特表 2024-511963 Ｃ末端ペプチド修飾

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-18

(54)【発明の名称】Ｃ末端ペプチド修飾

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/13 20060101AFI20240311BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20240311BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240311BHJP

【ＦＩ】

C07K1/13

C07K7/06 ZNA

A61K47/68

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023556476

(86)(22)【出願日】2022-03-25

(85)【翻訳文提出日】2023-11-08

(86)【国際出願番号】 NL2022050164

(87)【国際公開番号】W WO2022203512

(87)【国際公開日】2022-09-29

(31)【優先権主張番号】2027847

(32)【優先日】2021-03-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】NL

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】511086559

【氏名又は名称】テクニシュ ユニベルシテイト デルフト

【氏名又は名称原語表記】ＴＥＣＨＮＩＳＣＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＩＴ ＤＥＬＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100182305

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 鉄平

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100221958

【弁理士】

【氏名又は名称】篠田 真希恵

(74)【代理人】

【識別番号】100192441

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 仁

(72)【発明者】

【氏名】エルケマ リエンク

(72)【発明者】

【氏名】マッキオーネ マリアーノ

(72)【発明者】

【氏名】ボーランダー ペギー

【テーマコード（参考）】

4C076

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC41

4C076EE59

4C076FF70

4H045BA13

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA50

4H045FA51

(57)【要約】

本発明では、ペプチド（１１０）のＣ末端（１１１）にカーゴを提供するための、第１の段階及び第２の段階を含む方法であって、第１の段階が、ペプチド（１１０）のＣ末端（１１１）を第１の触媒（１３０）及び第１の放射（１４０）の存在下で第１の反応体（１２０）と反応させて、第１の中間体（１５０）を提供するステップを含み、第１の触媒（１３０）が、第１の放射（１４０）の存在下でペプチド（１１０）のＣ末端（１１１）を脱炭酸化するように構成され、第２の段階が、第１の中間体（１５０）を第２の反応体（２２０）に曝露するステップを含む、方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペプチド（１１０）のＣ末端（１１１）にカーゴを提供するための、第１の段階及び第２の段階を含む方法であって、前記第１の段階が、第１の触媒（１３０）及び第１の放射（１４０）の存在下で第１の反応体（１２０）と前記ペプチド（１１０）の前記Ｃ末端（１１１）を反応させて、第１の中間体（１５０）を提供するステップを含み、前記第１の触媒（１３０）が、前記第１の放射（１４０）の存在下で前記ペプチド（１１０）の前記Ｃ末端（１１１）を脱炭酸化するように構成され、前記第１の反応体（１２０）が、式Ｉによる第１の化学構造を有し、

【化1】

式中、Ｒ_０が、Ｈ、ハライド、Ｏ－アシル基、炭酸基、スルホン酸基、及びＮＲ_３基からなる群から選択され、各ＲがＨ及びアルキル基から独立的に選択されるか、又はＮＲ_３がピリジニウム若しくはこの誘導体を含み、
Ｒ’が、Ｈ、アリール基及びアルキル基からなる群から選択され、
Ｒ’’が、エステル、チオエステル、アミド、ケトン、ニトロ、スルホキシド、スルホン、リン酸エステル、アシルヒドラジド、シアノ基、及びトリハロゲンメチル基からなる群から選択される官能基を含む電子求引基であり；かつ
前記第２の段階が、前記第１の中間体（１５０）を第２の反応体（２２０）に曝露するステップを含み、前記第２の反応体（２２０）が、式IIIによる第２の化学構造を有し、

【化2】

式中、Ｒ’’’が、カーゴを含む、前記方法。

【請求項2】

各Ｒが、Ｈ、及び１～６のＣ原子を含むアルキル基から独立的に選択され、Ｒ’が、Ｈ、アリール基、及び１～６のＣ原子を含むアルキル基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

Ｒ_０がＨであり、Ｒ’がアルキル基であり、Ｒ’’がチオエステルであり、かつ第２の化学構造が、式IIIＡによるものであり、

【化3】

式中、Ｘが、Ｏ又はＮＨであり、Ｒ１がカーゴを含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

Ｒ_０が、ハライド、Ｏ－アシル基、炭酸基、スルホン酸基、及びＮＲ_３基を含む群から選択され、かつＲ’がＨである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項5】

第１の触媒が、リボフラビンテトラブチラート及びＩｒ［ｄＦ（ＣＦ_３）ｐｐｙ］_２（ｄｔｂｂｐｙ）ＰＦ_６を含む群から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

第１の放射（１４０）が、３７５～５２５ｎｍの範囲の第１の波長を含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

第１の段階を第１の溶媒（１０１）を含む第１の混合物中で実行し、前記第１の溶媒（１０１）が、水、ＤＭＳＯ及びＤＭＦのうちの１又は２以上を含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

第１の混合物が、１ｐｐｍ以下の溶存酸素を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

中間段階をさらに含み、前記中間段階が、第１の反応体（１２０）から第１の中間体（１５０）を分離するステップを含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

第２の段階を不活性ガス下の脱気緩衝液中で実施する、請求項１～９のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

第２の段階において、ペプチドを６～１０のｐＨを有する第２の環境に曝露する、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

カーゴが第２のペプチド（１１０）を含む、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

カーゴが抗体を含む、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。

【請求項14】

請求項１～１３のいずれかに記載の方法を使用して得られるペプチド－カーゴコンジュゲート（２５０）であって、
式IVＡによる化学構造を有し、

【化4】

式中、Ｘが、Ｏ若しくはＮＨであり、Ｒ’がアルキル基であり、Ｒ_１がカーゴを含み、Ｒ_３がペプチドを指すか、又は
式IVＢによる化学構造を有し、

【化5】

式中、Ｒ’’が、エステル、チオエステル、アミド、ケトン、ニトロ、スルホキシド、スルホン、リン酸エステル及びアシルヒドラジドからなる群から選択される官能基を含む電子求引基であり、Ｒ’’’がカーゴを指し、Ｒ_３がペプチドを含む、前記ペプチド－カーゴコンジュゲート（２５０）。

【請求項15】

式IVＡによる化学構造を有する、請求項１４に記載のペプチド－カーゴコンジュゲート（２５０）。

【請求項16】

式IVＢによる化学構造を有する、請求項１４に記載のペプチド－カーゴコンジュゲート（２５０）。

【請求項17】

抗体薬物コンジュゲートとしての使用のための、請求項１４～１６のいずれかに記載のペプチド－カーゴコンジュゲート（２５０）。

【請求項18】

請求項１４～１６のいずれかに記載のペプチド－カーゴコンジュゲート（２５０）を含むペプチドアレイ。

【請求項19】

ペプチドシーケンシングのための、請求項１４～１６のいずれかに記載のペプチド－カーゴコンジュゲート（２５０）の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ペプチドのＣ末端にカーゴを提供するための方法に関する。本発明は、ペプチド－カーゴコンジュゲートにさらに関する。本発明は、ペプチド－カーゴコンジュゲートを含むペプチドアレイにさらに関する。本発明は、ペプチド－カーゴコンジュゲートの使用にさらに関する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質のＣ末端を修飾するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Bloom et al, "Decarboxylative Alkylation: An Approach to Site-Selective Bioconjugation of Native Proteins via Oxidation Potentials", Nature Chemistry, 2018では、可視光により媒介される単一電子移動について、部位及び化学選択的バイオコンジュゲーションを徐々に可能とする一機構として記載している。

【0003】

Malins, "decarboxylative couplings as versatile tools for late-stage peptide modifications", Peptide Science, 2018では、未変性ペプチド酸の標的機能化のための脱炭酸性共役戦略について総説が記載されている。

【0004】

国際公開第２０１６１９６９３１号では、脱炭酸機構を介するコンジュゲート付加により分子種を生成する合成方法について記載している。ここでは、ペプチドＣ末端残基の選択的機能化を含むペプチド残基機能化の方法を記載している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２０１６１９６９３１号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Bloom et al, “Decarboxylative Alkylation: An Approach to Site-Selective Bioconjugation of Native Proteins via Oxidation Potentials”, Nature Chemistry, 2018

【非特許文献2】Malins, “decarboxylative couplings as versatile tools for late-stage peptide modifications”, Peptide Science, 2018

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ペプチド、特に、タンパク質のＣ末端修飾は、センサー、アレイ、（基礎）研究、シーケンシングアプリケーション、並びにタンパク質－薬物コンジュゲートの合成に重要であり得る。しかし、未変性のペプチド又はタンパク質のＣ末端を選択的に修飾することは困難であり得る。

【0008】

例えば、Ｃ末端ペプチド修飾のための先行技術の方法は、小範囲のＣ末端残基に適合し得るのみである。

【0009】

先行技術の方法は、さらなる修飾のための官能基を有する（組換え）変異タンパク質の合成にさらに関し得る。しかし、このような方法は、（天然）生物学的試料由来のペプチドの修飾には適合しないことがある。

【0010】

さらに、先行技術の方法は、固相合成方法を必要とし得るか、又はカーゴをペプチドに結合させる非天然カップリング化学反応の使用を必要とし得る。

【0011】

先行技術の方法は、特定の溶媒をさらに必要とし得る。これは、このような溶媒に不溶性のペプチドに適合しないことがあり、相対的に大型のペプチド及びタンパク質に関して特に適切であり得る。

【0012】

加えて、先行技術の方法は、多くの種類のカーゴに適合しない可能性を有する。

【0013】

したがって、先行技術の方法は、ペプチドとの適合性、特に、Ｃ末端残基及び様々な種類のカーゴに関してかなり制限され得る。

【0014】

したがって、本発明の態様では、好ましくは、１又は２以上の上記の欠点を少なくとも部分的にさらに取り除く、Ｃ末端ペプチド修飾の代替方法を提供する。本発明は、先行技術の不利益の少なくとも１つを克服若しくは改善するか、又は有用な代替方法を提供する目的を有し得る。

【課題を解決するための手段】

【0015】

第１の態様では、本発明は、ペプチドのＣ末端にカーゴを提供するための方法、すなわち、ペプチド－カーゴコンジュゲートを提供するための方法を提供し得る。方法は、第１の段階及び第２の段階を含み得る。実施形態では、第１の段階は、ペプチドのＣ末端を第１の触媒及び第１の放射（radiation）の存在下で第１の反応体と反応させて、第１の中間体を提供するステップを含み得る。特に、第１の触媒は、第１の放射の存在下でペプチドのＣ末端を脱炭酸化するように構成され得る。実施形態では、第１の反応体は、式Ｉによる第１の化学構造を有してもよく、

【0016】

【化1】

【0017】

特に、式中、Ｒ_０は、Ｈ、ハライド、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩ、Ｏ－アシル基、例えば、Ｒがアルキル又はアリールであるＯ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ基、炭酸基、例えば、Ｒがアルキル又はアリールであるＯ（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ基、並びにスルホン酸基、例えば、Ｒがアルキル又はアリールであるＯＳ（Ｏ_２）－Ｒ基、並びにＮＲ_３基からなる群から選択され、特に、各ＲがＨ及びアルキル基から独立的に選択され得るか、又は特に、ＮＲ_３がピリジニウム若しくはこの誘導体を含み；特に、Ｒ’は、Ｈ、アリール基及びアルキル基からなる群から選択され；特に、Ｒ’’は、エステル、チオエステル、アミド、ケトン、ニトロ、スルホキシド、スルホン、リン酸エステル、アシルヒドラジド、シアノ基、及びトリハロゲンメチル基からなる群から選択される官能基を含む電子求引基である。実施形態では、第２の段階は、第１の中間体を第２の反応体に曝露するステップを含んでもよく、特に、第２の反応体は、式IIIによる第２の化学構造を有し、

【0018】

【化2】

【0019】

式中、Ｒ’’’は、カーゴを含む。

【0020】

本発明の方法は、ペプチドのＣ末端を選択的に脱炭酸化し、これによりラジカルを導入することができ、その後、ペプチドのＣ末端、特に、チオエステル基、又は特に、マイケル受容体基に反応基を結合させるステップに関する。次いで、反応基は、第２の段階において使用して、ペプチドにカーゴを結合し得る。特に、本発明の方法により、他のペプチドを含む多種多様なカーゴを、天然ペプチドのＣ末端に選択的に共有結合させることが可能であるという利点が提供され得る。例えば、これは、抗体薬物コンジュゲートの形成におけるペプチドシーケンシング、特に、タンパク質シーケンシングの文脈において、及びペプチドアレイ、特に、タンパク質アレイを提供するのに有益であり得る。

【0021】

特に、第１の段階では、ペプチドのＣ末端に配置するチオエステル官能基、及び／又はペプチドのＣ末端に配置するマイケル受容体基、特に、チオエステル基、又は特に、マイケル受容体基を有する第１の中間体を提供し得る。例えば、第１の中間体がＣ末端チオエステル官能基を含む実施形態では、第１の中間体は、式IIIＡ（以下参照）による第２の化学構造を有する第２の反応体、例えば、システイン官能基を有する第２の反応体と反応させて、カーゴをペプチドに結合させ得る。第１の中間体がＣ末端マイケル受容体基を含む実施形態では、第１の中間体は、式IIIによる第２の化学構造を有する第２の反応体と特に反応させて、カーゴをペプチドに結合させ得る。

【0022】

本発明の方法では、固相方法を必要とせずに、殆どどのようなカーゴをも殆どのペプチドのＣ末端に結合させる一般的手法を提供し得る。さらに方法は、天然ペプチドに適合し得る。

【0023】

したがって、特定の実施形態では、ペプチドのＣ末端にカーゴを提供するための方法であって、第１の段階及び第２の段階を含み、第１の段階が、第１の触媒及び第１の放射の存在下で第１の反応体とペプチドのＣ末端を反応させて、第１の中間体を提供するステップを含み、第１の触媒が、第１の放射の存在下でペプチドのＣ末端を脱炭酸化するように構成され、第１の反応体が、式Ｉによる第１の化学構造を有し、

【0024】

【化3】

【0025】

式中、Ｒ_０は、Ｈ、ハライド、Ｏ－アシル基、炭酸基、スルホン酸基及びＮＲ_３基からなる群から選択され、Ｒ’は、Ｈ、アリール基及びアルキル基からなる群から選択され、Ｒ’’は、エステル、チオエステル、アミド、ケトン、ニトロ、スルホキシド、スルホン、リン酸エステル、及びアシルヒドラジド、シアノ基、及びトリハロゲンメチル基からなる群から選択される官能基を含む電子求引基であり、第２の段階は、第１の中間体を第２の反応体に曝露するステップを含み、第２の反応体は、式IIIによる第２の化学構造を有し、

【0026】

【化4】

【0027】

式中、Ｒ’’’は、カーゴを含む、方法を本発明により提供する。

【0028】

したがって、本発明では、ペプチドのＣ末端にカーゴを提供するための方法を提供し得る。

【0029】

「カーゴ」の用語は、ペプチドに結合させるのに適切な任意の化合物を本明細書において指し得る。例えばカーゴは、第２のペプチド、抗体、薬物、転写因子、精製タグ、ナノ粒子、蛍光色素、及びアンカータグを含み得る。

【0030】

「ペプチド」の用語は、任意の長さのアミノ酸の鎖、特に、少なくとも２つのアミノ酸の鎖、より詳細には、１０又はこれ以上のアミノ酸の鎖を本明細書において指し得る。したがって、ペプチドの用語は、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質をも指し得る。実施形態では、ペプチドは、天然ペプチド、特に、天然タンパク質、すなわち、天然に存在する生物により生成される未変性のペプチド（又はタンパク質）を含み得る。ペプチドは、２～４０００、例えば、３～２５００、特に、３～１０００の範囲から選択される多くのアミノ酸を特に含み得る。さらなる実施形態では、ペプチドは、最大で５００のアミノ酸、例えば、最大で１００のアミノ酸、特に、最大で５０のアミノ酸、例えば、最大で（約）４０のアミノ酸を含み得る。さらなる実施形態では、ペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸、例えば、少なくとも３つのアミノ酸、特に、少なくとも５つのアミノ酸を含み得る。さらなる実施形態では、ペプチドは、２～６０の範囲、特に、２～４０の範囲、例えば、３～４０の範囲から選択される多数のアミノ酸を特に含み得る。

【0031】

方法は、第１の段階及び第２の段階を特に含み得る。本明細書において使用する「段階」の用語及び類似の用語は、方法の（時間）期間（及び「相」）を指し得る。第１の段階及び第２の段階は、特に、時間的に分離してもよく、第２の段階は、第１の段階後に時間的に配置する。

【0032】

第１の段階は、ペプチドのＣ末端を第１の触媒及び第１の放射の存在下で第１の反応体と反応させて、特に、第１の中間体を提供するステップを含み得る。

【0033】

第１の触媒は、第１の放射の存在下でペプチドのＣ末端を脱炭酸化するように特に構成され得る。特に、第１の触媒は、リボフラビン誘導体、例えば、リボフラビンテトラブチラートを含む、リボフラビン触媒、及びイリジウム触媒、例えば、Ｉｒ［ｄＦ（ＣＦ_３）ｐｐｙ］_２（ｄｔｂｂｐｙ）ＰＦ_６、特に、リボフラビンテトラブチラートを含み得る。第１の触媒は、特に、第１の放射に曝露する場合にペプチドのＣ末端を脱炭酸化する光触媒であり得る。したがって、第１の触媒は、第１の放射の存在下でペプチドのＣ末端を脱炭酸化するように構成され得る。第１の放射は、２５０～６００ｎｍの範囲、特に、３００～６００ｎｍからの範囲の第１の波長を特に含み得る。さらなる実施形態では、第１の放射は、３７５～５２５ｎｍの範囲、例えば、４００～５２５ｎｍの範囲の第１の波長を含み得る。したがって、実施形態では、第１の放射は、２５０～６００ｎｍの範囲、特に、３００～６００ｎｍの範囲の強度の第１の波長を有し得る。さらなる実施形態では、第１の放射は、３７５～５２５ｎｍの範囲、例えば、４００～５２５ｎｍの範囲の強度の第１の波長を有し得る。第１の放射は、第１の放射に曝露する場合に第１の触媒によりタンパク質のＣ末端が脱炭酸化されるように選択される第１の波長を特に含み得る。すなわち、第１の波長は、第１の放射に曝露する場合に第１の触媒によりタンパク質のＣ末端が脱炭酸化されるのに適し得る。

【0034】

さらなる実施形態では、方法は、光源、特に、固体光源、例えば、ＬＥＤを用いて第１の放射を提供するステップを含み得る。光源は、２５０～６００ｎｍの範囲、特に、３００～６００ｎｍの範囲のピーク波長を特に有し得る。さらなる実施形態では、光源は、３７５～５２５ｎｍの範囲、例えば、４００～５２５ｎｍの範囲のピーク波長を有し得る。

【0035】

さらなる実施形態では、第１の溶媒が有機溶媒を含み、特に、これからなる場合、第１の触媒は、（Ｉｒ［ｄＦ（ＣＦ_３）ｐｐｙ］_２（ｄｔｂｐｙ））ＰＦ_６（ＣＡＳ番号８７０９８７－６３－６）、［Ｉｒ（ｄｔｂｂｐｙ）（ｐｐｙ）_２］ＰＦ_６（ＣＡＳ番号６７６５２５－７７－２）、［Ｉｒ（ｄＦｐｐｙ）_２（ｄｔｂｂｐｙ）］ＰＦ_６（ＣＡＳ番号１０７２０６７－４４－７）、［Ｉｒ（ｄＦＣＦ_３ｐｐｙ）_２－（５，５’－ｄＣＦ_３ｂｐｙ）］ＰＦ_６（ＣＡＳ番号１９７３３７５－７２－２）、［Ｉｒ（ｄＦ（Ｍｅ）ｐｐｙ）_２（ｄｔｂｂｐｙ）］ＰＦ_６（ＣＡＳ番号１３３５０４７－３４－１）、［Ｉｒ｛ｄＦＣＦ_３ｐｐｙ｝_２（ｂｐｙ）］ＰＦ_６（ＣＡＳ番号１０９２７７５－６２－６）、［Ｉｒ（ｐ－Ｆ（Ｍｅ）ｐｐｙ）_２－（４，４’－ｄｔｂｂｐｙ）］ＰＦ_６（ＣＡＳ番号８０８１４２－８８－３）、Ｉｒ（ｄＦｐｐｙ）_３（ＣＡＳ番号３８７８５９－７０－３）、Ｉｒ（ｄＦＦｐｐｙ）_２（ｄｔｂｂｐｙ）ＰＦ_６（ＣＡＳ番号２０４２２０１－１８－１）及びＩｒ［ｄＦＦｐｐｙ］_２－（４，４’－ｄＣＦ_３ｂｐｙ）ＰＦ_６（ＣＡＳ番号２０３０４３７－９２－２）を含む群から選択されるイリジウム触媒を含み得る。このような実施形態では、第１の環境、特に、第１の溶媒は、０．００５～２ｍＭ、例えば、０．０１～１ｍＭの第１の触媒を特に含み得る。

【0036】

さらなる実施形態では、第１の溶媒が水を含む場合、又は第１の溶媒が有機溶媒／水混合物を含む場合、第１の触媒は、リボフラビンテトラブチラート（ＣＡＳ番号７５２－５６－７）、ルミフラビン（ＣＡＳ番号１０８８－５６－８）、リボフラビン（ＣＡＳ番号８３－８８－５）、リボフラビン５’－一リン酸ナトリウム塩（ＣＡＳ番号１３０－４０－５）、ルミクロム（ＣＡＳ番号１０８６－８０－２）、リボフラビンＮ－カルバミン酸エチル、４－［２－（７，８－ジメチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロ－ベンゾ［ｇ］プテリジン－１０（２Ｈ）－イル）エトキシ］－４－オキソブタン酸、１０－エチル－３，７，８－トリメチル－ベンゾ［ｇ］プテリジン－２，４（３Ｈ，１０Ｈ）－ジオン、７，８－ジメチル－１０－｛２－［ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］エチル｝イソアロキサジン塩酸塩、及び７，８－ジエチル－１０－（１’－ｄ－リビチル）イソアロキサジンを含む群から選択されるリボフラビン触媒を含み得る。このような実施形態では、第１の環境、特に、第１の溶媒は、０．００５～６００ｍＭ、例えば、０．０１～３００ｍＭの第１の触媒を特に含み得る。

【0037】

さらなる実施形態では、第１の触媒は、メシチルアクリジニウム触媒を含み得る。このような実施形態では、第１の環境、特に、第１の溶媒は、０．０１～１ｍＭの第１の触媒を特に含み得る。

【0038】

「イリジウム触媒」の用語は、本明細書において、イリジウムを含む触媒、すなわち、触媒を含むイリジウムを特に指し得る。

【0039】

実施形態では、第１の反応体は、式Ｉによる第１の化学構造を有し得る。

【0040】

【化5】

【0041】

実施形態では、Ｒ_０は、Ｈ、ハライド、Ｏ－アシル基、炭酸基、スルホン酸基及びＮＲ_３基を含む群から選択され得る。さらなる実施形態では、Ｒ_０は、Ｈを含み得る。さらなる実施形態では、Ｒ_０は、ハライド、特に、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを含み得る。さらなる実施形態では、Ｒ_０は、Ｏ－アシル基、すなわち、式中、Ｒがアルキル又はアリール基を含む、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ基を含み得る。さらなる実施形態では、Ｒ_０は、炭酸基、すなわち、式中、Ｒがアルキル又はアリール基を含む、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ基を含み得る。さらなる実施形態では、Ｒ_０は、スルホン酸基、例えば、トシレート及びメシレート、特に、式中、Ｒがアルキル又はアリール基を含む、－ＯＳ（Ｏ_２）－Ｒを含み得る。さらなる実施形態では、Ｒ_０は、ＮＲ_３基、特に、ピリジニウム若しくはこの誘導体を含み得るか、又は特に、各Ｒは、Ｈ及びアルキル基を含む群から独立的に選択される。

【0042】

さらなる実施形態では、Ｒ’は、Ｈ、アリール基及びアルキル基からなる群から選択され得る。さらなる実施形態では、Ｒ’は、Ｈであり得る。さらなる実施形態では、Ｒ’は、アリール基を含み得る。さらなる実施形態では、Ｒ’は、アルキル基を含み得る。

【0043】

さらなる実施形態では、Ｒ’’は、電子求引基、特に、エステル、チオエステル、アミド、ケトン、ニトロ、スルホキシド、スルホン、リン酸エステル、アシルヒドラジド、シアノ基、及びトリハロゲンメチル基からなる群から選択される官能基を含む電子求引基であり得る。特に、電子求引基は、式Ｉに示すＣ＝Ｃ結合がペプチドの脱炭酸化Ｃ末端に関して（さらに）反応性であり得るように選択され得る。さらなる実施形態では、電子求引基は、特に、エステル基及びチオエステル基からなる群から選択される官能基、特に、エステル基、又は特に、チオエステル基を含み得る。さらなる実施形態では、電子求引基は、ケトン官能基を特に含み得る。さらなる実施形態では、電子求引基は、ニトロ官能基を特に含み得る。さらなる実施形態では、電子求引基は、スルホキシド官能基を特に含み得る。さらなる実施形態では、電子求引基は、リン酸エステル官能基を特に含み得る。さらなる実施形態では、電子求引基は、アシルヒドラジド官能基を特に含み得る。さらなる実施形態では、電子求引基は、シアノ官能基を特に含み得る。さらなる実施形態では、電子求引基は、トリハロゲンメチル官能基を特に含んでもよく、特に、トリハロゲンメチル官能基は、Ｆ、Ｃｌ及びＢｒを含む群から選択されるハロゲンを含み、より詳細には、トリハロゲンメチル官能基は、同一の３つのハロゲンを含み、例えば、－ＣＦ_３、－ＣＣｌ_３又はＣＢｒ_３、特に、－ＣＦ_３を含むトリハロゲンメチル官能基が挙げられる。

【0044】

さらなる実施形態では、Ｒ’’は、エステル、シアノ基、及び－ＣＦ_３からなる群から選択される官能基を含み得る。実施形態では、Ｒ’’がエステルを含む場合、Ｒ’’は、メチルエステルを特に含み得る。したがって、実施形態では、Ｒ’’は、メチルエステルを含み得る。

【0045】

「アルキル基」の用語は、１～１０のＣ原子、特に、１～６のＣ原子、例えば、１～４のＣ原子を含むアルキル基を本明細書において特に指し得る。

【0046】

「アリール基」の用語は、芳香環内に５～１０の要素を含む芳香環に由来する官能基又は置換基を本明細書において特に指し得る。

【0047】

実施形態では、第１の段階において、ペプチドは、第１の環境に曝露し得る。特に、ペプチド（及び第１の触媒）は、第１の溶媒を含む第１の混合物中に配置し得る。実施形態では、第１の溶媒は、水、ジメチルスルホキシド、（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、及びテトラヒドロフランを含む群から、特に、水、ＤＭＳＯ及びＤＭＦを含む群から特に選択され得る。

【0048】

第１の混合物は、第１の溶媒、ペプチド、及び第１の反応体の１又は２以上を特に含み得る。実施形態では、第１の混合物は、さらなる添加物（以下参照）を含み得る。

【0049】

実施形態では、第１の溶媒は、水を含み得る。このような実施形態では、第１の溶媒は、１～１１の範囲から、特に、１．５～８の範囲から、又は、７～１０の範囲から選択されるｐＨを有し得る。したがって、実施形態では、第１の環境は、１～１１の範囲から、特に、１．５～８の範囲から、例えば、７～１０の範囲から選択されるｐＨを有し得る。特に、第１の反応体が式ＩＡによる第１の化学構造を有する実施形態では、第１の段階が、５～１０の範囲、例えば、約７のｐＨを有する第１の環境において発生することが特に有益であり得る。

【0050】

さらなる実施形態では、第１の溶媒は、少なくとも１、特に、少なくとも１．５、例えば、少なくとも２のｐＨを有し得る。さらなる実施形態では、第１の環境、特に、第１の溶媒は、少なくとも５、特に、少なくとも６、例えば、少なくとも７のｐＨを有し得る。さらなる実施形態では、第１の環境、特に、第１の溶媒は、最大で１１、特に、最大で１０．５、例えば、最大で１０のｐＨを有し得る。さらなる実施形態では、第１の環境、特に、第１の溶媒は、最大で９、特に、最大で８．５、例えば、最大で８のｐＨを有し得る。

【0051】

実施形態では、第１の溶媒は、１００ｖｏｌ．％を含んで少なくとも７０ｖｏｌ．％、例えば、少なくとも８０ｖｏｌ．％、特に、少なくとも９０ｖｏｌ．％の水を含み得る。

【0052】

さらなる実施形態では、第１の溶媒は、有機溶媒、特に、ＤＭＳＯ、アセトニトリル及びＤＭＦを含む群から選択される有機溶媒を含み得る。実施形態では、第１の溶媒は、１００ｖｏｌ．％を含んで少なくとも７０ｖｏｌ．％、例えば、少なくとも８０ｖｏｌ．％、特に、少なくとも９０ｖｏｌ．％の有機溶媒を含み得る。「有機溶媒」の用語は、本明細書において、複数の（異なる）有機溶媒をも指す。

【0053】

実施形態では、第１の環境、特に、第１の混合物、さらに詳細には、第１の溶媒は、５～４５℃の範囲から、特に、１０～４０℃の範囲から選択される第１の温度を有し得る。さらなる実施形態では、方法は、特に、第１の段階において、第１の温度を最大で４５℃、例えば、最大で４０℃に制御するステップを含み得る。さらなる実施形態では、方法は、温度制御要素、特に、冷却要素を使用して第１の温度を制御するステップを含み得る。

【0054】

実施形態、特に、第１の溶媒が水を含む実施形態では、第１の混合物は、反応性酸素種のためのシーケンシング剤をさらに含み得る。特に、実施形態では、第１の混合物は、１～１０ｖｏｌ．％のグリセリンを含み得る。

【0055】

さらに、実施形態では、第１の溶媒は、水及び有機溶媒、例えば、ＤＭＦ又は１－ブタノールを含み得る。特に、第１の溶媒は、少なくとも５０ｗｔ．％の水及び２～２０ｗｔ．％、例えば、５～１５ｗｔ．％の有機溶媒を含み得る。有機溶媒により、第１の触媒の溶解が促進され得る。さらなる実施形態では、第１の溶媒は、水相及び有機相を含み得る。

【0056】

実施形態では、第１の環境、特に、第１の混合物は、０．０２～１００ｍＭのペプチド、特に、０．０５～５０ｍＭのペプチドを含み得る。

【0057】

さらなる実施形態では、第１の環境、特に、第１の混合物は、０．０５～１０００ｍＭ、特に、０．１～５００ｍＭの第１の反応体を含み得る。

【0058】

実施形態では、第１の環境、特に、第１の混合物は、塩、特に、０．０５～１００ｍＭの塩、例えば、１～５０ｍＭの塩、特に、２～１０ｍＭの塩を含み得る。実施形態では、特に、第１の溶媒が有機溶媒を含む実施形態では、塩は、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ギ酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、フッ化物及び炭酸塩を含む群から、特に、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ギ酸セシウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、ＣｓＦ、ＣｓＯＡｃ、Ｃｓ_２ＣＯ_３及びＫ_２ＣＯ_３を含む群から、より詳細には、Ｋ_２ＨＰＯ_４及びギ酸セシウムを含む群から選択され得る。

【0059】

第１の段階後、第１の混合物中に残った第１の反応体が尚存在し得る。特定の場合では、例えば、第１の段階の終わりに第１の混合物を保存する場合、残った第１の反応体は、ペプチドと不必要に反応し得る。したがって、実施形態では、方法は、第１の段階の後（又は「終わり」）にチオール化合物、特に、３－メルカプト－Ｎ－メチルプロパンアミド、２－メルカプトエタノール及びエチル３－メルカプトプロピオン酸を含む群から選択されるチオール化合物を加えるステップを含み得る。チオール化合物を追加すると、副生成物の形成が減少、特に、除去され得る。

【0060】

第２の段階は、第１の中間体を第２の反応体に曝露するステップを含み得る。特に、第２の段階は、第１の中間体及び第２の反応体を反応させて、ペプチド－カーゴコンジュゲートを提供するステップを含み得る。第２の反応体は、式IIIによる第２の化学構造を特に有してもよく、

【0061】

【化6】

【0062】

式中、Ｒ’’’は、カーゴを含む。

【0063】

実施形態では、第２の段階において、第１の中間体は、第２の環境に曝露し得る。特に、第１の中間体（及び第２の反応体）は、第２の溶媒を含む第２の混合物中に配置し得る。実施形態では、第２の溶媒は、特に、水、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、アセトニトリル、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、及びテトラヒドロフランを含む群、特に、水、ＤＭＳＯ、アセトニトリル及びＤＭＦを含む群から選択され得る。

【0064】

第２の混合物は、第２の溶媒、第１の中間体、及び第２の反応体の１又は２以上を特に含み得る。実施形態では、第２の混合物は、さらなる添加物（以下参照）を含み得る。

【0065】

実施形態では、第２の溶媒は、水を含み得る。このような実施形態では、第２の溶媒は、５．５～１０．５の範囲、特に、６～１０の範囲、例えば、６．５～９．５の範囲から選択されるｐＨを有し得る。さらなる実施形態では、第２の溶媒は、少なくとも４．５、特に、少なくとも５、例えば、少なくとも５．５のｐＨを有し得る。さらなる実施形態では、第２の溶媒は、少なくとも６、特に、少なくとも６．５のｐＨを有し得る。さらなる実施形態では、第２の溶媒は、最大で１１、特に、最大で１０．５のｐＨを有し得る。さらなる実施形態では、第２の溶媒は、最大で１０、特に、最大で９．５のｐＨを有し得る。

【0066】

式IIＢ（以下参照）による化学構造を有する第１の中間体に関しては、高ｐＨでは、副生成物の形成が引き起こされ得る一方、低ｐＨでは、反応率及び収率が低下し得る。特に、このような実施形態では、第２の溶媒は、６～１０のｐＨ範囲から選択されるｐＨ、例えば、約８のｐＨを有し得る。第２の溶媒のこのようなｐＨ値により、特に良好な結果が得られ得る。

【0067】

実施形態では、第２の段階において、第２の環境、特に、第２の混合物、より詳細には、第２の溶媒は、第２の温度を有し得る。第２の温度が低い場合、第１の中間体との間の反応は、緩徐に進行し得る。しかし、第２の温度が高いと、（さらなる）副生成物の形成が引き起こされ得る。したがって、実施形態では、第２の温度は、２～５５℃の範囲、例えば、４～５０℃の範囲から選択され得る。第１の中間体が式IIＡ（以下参照）による第１の化学構造を有する実施形態では、第２の温度は、３０～５０℃の範囲から特に選択され得る。第１の中間体が式IIＢ（以下参照）による第１の化学構造を有する実施形態では、第２の温度は、４～４５℃の範囲から特に選択され得る。

【0068】

さらなる実施形態では、第２の溶媒は、有機溶媒、特に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含む群から選択される有機溶媒を含み得る。

【0069】

実施形態では、第２の溶媒は、水及び有機溶媒を含んでもよく、特に、第２の溶媒は、最大で２５ｖｏｌ．％、例えば、最大で２０ｖｏｌ．％の有機溶媒を含む。さらなる実施形態では、第２の溶媒は、少なくとも７０ｖｏｌ．％の水、例えば、少なくとも７５ｖｏｌ．％の水、特に、少なくとも８０ｖｏｌ．％の水を含み得る。

【0070】

実施形態では、第２の環境、特に、第２の混合物は、０．００５～２００ｍＭの第１の中間体、特に、０．０１～１００ｍＭの第１の中間体、例えば、０．１～１００ｍＭの第１の中間体を含み得る。

【0071】

さらなる実施形態では、第２の環境、特に、第２の混合物は、０．００５～４００ｍＭ、特に、０．０１～２００ｍＭ、例えば０．１～２００ｍＭの第２の反応体を含み得る。

【0072】

酸素の存在は、第１の段階において第１の中間体を提供するのに、及び／又は第２の段階においてタンパク質－カーゴコンジュゲートを提供するのに害を及ぼし得る。特に、酸素の存在は、第１の段階におけるペプチドの光触媒脱炭酸化に害を及ぼし得る。詳細には、第１の段階では、酸素の存在により、第１の中間体収率の低下が生じ得る。さらに、第２の段階では、酸素の存在により、第２の反応体又は還元剤（以下参照）に存在し得るＳＨ基の酸化が生じることがあり、これによってジスルフィド形成が生じ得る。したがって、両方の段階では、酸素の存在により、本発明の方法が妨害され得る。

【0073】

したがって、実施形態では、第１の環境、特に、第１の混合物は、脱気緩衝液を含み得る。特に、第１の環境、特に、第１の混合物は、１０ｐｐｍ以下の溶存酸素、例えば、５ｐｐｍ以下の溶存酸素、特に、２ｐｐｍ以下の溶存酸素を含み得る。さらなる実施形態では、第１の環境、特に、第１の混合物は、１ｐｐｍ以下の溶存酸素、例えば、０．８ｐｐｍ以下の溶存酸素、特に、０．６ｐｐｍ以下の溶存酸素、例えば、０．５ｐｐｍ以下の溶存酸素を含み得る。さらなる実施形態では、第１の混合物は、最大で０．４ｐｐｍの溶存酸素、例えば、０．２～０．４ｐｐｍの溶存酸素を含み得る。

【0074】

実施形態では、方法は、第１の環境、特に、第１の混合物中の（溶存）酸素濃度を制御する、特に、低下させるステップを含み得る。特に、方法は、第１混合物、特に、第１の溶媒を不活性ガス、特に、Ｎ_２によりスパージする（sparging）（又は「パージする（purging）」）ステップを含み得る。

【0075】

さらなる実施形態では、方法は、不活性ガス、特に、Ｎ_２、又は特に、Ａｒ下の脱気緩衝液中で第１の段階を実行するステップを含み得る。アルゴンは、空気よりも重いため、特に適し得る。

【0076】

さらなる実施形態では、第２の環境、特に、第２の混合物は、脱気緩衝液を含み得る。特に、第２の環境、特に、第２の混合物は、１０ｐｐｍ以下の溶存酸素、例えば、５ｐｐｍ以下の溶存酸素、特に、２ｐｐｍ以下の溶存酸素を含み得る。さらなる実施形態では、第２の環境、特に、第２の混合物は、１ｐｐｍ以下の溶存酸素、例えば、０．８ｐｐｍ以下の溶存酸素、特に、０．６ｐｐｍ以下の溶存酸素を含み得る。さらなる実施形態では、第２の混合物は、最大で０．４ｐｐｍの溶存酸素、例えば、０．２～０．４ｐｐｍの溶存酸素を含み得る。

【0077】

当業者に公知のように、溶存酸素は、ウィンクラー滴定を使用して特に決定し得る。特に、とりわけ水に関しては、溶存酸素に対してｐｐｍ及びｍｇ／Ｌを典型的に、互換的に使用し得る。したがって、実施形態では、第１の混合物（又は第２の混合物）は、１０ｍｇ／Ｌ以下の溶存酸素、例えば、５ｍｇ／Ｌ以下の溶存酸素、特に、２ｍｇ／Ｌ以下の溶存酸素を含み得る。さらなる実施形態では、第１の混合物（又は第２の混合物）は、１ｍｇ／Ｌ以下の溶存酸素、例えば、０．８以下の溶存酸素、特に、０．６ｍｇ／Ｌ以下の溶存酸素、例えば、０．５ｍｇ／Ｌ以下の溶存酸素を含み得る。さらなる実施形態では、第１の混合物（又は第２の混合物）は、最大で０．４ｍｇ／Ｌの溶存酸素、例えば、０．２～０．４ｍｇ／Ｌの溶存酸素を含み得る。

【0078】

実施形態では、方法は、第２の環境、特に、第２の混合物中の（溶存）酸素濃度を制御する、特に、低下させるステップを含み得る。特に、方法は、第２の混合物、特に、第２の溶媒を不活性ガス、特に、Ｎ_２によりスパージするステップを含み得る。

【0079】

さらなる実施形態では、方法は、不活性ガス、特に、Ｎ_２、又は特に、Ａｒ下の脱気緩衝液中で第２の段階を実行するステップを含み得る。アルゴンは、空気よりも重いため、特に適し得る。

【0080】

第１の段階及び第２の段階は、（本質的に）同一の溶媒中で特に実施し得る。例えば、第１の段階及び第２の段階の両方は、水中で実行してもよい。しかし、実施形態では、第１の段階及び第２の段階は、種々の溶媒中で実行し得る。このような実施形態では、方法は、中間段階をさらに含み得る。中間段階は、特に、第１の反応体及び／又はペプチド及び／又は第１の触媒の残り、特に、第１の触媒、又は特に、第１の反応体（の残り）、又は特に、ペプチド（の残り）から第１の中間体を分離するステップを含み得る。中間段階は、第１の溶媒から第１の中間体を分離するステップをさらに含み得る。実施形態では、中間段階は、抽出、特に、有機溶媒による抽出、例えば、酢酸エチル、ジクロロメタン又はエーテルの１又は２以上、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル及びジイソプロピルエーテルを含む群から選択されるエーテルによる抽出を含み得る。

【0081】

中間段階は、特に、第１の段階及び第２の段階の間に時間的に配置し得る。

【0082】

本発明の方法は、（天然）タンパク質原性アミノ酸、例えば、標準アミノ酸、並びにタンパク質に天然には組み込まれない天然アミノ酸、例えば、オルニチン、並びに非天然アミノ酸を含む多種多様なＣ末端残基と適合し得る。特に、実施形態では、ペプチドは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパルテート、システイン、グルタメート、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ピロリジン、セレノシステイン、トリプトファン、チロシン及びオルニチンを含む群、特に、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパルテート、システイン、グルタメート、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン及びチロシンを含む群から選択されるＣ末端残基を含み得る。

【0083】

特に、第１の反応体が式ＩＡによる第１の化学構造を有する実施形態では、ペプチドは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパルテート、システイン、グルタメート、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ピロリジン、セレノシステイン、トリプトファン、チロシン及びオルニチンを含む群、特に、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパルテート、システイン、グルタメート、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン及びチロシンを含む群から選択されるＣ末端残基を含み得る。

【0084】

さらなる実施形態では、第１の反応体が式ＩＢによる第１の化学構造を有する場合、ペプチドは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパルテート、システイン、グルタメート、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ピロリジン、セレノシステイン、トリプトファン、チロシン及びオルニチンを含む群、特に、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパルテート、システイン、グルタメート、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン及びチロシンを含む群から選択されるＣ末端残基を含み得る。特に、カーゴは、本発明の方法及び式IIＢによる第１の中間体を使用して、Ｃ末端残基であるアスパラギン、アルギニン及びプロリンを有するペプチドに良好に結合させた。したがって、さらなる実施形態では、ペプチドは、アスパラギン、アルギニン及びプロリンを含む群から選択されるＣ末端残基を含み得る。

【0085】

ペプチドにおける一部のアミノ酸、例えば、システイン及びセレノシステインでは、第１の段階前にアミノ酸を保護することが有益であり得る。したがって、実施形態では、方法は、第１の段階前に時間的に配置する準備段階をさらに含んでもよく、準備段階は、所定のアミノ酸型のアミノ酸、例えば、システイン及び／又はセレノシステインに保護基を提供するステップを含む。例えば、実施形態では、準備段階は、アクリルアミド、マレイミド、アルファ－ハロアセトアミドとペプチドを反応させるステップを含み得る。さらなる実施形態では、方法は、低分子活性化ジスルフィドによるジスルフィド形成によってシステイン及び／又はセレノシステインをキャッピングするステップを含み得る。

【0086】

実施形態では、第１の反応体は、式Ｉによる第１の化学構造を有してもよく、

【0087】

【化7】

【0088】

特に、式中、Ｒ_０はＨであり、特に、Ｒ’はアルキル基であり、特に、Ｒ’’はチオエステルである。したがって、実施形態では、第１の反応体は、式ＩＡによる第１の化学構造を有してもよく、

【0089】

【化8】

【0090】

特に、式中、Ｒ’は、アルキル基、例えば、メチル基であり、特に、Ｒ_２は、アルキル基である。実施形態では、Ｒ_２は、アルキル基を含み得る。さらなる実施形態では、Ｒ_２は、鎖の下流にさらなる官能基、特に、アミド、エステル、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、アミン、芳香族を含む群から選択される官能基を有していてもよい。

【0091】

第１の反応体が式ＩＡによる第１の化学構造を有する実施形態では、第１の触媒は、イリジウム触媒を特に含み得る。イリジウム触媒は、このような第１の反応体と組み合わせて特に良好に作用し得る。

【0092】

同様に、第１の反応体が式ＩＡによる第１の化学構造を有する実施形態では、第１の溶媒は、ＤＭＳＯを特に含んでもよく、第２の溶媒は、水を特に含み得る。

【0093】

このような実施形態は、ペプチドのＣ末端にチオエステル官能基を提供するのに特に適し得る。さらなる実施形態では、第１の中間体は、式IIＡによる化学構造を有してもよく、

【0094】

【化9】

【0095】

特に、式中、Ｒ’は、アルキル基であり、特に、Ｒ_２は、アルキル基であり、特に、Ｒ_３は、ペプチドを指す。

【0096】

さらなる実施形態では、第１の溶媒は、無水溶媒、例えば、ＤＭＳＯ及びＤＭＦの１又は２以上を特に含んでもよく、すなわち、実施形態では、第１の段階は、第１の溶媒中で特に実行してもよく、第１の溶媒は、無水溶媒、例えば、ＤＭＳＯ及びＤＭＦの１又は２以上を含む。特に、無水溶媒により、第１の中間体の安定性が向上し得る。

【0097】

さらなる実施形態では、第２の反応体は、式IIIＡによる第２の化学構造を特に有してもよく、

【0098】

【化10】

【0099】

特に、式中、Ｘは、Ｏ又はＮＨであり、特に、Ｒ１は、カーゴを含む。

【0100】

特に、実施形態では、方法、特に、第２の段階は、式IIＡによる化学構造を有する第１の中間体を、式IIIＡによる化学構造を有する第２の反応体と反応させるステップを含み得る。特に、第１の中間体及び第２の反応体は、トランスチオエステル化及び後続のＳ－Ｎアシル転換を含む第２の反応を介して反応し得る。

【0101】

第１の中間体が式IIＡによる化学構造を有する実施形態では、第２の環境、特に、第２の溶媒は、０．１～１００ｍＭの第１の中間体を特に含み得る。さらに、このような実施形態では、第２の環境、特に、第２の溶媒は、０．１～２００ｍＭの第２の反応体を含み得る。

【0102】

第１の中間体が式IIＡによる化学構造を有する実施形態では、第２の段階は、これによって参照により本明細書に組み込むAgouridas et al., "Native Chemical Ligation and Extended Methods: Mechanisms, Catalysis, Scope, and Limitations", 2019, Chemical Reviews及びBoll et al., "One-pot chemical synthesis of small ubiquitin-like modifier protein-peptide conjugates using bis(2-sulfanylethyl)amido peptide latent thioester surrogates", 2015, Nature Protocolsに記載のネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）手順に従って本質的に実行し得る。したがって、実施形態では、第２の混合物は、４－メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）を含んでもよく、ＭＰＡＡの存在により、第２の段階に有益に影響し得る反応性チオエステル中間体の形成が促進され得る。同様に、実施形態では、第２の混合物は、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を含んでもよく、ＴＣＥＰの存在により、第２の段階に有益に影響し得る、第１の中間体及び／又は第２の反応体上での遊離ＳＨ基の維持が促進され得る。さらなる添加物を使用してＮＣＬ手順に有益に影響させてもよく、次いでこれにより本発明の方法の実施形態の第２の段階に有利に影響させ得ることは、当業者に明らかである。

【0103】

したがって、実施形態では、式IVＡによる化学構造を有するペプチド－カーゴコンジュゲートを方法により提供してもよく、

【0104】

【化11】

【0105】

特に、式中、Ｒ’は、アルキル基であり、特に、Ｒ_３は、ペプチドを指し、特に、Ｘは、Ｏ又はＮＲであり、式中、Ｒは、Ｈ又はアルキルであり、特に、Ｘは、Ｏ又はＮＨであり、特に、Ｒ_１は、カーゴを含む。

【0106】

特に、式IIIＡによる第２の化学構造は、Ｎ末端システイン残基に類似することがあり、アミドを介してカーゴに結合していてもよく（ＣＯＮＲ）、特に、ＣＯＮＨ、例えば、Ｎ末端システイン残基を有する天然タンパク質におけるものであるか、又はエステルを介してカーゴに結合していてもよい（ＣＯＯ）。このような実施形態は、Ｎ末端システイン残基を有する第２のペプチドを含むカーゴの結合に、特に好都合であり得る。

【0107】

したがって、実施形態では、カーゴは、第２のペプチドを含み得る。これによって、実施形態では、ペプチド－カーゴコンジュゲートは、ペプチド－ペプチドコンジュゲート、すなわち、融合ペプチドを含み得る。さらなる実施形態では、第２のペプチドは、式IIIＡによるＮ末端、特に、Ｎ末端システイン残基を有し得る。したがって、本発明の方法により、融合ペプチド（又はタンパク質）を提供することが容易となることがあり、特に、ペプチド及び任意により第２のペプチドは、天然に生成される。したがって、本発明の方法により、非組換え融合ペプチド（又はタンパク質）を提供することが容易となり得る。

【0108】

Ｒ_３（例えば、式ＩＢを参照）が「完全」ペプチドを含まず、Ｒ_３が、このＣ末端カルボン酸基に事前に結合したペプチド部分を指し得ることは、当業者に明らかである。詳細には、Ｒ_３は、段階１の光脱炭酸化を介して除去されたＣ末端カルボン酸基以外のペプチドを含み得る。したがって、Ｒ_３は、ペプチド（又はコンジュゲートのペプチド部分）を実質的に指し得る。

【0109】

実施形態では、Ｒ_０は、ハライド、Ｏ－アシル基、炭酸基、スルホン酸基及びＮＲ_３を含む群から選択されることがあり、Ｒ’は、特に、Ｈであり得る。特に、Ｒ_０は、脱炭酸化ペプチドとの反応を促進する「脱離基」であり得る。したがって、実施形態では、第１の反応体は、式ＩＢによる第１の化学構造を有してもよく、

【0110】

【化12】

【0111】

式中、Ｒ_０は、ハライド、Ｏ－アシル基、炭酸基、スルホン酸基及びＮＲ_３基からなる群から選択され、Ｒ’’は、エステル、チオエステル、アミド、ケトン、ニトロ、スルホキシド、スルホン、リン酸エステル、アシルヒドラジド、シアノ基、及びトリハロゲンメチル基からなる群から選択される官能基を含む電子求引基である。さらなる実施形態では、Ｒ’’は、エステル、例えば、メチルエステルを特に含み得る。

【0112】

特に良好な結果は、Ｒ’’がメチルエステル、特に、ＣＨ_３Ｏ（Ｃ＝Ｏ）を含む第１の反応体により得られた。この場合、Ｒ_０は、Ｏ－アシル基、特に、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３を含む。したがって、さらなる実施形態では、Ｒ’’は、メチルエステル、特に、ＣＨ_３Ｏ（Ｃ＝Ｏ）を含み得る。さらなる実施形態では、Ｒ_０は、Ｏ－アシル基、特に、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３を含み得る。

【0113】

第１の反応体が式ＩＢによる第１の化学構造を有する実施形態では、第１の触媒は、リボフラビン又はこの誘導体を特に含み得る。リボフラビン系触媒は、このような第１の反応体と組み合わせて特に良好に作用し得る。

【0114】

同様に、第１の反応体が式ＩＢによる第１の化学構造を有する実施形態では、第１の溶媒は、水を特に含んでもよく、第２の溶媒は、水を特に含み得る。

【0115】

さらに、第１の反応体が式ＩＢによる第１の化学構造を有する実施形態は、ペプチドのＣ末端にマイケル受容体官能基を提供するのに特に適し得る。さらなる実施形態では、第１の中間体は、式IIＢによる化学構造を有してもよく、

【0116】

【化13】

【0117】

特に、式中、Ｒ_３は、ペプチドを指し、Ｒ’’は、エステル、チオエステル、アミド、ケトン、ニトロ、スルホキシド、スルホン、リン酸エステル、アシルヒドラジド、シアノ基、及びトリハロゲンメチル基からなる群から選択される官能基を含む電子求引基である。

【0118】

特に、実施形態では、方法、特に、第２の段階は、式IIＢによる化学構造を有する第１の中間体を、式IIIによる化学構造を有する第２の反応体と反応させるステップを含み得る。特に、第１の中間体及び第２の反応体は、マイケル反応を介して反応し得る。

【0119】

第１の中間体が式IIＢによる化学構造を有する実施形態では、第２の環境、特に、第２の混合物は、０．０１～１００ｍＭの第１の中間体を特に含み得る。さらに、このような実施形態では、第２の環境、特に、第２の混合物は、０．０１～２００ｍＭの第２の反応体を含み得る。

【0120】

したがって、実施形態では、式IVＢによる化学構造を有する、ペプチド－カーゴコンジュゲートであって、

【0121】

【化14】

【0122】

式中、Ｒ_３が、ペプチドを指し、Ｒ’’が、エステル、チオエステル、アミド、ケトン、ニトロ、スルホキシド、スルホン、リン酸エステル及びアシルヒドラジド、シアノ基、及びトリハロゲンメチル基からなる群から選択される官能基を含む電子求引基であり、Ｒ’’’が、カーゴを含む、ペプチド－カーゴコンジュゲートを方法により提供し得る。

【0123】

さらなる実施形態では、カーゴは、抗体を含み得る。特に、当業者に公知のように、抗体は、複数のポリペプチドを含んでもよく、したがって、（他のペプチドと同様に）カーゴとしてこのペプチドに結合し得る。特に、抗体は、動物体内、特に、ヒト体内の（特定の）標的位置を標的とするように構成されていてもよく、ペプチドは、標的位置において（適切な）医学的又は治療的機能を有し得る。これによりペプチド－カーゴコンジュゲートによって、動物体内、特に、ヒト体内の特定の部位にペプチドを提供することが容易となり得る。したがって、本発明の方法により、ペプチド－抗体コンジュゲート、特に、抗体－薬物コンジュゲートを提供することが容易となり得る。

【0124】

実施形態では、カーゴは、（生じる）ペプチド－カーゴコンジュゲートを標的位置上に選択的に配置するのに適するタグを含み得る。

【0125】

カーゴの種々の特定の例を本明細書に記載する。しかし、本発明が、このような例に制限されず、多種多様な他のカーゴ化合物をさらに包含し得ることは、当業者に明らかである。

【0126】

さらなる態様では、ペプチド－カーゴコンジュゲート、特に、本発明の方法により得られるペプチド－カーゴコンジュゲートを本発明により提供し得る。特に、ペプチド－カーゴコンジュゲートは、式IVＡ又は式IVＢによる化学構造を有し得る。

【0127】

実施形態では、ペプチド－カーゴコンジュゲートは、式IVＡによる化学構造を有してもよく、

【0128】

【化15】

【0129】

特に、式中、Ｒ’はアルキル基であり、特に、Ｒ_３はペプチドを指し、特に、Ｘは、Ｏ又はＮＨであり、特に、Ｒ１はカーゴを含む。

【0130】

さらなる実施形態では、ペプチド－カーゴコンジュゲートは、式IVＢによる化学構造を有してもよく、

【0131】

【化16】

【0132】

特に、式中、Ｒ’’は、エステル、チオエステル、アミド、ケトン、ニトロ、スルホキシド、スルホン、リン酸エステル及びアシルヒドラジドからなる群から選択される官能基を含む電子求引基であり、特に、Ｒ’’’は、カーゴを含み、特に、Ｒ_３は、ペプチドを指す。

【0133】

実施形態では、カーゴは、抗体を含み得る。したがって、ペプチド－カーゴコンジュゲートは、ペプチド－抗体コンジュゲートを含み得る。

【0134】

さらなる実施形態では、ペプチドは、抗体（の１又は２以上のポリペプチド）を含み得る。このような実施形態では、カーゴは、例えば、薬物、例えば、ペプチド薬物を含み得る。特に、抗体のＣ末端は、ゲスト結合には典型的に関与しないことがあり、このため、この機能化は、抗体結合に干渉しないことがある。抗体は４つのＣ末端を一般に有するため、十分に定義されたカーゴの充填が促進され得る。

【0135】

実施形態では、ペプチド－カーゴコンジュゲートは、抗体薬物コンジュゲートとしての使用のためのものであり得る。特に、ペプチド－カーゴコンジュゲートは、医薬としての使用のためのものであることがあり、特に、ペプチドは、医学的に適切な活性を有し、特に、カーゴは抗体を含む。抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、特に、共有結合リンカーを介して、（細胞傷害性）薬物と結合する抗体の構築物である。抗体の目的は、（選択的）標的化であってもよく、薬物は、例えば、腫瘍（又は他の）細胞を殺傷するように作用し得る。リンカーは、抗体への薬物の結合を維持するように作用して、例えば、標的細胞又は組織の非存在下での薬物の放出を回避し得る。したがって、薬物が、安定な結合を介し、制御可能な抗体数で結合することが重要であり得る（これにより、不均一な混合物が生じることがあり、抗体の特性が変更され得るため、抗体の多数のアミン又はカルボン酸側鎖への結合が、それほど好ましくないものとなり得る。）したがって、抗体のＣ末端がゲスト結合には典型的に関与しないことがあり、このため、この機能化が抗体結合に干渉しないことがあることをも考慮すれば、本発明の方法は、抗体－薬物コンジュゲートを提供するのに特に適し得る。

【0136】

実施形態では、カーゴは、第２のペプチドを含み得る。したがって、ペプチド－カーゴコンジュゲートは、融合ペプチド、特に、非組換え融合ペプチドを含み得る。

【0137】

さらなる実施形態では、カーゴは、標的位置上、例えば、表面上にペプチド－カーゴコンジュゲートを選択的に配置するのに適するタグを含み得る。さらなる実施形態では、タグは、抗体を含み得る。このような実施形態により、ペプチドのシーケンシングが促進されることがあり、ペプチドアレイを提供することが容易となり得る。

【0138】

したがって、さらなる態様では、本発明は、本発明によるペプチド－カーゴコンジュゲートを含むペプチドアレイを提供し、特に、ペプチド－カーゴコンジュゲートは、タグを含み得る。特に、ペプチドアレイは、固体表面、例えば、スライドガラスに結合するペプチドのライブラリーを含み得る。このようなアレイは、抗体をプロファイリングし、エピトープ及び受容体－リガンド相互作用をマッピングするためのペプチド薬物候補、酵素阻害物質、及び酵素基質の同定のために大規模に使用し得る。このようなアレイを生成するための最も一般的な方法は、信頼性及び選択的な結合化学反応を必要とし得る共有結合によるものであり、例えば、これにより参照によって本明細書に組み込むSzymczak et al., “Peptide Arrays: Development and Application”, Analytical Chemistry, 2018に記載のものが挙げられる。通常、適切な化学基をペプチド合成に導入するが、先行技術の方法によって未変性のペプチド（生物学的起源から単離したペプチド）に導入することは困難であり得る。しかし、本発明の方法により、ペプチドにおける適する化学基の選択的Ｃ末端導入が促進されて、ペプチドアレイを提供することが容易となり得る。したがって、実施形態では、カーゴは、標的位置上、特に、表面上へのペプチド－カーゴコンジュゲートの選択的配置に適するタグを含み得る。例えば、タグは、クリック化学に適し得る。実施形態では、タグは、ポリヌクレオチド（標的位置において相補性ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように構成される）、ビオチンタグ（標的位置におけるアビジン又はストレプトアビジンとのハイブリダイズに適する）及びアジ化物含有ペプチド（シクロオクチン修飾表面上でのクリック化学による化学的固定化に適する）を含む群から選択され得る。ペプチドアレイの標的位置におけるペプチド－カーゴコンジュゲートの配置を可能とするために、カーゴに対して多くの特定の選択が行われ得ることは、当業者に明らかである。

【0139】

さらなる態様では、本発明は、ペプチドシーケンシングのためのペプチド－カーゴコンジュゲートの使用を提供し得る。特に、次世代ペプチド／タンパク質シーケンシング技術、例えば、これにより参照によって本明細書に組み込むAlfaro et al., “The emerging landscape of single-molecule protein sequencing technologies”, Nature Methods, 2021に記載のものは、表面上へのペプチドの固定化、又はナノポアを通して転位置が促進される分子単位へのペプチドの結合のいずれかを含み得る。両方のシナリオでは、表面上での信頼性の位置づけを提供するために、又はナノポアを通過する場合、ペプチド上の単一の特定の位置において結合が生じることが重要である。当業者に明らかとなるように、ペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかへの結合は、特に好都合であり得る。本発明の方法により、ペプチドのＣ末端におけるペプチド及び表面又は分子単位の間の結合を提供することが容易となり、これによりペプチドのペプチドシーケンシングが促進され得る。特に、このような実施形態では、カーゴは、ポリヌクレオチド、特に、一本鎖ポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、例えば、表面に結合する（相補性）ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを介して、表面上にペプチドを配置するために構成され得る。ポリヌクレオチドは、ペプチド－カーゴコンジュゲートによるナノポアの通過が促進されるように、さらに構成され得る。

【0140】

本明細書に記載の実施形態は、本発明の単一の態様に制限されない。例えば、方法を記載する実施形態は、（生じる）ペプチド－カーゴコンジュゲートにさらに関連し得る。同様に、ペプチド－カーゴコンジュゲートの実施形態は、方法の実施形態にさらに関連し得る。特に、特定の基（例えば、特異的に選択された潜在的Ｒ’’基）により構造式を記載する方法の実施形態は、ペプチド－カーゴコンジュゲートが、実施形態において、このような基（例えば、特異的に選択された潜在的Ｒ’’基）を有し得ることを示し得る。

【図面の簡単な説明】

【0141】

ここで、対応する参照記号により対応する部分を示し、添付の模式図を参照して、単なる例として本発明の実施形態を記載する。

【図1A】～

【図1B】本発明の方法の実施形態を模式的に示す図である。模式図は、必ずしも縮尺通りではない。

【発明を実施するための形態】

【0142】

図１Ａ～Ｂでは、ペプチド１１０のＣ末端１１１にカーゴを提供するため、すなわち、ペプチド－カーゴコンジュゲート２５０を提供するための方法の実施形態を模式的に示す。示す実施形態では、方法は、第１の段階及び第２の段階を含む。第１の段階は、ペプチド１１０のＣ末端１１１を第１の触媒１３０及び第１の放射１４０の存在下で第１の反応体１２０と反応させて、第１の中間体１５０を提供するステップを含み得る。特に、第１の触媒１３０は、第１の放射１４０の存在下でペプチド１１０のＣ末端１１１を脱炭酸化するように構成されることがあり、これによりペプチドのＣ末端に反応性ラジカル基が生じ得る。第１の反応体１２０は、式Ｉによる第１の化学構造を特に有し得る。

【0143】

【化17】

【0144】

特に、式中、Ｒ_０は、Ｈ、ハライド、Ｏ－アシル基、炭酸基、スルホン酸基及びＮＲ_３基からなる群から選択され、各Ｒは、Ｈ及びアルキル基から独立的に選択されるか、又はＮＲ_３は、ピリジニウム若しくはこの誘導体を含み、特に、Ｒ’は、Ｈ、アリール基、及びアルキル基からなる群から選択され、特に、Ｒ’’は、エステル、チオエステル、アミド、ケトン、ニトロ、スルホキシド、スルホン、リン酸エステル及びアシルヒドラジド、シアノ基、及びトリハロゲンメチル基からなる群から選択される官能基を含む電子求引基である。実施形態では、第２の段階は、第１の中間体１５０を第２の反応体２２０に曝露するステップを含んでもよく、特に、第２の反応体２２０は、式IIIによる第２の化学構造を有し、

【0145】

【化18】

【0146】

式中、Ｒ’’’は、カーゴを含む。

【0147】

図１Ａは、Ｒ_０がＨであり、Ｒ’がアルキル基であり、Ｒ’’がチオエステルであり、Ｒ_２が、アルキル基、例えば、メチル基であり、第２の化学構造が、式IIIＡによるものであり、

【0148】

【化19】

【0149】

式中、Ｘが、Ｏ又はＮＨであり、Ｒ１がカーゴを含む、実施形態を示す。

【0150】

図１Ｂでは、Ｒ_０が、ハライド、Ｏ－アシル基、炭酸基、スルホン酸基、及びＮＲ_３基を含む群から選択され、Ｒ’が、Ｈである、実施形態を模式的に示す。

【0151】

実施形態では、第１の放射１４０は、３７５～５２５ｎｍの範囲、例えば、４００～５２５ｎｍの範囲から選択され得る。特に、第１の放射１４０は、３７５～５２５ｎｍの範囲、例えば、４００～５２５ｎｍの範囲の第１の波長を含み得る。このような波長を有する第１の放射は、第１の触媒１３０により触媒され得る、ペプチド１１０のＣ末端１１１の光活性化脱炭酸を促進するのに特に適し得る。

【0152】

実施形態では、第１の中間体１５０は、第２の段階において第２の環境２００に曝露し得る。特に、第１の中間体１５０は、第２の段階において第２の溶媒２０１に曝露してもよく、特に、第２の溶媒２０１を含む第２の混合物中で第２の段階を実行する。第２の溶媒１０１は、水、ＤＭＳＯ及びＤＭＦのうちの１又は２以上を特に含み得る。さらなる実施形態では、第２の環境２００、特に、第２の混合物は、１ｐｐｍ以下の溶存酸素を含む。さらなる実施形態では、第１の段階は、不活性ガス、例えば、Ｎ_２又はＡｒ下で実施し得る。

【0153】

実施形態では、ペプチド１１０は、第１の段階において第１の環境１００に曝露し得る。特に、ペプチド１１０は、第１の段階において第１の溶媒１０１に曝露してもよく、特に、第１の溶媒１０１を含む第１の混合物中で第１の段階を実行する。第１の溶媒１０１は、水、ＤＭＳＯ及びＤＭＦのうちの１又は２以上を特に含み得る。さらなる実施形態では、第１の環境１００、特に、第１の混合物は、１ｐｐｍ以下の溶存酸素を含む。さらなる実施形態では、第２の段階は、不活性ガス、例えば、Ｎ_２又はＡｒ下で実施し得る。

【0154】

図１Ａ～Ｂでは、ペプチド－カーゴコンジュゲート２５０の実施形態をさらに模式的に示す。

【0155】

特に、図１Ａでは、式IVＡによる化学構造を有するペプチド－カーゴコンジュゲートを模式的に示し、

【0156】

【化20】

【0157】

特に、式中、Ｒ’は、アルキル基であり、特に、Ｒ_１は、カーゴを含み、特に、Ｒ_３は、ペプチドを指す。

【0158】

図１Ｂでは、式IVＢによる化学構造を有するペプチド－カーゴコンジュゲートを模式的に示す。

【0159】

【化21】

【0160】

特に、式中、Ｒ’’は、エステル、チオエステル、アミド、ケトン、ニトロ、スルホキシド、スルホン、リン酸エステル及びアシルヒドラジドからなる群から選択される官能基を含む電子求引基であり、特に、Ｒ’’’は、カーゴを指し、特に、Ｒ_３は、ペプチドを含む。

【0161】

実験１－チオエステル官能基を含む第１の中間体
第１の段階－Ｋ_２ＨＰＯ_４保存液（Ｈ_２Ｏ中）２μＬ（１０．０ｅｑ、２．５μｍｏｌ、０．４３５ｍｇ）を４ｍＬのドラムバイアルに加え、凍結乾燥させた。Ｋ_２ＨＰＯ_４残留物を有するバイアルに、無水ＤＭＳＯ２８０μＬ、ペプチド１１０保存液（ＤＭＳＯ中）５０μＬ（１．０ｅｑ、０．２５μｍｏｌ）、第１の溶媒１３０保存液、特に、Ｉｒ［ｄＦ（ＣＦ_３）ｐｐｙ］_２（ｄｔｂｂｐｙ）ＰＦ_６保存液（ＤＭＳＯ中）（０．１２ｅｑ、０．０３μｍｏｌ）５０μＬ、第１の反応体保存液（ＤＭＳＯ中）２０μＬ（１０．０ｅｑ、２．５μｍｏｌ、０．５０ｍｇ）を加え、窒素でスパージすることにより混合物を１０分間脱気した。次いで、バイアルをアルゴンで洗い流し、パラフィルムを巻き、青色ＬＥＤ（４０Ｗ、Kessil社、およそ４ｃｍの距離）を使用して第１の放射１４０により１６時間、混合物を照射した。

【0162】

特に、実験１は、化学構造１Ａを有する２つの異なる第１の反応体であって、特に、式中、Ｒ’が、メチル基を含み、Ｒ_２が、メチルアセトアミド又はメチルプロパンアミドのいずれかを含む、第１の反応体、すなわち、式ＩＡ_１による第１の反応体であって、

【0163】

【化22】

【0164】

式中、ｎが、１又は２のいずれかである、第１の反応体を用いて実施した。

【0165】

次いで、副生成物の形成を減少、特に、回避するために、試料をチオール化合物、特に、３－メルカプト－Ｎ－メチルプロパンアミド０．５７μＬ（２０ｅｑ、５．０μｍｏｌ、０．５９６ｍｇ）又は２－メルカプトエタノール２０ｅｑ（５．０μｍｏｌ、０．３９１ｍｇ、０．３５μＬ）と混合し、混合物を液体窒素中で凍結させて一晩凍結乾燥させた。種々のチオール化合物により、類似の結果が提供された。

【0166】

中間段階－第１の段階の残留物を、超音波浴を使用してＨ_２Ｏ ５００μＬ中に溶解し、２つの部分に分けた。次いで、各部分をジエチルエーテル８００μＬにより３回抽出した。次いで、アルゴン流下でジエチルエーテルから乾燥させた両方の水層を組合せ、混合し、２００μＬ（最大０．１μｍｏｌの第１の中間体１５０）の２つの部分を２つの別々のチューブに移した。別々の画分を穿孔したキャップで閉じ、凍結乾燥させた。

【0167】

第２の段階－第２の段階では、次いでネイティブケミカルライゲーション手順を行った。詳細には、変性剤である塩酸グアニジン２８６．６ｍｇ（３ｍｍｏｌ）を別々のチューブに加え、リン酸ナトリウム緩衝液２５０μＬ（１００ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ９）中に可溶化した。次いで、この混合物を窒素で１０～１５分間脱気した。以下では、混合前に化合物を加えた場合はいつでも反応混合物をアルゴンで洗い流した。次いで、全溶液を、４－メルカプトフェニル酢酸１６．８２ｍｇ（１００μｍｏｌ）を含むチューブに移し、超音波浴を使用して、これを溶解した。次いで、この溶液２０９μＬを、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩３．０１ｍｇ（１０．５μｍｏｌ）を有するチューブに加え、溶解するまで混合した。この混合物に、６Ｍの水酸化ナトリウム２０μＬを加えて混合し、次いで全溶液を、第２の反応体を含むチューブに移し、溶解するまで混合した。この場合、第２の反応体は、Ｎ末端システイン残基を有する第２のペプチド（２ｅｑ、０．２μｍｏｌ）を含む。次いで最終的に、全混合物を、第１の中間体１５０の一部分（最大０．１μｍｏｌ）を含むチューブに移し、混合した。ｐＨは、６ＭのＮａＯＨを使用してｐＨ７．５～７．７に調整した。反応混合物は、３７℃で２～３日間振盪させた。

【0168】

したがって、ペプチド－カーゴコンジュゲートは、良好に得られた。特に、ペプチドに含まれるカーゴとして、融合ペプチドを良好に得た。

【0169】

第２の段階の代替手順－或いは、変性剤塩酸グアニジン５７３．２ｍｇ（６ｍｍｏｌ）及びリン酸ナトリウム緩衝液５００μＬをバイアルに加えた。次いで、全溶液を、４－メルカプトフェニル酢酸３３．６４ｍｇ（２００μｍｏｌ）を含むチューブに移し、超音波浴を使用して、これを溶解した。次いで、この溶液８４０μＬを、ＴＣＥＰ４８．１６ｍｇ（１６８．０μｍｏｌ）を有するチューブに加え、溶解するまで混合した。この混合物を、６ＭのＮａＯＨを使用してｐＨ７．５に調整した。次いで、ライゲーション緩衝液を２５分間脱気した。次いで、脱気したライゲーション緩衝液８５．６μＬを、Ｎ末端Ｃｙｓ残基を有するペプチドを含むチューブに移し、溶解するまで混合した。次いで、全混合物を、第１の中間体を含むチューブに移し、混合した。最終的には、全混合物を０．５ｍＬの反応チューブ内に移し、アルゴンで洗い流し、アルゴン下で蓋を閉じて、密封したガラスバイアル内に充填し、３７℃で３日撹拌した。

【0170】

したがって、ペプチド－カーゴコンジュゲートをも良好に得られた。特に、第２の段階の代替手順により（わずかに）高い収率が得られた。

【0171】

実験２－マイケル受容体を含む第１の中間体
実験２は、次の反応体：ペプチド１１０；Ｋ_２ＨＰＯ_４緩衝液ｐＨ７．０、１００ｍＭ；第１の触媒１３０、特に、リボフラビンテトラブチラート触媒；グリセリン１０％ｖ／ｖ；第１の反応体１２０、特に、メトキシエステル酢酸アリル；ＤＭＦ；及びＨ_２Ｏ、トリス－ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０、２０ｍＭ、並びに第２の反応体２２０、特に、エチル３－メルカプトプロピオン酸を使用して実施した。特に、２つの異なるペプチド１１０：ＴＲＡＰ－６（ペプチド６のトロンビン受容体活性化因子６；ＣＡＳ１４１１３６－８３－６）及びＡＣＥ Ｉ（アンジオテンシンＩ変換酵素阻害物質；ＣＡＳ５８－８２－２；ＮＣＢＩ受託番号Ｐ０ＤＭ７６）を実験２に使用した。

【0172】

調製：第１の触媒の保存液を、ＤＭＦ１ｍＬ中２．４６ｍｇの溶解時に最初に調製した。第１の触媒保存液をＮ_２で１０～１５分間、別々に脱気した後、これを反応溶液に加えた。また、各ペプチドの保存液を調製し、－２０℃で貯蔵した。ＴＲＡＰ－６は、ＤＭＦ６６８μＬ中２．５ｍｇ、３．３μｍｏｌ。ＡＣＥ Ｉは、ＤＭＦ４７２μＬ中２．５ｍｇ、２．４μｍｏｌ。第２の反応体の保存液は、ＤＭＦ１ｍＬ中に７．９μＬ（８．３８ｍｇ）を溶解することにより調製した。

【0173】

第１の段階－小型の撹拌棒を備えた４ｍＬのバイアルに、Ｋ_２ＨＰＯ_４緩衝液４０μＬ（１６．０ｅｑ．、４．０μｍｏｌ）をマイクロピペットにより加えた。次いで、１０％ｖ／ｖのＨ_２Ｏ中のグリセリン溶液２００μＬを加えた（最終濃度およそ４．５％）。第１の反応体１２０（０．４μＬ＝３９５μｇ、１０．０ｅｑ．、２．５μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３０μＬ）及びmilliQＨ_２Ｏ（９０μＬ）とともに混合物に加えた。後に、ＤＭＦ中のペプチド保存液５０μＬ（１．０ｅｑ、０．２５μｍｏｌ）を反応バイアル内で混合した。この時点では、反応バイアルをＮ_２で１０～１５分間脱気して、反応結果に干渉し得るＯ_２を取り除いた。脱気後、ＤＭＦ中の第１の触媒保存液４０μＬ（０．６ｅｑ．、０．０９８ｍｇ、０．１５０μｍｏｌ）をＡｒ流下でバイアル内に加えた。バイアルを閉じる前に、ねじ蓋にＡｒで洗い流して、Ｏ_２夾雑を回避した。次いで、バイアルをパラフィルムで覆い、４０Ｗの青色ｌｅｄを使用して８時間、第１の放射を提供した。

【0174】

中間段階－８時間の照射後、粗製反応混合物を凍結乾燥させて第１の溶媒を除去した。次いで、残りをmilliQＨ_２Ｏ ５００μＬ中に溶解し、２ｍＬのエッペンドルフ内に移して、Ｅｔ_２Ｏで３回抽出した。

【0175】

第２の段階－（milliQ）Ｈ_２Ｏ ５００μＬ中に事前に溶解した粗製反応混合物を、２つの部分に分割した。２５０μＬのそれぞれは、およそ０．１２５μｍｏｌの第１の中間体１５０を含んだ。一方の部分を凍結乾燥させて、すべてのＨ_２Ｏを除去し、新たに調製したトリス－ＨＣｌ緩衝液９０μＬを残留物に加えた。最終的には、第２の反応体保存液１０μＬ（５．０ｅｑ．、０．６２５μｍｏｌ、８３．８μｇ）を溶液に加えて、反応を引き起こした。撹拌開始前に、溶液をＡｒで洗い流して、チア－マイケル付加に干渉し得るＯ_２を酸化により除去し、これによりチオールが不活性化されてジスルフィドを形成した。次いで、エッペンチューブ内の溶液を４０℃で２４時間、撹拌機内に配置した。

【0176】

その後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ解析により、両方のペプチドにおいて、ペプチド－カーゴコンジュゲートが良好に得られたことが確認された。

【0177】

結論として、低分子アクリル酸リンカーによるＣ末端光脱炭酸アルキル化が、反応性部分をアミノ酸及び低分子ペプチド配列上に導入するための多目的な方法として示された。実験により、強力な求核試薬様チオールが、どのように関与して第１の中間体によるマイケル付加を受け、部位及び化学特異的修飾が促進され得るかが実証される。

【0178】

実験３－さらなる第１の反応体及び第２の反応体
本発明の方法は、以下の表に要約するように、他の多様な第１及び第２の反応体とともに、さらに適用した。

【0179】

【表1】

【0180】

第１の段階及び第２の段階に関しては、「＋／－」は、機能性であるが不十分な結果を示し、「＋」は、良好な結果を示し、「＋＋」は、優れた結果を示し、「Ｎ．Ｄ．」は、未決定を示す。詳細には、実験３．２では、第２の段階は緩徐に進み、実験３．２～３．８の第１の反応体により、広範な種々のＣ末端残基を有するペプチドとの適合性が実証された。実験３．９～３．１１では、Ｃ末端残基のサブセットについて優良に実施されたにもかかわらず、実験３．９～３．１３では、第１の中間体の安定性は、ペプチドのＣ末端残基に応じて変動した。

【0181】

「複数」の用語は、２又は３以上を指す。その上、「複数の」及び「多数の」の用語は、互換的に使用し得る。

【0182】

本明細書における「実質的に」又は「本質的に」の用語及び類似の用語は、当業者に理解される。また、「実質的に」又は「本質的に」の用語は、実施形態を「全体的に」、「完全に」、「全て」等により含み得る。したがって、実施形態では、実質的又は本質的な形容詞も除去し得る。適用可能な場合、「実質的に」の用語又は「本質的に」の用語は、１００％を含んで９０％又はこれ以上、例えば、９５％又はこれ以上、特に、９９％又はこれ以上、さらにより詳細には、９９．５％又はこれ以上にも関連し得る。その上、「約」及び「およそ」の用語も、１００％を含んで９０％又はこれ以上、例えば、９５％又はこれ以上、特に、９９％又はこれ以上、さらにより詳細には、９９．５％又はこれ以上に関連し得る。数値では、「実質的に」、「本質的に」、「約」及び「およそ」の用語が、９０％～１１０％、例えば、９５％～１０５％、特に、９９％～１０１％の範囲の、これが指す値（複数可）に関連し得ることも理解されるべきである。

【0183】

また、「～を含む（comprise）」の用語は、「～を含む（comprise）」の用語が「～からなる（consist of）」を意味する実施形態を含む。

【0184】

「及び／又は」の用語は、「及び／又は」の前後に言及する項目の１又は２以上に特に関連する。例えば、「項目１及び／又は項目２」の句及び類似の句は、項目１及び項目２の１又は２以上に関連し得る。ある実施形態では、「～を含む（comprising）」の用語は、「～からなる（consisting of）」を指し得るが、別の実施形態では、「少なくとも定義の種及び１又は２以上の他の任意の種を含む（containing）」ことをも指し得る。

【0185】

その上、第１の、第２の、第３の等の用語は、明細書及び特許請求の範囲において、類似の要素を区別するために使用し、連続的又は経時的順序を説明するために必ずしも使用しない。このように使用する用語が、適切な状況下で互換的であり、本明細書に記載する本発明の実施形態が、本明細書に記載又は例示する以外の順番で操作可能であることが理解されるべきである。

【0186】

操作における装置、器具、又は系を、とりわけ本明細書において記載し得る。当業者に明らかであるように、本発明は、操作の方法、又は操作における装置、器具、若しくは系に制限されない。

【0187】

「さらなる実施形態」の用語及び類似の用語は、これまでに考察した実施形態の特徴を含む実施形態を指し得るが、代替の実施形態をも指し得る。

【0188】

上記の実施形態によって本発明を制限ではなく、例示し、当業者が、添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、多くの代替実施形態を設計可能であることに注意すべきである。

【0189】

特許請求の範囲では、括弧の間に配置する任意の参照記号は、特許請求の範囲の制限として解釈されないものとする。

【0190】

「～を含む（to comprise）」の動詞及びこの活用の使用により、特許請求の範囲に述べるもの以外の要素又はステップの存在は除外されない。文脈上明らかに他に必要としない限り、本記載及び特許請求の範囲にわたって、「～を含む（comprise、comprising、include、including、contain、containing等）」の単語は、排他的又は徹底的意味に対する包括的意味により、すなわち、「～を含むが、これらに制限されない」の意味により解釈されるべきである。

【0191】

要素に先行する「a」又は「an」の冠詞により、このような要素の複数の存在は除外されない。

【0192】

本発明は、いくつかの別個の要素を含むハードウェア及び好適にプログラムしたコンピュータによって実行し得る。いくつかの手段を列挙する装置の請求項、又は器具の請求項、又は系の請求項では、このような手段のいくつかは、ハードウェアの全く同一の項目により具体化し得る。相互に異なる従属項において特定の尺度を列挙するという単なる事実は、このような尺度の組合せを都合よく使用することができないことを示すものではない。

【0193】

本発明はまた、装置、器具、若しくは系を制御し得るか又は本明細書に記載の方法若しくはプロセスを実行し得る、制御系を提供する。またさらに、本発明は、装置、器具、若しくは系と機能的に連結するか又はこれらに含まれるコンピュータ上での実行により、このような装置、器具、若しくは系の１又は２以上の制御可能な要素を制御する場合、コンピュータプログラム製品をも提供する。

【0194】

本発明は、本明細書に記載し及び／又は添付の図面に示す、特徴づけられる特徴の１又は２以上を含む、装置、器具、又は系にさらに適用する。本発明は、本明細書に記載し及び／又は添付の図面に示す、特徴づけられる特徴の１又は２以上を含む、方法又はプロセスにさらに関係する。その上、方法又はこの方法の実施形態を装置、器具、又は系において実行するものと記載する場合、装置、器具、又は系が、方法若しくはこの方法の実施形態のそれぞれに適するか又は（これらを実行するように）構成されることが理解される。

【0195】

本特許において考察する種々の態様は、さらなる利点を提供するために組み合わせることが可能である。さらに当業者は、実施形態を組み合わせることが可能であり、２つ以上の実施形態を組み合わせることも可能であることを理解する。その上、特徴の一部により、１又は２以上の分割出願の基礎を形成することが可能である。

【図1A】

【図1B】

【配列表】

2024511963000001.app

【国際調査報告】