特表 2024-511851 改変血漿凝固第ＶＩＩＩ因子およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-15

(54)【発明の名称】改変血漿凝固第ＶＩＩＩ因子およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20240308BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20240308BHJP

   C07K 14/755 20060101ALI20240308BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240308BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240308BHJP

   A61K 38/37 20060101ALI20240308BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240308BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240308BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240308BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240308BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C07K14/00

C07K14/755

C12N15/864 100Z

C12N5/10

A61K38/37

A61K35/76

A61K35/12

A61K31/7088

A61P7/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023560378

(86)(22)【出願日】2021-03-30

(85)【翻訳文提出日】2023-11-15

(86)【国際出願番号】 US2021024916

(87)【国際公開番号】W WO2022211791

(87)【国際公開日】2022-10-06

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523370945

【氏名又は名称】エーエーブイネルジーン インク．

【氏名又は名称原語表記】ＡＡＶＮＥＲＧＥＮＥ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ワン，チージャオ

(72)【発明者】

【氏名】ユ，ダオジャン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93Y

4B065AB10

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA07

4C084CA53

4C084DC15

4C084NA14

4C084ZA53

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA53

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087BC83

4C087CA12

4C087CA20

4C087NA14

4C087ZA53

4H045AA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA66

4H045EA24

4H045FA74

(57)【要約】

増強された第ＶＩＩＩ因子の活性を有する、改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを記載する。一部の実施形態において、改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ２０、Ｔ２１、Ｆ５７、Ｌ６９、Ｉ８０、Ｌ１７８、Ｒ１９９、Ｈ２１２、Ｉ２１５、Ｒ２６９、Ｉ３１０、Ｌ３１８、Ｓ３３２、Ｒ３７８、Ｉ６１０および／またはＩ６６１位に１以上のアミノ酸置換を含む。そのようなポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするウイルスベクターは、血友病ＡなどのＦＶＩＩＩ欠乏症の処置のために使用され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ａ２０、Ｔ２１、Ｆ５７、Ｌ６９、Ｉ８０、Ｌ１７８、Ｒ１９９、Ｈ２１２、Ｉ２１５、Ｒ２６９、Ｉ３１０、Ｌ３１８、Ｓ３３２、Ｒ３７８、Ｉ６１０およびＩ６６１からなる群から選択される位置に１以上のアミノ酸置換を含む、単離された改変ヒト第ＶＩＩＩ因子（ｍｈＦＶＩＩＩ）。

【請求項2】

表１に記載のアミノ酸置換からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の単離されたｍｈＦＶＩＩＩ。

【請求項3】

Ａ２０Ｋ、Ｔ２１Ｉ、Ｔ２１Ｖ、Ｆ５７Ｌ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、Ｓ３３２Ｐ、Ｒ３７８Ｓ、Ｉ６１０ＭおよびＩ６６１Ｖからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む、請求項１または２に記載の単離されたｍｈＦＶＩＩＩ。

【請求項4】

（１）Ａ２０ＫおよびＴ２１Ｉ、または
（２）Ａ２０ＫおよびＴ２１Ｖ、または
（３）Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９ＶおよびＩ８０Ｖ、または
（４）Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０およびＬ１７８Ｆ、または
（５）Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、およびＩ６６１Ｖ、または
（６）Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０、Ｌ１７８ＦおよびＩ６６１Ｖ、または
（７）Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８ＦおよびＳ３３２Ｐ、または
（８）Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｌ３１８ＦおよびＩ６６１Ｖ、または
（９）Ａ２０Ｋ、Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｌ３１８ＦおよびＩ６６１Ｖ、または
（１０）Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、Ｓ３３２ＰおよびＩ６６１Ｖ、または
（１１）Ａ２０Ｋ、Ｔ２１Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、Ｓ３３２ＰおよびＩ６６１Ｖ
のアミノ酸置換を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のｍｈＦＶＩＩＩ。

【請求項5】

単一ポリペプチドからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載のｍｈＦＶＩＩＩ。

【請求項6】

トランケートされたＢドメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｍｈＦＶＩＩＩ。

【請求項7】

（１）野生型ｈＦＶＩＩＩまたはｍｈＦＶＩＩＩのＡ１およびＡ２ドメイン、ならびに（２）非ヒト種由来のＦＶＩＩＩのＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｍｈＦＶＩＩＩ。

【請求項8】

Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインが、イヌ第ＶＩＩＩ因子由来である、請求項７に記載のｍｈＦＶＩＩＩ。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか一項に記載のｍｈＦＶＩＩＩをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、任意に、ポリヌクレオチドに動作可能に連結された調節配列を含有する、単離されたポリヌクレオチド。

【請求項10】

請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項11】

ウイルスベクターである、請求項１０に記載の発現ベクター。

【請求項12】

ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項１１に記載の発現ベクター。

【請求項13】

請求項１０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項14】

（１）請求項１～８のいずれか一項に記載の単離されたｍｈＦＶＩＩＩ、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の発現ベクター、または請求項１３に記載の宿主細胞；および
（２）薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物。

【請求項15】

医薬における使用のための、請求項１４に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、一般に、医学的処置、特に、改変血漿凝固第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、および血友病Ａの処置におけるそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

血友病Ａは、機能的血漿凝固第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩ）の欠乏によって引き起こされるＸ連鎖劣性障害である。血友病Ａを有する患者において、血液は、適切に凝固せず、負傷した時に過剰の出血をもたらす。出血表現型は、一般に、残留因子活性に関係する：重度の疾患を有する人々（因子活性が正常の＜１％）は、頻繁に突発的に出血する；中等度の疾患を有する人々（因子活性が正常の１％～５％）は、軽い外傷により出血するが、稀に突発的に出血する；および軽度の疾患を有する人々（因子活性が正常の５％～４０％）は、侵襲的手順または外傷の間に出血する。

【0003】

重度の血友病Ａ（＜１％の第ＶＩＩＩ因子活性）のための現在の処置は、組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）または血漿濃縮第ＶＩＩＩ因子の定期的な静脈内注入を必要とする。中等度および軽度の血友病Ａを有する個体は、定期的な予防的スケジュールなく、必要な場合に処置され得る。注入処置は、高価で、感染性疾患のリスクを導く。ｒＦＶＩＩＩ療法は、産生、精製および製剤化の費用に起因してコストがかかることが判明している。ｒＦＶＩＩＩ療法は、他の送達経路からの限定的な生物学的利用率に起因して、送達のための静脈内アクセスが依然必要である。ｒＦＶＩＩＩのコストおよび限定的な利用率のため、この処置戦略を広く実行することが妨げられている。

【0004】

遺伝子療法は、注入処置に対する代替案を提供する。しかしながら、現在の遺伝子療法は、高ウイルスベクター用量が必要であり、処置関連費用が増加する。しかしながら、遺伝子療法技法を実行するうえでの困難としては、ベクターの毒性および第ＶＩＩＩ因子の不十分な発現レベルが挙げられる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、分泌の増加、特異的活性の増加、またはその両方を反映する、改善された凝固活性のために生物工学によって作られたＦＶＩＩＩは、細胞培養製造またはトランスジェニック動物におけるｒＦＶＩＩＩ産生を大幅に改善するだけでなく、血友病Ａに対する遺伝子療法戦略の成功可能性を高める。そのため、ＦＶＩＩＩ産生を増加させるか、またはウイルスベクターの必要な用量を許容されるレベルに低減するために十分な量のｈＦＶＩＩＩタンパク質を効率的に発現することができる、改善されたベクターおよび構築物が必要である。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本出願の一態様は、野生型ｈＦＶＩＩＩポリペプチドまたは参照ポリペプチドと比較して、１以上の変異を含有する改変ｈＦＶＩＩＩポリペプチド（ｍｈＦＶＩＩＩ）に関する。

【0007】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、Ａ２０、Ｔ２１、Ｆ５７、Ｌ６９、Ｉ８０、Ｌ１７８、Ｒ１９９、Ｈ２１２、Ｉ２１５、Ｒ２６９、Ｉ３１０、Ｌ３１８、Ｓ３３２、Ｒ３７８、Ｉ６１０および／またはＩ６６１位に１以上のアミノ酸置換を含む。

【0008】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、表１に記載のアミノ酸置換からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む。

【0009】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、Ａ２０Ｋ、Ｔ２１Ｉ、Ｔ２１Ｖ、Ｆ５７Ｌ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、Ｓ３３２Ｐ、Ｒ３７８Ｓ、Ｉ６１０ＭおよびＩ６６１Ｖからなる群から選択される位置に１以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、単一のアミノ酸置換を含有する。

【0010】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸Ａ２０ＫおよびＴ２１Ｉのそれぞれにおけるアミノ酸置換を含む。

【0011】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ａ２０ＫおよびＴ２１Ｖを含む。

【0012】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、およびＩ８０Ｖを含む。

【0013】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０、およびＬ１７８Ｆを含む。

【0014】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、およびＩ６６１Ｖを含む。

【0015】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０、Ｌ１７８Ｆ、およびＩ６６１Ｖを含む。

【0016】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、およびＳ３３２Ｐを含む。

【0017】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｌ３１８Ｆ、およびＩ６６１Ｖを含む。

【0018】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ａ２０Ｋ、Ｔ２１Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｌ３１８Ｆ、およびＩ６６１Ｖを含む。

【0019】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、Ｓ３３２ＰおよびＩ６６１Ｖを含む。

【0020】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ａ２０Ｋ、Ｔ２１Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、Ｓ３３２ＰおよびＩ６６１Ｖを含む。

【0021】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、ｈＦＶＩＩＩのＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含む単一ポリペプチドからなる。

【0022】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、（１）ｈＦＶＩＩＩのＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメイン；および（２）ｈＦＶＩＩＩのトランケートされたＢドメインを含む単一ポリペプチドからなる。

【0023】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、ｈＦＶＩＩＩのＡ１およびＡ２ドメインを含む重鎖ポリペプチド、ならびにｈＦＶＩＩＩのＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含む軽鎖ポリペプチドからなる。一部の実施形態において、重鎖ポリペプチドは、ｈＦＶＩＩＩのトランケートされたＢドメインをさらに含み、軽鎖ポリペプチドは、ｈＦＶＩＩＩのＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含む。

【0024】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、ヒトＦＶＩＩＩの重鎖、および異なる種由来のＦＶＩＩＩの軽鎖、例えば、イヌＦＶＩＩＩの軽鎖を含む。

【0025】

本出願の別の態様は、本出願のｍｈＦＶＩＩＩをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。

【0026】

本出願の別の態様は、本出願のポリヌクレオチド；およびポリヌクレオチドに動作可能に連結された調節配列を含む発現カセットに関する。

【0027】

本出願の別の態様は、本出願のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。一部の実施形態において、発現ベクターは、プラスミドである。一部の実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態において、発現ベクターは、ＡＡＶベクターである。

【0028】

本出願の別の態様は、本出願の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。

【0029】

本出願の別の態様は、本出願のｍｈＦＶＩＩＩおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

【0030】

本出願の別の態様は、本出願の発現ベクターおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

【0031】

本出願の別の態様は、第ＶＩＩＩ因子欠乏症を有する対象を処置する方法に関する。該方法は、有効量の本出願のｍｈＦＶＩＩＩ、発現ベクター、または宿主細胞を対象に投与する工程を含む。

【0032】

本出願の別の態様は、ｍｈＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチドを含む組換えＡＡＶベクターであって、ｍｈＦＶＩＩＩが、Ａ２０Ｋ、Ｔ２１Ｉ、Ｔ２１Ｖ、Ｆ５７Ｌ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、Ｓ３３２Ｐ、Ｒ３７８Ｓ、Ｉ６１０ＭおよびＩ６６１Ｖからなる群から選択される位置に１以上のアミノ酸置換を含み、ＡＡＶベクターが、宿主細胞中でｍｈＦＶＩＩＩを発現することができる、組換えＡＡＶベクターに関する。一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、ｈＦＶＩＩＩのトランケートされたＢドメインを含む。

【0033】

本出願の別の態様は、ｍｈＦＶＩＩＩを発現させる方法に関する。該方法は、（ａ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列およびｍｈＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ｍｈＦＶＩＩＩが、Ａ２０Ｋ、Ｔ２１Ｉ、Ｔ２１Ｖ、Ｆ５７Ｌ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、Ｓ３３２Ｐ、Ｒ３７８Ｓ、Ｉ６１０ＭおよびＩ６６１Ｖからなる群から選択される位置に１以上のアミノ酸置換を含む、ポリヌクレオチド；およびポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含む発現ベクターを宿主細胞に導入する工程；（ｂ）ｍｈＦＶＩＩＩの発現および分泌に好適な条件下で宿主細胞を成長させる工程；（ｃ）宿主細胞から培養培地を採取する工程、および（ｄ）採取された培養培地からｍｈＦＶＩＩＩを精製する工程を含む。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】Ｂドメイン中に欠失を有する野生型ヒトＦＶＩＩＩ（ｈＢＤＤＦ８）をコードする発現プラスミド（ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８）を示す図である。ｈＢＤＤＦ８コード配列（重鎖および軽鎖を含む）は、本出願のさまざまな改変ｈＢＤＤＦ８タンパク質（「変異型ｈＦＶＩＩＩ」または「ｈＦＶＩＩＩ変異体」とも称される）の機能活性をアッセイするために利用されたＣＡＧプロモーターの制御下にある。

【図2】ｈＦＶＩＩＩ変異体活性の分析のための、ｈＢＤＤＦ８重鎖（ｈＢＤＤＦ８－ＨＣ）と、１６のアミノ酸位置に１７の置換変異を含有する改変ｈＢＤＤＦ８重鎖（ｑｗＢＤＤＦ８－ＨＣ）との間のアライメントを示す図である。それらのさまざまな単一、二重および多重置換を含有する追加の構築物を、図３および実施例１にさらに記載する。そのような変異体の相対機能活性のさらなる分析を、下記にさらに記載するように、図４～９に示す。

【図3】ｈＦＶＩＩＩ機能活性の分析のためのｈＢＤＤＦ８－ＨＣにおける例示的な置換変異体を要約する。

【図4】ｈＦＶＩＩＩ（すなわち、未改変ｈＢＤＤＦ８タンパク質）の機能活性と比較した、ＨｕＨ７細胞における単一アミノ酸置換ｈＦＶＩＩＩ変異体（すなわち、改変ｈＢＤＤＦ８タンパク質）の相対機能活性を示す。

【図5】ｈＦＶＩＩＩ（すなわち、未改変ｈＢＤＤＦ８タンパク質）の機能活性と比較した、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞における単一アミノ酸置換ｈＦＶＩＩＩ変異体（すなわち、改変ｈＢＤＤＦ８タンパク質）の相対機能活性を示す。

【図6】ｈＦＶＩＩＩ（すなわち、未改変ｈＢＤＤＦ８タンパク質）の機能活性と比較した、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞におけるｈＦＶＩＩＩ重鎖のアミノ酸２１における特異的な単一アミノ酸置換変異（すなわち、アミノ酸２１位で改変されたｈＢＤＤＦ８タンパク質）の相対機能活性を示す。

【図7】非変性ｈＢＤＤＦ８タンパク及び単一アミノ酸置換変異体Ｔ２１Ｉと同様、互いと比較した、ＨＲＫ ２９３細胞におけるｈＦＶＩＩＩ重鎖（すなわち、アミノ酸２１位における改変）のアミノ酸２０における様々な置換と組み合わせた、Ｔ２１Ｉを含む二重アミノ酸置換の相対的機能活性を表す。

【図8】トランスフェクション後２４時間または４８時間での、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８におけるｈＢＤＤＦ８ ｃＤＮＡと比較した、ＨｕＨ７細胞における単一または多重変異（示される通り）を有するさまざまなｈＦＶＩＩＩ－ＨＣ変異体の機能活性を示す。

【図9】トランスフェクション後２４時間、４８時間および７２時間での、ｈＦＶＩＩＩ（すなわち、未改変ｈＢＤＤＦ８タンパク質）の機能活性と比較した、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞における単一および多重変異（示される通り）を有するものを含むさまざまなｈＦＶＩＩＩ－ＨＣ変異体の機能活性を示す。

【図10】トランスフェクション後２４時間または４８時間での、ｈＦＶＩＩＩ（すなわち、未改変ｈＢＤＤＦ８タンパク質）の機能活性と比較した、ＣＨＯ細胞における単一または多重変異（示される通り）を有するものを含むさまざまなｈＦＶＩＩＩ－ＨＣ変異体の機能活性を示す。

【図11A】選択されたｈＦＶＩＩＩ変異体（および野生型）およびヒト／イヌハイブリッドＦＶＩＩＩ変異体の構造ドメインを示すグラフである。

【図11B】トランスフェクション後４８時間での、ｈＦＶＩＩＩ（すなわち、未改変ｈＢＤＤＦ８タンパク質）の機能活性と比較した、図１１ＡにおけるＢドメインなしのｈＦＶＩＩＩ変異体（および野生型）およびヒト／イヌハイブリッドＦＶＩＩＩ変異体のＨＥＫ ２９３Ｔ細胞における機能活性を示すグラフである。

【図12】ＣＡＧプロモーターがＴＴＲプロモーターによって置換されていることを除いて、図１における発現プラスミドに類似する発現プラスミド（ｐＡＮＧ－ＴＴＲ－ｈＢＤＤＦ８）を示す図である。

【図13】図１３は、トランスフェクション後７２時間での、ｒＡＡＶ２ベクターからＨｕＨ７細胞において発現したｈＢＤＤＦ８およびさまざまなｍｈＦＶＩＩＩ構築物の機能活性を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0035】

Ｉ．定義
本出願の生体分子に関係するさまざまな用語が、本明細書において上記、ならびに明細書および特許請求の範囲全体を通して使用される。

【0036】

「活性が増強されたＦＶＩＩＩ（ａｃｔＦＶＩＩＩまたはａｃｔＦ８）」という語句は、コードされるタンパク質が、未改変野生型ｈＦＶＩＩＩと比較した場合に、活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の増加を示すように遺伝子的に変更されている改変ｈＦＶＩＩＩ（ｈＦ８）を指す。未改変野生型ｈＦＶＩＩＩについてのヌクレオチド配列は、配列番号１に示され、これは、１９アミノ酸のシグナルペプチド（ＭＱＩＥＬＳＴＣＦＦＬＣＬＬＲＦＣＦＳ（配列番号２））をコードするヌクレオチド配列を含有する。シグナルペプチドを含む未改変野生型ｈＦＶＩＩＩについてのアミノ酸配列は、配列番号３に示される。シグナルペプチドなしの未改変野生型ｈＦＶＩＩＩについてのアミノ酸配列は、配列番号４に示される。

【0037】

「ｈＢＤＤＦ８タンパク質」、「ｈＢＤＤＦ８ポリペプチド」または「ｈＢＤＤＦ８」という用語は、Ｂドメイン中に欠失を有する野生型ｈＦＶＩＩＩタンパク質を指す。一部の実施形態において、欠失は、Ｂドメインの大部分を包含し、野生型Ｂドメイン内の複数の切断に応答性の配列を含む。例示的なｈＢＤＤＦ８ポリペプチドは、配列番号５（シグナルペプチドあり）、または配列番号６（シグナルペプチドなし）に示されるアミノ酸配列を有し、これは、ｈＦＶＩＩＩ重鎖（配列番号７）、トランケートされたＢドメイン（配列番号８）およびｈＦＶＩＩＩ軽鎖（配列番号９）を含有する。

【0038】

要素または種のリストの後の「１以上」という語句は、リスト中の要素または種の任意の並べ替えを包含することを意図する。したがって、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦからなる群から選択される１以上の置換変異」という語句は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅおよび／またはＦを含有する置換変異の任意の組合せを含み得る。

【0039】

本明細書において、範囲は、ある特定の整数値から別の特定の整数値までを表し得る。そのような範囲が表される場合、その範囲内のありとあらゆる整数値が、本出願の別々の実施形態を定義すること、および範囲内に含まれる実施形態の完全な範囲が、初期範囲内の整数値の任意の対間のありとあらゆる下位範囲をさらに含むことが理解されるべきである。

【0040】

本出願の核酸に関して、「単離された核酸」という用語は、ＤＮＡに適用される場合、それが起源とする生物の天然に存在するゲノム中で（５’および３’方向で）直ぐ隣接している配列から分離されたＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離された核酸」は、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクターに挿入されたＤＮＡもしくはｃＤＮＡ分子を含んでいてもよく、または原核生物または真核生物のＤＮＡに組み込まれてもよい。核酸コドンは、哺乳動物細胞における増強された発現のために最適化され得る。

【0041】

本出願のＲＮＡ分子に関して、「単離された核酸」という用語は、上記に定義される単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を主に指す。あるいは、この用語は、それが「実質的に純粋な」形態で存在するように、その天然の状態で（すなわち、細胞または組織中で）関連するであろうＲＮＡ分子から十分に分離されているＲＮＡ分子を指し得る（「実質的に純粋な」という用語は、下記に定義する）。

【0042】

タンパク質に関して、「単離されたタンパク質」または「単離および精製されたタンパク質」という用語は、本明細書において、本出願の単離された核酸分子の発現によって産生されるタンパク質に関連して使用される。あるいは、この用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するように、それが天然で関連するであろう他のタンパク質から十分に分離されているタンパク質を指し得る。

【0043】

「ｈＦＶＩＩＩポリペプチド」という用語は、全長ヒトＦＶＩＩＩタンパク質、ヒトＦＶＩＩＩタンパクの断片、ｈＦＶＩＩＩの生物学的機能を実質的に維持しているヒトＦＶＩＩＩタンパクのドメインおよびドメインの組合せを指す。

【0044】

「変異型ｈＦＶＩＩＩポリペプチド」または「改変ｈＦＶＩＩＩポリペプチド」という用語は、１以上のアミノ酸（例えば、１以上のアミノ酸置換）によって参照ｈＦＶＩＩＩポリペプチドとは異なるポリペプチドを指す。参照ｈＦＶＩＩＩポリペプチドは、シグナルペプチドありまたはなしの野生型ｈＦＶＩＩＩタンパク質、改変を有する野生型ｈＦＶＩＩＩタンパク質、例えば、Ｂドメイン中に欠失を有する野生型ｈＦＶＩＩＩタンパク質（例えば、ｈＢＤＤＦ８）またはＢドメインなしのｈＦＶＩＩＩ、ｈＦＶＩＩＩの断片、さらなる改変ありもしくはなしのｈＦＶＩＩＩのドメインまたはドメインの組合せであり得る。一部の実施形態において、「改変ｈＦＶＩＩＩポリペプチド」の「参照ｈＦＶＩＩＩポリペプチド」は、改変前のｈＦＶＩＩＩポリペプチドを指す。一部の実施形態において、「変異型ｈＦＶＩＩＩポリペプチド」または「改変ｈＦＶＩＩＩポリペプチド」という用語は、ヒトＦＶＩＩＩ重鎖、およびイヌＦＶＩＩＩ由来の軽鎖などの異なる種由来のＦＶＩＩＩ軽鎖を含むハイブリッドＦＶＩＩＩポリペプチドを指す。

【0045】

「ｈＦＶＩＩＩバリアント」という用語は、本明細書において、ｈＦＶＩＩＩの生物学的機能を実質的に維持している「変異型ｈＦＶＩＩＩタンパク質」または「改変ｈＦＶＩＩＩタンパク質」を指す。

【0046】

「保存的アミノ酸置換」は、機能的に類似する残基によるアミノ酸残基の置換である。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどの非極性（疎水性）残基の別のものとの置換；アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、もしくはトレオニンとセリンとの間などの荷電もしくは極性（親水性）残基の別のものとの置換；リジンもしくはアルギニンなどの塩基性残基の別のものと置換；アスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの酸性残基と別のものとの置換；フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族残基の別のものとの置換；またはアラニンもしくはグリシンの置換が挙げられる。本出願の変異型ＦＶＩＩＩタンパク質は、参照タンパク質に対して１以上の保存的に置換されたアミノ酸を含み、本明細書に記載されるように、参照タンパク質の活性の一部または全部を維持し得る。

【0047】

「発現カセット」という用語は、本明細書において、目的のポリヌクレオチドの発現に十分な核酸エレメントを含む核酸構築物を指す。典型的には、発現カセットは、プロモーターおよびエンハンサーなどの調節配列に作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、発現カセットは、追加のエレメント、例えば、イントロン、ポリアデニル化部位、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後応答エレメント（ＷＰＲＥ）、分泌シグナル配列、および／またはコード配列の発現レベルに影響を及ぼすことが公知の他のエレメントを含んでいてもよい。

【0048】

「調節配列」という用語は、遺伝子の転写調節配列を指し、これは、コード領域の３’もしくは５’側、またはコード領域内、またはイントロン内で見出され得る。調節配列の例としては、限定されるものではないが、プロモーターおよびエンハンサーが挙げられる。

【0049】

「プロモーター」という用語は、本明細書において、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるヌクレオチド配列を指す。一般に、目的のポリヌクレオチドは、プロモーター配列の３’に位置する。一部の実施形態において、プロモーターは、その全体が、ネイティブ遺伝子に由来する。一部の実施形態において、プロモーターは、異なる天然に存在するプロモーターに由来する異なるエレメントから構成される。一部の実施形態において、プロモーターは、合成ヌクレオチド配列を含む。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型の、あるいは異なる発達の段階で、あるいは異なる環境条件または薬物もしくは転写補助因子の存在もしくは非存在に応答して、遺伝子の発現を指示することが当業者に理解されるであろう。遍在性プロモーター、細胞型特異的プロモータープロモーター、組織特異的プロモーター、発生段階特異的プロモーター、および条件的プロモーター、例えば、薬物応答性プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター）が当業者に周知である。プロモーターの例としては、限定されるものではないが、ホスホグリセリン酸（ｐｈｏｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）キナーゼ（ＰＫＧ）プロモーター、ＣＡＧ、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、シナプシンまたはＮｅｕＮプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ＳＦＦＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。プロモーターは、ヒト起源のもの、またはマウス由来を含む他の種由来のものであり得る。加えて、マウスメタロチオネイン遺伝子プロモーターなどの非ウイルス遺伝子に由来する配列も、本明細書において使用される。一部の実施形態において、プロモーターは、異種プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、エンハンサーエレメントを含むことができる。

【0050】

「異種プロモーター」という用語は、本明細書において、天然で所与のコード配列に作動可能に連結されていることが見出されていないプロモーターを指す。

【0051】

「エンハンサー」という用語は、プロモーター活性を刺激することができ、プロモーターの生得的エレメント、またはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであり得る、ヌクレオチド配列を指す。

【0052】

「作動可能に連結された」または「動作可能に連結された」という用語は、その機能が他のものによって影響を受けるような、単一の核酸断片上の２つ以上の核酸断片の関連を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（例えば、コード配列は、プロモーターの転写制御下にある）場合に、コード配列に作動可能に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンスの方向で、調節配列に作動可能に連結され得る。

【0053】

本明細書において、「分泌シグナル配列」、「シグナルペプチド」という用語、またはその変形形態は、ネイティブポリペプチドで見られる分泌のレベルと比較して、動作可能に連結されたポリペプチドの細胞からの分泌を増強するように（上記に定義された通り）機能するアミノ酸配列を指すことを意図する。上記で定義されたように、「増強された」分泌とは、細胞から分泌される細胞によって合成されたポリペプチドの相対割合が増加することを意味し、分泌されたタンパク質の絶対量も増加する必要はない。一部の実施形態において、本質的にすべて（すなわち、少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）のポリペプチドが分泌される。しかしながら、分泌のレベルが、ネイティブポリペプチドと比較して増強されている限り、本質的にすべてのまたはさらにほとんどのポリペプチドが分泌される必要はない。一般に、分泌シグナル配列は、小胞体内で切断され、一部の実施形態において、分泌シグナル配列は、分泌の前に切断される。しかしながら、細胞からのポリペプチドの分泌が増強され、ポリペプチドが機能的である限り、分泌シグナル配列が切断される必要はない。したがって、一部の実施形態において、分泌シグナル配列は、部分的にまたは全体的に保持される。分泌シグナル配列は、分泌されたポリペプチドの分泌シグナルに（すなわち、前駆体に）全体的にもしくは部分的に由来し得、および／または全体的にもしくは部分的に合成であり得る。分泌シグナル配列の長さは重要ではなく、一般に、公知の分泌シグナル配列は、約１０～１５から５０～６０アミノ酸長である。さらに、分泌されたポリペプチド由来の公知の分泌シグナルは、得られた分泌シグナル配列が、動作可能に連結されたポリペプチドの分泌を増強するように機能する限り、変更または改変され得る（例えば、アミノ酸の置換、欠失、トランケーションまたは挿入によって）。本発明の分泌シグナル配列は、天然に存在する分泌シグナル配列もしくはその改変（上記に記載される通り）を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、またはそれからなり得る。多数の分泌されたタンパク質、および細胞からの分泌を指示する配列が、当技術分野において公知である。本発明の分泌シグナル配列は、さらに、全体的にまたは部分的に、合成または人工であり得る。合成または人工分泌シグナルペプチドは、当技術分野において公知あり、例えば、その開示が、その全体的が本明細書に組み込まれるＢａｒａｓｈら、「Ｈｕｍａｎ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｔｒｏｎｇ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ ２９４：８３５～４２ページ（２００２）を参照されたい。「動作可能に連結された」という用語は、コード配列の発現のために必要な調節配列が、コード配列の発現を生じるように、コード配列に対して適切な位置でＤＮＡ分子中に置かれていることを意味する。この同じ定義は、発現ベクターにおけるコード配列および転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、および終結エレメント）の配列に適用される場合がある。この定義はまた、ハイブリッド核酸分子が作製される第１および第２の核酸分子の核酸配列の配置にも適用される場合がある。

【0054】

「実質的に純粋な」という用語は、少なくとも５０～６０重量％の目的の化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を含む調製物を指す。より好ましくは、該調製物は、少なくとも７５重量％、最も好ましくは９０～９９重量％の目的の化合物を含む。純度は、目的の化合物について適切な方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。

【0055】

特定のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す場合の「本質的に～からなる」という語句は、所与の配列番号の性質を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列への言及において使用される場合、この語句は、それ自体の配列、および配列の基本的および新規の特徴に影響を及ぼさないであろう分子改変を含む。

【0056】

「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において、本出願のプライマーおよびプローブを指し、２つ以上のリボまたはデオキシリボヌクレオチド、好ましくは３つ超のリボまたはデオキシリボヌクレオチドから構成される核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、さまざまな要因、およびオリゴヌクレオチドが使用される特定の適用に左右される。「プローブ」という用語は、本明細書において、核酸をプローブに相補的な配列とアニーリングまたは特異的にハイブリダイズすることができる、精製された制限酵素消化において天然に存在するか、または合成的に産生されたかに関わらず、Ｒ ＡまたはＤＮＡいずれかの、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸を指す。プローブは、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。プローブの正確な長さは、温度、プローブの起源および使用の方法を含む多くの要因に依存する。例えば、診断的適用のために、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブは、典型的には、１５～２５またはそれ以上のヌクレオチドを含有するが、これは、より少ないヌクレオチドを含有していてもよい。

【0057】

「同一パーセント」という用語は、本明細書において、核酸またはアミノ酸配列の間での比較に関して使用される。核酸およびアミノ酸配列は、多くの場合、例えば、国立医学図書館のＢＬＡＳＴアライメントプログラムにおけるコンピュータープログラムを使用して比較される。

【0058】

いずれかの「対応する」核酸またはアミノ酸または配列は、本明細書において、別の種のＦＶＩＩＩ分子における部位と同じ構造および／または機能を有するが、核酸もしくはアミノ酸数は同一でなくてもよい、ＦＶＩＩＩもしくは変異型ＦＶＩＩＩ分子、またはその断片における部位に存在するものである。別のＦＶＩＩＩ配列「に対応する」配列は、そのような配列に実質的に対応し、ストリンジェントな条件下で配列番号１と指定されたヒトＦＶＩＩＩ ＤＮＡ配列とハイブリダイズする。別のＦＶＩＩＩ配列「に対応する」配列はまた、ＦＶＩＩＩまたは特許請求の範囲に係る凝固促進ハイブリッドＦＶＩＩＩまたはその断片の発現をもたらし、遺伝コードの冗長性を別にすれば、配列番号１を含む核酸分子にハイブリダイズするであろう、配列を含む。

【0059】

「固有の」アミノ酸残基または配列は、本明細書において、別の種のＦＶＩＩＩ分子における相同残基または配列とは異なる、ある種のＦＶＩＩＩ分子におけるアミノ酸配列または残基を指す。

【0060】

「特異的活性」は、本明細書において、ヒト第ＶＩＩＩ因子欠乏症の血漿の凝固の欠陥を修正する活性を指す。特異的活性は、ヒトＦＶＩＩＩ欠乏症の血漿の凝固時間を正常なヒト血漿のものと比較する標準的なアッセイにおいて、総ＦＶＩＩＩタンパク質 １ミリグラムあたりの凝固活性の単位で測定される。ＦＶＩＩＩ活性の１つの単位は、正常ヒト血漿１ミリリットル中に存在する活性である。このアッセイにおいて、血塊形成のための時間が短くなると、アッセイされるＦＶＩＩＩの活性が高くなる。ハイブリッドヒト／ブタＦＶＩＩＩは、ヒトＦＶＩＩＩアッセイにおいて凝固活性を有する。この活性だけでなく、他のハイブリッドＦＶＩＩＩ分子もしくはハイブリッド等価ＦＶＩＩＩ分子、またはその断片の活性は、血漿由来または組換えヒトＦＶＩＩＩのいずれかの活性よりも低くあり得るか、それと等しくあり得るか、またはそれよりも高くあり得る。

【0061】

ヒトまたは動物ＦＶＩＩＩの「サブユニット」は、本明細書において、タンパク質の重鎖および軽鎖である。ＦＶＩＩＩの重鎖は、Ａ１、Ａ２およびＢの３つのドメインを含有する。ＦＶＩＩＩの軽鎖も、Ａ３、ＣＩおよびＣ２の３つのドメインを含有する。

【0062】

「エピトープ」、「抗原性部位」および「抗原決定基」という用語は、本明細書において、同義的に使用され、抗体によって特異的に認識される、ヒト、動物、ハイブリッドもしくはハイブリッド等価ＦＶＩＩＩの部分、またはその断片として定義される。これは、任意の数のアミノ酸残基からなり得、タンパク質の一次、二次または三次構造に依存し得る。本開示の少なくとも１つのエピトープを含む、ハイブリッドＦＶＩＩＩ、ハイブリッドＦＶＩＩＩ等価体、またはいずれかの断片は、下記に記載される診断アッセイにおける試薬として使用され得る。一部の実施形態において、ハイブリッドＦＶＩＩＩもしくはハイブリッド等価ＦＶＩＩＩ、またはその断片は、交差反応性ではないか、またはヒトもしくはブタＦＶＩＩＩよりもすべての天然に存在する阻害性ＦＶＩＩＩ抗体との交差反応性が低い。

【0063】

「免疫原性部位」という用語は、本明細書において、本明細書に記載される、イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、またはベセスダアッセイなどのルーチンプロトコールによって測定される、ヒトまたは動物におけるＦＶＩＩＩ、ハイブリッド、ハイブリッド等価体、またはその断片に対する抗体の産生を特異的に誘発する、ヒトまたは動物のＦＶＩＩＩ、ハイブリッド、もしくはハイブリッド等価ＦＶＩＩＩ、またはその断片の領域として定義される。これは、任意の数のアミノ酸残基からなり得、タンパク質の一次、二次または三次構造に依存し得る。一部の実施形態において、ハイブリッドもしくはハイブリッド等価ＦＶＩＩＩ、またはその断片は、ヒトまたはブタＦＶＩＩＩよりも、動物またはヒトにおいて免疫原性ではないか、または免疫原性が低い。

【0064】

「ＦＶＩＩＩ欠乏症」は、本明細書において、（１）欠陥のあるＦＶＩＩＩの産生；（２）ＦＶＩＩＩの不十分な産生または産生なし；または（３）ＦＶＩＩＩの部分的なもしくは全体的な阻害によって引き起こされる凝固活性における欠乏症を指す。血友病Ａは、Ｘ連鎖性遺伝子の欠損、およびそれがコードするＦＶＩＩＩタンパク質の非存在または欠乏から生じるＦＶＩＩＩ欠乏症の一種である。

【0065】

ＩＩ．改変ｈＦＶＩＩＩポリペプチド（ｍｈＦＶＩＩＩ）
本出願の一態様は、野生型ｈＦＶＩＩＩポリペプチドまたは未改変参照ポリペプチドと比較して、１以上の変異を含有する改変ｈＦＶＩＩＩポリペプチド（ｍｈＦＶＩＩＩ）に関する。一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、宿主細胞において発現される場合、同じ条件下で同じ種類の宿主細胞において発現される野生型ｈＦＶＩＩＩまたは参照タンパク質（ｈＢＤＤＦ８など）と比較して、宿主細胞における増加したｈＦＶＩＩＩ活性をもたらす。

【0066】

ヒトＦＶＩＩＩは、２３５１アミノ酸のタンパク質（１９アミノ酸のシグナルペプチドおよび２３３２アミノ酸の成熟タンパク質を有する）をコードする。これは、一連の構造「ドメイン」：ＮＨ₂－ＳＰ－Ａ１－ａｌ－Ａ２－ａ２－Ｂ－ａ３－Ａ３－Ｃｌ－Ｃ２－ＣＯＯＨで配置される。本明細書において、ＦＶＩＩＩ「ドメイン」は、例えば、構造的に関連するドメインに対する内部アミノ酸配列同一性によって、およびトロンビンによるタンパク質分解的切断の部位によって特徴付けられるアミノ酸の連続配列によって定義される。さらに、「ドメインなし」または「ドメインを欠いている」という用語は、少なくとも９５％または１００％のドメインが欠失していることを意味することが理解されるべきである。他に規定されない限り、ＦＶＩＩＩドメインは、以下の通り、アミノ末端からカルボキシ末端に、ｈＦＶＩＩＩにおいて配置された以下のアミノ酸残基によって定義される（配列番号３で示す通り）：ＳＰ、アミノ酸残基１～１９；Ａｌドメイン、アミノ酸残基２０～３５４；ａ１ドメイン、アミノ酸残基３５５～３９１、Ａ２ドメイン、アミノ酸残基３９２～７２８；ａ２ドメイン、アミノ酸残基７２９～７６０、Ｂドメイン、アミノ酸残基７６１～ｌ６６７；ａ３ドメイン、アミノ酸残基１６６８～ｌ７０８；Ａ３ドメイン、アミノ酸残基１７０９～２０３９；Ｃ１ドメイン、アミノ酸残基２０４０～２１９２；およびＣ２ドメイン、アミノ酸残基２１９３～２３５１。

【0067】

Ａ１－ａ₁－Ａ２－ａ₂－Ｂ（ａａ ２０～１６６７）配列またはＡ１－ａ₁－Ａ２－ａ₂（ａａ １～７４０）配列は、通常、ｈＦＶＩＩＩ重鎖と称される。ａ₃－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２配列（ａａ ｌ６６８～２３５１）は、通常、ｈＦＶＩＩＩ軽鎖と称される。ＦＶＩＩＩは、トロンビンまたは第Ｘａ因子によってタンパク分解的に活性化され、これは、それをフォン・ヴィルブランド因子から解離させ、凝固促進機能を有するＦＶＩＩＩａを形成する。ＦＶＩＩＩａの生物学的機能は、第Ｘ因子の活性化に対する第ＩＸａ因子の触媒効率を数桁増加させることである。トロンビン活性化ＦＶＩＩＩａは、血小板または単球の表面上で第ＩＸａ因子および第Ｘ因子と複合体を形成する、１６０ｋＤａのＡ１－ａ₁／Ａ２－ａ₂／ａ₃－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２ヘテロ三量体である。

【0068】

野生型ヒトＦＶＩＩＩをコードするｃＤＮＡ配列は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する。配列番号１において、ＦＶＩＩＩオープンリーディングフレームの最初の５７ヌクレオチドは、成熟ＦＶＩＩＩタンパク質から典型的には切断されるシグナルペプチド配列（配列番号２）をコードする。

【0069】

一部の実施形態において、本出願の改変ｈＦＶＩＩＩポリペプチドは、配列番号３で示される野生型ｈＦＶＩＩＩアミノ酸配列のアミノ酸残基２０～１７１に対応する領域において１以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、本出願の改変ｈＦＶＩＩＩポリペプチドは、Ａ２０、Ｔ２１、Ｆ５７、Ｌ６９、Ｉ８０、Ｌ１７８、Ｒ１９９、Ｈ２１２、Ｉ２１５、Ｒ２６９、Ｉ３１０、Ｌ３１８、Ｓ３３２、Ｒ３７８、Ｉ６１０、およびＩ６６１位に１以上の置換を含む。

【0070】

本明細書に記載される変異体または改変に関して、アミノ酸の１文字コードとそれに続く数値によって表される位置の命名法は、野生型ｈＦＶＩＩＩ（配列番号３）におけるアミノ酸残基およびその位置を指す。例えば、命名法「Ａ２０」は、野生型ｈＦＶＩＩＩ配列（配列番号３）の２０位におけるアミノ酸残基アラニン（Ａ）を指す。同様に、第１のアミノ酸の１文字コード、それに続く数値、それに続く第２のアミノ酸の１文字コードによって表される置換の命名法は、第２のアミノ酸を有する野生型ｈＦＶＩＩＩ（配列番号３）における数値で示される位置での元のアミノ酸残基の置換を指す。例えば、命名法「Ａ２０Ｋ」は、野生型ｈＦＶＩＩＩ配列（配列番号３）の２０位におけるアミノ酸残基アラニン（Ａ）のアミノ酸残基リジン（Ｋ）による置換を指す。アミノ酸の位置の命名法および置換の命名法はまた、ｈＦＶＩＩＩのドメイン、ｈＦＶＩＩＩの重鎖および軽鎖、ｈＦＶＩＩＩの断片、ｈＦＶＩＩＩと共通配列を共有するポリペプチド、ならびに／またはｈＢＤＤＦ８などの他のｈＦＶＩＩＩ由来の配列にも適用される。

【0071】

一部の実施形態において、本出願は、Ａ２０、Ｔ２１、Ｆ５７、Ｌ６９、Ｉ８０、Ｌ１７８、Ｒ１９９、Ｈ２１２、Ｉ２１５、Ｒ２６９、Ｉ３１０、Ｌ３１８、Ｓ３３２、Ｒ３７８、Ｉ６１０およびＩ６６１からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含むｍｈＦＶＩＩＩを提供する。ｍｈＦＶＩＩＩは、これらの１６のアミノ酸部位を包含する変異の任意の並び替えを含んでいてもよい。本出願における使用のための例示的なｍｈＦＶＩＩＩは図３に記載されており、これは、ボックスを埋める単一および複数の変異を特定する。

【0072】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ａ２０Ｋ、Ｔ２１Ｉ、Ｔ２１Ｖ、Ｆ５７Ｌ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、Ｓ３３２Ｐ、Ｒ３７８Ｓ、Ｉ６１０ＭおよびＩ６６１Ｖからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む。

【0073】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ｔ２１位にアミノ酸置換を含む。好ましい置換としては、Ｔ２１ＩおよびＴ２１Ｖが挙げられる。一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、Ａ２０、Ｆ５７、Ｌ６９、Ｉ８０、Ｌ１７８、Ｒ１９９、Ｈ２１２、Ｉ２１５、Ｒ２６９、Ｉ３１０、Ｌ３１８、Ｓ３３２、Ｒ３７８、Ｉ６１０およびＩ６６１からなる群から選択される位置に１以上のアミノ酸置換をさらに含む。

【0074】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ａ２０およびＴ２１位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ａ２０ＫおよびＴ２１Ｉ（２Ｍ１変異体）、またはアミノ酸置換Ａ２０ＫおよびＴ２１Ｖ（２Ｍ２変異体）を含む。

【0075】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ｔ２１、Ｌ６９およびＩ８０位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、およびＩ８０Ｖ（３Ｍ１変異体）を含む。

【0076】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ｔ２１、Ｌ６９、Ｉ８０、およびＬ１７８位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０、およびＬ１７８Ｆ（４Ｍ１変異体）を含む。

【0077】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ｔ２１、Ｌ６９、Ｉ８０およびＩ６６１位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０ＶおよびＩ６６１Ｖ（４Ｍ３変異体）を含む。

【0078】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ｔ２１、Ｌ６９、Ｉ８０、Ｌ１７８およびＩ６６１位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８ＦおよびＩ６６１Ｖ（５Ｍ４変異体）を含む。

【0079】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ｒ１９９、Ｈ２１２、Ｉ２１５、Ｒ２６９、Ｉ３１０、Ｌ３１８およびＳ３３２位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８ＦおよびＳ３３２Ｐ（７Ｍ２変異体）を含む。

【0080】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ｔ２１、Ｌ６９、Ｉ８０、Ｌ１７８、Ｈ２１２、Ｉ２１５、Ｒ２６９、Ｌ３１８およびＩ６６１位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｌ３１８ＦおよびＩ６６１Ｖ（９Ｍ１変異体）を含む。

【0081】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ａ２０、Ｔ２１、Ｌ６９、Ｉ８０、Ｌ１７８、Ｈ２１２、Ｉ２１５、Ｒ２６９、Ｌ３１８およびＩ６６１位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ａ２０Ｋ、Ｔ２１Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｌ３１８ＦおよびＩ６６１Ｖ（１０Ｍ１変異体）を含む。

【0082】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ｔ２１、Ｌ６９、Ｉ８０、Ｌ１７８、Ｒ１９９、Ｈ２１２、Ｉ２１５、Ｒ２６９、Ｉ３１０、Ｌ３１８、Ｓ３２２およびＩ６６１位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、Ｓ３２２ＰおよびＩ６６１Ｖ（１２Ｍ１変異体）を含む。

【0083】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ａ２０、Ｔ２１、Ｌ６９、Ｉ８０、Ｌ１７８、Ｒ１９９、Ｈ２１２、Ｉ２１５、Ｒ２６９、Ｉ３１０、Ｌ３１８、Ｓ３３２およびＩ６６１位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、アミノ酸置換Ａ２０Ｋ、Ｔ２１Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、Ｓ３３２ＰおよびＩ６６１Ｖ（１３Ｍ１変異体）を含む。

【0084】

一部の実施形態において、上記のアミノ酸置換に対応するアミノ酸位置は、他の保存的置換で置換されていてもよい。表１は、アミノ酸Ａ２０、Ｔ２１、Ｌ６９、Ｉ８０、Ｌ１７８、Ｒ１９９、Ｈ２１２、Ｉ２１５、Ｒ２６９、Ｉ３１０、Ｌ３１８、Ｓ３３２およびＩ６６１位の例示的なアミノ酸置換のリストを提供する。

【0085】

【表1】

【0086】

一部の実施形態において、上記のｍｈＦＶＩＩＩは、Ｂドメインの欠失（「Ｂドメインなし」）を含む。Ｂドメインの欠失を含むｈＦＶＩＩＩポリペプチドの例は、米国特許第６，８００，４６１号、米国特許第６，７８０，６１４号、米国特許出願公開第２００４／０１９７８７５号に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0087】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、単鎖ポリペプチドを含む。一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、トランケートされたまたは欠失したＢドメインを有する単鎖ｈＦＶＩＩＩポリペプチドを含む。一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ａ１ドメインおよびＡ２ドメインを含む重鎖（ＨＣ）、ならびにＡ３ドメイン、Ｃ１ドメインおよびＣ２ドメインを含む軽鎖（ＬＣ）のヘテロ二量体を含む。一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、および全長またはトランケートされたＢドメインを含む重鎖（ＨＣ）、ならびにＡ３ドメイン、Ｃ１ドメインおよびＣ２ドメインを含む軽鎖（ＬＣ）のヘテロ二量体を含む。一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ａ１ドメインを含むポリペプチド、Ａ２ドメインを含むポリペプチド、ならびにＡ３ドメイン、Ｃ１ドメインおよびＣ２ドメインを含むポリペプチドのヘテロ三量体を含む。

【0088】

一部の実施形態において、上記のｍｈＦＶＩＩＩは、配列番号５で示されるネイティブｈＦＶＩＩＩシグナルペプチドを有するＢドメインの欠失を含有する野生型ｈＢＤＤＦ８に由来する。ｍｈＦＶＩＩＩの分泌形態は、配列番号２で示されるシグナルペプチド配列を含有しない。

【0089】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、イン・ビトロまたはイン・ビボで発現される場合、野生型ｈＦＶＩＩＩまたはそれが由来する参照ポリペプチドの５％～１００倍、１０％～５０倍、５０％～２５倍、２～１００倍、２～８０倍、２～６０倍、２～４０倍、２～２０倍、２～１０倍、２～５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍または少なくとも１００倍のＦＶＩＩＩ活性の増加をもたらす。イン・ビトロＦＶＩＩＩ活性は、ｍｈＦＶＩＩＩを発現する細胞からの組織培養培地を分析することによって決定され得る。イン・ビボＦＶＩＩＩ活性は、ｍｈＦＶＩＩＩまたはｍｈＦＶＩＩＩを発現する発現ベクターの注入を受けている個体から収集された血漿を分析することによって決定され得る。

【0090】

一部の実施形態において、上記の本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、抗原性の低減、安定性の増加、血清結合タンパク質への結合を介した循環半減期の増加、タンパク質分泌の増加、第ＩＸａ因子および／もしくは第Ｘ因子に対する親和性の増加、フォン・ヴィルブランド因子に対する親和性の減少、グリコシル化の増加、不活性化切断の変更、少なくとも１つのカルシウム結合部位の変更、ならびに／または有効期間の増加のような他の所望の性質を付与するために、他のＦＶＩＩＩ配列を追加して含み、欠失し、または改変するように、さらに改変されていてもよい。

【0091】

例えば、一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ｒ５０３Ａ、Ｒ５０３Ｇ、Ｐ５０４Ａ、Ｌ５０５Ｓ、Ｙ５０６Ｌ、Ｙ５０６Ａ、Ｓ５０７Ａ、Ｓ５０７Ｌ、Ｒ５０８Ａ、Ｒ５０８Ｓ、Ｒ５０９Ｇ、Ｌ５１０Ｓ、Ｐ５１１Ｌ、Ｐ５１１Ａ、Ｋ５１２Ａ、Ｇ５１３Ｓ、Ｖ５１４Ａ、Ｋ５１５Ｍ、Ｈ５１６Ｌ、Ｌ５１７Ｓ、Ｋ５１８Ｍ、Ｄ５１９Ａ、Ｆ５２０Ａ、Ｐ５２１Ｌ、Ｉ５２２Ｍ、Ｌ５２３Ｍ、Ｐ５２４Ａ、Ｇ５２５Ａ、Ｅ５２６Ｇ、Ｉ５２７Ｍ、Ｉ５２８Ａ、Ｍ２２１８Ｉ、Ｆ２２１９Ｌ、Ｖ２２４２Ａ、Ｋ２２４６Ｅ、Ｌ２２７１Ｆまたはそれらの任意の組合せなどの米国特許第５，８５９，２０４号、米国特許第６，７７０，７４４号、および米国特許出願公開第２００３／０１６６５３６号に記載されるような、ヒトＦＶＩＩＩの免疫原性および／または抗原性の原因となるアミノ酸置換を追加して含むように改変されてもよい。

【0092】

他の実施形態において、上記の本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、Ｉ１０５Ｖ、Ｙ１２４Ｆ、Ａ１２７Ｓ、Ｄ１３４Ｅ、Ｑ１３６Ｈ、Ｆ１４８Ｌ、Ｇ１５１Ｋ、Ｈ１５３Ｑ、Ｍ１６６ＴおよびＬ１７１Ｐまたはそれらの任意のみ合せなどの米国特許出願第２０１６／１０２１３３号に記載されるような、分泌の増加を提供するアミノ酸置換を追加して含むように改変されてもよい。

【0093】

他の実施形態において、上記の本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、融合されたＡ２およびＡ３ドメインのおかげで活性化されたＦＶＩＩＩのより高い安定性を付与するアミノ酸置換を追加して含むように改変されてもよい。特に、ＦＶＩＩＩを、６８３および１８４５位のシステイン残基を置換することによって（すなわち、Ｙ６８３Ｃ、Ｔ１８４５Ｃ）改変して、Ａ２およびＡ３ドメインを共有結合的に連結するＣ６８３－Ｃｌ８４５ジスルフィド結合を形成する変異型ＦＶＩＩＩをもたらし得る。

【0094】

他の実施形態において、上記の本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、不活性化切断部位の変更を付与するアミノ酸置換を追加して含むようにさらに改変されてもよい。例えば、Ａ３５５またはＡ５８１は、野生型ＦＶＩＩＩを通常不活性化する切断酵素に対する変異型ＦＶＩＩＩの感受性を減少させるために、置換し、使用される。

【0095】

他の実施形態において、上記の本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、第ＩＸａ因子に対する増強された親和性を付与するアミノ酸置換を追加して含むようにさらに改変されてもよい。

【0096】

他の実施形態において、上記の本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、増加した循環半減期を付与するアミノ酸置換を追加して含むようにさらに改変されてもよい。これは、限定されないが、ヘパラン硫酸との相互作用を低減することによってを含むさまざまなアプローチにより達成され得る。

【0097】

他の実施形態において、上記の本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、アスパラギン残基でのグリコシル化のための認識配列を付与するアミノ酸置換を追加して含むようにさらに改変されてもよい。そのような改変は、既存の阻害性抗体によって（低抗原性ＦＶＩＩＩ）、および阻害性抗体を発生する可能性を減少させることによって（低免疫原性ＦＶＩＩＩ）、検出の回避に有用であり得る。代表的な一実施形態において、改変ＦＶＩＩＩは、Ｎ－Ｘ－－Ｓ／ＴなどのＮ連結グリコシル化のためのコンセンサスアミノ酸配列を組み込むように変異される。

【0098】

他の実施形態において、上記の本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、（ｉ）フォン・ヴィルブランド因子結合部位を欠失させる、（ｉｉ）Ａ７５９の変異を追加する、および／または（ｉｉｉ）Ａ２およびＡ３ドメインの間にアミノ酸配列スペーサーを追加する変異を追加して含むようにさらに改変されていてもよく、アミノ酸スペーサーは、活性化の際に凝固促進活性ＦＶＩＩタンパク質がヘテロ二量体になるような十分な長さのものである。

【0099】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、ヒトＦＶＩＩＩ重鎖、および異なる種由来のＦＶＩＩＩ軽鎖、例えば、イヌＦＶＩＩＩ由来の軽鎖を含むハイブリッドＦＶＩＩＩである。一部の実施形態において、ヒトＦＶＩＩＩ重鎖は、本出願に記載される１以上のアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態において、ハイブリッドＦＶＩＩＩは、トランケートされたＢドメインを含む。一部の実施形態において、ハイブリッドＦＶＩＩＩは、（１）野生型ヒトＦＶＩＩＩ重鎖配列または改変ヒトＦＶＩＩＩ重鎖配列、および（Ｂ）異なる種由来のＦＶＩＩＩ軽鎖配列、例えば、イヌＦＶＩＩＩ由来の軽鎖を含む単一ポリペプチドからなる。一部の実施形態において、改変ヒトＦＶＩＩＩ重鎖配列は、本出願に記載されるアミノ酸置換の１以上を含む。一部の実施形態において、改変ヒトＦＶＩＩＩ重鎖配列は、本出願に記載されるアミノ酸置換の１以上を有するｈＢＤＤＦ８配列または改変ｈＢＤＤＦ８配列を含む。

【0100】

ＩＩＩ．ｍｈＦＶＩＩＩをコードするポリヌクレオチド、発現カセットおよび発現ベクター
本出願の別の態様は、本明細書に記載される置換の幅および／または他の変異をコードするすべての可能な核酸を含む、本出願のｍｈＦＶＩＩＩをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。単離された核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。

【0101】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、さまざまなヒト、霊長類、または哺乳動物細胞、例えば、ＨｕＨ７、ＨＥＫ２９３ＴまたはＣＨＯ細胞における発現のためにコドン最適化されているｍｈＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。本出願のｍｈＦＶＩＩＩをコードするポリヌクレオチドは、コードされるアミノ酸配列を変更することなく、宿主細胞における活性、安定性または発現を改善するようにコドン最適化されていてもよい。

【0102】

コドンは、３つのヌクレオチドのセットからなり、特定のアミノ酸をコードするか、または翻訳の終結をもたらす（すなわち、停止コドン）。遺伝コードは、複数のコドンが、同じアミノ酸を規定する、すなわち、２０個のアミノ酸をコードする合計で６１のコドンが存在する点で、重複している。コドン最適化は、ポリヌクレオチド配列中に存在するコドンを、同じアミノ酸をコードする好ましいコドン、例えば、哺乳動物発現のために好ましいコドンで置換する。そのため、アミノ酸配列は、プロセスの間に変更されない。コドン最適化は、遺伝子最適化ソフトウェアを使用して行うことができる。コドン最適化されたヌクレオチド配列は、翻訳され、元のタンパク質配列と整列させて、アミノ酸配列に対して変化が行われていないことが確認される。コドン最適化の方法は、当技術分野において公知であり、例えば、米国出願公開第２００８／０１９４５１１号および米国特許第６，１１４，１４８号に記載されている。

【0103】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩタンパク質は、単鎖のＢドメインなしのｍｈＦＶＩＩＩの形態で発現される。一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩタンパク質は、ｈＦＶＩＩＩの重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む二重鎖（ＤＣ）タンパク質の形態で、１以上の核酸から発現される。一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩタンパク質は、Ａ１ドメインを含むポリペプチド、Ａ２ドメインを含むポリペプチド、ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含むポリペプチドのヘテロ三量体の形態で、１以上の核酸から発現される。

【0104】

一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩをコードするポリヌクレオチドは、野生型ｈＦＶＩＩＩアミノ末端シグナルペプチド（配列番号２）を発現するためのコード配列を含み、これは、成熟タンパク質から除去される。一部の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩは、配列番号５（シグナルペプチドあり）または配列番号６（シグナルペプチドなし）のアミノ酸配列を有するｈＢＤＤＦ８タンパク質に由来する。シグナルペプチド配列は、発現のレベルに影響を及ぼし得るので、ｍｈＦＶＩＩＩをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の各種の異種Ｎ末端シグナルペプチドのいずれかを持つｍｈＦＶＩＩＩを発現するために操作されていてもよい。

【0105】

一部の実施形態において、上記の本出願のｍｈＦＶＩＩＩをコードするポリヌクレオチドは、上にさらに記載されているように、抗原性の低減、安定性の増加、血清結合タンパク質への結合を介した循環半減期の増加、タンパク質分泌の増加、第ＩＸａ因子および／もしくは第Ｘ因子に対する親和性の増加、フォン・ヴィルブランド因子に対する親和性の減少、グリコシル化の増加、不活性化切断の変更、１つもしくは複数のカルシウム結合部位の変更、ならびに／または有効期間の増加のような他の所望の性質を付与する、他のＦＶＩＩＩ配列を追加して含み、欠失し、または改変するように、改変されていてもよい。

【0106】

本出願のさらなる態様は、本明細書に記載されるｍｈＦＶＩＩＩを発現するための発現カセットに関する。一部の実施形態において、発現カセットは、本出願のｍｈＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列、およびヌクレオチド配列に動作可能に連結された調節配列を含む。一部の実施形態において、調節配列は、プロモーターを含む。

【0107】

本出願のさらなる態様は、イン・ビトロおよび／またはイン・ビボで本出願のｍｈＦＶＩＩＩを発現することができる発現ベクターに関する。一部の実施形態において、発現ベクターは、非ウイルスベクター、例えば、プラスミドである。一部の実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクターである。

【0108】

本出願のｍｈＦＶＩＩＩを発現するための発現ベクターは、典型的には、発現されるポリヌクレオチド配列に動作可能に連結された１以上の調節配列を含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような要因に依存し得ることは、当業者によって認識されるであろう。本出願の発現ベクターは、宿主細胞に導入されて、それによって本明細書に記載されるｍｈＦＶＩＩＩを産生することができる。

【0109】

哺乳動物細胞における発現を指示するための好適な発現ベクターは、一般に、プロモーター、ならびに当技術分野において公知の他の転写および翻訳制御配列を含む。ある特定の実施形態において、哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的にポリヌクレオチドの発現を指示することができる（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して、ポリヌクレオチドが発現される）。組織特異的調節エレメントは、当技術分野において公知であり、例えば、肝臓細胞特異的プロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、アルブミンプロモーター、ａ－１アンチトリプシンプロモーター、ａｐｏＥエンハンサー）が含まれ得る。あるいは、事実上任意の細胞型において活性な構成的プロモーター（例えば、ＨＣＭＶ）が使用されてもよい。

【0110】

ある特定の好ましい実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、典型的には、除去された１以上のウイルス遺伝子を有し、本明細書に記載される変異型ＦＶＩＩＩ遺伝子を含む外因性導入遺伝子の挿入のためにウイルスゲノム挿入部位に挿入された遺伝子／プロモーターカセットを含む。除去された遺伝子の必要な機能は、トランスで初期遺伝子の遺伝子産物を発現するように操作されている細胞株によって供給され得る。例示的なウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターが挙げられる。他のウイルスベクターとしては、アストロウイルス、コロナウイルス、オルソミクソウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、トガウイルスのウイルスベクターなどが挙げられる。ウイルスベクターは、任意の好適な核酸構築物、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を含んでいてもよく、一本鎖、二本鎖、または二重であってもよい。

【0111】

本出願のＤＮＡ構築物が調製されたら、これは、宿主細胞に組み込まれる準備ができている。したがって、本出願の別の態様は、ｍｈＦＶＩＩＩ核酸を含む組換え細胞を作製する方法に関する。基本的に、これは、形質転換、形質導入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、リポソームなどを介してＤＮＡ構築物を細胞に導入すること、および宿主ゲノムにＤＮＡがエピソーム導入または組み込まれた細胞について選択することを伴う。一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩを発現する細胞は、血友病の処置のために、対象に移植される。

【0112】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩタンパク質は、血友病を有する患者への投与のために、ウイルスベクターから発現される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ヘルペスウイルスベクターである。一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩをコードする１以上のＡＡＶベクターの投与方法が提供される。

【0113】

組換えＡＡＶおよびレンチウイルスベクターは、各種の遺伝子療法適用に対する幅広い有用性が見出されている。そのような適用に対するそれらの有用性は、各種の器官の文脈において達成されるイン・ビボ遺伝子移入の高い効率に大いに起因する。ＡＡＶおよびレンチウイルス粒子は、有効な遺伝子送達のためのビヒクルとしての利益をもたらすために使用され得る。そのようなビリオンは、分裂および非分裂細胞のための向性を含む、そのような適用のためのいくつかの所望の特性を持つ。これらのベクターを用いる初期の臨床実験は、持続的な毒性がないことも実証し、免疫応答は、最小限であったか、または検出不能であった。ＡＡＶは、受容体媒介エンドサイトーシスによってまたはトランスサイトーシスによって、イン・ビトロおよびイン・ビボで、多種多様な細胞型に感染することが公知である。これらのベクター系は、ヒトにおいて、網膜上皮、肝臓、骨格筋、気道、脳、関節、および造血幹細胞の標的化が試験されている。プラスミドＤＮＡまたはミニサークルに基づく非ウイルスベクターが、ＦＶＩＩＩをコードするもののような大きな遺伝子のための好適な遺伝子移入ベクターでもある可能性がある。

【0114】

一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩコード配列は、カプシドにパッケージングされたウイルスベクターの構成要素として提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、本出願のｍｈＦＶＩＩＩのイン・ビボ送達のために使用される。この場合において、ＡＡＶベクターは、少なくとも１つのｍｈＦＶＩＩＩ、およびｍｈＦＶＩＩＩ配列の発現を制御するための関連する発現制御配列を含む。ｍｈＦＶＩＩＩ配列を発現するための例示的なＡＡＶベクターとしては、ＦＶＩＩＩ発現のためのプロモーター－エンハンサー調節領域、ならびにプロモーターの複製およびｍｈＦＶＩＩＩ核酸のＡＡＶカプシドへのパッケージングおよびｍｈＦＶＩＩＩ核酸の標的細胞のゲノムへの組込みを可能にするように機能するシス作用性ＩＴＲが挙げられ得る。好ましくは、ＡＡＶベクターは、欠失し、ｍｈＦＶＩＩＩ配列によって置換されたそのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにその関連する発現制御配列を有する。ｍｈＦＶＩＩＩ配列は、典型的には、ウイルス複製のために適当な１つまたは２つのＡＡＶ ＴＲまたはＴＲエレメントに隣接して（すなわち、フランキングして）挿入される。最も好ましくは、ベクターの必須部分のみ、例えば、それぞれ、ＩＴＲおよびＬＴＲエレメントのみが含まれる。一部の実施形態において、２つ以上のＡＡＶベクターが、本出願のｍｈＦＶＩＩＩのイン・ビボ送達のために使用される。この場合において、それぞれのＡＡＶベクターは、上記のようにして構築され、ｍｈＦＶＩＩＩコード配列の一部分を持つ（例えば、あるベクターは、ｍｈＦＶＩＩＩ重鎖についてのコード配列を持ち、別のベクターは、ｍｈＦＶＩＩＩ軽鎖についてのコード配列を持つ）。

【0115】

標的細胞における変異型ｈＦＶＩＩＩ配列の組織特異的発現を促進するために好適な調節配列は、イン・ビトロまたはイン・ビボで、ｍｈＦＶＩＩＩの発現のために利用される。本出願の発現構築物における組織特異的調節エレメントの組込みは、ｍｈＦＶＩＩＩまたはその機能的断片の発現のための少なくとも部分的な組織向性を提供する。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはＣＡＧプロモーターの制御下で変異型ＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、骨格筋発現のために用いることができるか、またはｈＡＡＴ－ＡｐｏＥなどは、肝臓特異的発現のために用いることができる。ＡＡＶおよびレンチウイルスベクターにおける造血特異的プロモーターも、イン・ビボでｍｈＦＶＩＩＩの発現を駆動するために利用され得る。

【0116】

パッケージングされたウイルスベクターのウイルスカプシド構成要素は、パルボウイルスカプシドであってもよい。ＡＡＶ Ｃａｐおよびキメラカプシドが好ましい。好適なパルボウイルスカプシド構成要素の例は、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）、例えば、自律性パルボウイルスまたはディペンドウイルス由来のカプシド構成要素である。例えば、ウイルスカプシドは、ＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２カプシド；当業者には、同じまたは類似の機能を行うまだ特定されていない他のバリアントが存在する可能性があることは公知であろう）であってもよく、または２つ以上のＡＡＶカプシド由来の構成要素を含んでいてもよい。ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の完全相補体は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含む。ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、全長未満の相補的ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質を含んでいてもよく、またはＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の完全相補体が提供されてもよい。

【0117】

ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の１以上は、キメラタンパク質であってもよく、これは、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら、米国特許第６，４９１，９０７号に記載されるように、２つ以上のウイルス、好ましくは、２つ以上のＡＡＶ由来のアミノ酸配列ＡＡＶ Ｃａｐを含む。例えば、キメラウイルスカプシドは、ＡＡＶ１ Ｃａｐタンパク質またはサブユニット、および少なくとも１つのＡＡＶ２ Ｃａｐまたはサブユニットを含むことができる。キメラカプシドは、例えば、１以上のＢ１９ Ｃａｐサブユニットを有するＡＡＶカプシドを含むことができ、例えば、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質またはサブユニットは、Ｂ１９ Ｃａｐタンパク質またはサブユニットによって置換することができる。例えば、ＡＡＶカプシドのＶｐ３サブユニットは、Ｂ１９のＶｐ２サブユニットによって置換することができる。

【0118】

パッケージング細胞を培養して、本出願のパッケージングされたウイルスベクターを産生し得る。パッケージング細胞は、（１）ウイルスベクター機能、（２）パッケージング機能、および（３）ヘルパー機能を含み得る。ウイルスベクター機能は、典型的には、上記の、欠失し、変異型ＦＶＩＩＩ配列によって置換されたｒｅｐおよびｃａｐ、ならびにその関連する発現制御配列とともに、ＡＡＶゲノムなどのパルボウイルスゲノムの一部分を含む。

【0119】

ある特定の実施形態において、ウイルスベクター機能は、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許公開第２００４／００２９１０６号に記載されているように、二重ベクター鋳型として好適に提供され得る。二重ベクターは、二量体の自己相補性（ｓｃ）ポリヌクレオチド（典型的には、ＤＮＡ）である。例えば、二重ベクターのＤＮＡは、鎖内塩基対形成に起因する二本鎖ヘアピン構造を形成するように、選択され得る。二重ＤＮＡベクターの両鎖は、ウイルスカプシド内にパッケージングされ得る。二重ベクターは、二本鎖ＤＮＡウイルスベクターと同等の機能を提供し、ウイルスによって通常カプシド形成された一本鎖ゲノムに対する相補的ＤＮＡを合成する標的細胞の必要性を軽減し得る。

【0120】

ウイルスベクターにおける使用のために選択されるＴＲ（分解可能および分解不能）は、好ましくは、ＡＡＶ配列（任意のＡＡＶ血清型由来）である。分解可能なＡＡＶ ＩＴＲは、ＴＲが、所望の機能、例えば、ウイルスパッケージング、組込み、および／またはプロウイルスレスキューなどを媒介する限り、野生型ＴＲ配列を有する必要はない（例えば、野生型配列は、挿入、欠失、トランケーションまたはミスセンス変異によって変更され得る）。ＴＲは、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号に記載される「ダブル－Ｄ配列」などのＡＡＶ逆位末端反復配列として機能する合成配列であってもよい。必ずしもではないが、典型的には、ＴＲは、同じパルボウイルス由来である、例えば、両ＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。

【0121】

パッケージング機能は、カプシド構成要素を含む。カプシド構成要素は、好ましくは、ＡＡＶカプシドまたはキメラＡＡＶカプシド機能などのパルボウイルスカプシド由来である。好適なパルボウイルスカプシド構成要素の例は、パルボウイルス科、例えば、自律性パルボウイルスまたはディペンドウイルス由来のカプシド構成要素である。例えば、カプシド構成要素は、ＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２、およびまだ特定されていない、または非ヒト霊長類起源の他の新規カプシドから選択され得る。カプシド構成要素は、２つ以上のＡＡＶカプシド由来の構成要素を含んでいてもよい。

【0122】

ある特定の実施形態において、ＶＰカプシドタンパク質の１以上は、２つ以上のウイルス、好ましくは、２つ以上のＡＡＶ由来のアミノ酸配列を含む、キメラタンパク質を含み得る。例えば、キメラウイルスカプシドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のカプシド領域、およびＢ１９ウイルス由来の少なくとも１つのカプシド領域を含むことができる。キメラカプシドは、例えば、１以上のＢ１９カプシドサブユニットを有するＡＡＶカプシドを含み、例えば、ＡＡＶカプシドサブユニットは、Ｂ１９カプシドサブユニットによって置換することができる。例えば、ＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３サブユニットは、Ｂ１９のＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３サブユニットによって置換することができる。別の例として、キメラカプシドは、２型ＶＰ１サブユニットが、ＡＡＶ１、３、４、５、または６型カプシド、好ましくは、３、４、または５型カプシド由来のＶＰ１サブユニットによって置換されている、ＡＡＶ２型カプシドを含んでいてもよい。あるいは、キメラパルボウイルスは、２型ＶＰ２サブユニットが、ＡＡＶ１、３、４、５、または６型カプシド、好ましくは、３、４、または５型カプシド由来のＶＰ２サブユニットによって置換されている、ＡＡＶ２型カプシドを有する。同様に、ＡＡＶ１、３、４、５、または６型（より好ましくは、３、４、または５型）由来のＶＰ３サブユニットが、ＡＡＶ２型カプシドのＶＰ３サブユニットで置換されているキメラパルボウイルスが好ましい。さらなる代替として、ＡＡＶ２型サブユニットの２つが、異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、３、４、５、または６型）のＡＡＶ由来のサブユニットによって置換されているキメラパルボウイルスが好ましい。この実施形態による例示的なキメラパルボウイルスにおいて、ＡＡＶ２型カプシドのＶＰ１およびＶＰ２、またはＶＰ１およびＶＰ３、またはＶＰ２およびＶＰ３サブユニットは、異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、３、４、５、または６型）のＡＡＶの対応するサブユニットによって置換されている。同様に、他の好ましい実施形態において、キメラパルボウイルスは、１つまたは２つのサブユニットが、ＡＡＶ２型について上記のように、異なる血清型のＡＡＶ由来のもので置換されているＡＡＶ１、３、４、５、または６型カプシド（好ましくは、２、３または５型カプシド）を有する。

【0123】

パッケージングされたウイルスベクターは、一般に、変異型ＦＶＩＩＩ配列、ならびにベクターＤＮＡのパッケージングおよび形質導入細胞における変異型ＦＶＩＩＩ配列のその後の発現をもたらすのに十分なＴＲエレメントにフランキングしている発現制御配列を含む。ウイルスベクター機能は、例えば、プラスミドまたはアンプリコンの構成要素として細胞に供給されてもよい。ウイルスベクター機能は、細胞株内で染色体外に存在していてもよく、および／または細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれていてもよい。

【0124】

ＩＶ．ｍｈＦＶＩＩＩタンパク質産生方法および細胞株
本出願の別の態様は、本出願のｍｈＦＶＩＩＩを作製する方法に関する。これは、宿主細胞が発現ベクターによって形質転換されて、ｍｈＦＶＩＩＩを発現する条件下で本出願の宿主細胞が成長することを伴う。次いで、発現したｍｈＦＶＩＩＩは、単離される。

【0125】

本出願のさらなる態様は、本出願のｍｈＦＶＩＩＩをコードする単離された核酸分子を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、エピソームプラスミドの形態のＤＮＡ分子として単離された核酸分子を含有することができるか、またはそれは、宿主細胞ゲノムに安定に組み込むことができる。さらに、宿主細胞は、ｍｈＦＶＩＩＩタンパク質を産生するための発現系を構成することができる。好適な宿主細胞としては、限定されないが、動物細胞（例えば、ヒトＨｕＨ７およびＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（「ＣＨＯ」）、ベビーハムスター腎臓（「ＢＨＫ」）細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、真菌細胞、酵母細胞（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））、植物細胞（例えば、シロイヌナズナまたはタバコ細胞）、藻類細胞などであり得る。本出願を行うために好適な哺乳動物細胞としては、数ある中でも、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ ２）、２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３）、ＣＨＯＰ、ＨｕＨ７、ＨＥＫ２９３およびＮＳ－１細胞が挙げられる。

【0126】

本出願の別の態様は、ｍｈＦＶＩＩＩを培養細胞から産生する方法に関する。一部の実施形態において、方法は、（ａ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列およびｍｈＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ｍｈＦＶＩＩＩが、Ａ２０Ｋ、Ｔ２１Ｉ、Ｔ２１Ｖ、Ｆ５７Ｌ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、Ｓ３３２Ｐ、Ｒ３７８Ｓ、Ｉ６１０ＭおよびＩ６６１Ｖからなる群から選択される位置に１以上のアミノ酸置換を含む、ポリヌクレオチド；およびポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含む発現ベクターを宿主細胞に導入する工程；（ｂ）ｍｈＦＶＩＩＩの発現および分泌に好適な条件下で発現ベクターを保持している宿主細胞を成長させる工程；ならびに（ｃ）宿主細胞の培養培地および／または宿主細胞を採取する工程、ならびに（ｄ）採取された培養培地および／または宿主細胞からｍｈＦＶＩＩＩを精製する工程を含む。

【0127】

一実施形態において、宿主細胞は、成長培地においてイン・ビトロで成長する。好適な成長培地としては、限定されないが、フォン・ヴィルブランド因子（本明細書において「ＶＷＦ」と称される）を含有する成長培地が挙げられ得る。この実施形態において、宿主細胞は、ＶＷＦをコードする導入遺伝子を含有し得るか、またはＶＷＦは、補充物として成長培地に導入され得る。成長培地中のＶＷＦは、ｍｈＦＶＩＩＩのより高い発現レベルを可能にする。組換えＦＶＩＩＩが成長培地に分泌されると、次いで、これは、関連する組換えＤＮＡおよびタンパク質の技術分野において当業者に周知の技法（本明細書に記載されるものを含む）を使用して、成長培地から単離することができる。別の実施形態において、本出願のｍｈＦＶＩＩＩを作製する方法は、ｍｈＦＶＩＩＩの単離の前に、宿主細胞を破壊する工程をさらに含む。この実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、細胞残屑から単離される。

【0128】

ｍｈＦＶＩＩＩは、好ましくは、実質的に純粋な形態で産生される。特定の実施形態において、実質的に純粋な組換えＦＶＩＩＩは、少なくとも約８０％純粋、より好ましくは、少なくとも９０％純粋、最も好ましくは、少なくとも９５％純粋、９８％純粋、９９％純粋、または９９．９％純粋である。実質的に純粋な組換えＦＶＩＩＩは、当技術分野において周知の従来の技法によって得ることができる。典型的には、実質的に純粋なｍｈＦＶＩＩＩは、組換え宿主細胞の成長培地に分泌される。あるいは、実質的に純粋なｍｈＦＶＩＩＩは、産生されるが、成長培地に分泌されない。そのような場合、実質的に純粋なｍｈＦＶＩＩＩを単離するために、組換えプラスミドを持つ宿主細胞は、増やされ、超音波処理によって溶解され、加熱され、または化学的処理され、ホモジネートは、遠心分離されて、細胞残屑が除去される。次いで、上清は、逐次的硫酸アンモニウム沈殿に付される。実質的に純粋なｍｈＦＶＩＩＩを含有する画分は、適切なサイズのデキストランまたはポリアクリルアミドカラムにおけるゲル濾過に付されて、ｍｈＦＶＩＩＩが分離される。必要により、タンパク質画分（実質的に純粋なｍｈＦＶＩＩＩを含有する）は、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）によってさらに精製されてもよい。

【0129】

Ｖ．処置方法
本出願の別の態様は、ＦＶＩＩＩ欠乏症を有する患者を処置する方法に関する。

【0130】

一部の実施形態において、本方法は、有効量の本出願のｍｈＦＶＩＩＩをそれを必要とする患者に投与する工程を含む。一部の実施形態において、ｍｈＦＶＩＩＩは、精製形態で静脈内投与される。

【0131】

他の実施形態において、本方法は、有効量の本出願のｍｈＦＶＩＩＩのコード配列を含む発現ベクターをそれを必要とする患者に投与する工程を含み、発現ベクターは、患者においてｍｈＦＶＩＩＩを発現することができる。

【0132】

他の実施形態において、本方法は、有効量の本出願のｍｈＦＶＩＩＩのコード配列を含む細胞をそれを必要とする患者に投与する工程を含み、細胞は、移植後に、患者においてｍｈＦＶＩＩＩを発現することができる。一部の実施形態において、細胞は、皮膚線維芽細胞である。一部の実施形態において、細胞は、自家細胞である。一部の実施形態において、方法は、ｍｈＦＶＩＩＩコード配列を標的細胞の集団に導入する工程であって、標的細胞が、そのような処置を必要とする対象から単離される、工程、標的細胞においてｍｈＦＶＩＩＩを発現する工程、および有効量のｍｈＦＶＩＩＩを発現する細胞を対象に注入する工程を含む。

【0133】

一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩ欠乏症は、血友病Ａである。この場合、本出願のｍｈＦＶＩＩＩの発現は、ヒトＦＶＩＩＩに対する抗体を発生する血友病を含む、そうでなければＦＶＩＩＩ欠乏症に起因する未制御の出血（例えば、関節内、頭蓋内、または胃腸の出血症状）を受けやすい患者における凝固を増強することができる。ベクターの標的細胞は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドを発現することができる細胞、例えば、哺乳動物の肝臓系の細胞、内皮細胞、および前駆体を処理してＦＶＩＩＩ活性を有するタンパク質を生じる、適当な細胞機構を有する他の細胞である。

【0134】

ｍｈＦＶＩＩＩタンパク質、またはｍｈＦＶＩＩＩをコードする発現ベクター、またはｍｈＦＶＩＩＩを発現する細胞のＦＶＩＩＩ欠乏症患者への投与は、凝固カスケードを機能的に再構成することができる。ｍｈＦＶＩＩＩタンパク質、またはｍｈＦＶＩＩＩをコードする発現ベクター、またはｍｈＦＶＩＩＩを発現する細胞は、単独で、または薬学的に許容されるもしくは生物学的に適合する組成物中で他の治療剤と組み合わせて投与することができる。

【0135】

一部の実施形態において、方法は、ヒトまたは動物ＦＶＩＩＩの注入のために使用される同じ手順に従って、ｍｈＦＶＩＩＩタンパク質を含む医薬組成物を患者に静脈内投与する工程を含む。好適な有効量のｍｈＦＶＩＩＩとしては、限定されないが、約１０～約５００単位／患者の体重ｋｇが挙げられ得る。

【0136】

ｍｈＦＶＩＩＩをコードする発現ベクター、またはｍｈＦＶＩＩＩタンパク質、またはｍｈＦＶＩＩＩを発現する細胞の処置投薬量は、ＦＶＩＩＩ欠乏症の重症度に応じて変わる。一般に、投薬量レベルは、それぞれの患者の出血エピソードの重症度および期間に沿って、頻度、期間、および単位において調節される。したがって、ｍｈＦＶＩＩＩをコードする発現ベクター、またはｍｈＦＶＩＩＩタンパク質、またはｍｈＦＶＩＩＩを発現する細胞は、標準的な凝固アッセイによって測定されるように、出血を停止するための治療有効量のタンパク質を患者に送達するのに十分な量で、薬学的に許容される担体、送達ビヒクル、または安定化剤に含まれる。

【0137】

ＦＶＩＩＩは、古典的には、血友病Ａを有する個体に由来する血漿における凝固の欠陥を修正する正常な血漿中に存在する物質として定義される。精製および部分的精製形態のＦＶＩＩＩのイン・ビトロでの凝固活性は、ヒト患者における注入のためのｍｈＦＶＩＩＩの用量を算出するために使用され、患者の血漿から回収された活性およびイン・ビボの出血の欠陥の修正の信頼性のある指標である。イン・ビトロでの新規ＦＶＩＩＩ分子の標準的なアッセイとイヌ注入モデルまたはヒト患者におけるそれらの挙動との間の食い違いは報告されていない。

【0138】

通常、ＦＶＩＩＩの投与により患者において達成される所望の血漿ＦＶＩＩＩ活性レベルは、正常の３０～２００％の範囲内である。一実施形態において、治療的ｍｈＦＶＩＩＩの投与は、約５～５００単位／体重ｋｇの範囲内、および特に、１０～１００単位／体重ｋｇの範囲内の好ましい投薬量、ならびにさらに特に、２０～４０単位／体重ｋｇの好ましい投薬量で静脈内に与えられ；間隔の頻度は、約８～２４時間（重篤な血友病において）の範囲内であり；処置の期間（日）は、１～１０日の範囲内、または出血エピソードが解消されるまでである。阻害因子を有する患者は、ＦＶＩＩＩのそれらの以前の形態とは異なる量のｍｈＦＶＩＩＩを必要とし得る。例えば、患者は、野生型ＶＩＩＩよりも高い特異的活性およびその減少した抗体反応性を理由として、より少ないｍｈＦＶＩＩＩを必要とし得る。ヒトまたは血漿由来ＦＶＩＩＩによる処置におけるように、注入される治療的ｍｈＦＶＩＩＩの量は、１段階のＦＶＩＩＩ凝固アッセイによって定義され、選択された例において、イン・ビボ回収は、注入後の患者の血漿におけるＦＶＩＩＩを測定することによって決定される。いかなる特定の対象についても、具体的な投薬レジメンが、個体の必要性および組成物を投与する者またはその投与監督者の専門的な判断に従って経時的に調節しなければならないこと、ならびに本明細書に示される濃度範囲が、単に例示的なものであって、特許請求の範囲に係るｍｈＦＶＩＩＩの範囲またはプラクティスを限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。

【0139】

処置は、必要により、ｍｔＦＶＩＩＩの単回静脈内投与、または長期間にわたる定期的もしくは継続的投与の形態を取ることができる。あるいは、治療的ｍｈＦＶＩＩＩは、種々の時間間隔で、１用量または数用量のリポソームで、皮下または経口投与することができる。

【0140】

発現ベクターの必要とするヒト対象または動物への投与は、ウイルスベクターを投与するための当技術分野において公知の任意の手段によってであり得る。例示的な投与の方式としては、直腸、経粘膜、局部、経皮、吸入、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、および関節内）投与など、ならびに組織または器官への直接注射、あるいはくも膜下腔内、直接筋肉内、脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射が挙げられる。注射物質は、液状の溶液もしくは懸濁液、注射前に液状の溶液もしくは懸濁液に好適な固体形態、またはエマルションとしてのいずれかの従来の形態で調製することができる。あるいは、ウイルスを、全身的な様式ではなく局所的な様式、例えば、デポー製剤または持続放出製剤で投与してもよい。

【0141】

ある特定の好ましい実施形態において、発現ベクターは、筋肉内、より好ましくは、筋肉内注射、または局所投与によって投与される。本明細書に開示されるベクターは、任意の好適な手段によって対象の肺に投与されてもよいが、好ましくは、対象が吸入する、本発明のパルボウイルスベクターから構成される呼吸用粒子のエアロゾル懸濁剤を投与することによって投与される。呼吸用粒子は、液体または固体であり得る。本発明のパルボウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を含む液状粒子のエアロゾルは、当業者に公知であるように、任意の好適な手段、例えば、圧力駆動性エアロゾル噴霧吸入器または超音波噴霧吸入器によって生成されてもよい。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。

【0142】

ｍｈＦＶＩＩＩを発現するウイルスベクターの投薬量は、投与の方式、処置される疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクター、および送達される遺伝子に依存し、ルーチン的な様式で決定することができる。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０⁵、１０⁶、１０⁷、１０⁸、１０⁹、１０¹⁰、１０¹¹、１０¹²、１０¹³、１０¹⁴、１０¹⁵形質導入単位以上、好ましくは、約１０⁸～１０¹³形質導入単位、さらにより好ましくは、１０¹²形質導入単位のウイルス力価である。本出願のｍｔＦＶＩＩＩをコードするポリヌクレオチドは、標的細胞における発現のために適切な調節エレメントを有するＤＮＡ分子の構成要素として投与されてもよい。本出願のｍｔＦＶＩＩＩをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスプラスミドまたはウイルス粒子、例えば、ＡＡＶ粒子の構成要素として投与されてもよい。ウイルス粒子は、それを必要とする対象の門脈血管への直接的なイン・ビボ直接送達によってウイルス粒子単独として、またはエクス・ビボでのウイルス粒子による細胞の形質導入と、それに続くイン・ビボでの形質導入された細胞を対象に戻す導入を含むエクス・ビボ処置として投与されてもよい。

【0143】

ｍｔＦＶＩＩＩをコードするポリヌクレオチドは、重鎖および軽鎖部分の両方を含有する単鎖分子として、または患者の宿主細胞への送達のための複数の独立したウイルスもしくは非ウイルスベクターにおいて２つもしくは複数の分子（例えば、重鎖および軽鎖）に分割して、用いることができる。

【0144】

一部の実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。本出願において使用され得るウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、複数の血清型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＡＡＶ－１～ＡＡＶ－１２、およびそれらのシュードタイプベクター）、ハイブリッドＡＡＶベクター、レトロウイルスベクターが挙げられ、レンチウイルスベクターおよびシュードタイプレンチウイルスベクター（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））；アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、非ウイルスベクターなどを含む。加えて、ウイルスベクターのいずれも、組織特異的プロモーター／エンハンサーなどを含むように改変されていてもよい。

【0145】

ＶＩ．医薬組成物
本出願の別の態様は、（１）本出願のｍｈＦＶＩＩＩポリペプチド、ｍｈＦＶＩＩＩをコードする発現ベクター、またはｍｈＦＶＩＩＩを発現する細胞、および（２）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

【0146】

例示的な薬学的に許容される担体としては、無菌のパイロジェンフリーの水、および無菌のパイロジェンフリーのリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。生理学的に許容される担体には、薬学的に許容される担体が含まれる。薬学的に許容される担体は、生物学的等の点で有害ではないもの、すなわち、材料の有利な生物学的効果を上回る有害な生物学的効果を引き起こすことなく、対象に投与され得る材料である。一部の実施形態において、医薬組成物は、注射製剤化される。

【0147】

注射について、担体は、典型的には、液体である。注射媒体として、注射溶液のために有用な添加剤、例えば、安定剤、塩もしくは生理食塩水、および／または緩衝液を含有する水を使用することが好ましい。投与の他の方法について、担体は、固体または液体のいずれかであり得る。吸入投与について、担体は、呼吸用であり、好ましくは、固体または液体の粒子形態である。

【0148】

本出願を、以下の実施例によってさらに説明するが、これらは本出願を限定するものと解釈すべきではない。本出願全体を通して引用されたすべての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0149】

実施例１ 第ＶＩＩＩ因子変異体の構築、発現および特徴評価
鋳型：プラスミドｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８を、複数のｈＦＶＩＩＩ変異をｈＦＶＩＩＩ重鎖のコード領域に導入するための鋳型として使用した。図１に示すように、ヒト第ＶＩＩＩ因子（ｈＢＤＤＦ８）ｃＤＮＡを含有するｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８（配列番号１５）は、ＣＡＧプロモーターの制御下にある。加えて、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８は、機能的に欠陥があるＢドメインをもたらすＢドメインにおける欠失を持つ。図２は、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８において構築されたｈＦＶＩＩＩ変異を特定する。図３は、単一アミノ酸置換およびその組合せの両方を含む、本研究において分析された両ｈＦＶＩＩＩ変異を示す。

【0150】

単一の変異：ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）法を使用して、ヒト第ＶＩＩＩ因子のＡ２０Ｋ、Ｔ２１Ｉ、Ｔ２１Ｖ、Ｆ５７Ｌ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、Ｓ３３２Ｐ、Ｒ３７８Ｓ、Ｉ６１０ＭおよびＩ６６１Ｖに対応する個々の変異を、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８プラスミドに導入した。得られたプラスミドには、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ａ２０Ｋ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｔ２１Ｉ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｔ２１Ｖ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｆ５７Ｌ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｌ６９Ｖ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｉ８０Ｖ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｌ１７８Ｆ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｒ１９９Ｋ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｈ２１２Ｑ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｉ２１５Ｖ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｒ２６９Ｋ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｉ３１０Ｖ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｌ３１８Ｆ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｓ３３２Ｐ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｒ３７８Ｓ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｉ６１０Ｍ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｉ６６１Ｖが含まれる。

【0151】

Ｔ２１変異体：Ｔ２１をＰで置換することによって、ＡｖｒＩＩ制限部位を、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８に導入した。得られたプラスミドｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｔ２１Ｐを鋳型として使用して、アミノ酸２１位における複数の点変異を作出した。ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｔ２１Ｐを、ＡｖｒＩＩによって消化し、本明細書に記載される変異体構築物のための鋳型として使用した。Ｔ２１位に対応するＮＮＮを有する１９オリゴヌクレオチドを、ＨＩＦＩアセンブリーによって、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８に組み換えた。変異体プラスミドには、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｔ２１Ｖ、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｔ２１Ｉ・・・ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｔ２１Ｇなどが含まれる。最後の文字は、その特定の位置におけるアミノ酸置換を示す。類似の戦略を使用して、本発明に従う他の置換を作製することができる。

【0152】

Ｔ２１Ｉを有するＡ２０変異：Ｔ２１Ｉおよびアラニン２０に対応するＮＮＮを有する１９オリゴヌクレオチドを、ＨＩＦＩアセンブリーによって、ＡｖｒＩＩによって消化されるｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ｔ２１Ｐに組み換えた。得られた変異体プラスミドには、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ａ２０Ｋ／Ｔ２１Ｉ（２Ｍ１）、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ａ２０Ｅ／Ｔ２１Ｉ・・・ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ａ２０Ｖ／Ｔ２１Ｉなどが含まれる。類似の戦略を使用して、本発明に従う他の置換、例えば、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８－Ａ２０Ｋ／Ｔ２１Ｖ（２Ｍ２）を作製することができる。

【0153】

変異の組合せ：複数のＨＣ変異を有するｈＦＶＩＩＩ変異体（図３に示される通り）を、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８において構築した。一実施形態において、置換変異Ａ２０Ｋ、Ｔ２１Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、Ｓ３３２ＰおよびＩ６６１ＶをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８中の対応する領域を置換するために使用した。得られたプラスミドｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ＢＤＤＦ８－１３Ｍ１は、上記の１３個の変異を有する変異型第ＶＩＩＩ因子タンパク質（１３Ｍ１）を発現する。

【0154】

別の実施形態において、置換変異Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、Ｓ３３２ＰおよびＩ６６１ＶをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８の対応する領域を置換するために使用した。得られたプラスミドｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ＢＤＤＦ８－１２Ｍ１は、上記の１２個の変異を有する変異型第ＶＩＩＩ因子タンパク質（１２Ｍ１）を発現する。

【0155】

別の実施形態において、置換変異Ａ２０Ｋ、Ｔ２１Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｌ３１８Ｆ、およびＩ６６１ＶをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８の対応する領域を置換するために使用した。得られたプラスミドｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ＢＤＤＦ８－１０Ｍ１は、上記の１０個の変異を有する変異型第ＶＩＩＩ因子タンパク質（１０Ｍ１）を発現する。

【0156】

別の実施形態において、置換変異Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｌ３１８Ｆ、およびＩ６６１ＶをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８の対応する領域を置換するために使用した。得られたプラスミドｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ＢＤＤＦ８－９Ｍ１は、上記の９個の変異を有する変異型第ＶＩＩＩ因子タンパク質（９Ｍ１）を発現する。

【0157】

別の実施形態において、置換変異Ｒ１９９Ｋ、Ｈ２１２Ｑ、Ｉ２１５Ｖ、Ｒ２６９Ｋ、Ｉ３１０Ｖ、Ｌ３１８Ｆ、およびＳ３３２ＰをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８の対応する領域を置換するために使用した。得られたプラスミドｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ＢＤＤＦ８－７Ｍ２は、上記の７個の変異を有する変異型第ＶＩＩＩ因子タンパク質（７Ｍ２）を発現する。

【0158】

別の実施形態において、置換変異Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０Ｖ、Ｌ１７８Ｆ、およびＩ６６１ＶをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８の対応する領域を置換するために使用した。得られたプラスミドｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ＢＤＤＦ８－５Ｍ４は、上記の５個の変異を有する変異型第ＶＩＩＩ因子タンパク質（５Ｍ４）を発現する。

【0159】

別の実施形態において、置換変異Ｔ２１Ｖ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０ＶおよびＩ６６１ＶをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８の対応する領域を置換するために使用した。得られたプラスミドｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ＢＤＤＦ８－４Ｍ３は、上記の４個の変異を有する変異型第ＶＩＩＩ因子タンパク質（４Ｍ３）を発現する。

【0160】

別の実施形態において、置換変異Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９Ｖ、Ｉ８０ＶおよびＬ１７８ＦをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８の対応する領域を置換するために使用した。得られたプラスミドｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ＢＤＤＦ８－４Ｍ１は、上記の４個の変異を有する変異型第ＶＩＩＩ因子タンパク質（４Ｍ１）を発現する。

【0161】

別の実施形態において、置換変異Ｔ２１Ｉ、Ｌ６９ＶおよびＩ８０ＶをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８の対応する領域を置換するために使用した。得られたプラスミドｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ＢＤＤＦ８－３Ｍ１は、上記の３個の変異を有する変異型第ＶＩＩＩ因子タンパク質（３Ｍ１）を発現する。

【0162】

変異型構築物の機能活性を試験するために、ＨＥＫ ２９３Ｔ、ＨｕＨ７およびＣＨＯ細胞を、１０％のウシ胎仔血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を有するＤＭＥＭ中、５％のＣＯ₂が供給された湿潤環境において、３７℃で培養した。ＨＥＫ ２９３Ｔ、ＨｕＨ７およびＣＨＯ細胞を、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＤＤＦ８における野生型および変異型発現構築物でトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を、２％の不活性化ウシ胎仔血清を有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。細胞培養培地を、トランスフェクション後の異なる時間（２４時間、４８時間、７２時間）に収集した。分泌されたＦＶＩＩＩの活性を、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイを使用して分析した。正常なヒト血漿を、標準として使用した。

【0163】

これらのアッセイの代表的な結果を、図４～１０、１１Ｂおよび１３に示す。簡潔には、図４～６は、トランスフェクション後４８時間で、野生型ｈＦＶＩＩＩと比較した、ＨｕＨ７細胞（図４）およびＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（図５、６）における特異的な単一アミノ酸置換変異体の機能活性の増加を示す。図６は、Ｔ２１ＩおよびＴ２１Ｖ変異体が、トランスフェクション後４８時間で、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞においてＦＶＩＩＩ活性を有意に増加させたことを示す。図７は、Ａ２０Ｋを保有する二重変異体（Ａ２０Ｋ／Ｔ２１ＩおよびＡ２０Ｋ／Ｔ２１Ｖ）が、トランスフェクション後４８時間で、Ｔ２１およびＴ２１Ｖ単一置換対応物に対して、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞においてＦＶＩＩＩ活性をさらに増加させたことを示す。図８～１０は、複数の変異の組合せが、それぞれ、トランスフェクション後２４時間および４８時間で、ＨｕＨ７、ＨＥＫ ２９３Ｔ、およびＣＨＯ細胞において、野生型、単一置換および二重置換変異体と比較して、ＦＶＩＩＩ機能活性を大いに増加させることができることを示す。

【0164】

実施例２ ハイブリッドヒト／イヌ第ＶＩＩＩ因子変異体の構築、発現および機能活性
変異型ｈＶＩＩＩ重鎖（ｈＨＣ）およびイヌＦＶＩＩＩ軽鎖（ｃＬＣ）からなる変異型ハイブリッドヒト／イヌＦＶＩＩＩを比較して本出願の変異型ｈＶＩＩＩの機能活性を評価するために、図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、一連のＢドメインなしのＦＶＩＩＩ構築物を調製し、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において発現させた。

【0165】

簡潔には、変異型ヒトＦＶＩＩＩ重鎖およびイヌＦＶＩＩＩ軽鎖を含有する変異型ＦＶＩＩＩを構築した。簡潔には、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８を、ＣｓｐＣＩおよびＸｈｏＩを用いて消化した。イヌ軽鎖（ｃＬＣ）をコードするＤＮＡ断片を化学合成し、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８において対応するヒト軽鎖（ｈＬＣ）領域を置換するために使用した。得られたプラスミドｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＨＣ－ｃＬＣは、ｈＨＣおよびｃＬＣから構成される（すなわちｈＨＣ－ｃＬＣ）、Ｂドメインなしのハイブリッドヒト／イヌ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを発現する。配列番号１０は、ネイティブｈＦＶＩＩＩシグナルペプチドありのｈＨＣ－ｃＬＣタンパク質のアミノ酸配列を示す。配列番号１１は、配列番号１０におけるタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１２は、ｈＦＶＩＩＩシグナルペプチドなしのｈＨＣ－ｃＬＣタンパク質のアミノ酸配列を示す。配列番号１３は、ｈＨＣ－ｃＬＣタンパク質におけるトランケートされたＢドメインのアミノ酸配列を示し、配列番号１４は、イヌＦＶＩＩＩ軽鎖（ｃＬＣ）のアミノ酸配列を示す。

【0166】

類似の戦略を使用して、図１１Ａに示されるように（および要約されるように）、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｑｗＨＣ－２Ｍ１－ｃＬＣ（２Ｍ１変異体）およびｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｑｗＨＣ－９Ｍ１－ｃＬＣ（９Ｍ１変異体）プラスミドを作製した。分泌されたＦＶＩＩＩの活性を、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイを使用して分析した。図１１Ｂは、トランスフェクション後４８時間での、ｈＦＶＩＩＩ（すなわち、未改変ｈＢＤＤＦ８タンパク質）の機能活性と比較した、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞におけるさまざまなヒト／イヌハイブリッドＦＶＩＩＩ変異体の機能活性を示す。図１１Ｂに示されるように、この系におけるｈＬＣのｃＬＣによる置換は、親プラスミドｈＢＤＤＦ８から発現されるｈＦＶＩＩＩと比較して、増加したＦＶＩＩＩ活性をもたらした。

【0167】

別の態様において、本出願の変異型ｈＶＩＩＩを発現するｒＡＡＶベクターの機能活性を、親ｈＢＤＤＦ８を発現するｒＡＡＶベクターと比較した。この場合、ｈＢＤＤＦ８タンパク質および改変ｈＢＤＤＦ８タンパク質を発現する一連のｒＡＡＶを構築し、産生した。得られたｒＡＡＶを使用して、ＨｕＨ７細胞に感染させ、感染細胞におけるｈＶＩＩＩ活性を分析した。

【0168】

この場合、ｈＢＤＤＦ８におけるＣＡＧプロモーターをヒトＴＴＲプロモーターで置換した第１の本出願の変異型ｈＶＩＩＩを発現する一連のｒＡＡＶを構築した。簡潔には、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８を、ＳｎａＢＩおよびＭｌｕＩを用いて消化した。ＴＴＲプロモーターおよびイントロンをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、ｐＡＮＧ－ＣＡＧ－ｈＢＤＤＦ８においてＣＡＧプロモーター領域を置換するために使用した。

【0169】

図１２に示すように、得られたプラスミドｐＡＮＧ－ＴＴＲ－ｈＢＤＤＦ８（配列番号１８）は、ＴＴＲプロモーターの制御下で、ｈＢＤＤＦ８タンパク質を発現する。類似の戦略を使用して、ｐＡＮＧ－ＴＴＲ－ｑｗＢＤＤＦ８－２Ｍ１、ｐＡＮＧ－ＴＴＲ－ｑｗＢＤＤＦ８－２Ｍ２、ｐＡＮＧ－ＴＴＲ－ｑｗＢＤＤＦ８－９Ｍ１、ｐＡＮＧ－ＴＴＲ－ｑｗＢＤＤＦ８－１０Ｍ１、ｐＡＮＧ－ＴＴＲ－ｑｗＢＤＤＦ８－１２Ｍ１、ｐＡＮＧ－ＴＴＲ－ｑｗＢＤＤＦ８－１３Ｍ１プラスミドを作製した。

【0170】

ｐＡＮＧ－ＴＴＲ－ｈＢＤＤＦ８およびその改変バリアントプラスミドを、ＡＡＶ２カプシドでパッケージングして、それらからｒＡＡＶを産生した。簡潔には、ｐＡＡＶ－ＲｅｐおよびＣａｐ（血清型２）、ｐＡｄヘルパー、および導入遺伝子プラスミドを、１：１：１の比で、ローラーボトルにおいて培養されたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞培地からのｒＡＡＶを、トランスフェクション後７２時間で採取し、２ラウンドのＣｓＣｌ勾配超遠心分離によって精製した。ｒＡＡＶのそれぞれを収集し、５％のＤ－ソルビトールを有するＰＢＳに対して大規模に交換した。

【0171】

ＨｕＨ７細胞を、１０％のＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中、５％のＣＯ₂が供給された湿潤環境において、３７℃で成長させた。それぞれの形質導入実験のために、５０，０００個の生存細胞を、２４ウェルプレートに、形質導入２４時間前に播種した。ｒＡＡＶを、１００，０００ｖｇ／細胞で、それぞれのウェルに直接添加した。分泌されたＦＶＩＩＩの活性を、トランスフェクション後７２時間で、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイを使用して分析した。

【0172】

図１３に示すように、改変ｈＢＤＤＦ８は、ＨｕＨ７細胞においてｒＡＡＶベクターによって発現された場合に、未改変ｈＢＤＤＦ８と比較して、増加したＦＶＩＩＩ活性を示した。

【0173】

上記の実施例は、本出願の変異型第ＶＩＩＩ因子産物が、野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、増加した機能活性を示すことを表す。したがって、本明細書に記載される変異体の使用は、既存の構築物と比べて、必要な生産コストおよびＦＶＩＩＩ発現のレベルを減少させることができる。それらはまた、より高度に活性なＦＶＩＩＩ産物を提供することによって、投与されるより低いベクター用量を可能にする。

【0174】

上述の記載は、当業者に、本出願を実施する方法を教示する目的のためのものである。説明を読む際に当業者に明らかになるであろう、すべての自明な改変およびその変形形態を詳述することを意図するものではない。しかしながら、すべてのそのような自明な改変および変形形態が、以下の特許請求の範囲によって定義される本出願の範囲内に含まれることを意図する。特許請求の範囲は、文脈が具体的に逆のことを示さない限り、特許請求の範囲に係る構成要素および工程を、これらの意図した目的を満たすために有効な任意の順序で包含することを意図する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】