▶ ドンペ ファーマスーチシ ソシエタ ペル アチオニの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-15
(54)【発明の名称】Ｃｏｖｉｄ－１９ワクチン接種の併用療法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/215 20060101AFI20240308BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20240308BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240308BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240308BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240308BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240308BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240308BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240308BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20240308BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20240308BHJP
A61K 31/138 20060101ALI20240308BHJP
A61K 31/4535 20060101ALI20240308BHJP
A61K 31/085 20060101ALI20240308BHJP
A61K 31/55 20060101ALI20240308BHJP
【ＦＩ】
A61K39/215
C12N15/50 ZNA
A61P31/14
A61P37/04
A61P43/00 121
A61P43/00 111
A61P43/00 105
A61K45/00
A61K48/00
A61P35/00
A61P15/00
A61P7/00
A61K31/138
A61K31/4535
A61K31/085
A61K31/55
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023560333
(86)(22)【出願日】2022-03-31
(85)【翻訳文提出日】2023-11-24
(86)【国際出願番号】 EP2022058688
(87)【国際公開番号】W WO2022207860
(87)【国際公開日】2022-10-06
(31)【優先権主張番号】21166461.0
(32)【優先日】2021-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516388388
【氏名又は名称】ドンペ ファーマスーチシ ソシエタ ペル アチオニ
(74)【代理人】
【識別番号】110001243
【氏名又は名称】弁理士法人谷・阿部特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】マルチェロ アレグレッティ
(72)【発明者】
【氏名】アンドレア ロサリオ ベッカーリ
(72)【発明者】
【氏名】マリア カンディダ チェスタ
(72)【発明者】
【氏名】エリサベッタ マリア エスター マウリ
(72)【発明者】
【氏名】カーマイン タラリコ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084AA19
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA511
4C084ZA811
4C084ZB091
4C084ZB211
4C084ZB261
4C084ZB331
4C084ZC411
4C084ZC751
4C085AA03
4C085BA71
4C085CC08
4C085EE03
4C086AA01
4C086BC21
4C086BC31
4C086GA03
4C086GA07
4C086GA12
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA51
4C086ZA81
4C086ZB09
4C086ZB21
4C086ZB26
4C086ZB33
4C086ZC41
4C086ZC75
4C206AA01
4C206CA27
4C206FA17
4C206KA01
4C206MA02
4C206MA04
4C206NA05
4C206NA14
4C206ZA51
4C206ZA81
4C206ZB09
4C206ZB21
4C206ZB26
4C206ZB33
4C206ZC41
4C206ZC75
(57)【要約】
本発明は、選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）とＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの併用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）とＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの併用。
【請求項2】
対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防に使用するための、請求項１に記載の併用。
【請求項3】
対象におけるＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの副作用の予防または治療に使用するための選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）。
【請求項4】
対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防のためにＣＯＶＩＤ－１９ワクチンと組み合わせて使用するための、選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項5】
対象におけるＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの副作用の予防または治療に使用するための、選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項6】
ａ）ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン；およびｂ） 選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）を含む医薬組成物
を含む部品キット。
【請求項7】
請求項１に記載の併用、請求項２に記載の使用のための併用、請求項３に記載の使用のための選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）、請求項４または５に記載の使用のための医薬組成物、または請求項６に記載の部品キットであって、前記ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質、その変異体、またはその免疫原性フラグメントを抗原として使用するＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチンであるもの。
【請求項8】
前記ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンがｍＲＮＡワクチンまたはＤＮＡワクチンである、請求項７に記載の併用、使用のための併用、使用のための選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）、使用のための医薬組成物、または部品のキット。
【請求項9】
請求項１、７または８に記載の併用、請求項２、７または８に記載の使用のための併用、請求項３、７または８に記載の使用のための選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）、請求項４に記載の使用のための医薬組成物であって、前記選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）が、タモキシフェン、ラロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、ドロキシフェン、オスペミフェン、アルゾキシフェン、トレミフェンおよびバゼドキシフェンから選択される、請求項６、７または８に記載の部品キット。
【請求項10】
請求項１、７、８または９に記載の併用、請求項２、７、８または９に記載の使用のための組み合わせ、請求項３、７、８または９に記載の使用のための選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）、請求項４、５、７、８または９に記載の使用のための医薬組成物、請求項６、７、８または９に記載の部品のキットであって、前記対象がＥＲ陽性乳がんと診断された対象であるもの。
【請求項11】
請求項１、７、８または９に記載の併用、請求項２、７、８または９に記載の使用のための併用、請求項３、７、８または９に記載の使用のための選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）、請求項４、５、７、８または９に記載の使用のための医薬組成物、請求項６、７、８または９に記載の部品のキットであって、前記対象が、生理的止血バランスを変化させる病的状態と診断された対象であるもの。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、エストロゲン受容体モジュレータとＣＯＶＩＤ－１９ワクチン接種の併用に関する。
【背景技術】
【0002】
コロナウイルス（Ｃｏｖｓ）は、コロナウイルス科に属する一本鎖のエンベロープ型ＲＮＡウイルスの大きなファミリーである。ヒトに感染できることが知られている限られた数のコロナウイルスは、過去には比較的無害な呼吸器系のヒト病原体であり、軽度の感染症を引き起こすと考えられていた。しかし、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）と中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）という２つのコロナウイルス亜型が出現し、これらは、ヒトに重篤な、時には致死的な呼吸器感染症を引き起こすようになった（Pereira, H.G., 1989 Coronaviridae, In J. S. Porterfield (ed.), Andrewes' Viruses of Vertebrates, 5th ed.pp.42-57（非特許文献１）；Holmes K.V. et al., Fields Virology 1996, 1: 1075-1093（非特許文献２））。２０１９年１２月、中国で非定型肺炎患者が発生し、後に原因が新型コロナウイルスであることが判明した。世界保健機関（ＷＨＯ）はこのウイルスをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、関連疾患をＣＯＶＩＤ－１９と命名した。
【0003】
ウイルスは急速に世界中に広がり、２０２０年３月１１日、ＷＨＯはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染をパンデミックと宣言した。ＣＯＶＩＤ－１９に感染した人のほとんどは、軽度から中等度の呼吸器疾患（発熱、疲労、乾いた咳、呼吸困難）を経験し、特別な治療を必要とせずに回復する。高齢者や心血管疾患、糖尿病、慢性呼吸器疾患、がんなどの基礎疾患を持つ人は重症化しやすい。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者の疫学的、臨床的特徴および転帰の分析から、症候性ＣＯＶＩＤ－１９に罹患した人の１５％が重症肺炎を含む重篤な疾患に罹患し、５％が生命を脅かす合併症を伴う重篤な疾患に罹患することが示されている。重篤な疾患には、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症、敗血症性ショック、心疾患、肺塞栓症などの血栓塞栓事象、多臓器不全が含まれる。
【0004】
重篤なＣＯＶＩＤ－１９を発症した場合、稀な神経学的および精神医学的合併症などの長期的な結果が合理的に予想されるという証拠も増えてきている。これらには脳卒中、せん妄、不安、抑うつ、脳の損傷や炎症、睡眠障害などが含まれる。
【0005】
世界中で患者数と死亡者数が劇的に増加し、社会的および経済的な影響を及ぼしているため、感染拡大の制御を助け、ＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックを終息させるために、安全且つ効果的なワクチンの開発に力が入れられている。
【0006】
現在、さまざまなワクチンが開発中であり、いくつかはすでにＣＯＶＩＤ－１９の予防のために承認されている。
【0007】
すべてのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンおよびワクチン候補は、ウイルスタンパク質抗原に対する免疫反応を誘導することによって作用する。
【0008】
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２は４つの構造タンパク質、すなわちスパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質によって特徴づけられる（Chen Y et al, J Med Virol 2020, 92: 418-423（非特許文献３））。
【0009】
現在、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの標的抗原としてスパイク（Ｓ）タンパク質が用いられている。このタンパク質はウイルス表面に位置するため非常に露出度が高く、防御免疫反応を誘導できる重要な抗原決定基と考えられている（Ou et al, Nat Commun 2020; 11: 1620（非特許文献４））。
【0010】
さらに、これは、細胞侵入受容体アンジオテンシン変換酵素ＩＩ（ＡＣＥ２）を介してウイルスが細胞内に侵入するために必須の分子である。スパイクタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０ＤＴＣ２）の配列は１２７３アミノ酸長であり、Ｎ末端に位置するシグナルペプチド（アミノ酸１～１３）、Ｓ１サブユニット（１４～６８５残基）、およびＳ２サブユニット（６８６～１２７３残基）からなり、最後の２つの領域はそれぞれ受容体結合と膜融合を担っている。特に、Ｓ１サブユニットは受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を介してＡＣＥ２への受容体結合を媒介し、Ｓ２サブユニットは膜融合を担っている（Letko et al, Nat Microbiol 2020, 5: 562-569（非特許文献５））。
【0011】
ＣＯＶＩＤ－１９のために開発された、あるいは開発中のワクチンおよびワクチン候補は、主に２つの大きなカテゴリー：すなわち。ウイルスタンパク質抗原を宿主の体内に導入する従来の不活化ウイルスワクチンまたは弱毒化ウイルスワクチン、およびＤＮＡワクチンおよびｍＲＮＡワクチンなどのより新しい遺伝子ベースのワクチンに分類される。
【0012】
ＤＮＡワクチンおよびｍＲＮＡワクチンは、宿主の細胞内でｉｎ ｖｉｖｏ産生するためにウイルスタンパク質抗原をコードする遺伝子を送達するものであり、安全性の向上と大量生産への適合性という観点から、従来のワクチンアプローチと比較してＣＯＶＩＤ－１９ワクチン接種に最適なアプローチと考えられている。
【0013】
ＥＭＡによってこれまでに承認された３種類のワクチンは、すべてこの技術的アプローチに基づいており、これらはファイザーとバイオエヌテックが開発したｍＲＮＡベースのＣｏｍｉｒｎａｔｙ、モデルナが開発したｍＲＮＡベースのＣＯＶＩＤ－１９ワクチン、およびオックスフォード大学とアストラゼネカが開発したＤＮＡウイルスベクターベースのＣＯＶＩＤ－１９ ＣｈＡｄＯｘ１－Ｓワクチンである。
【0014】
これらのワクチンの対象への投与は、スパイクタンパク質の体内でのｉｎ ｓｉｔｕ生産を誘導し、免疫系に免疫応答を開始させる。
【0015】
最近の証拠は、ウイルス感染の促進におけるその機能に加えて、およびその機能とは独立して細胞シグナル伝達に関してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の潜在的な活性を示唆している。
【0016】
例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の全長Ｓ１サブユニットは、マウスおよびヒトのマクロファージにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで炎症促進性の応答（pro-inflammatory responses）を誘導でき（Shirato et al, Heyon 2021, 7(2) e06187（非特許文献６））、培養ヒト血管細胞において細胞シグナル伝達の事象を活性化できる（Suzuki et al, Vascular Pharmacology 137 (2021) 106823（非特許文献７））ことが示されている。
【0017】
以上のことから、ワクチン接種によって産生されたスパイクタンパク質の体内における存在は、生物学的プロセスを妨害し、それによって免疫応答を阻害し、および／または短期および長期的に副作用を引き起こす可能性が示唆されている。
【0018】
エストロゲンは、女性の正常な性的および生殖的な発達に重要な役割を果たす一群のステロイドホルモンであり、その中でもエストラジオール（Ｅ２）は最も強力で、一般的である。
【0019】
これらのホルモンは、例えば、第二次性徴の発達と維持、代謝、骨の恒常性、血中塩分バランス、免疫および炎症応答、ストレスに対する応答、および／または神経細胞機能など、幅広い生理機能を調節している。
【0020】
これらのホルモンのレベルおよび活性の不均衡は、多くの病理学的過程に関与している。特にエストロゲンは、乳がん、子宮内膜がん、腎がん、子宮がんの病因に関与している（Okamoto et al, Toxicology Letters 2020, 318: 99-103（非特許文献８））。さらに、エストロゲンレベルの減少が、閉経後の女性における骨吸収の大幅な増加および骨粗鬆症の初期型および後期型に関連している（Riggs B.L, J. Clin. Invest 2000, 106, 1203-1204（非特許文献９））。
【0021】
さらに、外因的なエストロゲンの投与は、血栓性環境の生成と血栓性イベントの高リスクに寄与する止血および線維素溶解経路の多くの側面の調節障害に関連している（Abou-Ismail et al, Thrombosis Research 2020, 192: 40-51（非特許文献１０））。
【0022】
エストロゲンの活性は、ホルモン活性化転写因子として機能する核内受容体、エストロゲン受容体によって媒介される。リガンドの活性化について、この受容体は標的遺伝子のプロモーターに結合し、共調節因子（coregulator）と総称される多数の相互作用タンパク質と転写複合体を形成し、これは転写活性を活性化（コアクチベーター（coactivator)（ＣｏＡ））または不活性化（コリプレッサー（corepressor）（ＣｏＲ））し、これによって標的遺伝子発現の活性化または抑制を引き起こす（Patel et al, Pharmacology & Therapeutics 2018, 186: 1-24（非特許文献１１））。核内エストロゲン受容体とコアクチベーターとの相互作用は、コアクチベータータンパク質内に含まれ且つ共有されるＬｘｘＬＬモチーフ（Ｌはロイシンであり、ｘは任意のアミノ酸である。）によって媒介され、これは、これらのタンパク質の受容体への結合、およびその転写活性を増強するために必要かつ十分である（Patel et al, Pharmacology & Therapeutics 2018, 186: 1-24（非特許文献１１））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0023】
【非特許文献1】Pereira, H.G., 1989 Coronaviridae, In J. S. Porterfield (ed.), Andrewes' Viruses of Vertebrates, 5th ed.pp.42-57
【非特許文献2】Holmes K.V. et al., Fields Virology 1996, 1: 1075-1093
【非特許文献3】Chen Y et al, J Med Virol 2020, 92: 418-423
【非特許文献4】Ou et al, Nat Commun 2020; 11: 1620
【非特許文献5】Letko et al, Nat Microbiol 2020, 5: 562-569
【非特許文献6】Shirato et al, Heyon 2021, 7(2) e06187
【非特許文献7】Suzuki et al, Vascular Pharmacology 137 (2021) 106823
【非特許文献8】Okamoto et al, Toxicology Letters 2020, 318: 99-103
【非特許文献9】Riggs B.L, J. Clin. Invest 2000, 106, 1203-1204
【非特許文献10】Abou-Ismail et al, Thrombosis Research 2020, 192: 40-51
【非特許文献11】Patel et al, Pharmacology & Therapeutics 2018, 186: 1-24
【非特許文献12】Remington's Pharmaceutical Science (recent edition), Mack Publishing Company, Easton Pa.
【非特許文献13】Szklarczyk D et al., Nucleic Acids Res. 2021, 49: D605-D612, doi: 10.1093/nar/gkaa1074
【非特許文献14】Casalini L et al, ACS Cent.Sci. 2020, 6:1722-1734, https://doi.org/10.1021/acscentsci.0c01056
【非特許文献15】Maier J A et al, J. Chem.Theory Comput.2015, 11:3696-3713, https://doi.org/10.1021/acs.jctc.5b00255
【非特許文献16】Kirschner KN et al, J. Comput.Chem.2008, 29:622-655, https://doi.org/10.1002/jcc.20820
【非特許文献17】Lindorff-Larsen K et al, Proteins 2010,78:1950-1958, https://dx.doi.org/10.1002/prot.22711
【非特許文献18】Jorgensen WL et al, J Chem Phys 1983, 79:926-935, https://dx.doi.org/10.1063/1.445869
【非特許文献19】Abraham MJ et al., SoftwareX 2015, 1:19-25, https://dx.doi.org/10.1016/j.softx.2015.06.001
【非特許文献20】Bussi G et al, J Chem Phys, 2007 126:014101.https://dx.doi.org/10.1063/1.2408420
【非特許文献21】Darden T et al., J. Chem.Phys 1993, 98:10089, https://doi.org/10.1063/1.464397
【非特許文献22】Mocklinghoff S et al, ChemBioChem 2010, 11:2251-2254, https://doi.org/10.1002/cbic.201000532
【非特許文献23】Yan Y et al, Nat Protoc 2020, 15:1829-1852, https://doi.org/10.1038/s41596-020-0312-x
【非特許文献24】Plevin MJ et al, Trends Biochem Sci 2005, 30:66-69, https://dx.doi.org/10.1016/j.tibs.2004.12.001
【非特許文献25】Heery DM et al, Nature 1997, 387:733-736, https://doi.org/10.1038/42750
【非特許文献26】ER1: https://www.uniprot.org/uniprot/P03372#structure
【非特許文献27】ER2: https://www.uniprot.org/uniprot/Q92731#structure
【非特許文献28】Savkur RS et al, J Pept Res 2004, 63:207-212, https://dx.doi.org/10.1111/j.1399-3011.2004.00126.x
【非特許文献29】http://hdock.phys.hust.edu.cn/
【非特許文献30】Collin-Osdoby and Osdoby 2012, PMID: 22130930
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0024】
本発明者らは、驚くべきことに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質がエストロゲン受容体のシグナル伝達を妨害することを見出した。
【0025】
詳細には、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質が、核内コアクチベーター１（ＮＣＯＡ１）とホモログであるＬｘｘＬＬモチーフを含み、エストロゲン受容体上のＮＣＯＡ１結合ドメインに結合し、それによってその転写活性を活性化できることを見出した。本発明者らはまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質が異なる実験環境においてエストロゲン様活性を発揮することをｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で実証した。
【0026】
したがって、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン接種の文脈では、ワクチン接種後に産生されるスパイクタンパク質がエストロゲン受容体の活性を妨害し、この受容体によって媒介される生理的活性と病理学的活性との間に不均衡を生じ、その結果、望ましくない重篤な副作用を発生させる可能性がある。さらに、免疫応答の調節におけるエストロゲンの役割により、スパイクタンパク質によるエストロゲン受容体の活性化はワクチンの有効性を妨げる可能性がある。
【0027】
本発明者らはまた、驚くべきことに、選択的エストロゲン受容体モジュレータ（（Selective Estrogen Receptor Modulator）ＳＥＲＭ）の投与により、エストロゲン受容体上のスパイクの活性が復帰することを見出した。
【0028】
選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭｓ）は、エストロゲン受容体に結合し、その活性を調節する非ステロイド構造を有する化合物群である。ＳＥＲＭは、組織特異的な形式でＥＲのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる。
【0029】
ＳＥＲＭｓは、受容体に結合し、コアクチベーターやコリプレッサーとの相互作用能力に影響を与える明確に異なる構造変化を誘導することによって、エストロゲン受容体のシグナル伝達についてそれらの活性を発揮することが示唆されている。
【0030】
以上のデータの観点から、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの投与と組み合わせてＳＥＲＭを投与することは、免疫反応を改善し、ワクチン接種の副作用を減少するために有益であると予想される。
【0031】
したがって、本発明の第１の目的は、ＳＥＲＭ、好ましくはタモキシフェン、ラロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、ドロロキシフェン、オスペミフェン、アルゾキシフェン、トレミフェンおよびバゼドキシフェンから選択されるものと、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンとの併用である。
【0032】
本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防に使用するための上記の組み合わせである。
【0033】
本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防においてＣＯＶＩＤ－１９ワクチンと組み合わせて使用するためのＳＥＲＭである。
【0034】
本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの副作用の予防または治療に使用するためのＳＥＲＭである。
【0035】
本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防においてＣＯＶＩＤ－１９ワクチンと組み合わせて使用するための、ＳＥＲＭおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【0036】
本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの副作用の予防に使用するための、ＳＥＲＭおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【0037】
本発明のさらなる目的は、以下を含む部品キットである：
ａ） ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン；および
ｂ） 有効量のＳＥＲＭを含む医薬組成物。
ａ） ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン；および
ｂ） 有効量のＳＥＲＭを含む医薬組成物。
【0038】
本発明のさらなる目的は、ＳＥＲＭと組み合わせたＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの前記対象への投与を含む、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防方法である。
【0039】
本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの副作用の予防または治療のための方法であって、前記対象にＳＥＲＭを投与することを含む方法である。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】図１は、核内受容体コアクチベーターと複合体化したエストロゲン受容体（ＥＲ）を示す。完全な複合体はコンピュータ画像（cartoon）で報告されており、ＥＲモノマーは灰色の表面で、ＮＣＯＡセグメントは黒いコンピュータ画像と線で示されている。
【図2】図２は、ＥＲ１とＥＲ２の最も重要な相互作用のネットワークを示している（両方とも赤い球）。最も信頼性の高い相互作用タンパク質のうち、核内受容体コアクチベーター（Nuclear COActivator）（ＮＣＯＡ）は核内受容体と直接結合し、転写活性を刺激する。
【図4】図４は、スパイク－ＥＲブラインドドッキングの３Ｄ最良ドッキング仮説を示している。タンパク質はコンピュータ画像で報告されている。ＥＲ二量体は白いコンピュータ画像で、スパイクタンパク質は黒い表面で報告されている。
【図5】図５は、スパイク－ＥＲモチーフ指向型ドッキングの３次元最良ドッキング仮説を示している。タンパク質はコンピュータ画像で報告されている。ＥＲ二量体は白いコンピュータ画像であるが、スパイクタンパク質は黒い表面で報告されている。
【図6】図６は、エストラジオール（１ｎＭ）（ＥＳＴＲ）、スパイクタンパク質（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＳＰＩＫＥ）、ラロキシフェン（２μＭ）（ＲＡＬ）、エストラジオール（１ｎＭ）とスパイクタンパク質（１０ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせ（ＥＳＴＲ＋ＳＰＩＫＥ）、エストラジオール（１ｎＭ）とラロキシフェン（２μＭ）の組み合わせ（ＥＳＴＲ＋ＲＡＬ）、スパイクタンパク質（１０ｎｇ／ｍｌ）とラロキシフェン（２μＭ）の組み合わせ（ＳＰＩＫＥ＋ＲＡＬ）、エストラジオール（１ｎＭ）、スパイクタンパク質（１０ｎｇ／ｍｌ）およびラロキシフェン（２μＭ）の組み合わせ（ＥＳＴＲ＋ＳＰＩＫＥ＋ＲＡＬ）で２４時間処理したＭＣＦ－７細胞の増殖を、実施例５に記載のようにＢｒｄＵ増殖アッセイにより測定したモノを示す。実験は技術的３反復で行った。結果は、３つの異なる実験（ｎ＝３）の平均±ＳＤである。
【図7】図７は、エストラジオール（１ｎＭ）（ＥＳＴＲ）、スパイクタンパク質（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＳＰＩＫＥ）、ラロキシフェン（２μＭ）（ＲＡＬ）、エストラジオール（１ｎＭ）とスパイクタンパク質（１０ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせ（ＥＳＴＲ＋ＳＰＩＫＥ）、エストラジオール（１ｎＭ）とラロキシフェン（２μＭ）の組み合わせ（ＥＳＴＲ＋ＲＡＬ）、スパイクタンパク質（１０ｎｇ／ｍｌ）とラロキシフェン（２μＭ）の組み合わせ（ＳＰＩＫＥ＋ＲＡＬ）、エストラジオール（１ｎＭ）、スパイクタンパク質（１０ｎｇ／ｍｌ）およびラロキシフェン（２μＭ）の組み合わせ（ＥＳＴＲ＋ＳＰＩＫＥ＋ＲＡＬ）で２４時間処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の増殖を、実施例５に記載のようにＢｒｄＵ増殖アッセイによって測定したものを示した。実験は技術的３反復で行った。結果は、３つの異なる実験（ｎ＝３）の平均±ＳＤである。
【図8】図８は、破骨細胞に分化しておらず、ビヒクル（ＣＴＲ ｗ／ｏ ＲＡＮＫＬ）で処理したＲＡＷ細胞、ビヒクル（ＲＡＮＫＬを有するＣＴＲ（CTR with RANKL））で２４時間処理したＲＡＷ－ＯＣ細胞、１７β－エストラジオール（１ｎＭ）（エストラジオール）、スパイク（１０ｎｇ／ｍｌ）（スパイク）、ラロキシフェン（２μＭ）（ラロキシフェン）、スパイク（１０ｎｇ／ｍｌ）とラロキシフェン（２μＭ）の組み合わせ（スパイク＋ラロキシフェン）、スパイク（１０ｎｇ／ｍｌ）と１７β－エストラジオール（１ｎＭ）の組み合わせ（スパイク＋エストラジオール）、１７β－エストラジオール（１ｎＭ）とラロキシフェン（２μＭ）の組み合わせ（エストラジオール＋ラロキシフェン）、１７β－エストラジオール（１ｎＭ）、スパイク（１０ｎｇ／ｍｌ）およびラロキシフェン（２μＭ）の組み合わせ（エストラジオール＋スパイク＋ラロキシフェン）のＴＲＡＰ活性を、実施例６に記載のように測定し、Ｕ／Ｌで表したものを示す。データはＵ／Ｌとして報告されている。実験は技術的６反復で行った。結果は、３回実施したうちの代表的な１回の実験の平均±ＳＤである。
【発明を実施するための形態】
【0041】
本発明の第一の目的は、選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）とＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの併用である。
【0042】
すでに上述したように、本発明者らは、上記の組み合わせの投与が、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン単独の投与と比較して、副作用を軽減し、免疫応答を改善することを見出した。
【0043】
したがって、本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防に使用するための上記の組み合わせである。
【0044】
本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防においてＣＯＶＩＤ－１９ワクチンと組み合わせて使用するためのＳＥＲＭである。
【0045】
本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの副作用の予防または治療に使用するためのＳＥＲＭである。
【0046】
前記対象は、好ましくは人間である。
【0047】
前記ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンは、ＣＯＶＩＤ－１９スパイクタンパク質ベースのワクチンである。
【0048】
用語「スパイク蛋白質ベースのワクチン」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク蛋白質、その変異体またはその免疫原性断片を抗原として使用するＣＯＶＩＤ－１９に対するあらゆるワクチンを意味する。これには、対象への投与が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク蛋白質、その変異体または免疫原性断片をかかる対象の体内に誘導する、そのままの、あるいは不活化ウイルスまたは弱毒生ウイルスに結合させた、あらゆるワクチンが含まれる。また、この定義には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク蛋白質、その変異体またはその免疫原性断片を、人体への投与後にその場（ｉｎ ｓｉｔｕ）で産生させるあらゆるｍＲＮＡまたはＤＮＡワクチンも含まれる。
【0049】
好ましくは、前記ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンはＣＯＶＩＤ－１９ ｍＲＮＡまたはＤＮＡワクチンである。
【0050】
本発明の文脈において、用語「ＣＯＶＩＤ－１９ ｍＲＮＡまたはＤＮＡワクチン」は、対象への投与が、当該対象にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、その変異体またはその免疫原性フラグメントの産生を引き起こすｍＲＮＡまたはＤＮＡを含むあらゆるワクチンを指す。
【0051】
本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の「変異体」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、１つ以上の置換、内部アミノ酸の欠失または１つ以上のアミノ酸の挿入を含有するということにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の配列と異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。好ましくは、前記置換、欠失または挿入は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の抗原特性を維持する。
【0052】
好ましくは、前記変異体は、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質とのアミノ酸同一性を有する配列を有する。
【0053】
本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の「免疫原性フラグメント」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端切断配列に対応するアミノ酸配列を有し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその変異体の抗原特性を維持するタンパク質を意味する。
【0054】
前記スパイクタンパク質の免疫原性フラグメントは、好ましくは、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％からなるアミノ酸配列を有する。
【0055】
好ましくは、前記免疫原性フラグメントは、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０ＤＴＣ２）の以下のアミノ酸配列の１つ以上を含む：２３２位値から２４６位値まで、２３３位値から２４７位値まで、４７１位値から５０３位値まで、６０４位値から６２５位値まで、８１７位値から８３３位値まで、８１８位値から８２２位値まで、８９１位値から９０７位値まで、８９７位値から９１３位値まで、１１６４位値から１１９１位値まで、１１８２位値から１２０９位値まで。
【0056】
前記ＳＥＲＭは、好ましくは、タモキシフェン、ラロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、ドロロキシフェン、オスペミフェン、アルゾキシフェン、トレミフェンおよびバゼドキシフェンから選択される。
【0057】
本発明による特に好ましいＳＥＲＭはラロキシフェンである。
【0058】
上述したように、本発明によるＣＯＶＩＤ－１９ワクチンと組み合わせてＳＥＲＭを使用することは、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの投与後に宿主において産生されるスパイクタンパク質の妨害に起因する副作用をエストロゲン受容体の生理学的機能により防止し、ワクチンに対する免疫系の応答を改善する。
【0059】
これらの発見により、ＣＯＶＩＤ－１９を予防するための治療法が改善されることになる。
【0060】
好ましくは、前記副作用は、エストロゲン受容体の過剰活性化による望ましくない作用である。
【0061】
したがって、本発明によるＳＥＲＭの投与は、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの投与およびそれに伴うエストロゲン受容体の活性の上昇の結果として、より重篤な副作用を有する可能性のある対象の場合に特に有利である。例えば、これらは、ＥＲ陽性乳がんと診断された対象、または血液凝固障害のような生理的止血バランスを変化させる病的状態の対象である。
【0062】
一実施形態によれば、前記対象は、ＥＲ陽性乳がんと診断された対象である。
【0063】
別の実施形態によれば、前記対象は、生理的止血バランスを変化させる病的状態と診断された対象である。
【0064】
本発明によるＣＯＶＩＤ－１９ワクチンと併用したＳＥＲＭの投与は、副作用を回避し、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンに対する免疫応答を改善するために、他のすべてのカテゴリーの対象にも有利である。
【0065】
したがって、一実施形態によれば、前記対象は、ＥＲ陽性乳がんと診断されていない対象である。
【0066】
別の実施形態によれば、前記対象は、生理的止血バランスを変化させる病的状態と診断されていない対象である。
【0067】
別の実施形態によれば、前記対象は、生理的止血バランスを変化させる病的状態であるＥＲ陽性乳がんと診断されていない対象である。
【0068】
本発明のすべての目的に従って、ＳＥＲＭはＣＯＶＩＤ－１９ワクチンと同時または別々に投与することができる。
【0069】
好ましくは、ＳＥＲＭは、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンとは別に、異なる投与スケジュールで投与される。
【0070】
好ましくは、ＳＥＲＭは、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを受けた、受けている、または受ける予定の対象に、好ましくは１日１回または２回、ＳＥＲＭの２週間およびワクチンの最初の用量の投与の日から開始し、ワクチンの最後の用量の投与の少なくとも２週間後、より好ましくはワクチンの最後の用量の投与の少なくとも１ヵ月後に終了する期間投与される。
【0071】
投与頻度と投与期間は、使用するＳＥＲＭの用量および／またはＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの種類によって変化する。
【0072】
一実施形態によれば、ＳＥＲＭは、他の病状の治療に通常用いられる用量と頻度で用いられる。
【0073】
より好ましくは、正しい投与量と投与スケジュールを決定するために、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを受ける予定の対象のエストロゲンのレベルをワクチン接種前に測定し、患者の基礎レベルに基づいてＳＥＲＭによる治療を計画する。
【0074】
好ましくは、ＳＥＲＭは、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを受けた、受けている、または受ける予定の対象に、医薬組成物の形態で投与される。
【0075】
したがって、本発明のさらなる目的は、先に記載したように、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防のためにＣＯＶＩＤ－１９ワクチンと組み合わせて使用するための、先に記載したようなＳＥＲＭ、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【0076】
本発明のさらなる目的は、先に記載したようなＳＥＲＭと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物であって、先に記載したような、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの副作用の予防または治療に使用するための医薬組成物である。
【0077】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、有効量のＳＥＲＭおよび薬学的に許容される賦形剤を含む適切な投与量形態で調製される。
【0078】
対象への本発明の医薬組成物の投与は、公知の方法に従うものであり、経口投与、非経口投与、好ましくは静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、動脈内投与、皮下投与、局所投与、頬投与または直腸（座薬）投与から選択される投与を含むことができる。
【0079】
本発明によれば、用語「有効量」は、所望の応答を有意に達成するのに十分な化合物または組成物の投与量を意味する。
【0080】
ワクチンとＳＥＲＭはパーツキットとして提供されることもある。
【0081】
したがって、本発明の別の目的は、
ａ）上記のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン、および
ｂ）上記のＳＥＲＭを含む医薬組成物
を含む部品キットである。
ａ）上記のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン、および
ｂ）上記のＳＥＲＭを含む医薬組成物
を含む部品キットである。
【0082】
本発明による使用のためのＳＥＲＭまたは医薬組成物の投与経路は、使用されるまたは医薬組成物に含有される特定の化合物に依存し、化合物の投与のための既知の方法に従うが、これは通常、全身投与、好ましくは経口、非経口または吸入経路によるものである。本明細書で使用される非経口的という用語は、静脈内、腹腔内、脳内、髄膜内、頭蓋内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、眼内、動脈内、皮下、皮内注射または注入技術を含む。
【0083】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの経口剤、吸入剤、注射剤に製剤化することができる。
【0084】
本発明による薬学的に許容される賦形剤には、所望される特定の投与量形態に適した、ありとあらゆる溶媒、希釈剤、または他のビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、表面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などが含まれる。
【0085】
薬学的に許容される賦形剤として機能しうる材料のいくつかの例としては、ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンのようなデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなセルロースおよびその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬ワックスのような賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；滅菌水；リンゲル液；緩衝食塩水；ブドウ糖溶液；マルトデキストリン溶液；エチルアルコール；およびリン酸緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。
【0086】
さらに、本発明の組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤をさらに添加することにより、溶液、懸濁液、乳剤などの吸入可能または注射可能な剤形に製剤化することができる。
【0087】
さらに、本発明の組成物は、当該技術分野で公知の適切な方法を用いて、またはRemington's Pharmaceutical Science(recent edition), Mack Publishing Company, Easton Pa.（非特許文献１２）に開示されている方法により、好適に処方することができる。
【0088】
「薬学的に許容される」という用語は、生物に投与される医薬組成物を調製するのに適したあらゆる材料を、限定することなく定義することを意図している。
【0089】
投与量形態は、防腐剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、乳化剤、甘味料、着色料、香料などのような従来の他の成分を含むこともできる。
【0090】
本発明の医薬組成物の投与量形態は、製薬化学者によく知られた技術によって調製することができ、混合、造粒、圧縮、溶解、滅菌などが含まれる。
【0091】
本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９の予防方法であって、ＳＥＲＭと組み合わせてＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを前記対象に投与することを含む、方法である。
【0092】
本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの副作用の予防または治療のための方法であって、前記対象にＳＥＲＭを投与することを含む方法である。
【実施例】
【0093】
実施例１～４
材料と方法
１． インターアクトーム（interactome）解析
ＳＴＲＩＮＧデータベース［Szklarczyk D et al., Nucleic Acids Res. 2021, 49: D605-D612, doi: 10.1093/nar/gkaa1074（非特許文献１３）］は、物理的相互作用ならびに機能的連係を含めた、タンパク質間の既知および予測されるすべての関連性を統合したものであり、生体分子間の機能的関連性を解析するために使用された。各タンパク質－タンパク質相互作用は「スコア」で注記されている。このスコアは相互作用の強さまたは特異性を示すものではなく、信頼性のみを示す。すべてのスコアは０から１までランク付けされ、１が起こりうる最も高い信頼度である。
材料と方法
１． インターアクトーム（interactome）解析
ＳＴＲＩＮＧデータベース［Szklarczyk D et al., Nucleic Acids Res. 2021, 49: D605-D612, doi: 10.1093/nar/gkaa1074（非特許文献１３）］は、物理的相互作用ならびに機能的連係を含めた、タンパク質間の既知および予測されるすべての関連性を統合したものであり、生体分子間の機能的関連性を解析するために使用された。各タンパク質－タンパク質相互作用は「スコア」で注記されている。このスコアは相互作用の強さまたは特異性を示すものではなく、信頼性のみを示す。すべてのスコアは０から１までランク付けされ、１が起こりうる最も高い信頼度である。
【0094】
２． ３Ｄモデルの選択
スパイク３Ｄモデルは、野生型に戻され完全にグリコシル化されたＰＤＢ ６ＶＹＢに基づいて構築された。３つのプロトマーの非対称グリコシル化は、公表されているＮ－グリカンとＯ－グリカンのグリコアナリシスのデータによって導かれた（Casalini L et al, ACS Cent.Sci. 2020, 6:1722-1734, https://doi.org/10.1021/acscentsci.0c01056（非特許文献１４））。タンパク質はＡｍｂｅｒ１４ＳＢ力場を用いてモデル化し（Maier J A et al, J. Chem. Theory Comput.2015, 11:3696-3713, https://doi.org/10.1021/acs.jctc.5b00255（非特許文献１５））、糖質部分（carbohydrate moieties）はＧＬＹＣＡＭ０６力場のＧＬＹＣＡＭ０６ｊ－１バージョン（Kirschner KN et al, J. Comput.Chem.2008, 29:622-655, https://doi.org/10.1002/jcc.20820（非特許文献１６））によってモデル化した。このようにして調製した構造を、分子ドッキング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｏｃｋｉｎｇ）シミュレーションの開始点として使用した。トポロジーファイルは、ａｍｂｅｒ９９ｓｂ力場（Lindorff-Larsen K et al, Proteins 2010,78:1950-1958, https://dx.doi.org/10.1002/prot.22711（非特許文献１７））を使用して、ｐｄｂ２ｇｍｘ ＧＲＯＭＡＣＳツールで生成した。タンパク質は、溶質から１５Åまで伸びる三斜晶ボックス内に挿入し、ＴＩＰ３Ｐ水分子（Jorgensen WL et al, J Chem Phys 1983, 79:926-935, https://dx.doi.org/10.1063/1.445869（非特許文献１８））に浸した。全体の電荷を中和するために、Ｇｅｎｉｏｎ ＧＲＯＭＡＣＳツールで対イオンを加えた。エネルギー最小化の後、タンパク質原子に１０００ｋＪｍｏｌ－１ｎｍ－２の位置拘束を適用して系を５ｎｓに弛緩させた。このステップに続いて、ＧＲＯＭＡＣＳ２０１８．３シミュレーションパッケージ（スーパーコンピューターＧａｌｉｌｅｏおよびＭａｒｃｏｎｉ－１００、ＣＩＮＥＣＡ、ボローニャ、イタリア）を用いて、時間ステップ２ｆｓで、１マイクロ秒の長さで非拘束ＭＤシミュレーションを実施した（Abraham MJ et al., SoftwareX 2015, 1:19-25, https://dx.doi.org/10.1016/j.softx.2015.06.001（非特許文献１９））。温度を３００Ｋで一定に保つためにＶ－ｒｅｓｃａｌｅ温度カップリングを採用した（Bussi G et al, J Chem Phys, 2007 126:014101.https://dx.doi.org/10.1063/1.2408420（非特許文献２０））。長距離静電相互作用の処理にはＰａｒｔｉｃｌｅ－Ｍｅｓｈ Ｅｗａｌｄ法を用いた（Darden T et al., J. Chem.Phys 1993, 98:10089, https://doi.org/10.1063/1.464397（非特許文献２１））。各軌跡の最初の５ナノ秒は解析から除外した。１マイクロ秒のＭＤシミュレーション後に得られた軌跡は、代表的な構造を得るためにクラスター化された。特に、ドッキング研究に使用された構造は、ＭＤ実験から抽出された最初のクラスターの最初の重心である。
スパイク３Ｄモデルは、野生型に戻され完全にグリコシル化されたＰＤＢ ６ＶＹＢに基づいて構築された。３つのプロトマーの非対称グリコシル化は、公表されているＮ－グリカンとＯ－グリカンのグリコアナリシスのデータによって導かれた（Casalini L et al, ACS Cent.Sci. 2020, 6:1722-1734, https://doi.org/10.1021/acscentsci.0c01056（非特許文献１４））。タンパク質はＡｍｂｅｒ１４ＳＢ力場を用いてモデル化し（Maier J A et al, J. Chem. Theory Comput.2015, 11:3696-3713, https://doi.org/10.1021/acs.jctc.5b00255（非特許文献１５））、糖質部分（carbohydrate moieties）はＧＬＹＣＡＭ０６力場のＧＬＹＣＡＭ０６ｊ－１バージョン（Kirschner KN et al, J. Comput.Chem.2008, 29:622-655, https://doi.org/10.1002/jcc.20820（非特許文献１６））によってモデル化した。このようにして調製した構造を、分子ドッキング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｏｃｋｉｎｇ）シミュレーションの開始点として使用した。トポロジーファイルは、ａｍｂｅｒ９９ｓｂ力場（Lindorff-Larsen K et al, Proteins 2010,78:1950-1958, https://dx.doi.org/10.1002/prot.22711（非特許文献１７））を使用して、ｐｄｂ２ｇｍｘ ＧＲＯＭＡＣＳツールで生成した。タンパク質は、溶質から１５Åまで伸びる三斜晶ボックス内に挿入し、ＴＩＰ３Ｐ水分子（Jorgensen WL et al, J Chem Phys 1983, 79:926-935, https://dx.doi.org/10.1063/1.445869（非特許文献１８））に浸した。全体の電荷を中和するために、Ｇｅｎｉｏｎ ＧＲＯＭＡＣＳツールで対イオンを加えた。エネルギー最小化の後、タンパク質原子に１０００ｋＪｍｏｌ－１ｎｍ－２の位置拘束を適用して系を５ｎｓに弛緩させた。このステップに続いて、ＧＲＯＭＡＣＳ２０１８．３シミュレーションパッケージ（スーパーコンピューターＧａｌｉｌｅｏおよびＭａｒｃｏｎｉ－１００、ＣＩＮＥＣＡ、ボローニャ、イタリア）を用いて、時間ステップ２ｆｓで、１マイクロ秒の長さで非拘束ＭＤシミュレーションを実施した（Abraham MJ et al., SoftwareX 2015, 1:19-25, https://dx.doi.org/10.1016/j.softx.2015.06.001（非特許文献１９））。温度を３００Ｋで一定に保つためにＶ－ｒｅｓｃａｌｅ温度カップリングを採用した（Bussi G et al, J Chem Phys, 2007 126:014101.https://dx.doi.org/10.1063/1.2408420（非特許文献２０））。長距離静電相互作用の処理にはＰａｒｔｉｃｌｅ－Ｍｅｓｈ Ｅｗａｌｄ法を用いた（Darden T et al., J. Chem.Phys 1993, 98:10089, https://doi.org/10.1063/1.464397（非特許文献２１））。各軌跡の最初の５ナノ秒は解析から除外した。１マイクロ秒のＭＤシミュレーション後に得られた軌跡は、代表的な構造を得るためにクラスター化された。特に、ドッキング研究に使用された構造は、ＭＤ実験から抽出された最初のクラスターの最初の重心である。
【0095】
エストロゲン受容体については、エストラジオールおよび核内受容体コアクチベーター１を含有する、コード３ＯＬのＸＲＡＹ ＰＤＢモデルを使用した（Mocklinghoff S et al, ChemBioChem 2010, 11:2251-2254, https://doi.org/10.1002/cbic.201000532（非特許文献２２））。
【0096】
３． タンパク質－タンパク質ドッキング手順
２つのタンパク質、一方はレセプターおよび他方はリガンドの入力を提供した。特に、Ｓｐｉｋｅタンパク質およびＥＲをそれぞれ受容体およびリガンドとして用いた。次に、ＨＤＯＣＫツールは、ＦＦＴベースの探索方法により、推定される結合様式をサンプリングするドッキングを行い、タンパク質間相互作用をスコアリングする。最後に、予測された複合体構造のトップ１００が提供され、計算の信頼性を確認するために、ベスト１０の仮説が視覚的に検査された。ワークフロー全体は記載（Yan Y et al, Nat Protoc 2020, 15:1829-1852, https://doi.org/10.1038/s41596-020-0312-x（非特許文献２３））されている。
２つのタンパク質、一方はレセプターおよび他方はリガンドの入力を提供した。特に、Ｓｐｉｋｅタンパク質およびＥＲをそれぞれ受容体およびリガンドとして用いた。次に、ＨＤＯＣＫツールは、ＦＦＴベースの探索方法により、推定される結合様式をサンプリングするドッキングを行い、タンパク質間相互作用をスコアリングする。最後に、予測された複合体構造のトップ１００が提供され、計算の信頼性を確認するために、ベスト１０の仮説が視覚的に検査された。ワークフロー全体は記載（Yan Y et al, Nat Protoc 2020, 15:1829-1852, https://doi.org/10.1038/s41596-020-0312-x（非特許文献２３））されている。
【0097】
スパイクタンパク質および核内エストロゲン受容体（ＥＲ）の結合メカニズムに関する構造の情報が欠如していたため、最初のチェックには、エストロゲン受容体と相互作用することが知られているタンパク質を同定することが含まれた。これらのＥＲ相互作用タンパク質を同定した後、第二段階には、スパイクタンパク質とＥＲエフェクタータンパク質との間のあらゆる配列類似性の調査が含まれた。
【0098】
実施例１
核内受容体コアクチベーターとＬｘｘＬＬモチーフ
多くの転写因子およびコファクターは、エフェクタータンパク質との相互作用を確実にする共通の構造モチーフを示す。これらのタンパク質－タンパク質相互作用に関与するモチーフはＬｘｘＬＬ（ＬＤＸ）と呼ばれ、転写制御の様々な側面に関連している（Plevin MJ et al, Trends Biochem Sci 2005, 30:66-69, https://dx.doi.org/10.1016/j.tibs.2004.12.001（非特許文献２４））。ＬｘｘＬＬ配列はもともと、核内受容体リガンド結合ドメイン（ＬＢＤｓ）の活性化機能－２（ＡＦ－２）領域に結合するタンパク質で同定された。これらのモチーフは、コアクチベータ（ＮＣＯＡ－１、２、３）を含む多くの核内受容体結合タンパク質との核内受容体制御における基本である（Heery DM et al, Nature 1997, 387:733-736, https://doi.org/10.1038/42750（非特許文献２５））。
核内受容体コアクチベーターとＬｘｘＬＬモチーフ
多くの転写因子およびコファクターは、エフェクタータンパク質との相互作用を確実にする共通の構造モチーフを示す。これらのタンパク質－タンパク質相互作用に関与するモチーフはＬｘｘＬＬ（ＬＤＸ）と呼ばれ、転写制御の様々な側面に関連している（Plevin MJ et al, Trends Biochem Sci 2005, 30:66-69, https://dx.doi.org/10.1016/j.tibs.2004.12.001（非特許文献２４））。ＬｘｘＬＬ配列はもともと、核内受容体リガンド結合ドメイン（ＬＢＤｓ）の活性化機能－２（ＡＦ－２）領域に結合するタンパク質で同定された。これらのモチーフは、コアクチベータ（ＮＣＯＡ－１、２、３）を含む多くの核内受容体結合タンパク質との核内受容体制御における基本である（Heery DM et al, Nature 1997, 387:733-736, https://doi.org/10.1038/42750（非特許文献２５））。
【0099】
ＥＲとＮＣＯＡとの間の相互作用を示す実験的および構造的な確認により、ＬｘｘＬＬモチーフに注目することが可能となり、これを出発点として、スパイクタンパク質の配列のマッピングが行われ、ＥＲとその核内コアクチベーターとの間の相互作用を模倣できるスパイクの構造モチーフおよび相同部分が探索された（図１）。
【0100】
実施例２
エストロゲン受容体結合タンパク質のネットワーク解析
ＥＲ１およびＥＲ２（ともに球体）の最も重要な相互作用のネットワーク（図２）は、ＥＲ１およびＥＲ２と最も確実に相互作用するタンパク質の中で、核内受容体コアクチベータ－（ＣＯＡｃｔｉｖａｔｏｒ）（ＮＣＯＡｓ）が核内受容体と直接結合し、ホルモン依存性の形式で転写活性を刺激することを強調している。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに寄託されているＥＲとＮＣＯＡｓの複合体の多くの実験データは、これらの知見を支持しており、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースに見出すことができる（ER1: https://www.uniprot.org/uniprot/P03372#structure（非特許文献２６）； ER2: https://www.uniprot.org/uniprot/Q92731#structure（非特許文献２７））。
エストロゲン受容体結合タンパク質のネットワーク解析
ＥＲ１およびＥＲ２（ともに球体）の最も重要な相互作用のネットワーク（図２）は、ＥＲ１およびＥＲ２と最も確実に相互作用するタンパク質の中で、核内受容体コアクチベータ－（ＣＯＡｃｔｉｖａｔｏｒ）（ＮＣＯＡｓ）が核内受容体と直接結合し、ホルモン依存性の形式で転写活性を刺激することを強調している。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに寄託されているＥＲとＮＣＯＡｓの複合体の多くの実験データは、これらの知見を支持しており、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースに見出すことができる（ER1: https://www.uniprot.org/uniprot/P03372#structure（非特許文献２６）； ER2: https://www.uniprot.org/uniprot/Q92731#structure（非特許文献２７））。
【0101】
ＮＡＣＯｓとスパイクとの間の配列アラインメントと、ウイルスタンパク質の３次元解析を組み合わせると、スパイクタンパク質はＬｘｘＬＬに相同な配列を含有し、外側の領域において、構造的な観点からも有効であり（実際、この領域はα－ヘリックスコンホメーションをとる）、原理的にはＥＲとの相互作用領域部位として働く可能性があることが明らかになった（図３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の８１８から８２８番目のアミノ酸）。異なるＬＤＸドメインは特定の補因子－受容体相互作用に関連しており、スパイクＬＤＸ１はＮＣＯＡ１ ＬＤＸ４に似ており、クラスＩＩＩドメインに属している（Savkur RS et al, J Pept Res 2004, 63:207-212, https://dx.doi.org/10.1111/j.1399-3011.2004.00126.x（非特許文献２８））。
【0102】
実施例３
スパイクタンパク質とＥＲのブラインドドッキング
ＥＲがウイルスタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）と結合しないことは、実験的に検証されている（データは示さず）。インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）予測を確認し、検証するために、ＥＲがウイルスＲＢＤ以外の領域で相互作用する能力を、ＨＤＯＣＫサーバー［http://hdock.phys.hust.edu.cn/（非特許文献２９）］を用いた２つのタンパク質間のブラインドドッキングによって評価した。ブラインドドッキングのアプローチは、いずれの構造的なバイアスも考慮せず、完全に無誘導である。見つかった最良の結合仮説は、いわゆる「融合ペプチド部分」に属するスパイクタンパク質の側方領域に対するＥＲの高い親和性を証明するものであった（図４）。
スパイクタンパク質とＥＲのブラインドドッキング
ＥＲがウイルスタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）と結合しないことは、実験的に検証されている（データは示さず）。インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）予測を確認し、検証するために、ＥＲがウイルスＲＢＤ以外の領域で相互作用する能力を、ＨＤＯＣＫサーバー［http://hdock.phys.hust.edu.cn/（非特許文献２９）］を用いた２つのタンパク質間のブラインドドッキングによって評価した。ブラインドドッキングのアプローチは、いずれの構造的なバイアスも考慮せず、完全に無誘導である。見つかった最良の結合仮説は、いわゆる「融合ペプチド部分」に属するスパイクタンパク質の側方領域に対するＥＲの高い親和性を証明するものであった（図４）。
【0103】
実施例４
スパイクタンパク質－ＥＲモチーフ指向型ドッキング
ＥＲ残基がＮＣＯＡｓによって認識されるという構造情報は、タンパク質－タンパク質相互作用を最適化することによって、スパイクに対するＥＲのドッキング研究を導くために使用された。タンパク質の構造と残基の拘束を入力として、ＨＤＯＣＫサーバーによって適切なモデルが生成された。ＥＲとＮＣＯＡとの間の相互作用の構造情報が既知であるとすると、ＮＣＯＡｓとの相互作用を保証するＥＲ残基を考慮した第二のドッキング研究が実施され、分子ドッキング手順が導かれる。ガイド付きドッキング研究から得られた最良の結合仮説を図５に示すが、これはＬｘｘＬＬパターンに相同なモチーフを含有するスパイク領域へのＥＲの結合を強調している（図５）。
スパイクタンパク質－ＥＲモチーフ指向型ドッキング
ＥＲ残基がＮＣＯＡｓによって認識されるという構造情報は、タンパク質－タンパク質相互作用を最適化することによって、スパイクに対するＥＲのドッキング研究を導くために使用された。タンパク質の構造と残基の拘束を入力として、ＨＤＯＣＫサーバーによって適切なモデルが生成された。ＥＲとＮＣＯＡとの間の相互作用の構造情報が既知であるとすると、ＮＣＯＡｓとの相互作用を保証するＥＲ残基を考慮した第二のドッキング研究が実施され、分子ドッキング手順が導かれる。ガイド付きドッキング研究から得られた最良の結合仮説を図５に示すが、これはＬｘｘＬＬパターンに相同なモチーフを含有するスパイク領域へのＥＲの結合を強調している（図５）。
【0104】
実施例５
がん細胞の増殖の誘導
この実験では、ＭＣＦ－７細胞とＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を用いた。ＭＣＦ－７は浸潤性乳管／乳がん（invasive ductal/breast carcinoma）ホルモン依存性細胞株（エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体ともに陽性）であり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１はエストロゲン受容体を欠く上皮性ヒト乳がん細胞株である。
がん細胞の増殖の誘導
この実験では、ＭＣＦ－７細胞とＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を用いた。ＭＣＦ－７は浸潤性乳管／乳がん（invasive ductal/breast carcinoma）ホルモン依存性細胞株（エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体ともに陽性）であり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１はエストロゲン受容体を欠く上皮性ヒト乳がん細胞株である。
【0105】
細胞はＡＴＣＣから入手し、フェノールレッド無添加、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２、９５％加湿雰囲気で増殖させた。各アッセイにおいて、細胞は１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種した。処理の前に、ＦＢＳ中のエストロゲンレベルを下げ、いずれの干渉も避けるため、細胞を５％デキストランでコーティングしたチャーコールで処理された血清を含有する培地で２４時間培養した。
【0106】
その後、細胞を、エストラジオール（１ｎＭ）（ＥＳＴＲ）、スパイクタンパク質（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＳＰＩＫＥ）、ラロキシフェン（２μＭ）（ＲＡＬ）、１７β－エストラジオール（１ｎＭ）とスパイクプロテイン（１０ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせ（ＥＳＴＲ＋ＳＰＩＫＥ）、１７β－エストラジオール（１ｎＭ）とラロキシフェン（２μＭ）の組み合わせ（ＥＳＴＲ＋ＲＡＬ）、スパイクタンパク質（１０ｎｇ／ｍｌ）とラロキシフェン（２μＭ）の組み合わせ（ＳＰＩＫＥ＋ＲＡＬ）、１７β－エストラジオール（１ｎＭ）、スパイクタンパク質（１０ｎｇ／ｍｌ）およびラロキシフェン（２μＭ）の組み合わせ（ＥＳＴＲ＋ＳＰＩＫＥ＋ＲＡＬ）で２４時間処理した。
【0107】
その後、細胞の増殖を測定するために、ＢｒｄＵ増殖アッセイを行った。このアッセイは、細胞層を固相として用いてマイクロタイタープレートで培養された分裂細胞のＤＮＡにＢｒｄＵを取り込ませることを含む。ＢｒｄＵ細胞増殖ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、ａｂ１２６５５６）を製造元の指示に従って使用した。ＢｒｄＵを２４時間ウェルに添加し、次いで、Ｆｉｘｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて細胞を固定した。次いで、細胞を洗浄し、検出器抗ＢｒｄＵ抗体と１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたヤギ抗マウス抗体と３０分間インキュベートした。検出のために発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、発色した産物を分光光度計（４５０／５５０ｎｍ）を用いて検出した。
【0108】
得られた結果を、ＭＣＦ７細胞については図６に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞については図７に示す。見てわかるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、エストロゲンレセプターの存在に依存した乳がん細胞に対する増殖誘導活性を示す。事実、ＭＣＦ－７細胞では、１７β－エストラジオールまたはスパイクで処理すると、細胞の増殖が同様に増加するが、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞では、１７β－エストラジオールおよびスパイクは、単独でも併用でも細胞増殖に有意な影響を与えない。１７β－エストラジオールとスパイクの両方の増殖促進活性は、ＳＥＲＭであるラロキシフェンによる処理によってブロックされる。これらの結果は、スパイクがエストロゲン受容体を活性化することによって細胞に作用し、ＥＲ陽性がん細胞の増殖を誘導できることを明確に示している。
【0109】
実施例６
ＲＡＷ－ＯＣｓにおけるＥＬＩＳＡアッセイによるＴＲＡＰ活性
スパイクがエストロゲン受容体を活性化することをさらに例示するために、破骨細胞モデルにおいて、ＴＲＡＰ活性に対する１７β－エストラジオールとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの効果を比較した。
ＲＡＷ－ＯＣｓにおけるＥＬＩＳＡアッセイによるＴＲＡＰ活性
スパイクがエストロゲン受容体を活性化することをさらに例示するために、破骨細胞モデルにおいて、ＴＲＡＰ活性に対する１７β－エストラジオールとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの効果を比較した。
【0110】
組換えＲＡＮＫＬに暴露されると破骨細胞に分化する、マウス単球系細胞株であるＲＡＷ２６４．７を用いた。
【0111】
詳細には、ＲＡＷ２６４．７（マウスマクロファージＡＴＣＣ、米国）を製造元のプロトコールに従って培養した。その後、２４ウェルディッシュに１．５×１０５細胞／ｃｍ２を播種し、マウス破骨細胞（ＯＣ）の発生を開始させるために、核因子ｋｂリガンドのマウス受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ）を最終濃度３５ｎｇ／ｍｌで添加した（０日目）（Collin-Osdoby and Osdoby 2012, PMID: 22130930（非特許文献３０））。３日目に、細胞を顕微鏡で観察し、ＲＡＮＫＬを含有する新鮮な培地で再培養した。６日目に、ＲＡＷ－ＯＣ集団が蔓延していた。細胞を１７－β－エストラジオール（１ｎＭ）、スパイク（１０ｎｇ／ｍｌ）、ラロキシフェン（２μＭ）、およびこれらの組み合わせで２４時間処理した。２４時間の処理後、細胞を滅菌チューブに集め、約１００万／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁した。その後、細胞は凍結融解を繰り返し、内部の成分を放出させた。その間、キットの試薬を室温に戻した。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性は、Ｍｙｏｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社から購入した酵素結合免疫吸着測定法（猫番号ＭＢＳ１６０１１６７）により測定した。標準曲線、試薬およびサンプルは、製造業者のプロトコールに従って調製した。手短には、５０μｌの標準品を標準ウェルに、４０μｌの試料対試料ウェルに添加し、次いで１０μｌの抗ＴＲＡＰ抗体を試料ウェルに、５０μｌのストレプトアビジン－ＨＲＰを試料ウェルと標準ウェルに添加した。プレートをシーラーで覆い、振動台の上でよく混合し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄し、各ウェルに基質溶液Ａ５０μｌと基質溶液Ｂ５０μｌを加え、３７℃、暗所で１０分間インキュベートした。最後に、各ウェルに５０μｌの停止液を加え、直ちに４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを用いて光学濃度を測定した。
【0112】
得られた結果を図８に示す。見てわかるように、細胞をエストラジオールまたはスパイクで処理すると、ＴＲＡＰの活性が重畳的に低下し、この効果はＳＥＲＭであるラロキシフェンとの共処理によって阻害される。これらの結果は、スパイクがエストロゲン受容体を活性化することによって作用することをさらに例示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】