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特表2024-511995がん治療における第一選択療法としてのｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ融合タンパク質の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-18
(54)【発明の名称】がん治療における第一選択療法としてのｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ融合タンパク質の使用
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20240311BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240311BHJP
A61K 31/337 20060101ALI20240311BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240311BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240311BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240311BHJP
C07K 14/46 20060101ALI20240311BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17
A61P35/00
A61K31/337
A61P43/00 121
A61K39/395 T
A61K47/64
C07K14/46 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023557284
(86)(22)【出願日】2022-03-18
(85)【翻訳文提出日】2023-11-13
(86)【国際出願番号】 US2022020878
(87)【国際公開番号】W WO2022198001
(87)【国際公開日】2022-09-22
(31)【優先権主張番号】63/162,691
(32)【優先日】2021-03-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523353579
【氏名又は名称】クラスノペロフ，ヴァレリー
【氏名又は名称原語表記】ＫＲＡＳＮＯＰＥＲＯＶ，Ｖａｌｅｒｙ
(74)【代理人】
【識別番号】110001302
【氏名又は名称】弁理士法人北青山インターナショナル
(72)【発明者】
【氏名】クラスノペロフ，ヴァレリー
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA94
4C076BB11
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA41
4C084MA66
4C084NA03
4C084NA12
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB11
4C085EE03
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA02
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB26
4C086ZC75
4H045AA30
4H045BA09
4H045EA20
(57)【要約】
本明細書で開示されるのは、現在の療法が有効でない、再発という結果になる、又はがん及び関連する腫瘍の種類に起因して使用が考慮もされないがんに対する有効な第一選択療法としてｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡを使用する方法である。
【選択図】図８
【選択図】図８
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含むがんを治療するための方法であって、前記ポリペプチド剤が前記治療における第一選択療法として使用される、方法。
【請求項2】
前記がんが、頭頸部の扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、Ｋｒａｓ変異非小細胞肺腺がん（ＮＳＣＬＣ）、カポジ肉腫（ＫＳ）、膀胱、及び胆管がん（ＣＣＡ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記がんが、免疫療法、化学療法剤による治療、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体を用いた治療、共刺激分子又は共抑制分子に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又はブロッキング抗体に用いた治療、任意選択で免疫チェックポイント阻害剤、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体及び細胞毒性剤を含む免疫複合体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、融合分子を用いた標的治療、低分子キナーゼ阻害剤による標的治療、手術を用いた治療、幹細胞移植を用いた治療、並びに放射線を用いた治療から選択される抗がん療法に不応である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記がんが、免疫チェックポイント阻害剤による治療に不応である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記がんが、放射線療法による治療に不応である、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記がんが、白金製剤ベースの化学療法による治療に不応である、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
前記がんが、エフリンＢ２を発現する腫瘍を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ポリペプチド剤が、前記ＥｐｈＢ４タンパク質のリガンド結合部分であり、血清中半減期を増加させる改変を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ポリペプチド剤が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（「ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ」）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（「ｓＥｐｈＢ４－ＢＳＡ」）から選択されるアルブミンと共有結合的又は非共有結合的に結合した、配列番号１のアミノ酸１～１９７、１６～１９７、２９～１９７、１～３１２、１６～３１２、２９～３１２、１～３２１、１６～３２１、２９～３２１、１～３２６、１６～３２６、２９～３２６、１～４１２、１６～４１２、２９～４１２、１～４２７、１６～４２７、２９～４２７、１～４２９、１６～４２９、２９～４２９、１～５２６、１６～５２６、２９～５２６、１～５３７、１６～５３７及び２９～５３７（「ｓＥｐｈＢ４ポリペプチド」）の配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡが、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～３２６を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡが、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～５３７を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗体断片、任意選択でセツキシマブを投与することをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
タキサン、任意選択でパクリタキセル（タキソール）又はドセタキセル（タキソテール）を投与することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
がんを治療するための方法であって、（ｉ）配列番号１のアミノ酸１６～５３７の配列を含むＥｐｈＢ４タンパク質のリガンド結合部分及び
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２５～６０９の配列を含むヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）
を含むポリペプチド剤の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含み、
前記ポリペプチド剤が、前記治療における第一選択療法として使用される、且つ／又は
前記がんが、再発性、抵抗性、若しくは難治性のがんである
方法。
【請求項15】
前記がんが、頭頸部の扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、Ｋｒａｓ変異非小細胞肺腺がん（ＮＳＣＬＣ）、カポジ肉腫（ＫＳ）、膀胱、及び胆管がん（ＣＣＡ）から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記がんが、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法、及び／又は化学療法に抵抗性又は不応である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、一部には、可溶性エフリン－ＨＳＡ融合タンパク質を含む組成物及び方法、並びにがんの治療方法を含むそれらの使用を提供する。
【0002】
関連出願
本出願は、２０２１年３月１８日に出願された米国仮出願第６３／１６２，６９１号の利益及び優先権を主張するものであり、該仮出願の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年３月１８日に出願された米国仮出願第６３／１６２，６９１号の利益及び優先権を主張するものであり、該仮出願の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0003】
配列表
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ読み取り可能フォーマットのコピー（ファイル名：「ＶＡＳ－００２ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、記録日：２０２２年３月１７日、ファイルサイズ：１４，１２７バイト）。
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ読み取り可能フォーマットのコピー（ファイル名：「ＶＡＳ－００２ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、記録日：２０２２年３月１７日、ファイルサイズ：１４，１２７バイト）。
【背景技術】
【0004】
今日、数多くの高度な診断法及び治療法が開発されているにもかかわらず、がんは依然として世界中で主な死因となっている。ヒトにおいて、がんは、一次的な遺伝的イベントの後に、細胞の代謝及び増殖速度の増加、血管新生の刺激による腫瘍への血液供給の増加、並びにシグナル伝達経路及び腫瘍抑制因子の調節不全を含むが、それらに限定されない多くの機序によって形成する。臨床腫瘍学における根治的治療プロトコールは、依然として外科的切除、電離放射線、及び細胞毒性化学療法の組み合わせに依存している。がんの治療と予防を成功させる上で大きな障害となっているのは、依然として多くのがんが現在の化学療法及び免疫療法の介入に反応しないという事実であり、積極的な治療を行っても多くの人が再発又は死亡を経験する。さらに、腫瘍は、薬物の細胞からの排出、薬物の標的への結合を妨げる変異の発生、及び薬物標的とは関係のない遺伝子やそのタンパク質産物におけるさらなる変異の発生を含むが、それらに限定されない多くの機序によって、抗がん剤に対して抵抗性になる可能性がある。これらの欠点に対処するために、がんにおいて調節不全となっているシグナル伝達軸を調節できる標的療法を開発しようという創薬のトレンドが存在している。現在では、無数の臨床的に重要な標的の治療的にコントロールできるＦＤＡ承認抗体及び低分子が多数存在する。
【0005】
Ｅｐｈ（エリスロポエチン産生肝細胞がん）受容体及びリガンドは、受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の最も大きいファミリーの一部である。そのファミリーは、配列相同性及び２つの異なるタイプの膜アンカー型エフリンリガンドに対する結合親和性に基づいて、クラスＡとクラスＢに細分される。各Ｅｐｈ受容体及びリガンドは、複数のリガンドや受容体に結合することができ、ある特定の受容体は推定腫瘍抑制因子と仮定され、他の受容体は腫瘍促進因子と仮定されている（Ｖａｕｇｈｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１０（６）：２１７－２２４，２００８）。エフリンＢ２とその高親和性同族受容体であるＥｐｈＢ４は、腫瘍血管で誘導され、免疫細胞の輸送を調節する膜貫通タンパク質である。エフリンＢ２－ＥｐｈＢ４相互作用の阻害は、インビトロ及び生体外において腫瘍細胞の増殖に直接的な阻害作用を示す。
【発明の概要】
【0006】
態様において、本開示は、ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含むがんを治療するための方法であって、ポリペプチド剤が治療における第一選択療法として使用される方法に関する。
【0007】
態様において、本開示は、がんを治療する際の第一選択療法として使用するための医薬を調製する際の、ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤の使用に関する。実施形態において、がんは、頭頸部の扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、Ｋｒａｓ変異非小細胞肺腺がん、及びカポジ肉腫（ＫＳ）から選択されるが、これらに限定されない。
【0008】
実施形態において、対象は、以前に抗がん治療が奏効したが、治療を止めると再発を経験した（以下「再発性がん」）。実施形態において、対象は、抵抗性又は難治性のがんを有する。実施形態において、がんは、白金製剤ベースの化学療法に不応である。実施形態において、がんは、免疫療法に不応である。実施形態において、がんは、化学療法剤による治療に不応である。実施形態において、がんは、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体を用いた治療に不応である。実施形態において、がんは、共刺激分子又は共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又はブロッキング抗体を用いた治療に不応である。実施形態において、がんは、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体及び細胞毒性剤を含む免疫複合体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又は融合分子による標的治療に不応である。実施形態において、がんは、低分子キナーゼ阻害剤による標的治療に不応である。実施形態において、がんは、手術を用いた治療に不応である。実施形態において、がんは、幹細胞移植を用いた治療に不応である。実施形態において、がんは、放射線を用いた治療に不応である。実施形態において、がんは、例えば、免疫療法、白金製剤ベースの化学療法剤による治療、腫瘍抗原特異的除去抗体による治療、腫瘍抗原特異的除去抗体及び細胞毒性剤を含む免疫複合体、ＡＤＣ、又は融合分子による治療、低分子キナーゼ阻害剤による標的治療、手術を用いた治療、幹細胞移植を用いた治療、並びに放射線を用いた治療のうちの２つ以上を伴う併用療法に不応である。実施形態において、対象は、様々な抗がん療法の使用が考慮もされないと判断されたがんの形態を有する。
【0009】
実施形態において、本発明の使用は、対象における頭頸部の扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）を治療する方法であって、対象に治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチドを第一選択療法として投与することを含む方法に関する。実施形態において、ＨＮＳＣＣは、白金製剤ベースの化学療法及び／又は放射線療法を用いた治療に不応である。実施形態において、ＨＮＳＣＣは、チェックポイント阻害剤を用いた治療に不応である。実施形態において、対象は、再発したＨＮＳＣＣを有する。
【0010】
実施形態において、本発明の使用は、対象における肝細胞がん（ＨＣＣ）を治療する方法であって、対象に治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチドを第一選択療法として投与することを含む方法に関する。実施形態において、ＨＣＣは、白金製剤ベースの化学療法及び／又は放射線療法を用いた治療に不応である。実施形態において、ＨＣＣは、チェックポイント阻害剤を用いた治療に不応である。実施形態において、対象は、再発したＨＣＣを有する。
【0011】
実施形態において、本発明の使用は、対象におけるＫｒａｓ変異非小細胞肺腺がんを治療する方法であって、対象に治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチドを第一選択療法として投与することを含む方法に関する。実施形態において、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１阻害剤である。実施形態において、腺がんは、白金製剤ベースの化学療法及び／又は放射線療法を用いた治療に不応である。実施形態において、腺がんは、チェックポイント阻害剤を用いた治療に不応である。実施形態において、対象は、再発した腺がんを有する。
【0012】
実施形態において、本発明の使用は、対象におけるカポジ肉腫（ＫＳ）を治療する方法であって、対象に治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチドを第一選択療法として投与することを含む方法に関する。実施形態において、ＫＳは、白金製剤ベースの化学療法及び／又は放射線療法を用いた治療に不応である。実施形態において、ＫＳは、チェックポイント阻害剤を用いた治療に不応である。実施形態において、対象は、再発したＫＳを有する。
【0013】
実施形態において、アルブミンに融合したＥｐｈＢ４の可溶性細胞外断片（ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ）は、エフリン－Ｂ２とＥｐｈＢ４の相互作用を遮断し、双方向のシグナル伝達を遮断し、結果として免疫細胞輸送を促進し、様々ながんにおける抗腫瘍免疫応答を誘導する。したがって、本開示は、様々な実施形態において、様々ながんの治療のためのエフリンＢ２－ＥｐｈＢ４阻害剤、「ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ」（ヒト血清アルブミンに融合したＥｐｈＢ４チロシンキナーゼ受容体の可溶性細胞外断片）を提供した。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とインフレームで（ｉｎ ｆｒａｍｅ）融合したヒトＥｐｈＢ４受容体（ｓＥｐｈＢ４）の細胞外ドメインからなる。このＨＳＡとの融合はｓＥｐｈＢ４の薬物動態を増強する。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、ＥｐｈＢ４チロシンキナーゼ受容体のリガンドである膜貫通タンパク質エフリン－Ｂ２に結合する。この結合によって、内在性のＥｐｈＢチロシンキナーゼ受容体がエフリンＢ２と相互作用するのを阻止する。データが示すところによると、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、腫瘍の血管新生を低減し、結果として、腫瘍の血液を飢餓状態にし、腫瘍へのＴ細胞の動員を抑制するエフリンＢ２の能力を阻害し、その結果Ｔ細胞の増加を増加させる。
【0014】
実施形態において、がんの治療に使用するためのｓＥｐｈＢ４のポリペプチド剤は、抗ＥＧＦＲ抗体若しくはその抗体断片又はタキサンの使用をさらに含む。態様において、可溶性ＥｐｈＢ４－ＨＳＡ融合タンパク質（ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ）及び、がんの治療に使用するための抗ＥＧＦＲ抗体又はその断片を含む組成物。実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブである。
【0015】
実施形態において、本発明の方法は、タキサン、任意選択でパクリタキセル（タキソール）又はドセタキセル（タキソテール）との併用療法を提供する。実施形態において、本発明の方法は、抗ＥＧＦＲ抗体、任意選択でセツキシマブとの併用療法を提供する。
【0016】
本明細書で示されたデータは、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡが、現在の療法が有効でない、再発という結果になる、又はがん及び関連する腫瘍の種類に起因して使用が考慮もされない多くのがんに対する有効な第一選択療法である可能性が示している。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図3】図３は、１０ｍｇ／ｋｇのｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの投与を毎週受けた扁桃ＳＣＣ（ＨＰＶ－）患者のスキャンを示す。スキャンでは、治療の８週目に部分奏効が見られ、１６週目に腫瘍の徴候は見られない。患者は奏効中に試験を止め、安定であった。
【図4】図４は、１０ｍｇ／ｋｇのｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの投与を毎週受けた肝がん（ＨＣＣ）患者のスキャンを示す。スキャンはでは、治療の１６週目に部分奏効が見られ、週目に腫瘍の徴候は見られない。患者は８＋か月間無治療で無病のままである。
【図5】図５は、１０ｍｇ／ｋｇのｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡで毎週治療された肝がん（ＨＣＣ）患者のスキャンを示す。スキャンでは、治療の１６週目に部分奏効が見られる。患者は奏効中に試験を止め、安定であった。治験登録から１８＋か月経過した時点で、患者は依然として治療を受け、安定している。
【図6】図６は、全脳照射による前治療から進行した後、１０ｍｇ／ｋｇのｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ投与を毎週受け、その後カルボプラチン、パクリタキセル、アバスチンの投与を３サイクル受けた、Ｋｒａｓ変異多巣性腺がんの肺及び脳転移をもつ患者のスキャンを示す。患者はｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ療法から１１＋か月の時点で安定である。
【図10】図１０は、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ投与に対する生体内自然発生乳房腫瘍マウスモデル（ＭＭＴＶ－ｎｅｕ／Ｈｅｒ２）の反応を示す。マウスに７．５ｍｇ／ｋｇを週３回、ＩＰ注射で５週間投与した。腫瘍組織を、Ｈｅｒ２／ＥＲＢＢ２の総タンパク質発現及びリン酸化について分析した。肺を転移について分析した。
【図12】図１２は、どのようにＥｐｈＢ４がＥＧＦＲと結合し安定化するかを示すウェスタンブロット分析である。ＥｐｈＢ４はＥＧＦＲと結合する；ＥｐｈＢ４のノックダウンはＥＧＦＲを低下させる；ＥｐｈＢ４はＥＧＦＲを増加させる。
【図14】図１４は、ヒト患者（ＪＧ ６４Ｆ）における胆管がんの生体内腫瘍退縮を示す。ｓＥｐＨＢ４－ＨＳＡは１５ｍｇ／ｋｇで２週間毎に１５か月間投与された。患者の生存期間は、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ治療開始から２４＋か月である。
【図15】図１５Ａ～１５Ｆは、細胞株に対するチロシンキナーゼのｍＲＮＡを介したノックダウンの効果（図１５Ａ）、６つの細胞株に対するＫｒａｓ除去の効果（図１５Ｂ）、Ｋａｓ介在細胞株に対するＥｐｈＢ４の効果（図１５Ｃ）を示すヒートマップによって、ＥｐｈＢ４発現がＫｒａｓ変異細胞に増殖優位性を与えることを示す。ＥｐｈＢ４タンパク質はＫｒａｓによって用量依存的に増強され（図１５Ｄ）、ＥｐｈＢ４及びそのリガンドエフリンＢ２はともに腫瘍において増加し（図１５Ｅ）、ＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２の過剰発現も腫瘍において観察された（図１５Ｆ）。
【図16】図１６Ａ～１６Ｄは、ＥｐｈＢ４の遺伝子破壊除去が、Ｋｒａｓ変異マウスにおいて生存率を増加させることを示し、その変異体は、ｃｒｅを介した組換え（図１６Ａ）及びＥｐｈＢ４の再構成（図１６Ｂ）の後、ｅｐｈＢ４遺伝子に中途停止コドンを作る。図１６Ｃは、Ｋ１４ＫＢ４（ｎ＝９）マウスは腫瘍増殖が有意に少なく、生存期間が延びたことを示す。肺腺がんの発がんはＡｄＫＰＢ４において劇的に減少していた（図１６Ｄ）。
【図17】図１７Ａ～１７Ｄは、Ｋｒａｓによって引き起こされる腫瘍におけるＡＫＴ及びＥＲＫシグナル伝達を弱めるＥｐｈＢ４のノックダウンの効果を示す。ｐ－ＥＲＫ１／２を除くシグナル伝達指標は、口腔乳頭腫（図１７Ａ）で検出されたが、肺腺がんのＥｐｈＢ４ノックアウトマウスの組織では検出されなかった（図１７Ｂ）。図１７Ｃは、インサイチュ染色及び免疫蛍光染色により、腫瘍内で過剰発現したＥｐｈＢ４ ｍＲＮＡ及びタンパク質をそれぞれみられたことを示す。図１７ＤはＡｄ－Ｃｒｅマウスのタンパク質発現を示す。
【図18】図１８Ａ～１８Ｇは、生体内で、ＥｐｈＢ４の薬理学的阻害がＫｒａｓによって引き起こされる腫瘍形成を効果的に阻害することを示す。図１８Ａは、ｓＥｐｈＢ４投与腫瘍におけるＥｐｈＢ４のｐ－Ｔｙｒシグナルのウェスタンブロットを示す。図１８Ｂは、対照のＫ１４Ｋマウスの生存率と比較した両ｓＥｐｈＢ４投与群の生存率を示す。図１８Ｃは、腫瘍形成及び生存に対する、Ｋ１４ＫＰへのｓＥｐｈＢ４の予防投与の効果を示す。図１８Ｄはタキソール及びｓＥｐｈＢ４併用投与の効果を示す。図１８Ｅ及び図１８Ｆは、腫瘍のアポトーシス及び細胞増殖に対するｓＥｐｈＢ４投与の効果をＴＵＮＥＬ及びＫｉ６７染色で示す。図１８Ｇは、ＥｐｈＢ４投与後のＰ－ＡＫＴ及びＰ－Ｓ６の存在量を示す。
【図19】図１９Ａ～１９Ｆは、β－ＴｒＣＰ１を介したＫｒａｓのユビキチン化及び分解に対するＥｐｈＢ４の効果を示す。図１９Ａは、ｓｉＲＮＡによるＥｐｈＢ４のノックダウンが内在性Ｋｒａｓタンパク質の半減期を減少させたことを示す。図１９Ｂは、ｓＥｐｈＢ４投与後のＫ１４Ｋマウスの腫瘍におけるＫｒａｓレベルを示す。図１９Ｃは、Ｋｒａｓのユビキチン化に対するＥｐｈＢ４のｓｉＲＮＡノックダウン及びＥｐｈＢ４過剰発現の効果を示す。図１９Ｄは、Ｋｒａｓのユビキチン化に対するβ－ＴｒＣＰ１のｓｉＲＮＡノックダウン及びβ－ＴｒＣＰ１過剰発現の効果を示す。図１９Ｅは、β－ＴｒＣＰを介したＫｒａｓポリユビキチン化に対する過剰発現ＥｐｈＢ４の効果のＩＰ／ウェスタンブロット分析を示す。図１９Ｆは、Ｋｒａｓとβ－ＴｒＣＰ１の間、ＥｐｈＢ４とβ－ＴｒＣＰ１の間、及びＥｐｈＢ４とＫｒａｓの間のタンパク質間相互作用のｃｏ－ＩＰ試験を示す。
【図20】図２０Ａ～２０Ｆは、Ｃ末端ＥｐｈＢ４断片の存在がβ－ＴｒＣＰ１リガーゼ活性を調節し、Ｃｙｓ１１８位でのＫｒａｓのモノユビキチン化を促進することを示す。図２０Ａは、ＨＥＫ２９３細胞溶解物から免疫沈降させたｂ－ＴｒＣＰ１－ＧＦＰを用いて、図に示されているインビトロで転写及び翻訳されたＥｐｈＢ４のＣ末端断片の存在下又は非存在下で、インビトロユビキチン化に供した細菌精製Ｈｉｓタグ付きＫｒａｓタンパク質（野生型、ＷＴ又はＧ１２Ｖ変異体）を示す。２時間のインキュベーション後、サンプルローディング色素を加えることによって反応を停止させ、図に示されている抗体を用いてイムノブロットに供した。図２０Ｂは、ＫｒａｓのＣｙｓ１１８のユビキチン化を明らかにするペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルである。ゲル内消化で単離したペプチドを逆相カラムで分離し、Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分析計を用いて衝突誘起解離スペクトルを得た。図２０Ｃは、Ｃ１１８モノユビキチン化の重要性の検証を示し、Ｇ１２Ｄ変異体バックグラウンドのＫｒａｓのＣｙｓ１１８Ｓｅｒ変異体（ＧＣ変異体と命名）を、パネル（ａ）に記載したようにＷＴ及びＧ１２Ｄ（ＧＤ）変異体とともにインビトロユビキチン化に供し、図に示されている抗体を用いた免疫ブロットを用いて処理／分析した。図２０Ｄは、ＥｐｈＢ４過剰発現の存在及び非存在のいずれかにおける、異なるＫＲＡＳ（野生型、ＷＴ；Ｇ１２Ｄ、ＧＤ；Ｃ１１８Ｓ、ＣＳ、及びＧ１２Ｄ＋Ｃ１１８Ｓ、ＧＣ）変異体の定常状態レベルを示す。相対バンド強度（任意単位）は、野生型Ｋｒａｓレベルを「１」としてＩｍａｇｅ Ｊを用いて定量した。上記の－ＴｒＣＰ１についても上記のように相対バンド強度を計算した。図２０Ｅは、ＷＴ、ＧＤ、ＣＳ及びＧＣ Ｋｒａｓ変異体のタンパク質半減期を、シクロヘキシミド（ＣＨＸ、５０μｇ／ｍｌ）を加えることによって、ＥｐｈＢ４の存在下及び非存在下で計算したものを示す。図に示されている時点で試料を集め、バンド強度を計算し、時間とともにプロットした。図２０Ｆは、変異型Ｋｒａｓの過剰活性化に必要なＣ１１８のモノユビキチン化を促進するＥｐｈＢ４の重要性を示す仮説的モデルを示す。ＥｐｈＢ４の標的化、あるいはＣ１１８部位のセリン（Ｓ）への遺伝子改変は、変異Ｋｒａｓの発がん活性を弱めることができる。
【発明を実施するための形態】
【0018】
態様において、ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２、例えばｓＥｐｈＢ４を阻害するポリペプチド剤の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを治療する方法であって、その治療が第一選択療法である方法が提供される。
【0019】
態様において、ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２、例えばｓＥｐｈＢ４を阻害するポリペプチド剤の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを治療する方法であって、その患者が別の抗がん剤による治療を受けたことがない方法が提供される。
【0020】
態様において、がんを治療する際に第一選択療法として使用するための医薬の調製に使用するための、ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤が提供される。態様において、がんを治療する際に第一選択療法として使用するためのＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤が提供される。
【0021】
ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害剤
本開示の方法は、第一選択療法として、ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤を投与することによって、原発腫瘍の増殖若しくは原発がんの形成、又はがんの転移を治療、低減、又は予防することを含む。
本開示の方法は、第一選択療法として、ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤を投与することによって、原発腫瘍の増殖若しくは原発がんの形成、又はがんの転移を治療、低減、又は予防することを含む。
【0022】
１型受容体チロシンキナーゼＥｐｈＢ４及び膜局在性リガンドエフリンＢ２は、双方向性シグナル伝達（受容体発現細胞では順方向、リガンド発現細胞では逆シグナル伝達）を誘導する。ＥｐｈＢ４は受容体型チロシンキナーゼの最大のファミリーに属し、エフリンＢ２リガンドと相互作用すると、神経細胞の移動、骨のリモデリング、血管新生、がんの進行、転移を調節することが報告されている（Ｐａｓｑｕａｌｅ ＥＢ，Ｃｅｌｌ，１３３：３８－５２，２００８）。ＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２の発現は、成人の正常組織の大部分では、早ければ生後発育でもダウンレギュレートされているが、ＥｐｈＢ４は肺がんや、膀胱がん、頭頸部がん、膵がんを含む複数の上皮性がんで過剰発現している（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ＢＤ，ｅｔ ｅｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，３２：２０２－６，２０１４）。変異型ＫｒａｓやＰＴＥＮの欠損を含むがん遺伝子はＥｐｈＢ４発現を誘導する。ＥｐｈＢ４のノックダウンはアポトーシスによる細胞死につながるので、ＥｐｈＢ４の発現は、病期、悪性度、及び生存と相関する。リガンドであるエフリンＢ２の過剰発現と予後不良との相関は、いくつかのがん種で報告されている。ＩＣＴは腫瘍血管（及び腫瘍）においてエフリンＢ２を増加させ、高レベルのエフリンＢ２は免疫細胞の動員を妨げ、したがって治療に対する抵抗性が生じる。
【0023】
ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２相互作用の阻害は、インビトロ及び細胞外において腫瘍細胞の増殖に直接的な阻害作用を示す。ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤は、本発明の発明者らによって以前に記載されている（例えば、米国特許第７，３８１，４１０号、米国特許第７，８６２，８１６号、米国特許第７，９７７，４６３号、米国特許第８，０６３，１８３号、米国特許第８，２７３，８５８号、米国特許第８，９７５，３７７号、米国特許第８，９８１，０６２号、米国特許第９，５３３，０２６号を参照されたい；それらはそれぞれ、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、１２３．３ｋＤａの単一のシームレスなタンパク質として発現すると、Ｃ末端でアルブミンと融合した可溶性ＥｐｈＢ４細胞外ドメインから構成される完全ヒト融合タンパク質である。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡはエフリンＢ２に特異的に結合する。腫瘍モデルにおけるｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの予備的研究では、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の腫瘍への遊走の増加が示されている。これは腫瘍血管におけるＩＣＡＭ－１の誘導を伴う。ＩＣＡＭ－１はインテグリンであり、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の内皮への接着を促進し、それに続いて細胞の腫瘍への遊出を促進する。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡはまた、腫瘍細胞及び腫瘍血管におけるＥｐｈＢ－エフリンＢ２相互作用を遮断することによって、ＰＩ３Ｋシグナル伝達のダウンレギュレーションを示す。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、ＰＩ３Ｋ経路をダウンレギュレートすることによって、シグナル伝達を遮断し、免疫細胞の腫瘍内への輸送を促進し、腫瘍細胞の生存シグナルを阻害する。
【0024】
ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２を標的とすることは、治験の検証を乗り越えてきた治療戦略である。複数の治験において、毒性が最小限であるか、全くなく、安全であることが示されており、（Ａ．Ｅｌ－Ｋｈｏｕｅｉｒｙ ＢＧ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，６９，２０１６）、これは正常組織での発現レベルが低いためと考えられる。がん関連免疫反応におけるＥｐｈＢ４－エフリンＢ２相互作用を示唆する直接的な証拠はないが、動脈硬化や創傷治癒などの炎症モデルにおいて、Ｅｐｈ／エフリン遺伝子ファミリーのメンバーが免疫細胞のプロセスを調節することが複数の論文で報告されている（Ｂｒａｕｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，３１：２９７－３０５，２０１１；Ｐｏｉｔｚ ＤＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，６８：６４８－５６，２０１５；Ｙｕ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７１：１０６－１４，２００３；Ｆｕｎｋ ＳＤ， ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，３２：６８６－９５，２０１２）。また、Ｅｐｈ－エフリン相互作用は、単球の血管壁への接着、経上皮遊走、Ｔ細胞の走化性、活性化、増殖及びアポトーシス、骨髄類洞細胞からの造血細胞の動員を調節することが報告されている。
【0025】
本開示の実施形態において、ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤は、ＥｐｈＢ４タンパク質若しくはエフリンＢ２タンパク質の単量体リガンド結合部分、又はＥｐｈＢ４若しくはエフリンＢ２に結合し、影響を及ぼす抗体である。実施形態において、ポリペプチド剤は、エフリンＢ２ポリペプチドに特異的に結合し、ＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む可溶性ＥｐｈＢ４（ｓＥｐｈＢ４）ポリペプチドである。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４タンパク質の球状ドメインを含む。
【0026】
実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の残基１～５２２と少なくとも９０％同一である配列、残基１～４１２と少なくとも９０％同一である配列、及び残基１～３１２と少なくとも９０％同一である配列から選択される配列を含む。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、球状（Ｇ）ドメイン（配列番号１のアミノ酸２９～１９７）、及び任意選択で、システインリッチドメイン（配列番号１のアミノ酸２３９～３２１）や、第１のフィブロネクチン３型ドメイン（配列番号１のアミノ酸３２４～４２９）、第２のフィブロネクチン３型ドメイン（配列番号１のアミノ酸４３４～５２６）などのさらなるドメインを包含する配列を含むことができる。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～５３７を含むことになる。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～４２７を含むことになる。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～３２６を含むことになる。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～１９７、２９～１９７、１～３１２、２９～１３２、１～３２１、２９～３２１、１～３２６、２９～３２６、１～４１２、２９～４１２、１～４２７、２９～４２７、１～４２９、２９～４２９、１～５２６、２９～５２６、１～５３７及び２９～５３７を含むことになる。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１６～１９７、１６～３１２、１６～３２１、１６～３２６、１６～４１２、１６～４２７、１６～４２９、１６～５２６を含むことになる。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、エフリンＢ２結合活性を保持しつつ、前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％、任意選択で９５％又は９９％同一なアミノ酸配列を含むものであることができる。実施形態において、実施形態において、配列番号１に示される配列からのアミノ酸配列の変形は、特に表面ループ領域において、１、２、３、４又は５つを超えないアミノ酸の保存的変化又は欠失である。
【0027】
実施形態では、可溶性ポリペプチドは、例えば、Ｆｃ融合タンパク質として発現させること又は別の多量体化ドメインと融合させることによって、多量体の形態で調製することができる。
【0028】
実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、エフリンＢ２結合活性を保持しつつ、血清中の半減期の延長をもたらすさらなる成分をさらに含むことになる。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは単量体であり、１つ又は複数のポリオキシアクリレン基（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン）に共有結合している。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、単一のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基に共有結合している（以下「ｓＥｐｈＢ４－ＰＥＧ」）。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは２つ、３つ、又はそれより多くのＰＥＧ基に共有結合している。
【0029】
実施形態において、１つ又は複数のＰＥＧは、約１ｋＤａ～｜約１００ｋＤａ、約１０～｜約６０ｋＤａ、及び約１０～｜約４０ｋＤａの範囲の分子量を有することができる。ＰＥＧ基は、直鎖ＰＥＧでもよく、分岐ＰＥＧでもよい。実施形態において、可溶性の単量体ＥｐｈＢ４複合体は、例えばｓＥｐｈＢ４リジンのｓ－アミノ基又はＮ末端アミノ基を介して、約１０～約４０ｋＤａ（モノＰＥＧ化ＥｐｈＢ４）又は約１５～約３０ｋＤａの１つのＰＥＧ基に共有結合したｓＥｐｈＢ４ポリペプチドを含む。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４は、ｓＥｐｈＢ４リジンのｓ－アミノ基及びＮ末端アミノ基のうちの１つのアミノ基でランダムにＰＥＧ化される。
【0030】
実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、エフリンＢ２結合を実質的に減少させることなく半減期を改善する第２の安定化ポリペプチドと安定に結合している。実施形態において、安定化ポリペプチドはヒト患者（又は獣医学的使用が企図される場合には動物の患者）と免疫適合性があり、有意な生物活性をほとんど有しない、又は有しないことになる。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（以下「ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ」）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（以下「ｓＥｐｈＢ４－ＢＳＡ」）から選択されるアルブミンと共有結合的又は非共有結合的に結合している。
【0031】
実施形態において、共有結合は、ヒト血清アルブミンとの共翻訳融合体としてのｓＥｐｈＢ４ポリペプチドの発現によって達成することができる。アルブミン配列は、Ｎ末端、Ｃ末端、又はｓＥｐｈＢ４ポリペプチド内の中断のない（ｎｏｎ－ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ）内部位置で融合することができる。ｓＥｐｈＢ４の露出したループはアルブミン配列の挿入に適した位置と思われる。アルブミンは、例えば化学的架橋によってｓＥｐｈＢ４ポリペプチドに翻訳後結合することもできる。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、２つ以上のアルブミンポリペプチドと安定的に結合することもできる。
【0032】
実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ融合は、エフリンＢ２とＥｐｈＢ４の間の相互作用、エフリンＢ２若しくはＥｐｈＢ４のクラスター化、エフリンＢ２若しくはＥｐｈＢ４のリン酸化、又はそれらの組み合わせを阻害する。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ融合は、改変されていない野生型ポリペプチドと比較して、生体内安定性が増強されている。
【0033】
実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～１９７を含む。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～３１２を含む。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～３２１を含む。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～３２６を含む。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～４１２を含む。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～４２７を含む。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～４２９を含む。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～５２６を含む。実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～５３７を含む。
【0034】
頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療としてＨＮＳＣＣを治療するための方法及び使用に関する。
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療としてＨＮＳＣＣを治療するための方法及び使用に関する。
【0035】
頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）は、上部気道消化管（ＵＡＤＴ）に関わるがんのほぼ９０％を占める。米国では、２００５年、口腔、咽頭、喉頭のがんは、罹患（ｉｎｃｉｄｅｎｔ）がんのほぼ３％、がんによる死亡の２％を占めると予想されている。世界中で毎年約５０万人が新たに診断されている。男性は女性の２倍超罹患している。これらのがんの半数超は口腔に発生する。残りは喉頭と咽頭に等分される。頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）を含むヒトのがんにおいて、数多くの臨床試験が免疫療法の有益性を検証している。客観的奏効率は６～２０％であり（Ｓｚｔｕｒｚ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｅｄ，１５：１１０，２０１７；Ｆｅｒｒｉｓ ＲＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ，８１：４５－５１，２０１８；Ｐｏｓｔｏｗ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，３３：１９７４－８２，２０１５；Ｃｈｏｗ ＬＱＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，３４：３８３８－４５，２０１６；Ｓｉｕ ＬＬ，ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ ２０１８）、大多数の患者は免疫療法に対して自然（ｉｎｎａｔｅ）耐性又は獲得耐性を示す。より多くの免疫チェックポイント阻害剤を単に併用する試みも、患者に対する毒性が増し、追加しても有益性が得られないために期待外れであることが証明されている（治験番号ＮＣＴ０２２０５３３３）。ＨＮＳＣＣの同所性マウスモデルにおいて、最近、抗ＰＤＬ１抗体と放射線療法（ＲＴ）の併用療法後でも腫瘍の再増殖が起こることが示されている（Ｏｗｅｉｄａ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１８；Ｍｅｓｓｅｎｈｅｉｍｅｒ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２３：６１６５－７７，２０１７）。
【0036】
放射線療法は、依然として局所進行ＨＮＳＣＣ患者の根治的管理における標準治療であり、免疫療法のアジュバント療法として機能しうるが、ＲＴに反応して生じるいくつかの望ましくない影響があり、その結果として免疫療法薬の有効性を損なう。ＲＴは後期（修復期）におけるＴｒｅｇなどの免疫抑制性の集団の蓄積を克服することはできない。したがって、有害な副作用、治療抵抗性、及び腫瘍の再増殖を克服するためには、ＲＴと相乗的に作用し、その悪影響を打ち消す他の治療法を見つけることが重要である。
【0037】
ＨＮＳＣＣの５年生存率は低く、数十年（ｓｅｖｅｒａｌ ｄｅｃａｄｅｓ）、改善していない。さらに、この疾患の患者は、外貌醜状、発話障害、嚥下障害及び呼吸障害を含む重度の病的状態を経験する。診断の晩期化及び再発傾向は、これらの患者の転帰を改善する努力を妨げる課題である。ペムブロリズマブは、ＰＤ－１とそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２との相互作用を直接阻害するように設計された、ＩｇＧ４／κアイソタイプの強力でかつ選択性の高いヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は２０１６年８月５日に、ペムブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））を、一部の進行した形態の頭頸部がん患者に対する治療用に承認した。この承認は、化学療法による標準治療にもかかわらず進行が続いている再発性又は転移性の頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）をもつ患者を対象としている。ＦＤＡの承認概要によると、２８名の患者（１６％）がペムブロリズマブによる治療後に腫瘍の反応を経験した。これらの患者のうち２３名（８２％）では、腫瘍の反応が６か月以上持続し、数名は２年を超えて持続した。腫瘍がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性のＨＮＳＣＣ患者は、典型的に、腫瘍がＨＰＶ陰性の患者よりも化学療法による治療後の転帰が良好である。ＦＤＡの承認概要によれば、ＨＰＶ陰性腫瘍の患者だけでなく、ＨＰＶ陽性腫瘍の患者でも奏効が見られた（それぞれ２４％と１６％）。
【0038】
再発性、局所進行性、又は転移性の頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）は生命を脅かす疾患である。頭頸部の扁平上皮がんは、発生部位によって予後が異なる不均一な腫瘍である。口腔／咽頭と喉頭の２つのカテゴリーがある。ＨＰＶ陰性腫瘍は高いリスクを伴う一方で、ＨＰＶは口腔咽頭の低リスク群となる。米国では２０１６年に、新たに４８，０００例を超える口腔がん及び咽頭がん、１３，０００例を超える喉頭がんが診断され、これらのがんが原因で約１３，０００名が死亡した。初診時に、口腔／咽頭がんの患者の約１８％、喉頭がんの患者の約１９％に遠隔転移が存在する。さらに、初診時に、口腔／咽頭がんの患者の約４７％、喉頭がんの患者の約２２％に所属リンパ節病変（遠隔転移を伴わない）が存在する；そのような局所的に進行した疾患の患者では、２０％～３０％が局所に再発することになり、さらなる１０％～１５％が遠隔転移を起こすことが予想されうる。ほとんどの臨床シリーズにおいて、再発性又は転移性のＨＮＳＣＣの患者の生存期間中央値は６～１０か月である。
【0039】
局所進行ＨＮＳＣＣの標準治療には、放射線（例えば、導入療法として、放射線との同時併用療法として、又は外科的切除後の放射線によるアジュバント療法の一部として）と併用する白金製剤を含む化学療法が含まれる。転移性ＨＮＳＣＣに対する第一選択化学療法は、シスプラチン又はカルボプラチン＋５－フルオロウラシル＋セツキシマブなどの多剤白金製剤含有化学療法レジメンからなる。最近では、ＰＤ１抗体が、白金製剤及びセツキシマブが失敗した後に再発した又は難治性のＨＮＳＣＣ患者に対して承認された。ＰＤ１抗体単独の奏効率は１６％であり、ＤＯＲは２．４＋か月から２７．７＋か月の範囲であり、持続的奏効を示している。しかし、化学療法、セツキシマブ、及びＰＤ１抗体が失敗した、又はそれらに対して許容できない毒性を経験した患者のための新しい治療法の必要性が依然として残っている。
【0040】
肝細胞がん（ＨＣＣ）
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療としてＨＣＣを治療するための方法及び使用に関する。
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療としてＨＣＣを治療するための方法及び使用に関する。
【0041】
肝がんは年間８５万人を超える新規がん症例を占め、それらの約９０％が肝細胞がん（ＨＣＣ）である。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による慢性感染は、ＨＣＣの一番の原因である。ＨＣＣは、世界の特定の地域で最も頻度の高いがんであり、世界で５番目に多いがんである。世界的には、男性のがんによる死亡の主な原因の第２位、女性のがんによる死亡の主な原因の第６位である（例えば、Ｐａｒｋｉｎ Ｄ．Ｍ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２：５３３－４３，２００１を参照）。ＨＣＣは臨床症状の経過の後期に診断されることが多いので、根治手術の候補となる患者は１０～１５％にすぎない。局所療法には複数の治療法が利用可能であり、手術、化学的アブレーション、放射線アブレーション、化学塞栓術などが挙げられ、かなりの患者集団で局所病勢コントロールを伴う。大多数のＨＣＣ患者では、全身化学療法又は支持療法が主力治療選択肢である。ＨＣＣは一般に、治療に対する反応が極めて乏しく、ほとんどの化学療法剤は有効性（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）が限られ、患者の生存を改善することができていない（例えば、Ｇｉｓｈ Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２５：３０６９－７５，２００７；Ｒａｍａｎａｔｈａｎ Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２４：４０１０，２００６を参照）。
【0042】
ソラフェニブは低分子マルチキナーゼ阻害剤であり、進行肝細胞がんに対して承認された最初の全身療法であった。ソラフェニブに忍容性を示したが、別治療中に進行した一部の患者において、別のマルチキナーゼ阻害剤であるレゴラフェニブが承認され、プラセボ対照と比較して延命効果をもたらした（１０．６か月対７．８か月）。最近では、第一選択治療として、アテゾリズマブとベバシズマブの併用がソラフェニブよりも優れていることが示された。中央値８．６か月の追跡調査の後、ソラフェニブ群の１３．２か月と比較して、併用群では全生存期間中央値は達されなかった。全奏効率は併用群で２７％であったのに対し、ソラフェニブ群では１２％であった。
【0043】
プログラム死（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ）１（ＰＤ－１）抗体ニボルマブ（オプジーボ（登録商標））を評価する最近の研究では、約１０～２０％の奏効率が示された。奏効期間はＣＲでは１４～１７＋か月、ＰＲでは＜１～８＋か月、安定（ＳＤ）では１．５～１７＋か月であった。６か月時点での全生存率（ＯＳ）は７２％である。ニボルマブは管理可能なＡＥプロファイルを示し、すべての投与量レベル及びＨＣＣコホートにわたって持続的な奏効を示し、６か月ＯＳ率は良好であった。ＰＤ－１抗体は第二選択治療においても迅速承認されている。現在承認されている治療法が失敗する患者にはさらなる治療法が必要である。
【0044】
非小細胞性肺がん（ＮＳＣＬＣ）
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療としてＮＳＣＬＣを治療するための方法及び使用に関する。
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療としてＮＳＣＬＣを治療するための方法及び使用に関する。
【0045】
ＮＳＣＬＣは最も一般的なタイプの肺がんである。扁平上皮がん、腺がん、大細胞がんはいずれもＮＳＣＬＣのサブタイプである。ＮＳＣＬＣは全肺がんの約８５％を占める。クラスとしては、ＮＳＣＬＣは小細胞がんと比較して化学療法に比較的感受性が低い。可能であれば、第一に根治を目的とした外科的切除によって治療されるが、術前（ネオアジュバント化学療法）と術後（アジュバント化学療法）の両方で化学療法が用いられることが多くなっている。２０１５年１０月２日、ＦＤＡはペムブロリズマブを、腫瘍がＰＤ－Ｌ１を発現し、他の化学療法剤による治療が失敗した患者の転移性非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の治療に対して承認した。２０１６年１０月、ペムブロリズマブは、がんがＰＤＬ１を過剰発現し、がんがＥＧＦＲにもＡＬＫにも変異を有しない場合に、ＮＳＣＬＣの治療の第一選択として使用される最初の免疫療法となった；既に化学療法が施されている場合には、ペムブロリズマブを第二選択治療として使用できるが、がんがＥＧＦＲ変異又はＡＬＫ変異を有する場合、それらの変異を標的とした薬剤が最初に使用されるべきである。ＰＤＬ１の評価は、有効性が確認され承認されたコンパニオン診断薬を用いて行われなければならない。Ｋｅｙｎｏｔｅ－００１試験（ＮＴＣ０１２９５８２７）では、進行非小細胞肺がんをもつ患者において、ペムブロリズマブによるプログラム細胞死（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）１（ＰＤ－１）阻害の有効性及び安全性が評価された。すべての患者の客観的奏効率は１９．４％、奏効期間の中央値は１２．５か月であった。無増悪生存期間の中央値は３．７か月、全生存期間の中央値は１２．０か月であった。腫瘍細胞の少なくとも５０％のＰＤ－Ｌ１発現をトレーニング群（ｔｒａｉｎｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）からカットオフ値として選択した。検証群の割合スコアが少なくとも５０％の患者では、奏効率は４５．２％であった。プロポーションスコアが少なくとも５０％のすべての患者では、無増悪生存期間の中央値は６．３か月であった；全生存期間の中央値に達しなかった。少なくとも５０％の腫瘍細胞のＰＤ－Ｌ１の発現は、ペムブロリズマブの有効性（ｅｆｆｉｃａｃｙ）の改善と相関した（Ｇａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３７２：２０１８－２０２８，２０１５）。非小細胞肺がんの３０％を占めるＫＲＡＳ変異肺腺がんは、臨床的意義が明らかになりつつある高度な不均一性を示す。腫瘍の不均一性は、ＫＲＡＳと同時に発生する遺伝的及び／又はエピジェネティックな変化に影響されうる一方で、不均一な腫瘍サブセットは、異なる起源の細胞の産物である可能性もある。発がん性Ｋｒａｓの空間的及び時間的活性化に基づく遺伝子組換えマウスモデルは、これらの問題に対処するのに役立っている。実際、肺を除くほとんどの組織がＫｒａｓＧ１２Ｖ発がんシグナルに抵抗性であるという観察から、発がん性Ｋｒａｓによって引き起こされる形質転換の精巧な（ｅｘｑｕｉｓｉｔｅ）細胞型依存性が強調される。
【0046】
カポジ肉腫（ＫＳ）
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療としてＫＳを治療するための方法及び使用に関する。
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療としてＫＳを治療するための方法及び使用に関する。
【0047】
カポジ肉腫（ＫＳ）は血管内皮の多巣性血管増殖性疾患であり、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８）としても知られるカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）の感染に最も関連している。ＫＳは多くの疫学的及び病態生理学的因子と関連している。ＫＳは、古典的地中海性ＫＳ、アフリカ風土病型ＫＳ、免疫抑制薬関連型ＫＳ、ＨＩＶ関連型ＫＳの４つの臨床型に分類される。ＨＩＶ及びＡＩＤＳの時代以前には稀な疾患であったＨＩＶ関連型ＫＳは、ＨＩＶ感染患者において最も頻度の高い悪性腫瘍である。ＫＳは多くの臓器に影響を及ぼしうる。ＫＳは最も頻繁に皮膚の疾患として現れる。多くの進行症例では、ＫＳは肺、肝臓、消化管などの臓器を侵す。現時点では、ＫＳは不治である。利用可能な治療法は緩和のためのものである。全身化学療法は一般に、より進行した疾患又は疾患の急速な進行の証拠がある患者に用いられる。治療の主な目標は、症状の緩和、疾患進行の予防、及びリンパ浮腫、臓器障害、心理的ストレスを和らげるための腫瘍量の軽減である。内臓型又は進行した皮膚ＫＳの標準的な治療法には、リポソームアントラサイクリンやパクリタキセルなどの細胞毒性化学療法が含まれる。リポソームドキソルビシンは、非リポソームドキソルビシン、ビンクリスチン、及びブレオマイシンの併用と比較して、優れた有効性並びに良好な忍容性及び毒性を有し、ＨＩＶ患者において全奏効率は５９％である。古典的ＫＳでは、リポソームドキソルビシンに対する奏効率がより高くなりうる。しかし、完全奏効率はまれであり、治療法はない。現時点では、ＫＳに対する標的療法は十分に開発されていない。
【0048】
実施形態において、がんは、頭頸部の扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、Ｋｒａｓ変異非小細胞肺腺がん、及びカポジ肉腫（ＫＳ）から選択されるが、これらに限定されない。
【0049】
実施形態において、患者は、過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発（以下「再発性増殖性疾患」）を経験した。
【0050】
実施形態において、患者は抵抗性又は難治性のがんを有する。実施形態において、がんは、免疫療法に不応である。実施形態において、がんは、化学療法剤による治療に不応である。実施形態において、がんは、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体を用いた治療に不応である。実施形態において、がんは、共刺激分子又は共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又はブロッキング抗体を用いた治療に不応である。実施形態において、がんは、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体及び細胞毒性剤を含む免疫複合体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又は融合分子による標的治療に不応である。実施形態において、がんは、低分子キナーゼ阻害剤による標的治療に不応である。実施形態において、がんは、例えば、免疫療法、化学療法剤による治療、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体を用いた治療、共刺激分子又は共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又はブロッキング抗体を用いた治療、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体及び細胞毒性剤を含む免疫複合体、ＡＤＣ、又は融合分子を用いた治療、低分子キナーゼ阻害剤による標的治療、手術を用いた治療、幹細胞移植を用いた治療、並びに放射線を用いた治療のうちの２つ以上を伴う併用療法に不応である。
【0051】
膀胱がん
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療として膀胱がんを治療するための方法及び使用に関する。
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療として膀胱がんを治療するための方法及び使用に関する。
【0052】
実施形態において、膀胱（ｂａｌｄｅｒ）がんは、新たに診断された、（膀胱又は排尿系、尿管、腎盂を越えて）局所的に進行した膀胱がん及び尿路上皮がんである。実施形態において、膀胱がん患者は、全身療法を受けていない、又はネオアジュバント全身化学療法から１２か月以内である。
【0053】
実施形態において、膀胱がん患者はシスプラチンを含む標準的なレジメンを受けるのに不適格である。
【0054】
実施形態において、膀胱がん腫瘍は、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ－１、ＢＡＰ－１、ＲＡＳ、ＰＢＲＭ１、ＰＩ３Ｋ、及び／又はＰＩＫ３ＣＡの変異を有する。実施形態において、膀胱がん腫瘍はＨＥＲ２及び／又はＥＧＦＲ２の変異を有する。
【0055】
実施形態において、膀胱がんは筋層浸潤性膀胱がんである。
【0056】
胆管がん（ＣＣＡ）
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療としてＣＣＡを治療するための方法及び使用に関する。
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療としてＣＣＡを治療するための方法及び使用に関する。
【0057】
ＣＣＡは胆道系に発生する多様な悪性腫瘍群を構成する。ＣＣＡは、解剖学的な発生部位に応じて、肝内（ｉＣＣＡ）、肺門部（ｐＣＣＡ）、及び遠位（ｄＣＣＡ）の３つのサブタイプに分けられる。ＨＣＣ－ＣＣＡ混合腫瘍は独立実体（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｔｉｔｙ）と考えられており、ｉＣＣＡとＨＣＣの両方の特徴を共有し、侵襲性の強い疾患経過及び予後不良を示す稀なタイプの肝悪性腫瘍である。ｉＣＣＡは二次胆管の上方に生じるが、ｐＣＣＡとｄＣＣＡの間の解剖学的な区別のポイントは、胆嚢管の挿入である。ｐＣＣＡとｄＣＣＡをまとめて「肝外」（ｅＣＣＡ）と呼ぶこともある。米国では、ｐＣＣＡがＣＣＡ全体の約５０～６０％を占める単一の最大のグループであり、次いでｄＣＣＡ（２０～３０％）、ｉＣＣＡ（１０～２０％）となっている。ＣＣＡは肝細胞がん（ＨＣＣ）に次いで２番目に頻度の高い原発性肝悪性腫瘍であり、すべての原発性肝腫瘍の約１５％、消化器がんの３％を占める。ＣＣＡは通常、早期では無症状であり、したがって疾患が既に進行した段階で診断されることが多く、治療選択肢が大きく狭まり、結果として予後不良となる。ＣＣＡは稀ながんであるが、その発生率（住民１０万人あたり年間０．３～６人）及び死亡率（韓国や、中国、タイなど、発生率が人口１０万人あたり＞６人の特定の地域を考慮せず、世界的に住民１０万人あたり年間１～６人）は、ここ数十年、世界中で増加しており、世界的な健康問題となっている。ＣＣＡに対する認識、知識、診断及び治療法の進歩にもかかわらず、患者の予後は過去１０年間で実質的に改善されておらず、５年生存率（７～２０％）及び切除後の腫瘍再発率は依然として期待外れである。大胆管ｉＣＣＡでは、ｐＣＣＡ及びｄＣＣＡと同様に、ＫＲＡＳ及び／又はＴＰ５３遺伝子の高頻度の変異がみられる。実施例１～２で議論されるように、変異がＴＰ５３、ＡＲＩＤ－１、ＢＡＰ－１、ＲＡＳ、ＰＢＲＭ１、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡにある腫瘍は、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ療法に対する反応を妨げなかった。さらに、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ＋抗ＥＧＦＲ（セツキシマブ）の共投与は、例えばＨＥＲ２の過剰発現などの要因におそらく起因して、特に抗ＥＧＦＲ抵抗性のがんなどにおいて相乗的な抗腫瘍効果を有しうる。
【0058】
実施形態において、ＣＣＡ患者は、シスプラチン及び／又はゲムシタビンに抵抗性である。
【0059】
他のがん種のなかでもとりわけ、胆管がんを治療するための組成物には、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ融合タンパク質と、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗体断片（例えばＶＨＨ、ナノボディ、ｓｃＦｖなど）の併用投与が含まれる。実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるセツキシマブであることができる。抗体は、他の抗体フォーマットのなかでもとりわけ、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体であることができる。
【0060】
ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ２変異がん
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療としてＨＥＲ２／ＥＧＦＲ２変異がんを治療するための方法及び使用に関する。
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療としてＨＥＲ２／ＥＧＦＲ２変異がんを治療するための方法及び使用に関する。
【0061】
実施形態において、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ２変異がんは、肺がん、頭頸部がん又は膀胱がんである。
【0062】
実施形態において、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ２変異がん患者は、化学療法及び／又はキナーゼ阻害剤治療及び／又はＨｅｒ２抗体治療（例えばＡＤＣを含む）が失敗している。
【0063】
実施形態において、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ２変異がん患者は、エクソン２０ ｐ＾７７２＿Ａ７７５重複Ｈｅｒ２変異を有する。実施形態において、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ２変異がん患者は、ＲＢ１ エクソン２０ ｐＬ７００Ｘ、ＴＰ５３ エクソン４ ｐ．Ｓ１１６ｆｓの同時変異を有する。
【0064】
実施形態において、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ２変異がん患者はＥＲＢＢ２ エクソン１７ Ｖ６５９Ｅ変異を有する。実施形態において、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ２変異がん患者は、ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ ５４５Ｋ、ＴＰ５３、エクソン５、Ｒ１５８ｆｓ、及びＡＴＭ Ｇ２８９１Ｄ ＮＦ１ Ｅ２１４３変異を同時に有する。
【0065】
実施形態において、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ２変異がん患者はＥＲＢＢ２変異を有する。実施形態において、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ２変異がん患者は、ＡＴＭ、ＲＩＣＴＯＲ、ＣＣＮＥ１、ＣＤＫＮ１８、ＩＲＳ２、ＰＭＳ２、ＴＥＲＴ、及びＴＰ５３変異を同時に有する。
【0066】
実施形態において、ＥＧＦＲ変異がん、例えば頭頸部がん、肺がん、結腸（ｃｏｌｏｎ）がん、及び膀胱がんは、高いＥＧＦＲレベルを示す。
【0067】
ＫＲＡＳ変異がん
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療としてｋｒａｓ変異がんを治療するための方法及び使用に関する。
実施形態において、本開示は、例えば、第一選択療法として；且つ／又は過去に抗がん療法による治療に反応したが、治療を止めると再発性がんを経験した対象の治療として；且つ／又は抵抗性若しくは難治性のがんの対象の治療としてｋｒａｓ変異がんを治療するための方法及び使用に関する。
【0068】
実施形態において、ｋｒａｓ変異がんは、肺、結腸直腸（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ）及び膵臓がんから選択される。実施形態において、ｋｒａｓ変異がんは、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）から選択される。
【0069】
実施形態において、ｋｒａｓの変異は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｒから選択される。
【0070】
実施形態において、本発明の方法は、Ｋｒａｓ核酸又はタンパク質レベルの低下又は阻害を引き起こす。実施形態において、本発明の方法は、Ｋｒａｓタンパク質のタンパク質分解の増加を引き起こす。
【0071】
実施形態において、本発明の方法は、例えば未治療の状態（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）と比較して、Ｋｒａｓによって引き起こされる腫瘍形成の減少又は阻害を引き起こす。
【0072】
医薬組成物
実施形態において、本開示のポリペプチド治療剤は、活性治療剤、すなわち、及び（ｉ．ｅ．，ａｎｄ）他の様々な薬学的に許容される成分を含む医薬組成物として投与されることが多い（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０を参照）。好ましい形態は、意図する投与の方法及び治療への応用によって決まる。組成物には、所望の製剤に応じて、動物又はヒトへの投与のための医薬組成物を製剤化するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される、薬学的に許容される無毒の担体又は希釈剤を含めることもできる。希釈剤は、組み合わせたもの（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）の生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、及びハンク液である。さらに、医薬組成物又は製剤は、他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤などを含むこともできる。
実施形態において、本開示のポリペプチド治療剤は、活性治療剤、すなわち、及び（ｉ．ｅ．，ａｎｄ）他の様々な薬学的に許容される成分を含む医薬組成物として投与されることが多い（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０を参照）。好ましい形態は、意図する投与の方法及び治療への応用によって決まる。組成物には、所望の製剤に応じて、動物又はヒトへの投与のための医薬組成物を製剤化するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される、薬学的に許容される無毒の担体又は希釈剤を含めることもできる。希釈剤は、組み合わせたもの（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）の生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、及びハンク液である。さらに、医薬組成物又は製剤は、他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤などを含むこともできる。
【0073】
実施形態において、原発性又は転移性がんの治療のための医薬組成物は、非経口、局所、静脈内、腫瘍内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、又は筋肉内の手段によって投与することができる。
【0074】
非経口投与の場合、開示の医薬組成物は、水や、油、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの無菌の液体でありうる医薬担体を用いて、生理的に許容される希釈剤中の物質の溶液又は懸濁液の注射可能な用量として投与することができる。さらに、湿潤剤又は乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質を組成物中に存在させることができる。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物、又は合成由来のもの、例えばピーナッツ油、大豆油、及び鉱油である。一般に、プロピレングリコールやポリエチレングリコールなどグリコールは、特に注射可能な溶液に好ましい液体担体である。抗体及び／又はポリペプチドは、有効成分の徐放を可能にするような方法で製剤化されたデポ注射剤又はインプラント製剤の形態で投与することができる。典型的には、医薬組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして注射剤として調製される；注射前に液体ビヒクルへの溶解又は懸濁に適した固体形態も調製することができる。この製剤は、前述のように、アジュバント効果を高めるために、リポソーム又はポリラクチドや、ポリグリコリド、コポリマーなどの微粒子に乳化又はカプセル化することもできる。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７，１９９０及びＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８：９７－１１９，１９９７。本開示のポリペプチド剤は、有効成分の持続的又はパルス放出を可能にするような方法で製剤化できるデポ注射剤又はインプラント製剤の形態で投与することができる。
【0075】
他の投与方法に適したさらなる製剤としては、経口、鼻腔内、及び肺用製剤、坐剤、並びに経皮適用が挙げられる。
【0076】
実施形態において、本開示の方法は、治療を必要とする患者に、本開示のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチドの治療有効量又は有効量を投与することを含む。実施形態において、例えば、原発性又は転移性がんの治療のための、本明細書に記載の本開示のポリペプチドの有効量は、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、施される他の薬物療法（ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ）、及び治療が予防的か治療的かを含む多くの様々な因子に応じて異なる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含むヒト以外の哺乳類も治療することができる。治療投与量は、安全性及び有効性を最適化するように量を決める必要がある。
【0077】
実施形態において、投与量は、約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇの宿主体重、より通常は０．０１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であることができる。例えば、投与量は１ｍｇ／ｋｇ体重若しくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、又は１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であることができる。実施形態において、患者に投与されるポリペプチドの投与量は、約０．５、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０、及び約１０．０ｍｇ／ｋｇから選択される。実施形態において、治療計画（ｒｅｇｉｍｅ）は週１回の投与を伴う。実施形態において、治療計画は２週間に１回又は１か月に１回又は３か月～６か月に１回の投与を伴う。本開示の治療実体（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）は、通常、複数回にわたって投与される。単回投与の間隔は、毎週、隔週、毎月、又は毎年であることができる。また、間隔は、適応があれば、患者の治療実体の血中レベルを測定することによって不規則であることもできる。代替的に、本開示の治療実体は、徐放性製剤として投与でき、その場合、投与回数が少なくてすむ。投与量及び頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期によって異なる。
【0078】
本明細書に記載のポリペプチドの毒性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％を致死させる投与量）又はＬＤ１００（集団の１００％を致死させる投与量）を測定することによって、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果の投与量比が治療指数である。細胞培養アッセイ及び動物試験で得られたデータは、ヒトでの使用に毒性のない投与量範囲を処方する際に使用することができる。本明細書に記載のポリペプチドの投与量は、好ましくは、毒性がほとんど又は全くない有効量を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、採用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わりうる。正確な製剤、投与経路及び投与量は、患者の状態を考慮して、対象の医師（ｓｕｂｊｅｃｔ ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）によって選択されうる（例えば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１を参照）。
【0079】
実施形態において、本発明の方法は、免疫療法、化学療法、標的特異的腫瘍抗原に対する除去抗体を用いた治療、標的共刺激分子又は共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又はブロッキング抗体を用いた治療、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体及び細胞毒性剤を含む免疫複合体、ＡＤＣ、又は融合分子を用いた標的治療、低分子キナーゼ阻害剤標的治療、手術、放射線療法、並びに幹細胞移植から選択される１つ又は複数のさらなる抗がん療法を含む。併用は相乗効果がある可能性がある。併用は、抗がん療法の治療指数を高める可能性がある。
【0080】
実施形態において、免疫療法は、ＰＤ－１や、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡなど共刺激分子又は共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又はブロッキング抗体を用いた治療；ブリナツモマブなどの二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ（登録商標））用いた治療：ＩＬ－２や、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γなどの生物学的反応修飾物質の投与を伴う治療；シプロイセルＴなどの治療ワクチンを用いた治療；樹状細胞ワクチン又は腫瘍抗原ペプチドワクチンを用いた治療；キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を用いた治療；ＣＡＲ－ＮＫ細胞を用いた治療；腫瘍浸潤リンパ球腫瘍（ＴＩＬ）を用いた治療；養子移入抗腫瘍Ｔ細胞（生体外増殖及び／又はＴＣＲトランスジェニック）を用いた治療；ＴＡＬＬ－１０４細胞を用いた治療；並びにＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストＣｐＧやイミキモドなどの免疫刺激剤を用いた治療から選択される。実施形態において、免疫療法は、共刺激分子又は共抑制分子に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又はブロッキング抗体を用いた治療；キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を用いた治療；ＣＡＲ－ＮＫ細胞を用いた治療；及び二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ（登録商標））を用いた治療から選択される。実施形態において、免疫療法は、共刺激分子又は共抑制分子に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又はブロッキング抗体を用いた治療である。実施形態において、免疫療法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を用いた治療である。実施形態において、免疫療法は、ＣＡＲ－ＮＫ細胞を用いた治療である。実施形態において、免疫療法は、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ（登録商標））をも用いた治療である。
【0081】
併用療法の性質に応じて、本開示のポリペプチド治療剤の投与は、他の療法が投与されている間に、かつ／又はその後に継続することができる。ポリペプチド治療剤は、さらなる抗がん療法の前、同時、又は後に、通常、少なくとも約１週間以内、少なくとも約５日以内、少なくとも約３日以内、少なくとも約１日以内に投与することができる。ポリペプチド治療剤は、単回投与で送達してもよく、複数回投与に分割してもよく、例えば、毎日、隔日、半週（ｓｅｍｉ－ｗｅｅｋｌｙ）、毎週を含む一定期間にわたって送達してもよい。有効量は、投与経路、特定の薬剤、抗がん剤の投与量などによって異なることになり、当業者が経験的に決定することができる。
【0082】
本開示をさらに詳細に説明するために以下の実施例を示す。
【実施例】
【0083】
実施例１：頭頸部ＳＣＣにおけるｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ単剤療法の第Ｉ／ＩＩ相試験
この研究では、用量漸増コホート７名と拡大コホート１１名を含む１８名のＨＮＳＣＣ患者が登録された。８名の患者がＨＰＶ陰性、１０名の患者がＨＰＶ陽性であった。耳下腺の腺嚢胞がん患者１名は解析から除外された。１名の患者は治療の最初の３週間内に治療を中止した。
この研究では、用量漸増コホート７名と拡大コホート１１名を含む１８名のＨＮＳＣＣ患者が登録された。８名の患者がＨＰＶ陰性、１０名の患者がＨＰＶ陽性であった。耳下腺の腺嚢胞がん患者１名は解析から除外された。１名の患者は治療の最初の３週間内に治療を中止した。
【0084】
１６名の患者の反応を評価した。患者は毎週、静注ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡを１０ｍｇ／ｋｇで受けた。１５名の患者は過去に根治的放射線療法及び化学療法を受けていた。１０名の患者は診断時又は再発時のいずれかに手術を受けたことがあった。患者は全員、再発したＨＮＳＣＣに対する化学療法を受けた。前全身療法は２～６つの異なるレジメンであった。さらに、１２名の患者が以前にセツキシマブの投与を受け、１名の患者がＰＤ１抗体の投与を受けた。結果を下の表１並びに図１、図２及び図３に示す。
【0085】
これらの患者のなかでの全奏効は、ＰＲが２名、腫瘍退縮が２名、混合奏効が１名、４か月を超える安定が５名で見られた。６名の患者は進行であった。奏効した患者のなかで１名が生検を受けたが、生存腫瘍の証拠はなかった（図１）。１名の患者は１０か月後に治療を止めることを決め、それから１６か月間無病状態のままであった。図２は、１０ｍｇ／ｋｇのｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡで毎週治療した喉頭ＳＣＣの患者のスキャンを示す。スキャンでは、治療の８週目に部分奏効がみられる。
【0086】
【0087】
本研究により、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡが単剤で再発した難治性ＨＮＳＣＣに活性を有することが示され、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡがＨＮＳＣＣの治療の第一選択療法として使用できることが示唆されている。
【0088】
実施例２：肝細胞がんにおけるｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ単剤療法
組織学的に進行肝細胞がんと確認されたＨＣＣ（≧１８歳）のコホートを調べた。過去にソラフェニブ及び／又はＰＤ１抗体による治療を受けた患者を適格とした。主要評価項目は、安全性及び忍容性及び客観的奏効率（固形腫瘍における治療効果評価基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）バージョン１．１、奏効期間、安定の期間、並びに無増悪期間であった。患者は毎週、１０ｍｇ／ｋｇのｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの静脈内投与を受けた。１５名の適格患者が試験に登録された。患者のほとんどはアジア人の男性で、ほとんどの患者のＥＣＯＧパフォーマンスステータスは１であった。患者全員が過去に全身療法を受けたことがあり、ＰＤ１抗体が１０例、ネクサバールが９例、手術が６例、放射線が５例であった。ほとんどの患者は以前に２つ以上のレジメンを受けていた。これまでのところ、客観的奏効率は１５名の患者のうち１名（７％）、４か月を超える安定が８名（２０＋か月超は２名）であった。結論として、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは安全に長期間投与することができる。グレード３の毒性は、疲労１名、悪心１名、好中球減少１名、及び高血圧６名である。高血圧では５名で、減量が必要であった。ネクサバール及びＰＤ－１が失敗した後の持続的な客観的奏効及び長期安定は、単剤及びＰＤ－１抗体との併用での開発を支持する。
組織学的に進行肝細胞がんと確認されたＨＣＣ（≧１８歳）のコホートを調べた。過去にソラフェニブ及び／又はＰＤ１抗体による治療を受けた患者を適格とした。主要評価項目は、安全性及び忍容性及び客観的奏効率（固形腫瘍における治療効果評価基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）バージョン１．１、奏効期間、安定の期間、並びに無増悪期間であった。患者は毎週、１０ｍｇ／ｋｇのｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの静脈内投与を受けた。１５名の適格患者が試験に登録された。患者のほとんどはアジア人の男性で、ほとんどの患者のＥＣＯＧパフォーマンスステータスは１であった。患者全員が過去に全身療法を受けたことがあり、ＰＤ１抗体が１０例、ネクサバールが９例、手術が６例、放射線が５例であった。ほとんどの患者は以前に２つ以上のレジメンを受けていた。これまでのところ、客観的奏効率は１５名の患者のうち１名（７％）、４か月を超える安定が８名（２０＋か月超は２名）であった。結論として、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは安全に長期間投与することができる。グレード３の毒性は、疲労１名、悪心１名、好中球減少１名、及び高血圧６名である。高血圧では５名で、減量が必要であった。ネクサバール及びＰＤ－１が失敗した後の持続的な客観的奏効及び長期安定は、単剤及びＰＤ－１抗体との併用での開発を支持する。
【0089】
全部で、８名の患者が４か月以上続く安定を、２名の患者が２０か月を超えて安定であった。グレード３／４の治療関連有害事象は７名の患者（４７％）に認められ、うち６名の患者は高血圧であった。２名の患者は減量が必要であった。高血圧による合併症が起きた患者はいなかった。
【0090】
１名の患者（ＦＮ）はＨＣＶ関連ＨＣＣの７９歳の女性で、過去に１５か月間ＴＡＣＥによる治療を受け、部分奏効を得た。次いで、ＰＤ１抗体による治療を受け、５か月後に進行した。その後、１１か月間ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡによる治療を受け、２つの小さな残存結節を定位放射線療法で治療した。その患者は現在、８か月＋の間（又は最初の試験登録から２２＋か月）無治療で無病状態のままである（図４）。
【0091】
別の患者（ＢＷ）は、ＨＣＶ関連ＨＣＣの男性で、過去にＴＡＣＥによる治療を受け、７か月間安定であった。次いで、ＰＤ１抗体の投与を受け、腫瘍が退縮した。その後、肺転移を含む疾患進行が認められた。ＰＤ１抗体は１８か月間継続したが、最初の８か月以降は徐々に進行した。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡを２０＋か月の間使用しており、安定している。３例目の患者（ＴＮ）は、肝移植を受け、再発性ＨＣＣを発症した。過去にネクサバール、ＴＡＣＥ、ジェムザール、オキサリプラチン、イットリウム９０の投与を受けた。８か月間安定であった（図５）。
【0092】
この第２相試験は、ネクサバール及びＰＤ１抗体が失敗した後、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡによる治療は、腫瘍の退縮及び持続的な病勢コントロールをもたらし、奏効、奏効期間及び生存の改善が得られ、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡはＨＣＣの治療に第一選択療法として使用できることを示している。
【0093】
実施例３：Ｋｒａｓ変異非小細胞肺腺がんにおけるｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ単剤療法
Ｋｒａｓ変異肺腺がん患者のコホートを単剤ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ試験で評価した。患者は、ＫＲＡＳ変異肺がんの診断歴があり、以前の治療が失敗で、進行性の疾患の証拠がある場合に組み入れられた。９名の患者が登録された。９名中２名の患者は治療４週間以内に試験から抜け、反応は評価されなかった。患者の概要は臨床概要データにも含まれている。５症例をそれぞれ以下にまとめる。
Ｋｒａｓ変異肺腺がん患者のコホートを単剤ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ試験で評価した。患者は、ＫＲＡＳ変異肺がんの診断歴があり、以前の治療が失敗で、進行性の疾患の証拠がある場合に組み入れられた。９名の患者が登録された。９名中２名の患者は治療４週間以内に試験から抜け、反応は評価されなかった。患者の概要は臨床概要データにも含まれている。５症例をそれぞれ以下にまとめる。
【0094】
患者ＡＣ：Ｋｒａｓ変異多巣性肺腺がん及び脳転移。患者は脳照射を受け、その後カルボプラチン、パクリタキセル、アバスチンを３サイクル投与された。患者は不耐であり、７か月で進行した。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの治療を受け、１１か月間安定していた（図６）。
【0095】
患者ＴＣ：Ｋｒａｓ変異右上肺腺がん、アリムタ及びカルボプラチンの投与を受け、１０か月後に進行した。次いで、ナノスフィアドセタキセルを６か月間投与して安定し、タキソテールを４か月間投与して進行した。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡに進み、右肩痛は消失し、８か月間安定していた。
【0096】
患者ＰＳ：Ｋｒａｓ変異肺がんに対し、アリムタ、カルボプラチン及びアバスチンを６サイクルによる治療、続いてアリムタを計２１か月間維持。再発時には、タキソテールによる８か月間の治療を受け、アバスチンで進行、ノベルビンとアバスチンに不耐性、アバスチン単独での進行、エトポシド＋シスプラチン＋ゲムシタビンで進行であった。次いで、ゲムシタビンとアバスチンの投与を６か月間受けた。進行でｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ試を受けた。４か月間安定している。
【0097】
患者ＪＣ：右上肺Ｋｒａｓ変異中等度分化型肺腺がんをもつ７６歳女性、手術を受け、シスプラチン及びアリムタのアジュバント療法を４サイクル行った。患者の疾患は進行していた。腫瘍はＰＤ－Ｌ１陽性（７０％）であったので、ペムブロリズマブの治験に進んだ。腫瘍は３か月後に進行した。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの治験を受け、４か月間安定であった。
【0098】
患者ＨＷ：Ｋｒａｓ変異肺がん患者はアバスチン、アリムタ、及びカルボプラチンの投与を受けた。６か月後に進行し、患者はｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ治験に入った。患者は３２週間安定（ｔａｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ）であった。
【0099】
奏効を評価できた９名の患者中７名で、５名の患者がＥｐｈＢ４－ＨＳＡ単剤療法でそれぞれ１１か月、８か月、８か月、４か月、及び４か月間安定を示した。
【0100】
実施例４：カポジ肉腫におけるｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ単剤療法
３名のＫＳ患者を試験対象とした。２名はＨＩＶに感染し、１名はＨＩＶ陰性であった。３名の患者は全員、過去に複数の前治療を受けていた。６つの前治療を受けた２名のＨＩＶ ＫＳ患者のうちの１名は、脚全体で疾患が進行し、３つの前治療で完全には消失しなかった長期にわたる広範な関連浮腫があった。
３名のＫＳ患者を試験対象とした。２名はＨＩＶに感染し、１名はＨＩＶ陰性であった。３名の患者は全員、過去に複数の前治療を受けていた。６つの前治療を受けた２名のＨＩＶ ＫＳ患者のうちの１名は、脚全体で疾患が進行し、３つの前治療で完全には消失しなかった長期にわたる広範な関連浮腫があった。
【0101】
別の患者は、以前に細胞毒性化学療法及び複数の治験薬による治療を受けていた。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡを投与した。腫瘍は完全に消失し、脚の浮腫も完全に消失した（図７）。２年を超えて寛解が続いている。治療頻度は、２週間に１回、１０ｍｇ／ｋｇに減らされ、６か月を超えて寛解が維持されている。前臨床試験、腫瘍での標的発現、及び臨床での反応に基づき、現在ＮＣＩ－ＣＴＥＰ－ＡＭＣ（ＡＩＤＳ悪性腫瘍コンソーシアム（ＡＩＤＳ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ））を通じて第ＩＩ相試験が進行中である。
【0102】
実施例５：ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ膀胱がんの第一選択又はフロントライン療法
進行した疾患：全身療法の使用前又はネオアジュバント全身化学療法の１２か月以内に新しく診断された、（膀胱又は排尿系、尿管、腎盂を越えて）局所的に進行した膀胱がん及び尿路上皮がん（図８）。８名の患者は標準的なシスプラチン含有レジメンを受けるのに不適格で、結果として生存率は非常に低かった。１０名の患者は、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、メトトレキサートなどの細胞毒性化学療法を受けずに、毎週１０ｍｇ／ｋｇのｓＥｐｈＢ４－アルブミンを含むレジメンで治療されていた。６人の患者は、最初の６週間の治療を完了し、放射線学的方法（コンピュータ断層撮影）による腫瘍評価を１回又は複数回受けた。６人の患者はそれぞれ、ＲＥＣＩＳＴ治療効果基準（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ）（バージョン１．０）によって定義された奏効を示した。さらに、６人の患者はそれぞれ、完全寛解を達成した。さらに、４～１６か月の追跡調査後に再発した患者はいなかった。最初の３週間内に無関係な理由で治療を中止した２人の患者が死亡した。８人の患者が生存している。
進行した疾患：全身療法の使用前又はネオアジュバント全身化学療法の１２か月以内に新しく診断された、（膀胱又は排尿系、尿管、腎盂を越えて）局所的に進行した膀胱がん及び尿路上皮がん（図８）。８名の患者は標準的なシスプラチン含有レジメンを受けるのに不適格で、結果として生存率は非常に低かった。１０名の患者は、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、メトトレキサートなどの細胞毒性化学療法を受けずに、毎週１０ｍｇ／ｋｇのｓＥｐｈＢ４－アルブミンを含むレジメンで治療されていた。６人の患者は、最初の６週間の治療を完了し、放射線学的方法（コンピュータ断層撮影）による腫瘍評価を１回又は複数回受けた。６人の患者はそれぞれ、ＲＥＣＩＳＴ治療効果基準（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ）（バージョン１．０）によって定義された奏効を示した。さらに、６人の患者はそれぞれ、完全寛解を達成した。さらに、４～１６か月の追跡調査後に再発した患者はいなかった。最初の３週間内に無関係な理由で治療を中止した２人の患者が死亡した。８人の患者が生存している。
【0103】
ＴＰ５３、ＡＲＩＤ－１、ＢＡＰ－１、ＲＡＳ、ＰＢＲＭ１、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡに変異がある腫瘍は、治療への反応を妨げなかった。
【0104】
標準治療の化学療法では、一般にゲムシタビンと併用されるシスプラチンが含まれる。最良の治療レジメンにより、症例の約４０％で全奏効が得られ、無増悪生存期間は６～７か月、全生存期間中央値は約１６か月であった。シスプラチンの投与を受けることができなかった患者（一般に４０～６０％）の予後は、はるかに悪かった。
【0105】
実施例６：筋層浸潤性膀胱がん
図８は、新たに診断され、ｓＥｐｈＢ４－アルブミン融合タンパク質を含むレジメンで治療された進行膀胱がんの全生存率をグラフ化したものである。
図８は、新たに診断され、ｓＥｐｈＢ４－アルブミン融合タンパク質を含むレジメンで治療された進行膀胱がんの全生存率をグラフ化したものである。
【0106】
新たに膀胱がんと診断された患者は、標準治療のシスプラチン＋ゲムシタビンによる化学療法を受け、根治手術（根治的膀胱全摘術）の時点で３０％近くの病理学的完全寛解が得られ、長期無病生存が予測された。再発までの期間の中央値は約１４～１７か月であった。新たに筋層浸潤性膀胱がんと診断された１７名の患者を、ｓＥｐｈＢ４－アルブミン融合タンパク質で治療した（図９）。薬剤の標的であるエフリンＢ２を発現した１０名の患者の病理学的完全寛解率は７０％であった。これら７人の患者のうち、最長３６か月の追跡期間中に再発したものはいなかった。さらに、膀胱摘出術を拒否した２名の患者は、２年を超える追跡調査の後も無病のままであり、バイオマーカー陽性膀胱がん患者では臓器温存が達成できることを示している。これらの結果は非常に想定外であった。さらに、７名のバイオマーカーエフリンＢ２陰性患者は、最長３６か月までの追跡調査後に再発した患者はいなかったが、病理学的完全寛解を達成した患者は２名だけであった。これらのデータは、エフリンＢ２が治療中に誘導され、生物学的な利益、さらには記憶反応（ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を生み出すことにつながる可能性を示唆した。
【0107】
実施例７：筋層非浸潤性膀胱がん又は表在がん
筋層浸潤性膀胱がんなどのバイオマーカー陽性患者の腫瘍は、筋層浸潤性膀胱がん及び転移性膀胱がんよりも、免疫療法に反応する腫瘍を有し、持続的な反応を得る可能性がさらに高い。とりわけ、ＢＣＧは筋非浸潤性膀胱がんに高い活性を示す。様々な臓器：肺、頭頚部、膀胱のＨＥＲ２／ＥＧＦＲ２変異がん、Ｈｅｒ２変異腫瘍は治癒不能である。標準的な療法としては、化学療法、キナーゼ阻害剤、及びＨｅｒ２抗体薬物複合体が挙げられる。それらの治療は、部分的な患者集団に部分奏効をもたらした。
筋層浸潤性膀胱がんなどのバイオマーカー陽性患者の腫瘍は、筋層浸潤性膀胱がん及び転移性膀胱がんよりも、免疫療法に反応する腫瘍を有し、持続的な反応を得る可能性がさらに高い。とりわけ、ＢＣＧは筋非浸潤性膀胱がんに高い活性を示す。様々な臓器：肺、頭頚部、膀胱のＨＥＲ２／ＥＧＦＲ２変異がん、Ｈｅｒ２変異腫瘍は治癒不能である。標準的な療法としては、化学療法、キナーゼ阻害剤、及びＨｅｒ２抗体薬物複合体が挙げられる。それらの治療は、部分的な患者集団に部分奏効をもたらした。
【0108】
Ｈｅｒ２はＥｐｈＢ４とともに細胞膜に局在する。Ｈｅｒ２はＥｐｈＢ４を誘導する。Ｈｅｒ２特異的抗体はＥｐｈＢ４レベルを低下させた。研究により、ＥｐｈＢ４がＨｅｒ２の下流シグナル伝達及びリン酸化を調節することが示された。まず、ＥｐｈＢ４の発現が予想通り高いＨｅｒ２トランスジェニックマウスを調べた。トランスジェニックマウスに可溶性ＥｐｈＢ４を投与すると、腫瘍形成及び肺を含む転移が阻止された（図１０）。マウスに７．５ｍｇ／ｋｇの投与量を週３回ＩＰ注射で５週間投与した。腫瘍組織のＨｅｒ２／ＥＲＢＢ２総タンパク質及びタンパク質のリン酸化を分析した。組織分析では、蛍光共焦点顕微鏡染色分析によりＨｅｒ２リン酸化の減少が示された。したがって、化学療法が失敗したＨｅｒ２過剰発現腫瘍を治療した。迅速で且つしばしば完全な寛解が観察され、長期間持続した。マウスにおけるｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ投与は、腫瘍体積の統計的に有意な減少（ｐ＝０．００５）とマウス１頭当たりの腫瘍量の有意な減少（ｐ＜０．００５）を示した。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ投与後、マウス１頭当たりの平均腫瘍数の統計的に有意な減少が観察された（ｐ＜０．０１）。さらに、観察された肺転移の量は大きく減少した。
【0109】
ヒトでは、Ｈｅｒ２変異腫瘍はさらに大きな課題となる。標準治療化学療法及びキナーゼ阻害剤が失敗したＨｅｒ２変異がんの患者を治療した。疾患のこの状態は、アンメットニーズを表している。治療への抵抗性を示すエクソン２０ ｐ＾７７２＿Ａ７７５重複、ＲＢ１ エクソン２０ ｐＬ７００Ｘ、ＴＰ５３ エクソン４ ｐ．Ｓ１１６ｆｓ；ＥＲＢＢ２ エクソン１７ Ｖ６５９Ｅの同時変異、同時ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ ５４５Ｋ、ＴＰ５３、エクソン５、Ｒ１５８ｆｓ、ＡＴＭ Ｇ２８９１Ｄ ＮＦ１ Ｅ２１４３を含むＨｅｒ２変異をもつ５名の患者を治療した。別の症例では、ＥＲＢＢ２変異はＡＴＭ、ＲＩＣＴＯＲ、ＣＣＮＥ１、ＣＤＫＮ１８、ＩＲＳ２、ＰＭＳ２、ＴＥＲＴ、ＴＰ５３を同時に有する。患者は完全寛解し、２年後、無病で無治療のままであった。図１１は、ｓＥｐｈＢ４療法に対するＥＲＢＢ２ エクソン２０重複の奏効を示した。
【0110】
別の患者では、ＥＲＢＢ２変異にくわえて、ＡＬＫとＲＯＳ１の再構成の同時変異があった。腫瘍は肺、頭頸部、骨、脳、及びリンパ節に限局していた。
【0111】
それぞれの患者において、週１回１０ｍｇ／ｋｇの治療でｓＥｐｈＢ４－アルブミン融合タンパク質を投与すると迅速な奏効が観察された。５名の患者のうち３名で完全寛解が認められた。５名の患者のうち４名が奏効を示し、３名の患者が完全寛解を達成し、期間は６か月の持続～２年を超えて持続中である。
【0112】
実施例８：ＥＧＦＲ変異及び高発現が臨床上の大きな課題となる
ＥＧＦＲの増加は、頭頸部がん、肺がん、結腸がん、膀胱がんなど多くのがんで認められる。単剤抗体療法に対する奏効率は比較的低く、持続期間も短い。ＥＧＦＲ遺伝子変異はさらに大きな課題であり、キナーゼ阻害剤が失敗するのが一般的である。特に治療初期にＥＧＦＲ標的療法と併用する追加の療法が必要である。
ＥＧＦＲの増加は、頭頸部がん、肺がん、結腸がん、膀胱がんなど多くのがんで認められる。単剤抗体療法に対する奏効率は比較的低く、持続期間も短い。ＥＧＦＲ遺伝子変異はさらに大きな課題であり、キナーゼ阻害剤が失敗するのが一般的である。特に治療初期にＥＧＦＲ標的療法と併用する追加の療法が必要である。
【0113】
本発明者らはＥＧＦＲとＥｐｈＢ４は互いの発現を増強することを明らかにした。図１２に示されるように、抗ＥｐｈＢ４を用いた免疫沈降（ＩＰ）ではＥＧＦＲがプルダウンされ、同様に抗ＥＧＦＲを用いたＩＰではＥｐｈＢ４がプルダウンされ、両者が直接的な結合を介して共局在していることが示された。ＥｐｈＢ４のノックダウンは、細胞溶解物の免疫ブロットによって示されるように、ＥＧＦＲタンパク質レベルを低下させた。薬剤をそれぞれ標的とすることが、ＥｐｈＢ４過剰発現ＮＳＣＬＣ細胞（ＫＲＡＳ変異を有するＨ３５８非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）細胞株）において有効性であることが示され、併用すると、Ｈ６６１（Ｈｅｒ２過剰発現）ＮＳＣＬＣ細胞においてでさえも、その活性は増強された。したがって、ｓＥｐｈＢ４とＥＧＦＲを標的とする療法は強力な相乗的活性を示し、併用の根拠となった。
【0114】
図１３に示されるように、ｓＥｐｈＢ４と抗ＥＧＦＲ抗体（セツキシマブ）を用いた生体内有効性試験では、相乗的な有効性が示された。抗ＥＧＦＲ治療に抵抗性の腫瘍では、ｓＥｐｈＢ４は有効であり、ｓＥｐｈＢ４＋セツキシマブはどちらか単独の治療よりも有効であった。
【0115】
実施例９：胆管がんのｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ治療のアウトカム
胆管がんは治療に対する反応が悪い。標準的な化学療法はシスプラチン及びゲムシタビンである。新しい治療法、特に標的療法が必要である。最近、キナーゼ阻害剤によるＦＧＦＲ変異胆管がんの治療で腫瘍の退縮が示されたが、奏効率は低く、完全寛解の可能性はさらに低い。新規の治療法が必要である。胆管がんをｓＥｐｈＢ４で治療し、一部の患者は持続的な奏効を示した。これは、アンメットニーズに対する解決策であった。
胆管がんは治療に対する反応が悪い。標準的な化学療法はシスプラチン及びゲムシタビンである。新しい治療法、特に標的療法が必要である。最近、キナーゼ阻害剤によるＦＧＦＲ変異胆管がんの治療で腫瘍の退縮が示されたが、奏効率は低く、完全寛解の可能性はさらに低い。新規の治療法が必要である。胆管がんをｓＥｐｈＢ４で治療し、一部の患者は持続的な奏効を示した。これは、アンメットニーズに対する解決策であった。
【0116】
胆管がんでの奏効の例を示す図１４に示されるように、例えば、過去にゲムシタビン、シスプラチン、マイトマイシンＣ、手術、放射線療法、及び高周波超音波による治療を受けた６４歳の女性は、肺転移が進行していた。ｓＥｐｈＢ４－アルブミン融合タンパク質を１５ｍｇ／ｋｇで２週間ごとに投与する治療を受け、実質的な腫瘍退縮が１年を超えて続いた。
【0117】
実施例１０：ＥｐｈＢ４発現はＫｒａｓ変異細胞に増殖優位性を与える
本発明者らは、ヒトチロシンキナーゼのｓｉＲＮＡライブラリー（サーモサイエンティフィック）を使用して、Ｋｒａｓ変異がん細胞の生存の調節におけるチロシンキナーゼの役割を調べた。３つのＫｒａｓ変異がん細胞株（Ｈ３５８、Ｈ７２７、及びＭｉａ Ｐａｃａ－２）並びに２つのＫｒａｓ野生型細胞株（２９３Ｔ及びＬＴＣ）を、８５個のチロシンキナーゼを標的とするＳＭＡＲＴｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡライブラリー（遺伝子当たり４つのｓｉＲＮＡの混合物）でトランスフェクトした。ＭＴＴアッセイの結果は、ｓｉＲＮＡを介したチロシンキナーゼのノックダウンが細胞株の生存に及ぼす影響を示すヒートマップとして示した（図１５Ａ）。受容体型チロシンキナーゼＥｐｈＢ４の阻害は、３つのＫｒａｓ変異細胞において生存が最も低下し、対照（２９３Ｔ及びＬＴＣ）と比較して最も優れたｐ値（Ｐ＝０．０１８）をもつものをもたらしたので、ＥｐｈＢ４は対象となる標的である（図１５Ａ）。
本発明者らは、ヒトチロシンキナーゼのｓｉＲＮＡライブラリー（サーモサイエンティフィック）を使用して、Ｋｒａｓ変異がん細胞の生存の調節におけるチロシンキナーゼの役割を調べた。３つのＫｒａｓ変異がん細胞株（Ｈ３５８、Ｈ７２７、及びＭｉａ Ｐａｃａ－２）並びに２つのＫｒａｓ野生型細胞株（２９３Ｔ及びＬＴＣ）を、８５個のチロシンキナーゼを標的とするＳＭＡＲＴｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡライブラリー（遺伝子当たり４つのｓｉＲＮＡの混合物）でトランスフェクトした。ＭＴＴアッセイの結果は、ｓｉＲＮＡを介したチロシンキナーゼのノックダウンが細胞株の生存に及ぼす影響を示すヒートマップとして示した（図１５Ａ）。受容体型チロシンキナーゼＥｐｈＢ４の阻害は、３つのＫｒａｓ変異細胞において生存が最も低下し、対照（２９３Ｔ及びＬＴＣ）と比較して最も優れたｐ値（Ｐ＝０．０１８）をもつものをもたらしたので、ＥｐｈＢ４は対象となる標的である（図１５Ａ）。
【0118】
本発明者らは、ＥｐｈＢ４がＫｒａｓ変異依存性がん細胞株における細胞の生存の重要な調節因子であることを確認した。表１７に示される発がん性のＫｒａｓ変異を有する次の細胞株を、Ｋｒａｓ変異依存性について分析した：非小細胞性肺がん細胞株（ＮＳＣＬＣ）（Ｈ３５８、Ｈ７２７及びＨ２００９）、膵臓がん細胞株（Ｍｉａ Ｐａｃａ－２）、及び結腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６及びＳＷ６２０）。６つの細胞株はすべて、Ｋｒａｓ変異の除去に感受性があった（図１５Ｂ）。さらに、ＥｐｈＢ４の異なる領域を標的とする２つのｓｈＲＮＡによって細胞内でＥｐｈＢ４をノックダウンした。結果は、ＴＰ５３遺伝子の異常の存在の有無にかかわらず、ＥｐｈＢ４がＫｒａｓ変異細胞株の生存に必要であることを示した（図１５Ｃ及び表１７）。
【0119】
ＥｐｈＢ４タンパク質の発現は様々なヒトのがんで誘導され、腫瘍の病期の進行と関連している。ＨＣＴ１１６細胞においてＫｒａｓＧ１２Ｄ－ｍｙｃを過剰発現させ、内在性ＥｐｈＢ４タンパク質のレベルがＫｒａｓによって用量依存的に増強されることが示された（図１５Ｄ）。また、Ｋｒａｓによって引き起こされる２つの異なるマウスがんモデル（口腔乳頭腫及びＮＳＣＬＣ）の腫瘍におけるＥｐｈＢ４発現も検討した。Ｋ１４－ＣｒｅＥＲｔａｍ；ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄマウスは、サイトケラチン１４（Ｋ１４）プロモーターによって誘導されるタモキシフェン誘導Ｃｒｅリコンビナーゼ（ＣｒｅＥＲｔａｍ）を発現する。それらのマウスはまた、Ｋｒａｓ変異（ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ）を有し、タモキシフェン誘導（変異したＫｒａｓＧ１２Ｄの上流にあるｌｏｘＰ隣接ＳＴＯＰカセット（ＬＳＬ）のＣｒｅを介した除去）の１か月後に口腔乳頭腫を発症する。免疫染色により、ＥｐｈＢ４とそのリガンドエフリンＢ２の両方が腫瘍内で増加していることが示された（図１５Ｅ）。ＥｐｈＢ４染色の上昇が乳頭腫の基底層及び中間層で観察され、より分化した腫瘍領域ではエフリンＢ２リガンドがＥｐｈＢ４受容体と相補的に発現していた。
【0120】
ＮＳＣＬＣのモデルマウスにおいて、アデノウイルスを使用することによってＣｒｅリコンビナーゼ（アデノ－Ｃｒｅ）を、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｐ５３Ｆ／Ｆマウスの肺細胞に送達した。マウスはアデノウイルス気管内感染後に肺腺がんを発症する。ＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２の過剰発現も腫瘍内で観察された（図１５Ｆ）。これらの結果から、ＥｐｈＢ４シグナル伝達が発がん性のＫｒａｓＧ１２Ｄによって誘導されることが示唆された。
【0121】
実施例１１：ＥｐｈＢ４の遺伝子破壊除去はＫｒａｓ変異マウスの生存を増加させる
腫瘍発生におけるＥｐｈＢ４の役割を調べるため、ｅｐｈＢ４遺伝子のエクソン２及び３を標的としたＥｐｈＢ４コンディショナルノックアウトマウスを作製した。この変異体は、ｃｒｅを介した組換え後にｅｐｈＢ４に中途停止コドンを作り出す（図１６Ａ）。ＥｐｈＢ４Ｆ／Ｆの組織特異的ノックアウトを決定するために、Ｋ１４－ＣｒｅＥＲｔａｍマウスと変異体を交配し、マウスにタモキシフェンを投与した。口唇、舌、肺、心臓のＤＮＡ試料を採取し、タモキシフェン治療の１か月後に遺伝子型を決定した。予想通り、ＥｐｈＢ４再構成（図１６ＢのＥｐｈＢ４ ＲＡ）は、Ｋ１４－ＣｒｅＥＲｔａｍ；ＥｐｈＢ４Ｆ／Ｆマウスの口唇及び舌でのみ検出された。Ｋ１４－ＣｒｅＥＲｔａｍ；ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２ＤマウスのＫｒａｓ遺伝子上流のＳＴＯＰカセットの除去も口唇腫瘍で確認した。
腫瘍発生におけるＥｐｈＢ４の役割を調べるため、ｅｐｈＢ４遺伝子のエクソン２及び３を標的としたＥｐｈＢ４コンディショナルノックアウトマウスを作製した。この変異体は、ｃｒｅを介した組換え後にｅｐｈＢ４に中途停止コドンを作り出す（図１６Ａ）。ＥｐｈＢ４Ｆ／Ｆの組織特異的ノックアウトを決定するために、Ｋ１４－ＣｒｅＥＲｔａｍマウスと変異体を交配し、マウスにタモキシフェンを投与した。口唇、舌、肺、心臓のＤＮＡ試料を採取し、タモキシフェン治療の１か月後に遺伝子型を決定した。予想通り、ＥｐｈＢ４再構成（図１６ＢのＥｐｈＢ４ ＲＡ）は、Ｋ１４－ＣｒｅＥＲｔａｍ；ＥｐｈＢ４Ｆ／Ｆマウスの口唇及び舌でのみ検出された。Ｋ１４－ＣｒｅＥＲｔａｍ；ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２ＤマウスのＫｒａｓ遺伝子上流のＳＴＯＰカセットの除去も口唇腫瘍で確認した。
【0122】
以前に報告された従来のＥｐｈＢ４ノックアウトマウスは、心臓の欠陥に起因してＥ１０で胚致死を示す。そこで、コンディショナルＥｐｈＢｂ４変異体を、完全な遺伝子ノックアウトを生じる遍在的発現ＣＭＶ－Ｃｒｅ欠失マウスとクロスした。ＣＭＶ－Ｃｒｅ；ＥｐｈＢ４Ｆ／Ｆ胚の成長遅延がＥ１０．５及びＥ１１．５段階で認められた。また、ＥｐｈＢ４Ｆ／Ｆとタモキシフェン誘導ＣＭＶ－Ｃｒｅｔａｍマウスを交配させて、成体におけるＥｐｈＢ４の意義を調べた。ＣＭＶ－Ｃｒｅｔａｍ；ＥｐｈＢ４Ｆ／Ｆマウスの肺、心臓、腎臓、肝臓、及び小腸を含む主要臓器の病理学的解析を、タモキシフェン誘導の１か月後に行った。誘導されたマウスは健康で生存可能であり、対照と比較して突然変異体の臓器に目立った表現型は観察されなかった。これらの結果から、ＥｐｈＢ４は胚発生に重要であるがにもかかわらず、正常な成体では重要な機能を有しないことが示唆された。
【0123】
多くのヒトのがんにおいて過剰発現したＥｐｈＢ４の発がん特性にくわえて、ＥｐｈＢ４のノックダウンはＫｒａｓ依存性細胞株の細胞生存度を低下させた。これらの結果に促され、ＥｐｈＢ４が、Ｋｒａｓによって引き起こされるがんモデルの腫瘍形成に影響するかどうかを調べた。この目的のために、Ｋ１４－ＣｒｅＥＲｔａｍ；ＬＳＬ－Ｋ－ｒａｓＧ１２Ｄ；ＥｐｈＢ４Ｆ／Ｆ（Ｋ１４ＫＢ４）マウスを作製し、Ｋ１４－ＣｒｅＥＲｔａｍ；ＬＳＬ－Ｋ－ｒａｓＧ１２Ｄ（Ｋ１４Ｋ）マウスと比較した。タモキシフェン治療後４週目に、口腔扁平上皮乳頭腫がＫ１４Ｋマウスの１００％（ｎ＝１０）で検出された。その結果から、Ｋ１４ＫＢ４（ｎ＝９）マウスはＫ１４Ｋマウスと比較して、腫瘍増殖が有意に少なく、生存期間が延びることが示された（図１６Ｃ）（Ｐ＜０．００５）。ＮＳＣＬＣマウスモデルではさらに大きな生存の差が観察された。ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｐ５３Ｆ／Ｆ又はＬＳＬ－Ｋ－ｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３Ｆ／Ｆ；ＥｐｈＢ４Ｆ／ＦマウスにＡｄ－Ｃｒｅ（それぞれＡｄＫＰ及びＡｄＫＰＢ４）を施した。肺腺がんの発がんはＡｄＫＰＢ４（図１６Ｄ）で劇的に減少した。ＡｄＫＰＢ４（ｎ＝１８）の半数超（５６％）は、Ａｄ－Ｃｒｅ感染後１５０日目まで生存したが、ＡｄＫＰ（ｎ＝１１）はすべて９８日目以前に死亡した（Ｐ＜０．０００１）。
【0124】
実施例１２：ＥｐｈＢ４のノックダウンはＫｒａｓによって引き起こされる腫瘍におけるＡＫＴ及びＥＲＫシグナル伝達を弱めた
発がん性ＫｒａｓがＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ及びＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路を活性化することはよく知られており、これらはいずれもがん治療において重要な治療標的として機能する。そこで我々は、マウスの口腔乳頭腫及び肺腺がんにおいて、活性化されたＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路についてはｐ－ＡＫＴ及びｐ－Ｓ６の発現レベルを、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路についてはｐ－ＥＲＫ１／２の発現レベルを調べた。口腔乳頭腫では検出できないｐ－ＥＲＫ１／２を除くすべてのシグナル伝達指標は、腫瘍領域では有意に増加したが、ＥｐｈＢ４ノックアウトマウスの組織では増加しなかった（口腔乳頭腫については図１７Ａ、肺腺がんについては図１７Ｂ）。
発がん性ＫｒａｓがＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ及びＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路を活性化することはよく知られており、これらはいずれもがん治療において重要な治療標的として機能する。そこで我々は、マウスの口腔乳頭腫及び肺腺がんにおいて、活性化されたＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路についてはｐ－ＡＫＴ及びｐ－Ｓ６の発現レベルを、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路についてはｐ－ＥＲＫ１／２の発現レベルを調べた。口腔乳頭腫では検出できないｐ－ＥＲＫ１／２を除くすべてのシグナル伝達指標は、腫瘍領域では有意に増加したが、ＥｐｈＢ４ノックアウトマウスの組織では増加しなかった（口腔乳頭腫については図１７Ａ、肺腺がんについては図１７Ｂ）。
【0125】
ＥｐｈＢ４Ｆ／Ｆは口腔乳頭腫と肺腺がんマウスモデルの両方で腫瘍形成を遅らせるが、Ｋ１４ＫＢ４又はＡｄＫＰＢ４マウスでは様々なレベルの腫瘍が最終的には発生することが観察された。これは、腫瘍におけるＥｐｈＢ４の不完全なノックアウトの結果でありうるのではないかと考えた。まず、ＡｄＫＰＢ４マウスの肺組織におけるＥｐｈＢ４発現を調べた。インサイチュ染色と免疫蛍光染色はともに、ＥｐｈＢ４ ｍＲＮＡとタンパク質それぞれの過剰発現を示した（図１７Ｃ）。また、ＡｄＫＰＢ４の肺凍結切片を顕微解剖したところ、再構成（ＲＡ）－Ｋｒａｓ、ＲＡ－Ｐ５３、及びＲＡ－ＥｐｈＢ４が腫瘍領域と非腫瘍領域の両方でＰＣＲによって検出できることがわかり、肺全体でのＡｄ－Ｃｒｅ活性が示された（図１７Ｄ、上のパネル）。しかし、ｌｏｘＰが導入された対立遺伝子をすべて欠失させれば、ｌｏｘＰが導入されたＥｐｈＢ４のバンドは完全に失われることから、ｌｏｘＰが導入されたＥｐｈＢ４遺伝子の存在は不完全ノックアウトの証拠となった。さらに、ＲＴ－ＰＣＲにより、非腫瘍領域と比較して腫瘍においてＥｐｈＢ４ ｍＲＮＡの過剰発現が明らかに示され、肺の特定の領域ではＥｐｈＢ４の発現をうまく減らすことができず、結果としてＡｄＫＰＢ４マウスでは、変異Ｋｒａｓ及びＰ５３によって誘導される腫瘍形成を阻止できないことが示唆された（図１７Ｄ、下のパネル）。
【0126】
本発明者らは、インサイチュハイブリダイゼーションを用いて、口腔乳頭腫におけるＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２のＲＮＡ発現を分析した。その結果から、ＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２のＲＮＡ発現はかなり弱かったが、Ｋ１４ＫＢ４マウスの腫瘍領域では依然として検出できることが示された。免疫染色により、Ｋ１４ＫＢ４の腫瘍ではＥｐｈＢ４タンパク質の部分的な発現が明らかになった。
【0127】
実施例１３：ＥｐｈＢ４の薬理学的阻害は生体内でＫｒａｓによって引き起こされる腫瘍形成を効果的に阻害する
ｓＥｐｈＢ４の効率（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）をさらに示すために、ｓＥｐｈＢ４投与下で活性化されたＥｐｈＢ４タンパク質におけるチロシン自己リン酸化状態を調べた。タモキシフェン誘導Ｋ１４ＫマウスにｓＥｐｈＢ４（５０ｍｇ／ｋｇマウス体重）を腹腔内投与した。ｓＥｐｈＢ４投与の３日後に口腔乳頭腫を採取し、抗ＥｐｈＢ４抗体を用いて腫瘍溶解物を免疫沈降させた。ウェスタンブロッティングにより、ＥｐｈＢ４のｐ－ＴｙｒシグナルがｓＥｐｈＢ４投与腫瘍では有意に減少したが、対照では減少しなかったことが示された（図１８Ａ）。結果は、生体内でｓＥｐｈＢ４は自己リン酸化もＥｐｈＢ４受容体の活性化も阻止できることを示した。
ｓＥｐｈＢ４の効率（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）をさらに示すために、ｓＥｐｈＢ４投与下で活性化されたＥｐｈＢ４タンパク質におけるチロシン自己リン酸化状態を調べた。タモキシフェン誘導Ｋ１４ＫマウスにｓＥｐｈＢ４（５０ｍｇ／ｋｇマウス体重）を腹腔内投与した。ｓＥｐｈＢ４投与の３日後に口腔乳頭腫を採取し、抗ＥｐｈＢ４抗体を用いて腫瘍溶解物を免疫沈降させた。ウェスタンブロッティングにより、ＥｐｈＢ４のｐ－ＴｙｒシグナルがｓＥｐｈＢ４投与腫瘍では有意に減少したが、対照では減少しなかったことが示された（図１８Ａ）。結果は、生体内でｓＥｐｈＢ４は自己リン酸化もＥｐｈＢ４受容体の活性化も阻止できることを示した。
【0128】
本発明者らは、口腔乳頭腫及びＮＳＣＬＣマウスモデルを用いてｓＥｐｈＢ４の治療上の効力（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｃｙ）を検討した。Ｋ１４ＫマウスにｓＥｐｈＢ４（２０ｍｇ／ｋｇ、隔日）を、タモキシフェン誘発と同時に開始する群（予防群）又は２週間後に開始する群（逆戻し群）に投与した。両ｓＥｐｈＢ４投与群の生存率は対照Ｋ１４Ｋマウスと比較して有意に増加した（図１８Ｂ）。Ｋ１４Ｋマウス（Ｋ１４ＫＰ）にさらなるＰ５３ノックアウト変異を追加すると、腫瘍の発生が促進された。Ｋ１４ＫＰに対するｓＥｐｈＢ４の予防投与も腫瘍形成を遅らせ、生存期間を延長させた（図１８Ｃ）。
【0129】
化学療法薬のパクリタキセル（タキソール）はＮＳＣＬＣの治療に広く用いられている。他のがん治療薬（ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ）との相乗的な相互作用が示されている。タキソールと併用したｓＥｐｈＢ４を用いて、ＮＳＣＬＣモデルマウスＡｄＫＰに投与した。タキソール及びｓＥｐｈＢ４の単剤投与は、対照と比較して同様の有意な生存優位性を示したが、タキソール投与マウスとｓＥｐｈＢ４投与マウスの間に有意な差は認められなかった。タキソールとｓＥｐｈＢ４の併用投与は、それぞれの単剤療法と比較して生存をさらに大きく改善した（図１８Ｄ）。
【0130】
Ｋｒａｓ変異は腫瘍におけるアポトーシスの減少及び増殖の増加と関連することが示唆されている。Ｋｒａｓによって引き起こされるがんにおけるｓＥｐｈＢ４の効果を理解するために、ｓＥｐｈＢ４を投与した、自然発生腫瘍を有するＫ１４Ｋマウスのアポトーシス及び増殖の状態をそれぞれＴＵＮＥＬアッセイ及びＫｉ６７染色を用いて調べた。ｓＥｐｈＢ４を１日おきに２０日間投与すると、アポトーシスが有意に増加し、腫瘍の増殖が減少することがわかった（図１８Ｅ及び図１８Ｆ）。Ｋｒａｓ下流シグナル伝達分子ｐ－ＡＫＴ及びＰ－Ｓ６も、ｓＥｐｈＢ４の投与で大きく減少した（図１８Ｇ）。さらに、短期（４４時間）の腫瘍組織培養により、腫瘍細胞のアポトーシス誘導に対するｓＥｐｈＢ４の顕著な効果が確認された。
【0131】
実施例１４：ＥｐｈＢ４はβ－ＴｒＣＰ１を介したユビキチン化及びＫｒａｓの分解を妨げる
マウスの遺伝子組改変又はアンタゴニストであるｓＥｐｈＢ４の投与のいずれかによるＥｐｈＢ４シグナルのノックダウンは、Ｋｒａｓによって引き起こされる腫瘍形成を効果的に消失させることが示された。一方、ＨＣＴ１１６細胞株でＥｐｈＢ４をｓｉＲＮＡでノックダウンは、ＣＭＶプロモーター駆動過剰発現Ｒａｓタンパク質のレベルを低下させ、ＥｐｈＢ４がＲａｓタンパク質の安定性に影響を及ぼしうることが示唆された。ＥｐｈＢ４が内在性Ｋｒａｓタンパク質の半減期を調節するかどうかを確かめた。野生型Ｋｒａｓを有するヒト口腔扁平上皮がん細胞株ＳＣＣ７１及び発がん性ＫｒａｓＧ１２Ｄを有するマウスＮＳＣＬＣ細胞株４Ｂ－ＧＦＰを選んで、野生型と変異型ＫｒａｓがともにＥｐｈＢ４によって調節されうるかどうかを調べた。ｓｉＲＮＡによるＥｐｈＢ４のノックダウンは、内在性Ｋｒａｓタンパク質の半減期をＳＣＣ７１では３０．７時間から８．９時間に、４Ｂ－ＧＦＰ細胞では４１．１時間から７．１時間に減少させることがわかった（図１９Ａ）。さらに、Ｋｒａｓ半減期の減少はプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２によって戻すことができ、ユビキチン－プロテアソーム機構がＫｒａｓタンパク質分解の制御に主要な役割を果たしていることが示唆される。Ｋ１４Ｋマウスの腫瘍におけるＫｒａｓレベルをさらに調べ、ｓＥｐｈＢ４投与後、ＥｐｈＢ４過剰発現細胞にあたる乳頭腫の基底層及び中間層においてＫｒａｓ発現が減少していることがわかった（図１９Ｂ）。
マウスの遺伝子組改変又はアンタゴニストであるｓＥｐｈＢ４の投与のいずれかによるＥｐｈＢ４シグナルのノックダウンは、Ｋｒａｓによって引き起こされる腫瘍形成を効果的に消失させることが示された。一方、ＨＣＴ１１６細胞株でＥｐｈＢ４をｓｉＲＮＡでノックダウンは、ＣＭＶプロモーター駆動過剰発現Ｒａｓタンパク質のレベルを低下させ、ＥｐｈＢ４がＲａｓタンパク質の安定性に影響を及ぼしうることが示唆された。ＥｐｈＢ４が内在性Ｋｒａｓタンパク質の半減期を調節するかどうかを確かめた。野生型Ｋｒａｓを有するヒト口腔扁平上皮がん細胞株ＳＣＣ７１及び発がん性ＫｒａｓＧ１２Ｄを有するマウスＮＳＣＬＣ細胞株４Ｂ－ＧＦＰを選んで、野生型と変異型ＫｒａｓがともにＥｐｈＢ４によって調節されうるかどうかを調べた。ｓｉＲＮＡによるＥｐｈＢ４のノックダウンは、内在性Ｋｒａｓタンパク質の半減期をＳＣＣ７１では３０．７時間から８．９時間に、４Ｂ－ＧＦＰ細胞では４１．１時間から７．１時間に減少させることがわかった（図１９Ａ）。さらに、Ｋｒａｓ半減期の減少はプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２によって戻すことができ、ユビキチン－プロテアソーム機構がＫｒａｓタンパク質分解の制御に主要な役割を果たしていることが示唆される。Ｋ１４Ｋマウスの腫瘍におけるＫｒａｓレベルをさらに調べ、ｓＥｐｈＢ４投与後、ＥｐｈＢ４過剰発現細胞にあたる乳頭腫の基底層及び中間層においてＫｒａｓ発現が減少していることがわかった（図１９Ｂ）。
【0132】
Ｋｒａｓ半減期研究の結果に促され、理論に縛られることを望むものではないが、ＥｐｈＢ４がＫｒａｓユビキチン化の調節を介してＫｒａｓタンパク質の安定性に影響を与えるという仮説が立てられる。Ｕｂ－Ｆｌａｇ及びＫｒａｓ－ｍｙｃを２９３Ｔ細胞に発現させ、一方でＥｐｈＢ４レベルをノックダウン又は過剰発現によって変化させた。抗Ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降を行い（Ｋｒａｓ－ｍｙｃ）、続いて抗Ｆｌａｇ抗体を用いた免疫ブロット（Ｕｂ－Ｆｌａｇ）を行った。その結果から、ｓｉＲＮＡによるＥｐｈＢ４のノックダウンは、安定性の低下と一致するＫｒａｓポリユビキチン化を大きく増加させたが、ＥｐｈＢ４の過剰発現はＫｒａｓユビキチン化を減少させたことが示された（図１９Ｃ）。
【0133】
Ｋｒａｓのポリユビキチン化は、Ｆ－ｂｏｘファミリーＥ３リガーゼであるβトランスデューシンリピート（β－ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｒｅｐｅａｔ）含有タンパク質１（β－ＴｒＣＰ１）を介して調節されていることが示されている。β－ＴｒＣＰ１の過剰発現はＫｒａｓポリユビキチン化を促進した一方で、β－ＴｒＣＰ１のノックダウンはＫｒａｓユビキチン化を減少させることが確認された（図１９Ｄ）。どのようにＥｐｈＢ４がこのプロセスに関与するかについての洞察を得るために、２９３Ｔ細胞においてＥｐｈＢ４をＦｌａｇ－β－ＴｒＣＰ１、ＨＡ－Ｕｂ及びＫｒａｓ－ｍｙｃの存在下で過剰発現させた。ＩＰ／ウェスタンブロット解析により、過剰発現したＥｐｈＢ４が、β－ＴｒＣＰを介するポリユビキチン化をなくすことが示された（図１９Ｅ）。共免疫沈降（Ｃｏ－ＩＰ）研究により、Ｋｒａｓとβ－ＴｒＣＰ１の間のタンパク質間相互作用は、過剰発現したＥｐｈＢ４によって特異的に破壊されうるが、ＥｐｈＢ４－ｅＧＦＰ（ＥｐｈＢ４の細胞内ドメイン切断型）、エフリンＢ２又はＨｅｒ２によっては破壊されないことがさらに証明された（図１９Ｆ、上のパネル）。ＥｐｈＢ４とβ－ＴｒＣＰ１の間のＣｏ－ＩＰ又はＥｐｈＢ４とＫｒａｓの間のＣｏ－ＩＰから、ＥｐｈＢ４がＫｒａｓタンパク質の代わりにβ－ＴｒＣＰ１に結合することによってβ－ＴｒＣＰ１－Ｋｒａｓ相互作用と競合することが示された（図１９Ｆ、中央のパネル）。
【0134】
実施例１５：Ｃ末端ＥｐｈＢ４断片の存在は、Ｃｙｓ１１８位でのＫｒａｓモノユビキチン化を促進するβ－ＴｒＣＰ１リガーゼ活性を調節する
β－ＴｒＣＰ１を介したＫｒａｓのポリユビキチン化をＥｐｈＢ４が阻害する機序を解明するため、インビトロユビキチン化アッセイを行った。図２０Ａに示されるように、Ｋｒａｓの野生型（ＷＴ）とＧ１２Ｖ変異体の両方で、より高濃度のＥｐｈＢ４の存在下でのみ、モノユビキチン化の可能性を示すゆっくりと移動するＫｒａｓのバンドが確認された。次に質量分析を行い、ＷＴとＧ１２Ｖ変異体Ｋｒａｓの両方において、システイン１１８位のユビキチン部分の特異的な結合が認められた（１１８－ＣｇｇＤＬＰＳＲ－１２３）（図２０Ｂ）。その結果を踏まえて、Ｇ１２Ｄ変異体バックグラウンドでＫｒａｓのＣｙｓ１１８からセリン（Ｓ）への変異体を作製し、ＧＣ変異体と命名し、さらに上記のようにインビトロユビキチン化及び質量分析を行った。ＥｐｈＢ４の存在下でのみ、ＫｒａｓのＷＴとＧＤ変異体の両方でＣ１１８モノユビキチン化が確認されたが、ＧＣ変異体では、モノユビキチン化を示す移動度シフトは見られず（図２０Ｃ）、質量分析後のユビキチン修飾ペプチドも同定されなかった。興味深いことに、タンパク質の発現データを分析していると、一貫してＥｐｈＢ４の存在下でのみβ－ＴｒＣＰ１断片が認められた。次に、様々なＫｒａｓ変異体（ＷＴ、ＧＤ、ＣＳ、ＧＣ）の定常状態レベルを測定し、レベルの増加したＫｒａｓＧＣ変異体のレベルの増加が見られた（図２０Ｄ）。Ｋｒａｓタンパク質の安定性に対するＥｐｈＢ４の役割を確認するために、ｓｉＲＮＡを介したＥｐｈＢ４のノックダウンを行い、様々なＫｒａｓタンパク質の半減期を測定した。ＥｐｈＢ４の消失は、ＷＴ、ＧＤ及びＣＳ変異体のＫｒａｓタンパク質安定性に負の影響を与えることがわかった。データから、ＥｐｈＢ４の非存在下でさえもＧＣ変異体タンパク質安定性の増加が示され（図２０Ｅ）、ＥｐｈＢ４を介するＫｒａｓ調節におけるＣ１１８の重要性が示唆された。ＧＣ変異体は、より安定であるにもかかわらず、ｐＥＲＫ１／２レベルが低いことによって示されるように、ＧＤ Ｋｒａｓ変異体と比較して低活性であることがわかった。この研究では、ＥｐｈＢ４の過剰発現時のβ－ＴｒＣＰ１レベルの低下も認められ、ＥｐｈＢ４－β－ＴｒＣＰ１軸の間に負の相関があることが示唆された。これらを総合して、ＥｐｈＢ４の過剰発現が、変異Ｋｒａｓタンパク質の過剰活性化に必要なＫｒａｓのβ－ＴｒＣＰ１を介したモノユビキチン化の増強をもたらしうるというモデル（図２０Ｆ）が提案された。結果として、ＫｒａｓにおけるＥｐｈＢ４の欠損又はＣ１１８の部位特異的変異のいずれかが、変異体Ｋｒａｓの活性を弱める可能性があり、変異体ＫｒａｓとＥｐｈＢ４の間の協同性が示唆される。
β－ＴｒＣＰ１を介したＫｒａｓのポリユビキチン化をＥｐｈＢ４が阻害する機序を解明するため、インビトロユビキチン化アッセイを行った。図２０Ａに示されるように、Ｋｒａｓの野生型（ＷＴ）とＧ１２Ｖ変異体の両方で、より高濃度のＥｐｈＢ４の存在下でのみ、モノユビキチン化の可能性を示すゆっくりと移動するＫｒａｓのバンドが確認された。次に質量分析を行い、ＷＴとＧ１２Ｖ変異体Ｋｒａｓの両方において、システイン１１８位のユビキチン部分の特異的な結合が認められた（１１８－ＣｇｇＤＬＰＳＲ－１２３）（図２０Ｂ）。その結果を踏まえて、Ｇ１２Ｄ変異体バックグラウンドでＫｒａｓのＣｙｓ１１８からセリン（Ｓ）への変異体を作製し、ＧＣ変異体と命名し、さらに上記のようにインビトロユビキチン化及び質量分析を行った。ＥｐｈＢ４の存在下でのみ、ＫｒａｓのＷＴとＧＤ変異体の両方でＣ１１８モノユビキチン化が確認されたが、ＧＣ変異体では、モノユビキチン化を示す移動度シフトは見られず（図２０Ｃ）、質量分析後のユビキチン修飾ペプチドも同定されなかった。興味深いことに、タンパク質の発現データを分析していると、一貫してＥｐｈＢ４の存在下でのみβ－ＴｒＣＰ１断片が認められた。次に、様々なＫｒａｓ変異体（ＷＴ、ＧＤ、ＣＳ、ＧＣ）の定常状態レベルを測定し、レベルの増加したＫｒａｓＧＣ変異体のレベルの増加が見られた（図２０Ｄ）。Ｋｒａｓタンパク質の安定性に対するＥｐｈＢ４の役割を確認するために、ｓｉＲＮＡを介したＥｐｈＢ４のノックダウンを行い、様々なＫｒａｓタンパク質の半減期を測定した。ＥｐｈＢ４の消失は、ＷＴ、ＧＤ及びＣＳ変異体のＫｒａｓタンパク質安定性に負の影響を与えることがわかった。データから、ＥｐｈＢ４の非存在下でさえもＧＣ変異体タンパク質安定性の増加が示され（図２０Ｅ）、ＥｐｈＢ４を介するＫｒａｓ調節におけるＣ１１８の重要性が示唆された。ＧＣ変異体は、より安定であるにもかかわらず、ｐＥＲＫ１／２レベルが低いことによって示されるように、ＧＤ Ｋｒａｓ変異体と比較して低活性であることがわかった。この研究では、ＥｐｈＢ４の過剰発現時のβ－ＴｒＣＰ１レベルの低下も認められ、ＥｐｈＢ４－β－ＴｒＣＰ１軸の間に負の相関があることが示唆された。これらを総合して、ＥｐｈＢ４の過剰発現が、変異Ｋｒａｓタンパク質の過剰活性化に必要なＫｒａｓのβ－ＴｒＣＰ１を介したモノユビキチン化の増強をもたらしうるというモデル（図２０Ｆ）が提案された。結果として、ＫｒａｓにおけるＥｐｈＢ４の欠損又はＣ１１８の部位特異的変異のいずれかが、変異体Ｋｒａｓの活性を弱める可能性があり、変異体ＫｒａｓとＥｐｈＢ４の間の協同性が示唆される。
【0135】
実施例１６：Ｒａｓ変異ヒト腫瘍を標的としたｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの臨床的有効性
前臨床データは、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２経路ターゲッティングがヒト腫瘍においてで有効である可能性があり、保存された作用機序及びＲａｓのすべての型（ＫＲａｓ、ＨＲａｓ、ＮＲａｓ）に保存された重要な残基により、それぞれのＲａｓアイソフォーム内のすべての変異がＥｐｈＢ４－エフリンｂ２ターゲッティングを妨げる対象であることを示した。
前臨床データは、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２経路ターゲッティングがヒト腫瘍においてで有効である可能性があり、保存された作用機序及びＲａｓのすべての型（ＫＲａｓ、ＨＲａｓ、ＮＲａｓ）に保存された重要な残基により、それぞれのＲａｓアイソフォーム内のすべての変異がＥｐｈＢ４－エフリンｂ２ターゲッティングを妨げる対象であることを示した。
【0136】
本発明者らはＲａｓ変異をもつ数名の患者を治療した。
１．ＫＲａｓ１２Ｄに変異及びＡＴＭ Ｇ２８９１ＤとＰＩＫ３ＣＡ Ｅ５４５Ｋの同時変異を有する肺腺がんの５７歳女性。患者は以前に放射線療法を受け、失敗した。腫瘍はエフリンＢ２の発現を示した。患者はｓＥｐｈＢ４－アルブミン融合タンパク質療法を受け、完全寛解を得た。患者には２年を超えて腫瘍がない状態である。患者は１年超治療を受けていない。
２．患者ＣＢ、ＫＲａｓＧ１２Ｃ変異、ＤＫＮ２Ａ．の同時変異をもち、肺の腺がんを有した６２歳女性。患者は過去にカルボプラチン、アリムタ、アバスチンを含む化学療法を受けていた。患者は、５か月続く短期間の奏効を示した。患者の腫瘍はエフリンＢ２発現を示し、化学療法の追加なしにｓＥｐｈＢ４－アルブミンを含む治療を行った。患者は６か月間治療に反応した。患者は治療を止めることを決め、最終的には進行した。
３．ＪＫ ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｒ変異、同時ＧＮＡＳ、ＴＰ５３変異をもつ４２歳の患者は、膀胱がんを有する。患者はシスプラチン及びエトポシドによる治療を受けたが、一次耐性を示した。腫瘍分析ではエフリンＢ２の発現がみられた。その後、患者はｓＥｐｈＢ４－アルブミン融合タンパク質療法を受けた。患者は４か月続く腫瘍反応を示したが、最終的には進行した。
４．ＲＧ ＮＲＡＳ変異、ＣＹＬＣ Ｌ２２７ｆｓ、ＦＢＸＷＹ Ｒ４９Ｑの同時変異をもつ７９歳男性。患者は頭頸部がんを有し、放射線療法及びＥＧＦＲ抗体による治療を受け、奏効を達成し、９か月持続した。患者は、肺及びリンパ節に腫瘍が再発した。腫瘍生検ではエフリンＢ２の発現がみられた。患者はｓＥｐｈＢ４－アルブミン融合タンパク質療法を受けた。患者は完全寛解を達成し、無治療で２．５か月を超えて寛解を維持した。
１．ＫＲａｓ１２Ｄに変異及びＡＴＭ Ｇ２８９１ＤとＰＩＫ３ＣＡ Ｅ５４５Ｋの同時変異を有する肺腺がんの５７歳女性。患者は以前に放射線療法を受け、失敗した。腫瘍はエフリンＢ２の発現を示した。患者はｓＥｐｈＢ４－アルブミン融合タンパク質療法を受け、完全寛解を得た。患者には２年を超えて腫瘍がない状態である。患者は１年超治療を受けていない。
２．患者ＣＢ、ＫＲａｓＧ１２Ｃ変異、ＤＫＮ２Ａ．の同時変異をもち、肺の腺がんを有した６２歳女性。患者は過去にカルボプラチン、アリムタ、アバスチンを含む化学療法を受けていた。患者は、５か月続く短期間の奏効を示した。患者の腫瘍はエフリンＢ２発現を示し、化学療法の追加なしにｓＥｐｈＢ４－アルブミンを含む治療を行った。患者は６か月間治療に反応した。患者は治療を止めることを決め、最終的には進行した。
３．ＪＫ ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｒ変異、同時ＧＮＡＳ、ＴＰ５３変異をもつ４２歳の患者は、膀胱がんを有する。患者はシスプラチン及びエトポシドによる治療を受けたが、一次耐性を示した。腫瘍分析ではエフリンＢ２の発現がみられた。その後、患者はｓＥｐｈＢ４－アルブミン融合タンパク質療法を受けた。患者は４か月続く腫瘍反応を示したが、最終的には進行した。
４．ＲＧ ＮＲＡＳ変異、ＣＹＬＣ Ｌ２２７ｆｓ、ＦＢＸＷＹ Ｒ４９Ｑの同時変異をもつ７９歳男性。患者は頭頸部がんを有し、放射線療法及びＥＧＦＲ抗体による治療を受け、奏効を達成し、９か月持続した。患者は、肺及びリンパ節に腫瘍が再発した。腫瘍生検ではエフリンＢ２の発現がみられた。患者はｓＥｐｈＢ４－アルブミン融合タンパク質療法を受けた。患者は完全寛解を達成し、無治療で２．５か月を超えて寛解を維持した。
【0137】
配列
添付の配列表に載せたアミノ酸配列は、アミノ酸の標準的な３文字コードを使用して示されている。
添付の配列表に載せたアミノ酸配列は、アミノ酸の標準的な３文字コードを使用して示されている。
【0138】
配列番号１は、ヒトエフリンＢ型受容体前駆体（ＮＰ＿００４４３５．３）のアミノ酸配列である。アミノ酸残基１～１５はシグナル配列をコードする。
ＭＥＬＲＶＬＬＣＷＡＳＬＡＡＡＬＥＥＴＬＬＮＴＫＬＥＴＡＤＬＫＷＶＴＦＰＱＶＤＧＱＷＥＥＬＳＧＬＤＥＥＱＨＳＶＲＴＹＥＶＣＤＶＱＲＡＰＧＱＡＨＷＬＲＴＧＷＶＰＲＲＧＡＶＨＶＹＡＴＬＲＦＴＭＬＥＣＬＳＬＰＲＡＧＲＳＣＫＥＴＦＴＶＦＹＹＥＳＤＡＤＴＡＴＡＬＴＰＡＷＭＥＮＰＹＩＫＶＤＴＶＡＡＥＨＬＴＲＫＲＰＧＡＥＡＴＧＫＶＮＶＫＴＬＲＬＧＰＬＳＫＡＧＦＹＬＡＦＱＤＱＧＡＣＭＡＬＬＳＬＨＬＦＹＫＫＣＡＱＬＴＶＮＬＴＲＦＰＥＴＶＰＲＥＬＶＶＰＶＡＧＳＣＶＶＤＡＶＰＡＰＧＰＳＰＳＬＹＣＲＥＤＧＱＷＡＥＱＰＶＴＧＣＳＣＡＰＧＦＥＡＡＥＧＮＴＫＣＲＡＣＡＱＧＴＦＫＰＬＳＧＥＧＳＣＱＰＣＰＡＮＳＨＳＮＴＩＧＳＡＶＣＱＣＲＶＧＹＦＲＡＲＴＤＰＲＧＡＰＣＴＴＰＰＳＡＰＲＳＶＶＳＲＬＮＧＳＳＬＨＬＥＷＳＡＰＬＥＳＧＧＲＥＤＬＴＹＡＬＲＣＲＥＣＲＰＧＧＳＣＡＰＣＧＧＤＬＴＦＤＰＧＰＲＤＬＶＥＰＷＶＶＶＲＧＬＲＰＤＦＴＹＴＦＥＶＴＡＬＮＧＶＳＳＬＡＴＧＰＶＰＦＥＰＶＮＶＴＴＤＲＥＶＰＰＡＶＳＤＩＲＶＴＲＳＳＰＳＳＬＳＬＡＷＡＶＰＲＡＰＳＧＡＶＬＤＹＥＶＫＹＨＥＫＧＡＥＧＰＳＳＶＲＦＬＫＴＳＥＮＲＡＥＬＲＧＬＫＲＧＡＳＹＬＶＱＶＲＡＲＳＥＡＧＹＧＰＦＧＱＥＨＨＳＱＴＱＬＤＥＳＥＧＷＲＥＱＬＡＬＩＡＧＴＡＶＶＧＶＶＬＶＬＶＶＩＶＶＡＶＬＣＬＲＫＱＳＮＧＲＥＡＥＹＳＤＫＨＧＱＹＬＩＧＨＧＴＫＶＹＩＤＰＦＴＹＥＤＰＮＥＡＶＲＥＦＡＫＥＩＤＶＳＹＶＫＩＥＥＶＩＧＡＧＥＦＧＥＶＣＲＧＲＬＫＡＰＧＫＫＥＳＣＶＡＩＫＴＬＫＧＧＹＴＥＲＱＲＲＥＦＬＳＥＡＳＩＭＧＱＦＥＨＰＮＩＩＲＬＥＧＶＶＴＮＳＭＰＶＭＩＬＴＥＦＭＥＮＧＡＬＤＳＦＬＲＬＮＤＧＱＦＴＶＩＱＬＶＧＭＬＲＧＩＡＳＧＭＲＹＬＡＥＭＳＹＶＨＲＤＬＡＡＲＮＩＬＶＮＳＮＬＶＣＫＶＳＤＦＧＬＳＲＦＬＥＥＮＳＳＤＰＴＹＴＳＳＬＧＧＫＩＰＩＲＷＴＡＰＥＡＩＡＦＲＫＦＴＳＡＳＤＡＷＳＹＧＩＶＭＷＥＶＭＳＦＧＥＲＰＹＷＤＭＳＮＱＤＶＩＮＡＩＥＱＤＹＲＬＰＰＰＰＤＣＰＴＳＬＨＱＬＭＬＤＣＷＱＫＤＲＮＡＲＰＲＦＰＱＶＶＳＡＬＤＫＭＩＲＮＰＡＳＬＫＩＶＡＲＥＮＧＧＡＳＨＰＬＬＤＱＲＱＰＨＹＳＡＦＧＳＶＧＥＷＬＲＡＩＫＭＧＲＹＥＥＳＦＡＡＡＧＦＧＳＦＥＬＶＳＱＩＳＡＥＤＬＬＲＩＧＶＴＬＡＧＨＱＫＫＩＬＡＳＶＱＨＭＫＳＱＡＫＰＧＴＰＧＧＴＧＧＰＡＰＱＹ（配列番号１）
ＭＥＬＲＶＬＬＣＷＡＳＬＡＡＡＬＥＥＴＬＬＮＴＫＬＥＴＡＤＬＫＷＶＴＦＰＱＶＤＧＱＷＥＥＬＳＧＬＤＥＥＱＨＳＶＲＴＹＥＶＣＤＶＱＲＡＰＧＱＡＨＷＬＲＴＧＷＶＰＲＲＧＡＶＨＶＹＡＴＬＲＦＴＭＬＥＣＬＳＬＰＲＡＧＲＳＣＫＥＴＦＴＶＦＹＹＥＳＤＡＤＴＡＴＡＬＴＰＡＷＭＥＮＰＹＩＫＶＤＴＶＡＡＥＨＬＴＲＫＲＰＧＡＥＡＴＧＫＶＮＶＫＴＬＲＬＧＰＬＳＫＡＧＦＹＬＡＦＱＤＱＧＡＣＭＡＬＬＳＬＨＬＦＹＫＫＣＡＱＬＴＶＮＬＴＲＦＰＥＴＶＰＲＥＬＶＶＰＶＡＧＳＣＶＶＤＡＶＰＡＰＧＰＳＰＳＬＹＣＲＥＤＧＱＷＡＥＱＰＶＴＧＣＳＣＡＰＧＦＥＡＡＥＧＮＴＫＣＲＡＣＡＱＧＴＦＫＰＬＳＧＥＧＳＣＱＰＣＰＡＮＳＨＳＮＴＩＧＳＡＶＣＱＣＲＶＧＹＦＲＡＲＴＤＰＲＧＡＰＣＴＴＰＰＳＡＰＲＳＶＶＳＲＬＮＧＳＳＬＨＬＥＷＳＡＰＬＥＳＧＧＲＥＤＬＴＹＡＬＲＣＲＥＣＲＰＧＧＳＣＡＰＣＧＧＤＬＴＦＤＰＧＰＲＤＬＶＥＰＷＶＶＶＲＧＬＲＰＤＦＴＹＴＦＥＶＴＡＬＮＧＶＳＳＬＡＴＧＰＶＰＦＥＰＶＮＶＴＴＤＲＥＶＰＰＡＶＳＤＩＲＶＴＲＳＳＰＳＳＬＳＬＡＷＡＶＰＲＡＰＳＧＡＶＬＤＹＥＶＫＹＨＥＫＧＡＥＧＰＳＳＶＲＦＬＫＴＳＥＮＲＡＥＬＲＧＬＫＲＧＡＳＹＬＶＱＶＲＡＲＳＥＡＧＹＧＰＦＧＱＥＨＨＳＱＴＱＬＤＥＳＥＧＷＲＥＱＬＡＬＩＡＧＴＡＶＶＧＶＶＬＶＬＶＶＩＶＶＡＶＬＣＬＲＫＱＳＮＧＲＥＡＥＹＳＤＫＨＧＱＹＬＩＧＨＧＴＫＶＹＩＤＰＦＴＹＥＤＰＮＥＡＶＲＥＦＡＫＥＩＤＶＳＹＶＫＩＥＥＶＩＧＡＧＥＦＧＥＶＣＲＧＲＬＫＡＰＧＫＫＥＳＣＶＡＩＫＴＬＫＧＧＹＴＥＲＱＲＲＥＦＬＳＥＡＳＩＭＧＱＦＥＨＰＮＩＩＲＬＥＧＶＶＴＮＳＭＰＶＭＩＬＴＥＦＭＥＮＧＡＬＤＳＦＬＲＬＮＤＧＱＦＴＶＩＱＬＶＧＭＬＲＧＩＡＳＧＭＲＹＬＡＥＭＳＹＶＨＲＤＬＡＡＲＮＩＬＶＮＳＮＬＶＣＫＶＳＤＦＧＬＳＲＦＬＥＥＮＳＳＤＰＴＹＴＳＳＬＧＧＫＩＰＩＲＷＴＡＰＥＡＩＡＦＲＫＦＴＳＡＳＤＡＷＳＹＧＩＶＭＷＥＶＭＳＦＧＥＲＰＹＷＤＭＳＮＱＤＶＩＮＡＩＥＱＤＹＲＬＰＰＰＰＤＣＰＴＳＬＨＱＬＭＬＤＣＷＱＫＤＲＮＡＲＰＲＦＰＱＶＶＳＡＬＤＫＭＩＲＮＰＡＳＬＫＩＶＡＲＥＮＧＧＡＳＨＰＬＬＤＱＲＱＰＨＹＳＡＦＧＳＶＧＥＷＬＲＡＩＫＭＧＲＹＥＥＳＦＡＡＡＧＦＧＳＦＥＬＶＳＱＩＳＡＥＤＬＬＲＩＧＶＴＬＡＧＨＱＫＫＩＬＡＳＶＱＨＭＫＳＱＡＫＰＧＴＰＧＧＴＧＧＰＡＰＱＹ（配列番号１）
【0139】
配列番号２は、ヒト血清アルブミンプレプロタンパク質（ＮＰ＿０００４６８．１）のアミノ酸配列である。アミノ酸残基２５～６０９は成熟ペプチドをコードする。
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号２）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号２）
【0140】
参照による援用
特許文献米国特許第７，３８１，４１０号、米国特許第７，８６２，８１６号、米国特許第７，９７７，４６３号、米国特許第８，０６３，１８３号、米国特許第８，２７３，８５８号、米国特許第８，９７５，３７７号、米国特許第８，９８１，０６２号、米国特許第９，５３３，０２６号、国際出願２０２０／０１８１６０号、国際出願２０２０／０２３２１５号及び本明細書に開示のすべての参考文献は、すべての目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
特許文献米国特許第７，３８１，４１０号、米国特許第７，８６２，８１６号、米国特許第７，９７７，４６３号、米国特許第８，０６３，１８３号、米国特許第８，２７３，８５８号、米国特許第８，９７５，３７７号、米国特許第８，９８１，０６２号、米国特許第９，５３３，０２６号、国際出願２０２０／０１８１６０号、国際出願２０２０／０２３２１５号及び本明細書に開示のすべての参考文献は、すべての目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0141】
その他（ＭＩＳＣＥＬＬＡＮＥＯＵＳ）
本明細書において開示され、特許請求される物品及び方法はすべて、本開示に照らして過度の実験をすることなしに作製及び実行することができる。本発明の物品及び方法は実施形態の観点から説明されているが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、物品及び方法に変形を適用できることは、当業者には明らかであろう。当業者にとって明らかなそのような変形及び均等物はすべて、現存するものであれ、後に開発されるものであれ、添付の特許請求の範囲によって画定される本発明の趣旨及び範囲内にあるものとみなされる。明細書に記載の特許、特許出願、及び刊行物はすべて、本発明が関係する技術分野の当業者のレベルを示すものである。すべての特許、特許出願及び刊行物は、すべての目的のために、かつ、対象の刊行物がそれぞれ、すべての目的のために、その全体が参照により組み込まれることが具体的かつ主観的に示されているのと同じ程度に、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に例示的に記載された発明は、本明細書に具体的に開示されていない要素（複数可）がない場合にも実施することができる。採用されている用語及び表現は、限定の用語ではなく、説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用において、示され説明された特徴又はその一部の均等物を排除する意図はないが、請求された発明の範囲内で様々な変更形態が可能であることが認識される。したがって、本発明は、実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示の概念の変更及び変形が、当業者によって用いられる可能性があり、そのような変形及び変形は、添付の特許請求の範囲によって画定される本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるべきである。
本明細書において開示され、特許請求される物品及び方法はすべて、本開示に照らして過度の実験をすることなしに作製及び実行することができる。本発明の物品及び方法は実施形態の観点から説明されているが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、物品及び方法に変形を適用できることは、当業者には明らかであろう。当業者にとって明らかなそのような変形及び均等物はすべて、現存するものであれ、後に開発されるものであれ、添付の特許請求の範囲によって画定される本発明の趣旨及び範囲内にあるものとみなされる。明細書に記載の特許、特許出願、及び刊行物はすべて、本発明が関係する技術分野の当業者のレベルを示すものである。すべての特許、特許出願及び刊行物は、すべての目的のために、かつ、対象の刊行物がそれぞれ、すべての目的のために、その全体が参照により組み込まれることが具体的かつ主観的に示されているのと同じ程度に、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に例示的に記載された発明は、本明細書に具体的に開示されていない要素（複数可）がない場合にも実施することができる。採用されている用語及び表現は、限定の用語ではなく、説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用において、示され説明された特徴又はその一部の均等物を排除する意図はないが、請求された発明の範囲内で様々な変更形態が可能であることが認識される。したがって、本発明は、実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示の概念の変更及び変形が、当業者によって用いられる可能性があり、そのような変形及び変形は、添付の特許請求の範囲によって画定される本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図15-3】
【図16-1】
【図16-2】
【図17-1】
【図17-2】
【図18-1】
【図18-2】
【図18-3】
【図18-4】
【図18-5】
【図19-1】
【図19-2】
【図19-3】
【図19-4】
【図19-5】
【図20-1】
【図20-2】
【図20-3】
【配列表】
【国際調査報告】