(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-18
(54)【発明の名称】ＣＤ２２及びＣＤ７９Ｂを標的とする抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20240311BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240311BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240311BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240311BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240311BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240311BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240311BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240311BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240311BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240311BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240311BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240311BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240311BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240311BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240311BHJP
A61P 5/38 20060101ALI20240311BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20240311BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240311BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20240311BHJP
A61P 1/14 20060101ALI20240311BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240311BHJP
A61P 15/08 20060101ALI20240311BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240311BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240311BHJP
A61P 5/14 20060101ALI20240311BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240311BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240311BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20240311BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240311BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240311BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240311BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20240311BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240311BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240311BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 Z
C07K16/46 ZNA
C07K16/28
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12P21/08
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K47/68
A61P37/06
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P3/10
A61P5/38
A61P7/06
A61P1/16
A61P1/18
A61P1/14
A61P13/12
A61P15/08
A61P27/02
A61P11/00
A61P5/14
A61P25/00
A61P17/00
A61P21/04
A61P25/28
A61P9/00
A61P37/02
A61P7/00
A61P43/00 105
A61K39/395 N
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023558396
(86)(22)【出願日】2022-03-23
(85)【翻訳文提出日】2023-11-10
(86)【国際出願番号】 IB2022052645
(87)【国際公開番号】W WO2022201052
(87)【国際公開日】2022-09-29
(31)【優先権主張番号】63/165,416
(32)【優先日】2021-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509087759
【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100217663
【弁理士】
【氏名又は名称】末広 尚也
(72)【発明者】
【氏名】ベッドナー，カイル
(72)【発明者】
【氏名】クマール，ナレシュ
(72)【発明者】
【氏名】シン，サンジャヤ
(72)【発明者】
【氏名】ガネサン，ラジクマール
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ダンリン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC15
4B064CC24
4B064CE03
4B064CE06
4B064DA01
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD15
4B065BD18
4B065CA25
4B065CA44
4C076BB01
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076CC01
4C076CC07
4C076CC09
4C076CC10
4C076CC11
4C076CC14
4C076CC15
4C076CC16
4C076CC17
4C076CC18
4C076CC21
4C076CC26
4C076CC30
4C076EE59
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB41
4C085BB42
4C085BB43
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG06
4C085GG08
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA41
4H045BA50
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA10
4H045GA15
4H045GA45
(57)【要約】
本明細書では、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ２２に結合する多重特異性抗体、それらをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、それらを作製及び使用する方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多重特異性抗体又は多重特異性結合断片であって、ａ）分化抗原群７９Ｂタンパク質（ＣＤ７９Ｂ）に結合する第１の抗原結合アームであって、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）を含み、第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）を更に含む、第１の抗原結合アームと、
ｂ）分化抗原群２２（ＣＤ２２）に結合する第２の抗原結合アームであって、第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）を含み、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を更に含む、第２の抗原結合アームと、を含む、多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項2】
（ａ）前記ＶＨ１が、配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ１が、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む、（ｂ）前記ＶＨ１が、配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ１が、配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含む、
（ｃ）前記ＶＨ１が、配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ１が、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２、及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む、
（ｄ）前記ＶＨ１が、配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、及び配列番号３５のＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ１が、配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２、及び配列番号３８のＬＣＤＲ３を含む、
（ｅ）前記ＶＨ１が、配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４３のＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ１が、配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２、及び配列番号４６のＬＣＤＲ３を含む、
（ｆ）前記ＶＨ１が、配列番号４９のＨＣＤＲ１、配列番号５０のＨＣＤＲ２、及び配列番号５１のＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ１が、配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号５３のＬＣＤＲ２、及び配列番号５４のＬＣＤＲ３を含む、又は
（ｇ）前記ＶＨ１が、配列番号５７のＨＣＤＲ１、配列番号５８のＨＣＤＲ２、及び配列番号５９のＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ１が、配列番号６０のＬＣＤＲ１、配列番号６１のＬＣＤＲ２、及び配列番号６２のＬＣＤＲ３を含む、
請求項１に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項3】
ＣＤ７９ｂに結合する前記第１の抗原結合アームが、以下：ａ）配列番号１５のＶＨ及び配列番号１６のＶＬ、
ｂ）配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、
ｃ）配列番号３１のＶＨ及び配列番号３２のＶＬ、
ｄ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、
ｅ）配列番号４７のＶＨ及び配列番号４８のＶＬ、
ｆ）配列番号５５のＶＨ及び配列番号５６のＶＬ、
ｇ）配列番号６３のＶＨ及び配列番号６４のＶＬ、並びに
ｈ）配列番号８０のＶＨ及び配列番号８１のＶＬ
からなる群から選択されるＶＨ及びＶＬを含む、請求項１又は２に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項4】
ＣＤ７９ｂに結合する前記抗原結合アームが、配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ１、並びに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ１を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項5】
ＣＤ７９ｂに結合する前記抗原結合アームが、配列番号８０の前記ＶＨ１及び配列番号８１の前記ＶＬ１を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項6】
ＣＤ２２に結合する前記第２の抗原結合アームが、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ２、並びに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ２を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項7】
前記ＶＨ２が、配列番号７を含み、前記ＶＬ２が、配列番号８を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項8】
前記第１又は第２の抗原結合アームが、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、抗原結合断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ＶＨＨ、及びｄＡＢからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項9】
前記第１の抗原結合アームが、ｓｃＦｖを含み、前記第２の抗原結合アームが、Ｆａｂを含む、請求項８に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項10】
前記第１の抗原結合アームが、配列番号８２のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項11】
ＣＤ７９ｂに結合する前記第１の抗原結合アームが、第１の断片結晶化可能（Ｆｃ）ドメインを含むか、又はそれに作動可能に連結されており、ＣＤ２２に結合する前記第２の抗原結合アームが、第２のＦｃドメインを含むか、又はそれに作動可能に連結されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項12】
前記第１及び第２のＦｃドメインのうちの少なくとも１つが、１つ又は２つ以上の変異を含み、前記１つ又は２つ以上の変異が、前記Ｆｃドメインのヘテロ二量体化を促進するか、Ｆｃγ受容体へのＦｃ結合を低減させるか、プロテインＡへのＦｃ結合を低減させるか、前記多重特異性抗体若しくは多重特異性結合断片の半減期を延長するか、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１１に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項13】
前記Ｆｃドメインのヘテロ二量体化を促進する前記１つ又は２つ以上の変異が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｔ３６６Ｗ、及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け）から選択される、請求項１２に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項14】
前記第１のＦｃドメインが、変異Ｔ３６６Ｗを含み、前記第２のＦｃドメインが、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む、請求項１３に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項15】
Ｆｃγ受容体へのＦｃ結合を低減させる前記１つ又は２つ以上の変異が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓ（ＥＵ番号付け）から選択される、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項16】
前記第１のＦｃドメイン及び前記第２のＦｃドメインの両方が、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓを含む、請求項１５に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項17】
プロテインＡへのＦｃ結合を低減させる前記１つ又は２つ以上の変異が、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ（ＥＵ番号付け）から選択される、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項18】
前記第２のＦｃドメインが、変異Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆを含む、請求項１７に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項19】
前記多重特異性抗体又は多重特異性結合断片の半減期を延長する前記１つ又は２つ以上の変異が、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（ＥＵ番号付け）から選択される、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項20】
前記第１のＦｃドメイン及び前記第２のＦｃドメインの両方が、変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅを含む、請求項１９に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項21】
前記第１のＦｃドメインが、配列番号８９を含み、前記第２のＦｃドメインが、配列番号９０を含む、請求項１１～２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項22】
配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片。
【請求項23】
治療剤又は造影剤にコンジュゲートされた、請求項１～２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片を含む、免疫コンジュゲート。
【請求項24】
請求項１～２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項25】
請求項１～２２いずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項26】
請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項27】
請求項２７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項28】
対象における自己免疫性疾患を治療する方法であって、治療有効量の請求項１～２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片を、前記自己免疫性疾患を治療するのに十分な時間にわたって、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項29】
前記自己免疫性疾患が、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群（ＳｊＳ）、リウマチ性関節炎、自己免疫ミオパシー、１型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、自己免疫性膵炎、セリアック病、巣状糸球体硬化症、原発性膜性腎症、卵巣機能不全、自己免疫精巣炎、乾性眼疾患、特発性間質性肺炎、甲状腺疾患（例えば、グレーブス病）、全身性硬化症（強皮症）、筋無力症症候群、自己免疫脳炎、水疱性皮膚疾患、ＴＴＰ、ＩＴＰ、ＡＩＨＡ、Ａｎｃａ血管炎、心筋炎／拡張型ＣＭ、ＮＭＯＳＤ、母体－胎児同種免疫、母体－胎児自己免疫、抗カルジオリピン／抗リン脂質抗体症候群、高ガンマグロブリン血症、移植関連ＩＤ、又は多巣性運動ニューロパチーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
対象におけるＢ細胞活性化を調節するか、又は異常なＢ細胞活性化を阻害する方法であって、有効量の請求項１～２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体若しくは多重特異性結合断片を、Ｂ細胞活性化を調節するか、又は異常なＢ細胞活性化を阻害するのに十分な時間にわたって、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項31】
対象におけるＢ細胞活性化を調節するか、異常なＢ細胞活性化を阻害するか、又は自己免疫性疾患を治療するための多重特異性抗体又は多重特異性結合断片の使用であって、有効量の請求項１～２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片を、前記対象に投与することを含む、使用。
【請求項32】
対象におけるＢ細胞増殖を減少させるか、サイトカイン産生を減少させるか、又はＢ細胞活性化を低減させる方法であって、有効量の請求項１～２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片を、Ｂ細胞増殖を減少させるか、サイトカイン産生を減少させるか、又はＢ細胞活性化を低減させるのに十分な時間にわたって、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項33】
対象におけるＢ細胞増殖を減少させるか、サイトカイン産生を減少させるか、又はＢ細胞活性化を低減させるための多重特異性抗体又は多重特異性結合断片の使用であって、有効量の請求項１～２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片を、前記対象に投与することを含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年３月２４日に出願された米国特許仮出願第６３／１６５，４１６号に対する優先権を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年３月２４日に出願された米国特許仮出願第６３／１６５，４１６号に対する優先権を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
（ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された「配列表」、表、又はコンピュータプログラムリストの付録への参照）
配列表は、ＡＳＣＩＩテキストファイル：２０６３８９－００４４－００ＵＳ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔに書かれており、２０２２年３月１５日に作成され、８０，０３６バイトのファイルサイズを有し、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表は、ＡＳＣＩＩテキストファイル：２０６３８９－００４４－００ＵＳ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔに書かれており、２０２２年３月１５日に作成され、８０，０３６バイトのファイルサイズを有し、参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
（技術分野）
本開示は、分化抗原群７９Ｂタンパク質（cluster of differentiation 79B、ＣＤ７９Ｂ）及び分化抗原群２２（cluster of differentiation 22、ＣＤ２２）に結合する多重特異性抗体、多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びに多重特異性抗体を作製及び使用する方法を提供する。
本開示は、分化抗原群７９Ｂタンパク質（cluster of differentiation 79B、ＣＤ７９Ｂ）及び分化抗原群２２（cluster of differentiation 22、ＣＤ２２）に結合する多重特異性抗体、多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びに多重特異性抗体を作製及び使用する方法を提供する。
【背景技術】
【0004】
自己免疫性疾患の有病率は、一般集団の３～５％であると推定され、Ｂ細胞の調節不全、自己反応性Ｂ細胞、及び自己抗体の存在は、多くの自己免疫性疾患の共通の特徴である（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２０１５；２７８：３６９－３９５）。
【0005】
Ｂ細胞又はＢリンパ球は、適応免疫の中心的な構成要素であり、抗体を産生し、抗原提示細胞の役割を果たし、サイトカインを分泌し、活性化後にメモリＢ細胞へと発達することにより、異なる病原体に反応する（Ｐａｃｋａｒｄ ａｎｄ Ｃａｍｂｉｅｒ，２０１３，Ｆ１０００Ｐｒｉｍｅ Ｒｅｐ，５：４０）。Ｂ細胞は、血液及びリンパ系で循環する。リンパ器官では、Ｂ細胞は、その同族抗原に遭遇し、Ｔヘルパー細胞からの追加シグナルと共に、エフェクター形質細胞に分化することができる。これらの細胞は、血液中を循環して、抗原又は病原体を標的とし排除する、特定の抗体を分泌する（Ｐｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３２（４）：３９７－４２７）。
【0006】
健康な個体において、免疫寛容は、免疫系が自己抗原を認識することを妨げ、したがって、Ｂ、Ｔ、及び骨髄細胞による健康な細胞及び組織の標的化及び破壊を制限する。しかしながら、自己免疫性疾患は、免疫細胞が自己抗原を認識して反応する寛容の破壊を特徴とする。そのような場合、Ｂ細胞は、自己抗原に対する抗体（「自己抗体」）を認識して産生し、これは、次いで、補体、細胞傷害性Ｔ細胞、及び骨髄細胞などの免疫系の他の成分による破壊のために細胞及び組織を標的とすることができる。
【0007】
病原体由来又は自己抗原のいずれかの抗原を検出するために、Ｂ細胞は、膜貫通免疫グロブリン分子（ｍＩｇ）並びにＣＤ７９ａ（Ｉｇα）及びＣＤ７９ｂ（Ｉｇβ）のジスルフィド結合ヘテロ二量体から構成される多成分受容体である細胞表面受容体（ＢＣＲ）を発現する（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｍｏｒｐｈｏｌ，Ｊｕｎ；９（２）：９７－１０６）。ＣＤ７９ｂは、Ｂ細胞の多くの分化状態にわたってＢ細胞系列内で選択的に発現される。ＢＣＲの活性化は、Ｂ細胞分化、抗体及び自己抗体産生、サイトカイン産生、並びにＴ細胞への抗原提示を含む複数の免疫活性化結果をもたらす。
【発明の概要】
【0008】
いくつかの実施形態では、本発明は、多重特異性抗体又は多重特異性結合断片であって、
ａ）分化抗原群７９Ｂタンパク質（ＣＤ７９Ｂ）に結合する第１の抗原結合アームであって、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）を含み、第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）を更に含む、第１の抗原結合アームと、
ｂ）分化抗原群２２（ＣＤ２２）に結合する第２の抗原結合アームであって、第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）を含み、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を更に含む、第２の抗原結合アームと、を含む、多重特異性抗体又は多重特異性結合断片を提供する。
ａ）分化抗原群７９Ｂタンパク質（ＣＤ７９Ｂ）に結合する第１の抗原結合アームであって、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）を含み、第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）を更に含む、第１の抗原結合アームと、
ｂ）分化抗原群２２（ＣＤ２２）に結合する第２の抗原結合アームであって、第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）を含み、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を更に含む、第２の抗原結合アームと、を含む、多重特異性抗体又は多重特異性結合断片を提供する。
【0009】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する第１の抗原結合アームは、
ａ）配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９、若しくは５７の重鎖相補性決定領域（heavy chain complementarity determining region、ＨＣＤＲ）１、
ｂ）配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０、若しくは５８のＨＣＤＲ２、
ｃ）配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１、若しくは５９のＨＣＤＲ３、
ｄ）配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２、若しくは６０の軽鎖相補性決定領域（light chain complementarity determining region、ＬＣＤＲ）１、
ｅ）配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３、若しくは６１のＬＣＤＲ２、又は
ｆ）配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４、及び６２のＬＣＤＲ３を含む。
ａ）配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９、若しくは５７の重鎖相補性決定領域（heavy chain complementarity determining region、ＨＣＤＲ）１、
ｂ）配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０、若しくは５８のＨＣＤＲ２、
ｃ）配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１、若しくは５９のＨＣＤＲ３、
ｄ）配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２、若しくは６０の軽鎖相補性決定領域（light chain complementarity determining region、ＬＣＤＲ）１、
ｅ）配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３、若しくは６１のＬＣＤＲ２、又は
ｆ）配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４、及び６２のＬＣＤＲ３を含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する第１の抗原結合アームは、
（ａ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３、並びに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３、並びに配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、及び配列番号２２のＬＣＤＲ３、
（ｃ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、及び配列番号２７のＨＣＤＲ３、並びに配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２、及び配列番号３０のＬＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、及び配列番号３５のＨＣＤＲ３、並びに配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２、及び配列番号３８のＬＣＤＲ３、
（ｅ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４３のＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２、及び配列番号４６のＬＣＤＲ３、
（ｆ）配列番号４９のＨＣＤＲ１、配列番号５０のＨＣＤＲ２、及び配列番号５１のＨＣＤＲ３、並びに配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号５３のＬＣＤＲ２、及び配列番号５４のＬＣＤＲ３、又は
（ｇ）配列番号５７のＨＣＤＲ１、配列番号５８のＨＣＤＲ２、及び配列番号５９のＨＣＤＲ３、並びに配列番号６０のＬＣＤＲ１、配列番号６１のＬＣＤＲ２、及び配列番号６２のＬＣＤＲ３を含む。
（ａ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３、並びに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３、並びに配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２、及び配列番号２２のＬＣＤＲ３、
（ｃ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、及び配列番号２７のＨＣＤＲ３、並びに配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２、及び配列番号３０のＬＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、及び配列番号３５のＨＣＤＲ３、並びに配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２、及び配列番号３８のＬＣＤＲ３、
（ｅ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４３のＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２、及び配列番号４６のＬＣＤＲ３、
（ｆ）配列番号４９のＨＣＤＲ１、配列番号５０のＨＣＤＲ２、及び配列番号５１のＨＣＤＲ３、並びに配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号５３のＬＣＤＲ２、及び配列番号５４のＬＣＤＲ３、又は
（ｇ）配列番号５７のＨＣＤＲ１、配列番号５８のＨＣＤＲ２、及び配列番号５９のＨＣＤＲ３、並びに配列番号６０のＬＣＤＲ１、配列番号６１のＬＣＤＲ２、及び配列番号６２のＬＣＤＲ３を含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する第１の抗原結合アームは、以下：
ａ）配列番号１５のＶＨ及び配列番号１６のＶＬ、
ｂ）配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、
ｃ）配列番号３１のＶＨ及び配列番号３２のＶＬ、
ｄ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、
ｅ）配列番号４７のＶＨ及び配列番号４８のＶＬ、
ｆ）配列番号５５のＶＨ及び配列番号５６のＶＬ、
ｇ）配列番号６３のＶＨ及び配列番号６４のＶＬ、又は
ｈ）配列番号８０のＶＨ及び配列番号８１のＶＬのＶＨ及びＶＬを含む。
ａ）配列番号１５のＶＨ及び配列番号１６のＶＬ、
ｂ）配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、
ｃ）配列番号３１のＶＨ及び配列番号３２のＶＬ、
ｄ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、
ｅ）配列番号４７のＶＨ及び配列番号４８のＶＬ、
ｆ）配列番号５５のＶＨ及び配列番号５６のＶＬ、
ｇ）配列番号６３のＶＨ及び配列番号６４のＶＬ、又は
ｈ）配列番号８０のＶＨ及び配列番号８１のＶＬのＶＨ及びＶＬを含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する抗原結合アームは、配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨ１、並びに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ１を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する抗原結合アームは、配列番号８０のＶＨ１及び配列番号８１のＶＬ１を含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２に結合する第２の抗原結合アームは、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ２、並びに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ２を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、ＶＨ２は、配列番号７を含み、ＶＬ２は、配列番号８を含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する第１の抗原結合アームは、
ａ）配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９、若しくは５７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、
ｂ）配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０、若しくは５８のＨＣＤＲ２、
ｃ）配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１、若しくは５９のＨＣＤＲ３、
ｄ）配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２、若しくは６０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、
ｅ）配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３、若しくは６１のＬＣＤＲ２、又は
ｆ）配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４、及び６２のＬＣＤＲ３を含み、
ＣＤ２２に結合する第２の抗原結合アームは、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ２、並びに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ２を含む。
ａ）配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９、若しくは５７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、
ｂ）配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０、若しくは５８のＨＣＤＲ２、
ｃ）配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１、若しくは５９のＨＣＤＲ３、
ｄ）配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２、若しくは６０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、
ｅ）配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３、若しくは６１のＬＣＤＲ２、又は
ｆ）配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４、及び６２のＬＣＤＲ３を含み、
ＣＤ２２に結合する第２の抗原結合アームは、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ２、並びに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ２を含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する第１の抗原結合アームは、配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３、並びに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ１を含み、ＣＤ２２に結合する第２の抗原結合アームは、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨ２、並びに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ２を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する第１の抗原結合アームは、配列番号８０のＶＨ１及び配列番号８１のＶＬ１を含み、ＣＤ２２に結合する第２の抗原結合アームは、配列番号７のＶＨ２及び配列番号８のＶＬ２を含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、第１又は第２の抗原結合アームは、単鎖可変断片（single-chain variable fragment、ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、抗原結合断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ＶＨＨ、又はｄＡＢを含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合アームは、ｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合アームは、Ｆａｂを含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合アームは、配列番号８２のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する第１の抗原結合アームは、第１の断片結晶化可能（Fragment crystallizable、Ｆｃ）ドメインを含むか、又はそれに作動可能に連結され、ＣＤ２２に結合する第２の抗原結合アームは、第２のＦｃドメインを含むか、又はそれに作動可能に連結される。
【0023】
いくつかの実施形態では、第１及び第２のＦｃドメインのうちの少なくとも１つは、１つ又は２つ以上の変異を含み、１つ又は２つ以上の変異は、Ｆｃドメインのヘテロ二量体化を促進するか、Ｆｃγ受容体へのＦｃ結合を低減させるか、プロテインＡへのＦｃ結合を低減させるか、多重特異性抗体若しくは多重特異性結合断片の半減期を延長するか、又はこれらの任意の組み合わせである。
【0024】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインのヘテロ二量体化を促進する１つ又は２つ以上の変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｔ３６６Ｗ、及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け）から選択される。
【0025】
いくつかの実施形態では、第１のＦｃドメインは、変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＦｃドメインは、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け）を含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、Ｆｃγ受容体へのＦｃ結合を低減させる１つ又は２つ以上の変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓ（ＥＵ番号付け）から選択される。
【0027】
いくつかの実施形態では、第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインの両方が、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓ（ＥＵ番号付け）を含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、プロテインＡへのＦｃ結合を低減させる１つ又は２つ以上の変異は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ（ＥＵ番号付け）から選択される。
【0029】
いくつかの実施形態では、第２のＦｃドメインは、変異Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ（ＥＵ番号付け）を含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体又は多重特異性結合断片の半減期を延長する１つ又は２つ以上の変異は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（ＥＵ番号付け）から選択される。
【0031】
いくつかの実施形態では、第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインの両方が、変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅを含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、第１のＦｃドメインは、配列番号８９を含み、第２のＦｃドメインは、配列番号９０を含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体又は多重特異性結合断片は、配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、本発明は、治療剤又は造影剤にコンジュゲートされた、本開示による多重特異性抗体又は多重特異性結合断片を含む免疫コンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、免疫コンジュゲートは、配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含み、配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４のうちの少なくとも１つは、治療剤又は造影剤にコンジュゲートされている。
【0035】
いくつかの実施形態では、本発明は、本開示による多重特異性抗体又は免疫コンジュゲート分子、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含む多重特異性抗体又は免疫コンジュゲート分子、並びに医薬的に許容される担体を含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、本発明は、本開示による多重特異性抗体又は免疫コンジュゲート分子の抗原結合アーム又はその断片をコードする少なくとも１つの核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、核酸分子の組み合わせを提供し、その核酸分子の組み合わせは、配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４の各々をコードする。
【0037】
いくつかの実施形態では、本発明は、本開示による多重特異性抗体又は免疫コンジュゲート分子の抗原結合アーム又はその断片をコードする核酸分子を含む少なくとも１つのベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、核酸分子の組み合わせを含むベクターの組み合わせを提供し、その核酸分子の組み合わせは、配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４の各々をコードする。
【0038】
いくつかの実施形態では、本発明は、本開示による多重特異性抗体又は免疫コンジュゲート分子の少なくとも１つの抗原結合アーム又は断片をコードする核酸分子を含む少なくとも１つのベクターを含む少なくとも１つの宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、核酸分子の組み合わせを含むベクターの組み合わせを提供し、その核酸分子の組み合わせは、配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４の各々をコードする。
【0039】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象における自己免疫性疾患を治療する方法であって、治療有効量の本開示による多重特異性抗体又は多重特異性結合断片又は免疫コンジュゲートを、自己免疫性疾患を治療するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象における自己免疫性疾患を治療する方法であって、治療有効量の、配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４を含む多重特異性抗体又は多重特異性結合断片又は免疫コンジュゲートを投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象における自己免疫性疾患を治療する方法であって、治療有効量の、配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４を含み、かつ医薬的担体を更に含む、多重特異性抗体又は多重特異性結合断片又は免疫コンジュゲートを投与することを含む、方法を提供する。
【0040】
いくつかの実施形態では、自己免疫性疾患は、全身性紅斑性狼瘡（Systemic lupus erythematosus、ＳＬＥ）、シェーグレン症候群（Sjogren’s syndrome、ＳｊＳ）、リウマチ性関節炎、自己免疫ミオパシー、１型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎（Primary biliary cholangitis、ＰＢＣ）、自己免疫性膵炎、セリアック病、巣状糸球体硬化症、原発性膜性腎症、卵巣機能不全、自己免疫精巣炎、乾性眼疾患、特発性間質性肺炎、甲状腺疾患（例えば、グレーブス病）、全身性硬化症（強皮症）、筋無力症症候群、自己免疫脳炎、水疱性皮膚疾患、ＴＴＰ、ＩＴＰ、ＡＩＨＡ、Ａｎｃａ血管炎、心筋炎／拡張型ＣＭ、ＮＭＯＳＤ、母体－胎児同種免疫、母体－胎児自己免疫、抗カルジオリピン／抗リン脂質抗体症候群、高ガンマグロブリン血症、移植関連ＩＤ、又は多巣性運動ニューロパチーである。
【0041】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｂ細胞活性化を調節するか、又は異常なＢ細胞活性化を阻害する方法であって、本開示による多重特異性抗体又は多重特異性結合断片又は免疫コンジュゲートを、対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｂ細胞活性化を調節するか、又は異常なＢ細胞活性化を阻害する方法であって、配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４を含む多重特異性抗体又は多重特異性結合断片、又は免疫コンジュゲートを投与することを含む、方法を提供する。
【0042】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象におけるＢ細胞活性化を調節するか、又は異常なＢ細胞活性化を阻害する方法であって、有効量の本開示による多重特異性抗体又は多重特異性結合断片又は免疫コンジュゲートを、Ｂ細胞活性化を調節するか、又は異常なＢ細胞活性化を阻害するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象におけるＢ細胞活性化を調節するか、又は異常なＢ細胞活性化を阻害する方法であって、有効量の、配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４を含む多重特異性抗体又は多重特異性結合断片又は免疫コンジュゲートを、Ｂ細胞活性化を調節するか、又は異常なＢ細胞活性化を阻害するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0043】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象におけるＢ細胞活性化を調節するか、異常なＢ細胞活性化を阻害するか、又は自己免疫性疾患を治療するための、有効量の、本開示による多重特異性抗体又は多重特異性結合断片又は免疫コンジュゲートの使用に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象におけるＢ細胞活性化を調節する、異常なＢ細胞活性化を阻害する、又は自己免疫性疾患を治療するための、有効量の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片又は免疫コンジュゲートの使用であって、当該多重特異性抗体又は多重特異性結合断片又は免疫コンジュゲートが、配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４を含む、使用に関する。
【0044】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象におけるＢ細胞増殖を減少させるか、サイトカイン産生を減少させるか、又はＢ細胞活性化を低減させる方法であって、有効量の、本開示による多重特異性抗体又は多重特異性結合断片又は免疫コンジュゲートを、Ｂ細胞増殖を減少させるか、サイトカイン産生を減少させるか、又はＢ細胞活性化を低減させるのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象におけるＢ細胞増殖を減少させるか、サイトカイン産生を減少させるか、又はＢ細胞活性化を低減させる方法であって、有効量の、配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４を含む多重特異性抗体又は多重特異性結合断片又は免疫コンジュゲートを投与することを含む、方法を提供する。
【0045】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｂ細胞増殖を減少させるか、サイトカイン産生を減少させるか、又はＢ細胞活性化を低減させるための、有効量の、本開示による多重特異性抗体又は多重特異性結合断片又は免疫コンジュゲートの使用に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｂ細胞増殖及びサイトカイン産生を減少させるか、又はＢ細胞活性化を低減させるための、有効量の多重特異性抗体又は多重特異性結合断片又は免疫コンジュゲートの使用であって、その多重特異性抗体又は多重特異性結合断片又は免疫コンジュゲートが、配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４を含む、使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【0046】
【図1】ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体の非枯渇能力を実証する実験結果を示す。ＰＢＭＣを、培地単独、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３０）、ＣＤ２２×アイソタイプ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３６）、アイソタイプ×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ２）、又は抗ＣＤ２０枯渇ｍＡｂと共に４８時間培養した。４８時間後、細胞を生細胞（Ｚｏｍｂｉｅ Ｄｙｅ Ａｑｕａ）、Ｔ細胞（ＣＤ３）、及びＢ細胞（ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ１９）について染色した。次いで、ｂ細胞のパーセントを、培地単独ウェルと比較して計算した。二重特異性抗体は、いずれの二重特異性フォーマットにおいてもＢ細胞の枯渇をほとんど又は全く有さなかったが、抗ＣＤ２０枯渇ｍＡｂの陽性対照は、ＰＢＭＣにおけるＢ細胞の有意な減少を示した。
【図2】Ｂ細胞近位シグナル（ｐ－Ｓｙｋ、ｐ－ＰＬＣγ２）がＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体によって阻害されたことを実証する実験結果を示す。精製されたＢ細胞を、刺激前に以下のものと共に３０分間培養した：培地単独、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３０）、ＣＤ２２×アイソタイプ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３６）、及びアイソタイプ×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ２）。３０分が経過した後、Ｂ細胞を抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ）’２（２０μｇ／ｍＬ）で刺激して、ＦｃγＲ結合に関与している可能性があるあらゆる交絡因子を回避した。次いで、Ｂ細胞を所定の時点（０、５、８、１０、１５及び３０分）で固定した。固定後、細胞を、Ｂ細胞受容体（B-cell receptor、ＢＣＲ）複合体の下流リンタンパク質シグナル伝達分子（ｐ－Ｓｙｋ、ｐ－ＰＬＣγ２）について染色した。ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体は、刺激対照又はアイソタイプ対照アーム対照と比較して、ｐ－Ｓｙｋ及びｐ－ＰＬＣγ２を阻害することによって、ＢＣＲ複合体を介してシグナル伝達するＢ細胞の能力に有意に影響を与えた。
【図3】Ｂ細胞遠位リードアウト（増殖、サイトカイン分泌）がＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体によって著しく阻害されたことを実証する実験結果を示す。精製されたＢ細胞を、刺激前に以下のものと共に３０分間培養した：ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３０）、ＣＤ２２×アイソタイプ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３６）、及びアイソタイプ×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ２）。３０分後、Ｂ細胞を相乗用量の抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ）’２（２．５μｇ／ｍＬ）及びＣＰＧ（０．３１２５μＭ）で刺激した。示されるように、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ抗体は、アイソタイプ対照アームと比較して、ＢＣＲ＋ＴＬＲ刺激に応答してＢ細胞増殖を著しく低減させることができた。更に、Ｂ細胞ＩＬ－６産生は、著しく影響を受けたが、ここでもアイソタイプ対照アームは、ほとんど又は全く効果を示さなかった。
【図4】ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体が、ＮＳＧ－ヒトＰＢＭＣ移入モデルからのＩｇＭ抗体産生をインビボで阻害したことを実証する実験結果を示す。ヒトＰＢＭＣを、照射された免疫不全マウス－ＮＳＧ（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒガンマｎｕｌｌ）に移入した。次いで、マウスを、様々な用量のＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（０．２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び５ｍｇ／ｋｇ）又はアイソタイプ対照抗体（５ｍｇ／ｋｇ）で処置した。次いで、細胞を７時間生着させた。この間に、Ｂ細胞は、ヒト抗体をインビボで産生し始めた。７日後、動物を屠殺し、フローサイトメトリーのための脾細胞、及び分析のために血清を採取した。血清は、対照（ＰＢＳ及びアイソタイプ）と比較して、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体で処置した５ｍｇ／ｋｇ群においてヒトＩｇＭの有意な低減を示した。
【図5】ＣＤ７９ｂ－ｓｃＦｖアームのステープリングが凝集を軽減したことを実証する実験結果を示す。
【図6】ステープルされた二重特異性分子がＢ細胞機能を阻害したことを実証する実験結果を示す。
【図7】活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ８３の発現の減少によって実証されるように、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体がＢ細胞活性化を低減させたことを実証する実験結果を示す。
【発明の詳細な説明】
【0047】
開示される方法は、以下の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解され得る。本開示の方法は、本明細書に記載及び／又は示される特定の方法に限定されないこと、更に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を例によって説明することのみを目的とし、特許請求された方法に限定することを意図しないことを理解されたい。
【0048】
本明細書に引用される全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、あたかも本明細書に完全に記載されているように参照により組み込まれる。
【0049】
リストが提示される場合、特に指定されない限り、そのリストの各個々の要素及びそのリストの全ての組み合わせは別個の実施形態であることを、理解されたい。例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣ」として提示される実施形態のリストは、実施形態「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ又はＣ」、「Ｂ又はＣ」、又は「Ａ、Ｂ、又はＣ」を含むと解釈されるべきである。
【0050】
本発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例に記載された数値は、可能な限り正確に報告される。ただし、任意の数値は、各試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じる一定の誤差を本質的に含有する。
【0051】
定義
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、その内容について特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ又は３つ以上の細胞の組み合わせなどが含まれる。
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、その内容について特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ又は３つ以上の細胞の組み合わせなどが含まれる。
【0052】
「備える／含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting essentially of）」、及び「からなる（consisting）」という移行句は、特許用語において概ね受け入れられている意味を含意することを意図しており、すなわち、（ｉ）「備える／含む（comprising）」は、「含む」、「含有する」、又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非制限的なものであり、追加の列挙されていない要素又は方法工程を除外するものではなく、（ｉｉ）「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲において特定されていない、あらゆる要素、工程、又は成分を除外し、並びに（ｉｉｉ）「から本質的になる」は、特定される材料又は工程、並びに、特許請求される発明の「基本的かつ新しい特徴に実質的に影響しないもの」に、特許請求の範囲を制限する。語句「備える／含む」（又はその同義語）を伴って記載される実施形態はまた、「からなる」及び「から本質的になる」を伴って独立して記載される実施形態として提供する。
【0053】
「約」は、当業者によって求められた特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち、測定システムの制限事項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において、実施例又は明細書の他の箇所に別途明示的に記載されない限り、「約」は、当該技術分野の実施につき１つの標準偏差、又は５％までの範囲のうちのいずれか大きい方の範囲内であることを意味する。
【0054】
「活性化」又は「刺激」又は「活性化された」、又は「刺激された」は、活性化マーカーの発現、サイトカイン産生、増殖、又は標的細胞の細胞傷害の媒介をもたらす、細胞の生物学的状態の変化の誘導を指す。細胞は、一次刺激シグナルによって活性化され得る。共刺激シグナルは、一次シグナルの大きさを増幅し、初期刺激後の細胞死を抑制することができ、その結果、より耐久性のある活性化状態、ひいてはより高い細胞傷害能をもたらす。「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞及び／若しくはＮＫ細胞の増殖、並びに／又は鍵となる分子の上方制御若しくは下方制御を引き起こすシグナルを指す。
【0055】
「代替スカフォールド」は、立体配座許容度が高い可変ドメインに会合する構造化コアを含有する、単鎖タンパク質フレームワークを指す。可変ドメインは、スカフォールドの完全性を損なうことなく導入されるバリエーションを許容するため、可変ドメインは、特異的抗原に結合するように操作及び選択され得る。
【0056】
「抗体依存性細胞傷害」、「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」、又は「ＡＤＣＣ（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）」は、抗体でコーティングされた標的細胞と、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、及び好中球などの溶解活性を有するエフェクター細胞との、エフェクター細胞上で発現するＦｃガンマ受容体（Fc gamma receptor、ＦｃｇＲ）を介した相互作用に依存する細胞死を誘導する機序を指す。
【0057】
「抗体依存性細胞貪食作用」又は「Antibody-dependent cellular phagocytosis、ＡＤＣＰ」は、マクロファージ、又は樹状細胞などの貪食細胞による内在化によって、抗体でコーティングされた標的細胞を排除する機序を指す。
【0058】
「抗原」は、抗原結合ドメインによって結合されることが可能な任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖、糖タンパク質、糖脂質、核酸、その部分、又はそれらの組み合わせ）を指す。抗原は、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞、又は他の生物学的成分を有する流体、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、及び死滅若しくは不活性化された全細胞又は溶解物などの生体サンプルからの遺伝子によって発現し得る、サンプルから合成され得る、又はサンプルから精製され得る。
【0059】
「抗原結合断片」又は「抗原結合ドメイン」は、抗原に結合するタンパク質の一部分を指す。抗原結合断片は、合成ポリペプチド、酵素的に入手可能なポリペプチド、又は遺伝的に操作されたポリペプチドであってもよく、これには、抗原に結合する免疫グロブリンの部分、例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片、１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインからなるドメイン抗体（ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｄＡｂ）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ＶＨＨドメイン、ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４部分などの抗体のＣＤＲを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニット、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３、抗原に結合する代替スカフォールド、並びに抗原結合断片を含む多重特異性タンパク質が挙げられる。抗原結合断片（ＶＨ及びＶＬなど）は、合成リンカーを介して互いに連結して、ＶＨ及びＶＬドメインが別個の一本鎖により発現された場合にＶＨ／ＶＬドメインが分子内又は分子間で対合して一価の抗原結合ドメイン、例えば一本鎖Ｆｖ（single chain Fv、ｓｃＦｖ）又はダイアボディを形成することができる、様々な種類の一本鎖抗体設計を形成することができる。抗原結合断片はまた、二重特異性及び多重特異性タンパク質を操作するために、単一特異性又は多重特異性であり得る他の抗体、タンパク質、抗原結合断片、又は代替スカフォールドにコンジュゲートされてもよい。
【0060】
「抗体」は、広義の意味を有し、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性、三重特異性、四重特異性などの多特異性抗体、二量体、四量体、又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、及び必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された形態を含む免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された、２本の重鎖（heavy chain、ＨＣ）及び２本の軽鎖（light chain、ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えばＩｇＭ）から構成される。各ＨＣは、重鎖可変領域（ＶＨ）、及び重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３から構成される）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（light chain constant region、ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（framework region、ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。あらゆる脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。
【0061】
「二重特異性」は、同じ抗原内の２つの異なる抗原、又は２つの異なるエピトープに特異的に結合する分子（抗体など）を指す。二重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト若しくはサル、例えば、カニクイザル（Macaca cynomolgus）（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ、ｃｙｎｏ）若しくはチンパンジー（Pan troglodytes）などの他の種に由来する同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有し得るか、又は２つ若しくは３つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合し得る。
【0062】
本明細書で使用されるとき、「キメラ」という用語は、非ヒト哺乳動物、げっ歯動物、又は爬虫類の抗体アミノ酸配列に由来する少なくとも１つの可変ドメインの少なくともいくらかの部分を有するものの、抗体又はその抗原結合断片の残りの部分は、ヒトに由来する、抗体又はその抗原結合断片を指す。
【0063】
本明細書で使用される、「キメラ抗原受容体」（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）は、細胞外標的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞表面受容体として定義され、全て天然では単一のタンパク質において一緒に見られることのない組み合わせである。これには、細胞外ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインが天然では単一の受容体タンパク質において一緒に見られることのない受容体が含まれる。ＣＡＲは、主に、Ｔ細胞及びＮＫ細胞などのリンパ球との使用が意図される。
【0064】
「クローン」は、有糸分裂により、単一の細胞又は共通する祖先から得られる細胞集団である。「細胞株」は、インビトロにおいて何代にもわたって安定して成長させることができる初代細胞のクローンである。本明細書で提供された一部の例では、細胞は、細胞をＤＮＡで遺伝子導入することにより、形質転換される。
【0065】
「補体依存性細胞傷害」又は「complement-dependent cytotoxicity、ＣＤＣ」は、標的に結合したタンパク質のＦｃエフェクタードメインが補体成分Ｃ１ｑに結合し、これを活性化し、次に、補体カスケードを活性化し、標的細胞死をもたらす、細胞死を誘導する機序を指す。補体の活性化はまた、標的細胞表面に対する補体成分の沈着をもたらし得、白血球への補体受容体（例えば、ＣＲ３）の結合によって、ＣＤＣを容易にする
【0066】
「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、抗原に結合する抗体の領域である。ＶＨには３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、ＶＬには３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲは、以下のものなどの様々な記述を使用して定義することができる：Ｋａｂａｔ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１－５０、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－１７）、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７）、及びＡｂＭ（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ Ｊ Ｂｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６３：８００－１５，１９９６）。様々な記述と、可変領域の付番との対応が記載されている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００１）３０９：６５７－７０、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ、ＩＭＧＴ）データベース、ウェブリソース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇを参照されたい）。ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＣＤＲを描写することができる。本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、本明細書で別途明示的に記載のない限り、上述したＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、又はＡｂＭの方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。
【0067】
典型的には、ＣＤＲは、カノニカル構造として分類され得るループ構造を形成する。「カノニカル構造」という用語は、抗原結合（ＣＤＲ）ループによって採用される主鎖立体構造を意味する。比較構造の研究から、６つの抗原結合ループのうちの５つは利用可能な立体構造のレパートリーがごく限られていることが判明している。各カノニカル構造は、ポリペプチド主鎖のねじれ角によって特徴付けられ得る。したがって抗体間で対応するループは、ループの大部分において高度のアミノ酸配列可変性が見られるにもかかわらず、非常によく似た三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ」，Ｉ ３４２：８７７（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｉｎ Ｌｏｏｐｓ ｏｆ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００（１９９６）、その文献の各々は、参照によりその全体が組み込まれる）。更に、とられるループ構造とその周囲のアミノ酸配列との間には関係がある。特定のカノニカルクラスの立体構造は、ループの長さと、ループ内の重要な位置並びに保存されたフレームワーク（すなわち、ループの外側）内にあるアミノ酸残基とによって決定される。したがって、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて、特定のカノニカルクラスへの割り当てを行うことができる。
【0068】
「減少する」、「低下する」、「低くする」、「低減させる」、又は「軽減する」は、一般に、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較した場合に、試験分子が低減された応答（すなわち、下流効果）を媒介する能力を指す。例示的な応答は、Ｔ細胞拡大、Ｔ細胞活性化、又はＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅、又はタンパク質のその抗原若しくは受容体への結合、並びにＦｃγへの増強された結合、又は増強されたＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／若しくはＡＤＣＰなどの増強されたＦｃエフェクター機能である。減少は、試験分子と対照（又はビヒクル）との間の測定された応答の統計的に有意な差、又は約１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは３０倍若しくはそれ以上、例えば、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００倍若しくはそれ以上（１を上回る全ての整数及びその間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）の増加などの、測定された応答の増加であってもよい。
【0069】
「ドメイン抗体」、「ｄＡｂ」、又は「ｄＡｂ断片」は、抗体の単一のアームからのＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれかで構成される抗体断片を指す。
【0070】
「分化」は、細胞の能力若しくは増殖を減少させるか、又は細胞をより発達的に制限された状態に移動させる方法を指す。
【0071】
「コードする」又は「コードすること」は、定義されたヌクレオチドの配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）か、又は定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異性配列の固有の特性、並びにそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、細胞又は他の生物系において、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳がタンパク質を産生する場合、その遺伝子、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡは、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖とはいずれも、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードするとして言及され得る。
【0072】
「増強する」、「促進する」、「増加させる」、「拡大する」、又は「改善する」は、一般に、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較した場合に、より大きな応答（すなわち、下流効果）を媒介する試験分子の能力を指す。例示的な応答は、Ｔ細胞拡大、Ｔ細胞活性化、又はＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅、又はタンパク質のその抗原若しくは受容体への結合、並びにＦｃγへの増強された結合、又は増強されたＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／若しくはＡＤＣＰなどの増強されたＦｃエフェクター機能である。増強は、試験分子と対照（又はビヒクル）との間の測定された応答の統計的に有意な差、又は約１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは３０倍若しくはそれ以上、例えば、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００倍若しくはそれ以上（１を上回る全ての整数及びその間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）の増加などの、測定された応答の増加であってもよい。
【0073】
「拡大」は、細胞分裂及び細胞死の結果を指す。
【0074】
「発現する」及び「発現」は、細胞内又はインビトロで起こる周知の転写及び翻訳を指す。したがって、発現産物、例えば、タンパク質は、細胞によって又はインビトロで発現し、細胞内、細胞外、又は膜貫通タンパク質であってもよい。
【0075】
「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指示するために、生物系又は再構成された生物系で利用することができるベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用要素を含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、又はインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターとしては、組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば、裸の、又はリポソームに含有されるもの）、及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含む、当該技術分野において既知の全てのベクターが挙げられる。
【0076】
「ｄＡｂ」又は「ｄＡｂ断片」は、ＶＨドメインで構成される抗体断片を指す（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４ ５４６（１９８９））。
【0077】
「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ断片」は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬドメインで構成される抗体断片を指す。
【0078】
「Ｆ（ａｂ’）２」又は「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって接続された２つのＦａｂ断片を含有する抗体断片を指す。
【0079】
「Ｆｄ」又は「Ｆｄ断片」は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成される抗体断片を指す。
【0080】
「Ｆｖ」又は「Ｆｖ断片」は、抗体の単一のアームからのＶＨ及びＶＬドメインで構成される抗体断片を指す。
【0081】
「完全長抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に接続された、２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）、並びにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）で構成される。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメインで構成され、重鎖定常ドメインは、サブドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）で構成される。ＶＨ及びＶＬは、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変性の領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。
【0082】
「遺伝子修飾」は、宿主細胞が、導入された遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的には、導入された遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素を産生するように、「外来」（すなわち、外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することを指す。導入された遺伝子又は配列はまた、「クローニングされた」又は「外来」遺伝子又は配列と呼ばれる場合もあり、開始、終止、プロモータ、シグナル、分泌、又は細胞の遺伝機序によって使用される他の配列などのキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結した調節配列又は制御配列を含んでもよい。遺伝子又は配列は、既知の機能を有さない非機能的配列を含んでもよい。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け取って発現する宿主細胞は、「遺伝的に操作されている」。宿主細胞に導入されたＤＮＡ又はＲＮＡは、宿主細胞と同じ属若しくは種の細胞を含む任意の起源、又は異なる属若しくは種に由来し得る。
【0083】
「異種」は、自然界では互いに対して同じ関係で見られない、２つ若しくは３つ以上のポリヌクレオチド又は２つ若しくは３つ以上のポリペプチドを指す。
【0084】
「異種ポリヌクレオチド」は、本明細書に記載される２つ又は３つ以上のネオ抗原をコードする、天然には存在しないポリヌクレオチドを指す。
【0085】
「異種ポリペプチド」は、本明細書に記載される２つ又は３つ以上のネオ抗原ポリペプチドを含む、天然には存在しないポリペプチドを指す。
【0086】
「宿主細胞」は、異種核酸を含有する任意の細胞を指す。例示的な異種核酸は、ベクター（例えば、発現ベクター）である。
【0087】
「ヒト抗体」は、ヒト対象に投与されたときに免疫応答が最小限になるように最適化されている抗体を指す。ヒト抗体の可変領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体が定常領域又は定常領域の一部分を含む場合、その定常領域もまた、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、ヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。このような例示的な系は、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばマウス又はラットである。「ヒト抗体」は、典型的には、ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために使用した系の違い、フレームワーク若しくはＣＤＲへの体細胞変異の導入若しくは置換の意図的な導入、又はこれらの両方により、ヒトで発現した免疫グロブリンと比較したときにアミノ酸の違いを含有する。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７－８６に記載されるヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６及び国際特許公開第２００９／０８５４６２号に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含有し得る。少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
【0088】
「ヒト化抗体」は、少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来し、少なくとも１つのフレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。
【0089】
「～と組み合わせて」は、２つ又は３つ以上の治療剤を、混合物の状態で一緒に、単剤として同時に、又は単剤として任意の順序で順次に、対象に投与することを意味する。
【0090】
「単離された」は、組換え細胞などにおいて分子が産生される系の他の成分から離して実質的に分離及び／又は精製されている分子の均質な集団（例えば、合成ポリヌクレオチド又はポリペプチド）に加えて、少なくとも１つの精製又は単離工程に供されているタンパク質を指す。「単離された」は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない分子を指し、より高い純度、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度まで単離された分子を包含する。「単離された」核酸、ペプチド、及びタンパク質は、組成物の一部であることができ、このような組成物が核酸、ペプチド、又はタンパク質の本来の環境の一部ではない場合であっても単離されている。また、この用語は、宿主細胞中での組換え発現により調製された核酸、ペプチド、及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も包含する。本明細書で使用されるとき、「単離された」抗体又は抗原結合断片は、種々の抗原特異性を有する他の抗体又は抗原結合断片を実質的に含まない抗体又は抗原結合断片を指すことを意図している（例えば、ＣＤ７９ｂに特異的に結合する単離された抗体は、ＣＤ７９ｂ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ただし、ＣＤ７９ｂのエピトープ、アイソフォーム、又はバリアントに特異的に結合する単離された抗体は、例えば、他の種に由来する他の関連抗原（例えば、ＣＤ７９ｂ種間ホモログ）に対する交差反応性を有し得る。
【0091】
「分化抗原群ＣＤ２２タンパク質」又は「ＣＤ２２」は、ＣＤ２２とも呼ばれる既知のタンパク質を指す。様々なアイソフォームのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋから検索可能であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１７６２．２、ＮＰ＿００１１７２０２８．１、ＮＰ＿００１１７２０２９．１、ＮＰ＿００１１７２０３０．１、及びＮＰ＿００１２６５３４６．１が含まれる。
【0092】
「分化抗原群ＣＤ７９Ｂタンパク質」又は「ＣＤ７９ｂ」は、ＣＤ７９ｂとも呼ばれる既知のタンパク質を指す。様々なアイソフォームのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋから検索可能であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ３２６５１．１、ＥＡＷ９４２３２．１、ＡＡＨ０２９７５．２、ＮＰ＿０００６１７．１、及びＮＰ＿００１０３５０２２．１が含まれる。完全長ＣＤ７９ｂ配列のアミノ酸配列を以下に示す。配列は、細胞外ドメイン（残基２９～１５９）及び細胞質ドメイン（残基１８１～２２９）を含む。
【0093】
ＭＡＲＬＡＬＳＰＶＰＳＨＷＭＶＡＬＬＬＬＬＳＡＥＰＶＰＡＡＲＳＥＤＲＹＲＮＰＫＧＳＡＣＳＲＩＷＱＳＰＲＦＩＡＲＫＲＧＦＴＶＫＭＨＣＹＭＮＳＡＳＧＮＶＳＷＬＷＫＱＥＭＤＥＮＰＱＱＬＫＬＥＫＧＲＭＥＥＳＱＮＥＳＬＡＴＬＴＩＱＧＩＲＦＥＤＮＧＩＹＦＣＱＱＫＣＮＮＴＳＥＶＹＱＧＣＧＴＥＬＲＶＭＧＦＳＴＬＡＱＬＫＱＲＮＴＬＫＤＧＩＩＭＩＱＴＬＬＩＩＬＦＩＩＶＰＩＦＬＬＬＤＫＤＤＳＫＡＧＭＥＥＤＨＴＹＥＧＬＤＩＤＱＴＡＴＹＥＤＩＶＴＬＲＴＧＥＶＫＷＳＶＧＥＨＰＧＱＥ（配列番号：１２６）
【0094】
「調節する」は、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較したときに、より多い又はより少ない応答を媒介する（すなわち、下流効果）試験分子の増強した又は減少した能力のいずれかを指す。
【0095】
「モノクローナル抗体」は、抗体重鎖からＣ末端リジンを除去する、又はアミノ酸の異性化若しくは脱アミド、メチオニンの酸化、又はアスパラギン若しくはグルタミンの脱アミドなどの翻訳後修飾といった、可能な周知の改変を除いて同一である、抗体分子の実質的に均質な母集団から得られた抗体、すなわち、集団を構成する個別の抗体を指す。モノクローナル抗体は、典型的には、１つの抗原性エピトープに結合する。二重特異性モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原性エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団内で不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性であってもよく、又は、二重特異性などの多重特異性であってもよく、一価、二価、又は多価であってもよい。
【0096】
「ミニボディ」は、ＣＨ３ドメインを介して連結されたｓｃＦｖ断片を指す。
【0097】
「多重特異性」は、２つ若しくは３つ以上の異なる抗原、又は同じ抗原内の２つ若しくは３つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する、抗体などの分子を指す。多重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト若しくはサル、例えば、カニクイザル（Macaca fascicularis）（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ、ｃｙｎｏ）若しくはチンパンジー（Pan troglodytes）などの他の種に由来する同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有し得るか、又は２つ若しくは３つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合し得る。
【0098】
「ナチュラルキラー細胞」及び「ＮＫ細胞」は、本明細書では互換的かつ同義的に使用される。本明細書で使用するとき、ＮＫ細胞は、ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋及び／又はＣＤ５７＋ＴＣＲ－表現型を有する分化リンパ球を指す。ＮＫ細胞は、特定の細胞溶解性酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合し、死滅させる能力、腫瘍細胞又はＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する他の疾患細胞を死滅させる能力、及び免疫応答を刺激又は阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を特徴とする。
【0099】
「動作可能に連結された」及び類似の語句は、核酸又はアミノ酸に関して使用される場合、それぞれ、互いに機能的な関係で配置された核酸配列又はアミノ酸配列の動作上の連結を指す。例えば、動作可能に連結されたプロモータ、エンハンサエレメント、オープンリーディングフレーム、５’及び３’ＵＴＲ、並びにターミネータ配列は、核酸分子（例えば、ＲＮＡ）の正確な産生をもたらし、場合によっては、ポリペプチドの産生（すなわち、オープンリーディングフレームの発現）をもたらす。「動作可能に連結されたペプチド」は、ペプチドの機能ドメインが互いに適切な距離で配置されて、各ドメインの意図された機能を付与するペプチドを指す。
【0100】
「医薬的組み合わせ」は、一緒に又は別個にのいずれかで投与される、２つ又は３つ以上の活性成分の組み合わせを指す。
【0101】
「医薬組成物」は、活性成分と医薬的に許容される担体とを組み合わせて得られる組成物を指す。
【0102】
「医薬的に許容される担体」又は「賦形剤」は、対象に対して毒性のない、活性成分以外の医薬組成物中の成分を指す。例示的な医薬的に許容される担体は、緩衝液、安定剤、又は防腐剤である。
【0103】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、糖－リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学によって共有結合されたヌクレオチド鎖を含む、合成分子を指す。ｃＤＮＡは、ポリヌクレオチドの典型例である。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり得る。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖、又はより典型的には、二本鎖、又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってもよい）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語はまた、１つ若しくは２つ以上の修飾された塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由により修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含む。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾が、ＤＮＡ及びＲＮＡになされてもよく、したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと称される）も包含する。
【0104】
疾患又は障害を「予防する」、「予防すること」、「予防」、又は「予防法」は、対象において障害が発生するのを防ぐことを意味する。
【0105】
「増殖」は、細胞の対称的又は非対称的な分裂のいずれかである細胞分裂の増加を指す。
【0106】
「プロモータ」は、転写を開始させるために必要な最小配列を指す。プロモータはまた、それぞれ、転写を増強又は抑制するエンハンサ又はリプレッサエレメントを含み得る。
【0107】
本明細書では互換的に使用される「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、各々がペプチド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸残基で構成された１つ又は２つ以上のポリペプチドを含む分子を指す。タンパク質は、モノマーであり得るか、又は同一若しくは異なる２つ若しくは３つ以上のサブユニットのタンパク質複合体であり得る。５０個未満のアミノ酸からなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。タンパク質は、異種融合タンパク質、糖タンパク質、又はリン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、グリコシル化、酸化、ホルミル化、アミド化、シトルリン化、ポリグルタミル化、ＡＤＰ－リボシル化、ペグ化又はビオチン化などの翻訳後修飾によって修飾されたタンパク質であり得る。タンパク質は、組換え発現され得る。
【0108】
「組換え体」は、組換え手段によって調製、発現、創出、又は単離されているポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、ウイルス、及び他の巨大分子を指す。
【0109】
「調節エレメント」は、核酸配列の発現のある側面を制御する任意のシス又はトランス作用性遺伝要素を指す。
【0110】
「再発性」は、治療法による以前の治療後の改善期間後に疾患又は疾患の徴候及び症状が再開することを指す。
【0111】
「難治性」は、治療に応答しない疾患を指す。難治性疾患は、治療前若しくは治療開始時に治療に抵抗性であり得るか、又は難治性疾患は、治療中に抵抗性疾患となり得る。
【0112】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む少なくとも１つの抗体断片と、を含む融合タンパク質を指し、ＶＬ及びＶＨは、ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現することができる。特に指定されない限り、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨ可変領域をいずれの順序で有していてもよく、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでいてもよく、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでいてもよい。ｓｃＦｖは、実施例２のように、ステープルされた単鎖Ｆｖであってもよい。
【0113】
「特異的に結合する」、「特異的結合」、「特異的に結合している」、又は「結合する」は、タンパク質性分子が、抗原又は抗原内のエピトープに、他の抗原に対する親和性よりも高い親和性で結合することを指す。典型的には、タンパク質性分子は、約１×１０－７Ｍ以下、例えば約５×１０－８Ｍ以下、約１×１０－８Ｍ以下、約１×１０－９Ｍ以下、約１×１０－１０Ｍ以下、約１×１０－１１Ｍ以下、又は約１×１０－１２Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で抗原又は抗原内のエピトープに結合し、典型的には、ＫＤは、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのＫＤよりも少なくとも１００倍小さい。本明細書に記載のＣＤ７９ｂ抗原の文脈において、「特異的結合」は、タンパク質性分子が、ＣＤ７９ｂ抗原がそのバリアントである野生型タンパク質に検出可能に結合することなく、ＣＤ７９ｂ抗原に結合することを指す。
【0114】
「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」としては、あらゆる脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳類及び非哺乳類が挙げられる。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
【0115】
「実質的に同じ」の意味は、この用語が使用される文脈に応じて異なる場合がある。重鎖及び軽鎖並びにこれらをコードする遺伝子中には天然の配列バリエーションが存在し得ることから、本明細書に記載されたアミノ酸配列又は抗体若しくは抗原結合断片をコードする遺伝子内には、固有の結合特性（例えば、特異的及び親和性）にはほとんど影響しない、又は影響しない、ある程度のバリエーションが見られることが予測される。このような予測は、部分的には、遺伝暗号の縮重及び保存的アミノ酸配列バリエーションの進化的成功により、同バリエーションは、コードされたタンパク質の性質を認識され得るほどには改変させない。したがって、核酸配列の文脈において、「実質的に同じ」は、２つ又は３つ以上の配列間での少なくとも６５％の同一性を意味する。好ましくは、この用語は、２つ又は３つ以上の配列間での少なくとも７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも７５％の同一性、より好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９１％の同一性、より好ましくは、少なくとも９２％の同一性、より好ましくは、少なくとも９３％の同一性、より好ましくは、少なくとも９４％の同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９６％の同一性、より好ましくは、少なくとも９７％の同一性、より好ましくは、少なくとも９８％の同一性、及びより好ましくは、少なくとも９９％又はそれ以上の同一性を意味する。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップ数及び各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一の位置の数の関数であり（すなわち、相同性の割合（％）＝同一位置数／位置の総数×１００）同考慮は、２つの配列の最適なアライメントを導くのに必要である。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性パーセントは、例えば、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ ４，１１－１７（１９８８）のアルゴリズムを使用して決定されてもよく、同アルゴリズムは、ＰＡＭ１２０重み付け残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４４－４５３（１９７０）のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。
【0116】
「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」は、互換的であり、本明細書では同義的に使用される。Ｔ細胞には、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、メモリＴ細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、又は活性化Ｔリンパ球が含まれる。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（T helper、Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）又はＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。また、「ＮＫＴ細胞」も含まれ、これは、セミインバリアントなαβＴ細胞受容体を発現するだけでなく、ＮＫ１．１などの典型的にはＮＫ細胞に関連する様々な分子マーカーも発現する、Ｔ細胞の特殊な集団を指す。ＮＫＴ細胞には、ＮＫ１．１＋及びＮＫ１．１－、並びにＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋、及びＣＤ８－細胞が含まれる。ＮＫＴ細胞のＴＣＲは、ＭＨＣ Ｉ様分子ＣＤ Ｉｄによって提示される糖脂質抗原を認識するという点で独特である。ＮＫＴ細胞は、炎症又は免疫寛容のいずれかを促進するサイトカインを産生する能力により、保護効果又は有害効果のいずれかを有し得る。また、「ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）」も含まれ、これは、それらの表面に異なるＴＣＲを有するＴ細胞の小さなサブセットの特殊な集団を指し、ＴＣＲがα及びβ－ＴＣＲ鎖と表記される２つの糖タンパク質鎖から構成されるＴ細胞の大部分とは異なり、γδＴ細胞におけるＴＣＲは、γ鎖及びδ鎖から構成される。γδＴ細胞は、免疫監視及び免疫調節においてある役割を果たすことができ、ＩＬ－１７の重要な供給源であること、及び強力なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することが見出された。また、「調節性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」も含まれ、これは、異常又は過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容における役割を果たす、Ｔ細胞を指す。Ｔｒｅｇは、典型的には、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞であり、かつ、ＩＬ－１０産生ＣＤ４＋Ｔ細胞である転写因子Ｆｏｘｐ３陰性調節性Ｔ細胞も含み得る。
【0117】
本明細書において互換的に使用される「治療有効量」又は「有効量」は、所望の治療結果を達成するのに必要な投薬量及び期間で有効な量を指す。治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、及び体重などの要因、並びに個体において所望の応答を引き出す治療法又は治療法の組み合わせの能力によって様々であってもよい。有効な治療法又は治療法の組み合わせの例示的な指標としては、例えば、患者の健康状態の改善、腫瘍量の低減、腫瘍の成長の停止若しくは鈍化、及び／又は体内の他の場所へのがん細胞の転移の非存在が含まれる。
【0118】
「形質導入」は、ウイルスベクターを使用する、外来核酸の細胞への導入を指す。
【0119】
がんなどの疾患又は障害を「治療する」、「治療すること」、又は「治療」は、以下：障害の重症度及び／若しくは期間を低減する、治療される障害の特徴的な症状の悪化を阻害する、以前障害を有していた対象における障害の再発を制限若しくは予防する、又は以前に障害の症状を有していた対象における症状の再発を制限若しくは予防する、のうちの１つ又は２つ以上を達成することを指す。
【0120】
「バリアント」、「変異体」、又は「改変された」は、１つ又は２つ以上の修飾、例えば、１つ又は２つ以上の置換、挿入、又は欠失によって、参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なる、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
【0121】
本明細書全体を通して、抗体定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、本明細書に別途明示的に記載のない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のＥＵインデックスに従う。
【0122】
Ｉｇ定常領域の変異は、以下のように称される：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖは、１つの免疫グロブリン定常領域におけるＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を指す。Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗは、１つの多量体タンパク質中に存在する、第１のＩｇ定常領域におけるＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異並びに第２のＩｇ定常領域におけるＴ３９４Ｗ変異を指す。
【0123】
したがって、ＣＤ７９Ｂを標的とする抗体又は抗原結合ドメインは、ＢＣＲ複合体に薬剤を送達することができる。したがって、ＣＤ７９Ｂ標的化分子は、天然に存在する阻害タンパク質をＢＣＲ複合体に動員して、異常なＢ細胞活性化を阻害するための二重特異性薬剤の生成において有用である。例えば、ＣＤ７９Ｂ及び阻害性Ｆｃガンマ受容体ＣＤ３２Ｂの両方を認識する抗原結合ドメインを有する二重特異性二重親和性再標的化（dual-affinity retargeting、ＤＡＲＴ）分子は、Ｂ細胞活性化を阻害し、Ｂ細胞増殖及び免疫グロブリン分泌の低減によってモニタリングされる。ＣＤ７９ｂ及びＣＤ３２Ｂの両方を認識する同様の二重特異性分子は、自己免疫性関節炎の前臨床モデルにおいて発症を遅延させ、疾患重症度を低減させ、ＢＣＲへの阻害性タンパク質のＣＤ７９ｂ媒介性動員が、自己免疫性疾患を有する患者に治療的利益を提供し得ることを示した（Ｖｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，６２：１９３３－１９４３）。ＣＤ７９Ｂ標的化二重特異性抗体又は抗原結合ドメインは、ＣＤ２２又はＳｉｇｌｅｃ－１０などのＳｉｇｌｅｃファミリーのメンバーを含む、Ｂ細胞の表面上に発現される他の阻害性分子を標的とすることもでき、これは、ＢＣＲ媒介性シグナル伝達を阻害することも実証されている（Ｄｕａｎ＆Ｐａｕｌｓｏｎ ２０２０，Ａｎｎ．Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３８（１）：３６５－３６９）。
【0124】
ＣＤ７９Ｂ標的化抗体又は抗原結合ドメインは、様々な形態のがんの治療にも有用であり得る。例えば、ポラツズマブベドチン、抗ＣＤ７９ｂ抗体薬物コンジュゲートは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者（ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＤＬＢＣＬ）の治療のために承認されている（Ｗａｌｊｉ ２０２０、ＰＭＩＤ：３２７００５８６；ＤＯＩ：１０．１０８０／１７４７４０８６．２０２０－１７９５８２８に概説されている）。加えて、ＣＤ７９Ｂに結合するキメラ抗原受容体を発現する操作されたＴ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）は、ＣＤ７９Ｂ発現Ｂ細胞リンパ腫細胞をインビトロ及びインビボで排除した（Ｄｉｎｇ ２０２０，ＰＭＩＤ：３２４９５１６１ ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１１５２３－０２０－００７２９－７；Ｊｉａｎｇ ２０２０，ＰＭＩＤ：３１６２４３７４ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１３７５－０１９－０６０７－５；Ｏｒｍｈｏｊ２０１９，ＰＭＩＤ：３１４３９５７７ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６８９１１６３ ＤＯＩ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１９－１３３７）。
【0125】
抗体
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ７９ｂに結合する抗体、その結合断片、前述のものをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びに前述のものを作製及び使用する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ２２に結合する抗体、その結合断片、前述のものをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びに前述のものを作製及び使用する方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ（ステープルされたｓｃＦｖ（ｓｐＦｖ）を含む）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖフォーマットに操作され得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ７９ｂに結合する抗体、その結合断片、前述のものをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びに前述のものを作製及び使用する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ２２に結合する抗体、その結合断片、前述のものをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びに前述のものを作製及び使用する方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ（ステープルされたｓｃＦｖ（ｓｐＦｖ）を含む）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖフォーマットに操作され得る。
【0126】
一態様では、本開示は、ＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインを含む組成物を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ２２に結合する抗原結合ドメイン（すなわち、ＣＤ２２結合ドメイン）を含む抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインは、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、配列番号１のＨＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号２のＨＣＤＲ２を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号３のＨＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインは、それぞれ配列番号１、２及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ及びＨＣＤＲ３を含む。
【0127】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインは、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号４のＬＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号５のＬＣＤＲ２を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号６のＬＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインは、それぞれ配列番号４、５及び６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【0128】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインは、それぞれ配列番号１、２、３、４、５、及び６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ、及びＬＣＤＲ３を含む。
【0129】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号８の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【0130】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、及び配列番号８のＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号７のＶＨ、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む。
【0131】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
【0132】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインを含む抗体は、ｓｃＦｖである。
【0133】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインを含む抗体は、（ｓｃＦｖ）２である。
【0134】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインを含む抗体は、Ｆｖである。
【0135】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインを含む抗体は、Ｆａｂである。
【0136】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインを含む抗体は、Ｆ（ａｂ’）２である。
【0137】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインを含む抗体は、Ｆｄである。
【0138】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインを含む抗体は、ｄＡｂである。
【0139】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合ドメインを含む抗体は、ＶＨＨである。
【0140】
一態様では、本開示は、ＣＤ７９ｂに結合する抗原結合ドメインを含む組成物を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ７９ｂに結合する抗原結合ドメイン（すなわち、ＣＤ７９ｂ結合ドメイン）を含む抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９又は５７のＨＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０又は５８のＨＣＤＲ２を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１又は５９のＨＣＤＲ３を含む。
【0141】
一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９又は５７のＨＣＤＲ１、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０又は５８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１又は５９のＨＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、以下：
それぞれ配列番号９、１０、及び１１、
それぞれ配列番号１７、１８、及び１９、
それぞれ配列番号２５、２６、及び２７、
それぞれ配列番号３３、３４、及び３５、
それぞれ配列番号４１、４２、及び４３、
それぞれ配列番号４９、５０、及び５１、又は
それぞれ配列番号５７、５８、及び５９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。
それぞれ配列番号９、１０、及び１１、
それぞれ配列番号１７、１８、及び１９、
それぞれ配列番号２５、２６、及び２７、
それぞれ配列番号３３、３４、及び３５、
それぞれ配列番号４１、４２、及び４３、
それぞれ配列番号４９、５０、及び５１、又は
それぞれ配列番号５７、５８、及び５９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。
【0142】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２又は６０のＬＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３又は６１のＬＣＤＲ２を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４又は６２のＬＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、以下：
それぞれ配列番号１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号６０、６１、及び６２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
それぞれ配列番号１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号６０、６１、及び６２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【0143】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９又は５７のＨＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０又は５８のＨＣＤＲ２を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１又は５９のＨＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２又は６０のＬＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３又は６１のＬＣＤＲ２を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４又は６２のＬＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、以下：
それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号１７、１８、１９、２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３３、３４、３５、３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４１、４２、４３、４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号４９、５０、５１、５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号５７、５８、５９、６０、６１、及び６２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号１７、１８、１９、２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３３、３４、３５、３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４１、４２、４３、４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号４９、５０、５１、５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号５７、５８、５９、６０、６１、及び６２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【0144】
一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、ＶＨを含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、配列番号１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３又は８０のＶＨを含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、ＶＬを含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂドメインは、配列番号１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４又は８１のＶＬを含む。
【0145】
一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９又は５７のＨＣＤＲ１、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０又は５８のＨＣＤＲ２、配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１又は５９のＨＣＤＲ３及び配列番号１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４又は８１のＶＬを含む。
【0146】
一実施形態では、ＣＤ７９ｂドメインは、配列番号１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３又は８０のＶＨ、配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２又は６０のＬＣＤＲ１、配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３又は６１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４、又は６２のＬＣＤＲ３を含む。
【0147】
一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬを含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインは、以下：
それぞれ配列番号１５及び１６、
それぞれ配列番号２３及び２４、
それぞれ配列番号３１及び３２、
それぞれ配列番号３９及び４０、
それぞれ配列番号４７及び４８、
それぞれ配列番号５５及び５６、
それぞれ配列番号６３及び６４、又は
それぞれ配列番号８０及び８１のＶＨ及びＶＬを含む。
それぞれ配列番号１５及び１６、
それぞれ配列番号２３及び２４、
それぞれ配列番号３１及び３２、
それぞれ配列番号３９及び４０、
それぞれ配列番号４７及び４８、
それぞれ配列番号５５及び５６、
それぞれ配列番号６３及び６４、又は
それぞれ配列番号８０及び８１のＶＨ及びＶＬを含む。
【0148】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインを含む抗体は、ｓｃＦｖである。
【0149】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインを含む抗体は、（ｓｃＦｖ）２である。
【0150】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインを含む抗体は、Ｆｖである。
【0151】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインを含む抗体は、Ｆａｂである。
【0152】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインを含む抗体は、Ｆ（ａｂ’）２である。
【0153】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインを含む抗体は、Ｆｄである。
【0154】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインを含む抗体は、ｄＡｂである。
【0155】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインを含む抗体は、ＶＨＨである。
【0156】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合ドメインを含む抗体は、ステープルされたｓｃＦｖ（ｓｐＦｖ）である。
【0157】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、以下：
それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号１７、１８、１９、２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３３、３４、３５、３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４１、４２、４３、４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号４９、５０、５１、５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号５７、５８、５９、６０、６１、及び６２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、ｓｃＦｖである。
それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号１７、１８、１９、２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３３、３４、３５、３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４１、４２、４３、４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号４９、５０、５１、５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号５７、５８、５９、６０、６１、及び６２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、ｓｃＦｖである。
【0158】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＶＨを含むｓｃＦｖである。一実施形態では、ｓｃＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、又は８０のＶＨを含む。一実施形態では、ｓｃＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＶＬを含む。一実施形態では、ｓｃＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４又は８１のＶＬを含む。
【0159】
一実施形態では、ｓｃＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９又は５７のＨＣＤＲ１、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０又は５８のＨＣＤＲ２、配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１又は５９のＨＣＤＲ３、及び配列番号１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４又は８１のＶＬを含む。
【0160】
一実施形態では、ｓｃＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３又は８０のＶＨ、配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２又は６０のＬＣＤＲ１、配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３又は６１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４、又は６２のＬＣＤＲ３を含む。
【0161】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＶＨ及びＶＬを含むステープルされたｓｃＦｖ（ｓｐＦｖ）である。一実施形態では、ｓｐＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号８０のＶＨ及び配列番号８１のＶＬを含む。一実施形態では、ｓｐＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号８２のＶＨ及びＶＬ並びにリンカーを含む。一実施形態では、ｓｐＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号７９を含む。
【0162】
一実施形態では、本開示は、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ２２に結合する多重特異性抗体、その多重特異性結合断片、前述のものをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びに前述のものを作製及び使用する方法を提供する。このような抗体又は抗体断片は、これらの標的のうちの１つのみを標的とする抗体と比較して、細胞の特定のサブセットへのより特異的な標的化を可能にし得る。
【0163】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ２２に結合する二重特異的抗体、並びにその二重特異的結合断片が本明細書に提供される。これは、ＣＤ７９ｂに特異的に結合する第１の領域及びＣＤ２２に特異的に結合する第２の結合領域を含む分子を作製することにより達成される。抗原結合領域は、標的の特異的な認識を可能にする任意の形態をとることができ、例えば、結合領域は、重鎖可変ドメイン、Ｆｖ（重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの組み合わせ）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づいた結合ドメイン（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．のＣｅｎｔｙｒｉｎ分子など、フィブロネクチンからか若しくはフィブロネクチンからのＩＩＩ型ドメインのコンセンサスに基づいたもの、又はテネイシンからか若しくはテネイシン由来のＩＩＩ型ドメインのコンセンサスに基づいたもの、例えば、国際公開第２０１０／０５１２７４号及び国際公開第２０１０／０９３６２７号を参照されたい）であっても、これらを含んでいてもよい。したがって、それぞれＣＤ７９ｂ及びＣＤ２２に結合する２種類の異なる抗原結合領域を含む二重特異性分子が提供される。
【0164】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２２多重特異性抗体は、第１の抗原に結合する第１の抗原結合部位を含む第１の抗原結合アームと、第２の抗原に結合する第２の抗原結合部位を含む第２の抗原結合アームと、を含む。第１及び第２の抗原結合アームは各々、ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む断片結晶化可能（Ｆｃ）ドメインを含み得る。
【0165】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２２二重特異性抗体は、ＣＤ７９ｂに結合する第１の抗原結合部位を含む第１の抗原結合アームを含むＣＤ７９ｂ特異的アームと、ＣＤ２２に結合する第２の抗原結合部位を含む第２の抗原結合アームを含むＣＤ２２特異的アームと、を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２２二重特異性抗体は、ＣＤ２２に結合する抗原結合部位を含むＣＤ２２特異的アームと、ＣＤ７９ｂに結合する抗原結合部位を含むＣＤ７９ｂ特異的アームと、を含む。
【0166】
いくつかの実施形態では、第１の抗体結合部位は、一本鎖可変断片（single-chain variable fragment、ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、ステープルされた一本鎖可変断片（stapled single-chain variable fragment、ｓｐＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位は、抗原結合断片（Ｆａｂ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部位は、抗原結合断片（Ｆａｂ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部位は、一本鎖可変断片（single-chain variable fragment、ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部位は、ステープルされた一本鎖可変断片（stapled single-chain variable fragment、ｓｐＦｖ）を含む。
【0167】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ×ＣＤ２２多重特異性抗体は、第１の抗原に結合する抗原結合部位を形成する重鎖可変（ＶＨ１）及び軽鎖可変（ＶＬ１）ドメインを含むｓｃＦｖを含む第１の抗原結合アームと、第２の抗原に結合する第２の抗原結合部位を形成する重鎖可変（ＶＨ２）及び軽鎖可変（ＶＬ２）ドメインを含むＦａｂを含む第２の抗原結合アームと、を含む。第１及び第２の抗原結合アームは各々、断片結晶化可能Ｆｃ）ドメインを含み得る。
【0168】
一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、抗原結合断片（Ｆａｂ）を含み、ＣＤ２２結合アームは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。
【0169】
一実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、抗原結合断片（Ｆａｂ）を含み、ＣＤ７９ｂ結合アームは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。
【0170】
一実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、抗原結合断片（Ｆａｂ）を含み、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ステープルされた一本鎖可変断片（ｓｐＦｖ）を含む。
【0171】
いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、完全長の抗体構造を有する抗体を含む。本明細書で使用されるとき、「完全長の抗体」は、２本の完全長の抗体重鎖と２本の完全長の抗体軽鎖とを有する抗体を意味する。完全長の抗体重鎖（ＨＣ）は、重鎖可変ドメイン及び定常ドメイン、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。完全長の抗体軽鎖（ＬＣ）は、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメイン、ＶＬ及びＣＬを含む。完全長抗体は、一方又は両方の重鎖のいずれかにおいて、Ｃ末端リジン（Ｋ）を欠いていてもよい。「Ｆａｂアーム」又は「半分子」という用語は、抗原に結合する一対の重鎖－軽鎖を指す。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインのうちの１つは、非抗体ベースの結合ドメイン、例えば、フィブロネクチン３型ドメインに基づいた結合ドメイン、例えば、Ｃｅｎｔｙｒｉｎである。
【0172】
ＣＤ２２結合アーム
一実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、ＣＤ２２に特異的な抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、ヒトＣＤ２２に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、ＣＤ２２細胞外ドメイン（extracellular domain、ＥＣＤ）からの１つ又は２つ以上の残基を含むエピトープに結合する。そのようなＣＤ２２結合アームは、５×１０－７Ｍ以下、例えば、１×１０－７Ｍ以下、５×１０－８Ｍ以下、１×１０－８Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、１×１０－９Ｍ、又は５×１０－１０Ｍ以下の親和性でＣＤ２２に結合し得る。一実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、約１×１０－１１Ｍ～１×１０－９Ｍの親和性でＣＤ２２に結合する。一実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、約１×１０－１１Ｍ、約２×１０－１１Ｍ、約３×１０－１１Ｍ、約４×１０－１１Ｍ、約５×１０－１１Ｍ、約６×１０－１１Ｍ、約７×１０－１１Ｍ、約８×１０－１１Ｍ、約９×１０－１１Ｍ、１×１０－１０Ｍ、約２×１０－１０Ｍ、約３×１０－１０Ｍ、約４×１０－１０Ｍ、約５×１０－１０Ｍ、約６×１０－１０Ｍ、約７×１０－１０Ｍ、約８×１０－１０Ｍ、約９×１０－１０Ｍ、又は約１×１０－９Ｍの親和性でＣＤ２２に結合する。
一実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、ＣＤ２２に特異的な抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、ヒトＣＤ２２に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、ＣＤ２２細胞外ドメイン（extracellular domain、ＥＣＤ）からの１つ又は２つ以上の残基を含むエピトープに結合する。そのようなＣＤ２２結合アームは、５×１０－７Ｍ以下、例えば、１×１０－７Ｍ以下、５×１０－８Ｍ以下、１×１０－８Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、１×１０－９Ｍ、又は５×１０－１０Ｍ以下の親和性でＣＤ２２に結合し得る。一実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、約１×１０－１１Ｍ～１×１０－９Ｍの親和性でＣＤ２２に結合する。一実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、約１×１０－１１Ｍ、約２×１０－１１Ｍ、約３×１０－１１Ｍ、約４×１０－１１Ｍ、約５×１０－１１Ｍ、約６×１０－１１Ｍ、約７×１０－１１Ｍ、約８×１０－１１Ｍ、約９×１０－１１Ｍ、１×１０－１０Ｍ、約２×１０－１０Ｍ、約３×１０－１０Ｍ、約４×１０－１０Ｍ、約５×１０－１０Ｍ、約６×１０－１０Ｍ、約７×１０－１０Ｍ、約８×１０－１０Ｍ、約９×１０－１０Ｍ、又は約１×１０－９Ｍの親和性でＣＤ２２に結合する。
【0173】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、配列番号１のＨＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、配列番号２のＨＣＤＲ２を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、配列番号３のＨＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、それぞれ配列番号１、２、及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ、及びＨＣＤＲ３を含む。
【0174】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、配列番号４のＬＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、配列番号５のＬＣＤＲ２を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、配列番号６のＬＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、それぞれ配列番号４、５、及び６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【0175】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、それぞれ配列番号１、２、３、４、５、及び６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ、及びＬＣＤＲ３を含む。
【0176】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、配列番号７の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、配列番号８の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【0177】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、及び配列番号８のＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、配列番号７のＶＨ、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む。
【0178】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
【0179】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、ｓｃＦｖである。
【0180】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、（ｓｃＦｖ）２である。
【0181】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、Ｆｖである。
【0182】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、Ｆａｂである。
【0183】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、Ｆ（ａｂ’）２である。
【0184】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、Ｆｄである。
【0185】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、ｄＡｂである。
【0186】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、ＶＨＨである。
【0187】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、ヒト化抗原結合断片を含む。ヒト化抗体結合断片は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最少配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖若しくは断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体の他の抗原結合配列）に由来してもよい。ほとんどの場合、ヒト化抗体又は抗体結合断片は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、又はウサギのＣＤＲからの残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一般的には、ヒト化抗体結合断片は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むこととなり、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全て又は実質的に全てのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体抗原結合断片は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含み得る。
【0188】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、（ｓｃＦｖ）２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、Ｆｖを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、Ｆ（ａｂ’）２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、Ｆｄを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、ｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、ＶＨＨを含む。
【0189】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、ＩｇＧ又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である。ＣＤ２２結合アームがＩｇＧ４アイソタイプを有するいくつかの実施形態では、それは、そのＦｃ領域中にＳ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換を含有する。
【0190】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、Ｆｃドメインを含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ヘテロ二量体化を促進する、Ｆｃγ受容体へのＦｃ結合を低減させる、プロテインＡへのＦｃ結合を低減させる、多特異性結合分子の半減期を延長する、又はそれらの任意の組み合わせのための少なくとも１つの変異を含む。ヘテロ二量体化を促進するための例示的な変異としては、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖが挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｃγ受容体へのＦｃ結合を低減させるための例示的な変異としては、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓが挙げられるが、これらに限定されない。プロテインＡへのＦｃ結合を低減させるための例示的な変異としては、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆが挙げられるが、これらに限定されない。半減期を延長するための例示的な変異としては、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【0191】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、配列番号８５又はその誘導体を含むＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ｓ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｈ４３５Ｒ、及びＹ４３６Ｆ置換のうちの少なくとも１つを含むＦｃドメインの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ｓ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｈ４３５Ｒ、及びＹ４３６Ｆ置換の各々を含むＦｃドメインの誘導体を含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、配列番号９０に記載のバリアントＩｇＧを含む。
【0192】
ＣＤ７９ｂ結合アーム
一実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、ＣＤ７９ｂに特異的な抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ヒトＣＤ７９ｂに結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ヒトＣＤ７９ｂ及びカニクイザルＣＤ７９ｂに結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ヒトＣＤ７９ｂに結合するが、カニクイザルＣＤ７９ｂには結合しない。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＣＤ７９ｂ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からの１つ又は２つ以上の残基を含むエピトープに結合する。そのようなＣＤ７９ｂ結合アームは、５×１０－７Ｍ以下、例えば、１×１０－７Ｍ以下、５×１０－８Ｍ以下、１×１０－８Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、１×１０－９Ｍ、又は５×１０－１０Ｍ以下の親和性でＣＤ７９ｂに結合し得る。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、約１×１０－１１Ｍ～１×１０－９Ｍの親和性でＣＤ７９ｂに結合する。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、約１×１０－１１Ｍ、約２×１０－１１Ｍ、約３×１０－１１Ｍ、約４×１０－１１Ｍ、約５×１０－１１Ｍ、約６×１０－１１Ｍ、約７×１０－１１Ｍ、約８×１０－１１Ｍ、約９×１０－１１Ｍ、１×１０－１０Ｍ、約２×１０－１０Ｍ、約３×１０－１０Ｍ、約４×１０－１０Ｍ、約５×１０－１０Ｍ、約６×１０－１０Ｍ、約７×１０－１０Ｍ、約８×１０－１０Ｍ、約９×１０－１０Ｍ、又は約１×１０－９Ｍの親和性でＣＤ７９ｂに結合する。
一実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、ＣＤ７９ｂに特異的な抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ヒトＣＤ７９ｂに結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ヒトＣＤ７９ｂ及びカニクイザルＣＤ７９ｂに結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ヒトＣＤ７９ｂに結合するが、カニクイザルＣＤ７９ｂには結合しない。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＣＤ７９ｂ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からの１つ又は２つ以上の残基を含むエピトープに結合する。そのようなＣＤ７９ｂ結合アームは、５×１０－７Ｍ以下、例えば、１×１０－７Ｍ以下、５×１０－８Ｍ以下、１×１０－８Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、１×１０－９Ｍ、又は５×１０－１０Ｍ以下の親和性でＣＤ７９ｂに結合し得る。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、約１×１０－１１Ｍ～１×１０－９Ｍの親和性でＣＤ７９ｂに結合する。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、約１×１０－１１Ｍ、約２×１０－１１Ｍ、約３×１０－１１Ｍ、約４×１０－１１Ｍ、約５×１０－１１Ｍ、約６×１０－１１Ｍ、約７×１０－１１Ｍ、約８×１０－１１Ｍ、約９×１０－１１Ｍ、１×１０－１０Ｍ、約２×１０－１０Ｍ、約３×１０－１０Ｍ、約４×１０－１０Ｍ、約５×１０－１０Ｍ、約６×１０－１０Ｍ、約７×１０－１０Ｍ、約８×１０－１０Ｍ、約９×１０－１０Ｍ、又は約１×１０－９Ｍの親和性でＣＤ７９ｂに結合する。
【0193】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９、又は５７のＨＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０、又は５８のＨＣＤＲ２を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１、又は５９のＨＣＤＲ３を含む。
【0194】
一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９、又は５７のＨＣＤＲ１、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０、又は５８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１、又は５９のＨＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、以下：
それぞれ、配列番号９、１０、及び１１、
それぞれ配列番号１７、１８、及び１９、
それぞれ配列番号２５、２６、及び２７、
それぞれ配列番号３３、３４、及び３５、
それぞれ配列番号４１、４２、及び４３、
それぞれ配列番号４９、５０、及び５１、又は
それぞれ配列番号５７、５８、及び５９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。
それぞれ、配列番号９、１０、及び１１、
それぞれ配列番号１７、１８、及び１９、
それぞれ配列番号２５、２６、及び２７、
それぞれ配列番号３３、３４、及び３５、
それぞれ配列番号４１、４２、及び４３、
それぞれ配列番号４９、５０、及び５１、又は
それぞれ配列番号５７、５８、及び５９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。
【0195】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２又は６０のＬＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３又は６１のＬＣＤＲ２を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４又は６２のＬＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、以下：
それぞれ配列番号１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号６０、６１、及び６２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
それぞれ配列番号１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号６０、６１、及び６２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【0196】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９又は５７のＨＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０又は５８のＨＣＤＲ２を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１又は５９のＨＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２又は６０のＬＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３又は６１のＬＣＤＲ２を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４又は６２のＬＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、以下：
それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号１７、１８、１９、２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３３、３４、３５、３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４１、４２、４３、４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号４９、５０、５１、５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号５７、５８、５９、６０、６１、及び６２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号１７、１８、１９、２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３３、３４、３５、３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４１、４２、４３、４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号４９、５０、５１、５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号５７、５８、５９、６０、６１、及び６２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【0197】
一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＶＨを含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３又は８０のＶＨを含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＶＬを含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４又は８１のＶＬを含む。
【0198】
一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９又は５７のＨＣＤＲ１、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０又は５８のＨＣＤＲ２、配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１又は５９のＨＣＤＲ３、及び配列番号１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４又は８１のＶＬを含む。
【0199】
一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３又は８０のＶＨ、配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２又は６０のＬＣＤＲ１、配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３又は６１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４又は６２のＬＣＤＲ３を含む。
【0200】
一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＶＨ及びＶＬを含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、以下：
それぞれ配列番号１５及び１６、
それぞれ配列番号２３及び２４、
それぞれ配列番号３１及び３２、
それぞれ配列番号３９及び４０、
それぞれ配列番号４７及び４８、
それぞれ配列番号５５及び５６、
それぞれ配列番号６３及び６４、又は
それぞれ配列番号８０及び８１のＶＨ及びＶＬを含む。
それぞれ配列番号１５及び１６、
それぞれ配列番号２３及び２４、
それぞれ配列番号３１及び３２、
それぞれ配列番号３９及び４０、
それぞれ配列番号４７及び４８、
それぞれ配列番号５５及び５６、
それぞれ配列番号６３及び６４、又は
それぞれ配列番号８０及び８１のＶＨ及びＶＬを含む。
【0201】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ｓｃＦｖである。
【0202】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、（ｓｃＦｖ）２である。
【0203】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、Ｆｖである。
【0204】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、Ｆａｂである。
【0205】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、Ｆ（ａｂ’）２である。
【0206】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、Ｆｄである。
【0207】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ｄＡｂである。
【0208】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＶＨＨである。
【0209】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ステープルされたｓｃＦｖ（ｓｐＦｖ）である。
【0210】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、以下：
それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号１７、１８、１９、２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３３、３４、３５、３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４１、４２、４３、４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号４９、５０、５１、５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号５７、５８、５９、６０、６１、及び６２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、ｓｃＦｖである。
それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号１７、１８、１９、２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３３、３４、３５、３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４１、４２、４３、４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号４９、５０、５１、５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号５７、５８、５９、６０、６１、及び６２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、ｓｃＦｖである。
【0211】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＶＨを含むｓｃＦｖである。一実施形態では、ｓｃＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３又は８０のＶＨを含む。一実施形態では、ｓｃＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＶＬを含む。一実施形態では、ｓｃＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４又は８１のＶＬを含む。
【0212】
一実施形態では、ｓｃＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９又は５７のＨＣＤＲ１、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０又は５８のＨＣＤＲ２、配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１又は５９のＨＣＤＲ３、及び配列番号１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４又は８１のＶＬを含む。
【0213】
一実施形態では、ｓｃＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３又は８０のＶＨ、配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２又は６０のＬＣＤＲ１、配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３又は６１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４又は６２のＬＣＤＲ３を含む。
【0214】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＶＨを含むステープルされたｓｃＦｖである。一実施形態では、ステープルされたｓｃＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号８０のＶＨ及び配列番号８１のＶＬを含む。一実施形態では、ステープルされたｓｃＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号８２のＶＨ及びＶＬ並びにリンカーを含む。一実施形態では、ステープルされたｓｃＦｖ ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号７９を含む。
【0215】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ヒト化抗原結合断片を含む。ヒト化抗体結合断片は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最少配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖、又はその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体の他の抗原結合配列）に由来してもよい。ほとんどの場合、ヒト化抗体又は抗体結合断片は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、又はウサギのＣＤＲからの残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一般的には、ヒト化抗体結合断片は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むこととなり、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全て又は実質的に全てのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体抗原結合断片は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含み得る。
【0216】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ｓｃＦｖ、例えば、ｓｐＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、（ｓｃＦｖ）２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、Ｆｖを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、Ｆ（ａｂ’）２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、Ｆｄを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＶＨＨを含む。
【0217】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＩｇＧ又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である。ＣＤ７９ｂ結合アームがＩｇＧ４アイソタイプを有するいくつかの実施形態では、アームは、そのＦｃ領域中にＳ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換を含有する。
【0218】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、Ｆｃドメインを含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ヘテロ二量体化を促進する、Ｆｃγ受容体へのＦｃ結合を低減させる、プロテインＡへのＦｃ結合を低減させる、多特異性結合分子の半減期を延長する、又はそれらの任意の組み合わせのための少なくとも１つの変異を含む。ヘテロ二量体化を促進するための例示的な変異としては、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖが挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｃγ受容体へのＦｃ結合を低減させるための例示的な変異としては、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓが挙げられるが、これらに限定されない。プロテインＡへのＦｃ結合を低減させるための例示的な変異としては、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆが挙げられるが、これらに限定されない。半減期を延長するための例示的な変異としては、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【0219】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号８８又はその誘導体を含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号８９に記載されるＦｃドメインを含む。
【0220】
抗体及び抗体断片
本開示のＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ２２結合アームは、標準的な方法を使用して様々な設計の単一特異性又は多重特異性タンパク質に操作され得る。本開示はまた、本開示のＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインを含む単一特異性タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、単一特異性タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、抗体である。
本開示のＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ２２結合アームは、標準的な方法を使用して様々な設計の単一特異性又は多重特異性タンパク質に操作され得る。本開示はまた、本開示のＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインを含む単一特異性タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、単一特異性タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、抗体である。
【0221】
このアプローチによって限定されないが、一般に、多重特異性抗体として抗体を構築する場合、各標的に対する結合ドメインモジュール（第１、第２、第３など）は、任意選択で、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、可変ドメイン（例えば、ＶＨ又はＶＬ）、ダイアボディ、ミニボディ、又は完全長抗体から構築される。例えば、各当該の結合ドメイン又はモジュールは、以下の非限定的なフォーマットのうちの１つ又は２つ以上で作製され、可変ドメイン、及び／又は完全長抗体、及び／又は抗体断片を含む結合ドメインは、多重特異性抗体を生成するように直列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、二重特異性である。
【0222】
一実施形態では、ＣＤ７９ｂを標的とする少なくとも１つの第１の抗体由来結合ドメインを含み、かつＣＤ２２を標的とする少なくとも１つの第２の抗体結合ドメインに作動可能に連結されている多重特異性抗体が提供される。任意選択で、結合ドメインは、少なくとも１つ若しくは２つ以上のＶＨ及び同族ＶＬ結合ドメイン、又は１つ若しくは２つ以上のＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ２及び同族ＶＬ－ＣＬ結合ドメイン、又は１つ若しくは２つ以上の抗体断片結合ドメインを含む。
【0223】
また、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に結合する本明細書で同定されたＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれも、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖフォーマットに操作され得、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２へのそれらの結合は、本明細書に記載されるアッセイを使用して評価することができる。
【0224】
例えば、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に結合する本明細書で同定されたＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれも、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれかのｓｃＦｖフォーマットに操作され得る。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖフォーマットは、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれかである。また、本明細書で同定されたＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれも、ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ、ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ、ＶＨ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＬ、ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ、ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ、又はＶＬ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＨなどのｓｃ（Ｆｖ）２構造を生成するために使用され得る。
【0225】
本明細書で同定されたＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ｓｃＦｖフォーマットに組み込むことができ、得られたｓｃＦｖのＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２への結合及び熱安定性は、既知の方法を使用して評価することができる。結合は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、若しくはＫｉｎＥｘＡ機器、ＥＬＩＳＡ、又は当業者に既知の競合的結合アッセイを使用して評価することができる。結合は、精製されたｓｃＦｖ又は大腸菌上清、又は発現したｓｃＦｖを含有する溶解細胞を使用して評価することができる。試験ｓｃＦｖのＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に対する親和性の測定値は、異なる条件（例えば、モル浸透圧濃度、ｐＨ）下で測定した場合、異なり得る。したがって、親和性及びその他の結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、通常、標準的な条件、及び標準化緩衝液を用いて行われる。熱安定性は、５０℃、５５℃、又は６０℃などの高温で、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、又は３０分などの期間、試験ｓｃＦｖを加熱し、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２への試験ｓｃＦｖの結合を測定することによって評価し得る。非加熱ｓｃＦｖサンプルと比較したときに、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２への同等の結合を保持しているｓｃＦｖが、熱安定性であると称される。
【0226】
組換え発現系にて、リンカーはペプチドリンカーであり、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。リンカーに含まれ得る例示的なアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ及びＴｈｅである。リンカーは、ＣＤ７９ｂへの結合などの所望の活性を保持するように、互いに対して正確な高次構造を形成するような方式でＶＨ及びＶＬを連結させるのに適切である長さを有している必要がある。
【0227】
リンカーは、約５～５０個のアミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～４０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～３５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～３０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～２５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１５～２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、４０個のアミノ酸長である。使用され得る例示的なリンカーは、Ｇｌｙリッチリンカー、Ｇｌｙ及びＳｅｒ含有リンカー、Ｇｌｙ及びＡｌａ含有リンカー、Ａｌａ及びＳｅｒ含有リンカー、並びに他の柔軟なリンカーである。
【0228】
他のリンカー配列は、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖アイソタイプに由来する免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＬ又はＣＨ１の部分を含み得る。代替的に、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含む様々な非タンパク質性ポリマーは、リンカーとしての使用が見出され得る。追加のリンカーは、例えば、国際特許公開第２０１９／０６０６９５号に記載されている。
【0229】
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む。
【0230】
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、約５～５０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、約５～４０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、約１０～３０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、約１０～２０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号９１～１２５のアミノ酸配列を含む。
【0231】
多特異性抗体
いくつかの実施形態では、抗原結合アームは、二重可変ドメイン免疫グロブリン（Dual Variable Domain Immunoglobulins、ＤＶＤ）に組み込まれ得る（国際特許公開第２００９／１３４７７６号、ＤＶＤは、ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２－ＣＨ構造を有する重鎖と、ＶＬ１－リンカー－ＶＬ２－ＣＬ構造を有する軽鎖とを含む完全長抗体であり、リンカーは任意選択である）、異なる特異性を有する２つの抗体アームを結合するための様々な二量化ドメインを含む構造、例えば、ロイシンジッパー又はコラーゲン二量化ドメイン（国際特許公開第２０１２／０２２８１１号、米国特許第５，９３２，４４８号、米国特許第６，８３３，４４１号）、一緒にコンジュゲートされた２つ又は３つ以上のドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、ダイアボディ、ラクダ科抗体及び操作されたラクダ科抗体などの重鎖のみ抗体、Ｄｕａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（Ｄｕａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、Ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ Ｍａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）及びＣｏｖＸ－ｂｏｄｙ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ＩｇＧ－ｌｉｋｅ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＩｎｎＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）及びＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）、ＳｃＦｖ／Ｆｃ Ｆｕｓｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ））、Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ－ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）及びＤｕａｌ（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－－Ｃｈｉｎａ）、Ｄｕａｌ－Ａｃｔｉｏｎ又はＢｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）並びにＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ抗体、ダイアボディに基づく抗体、及びドメイン抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ、ＢｉＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄｅｍ Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、二重親和性再標的技術（Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、一本鎖ダイアボディ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二重標的ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的重鎖のみドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、抗原結合アームは、二重可変ドメイン免疫グロブリン（Dual Variable Domain Immunoglobulins、ＤＶＤ）に組み込まれ得る（国際特許公開第２００９／１３４７７６号、ＤＶＤは、ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２－ＣＨ構造を有する重鎖と、ＶＬ１－リンカー－ＶＬ２－ＣＬ構造を有する軽鎖とを含む完全長抗体であり、リンカーは任意選択である）、異なる特異性を有する２つの抗体アームを結合するための様々な二量化ドメインを含む構造、例えば、ロイシンジッパー又はコラーゲン二量化ドメイン（国際特許公開第２０１２／０２２８１１号、米国特許第５，９３２，４４８号、米国特許第６，８３３，４４１号）、一緒にコンジュゲートされた２つ又は３つ以上のドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、ダイアボディ、ラクダ科抗体及び操作されたラクダ科抗体などの重鎖のみ抗体、Ｄｕａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（Ｄｕａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、Ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ Ｍａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）及びＣｏｖＸ－ｂｏｄｙ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ＩｇＧ－ｌｉｋｅ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＩｎｎＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）及びＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）、ＳｃＦｖ／Ｆｃ Ｆｕｓｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ））、Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ－ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）及びＤｕａｌ（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－－Ｃｈｉｎａ）、Ｄｕａｌ－Ａｃｔｉｏｎ又はＢｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）並びにＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ抗体、ダイアボディに基づく抗体、及びドメイン抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ、ＢｉＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄｅｍ Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、二重親和性再標的技術（Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、一本鎖ダイアボディ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二重標的ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的重鎖のみドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。
【0232】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている多重特異性抗体は、多重特異性抗体について当該技術分野において記載されている任意のフォーマットを採用し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、二重特異性抗体フォーマットに基づいて構築される。これは、第３の抗原結合領域を二重特異性抗体に付加することによって達成することができる。これまでに種々のフォーマットの二重特異性抗体が記載されており、近年ではＣｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｂａｔｙ（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ Ｄｅｖ １２：２７６によりレビューされている。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、ダイアボディ、クロスボディ、又は本発明において記載されるもののような制御されたＦａｂアーム交換により得られる二重特異性抗体である二重特異性抗体である。
【0233】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体には、ヘテロ二量体化を強制する相補性ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子、組換えＩｇＧ様二重標的化分子（この分子の２つの側面は各々、少なくとも２つの異なる抗体のＦａｂ断片又はＦａｂ断片の一部を含む）；ＩｇＧ融合分子（完全長ＩｇＧ抗体が、余分のＦａｂ断片又はＦａｂ断片の一部に融合されている）；Ｆｃ融合分子（一本鎖Ｆｖ分子又は安定化されたダイアボディが、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域、又はその一部に融合されている）；Ｆａｂ融合分子（異なるＦａｂ断片が一緒に融合されている）；ＳｃＦｖ及びダイアボディベース及び重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）（異なる一本鎖Ｆｖ分子又は異なるダイアボディ又は異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が互いに融合されているか、又は別のタンパク質若しくは担体分子に融合されている）が挙げられる。
【0234】
いくつかの実施形態では、相補性ＣＨ３ドメイン分子を有するＩｇＧ様分子としては、Ｔｒｉｏｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂｓ（Ｒｏｃｈｅ）、及び静電的に調整されたもの（Ａｍｇｅｎ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ストランドを交換し操作したドメインボディ（Ｓｔｒａｎｄ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｄｏｍａｉｎ ｂｏｄｙ、ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）、ＤｕｏＢｏｄｙ（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ）、及び他の非対称変異（例えば、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）が挙げられる。
【0235】
いくつかの実施形態では、組換えＩｇＧ様二重標的化分子としては、Ｄｕａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、Ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ Ｍａｂｓ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）、及びＣｏｖＸ－ｂｏｄｙ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。
【0236】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ融合分子としては、Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ（ＤＶＤ）－Ｉｇ（Ａｂｂｏｔｔ）、ＩｇＧ－ｌｉｋｅ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＩｎｎＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）、及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、並びにＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。
【0237】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合分子としては、ＳｃＦｖ／Ｆｃ Ｆｕｓｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）、Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ－ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、及びＤｕａｌ（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－－Ｃｈｉｎａ）が挙げられる。
【0238】
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ融合二重特異性抗体としては、Ｆ（ａｂ）２（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）、Ｄｕａｌ－Ａｃｔｉｏｎ ｏｒ Ｂｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）、及びＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ－、ダイアボディに基づく抗体及びドメイン抗体には、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢｉＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、Ｔａｎｄｅｍ Ｄｉａｂｏｄｙ（Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｄｉａｂｏｄｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ－ｌｉｋｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＡＩＴ，ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ ＳｃＦｖ Ｆｕｓｉｏｎ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二重標的指向性ナノボディ（ｄｕａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｎａｎｏｂｏｄｙ）（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的指向性の重鎖のみのドメイン抗体（ｄｕａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｎｌｙ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0239】
本開示の完全長多重特異性抗体は、例えば、２つの単一特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を使用して、インビトロにおいて、無細胞環境下又は共発現使用下のいずれかで、別個の特異性を有する２つの抗体半分子のヘテロ二量体化に有利になるように、各々の半分子において重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することにより生成され得る。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離－会合の結果である。単一特異性親抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は、低減される。単一特異性親抗体のうちの１つについて生じる遊離システインは、第２の単一特異性親抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、解離－会合により開放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化に有利となるように操作され得る。得られた産物は、各々別個のエピトープ、例えば、ＣＤ７９ｂ上のエピトープ及びＣＤ２２上のエピトープに結合する、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
【0240】
本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体化」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
【0241】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体化」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
【0242】
「ノブ－イン－ホール」戦略（例えば、ＰＴＣ国際公開第２００６／０２８９３６号を参照のこと）が、完全長二重特異性抗体を生成するのに使用されてもよい。簡潔に述べると、ヒトＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸は、ヘテロ二量体形成を促進するように、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において変異され得る。小さい側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きい側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、ヘテロ二量体が、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換の対は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置として表現）。
【0243】
本明細書に記載される多重特異性抗体又は多重特異性結合断片のいくつかの実施形態では、第１の抗原結合アームのＦｃドメインは、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、第２の抗原結合アームのＦｃドメインは、変異Ｔ３６６Ｗを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合アームのＦｃドメインは、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、第１の抗原結合アームのＦｃドメインは、変異Ｔ３６６Ｗを含む。
【0244】
他の戦略、例えば、１つのＣＨ３表面における正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量体化の促進が、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載されるように使用されてもよい。他の戦略では、ヘテロ二量体化は、以下の置換（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置として表現される）によって促進されてもよい：米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に記載されるように、Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５ＡＹ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ Ｋ４０９Ｆ Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）。
【0245】
上記の方法に加えて、本発明の多重特異性抗体は、インビトロにおいて、無細胞環境下で、国際特許公開第２０１１／１３１７４６号に記載された方法に従って、２つの単一特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域中に非対称変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下において、２つの親単一特異性ホモ二量体抗体から多重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することにより生成されてもよい。この方法において、第１の単特異性二価抗体（例えば、抗ＣＤ７９ｂ抗体）及び第２の単特異性二価抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体）は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおける特定の置換を有するように操作され、抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるために十分な還元条件下において一緒にインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により多重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻されてもよい。使用され得る例示的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（2-mercaptoethylamine、２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（dithioerythritol、ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（tris（2-carboxyethyl）phosphine、ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びβ－メルカプトエタノールであり、好ましくは、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度において、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えば、ｐＨ７．０又はｐＨ７．４において、少なくとも９０分のインキュベートが使用されてもよい。
【0246】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体又は抗原結合断片は、ＩｇＧ又はその誘導体である。ＩｇＧクラスは、ヒトにおいて、４つのアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分割される。これらは、Ｆｃ領域のアミノ酸配列において９５％を上回る相同性を共有するが、ヒンジ領域のアミノ酸組成及び構造において主な差異を示す。Ｆｃ領域は、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cellular cytotoxicity、ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）を媒介する。ＡＤＣＣでは、抗体のＦｃ領域は、免疫エフェクター細胞、例えば、ナチュラルキラー及びマクロファージの表面上のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）に結合し、標的細胞の貪食又は溶解をもたらす。ＣＤＣでは、抗体は、細胞表面における補体カスケードをトリガーすることによって、標的細胞を殺滅させる。本明細書に記載される抗体は、ＩｇＧアイソタイプのいずれかとの組み合わせで、可変ドメインの記載された特徴を有する抗体を含み、これには、異なるエフェクター機能をもたらすようにＦｃ配列が修飾されている改変版が含まれる。
【0247】
多くの治療用抗体の適用に関し、Ｆｃに媒介されるエフェクター機能は、作用機序を担わない。これらのＦｃに媒介されるエフェクター機能は、機序外の毒性を引き起こすことにより有害となるおそれがあり、かつ安全性リスクを引き起こすおそれがある。エフェクター機能の修飾は、Ｆｃ領域を操作して、ＦｃγＲ又は補体因子へのそれらの結合を低減させることにより達成され得る。活性化（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂ）及び阻害性（ＦｃγＲＩＩｂ）ＦｃγＲ又は補体の第１の成分（Ｃ１ｑ）へのＩｇＧの結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメイン中に位置する残基により決まる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４に変異が導入されると、Ｆｃ機能が低下又はサイレンシングする。本明細書に記載される抗体は、これらの修飾を含んでもよい。
【0248】
一実施形態では、抗体は、下記特性：（ａ）親Ｆｃと比較した場合、低下したエフェクター機能、（ｂ）ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩｂ及び／又はＦｃγＲＩＩＩａに対する低減された親和性、（ｃ）ＦｃγＲＩに対する低減された親和性、（ｄ）ＦｃγＲＩＩａに対する低減された親和性、（ｅ）ＦｃγＲＩＩｂに対する低減された親和性、（ｆ）ＦｃγＲＩＩＩｂに対する低減された親和性又は（ｇ）ＦｃγＲＩＩＩａに対する低減された親和性、のうちの１つ又は２つ以上を有するＦｃ領域を含む。
【0249】
いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＩｇＧ又はその誘導体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４アイソタイプである。抗体がＩｇＧ１アイソタイプを有するいくつかの実施形態では、抗体は、そのＦｃ領域に、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ｓ、及び／又はＫ４０９Ｒ置換を含有する。抗体がＩｇＧ４アイソタイプを有するいくつかの実施形態では、抗体は、そのＦｃ領域に、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を含む。本明細書に記載される抗体は、これらの修飾を含んでもよい。
【0250】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体の第１及び／又は第２の抗原結合アームのＦｃドメインは各々、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓから選択される１つ又は２つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗原結合アームのＦｃドメインは各々、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓを含む。
【0251】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体の第１又は第２の抗原結合アームのＦｃドメインは、プロテインＡへのＦｃ結合を低減させる１つ又は２つ以上の変異を更に含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の抗原結合アームのＦｃドメインは、変異Ｈ４３５Ｒ及び／又はＹ４３６Ｆを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２抗原結合アームのＦｃドメインは、変異Ｈ４３５Ｒ及び／又はＹ４３６Ｆを含む。
【0252】
様々な実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体において使用されるｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、リンカー及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ－ＶＬ）又はＶＬ、Ｌ及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ－ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ、リンカー、及びＶＨ（ＶＬ－リンカー－ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ、リンカー、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ－ＶＨ）を含む。
【0253】
本開示において使用されるリンカーは、約５～５０個のアミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～４０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～３５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～３０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～２５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１５～２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、４０個のアミノ酸長である。使用され得る例示的なリンカーは、Ｇｌｙリッチリンカー、Ｇｌｙ及びＳｅｒ含有リンカー、Ｇｌｙ及びＡｌａ含有リンカー、Ａｌａ及びＳｅｒ含有リンカー、並びに他の柔軟なリンカーである。
【0254】
他のリンカー配列は、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖アイソタイプに由来する免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＬ又はＣＨ１の部分を含み得る。使用され得る例示的なリンカーを表１に示す。追加のリンカーは、例えば、国際特許公開第２０１９／０６０６９５号に記載されている。
【0255】
いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号９１～１２５のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
【0256】
【表1】
【0257】
二重特異性抗体
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片は、ＣＤ７９ｂ結合アームと、ＣＤ２２結合アームと、を含む。一実施形態では、二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片は、第１の抗原に結合する第１の抗原結合部位と、第２の抗原に結合する第２の抗原結合部位と、を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片は、ＣＤ７９ｂ結合アームと、ＣＤ２２結合アームと、を含む。一実施形態では、二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片は、第１の抗原に結合する第１の抗原結合部位と、第２の抗原に結合する第２の抗原結合部位と、を含む。
【0258】
一実施態様では、二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片は、ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合アームと、ＣＤ７９ｂに結合する第２の抗原結合アームと、を含む。
【0259】
一実施態様では、二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片は、ＣＤ７９ｂに結合する第１の抗原結合アームと、ＣＤ２２に結合する第２の抗原結合アームと、を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する第１の抗原結合アームは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９又は５７のＨＣＤＲ１、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０又は５８のＨＣＤＲ２、配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１又は５９のＨＣＤＲ３、配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２又は６０のＬＣＤＲ１、配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３又は６１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４又は６２のＬＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する抗原結合アームは、以下：
それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号１７、１８、１９、２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３３、３４、３５、３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４１、４２、４３、４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号４９、５０、５１、５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号５７、５８、５９、６０、６１、及び６２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号１７、１８、１９、２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３３、３４、３５、３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４１、４２、４３、４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号４９、５０、５１、５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号５７、５８、５９、６０、６１、及び６２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【0260】
一実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する第１の抗原結合アームは、配列番号１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３又は８０のＶＨ、及び配列番号１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４又は８１のＶＬを含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する第１の抗原結合アームは、以下：
それぞれ配列番号１５及び１６、
それぞれ配列番号２３及び２４、
それぞれ配列番号３１及び３２、
それぞれ配列番号３９及び４０、
それぞれ配列番号４７及び４８、
それぞれ配列番号５５及び５６、
それぞれ配列番号６３及び６４、又は
それぞれ配列番号８０及び８１のＶＨ及びＶＬを含む。
それぞれ配列番号１５及び１６、
それぞれ配列番号２３及び２４、
それぞれ配列番号３１及び３２、
それぞれ配列番号３９及び４０、
それぞれ配列番号４７及び４８、
それぞれ配列番号５５及び５６、
それぞれ配列番号６３及び６４、又は
それぞれ配列番号８０及び８１のＶＨ及びＶＬを含む。
【0261】
一実施形態では、ＣＤ２２に結合する第２の抗原結合アームは、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ２２に結合する第２の抗原結合アームは、配列番号７のＶＨを含む。一実施形態では、ＣＤ２２に結合する第２の抗原結合アームは、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ＣＤ２２に結合する第２の抗原結合アームは、配列番号８のＶＬを含む。
【0262】
一実施形態では、二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片は、配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、配列番号１１のＨＣＤＲ３、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＣＤ７９ｂに結合する抗原結合アームと、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＣＤ２２と結合する抗原結合アームと、を含む。
【0263】
一実施態様では、二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片は、配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、配列番号１１のＨＣＤＲ３、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＣＤ７９ｂに結合する抗原結合アームと、配列番号７のＶＨ、及び配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＣＤ２２に結合する抗原結合アームと、を含む。
【0264】
一実施態様では、二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片は、配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、配列番号１１のＨＣＤＲ３、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＣＤ７９ｂに結合する抗原結合アームと、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３、並びに配列番号８のＶＬを含むＣＤ２２に結合する抗原結合アームと、を含む。
【0265】
一実施態様では、二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片は、配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、配列番号１１のＨＣＤＲ３、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＣＤ７９ｂに結合する抗原結合アームと、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含むＣＤ２２に結合する抗原結合アームと、を含む。
【0266】
一実施態様では、二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片は、配列番号８０のＶＨ、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＣＤ７９ｂに結合する抗原結合アームと、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＣＤ２２に結合する抗原結合アームと、を含む。
【0267】
一実施態様では、二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片は、配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、配列番号１１のＨＣＤＲ３、及び配列番号８１のＶＬを含むＣＤ７９ｂに結合する抗原結合アームと、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＣＤ２２に結合する抗原結合アームと、を含む。
【0268】
一実施態様では、二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片は、配列番号８０のＶＨ及び配列番号８１のＶＬを含むＣＤ７９ｂに結合する抗原結合アームと、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＣＤ２２に結合する抗原結合アームと、を含む。
【0269】
一実施態様では、二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片は、配列番号８０のＶＨ及び配列番号８１のＶＬを含む、ＣＤ７９ｂに結合する抗原結合アームと、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含むＣＤ２２に結合する抗原結合アームと、を含む。
【0270】
相同抗体
本明細書に記載される、単一特異性抗体、多重特異性抗体、又は抗原結合断片を含む、抗体は、記載される多重特異性抗体又は抗原結合断片の生物学的特性（例えば、結合親和性又は免疫エフェクター活性）を保持している、単一又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するバリアントを含む。例えば、バリアントは、親抗原結合ドメインと比較したときに改善された機能的性質を保持するか又は有する限り、ＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９個又はそれ以上のアミノ酸置換を含んでもよい。いくつかの実施形態では、配列同一性は、本開示のＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインに対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であってもよい。いくつかの実施形態では、バリエーションが、フレームワーク領域に存在する。いくつかの実施形態では、バリアントは、保存的置換により生成される。
本明細書に記載される、単一特異性抗体、多重特異性抗体、又は抗原結合断片を含む、抗体は、記載される多重特異性抗体又は抗原結合断片の生物学的特性（例えば、結合親和性又は免疫エフェクター活性）を保持している、単一又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するバリアントを含む。例えば、バリアントは、親抗原結合ドメインと比較したときに改善された機能的性質を保持するか又は有する限り、ＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９個又はそれ以上のアミノ酸置換を含んでもよい。いくつかの実施形態では、配列同一性は、本開示のＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインに対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であってもよい。いくつかの実施形態では、バリエーションが、フレームワーク領域に存在する。いくつかの実施形態では、バリアントは、保存的置換により生成される。
【0271】
本発明の文脈において、別途記載のない限り、下記注釈が、変異を説明するために使用される。ｉ）所与の位置におけるアミノ酸の置換は、例えば、Ｋ４０９Ｒと記載される。Ｋ４０９Ｒは、４０９位におけるリジンのアルギニンによる置換を意味する。ｉｉ）特定のバリアントについて、特定の三文字又は一文字コードは、コードＸａａ及びＸを含めて、アミノ酸残基を示すのに使用される。このため、４０９位におけるリジンについてのアルギニンの置換は、Ｋ４０９Ｒと指定され、又は４０９位におけるリジンについての任意のアミノ酸残基の置換は、Ｋ４０９Ｘと指定される。４０９位におけるリジンの欠失の場合には、この欠失は、Ｋ４０９＊により示される。当業者であれば、単一又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するバリアントを産生することができる。
【0272】
これらのバリアントとしては、（ａ）１つ又は２つ以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸により置換されているバリアント、（ｂ）１つ若しくは２つ以上のアミノ酸がポリペプチドに付加されているか又はそれから欠失しているバリアント、（ｃ）１つ又は２つ以上のアミノ酸が置換基を含むバリアント、及び（ｄ）ポリペプチドが、ポリペプチドに有用な特性、例えば、抗体に対するエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分などを付与し得る別のペプチド又はポリペプチド、例えば、融合パートナー、タンパク質タグ、又は他の化学部分と融合したバリアントを挙げることができる。本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、保存的又は非保存的位置のいずれかにおいて、ある種に由来するアミノ酸残基が別の種における対応する残基に置換されているバリアントを含んでもよい。他の実施形態では、非保存的位置におけるアミノ酸残基は、保存的又は非保存的残基により置換される。これらのバリアントを得るための手法は、遺伝的（欠失、変異など）、化学的、及び酵素的手法を含め、当業者に既知である。
【0273】
ＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に結合する抗原結合断片を生成する方法
本開示で提供されるＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインは、様々な技術を使用して生成することができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法を使用して、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に結合するＶＨ／ＶＬ対を同定することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の宿主動物、例えば、ハムスター、ラット、若しくはニワトリを、ヒト及び／又はカニクイザルＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２で免疫し、続いて、標準的な方法を使用して骨髄腫細胞と、免疫した動物の脾臓細胞を融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。１つの不死化したハイブリドーマ細胞から生じたコロニーを、結合の特異性、交差反応性又はその欠如、抗原に対する親和性、及び任意の所望の機能性などの所望の特性を有するＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインを含有する抗体の生成についてスクリーニングしてもよい。
本開示で提供されるＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインは、様々な技術を使用して生成することができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法を使用して、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に結合するＶＨ／ＶＬ対を同定することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の宿主動物、例えば、ハムスター、ラット、若しくはニワトリを、ヒト及び／又はカニクイザルＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２で免疫し、続いて、標準的な方法を使用して骨髄腫細胞と、免疫した動物の脾臓細胞を融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。１つの不死化したハイブリドーマ細胞から生じたコロニーを、結合の特異性、交差反応性又はその欠如、抗原に対する親和性、及び任意の所望の機能性などの所望の特性を有するＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインを含有する抗体の生成についてスクリーニングしてもよい。
【0274】
非ヒト動物を免疫することによって生成されたＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインは、ヒト化され得る。ヒトアクセプタフレームワークの選択を含む例示的なヒト化技術としては、ＣＤＲ移植（米国特許第５，２２５，５３９号）、ＳＤＲ移植（米国特許第６，８１８，７４９号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ，（１９９１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：４８９－４９９）、特異性決定残基リサーフェシング（米国特許出願公開第２０１０／０２６１６２０号）、ヒトフレームワーク適合（米国特許第８，７４８，３５６号）、又は超ヒト化（米国特許第７，７０９，２２６号）が挙げられる。これらの方法では、ＣＤＲの長さの類似性若しくはカノニカル構造の同一性、又はそれらの組み合わせに基づいて、親フレームワークに対する全体的な相同性に基づき選択され得るヒトフレームワークに、親抗体のＣＤＲ又はＣＤＲ残基のサブセットを移植する。
【0275】
ヒト化抗原結合ドメインは、国際特許公開第１９９０／００７８６１号及び同第１９９２／２２６５３号に記載されているものなどの技術により、改変されたフレームワーク支持残基を組み込んで、結合親和性を保持することによって（復帰変異）、又はＣＤＲのいずれかにバリエーションを導入して、例えば抗原結合ドメインの親和性を改善することによって、所望の抗原に対するそれらの選択性又は親和性を改善するように更に最適化してもよい。
【0276】
自身のゲノムにヒト免疫グロブリン（immunoglobulin、Ｉｇ）遺伝子座を保有するマウス、ラット、又はニワトリなどのトランスジェニック動物を使用して、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に結合する抗原結合断片を生成することができ、例えば、米国特許第６，１５０，５８４号、国際特許公開第１９９９／４５９６２号、国際特許公開第２００２／０６６６３０号、同第２００２／４３４７８号、同第２００２／０４３４７８号、及び同第１９９０／０４０３６号に記載されている。このような動物の内因的な免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させてもよく、相同又は非相同組換えを使用して、導入染色体（transchromosome）を使用して、又はミニ遺伝子を使用して、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を動物のゲノムに挿入してもよい。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（ｗｗｗ＿ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ＿ｃｏｍ）、Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｗｗｗ＿ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＿ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（ｗｗｗ＿ｏｍｔｉｎｃ＿ｎｅｔ）、ＫｙＭａｂ （ｗｗｗ＿ｋｙｍａｂ＿ｃｏｍ）、Ｔｒｉａｎｎｉ （ｗｗｗ．ｔｒｉａｎｎｉ＿ｃｏｍ）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（ｗｗｗ＿ａｂｌｅｘｉｓ＿ｃｏｍ）などの企業は、上記の技術を使用して、選択された抗原に対するヒト抗体の提供に従事し得る。
【0277】
ＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインは、ヒト免疫グロブリン又はその部分、例えばＦａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は不対若しくは対合抗体可変領域を発現するようにファージが操作されているファージディスプレイライブラリから選択することができる。ＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインは、例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６、及び国際特許公開第０９／０８５４６２号に記載されるようなバクテリオファージｐＩＸ被覆タンパク質との融合タンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラリから単離され得る。ライブラリを、ヒト及び／又はカニクイザルＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２へのファージ結合についてスクリーニングしてもよく、得られた陽性クローンを更に特性付けし、クローン溶解物からＦａｂを単離し、ｓｃＦｖ又は抗原結合断片の他の構成に変換してもよい。
【0278】
免疫原性抗原の調製並びに本開示の抗原結合ドメインの発現及び生成は、組換えタンパク質生成などの任意の好適な技術を使用して行うことができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、あるいは全細胞又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与されてもよく、あるいは、抗原は、当該抗原又はその一部分をコードする核酸から動物の体内で新規に（de novo）形成されてもよい。
【0279】
アイソタイプ、アロタイプ、及びＦｃ操作
本明細書に記載される、単一特異性抗体、多重特異性抗体、又は抗原結合断片は、いくつかの抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを具現化することができる。いくつかの実施形態では、抗体アイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプ、好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のアイソタイプである。抗体又はその抗原結合断片の特異性は、ＣＤＲのアミノ酸配列及び配置により主に決定される。したがって、あるアイソタイプのＣＤＲは、抗原特異性を改変することなく、別のアイソタイプに変更することができる。代替的に、抗原特異性を改変することなく、ハイブリドーマに、ある抗体アイソタイプを別のものにスイッチさせる技術（アイソタイプスイッチング）が確立されている。したがって、このような抗体アイソタイプは、記載される抗体又は抗原結合断片の範囲内にある。
本明細書に記載される、単一特異性抗体、多重特異性抗体、又は抗原結合断片は、いくつかの抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを具現化することができる。いくつかの実施形態では、抗体アイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプ、好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のアイソタイプである。抗体又はその抗原結合断片の特異性は、ＣＤＲのアミノ酸配列及び配置により主に決定される。したがって、あるアイソタイプのＣＤＲは、抗原特異性を改変することなく、別のアイソタイプに変更することができる。代替的に、抗原特異性を改変することなく、ハイブリドーマに、ある抗体アイソタイプを別のものにスイッチさせる技術（アイソタイプスイッチング）が確立されている。したがって、このような抗体アイソタイプは、記載される抗体又は抗原結合断片の範囲内にある。
【0280】
本開示のタンパク質中に存在するＩｇ定常領域又はＦｃ領域などのＩｇ定常領域の断片は、任意のアロタイプ又はアイソタイプのものであってよい。
【0281】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１アイソタイプである。いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ２アイソタイプである。いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ３アイソタイプである。いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【0282】
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、任意のアロタイプであり得る。アロタイプは結合又はＦｃ媒介性エフェクター機能などのＩｇ定常領域の特性に影響を与えないことが予想される。断片のＩｇ定常領域を含む治療用タンパク質の免疫原性は、輸注反応のリスク増大及び治療応答の期間短縮に関連している（Ｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０２－０８）。断片のＩｇ定常領域を含む治療用タンパク質が宿主において免疫応答を誘導する程度は、Ｉｇ定常領域のアロタイプによってある程度決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２１３－２１）。Ｉｇ定常領域のアロタイプは、抗体の定常領域配列における特定の位置のアミノ酸配列バリエーションに関連する。表２は、選択ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４アロタイプを示す。
【0283】
【表2】
【0284】
Ｃ末端リジン（C-terminal lysine、ＣＴＬ）は、Ｉｇ定常領域から、血流中の内因性循環カルボキシペプチダーゼによって除去され得る（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０８：４０４－４１２）。製造中、米国特許出願公開第２０１４０２７３０９２号に記載のとおり細胞外Ｚｎ２＋、ＥＤＴＡ、又はＥＤＴＡ－Ｆｅ３＋の濃度を制御することによって、ＣＴＬの除去を最高レベル未満に制御することができる。タンパク質のＣＴＬ含量を、既知の方法を使用して測定することができる。
【0285】
いくつかの実施形態では、抗体は、約１０％～約９０％のＣ末端リジン含量を有する。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約２０％～約８０％である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約４０％～約７０％である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約５５％～約７０％である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約６０％である。
【0286】
Ｉｇ定常領域を含む多重特異性抗体又はＩｇ定常領域の断片に対してＦｃ領域変異を行って、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／若しくはＡＤＣＰなどのそれらのエフェクター機能、並びに／又は薬物動態特性を調節し得る。これは、変異したＦｃの活性化ＦｃγＲｓ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩ）、ＦｃγＲＩＩｂ、及び／又はＦｃＲｎへの結合を制御する変異をＦｃに導入することによって達成可能である。
【0287】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む多重特異性抗体は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片に少なくとも１つの変異を含む。
【0288】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、Ｆｃ領域にある。
【0289】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む多重特異性抗体は、Ｆｃ領域に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の変異を含む。
【0290】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む多重特異性抗体は、抗体のＦｃＲｎへの結合を調節する、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を含む。
【0291】
半減期（例えば、ＦｃＲｎへの結合）を調節するために変異させることが可能なＦｃの位置としては、位置２５０、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、３０７、３７６、３８０、４２８、４３４、及び４３５が挙げられる。単独で、又は組み合わせで行われ得例示的な変異は、変異Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ、Ｔ３０７Ａ、Ｄ３７６Ｖ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、Ｈ４３５Ａ、及びＨ４３５Ｒである。抗体の半減期を増加させるように行われ得る例示的な単独で又は組み合わせでの変異は、変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ及びＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａである。半減期を低減させるように行われ得る例示的な単独で又は組み合わせでの変異は、変異Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ及びＨ４３５Ｒである。
【0292】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む多重特異性抗体は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異を含む。
【0293】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む多重特異性抗体は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）へのタンパク質の結合を低減し、かつ／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び／若しくは貪食作用（antibody-dependent cell-mediated phagocytosis、ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を低減させる、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を含む。
【0294】
活性化ＦｃγＲへのタンパク質の結合を低減させ、続いて、エフェクター機能を低減させるために変異させ得るＦｃ位置としては、位置２１４、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２６７、２６８、２７０、２９５、２９７、３０９、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、及び３６５が挙げられる。単独で、又は組み合わせで加えることができる例示的な変異は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４における、変異Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓである。
【0295】
ＡＤＣＣが低減したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、全てのＩｇアイソタイプにおけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及び、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓの変異である。また、ＩｇＧ２由来の残基１１７～２６０及びＩｇＧ４由来の残基２６１～４４７を有するＦｃなどのハイブリッドＩｇＧ２／４Ｆｃドメインを使用してもよい。
【0296】
ＣＤＣが低減したタンパク質をもたらす例示的な変異は、Ｋ３２２Ａ変異である。
【0297】
周知のＳ２２８Ｐ変異をＩｇＧ４抗体に加えて、ＩｇＧ４の安定性を増強することができる。
【0298】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む多重特異性抗体は、Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の枯渇、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ｋ３２２、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｈ３１８Ｒ、及びＹ３１９Ｆからなる群から選択される、少なくとも１つの変異を含む。
【0299】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を含む。
【0300】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインの断片は、Ｆｃγ受容体へのＦｃ結合を低減させるための少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインの断片は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓに対応する変異を含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号８９に記載されるバリアントＩｇＧを含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号７９を含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号９０に記載されるＦｃドメインを含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号８３を含む。
【0301】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインの断片は、多重特異性結合分子の半減期を延長するための少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインの断片は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅに対応する変異を含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号８９に記載されるバリアントＩｇＧを含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号７９を含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号９０に記載されるＦｃドメインを含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号８３を含む。
【0302】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインの断片は、ヘテロ二量体化を促進するための少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインの断片は、Ｔ３６６Ｗに対応する変異を含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号８９に記載されるバリアントＩｇＧを含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号７９を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインの断片は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖに対応する変異を含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号９０に記載されるＦｃドメインを含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号８３を含む。
【0303】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインの断片は、プロテインＡへのＦｃ結合を低減させるための少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインの断片は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆに対応する変異を含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号９０に記載されるＦｃドメインを含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号８３を含む。
【0304】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む多重特異性抗体は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）へのタンパク質の結合を増強し、かつ／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び／若しくは貪食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を増強する、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を含む。
【0305】
活性化ＦｃγＲへのタンパク質の結合を増加させ、かつ／又はＦｃエフェクター機能を増強するために変異させ得るＦｃ位置としては、位置２３６、２３９、２４３、２５６、２９０、２９２、２９８、３００、３０５、３１２、３２６、３３０、３３２、３３３、３３４、３４５、３６０、３３９、３７８、３９６、又は４３０（ＥＵインデックスに従う残基番号付け）が挙げられる。単一で又は組み合わせて行われ得る例示的な変異は、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｌ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３３０Ｋ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ及びＰ３９６Ｌである。ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰが増加したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅである。
【0306】
ＣＤＣを増強させるように変異され得るＦｃ位置としては、位置２６７、２６８、３２４、３２６、３３３、３４５及び４３０が挙げられる。単一で又は組み合わせで行われ得る例示的な変異は、Ｓ２６７Ｅ、Ｆ１２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ３４５Ｑ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ３４５Ｙ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ及びＥ４３０Ｔである。ＣＤＣが増加したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ、及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔである。
【0307】
配列番号８５－野生型ＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0308】
配列番号８６－野生型ＩｇＧ２
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0309】
配列番号８７－野生型ＩｇＧ４
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【0310】
配列番号８８－ＩｇＧ誘導体
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0311】
配列番号８９－太字のバリアントを有するＩｇＧ誘導体
【0312】
【表3】
【0313】
配列番号９０－太字のバリアントを有するＩｇＧ１
【0314】
【表4】
【0315】
抗体のＦｃγＲ又はＦｃＲｎへの結合は、フローサイトメトリーを使用して、各受容体を発現するように操作された細胞にて評価することができる。例示的な結合アッセイでは、９６ウェルプレートに２×１０５個／ウェルの細胞を播種し、ＢＳＡ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）中にて４℃で３０分間ブロッキングする。細胞を、氷上で、４℃で１．５時間、試験抗体と共にインキュベートする。ＢＳＡ染色緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、Ｒ－ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に４℃で４５分間、インキュベートする。細胞を、で２回洗浄し、次いで、１：２００希釈したＤＲＡＱ７生／死細胞染色試薬（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）を含有する１５０μＬの染色緩衝液中に再懸濁する。染色された細胞のＰＥ及びＤＲＡＱ７シグナルを、それぞれＢ２及びＢ４チャネルを使用してＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）によって検出する。生細胞をＤＲＡＱ７除外でゲートし、収集された少なくとも１０，０００生細胞イベントについて、幾何平均蛍光シグナルを決定する。分析にはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用する。データを、平均蛍光シグナルに対する抗体濃度の対数としてプロットする。非線形回帰分析を実行する。
【0316】
多重特異性タンパク質の生成
多重特異性タンパク質は、Ｆａｂアーム交換を使用して生成され得、置換が、インビトロでＦａｂアーム交換を促進する、Ｉｇ定常領域ＣＨ３ドメイン内の２つの単一特異性二価抗体に導入される。この方法では、ヘテロ二量体の安定性を促進する特定の置換をＣＨ３ドメインに有するように、２つの単一特異性二価抗体を操作する。これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるために十分な還元条件下において一緒にインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る代表的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びβ－メルカプトエタノールであり、好ましくは、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを使用することができる。
多重特異性タンパク質は、Ｆａｂアーム交換を使用して生成され得、置換が、インビトロでＦａｂアーム交換を促進する、Ｉｇ定常領域ＣＨ３ドメイン内の２つの単一特異性二価抗体に導入される。この方法では、ヘテロ二量体の安定性を促進する特定の置換をＣＨ３ドメインに有するように、２つの単一特異性二価抗体を操作する。これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるために十分な還元条件下において一緒にインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る代表的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びβ－メルカプトエタノールであり、好ましくは、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを使用することができる。
【0317】
使用され得るＣＨ３変異としては、ノブインホール変異（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、静電的マッチ変異（Ｃｈｕｇａｉ、Ａｍｇｅｎ、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｏｎｃｏｍｅｄ）、鎖交換操作ドメインボディ（Ｓｔｒａｎｄ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｄｏｍａｉｎ ｂｏｄｙ、ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）変異（Ｇｅｎｍａｂ）、及び他の非対称変異（例えば、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）などの技術が挙げられる。
【0318】
ノブインホール変異は、例えば、国際公開第１９９６／０２７０１１号に開示されており、小さい側鎖（ホール）を有するアミノ酸が第１のＣＨ３領域に導入され、大きい側鎖（ノブ）を有するアミノ酸が第２のＣＨ３領域に導入され、第１のＣＨ３領域と第２のＣＨ３領域との間に優先的な相互作用をもたらす、ＣＨ３領域の界面上の変異が含まれる。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３領域変異は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである。
【0319】
重鎖ヘテロ二量体形成は、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載のように、第１のＣＨ３領域上の正に荷電した残基及び第２のＣＨ３領域上の負に荷電した残基を置換することにより、静電相互作用を使用することによって促進され得る。
【0320】
重鎖ヘテロ二量体化を促進するために使用することができる他の非対称変異は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）に記載のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗである。
【0321】
ＳＥＥＤボディ変異は、米国特許出願公開第２００７０２８７１７０号に記載のように、選択されたＩｇＧ残基をＩｇＡ残基と置換して、重鎖ヘテロ二量体化を促進することを伴う。
【0322】
使用され得る他の例示的な変異は、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号、及び米国特許出願公開第２０１８／０１１８８４９号に記載のＲ４０９Ｄ＿Ｋ３７０Ｅ／Ｄ３９９Ｋ＿Ｅ３５７Ｋ、Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｋ／Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｋ／Ｙ３４９Ｅ、Ｌ３５１Ｋ／Ｙ３４９Ｄ、Ｌ３５１Ｋ／Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ３５６Ｋ、Ｋ２５３Ｅ＿Ｄ２８２Ｋ＿Ｋ３２２Ｄ／Ｄ２３９Ｋ＿Ｅ２４０Ｋ＿Ｋ２９２Ｄ、Ｋ３９２Ｄ＿Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３５６Ｋ＿Ｄ３９９Ｋである。
【0323】
Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）変異（Ｇｅｎｍａｂ）は、例えば、米国特許第９１５０６６３号及び米国特許公開第２０１４／０３０３３５６号に記載されており、Ｆ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、野生型／Ｆ４０５Ｌ＿Ｒ４０９Ｋ、Ｔ３５０Ｉ＿Ｋ３７０Ｔ＿Ｆ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、Ｋ３７０Ｗ／Ｋ４０９Ｒ、Ｄ３９９ＡＦＧＨＩＬＭＮＲＳＴＶＷＹ／Ｋ４０９Ｒ、Ｔ３６６ＡＤＥＦＧＨＩＬＭＱＶＹ／Ｋ４０９Ｒ、Ｌ３６８ＡＤＥＧＨＮＲＳＴＶＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、Ｄ３９９ＦＨＫＲＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、Ｆ４０５ＩＫＬＳＴＶＷ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、及びＹ４０７ＬＷＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨの変異が含まれる。
【0324】
追加の二重特異性又は多重特異性構造としては、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ）（国際特許公開第２００９／１３４７７６号、ＤＶＤは、ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２－ＣＨ構造を有する重鎖と、ＶＬ１－リンカー－ＶＬ２－ＣＬ構造を有する軽鎖とを含む完全長抗体であり、リンカーは任意選択である）、異なる特異性を有する２つの抗体アームを結合するための様々な二量化ドメインを含む構造、例えば、ロイシンジッパー又はコラーゲン二量化ドメイン（国際特許公開第２０１２／０２２８１１号、米国特許第５，９３２，４４８号、米国特許第６，８３３，４４１号）、一緒にコンジュゲートされた２つ又は３つ以上のドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、ダイアボディ、ラクダ科抗体及び操作されたラクダ科抗体などの重鎖のみ抗体、Ｄｕａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、Ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ Ｍａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）及びＣｏｖＸ－ｂｏｄｙ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ＩｇＧ－ｌｉｋｅ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＩｎｎＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）及びＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）、ＳｃＦｖ／Ｆｃ Ｆｕｓｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）、Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ－ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）及びＤｕａｌ（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－－Ｃｈｉｎａ）、Ｄｕａｌ－Ａｃｔｉｏｎ又はＢｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）並びにＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ抗体、ダイアボディに基づく抗体、及びドメイン抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ、ＢｉＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄｅｍ Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、二重親和性再標的技術（Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、一本鎖ダイアボディ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二重標的ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的重鎖のみドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。
【0325】
いくつかの実施形態では、多重特異的タンパク質は、３つのポリペプチド鎖を含む。このような設計では、少なくとも１つの抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖの形態である。例示的な設計としては、以下の設計１～４が挙げられる（「１」は第１の抗原結合ドメインを示し、「２」は第２の抗原結合ドメインを示し、「３」は第３の抗原結合ドメインを示す：
設計１：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計２：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計３：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計４：鎖Ａ）ＣＨ２－ＣＨ３－ｓｃＦｖ１、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計１：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計２：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計３：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計４：鎖Ａ）ＣＨ２－ＣＨ３－ｓｃＦｖ１、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
【0326】
ＣＨ３操作は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）に記載のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗの変異など、設計１～４に組み込まれ得る。
【0327】
免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はＩｇ定常領域の断片へのコンジュゲーション
いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ７９ｂ結合アーム及び／又はＣＤ２２結合アームは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートして、Ｆｃエフェクター機能Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食作用、又は細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方制御を含む、抗体様特性を付与することができる。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片はまた、本明細書で考察されるように、半減期延長部分としても機能する。本開示のＣＤ７９ｂに結合する抗原結合ドメインは、標準的な方法を使用して従来の完全長抗体に操作することができる。ＣＤ７９ｂに結合する抗原結合ドメインを含む完全長抗体は、本明細書に記載のとおり、更に操作されてもよい。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ７９ｂ結合アーム及び／又はＣＤ２２結合アームは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートして、Ｆｃエフェクター機能Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食作用、又は細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方制御を含む、抗体様特性を付与することができる。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片はまた、本明細書で考察されるように、半減期延長部分としても機能する。本開示のＣＤ７９ｂに結合する抗原結合ドメインは、標準的な方法を使用して従来の完全長抗体に操作することができる。ＣＤ７９ｂに結合する抗原結合ドメインを含む完全長抗体は、本明細書に記載のとおり、更に操作されてもよい。
【0328】
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、サブドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。いくつかの実施形態では、ＥＵインデックスに従う残基番号付けで、重鎖において、ＣＨ１ドメインは、残基Ａ１１８からＶ２１５に及び、ＣＨ２ドメインは、残基Ａ２３１からＫ３４０に及び、ＣＨ３ドメインは、残基Ｇ３４１からＫ４４７に及ぶ。いくつかの例では、Ｇ３４１は、ＣＨ２ドメイン残基と称される。ヒンジは、概して、Ｅ２１６を含み、ヒトＩｇＧ１のＰ２３０で終結すると定義される。いくつかの実施形態では、Ｉｇ Ｆｃ領域は、Ｉｇ定常領域の少なくともＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、したがって、Ｉｇ重鎖定常領域の少なくともおよそＡ２３１からＫ４４７までの領域を含む。
【0329】
本発明はまた、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＣＤ７９ｂに結合する抗原結合ドメインを提供する。
【0330】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域は、重鎖定常領域である。
【0331】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域は、軽鎖定常領域である。
【0332】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、Ｆｃ領域を含む。
【0333】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメインを含む。
【0334】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ３ドメインを含む。
【0335】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
【0336】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。ヒンジの一部分は、Ｉｇヒンジの１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を指す。
【0337】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
【0338】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＮ末端にコンジュゲートされる。
【0339】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＣ末端にコンジュゲートされる。
【0340】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アーム及び／又はＣＤ２２結合アームは、第２のリンカー（Ｌ２）を介してＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる。
【0341】
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号７９～１１２のアミノ酸配列を含む。
【0342】
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした本開示のＣＤ７９ｂに結合する抗原結合ドメインは、いくつかの既知のアッセイを使用してその機能性について評価することができる。ＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２への結合は、本明細書に記載の方法を使用して評価することができる。Ｉｇ定常ドメイン又はＩｇ定常領域の断片、例えばＦｃ領域によって付与される改変された特性は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、若しくはＦｃＲｎ受容体などの受容体の可溶性形態を使用するＦｃ受容体結合アッセイにおいて、又は例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ、若しくはＡＤＣＰを測定する細胞ベースのアッセイを使用して、アッセイすることができる。
【0343】
ＡＤＣＣは、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ２２発現細胞を標的細胞として、ＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用するインビトロアッセイを使用して評価することができる。細胞溶解は、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光染料、又は天然の細胞内タンパク質）の放出によって検出することができる。例示的なアッセイでは、標的細胞を、１つの標的細胞の、４つのエフェクター細胞に対する比で使用する。標的細胞はＢＡＴＤＡで予め標識し、エフェクター細胞及び試験抗体と組み合わせる。サンプルを２時間インキュベートし、上清に放出したＢＡＴＤＡを測定することにより、細胞溶解を測定する。０．６７％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）による最大の細胞傷害に対してデータを正規化し、また任意の抗体の非存在下における標的細胞からのＢＡＴＤＡの自然放出によって最小対照を求める。
【0344】
ＡＤＣＰは、単球由来マクロファージをエフェクター細胞として、かつ、ＧＦＰ又は他の標識分子を発現するように操作されている任意のＣＤ７９ｂ発現細胞を標的細胞として使用することによって評価することができる。例示的なアッセイでは、エフェクター：標的細胞比は、例えば４：１とすることができる。エフェクター細胞は、本発明の抗体を添加して、又は添加せずに、標的細胞と共に４時間インキュベートしてもよい。インキュベーション後、細胞は、アクターゼを使用して剥離され得る。マクロファージは、蛍光標識に結合した抗ＣＤ１１ｂ抗体及び抗ＣＤ１４抗体を用いて特定することができ、貪食作用の割合は、標準的な方法を使用して、ＣＤ１１＋ＣＤ１４＋マクロファージにおけるＧＦＰ蛍光％に基づいて求めることができる。
【0345】
細胞のＣＤＣは、例えば、Ｄａｕｄｉ細胞を、ＲＰＭＩ－Ｂ（１％のＢＳＡを補給したＲＰＭＩ）に１×１０５個の細胞／ウェル（５０μＬ／ウェル）で播種し、５０μＬの試験タンパク質を０～１００μｇ／ｍＬの最終濃度でウェルに添加し、反応物を室温で１５分間インキュベートし、１１μＬのプールヒト血清をウェルに添加し、反応物を３７℃で４５分間インキュベートすることによって測定され得る。溶解した細胞の割合（％）は、標準法を使用して、ＦＡＣＳアッセイにおけるヨウ化プロピジウム染色細胞の％として検出され得る。
【0346】
糖鎖操作
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む多重特異性抗体の、ＡＤＣＣを媒介する能力は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のオリゴ糖成分を操作することによって増強することができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７においてＮ－グリコシル化され、グリカンの大部分は、周知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。操作されていないＣＨＯ細胞により産生され得るＩｇ定常領域含有タンパク質は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含むａｎｔ多重特異性抗体に結合した二分岐複合体型オリゴ糖からコアフコースを除去すると、抗原結合もＣＤＣ活性も改変することなく、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合を介してタンパク質のＡＤＣＣが増強される。そのようなタンパク質は、二分岐複合体型Ｆｃオリゴ糖を有する、比較的高度に脱フコシル化された免疫グロブリンの発現を成功させることが報告されている異なる方法を使用して達成することができ、例えば、培養浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４：２４９－６５，２０１２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３－２６７４０，２００２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株ＥＢ６６の適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ；２（４）：４０５－４１５，２０１０；ＰＭＩＤ：２０５６２５８２）、宿主細胞株としてのラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６－３４７３，２００３）、１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１－９０８，２００４）、又はβ－１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα－マンノシダーゼＩＩ若しくは強力なアルファ－マンノシダーゼＩ阻害物質であるキフネンシンの共発現（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：５０３２－５０３６，２００６、Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９３：８５１－８６１，２００６；Ｘｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９９：６５２－６５，２００８）。
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む多重特異性抗体の、ＡＤＣＣを媒介する能力は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のオリゴ糖成分を操作することによって増強することができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７においてＮ－グリコシル化され、グリカンの大部分は、周知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。操作されていないＣＨＯ細胞により産生され得るＩｇ定常領域含有タンパク質は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含むａｎｔ多重特異性抗体に結合した二分岐複合体型オリゴ糖からコアフコースを除去すると、抗原結合もＣＤＣ活性も改変することなく、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合を介してタンパク質のＡＤＣＣが増強される。そのようなタンパク質は、二分岐複合体型Ｆｃオリゴ糖を有する、比較的高度に脱フコシル化された免疫グロブリンの発現を成功させることが報告されている異なる方法を使用して達成することができ、例えば、培養浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４：２４９－６５，２０１２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３－２６７４０，２００２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株ＥＢ６６の適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ；２（４）：４０５－４１５，２０１０；ＰＭＩＤ：２０５６２５８２）、宿主細胞株としてのラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６－３４７３，２００３）、１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１－９０８，２００４）、又はβ－１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα－マンノシダーゼＩＩ若しくは強力なアルファ－マンノシダーゼＩ阻害物質であるキフネンシンの共発現（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：５０３２－５０３６，２００６、Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９３：８５１－８６１，２００６；Ｘｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９９：６５２－６５，２００８）。
【0347】
いくつかの実施形態では、本開示のＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む多重特異性抗体は、約１％～約１５％、例えば、約１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％のフコース含量を有する二分岐グリカン構造を有する。いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む多重特異性抗体は、約５０％、４０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、又は２０％のフコース含量を有するグリカン構造を有する。
【0348】
「フコース含量」は、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコース単糖類の量を意味する。フコースの相対量は、フコース含有構造の全糖構造に対する割合である。これらは、複数の方法、例えば、１）国際公開第２００８／０７７５４６２号に記載されるような、Ｎ－グリコシダーゼＦ処理サンプル（例えば、複合体、ハイブリッド、及びオリゴ－並びに高マンノース構造）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの使用、２）Ａｓｎ２９７グリカンの酵素放出、その後の誘導体化、並びに蛍光検出を備えたＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）及び／又はＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による検出／定量化、３）第１のＧｌｃＮＡｃ単糖類と第２のＧｌｃＮＡｃ単糖類との間を切断し、フコースを第１のＧｌｃＮＡｃに付加されたままにさせる、Ｅｎｄｏ Ｓ又は他の酵素によるＡｓｎ２９７グリカンの処理を伴うか又はこの処理なしでの、天然又は還元ｍＡｂのインタクトプロテイン分析、４）酵素消化（例えば、トリプシン又はエンドペプチダーゼＬｙｓ－Ｃ）によるｍＡｂの構成ペプチドへの消化、その後のＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による分離、検出及び定量化、５）Ａｓｎ ２９７にＰＮＧａｓｅ Ｆを有する特異的な酵素脱グリコシル化により、ｍＡｂタンパク質からｍＡｂオリゴ糖を分離すること、により特性評価及び定量化され得る。このように放出されるオリゴ糖は、フルオロフォアで標識し、実測された質量の理論上の質量との比較によるマトリックス支援レーザ脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption ionization、ＭＡＬＤＩ）質量分析によるグリカン構造の細かな特性評価、イオン交換ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｃ）によるシアル化の程度の決定、順相ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｎ）による親水性基準に準拠するオリゴ糖型の分離及び定量化、並びに高性能キャピラリー電気泳動－レーザ誘起蛍光（high performance capillary electrophoresis-laser induced fluorescence、ＨＰＣＥ－ＬＩＦ）によるオリゴ糖の分離及び定量化、を可能にする様々な補足的技術によって分離及び特定することができる。
【0349】
「低フコース」又は「低フコース含量」は、本明細書で使用するとき、約１％～１５％のフコース含量を有する、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む多重特異性抗体を指す。
【0350】
「正常フコース」又は「正常フコース含量」は、本明細書で使用するとき、約５０％超、典型的には８０％超又は８５％超のフコース含量を有する、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む多重特異性抗体を指す。
【0351】
抗イディオタイプ抗体
本開示のＣＤ７９ｂ結合アーム及び／又はＣＤ２２結合アームを含む抗体に結合する抗イディオタイプが本明細書に提供される。抗イディオタイプ（idiotypic、Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原決定基（例えば、パラトープ又はＣＤＲ）を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗原をブロッキングするものであっても、しないものであってもよい。抗原ブロッキングＩｄは、サンプル中の遊離抗原結合ドメイン（例えば、本開示のＣＤ７９ｂに結合する抗原結合ドメイン）を検出するために使用され得る。ブロッキングしないＩｄを使用して、サンプル中の全抗体（遊離しているもの、抗原に一部結合しているもの、又は抗原に完全に結合しているもの）を検出することができる。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄが調製されている抗体で動物を免疫することによって調製し得る。
本開示のＣＤ７９ｂ結合アーム及び／又はＣＤ２２結合アームを含む抗体に結合する抗イディオタイプが本明細書に提供される。抗イディオタイプ（idiotypic、Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原決定基（例えば、パラトープ又はＣＤＲ）を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗原をブロッキングするものであっても、しないものであってもよい。抗原ブロッキングＩｄは、サンプル中の遊離抗原結合ドメイン（例えば、本開示のＣＤ７９ｂに結合する抗原結合ドメイン）を検出するために使用され得る。ブロッキングしないＩｄを使用して、サンプル中の全抗体（遊離しているもの、抗原に一部結合しているもの、又は抗原に完全に結合しているもの）を検出することができる。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄが調製されている抗体で動物を免疫することによって調製し得る。
【0352】
また、更に別の動物で免疫応答を誘導する免疫原として抗Ｉｄ抗体を使用して、いわゆる抗－抗Ｉｄ抗体を生成することもできる。抗－抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した元の抗原結合ドメインとエピトープが同一であり得る。したがって、抗原結合ドメインのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗原結合ドメインを発現する他のクローンを同定することが可能である。抗Ｉｄ抗体は、本明細書の他の箇所に記載のものなどの任意の好適な技術によって変動（それにより、抗Ｉｄ抗体バリアントを産生する）及び／又は誘導し得る。
【0353】
免疫コンジュゲート（Immunoconjugates）
本開示の抗体、ＣＤ７９ｂ結合アーム及び／又はＣＤ２２結合アームは、異種分子にコンジュゲートされてもよい。いくつかの実施形態では、異種分子は、検出可能な標識又は治療剤である。
本開示の抗体、ＣＤ７９ｂ結合アーム及び／又はＣＤ２２結合アームは、異種分子にコンジュゲートされてもよい。いくつかの実施形態では、異種分子は、検出可能な標識又は治療剤である。
【0354】
いくつかの実施形態では、本開示は、検出可能な標識にコンジュゲートされたＣＤ７９ｂ結合アームを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、検出可能な標識にコンジュゲートされたＣＤ２２結合アームを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、検出可能な標識にコンジュゲートされたＣＤ７９ｂ結合アーム及びＣＤ２２結合アームを含むタンパク質を提供する。
【0355】
いくつかの実施形態では、本開示は、治療剤にコンジュゲートされたＣＤ７９ｂ結合アームを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、治療剤にコンジュゲートされたＣＤ２２結合アームを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、治療剤にコンジュゲートされたＣＤ７９ｂ結合アーム及びＣＤ２２結合アームを含むタンパク質を提供する。
【0356】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、治療剤でもある。
【0357】
検出可能な標識にコンジュゲートされた本開示のタンパク質を使用して、様々なサンプル上のＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ２２の発現を評価することができる。検出可能な標識は、本開示のＣＤ７９ｂ結合アーム及び／又はＣＤ２２結合アームを含むタンパク質にコンジュゲートさせたとき、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段を介して後者を検出可能なものにする組成物を含む。
【0358】
例示的な検出可能な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、電子密度試薬、酵素（例えば、一般的にＥＬＩＳＡにおいて使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、フルオロフォア、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位体、シンチレート（scintillates）、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体又はその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、及び比色基質が挙げられる。
【0359】
検出可能な標識は、例えば、検出可能な標識が放射性同位体であるときなど、自発的にシグナルを発し得る。他の場合、検出可能な標識は、外部場によって刺激された結果として、シグナルを発する。
【0360】
例示的な放射性同位体は、γ放出、オージェ放出、β放出、α放出、又はポジトロン放出性の放射性同位体であり得る。例示的な放射性同位体としては、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、１９Ｆ、５５Ｃｏ、５７Ｃｏ、６０Ｃｏ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｓｒ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１１５Ｉｎ、１２３１、１２４１、１２５Ｉ、１３１１、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２６Ｒａ、２２５Ａｃ、及び２２７Ａｃが挙げられる。
【0361】
例示的な金属原子は、２０超の原子番号を有する金属、例えば、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオブ原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、スズ原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユウロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、バーケリウム原子、カリホルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子、又はローレンシウム原子である。
【0362】
いくつかの実施形態では、金属原子は、２０超の原子番号を有するアルカリ土類金属であり得る。
【0363】
いくつかの実施形態では、金属原子は、ランタニドであり得る。
【0364】
いくつかの実施形態では、金属原子は、アクチニドであり得る。
【0365】
いくつかの実施形態では、金属原子は、遷移金属であり得る。
【0366】
いくつかの実施形態では、金属原子は、卑金属であり得る。
【0367】
いくつかの実施形態では、金属原子は、金原子、ビスマス原子、タンタル原子、及びガドリニウム原子であり得る。
【0368】
いくつかの実施形態では、金属原子は、５３（すなわち、ヨウ素）～８３（すなわち、ビスマス）の原子番号を有する金属であり得る。
【0369】
いくつかの実施形態では、金属原子は、磁気共鳴映像法に好適な原子であり得る。
【0370】
金属原子は、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｃｒ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｒ６＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｃｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｇｄ３＋、Ａｕ＋、Ａｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆ３＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｍｎ７＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎｉ３＋、Ａｇ＋、Ｓｒ２＋、Ｓｎ２＋、Ｓｎ４＋、及びＺｎ２＋などの＋１、＋２、又は＋３酸化状態の形態の金属イオンであり得る。金属原子は、金属酸化物、例えば、酸化鉄、酸化マンガン、又は酸化ガドリニウムを含み得る。
【0371】
好適な色素としては、例えば、５（６）－カルボキシフルオレセイン、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤマレイミド、又はＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、ルテニウムポリピリジル色素などの任意の市販の色素が挙げられる。
【0372】
好適なフルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate、ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、テキサスレッド、ＣｙＤｙｅ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７）、近赤外（near infrared、ＮＩＲ）（７００～９００ｎｍ）蛍光染料、並びにカルボシアニン及びアミノスチリル染料である。
【0373】
検出可能な標識にコンジュゲートされた本開示のＣＤ７９ｂ結合アーム及び／又はＣＤ２２結合アームを含むタンパク質は、造影剤として使用され得る。
【0374】
いくつかの実施形態では、治療剤は、細胞傷害性剤である。いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物由来の酵素活性を有する毒素、又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）である。
【0375】
いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンデシン、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン、ゲルダナマイシン、マイタンシノイド、又はカリケアマイシンである。細胞傷害性剤は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構によってその細胞傷害性又は細胞増殖抑制作用を誘発し得る。
【0376】
いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の未結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（Pseudomonas aeruginosa）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボン草（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、並びにトリコテセン（tricothecenes）などの酵素活性毒素である。
【0377】
いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅなどの放射性核種である。
【0378】
いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、ドラスタチン又はドロスタチンのペプチド類似体及び誘導体、アウリスタチン又はモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。例示的な分子は、米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号に開示されている。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰの加水分解、並びに核及び細胞の分裂に干渉し（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０－３５８４）、抗がん及び抗真菌活性を有することが示されている。ドラスタチン及びアウリスタチン薬剤部位は、ペプチド薬剤部位のＮ（アミノ）末端若しくはＣ（カルボキシル）末端を介して（国際公開第０２／０８８１７２号）、又は抗体内に操作された任意のシステインを介して、本発明の抗体に結合することができる。
【0379】
本開示のＣＤ７９ｂ結合アーム及び／又はＣＤ２２結合アームを含むタンパク質は、既知の方法を使用して検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。
【0380】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、キレート剤と複合体を形成している。
【0381】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、リンカーを介して本開示のＣＤ７９ｂ結合タンパク質にコンジュゲートされる。
【0382】
検出可能な標識又は細胞傷害性部分は、既知の方法を使用して、本開示のＣＤ７９ｂ結合タンパク質に直接又は間接的に連結させることができる。好適なリンカーは、当該技術分野において既知であり、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー（Ｎ－スクシミジル－ベンゾエートの誘導体、ドデカボラート）、大環状及び非環式の両キレート剤のキレート部分、例えば、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０，四酢酸（1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7，10，tetraacetic acid、ＤＯＴＡ）の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（diethylenetriaminepentaacetic avid、ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ－２－（４－イソチオシアナトベンジル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（S-2-（4-Isothiocyanatobenzyl）-1，4，7-triazacyclononane-1，4，7-triacetic acid、ＮＯＴＡ）の誘導体、及び１，４，８，１１－テトラアザシクロドデカン－１，４，８，１１－四酢酸（1，4，8，11-tetraazacyclodocedan-1，4，8，11-tetraacetic、ＴＥＴＡ）の誘導体、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオナート（N-succinimidyl-3-（2-pyridyldithiol）propionate、ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（iminothiolane、ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアナート）、及びビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）、並びに他のキレート部分が挙げられる。好適なペプチドリンカーは周知である。
【0383】
ポリヌクレオチド、宿主細胞、及びベクター
記載された抗体、多重特異性抗体、及び抗原結合断片に加えて、記載された抗体、多重特異性抗体、及び抗原結合断片をコードすることができるポリヌクレオチド配列もまた提供される。
記載された抗体、多重特異性抗体、及び抗原結合断片に加えて、記載された抗体、多重特異性抗体、及び抗原結合断片をコードすることができるポリヌクレオチド配列もまた提供される。
【0384】
ＣＤ２２結合アームをコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ２２結合アームをコードする配列を含むポリヌクレオチドコードを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１のＨＣＤＲ１を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２のＨＣＤＲ２を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３のＨＣＤＲ３を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号１、２、及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ、及びＨＣＤＲ３を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ２２結合アームをコードする配列を含むポリヌクレオチドコードを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１のＨＣＤＲ１を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２のＨＣＤＲ２を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３のＨＣＤＲ３を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号１、２、及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ、及びＨＣＤＲ３を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。
【0385】
いくつかの実施形態では、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４のＬＣＤＲ１を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５のＬＣＤＲ２を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６のＬＣＤＲ３を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号４、５、及び６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。
【0386】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号１、２、３、４、５、及び６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ、及びＬＣＤＲ３を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。
【0387】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号８の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。
【0388】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、及び配列番号８のＶＬを含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７のＶＨ、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。
【0389】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む、ＣＤ２２結合アームをコードする。
【0390】
ＣＤ７９ｂ結合アームをコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする配列を含むポリヌクレオチドコードを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする配列を含むポリヌクレオチドコードを提供する。
【0391】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９又は５７のＨＣＤＲ１を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０又は５８のＨＣＤＲ２を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１又は５９のＨＣＤＲ３を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。
【0392】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９又は５７のＨＣＤＲ１、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０又は５８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１又は５９のＨＣＤＲ３を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下：
それぞれ配列番号９、１０、及び１１、
それぞれ配列番号１７、１８、及び１９、
それぞれ配列番号２５、２６、及び２７、
それぞれ配列番号３３、３４、及び３５、
それぞれ配列番号４１、４２、及び４３、
それぞれ配列番号４９、５０、及び５１、又は
それぞれ配列番号５７、５８、及び５９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。
それぞれ配列番号９、１０、及び１１、
それぞれ配列番号１７、１８、及び１９、
それぞれ配列番号２５、２６、及び２７、
それぞれ配列番号３３、３４、及び３５、
それぞれ配列番号４１、４２、及び４３、
それぞれ配列番号４９、５０、及び５１、又は
それぞれ配列番号５７、５８、及び５９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。
【0393】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２又は６０のＬＣＤＲ１を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３又は６１のＬＣＤＲ２を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４又は６２のＬＣＤＲ３を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下：
それぞれ配列番号１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号６０、６１、及び６２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。
それぞれ配列番号１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号６０、６１、及び６２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。
【0394】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９又は５７のＨＣＤＲ１を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０又は５８のＨＣＤＲ２を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１又は５９のＨＣＤＲ３を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２又は６０のＬＣＤＲ１を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３又は６１のＬＣＤＲ２を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４又は６２のＬＣＤＲ３を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下：
それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号１７、１８、１９、２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３３、３４、３５、３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４１、４２、４３、４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号４９、５０、５１、５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号５７、５８、５９、６０、６１、及び６２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。
それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、及び１４、
それぞれ配列番号１７、１８、１９、２０、２１、及び２２、
それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び３０、
それぞれ配列番号３３、３４、３５、３６、３７、及び３８、
それぞれ配列番号４１、４２、４３、４４、４５、及び４６、
それぞれ配列番号４９、５０、５１、５２、５３、及び５４、又は
それぞれ配列番号５７、５８、５９、６０、６１、及び６２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。
【0395】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＶＨを含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３又は８０のＶＨを含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＶＬを含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４又は８１のＶＬを含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。
【0396】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９又は５７のＨＣＤＲ１、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０又は５８のＨＣＤＲ２、配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１又は５９のＨＣＤＲ３、及び配列番号１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４又は８１のＶＬを含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。
【0397】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３又は８０のＶＨ、配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２又は６０のＬＣＤＲ１、配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３又は６１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４又は６２のＬＣＤＲ３を含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。
【0398】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＶＨ及びＶＬを含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下：
それぞれ配列番号１５及び１６、
それぞれ配列番号２３及び２４、
それぞれ配列番号３１及び３２、
それぞれ配列番号３９及び４０、
それぞれ配列番号４７及び４８、
それぞれ配列番号５５及び５６、
それぞれ配列番号６３及び６４、又は
それぞれ配列番号８０及び８１のＶＨ及びＶＬを含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。
それぞれ配列番号１５及び１６、
それぞれ配列番号２３及び２４、
それぞれ配列番号３１及び３２、
それぞれ配列番号３９及び４０、
それぞれ配列番号４７及び４８、
それぞれ配列番号５５及び５６、
それぞれ配列番号６３及び６４、又は
それぞれ配列番号８０及び８１のＶＨ及びＶＬを含む、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードする。
【0399】
一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アーム又はその断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６５、６８、７０、７３、７５、又は７７の配列を含む、ＶＨをコードする配列を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アーム又はその断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６６、６７、６９、７１、７２、７４、７６、又は７８の配列を含む、ＶＬをコードする配列を含む。一実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームをコードするポリヌクレオチドは、以下：
配列番号６５及び６６、
配列番号６５及び６７、
配列番号６８及び６９、
配列番号７０及び７１、
配列番号７０及び７２、
配列番号７３及び７４、
配列番号７５及び７６、又は
配列番号７７及び７８を含む、ＶＨをコードする配列及びＶＬをコードする配列を含む。
配列番号６５及び６６、
配列番号６５及び６７、
配列番号６８及び６９、
配列番号７０及び７１、
配列番号７０及び７２、
配列番号７３及び７４、
配列番号７５及び７６、又は
配列番号７７及び７８を含む、ＶＨをコードする配列及びＶＬをコードする配列を含む。
【0400】
ベクター及び宿主細胞
記載されるポリヌクレオチドを含むベクターも提供され、同様に、抗体、多重特異性抗体、又は抗原結合断片を発現する細胞も本明細書において提供される。また、開示されるベクターを発現することができる細胞も、記載される。これらの細胞は、哺乳類細胞（例えば、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ７細胞）、酵母細胞、植物細胞、又は細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）でもよい。記載される抗体はまた、ハイブリドーマ細胞により産生することができる。記載される抗体はまた、組換え的に産生され得る。
記載されるポリヌクレオチドを含むベクターも提供され、同様に、抗体、多重特異性抗体、又は抗原結合断片を発現する細胞も本明細書において提供される。また、開示されるベクターを発現することができる細胞も、記載される。これらの細胞は、哺乳類細胞（例えば、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ７細胞）、酵母細胞、植物細胞、又は細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）でもよい。記載される抗体はまた、ハイブリドーマ細胞により産生することができる。記載される抗体はまた、組換え的に産生され得る。
【0401】
組換え抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、記載されるポリヌクレオチド（及びそれらがコードするペプチド）は、リーダー配列を含む。当該技術分野において既知の任意のリーダー配列を用いることができる。リーダー配列は、制限部位又は翻訳開始部位を含み得るがこれらに限定されない。
【0402】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供される。ベクターは、発現ベクターであり得る。したがって、目的のポリペプチドをコードする配列を含む組換え発現ベクターは、本開示の範囲内であることが企図される。発現ベクターは、制御配列（例えば、プロモータ、エンハンサ）、選択マーカー、及びポリアデニル化シグナルなどであるがこれらに限定されない、１つ又は２つ以上の追加配列を含んでもよい。広範な宿主細胞を形質転換するためのベクターは周知であり、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌人工染色体（bacterial artificial chromosome、ＢＡＣ）、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome、ＹＡＣ）、並びに、他の細菌、酵母、及びウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0403】
本明細書の範囲内にある組換え発現ベクターは、好適な調節エレメントに作動可能に連結することができる少なくとも１つの組換えタンパク質をコードする、合成、ゲノム、又はｃＤＮＡ由来の核酸断片を含む。そのような調節エレメントとしては、転写プロモータ、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列を挙げることができる。発現ベクター、特に、哺乳動物の発現ベクターはまた、１つ若しくは２つ以上の非転写エレメント、例えば、複製の起点、発現させようとする遺伝子に連結されている好適なプロモータ及びエンハンサ、他の５’若しくは３’フランキング非転写配列、５’若しくは３’非翻訳配列（例えば、必須リボソーム結合部位）、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプタ部位、又は転写終了配列を含んでもよい。宿主において複製する能力を付与する複製の起点もまた、組み込まれ得る。
【0404】
脊椎動物細胞を形質転換するのに使用される発現ベクター中の転写及び翻訳制御配列は、ウイルス源により提供することができる。例示的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，３ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３）によって記載されるように構築され得る。
【0405】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体又は抗原結合断片のコーディング配列は、強力な構成的プロモータ、例えば、以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（hypoxanthine phosphoribosyl transferase、ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンなどのためのプロモータの制御下に置かれる。加えて、多くのウイルスプロモータが、真核細胞中で構成的に機能し、記載される実施形態での使用に好適である。そのようなウイルスプロモータとしては、サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus、ＣＭＶ）最初期プロモータ、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、マウス乳がんウイルス（Mouse Mammary Tumor Virus、ＭＭＴＶ）プロモータ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（Epstein Barr Virus、ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus、ＲＳＶ）、及び他のレトロウイルスの長端末反復配列（long terminal repeat、ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、多重特異性抗体又は多重特異性結合断片のコーディング配列は、メタロチオネインプロモータ、テトラサイクリン誘導性プロモータ、ドキシサイクリン誘導性プロモータなどの誘導性プロモータ、プロテインキナーゼＲ ２’，５’－オリゴアデニレート合成酵素、Ｍｘ遺伝子、ＡＤＡＲ１などの１つ又は２つ以上のインターフェロン刺激応答エレメント（interferon-stimulated response elements、ＩＳＲＥ）を含有するプロモータの制御下に置かれる。
【0406】
本明細書に記載されるベクターは、１つ又は２つ以上の内部リボソーム進入部位（Internal Ribosome Entry Site、ＩＲＥＳ）を含み得る。ＩＲＥＳ配列を融合ベクターに含めることは、一部のタンパク質の発現を増強させるのに有益であり得る。いくつかの実施形態では、ベクター系は、１つ又は２つ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含むこととなり、これは、前述の核酸配列のうちいずれかの上流又は下流にあってもよい。ベクターの成分は、近接して連結されてもよく、又は遺伝子産物を発現させるのに最適な間隔を提供するように（すなわち、ＯＲＦ間に「スペーサー」ヌクレオチドを導入することにより）配置されてもよく、又は別の方式で位置付けられてもよい。また、調節エレメント、例えば、ＩＲＥＳモチーフが、発現に最適な間隔を提供するように配置されてもよい。
【0407】
ベクターは、当該技術分野において周知の選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーには、陽性及び陰性選択マーカー、例えば、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ペニシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子）、グルタミン酸合成酵素遺伝子、ガンシクロビル選択用のＨＳＶ－ＴＫ、ＨＳＶ－ＴＫ誘導体、又は６－メチルプリン選択用の細菌のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子が含まれる（Ｇａｄｉ ｅｔ ａｌ．，７ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７３８－１７４３（２０００））。選択マーカーをコードする核酸配列又はクローニング部位は、目的のポリペプチドをコードする核酸配列又はクローニング部位の上流又は下流にあってもよい。
【0408】
本明細書に記載されるベクターを使用して、様々な細胞に、記載される抗体又は抗原結合断片をコードする遺伝子を形質転換することができる。例えば、ベクターを使用して、多重特異性抗体又は抗原結合断片の生成細胞を生成することができる。このため、別の態様は、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２０、及び／若しくはＣＤ３に結合する抗体又はその抗原結合断片、例えば、本明細書に記載され、例示された抗体又は抗原結合断片をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換された宿主細胞を特徴とする。
【0409】
外来遺伝子を細胞内に導入するための数多くの手法が、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載され例示される様々な実施形態に従って、記載される方法を行う目的で組換え細胞を構築するのに使用することができる。使用される手法は、異種遺伝子配列が細胞の子孫により遺伝及び発現可能であり、かつレシピエント細胞に必須の成育及び生理学的機能を損なうことのないよう、異種遺伝子配列を宿主細胞に安定して導入するものでなければならない。使用することができる手法としては、染色体導入法（例えば、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、マイクロ細胞媒介性遺伝子導入）、物理的方法（例えば、トランスフェクション、スフェロプラスト融合、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム担体）、ウイルスベクター導入（例えば、組換えＤＮＡウイルス、組換えＲＮＡウイルス）などが挙げられるがこれらに限定されない（Ｃｌｉｎｅ，２９ Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６９－９２（１９８５））。また、哺乳類細胞による細菌プロトプラストのリン酸カルシウム沈殿及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導融合を使用して、細胞を形質転換することができる。
【0410】
本明細書に記載される多重特異性抗体又は抗原結合断片の発現に使用するのに好適な細胞は、好ましくは、真核細胞、より好ましくは、植物、げっ歯類、又はヒト起源の細胞であり、例えば、特にＮＳＯ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ｐｅｒＣ．６、Ｔｋ－ｔｓ１３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ－７、Ｔ９８Ｇ、ＣＶ－１／ＥＢＮＡ、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＮＳ１、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞、及びＢＨＫ細胞株であるが、これらに限定されない。加えて、抗体の発現は、ハイブリドーマ細胞を使用して達成されてもよい。ハイブリドーマを産生するための方法は、当該技術分野において十分確立されている。
【0411】
本明細書に記載される発現ベクターが形質転換された細胞は、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片の組換え発現について選択又はスクリーニングされ得る。組換え陽性細胞は、例えば、タンパク質修飾若しくは改変された翻訳後修飾により、所望の表現型、例えば、高レベルの発現、増強された増殖特性、又は所望の生化学的特性を有するタンパク質を生成する能力を示すサブクローンについて増殖及びスクリーニングされる。これらの表現型は、所与のサブクローンの本来の特性又は変異によるものであり得る。変異は、化学薬品、ＵＶ波長光、照射、ウイルス、挿入変異源、ＤＮＡミスマッチ修復の阻害、又はこのような方法の組み合わせにより生じ得る。
【0412】
医薬組成物／投与
本開示はまた、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【0413】
治療用途では、本開示の抗体又は多重特異性抗体は、医薬的に許容される担体中に活性成分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」は、本発明の抗体が共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってもよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用してもよい。これらの溶液は滅菌され、概して粒子状物質を含まない。これらは、従来周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含有し得る。そのような医薬製剤中の本発明の抗体又は多重特異性抗体の濃度は、約０．５重量％未満から通常少なくとも約１重量％まで、最大で１５又は２０重量％まで変動し得、選択される投与様式に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ６９１－１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８－９８９を参照されたい。
【0414】
本開示の抗体又は多重特異性抗体の投与様式は、当該技術分野において周知であるように、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、若しくは皮下、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）、又は当業者に理解される他の手段などの任意の好適な経路であり得る。
【0415】
本開示の抗体又は多重特異性抗体はまた、がんなどの疾患を発症するリスクを低減させるために、予防的に投与され得る。
【0416】
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍｌの滅菌緩衝水と、約１ｎｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約５０ｎｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ～約２５ｍｇ／ｋｇの本発明の本開示のＣＤ７９ｂ結合タンパク質と、を含むように調製することができる。
【0417】
本開示の実施形態では、抗体又は多重特異性抗体発現細胞は、抗体又は多重特異性抗体発現細胞と、医薬的に許容される担体と、を含む組成物、例えば、好適な医薬組成物において提供され得る。一態様では、本開示は、記載される抗体又は多重特異性抗体のうちの１つ又は２つ以上を発現する有効量のリンパ球と、医薬的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、抗体又は多重特異性抗体発現細胞、例えば、本明細書に記載されるような複数の多重特異性抗体発現細胞を、１つ又は２つ以上の医薬的若しくは生理学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤と組み合わせて含み得る。医薬的に許容される担体は、活性成分以外の、対象に対して無毒性である医薬組成物中の成分であり得る。
【0418】
医薬的に許容される担体としては、緩衝液、賦形剤、安定剤、又は防腐剤を挙げることができる。医薬的に許容される担体の例は、生理学的に適合性の溶剤、分散媒体、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などであり、例えば、塩、緩衝液、抗酸化剤、糖類、水性若しくは非水性担体、防腐剤、湿潤剤、界面活性剤、若しくは乳化剤、又はこれらの組み合わせである。医薬組成物中の医薬的に許容される担体の量は、担体の活性及び製剤の所望の特性、例えば安定性及び／又は最小酸化に基づいて実験的に決定され得る。
【0419】
医薬組成物は、酢酸、クエン酸、ギ酸、コハク酸、リン酸、炭酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、ホウ酸、トリス緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチド又はアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）；抗菌剤及び抗真菌剤；並びに防腐剤を含み得る。
【0420】
本開示の医薬組成物は、非経口投与又は経口投与の様々な手段のために製剤化することができる。一実施形態では、組成物は、注入又は静脈内投与向けに製剤化され得る。本明細書に開示される医薬組成物は、例えば、無菌液体調製物、例えば、等張水溶液、乳剤、懸濁液、分散液、又は粘性組成物として提供することができ、これらは、所望のｐＨに緩衝され得る。経口投与に好適な製剤としては、液体溶液、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤、ドロップ剤、及びトローチ剤、適切な液体及び乳剤中の粉末液体懸濁液を挙げることができる。
【0421】
医薬組成物に関して本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される」という用語は、動物及び／又はヒトにおける使用について、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。
【0422】
本明細書で使用されるとき、「医薬的に許容される担体」という用語は、生理学的に適合性である、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、及び抗真菌剤などを含む。好適な担体、希釈剤、及び／又は賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１つ又は２つ以上、並びにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。多くの場合、等張性剤、例えば、糖、ポリアルコール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含めるのが好ましい。特に、好適な担体の関連する例としては、（１）ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ約７．４、約１ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを含有又は不含、（２）０．９％の生理食塩水（０．９％重量／体積の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））、及び（３）５％（重量／体積）のデキストロースが挙げられ、抗酸化剤、例えば、トリプタミン、及び安定化剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）も含有してもよい。
【0423】
本明細書における組成物はまた、治療されている特定の疾患にとって必要な場合には、更なる治療剤を含有してもよい。一実施形態では、抗体又は多重特異性抗体又は結合断片及び補助的な活性化合物は、互いに有害に影響を及ぼさない補完的な活性を有することとなる。
【0424】
本発明の組成物は、様々な形態にあってもよい。これらには、例えば、液体、半固体、及び固体の剤形が挙げられるが、好ましい形態は、意図された投与様式及び治療用途により決まる。典型的に好ましい組成物は、注射液又は注入可能な溶液の形態である。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）である。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ボーラス又は一定期間にわたる連続的な注入により静脈投与される。別の好ましい実施形態では、本組成物は、局所並びに全身的な治療効果を発揮するために、筋肉内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、又は病巣周囲の経路により注射される。
【0425】
非経口投与用の無菌組成物が、本発明の抗体、抗体断片、又は抗体コンジュゲートを、必要とされる量で適切な溶媒に包含させ、続けて、マイクロフィルタ法により滅菌することにより調製され得る。溶媒又は賦形剤として、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、並びにこれらの組み合わせを使用することができる。多くの場合には、等張性剤、例えば、糖、ポリアルコール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。これらの組成物はまた、補助剤、特に、湿潤剤、等張化剤、乳化剤、分散剤、及び安定化剤を含有してもよい。非経口投与用の無菌組成物はまた、使用時に滅菌水又は任意の他の注射可能な無菌媒体中に溶解することができる、無菌の固体組成物の形態で調製されてもよい。
【0426】
抗体、多重特異性抗体、又は抗体断片はまた、経口投与されてもよい。経口投与用の固体組成物として、錠剤、丸剤、粉末剤（ゼラチンカプセル剤、サッシェ剤）、又は顆粒剤が使用されてもよい。これらの組成物において、本発明による活性成分は、１つ又は２つ以上の不活性希釈剤、例えば、デンプン、セルロース、スクロース、ラクトース、又はシリカと、アルゴン流下において混合される。これらの組成物はまた、希釈剤以外の物質、例えば、１つ又は２つ以上の滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルク、着色剤、コーティング（糖衣錠）、又はグレーズを含んでもよい。
【0427】
経口投与用の液体組成物として、不活性希釈剤、例えば、水、エタノール、グリセロール、植物油、又はパラフィンオイルを含有する、医薬的に許容され得る液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、及びエリキシル剤が使用されてもよい。これらの組成物は、希釈剤以外の物質、例えば、湿潤剤、甘味料、増粘剤、着香剤、又は安定化製品を含んでもよい。
【0428】
用量は、所望の効果、治療の期間、及び使用される投与経路により決まり、用量は、一般的には、成人では１日当たり経口で５ｍｇ～１０００ｍｇであり、単位用量は、活性物質１ｍｇ～２５０ｍｇの範囲である。一般的には、医師は、適切な用量を、処置される対象の年齢、体重、及び同対象に特異的な任意の他の要因に応じて決定する。
【0429】
検出方法
本開示はまた、サンプル中のＣＤ７９ｂ、ＣＤ２２、又は両方を検出する方法であって、サンプルを入手することと、サンプルを本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片と接触させることと、サンプル中の結合したＣＤ７９ｂ、ＣＤ２２、又は両方を検出することと、を含む、方法を提供する。
本開示はまた、サンプル中のＣＤ７９ｂ、ＣＤ２２、又は両方を検出する方法であって、サンプルを入手することと、サンプルを本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片と接触させることと、サンプル中の結合したＣＤ７９ｂ、ＣＤ２２、又は両方を検出することと、を含む、方法を提供する。
【0430】
いくつかの実施形態では、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、滑液、循環細胞、組織に会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科的に切除された組織、穿刺吸引を含む生検材料）、組織プレパラートなどに由来し得る。
【0431】
本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片は、既知の方法を使用して検出され得る。例示的な方法としては、蛍光若しくは化学発光標識、又は放射線標識を使用して抗体を直接標識すること、又は本発明の抗体に、ビオチン、酵素、又はエピトープタグなどの容易に検出可能な部分を結合させることが挙げられる。例示的な標識及び部分は、ルテニウム、１１１Ｉｎ－ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ－ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びベータガラクトシダーゼ、ポリ－ヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、及びＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料である。
【0432】
本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片は、サンプル中のＣＤ７９ｂ、ＣＤ２２、又は両方を検出するための様々なアッセイで使用され得る。例示的なアッセイは、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫沈降、平衡透析、免疫拡散、電気化学発光（electrochemiluminescence、ＥＣＬ）イムノアッセイ、免疫組織化学的検査、蛍光活性化細胞選別（fluorescence-activated cell sorting、ＦＡＣＳ）、又はＥＬＩＳＡアッセイである。
【0433】
治療及び使用方法
本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片は、自己免疫性疾患若しくは障害又はその１つ若しくは２つ以上の症状を管理、治療、予防、又は改善するために、それを必要とする対象に投与され得る。
本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片は、自己免疫性疾患若しくは障害又はその１つ若しくは２つ以上の症状を管理、治療、予防、又は改善するために、それを必要とする対象に投与され得る。
【0434】
本開示はまた、治療有効量の本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を、自己免疫性疾患を有する対象に投与することを含む方法を提供する。
【0435】
本開示はまた、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を含む、治療有効量の免疫コンジュゲートを、自己免疫性疾患を有する対象に投与することを含む方法を提供する。
【0436】
本開示はまた、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を含む、治療有効量の医薬組成物を、自己免疫性疾患を有する対象に投与することを含む方法を提供する。
【0437】
本開示はまた、対象における自己免疫性疾患を治療する方法であって、治療有効量の本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を、自己免疫性疾患を治療するのに十分な時間にわたって、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【0438】
本開示はまた、対象における自己免疫性疾患を治療する方法であって、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を含む、治療有効量の免疫コンジュゲートを、自己免疫性疾患を治療するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0439】
本開示はまた、対象における自己免疫性疾患を治療する方法であって、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を含む、治療有効量の医薬組成物を、自己免疫性疾患を治療するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0440】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、Ｂ細胞、自己反応性Ｂ細胞の調節不全、又は自己抗体の存在に関連するか、又はそれらによって特徴付けられる。自己免疫性疾患の例としては、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群（ＳｊＳ）、リウマチ性関節炎、自己免疫ミオパシー、１型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、自己免疫性膵炎、セリアック病、巣状糸球体硬化症、原発性膜性腎症、卵巣機能不全、自己免疫精巣炎、乾性眼疾患、特発性間質性肺炎、甲状腺疾患（例えば、グレーブス病）、全身性硬化症（強皮症）、筋無力症症候群、自己免疫脳炎、水疱性皮膚疾患、ＴＴＰ、ＩＴＰ、ＡＩＨＡ、Ａｎｃａ血管炎、心筋炎／拡張型ＣＭ、ＮＭＯＳＤ、母体－胎児同種免疫、母体－胎児自己免疫、抗カルジオリピン／抗リン脂質抗体症候群、高ガンマグロブリン血症、移植関連ＩＤ、多巣性運動ニューロパチーが挙げられるが、これらに限定されない。
【0441】
本開示はまた、対象における自己免疫性疾患を予防する方法であって、治療有効量の本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を、自己免疫性疾患を予防するのに十分な時間にわたって、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、予防することは、無症候性対象を治療することを含む。ある特定の実施形態では、予防することは、対象における自己免疫性疾患症状の発症を予防することを含む。
【0442】
本開示はまた、対象における自己免疫性疾患を予防する方法であって、治療有効量の本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を、自己免疫性疾患を治療するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0443】
本開示はまた、対象における自己免疫性疾患を予防する方法であって、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を含む、治療有効量の免疫コンジュゲートを、自己免疫性疾患を治療するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0444】
本開示はまた、対象における自己免疫性疾患を予防する方法であって、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を含む、治療有効量の医薬組成物を、自己免疫性疾患を予防するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0445】
一実施形態では、対象における自己免疫性疾患を予防する方法は、対象における自己抗体を検出することを更に含む。
【0446】
本開示はまた、対象におけるＢ細胞活性化を調節する方法であって、治療有効量の本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を、Ｂ細胞活性化を調節するのに十分な時間にわたって、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0447】
本開示はまた、対象におけるＢ細胞活性化を調節する複数の方法であって、治療有効量の本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を、Ｂ細胞活性化を調節するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0448】
本開示はまた、対象におけるＢ細胞活性化を調節する方法であって、治療有効量の本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を、Ｂ細胞活性化を調節するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0449】
本開示はまた、対象におけるＢ細胞活性化を調節する方法であって、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を含む、治療有効量の免疫コンジュゲートを、Ｂ細胞活性化を調節するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0450】
本開示はまた、対象におけるＢ細胞活性化を調節する方法であって、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を含む、治療有効量の医薬組成物を、Ｂ細胞活性化を調節するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0451】
本開示はまた、対象における異常なＢ細胞活性化を阻害する方法であって、治療有効量の本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を、異常なＢ細胞活性化を阻害するのに十分な時間にわたって、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0452】
本開示はまた、対象における異常なＢ細胞活性化を阻害する方法であって、治療有効量の本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を、異常なＢ細胞活性化を阻害するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0453】
本開示はまた、対象における異常なＢ細胞活性化を阻害する方法であって、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を含む、治療有効量の免疫コンジュゲートを、異常なＢ細胞活性化を阻害するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0454】
本開示はまた、対象における異常なＢ細胞活性化を阻害する方法であって、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を含む、治療有効量の医薬組成物を、異常なＢ細胞活性化を阻害するのに十分な時間にわたって、対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0455】
本開示はまた、対象における自己免疫性疾患を治療する方法であって、多重特異性抗体又は多重特異性結合断片を含む、治療有効量の組成物を、自己免疫性疾患を治療するのに十分な時間にわたって、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供し、多特異性抗体は、ＣＤ７９ｂ結合アーム及びＣＤ２２結合アームを含む。
【0456】
本開示はまた、対象における自己免疫性疾患を予防する方法であって、多重特異性抗体又は多重特異性結合断片を含む、治療有効量の組成物を、自己免疫性疾患を治療するのに十分な時間にわたって、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供し、多特異性抗体は、ＣＤ７９ｂ結合アーム及びＣＤ２２結合アームを含む。
【0457】
本開示はまた、対象におけるＢ細胞活性化を調節する方法であって、多重特異性抗体又は多重特異性結合断片を含む、治療有効量の組成物を、自己免疫性疾患を治療するのに十分な時間にわたって、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供し、多特異性抗体は、ＣＤ７９ｂ結合アーム及びＣＤ２２結合アームを含む。
【0458】
本開示はまた、対象における異常なＢ細胞活性化を阻害する方法であって、多重特異性抗体又は多重特異性結合断片を含む、治療有効量の組成物を、自己免疫性疾患を治療するのに十分な時間にわたって、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供し、多特異性抗体は、ＣＤ７９ｂ結合アーム及びＣＤ２２結合アームを含む。
【0459】
本開示はまた、多重特異性抗体又は多重特異性結合断片を含む組成物を、対象に投与することを含む方法を提供し、多特異性抗体は、ＣＤ７９ｂ結合アーム及びＣＤ２２結合アームを含む。
【0460】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、それぞれ配列番号１、２、３、４、５、及び６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ、及びＬＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２結合アームは、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む。
【0461】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９又は５７のＨＣＤＲ１、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０又は５８のＨＣＤＲ２、配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１又は５９のＨＣＤＲ３、配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２又は６０のＬＣＤＲ１、配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３又は６１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４、２２、３０，３８、４６、５４、又は６２のＬＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９ｂ結合アームは、配列番号１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３又は８０のＶＨ、及び配列番号１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４又は８１のＶＬを含む。
【0462】
治療有効量が指定されている場合、投与される本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片の正確な量は、対象の年齢、体重、及び状態における個々の差異を考慮して、医師が判断することができる。
【0463】
本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片の文脈における有用な送達システムは、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片の送達が、治療される部位の感作の前に、かつ感作を引き起こすために十分な時間で行われるように、徐放性、遅延放出、及び持続性放出送達システムを含み得る。組成物は、他の治療剤又は療法と併用することができる。かかるシステムは、組成物の反復投与を回避することにより、対象及び医師に対する利便性を高めることができ、本発明における特定の組成物の実施形態に対して特に好適であり得る。
【0464】
多くの種類の放出送達システムが利用可能であり、当業者に既知である。これらには、ポリ（ラクチド－グリコリド）、コポリオキサレート、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、及びポリ無水物などのポリマー基本成分システムが含まれる。前述の薬物含有ポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達システムとしてはまた、コレステロール、コレステロールエステルなどのステロール、並びに脂肪酸又はモノ－ジ－及びトリ－グリセリドなどの中性脂肪を含む脂質である非ポリマーシステム、シラスティックシステム、ペプチド基本成分システム、ヒドロゲル放出システム、ワックスコーティング、従来のバインダー及び賦形剤を使用した圧縮錠剤、部分的に融合したインプラントなども挙げられる。具体例としては、（ａ）米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６６７，０１４号、同第４，７４８，０３４号、及び同第５，２３９，６６０号に記載されているものなど、活性組成物がマトリックス内の形態で含有される侵食系、並びに（ｂ）米国特許第３，８５４，４８０号及び同第３，８３２，２５３号に記載されているものなどの活性成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散系が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、ポンプベースのハードウェア送達システムが使用され得、そのうちのいくつかは埋め込み用に適合されている。
【0465】
本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片の投与は、エアロゾル吸入、注射、注入、経口摂取、輸血、埋め込み、又は移植を含む、任意の方法、例えば、非経口投与又は非経腸投与によって実施することができる。例えば、本明細書に記載されるＣＤ７９ｂ結合タンパク質及び組成物は、経動脈、皮内、皮下、腫瘍内、髄内、節内、筋肉内経路で、静脈内（intravenous、ｉ．ｖ．）注射によって、又は腹腔内経路で患者に投与され得る。一態様では、本開示の組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与される。一態様では、本開示の組成物は、皮内注射又は皮下注射によって対象に投与される。本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片の組成物は、例えば、腫瘍、リンパ節、組織、器官、又は感染部位に直接注射することができる。
【0466】
一実施形態では、投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月以上後に繰り返され得る。また、治療過程を繰り返すことも、長期にわたる投与として可能である。反復投与は、同一用量であっても異なる用量であってもよい。
【0467】
組み合わせ療法
本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片は、少なくとも１つの追加の治療法と組み合わせて投与されてもよい。
本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片は、少なくとも１つの追加の治療法と組み合わせて投与されてもよい。
【0468】
本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片はまた、１つ又は２つ以上の他の療法と組み合わせて投与されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片は、自己免疫性疾患若しくは障害又は１つ若しくは２つ以上のその症状の予防、管理、治療、又は改善に有用な１つ又は２つ以上の他の療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与して、自己免疫性疾患若しくは障害又は１つ若しくは２つ以上のその症状を予防、管理、治療、又は改善してもよい。
【0469】
いくつかの実施形態では、１つの治療の送達は、第２の送達が開始されるときにも依然として起こるため、投与に関して重複がある。これは、本明細書において「同時」又は「同時送達」と称されることがある。他の実施形態では、１つの治療の送達は、もう１つの治療の送達が開始される前に終了する。いずれかの場合のいくつかの実施形態では、組み合わせ投与であることから、治療はより効果的である。例えば、第２の治療はより効果的であり、例えば、同等の効果が、第２の治療を少なくして見られ、又は第２の治療が、第１の治療なく第２の治療が施される場合に見られるよりも、症状を大幅に軽減し、又は第１の治療と同様の状況が見られる。いくつかの実施形態では、送達は、障害に関連する症状又は他のパラメータの軽減が、他の治療なしで送達される１つの治療で観察される軽減よりも大きくなるようなものである。２つの治療の効果は、部分的に相加的であるか、全体的に相加的であるか、又は相加的を超えるものであり得る。送達は、送達された第１の治療の効果が、第２の送達時に依然として検出可能であるようなものであり得る。
【0470】
一実施形態では、因子などの他の治療剤は、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片の前、後、又はそれと同時に（同時に）投与され得る。
【0471】
本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞などの本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片、及び少なくとも１つの追加の治療剤は、同じ若しくは別個の組成物で同時に、又は連続で投与することができる。連続投与の場合、本明細書に記載される抗体、多重特異性抗体、又は結合断片を最初に投与し、次に追加の薬剤を投与することができ、又は投与の順序を逆にすることができる。
【0472】
一実施形態では、対象に、本開示の抗体、多重特異性抗体、又は結合断片の活性を増強する薬剤を投与することができる。例えば、一実施形態では、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。
【0473】
配列
表３は、ＣＤＲ、ＶＨ、及びＶＬアミノ酸配列を提供する。
表３は、ＣＤＲ、ＶＨ、及びＶＬアミノ酸配列を提供する。
【0474】
【表5-1】
【0475】
【表5-2】
【0476】
表４は、ＶＨ及びＶＬヌクレオチド配列を提供する。
【0477】
【表6-1】
【0478】
【表6-2】
【0479】
【表6-3】
【0480】
表５は、ＣＤ７９ｂに結合するステープルされたｓｃＦｖの配列を提供する
【0481】
【表7】
【0482】
表６は、ＣＤ２２に結合するＦａｂの重鎖の配列を提供する。
【0483】
【表8】
【0484】
表７は、ＣＤ２２に結合するＦａｂの軽鎖の配列を提供する
【0485】
【表9】
【0486】
本明細書において開示した実施形態のいくつかを更に説明するために、以下の実施例を提供する。これらの実施例は、例示を目的とするものであって、本開示の実施形態を制限するものではない。
【実施例】
【0487】
下記実施例は、先の開示を補い、本明細書に記載された主題のより良好な理解を提供するために提供される。これらの実施例は、記載された主題を限定すると解釈されるべきでない。本明細書に記載された実施例及び実施形態は例示のみを目的とするものであり、それらを考慮した様々な修正又は変更は、当業者に明らかであり、また、本発明の真の範囲内に含まれ、かつ本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【0488】
（実施例１）
ＰＢＭＣ Ｂ細胞枯渇アッセイ
末梢血単核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell、ＰＢＭＣ）を、ＨｅｍａＣａｒｅ（Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）を介して、ヒトサンプル取得のための施設プロトコルに従って購入した。細胞を製造業者のプロトコルに従って解凍した。ＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳ、２％ペニシリン及びストレプトマイシン、１％Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Non-Essential Amino Acid、ＮＥＡＡ）、並びにピルビン酸ナトリウム［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ］を含有するＲＰＭＩと共に、９６ウェルＵ底プレート中で１×１０６個の細胞／ウェルで培養した。次いで、ＰＢＭＣを９０ｎＭのＣ１９２Ｂ３０、対照抗体又は陽性対照としての抗ヒトＣＤ２０ｍＡｂと共にインキュベートした。次いで、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。抗体とのインキュベーション後、プレートをスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、細胞をＤＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｌ３４９５７］を使用して、室温で５分間、細胞を生存率について染色した。プレートをスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、細胞を、Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）（Ｆｃ受容体ブロッキング溶液）［Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４２２３０２］を含有するＦＡＣｓ緩衝液に再懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。１５分後、細胞を、抗ＣＤ３ ＰｅｒＣｐ－Ｃｙ５．５［クローンＨＩＴ３ａ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３００３２８］、抗ＣＤ１９－ＰＥ［クローン４Ｇ７ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３９２５０６］、抗ＣＤ２２－ＰＥ［クローンＨＩＢ２２ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０２５０６］、及び抗ＣＤ２０－ＰＥ［クローン２Ｈ７ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０２３０６］を用いて、４℃で３０分間、製造業者が推奨する濃度で染色した。プレートをスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、ＦＡＣｓ緩衝液で２回洗浄し、製造業者の推奨に従ってＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液［ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５４６５５］で固定し、分析のために取得する前にＦＡＣｓ緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーデータを、最大１０個の蛍光色素を用いてＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で得、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。分析は、総Ｂ細胞枯渇％を決定するために、Ｂ細胞（ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ２０）対ＣＤ３集団を調べた。
ＰＢＭＣ Ｂ細胞枯渇アッセイ
末梢血単核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell、ＰＢＭＣ）を、ＨｅｍａＣａｒｅ（Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）を介して、ヒトサンプル取得のための施設プロトコルに従って購入した。細胞を製造業者のプロトコルに従って解凍した。ＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳ、２％ペニシリン及びストレプトマイシン、１％Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Non-Essential Amino Acid、ＮＥＡＡ）、並びにピルビン酸ナトリウム［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ］を含有するＲＰＭＩと共に、９６ウェルＵ底プレート中で１×１０６個の細胞／ウェルで培養した。次いで、ＰＢＭＣを９０ｎＭのＣ１９２Ｂ３０、対照抗体又は陽性対照としての抗ヒトＣＤ２０ｍＡｂと共にインキュベートした。次いで、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。抗体とのインキュベーション後、プレートをスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、細胞をＤＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｌ３４９５７］を使用して、室温で５分間、細胞を生存率について染色した。プレートをスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、細胞を、Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）（Ｆｃ受容体ブロッキング溶液）［Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４２２３０２］を含有するＦＡＣｓ緩衝液に再懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。１５分後、細胞を、抗ＣＤ３ ＰｅｒＣｐ－Ｃｙ５．５［クローンＨＩＴ３ａ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３００３２８］、抗ＣＤ１９－ＰＥ［クローン４Ｇ７ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３９２５０６］、抗ＣＤ２２－ＰＥ［クローンＨＩＢ２２ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０２５０６］、及び抗ＣＤ２０－ＰＥ［クローン２Ｈ７ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０２３０６］を用いて、４℃で３０分間、製造業者が推奨する濃度で染色した。プレートをスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、ＦＡＣｓ緩衝液で２回洗浄し、製造業者の推奨に従ってＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液［ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５４６５５］で固定し、分析のために取得する前にＦＡＣｓ緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーデータを、最大１０個の蛍光色素を用いてＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で得、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。分析は、総Ｂ細胞枯渇％を決定するために、Ｂ細胞（ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ２０）対ＣＤ３集団を調べた。
【0489】
下流ＢＣＲシグナル伝達カスケード評価
精製されたヒトＢ細胞を、ヒトサンプル取得のための施設プロトコルに従って、ＨｅｍａＣａｒｅ（Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）から購入した。細胞を製造業者のプロトコルに従って解凍した。Ｂ細胞を計数し、１．５×１０５個の細胞／ウェルの濃度で９６ウェル丸底プレートにプレーティングした。プレーティング後、Ｂ細胞をＣ１９２Ｂ３０又は対照分子と共に４℃で３０分間インキュベートした。３０分のインキュベーション時間後、抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’２）（２０μｇ／ｍＬ）［Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログ番号１０９－００６－１２９］を温培地で希釈し、Ｃ１９２Ｂ３０、対照分子又は培地単独（刺激対照）を含有するウェルに添加した。同時に、抗ＩｇＭを含有しない温培地を、刺激なし対照としてウェルに添加した。示された時点（０～３０分）で、Ｂ細胞を、固定緩衝液Ｉ［ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号５５７８７０］を既に含有する別個のＵ底プレートに移した。最終時点の後、プレートをスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、染色緩衝液［ＤＰＢＳ＋２％ＨＩＦＣＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ］で洗浄／再懸濁した。細胞を洗浄した後、プレートを再びスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、製造業者のプロトコルに従って、冷却したｐｅｒｍ緩衝液ＩＩ［ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号５５８０５２］を用いて氷上で透過処理した。透過処理後、プレートをスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、染色緩衝液で２回洗浄し、Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）（Ｆｃ受容体ブロッキング溶液）［Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４２２３０２］で１５分間ブロッキングし、次いで、抗ｐＳｙｋ（Ｙ３５２）－ＰＥ抗体［ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号５５７８８１］及び抗ｐＰＬＣｇ２（Ｙ７５９）－Ａｌｅｘａ ６４７［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１７－９８６６－４２］で氷上で１時間標識した。プレートをスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、ＦＡＣｓ緩衝液で２回洗浄し、製造業者の推奨に従ってＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液［ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５４６５５］で固定し、分析のために取得する前にＦＡＣｓ緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーデータを、最大１０個の蛍光色素を用いてＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で得、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。ＭＦＩを決定し、式＝１００＊（１－（（刺激平均－化合物ウェル（対象の化合物処理ウェルの生データ））／（刺激平均－未刺激平均）））によって定義される阻害％と共にグラフ化した。
精製されたヒトＢ細胞を、ヒトサンプル取得のための施設プロトコルに従って、ＨｅｍａＣａｒｅ（Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）から購入した。細胞を製造業者のプロトコルに従って解凍した。Ｂ細胞を計数し、１．５×１０５個の細胞／ウェルの濃度で９６ウェル丸底プレートにプレーティングした。プレーティング後、Ｂ細胞をＣ１９２Ｂ３０又は対照分子と共に４℃で３０分間インキュベートした。３０分のインキュベーション時間後、抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’２）（２０μｇ／ｍＬ）［Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログ番号１０９－００６－１２９］を温培地で希釈し、Ｃ１９２Ｂ３０、対照分子又は培地単独（刺激対照）を含有するウェルに添加した。同時に、抗ＩｇＭを含有しない温培地を、刺激なし対照としてウェルに添加した。示された時点（０～３０分）で、Ｂ細胞を、固定緩衝液Ｉ［ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号５５７８７０］を既に含有する別個のＵ底プレートに移した。最終時点の後、プレートをスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、染色緩衝液［ＤＰＢＳ＋２％ＨＩＦＣＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ］で洗浄／再懸濁した。細胞を洗浄した後、プレートを再びスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、製造業者のプロトコルに従って、冷却したｐｅｒｍ緩衝液ＩＩ［ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号５５８０５２］を用いて氷上で透過処理した。透過処理後、プレートをスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、染色緩衝液で２回洗浄し、Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）（Ｆｃ受容体ブロッキング溶液）［Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４２２３０２］で１５分間ブロッキングし、次いで、抗ｐＳｙｋ（Ｙ３５２）－ＰＥ抗体［ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号５５７８８１］及び抗ｐＰＬＣｇ２（Ｙ７５９）－Ａｌｅｘａ ６４７［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１７－９８６６－４２］で氷上で１時間標識した。プレートをスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、ＦＡＣｓ緩衝液で２回洗浄し、製造業者の推奨に従ってＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液［ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５４６５５］で固定し、分析のために取得する前にＦＡＣｓ緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーデータを、最大１０個の蛍光色素を用いてＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で得、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。ＭＦＩを決定し、式＝１００＊（１－（（刺激平均－化合物ウェル（対象の化合物処理ウェルの生データ））／（刺激平均－未刺激平均）））によって定義される阻害％と共にグラフ化した。
【0490】
Ｂ細胞増殖及びサイトカイン産生
精製されたヒトＢ細胞を、ヒトサンプル取得のための施設プロトコルに従って、ＨｅｍａＣａｒｅ（Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）から購入した。細胞を製造業者のプロトコルに従って解凍した。精製されたＢ細胞を、１０％ＦＢＳ、２％ペニシリン及びストレプトマイシン、１％Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、並びにピルビン酸ナトリウム［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ］を含有するＤＭＥＭと共に、３８４ウェル不透明壁プレート中で３×１０４個の細胞／ウェルで培養した。プレーティング後、Ｂ細胞をＣ１９２Ｂ３０又は対照分子と共に４℃で３０分間インキュベートした。３０分のインキュベーション時間の後、抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’２）（１０μｇ／ｍＬ）［Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログ番号１０９－００６－１２９］及びＣＰＧ（０．３１２５μＭ）［Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎカタログ番号ｔｌｒｌ－２００６－５］を、Ｃ１９２Ｂ３０、対照分子、又は培地単独（刺激対照）を含有するウェルに添加した。同時に、抗ＩｇＭ又はＣＰＧを含有しない温培地を、刺激なし対照としてウェルに添加した。７２時間後、５０μＬの上清を更なる分析のために別の３８４ウェルプレートに移し、－８０℃で保存した。Ｂ細胞を含有する元のプレートを、製造業者のプロトコルに従って５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ２．０［Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ９２４１］をウェルに添加することによって、増殖について直ちに分析した。次いで、サンプルを発光について分析した。簡潔には、プレートをオービタルシェーカー上に２分間置き、室温で１０分間インキュベートし、次いで、ＰｈｅｒａＳｔａｒ［ＢＭＧＬａｂＴｅｃｈ］上で発光について記録した。次に、先の工程で保存した上清も、製造業者のプロトコルに従ってＭＳＤ［ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｏｎｓｉｔｉｃｓカタログ番号Ｋ１５１ＴＸＫ］を介してＩＬ－６産生について分析した。式＝１００＊（１－（（刺激平均－化合物ウェル（対象の化合物処理ウェルの生データ））／（刺激平均－未刺激平均）））によって定義されるように、増殖及びサイトカイン産生の両方についてパーセント阻害を計算した。
精製されたヒトＢ細胞を、ヒトサンプル取得のための施設プロトコルに従って、ＨｅｍａＣａｒｅ（Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）から購入した。細胞を製造業者のプロトコルに従って解凍した。精製されたＢ細胞を、１０％ＦＢＳ、２％ペニシリン及びストレプトマイシン、１％Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、並びにピルビン酸ナトリウム［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ］を含有するＤＭＥＭと共に、３８４ウェル不透明壁プレート中で３×１０４個の細胞／ウェルで培養した。プレーティング後、Ｂ細胞をＣ１９２Ｂ３０又は対照分子と共に４℃で３０分間インキュベートした。３０分のインキュベーション時間の後、抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’２）（１０μｇ／ｍＬ）［Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログ番号１０９－００６－１２９］及びＣＰＧ（０．３１２５μＭ）［Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎカタログ番号ｔｌｒｌ－２００６－５］を、Ｃ１９２Ｂ３０、対照分子、又は培地単独（刺激対照）を含有するウェルに添加した。同時に、抗ＩｇＭ又はＣＰＧを含有しない温培地を、刺激なし対照としてウェルに添加した。７２時間後、５０μＬの上清を更なる分析のために別の３８４ウェルプレートに移し、－８０℃で保存した。Ｂ細胞を含有する元のプレートを、製造業者のプロトコルに従って５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ２．０［Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ９２４１］をウェルに添加することによって、増殖について直ちに分析した。次いで、サンプルを発光について分析した。簡潔には、プレートをオービタルシェーカー上に２分間置き、室温で１０分間インキュベートし、次いで、ＰｈｅｒａＳｔａｒ［ＢＭＧＬａｂＴｅｃｈ］上で発光について記録した。次に、先の工程で保存した上清も、製造業者のプロトコルに従ってＭＳＤ［ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｏｎｓｉｔｉｃｓカタログ番号Ｋ１５１ＴＸＫ］を介してＩＬ－６産生について分析した。式＝１００＊（１－（（刺激平均－化合物ウェル（対象の化合物処理ウェルの生データ））／（刺激平均－未刺激平均）））によって定義されるように、増殖及びサイトカイン産生の両方についてパーセント阻害を計算した。
【0491】
インビボ有効性モデル
Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ＬＬＣ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅは、マウスを含む全ての実験手順を承認した。雌性ＮＳＧ（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒガンマｎｕｌｌ）マウスを、６～１２週齢でＪａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。マウスは、ヒトＰＢＭＣ移入の１日前に全身照射を受けた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＨｅｍａＣａｒｅ（Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）を介して、ヒトサンプル取得のための施設プロトコルに従って購入した。細胞を製造業者のプロトコルに従って解凍した。ＰＢＭＣ濃度をＲＰＭＩ－１６４０中で１５×１０７／ｍＬに調整し、注射前に氷上で短時間保存した。２５－Ｇ×５／８－インチの１－ｃｃツベルクリンシリンジを使用して、０．１ｍｌ（１５×１０６個のＰＢＭＣ）を、腹腔内（intra-peritoneum、ＩＰ）注射を介して腹腔内に注射する。ヒトＰＢＭＣの注射後、抗体をＩＰ経路、アイソタイプ（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ１９２Ｂ３０（示された用量）、又はＰＢＳで投与した。動物を臨床症状についてモニターし、体重をＩＡＣＵＣプロトコルに従って記録した。生着の７日後、動物を安楽死させ、心臓穿刺を行って、全血を採取した。遠心分離（１７，０００ＲＣＦ、１分）後に血清を得た。血清を等分し、ヒト抗体産生の分析のために－８０℃で保存した。ヒト抗体産生を、ＭｉｌｌｉＰｌｅｘヒトアイソタイピング磁気ビーズパネル［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａカタログ番号ＨＧＡＭＭＡＧ－３０１ｋ］を介して製造業者のプロトコルに従って測定した。マウス血清の希釈物を１：１００希釈で使用した。
Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ＬＬＣ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅは、マウスを含む全ての実験手順を承認した。雌性ＮＳＧ（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒガンマｎｕｌｌ）マウスを、６～１２週齢でＪａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。マウスは、ヒトＰＢＭＣ移入の１日前に全身照射を受けた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＨｅｍａＣａｒｅ（Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）を介して、ヒトサンプル取得のための施設プロトコルに従って購入した。細胞を製造業者のプロトコルに従って解凍した。ＰＢＭＣ濃度をＲＰＭＩ－１６４０中で１５×１０７／ｍＬに調整し、注射前に氷上で短時間保存した。２５－Ｇ×５／８－インチの１－ｃｃツベルクリンシリンジを使用して、０．１ｍｌ（１５×１０６個のＰＢＭＣ）を、腹腔内（intra-peritoneum、ＩＰ）注射を介して腹腔内に注射する。ヒトＰＢＭＣの注射後、抗体をＩＰ経路、アイソタイプ（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ１９２Ｂ３０（示された用量）、又はＰＢＳで投与した。動物を臨床症状についてモニターし、体重をＩＡＣＵＣプロトコルに従って記録した。生着の７日後、動物を安楽死させ、心臓穿刺を行って、全血を採取した。遠心分離（１７，０００ＲＣＦ、１分）後に血清を得た。血清を等分し、ヒト抗体産生の分析のために－８０℃で保存した。ヒト抗体産生を、ＭｉｌｌｉＰｌｅｘヒトアイソタイピング磁気ビーズパネル［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａカタログ番号ＨＧＡＭＭＡＧ－３０１ｋ］を介して製造業者のプロトコルに従って測定した。マウス血清の希釈物を１：１００希釈で使用した。
【0492】
実験結果
ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体の非枯渇能力を調べるために、実験を行った（図１）。ＰＢＭＣを、培地単独、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３０、配列番号１～６及び９～１４のＣＤＲを含む）、ＣＤ２２×アイソタイプ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３６）、アイソタイプ×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ２）、又は抗ＣＤ２０枯渇ｍＡｂと共に４８時間培養した。４８時間後、細胞を生細胞（Ｚｏｍｂｉｅ Ｄｙｅ Ａｑｕａ）、Ｔ細胞（ＣＤ３）、及びＢ細胞（ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ１９）について染色した。次いで、ｂ細胞のパーセントを、培地単独ウェルと比較して計算した。図１に示されるように、二重特異性抗体は、いずれの二重特異性フォーマットにおいてもＢ細胞の枯渇をほとんど又は全く有さなかったが、抗ＣＤ２０枯渇ｍＡｂの陽性対照は、ＰＢＭＣにおけるＢ細胞の有意な減少を示した。
ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体の非枯渇能力を調べるために、実験を行った（図１）。ＰＢＭＣを、培地単独、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３０、配列番号１～６及び９～１４のＣＤＲを含む）、ＣＤ２２×アイソタイプ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３６）、アイソタイプ×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ２）、又は抗ＣＤ２０枯渇ｍＡｂと共に４８時間培養した。４８時間後、細胞を生細胞（Ｚｏｍｂｉｅ Ｄｙｅ Ａｑｕａ）、Ｔ細胞（ＣＤ３）、及びＢ細胞（ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ１９）について染色した。次いで、ｂ細胞のパーセントを、培地単独ウェルと比較して計算した。図１に示されるように、二重特異性抗体は、いずれの二重特異性フォーマットにおいてもＢ細胞の枯渇をほとんど又は全く有さなかったが、抗ＣＤ２０枯渇ｍＡｂの陽性対照は、ＰＢＭＣにおけるＢ細胞の有意な減少を示した。
【0493】
Ｂ細胞近位シグナルを調べるための実験も行った（図２）。Ｂ細胞近位シグナル（ｐ－Ｓｙｋ、ｐ－ＰＬＣγ２）は、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体によって阻害された。精製されたＢ細胞を、刺激前に以下のものと共に３０分間培養した：培地単独、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３０、配列番号１～６及び９～１４のＣＤＲを含む）、ＣＤ２２×アイソタイプ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３６）、及びアイソタイプ×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ２）。３０分が経過した後、Ｂ細胞を抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ）’２（２０μｇ／ｍＬ）で刺激して、ＦｃγＲ結合に関与している可能性があるあらゆる交絡因子を回避した。次いで、Ｂ細胞を所定の時点（０、５、８、１０、１５及び３０分）で固定した。固定後、細胞を、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）複合体の下流リンタンパク質シグナル伝達分子（ｐ－Ｓｙｋ、ｐ－ＰＬＣγ２）について染色した。図２のデータは、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体が、刺激対照又はアイソタイプ対照アーム対照と比較して、ｐ－Ｓｙｋ及びｐ－ＰＬＣγ２を阻害することによって、ＢＣＲ複合体を介してシグナル伝達するＢ細胞の能力に有意に影響を与えたことを示す。
【0494】
増殖及びサイトカイン分泌のＢ細胞遠位リードアウトを調べるための実験も行った（図３）。Ｂ細胞遠位リードアウト（増殖、サイトカイン分泌）は、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体によって著しく阻害された。精製されたＢ細胞を、刺激前に以下のものと共に３０分間培養した：ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３０、配列番号１～６及び９～１４のＣＤＲを含む）、ＣＤ２２×アイソタイプ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３６）、及びアイソタイプ×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ２）。３０分後、Ｂ細胞を相乗用量の抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ）’２（２．５μｇ／ｍＬ）及びＣＰＧ（０．３１２５μＭ）で刺激した。図３に示されるように、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ抗体は、アイソタイプ対照アームと比較して、ＢＣＲ＋ＴＬＲ刺激に応答してＢ細胞増殖を著しく低減させることができた。更に、Ｂ細胞ＩＬ－６産生は、著しく影響を受けたが、ここでもアイソタイプ対照アームは、ほとんど又は全く効果を示さなかった。
【0495】
ＩｇＭ抗体産生を調べるための実験も行った（図４）。ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体は、ＮＳＧ－ヒトＰＢＭＣ移入モデルからのＩｇＭ抗体産生をインビボで阻害した。ヒトＰＢＭＣを、照射された免疫不全マウス－ＮＳＧ（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒガンマｎｕｌｌ）に移入した。次いで、マウスを、様々な用量のＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（配列番号１～６及び９～１４のＣＤＲを含む；０．２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び５ｍｇ／ｋｇ）又はアイソタイプ対照抗体（５ｍｇ／ｋｇ）で処理した。次いで、細胞を７時間生着させた。この間に、Ｂ細胞は、ヒト抗体をインビボで産生し始めた。７日後、動物を屠殺し、フローサイトメトリーのための脾細胞、及び分析のために血清を採取した。血清は、対照（ＰＢＳ及びアイソタイプ）と比較して、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体で処置した５ｍｇ／ｋｇ群においてヒトＩｇＭの有意な低減を示した。
【0496】
（実施例２）
ステープルされたＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ ｓｃＦｖ結合分子を開発した。表５～７に提供される配列に示されるように、二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体との相互作用を低減させるための、両方のＦｃドメインにおけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓ（ＡＡＳ）の変異、並びに分子の半減期を延長するための、両方のＦｃドメインにおけるＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）の変異を特徴とする。二重特異性抗体のヘテロ二量体化は、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）プラットフォーム変異を使用することによって増強された。具体的には、ＣＤ７９ｂ結合アームは、「ノブ」（Ｔ３６６Ｗ）ＦｃドメインのＮ末端上に融合されたｓｃＦｖを含み、ＣＤ２２結合アームは、「ホール」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）ＦｃドメインのＮ末端上に融合したＦａｂを含む。更に、ＣＤ２２結合アームは、プロテインＡ結合を破壊するための「ＲＦ」変異（Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ）を含む。
ステープルされたＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ ｓｃＦｖ結合分子を開発した。表５～７に提供される配列に示されるように、二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体との相互作用を低減させるための、両方のＦｃドメインにおけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓ（ＡＡＳ）の変異、並びに分子の半減期を延長するための、両方のＦｃドメインにおけるＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）の変異を特徴とする。二重特異性抗体のヘテロ二量体化は、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）プラットフォーム変異を使用することによって増強された。具体的には、ＣＤ７９ｂ結合アームは、「ノブ」（Ｔ３６６Ｗ）ＦｃドメインのＮ末端上に融合されたｓｃＦｖを含み、ＣＤ２２結合アームは、「ホール」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）ＦｃドメインのＮ末端上に融合したＦａｂを含む。更に、ＣＤ２２結合アームは、プロテインＡ結合を破壊するための「ＲＦ」変異（Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ）を含む。
【0497】
実施例１で使用された二重特異性分子と比較して、ＣＤ７９ｂ結合アームのステープリング（図５）は、配列番号８２のアミノ酸配列を有するステープルされたｓｃＦｖにおいて示されるように、ＶＨ、ＶＬ、及びリンカー領域におけるアミノ酸変化を誘導することによって達成された。ステープルされた二重特異性抗体（ｓｐＦｖ）は、配列番号７９、配列番号８３、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含む。
【0498】
実験方法及び結果を以下に記載する。
【0499】
凝集実験
３０ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を有するＡｍｉｃｏｎ遠心限外濾過装置を使用して、分子の高濃縮を達成した。最初に、各タンパク質のアリコートを同じ出発濃度に希釈し、１０分間隔で、４０００×ｇで遠心分離した。各１０分間の遠心分離段階の終了時に、濃縮器を遠心分離器から取り出し、残りのサンプル体積の視覚的推定値を記録した。以下の結果のうちの１つが達成されるまで、全てのサンプルについて濃縮工程を繰り返した：（１）サンプルが標的濃度に基づく標的体積（例えば、３０ｍｇの初期タンパク質に対して２００μＬ）に達した、及び（２）サンプルが溶液から沈殿した。
３０ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を有するＡｍｉｃｏｎ遠心限外濾過装置を使用して、分子の高濃縮を達成した。最初に、各タンパク質のアリコートを同じ出発濃度に希釈し、１０分間隔で、４０００×ｇで遠心分離した。各１０分間の遠心分離段階の終了時に、濃縮器を遠心分離器から取り出し、残りのサンプル体積の視覚的推定値を記録した。以下の結果のうちの１つが達成されるまで、全てのサンプルについて濃縮工程を繰り返した：（１）サンプルが標的濃度に基づく標的体積（例えば、３０ｍｇの初期タンパク質に対して２００μＬ）に達した、及び（２）サンプルが溶液から沈殿した。
【0500】
遠心分離プロセスの終了時に、濃縮サンプルを回収し、勾配分光法を使用してタンパク質含量を決定した。次いで、最大に濃縮されたタンパク質のアリコートを所定の中間濃度（例えば、５０及び１００ｍｇ／ｍＬ）に希釈した。次いで、サンプルを、それらの様々な濃度状態で、４℃、２５℃、及び４０℃で２週間保存した。凝集を分析ＳＥＣによって決定し、濃度及び保存温度によって定義されたサンプルの各々を、分析直前に１ｍｇ／ｍＬに希釈した。
【0501】
図５に示されるように、ステープルの導入は、全ての温度及び濃度で、高分子量凝集体の形成をほぼ完全に排除した。
【0502】
Ｂ細胞増殖及びサイトカイン産生
精製されたヒトＢ細胞を、ヒトサンプル取得のための施設プロトコルに従って、ＨｅｍａＣａｒｅ（Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）から購入した。細胞を製造業者のプロトコルに従って解凍した。精製されたＢ細胞を、１０％ＦＢＳ、２％ペニシリン及びストレプトマイシン、１％Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ］及び０．０５ｍＭβ－メルカプトエタノールを含有するＤＭＥＭと共に、３８４ウェル不透明壁プレート中で３×１０４個の細胞／ウェルで培養した。プレーティング後、Ｂ細胞を、ＷＴ（（１）両方のＦｃドメインにおけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓ（ＡＡＳ）、（２）ＣＤ７９ｂ Ｆｃドメインにおけるノブ（Ｔ３６６Ｗ）及びＣＤ２２Ｆｃドメインにおけるホール（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）、並びに（３）ＣＤ２２ ＦｃドメインにおけるＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ（ＲＦ）を有する、ステープルされていない対照分子）、ＹＴＥ（ＷＴと同じであるが、両方のＦｃドメインにおいてＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）を更に有する）、及びステープルされたＹＴＥ（ＹＴＥと同じＣＤＲ及びＦｃ変異であるが、ステープルされたｓｃＦｖを有する）分子を４℃で３０分間インキュベートした。３０分間のインキュベーション時間の後、抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’２）（１０μｇ／ｍＬ）［Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログ番号１０９－００６－１２９］又は抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’２）（２．５μｇ／ｍＬ）及びＣＰＧ（０．３１２５μＭ）［Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎカタログ番号ｔｌｒｌ－２００６－５］をウェルに添加するか、又は培地のみ（刺激対照）を添加した。同時に、抗ＩｇＭ又はＣＰＧを含有しない温培地を、刺激なし対照としてウェルに添加した。７２時間後、５０μＬの上清を更なる分析のために別の３８４ウェルプレートに移し、－８０℃で保存した。Ｂ細胞を含有する元のプレートを、製造業者のプロトコルに従って５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ２．０［Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ９２４１］をウェルに添加することによって、増殖について直ちに分析した。次いで、サンプルを発光について分析した。簡潔に言うと、プレートをオービタルシェーカー上に２分間置き、室温で１０分間インキュベートし、次いで、ＰｈｅｒａＳｔａｒ［ＢＭＧＬａｂＴｅｃｈ］上で発光について記録した。次に、先の工程で保存した上清も、製造業者のプロトコルに従ってＭＳＤ［ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｏｎｓｉｔｉｃｓカタログ番号Ｋ１５０６７Ｌ］を介してＩＬ－６産生について分析した。式＝１００＊（１－（（刺激平均－化合物ウェル（対象の化合物処理ウェルの生データ））／（刺激平均－未刺激平均）））によって定義されるように、増殖及びサイトカイン産生の両方についてパーセント阻害を計算した。
精製されたヒトＢ細胞を、ヒトサンプル取得のための施設プロトコルに従って、ＨｅｍａＣａｒｅ（Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）から購入した。細胞を製造業者のプロトコルに従って解凍した。精製されたＢ細胞を、１０％ＦＢＳ、２％ペニシリン及びストレプトマイシン、１％Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ］及び０．０５ｍＭβ－メルカプトエタノールを含有するＤＭＥＭと共に、３８４ウェル不透明壁プレート中で３×１０４個の細胞／ウェルで培養した。プレーティング後、Ｂ細胞を、ＷＴ（（１）両方のＦｃドメインにおけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓ（ＡＡＳ）、（２）ＣＤ７９ｂ Ｆｃドメインにおけるノブ（Ｔ３６６Ｗ）及びＣＤ２２Ｆｃドメインにおけるホール（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）、並びに（３）ＣＤ２２ ＦｃドメインにおけるＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ（ＲＦ）を有する、ステープルされていない対照分子）、ＹＴＥ（ＷＴと同じであるが、両方のＦｃドメインにおいてＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）を更に有する）、及びステープルされたＹＴＥ（ＹＴＥと同じＣＤＲ及びＦｃ変異であるが、ステープルされたｓｃＦｖを有する）分子を４℃で３０分間インキュベートした。３０分間のインキュベーション時間の後、抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’２）（１０μｇ／ｍＬ）［Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログ番号１０９－００６－１２９］又は抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’２）（２．５μｇ／ｍＬ）及びＣＰＧ（０．３１２５μＭ）［Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎカタログ番号ｔｌｒｌ－２００６－５］をウェルに添加するか、又は培地のみ（刺激対照）を添加した。同時に、抗ＩｇＭ又はＣＰＧを含有しない温培地を、刺激なし対照としてウェルに添加した。７２時間後、５０μＬの上清を更なる分析のために別の３８４ウェルプレートに移し、－８０℃で保存した。Ｂ細胞を含有する元のプレートを、製造業者のプロトコルに従って５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ２．０［Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ９２４１］をウェルに添加することによって、増殖について直ちに分析した。次いで、サンプルを発光について分析した。簡潔に言うと、プレートをオービタルシェーカー上に２分間置き、室温で１０分間インキュベートし、次いで、ＰｈｅｒａＳｔａｒ［ＢＭＧＬａｂＴｅｃｈ］上で発光について記録した。次に、先の工程で保存した上清も、製造業者のプロトコルに従ってＭＳＤ［ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｏｎｓｉｔｉｃｓカタログ番号Ｋ１５０６７Ｌ］を介してＩＬ－６産生について分析した。式＝１００＊（１－（（刺激平均－化合物ウェル（対象の化合物処理ウェルの生データ））／（刺激平均－未刺激平均）））によって定義されるように、増殖及びサイトカイン産生の両方についてパーセント阻害を計算した。
【0503】
Ｂ細胞活性化マーカー発現
ＰＢＭＣを、ヒトサンプル取得のための施設プロトコルに従って、ＨｅｍａＣａｒｅ（Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）から購入した。細胞を製造業者のプロトコルに従って解凍した。ＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳ、２％ペニシリン及びストレプトマイシン［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ］を含有するＲＰＭＩと共に、９６ウェルプレート中で、３×１０５個の細胞／ウェルで培養した。プレーティング後、ＰＢＭＣを分子と共に４℃で３０分間インキュベートした。３０分間のインキュベーション時間の後、抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’２）（１０μｇ／ｍＬ）［Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログ番号１０９－００６－１２９］をウェルに添加した。対照ウェルでは、抗ＩｇＭを含有しない培地を刺激なし対照としてウェルに添加した。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏ ５０６（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣｓ緩衝液（１％ＦＢＳ及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で洗浄し、続いて抗ＣＤ２０－ＰＥ［クローン２Ｈ７ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２３４８］、抗ＣＤ６９ ＡＦ７００［クローンＦＮ５０ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１０９２２］、及び抗ＣＤ８３ ＡＰＣ／Ｃｙ７［クローンＨＢ１５ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０５３３０］を用いて、４℃で３０分間、製造業者の推奨濃度に従って表面染色した。プレートをスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、ＦＡＣｓ緩衝液で２回洗浄し、次いで製造業者の推奨に従ってＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液［ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５４６５５］で固定した。次いで、細胞を分析のために取得する前にＦＡＣｓ緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーデータを、ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。細胞を、生細胞、リンパ球、及びＣＤ２０陽性Ｂ細胞上でゲーティングした。活性化マーカーＣＤ６９又はＣＤ８３を発現するＢ細胞のパーセンテージを決定した。式＝１００＊（１－（（刺激平均－薬物処理ウェル（対象の薬物処理ウェルの生のデータ））／（刺激平均－未刺激平均）によって定義される阻害パーセント。
ＰＢＭＣを、ヒトサンプル取得のための施設プロトコルに従って、ＨｅｍａＣａｒｅ（Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）から購入した。細胞を製造業者のプロトコルに従って解凍した。ＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳ、２％ペニシリン及びストレプトマイシン［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ］を含有するＲＰＭＩと共に、９６ウェルプレート中で、３×１０５個の細胞／ウェルで培養した。プレーティング後、ＰＢＭＣを分子と共に４℃で３０分間インキュベートした。３０分間のインキュベーション時間の後、抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’２）（１０μｇ／ｍＬ）［Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログ番号１０９－００６－１２９］をウェルに添加した。対照ウェルでは、抗ＩｇＭを含有しない培地を刺激なし対照としてウェルに添加した。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏ ５０６（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣｓ緩衝液（１％ＦＢＳ及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で洗浄し、続いて抗ＣＤ２０－ＰＥ［クローン２Ｈ７ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２３４８］、抗ＣＤ６９ ＡＦ７００［クローンＦＮ５０ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１０９２２］、及び抗ＣＤ８３ ＡＰＣ／Ｃｙ７［クローンＨＢ１５ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０５３３０］を用いて、４℃で３０分間、製造業者の推奨濃度に従って表面染色した。プレートをスピンダウンし（３００ＲＣＦ、５分）、ＦＡＣｓ緩衝液で２回洗浄し、次いで製造業者の推奨に従ってＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液［ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５４６５５］で固定した。次いで、細胞を分析のために取得する前にＦＡＣｓ緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーデータを、ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。細胞を、生細胞、リンパ球、及びＣＤ２０陽性Ｂ細胞上でゲーティングした。活性化マーカーＣＤ６９又はＣＤ８３を発現するＢ細胞のパーセンテージを決定した。式＝１００＊（１－（（刺激平均－薬物処理ウェル（対象の薬物処理ウェルの生のデータ））／（刺激平均－未刺激平均）によって定義される阻害パーセント。
【0504】
実験結果
ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体は、増殖及びサイトカイン産生のＢ細胞遠位リードアウトに影響を与えた（図６）。Ｂ細胞遠位リードアウト（増殖、サイトカイン分泌）は、ステープルされたＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体によって強く阻害された。精製されたＢ細胞を、刺激前に以下のものと共に３０分間培養した：ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体、ＣＤ２２×アイソタイプ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３６）、及びアイソタイプ×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ２）。次いで、３０分間のインキュベーション後、Ｂ細胞を相乗用量の抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ）’２（２．５μｇ／ｍＬ）及びＣＰＧ（０．３１２５μＭ）で刺激した。図６に示されるように、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ抗体（ＷＴ、ＹＴＥ、ステープルされたＹＴＥ）は、アイソタイプ対照アームと比較して、ＢＣＲ及び＋ＴＬＲ刺激に応答してＢ細胞増殖を著しく低減させることができた。更に、ＷＴ、ＹＴＥ、及びステープルされたＹＴＥ分子の存在下でのＩＬ－６のＢ細胞ＩＬ－６産生は、減少したが（図６）、ここでもアイソタイプ対照アームは、ほとんど又は全く効果を示さなかった。
ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体は、増殖及びサイトカイン産生のＢ細胞遠位リードアウトに影響を与えた（図６）。Ｂ細胞遠位リードアウト（増殖、サイトカイン分泌）は、ステープルされたＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体によって強く阻害された。精製されたＢ細胞を、刺激前に以下のものと共に３０分間培養した：ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体、ＣＤ２２×アイソタイプ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ３６）、及びアイソタイプ×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ２）。次いで、３０分間のインキュベーション後、Ｂ細胞を相乗用量の抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ）’２（２．５μｇ／ｍＬ）及びＣＰＧ（０．３１２５μＭ）で刺激した。図６に示されるように、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ抗体（ＷＴ、ＹＴＥ、ステープルされたＹＴＥ）は、アイソタイプ対照アームと比較して、ＢＣＲ及び＋ＴＬＲ刺激に応答してＢ細胞増殖を著しく低減させることができた。更に、ＷＴ、ＹＴＥ、及びステープルされたＹＴＥ分子の存在下でのＩＬ－６のＢ細胞ＩＬ－６産生は、減少したが（図６）、ここでもアイソタイプ対照アームは、ほとんど又は全く効果を示さなかった。
【0505】
Ｂ細胞活性化に対するＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性の影響を調査するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）アッセイにおいて実験を行った。ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体は、活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ８３の発現の減少によって実証されるように、Ｂ細胞活性化を減少させた。抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ）’２（１０μｇ／ｍＬ）の添加前に、ＷＴ及びステープルされたＹＴＥ、又はアイソタイプ×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体（Ｃ１９２Ｂ２）と共に、ＰＢＭＣを３０分間プレインキュベートした。図７に示されるように、ＣＤ２２×ＣＤ７９ｂ抗体（ＷＴ及びステープルされたＹＴＥ）は、アイソタイプ×ＣＤ７９ｂ二重特異性抗体と比較して、ＩｇＭ ＢＣＲ刺激に応答したＢ細胞活性化を低減させた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】