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特表2024-511874Ｇ４を形成しやすいポリヌクレオチドの酵素合成のための方法及びキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-15
(54)【発明の名称】Ｇ４を形成しやすいポリヌクレオチドの酵素合成のための方法及びキット
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20240308BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20240308BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z
C12P19/34 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023560824
(86)(22)【出願日】2022-04-01
(85)【翻訳文提出日】2023-12-01
(86)【国際出願番号】 EP2022058814
(87)【国際公開番号】W WO2022207934
(87)【国際公開日】2022-10-06
(31)【優先権主張番号】EP21305428
(32)【優先日】2021-04-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516304610
【氏名又は名称】ディーエヌエー スクリプト
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ドゥ クロザルス， ギャブリエル
(72)【発明者】
【氏名】ドゥ レヴェル， エマニュエル
(72)【発明者】
【氏名】ラシェイズ， アンリ
(72)【発明者】
【氏名】ホルガン， アドリアン
(72)【発明者】
【氏名】ゴドロン， シャビエル
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AF27
4B064CA21
4B064CB30
4B064CE20
4B064DA20
(57)【要約】
本発明は、Ｇ四重鎖（Ｇ４）構造を形成することができる配列を有するポリヌクレオチドの鋳型フリー酵素合成のための方法、組成物及びキットに関する。本発明によれば、Ｇ４形成によって影響を受ける伸長反応は、鎖内又は鎖間のＧ４構造の形成を阻害又は防止するポリＣオリゴヌクレオチド、例えば、ポリＣ開始剤の存在下で行われる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｇ４構造を形成することができる所定の配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法であって、（ａ）合成支持体に結合させて、それぞれ遊離３’－ヒドロキシルを有する開始剤を付与する工程と、
（ｂ）合成支持体を含む反応混合物中で、ポリヌクレオチドが形成されるまで、（ｉ）開始剤又は遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する伸長断片を３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸及び鋳型非依存性ポリメラーゼと伸長条件下で接触させて、開始剤又は伸長断片を３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の組み込みによって伸長させて、３’－Ｏ－ブロック伸長断片を形成することと、（ｉｉ）伸長断片をデブロッキングして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片を形成することと、からなるサイクルを繰り返す工程であって、開始剤又は伸長断片を伸長するための反応混合物が、ポリヌクレオチドの領域と二重鎖を形成することができるポリＣオリゴヌクレオチドを含む、工程と、
を含む、方法。
【請求項2】
前記開始剤が前記ポリＣオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記合成支持体が、それに結合した前記ポリＣオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記反応混合物が、前記伸長断片がＧ４を形成しやすいポリヌクレオチドであるときはいつでも、溶液中にポリＣオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡであり、前記鋳型非依存性ポリメラーゼがポリ（Ａ）ポリメラーゼ又はポリ（Ｕ）ポリメラーゼ又はそのバリアントである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸が３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、前記鋳型非依存性ポリメラーゼがターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）又はそのバリアントである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ポリＣオリゴヌクレオチドが、２から２０ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ポリヌクレオチドを前記合成支持体から切断する工程をさらに含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
前記３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸が、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アリルヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アミンヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチルヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－（２－シアノエチル）ヌクレオシド三リン酸、及び３’－Ｏ－プロパルギルヌクレオシド三リン酸からなる群から選択される、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸が３’－Ｏ－アジドメチルヌクレオシド三リン酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸が３’－Ｏ－アミンヌクレオシド三リン酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
ポリＣオリゴヌクレオチドを含む開始剤が付着した合成支持体を含む鋳型フリーポリメラーゼを使用して所定の配列のポリヌクレオチドを合成するためのキット。
【請求項14】
前記ポリヌクレオチドがポリデオキシリボヌクレオチドであり、前記鋳型フリーポリメラーゼがターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ又はそのバリアントである、請求項１３に記載のキット。
【請求項15】
前記ポリヌクレオチドがポリリボヌクレオチドであり、前記鋳型フリーポリメラーゼがポリ（Ａ）ポリメラーゼ又はポリ（Ｕ）ポリメラーゼ又はそのバリアントである、請求項１３に記載のキット。
【請求項16】
前記合成支持体が微小粒子の集団を含む、請求項１３、１４又は１５のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
ポリヌクレオチド合成への酵素的アプローチへの関心は、合成生物学、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９適用、及びハイスループットシーケンシングなどの多くの分野における合成ポリヌクレオチドに対する需要の増加のためだけでなく、ポリヌクレオチド合成への化学的アプローチの限界、例えば、生成物の長さ及びその使用の上限、並びに有機溶媒を処分する必要性のために、近年増加している、Ｊｅｎｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７：１８２１－１８３２（２０１８）。酵素合成は、その特異性及び効率、並びに穏やかな水性適合性試薬及び反応条件のみを必要とするため、魅力的である。
【0002】
現在、ＤＮＡ合成及びＲＮＡ合成の双方のためのほとんどの酵素的アプローチでは、鋳型フリーポリメラーゼを使用して、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸を一本鎖開始剤又は支持体に結合した伸長鎖に繰り返し付加し、続いて所望の配列のポリヌクレオチドが得られるまでデブロッキングする、例えば、Ｈｉａｔｔ及びＲｏｓｅ、国際公開第９６／０７６６９号。本発明者らは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）などの鋳型フリーポリメラーゼが、Ｇ四重鎖（Ｇ４）を形成することができる配列においてヌクレオチドを伸長鎖に効率的に結合しないことを発見した。Ｇ４構造は、様々な天然のプロセスへの関与に重要な一般的に存在する二次構造である、例えば、Ｋｗｏｋら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３５（１０）：９９７－１０１３（２０１７）；Ｍｕｒａｔら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖｅｌ．，２５：２２－２９（２０１４）など。したがって、酵素合成の最新技術には、現在、Ｇ４構造を形成しやすいポリヌクレオチドを合成するその能力が不足している。
【0003】
ポリヌクレオチドの鋳型フリー酵素合成の適用を拡大することへの関心を考えると、Ｇ４構造を含有する標的ポリヌクレオチドの効率及び収率を高めるための方法を用いることができれば、この分野は進歩するであろう。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、ＤＮＡポリヌクレオチド又はＲＮＡポリヌクレオチドのいずれかの鋳型フリー酵素合成のための、Ｇ４構造の形成を妨げるために合成反応において薬剤を使用する方法及びキットに関する。一態様では、かかる薬剤は、ポリシチジル酸又はポリデオキシシチジル酸オリゴヌクレオチド（本明細書では「ポリＣオリゴヌクレオチド」と総称する）である。いくつかの実施形態では、ポリＣオリゴヌクレオチドは、合成されるポリヌクレオチドのＧリッチドメインと相互作用することができるような開始剤及び／又は合成支持体の成分である。他の実施形態では、ポリＣオリゴヌクレオチドは、合成中の選択されたカップリング又は伸長工程の間、溶液中に遊離している。
【0005】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｇ４構造を形成することができる所定の配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法であって、（ａ）合成支持体に結合させて、それぞれ遊離３’－ヒドロキシルを有する開始剤を付与する工程と、（ｂ）合成支持体を含む反応混合物中で、ポリヌクレオチドが形成されるまで、（ｉ）開始剤又は遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する伸長断片を３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸及び鋳型非依存性ポリメラーゼと伸長条件下で接触させて、開始剤又は伸長断片を３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の組み込みによって伸長させて、３’－Ｏ－ブロック伸長断片を形成することと、（ｉｉ）伸長断片をデブロッキングして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片を形成することと、からなるサイクルを繰り返す工程であって、開始剤又は伸長断片を伸長するための反応混合物が、ポリヌクレオチドの領域と二重鎖を形成することができるポリＣオリゴヌクレオチドを含む、工程と、を含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、開始剤はそれぞれ、ポリＣオリゴヌクレオチドからなるセグメントを含む。他の実施形態では、最終的に開始剤に加えて、それに結合したポリＣオリゴヌクレオチドを有する合成支持体が提供される。さらに他の実施形態では、ポリＣオリゴヌクレオチドは、Ｇ４構造形成が起こる可能性が高い選択された伸長サイクルのための伸長反応混合物の成分として溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、そのような選択された伸長サイクルは、従来のＧ４予測アルゴリズムによって特定することができる。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【発明を実施するための形態】
【0007】
本発明の一般的な原理は、具体的に例によって、例えば、図面に示され詳細に説明されている例によって、本明細書により詳細に開示されている。しかしながら、その意図は、本発明を記載された特定の実施形態に限定するものではないことを理解されたい。本発明は、様々な変更及び代替形態を受け入れることができ、その詳細はいくつかの実施形態について示されている。この意図は、本発明の原理及び範囲内に入るすべての修正、均等物、及び代替物を網羅することである。
【0008】
本発明の実施は、別途指示がない限り、当業者の技術の範囲内である、有機化学、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、及び生化学の従来の技術及び説明を採用することができる。そのような従来の技術としては、合成ペプチド、合成ポリヌクレオチド、モノクローナル抗体、核酸クローニング、増幅、配列決定及び分析、並びに関連技術の調製及び使用を挙げることができるが、これらに限定されない。そのような従来の技術のプロトコルは、製造業者の製品文献及び実験マニュアル、例えば、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ－ＩＶ）、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、及び、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（すべて、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓから）、Ｌｕｔｚ ａｎｄ Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００９）、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００８）、並びに、同様の参考文献に見出すことができる。
【0009】
本発明は、伸長中の鎖におけるＧ四重鎖（又はＧ４）二次構造の形成を抑制又は妨害する合成条件を提供することによって、長いポリヌクレオチドのより高い収率を可能にする、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡ又はＲＮＡの鋳型フリー酵素合成の改善に関する。特定の理論又は仮説に限定する意図はないが、Ｇ４構造の形成は、鋳型フリーポリメラーゼなどの合成試薬へのアクセスを制限し、それによって鎖延長又は伸長を阻害し、それによって生成物の長さのばらつきが大きくなると考えられる。一つには、本発明は、Ｇ４構造の形成を妨げる薬剤、特にポリＣオリゴヌクレオチドを含む伸長（又は延長若しくはカップリング）条件を設けることによって、生成物収率に対するそのような二次構造の悪影響を緩和又は抑制することができるという認識及び理解に基づく。特に、そのような妨げは、Ｇリッチ領域を有する成長鎖が占有することができる代替的な安定した構成、例えば、ポリＣ領域との二重鎖を生じることによって起こると考えられる。上記を考慮して、いくつかの実施形態では、本発明の開始剤は、代替的な安定した立体配置が、開始剤中のポリＧオリゴヌクレオチドと合成されるポリヌクレオチドのＧリッチ配列との間のＧ４構造であり得るポリＧオリゴヌクレオチドを含み得る。そのようなポリＧオリゴヌクレオチドは、２から２０グアニレート又はデオキシグアニレートの範囲の長さを有し得る。
【0010】
Ｇ四重鎖構造は自然界でよく見られるものであり、利用可能なアルゴリズム、例えば、Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４８（１）：１－１５（２０２０）や同様の参考文献を使用して予測することができる。Ｇ３＋Ｎ１－７Ｇ３＋Ｎ１－７Ｇ３＋Ｎ１－７Ｇ３＋は共通のＧ４モチーフであり、式中、「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり、「３＋」は連続した３個以上のＧを意味する。本明細書で使用される場合、「Ｇ４を形成しやすいポリヌクレオチド」という用語は、伸長反応条件下でＧ４構造を形成することができるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、「Ｇ４を形成しやすいポリヌクレオチド」は、従来のＧ４予測アルゴリズムがＧ４構造を形成する可能性が高いと示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを意味する、例えば、Ｂｕｒｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４（１９）：５４０２－５４１５（２００６）、Ｈｕｐｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３（９）：２９０８－２９１６（２００５）、Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５（１０）：９９７－１０１３（２０１７）、Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ（ｃｉｔｅｄ ａｂｏｖｅ）、Ｍｕｒａｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２５：２２－２９（２０１４）、Ｔｏｄｄ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３（９）：２９０１－２９０７（２００５）、Ｂｅｄｒａｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４（４）：１７４６－１７５９（２０１６）、など。
【0011】
本発明のポリＣオリゴヌクレオチドは、２ヌクレオチド以上の長さを有し得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリＣオリゴヌクレオチドは、２から６０ヌクレオチド、又は２から５０ヌクレオチド、又は２から４０ヌクレオチド、又は２から３０ヌクレオチド、又は２から２０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。他の実施形態では、本発明のポリＣオリゴヌクレオチドは、６から６０ヌクレオチド、又は６から５０ヌクレオチド、又は６から４０ヌクレオチド、又は６から３０ヌクレオチド、又は６から２０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、本発明の開始剤は、６から５０ヌクレオチドの範囲の長さを有し、ポリＣオリゴヌクレオチドは、開始剤配列の５０パーセント以上を構成する。いくつかの実施形態では、本発明のポリＣオリゴヌクレオチドは、合成されたポリヌクレオチドの純度を、ポリＴ開始剤を使用する同等の合成と比較して２０パーセント以上増加させるのに十分な規模の長さ、濃度及び／又は立体配置（すなわち、開始剤のセグメントが開始剤と同じ固体支持体に独立して結合しているか、又は遊離溶液中にあるか）を有する。
【0012】
いくつかの実施形態では、複数のポリＣオリゴヌクレオチドは、大きなオリゴヌクレオチド、例えば、伸長反応混合物の成分である開始剤の中に存在し得る。例えば、開始剤は、非Ｃヌクレオチド、例えば、－ＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴ－（配列番号１５９）、－ＣＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＴ－（配列番号１６０）などによって分離されたいくつかのポリＣオリゴヌクレオチドを含むセグメントを有し得る。いくつかの実施形態では、ポリＣオリゴヌクレオチドのそのような複合体は、製造を容易にするために選択され得る。
【0013】
開始剤（以下でさらに十分に説明する）がポリＣオリゴヌクレオチドを含むときはいつでも、ポリＣオリゴヌクレオチドは開始剤の全部又は一部を含んでいてもよい。異なる実施形態では、ポリＣオリゴヌクレオチドは、以下の構成、すなわち、（ｉ）開始剤の一部として、（ｉｉ）開始剤と同じ合成支持体に結合したオリゴヌクレオチドの一部として、及び（ｉｉｉ）遊離溶液中のオリゴヌクレオチドの一部として、のうちのいずれか又はすべての構成をもって提供され得るいずれの場合も、ポリＣであるオリゴヌクレオチド又は開始剤の部分は、オリゴヌクレオチド又は開始剤全体であり得る。（ｉｉ）に関して、そのようなオリゴヌクレオチドは、５’末端又は３’末端のいずれかを介して合成支持体に結合され得る。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドが５’末端を介して結合されるときはいつでも、その３’末端は、カップリング又は伸長工程の間にヌクレオチドがそれに結合しないようにキャップされる。同様に、（ｉｉｉ）に関して、遊離溶液中のポリＣオリゴヌクレオチドは、カップリング工程又は伸長工程中にヌクレオチドがそれらに結合しないように３’末端がキャップされている。
【0014】
図２Ａ～図２Ｄは、本発明の様々な態様を示す。図２Ａは、オリゴヌクレオチド開始剤（２０２）がその５’末端を介して支持体（２００）に結合している合成支持体（２００）を示す。ポリＧセグメントを含有するポリヌクレオチド（２０８）の合成（２０５）の後、鎖間（２０４）Ｇ４構造が形成され得るか、又は鎖内（２０６）Ｇ４構造が形成されてポリヌクレオチドのさらなる延長を阻害し得る。いくつかの場合（例えば、２０６）では、ポリヌクレオチドの最終的なＧリッチセグメントの合成が起こるまで阻害は起こらず、これによりＧ４の形成が可能になる。したがって、いくつかの実施形態では、遊離溶液ポリＣオリゴヌクレオチドを、（先に引用した）Ｌｏｍｂａｒｄｉらに記載されているようなＧ４予測アルゴリズムを使用して特定のポリヌクレオチドについて特定することができる選択されたカップリング工程においてのみカップリング反応に導入する必要がある。図２Ｂは、ポリＣオリゴヌクレオチドが開始剤の成分である前の段落の実施形態（ｉ）を示す。図２Ｂの上部パネルでは、開始剤（２１０）が合成支持体（２０６）に結合している。各開始剤はポリＣオリゴヌクレオチドセグメント（２１２）を含有する。鎖内Ｇ４構造が形成し始めるところまで合成した後、図２Ｂの下のパネルは、それ自体の、またお互いの相互作用におけるポリヌクレオチドの３つの可能な構成を示す。鎖（２１６）及び鎖（２２６）は、それぞれ（２１４）及び（２３２）に、それらの３’末端のＧ４構造を示しており、これらが、ＴｄＴなどの鋳型フリーポリメラーゼが延長反応に関与するのを阻害する。スタンド（２２２）は、そのポリＧセグメントの一方が開始剤のポリＣ成分と鎖内二本鎖を形成し、それによってその３’末端でのＧ４構造の形成を阻害するポリヌクレオチドを示す。鎖（２１６）及び鎖（２２５）は、鎖（２１６）の開始剤のポリＣ成分と鎖（２２５）のポリＧセグメントの一方との間の鎖間二重鎖の形成を示し、それによって鎖（２２５）の末端でのＧ４構造の形成を妨げる。上述のように、Ｇ－Ｃ二重鎖の形成及び二重鎖状態とＧ４状態との間の鎖の移行（例えば、（２１８）及び（２２０））のために、鋳型フリーポリメラーゼは、そうでなければはるかに低い効率で起こるであろうカップリング反応を触媒するために、成長中の鎖の遊離３’－ヒドロキシルと相互作用する機会を有すると考えられる。
【0015】
図２Ｃは、ポリＣオリゴヌクレオチド（２３６）が、開始剤（２３８）と同じ合成支持体（２０６）に結合した別個のオリゴヌクレオチドとして付与される実施形態を示す。ポリＣオリゴヌクレオチドは、それらの５’末端又はそれらの３’末端のいずれかを介して結合され得るが、それらの５’末端を介して結合される場合、好ましくは、３’末端は、延長工程中に延長されないようにキャップされる（図では「ｘ」として示される）。開始剤及びポリＣオリゴヌクレオチドは、従来の付着化学を用いて結合させることができる。典型的には、両方がそれらの結合末端に反応性部分（例えば、アミン）を有し、ポリＣオリゴヌクレオチドの密度が鎖間二重鎖の形成を可能にするのに十分に高くなるように選択された相対濃度で合成支持体上の相補的部分と反応する。図２Ｃの下のパネルは、合成後（２４０）、鎖内Ｇ４構造、例えば、（２４２）及び（２４４）が形成され得る時点までのポリＣ領域とポリＧ領域との相互作用を示す。この実施形態では、合成される鎖とポリＣオリゴヌクレオチドとの間の鎖間Ｃ－Ｇ二重鎖のみ、例えば、（２４６）及び（２４８）。上記のように、合成された鎖（２３７、２３８、２４３、２４５）に近接するポリＣオリゴヌクレオチドは、二重鎖状態（２４６）及び（２４８）とＧ４状態（２４２）及び（２４４）との間の遷移、例えば、（２４７）及び（２４９）をそれぞれ可能にし、これにより、より効率的な延長反応が起こることを可能にする。
【0016】
図２Ｄは、ポリＣオリゴヌクレオチドが反応混合物の成分として溶液中に付与される実施形態を示す。図２Ｄの上のパネルには、開始剤（２５０）を有し、ポリＣオリゴヌクレオチドのない合成支持体（２０６）が示されている。鎖内Ｇ４構造、例えば、（２５５）及び（２５６）が形成し始める時点までの標的ポリヌクレオチドの合成（２５２）後、複数の延長工程を、ポリＣオリゴヌクレオチド（２５４）を含有する反応混合物中で行うことができる。スタンド（ｓｔａｎｄｓ）（２５８）及び（２５９）について示されるように、溶液中のポリＣオリゴヌクレオチドは、そうでなければＧ４構造に寄与するであろうポリＧセグメントと二重鎖を形成する。
【0017】
ＤＮＡの鋳型フリー酵素合成
一般に、鋳型フリー（又は同等に、「鋳型非依存性」）の酵素的なＤＮＡ合成又はＲＮＡ合成の方法は、図１に示すように、各サイクルにおいて所定のヌクレオチドが開始剤又は成長鎖にカップリングされる工程の反復サイクルを含む。ポリヌクレオチドの鋳型フリー酵素合成の一般的な要素は、以下の参考文献、すなわち、Ｙｂｅｒｔら、国際特許公開第２０１５／１５９０２３号、Ｙｂｅｒｔ他、国際特許公開第２０１７／２１６４７２号、Ｈｙｍａｎ、米国特許第５４３６１４３号、Ｈｉａｔｔら、米国特許第５７６３５９４号、Ｊｅｎｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７：１８２１－１８３２（２０１８）、Ｍａｔｈｅｗｓら、Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＤＯＩ：０．１０３９／ｃ６ｏｂ０１３７１ｆ（２０１６）、Ｓｃｈｍｉｔｚら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔ．，１（１１）：１７２９－１７３１（１９９９）、に記載されている。
一般に、鋳型フリー（又は同等に、「鋳型非依存性」）の酵素的なＤＮＡ合成又はＲＮＡ合成の方法は、図１に示すように、各サイクルにおいて所定のヌクレオチドが開始剤又は成長鎖にカップリングされる工程の反復サイクルを含む。ポリヌクレオチドの鋳型フリー酵素合成の一般的な要素は、以下の参考文献、すなわち、Ｙｂｅｒｔら、国際特許公開第２０１５／１５９０２３号、Ｙｂｅｒｔ他、国際特許公開第２０１７／２１６４７２号、Ｈｙｍａｎ、米国特許第５４３６１４３号、Ｈｉａｔｔら、米国特許第５７６３５９４号、Ｊｅｎｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７：１８２１－１８３２（２０１８）、Ｍａｔｈｅｗｓら、Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＤＯＩ：０．１０３９／ｃ６ｏｂ０１３７１ｆ（２０１６）、Ｓｃｈｍｉｔｚら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔ．，１（１１）：１７２９－１７３１（１９９９）、に記載されている。
【0018】
開始剤ポリヌクレオチド（１００）は、例えば、遊離３’－ヒドロキシル基（１３０）を有する固体支持体（１２０）に結合して付与される。開始剤ポリヌクレオチド（１００）（又は後続のサイクルにおける伸長開始剤ポリヌクレオチド）に対して、開始剤ポリヌクレオチド（１００）（又は伸長開始剤ポリヌクレオチド）の３’末端への３’－Ｏ－保護－ＮＴＰの酵素的取り込みに有効な条件下（１４０）で、通常はＤＮＡ合成のために、３’－Ｏ－保護－ｄＮＴＰ又は３’－Ｏ－保護－ｒＮＴＰ及び鋳型フリーポリメラーゼ、例えば、ＴｄＴ又はそのバリアント（例えば、Ｙｂｅｒｔら、国際公開第２０１７／２１６４７２号、Ｃｈａｍｐｉｏｎら、国際公開第２０１９／１３５００７号）を、あるいは、通常はＲＮＡ合成のために、ポリＡポリメラーゼ（ＰＡＰ）又はポリＵポリメラーゼ（ＰＵＰ）又はそのバリアント（例えば、Ｈｅｉｎｉｓｃｈら、国際公開第２０２１／０１８９１９号）を添加する。この反応は、３’－ヒドロキシルが保護されている伸長開始剤ポリヌクレオチドを生成する（１０６）。伸長配列が完了していない場合、追加の別のサイクルが実施される（１０８）。伸長開始剤ポリヌクレオチドが競合配列を含む場合、３’－Ｏ－保護基を除去又は脱保護することができ、所望の配列を元の開始剤ポリヌクレオチドから切断することができる（１１０）。そのような切断は、様々な一本鎖切断技術のいずれかを使用して、例えば、元の開始剤ポリヌクレオチド内の所定の位置に切断可能なヌクレオチドを挿入することによって行うことができる。例示的な切断可能なヌクレオチドは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼによって切断されるウラシルヌクレオチドであり得る。伸長開始剤ポリヌクレオチドが完了した配列を含まない場合、３’－Ｏ－保護基を除去して遊離３’－ヒドロキシルを露出させ（１０３）、伸長開始剤ポリヌクレオチドをヌクレオチド付加及び脱保護の別のサイクルに供する。
【0019】
本明細書で使用される場合、ヌクレオチド又はヌクレオシドの３’－ヒドロキシルなどの特定の基に関して「保護された」及び「ブロック」という用語は互換的に使用され、化学的又は酵素的プロセス中の基への化学的変化を防ぐ、特定の基に共有結合している部分を意味することを意図している。指定された基がヌクレオシド三リン酸の３’－ヒドロキシル、又は３’保護（又はブロック）ヌクレオシド三リン酸が組み込まれた延長断片（又は「延長中間体」）であるときはいつでも、防止された化学変化は、酵素的カップリング反応による延長断片（又は「延長中間体」）のさらなる又はその後の延長である。
【0020】
本明細書で使用される場合、「開始剤」（又は同等の用語、例えば、「開始断片」、「開始剤核酸」、「開始剤オリゴヌクレオチド」など）は、その末端に遊離３’－ヒドロキシルを有する短いオリゴヌクレオチド配列を指し、これは、ＴｄＴなどの鋳型フリーポリメラーゼによってさらに伸長することができる。一実施形態では、開始断片はＤＮＡ開始断片である。代替的な実施形態では、開始断片はＲＮＡ開始断片である。いくつかの実施形態では、開始断片は、３～１００ヌクレオチド、特に３～２０ヌクレオチドを有し、これらはすべて又は部分的にポリＣであり得る。いくつかの実施形態では、開始断片は一本鎖である。代替的な実施形態では、開始断片は二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、開始剤オリゴヌクレオチドは、その５’末端を介して合成支持体に結合され得、他の実施形態では、開始剤オリゴヌクレオチドは、例えば、共有結合を介して合成支持体に直接結合している相補的オリゴヌクレオチドと二重鎖を形成することによって、合成支持体に間接的に結合し得る。いくつかの実施形態では、合成支持体は、平面状固体の不連続部位であり得るか、又はビーズであり得る固体支持体である。
【0021】
いくつかの実施形態では、開始剤は、ＴｄＴが３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰを結合し得る遊離ヒドロキシルを有する非核酸化合物、例えば、Ｂａｉｇａ、米国特許出願公開第２０１９／００７８０６５号及び米国特許出願公開第２０１９／００７８１２６号を含み得る。
【0022】
ポリＣ含有開始剤が結合する合成支持体は、ポリマー、ビーズ又はミクロスフェアなどの多孔質又は非多孔質固体、ガラススライド、膜などの平面などを含み得る。いくつかの実施形態では、固体支持体又は合成支持体は、磁気ビーズ、アガロースなどの粒子系樹脂などを含み得る。
【0023】
合成支持体としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）支持体、デンドリマー支持体などを含むポリマー支持体などの可溶性支持体、ポリスチレン粒子、Ｄｙｎａｂｅａｄｓなどの非膨潤性固体支持体、アガロースを含む樹脂又はゲルなどの膨潤性固体支持体が挙げられるが、これらに限定されない。合成支持体はまた、フィルタープレートのフィルター膜などの反応チャンバの一部を形成してもよい。可溶性支持体を選択するための指針は、参考文献、Ｂｏｎｏｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１２（５）：１２１３－１２１７（１９９３）、Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：３３２５－３３４４（２００２）、Ｆｉｓｈｍａｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６８：９８４３－９８４６（２００３）、Ｇａｖｅｒｔら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：４８９－５０９（１９９７）；Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５（２２）：４４４７－４４５４（１９９７）、及び同様の参考文献に見出される。固体支持体を選択するための指針は、Ｂｒｏｗｎら、Ｓｙｎｌｅｔｔ １９９８（８）：８１７－８２７、Ｍａｅｔａら、米国特許第９０４５５７３号、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８（１２）：２２２３－２３１１（１９９２）などに見出される。オリゴヌクレオチドを固体支持体に結合させるための指針は、Ａｒｎｄｔ－Ｊｏｖｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４：４１１－４１８（１９７５）、Ｇｈｏｓｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５（１３）：５３５３～５３７２（１９８７）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，‘‘Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ａｔｔａｃｈｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ，’’２０１４（ｖ６）、Ｇｏｋｍｅｎら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７：３６５－４０５（２０１２）、及び同様の参考文献に見出される。
【0024】
いくつかの実施形態では、固相支持体は、典型的には、樹脂又はゲルの形態の多孔質ビーズ又は粒子で構成される。多数の材料が、ポリヌクレオチドの合成のための固相支持体として適している。本明細書で使用される場合、「粒子」という用語は、「微小粒子」又は「ナノ粒子」又は「ビーズ」又は「マイクロビーズ」又は「ミクロスフィア」を含むが、これらに限定されない。本発明において有用な粒子又はビーズとしては、例えば、直径１から３００ミクロン、又は直径２０から３００ミクロン、又は直径３０から３００ミクロンのビーズ、又は直径３００ミクロン超のビーズが挙げられる。ポリＣ含有開始剤を含む粒子は、ガラス、プラスチック、ポリスチレン、樹脂、ゲル、アガロース、セファロース、及び／又は他の適切な材料で作製することができる。特に興味深いのは、多孔性樹脂粒子又はビーズ、例えば、アガロースビーズである。例示的なアガロース粒子としては、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ビーズが挙げられる。いくつかの実施形態では、４０～１６５μｍの範囲の直径を有する臭化シアン活性化４％架橋アガロースビーズを、本発明の方法で使用するためにポリＣ含有開始剤を用いて誘導体化することができる。他の実施形態では、２００～３００μｍの範囲の直径を有する臭化シアン活性化６％架橋アガロースビーズを本発明の方法に使用することができる。後者の２つの実施形態では、５’－アミノリンカーを有するポリＣ含有オリゴヌクレオチド開始剤は、本発明に使用するためにＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ビーズにカップリングされ得る。アガロースビーズのための他の望ましいリンカーとしては、チオール及びエポキシリンカーが挙げられる。
【0025】
いくつかの実施形態では、ポリＣ含有開始剤を用いて誘導体化された多孔性樹脂支持体は、少なくとも１０ｎｍ、又は少なくとも２０ｎｍ、又は少なくとも５０ｎｍの平均孔径を有する。他の実施形態では、そのような多孔性樹脂支持体は、１０ｎｍから５００ｎｍの範囲又は５０ｎｍから５００ｎｍの範囲の平均孔径を有する。
いくつかの実施形態では、ポリＣ含有開始剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨｏｒｇａｎら、国際公開第２０２０／０２０６０８号に記載されているように、試薬のインクジェット送達を介して、オリゴヌクレオチドの大規模並列合成のために平面支持体に結合される。いくつかの実施形態では、そのような平面支持体は、保護された３’－ヒドロキシルを有するポリＣ含有開始剤の均一なコーティングを含み、例えば、別個の反応部位は、別個の位置に脱保護溶液を送達することによって画定され得る。他の実施形態では、このような平面支持体は、各々がポリＣ含有開始剤を含有する一連の不連続な反応部位を含み、これは、例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ、米国特許第５４７４７９６号、Ｐｅｃｋら、米国特許第１０３８４１８９号、Ｉｎｄｅｒｍｕｈｌｅら、米国特許第１０６６９３０４号、Ｆｉｘｅら、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ。Ｖｏｌｕｍｅ ７２３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ－Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉａ（サンフランシスコ、カリフォルニア州、２００２年４月２～５日）、又は同様の参考文献のフォトリソグラフィ法によって形成することができる。
いくつかの実施形態では、ポリＣ含有開始剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨｏｒｇａｎら、国際公開第２０２０／０２０６０８号に記載されているように、試薬のインクジェット送達を介して、オリゴヌクレオチドの大規模並列合成のために平面支持体に結合される。いくつかの実施形態では、そのような平面支持体は、保護された３’－ヒドロキシルを有するポリＣ含有開始剤の均一なコーティングを含み、例えば、別個の反応部位は、別個の位置に脱保護溶液を送達することによって画定され得る。他の実施形態では、このような平面支持体は、各々がポリＣ含有開始剤を含有する一連の不連続な反応部位を含み、これは、例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ、米国特許第５４７４７９６号、Ｐｅｃｋら、米国特許第１０３８４１８９号、Ｉｎｄｅｒｍｕｈｌｅら、米国特許第１０６６９３０４号、Ｆｉｘｅら、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ。Ｖｏｌｕｍｅ ７２３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ－Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉａ（サンフランシスコ、カリフォルニア州、２００２年４月２～５日）、又は同様の参考文献のフォトリソグラフィ法によって形成することができる。
【0026】
合成が完了した後、所望のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、切断によって開始剤及び固体支持体から放出され得る。多種多様な切断可能な結合又は切断可能なヌクレオチドがこの目的のために使用され得る。いくつかの実施形態では、所望のポリヌクレオチドを切断すると、切断された鎖上に天然の遊離５’－ヒドロキシルが残るが、代替の実施形態では、切断工程は、後続の工程で、例えば、ホスファターゼ処理によって除去され得る部分、例えば、５’－リン酸を残し得る。切断工程は、化学的、熱的、酵素的又は光化学的方法によって実施され得る。いくつかの実施形態では、切断可能なヌクレオチドは、特定のグリコシラーゼ（例えば、それぞれ、ウラシルデオキシグリコシラーゼとそれに続くエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ及び８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ）によって認識されるデオキシウリジン又は８－オキソ－デオキシグアノシンなどのヌクレオチド類似体であり得る。いくつかの実施形態では、切断は、最後から２番目の３’ヌクレオチドであるデオキシイノシンを開始剤に付与することによって達成され得、これは、開始剤の３’末端でエンドヌクレアーゼＶによって切断され、放出されたポリヌクレオチド上に５’－リン酸を残し得る。一本鎖ポリヌクレオチドを切断するためのさらなる方法は、参照により組み込まれる以下の参考文献、すなわち、米国特許第５，７３９，３８６号、同第５，７００，６４２号、同第５，８３０，６５５号、及び米国特許出願公開第２００３／０１８６２２６号及び同第２００４／０１０６７２８号、及びＵｒｄｅａ及びＨｏｒｎの米国特許第５３６７０６６号に開示されている。
【0027】
いくつかの実施形態では、グリコシラーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼによる切断は、二本鎖ＤＮＡ基質を必要とし得る。
【0028】
図１に戻ると、いくつかの実施形態では、各合成工程において、３’－Ｏ－保護されたＮＴＰの存在下で、ＴｄＴなどの鋳型フリーポリメラーゼを使用して、並べられた一連のヌクレオチドを開始剤核酸にカップリングさせる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドを合成する方法は、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有する開始剤を付与する工程（１００）と、（ｂ）３’－Ｏ－保護ヌクレオシド三リン酸の存在下、延長条件下で開始剤又は遊離３’－ヒドロキシルを有する延長中間体を鋳型フリーポリメラーゼと反応させて（１０４）、３’－Ｏ－保護延長中間体を生成する工程（１０６）と、（ｃ）延長中間体を脱保護して、遊離３’－ヒドロキシルを有する延長中間体を生成する工程（１０８）と、（ｄ）ポリヌクレオチドが合成されるまで工程（ｂ）及び（ｃ）を繰り返す工程（１１０）とを含む（「延長中間体」及び「伸長断片」という用語は互換的に使用される場合がある）。いくつかの実施形態では、開始剤は、例えば、その５’末端を介して固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドとして付与される。上記の方法はまた、各反応又は延長工程の後、並びに各脱保護工程の後に洗浄工程を含み得る。例えば、反応させる工程は、所定のインキュベーション期間又は反応時間を経た後に、例えば、洗浄によって、組み込まれていないヌクレオシド三リン酸を除去するサブ工程を含み得る。そのような所定のインキュベーション期間又は反応時間は、典型的には、数秒、例えば、３０秒から数分、例えば、３０分であり得る。
【0029】
合成支持体上のポリヌクレオチドの配列が逆相補部分配列を含む場合、逆相補領域相互間の水素結合の形成によって二次分子内構造又は交差分子構造が作り出され得る。いくつかの実施形態では、環外アミンのための塩基保護部分は、保護された窒素の水素が水素結合に関与することができず、それにより、そのような二次構造の形成が妨げられるように選択される。すなわち、塩基保護部分は、通常の塩基対形成において形成されるような、例えば、ヌクレオシドＡとＴとの間及びヌクレオシドＧとＣとの間の水素結合の形成を防止するために使用され得る。合成の終わりに、塩基保護部分は除去され得、ポリヌクレオチド生成物は、固体支持体から、例えば、その開始剤から切断することによって切断され得る。
【0030】
塩基保護基を有する３’－Ｏ－ブロックＮＴＰモノマーを形成することに加えて、熱安定性鋳型フリーポリメラーゼを使用して高温で伸長反応を行うことができる。例えば、４０℃超で活性を有する熱安定性鋳型フリーポリメラーゼを使用することができ、又は、いくつかの実施形態では、４０～８５℃の範囲で活性を有する熱安定性鋳型フリーポリメラーゼを使用することができ、又は、いくつかの実施形態では、４０～６５℃の範囲で活性を有する熱安定性鋳型フリーポリメラーゼを使用することができる。
【0031】
いくつかの実施形態では、伸長条件は、水素結合又は塩基スタッキングを阻害する溶媒を伸長反応混合物に添加することを含み得る。このような溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノールなどの低誘電率の水混和性溶媒が挙げられる。同様に、いくつかの実施形態では、伸長条件は、ｎ－ブタノール、エタノール、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２－プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、尿素などを含むがこれらに限定されないカオトロピック剤を付与することを含み得る。いくつかの実施形態では、伸長条件は、二次構造抑制量のＤＭＳＯの存在を含む。いくつかの実施形態では、伸長条件は、二次構造の形成を阻害するＤＮＡ結合タンパク質を付与することを含むことができ、かかるタンパク質としては、一本鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、ＤＮＡグリコラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0032】
塩基が保護されていない３’－Ｏ－ブロック化ｄＮＴＰは、商業的供給業者から購入することができ、又は公開されている技術、例えば、米国特許第７０５７０２６号、Ｇｕｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０５（２７）：９１４５－９１５０（２００８）、Ｂｅｎｎｅｒ、米国特許第７５４４７９４号及び同第８２１２０２０号、国際特許公開第２００４／００５６６７号、国際特許公開第９１／０６６７８号、Ｃａｎａｒｄら、Ｇｅｎｅ（本明細書で引用）、Ｍｅｔｚｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４２５９－４２６７（１９９４）、Ｍｅｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１４：３２４８－３２５２（３００６）、米国特許公開第２００５／０３７９９１号を用いて合成することができる。塩基が保護された３’－Ｏ－ブロック化ｄＮＴＰは、以下に記載されるように合成することができる。
【0033】
塩基が保護されたｄＮＴＰが使用される場合、図１の方法は、塩基保護部分を除去する工程（ｅ）をさらに含み得、アシル又はアミジン保護基の場合、（例えば、）濃アンモニアで処理することを含み得る。
【0034】
上記の方法はまた、反応工程又は延長工程の後の洗浄工程に加えて、１つ以上のキャッピング工程を含んでいてもよい。第１のキャッピング工程は、部分的に合成されたポリヌクレオチド上の未反応の３’－ＯＨ基をキャッピングするか、又はさらなる延長に対して不活性にしてもよい。このようなキャッピング工程は、通常、カップリング工程の後に実施され、キャッピング化合物が使用されるときはいつでも、成長する鎖にカップリングしたばかりのモノマーの保護基と反応しないように選択される。いくつかの実施形態では、そのようなキャッピング工程は、部分的に合成されたポリヌクレオチドをさらなるカップリング、例えば、ＴｄＴとのカップリングが不可能にするキャッピング化合物を（例えば、第２の酵素カップリング工程によって）カップリングすることによって実施され得る。そのようなキャッピング化合物は、ジデオキシヌクレオシド三リン酸であり得る。他の実施形態では、遊離３’－ヒドロキシルを有する非延長鎖は、それらを３’－エキソヌクレアーゼ活性、例えば、Ｅｘｏ Ｉで処理することによって分解され得、例えば、Ｈｙｍａｎの米国特許第５４３６１４３号を参照されたい。同様に、いくつかの実施形態では、デブロッキングに失敗した鎖を処理して、鎖を除去するか、又はさらなる延長に対して不活性にすることができる。影響を受けたストランドをその後の任意の３’－Ｏ保護基又はブロッキング基のカップリング又は脱保護から不活性にするために、脱保護工程の後に第２のキャッピング工程を実施することができる。そのような第２のキャッピング工程のキャッピング化合物は、存在し得る遊離３’－ヒドロキシルと反応しないように選択される。いくつかの実施形態では、そのような第２のキャッピング化合物は、アルデヒド基と疎水性基とのコンジュゲートであり得る。後者の基は、疎水性に基づく分離を可能にする、例えば、Ａｎｄｒｕｓ、米国特許第５０４７５２４号。
【0035】
伸長工程（延長工程又はカップリング工程とも呼ばれる）の例示的な反応条件は、以下、２．０～２０μＭの精製ＴｄＴ、１２５～６００μＭの３’－Ｏ－ブロック化ｄＮＴＰ（例えば、３’－Ｏ－ＮＨ２－ブロック化ｄＮＴＰ）、約１０から約５００ｍＭのカコジル酸カリウム緩衝液（６．５～７．５のｐＨ）、及び約０．０１から約１０ｍＭの二価カチオン（例えば、ＣｏＣｌ２又はＭｎＣｌ２）、を含み、ここで、伸長反応は、５０μＬの反応容積中、室温から４５℃の範囲内の温度で３～５分間実施され得る。３’－Ｏ－ブロック化ｄＮＴＰが３’－Ｏ－ＮＨ２－ブロック化ｄＮＴＰである実施形態では、デブロッキング工程のための反応条件は、以下、７００～１５００ｍＭのＮａＮＯ２、５００～１０００ｍＭの酢酸ナトリウム（酢酸を用いて４．８～６．５の範囲のｐＨに調整）を含み得、ここで、デブロッキング化反応は、５０μＬの容積中、室温から４５℃の範囲内の温度で、３０秒から数分間実施され得る。カップリング反応の成分（例えば、酵素、モノマー、二価カチオン）を含まないカコジル酸緩衝液を用いて洗浄を行うことができる。
【0036】
特定の用途に応じて、デブロッキング及び／又は切断の工程は、様々な化学的又は物理的条件、例えば、光、熱、ｐＨ、特定の試薬、例えば、特定の化学結合を切断することができる酵素、の存在を含み得る。３’－Ｏ－ブロッキング基及び対応するデブロッキング条件を選択する際の指針は、参照により組み込まれる以下の参考文献、すなわち、Ｂｅｎｎｅｒ、米国特許第７５４４７９４号及び同第８２１２０２０号、米国特許第５８０８０４５号、米国特許第８８０８９８８号、国際特許公開第９１／０６６７８号、及び以下に引用される参考文献に見出すことができる。いくつかの実施形態では、切断剤（デブロッキング試薬又はデブロッキング剤と呼ばれることもある）は、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの化学的切断剤である。代替の実施形態では、切断剤は、３’－リン酸ブロッキング基を切断し得る、例えば、ホスファターゼなどの酵素切断剤であり得る。デブロッキング剤の選択は、使用される３’－ヌクレオチドブロッキング基の種類、１つ又は複数のブロッキング基が使用されているかどうか、開始剤が生細胞若しくは生物に結合しているのか又は固体支持体に結合しているのかどうかなどに依存し、穏やかな処理を必要とすることを当業者であれば理解するであろう。例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などのホスフィンを使用して３’Ｏ－アジドメチル基を切断することができ、パラジウム錯体を使用して３’Ｏ－アリル基を切断することができ、又は亜硝酸ナトリウムを使用して３’Ｏ－アミノ基を切断することができる。特定の実施形態では、切断反応は、ＴＣＥＰ、パラジウム錯体又は亜硝酸ナトリウムを含む。
【0037】
上述したように、いくつかの実施形態では、直交デブロッキング条件を使用して除去することができる２つ以上のブロッキング基を使用することが望ましい。以下の例示的なブロッキング基の対は、並列合成の実施形態で使用することができる。本発明のこれらの実施形態で使用するために、他のブロッキング基対、又は３つ以上を含む基が利用可能であり得ることが理解される。
【0038】
生細胞上でオリゴヌクレオチドを合成するには、穏やかなデブロック又は脱保護条件、すなわち、細胞膜を破壊せず、タンパク質を変性させず、重要な細胞機能を妨害しない条件などが求められる。いくつかの実施形態では、脱保護条件は、細胞生存に適合する生理学的条件の範囲内である。そのような実施形態では、酵素的脱保護は、生理学的条件下で行われ得ることから望ましい。いくつかの実施形態では、特定の酵素的に除去可能なブロッキング基は、それらの除去のために特定の酵素と会合する。例えば、エステル系又はアシル系ブロッキング基は、アセチルエステラーゼなどのエステラーゼ又は同様の酵素で除去することができ、リン酸ブロッキング基は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼなどの３’ホスファターゼで除去することができる。例として、３’－Ｏ－リン酸を、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び１ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの溶液による処理によって除去することができる。反応は３７℃の温度で１分間進行する。
【0039】
いくつかの実施形態では、３’－Ｏ－ブロッキング基は、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ＮＨ２、３’－Ｏ－アリルを含み、いくつかの実施形態では、ブロッキング基は、３’－Ｏ－メチル、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）、３’－Ｏ－アリル、３’－Ｏ－アミン、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブトキシエトキシ、３’－Ｏ－（２－シアノエチル）、３’－Ｏ－ニトロ、及び３’－Ｏ－プロパルギルを含む。他の実施形態では、３’－ブロックヌクレオチド三リン酸は、３’－Ｏ－アジドメチル又は３’－Ｏ－ＮＨ２のいずれかによってブロックされる。そのような３’－ブロックヌクレオシド三リン酸の合成及び使用は、以下の参考文献、すなわち、米国特許第９４１０１９７号、同第８８０８９８８号、同第６６６４０９７号、同第５７４４５９５号、同第７５４４７９４号、同第８０３４９２３号、同第８２１２０２０号、同第１０４７２３８３号、Ｇｕｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０５（２７）：９１４５－９１５０（２００８）、及び同様の参考文献に開示されている。
【0040】
特定の用途に応じて、デブロッキング及び／又は切断の工程は、様々な化学的又は物理的条件、例えば、光、熱、ｐＨ、特定の試薬、例えば、特定の化学結合を切断することができる酵素、の存在を含み得る。３’－Ｏ－ブロッキング基及び対応するデブロッキング条件の選択の指針は、Ｗｕｔｓ，Ｇｒｅｅｎ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ ２０１４）などの参考文献に見出すことができる。いくつかの実施形態では、切断剤（デブロッキング試薬又はデブロッキング剤と呼ばれることもある）は、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの化学的切断剤である。代替の実施形態では、切断剤は、３’－リン酸ブロッキング基を切断し得る、例えば、ホスファターゼなどの酵素切断剤であり得る。デブロッキング剤の選択は、使用される３’－ヌクレオチドブロッキング基の種類、１つ又は複数のブロッキング基が使用されているかどうか、開始剤が生細胞若しくは生物に結合しているのか又は固体支持体に結合しているのかどうかなどに依存し、穏やかな処理を必要とすることを当業者であれば理解するであろう。例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などのホスフィンを使用して３’Ｏ－アジドメチル基を切断することができ、パラジウム錯体を使用して３’Ｏ－アリル基及び３’－Ｏ－プロパルギル基を切断することができ、又は亜硝酸ナトリウムを使用して３’Ｏ－アミノ基を切断することができる。
【0041】
ＲＮＡの鋳型フリー酵素合成
本発明の方法は、ＲＮＡの酵素合成を含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、鋳型フリーポリメラーゼとしてポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）又はポリ（Ｕ）ポリメラーゼを使用する図１に記載の工程を含む。いくつかの実施形態では、３’－Ｏ－可逆的保護ｒＮＴＰ前駆体を使用してポリリボ核酸を合成するために、ＰＡＰ及び／又はＰＵＰが使用され、単一のＰＵＰ又はＰＡＰバリアントは、すべてのリボヌクレオシド三リン酸モノマーをカップリングするために使用することができ、又は代替の実施形態において使用することができる。いくつかの実施形態では、特定のＲＮＡの合成において異なる種類のリボヌクレオシド三リン酸モノマーをカップリングするために、異なるＰＵＰ及びＰＡＰを使用することができる。同様に、他の実施形態では、ＰＡＰ及び／又はＰＵＰを使用して、３’－Ｏ－可逆的保護ｄＮＴＰ前駆体を使用してポリデオキシリボ核酸を合成することができ、ここで、単一のＰＵＰ又はＰＡＰが、すべてのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）モノマーをカップリングするために使用され、又は代替の実施形態では、異なるＰＵＰ及びＰＡＰポリメラーゼが、異なる種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸モノマーをカップリングするために使用することができる。ＲＮＡ合成のためのいくつかの実施形態では、デオキシリボヌクレオチドについて上述したのと同じ３’－Ｏ－可逆的保護基をリボヌクレオチドモノマーと共に使用することもできる。ＲＮＡ合成のためのいくつかの実施形態では、上記３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸は、３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸である。いくつかの実施形態では、方法は、例えば、以下に記載されるように、３’－Ｏ－ブロックリボヌクレオシド三リン酸及び３’－Ｏ－ブロック－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸を合成において成長中のポリヌクレオチド鎖にカップリングする効率を改善するために遺伝子工学によって改変されたＰＡＰ及び／又はＰＵＰバリアントを使用することができる。
本発明の方法は、ＲＮＡの酵素合成を含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、鋳型フリーポリメラーゼとしてポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）又はポリ（Ｕ）ポリメラーゼを使用する図１に記載の工程を含む。いくつかの実施形態では、３’－Ｏ－可逆的保護ｒＮＴＰ前駆体を使用してポリリボ核酸を合成するために、ＰＡＰ及び／又はＰＵＰが使用され、単一のＰＵＰ又はＰＡＰバリアントは、すべてのリボヌクレオシド三リン酸モノマーをカップリングするために使用することができ、又は代替の実施形態において使用することができる。いくつかの実施形態では、特定のＲＮＡの合成において異なる種類のリボヌクレオシド三リン酸モノマーをカップリングするために、異なるＰＵＰ及びＰＡＰを使用することができる。同様に、他の実施形態では、ＰＡＰ及び／又はＰＵＰを使用して、３’－Ｏ－可逆的保護ｄＮＴＰ前駆体を使用してポリデオキシリボ核酸を合成することができ、ここで、単一のＰＵＰ又はＰＡＰが、すべてのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）モノマーをカップリングするために使用され、又は代替の実施形態では、異なるＰＵＰ及びＰＡＰポリメラーゼが、異なる種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸モノマーをカップリングするために使用することができる。ＲＮＡ合成のためのいくつかの実施形態では、デオキシリボヌクレオチドについて上述したのと同じ３’－Ｏ－可逆的保護基をリボヌクレオチドモノマーと共に使用することもできる。ＲＮＡ合成のためのいくつかの実施形態では、上記３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸は、３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸である。いくつかの実施形態では、方法は、例えば、以下に記載されるように、３’－Ｏ－ブロックリボヌクレオシド三リン酸及び３’－Ｏ－ブロック－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸を合成において成長中のポリヌクレオチド鎖にカップリングする効率を改善するために遺伝子工学によって改変されたＰＡＰ及び／又はＰＵＰバリアントを使用することができる。
【0042】
いくつかの実施形態では、所定の配列のオリゴリボヌクレオチドを合成する方法は、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有する開始剤を付与する工程と、（ｂ）３’－Ｏ－ブロックリボヌクレオシド三リン酸の存在下、伸長条件下で開始剤又は遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片をＰＡＰ又はＰＵＰと反応させて、３’－Ｏ－ブロック伸長断片を生成する工程と、（ｃ）伸長断片をデブロッキングして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片を生成する工程と、（ｄ）所定の配列のポリリボヌクレオチドが合成されるまで工程（ｂ）及び（ｃ）を繰り返す工程とを含み、ここで、開始剤又は伸長断片を伸長させるための反応混合物が、ポリヌクレオチドと二重鎖を形成することができるポリＣオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、開始剤はそれぞれ、ポリＣオリゴヌクレオチドからなるセグメントを含む。他の実施形態では、最終的に開始剤に加えて、それに結合したポリＣオリゴヌクレオチドを有する合成支持体が提供される。さらに他の実施形態では、ポリＣオリゴヌクレオチドは、Ｇ４構造形成が起こる可能性が高い選択された伸長サイクルのための伸長反応混合物の成分として溶液中に付与される。
【0043】
いくつかの実施形態では、上記のように、開始剤は、例えば、その５’末端を介して固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドとして付与される。上記の方法はまた、反応工程又は延長工程の後、並びにデブロッキング工程の後に洗浄工程を含んでいてもよい。例えば、反応させる工程は、所定のインキュベーション期間又は反応時間を経た後に、例えば、洗浄によって、組み込まれていないリボヌクレオシド三リン酸を除去するサブ工程を含み得る。そのような所定のインキュベーション期間又は反応時間は、数秒、例えば、３０秒から数分、例えば、３０分であり得る。
【0044】
上記の方法はまた、反応工程又は延長工程の後、並びにデブロッキング工程の後に、洗浄工程だけでなくキャップ工程を含んでいてもよい。上述のように、いくつかの実施形態では、非延長遊離３’－ヒドロキシルを、キャップされた鎖のさらなる延長を防止する化合物と反応させるキャップ工程を含めることができる。いくつかの実施形態では、そのような化合物は、ジデオキシヌクレオシド三リン酸であり得る。他の実施形態では、遊離３’－ヒドロキシルを有する非延長鎖は、それらを３’－エキソリボヌクレアーゼ活性、例えば、ＲＮａｓｅ Ｒ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で処理することによって分解され得る。同様に、いくつかの実施形態では、デブロッキングに失敗した鎖を処理して、鎖を除去するか、又はさらなる延長に対して不活性にすることができる。
【0045】
ＰＡＰ又はＰＵＰを使用する延長又は伸長工程のための例示的な反応条件は、以下を含む。反応条件１（プライマー＋ＡＭ－ｒＡＴＰについて）：２５０ｕＭのＡＭ－ｒＡＴＰ、０．１ｕＭのＡＴＴＯ４８８－（ｒＡ）５、１ｕＭのＰＡＰ、１×ＡＴＰ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．６ｍＭのＭｎＣｌ２、０．０２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡ、１０％グリセロール、１００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７～８）、３７Ｃ、３０分。反応条件２（プライマー＋ＡＭ－ｒＧＴＰについて）：２５０ｕＭのｒＧＴＰ、０．１ｕＭのＡＴＴＯ４８８－（ｒＡ）５、１ｕＭのＰＡＰ、１×ＧＴＰ緩衝液（０．６ｍＭＭｎＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ６）、３７Ｃ、３０分。前述において、「ＡＭ－ｒＮＴＰ」は３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸を指す。
【0046】
ポリヌクレオチド合成のための鋳型フリーポリメラーゼ
様々な異なる鋳型フリーポリメラーゼが、本発明の方法における使用のために利用可能である。鋳型フリーポリメラーゼとしては、例えば、以下の参考文献、すなわち、Ｙｂｅｒｔら、国際特許公開第２０１７／２１６４７２号、Ｃｈａｍｐｉｏｎら、米国特許第１０４３５６７６号、Ｃｈａｍｐｉｏｎら、国際公開第２０２０／０９９４５１号、Ｈｅｉｎｉｓｃｈら、国際特許公開第２０２１／０１８９１９号に記載されている、ｐｏｌＸファミリーポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼβ、λ及びμを含む）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ（ＰＵＰ）、ＤＮＡポリメラーゼθなどが挙げられるが、これらに限定されない。特に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）及びそのバリアントは、鋳型フリーＤＮＡ合成に有用であり、ＰＡＰ及びＰＵＰ及びそのバリアントは、鋳型フリーＲＮＡ合成に有用である。
様々な異なる鋳型フリーポリメラーゼが、本発明の方法における使用のために利用可能である。鋳型フリーポリメラーゼとしては、例えば、以下の参考文献、すなわち、Ｙｂｅｒｔら、国際特許公開第２０１７／２１６４７２号、Ｃｈａｍｐｉｏｎら、米国特許第１０４３５６７６号、Ｃｈａｍｐｉｏｎら、国際公開第２０２０／０９９４５１号、Ｈｅｉｎｉｓｃｈら、国際特許公開第２０２１／０１８９１９号に記載されている、ｐｏｌＸファミリーポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼβ、λ及びμを含む）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ（ＰＵＰ）、ＤＮＡポリメラーゼθなどが挙げられるが、これらに限定されない。特に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）及びそのバリアントは、鋳型フリーＤＮＡ合成に有用であり、ＰＡＰ及びＰＵＰ及びそのバリアントは、鋳型フリーＲＮＡ合成に有用である。
【0047】
いくつかの実施形態では、３’－Ｏ－修飾ヌクレオシド三リン酸に関して増加した取り込み活性を示すＴｄＴバリアントを本発明で使用する。例えば、そのようなＴｄＴバリアントは、参照によって本明細書中に組み込まれるＣｈａｍｐｉｏｎらの米国特許第１０４３５６７６号に記載される技術を使用して作製することができる。いくつかの実施形態では、配列番号７～２０（両端を含む）及び配列番号２４～３９（両端を含む）のいずれかのアミノ酸配列を有するＴｄＴと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有し、１つ以上の表１に列挙される置換を有するＴｄＴバリアントが使用され、ここで、ＴｄＴバリアントは、（ｉ）鋳型なしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）核酸断片の遊離３’－ヒドロキシルに３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを組み込むことができる。いくつかの実施形態では、上記のＴｄＴバリアントは、表１に列挙されたすべての位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、示された配列番号と少なくとも８５％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、示された配列番号と少なくとも９０％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、示された配列番号と少なくとも９５％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９７％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９８％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９９％の同一性である。本明細書で使用される場合、参照配列をバリアント配列と比較するために使用される同一性パーセント値は、バリアント配列の置換を含む明示的に指定されたアミノ酸位置を含まない。すなわち、同一性パーセントの関係は、参照タンパク質の配列と、バリアントタンパク質の、そのバリアント中の置換を含む明示的に指定された位置を除く配列との間のものである。したがって、例えば、参照配列及びバリアント配列がそれぞれ１００個のアミノ酸を含み、バリアント配列が２５及び８１の位置に変異を有する場合、パーセント相同性は配列１～２４、２６～８０及び８２～１００に関するものとなる。
【0048】
いくつかの実施形態では、本発明のＴｄＴバリアントは、配列番号４０～７５（両端を含む）から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列、及び表１に列挙される１つ以上の置換を含むＴｄＴに由来し、ここで、ＴｄＴバリアントは、（ｉ）鋳型なしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）核酸断片の遊離３’－ヒドロキシルに３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドを組み込むことができる。いくつかの実施形態では、上記のＴｄＴバリアントは、表２に列挙されたすべての位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、示された配列番号と少なくとも８５％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、示された配列番号と少なくとも９０％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、示された配列番号と少なくとも９５％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９７％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９８％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９９％の同一性である。上記のように、参照配列をバリアント配列と比較するために使用される同一性パーセント値は、バリアント配列の置換を含む明示的に指定されたアミノ酸位置を含まない。すなわち、同一性パーセントの関係は、参照タンパク質の配列と、バリアントタンパク質の、そのバリアント中の置換を含む明示的に指定された位置を除く配列との間のものである。
【0049】
配列番号４０～５４（５６、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７０、７３及び７４を含む）のＴｄＴバリアントは、４位（又は機能的に等価な位置）のグルタミンの安定化置換に加えて、表２に列挙されるように、示された１つ以上のアミノ酸位置に置換を含む。他の実施形態では、本発明のＴｄＴバリアントは、表２に列挙されるものなどの天然ＴｄＴに由来し、４位のグルタミンの安定化置換に加えて、１つおきの示されたアミノ酸位置に置換を有する。いくつかの実施形態では、グルタミンに置換されたそのような安定化アミノ酸は、Ｅ、Ｓ、Ｄ及びＮからなる群から選択される。他の実施形態では、安定化アミノ酸はＥである。
【0050】
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用するためのさらなるＴｄＴバリアントは、表２に示すように、メチオニン、システイン、アルギニン（第１位）、アルギニン（第２位）又はグルタミン酸の１つ以上の置換を含む。
【0051】
いくつかの実施形態では、配列番号５５、５７、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７１、７２、及び７５から１１２（両端を含む）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＴｄＴバリアントもまた、本発明に使用され得る。
【0052】
配列番号７～１１２のＴｄＴバリアントに関して、いくつかの実施形態では、３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドは、３’－Ｏ－ＮＨ２－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アリル－ヌクレオシド三リン酸、３’Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ヌクレオシド三リン酸、又は３’－Ｏ－プロパルギル－ヌクレオシド三リン酸を含み得る。
【0053】
３’－Ｏ－保護ｒＮＴＰ（３’－Ｏ－アジドメチルなどの特定の保護基を含む）のより高い取り込み速度、より大きな安定性及び貯蔵寿命、熱安定性、溶解度などの改善された特性のために操作されたＰＡＰバリアントを含む、多種多様なＰＡＰを本発明の方法に使用することができる。特に、Ｍ３１０（配列番号１）に変異を有する酵母ＰＡＰ、又は他のＰＡＰにおける機能的に等価な残基、例えば、種々の異なる種に由来するＰＡＰは、野生型ＰＡＰと比較して３’－Ｏ－保護ｒＮＴＰの取り込みの改善を示す。いくつかの実施形態では、本発明の酵母ＰＡＰバリアントは、Ｍ３１０における置換を除いて配列番号１のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、そのような置換は、Ｍ３１０Ｆ／Ｙ／Ｖ／Ｅ／Ｔから選択される。特に、置換Ｍ３１０Ｆ／Ｙは、３’－Ｏ－アミノ－ｒＡＴＰの取り込みを可能にし、置換Ｍ３１０Ｖ／Ｅ／Ｔは、３’－Ｏ－保護ｒＧＴＰの取り込み速度を改善する。他の実施形態では、本発明の酵母ＰＡＰバリアントは、Ｍ３１０における置換を除いて配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【0054】
本発明で使用するためのＰＡＰバリアントとしては、下記の表３に列挙されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＰＡＰバリアントは、表３に示される第２位に少なくとも１つの置換を含む。他の実施形態では、本発明のＰＡＰバリアントの実施形態は、表３に示される第１位に少なくとも１つの置換を含む。
【0055】
いくつかの実施形態では、表３に示されるような第１位における置換は、Ａ又はＧである（したがって、例えば、配列番号１１３について、置換はＶ２３４Ａ／Ｇと書くことができる）。いくつかの実施形態では、表３に示されるような第２位における置換は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｅ又はＴである（したがって、例えば、配列番号１１３について、置換はＭ３１０Ｆ／Ｙ／Ｖ／Ｅ／Ｔと書くことができる）。
【0056】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＡＰバリアントは、表３の置換の１つ以上を有し、示された配列番号と少なくとも８０％の同一性を有し、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、示された配列番号と少なくとも９０％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、示された配列番号と少なくとも９５％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９７％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９８％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９９％の同一性である。
【0057】
いくつかの実施形態では、合成されるＲＮＡ又はＤＮＡ中の二次構造の形成を低減又は排除する温度で方法が実施され得るように、熱安定性ＰＡＰが使用される。いくつかの実施形態では、熱安定性ＰＡＰについて最も高い取り込み速度が生じる温度範囲は４０℃より高い。いくつかの実施形態では、熱安定性ＰＡＰについて最も高い取り込み速度が生じる温度範囲は、５０℃より高い。いくつかの実施形態では、熱安定性ＰＡＰについて最も高い取り込み速度が生じる温度範囲は、４０℃～８５℃である。いくつかの実施形態では、熱安定性ＰＡＰについて最も高い取り込み速度が生じる温度範囲は、５０℃～８５℃の間である。
【0058】
ＰＡＰと同様に、３’－Ｏ－保護－ｒＮＴＰのより高い取り込み速度（３’－Ｏ－アジドメチルなどの特定の保護基を含む）、より大きな安定性及び貯蔵寿命、熱安定性、溶解度などの改善された特性のために操作されたＰＵＰバリアントを含む、多種多様なＰＵＰを本発明の方法に使用することができる。本発明で使用するためのＰＵＰバリアントには、以下の表４に列挙されるものが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のＰＵＰバリアントは、表４に示される第１位に少なくとも１つの置換を含む。他の実施形態では、本発明のＰＵＰバリアントの実施形態は、表４に示される第２位に少なくとも１つの置換を含む。
【0059】
いくつかの実施形態では、表４に示されるような第１位における置換は、Ａ又はＧである（したがって、例えば、配列番号１３６について、置換はＹ２１２Ａ／Ｇと書くことができる）。いくつかの実施形態では、表４に示されるような第２位における置換は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｅ又はＴである（したがって、例えば、配列番号４について、置換は、Ｈ３３６Ｆ／Ｙ／Ｖ／Ｅ／Ｔと書くことができる）。
【0060】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＵＰバリアントは、表４の置換の１つ以上を有し、示された配列番号と少なくとも８０％の同一性を有し、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、示された配列番号と少なくとも９０％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、示された配列番号と少なくとも９５％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９７％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９８％の同一性であり、いくつかの実施形態では、上記の同一性パーセント値は、少なくとも９９％の同一性である。
【0061】
いくつかの実施形態では、合成されるＲＮＡ又はＤＮＡ中の二次構造の形成を低減又は排除する温度で方法が実施され得るように、熱安定性ＰＵＰが使用される。いくつかの実施形態では、熱安定性ＰＵＰについて最も高い取り込み速度が生じる温度範囲は４０℃より高い。いくつかの実施形態では、熱安定性ＰＵＰについて最も高い取り込み速度が生じる温度範囲は５０℃より高い。いくつかの実施形態では、熱安定性ＰＵＰについて最も高い取り込み速度が生じる温度範囲は、４０℃～８５℃である。いくつかの実施形態では、熱安定性ＰＵＰについて最も高い取り込み速度が生じる温度範囲は、５０℃～８５℃である。
【0062】
本発明で使用するためのＴｄＴ、ＰＡＰ及びＰＵＰバリアントはそれぞれ、示された置換が存在することを条件として、特定の配列番号と配列同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、この様式で記載される本発明のバリアントと指定された配列番号との間の配列の相違の数及び種類は、置換、欠失及び／又は挿入によるものであり得、置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸は、任意のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような欠失、置換及び／又は挿入は、天然に存在するアミノ酸のみを含む。いくつかの実施形態では、置換は、Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８５：８６２－８６４（１９７４）に記載されているように、保存的アミノ酸変化又は同義語アミノ酸変化のみを含む。すなわち、アミノ酸の置換は、その同義アミノ酸のセットのメンバーの間でのみ起こり得る。いくつかの実施形態では、使用され得る同義アミノ酸のセットを表５Ａに示す。
【0063】
いくつかの実施形態では、使用され得る同義語アミノ酸のセットを表５Ｂに示す。
本発明で使用するためのＴｄＴ、ＰＡＰ及びＰＵＰバリアントは、従来のバイオテクノロジー技術によって製造され、Ｎ末端、Ｃ末端又は鋳型フリーポリメラーゼの内部位置に結合され得る、精製のためのアフィニティタグを含み得る。いくつかの実施形態では、アフィニティタグは、鋳型フリーポリメラーゼが使用される前に切断される。他の実施形態では、アフィニティタグは、使用前に切断されない。いくつかの実施形態では、ペプチドアフィニティタグは、ＴｄＴバリアントのループ２領域に挿入される。本発明のＴｄＴバリアントと共に使用するための例示的なＮ末端Ｈｉｓタグは、ＭＡＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＳＥＮＬＹＦＱＴＧＳＳＧ－（配列番号６））である。ペプチドアフィニティタグを選択するための指針は、以下の参考文献、すなわち、Ｔｅｒｐｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６０：５２３－５３３（２００３）、Ａｒｎａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，４８：１－１３（２００６）、Ｋｉｍｐｌｅら、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，７３：Ｕｎｉｔ－９．９（２０１５）、Ｋｉｍｐｌｅらによる米国特許第７３０９５７５号、Ｌｉｃｈｔｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，４１：９８－１０５（２００５）など、に記載されている。ペプチドアフィニティタグを選択するための指針は、以下の参考文献、すなわち、Ｔｅｒｐｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６０：５２３－５３３（２００３）、Ａｒｎａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，４８：１－１３（２００６）、Ｋｉｍｐｌｅら、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，７３：Ｕｎｉｔ－９．９（２０１５）、Ｋｉｍｐｌｅらによる米国特許第７３０９５７５号、Ｌｉｃｈｔｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，４１：９８－１０５（２００５）など、に記載されている。
【0064】
ヌクレオチド組み込み活性の測定
本発明で使用されるバリアントによるヌクレオチド取り込みの効率は、例えば、Ｂｏｕｌｅら（以下に引用）、Ｂｅｎｔｏｌｉｌａら（以下に引用）、及びＨｉａｔｔらの米国特許第５８０８０４５号（後者は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、延長又は伸長アッセイによって測定することができる。簡潔には、そのようなアッセイの一形態では、遊離３’－ヒドロキシルを有する蛍光標識オリゴヌクレオチドを、可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸の存在下、延長条件下で所定の期間、ＴｄＴなどの鋳型フリーポリメラーゼと反応させ、その後、延長反応を停止させ、ゲル電気泳動による分離後に延長産物及び未延長オリゴヌクレオチドの量を定量する。このようなアッセイにより、変異型鋳型フリーポリメラーゼの取り込み効率は、他のバリアントの効率又は野生型若しくは参照ポリメラーゼの効率と容易に比較することができる。いくつかの実施形態では、鋳型フリーポリメラーゼ効率の尺度は、同等のアッセイにおいて、野生型鋳型フリーポリメラーゼ又は参照ポリメラーゼを使用した延長産物の量に対する変異型鋳型フリーポリメラーゼを使用した延長産物の量の比（パーセンテージとして与えられる）であり得る。
本発明で使用されるバリアントによるヌクレオチド取り込みの効率は、例えば、Ｂｏｕｌｅら（以下に引用）、Ｂｅｎｔｏｌｉｌａら（以下に引用）、及びＨｉａｔｔらの米国特許第５８０８０４５号（後者は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、延長又は伸長アッセイによって測定することができる。簡潔には、そのようなアッセイの一形態では、遊離３’－ヒドロキシルを有する蛍光標識オリゴヌクレオチドを、可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸の存在下、延長条件下で所定の期間、ＴｄＴなどの鋳型フリーポリメラーゼと反応させ、その後、延長反応を停止させ、ゲル電気泳動による分離後に延長産物及び未延長オリゴヌクレオチドの量を定量する。このようなアッセイにより、変異型鋳型フリーポリメラーゼの取り込み効率は、他のバリアントの効率又は野生型若しくは参照ポリメラーゼの効率と容易に比較することができる。いくつかの実施形態では、鋳型フリーポリメラーゼ効率の尺度は、同等のアッセイにおいて、野生型鋳型フリーポリメラーゼ又は参照ポリメラーゼを使用した延長産物の量に対する変異型鋳型フリーポリメラーゼを使用した延長産物の量の比（パーセンテージとして与えられる）であり得る。
【0065】
いくつかの実施形態では、以下の特定の延長アッセイを使用して、ＴｄＴｓの取り込み効率を測定することができる：使用されるプライマーは以下の通りである。
５’－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧ－３’（配列番号５）
このプライマーはまた、５’末端にＡＴＴＯ蛍光色素を有する。使用される代表的な修飾ヌクレオチド（表６においてｄＮＴＰとして示される）としては、３’－Ｏ－アミノ－２’、３’－ジデオキシヌクレオチド－５’－三リン酸（－ＯＮＨ２、Ｆｉｒｅｂｉｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、例えば、３’－Ｏ－アミノ－２’、３’－ジデオキシアデノシン－５’－三リン酸が挙げられる。試験した異なるバリアントそれぞれについて、１本のチューブを反応に使用する。試薬を、水から出発して、次いで表６の順序でチューブに添加する。３７℃で３０分後、ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）の添加によって反応を停止する。
活性緩衝液は、例えば、ＣｏＣｌ２が補充されたＴｄＴ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能）を含む。
５’－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧ－３’（配列番号５）
このプライマーはまた、５’末端にＡＴＴＯ蛍光色素を有する。使用される代表的な修飾ヌクレオチド（表６においてｄＮＴＰとして示される）としては、３’－Ｏ－アミノ－２’、３’－ジデオキシヌクレオチド－５’－三リン酸（－ＯＮＨ２、Ｆｉｒｅｂｉｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、例えば、３’－Ｏ－アミノ－２’、３’－ジデオキシアデノシン－５’－三リン酸が挙げられる。試験した異なるバリアントそれぞれについて、１本のチューブを反応に使用する。試薬を、水から出発して、次いで表６の順序でチューブに添加する。３７℃で３０分後、ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）の添加によって反応を停止する。
【0066】
アッセイの産物を従来のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析する。例えば、上記アッセイの生成物は、１６％ポリアクリルアミド変性ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で分析することができる。ゲルは、ポリアクリルアミドをガラスプレートの内側に注ぎ、それを重合させることによって分析の直前に作製される。ガラスプレート内のゲルは、電気泳動工程のためにＴＢＥ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）が充填された適合タンクに取り付けられる。分析される試料は、ゲルの上部に載せる。室温で３から６時間、ゲルの上部と底部との間に５００から２，０００Ｖの電圧を印加する。分離後、ゲル蛍光を、例えば、Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナー（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてスキャンする。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）又はそれと同等のものを使用してゲル画像を分析して、修飾ヌクレオチドの取り込みのパーセンテージを計算する。
【0067】
鋳型フリーポリメラーゼの伸長効率は、以下のヘアピン完了アッセイでも測定することができる。そのようなアッセイでは、試験ポリヌクレオチドに、反応条件下ではそれが実質的に単なる一本鎖であるが、ＴｄＴバリアントなどのポリメラーゼによる延長時には一本鎖ループ及び二本鎖ステムを含む安定なヘアピン構造を形成するように、遊離３’ヒドロキシルが付与される。これにより、二本鎖ポリヌクレオチドの存在による３’末端の延長の検出が可能になる。二本鎖構造は、限定するものではないが、（ｉ）二本鎖構造へのインターカレーション時に優先的に蛍光を発する蛍光色素、（ｉｉ）延長されたポリヌクレオチド上のアクセプター（又はドナー）と、新たに形成されたヘアピンステムと三重鎖を形成するオリゴヌクレオチド上のドナー（又はアクセプター）との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、（ｉｉｉ）双方が試験ポリヌクレオチドに結合し、ヘアピンの形成時にＦＲＥＴ近接するＦＲＥＴアクセプター及びドナー、などを含む様々な方法で検出することができる。いくつかの実施形態では、単一ヌクレオチドによる延長後の試験ポリヌクレオチドのステム部分は、４塩基対～６塩基対長の範囲にあり、他の実施形態では、そのようなステム部分は、４から５塩基対長であり、さらに他の実施形態では、そのようなステム部分は４塩基対長である。いくつかの実施形態では、試験ポリヌクレオチドは１０から２０ヌクレオチドの範囲の長さを有し、他の実施形態では、試験ポリヌクレオチドは１２から１５ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、延長したステムと延長していないステムとの間の融解温度の差を最大にするヌクレオチドを用いて試験ポリヌクレオチドを延長させることが有利又は好都合であるので、いくつかの実施形態では、試験ポリヌクレオチドはｄＣ又はｄＧで延長される（したがって、試験ポリヌクレオチドはステム形成のための適切な相補的ヌクレオチドを有するように選択される）。
【0068】
ヘアピン完了アッセイのための例示的な試験ポリヌクレオチドとしては、ｄＧＴＰで延長することによって完了するｐ８７５（５’－ＣＡＧＴＴＡＡＡＡＡＣＴ）（配列番号２）、ｄＣＴＰで延長することによって完了するｐ８７６（５’－ＧＡＧＴＴＡＡＡＡＣＴ）（配列番号３）、及びｄＧＴＰで延長することによって完了するｐ８７７（５’－ＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴ）（配列番号４）が挙げられる。そのような試験ポリヌクレオチドについての例示的な反応条件は、２．５－５μＭの試験ポリヌクレオチド、１：４０００希釈のＧｅｌＲｅｄ（登録商標）（インターカレート色素、Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．製、フリーモント、カリフォルニア州）、２００ｍＭのカコジル酸ＫＯＨ（ｐＨ６．８）、１ｍＭのＣｏＣｌ２、０～２０％のＤＭＳＯ並びに所望の濃度の３’－ＯＮＨ２ｄＧＴＰ及びＴｄＴを含み得る。従来の蛍光計、例えば、ヘアピンの完了は、３６０ｎｍに設定された励起フィルター及び６３５ｎｍに設定された発光フィルターを使用し、２８～３８℃の反応温度でＴＥＣＡＮリーダーを使用して、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）色素の蛍光の増加によってモニタリングすることができる。
【0069】
キット
本発明は、本発明の方法を実施するための様々なキットを含む。一態様では、本発明のキットは、ポリＣオリゴヌクレオチドを含む開始剤が最終的には５’末端を介して結合された合成支持体を含む。いくつかの実施形態では、そのような合成支持体は、固体支持体である。さらなる実施形態では、そのような固体支持体は、多孔質粒子又は非多孔質粒子であり得る粒子を含み得る。非多孔質粒子は、例えば、磁気ビーズを含み得る。他の実施形態では、そのような粒子は、樹脂又はゲルなどの多孔質粒子を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような樹脂はアガロース樹脂を含む。上記の実施形態のいくつかでは、固体支持体に結合した開始剤はそれぞれ、１つ以上のポリＣオリゴヌクレオチドを含み、それぞれが２から３０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、そのような固体支持体は、微小粒子、特に非多孔質微小粒子の集団である。他の実施形態では、そのような固体支持体は、多孔性微小粒子の集団である。いくつかの実施形態では、そのような多孔質微小粒子はアガロース微小粒子である。いくつかの実施形態では、そのような固体支持体は、スライドガラスなどの平面支持体である。いくつかの実施形態では、そのような平面支持体は、１つ以上のポリＣオリゴヌクレオチドを含有する開始剤の均一なコーティングを有する。他の実施形態では、そのような平面支持体は、それぞれが１つ以上のポリＣオリゴヌクレオチドを含有する開始剤のコーティングを含む一連の個別の反応部位を有する。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、さらに、本明細書に記載の鋳型フリー酵素ポリヌクレオチド合成を実施するのに適した１つ以上の鋳型フリーポリメラーゼバリアントを、１つの製剤中に、又は別々に提供される場合は複数の製剤中に含む。そのようなキットはまた、３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰの成長鎖への鋳型フリーの付加又は組み込みを最適化するための反応条件を提供する、各鋳型フリーポリメラーゼバリアント用の合成緩衝液を含み得る。ＤＮＡを合成するための実施形態では、鋳型フリーポリメラーゼがＴｄＴバリアントである。ＲＮＡを合成するための実施形態では、鋳型フリーポリメラーゼは、ＰＡＰ及び／又はＰＵＰバリアントである。
本発明は、本発明の方法を実施するための様々なキットを含む。一態様では、本発明のキットは、ポリＣオリゴヌクレオチドを含む開始剤が最終的には５’末端を介して結合された合成支持体を含む。いくつかの実施形態では、そのような合成支持体は、固体支持体である。さらなる実施形態では、そのような固体支持体は、多孔質粒子又は非多孔質粒子であり得る粒子を含み得る。非多孔質粒子は、例えば、磁気ビーズを含み得る。他の実施形態では、そのような粒子は、樹脂又はゲルなどの多孔質粒子を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような樹脂はアガロース樹脂を含む。上記の実施形態のいくつかでは、固体支持体に結合した開始剤はそれぞれ、１つ以上のポリＣオリゴヌクレオチドを含み、それぞれが２から３０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、そのような固体支持体は、微小粒子、特に非多孔質微小粒子の集団である。他の実施形態では、そのような固体支持体は、多孔性微小粒子の集団である。いくつかの実施形態では、そのような多孔質微小粒子はアガロース微小粒子である。いくつかの実施形態では、そのような固体支持体は、スライドガラスなどの平面支持体である。いくつかの実施形態では、そのような平面支持体は、１つ以上のポリＣオリゴヌクレオチドを含有する開始剤の均一なコーティングを有する。他の実施形態では、そのような平面支持体は、それぞれが１つ以上のポリＣオリゴヌクレオチドを含有する開始剤のコーティングを含む一連の個別の反応部位を有する。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、さらに、本明細書に記載の鋳型フリー酵素ポリヌクレオチド合成を実施するのに適した１つ以上の鋳型フリーポリメラーゼバリアントを、１つの製剤中に、又は別々に提供される場合は複数の製剤中に含む。そのようなキットはまた、３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰの成長鎖への鋳型フリーの付加又は組み込みを最適化するための反応条件を提供する、各鋳型フリーポリメラーゼバリアント用の合成緩衝液を含み得る。ＤＮＡを合成するための実施形態では、鋳型フリーポリメラーゼがＴｄＴバリアントである。ＲＮＡを合成するための実施形態では、鋳型フリーポリメラーゼは、ＰＡＰ及び／又はＰＵＰバリアントである。
【0070】
いくつかの実施形態では、本発明のキットは、ポリＣオリゴヌクレオチド及び同じ固体支持体に結合した別個のポリＣオリゴヌクレオチドを含む開始剤が５’末端を介して結合した固体支持体を含み得る。さらなる実施形態では、そのようなキットは、溶液中にポリＣオリゴヌクレオチドを含み得る。
【0071】
いくつかの実施形態では、本発明のキットは、３’－Ｏ－可逆的保護ｄＮＴＰをさらに含む。そのような実施形態では、３’－Ｏ－可逆的保護ｄＮＴＰは、３’－Ｏ－アミノ－ｄＮＴＰ又は３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰを含み得る。さらなる実施形態では、キットは、以下の品目、すなわち、（ｉ）本明細書に記載の脱保護又はデブロッキング工程を実施するための脱保護又はデブロッキング試薬、（ｉｉ）開始剤が結合した固体支持体、（ｉｉｉ）完了したポリヌクレオチドを固体支持体から放出するための切断試薬、（ｉｖ）酵素添加又はカップリング工程の最後に未反応の３’－Ｏ－可逆的保護ｄＮＴＰを除去するための洗浄試薬又は緩衝液、及び（ｖ）合成後処理試薬、例えば、精製カラム、脱塩試薬、溶出試薬など、のうちの１つ以上を別々に又は上記の項目と共に含み得る。
【0072】
上記項目（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に関して、特定の開始剤と切断試薬とが相伴う。例えば、イノシン切断可能ヌクレオチドを含む開始剤には、エンドヌクレアーゼＶ切断試薬が付属し得、ニトロベンジル光切断性リンカーを含む開始剤には光切断性リンカーを切断するための適切な光源が付属し得、ウラシルを含む開始剤にはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ切断試薬が付属し得る、といった具合である。
【実施例】
【0073】
ポリＣ開始剤を用いる場合と用いない場合のＧ４形成ポリヌクレオチドの合成
この実施例では、実質的に上記の例示的な合成プロトコルに従って、ポリＣ開始剤を用いて、また用いないで、Ｇ４を形成しやすい配列を有する８つのポリデオキシリボヌクレオチドを合成する。固体支持体は、Ｃ１５リンカーを介して結合したポリＣ開始剤（－ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴｄＩＴ－３’（配列番号１５７））又はＣ１５リンカーを介して結合した非ポリＣ開始剤（－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｄＩＴ－３’（配列番号１５８））のいずれかを有するＣＮＢｒ活性化４５μｍアガロースビーズである。鋳型フリーポリメラーゼは、Ｎ末端親和性タグ（配列番号６）を有するＴｄＴバリアントＭ７７（配列番号１０６）である。合成後、ポリヌクレオチド産物を、Ｃｒｅｔｏｎ、国際特許公開第２０２０／１６５１３７号に記載されるプロトコルに従って、ＥｎｄｏＶエンドヌクレアーゼを使用して固体支持体から切断する。切断された合成産物をキャピラリー電気泳動によって分析して所望のポリヌクレオチドの純度を求め、産物の試料を配列決定して欠失、置換及び挿入エラーを評価する。両方の測定により、ポリＣ含有開始剤の使用は、所望の生成物の収率の有意な改善を示した。純度データは、ポリＣ開始剤を使用すると、Ｇ４を形成しやすいポリヌクレオチド生成物の純度が平均２０％以上増加したことを示している。以下の表は、ポリＣ含有開始剤を用いて、また用いずに合成したポリヌクレオチドからサンプリングした配列における様々なタイプのエラー率を比較する。
この実施例では、実質的に上記の例示的な合成プロトコルに従って、ポリＣ開始剤を用いて、また用いないで、Ｇ４を形成しやすい配列を有する８つのポリデオキシリボヌクレオチドを合成する。固体支持体は、Ｃ１５リンカーを介して結合したポリＣ開始剤（－ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴｄＩＴ－３’（配列番号１５７））又はＣ１５リンカーを介して結合した非ポリＣ開始剤（－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｄＩＴ－３’（配列番号１５８））のいずれかを有するＣＮＢｒ活性化４５μｍアガロースビーズである。鋳型フリーポリメラーゼは、Ｎ末端親和性タグ（配列番号６）を有するＴｄＴバリアントＭ７７（配列番号１０６）である。合成後、ポリヌクレオチド産物を、Ｃｒｅｔｏｎ、国際特許公開第２０２０／１６５１３７号に記載されるプロトコルに従って、ＥｎｄｏＶエンドヌクレアーゼを使用して固体支持体から切断する。切断された合成産物をキャピラリー電気泳動によって分析して所望のポリヌクレオチドの純度を求め、産物の試料を配列決定して欠失、置換及び挿入エラーを評価する。両方の測定により、ポリＣ含有開始剤の使用は、所望の生成物の収率の有意な改善を示した。純度データは、ポリＣ開始剤を使用すると、Ｇ４を形成しやすいポリヌクレオチド生成物の純度が平均２０％以上増加したことを示している。以下の表は、ポリＣ含有開始剤を用いて、また用いずに合成したポリヌクレオチドからサンプリングした配列における様々なタイプのエラー率を比較する。
【0074】
定義
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される核酸化学、生化学、遺伝学、及び分子生物学の用語及び記号は、当分野の標準的な論文及びテキスト、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ及びＢａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、ニューヨーク、１９９２年）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク、１９７５年）、Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２版（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ、ニューヨーク、１９９９年）のそれに従う。
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される核酸化学、生化学、遺伝学、及び分子生物学の用語及び記号は、当分野の標準的な論文及びテキスト、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ及びＢａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、ニューヨーク、１９９２年）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク、１９７５年）、Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２版（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ、ニューヨーク、１９９９年）のそれに従う。
【0075】
２つ以上の異なるＴｄＴのアミノ酸位置に関して「機能的に同等」とは、（ｉ）それぞれの位置のアミノ酸がＴｄＴの活性において同じ機能的役割を果たすこと、及び（ｉｉ）それぞれのＴｄＴのアミノ酸配列の相同アミノ酸位置にアミノ酸が存在することを意味する。配列アラインメント及び／又は分子モデリングに基づいて、２つ以上の異なるＴｄＴのアミノ酸配列における位置的に同等又は相同なアミノ酸残基を同定することが可能である。いくつかの実施形態では、機能的に等価なアミノ酸位置は、進化的に関連する種、例えば、属、科などのＴｄＴのアミノ酸配列間で保存されている非効率性モチーフに属する。そのような保存された非効率性モチーフの例は、Ｍｏｔｅａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１８０４（５）：１１５１－１１６６（２０１０）、Ｄｅｌａｒｕｅら、ＥＭＢＯ Ｊ．，２１：４２７－４３９（２００２）、及び同様の参考文献に記載されている。
【0076】
「キット」は、本発明のシステム又は装置によって実施される方法を実施するための材料又は試薬を配布するための任意の配布システム、例えば、パッケージを指す。いくつかの実施形態では、消耗品材料又は試薬は、本明細書で「キット」と呼ばれるパッケージで本発明のシステム又は装置のユーザに配布される。本発明の文脈において、そのような供給システムは、通常、合成支持体、オリゴヌクレオチド、３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰなどの材料の貯蔵、輸送又は配布を可能にする包装方法及び材料を含む。例えば、キットは、ポリＣ開始剤が付着した固体支持体及び／又は支持材料を含む１つ以上の筐体（例えば、ボックス）を含み得る。かかる内容物は、一緒に又は別々に意図されたレシピエントに配布してもよい。例えば、第１の容器は、ポリＣ開始剤が結合した固体支持体を含有していてもよく、一方、第２の又はそれを超える容器は、３’－Ｏ－保護デオキシヌクレオシド三リン酸、鋳型フリーポリメラーゼ、例えば、特定のＴｄＴバリアント、及び適切な緩衝液を含有する。
【0077】
互換的に使用される「変異」又は「バリアント」は、本明細書に記載の天然又は参照ＴｄＴポリペプチドに由来し、１つ以上の位置に修飾又は改変、すなわち置換、挿入及び／又は欠失を含むポリペプチドを指す。バリアントは、当技術分野で周知の様々な技術によって得ることができる。具体的には、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変するための技術の例としては、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、配列シャッフリング及び合成オリゴヌクレオチド構築が挙げられるが、これらに限定されない。変異誘発活性は、タンパク質の配列中の、又は本発明の場合はポリメラーゼの配列中の１個又は数個のアミノ酸の欠失、挿入又は置換からなる。置換を指定するために以下の用語が使用される。Ｌ２３８Ａは、参照又は野生型配列の位置２３８のアミノ酸残基（ロイシン、Ｌ）がアラニン（Ａ）に変更されることを示す。Ａ１３２Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の１３２位のアミノ酸残基（アラニン、Ａ）が、以下のアミノ酸、すなわち、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）又はメチオニン（Ｍ）のいずれかによって置換されていることを示す。置換は、保存的置換又は非保存的置換であり得る。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン及びトレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システイン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）及び小アミノ酸（グリシン、アラニン及びセリン）からなる群の範囲内のものである。
【0078】
「ポリヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用され、それぞれヌクレオチドモノマー又はその類似体の直鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、ワトソン－クリック型の塩基対形成、塩基スタッキング、フーグスティーン又は逆フーグスティーン型の塩基対形成など、モノマーとモノマーの相互作用の規則的なパターンによって天然のポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。そのようなモノマー及びそれらのヌクレオシド間結合は、天然に存在し得、又はその類似体、例えば、天然に存在する又は天然に存在しない類似体であってもよい。天然に存在しない類似体としては、ＰＮＡ、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、フルオロフォア又はハプテンなどの標識の付着を可能にする結合基を含む塩基などを挙げることができる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの使用が、ポリメラーゼによる延長、リガーゼによるライゲーションなどの酵素的プロセシングを必要とするときはいつでも、当業者は、それらの例におけるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、任意の位置又はいくつかの位置にヌクレオシド間結合、糖部分又は塩基の特定の類似体を含有しないことを理解するであろう。ポリヌクレオチドは、典型的には、それらが通常「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる場合、数個のモノマー単位、例えば、５～４０個から数千個のモノマー単位のサイズの範囲である。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ、」などの文字の配列（大文字又は小文字）によって表されるときはいつでも、別途指示がない限り、又は文脈から明らかでない限り、ヌクレオチドは左から右へ５’ →３’の順序であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを表し、「Ｃ」はデオキシシチジンを表し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを表し、「Ｔ」はチミジンを表し、「Ｉ」はデオキシイノシンを表し、「Ｕ」はウリジンを表すことが理解されよう。特に明記しない限り、用語及び原子番号付けの慣習は、Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ、ニューヨーク、１９９９年）に開示されているそれに従う。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された４つの天然ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡのためのデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン又はＲＮＡのためのそれらのリボース対応物）を含むが、それらは、例えば、修飾塩基、糖又はヌクレオシド間結合などの非天然ヌクレオチド類似体も含み得る。酵素が、活性に対する特異的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質の要件、例えば、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖などを有する場合、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質についての適切な組成物の選択は、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク、１９８９年）及び同様の参考文献などの論文からの指針がある場合は、十分に当業者の知識の範囲内であることは当業者には明らかである。同様に、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、一本鎖形態又は二本鎖形態（すなわち、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド及びそのそれぞれの相補体の二重鎖）のいずれかを指し得る。どちらの形態又は両方の形態が用語の使用の文脈から意図されているかは、当業者には明らかであろう。
【0079】
「プライマー」は、天然又は合成のいずれかのオリゴヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドの鋳型と二重鎖を形成すると、核酸合成の開始点として作用し、その３’末端から鋳型に沿って延長して、延長した二重鎖を形成することができるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの延長は、通常、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼを用いて行われる。延長過程で付加されるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって延長される。プライマーは、通常、１４から４０ヌクレオチドの範囲、又は１８から３６ヌクレオチドの範囲の長さを有する。プライマーは、様々な核酸増幅反応、例えば、単一のプライマーを使用する線形増幅反応、又は２つ以上のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応で使用される。特定の用途のためのプライマーの長さ及び配列を選択するための指針は、参照により組み込まれる以下の参考文献、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、２００３年）によって証明されるように、当業者に周知である：
【0080】
「配列同一性」は、２つの配列、例えば、２つのポリペプチド配列又は２つのポリヌクレオチド配列の間のマッチ（例えば、同一のアミノ酸残基）の数（又は割合、通常パーセンテージとして表される）を指す。配列同一性は、配列ギャップを最小化しながら重複及び同一性を最大化するように整列したときの配列を比較することによって求められる。具体的には、配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、いくつかの数学的グローバルアライメントアルゴリズム又はローカルアライメントアルゴリズムのいずれかを使用して求めることができる。類似の長さの配列は、好ましくは、配列を全長にわたって最適にアラインメントするグローバルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、１９７０年）を使用してアラインメントされ、一方で、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１年）又はＡｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、２００５年））を使用してアラインメントされる。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野の技能の範囲内である様々な方法で、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／又はｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／などのインターネットウェブサイトで利用可能な公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本明細書の目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用する２つの配列の最適なグローバルアライメントを作成するペアワイズ配列アラインメントプログラムＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して生成された値を指し、すべての検索パラメータはデフォルト値、すなわちＳｃｏｒｉｎｇ行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｇａｐ ｏｐｅｎ＝１０、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ＝０．５、Ｅｎｄ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝ｆａｌｓｅ、Ｅｎｄ ｇａｐ ｏｐｅｎ＝１０及びＥｎｄ ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ＝０．５に設定される。
【0081】
「置換」とは、あるアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味する。好ましくは、「置換」という用語は、天然に存在する標準的な２０アミノ酸残基、希少な天然に存在するアミノ酸残基（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、６－Ｎ－メチルリジン、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン）、及びしばしば合成的に作製される天然に存在しないアミノ酸残基（例えば、シクロヘキシル－アラニン）から選択される別のものによるアミノ酸残基の置換を指す。好ましくは、「置換」という用語は、天然に存在する標準２０アミノ酸残基から選択される別のものによるアミノ酸残基の置換を指す。記号「＋」は、置換の組み合わせを示す。アミノ酸は、本明細書では、以下の命名法に従って１文字又は３文字のコードによって表される。Ａ：アラニン（Ａｌａ）、Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）、Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）、Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）、Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）、Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）、Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）、Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）、Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）、Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）、Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）、Ｔ：トレオニン（Ｔｈｒ）、Ｖ：バリン（Ｖａｌ）、Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）及びＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。本明細書では、置換を指定するために以下の用語が使用される。Ｌ２３８Ａは、親配列の位置２３８のアミノ酸残基（ロイシン、Ｌ）がアラニン（Ａ）に変更されることを示す。Ａ１３２Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の１３２位のアミノ酸残基（アラニン、Ａ）が、以下のアミノ酸、すなわち、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）又はメチオニン（Ｍ）のいずれかによって置換されていることを示す。置換は、保存的置換又は非保存的置換であり得る。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン及びトレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システイン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）及び小アミノ酸（グリシン、アラニン及びセリン）からなる群の範囲内のものである。
【0082】
本開示は、記載された特定の形態の範囲に限定されることを意図するものではなく、本明細書に記載された変形形態の代替形態、修正形態、及び均等物を包含することを意図している。さらに、本開示の範囲は、本開示を考慮して当業者に明らかになり得る他の変形を完全に包含する。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【配列表】
【国際調査報告】