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特表2024-511808ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-15
(54)【発明の名称】ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20240308BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240308BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240308BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240308BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240308BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240308BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240308BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240308BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20240308BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240308BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20240308BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240308BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240308BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240308BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240308BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240308BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240308BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240308BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C07K19/00
A61K35/76
A61P1/04
A61P3/04
A61P3/10
A61P9/00
A61P25/16
A61P25/14
A61P25/28
A61P21/04
A61P37/06
A61K48/00
A61K31/7105
A61K31/713
A61P11/00
C12N15/113 Z
C12N15/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023559826
(86)(22)【出願日】2022-03-29
(85)【翻訳文提出日】2023-09-27
(86)【国際出願番号】 CN2022083601
(87)【国際公開番号】W WO2022206739
(87)【国際公開日】2022-10-06
(31)【優先権主張番号】202110336982.1
(32)【優先日】2021-03-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515190906
【氏名又は名称】南京大学
(74)【代理人】
【識別番号】110003823
【氏名又は名称】弁理士法人柳野国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼辰宇
(72)【発明者】
【氏名】▲陳▼熹
(72)【発明者】
【氏名】付正
(72)【発明者】
【氏名】李菁
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼翔
(72)【発明者】
【氏名】周心▲けん▼
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼▲麗▼
(72)【発明者】
【氏名】余▲夢▼超
(72)【発明者】
【氏名】郭宏源
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
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4C084MA56
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4C084NA13
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4C084ZA022
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4C084ZA162
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4C084ZA362
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4C084ZA702
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4C084ZC352
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4C086ZC35
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4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム及びその使用を提供する。該ＲＮＡ送達システムは、送達が必要なＲＮＡ断片を担持したウイルスベクターであって、宿主の器官組織内で富化し、前記宿主の器官組織内に前記ＲＮＡ断片を含有する複合構造を内因的に自発的に形成することができ、前記複合構造が、前記標的組織内に進入して結合し、前記ＲＮＡ断片を標的組織に送達することができるウイルスベクターを含む。該ウイルスベクターはターゲティングタグを有する。該複合構造はエクソソームである。該ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムは、安全性及び信頼性が十分に検証されており、創薬性が非常に良好であり、汎用性が強く、経済性及び応用の将来性に優れている。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
送達が必要なＲＮＡ断片を担持したウイルスベクターであって、宿主の器官組織内で富化し、前記宿主の器官組織内に前記ＲＮＡ断片を含有する複合構造を内因的に自発的に形成することができ、前記複合構造が、標的組織内に進入して結合し、前記ＲＮＡ断片を標的組織に送達することができるウイルスベクターを含む、ことを特徴とするウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項2】
前記ウイルスベクターはアデノウイルス関連ウイルスである、ことを特徴とする請求項１に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項3】
前記アデノウイルス関連ウイルスは、アデノウイルス関連ウイルス５型、アデノウイルス関連ウイルス８型、又はアデノウイルス関連ウイルス９型である、ことを特徴とする請求項２に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項4】
前記ＲＮＡ断片は、医療的に意味のある１つ又は２つ以上の特定のＲＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ配列は、医療的に意味のあるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、ことを特徴とする請求項１に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項5】
前記ウイルスベクターは、プロモーターと、宿主の器官組織内に前記複合構造のターゲティング構造を形成することができるターゲティングタグとを含み、前記ターゲティング構造は複合構造の表面に位置し、前記複合構造は、前記ターゲティング構造を介して標的組織を探索し結合し、標的組織に前記ＲＮＡ断片を送達可能である、ことを特徴とする請求項１に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項6】
前記ウイルスベクターは、プロモーター－ＲＮＡ断片、プロモーター－ターゲティングタグ、プロモーター－ＲＮＡ断片－ターゲティングタグのいずれか１つ又は複数の回路の組み合わせを含み、前記ウイルスベクターのそれぞれは、少なくとも１つのＲＮＡ断片と１つのターゲティングタグとを含み、前記ＲＮＡ断片及びターゲティングタグは、同一回路又は異なる回路にある、ことを特徴とする請求項５に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項7】
前記ウイルスベクターは、前記回路を正しい構造に折り畳んで発現させることができるフランキング配列、補償配列、及びループ配列をさらに含み、前記フランキング配列は、５’フランキング配列及び３’フランキング配列を含み、前記ウイルスベクターは、５’－プロモーター－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列、５’－プロモーター－ターゲティングタグ、５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列のいずれか１つ又は複数の回路の組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項６に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項8】
前記５’フランキング配列は、ｇｇａｔｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｔｇｃｔｇａａｇｇｃｔｇｔａｔｇｃｔｇａａｔｔｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、前記ループ配列は、ｇｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔｇａｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記３’フランキング配列は、ａｃｃｇｇｔｃａｇｇａｃａｃａａｇｇｃｃｔｇｔｔａｃｔａｇｃａｃｔｃａｃａｔｇｇａａｃａａａｔｇｇｃｃｃａｇａｔｃｔｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～５位の塩基が欠失されているものである、ことを特徴とする請求項７に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項9】
前記ウイルスベクターに少なくとも２種類の回路が存在する場合、隣接する回路は配列１～３からなる配列で連結され、配列１はＣＡＧＡＴＣであり、配列２は５～８０塩基からなる配列であり、配列３はＴＧＧＡＴＣである、ことを特徴とする請求項６に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項10】
前記ウイルスベクターに少なくとも２種類の回路が存在する場合、隣接する回路は配列４又は配列４と８０％超の相同性を有する配列で連結され、配列４は、ＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣである、ことを特徴とする請求項９に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項11】
前記臓器組織は肝臓であり、前記複合構造はエクソソームである、ことを特徴とする請求項１に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項12】
前記ターゲティングタグは、ターゲティング機能を有するターゲティングペプチド又はターゲティングタンパク質から選択される、ことを特徴とする請求項５に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項13】
前記ターゲティングペプチドは、ＲＶＧターゲティングペプチド、ＧＥ１１ターゲティングペプチド、ＰＴＰターゲティングペプチド、ＴＣＰ－１ターゲティングペプチド、及びＭＳＰターゲティングペプチドを含み、前記ターゲティングタンパク質は、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＰＴＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＭＳＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質を含む、ことを特徴とする請求項１２に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項14】
前記ＲＮＡ配列の長さが１５～２５ヌクレオチドである、ことを特徴とする請求項５に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項15】
前記ＲＮＡ配列は、ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＫＲＡＳ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＶＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＴＯＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｂ７遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ－β１遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｋ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｌ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＨＬＡ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＧＤＦ１５遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ－２１のアンチセンス鎖、ｍｉＲＮＡ－２１４のアンチセンス鎖、ＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＨＴＴ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｌｒｒｋ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子のｓｉＲＮＡ、又は上記配列と８０％超の相同性を有するＲＮＡ配列、又は上記ＲＮＡをコードする核酸分子から選択されるいずれか１種又は複数種である、ことを特徴とする請求項１４に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項16】
前記送達システムは、ヒトを含む哺乳動物で使用されるものである、ことを特徴とする請求項１に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか１項に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの薬物における使用。
【請求項18】
前記薬物の投与方法は、経口投与、吸入投与、皮下注射投与、筋肉注射投与、静脈注射投与を含む、ことを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項19】
前記薬物は、癌、肺線維症、結腸炎、肥満、肥満に起因する心血管疾患、２型糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、重症筋無力症、アルツハイマー病、又は移植片対宿主病を治療する薬物である、ことを特徴とする請求項１７に記載の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、生物医学の技術分野に関し、特にウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）療法は、発明されて以来、人類の疾患を治療する有望な戦略であると考えられてきたが、臨床的には多くの問題に直面しており、この治療法の進歩は予想よりもはるかに遅れている。
【0003】
ＲＮＡは細胞外に長期間安定に存在することはできないと考えられており、ＲＮＡは細胞外に豊富に含まれるＲＮａｓｅに分解されて断片化されるため、ＲＮＡｉ療法の効果を発現するには、ＲＮＡを細胞外に安定に存在させ、特定の組織に標的に取り込める方法を見つけることが必要とされる。
【0004】
現在、ｓｉＲＮＡと関連する特許は多く、主に以下のいくつの方面に焦点を当てている。１．医学効果を有するｓｉＲＮＡを設計する。２．ｓｉＲＮＡを化学修飾し、生体内でのｓｉＲＮＡの安定性を高め、収率を高める。３．種々の人工ベクター（例えば、脂質ナノ粒子、カチオン性ポリマーやウイルス）の設計を改善し、ｓｉＲＮＡの生体内での伝達効率を向上させる。このうち第３方面についての特許が多く、その根本的な原因は、研究者らが、ｓｉＲＮＡを標的組織に安全に、精確に、効率的に送達するための適切なｓｉＲＮＡ伝達システムが不足しており、この問題がＲＮＡｉ療法を制約する核心的な問題になっていることを認識しているからである。
【0005】
ウイルス（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｖｉｒｕｓ）とは、個体が微小で構造が単純で、１種類の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）しか含まず、生きた細胞内に寄生して複製的に増殖しなければならない非細胞型の生物である。ウイルスベクターは遺伝物質を細胞に持ち込むことができ、原理は、ウイルスがそのゲノムを他の細胞に送達して感染させる分子機構を持ち、完全な生体（ｉｎ ｖｉｖｏ）又は細胞培養（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で発生できることを利用しており、ウイルスは、主に基礎研究、遺伝子療法やワクチンに応用される。しかし、現在、ウイルスをベクターとして特殊な自己集合機構を利用してＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを送達する関連研究は少ない。
【0006】
公開番号ＣＮ１０８６２４５９０Ａの中国特許は、ＤＤＲ２遺伝子の発現を阻害できるｓｉＲＮＡを開示している。公開番号ＣＮ１０８６２４５９１Ａの中国特許は、ＡＲＰＣ４遺伝子をサイレンシングすることができるｓｉＲＮＡを開示しており、当該ｓｉＲＮＡにα－リン－セレン修飾を施している。公開番号ＣＮ１０８５４６７０２Ａの中国特許は、長鎖非コードＲＮＡ ＤＤＸ１１－ＡＳ１を標的とするｓｉＲＮＡを開示している。公開番号ＣＮ１０６１７７９９０Ａの中国特許は、多種の腫瘍治療に用いることができるｓｉＲＮＡ前駆体を開示している。これらの特許はすべて特定のｓｉＲＮＡを設計しており、遺伝子の変化によって引き起こされるある疾患を対象としている。
【0007】
公開番号ＣＮ１０８２５０２６７Ａの中国特許は、ポリペプチド、ポリペプチド－ｓｉＲＮＡ誘導共集合体を開示しており、ポリペプチドをｓｉＲＮＡのベクターとして使用している。公開番号ＣＮ１０８１１７５８５Ａの中国特許は、ｓｉＲＮＡを標的に導入して、乳癌細胞のアポトーシスを促進するポリペプチドを開示しており、同様にポリペプチドをｓｉＲＮＡのベクターとして使用している。公開番号ＣＮ１０８０９６５８３Ａの中国特許は、化学療法薬を含むと同時に乳癌治療効果を有するｓｉＲＮＡを搭載することができるナノ粒子ベクターを開示している。これらの特許はすべてｓｉＲＮＡベクターに関する発明創造であるが、その技術案には共通の特徴があり、それはベクター及びｓｉＲＮＡがいずれも生体外で予め集合されてから宿主の体内に導入されることである。実際には、現在設計されているほとんどの送達技術は上記と同様である。しかし、これらの人工的に合成された外因性送達システムは、宿主の循環システムによって容易に除去され、免疫原性反応を引き起こす可能性があり、さらには特定の細胞タイプと組織に有毒であるという共通の問題がある。
【0008】
本発明の研究チームは、内因性細胞がｍｉＲＮＡｓを選択的にエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）にカプセル化することができ、エクソソームはｍｉＲＮＡを受容体細胞に伝達し、その分泌されたｍｉＲＮＡが比較的低い濃度で、標的遺伝子の発現を強力にブロックすることができることを発見した。エクソソームは宿主免疫系と生体適合性であり、生体内でｍｉＲＮＡを生物学的バリアを越えて保護及び送達する先天的能力を有するため、ｓｉＲＮＡ送達に関連する問題を克服する潜在的な解決策となる。例えば、公開番号ＣＮ１１０６９９３８２Ａの中国特許は、ｓｉＲＮＡを送達するエクソソームの製造方法を開示しており、血漿からエクソソームを分離し、ｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによりエクソソームにカプセル化する技術を開示している。
【0009】
しかし、生体外でエクソソームを分離又は製造するこのような技術は、細胞培養を通じて大量のエクソソームを取得し、さらにｓｉＲＮＡカプセル化のステップを追加する必要があり、これは、この製品を大規模に応用する臨床費用が非常に高くなり、一般の患者に負担することができず、さらに、エクソソームの複雑な製造・精製プロセスにより、ＧＭＰ規格に合致することがほぼ不可能となっている。
【0010】
これまで、エクソソームを有効成分とする薬物はＣＦＤＡの承認を受けたことがなく、エクソソーム製品の一貫性が保証されていないことが中心的な問題となっており、このような製品の医薬品製造許可が得られないことに直結している。この問題を解決できれば、ＲＮＡｉ療法を推進する上で非常に意義がある。
【0011】
したがって、安全で正確かつ効率的なｓｉＲＮＡ送達システムの開発は、ＲＮＡｉ治療の効果を高め、ＲＮＡｉ療法を推進するために不可欠なことである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
以上に鑑み、本願の実施例は、従来技術に存在する技術的欠陥を解決するために、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システム及びその使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本願は、送達が必要なＲＮＡ断片を担持したウイルスベクターであって、宿主の器官組織内で富化し、前記宿主の器官組織内に前記ＲＮＡ断片を含有する複合構造を内因的に自発的に形成することができ、前記複合構造が、標的組織内に進入して結合し、前記ＲＮＡ断片を標的組織に送達することができるウイルスベクターを含む、ことを特徴とするウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムを提供する。ＲＮＡ断片を標的組織に送達すると、それに対応する遺伝子の発現を阻害し、標的組織における疾患の進行を阻害することができる。
【0014】
アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターを用いて構築されたＲＮＡ送達システムは、生体内での富化及び治療効果を有することが図１６～１７から示されている。
【0015】
任意選択に、前記ウイルスベクターはアデノウイルス関連ウイルスである。
【0016】
任意選択に、前記アデノウイルス関連ウイルスは、アデノウイルス関連ウイルス５型、アデノウイルス関連ウイルス８型、又はアデノウイルス関連ウイルス９型である。
【0017】
任意選択に、前記ＲＮＡ断片は、１つ又は２つ以上の特定の医療的に意味のあるＲＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ配列は、医学的に意味のあるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである。
【0018】
２種類のアデノウイルスベクターと６種類のＲＮＡ配列単独、又はその中の任意の２種類若しくはその中の任意の３種類のＲＮＡ配列からなるＲＮＡ断片が構築後に生体内での富化及び治療効果を有することが、図１８～１９から示されている。
【0019】
任意選択に、前記ウイルスベクターは、プロモーターと、宿主の器官組織内に前記複合構造のターゲティング構造を形成することができるターゲティングタグとを含み、前記ターゲティング構造は複合構造の表面に位置し、前記複合構造は、前記ターゲティング構造を介して標的組織を探索し結合し、標的組織に前記ＲＮＡ断片を送達可能である。
【0020】
任意選択に、前記ウイルスベクターは、プロモーター－ＲＮＡ断片、プロモーター－ターゲティングタグ、プロモーター－ＲＮＡ断片－ターゲティングタグのいずれか１つ又は複数の回路（ライン）の組み合わせを含み、前記ウイルスベクターのそれぞれは、少なくとも１つのＲＮＡ断片と１つのターゲティングタグとを含み、前記ＲＮＡ断片及びターゲティングタグは、同一回路又は異なる回路にある。
【0021】
２種類のＲＮＡ断片と２種類のターゲティングタグを単独又は任意に組み合わせてウイルスベクターに構築した場合、いずれも生体内での富化及び治療効果があることが、図２０～２３から示されている。
【0022】
任意選択に、前記ウイルスベクターは、前記回路を正しい構造に折り畳んで発現させることができるフランキング配列、補償配列、及びループ配列をさらに含み、前記フランキング配列は、５’フランキング配列及び３’フランキング配列を含み、
前記ウイルスベクターは、５’－プロモーター－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列、５’－プロモーター－ターゲティングタグ、５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列のいずれか１つ又は複数の回路の組み合わせを含む。
前記ウイルスベクターは、５’－プロモーター－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列、５’－プロモーター－ターゲティングタグ、５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列のいずれか１つ又は複数の回路の組み合わせを含む。
【0023】
５’－プロモーター－５’フランキング配列－ＲＮＡ配列－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列及び５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ＲＮＡ配列－ループ配列－補償配列－３’フランキングによって構築された送達ベクターはいずれも生体内での富化及び治療効果を有することが図２４から示されている。
【0024】
任意選択に、前記５’フランキング配列は、ｇｇａｔｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｔｇｃｔｇａａｇｇｃｔｇｔａｔｇｃｔｇａａｔｔｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記ループ配列は、ｇｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔｇａｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記３’フランキング配列は、ａｃｃｇｇｔｃａｇｇａｃａｃａａｇｇｃｃｔｇｔｔａｃｔａｇｃａｃｔｃａｃａｔｇｇａａｃａａａｔｇｇｃｃｃａｇａｔｃｔｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～５位の塩基が欠失されているものである。ＲＮＡ逆相補配列の１～５位の塩基を欠失したことは、この配列を発現しないようにすることを目的とする。
前記ループ配列は、ｇｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔｇａｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記３’フランキング配列は、ａｃｃｇｇｔｃａｇｇａｃａｃａａｇｇｃｃｔｇｔｔａｃｔａｇｃａｃｔｃａｃａｔｇｇａａｃａａａｔｇｇｃｃｃａｇａｔｃｔｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、
前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～５位の塩基が欠失されているものである。ＲＮＡ逆相補配列の１～５位の塩基を欠失したことは、この配列を発現しないようにすることを目的とする。
【0025】
５’フランキング配列／ループ配列／３’フランキング配列及びその相同配列によって構築された送達システムは、いずれも生体内での富化及び治療効果を有することが、図２５から示されている。
【0026】
好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～３位の塩基が欠失されている。
【0027】
より好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～３位の連続して配列した塩基が欠失されている。
【0028】
最も好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の９位及び／又は１０位の塩基が欠失されている。
【0029】
任意選択に、ウイルスベクターに少なくとも２種類の回路が存在する場合、隣接する回路は配列１～３からなる配列（配列1-配列2-配列3）で連結され、
配列１はＣＡＧＡＴＣであり、配列２は５～８０塩基からなる配列であり、配列３はＴＧＧＡＴＣである。
配列１はＣＡＧＡＴＣであり、配列２は５～８０塩基からなる配列であり、配列３はＴＧＧＡＴＣである。
【0030】
任意選択に、ウイルスベクターに少なくとも２種類の回路が存在する場合、隣接する回路は配列４又は配列４と８０％超の相同性を有する配列で連結され、
配列４は、ＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣである。
配列４は、ＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣである。
【0031】
配列４及びその相同配列によって構築されたウイルスベクター送達システムはいずれも生体内での富化及び治療効果を有することが、図２６から示されている。
【0032】
任意選択に、前記臓器組織は肝臓であり、前記複合構造はエクソソームである。
【0033】
任意選択に、前記ターゲティングタグは、ターゲティング機能を有するターゲティングペプチド又はターゲティングタンパク質から選択される。
【0034】
任意選択に、前記ターゲティングペプチドは、ＲＶＧターゲティングペプチド、ＧＥ１１ターゲティングペプチド、ＰＴＰターゲティングペプチド、ＴＣＰ－１ターゲティングペプチド、及びＭＳＰターゲティングペプチドを含み、
前記ターゲティングタンパク質は、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＰＴＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＭＳＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質を含む。
前記ターゲティングタンパク質は、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＰＴＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質、ＭＳＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質を含む。
【0035】
任意選択に、前記ＲＮＡ配列の長さが１５～２５ヌクレオチドである。例えば、前記ＲＮＡ配列の長さが、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチドであってもよい。好ましくは、前記ＲＮＡ配列の長さが１８～２２ヌクレオチドである。
【0036】
様々な長さのＲＮＡ配列によって構築された遺伝子回路はいずれも生体内での富化及び治療効果を有することが、図２７から示されている。
【0037】
任意選択に、前記ＲＮＡ配列は、ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＫＲＡＳ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＶＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＴＯＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｂ７遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ－β１遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｋ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｌ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＨＬＡ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＧＤＦ１５遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ－２１のアンチセンス鎖、ｍｉＲＮＡ－２１４のアンチセンス鎖、ＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＨＴＴ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｌｒｒｋ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子のｓｉＲＮＡ、又は上記配列と８０％超の相同性を有するＲＮＡ配列、又は上記ＲＮＡをコードする核酸分子から選択されるいずれか１種又は複数種である。なお、ここで「上記ＲＮＡ配列をコードする核酸分子」中のＲＮＡ配列には、それぞれのＲＮＡの相同性が８０％超のＲＮＡ配列も含まれる。
【0038】
ここで、上記各遺伝子のｓｉＲＮＡはいずれもその遺伝子の発現を阻害する機能を持つＲＮＡ配列であり、各遺伝子の発現を阻害する機能を持つＲＮＡ配列は多数存在するので、ここでは一つ一つ挙げることはできないが、効果が優れている以下の配列のみを例示して説明する。
【0039】
ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＧＵＵＧＣＵＵＣＵＣＵＵＡＡＵＵＣＣＵ、ＡＡＡＵＧＡＵＣＵＵＣＡＡＡＡＧＵＧＣＣＣ、ＵＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧＡＵＣＡＵ、ＡＡＵＡＵＵＣＧＵＡＧＣＡＵＵＵＡＵＧＧＡ、ＵＡＡＡＡＡＵＣＣＵＣＡＣＡＵＡＵＡＣＵＵ、ＥＧＦＲ遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0040】
ＫＲＡＳ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＧＡＵＵＵＡＧＵＡＵＵＡＵＵＵＡＵＧＧＣ、ＡＡＵＵＵＧＵＵＣＵＣＵＡＵＡＡＵＧＧＵＧ、ＵＡＡＵＵＵＧＵＵＣＵＣＵＡＵＡＡＵＧＧＵ、ＵＵＡＵＧＵＵＵＵＣＧＡＡＵＵＵＣＵＣＧＡ、ＵＧＵＡＵＵＵＡＣＡＵＡＡＵＵＡＣＡＣＡＣ、ＫＲＡＳ遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0041】
ＶＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＵＵＵＧＡＡＧＡＧＵＵＧＵＡＵＵＡＧＣＣ、ＵＡＡＵＡＧＡＣＵＧＧＵＡＡＣＵＵＵＣＡＵ、ＡＣＡＡＣＵＡＵＧＵＡＣＡＵＡＡＵＡＧＡＣ、ＵＵＵＡＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＵＵＣＵＣＣＡ、ＡＡＣＡＡＡＡＧＧＵＵＵＵＵＣＡＵＧＧＡＣ、ＶＥＧＦＲ遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0042】
ｍＴＯＲ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＧＡＵＡＧＵＵＧＧＣＡＡＡＵＣＵＧＣＣＡ、ＡＣＵＡＵＵＵＣＡＵＣＣＡＵＡＵＡＡＧＧＵ、ＡＡＡＡＵＧＵＵＧＵＣＡＡＡＧＡＡＧＧＧＵ、ＡＡＡＡＡＵＧＵＵＧＵＣＡＡＡＧＡＡＧＧＧ、ＵＧＡＵＵＵＣＵＵＣＣＡＵＵＵＣＵＵＣＵＣ、ｍＴＯＲ遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0043】
ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＡＡＡＣＡＵＡＡＵＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣ、ＵＡＡＡＡＡＡＣＡＵＡＡＵＣＡＡＡＡＧＡＡ、ＡＡＵＡＡＵＡＡＡＵＡＡＵＣＡＣＡＡＧＵＧ、ＵＵＵＵＣＡＣＧＧＡＡＡＡＣＡＵＧＵＣＵＧ、ＡＡＡＣＡＵＡＡＵＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡ、ＴＮＦ－α遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0044】
ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＵＡＡＵＣＡＵＣＵＣＣＡＵＵＡＡＵＧＵＣ、ＡＡＡＣＡＡＵＵＣＣＵＵＵＵＵＵＡＵＣＵＵ、ＡＵＵＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＡＣＵＵＵＧＡＧ、ＡＵＡＡＵＧＡＡＧＧＡＵＡＵＡＣＡＡＣＡＧ、ＵＵＣＵＵＵＡＵＵＣＡＵＡＡＡＡＧＵＣＵＣ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0045】
Ｂ７遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＵＵＵＣＵＵＵＧＧＧＵＡＡＵＣＵＵＣＡＧ、 ＡＧＡＡＡＡＡＵＵＣＣＡＣＵＵＵＵＵＣＵＵ、ＡＵＵＵＣＡＡＡＧＵＣＡＧＡＵＡＵＡＣＵＡ、 ＡＣＡＡＡＡＡＵＵＣＣＡＵＵＵＡＣＵＧＡＧ、ＡＵＵＡＵＵＧＡＧＵＵＡＡＧＵＡＵＵＣＣＵ、Ｂ７遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0046】
ＴＧＦ－β１遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＣＧＧＡＡＡＵＡＡＣＣＵＡＧＡＵＧＧＧＣ、ＵＧＡＡＣＵＵＧＵＣＡＵＡＧＡＵＵＵＣＧＵ、ＵＵＧＡＡＧＡＡＣＡＵＡＵＡＵＡＵＧＣＵＧ、ＵＣＵＡＡＣＵＡＣＡＧＵＡＧＵＧＵＵＣＣＣ、ＵＣＵＣＡＧＡＣＵＣＵＧＧＧＧＣＣＵＣＡＧ、ＴＧＦ－β１遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0047】
Ｈ２－Ｋ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＡＡＡＡＣＡＡＡＵＣＡＡＵＣＡＡＡＣＡＡ、 ＵＣＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＵＣＡＡＵＣＡＡ、ＵＡＵＧＡＧＡＡＧＡＣＡＵＵＧＵＣＵＧＵＣ、ＡＡＣＡＡＵＣＡＡＧＧＵＵＡＣＡＵＵＣＡＡ、ＡＣＡＡＡＡＣＣＵＣＵＡＡＧＣＡＵＵＣＵＣ、Ｈ２－Ｋ遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0048】
Ｈ２－Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＡＵＣＵＣＧＧＡＧＡＧＡＣＡＵＵＵＣＡＧ、ＡＡＵＧＵＵＧＵＧＵＡＡＡＧＡＧＡＡＣＵＧ、ＡＡＣＡＵＣＡＧＡＣＡＡＵＧＵＵＧＵＧＵＡ、ＵＧＵＵＡＡＣＡＡＵＣＡＡＧＧＵＣＡＣＵＵ、ＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＵＣＵＡＡＧＣＡＵ、Ｈ２－Ｄ遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0049】
Ｈ２－Ｌ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＧＡＵＣＣＧＣＵＣＣＣＡＡＵＡＣＵＣＣＧＧ、 ＡＵＣＵＧＣＧＵＧＡＵＣＣＧＣＵＣＣＣＡＡ、ＵＣＧＧＡＧＡＧＡＣＡＵＵＵＣＡＧＡＧＣＵ、ＵＣＵＣＧＧＡＧＡＧＡＣＡＵＵＵＣＡＧＡＧ、 ＡＡＵＣＵＣＧＧＡＧＡＧＡＣＡＵＵＵＣＡＧ、Ｈ２－Ｌ遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0050】
ＨＬＡ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＵＣＵＧＧＡＵＧＧＵＧＵＧＡＧＡＡＣＣＧ、ＵＧＵＣＡＣＵＧＣＵＵＧＣＡＧＣＣＵＧＡＧ、ＵＣＡＣＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＡＡ、 ＵＵＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＡＧＵＣＡＧＧＧＵ、ＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＵＧＣＡ、ＨＬＡ遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0051】
ＧＤＦ１５遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＡＵＡＡＡＵＡＣＡＧＣＵＧＵＵＵＧＧＧＣ、ＡＧＡＣＵＵＡＵＡＵＡＡＡＵＡＣＡＧＣＵＧ、ＡＡＵＵＡＡＵＡＡＵＡＡＡＵＡＡＣＡＧＡＣ、ＡＵＣＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＵＣＡＣＣＧＵＣ、ＵＧＣＡＡＣＵＣＣＡＧＣＵＧＧＧＧＣＣＧＵ、ＧＤＦ１５遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0052】
ＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＡＵＧＡＡＡＵＧＵＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡ、ＡＡＵＣＡＵＡＵＣＣＵＵＡＡＡＡＵＧＧＡＡ、ＵＡＡＵＣＡＵＡＵＣＣＵＵＡＡＡＡＵＧＧＡ、ＵＧＡＡＡＡＡＵＣＣＵＵＡＧＵＵＵＵＣＡＵ、ＡＧＡＡＧＵＡＡＡＡＡＡＣＵＡＵＵＧＣＧＡ、ＴＮＣ遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0053】
ＰＴＰ１Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＧＡＵＡＵＡＧＵＣＡＵＵＡＵＣＵＵＣＵＵ、ＵＣＣＡＵＵＵＵＵＡＵＣＡＡＡＣＵＡＧＣＧ、ＡＵＵＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＡＵＡＵＧＧＡＧ、ＡＡＵＵＵＵＡＡＵＡＣＡＵＵＡＵＵＧＧＵＵ、ＵＵＵＡＵＵＡＵＵＧＵＡＣＵＵＵＵＵＧＡＵ、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0054】
ｍＨＴＴ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＵＡＵＧＵＵＵＵＣＡＣＡＵＡＵＵＧＵＣＡＧ、ＡＵＵＵＡＧＵＡＧＣＣＡＡＣＵＡＵＡＧＡＡ、ＡＵＧＵＵＵＵＵＣＡＡＵＡＡＡＵＧＵＧＣＣ、ＵＡＵＧＡＡＵＡＧＣＡＵＵＣＵＵＡＵＣＵＧ、ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＣＵＣＵＵＡＡＵＡＣＡＡ、ｍＨＴＴ遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0055】
Ｌｒｒｋ２遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＵＵＡＡＣＡＵＧＡＡＡＡＵＡＵＣＡＣＵＵ、ＵＵＡＡＣＡＡＵＡＵＣＡＵＡＵＡＡＵＣＵＵ、ＡＵＣＵＵＵＡＡＡＡＵＵＵＧＵＵＡＡＣＧＣ、ＵＵＧＡＵＵＵＡＡＧＡＡＡＡＵＡＧＵＣＵＣ、ＵＵＵＧＡＵＡＡＣＡＧＵＡＵＵＵＵＵＣＵＧ、Ｌｒｒｋ２遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0056】
α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子のｓｉＲＮＡは、ＡＵＡＵＡＵＵＡＡＣＡＡＡＵＵＵＣＡＣＡＡ、ＡＡＧＵＡＵＵＡＵＡＵＡＵＡＵＵＡＡＣＡＡ、ＡＵＡＡＣＵＵＵＡＵＡＵＵＵＵＵＧＵＣＣＵ、ＵＡＡＣＵＡＡＡＡＡＡＵＵＡＵＵＵＣＧＡＧ、ＵＣＧＡＡＵＡＵＵＡＵＵＵＡＵＵＧＵＣＡＧ、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子の発現を阻害する他の配列及び上記配列と８０％超の相同性を有する配列を含む。
【0057】
ｍｉＲＮＡ－２１のアンチセンス鎖は５’－ＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡ－３’である。
【0058】
なお、上記の「８０％超の相同性を有する配列」は、相同性が８５％、８８％、９０％、９５％、９８％などであってもよい。
【0059】
任意選択に、前記ＲＮＡ断片は、ＲＮＡ配列本体と、ＲＮＡ配列本体をリボース修飾した修飾ＲＮＡ配列とを含む。すなわち、ＲＮＡ断片は、少なくとも１つのＲＮＡ配列本体のみから構成されていてもよいし、少なくとも１つの修飾ＲＮＡ配列のみから構成されていてもよいし、ＲＮＡ配列本体と修飾ＲＮＡ配列とから構成されていてもよい。
【0060】
本発明において、前記単離された核酸は、そのバリアント及び誘導体をさらに含む。当業者であれば、一般的な方法を用いて前記核酸を修飾することができる。修飾方式には、メチル化修飾、ヒドロカルビル修飾、グリコシル修飾（例えば、２－メトキシ－グリコシル修飾、ヒドロカルビル－グリコシル修飾、糖環修飾など）、核酸化修飾、ペプチドセグメント修飾、脂質修飾、ハロゲン修飾、核酸修飾（例えば、「ＴＴ」修飾）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の一実施形態では、前記修飾は、ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエート、２’－Ｏメトキシエチル（ＭＯＥ）、２’－フルオロ、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミドエステル、カルボキシメチルエステルおよびそれらの組み合わせから選択される。本発明の一実施形態では、前記修飾はヌクレオチドの修飾であり、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、鎖核酸（ＬＮＡ）、アラビノース－核酸（ＦＡＮＡ）、アナログ、誘導体、及びそれらの組み合わせから選択される。好ましくは、前記修飾は、２’フルオロピリミジン修飾である。２’フルオロピリミジン修飾はＲＮＡ上のピリミジンヌクレオチドの２’－ＯＨを２’－Ｆで置換し、２’－ＦはＲＮＡを生体内のＲＮＡ酵素に認識されにくくすることができ、それによってＲＮＡ断片の体内送達の安定性を高める。
【0061】
任意選択に、前記送達システムは、ヒトを含む哺乳動物で使用されるものである。
【0062】
本願はまた、上記のいずれかに記載の、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供する。
【0063】
任意選択に、前記薬物の投与方法は、経口投与、吸入投与、皮下注射投与、筋肉注射投与、静脈注射投与を含む。静脈注射が好ましい。
【0064】
任意選択に、前記薬物は、癌、肺線維症、結腸炎、肥満、肥満に起因する心血管疾患、２型糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、重症筋無力症、アルツハイマー病又は移植片対宿主病を治療する薬物である。
【0065】
任意選択に、前記薬物は、上記のウイルスベクターを含み、具体的には、ここでのウイルスベクターは、ＲＮＡ断片を担持した、又はＲＮＡ断片及びターゲティングタグを担持したウイルスベクターを表し、宿主体内に入って、肝臓部位で富化し、自己集合して複合構造エクソソームを形成することができ、この複合構造は、標的組織にＲＮＡ断片を送達し、ＲＮＡ断片を標的組織で発現させ、それに対応する遺伝子の発現を阻害し、疾患を治療する目的を達成することができる。
【0066】
前記薬物の剤形は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸薬、座薬、軟膏剤、溶液剤、懸濁剤、ローション剤、ゲル剤、ペースト剤などであってもよい。
【発明の効果】
【0067】
本願の技術的効果は次のとおりである。
本願によるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムは、ウイルスをベクターとし、ウイルスベクターを成熟した注入物とし、その安全性及び信頼性が十分に検証されており、創薬性が非常に良好である。最終的に効果を発揮するＲＮＡ配列は内因性エクソソームに包み込まれて送達され、免疫反応は一切存在せず、このエクソソームの安全性を検証する必要はない。この送達システムは、各種の小分子ＲＮＡを送達することができ、汎用性が高い。またウイルスの製造はエクソソームやタンパク質、ポリペプチドなどの物質の製造よりも安価で経済的である。本願によるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムは、生体内で自己集合された後、ＡＧＯ２と緊密に結合して富化して複合構造（エクソソーム）になることができ、これにより、その早期分解を防止し、循環中の安定性を維持することができるだけではなく、受容体細胞による吸収、細胞質内での放出、及びリソソームの脱出に有利であり、必要な用量は低い。
本願によるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムは、薬物に使用されると、薬物送達プラットフォームを提供し、このプラットフォームを通じてより多くのＲＮＡシステム薬物の研究開発基盤が提供され得、ＲＮＡシステム薬物の研究開発及び使用に極めて大きな推進効果をもたらすことができる。
本願によるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムは、ウイルスをベクターとし、ウイルスベクターを成熟した注入物とし、その安全性及び信頼性が十分に検証されており、創薬性が非常に良好である。最終的に効果を発揮するＲＮＡ配列は内因性エクソソームに包み込まれて送達され、免疫反応は一切存在せず、このエクソソームの安全性を検証する必要はない。この送達システムは、各種の小分子ＲＮＡを送達することができ、汎用性が高い。またウイルスの製造はエクソソームやタンパク質、ポリペプチドなどの物質の製造よりも安価で経済的である。本願によるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムは、生体内で自己集合された後、ＡＧＯ２と緊密に結合して富化して複合構造（エクソソーム）になることができ、これにより、その早期分解を防止し、循環中の安定性を維持することができるだけではなく、受容体細胞による吸収、細胞質内での放出、及びリソソームの脱出に有利であり、必要な用量は低い。
本願によるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムは、薬物に使用されると、薬物送達プラットフォームを提供し、このプラットフォームを通じてより多くのＲＮＡシステム薬物の研究開発基盤が提供され得、ＲＮＡシステム薬物の研究開発及び使用に極めて大きな推進効果をもたらすことができる。
【図面の簡単な説明】
【0068】
【図1】本願の一実施例によるマウス結腸炎の治療状況及びＲＮＡ発現レベルの比較図である。
【図2】本願の一実施例によるマウスサイトカイン濃度及び結腸ＨＥ染色の比較図である。
【図3】本願の一実施例によるマウス結腸炎の治療状況の比較図である。
【図4】本願の一実施例によるマウスの疾患活動指数及び複数のｓｉＲＮＡレベルの比較図である。
【図5】本願の一実施例によるマウスの複数のｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡレベルの比較図である。
【図6】本願の一実施例によるマウス結腸ＨＥ染色の比較図である。
【図7】本願の一実施例によるＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡに基づくマウス肺癌の治療状況を示す図である。
【図8】本願の一実施例によるＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡに基づくマウス肺癌の治療状況を示す図である。
【図9】本願の一実施例によるマウスの複数の酵素の含有量の比較図である。
【図10】本願の一実施例によるマウスのヒドロキシプロリン含有量、ｍＲＮＡレベルの比較図である。
【図11】本願の一実施例によるマウスの生存状況及び腫瘍評価の比較図である。
【図12】本願の一実施例によるマウス肥満の治療状況の比較図である。
【図13】本願の一実施例によるマウスの肥満指標の比較図である。
【図14】本願の一実施例によるマウスハンチントン病の治療状況の比較図である。
【図15】本願の一実施例による回路の構築及び特徴付け図である。
【図16】本願の一実施例によるアデノ随伴ウイルスベクターの肝、肺、血漿、エクソソームにおける富化効果及びＥＧＦＲ遺伝子発現量の検出であり、図において、Ａは、ＲＮＡ配列を担持したアデノ随伴ウイルスベクターの肝及び肺における富化効果であり、Ｂは、ＲＮＡ配列を担持したアデノ随伴ウイルスベクターの血漿及びエクソソームにおける富化効果であり、Ｃ及びＤは、それぞれＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量の結果である。
【図17】本願の一実施例によるレンチウイルスベクターの肝、肺、血漿、エクソソームにおける富化効果及びＥＧＦＲ遺伝子発現量の検出であり、図において、Ａは、ＲＮＡ配列を担持したレンチウイルスベクターの肝及び肺における富化効果であり、Ｂは、ＲＮＡ配列を担持したレンチウイルスベクターの血漿及びエクソソームにおける富化効果であり、Ｃ及びＤは、それぞれＥＧＦＲのタンパク質発現量及びｍＲＮＡ発現量の結果である。
【図18】本願の一実施例による、２種類の異なるアデノウイルスベクターによって構築された異なる６種類のＲＮＡ配列を含有する遺伝子ループであり、静脈注射後の対応するタンパク質及びｍＲＮＡの検出結果であり、図において、Ａは、ＥＧＦＲタンパク質発現量、ＢはＴＮＣタンパク質発現量、ＣはＥＧＦＲ ｍＲＮＡ発現量、ＤはＴＮＣ ｍＲＮＡ発現量である。
【図19】本願の一実施例による、２種類のアデノウイルスベクターと６種類のＲＮＡ配列のうちの任意の２種類又は任意の３種類のＲＮＡ配列からなるＲＮＡ断片を構築した後の、静脈注射後のタンパク質発現量であり、図において、Ａは、２種類のアデノウイルスベクターと６種類のＲＮＡ配列のうちの任意の２種類のＲＮＡ配列からなるＲＮＡ断片を構築した後に検出されたＥＧＦＲ及びＴＮＣのタンパク質含有量であり、Ｂは、２種類のアデノウイルスベクターと６種類のＲＮＡ配列のうちの任意の２種類のＲＮＡ配列からなるＲＮＡ断片を構築した後に検出されたＥＧＦＲ及びＴＮＣのｍＲＮＡ含有量であり、Ｃは、２種類のアデノウイルスベクターと６種類のＲＮＡ配列のうちの任意の３種類のＲＮＡ配列からなるＲＮＡ断片を構築した後に検出されたＥＧＦＲ及びＴＮＣのタンパク質含有量であり、Ｄは、２種類のアデノウイルスベクターと６種類のＲＮＡ配列のうちの任意の４種類のＲＮＡ配列からなるＲＮＡ断片を構築した後に検出されたＥＧＦＲ及びＴＮＣのｍＲＮＡ含有量である。
【図20】本願の一実施例による、個々のＲＮＡ断片と個々のターゲティングタグとを組み合わせてウイルスベクターに構築した後、静脈注射して検出されたＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ及びＴＮＣ ｓｉＲＮＡの膵臓及び脳における富化効果、並びにＥＧＦＲ及びＴＮＣの発現量であり、図において、Ａ～Ｄは、それぞれＡＤ２／ＡＤ５＋ＰＴＰ／ＲＶＧ＋ｓｉＲＥＧＦＲ／ｓｉＲＴＮＣの富化効果の検出結果であり、Ｅ～Ｈは、それぞれＡＤ２／ＡＤ５＋ＰＴＰ／ＲＶＧ＋ｓｉＲＥＧＦＲのＥＧＦＲタンパク質含有量及びｍＲＮＡ含有量の検出結果であり、Ｉ～Ｌは、それぞれＡＤ２／ＡＤ５＋ＰＴＰ／ＲＶＧ＋ｓｉＲＴＮＣのＴＮＣタンパク質含有量及びｍＲＮＡ含有量の検出結果である。
【図21】本願の一実施例による、２種類のＲＮＡ断片と２種類のターゲティングタグとを任意に組み合わせてウイルスベクターに構築した後、静脈注射して得られたＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ及びＴＮＣ ｓｉＲＮＡの膵臓、脳における富化効果であり、図において、Ａ～Ｂは、それぞれＡＤ２／ＡＤ５＋ＰＴＰ／ＲＶＧ＋ｓｉＲＥＧＦＲ＋ＴＮＣの富化効果の検出結果であり、Ｃ～Ｄは、それぞれＡＤ２／ＡＤ５＋（ＰＴＰ－ＲＶＧ）＋ｓｉＲＥＧＦＲの富化効果の検出結果であり、Ｅは、ＡＤ２／ＡＤ５＋（ＰＴＰ－ＲＶＧ）＋ｓｉＲＥＧＦＲ＋ＴＮＣの富化効果の検出結果である。
【図22】本願の一実施例による、２種類のＲＮＡ断片と２種類のターゲティングタグとを任意に組み合わせてウイルスベクターに構築した後、静脈注射して検出されたＥＧＦＲ及びＴＮＣの膵臓、脳における発現量であり、図において、Ａ～Ｄは、それぞれＡＤ２／ＡＤ５＋ＰＴＰ／ＲＶＧ＋ｓｉＲＥＧＦＲ＋ＴＮＣのＥＧＦＲタンパク質含有量及びｍＲＮＡ含有量の検出結果であり、Ｅ～Ｈは、それぞれＴＮＣタンパク質含有量及びｍＲＮＡ含有量の検出結果である。
【図23】本願の別の実施例による、２種類のＲＮＡ断片と２種類のターゲティングタグとを任意に組み合わせてウイルスベクターに構築した後、静脈注射して検出されたＥＧＦＲ及びＴＮＣの膵臓、脳における発現量であり、図において、Ａ～Ｂは、それぞれＡＤ２／ＡＤ５＋（ＰＴＰ－ＲＶＧ）＋ｓｉＲＥＧＦＲのＥＧＦＲタンパク質含有量及びｍＲＮＡ含有量の検出結果であり、Ｃ～Ｄは、ＡＤ２／ＡＤ５＋（ＰＴＰ－ＲＶＧ）＋ｓｉＲＥＧＦＲ＋ＴＮＣのＥＧＦＲタンパク質含有量及びｍＲＮＡ含有量の検出結果であり、Ｅ～Ｆは、ＡＤ２／ＡＤ５＋（ＰＴＰ－ＲＶＧ）＋ｓｉＲＴＮＣのＴＮＣタンパク質含有量及びｍＲＮＡ含有量の検出結果であり、Ｇ～Ｈは、ＡＤ２／ＡＤ５＋（ＰＴＰ－ＲＶＧ）＋ｓｉＲＥＧＦＲ＋ＴＮＣのＴＮＣタンパク質含有量及びｍＲＮＡ含有量の検出結果である。
【図24】本願の一実施例による、２種類の回路によって構築された送達システムの静脈注射後のｓｉＲＮＡの肝、肺、血漿、エクソソームにおける富化結果、並びにＥＧＦＲタンパク質及びｍＲＮＡの発現量の検出結果であり、図において、Ａは、送達システムＡＡＶ－ｓｉＲＥ及びＡＡＶ－ＧＥ１１－ｓｉＲＥの肝、肺における富化効果であり、Ｂは、送達システムＡＡＶ－ｓｉＲＥ及びＡＡＶ－ＧＥ１１－ｓｉＲＥの血漿、エクソソームにおける富化効果であり、Ｃは、送達システムＡＡＶ－ｓｉＲＥ及びＡＡＶ－ＧＥ１１－ｓｉＲＥのＥＧＦＲタンパク質含有量の検出結果であり、Ｄは、送達システムＡＡＶ－ｓｉＲＥ及びＡＡＶ－ＧＥ１１－ｓｉＲＥのＥＧＦＲ ｍＲＮＡ含有量の検出結果である。
【図25】本願の一実施例による、５’フランキング配列／ループ配列／３’フランキング配列と８０％超の相同性を有する２つの明確な配列を含有するアデノウイルスベクターの肺における富化効果であり、図において、Ａは異なる５’フランキング配列の富化効果であり、Ｂは、異なるループ配列の富化効果であり、Ｃは異なる３’フランキング配列の富化効果である。
【図26】本願の実施例による配列４、及び配列４と８０％超の相同性を有する２つの配列４－１、４－２をＡＡＶベクターに構築して、静脈注射してから９時間後の配列の肺組織における富化効果であり、図において、Ａは、配列４で連結されている場合、ＡＡＶ－ｓｉＲＥ及びＡＡＶ－ｓｉＲＴのｓｉＲＮＡ含有量の検出結果であり、Ｂは、配列４－１で連結されている場合、ＡＡＶ－ｓｉＲＥ及びＡＡＶ－ｓｉＲＴのｓｉＲＮＡ含有量の検出結果であり、Ｃは、配列４－２で連結されている場合、ＡＡＶ－ｓｉＲＥ及びＡＡＶ－ｓｉＲＴのｓｉＲＮＡ含有量の検出結果である。
【図27】本願の一実施例による異なる長さ配列を含有する遺伝子ループの静脈注射後のＥＧＦＲ発現量の検出結果であり、図において、Ａは、ＥＧＦＲタンパク質含有量の検出結果であり、Ｂは、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡ含有量の検出結果である。
【発明を実施するための形態】
【0069】
以下、図面を参照して、本願の具体的な実施形態について説明する。
【0070】
まず、本発明に係る専門名詞、試験方法などについて説明する。
【0071】
ヘマトキシリン－イオシン染色法（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ）は、ＨＥ染色と略称する。ＨＥ染色は組織学、病理学の教育や科学研究において最も基礎的で、最も広く使用されている技術方法の１つである。
【0072】
ヘマトキシリン染色液は塩基性で、組織の好塩基性構造（例えば、リボソーム、細胞核及び細胞質中のリボ核酸など）を青紫色に染色することができ、イオシンは酸性染料であり、組織の好酸性構造（例えば、レビー小体、アルコール小体及び細胞質の大部分を含む細胞内及び細胞間のタンパク質）をピンク色に染色し、細胞組織全体の形態が鮮明に見られるようにすることができる。
【0073】
ＨＥ染色の具体的なステップには、サンプル組織の固定化と切片化、組織サンプルの脱ろう、組織サンプルの水和、組織切片のヘマトキシリン染色、分化と抗青処理、組織切片のイオチン染色と脱水、組織サンプル切片の風乾とシーリング、顕微鏡での観察及び写真撮影が含まれる。
【0074】
ウェスタン免疫ブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）は、タンパク質を膜に転写し、抗体を用いて検出するもので、既知の発現タンパク質に対しては、対応する抗体を一次抗体として検出することができ、新規遺伝子の発現産物に対しては、融合部分の抗体を用いて検出することができる。
【0075】
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔにはポリアクリルアミドゲル電気泳動が使用されており、被検出物はタンパク質、「プローブ」は抗体、「発色」には、標識された二次抗体が使用される。ＰＡＧＥにより分離されたタンパク質サンプルは、非共有結合の形でタンパク質を吸着し、電気泳動で分離されたポリペプチドタイプ及びその生物学的活性を維持することができる固相担体（例えば、硝酸セルロースフィルム）に転写され、固相担体上のタンパク質又はポリペプチドを抗原として、対応する抗体と免疫反応を起こし、酵素又は同位体標識された第２抗体と反応し、基質発色又は自己放射現像を経て、電気泳動で分離された特定の目的遺伝子によって発現されたタンパク質成分を検出する。 そのステップには、主に、タンパク質の抽出、タンパク質の定量化、ゲル製造と電気泳動、膜転写、免疫標識と現像が含まれる。
【0076】
免疫組織化学技術（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）又は免疫細胞化学技術（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）と呼ばれる免疫組織化学は、抗原抗体反応、すなわち抗原と抗体が特異的に結合する原理を利用しており、抗体を標識する発色剤（フルオレセイン、酵素、金属イオン、同位体）を化学反応により発色させて組織細胞内抗原（ポリペプチド及びタンパク質）を特定し、その局在化、定性化及び相対的定量化について研究をする。
【0077】
免疫組織化学の主要なステップには、切片浸漬、一晩の乾燥、キシレン脱蝋、勾配アルコール脱蝋（１００％、９５％、９０％、８０％、７５％、７０％、５０％、毎回３ｍｉｎ）、二重蒸留、３％過酸化水素水を滴下してカタラーゼを除去すること、水洗、抗原修復、５％ＢＳＡを滴下して１ｈブロックすること、一次抗体希釈、ＰＢＳ緩衝液による洗浄、二次抗体のインキュベート、ＰＢＳ緩衝液による洗浄、発色液発色、水洗、ヘマトキシリン染色、勾配エタノール脱水、中性ゴムによるシーリングが含まれる。
【0078】
本発明に係るｓｉＲＮＡレベル、タンパク質含有量及びｍＲＮＡ含有量の検出は、いずれも、マウスの生体内にＲＮＡ送達システムを注射することにより、マウス幹細胞の生体外モデルを構築する。細胞、組織におけるｍＲＮＡ及びｓｉＲＮＡの発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲを用いて検出する。ｓｉＲＮＡの絶対定量は、標準品を用いて検量線を作成することにより決定する。内部参照に対する各ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡの発現量は２－ΔＣＴで表すことができ、ΔＣＴ＝Ｃサンプル－Ｃ内部参照である。ｓｉＲＮＡを増幅する場合、内部参照遺伝子はＵ６ ｓｎＲＮＡ（組織中）又はｍｉＲ－１６（血清、エクソソーム中）分子であり、ｍＲＮＡを増幅する場合、内部参照遺伝子はＧＡＰＤＨ又は１８ｓ ＲＮＡである。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ実験を用いて細胞、組織におけるタンパク質の発現レベルを検出し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてタンパク質の定量分析を行う。
【0079】
本発明による図面において、「＊」はＰ＜０．０５、「＊＊」はＰ＜０．０１、「＊＊＊」はＰ＜０．００５を表す。
【0080】
本発明において、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、別段の記載がない限り、当業者に一般に理解される意味を有する。また、本明細書で使用される試薬、材料や操作ステップは、すべて、当該分野で広く使用されている試薬、材料や通常のステップである。
【0081】
実施例１
本実施例は、送達が必要なＲＮＡ断片を担持したウイルスベクターであって、宿主の器官組織内で富化し、前記宿主の器官組織内に前記ＲＮＡ断片を含有する複合構造を内因的に自発的に形成することができ、前記複合構造が、標的組織内に進入して結合し、前記ＲＮＡ断片を標的組織に送達することができるウイルスベクターを含む、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムを提供する。
本実施例は、送達が必要なＲＮＡ断片を担持したウイルスベクターであって、宿主の器官組織内で富化し、前記宿主の器官組織内に前記ＲＮＡ断片を含有する複合構造を内因的に自発的に形成することができ、前記複合構造が、標的組織内に進入して結合し、前記ＲＮＡ断片を標的組織に送達することができるウイルスベクターを含む、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムを提供する。
【0082】
図１６～１７は、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターによって構築されたＲＮＡ送達システムが生体内での富化及び治療効果を有することを示し、図１６は、アデノ随伴ウイルスベクターの肝、肺、血漿、エクソソームにおける富化効果及びＥＧＦＲ遺伝子発現量の検出を示し、図１７は、レンチウイルスベクターの肝、肺、血漿、エクソソームにおける富化効果及びＥＧＦＲ遺伝子発現量の検出を示す。
【0083】
本実施例では、ウイルスベクターは、プロモーター及びターゲティングタグをさらに含む。前記ウイルスベクターは、プロモーター－ＲＮＡ配列、プロモーター－ターゲティングタグ、プロモーター－ＲＮＡ配列－ターゲティングタグのいずれか１つ又は複数の組み合わせを含み、前記ウイルスベクターのそれぞれは、少なくとも１つのＲＮＡ断片と１つのターゲティングタグを含み、前記ＲＮＡ断片及びターゲティングタグは、同一回路又は異なる回路にある。換言すれば、ウイルスベクターには、プロモーター－ＲＮＡ配列－ターゲティングタグのみが含まれていてもよいし、プロモーター－ＲＮＡ配列、プロモーター－ターゲティングタグの組み合わせ、又はプロモーター－ターゲティングタグ、プロモーター－ＲＮＡ配列－ターゲティングタグの組み合わせが含まれていてもよい。
【0084】
図２０～２３において、ＲＮＡ断片１はｓｉＲＥＧＦＲであり、ＲＮＡ断片２はｓｉＲＴＮＣであり、ターゲティングタグ１はＰＴＰであり、ターゲティングタグ２はＲＶＧである。２種類のＲＮＡ断片と２種類のターゲティングタグを単独又は任意に組み合わせてウイルスベクターに構築した後、マウスの体内に尾静脈注射し、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ及びＴＮＣ ｓｉＲＮＡの膵臓、脳、血漿、及びエクソソームにおける富化効果、並びにＥＧＦＲ及びＴＮＣの発現量を検出した。
【0085】
さらに、前記ウイルスベクターは、前記回路を正しい構造に折り畳んで発現させることができるフランキング配列、補償配列、及びループ配列をさらに含み、前記フランキング配列は、５’フランキング配列及び３’フランキング配列を含み、前記ウイルスベクターは、５’－プロモーター－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列、５’－プロモーター－ターゲティングタグ、５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ＲＮＡ断片－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列のいずれか１つ又は複数の回路の組み合わせを含んでもよい。
【0086】
ここで、前記５’フランキング配列は、好ましくは、ｇｇａｔｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｔｇｃｔｇａａｇｇｃｔｇｔａｔｇｃｔｇａａｔｔｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、ｇｇａｔｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｔｇｃｔｇａａｇｇｃｔｇｔａｔｇｃｔｇａａｔｔｃと８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％の相同性を有する配列などを含む。
【0087】
前記ループ配列は、好ましくは、ｇｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔｇａｃ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、ｇｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔｇａｃと８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％の相同性を有する配列などを含む。
【0088】
前記３’フランキング配列は、好ましくは、ａｃｃｇｇｔｃａｇｇａｃａｃａａｇｇｃｃｔｇｔｔａｃｔａｇｃａｃｔｃａｃａｔｇｇａａｃａａａｔｇｇｃｃｃａｇａｔｃｔｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇ又はそれと８０％超の相同性を有する配列であり、ａｃｃｇｇｔｃａｇｇａｃａｃａａｇｇｃｃｔｇｔｔａｃｔａｇｃａｃｔｃａｃａｔｇｇａａｃａａａｔｇｇｃｃｃａｇａｔｃｔｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇと８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％の相同性を有する配列などを含む。
【0089】
前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～５位の塩基が欠失されている。前記補償配列は、ＲＮＡ断片に１つのＲＮＡ配列のみが含まれる場合、このＲＮＡ配列の逆相補配列であってもよく、その中の任意の１～５位の塩基が欠失されている。
【0090】
好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～３位の塩基が欠失されている。前記補償配列は、ＲＮＡ断片に１つのＲＮＡ配列のみが含まれる場合、このＲＮＡ配列の逆相補配列であってもよく、その中の任意の１～３位の塩基が欠失されている。
【0091】
より好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の任意の１～３位の連続して配列した塩基が欠失されている。前記補償配列は、ＲＮＡ断片に１つのＲＮＡ配列のみが含まれる場合、このＲＮＡ配列の逆相補配列であってもよく、その中の任意の１～３位の連続して配列した塩基が欠失されている。
【0092】
最も好ましくは、前記補償配列は、前記ＲＮＡ断片の逆相補配列であって、その中の９位及び／又は１０位の塩基が欠失されている。前記補償配列は、ＲＮＡ断片に１つのＲＮＡ配列のみが含まれる場合、このＲＮＡ配列の逆相補配列であってもよく、その中の９位及び／又は１０位が欠失されている。９位と１０位の塩基の欠失が最も効果的である。
【0093】
なお、上記のフランキング配列、補償配列、ループ配列はすべて勝手に選択したのではなく、大量の理論研究と試験に基づいて決定したので、上記の特定のフランキング配列、補償配列、ループ配列の協力の下で、ＲＮＡ断片の発現率を最大限に高めることができる。
【0094】
図２４において、５’－プロモーター－５’フランキング配列－ＲＮＡ配列－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列に対応する送達ベクター名はＡＡＶ－ｓｉＲＥであり、５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ＲＮＡ配列－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列に対応する送達ベクター名は、ＡＡＶ－ＧＥ１１－ｓｉＲＥであり、図２４は、静脈注射後のｓｉＲＮＡの肝、肺、血漿、エクソソームにおける富化結果、並びに、ＥＧＦＲタンパク質及びｍＲＮＡの発現量の検出結果である。
【0095】
図２５において、アデノウイルスベクターの肺部における富化効果のデータを示し、アデノウイルスベクター中の配列は、５’フランキング配／ループ配列／３’フランキング配列と８０％超の相同性を有する２つの明確な配列である。
【0096】
上記の各配列の詳細を以下の表１に示す。
【0097】
【表1】
【0098】
ウイルスベクターが２つ以上の回路を担持する場合、隣接する回路は、配列１－配列２－配列３で連結されてもよく、ここで、配列１はＣＡＧＡＴＣであることが好ましく、配列２は５～８０塩基からなる配列、例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５塩基からなる配列、好ましくは、１０～５０塩基からなる配列、より好ましくは２０～４０塩基からなる配列であってもよく、配列３はＴＧＧＡＴＣであることが好ましい。
【0099】
配列２の詳細を以下の表２に示す。
【0100】
【表2】
【0101】
より好ましくは、ウイルスベクターが２つ以上の回路を担持する場合、隣接する回路は、配列４又は配列４と８０％超の相同性を有する配列で連結され、ここで、配列４はＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣである。
【0102】
図２６は、配列４及び配列４と８０％超の相同性を有する２つの配列である配列４－１、４－２をＡＡＶベクターに構築し、９時間静脈注射後の肺組織のＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ含有量の検出結果である。
【0103】
配列の詳細を以下の表３に示す。
【0104】
【表3】
【0105】
上記のＲＮＡ断片は、医療的に意味のある１つ又は２つ以上の特定のＲＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ配列は、対象受容体において発現可能であり、前記補償配列は対象受容体において発現不可能である。ＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ配列であってもよく、ｓｉＲＮＡ配列であることが好ましい。
【0106】
１つのＲＮＡ配列の長さが、１５～２５ヌクレオチド（ｎｔ）、好ましくは１８～２２ｎｔ、例えば、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔであってもよい。この配列の長さの範囲はランダムに選択されたものではなく、試験を繰り返すことによって決定されたものである。大量の試験により、ＲＮＡ配列の長さが１８ｎｔよりも短く、特に１５ｎｔよりも短い場合、このＲＮＡ配列はほとんど無効で、作用を発揮しないが、ＲＮＡ配列の長さが２２ｎｔよりも長く、特に２５ｎｔよりも長い場合、回路のコストが大幅に向上するだけでなく、効果も長さが１８～２２ｎｔのＲＮＡ配列より優れておらず、経済効果が悪いことが証明された。したがって、ＲＮＡ配列の長さが１５～２５ｎｔ、特に１８～２２ｎｔの場合、コストと作用の両立が最も効果的である。
【0107】
図２７は、それぞれ 様々な長さのＲＮＡ配列によって構築された遺伝子ループの静脈注射後のＥＧＦＲ発現量の検出であり、ここで、ＲＮＡ配列の長さがそれぞれ１８、２０、２２のプラスミドは、それぞれＡＡＶ－ｓｉＲＥ（１８）、ＡＡＶ－ｓｉＲＥ（２０）、ＡＡＶ－ｓｉＲＥ（２２）に対応している。
【0108】
様々な長さのＲＮＡ配列を以下の表４に示す。
【0109】
【表4】
【0110】
前記ＲＮＡ配列は、ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＫＲＡＳ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＶＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＴＯＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｂ７遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ－β１遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｋ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｄ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｈ２－Ｌ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＨＬＡ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＧＤＦ１５遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ－２１のアンチセンス鎖、ｍｉＲＮＡ－２１４のアンチセンス鎖、ＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｍＨＴＴ遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｌｒｒｋ２遺伝子のｓｉＲＮＡ、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ遺伝子のｓｉＲＮＡ、又は上記配列と８０％超の相同性を有するＲＮＡ配列、又は上記ＲＮＡをコードする核酸分子から選択されるいずれか１種又は複数種である。
【0111】
上記の各種遺伝子のｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖はいずれもこの遺伝子、ｍｉＲＮＡの発現又は突然変異を阻害することにより、疾患を阻害する効果を達成することができる。これらの疾患には、癌、肺線維症、結腸炎、肥満、肥満に起因する心血管疾患、２型糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、重症筋無力症、アルツハイマー病、移植片対宿主病、及びこれらに関連する疾患が含まれるが、これらに限定されない。ここで関連疾患とは、上記のいずれか１又は複数の疾患の発症又は進行の過程で発生する関連疾患、合併症、後遺症など、又は上記の疾患と一定の関連性を有する他の疾患をいう。ここで、癌には、胃癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、脳癌、血液癌、腸癌、皮膚癌、リンパ癌、乳癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、血管腫、膠細胞腫、黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。
【0112】
ＲＮＡ断片中のＲＮＡ配列の数は、１、２又はそれ以上である。例えば、脳膠芽腫を治療する場合、同一ウイルスベクターにＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡとＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡを併用することができ、腸炎を治療する場合、ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、及びＢ７遺伝子のｓｉＲＮＡを併用することができる。
【0113】
同一ウイルスベクターに「ｓｉＲＮＡ１」と「ｓｉＲＮＡ２」を併用する例では、このウイルスベクターの機能構造領域は、（プロモーター－ｓｉＲＮＡ１）－連結配列－（プロモーター－ｓｉＲＮＡ２）－連結配列－（プロモーター－ターゲティングタグ）、又は（プロモーター－ターゲティングタグ－ｓｉＲＮＡ１）－連結配列－（プロモーター－ターゲティングタグ－ｓｉＲＮＡ２）、又は（プロモーター－ｓｉＲＮＡ１）－連結配列－（プロモーター－ターゲティングタグ－ｓｉＲＮＡ２）などと表現することができる。
【0114】
より具体的には、このウイルスベクターの機能構造領域は、（５’－プロモーター－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ１－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）－連結配列－（５’－プロモーター－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ２－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）－連結配列－（５’－プロモーター－ターゲティングタグ）、又は（５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ１－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）－連結配列－（５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ２－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）、又は（５’－プロモーター－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ１－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）－連結配列－（５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ２－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）、（５’－プロモーター－ターゲティングタグ－５’フランキング配列－ｓｉＲＮＡ１－ｓｉＲＮＡ２－ループ配列－補償配列－３’フランキング配列）などと表現することができる。その他の場合は同様に類推することができるので、ここでは詳しく説明しない。上記連結配列は、「配列１－配列２－配列３」又は「配列４」としてもよく、１つの括弧は完全な回路（ｃｉｒｃｕｉｔ）を表す。
【0115】
好ましくは、上記ＲＮＡは、その中のＲＮＡ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ）をリボース修飾することによって得られてもよく、２’フルオロピリミジン修飾が好ましい。２’フルオロピリミジン修飾はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ上のピリミジンヌクレオチドの２’－ＯＨを２’－Ｆで置換することであり、２’－Ｆは、人体内のＲＮＡ酵素をｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを識別しにくくすることができ、このようにＲＮＡの体内送達の安定性を高めることができる。
好ましくは、上記ＲＮＡは、その中のＲＮＡ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ）をリボース修飾することによって得られてもよく、２’フルオロピリミジン修飾が好ましい。２’フルオロピリミジン修飾はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ上のピリミジンヌクレオチドの２’－ＯＨを２’－Ｆで置換することであり、２’－Ｆは、人体内のＲＮＡ酵素をｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを識別しにくくすることができ、このようにＲＮＡの体内送達の安定性を高めることができる。
好ましくは、上記ＲＮＡは、その中のＲＮＡ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ）をリボース修飾することによって得られてもよく、２’フルオロピリミジン修飾が好ましい。２’フルオロピリミジン修飾はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ上のピリミジンヌクレオチドの２’－ＯＨを２’－Ｆで置換することであり、２’－Ｆは、人体内のＲＮＡ酵素をｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを識別しにくくすることができ、このようにＲＮＡの体内送達の安定性を高めることができる。
【0116】
本実施例に記載された宿主体内の器官は、肝臓であることが好ましい。肝臓はすべての哺乳動物の組織器官の中で最も活発な細胞開閉組織である。
【0117】
肝臓に特異的に感染すると、ウイルスベクターがＲＮＡ断片（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）を放出し、肝臓組織はＲＮＡ断片を自発的にエクソソーム内に包み込み、これらのエクソソームはＲＮＡ送達機構（送達が必要なＲＮＡを含む、ターゲティング構造を持つ複合構造）となる。
【0118】
このエクソソームに「正確な誘導」能力を持たせるために、生体内に注入されたウイルスベクターにターゲティングタグが設計され、このターゲティングタグも肝臓組織によってエクソソームに組み込まれ、特にある特定のターゲティングタグを選択すると、ターゲティングタグはエクソソームの表面に挿入され、それによってエクソソームを誘導することができるターゲティング構造となり、これは本発明に記載されたＲＮＡ送達機構の正確性を大幅に向上させ、潜在的な薬物送達効率を大幅に向上させることができる。
【0119】
ターゲティングタグの選択は創造的な労力を必要とするプロセスであり、一方では標的組織に応じて利用可能なターゲティングタグを選択する必要があり、他方ではそのターゲティングタグがターゲティング機能を達成するためにエクソソームの表面に安定的に出現することを保証する必要がある。現在、すでに選別されたターゲティングタグは、ターゲティングペプチド、ターゲティングタンパク質、抗体を含む。その中でも、ターゲティングペプチドには、ＲＶＧターゲティングペプチド（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１で示される）、ＧＥ１１ターゲティングペプチド（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２で示される）、ＰＴＰターゲティングペプチド（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３で示される）、ＴＣＰ－１ターゲティングペプチド（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４で示される）、ＭＳＰターゲティングペプチド（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５で示される）が含まれるが、これらに限定されない。ターゲティングタンパク質には、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６で示される）、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７で示される）、ＰＴＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８で示される）、ＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９で示される）、ＭＳＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０で示される）が含まれるが、これらに限定されない。
【0120】
その中で、ＲＶＧターゲティングペプチド、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、脳組織を正確に標的化することができる。ＧＥ１１ターゲティングペプチド、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ高発現器官組織、例えばＥＧＦＲ突然変異肺癌組織を正確に標的化することができる。ＰＴＰターゲティングペプチド、ＰＴＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、膵臓、特にヒト由来とマウス由来の膵臓癌組織中に特異的に発現するｐｌｅｃｔｉｎ－１タンパク質を正確に標的化することができる。ＴＣＰ－１ターゲティングペプチド、ＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、結腸を正確に標的化することができる。ＭＳＰターゲティングペプチド、ＭＳＰ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、筋肉組織を正確に標的化することができる。
【0121】
実際の応用において、ターゲティングタグは各種の異なるＲＮＡ断片と柔軟に組み合わせることができ、異なるターゲティングタグを異なるＲＮＡ断片と組み合わせることにより、様々な作用を果たすことができる。例えば、ＲＶＧターゲティングペプチド、ＲＶＧ－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡ、ＴＮＣ遺伝子のｓｉＲＮＡ、又は両者の組み合わせと組み合わせて膠芽腫を治療することができ、また、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡと組み合わせて肥満を治療することができ、また、ｍＨＴＴ遺伝子のｓｉＲＮＡと組み合わせてハンチントン舞踏症を治療することができ、また、ＬＲＲＫ２遺伝子のｓｉＲＮＡと組み合わせてパーキンソンを治療することができる。ＧＥ１１ターゲティングペプチド、ＧＥ１１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、ＥＧＦＲ遺伝子のｓｉＲＮＡと組み合わせて、ＥＧＦＲ遺伝子の高発現又は突然変異によって誘導される肺癌などの疾患を治療することができる。ＴＣＰ－１ターゲティングペプチド又はＴＣＰ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ融合タンパク質は、ＴＮＦ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｂ７遺伝子のｓｉＲＮＡ、又はこれら３つの任意の組み合わせと組み合わせて結腸炎又は結腸癌などを治療することができる。
【0122】
ウイルスベクターの選択及び構造の設計は、本発明に開示された技術の中核的な内容の１つであり、研究の結果、ウイルスベクターは、好ましくは、アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）であり、より好ましくは、アデノウイルス関連ウイルス５型（ＡＡＶ－５）、アデノウイルス関連ウイルス８型（ＡＡＶ－８）、又はアデノウイルス関連ウイルス９型（ＡＡＶ－９）である。
【0123】
そのほか、正確な送達の目的を達成するために、多種のウイルスベクターの組み込み形態を実験した結果、以下の別の最適化形態を得た。すなわち、前記ウイルスベクターはまた異なる構造を持つ多種のウイルスで構成されてもよく、その中の１つのウイルスはプロモーターとターゲティングタグを含み、その他のウイルスはプロモーターとＲＮＡ断片を含む。すなわち、ターゲティングタグとＲＮＡ断片を異なるウイルスベクターに組み込み、２種類のウイルスベクターを体内に注入し、この場合、そのターゲティング効果は同じターゲティングタグとＲＮＡ断片を１つのウイルスベクターに組み込むことによるターゲティング効果に相当する。
【0124】
より好ましくは、２種類の異なるウイルスベクターを宿主に注入する際に、まず、ＲＮＡ配列を組み込んだウイルスベクターを注入し、１～２時間後に、ターゲティングタグを含有するウイルスベクターを注入してもよく、これにより、より優れたターゲティング効果を達成することができる。
【0125】
上記の送達システムは、いずれも、ヒトを含む哺乳動物で使用され得る。
【0126】
送達システムの実現可能性を検証するために、次のような試験を行った。
【0127】
まず、図１５ａに示すように、コア回路（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｉｒｃｕｉｔ）のインフラストラクチャを合理的に設計し、異なる機能モジュールを自由に組み合わせることができるようにした。コア回路はプロモーター部分とｓｉＲＮＡ発現部分からなり、ｓｉＲＮＡを産生して組織し、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）のペイロードとすることを目的とする。他の組み合わせ可能なコンポーネント（プラグイン）は、プラグアンドプレイ機能を実現するためにコア回路のフレームワークに統合することができる。例えば、２種類の組み合わせ可能な部分を結合してｓｉＲＮＡの作用を最適化する。一方は、エクソンの膜アンカータンパク質を修飾して組織選択性を実現し、他方は、２つの分子標的を同時に阻害するために、２つ目のｓｉＲＮＡを共発現することができる。
【0128】
コア回路構築物については、図１５ａに示すように、ガイド鎖（ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ）の発現を最大化しながら、望ましくないパッセンジャー鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ）の発現を最小化するために、プロモーター部分の制御下で最適化されたｓｉＲＮＡ発現骨格部分をコード化するスキームを設計した。上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＥＧＦＲ）は、多くのヒト腫瘍（例えば、肺癌や膠芽腫）において頻繁に突然変異し、高発現する癌遺伝子であり、ｓｉＲＮＡ標的として選択された。そして、ヒト胚腎２９３ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）とマウス肝癌細胞（ｈｅｐ１－６）をｓｉＲＮＡ生体外集合用のシャーシ細胞（ｃｅｌｌ ｃｈａｓｓｉｓ）として選択した。ｓｉＲＮＡの産生効率を最適化するために、以下の２種類の設計スキームを比較した。一方は、ＣＭＶプロモーターを用いてｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）を発現し、ｍｉＲＮＡ配列をｓｉＲＮＡで置換することであり、他方は、Ｕ６プロモーターを用いて短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現することである。まず、一連のｍｉＲＮＡ前駆体の構造を研究し、ｓｉＲＮＡを産生する最適な骨格としてｐｒｅ－ｍｉＲ－１５５を選択した。次に、図１５ｂに示すように、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ（ＣＭＶ－ｓｉＲＥ）及びＵ６指向性ＥＧＦＲ ｓｈＲＮＡ（Ｕ６－ｓｉＲＥ）をコードするＣＭＶ指向性（ＣＭＶ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのｓｉＲＮＡ産生効率を比較した。２つのスキームは、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡガイド鎖の転写を駆動する面で類似の効率を持っているが、図１５ｂに示すように、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ法は、ｓｈＲＮＡ法に比べて、生成されたパッセンジャー鎖がより少ないか、又は生成されない（成熟したガイド鎖の生物発生過程で、パッセンジャー鎖は分解されるようである）。そのため、オフターゲット効果を回避するために、ＣＭＶ駆動ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを選択して設計するようにした。
【0129】
次に、コア回路がエクソソームに自律的に組み込むようにｓｉＲＮＡを誘導できるか否かを調べる。ＣＭＶ－ｓｃｒＲ又はＣＭＶ－ｓｉＲＥを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、細胞培養液中のエクソソームを観察した。ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）により、各群が分泌したエクソソームは、数が類似し、大きさの分布が類似し、ピーク値が１２８～１３１ｎｍの間であることが示された。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により、精製したエクソソームは典型的な円形小胞形態を呈し、大きさが正確であることを証明した。さらに、特定のエクソンマーカー（ＣＤ６３、ＴＳＧ１０１及びＣＤ９）の富化は、精製エクソームでのみ検出され、細胞培地では検出されなかった。これらの結果は、回路トランスフェクションが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が産生するエクソームの大きさ、構造や量に影響を及ぼさないことを示している。最後に、ＣＭＶ－ｓｉＲＥ回路でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ及びＨｅｐａ１－６細胞由来のエクソソームからは、図１５ｃに示すように、大量のＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡが検出された。図１５ｄ、図１５ｅに示すように、これらのエクソソームは、マウスＬｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）細胞と一緒にインキュベートする時、ＥＧＦＲ発現の用量依存性が低下し、このことから、エクソソームｓｉＲＮＡが生物学的機能を有することが示唆された。
【0130】
回路のターゲティングタグを設計するために、図１５ａに示すように、Ｌａｍｐ２ｂタンパク質（典型的なエクソソーム膜タンパク質）のＮ末端に融合したターゲティングタグをコードする配列をＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。このタグはＬａｍｐ２ｂを介してエクソソームの表面にアンカーされ、それによって、複合構造エクソソームを所望の組織に送達するように誘導する。具体的には、ＲＶＧペプチドを標的とする中枢神経系を標識として選択し、エクソソームを脳に導入し（ＲＶＧはエクソソームが血液脳関門を通過して神経細胞に入るのを助けることが証明されている）、まず、プロモーターがＲＶＧ－Ｌａｍｐ２ｂ融合タンパク質の発現を開始する効率を評価した。試験により、ＣＭＶプロモーターはＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＲＶＧ－Ｌａｍｐ２ｂ ｍＲＮＡと標識タンパク質ｅＧＦＰの産生に一定の効果があることが証明されたが、Ｕ６プロモーターには効果がなく、このことから、ＣＭＶプロモーターが回路の各部分に連結されたことによる優位性が実証された。次に、免疫沈殿法を用いて、ターゲティングタグがエクソソーム表面で正しく発現していることをガイドして検証した。試験では、抗ＲＶＧ抗体が一時的に不足していたため、ＲＶＧの代わりにＦｌａｇタグを一時的に使用した。図１５ｆに示すように、ＣＭＶガイドＦｌａｇ－Ｌａｍｐ２ｂ回路を用いてＨＥＫ２９３ＴとＨｅｐａ１－６細胞をトランスフェクションした後、抗Ｆｌａｇビーズを用いて完全なエクソソームを免疫沈殿させることに成功し、このことから、ターゲティングタグを正確に位置決めすることが証明された。追加のｓｉＲＮＡ発現部分を設計するために、多くの癌、特に膠芽腫に関連する主要な癌遺伝子ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ（ＴＮＣ）を第２のｓｉＲＮＡ標的として使用した。ＴＮＣ－ｓｉＲＮＡも、図１５に示すように、前ｍｉＲ－１５５骨格に埋め込まれ、ＥＧＦＲ－ｓｉＲＮＡの下流に挿入されている。図１５ｇに示すように、単一（ＣＭＶ ｓｉＲＥ又はＣＭＶ ｓｉＲＴ）の転写かタンデム（ＣＭＶ ｓｉＲＥ）転写かにかかわらず、ＥＧＦＲとＴＮＣ ｓｉＲＮＡの差がほとんど検出されなかった。いずれにせよ、これらの結果は、ｓｉＲＮＡもターゲティングタグも、回路においてそれぞれの役割を果たすことを示唆している。
【0131】
次に、回路がエクソソームに自己集合できるか否かを調べた。たＥＧＦＲ及びＴＮＣ ｓｉＲＮＡｓをコードするＣＭＶガイド回路及びＲＶＧ標識（ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＥ）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。その結果、細胞培地由来のエクソソームは典型的な形態と大きさの分布を示し、複合コア回路で修飾してもエクソソームの物性は変化しないことを示した。さらに、ＥＧＦＲとＴＮＣ－ｓｉＲＮＡｓとターゲティングタグ（ＣＭＶ－Ｆｌａｇ－ｓｉＲＥ）を含む完全な回路を構築し、それでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ及びｈｅｐ１－６細胞から産生されるエクソソームを用いて免疫沈殿させることに成功し、図１５ｈに示すように、ＥＧＦＲ及びＴＮＣ ｓｉＲＮＡは、ともに免疫沈殿させたエクソソームに多く存在している。
【0132】
さらに、ＡＧＯ２は生体内で広く発現し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体の中核成分であり、エンドリボヌクレアーゼ活性を有し、ｓｉＲＮＡの成熟を促進し、その生合成と機能を調節することにより、標的遺伝子の発現を阻害することができる。
【0133】
ｓｉＲＮＡの加工はＡｒｇｏｎａｕｔｅ２（ＡＧＯ２）に依存しており、ｓｉＲＮＡをＡＧＯ２に適切に組み込むことでｓｉＲＮＡのターゲティング作用を高めることが期待されることから、ＡＧＯ２とエクソソーム中のｓｉＲＮＡとの関連を評価するために別の免疫沈殿実験を行った。試験により、ＡＧＯ２抗体（ａｎｔｉ－ＡＧＯ２）で沈殿させたエクソソーム中にＥＧＦＲ及びＴＮＣ ｓｉＲＮＡが容易に検出できることが証明され、これは、我々の設計がｓｉＲＮＡをＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードすることを保証し、ＡＧＯ２が結合されるｓｉＲＮＡのエクソソームへの効率的な輸送を促進することを明らかにした。最後に、インビロトで集合されたｓｉＲＮＡが機能するか否かを調べるために、ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＥ＋Ｔ回路でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のエクソソームをＵ８７ＭＧ膠芽腫細胞と共にインキュベートした。図１５ｉ、図１５ｊに示すように、Ｕ８７ＭＧ細胞においてＥＧＦＲとＴＮＣ発現の用量依存性の低下を実現した。さらに、エクソソームの表面にあるＲＶＧタグは、ＥＧＦＲ及びＴＮＣ ｓｉＲＮＡの標的に対するサイレンシング効果に影響を与えなかった。これらの結果は、回路を複数の組み合わせ可能な部分の有機的な結合として確立し、これらの部分の巧みな結合がＲＮＡの自己集合と放出を可能にした。
【0134】
したがって、本実施例によるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムは、ウイルスをベクターとし、ウイルスベクターを成熟した注入物とし、その安全性及び信頼性が十分に検証されており、創薬性が非常に良好である。最終的に効果を発揮するＲＮＡ配列は内因性エクソソームに包み込まれて送達され、免疫反応は一切存在せず、このエクソソームの安全性を検証する必要はない。この送達システムは、各種の小分子ＲＮＡを送達することができ、汎用性が高い。またウイルスベクターの製造はエクソソームやタンパク質、ポリペプチドなどの物質の製造よりも安価で経済的である。本実施例によるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムは、生体内で自己集合された後、ＡＧＯ２と緊密に結合して富化して複合構造（エクソソーム）になることができ、これにより、その早期分解を防止し、循環中の安定性を維持することができるだけではなく、受容体細胞による吸収、細胞質内での放出、及びリソソームの脱出に有利であり、必要な用量は低い。
【0135】
実施例２
実施例１に基づいて、本実施例は薬物を提供する。この薬物は、送達が必要なＲＮＡ断片を担持したウイルスベクターであって、宿主の器官組織内で富化し、前記宿主の器官組織内に前記ＲＮＡ断片を含有する複合構造を内因的に自発的に形成することができ、前記複合構造が、標的組織内に進入して結合し、前記ＲＮＡ断片を標的組織に送達することができるウイルスベクターを含む。ＲＮＡ断片を標的組織に送達すると、それに対応する遺伝子の発現を阻害し、標的組織における疾患の進行を阻害することができる。
実施例１に基づいて、本実施例は薬物を提供する。この薬物は、送達が必要なＲＮＡ断片を担持したウイルスベクターであって、宿主の器官組織内で富化し、前記宿主の器官組織内に前記ＲＮＡ断片を含有する複合構造を内因的に自発的に形成することができ、前記複合構造が、標的組織内に進入して結合し、前記ＲＮＡ断片を標的組織に送達することができるウイルスベクターを含む。ＲＮＡ断片を標的組織に送達すると、それに対応する遺伝子の発現を阻害し、標的組織における疾患の進行を阻害することができる。
【0136】
任意選択に、前記ＲＮＡ断片は、医療的に意味のある１つ又は２つ以上の特定のＲＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ配列は、医療的に意味のあるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである。
【0137】
図１８～１９において、２種類のアデノウイルスは、それぞれＡＤＶ１、ＡＤＶ２であり、６種類のＲＮＡは、それぞれｓｉＲＥ（標的遺伝子はＥＧＦＲ）、ｓｉＲＴ（標的遺伝子はＴＮＣ）、ｓｈＲＥ（標的遺伝子はＥＧＦＲ）、ｓｉＲＴ（標的遺伝子はＴＮＣ）、ｍｉＲ－７（標的遺伝子はＥＧＦＲ）、ｍｉＲ－１３３ｂ（標的遺伝子はＥＧＦＲ）である。図１８は、２種類のアデノウイルスベクターによって構築された１２種類の遺伝子ループの静脈注射後の対応するタンパク質の発現量を示し、図１９は、２種類のアデノウイルスベクターと６種類のＲＮＡ配列のうちの任意の２種類又は任意の３種類のＲＮＡ配列からなるＲＮＡ断片を構築した後の静脈注射後のタンパク質の発現量を示す。
【0138】
ＲＮＡ配列の詳細を以下の表５に示す。
【0139】
【表5】
【0140】
任意選択に、前記ウイルスベクターは、プロモーターと、宿主の器官組織内に前記複合構造のターゲティング構造を形成することができるターゲティングタグとを含み、前記ターゲティング構造は複合構造の表面に位置し、前記複合構造は、前記ターゲティング構造を介して標的組織を探索し結合し、標的組織に前記ＲＮＡ断片を送達可能である。
【0141】
本実施例における上記ウイルスベクター、ＲＮＡ断片、ターゲティングタグなどの説明は、いずれも実施例１を参考にすることができるので、ここでは詳しく説明しない。
【0142】
該薬物は、経口投与、吸入投与、皮下注射投与、筋肉注射投与又は静脈注射投与により人体に投与された後、実施例１に記載のウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムによって標的組織に送達され、治療効果を発揮することができる。
【0143】
該薬物は、癌、肺線維症、結腸炎、肥満、肥満に起因する心血管疾患、２型糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、重症筋無力症、アルツハイマー病、又は移植片対宿主病を治療する薬物であってもよい。
【0144】
本実施例の薬物は、希釈剤、緩衝剤、乳剤、カプセル化剤、賦形剤、充填剤、バインダ、スプレー剤、経皮吸収剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、着色剤、矯味剤、アジュバント、乾燥剤、吸着担体などを含むがこれに限定されない、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。
【0145】
本実施例による薬物の剤形は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸薬、座薬、軟膏剤、溶液剤、懸濁剤、ローション剤、ゲル剤、ペースト剤などであってもよい。
【0146】
本実施例による薬物は、ウイルスをベクターとし、ウイルスベクターを成熟した注入物とし、その安全性及び信頼性が十分に検証されており、創薬性が非常に良好である。最終的に効果を発揮するＲＮＡ配列は内因性エクソソームに包み込まれて送達され、免疫反応は一切存在せず、このエクソソームの安全性を検証する必要はない。この送達システムは、各種の小分子ＲＮＡを送達することができ、汎用性が高い。またウイルスの製造はエクソソームやタンパク質、ポリペプチドなどの物質の製造よりも安価で経済的である。本願による薬物は、生体内で自己集合された後、ＡＧＯ２と緊密に結合して富化して複合構造（エクソソーム）になることができ、これにより、その早期分解を防止し、循環中の安定性を維持することができるだけではなく、受容体細胞による吸収、細胞質内での放出、及びリソソームの脱出に有利であり、必要な用量は低い。
【0147】
実施例３
実施例１又は実施例２に基づいて、本実施例はウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物は結腸炎治療薬であり、本実施例では、結腸炎治療におけるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効果について、以下の２つの試験により具体的に説明する。
実施例１又は実施例２に基づいて、本実施例はウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物は結腸炎治療薬であり、本実施例では、結腸炎治療におけるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効果について、以下の２つの試験により具体的に説明する。
【0148】
第１の試験では、３つの試験群と２つの対照群を設置した。３つの試験群は、それぞれＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（中）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（高）群であり、対照群は、それぞれ正常群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。
【0149】
試験過程としては、図１Ａに示すように、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（中）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（高）群では、それぞれ、肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いてＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α）を包み込み、力価１０１２Ｖ．ｇ／ｍｌのＡＡＶ溶液を２５μＬ、５０μＬ、１００μＬでマウスに尾静脈注射した。
【0150】
生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした結果、図１Ｂに示すように、３週間後にＡＡＶシステムが体内、特に肝臓で安定に発現していることがわかり、その中で、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（高）群では、平均放射輝度（Ａｖｅｒａｇｅ Ｒａｄｉａｎｃｅ）は８．４２＊１０５（ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ）に達し、発現部位が肝臓であり、このことから、ＡＡＶシステムの発現が用量依存効果を持つことが示された。
【0151】
次に、ＤＳＳ誘導慢性結腸炎モデルの構築を開始し、その間２日ごとに体重を計量して記録した結果、図１Ｃに示すように、ＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲ ＴＮＦ－αシステムは慢性結腸炎マウスの体重減少を軽減でき、３つの試験群のマウスでは、炎症緩和期の体重回復速度もＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群より有意に速かった。
【0152】
１０週目にモデル構築を終了し、生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした後、マウスを殺して結腸を観察した結果、図１Ｄに示すように、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（中）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（高）群のマウスでは、結腸の発赤はある程度軽減し、慢性炎症による結腸長の短縮もある程度改善し、その中で、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（高）群では、炎症の改善が最も顕著であった。
【0153】
各群のマウスの疾患指数をスコアリングして統計した結果、図１Ｅに示すように、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（高）群のマウスでは、疾患指数はＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（中）群、及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群よりも低かった。
【0154】
各群のマウスの体内のＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡレベルをそれぞれ検出した結果、図１Ｆに示すように、３つの試験群のマウスでは、体内のＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡレベルはすべて高く、対照群のＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、体内のＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡの発現はほとんどなく、このことから、上記のＡＡＶシステムが一定量のＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡを産生できることが示唆された。
【0155】
各群のマウスの体内のＴＮＦ－α ｍＲＮＡレベルをそれぞれ検出した結果、図１Ｇに示すように、正常群と３つの試験群のマウスでは、体内のＴＮＦ－α ｍＲＮＡレベルはすべて低く、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、体内のＴＮＦ－α ｍＲＮＡレベルは高く、このことから、ＡＡＶシステムが結腸のＴＮＦ－αの発現と分泌を下げることができることが示唆された。
【0156】
マウス結腸内の炎症促進性サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３を検出した結果、図２Ａに示すように、正常群とＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（高）群のマウスでは、炎症促進性サイトカインの分泌が最も少なく、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、炎症促進性サイトカインの分泌が最も多かった。
【0157】
マウスの結腸切片をＨＥ染色して、病理スコアリングを行って統計した結果、図２Ｂ、図２Ｃに示すように、試験群、特にＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α（高）群のマウスでは、結腸粘膜の完全性はさらに高く、しかも免疫細胞の浸潤程度はさらに浅く、結腸陰窩膿瘍及び結腸の充血と出血もＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群より顕著に軽減された。
【0158】
以上の試験から、肝臓に親和性のＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲＴＮＦ－α回路によれば、長期的なＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ発現及び長期的なＴＮＦ－αサイレンシングを可能とし、しかも、結腸炎をある程度緩和することができ、創薬の潜在力及び臨床上の研究価値が極めて期待できた。
【0159】
第２の試験では、３つの試験群と２つの対照群を設置した。その中で、試験群は、それぞれＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ（中）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ（高）群であり、対照群は、それぞれ正常群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。
【0160】
ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ（中）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ（高）群では、それぞれ肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いて、ＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ、Ｂ７－ｓｉＲＮＡ及びＩｎｔｅｇｒｉｎα４ ｓｉＲＮＡエレメントタンデム送達システム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ）を包み込み、力価１０１２Ｖ．ｇ／ｍｌのＡＡＶ溶液を２５μＬ、５０μＬ、１００μＬでマウスに尾静脈注射した。
【0161】
生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした結果、図３Ａに示すように、３週間後にＡＡＶシステムが体内、特に肝臓で安定して発現しており、ＡＡＶシステムの発現が用量依存効果を持つことが示された。
【0162】
次に、ＤＳＳ誘導慢性結腸炎モデルの構築を開始し、その間２日ごとに体重を計量して記録した結果、図３Ｂに示すように、ＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉシステムは慢性結腸炎マウスの体重減少を軽減でき、３つの試験群のマウスでは、炎症緩和期の体重回復速度もＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群より有意に速かった。
【0163】
１０週目にモデル構築を終了し、生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした後、マウスを殺して結腸を観察した結果、図３Ｃに示すように、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ（中）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ（高）群のマウスでは、結腸の発赤はある程度軽減し、慢性炎症による結腸長の短縮もある程度改善し、その中で、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ（高）群では、炎症の改善が最も顕著であった。
【0164】
各群のマウスの疾患指数をスコアリングして統計した結果、図４Ａに示すように、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ（高）群のマウスでは、疾患指数はＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ（低）群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ（中）群、及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群よりも低かった。
【0165】
マウス血漿中のＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ、Ｂ７ ｓｉＲＮＡ及びｉｎｔｅｇｒｉｎα４ ｓｉＲＮＡを検出した結果、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄに示すように、ＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉシステムは、マウス血漿中に安定に発現するｓｉＲＮＡを一定量で生成し、用量依存性の効果を示した。
【0166】
マウス肝臓中のＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ、Ｂ７ ｓｉＲＮＡ及びｉｎｔｅｇｒｉｎα４ ｓｉＲＮＡを検出した結果、図４Ｅ、図４Ｆ、図４Ｇに示すように、ＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉシステムは、マウスの肝臓で安定に発現するｓｉＲＮＡを一定量で生成し、用量依存性の効果を示した。
【0167】
マウス結腸中のＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ、Ｂ７ ｓｉＲＮＡ及びｉｎｔｅｇｒｉｎα４ ｓｉＲＮＡを検出した結果、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃに示すように、ＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉシステムは、マウスの結腸で安定に発現するｓｉＲＮＡを一定量で生成し、用量依存性の効果を示した。
【0168】
マウス結腸中のＴＮＦ－α ｍＲＮＡ、Ｂ７ ｍＲＮＡ及びｉｎｔｅｇｒｉｎα４ ｍＲＮＡを検出した結果、図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆに示すように、ＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉシステムは、マウスの結腸中のＴＮＦ－α、Ｂ７及びｉｎｔｅｇｒｉｎα４ ｍＲＮＡの発現を著しく低下させた。
【0169】
マウスの結腸切片をＨＥ染色して、病理スコアリングを行って統計した結果、図６Ａ、及び図６Ｂに示すように、試験群、特にＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ（高）群のマウスでは、結腸粘膜の完全性はさらに高く、しかも、免疫細胞の浸潤程度はさらに浅く、結腸陰窩膿瘍及び結腸の充血と出血もＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群より顕著に軽減された。
【0170】
以上の試験から、肝臓に親和性のＡＡＶに包み込まれたＣＭＶ－ｓｉＲＴ＋Ｂ＋Ｉ回路によれば、長期的なＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ、Ｂ７ ｓｉＲＮＡ及びｉｎｔｅｇｒｉｎα４ ｓｉＲＮＡ発現、並びに複数の標的遺伝子のサイレンシングを可能とし、しかも、結腸炎症の程度を著しく緩和することができ、創薬の潜在力及び臨床上の研究価値が極めて期待できた。
【0171】
実施例４
実施例１又は実施例２に基づいて、本実施例は、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの医薬における使用を提供し、この薬物は肺癌治療薬であり、本実施例では、肺癌治療におけるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効果について、以下の４つの試験により具体的に説明する。
実施例１又は実施例２に基づいて、本実施例は、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの医薬における使用を提供し、この薬物は肺癌治療薬であり、本実施例では、肺癌治療におけるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効果について、以下の４つの試験により具体的に説明する。
【0172】
第１の試験では、肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いて、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ）とＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ）を包み込み、力価１０１２Ｖ．ｇ／ｍｌのＡＡＶ溶液を１００μＬでマウスに尾静脈注射した。生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした結果、３週間後にＡＡＶシステムが体内、特に肝臓で安定に発現していることが認められた。
【0173】
第２の試験では、１つの試験群と２つの対照群を設置し、その中で、１つの試験群はＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ群であり、対照群はＰＢＳ群とＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。
【0174】
群ごとに、同じ数のマウスを選択し、マウスの体内にマウス肺癌細胞（ＬＬＣ細胞）を注射し、ＣＴスキャン技術を用いてマウスモデル構築の進行を観察した。３０日後に、構築に成功したマウスに２日に１回投与し、すなわち、ＰＢＳ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群のマウスに２日ごとにＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡを注射して治療を行い、マウスの生存分析と腫瘍評価をそれぞれ行い、７回投与後に治療を停止した。
【0175】
各群のマウスの治療１００日後の生存を統計した結果、図７Ａに示すように、ＰＢＳ群とＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、生存率はほとんど変わらなかったが、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群のマウスでは、生存率は最も高かった。
【0176】
投与前後に各群のマウスをそれぞれＣＴスキャンし、ＣＴ画像に基づいてマウスの肺組織を３Ｄモデル化し、腫瘍の体積の大きさを計算し、その結果を図７Ｂに示す。図７Ｂにおいて、「ＰＢＳ ｐｒｅ」は投与前のＰＢＳ群を示し、「ＰＢＳ ｐｏｓｔ」は投与後のＰＢＳ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ ｐｒｅ」は投与前のＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ ｐｏｓｔ」は投与後のＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ ｐｒｅ」は投与前のＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ－ｓｉＲＮＡ ｐｏｓｔ」は投与後のＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群を示す。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群のマウスでは、投与後に腫瘍体積が有意に減少したが、ＰＢＳ群とＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、投与後に腫瘍体積が減少しないばかりか、ある程度増加していることが分かった。
【0177】
それぞれＲＴ－ｑＰＣＲとＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによって各群のマウス肺部ＫＲＡＳタンパク質及びｍＲＮＡ発現レベルを検出し、その結果を図７Ｃ、図７Ｄに示す。その結果、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群のマウスでは、肺部のＫＲＡＳタンパク質及びｍＲＮＡ発現量は対照群より低下した。
【0178】
以上の試験から、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡはマウスの肺癌の腫瘍に対して顕著な治療効果があることが示唆された。
【0179】
第３の試験では、１つの試験群と２つの対照群を設置し、その中で、試験群はＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群であり、対照群はＰＢＳ群とＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。
【0180】
ＥＧＦＲ－ＤＥＬ１９マウスモデルを構築し、ドキシサイクリン飼料を与えて腫瘍の産生を誘導し、３０日後に構築に成功したマウスに２日に１回投与し、すなわち、ＰＢＳ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群のマウスに２日ごとにＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡを注射して治療を行い、マウスの生存分析と腫瘍評価をそれぞれ行い、７回投与後に治療を停止した。
【0181】
各群のマウスの治療１００日後の生存を統計した結果、図８Ａに示すように、ＰＢＳ群とＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、生存率はほとんど変わらなかったが、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群のマウスでは、生存率は最も高かった。
【0182】
投与前後に各群のマウスをそれぞれＣＴスキャンし、ＣＴ画像を図８Ｅに示し、図８ＥのＣＴ画像に基づいてマウスの肺組織を３Ｄモデル化し、腫瘍の体積の大きさを計算し、その結果を図８Ｂに示す。図８Ｂにおいて、「ＰＢＳ ｐｒｅ」は投与前のＰＢＳ群を示し、「ＰＢＳ ｐｏｓｔ」は投与後のＰＢＳ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ ｐｒｅ」は投与前のＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ ｐｏｓｔ」は投与後のＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ ｐｒｅ」は投与前のＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群を示し、「ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ ｐｏｓｔ」は投与後のＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群を示す。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群のマウスでは、投与後に腫瘍体積が有意に減少したが、ＰＢＳ群及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、投与後に腫瘍体積が減少しないばかりか、異なる程度の増加を示したことが分かった。
【0183】
それぞれＲＴ－ｑＰＣＲとＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによって各群のマウス肺部ＥＧＦＲタンパク質及びｍＲＮＡ発現レベルを検出し、その結果を図８Ｃ、図８Ｄに示す。その結果、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群のマウスでは、肺部のＥＧＦＲタンパク質及びｍＲＮＡ発現量は対照群より低下した。
【0184】
以上の試験から、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡはＥＧＦＲ突然変異型マウスの肺癌の腫瘍に対して顕著な治療効果があることが示唆された。
【0185】
第４の試験では、２つの試験群と２つの対照群を設置し、その中で、試験群はＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群であり、対照群はＰＢＳ群とＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群であった。
ＥＧＦＲ－ＤＥＬ１９マウスモデルを構築し、ドキシサイクリン飼料を与えて腫瘍の産生を誘導し、３０日後に構築に成功したマウスに２日に１回投与し、すなわち、ＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群のマウスに２日ごとにＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡを注射して治療を行った。
ＥＧＦＲ－ＤＥＬ１９マウスモデルを構築し、ドキシサイクリン飼料を与えて腫瘍の産生を誘導し、３０日後に構築に成功したマウスに２日に１回投与し、すなわち、ＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群のマウスに２日ごとにＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡを注射して治療を行った。
【0186】
治療後、各群のマウス中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、血清アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、クレアチニン（ＣＲＥＡ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）の含有量を検出し、これらの結果を図９Ａ～図９Ｆに示し、その結果、ＰＢＳ群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ群のマウスでは、上記の酵素の含有量はほとんど変わらないことがわかった。
【0187】
以上の試験から、肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いて、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ）とＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ）を包み込むと、安全性が高く、信頼性が高く、マイナス作用がなく、大規模な普及や応用に適していることが示唆された。
【0188】
実施例５
実施例１又は実施例２に基づいて、本実施例は、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物は肺線維症治療薬であり、本実施例は、肺線維症の治療におけるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効について、以下の試験により具体的に説明する。
実施例１又は実施例２に基づいて、本実施例は、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物は肺線維症治療薬であり、本実施例は、肺線維症の治療におけるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効について、以下の試験により具体的に説明する。
【0189】
この試験では、肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いて、抗－ｍｉＲ－２１／ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ／抗－ｍｉＲ－２１＋ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡシステムを包み込み、ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１／ＡＡＶ－ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ／ＡＡＶ－ＭＩＸをそれぞれ得、力価１０１２Ｖ．ｇ／ｍｌのＡＡＶ溶液を１００μＬでマウスに尾静脈注射した。生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした結果、３週間後にＡＡＶシステムが体内、特に肝臓で安定に発現していることが認められた。
【0190】
次に、マウスを選択して、モデル化に成功した後、マウスにＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ｓｃｒＲ／ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１／ＡＡＶ－ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ／ＡＡＶ－ＭＩＸ（１０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ注射し、ＰＢＳ群／ＡＡＶ－ｓｃｒＲ群／ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１群／ＡＡＶ－ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ群／ＡＡＶ－ＭＩＸ群を作成した。
【0191】
正常マウス、ＰＢＳ群マウス、ＡＡＶ－ｓｃｒＲ群マウス、ＡＡＶ－ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ群マウスの相対ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡレベルをそれぞれ検出した結果、図１０Ｂに示すように、ＡＡＶ－ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ群マウスでは、相対ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡレベルが低いことがわかった。
正常マウス、ＰＢＳ群マウス、ＡＡＶ－ｓｃｒＲ群マウス、ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１群マウスの相対ｍｉＲ２１ ｍＲＮＡレベルをそれぞれ検出した結果、図１０Ｃに示すように、ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１群マウスでは、ｍｉＲ２１ ｍＲＮＡレベルが低いことが分かった。
正常マウス、ＰＢＳ群マウス、ＡＡＶ－ｓｃｒＲ群マウス、ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１群マウスの相対ｍｉＲ２１ ｍＲＮＡレベルをそれぞれ検出した結果、図１０Ｃに示すように、ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１群マウスでは、ｍｉＲ２１ ｍＲＮＡレベルが低いことが分かった。
【0192】
ヒドロキシプロリンは、コラーゲンを主成分とし、その含有量が肺線維化の程度を反映している。各群のマウスのヒドロキシプロリン含有量をそれぞれ検出した結果、図１０Ａに示すように、ＰＢＳ群、ＡＡＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、体内のヒドロキシプロリン含有量は最も高く、ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１群、ＡＡＶ－ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ群、ＡＡＶ－ＭＩＸ群のマウスでは、体内のヒドロキシプロリン含有量はすべて低く、このことから、ＡＡＶ－ａｎｔｉ－ｍｉＲ２１群、ＡＡＶ－ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ群、ＡＡＶ－ＭＩＸ群のマウスの肺繊維化が阻害されたことが示唆された。
【0193】
実施例６
実施例１又は実施例２に基づいて、本実施例は、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物は、膠芽腫治療薬であり、本実施例では、膠芽腫の治療におけるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効果について、以下の試験により具体的に説明する。
実施例１又は実施例２に基づいて、本実施例は、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物は、膠芽腫治療薬であり、本実施例では、膠芽腫の治療におけるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効果について、以下の試験により具体的に説明する。
【0194】
この試験では、肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いて、ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＥ）及びＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡとＴＮＣ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＥ＋Ｔ）を包み込み、力価１０１２Ｖ．ｇ／ｍｌのＡＡＶ溶液を１００μＬでマウスに尾静脈注射した。生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした結果、３週間後にＡＡＶシステムが体内、特に肝臓で安定に発現していることが認められた。
【0195】
次に、マウスを選択し、膠芽腫細胞（Ｕ－８７ ＭＧ－Ｌｕｃ細胞）をマウスに注射し、７日目から２１日目まで、ＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＥ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＥ＋Ｔ（５ｍｇ／ｋｇ）をマウスに２日ごとに投与して治療を行い、ＰＢＳ群／ＡＡＶ－ｓｃｒＲ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＥ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＥ＋Ｔ群を作成した。
【0196】
各群のマウスについて生存分析を行い、治療２０日、４０日、６０日、８０日後の生存率を統計した結果、図１１Ａに示すように、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＥ＋Ｔ群のマウスでは、生存期間は最も長く、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＥは、その次である。
【0197】
各群のマウスについて腫瘍評価を行い、すなわち、７日目、１４日目、２８日目、３５日目にそれぞれＢＬＩ生体内画像形成検出を行った結果、図１１Ｂに示すように、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＥ＋Ｔ群のマウスでは、膠芽腫の阻害効果は最も顕著であった。
【0198】
実施例７
実施例１又は実施例２に基づいて、本実施例は、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物は肥満治療薬であり、本実施例では、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの肥満治療における効果について、以下の試験により具体的に説明する。
実施例１又は実施例２に基づいて、本実施例は、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物は肥満治療薬であり、本実施例では、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの肥満治療における効果について、以下の試験により具体的に説明する。
【0199】
肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いて、ＰＴＰ１Ｂ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＰ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＰ）を包み込み、力価１０１２Ｖ．ｇ／ｍｌのＡＡＶ溶液を１００μＬでマウスに尾静脈注射した。生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした結果、３週間後にＡＡＶシステムが体内、特に肝臓で安定に発現していることが認められた。
【0200】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを選択し、１２週間後にＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＰ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＰをそれぞれ注射し、ＰＢＳ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＰ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＰ群を作成し、２４日以内に２日に１回注射した。各群のマウスにそれぞれ体重変化、脂肪体の重量、初期食物摂取量、血清レプチン含有量、血糖値、基礎グルコース含有量、血清総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、体長、食物摂取量の検出及び統計を行い、その結果を以下に示す。
【0201】
図１２Ａに示すように、この図は、各群のマウスの体重の比較図であり、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＰ群のマウスでは、体重が最も安定していた。
【0202】
図１２Ｂに示すように、この図は、各群のマウスの精巣上体脂肪体重量の比較図であり、ＡＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＰ群のマウスでは、精巣上体脂肪体の重量が最も軽かった。
【0203】
図１２Ｃに示すように、この図は、各群のマウスの初期食物摂取量曲線の比較図である。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＰ群のマウスでは、食物摂取量が最も少なかった。
【0204】
図１２Ｄに示すように、この図は、各群のマウスの血清レプチン含有量の比較図である。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＰ群のマウスでは、血清レプチン含有量が最も低かった。
【0205】
図１２Ｅに示すように、この図は、各群のマウスの血糖変化曲線の比較図である。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＰ群のマウスでは、血糖値が最も低かった。
【0206】
図１２Ｆに示すように、この図は、各群のマウスの基礎グルコース変化曲線の比較図である。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＰ群のマウスでは、基礎グルコース含有量が最も低かった。
【0207】
図１３Ａ～図１３Ｃに示すように、この３つの図は、それぞれ各群のマウスの血清総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の比較図であり、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＰ群のマウスでは、ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬが最も低かった。
【0208】
図１３Ｄに示すように、この図は、各群のマウスの体長の比較図であり、４群のマウスの体長はほとんど変わらないことがわかった。
【0209】
図１３Ｅに示すように、この図は、各群のマウスのＨＦＤ食物摂取量の比較図であり、４群のマウスのＨＦＤ食物摂取量もほとんど変わらないことがわかった。
【0210】
以上の試験から、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲＰ、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲＰは、肥満に対してある程度の阻害効果があることが示唆された。
【0211】
実施例８
実施例１又は実施例２に基づいて、本実施例は、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物はハンチントン病治療薬であり、本実施例では、ハンチントン病治療におけるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効果について、以下の試験により具体的に説明する。
実施例１又は実施例２に基づいて、本実施例は、ウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの薬物における使用を提供し、この薬物はハンチントン病治療薬であり、本実施例では、ハンチントン病治療におけるウイルスベクターに基づくＲＮＡ送達システムの効果について、以下の試験により具体的に説明する。
【0212】
この試験では、肝臓に親和性の高いＡＡＶ－５型アデノ随伴ウイルスを用いて、ＨＴＴ ｓｉＲＮＡシステム（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲｍＨＴＴ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲｍＨＴＴ）を包み込み、力価１０１２Ｖ．ｇ／ｍｌのＡＡＶ溶液を１００μＬでマウスに尾静脈注射した。生きている小動物を通してＡＡＶシステムの体内発現をモニタリングした結果、３週間後にＡＡＶシステムが体内、特に肝臓で安定に発現していることが認められた。
【0213】
次に、マウスを選択してモデル化を行い、モデル化が完了したマウスにＰＢＳ緩衝液／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲｍＨＴＴ／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲｍＨＴＴを注射し、ＰＢＳ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲｍＨＴＴ群／ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲｍＨＴＴ群を作成した。上記溶液を尾静脈注射した後、血漿エクソソームを分離し、ＰＫＨ２６染料で標識した後、細胞と共培養し、細胞のエクソソームの吸収状況を観察し、結果を以下に示す。
【0214】
図１４Ａに示すように、この図は、各群のマウス血漿エクソソーム中のｓｉＲＮＡレベルの比較図であり、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲｍＨＴＴ群及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲｍＨＴＴ群のマウスでは、血漿のエクソソーム中のｓｉＲＮＡレベルは高かった。
【0215】
図１４Ｂに示すように、この図は、マウスの血漿エクソソームと細胞を共培養した後の各群のマウスの相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルの比較図であり、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲｍＨＴＴ群及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲｍＨＴＴ群のマウスでは、相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルは低く、これは、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲｍＨＴＴ及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲｍＨＴＴは、ＨＴＴ ｍＲＮＡレベルを下げることができ、すなわち、エクソソームに組み込まれたｓｉＲＮＡは依然として遺伝子サイレンシング機能を発揮することができることが分かった。
【0216】
図１４Ｃに示すように、この図は、マウスの肝臓ｓｉＲＮＡの絶対レベルの比較図であり、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲｍＨＴＴ群及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲｍＨＴＴ群のマウスでは、絶対ｓｉＲＮＡレベルが高いことが分かった。
【0217】
図１４Ｄに示すように、この図は、マウスの血漿ｓｉＲＮＡの絶対レベルの比較図であり、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｉＲｍＨＴＴ群及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲｍＨＴＴ群のマウスでは、絶対ｓｉＲＮＡレベルが高いことが分かった。
【0218】
図１４Ｅに示すように、この図は、野生型マウス（ＷＴ）、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲｍＨＴＴ群のマウスの低下潜伏期の比較図であり、０週では、３群のマウスの低下潜伏期が一致し、４週目と８週目では、ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群のマウスでは、低下潜伏期が最も短いことが分かった。
【0219】
図１４Ｆに示すように、この図は、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲ群ｍＨＴＴ群のマウスの皮質及び線条体における相対ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルの比較図であり、皮質でも線条体でも、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲｍＨＴＴ群のマウスでは、ｍＨＴＴ ｍＲＮＡレベルはＡＡＶ－ＣＭＶ－ｓｃｒＲ群よりも低いことが分かった。
【0220】
以上の試験から、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＲＶＧ－ｓｉＲｍＨＴＴの静脈注射が、線条体及び皮質のｍＨＴＴタンパク質と毒性凝集体の減少に寄与し、ハンチントン舞踏症に対する治療効果を発揮することが示唆された。
【0221】
本明細書では、「上」、「下」、「前」、「後」、「左」、「右」などは、関連部分間の相対的な位置関係を表すためにのみ用いられ、これらの関連部分の絶対位置を限定するものではない。
【0222】
本明細書では、「第１」、「第２」などは、互いを区別するためのものであって、重要度や順序、相互の存在の前提などを示すものではない。
【0223】
本明細書では、「等しい」、「同じ」などは、厳密には数学的及び／又は幾何学的な意味での制限ではなく、当業者に理解可能であり、製造又は使用などによって許容される誤差も含む。
【0224】
別段の記載がない限り、本明細書における数値範囲は、その２つの端点内の範囲全体だけでなく、その中に含まれるいくつかのサブ範囲も含む。
【0225】
以上、本願の好ましい具体的な実施形態及び実施例については、図面を参照して詳細に説明したが、本願は上記の実施形態及び実施例に限定されるものではなく、当業者が有する知識の範囲内で、本願の構想を逸脱することなく、様々な変更も可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【国際調査報告】