備的知見を要約する。希釈因子が図２６に示されたサイトカイン濃度の計算で考慮されたので、理論的には、測定された同じ試料に対する類似の濃度値が、異なる希釈から観察されなければならない。刺激された試料中のＩＬ－４濃度の測定の場合、１：１、１：２、１：８、１：３２および１：１２８の比率で希釈された試料は、それぞれ、刺激試料のストック溶液中の６００、４３０、４６０、６４０、および１１１０ｐｇ／ｍＬのＩＬ－４濃度を報告し、一方で刺激されない試料の場合、いずれのアッセイも、おそらく刺激されない試料中の低いＩＬ－４濃度により、ＩＬ－４濃度を評価するための十分なシグナル強度を生成できなかった。刺激された試料中のＩＦＮγ濃度の測定の場合、異なる稀釈度でのアッセイは全て、極めて高いシグナル強度を報告し、これは、ほとんどの濃縮標準溶液の強度より高かった。

【0248】

結論
一連の１１種のタイプのランタニドコード化されたマイクロビーズが、２段階ＤｉｓＰにより合成された。これらのマイクロビーズ中の６種の金属の金属含量は、約１０００カウント／ビーズの強度中央値を有するＭＣシグナルを生成するマイクロビーズを作製するために、ＤｉｓＰの第２段階において金属錯体の供給量を変えることにより精密に制御された。これらのマイクロビーズは、サイズ（ＣＶ_直径＜２％）および金属含量（ＲＣＶ＜１５％）において均一であり、これが、それらをビーズ系アッセイにおける分類子ビーズ用の良好な候補にする。

【0249】

ＭＣによるこのビーズ系アッセイで、サイトカインレベルが、分析された。ＭＣでのサイトカインおよびケモカインの多重化ビーズ系サンドイッチ免疫アッセイ法を開発するために、金属コード化されたマイクロビーズの表面は、種々のタイプのＡｂで修飾され、標的分析物を捕捉するために分類子ビーズとして採用された。レポーターシステムを開発し、かつアッセイ条件を最適化するために、一連のビーズ系アッセイが最初に実施されて、既知の分析物濃度を有する最大で９タイプのサイトカインおよびケモカインを含む一連の標準溶液を分析した。この実験では、レポーターＮＰのＭＣシグナル強度は、標準溶液の濃度差異に応答した。これらのアッセイは、低い分析物濃度で高感度を示した。しかし、いくつかの検出Ａｂの非特異的結合が、バックグラウンドノイズ問題の増大をもたらした。バックグラウンドノイズは、これらのアッセイの検出限界を損なう可能性がある。さらに、２種のＰＢＭＣ試料の上清が、サイトカインおよびケモカインのためにこの調査で開発された９プレックスアッセイにより分析された。分析結果は、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激試料の上清が、非刺激試料に比べて高レベルのＩＬ－４、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを含むことを示した。この知見は、他のアッセイにより測定された文献で報告されたサイトカイン検出に関する結果と概ね一致した。この調査で示された結果は、ＭＣによるビーズ系サンドイッチ免疫アッセイ法が異なる分析物の同時検出に使用できることを示す。

【0250】

実施例１０ 実施例９の追加の実験の詳細および考察
材料
スチレン（Ｓｔ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、≧９９％）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、Ｍｗ 約５５ｋＤａ）、２，２－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ、９８％）、トリトンＸ３０５（ＴＸ３０５、７０％水溶液）、ジエチレントリアミン五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ酸二無水物、９８％）、ホルボール １２－ミリステート １３－アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、過酸化水素溶液（Ｈ_２Ｏ_２、Ｈ_２Ｏ中３０％）、硫酸（微量金属グレード）、ならびにランタン（ＩＩＩ）クロリド・七水和物（ＬａＣｌ_３・７Ｈ_２Ｏ）、セリウム（ＩＩＩ）クロリド・七水和物（ＣｅＣｌ_３・７Ｈ_２Ｏ、）、酢酸プラセオジム（ＩＩＩ）水和物（Ｐｒ（ＯＡｃ）_３・ｘＨ_２Ｏ）、テルビウム（ＩＩＩ）クロリド・六水和物（ＴｂＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）、ホルミウム（ＩＩＩ）クロリド・六水和物（ＨｏＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）およびツリウム（ＩＩＩ）クロリド・六水和物（ＴｍＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）を含む純度≧９９．９９％の金属塩（微量金属基準）を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａから購入した。４－ビニルベンジルアミン（ＶＢＡ、≧９２％）を、ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａから購入した。無水エタノール（ＥｔＯＨ）を、市販のアルコール（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）から製造した。誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）較正用の単一元素標準溶液を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｐｕｒｅ Ｐｌｕｓ）から購入した。

【0251】

金属コード化された分類子ビーズの調製
ＤＴＰＡビスビニルベンジルアミド（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）の金属錯体を、異なるタイプの金属イオンをポリスチレン（ＰＳ）マイクロビーズ中に組み込むためのキレート化剤として採用した。重合可能なＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２金属キレート剤の合成および金属ロード手順を、実施例４に記載する。Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、ＴｂおよびＴｍをマイクロビーズ中にコード化するためにＬａ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）、Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）、Ｐｒ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）、Ｔｂ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）およびＴｍ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）を、ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２をそれぞれ、ＬａＣｌ_３、ＣｅＣｌ_３、Ｐｒ（ＯＡｃ）_３、ＴｂＣｌ_３およびＴｍＣｌ_３と混合することにより水溶液中で調製した。これらの金属錯体を、^１Ｈ ＮＭＲにより特徴付けた。

【0252】

ビーズ系アッセイのための分類子ビーズとしてのマイクロビーズを、表７に記載されるように一連の２段階分散重合（ＤｉｓＰ）により合成した。典型的ビーズ合成では、無水エタノール（１８．７５ｇ）中のスチレン（６．２５ｇ）の重合の第１段階を、安定剤としてのＰＶＰ（１ｇ）およびＴＸ３０５（０．３５ｇ）の存在下で７０℃のＡＩＢＮ（０．２５ｇ）により開始した。反応を、ガス質量制御装置（ＯＭＥＧＡ）により制御されたＮ_２パージ（３ｍＬ／分）で保護した。反応の開始の２時間後に、異なるタイプのＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２の金属錯体を含む暖かいエタノールの一定分量（１５ｇ）を、ＤｉｓＰ反応系に加えて、マイクロビーズ中に金属イオンを組み込んだ。第２段階の一定分量中のＭ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）の供給量を、ＭＣにおいて設計されたレベルのシグナル強度を生成する金属イオンでコード化されたマイクロビーズを生成するように最適化した（表８参照）。反応を、開始の２４時間後に、停止し、室温に冷却した。反応分散液中のマイクロビーズを、無水エタノールによる２回のおよび水による４回の沈降－再分散サイクルにより精製した。精製されたマイクロビーズの分散液を、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）イメージング、ＭＣ測定およびさらなる表面修飾のために使用した。

【0253】

マイクロビーズの直径および直径分布を、日立Ｓ－５２００顕微鏡を用いて、それらのＳＥＭ像から特徴付けた。典型的には、２μＬの希釈したビーズ分散液を、３００メッシュのホルムバール／炭素コート銅グリッド上に滴下し、乾燥させた。マイクロビーズの直径を、複数ＳＥＭ像からＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてマニュアルで測定した。平均直径、標準偏差（ＳＤ）および変動係数（ＣＶ）を、少なくとも３００個の測定に基づき計算した。

【0254】

最初の２回の試行において、合成混合物への金属錯体の供給量を、目的の範囲の強度を有するＭＣシグナルを生成できるマイクロビーズを得るために調査した。これらのマイクロビーズを、試行１および試行２として表す。試行実験で開発された供給量配合に基づき、分類子ビーズとして１１種の試料を次に調製した。これらの分類子ビーズを、それぞれ、Ｃ－１、Ｃ－２、・・・Ｃ－１１として表し、表に列挙する。

【0255】

マイクロビーズの酸消化
ＤｉｓＰの停止後に、一定分量のＣ－１反応分散液を、２５０℃でＨ_２ＳＯ_４／Ｈ_２Ｏ_２を用いて消化し、反応系中の総金属含量について誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）により分析した。反応分散液中のマイクロビーズの消化のために、マイクロビーズ分散液（１００μＬ、０．５～２％固体含量）および５００μｌの硫酸を、２０ｍＬのグラスバイアル中で混合し、ホットプレート上で２５０℃に加熱し、磁気撹拌しながら４０分間保持し、続いて３０％のＨ_２Ｏ_２溶液（５０μＬ）を添加した。ＩＣＰ－ＭＳ分析のために、消化溶液をその後、２％ＨＮＯ_３で希釈した。反応分散液中の遊離金属含量を定量するために、反応ストック分散液を、シリンジフィルター（０．２μｍ、ナイロン）を通して濾過して、マイクロビーズを除去し、ＩＣＰ－ＭＳ分析のために濾液を収集した。Ｃ－１反応中の金属組み込み効率を、実施例４で上記したように、反応混合物中の総金属含量を遊離金属含量と比較することにより推定した。

【0256】

計測装置
誘導結合プラズマ－質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）。試料中の金属含量を定量するために、ＩＣＰ－ＭＳ（ｉＣＡＰ－Ｑ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）システムを、用いた。２％ＨＮＯ_３を用いて、校正溶液として４０、２０、１０、１および０．１ｐｐｂの一連の濃度に元素標準溶液を系列希釈した。各溶液試料中の金属含量を、１０ｐｐｔ未満の検出限界を有する較正フィッティング曲線に基づき決定した。

【0257】

追加の結果および考察
分散重合による金属コード化された分類子ビーズの合成
この調査では、金属コード化されたマイクロビーズを、重合可能な金属錯体、Ｍ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）を用いて金属イオンをＰＳマイクロビーズ中に組み込むために、２段階ＤｉｓＰにより調製した。ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２キレート化剤の合成を、無水ＤＭＳＯ中で、ＤＴＰＡ二無水物を４－ビニルベンジルアミンと反応させることにより実施した。Ｌａ^３＋、Ｃｅ^３＋、Ｐｒ^３＋、Ｔｂ^３＋、Ｈｏ^３＋およびＴｍ^３＋を、ｐＨ５～６の水溶液中でＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２キレート化剤にロードした。これらの合成の生成物を、^１Ｈ－ＮＭＲにより特徴付けた。キレート化剤合成および金属ロード手順の詳細を、実施例４に記載する。

【0258】

分類子ビーズ合成のための配合を開発するために、ステップは、第２段階の一定分量中のＭ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）の供給量を最適化して、これらの同位体チャネルのそれぞれについて８００～１０００カウント／ビーズの強度レベルを有する、ＭＣにおいて^１３９Ｌａ、^１４０Ｃｅ、^１４１Ｐｒ、^１５９Ｔｂ、^１６５Ｈｏおよび１^６９Ｔｍのシグナルを生成するマイクロビーズを調製することであった。本明細書の実施例４で考察された金属供給量と金属含量の間の直線関係に基づき、いくつかの試行合成を実施して、６種の金属錯体の供給量を設計した。試行実験で開発された供給量配合に基づき、Ｃ－１試料を、６種のタイプの金属イオンでコード化された一連の分類子ビーズとして調製した。

【0259】

加えて、Ｃ－１ビーズ中への金属イオンの金属組み込み効率を、ＩＣＰ－ＭＳにより評価した。図２２のパネル（ｂ）に示される結果は、６種のタイプ全ての金属イオンが、６３～７４％の範囲の効率で効率的に組み込まれたことを示す。各金属の組み込み効率を、合成後の金属含量を反応系中の総金属含量と比較することにより評価した。効率のわずかな増大が、より大きなイオン半径を有するランタニド金属イオンについて観察され、これは、上の実施例４で記載された知見と一致する。全体として、Ｃ－１ビーズは、候補分類子ビーズとして適切である。

【0260】

ＤｉｓＰにより調製されたマイクロビーズのサイズは、おそらく反応条件に対する粒子核生成の感度に起因して、バッチ間で変動する。小さいバッチ毎の粒径変動を有するマイクロビーズを最適化しおよび調製するために、いくつかの制御因子を、実験条件において調査し、粒径の再現性は、Ｎ_２パージおよび反応加熱の手順をバッチ間で一定に保持することにより改善できることを見出した。表６に要約されるように、均一（ＣＶ＜２％）であり、かつ２．８～３．０μｍの範囲の平均直径を有する小さいサイズを共有する１１種のタイプのマイクロビーズ（Ｃ－１～Ｃ－１１）を、調製した。

【0261】

配合の最適化後に、追加のタイプの分類子ビーズを、Ｃ－１合成のために開発した金属錯体の供給量を採用して調製した。第１セットの試料Ｃ－２～Ｃ－６では、２種のタイプの金属イオン、Ｃｅ（ＤＴＰＡ－ＶＢＡｍ_２）＋第２のタイプの金属錯体を、ビーズ合成において加えた。これらの二金属ビーズ合成での各金属錯体の量は、Ｃ－１ビーズの合成の場合と同じであった。同じ原理をその後、いくつかの三金属コード化されたマイクロビーズ（Ｃ－７～Ｃ１１）にもまた適用した。

【表7】

【表8】

【0262】

本開示は、現時点で好ましい実施例であると考えられるものを基準にして記載されているが、本開示は、開示される実施例に限定されるものではないことを理解されたい。むしろ、本開示は、添付の特許請求の範囲の趣旨と範囲内でさまざまな修正および等価の組み合わせ方を包含すると意図される。
全ての出版物、特許および特許出願は、あたかも、それぞれ個別の出版物、特許または特許出願が具体的に、また、個別に参照によってその全体が本明細書に組み込まれることが示されるのと同程度にその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。特に、例えば、表または別の場所で提供される受入番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含む本明細書で提供される各受入番号に関連する配列は、その全体が参照により組み込まれる。
特許請求の範囲は、好ましい実施形態および実施例により限定されるべきではなく、全体としての記載と一致する最も広い解釈を与えられるべきである。

【0263】

本明細書で参照された参考文献の引用

【表9】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【国際調査報告】