知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2024-512060生産物の抗炎症反応を特徴づけるための方法、キットおよび組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-18
(54)【発明の名称】生産物の抗炎症反応を特徴づけるための方法、キットおよび組成物
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20240311BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240311BHJP
A61K 35/50 20150101ALN20240311BHJP
A61P 29/00 20060101ALN20240311BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 Z
C12Q1/02
A61K35/50
A61P29/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023558703
(86)(22)【出願日】2022-03-23
(85)【翻訳文提出日】2023-11-21
(86)【国際出願番号】 US2022021614
(87)【国際公開番号】W WO2022204330
(87)【国際公開日】2022-09-29
(31)【優先権主張番号】63/164,846
(32)【優先日】2021-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】17/215,921
(32)【優先日】2021-03-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523362548
【氏名又は名称】オルガノジェネシス，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094112
【弁理士】
【氏名又は名称】岡部 讓
(74)【代理人】
【識別番号】100136799
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 亜希
(74)【代理人】
【識別番号】100128668
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 正巳
(74)【代理人】
【識別番号】100189474
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 修
(72)【発明者】
【氏名】モーリー，ケイティ，シー．
(72)【発明者】
【氏名】キマーリング，ケリー，エー．
(72)【発明者】
【氏名】バーネット，ミランダ，ディー．
(72)【発明者】
【氏名】カマ―，メアリー，ローズ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4C087
【Ｆターム（参考）】
2G045AA24
2G045BB20
2G045DA36
2G045FB03
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ79
4B063QR77
4B063QR90
4B063QS24
4B063QS33
4B063QX01
4B063QX02
4C087BB58
4C087ZB11
(57)【要約】
羊膜由来材料を定量化ないし標準化する方法、および、特定の疾患または状態が羊膜由来材料を用いた治療に反応するかどうかを決定する方法が必要である。
そこで本発明は、生産物の抗炎症活性を定量するための方法であって、前記生産物または前記生産物由来の物質を試験システムの活性化された細胞または組織に添加すること；前記生産物または前記生産物由来の前記物質を、前記試験システムで第１の期間培養すること；前記生産物または前記生産物由来の前記物質が、活性化された細胞または組織からの炎症誘発性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定して、生産物の値を生成すること；および前記生産物の値を前記生産物に関連付けること、を含む方法を提供する。
【選択図】図１
そこで本発明は、生産物の抗炎症活性を定量するための方法であって、前記生産物または前記生産物由来の物質を試験システムの活性化された細胞または組織に添加すること；前記生産物または前記生産物由来の前記物質を、前記試験システムで第１の期間培養すること；前記生産物または前記生産物由来の前記物質が、活性化された細胞または組織からの炎症誘発性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定して、生産物の値を生成すること；および前記生産物の値を前記生産物に関連付けること、を含む方法を提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生産物の抗炎症活性を定量するための方法であって、前記生産物または前記生産物由来の物質を試験システムの活性化された細胞または組織に添加すること；
前記生産物または前記生産物由来の前記物質を、前記試験システムで第１の期間培養すること；
前記生産物または前記生産物由来の前記物質が、活性化された細胞または組織からの炎症誘発性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定して、生産物の値を生成すること；および
前記生産物の値を前記生産物に関連付けること、を含む方法。
【請求項2】
請求項１に記載の方法であって、さらに、前記生産物または前記生産物由来の物質が、抗炎症メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定して、付加的な前記生産物の値を生成すること、および
付加的な前記生産物の値を前記生産物に関連付けること、を含む方法。
【請求項3】
前記生産物が、羊膜由来生成物、および羊膜懸濁液同種移植片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記生産物由来の前記物質が、前記生産物から生成された条件培地、および、前記生産物から生成された条件培地から単離された因子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記試験システムが、間葉系間質細胞株、および、活性化可能な表現型を保持する形質転換ヒト滑膜細胞株からなる群から選択される細胞株を含むインビトロのシステムである、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記試験システムの前記細胞または組織を活性化因子と第２の期間接触させることによって、前記活性化された細胞または組織を生成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記活性化因子が、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－１βとＴＮＦ－αの両方の組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記炎症誘発性メディエーターが、ＩＬ－ｌαおよびＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、白血病阻止因子、オンコスタチンＭ、ＩＬ－８、ＩＬ－１７、およびＩＬ－１８からなる群から選択されるサイトカインである、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記抗炎症メディエーターが、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１ｒａ）、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、骨形成タンパク質、インスリン様成長メディエーターＩ、および線維芽細胞成長メディエーターからなる群から選択されるサイトカインである、請求項２に記載の方法。
【請求項10】
生産物の抗炎症活性を標準化する方法であって、前記生産物または前記生産物由来の物質を試験システムの活性化された細胞または組織に添加すること；
前記生産物または前記生産物由来の前記物質を、試験システムを使って第１の期間培養すること；
前記生産物または前記生産物由来の前記物質が、活性化細胞または組織からの炎症誘発性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定して、生産物の値を生成すること；
生産物の値を参照値と比較して標準値を確定すること；および
標準値を生産物と関連付けること、を含む方法。
【請求項11】
前記試験システムの活性化された細胞または組織に標準を添加すること；前記標準を、前記試験システムを使って第１の期間培養すること；および
前記標準が前記活性化された細胞または組織からの炎症誘発性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定して、参照値を生成すること、によって参照値が確定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
請求項１０に記載の方法であって、さらに、前記生産物または生産物由来の物質が、抗炎症メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定して、付加的な生産物の値を生成すること；
前記付加的な生産物の値を付加的な参照値と比較して、付加的な標準値を確定すること；および
前記付加的な標準値を生産物に関連付けること、を含む方法であり、
ここでは、前記試験システムの活性化された細胞または組織に標準を添加すること；
前記標準を試験システムで第１の期間培養すること；および、前記標準が前記活性化された細胞または組織からの抗炎症メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定して付加的な標準値を生成すること、
によって、前記付加的な標準値が確定される。
【請求項13】
前記生産物が、羊膜由来生成物および羊膜懸濁同種移植片からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記生産物に由来する物質が、生産物から生成された条件培地、および、生産物から生成された条件培地から単離された因子からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項15】
前記試験システムが、間葉系間質細胞株、および活性化可能な表現型を保持する形質転換ヒト滑膜細胞株からなる群から選択される細胞株を含むインビトロのシステムである、請求項１０に記載の方法。
【請求項16】
前記試験システムの細胞または組織を活性化因子と第２の期間接触させることによって、前記活性化された細胞または組織を生成するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項17】
前記活性化因子が、ＩＬ－Ｉβ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－ＩβとＴＮＦ－αの両方からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記炎症誘発性メディエーターが、ＩＬ－ｌαおよびＩＬ－Ｉβ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、白血病阻止因子、オンコスタチンＭ、ＩＬ－８、ＩＬ－１７、およびＩＬ－１８からなる群から選択されるサイトカインである、請求項１０に記載の方法。
【請求項19】
前記抗炎症メディエーターが、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－ｌｒａ）、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、骨形成タンパク質、インスリン様成長メディエーターＩ、および線維芽細胞成長メディエーターからなる群から選択されるサイトカインである、請求項１２に記載の方法。
【請求項20】
被験体への生産物の投与に先立ち、被験体への前記生産物の投与が被験体に抗炎症効果を生じさせる可能性があるかどうかを判定する方法であって、試験システムの活性化された細胞または組織に生産物または生産物由来の物質を添加すること；
前記生産物または生産物由来の物質を前記試験システムで第１の期間培養すること；
前記生産物または生産物由来の物質が、活性化された細胞または組織からの炎症誘発性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定して、生産物の値を生成すること；
前記生産物の値を参照値と比較して標準値を確定すること；および
前記標準値を閾値と比較して、標準値が閾値以上である場合、被験体に抗炎症効果が生じる可能性が高くなるようにすること、を含む方法。
【請求項21】
標準を前記試験システムの活性化された細胞または組織に添加すること；前記標準を前記試験システムで第１の期間培養すること；および
前記標準が前記活性化された細胞または組織からの炎症誘発性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定して参照値を生成すること、によって参照値が確定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記生産物または生産物由来の物質が、抗炎症メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定して、付加的な生産物の値を生成すること；前記付加的な生産物の値を付加的な参照値と比較して、付加的な標準値を確定し、付加的な標準値が閾値以上である場合、被験体に抗炎症効果が生じる可能性が高くなること、
をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
前記試験システムの活性化された細胞または組織に標準を添加すること；前記標準を前記試験システムで第１の期間培養すること；および
前記標準が前記活性化された細胞または組織からの抗炎症メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定して付加的な参照値を生成すること、
によって前記付加的な参照値が確定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記生産物が、羊膜由来生成物および羊膜懸濁同種移植片からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項25】
前記生産物に由来する物質が、前記生産物を培養培地中で培養することによって生成される条件培地、および、前記生産物を培養培地中で培養することによって生成される条件培地から単離される因子からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項26】
前記試験システムが、間葉系間質細胞株および活性化可能な表現型を保持する形質転換ヒト滑膜細胞株からなる群から選択される細胞株を含むインビトロのシステムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項27】
前記試験システムの細胞または組織を活性化因子と第２の期間接触させることによって、前記活性化された細胞または組織を生成するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項28】
前記活性化因子が、ＩＬ－Ｉβ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－ＩβとＴＮＦ－αの両方からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記炎症誘発性メディエーターが、ＩＬ－ｌαおよびＩＬ－Ｉβ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、白血病阻止因子、オンコスタチンＭ、ＩＬ－８、ＩＬ－１７、およびＩＬ－１８からなる群から選択されるサイトカインである、請求項２０に記載の方法。
【請求項30】
前記抗炎症メディエーターが、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－ｌｒａ）、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、骨形成タンパク質、インスリン様成長メディエーターＩ、および線維芽細胞成長メディエーターからなる群から選択されるサイトカインである、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
関節疾患は、関節の軟部組織、軟骨、および軟骨下骨が侵される変性疾患である。関節疾患の２つの典型的な形態は、関節リウマチ（ＲＡ）および変形性関節症（ＯＡ）である。滑膜関節を構成する軟骨、腱、および骨の不可逆的細胞傷害は、ＲＡおよびＯＡの両方の特徴である。ＯＡは３０００万人以上の米国人が罹患している。ＲＡおよびＯＡは、生体力学的、生化学的および遺伝的因子が関与する緩徐進行性疾患である。これらの経路はそれぞれ、軟骨基質を破壊し、軟骨細胞における代謝反応を変化させることにより、軟骨におけるＲＡおよびＯＡの損傷の一因となりうる。早期疾患において、軟骨細胞は、一過性の増殖反応、初期の修復の試みとしての軟骨基質の合成増加、および、異化性サイトカインと基質分解酵素（マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、アグリカナーゼ、ＰＡ、カテプシンを含む）の合成増加を示す。プロテオグリカンの局所的消失およびＩＩ型コラーゲンの開裂は、最初は軟骨表面で起こり、病変の進行とともに軟骨基質の水分量の増加および引張強度の減少をもたらす。関節軟骨の破壊を引き起こすサイトカイン、特に炎症性サイトカインであるインターロイキン（ＩＬ）－１βおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、の中心的な役割は、この分野で十分に確立されている。生物学的には、炎症性サイトカインであるＩＬ－ＩβおよびＴＮＦ－αはＭＭＰとともに、関節破壊が見られる原因となる。
【0002】
軟骨はプロテオグリカンとＩＩ型コラーゲンで構成されている一方、腱と骨は主にＩ型コラーゲンで構成されている。ＲＡが全身のあらゆる多数の関節を苦しめる自己免疫疾患であるのとは対照的に、ＯＡは少数の関節で発症し、通常は常習的な酷使または怪我に起因する。どちらの疾患でも、ＩＬ－１βやＴＮＦ－αなどの炎症性サイトカインが、細胞外基質のすべての成分を分解し得る酵素であるＭＭＰの産生を刺激する。ＭＭＰ－１とＭＭＰ－１３は、コラーゲン分解の過程を律速するため、ＲＡとＯＡにおいて重要な役割を果たしている。ＭＭＰ－１は主に関節を満たす滑膜細胞によって産生され、ＭＭＰ－１３は軟骨に存在する軟骨細胞の産物である。その他のＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３およびＭＭＰ－９といったＭＭＰの発現も関節炎で上昇し、これらの酵素は関節の非コラーゲン基質成分を分解する。
【0003】
関節組織への好中球およびマクロファージの浸潤がない場合でも、炎症性サイトカインのレベルの上昇がＲＡおよびＯＡの滑液で測定されている。炎症作用に関与するサイトカインの産生源は完全には解明されていないが、線維芽細胞様滑膜細胞、マクロファージ様滑膜細胞および軟骨細胞が潜在的な源である。
【0004】
炎症は骨の治癒過程においても重要な役割を果たす。特にＴＮＦ－αは、骨折血腫内の初期炎症性サイトカインのひとつであり、初期濃度上昇は骨折部位への間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の漸増に必須である。高濃度の炎症性サイトカインへの長期曝露は、骨治癒に有害となりうる。例えば、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αに長期曝露した後のラットの中足骨の培養において、軟骨細胞増殖の低下およびアポトーシスの増加が観察されている。またＴＮＦ‐αへの高い曝露は、骨芽細胞の石灰化を減少させ、破骨細胞形成を増加させ、マウスモデルにおいてより高い非癒合率をもたらすことが示されている。いくつかの研究では、ＴＮＦ‐αおよびＩＬ‐１βの抑制効果が、ＩＬ‐１受容体拮抗薬（ＩＬ‐１Ｒａ）およびＩＬ‐１またはＴＮＦ‐αの抑制剤による治療によって、軽減されうることが示されている。
【0005】
変性椎間板環境では、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１の両方が、増加したレベルで存在することが報告されている。変性椎間板における炎症性ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αのレベルの増加は、環境を異化状態に導く可能性がある。さらに、これらの炎症性サイトカインの存在下で、ＩＶＤ細胞はマクロファージに対する化学誘引物質を産生し、さらに、椎間板における重要な同化因子である、著しく下方抑制した成長分化因子５を産生する。椎間板の髄核部分の大部分は脊椎固定術中に取り除かれるが、このプロセスは完全ではなく、脊椎固定術のアプローチによって異なる。特に、腰椎経椎間孔椎体間固定術（ＴＬＩＦ）を用いた椎間板調製中には、椎間板の７０～８０％のみが除去されることがわかっている。加えて、線維輪は脊椎固定術中に完全には除去されず、椎間板腔の炎症環境が部分的に残存することを示唆している。ＭＳＣやマクロファージを含む、様々な細胞型が、骨の癒合を活発にする炎症反応において役割を果たしている。
【0006】
ＭＳＣは近年、特に骨治癒において、免疫調節の細胞型と認識されている。ＭＳＣの免疫抑制活性は、ＴＮＦ－αによって活性化される核内因子κＢ経路を介して媒介されることが示されている。最近の研究では、特定のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）への曝露が、ＭＳＣを炎症性または抗炎症性表現型に分極化することが示されている。これらの活性化されたＭＳＣは、骨折後のＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βの減少において役割を果たすことが示され、より良い再生転帰につながっている。最近の研究はまた、骨治癒におけるＭＳＣ－マクロファージ間クロストークの重要性を示し、ＭＳＣがインビトロでマクロファージの炎症誘発反応を抑制することを示している。特に、免疫調節はＭＳＣ細胞治療のための主要な作用機序の一つであると考えられ、ＭＳＣが骨治癒において果たす役割を強調している。
【0007】
サイトカインと成長因子は関節組織内で産生され、滑液中に放出され、それらはオートクラインーパラクライン様式で常在細胞に作用する。これらのサイトカインと成長因子の多くは正常なホメオスタシスに低レベルで必要であるが、これらの因子が増加した量で産生されるか、または時間的に制約されない方法で産生される場合、それらはＲＡとＯＡの発症の一因となる可能性がある。主な炎症性サイトカイン（一般には異化性である）には、ＩＬ－１αおよびＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、ＩＬ－８、ＩＬ－１７、およびＩＬ－１８が含まれるが、これらに限定されない。滑膜細胞（膝関節の内層を覆う滑膜の細胞）は、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、およびＭＭＰを産生することが示されている。さらに、滑膜細胞は炎症性サイトカインや他の炎症性細胞によって産生される他の炎症性シグナルにも反応しうる。
【0008】
また抗炎症性サイトカインは、産生されると、炎症性サイトカインの作用を打ち消すことがある。これらの抗炎症性サイトカインには、プロテアーゼ阻害剤（マトリックスメタロプロテアーゼ３、ＴＩＭＰ－３など）、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１ｒａ、およびインターフェロン（ＩＦＮ）－γが含まれるが、これらに限定されない。加えて、形質転換成長因子（ＴＧＦ）－β／骨形成蛋白質（ＢＭＰ）ファミリーのメンバー、インスリン様成長因子Ｉ、および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、炎症および軟骨破壊の影響に対抗する可能性のある基質蛋白質の合成を促進するため、軟骨の主要な同化因子であると考えられている。炎症過程におけるサイトカインの役割をさらに複雑にしているのは、数種のサイトカインが、炎症促進および抗炎症作用の両方を有する可能性がある。これらのサイトカインには、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－６、およびＴＧＦ－βが含まれるが、これらには限定されない。
【0009】
炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインは治療的介入のための有望な標的を提供するが、この技術は、ＲＡおよびＯＡを含むがこれらに限定されない関節疾患の治療に有効な、さらなる治療療法を必要としている。羊膜由来材料の使用は、関節疾患（ＲＡおよびＯＡを含むがこれらに限定されない）の治療、および、炎症反応のダウンレギュレーションの過程を含む関連疾患および症状の治療に有望であることを示している。しかしながら、羊膜由来材料はヒトの出発物質に由来するため、多くの場合、羊膜由来材料の治療効果（例えば、炎症反応をダウンレギュレートする能力など）は供給者によって異なり、同じ供給者からの生産物であっても異なっている。さらに、羊膜由来材料を含む製品を標準化することは困難であり、特定の疾患または症状が羊膜由来材料を含む生産物を用いた治療に反応するかどうかを決定することは困難である。
【0010】
結果として、様々な疾患および状態の治療のための羊膜由来材料の品質と一貫性を管理する必要性が依然としてある。この技術は、羊膜由来材料を定量化ないし標準化する方法、および、特定の疾患または状態が羊膜由来材料を用いた治療に反応するかどうかを決定する方法が必要である。本開示は、これらおよび他の満たされていないニーズに対する解決策を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本開示は、関節疾患などの、しかしこれらに限定されない、ヒト疾患および状態における抗炎症反応をモデル化する抗炎症反応を産生するように最適化されたモデルシステムの使用に関する。本開示モデルシステムは、本明細書に開示される様々な方法で使用することができる。
【0012】
従って、特定の非限定的な実施形態において、本開示は、生産物、特に治療用生物学的生産物の抗炎症作用を決定するための試験方法、組成物、およびキットを提供する。特定の非限定的な実施形態において、本開示は、少なくとも１つの炎症性サイトカインないし少なくとも１つの抗炎症性サイトカインの産生ないし活性に対する、生産物、特に治療用生物学的生産物の効果を決定するための試験方法、組成物、およびキットを提供する。
【0013】
特定の非限定的な実施形態において、本開示は、少なくとも１つの炎症性サイトカインないし少なくとも１つの抗炎症性サイトカインの産生ないし活性に対する生産物の作用を決定することにより、生産物、特に治療用生物学的生産物の抗炎症作用を定量するための試験方法、組成物、およびキットを提供する。
【0014】
特定の非限定的な実施形態において、本開示は、少なくとも１つの炎症性サイトカインないし少なくとも１つの抗炎症性サイトカインの産生ないし活性に対する生産物の作用を決定することにより、生産物、特に治療用生物学的生産物の抗炎症作用を標準化するための試験方法、組成物、およびキットを提供する。
【0015】
特定の非限定的な実施形態において、本開示は、生産物の被験体への投与に先立って、生産物の被験体への投与が被験体に抗炎症作用を生じさせる可能性があるか否かを決定するための試験方法、組成物、およびキットを提供する。
【0016】
このような試験方法、組成物、およびキットは、炎症のある状態を患っているか、または患っている可能性のある被験者が、生産物、特に治療用生物学的生産物によってうまく治療されるかどうかを決定するために、使用することができる。
【0017】
特定の実施形態において、本開示は、生産物の抗炎症活性を定量する方法に関するものであり、その方法は以下を含む：生産物または生産物由来の物質を、試験システムの活性化された細胞または組織に添加すること；生産物または生産物由来の物質を試験システムで第１の期間培養すること；生産物または生産物由来の物質が、活性化された細胞または組織からの炎症性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定して、生産物の値を生成すること；および、生産物の値を生産物と関連付けること。いくつかの実施形態において、本方法はさらに以下を含む：生産物または生産物に由来する物質が、抗炎症性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定し、付加的な生産物の値を生成すること；および、付加的な生産物の値を生産物と関連付けること。
【0018】
いくつかの実施形態において、本開示は、生産物の抗炎症活性を標準化する方法に関するものであり、その方法は以下を含む：生産物または生産物由来の物質を、試験システムの活性化された細胞または組織に添加すること；生産物または生産物由来の物質を試験システムで第１の期間培養すること；生産物または生産物由来の物質が、活性化された細胞または組織からの炎症性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定して、生産物の値を生成すること；生産物の値を参照値と比較して標準値を決定すること；および、標準値を生産物に関連付けること。
【0019】
本方法のいくつかの実施形態において、参照値は以下により決定される：試験システムで活性化された細胞または組織に参照値を添加すること；標準を試験システムで第１の期間培養すること；および、標準が活性化された細胞または組織からの炎症性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定し、参照値を生成すること。いくつかの実施形態において、本方法はさらに以下のステップを含む：生産物または生産物由来の物質が、抗炎症性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定し、付加的な生産物の値を生成するステップ；付加的な生産物の値を付加的な参照値と比較して、付加的な標準値を決定するステップ；および、付加的な標準値を生産物に関連付けるステップ。ここで、付加的な標準値は以下によって決定される：標準を試験システムで活性化された細胞または組織に添加すること；第１の期間、標準を試験システムで培養すること；そして、標準が活性化された細胞または組織からの抗炎症メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定し、付加的な標準値を生成すること。
【0020】
いくつかの実施形態において、本開示は、生産物の被験体への投与に先立って、生産物の被験体への投与が被験体に抗炎症作用を生じさせる可能性があるか否かを決定する方法に関するものであり、その方法は以下を含む：生産物または生産物由来の物質を、試験システムで活性化された細胞または組織に添加すること；生産物または生産物由来の物質を試験システムで第１の期間培養すること；生産物または生産物由来の物質が、活性化された細胞または組織からの炎症性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定し、生産物の値を生成すること；生産物の値を参照値と比較して標準値を決定すること；および、標準値が閾値以上である場合、被験体に抗炎症効果が生じる可能性が高くなるよう、標準値を閾値と比較すること。
【0021】
本方法のいくつかの実施形態では、参照値は以下によって決定される：試験システムの活性化された細胞または組織に標準を添加すること；第１の期間、試験システムで標準を培養する；および、参照値を生成するために、標準が活性化された細胞または組織からの炎症性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定すること。いくつかの実施形態において、本方法はさらに以下を含む：生産物または生産物由来の物質が抗炎症性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定し、付加的な生産物の値を生成すること；付加的な標準値が閾値以上である場合には、被験体に抗炎症作用が生じる可能性が高くなるよう、付加的な生産物の値を付加的な参照値と比較して、付加的な標準値を決定すること。いくつかの実施形態において、付加的な参照値は以下により決定される：試験システムの活性化された細胞または組織に標準を添加すること；第１の期間、標準を試験システムで培養する；および、標準が活性化された細胞または組織からの抗炎症メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激する程度を決定して、付加的な参照値を生成すること。
【0022】
本方法のいくつかの実施形態において、生産物は、羊膜由来生産物、および、羊膜懸濁同種移植片からなる群から選択される。本方法のいくつかの実施形態では、生産物由来の物質は、生産物から生成される条件培地、および、生産物から生成される条件培地から単離される因子、からなる群から選択される。
【0023】
本方法のいくつかの実施形態では、試験システムはインビトロのシステムである。いくつかの実施形態において、このインビトロのシステムは間葉系間質細胞株を含む。いくつかの実施形態において、このインビトロのシステムは活性化可能な表現型を保持する形質転換ヒト滑膜細胞株を含む。いくつかの実施形態において、この細胞株はＳＷ９８２細胞株である。
【0024】
いくつかの実施形態において、本方法は、試験システムの細胞または組織を活性化因子と第２の期間接触させることによって、活性化された細胞または組織を生成するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の期間とは２４時間から９６時間である。いくつかの実施形態において、活性化因子は、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－１βとＴＮＦ－αの両方を組み合わせたもの、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、活性化因子とは濃度０．２５～６ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１βおよび濃度１～１５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－αである。
【0025】
本方法のいくつかの実施形態では、第１の期間とは２４時間から７２時間である。いくつかの実施形態において、本方法は、生産物の値に基づいて、メーカーまたはベンダーが、生産物が使用に適しているかどうかを決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、生産物の値に基づいて、医療提供者が治療決定を行うステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、生産物の値、付加的な生産物の値、または生産物の値と付加的な生産物の値の両方に基づいて、生産物が使用に適しているかどうかをメーカーまたはベンダーが決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、生産物の値、付加的な生産物の値、または生産物の値と付加的な生産物の値の両方に基づいて、医療提供者が治療決定を行うステップをさらに含む。
【0026】
本方法のいくつかの実施形態では、炎症性メディエーターとはサイトカインである。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－１αおよびＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、白血病阻害因子、オンコスタチン－Ｍ、ＩＬ－８、ＩＬ－１７、およびＩＬ－１８、からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、炎症性メディエーターとはプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼとはマトリックスメタロプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、抗炎症メディエーターとはサイトカインである。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１受容体拮抗薬（ＩＬ－１ｒａ）、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、骨形成タンパク質、インスリン様成長メディエーターＩ、および、線維芽細胞成長メディエーター、からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗炎症メディエーターとはプロテアーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ阻害剤とはマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤である。
【0027】
以下の図面を例として参照することで、本開示の以下の詳細な説明がよりよく理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】細胞の、より高い継代（「古い細胞」）とより低い継代（「新しい細胞」）との比較、細胞密度、およびＴＮＦ－αタンパク質レベルに対するウェル条件のランダム化の影響を示すＥＬＩＳＡデータのグラフ表示である。平均±標準偏差が報告されている；各群ｎ＝３。適切なＩＮＦ細胞条件対照に対するダネットの多重比較検定により、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。ＡＭはアッセイ培地を表す；ＩＮＦはＡＭ内の活性化因子のみを表す。高継代とは、継続的に継代された（１０回以上）細胞であり、連続保持の間にフラスコ内でコンフルエンシーまたはオーバーコンフルエンシーに達した可能性がある。低継代という用語は、アッセイで使用する前に約１～５回の間に解凍および継代された細胞を指す。
【図2】ＴＮＦ－αタンパク質レベルに対するＣＯ２の影響を示すＥＬＩＳＡデータのグラフ表示である。報告された平均±標準偏差；各群ｎ＝３。適切なＩＮＦ細胞条件対照に対するダネットの多重比較検定により、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。ＡＭはアッセイ培地を表す；ＩＮＦはＡＭ内の活性化因子のみを表す。
【図3】ＴＮＦ－αタンパク質レベルに対する活性化因子濃度の効果を示すＥＬＩＳＡデータのグラフ表示である。報告された平均±標準偏差；各群ｎ＝１－３。適切なＩＮＦ細胞条件対照に対するダネットの多重比較検定により、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。ＡＭはアッセイ培地を表す；ＩＮＦはＡＭ内の活性化因子のみを表す。
【図4】１００％または５０％の羊膜懸濁同種移植片の条件培地の存在下または非存在下での後のＴＮＦ－αタンパク質レベルによって示される炎症の減少率のグラフ表示である。報告された平均±標準偏差；各群ｎ＝１－３。適切なＩＮＦ細胞条件対照に対するダネットの多重比較検定により、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。ＡＭはアッセイ培地を表す；ＩＮＦはＡＭ内の活性化因子のみを表す。
【図5】活性化因子による７２時間のプライミング後（羊膜懸垂同種移植片条件培地による処理の直前、ｔ０）のＴＮＦ－αタンパク質レベルに対する活性化因子の効果を示すＥＬＩＳＡデータのグラフ表示である。平均±標準偏差が報告されている；各群ｎ＝３。適切なＡＭ細胞条件対照に対するダネットの多重比較検定により、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。ＡＭはアッセイ培地を表す；ＩＮＦはＡＭ内の活性化因子のみを表す。
【図6】無細胞対照におけるＴＮＦ－αタンパク質レベルを表示するＥＬＩＳＡデータのグラフ表示である。報告された平均±標準偏差；ＮｕＣｅｌ（マサチューセッツ州カントンのＯｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓオルガノジェネシス社から入手できるＡＳＡ）／プールされた陽性対照（ＰＰＣ）条件培地（ＣＭ）は各群ｎ＝３；無細胞対照は各群ｎ＝１。ＡＭはアッセイ培地を表す；ＩＮＦはＡＭ内の活性化因子のみを表す；ＰはＰＰＣを表す。
【図7】ＮｕＣｅｌ ＣＭおよびＰＰＣ ＣＭのＴＮＦ－αタンパク質レベルの減少率のグラフ表示である。報告された平均±標準偏差；各群ｎ＝３。ＩＮＦはＡＭ内の活性化因子のみを表す。
【図8】ＴＮＦ－αタンパク質レベルに対するいくつかの被験物質（ＴＡ）ＴＡ１、ＴＡ２、およびＰＰＣ ＣＭ処理の効果を示すＥＬＩＳＡデータのグラフ表示である。平均±標準偏差が報告されている；各群ｎ＝３。ＩＮＦ対照に対するダネットの多重比較検定により、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。ＡＭはアッセイ培地を表す；ＩＮＦはＡＭ内の活性化因子のみを表す。
【図9】ＴＮＦ－αタンパク質レベルに対するＮｕＣｅｌ ＣＭおよびＰＰＣ ＣＭ最小用量曲線処理の効果を示すＥＬＩＳＡデータのグラフ表示である。平均±標準偏差が報告されている；各群ｎ＝３。ＩＮＦ対照に対するダネットの多重比較検定により、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。ＡＭはアッセイ培地を表す；ＩＮＦはＡＭ内の活性化因子のみを表す。
【図10】無細胞対照におけるＴＮＦ－αタンパク質レベルを表示するＥＬＩＳＡデータのグラフ表示である。平均±標準偏差が報告されている；ＴＡＩ／ＴＡ２／ＰＰＣ ＣＭは各群ｎ＝３；無細胞対照は各群ｎ＝１。ＡＭはアッセイ培地を表す；ＩＮＦはＡＭ内の活性化因子のみを表す；Ｐはプールされた陽性対照（ＰＰＣ）を表す。
【図11】無細胞対照におけるＴＮＦ－αタンパク質レベルを表示するＥＬＩＳＡデータのグラフ表示である。平均±標準偏差が報告されている；ＮｕＣｅｌ／ＰＰＣ ＣＭは各群ｎ＝３；無細胞対照は各群ｎ＝１。ＡＭはアッセイ培地を表す；ＩＮＦはＡＭ内の活性化因子のみを表す；Ｐはプールされた陽性対照（ＰＰＣ）を表す。
【図12】２つのオペレータ間の図８および図９からＴＮＦ－αタンパク質レベルに対するＰＰＣ ＣＭ処理の効果を表示するＥＬＩＳＡデータのグラフ表示である。平均±標準偏差が報告されている；各群ｎ＝３。ＡＭはアッセイ培地を表す；ＩＮＦは活性化因子のみを表す。
【図13】２つのオペレータ間の図８および図９からＰＰＣ ＣＭのＴＮＦ－αタンパク質レベルの減少率を示すＥＬＩＳＡデータのグラフ表示である。報告された平均±標準偏差；各群ｎ＝３。ＩＮＦはＡＭ内の炎症のみを示す。
【図14】リカバリ対照のＴＮＦ－αタンパク質レベルを表示するＥＬＩＳＡデータのグラフ表示である。報告された平均；各群ｎ＝１。ＡＳＡは羊水懸垂同種移植片を表す；ＣＭは条件培地を表す。
【図15】ＨＦＬＳモデルにおけるＴＮＦ－α，ＩＬ－１β，ＩＬ－１ｒａに対するＡＳＡ処理の効果を示す図である。未処理群と比較した対応のあるｔ検定により、＊はｐ＜０．０５である。
【図16A】ＨＩＧ８２モデルにおけるＴＮＦ－αに対するＡＳＡ ＣＭまたは個々の成分処理の効果を示す図である。＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびダネットの多重比較検定。斜線の入った棒線はＡＳＡの５０％ＣＭを示す。ＡＭ＝炎症性サイトカインまたはＡＳＡが添加されていないアッセイ培地のみ；ＣＭ＝ＡＳＡ条件培地。
【図16B】ＨＩＧ８２モデルにおけるＴＮＦ－αに対するＡＳＡ ＣＭまたは個々の成分処理の効果を示す図である。＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびダネットの多重比較検定。斜線の入った棒線はＡＳＡの５０％ＣＭを示す。ＡＭ＝炎症性サイトカインまたはＡＳＡが添加されていないアッセイ培地のみ；ＣＭ＝ＡＳＡ条件培地。
【図17A】ＳＷ９８２モデルにおけるＴＮＦ－αに対するＡＳＡ ＣＭまたは個々の成分処理の効果を示す図である。＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびダネットの多重比較検定。斜線の入った棒線はＡＳＡの５０％ＣＭを示す。ＡＭ＝炎症性サイトカインまたはＡＳＡが添加されていないアッセイ培地のみ；ＣＭ＝ＡＳＡ条件培地。
【図17B】ＳＷ９８２モデルにおけるＴＮＦ－αに対するＡＳＡ ＣＭまたは個々の成分処理の効果を示す図である。＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびダネットの多重比較検定。斜線の入った棒線はＡＳＡの５０％ＣＭを示す。ＡＭ＝炎症性サイトカインまたはＡＳＡが添加されていないアッセイ培地のみ；ＣＭ＝ＡＳＡ条件培地。
【図18】ＳＷＡ９８２モデルにおけるＡＳＡ処理によるＴＮＦ－αレベルの減少率を示す図である。
【図19A】ｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣおよびプライマリｂｍＭＳＣのＴＮＦ－αタンパク質レベルに対するＡＳＡ処理の効果を示す図である。報告された平均±標準偏差；各群ｎ＝３。各プレート内のテューキーの多重比較検定により、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。
【図19B】ｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣおよびプライマリｂｍＭＳＣのＴＮＦ－αタンパク質レベルに対するＡＳＡ処理の効果を示す図である。報告された平均±標準偏差；各群ｎ＝３。各プレート内のテューキーの多重比較検定により、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。
【図20A】ｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣおよびプライマリｂｍＭＳＣのＴＮＦ－αタンパク質レベルに対するＡＳＡ処理の効果を示す図である。処理細胞（図１９に示すものと同じ塗りつぶされた棒線）と比較した無細胞対照（斜線の入った）におけるＴＮＦ－αレベル。報告された平均±標準偏差；各群ｎ＝３（塗りつぶされた棒線）、無細胞対照の各群ｎ＝１（斜線の入った）。
【図20B】ｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣおよびプライマリｂｍＭＳＣのＴＮＦ－αタンパク質レベルに対するＡＳＡ処理の効果を示す図である。処理細胞（図１９に示すものと同じ塗りつぶされた棒線）と比較した無細胞対照（斜線の入った）におけるＴＮＦ－αレベル。報告された平均±標準偏差；各群ｎ＝３（塗りつぶされた棒線）、無細胞対照の各群ｎ＝１（斜線の入った）。
【図21A】ｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣおよびプライマリｂｍＭＳＣについての、炎症のみからのＴＮＦ－αタンパク質レベルの減少率を示す図である。報告された平均±標準偏差；各群ｎ＝３。
【図21B】ｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣおよびプライマリｂｍＭＳＣについての、炎症のみからのＴＮＦ－αタンパク質レベルの減少率を示す図である。報告された平均±標準偏差；各群ｎ＝３。
【図22】ＴＮＦ－αタンパク質レベルに対するＡＳＡ処理の効果を示す図である。報告された平均±標準偏差；各群ｎ＝３。各プレート内のテューキーの多重比較検定により、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。
【図23】はＴＮＦ－αタンパク質レベルに対するＡＳＡ処理の効果を示す図である。処理細胞からの上清（図２２に示すものと同じ塗りつぶされた棒線）と比較した無細胞対照（斜線）におけるＴＮＦ－αレベル。報告された平均±標準偏差；各群ｎ＝３（塗りつぶされた棒線）、各群ｎ＝１（斜線の入った棒線）。
【図24】炎症のみからのＴＮＦ－αタンパク質レベルの減少率を示す図である。報告された平均±標準偏差；各群ｎ＝３。
【発明を実施するための形態】
【0029】
羊膜由来物質の使用は、関節疾患を含むがそれに限定されない、様々な疾患および状態の治療において有望であることが示されている。特に羊膜由来生産物は、ＯＡ、ＲＡ、脊椎固定術および骨治癒の治療に使用されている。
【0030】
残念ながら、羊膜由来生産物の治療効果は、少なくとも部分的には羊膜由来生産物間の異なる特性のために、予測が困難である。さらに、羊膜由来生産物の治療的可能性を評価するための標準値に関して、羊膜由来生産物は一般的に標準化されていない。その結果、関節疾患を含むがそれに限定されない、様々な疾患や状態の治療のために、羊膜由来生産物の品質と一貫性を管理する必要性が残っている。
【0031】
本開示は、生産物、特に羊膜由来生産物の活性、好ましくは抗炎症活性を定量化ないし標準化する方法を提供する。その結果、本開示は、本技術の欠点およびニーズに対する解決法を提供する。さらに、本開示は、生産物（特に羊膜由来生産物）を被験体に投与する前に、生産物を被験体に投与したときに抗炎症効果を生じる可能性があるかどうかを決定する方法を提供する。ここに開示された本方法の使用を通じて、本開示は、羊膜由来生産物を含むがこれに限定されない、様々な治療用途のための生産物のより広範な使用を可能にする。
【0032】
試験システムおよび活性化された試験システム
本開示の方法、組成物及びキットでは、様々な試験システムを用いることができる。試験システムは、インビトロの試験システム又はインビボの試験システムであり得る。好ましい実施形態では、試験システムはインビトロの試験システムである。
本開示の方法、組成物及びキットでは、様々な試験システムを用いることができる。試験システムは、インビトロの試験システム又はインビボの試験システムであり得る。好ましい実施形態では、試験システムはインビトロの試験システムである。
【0033】
本試験システムは、試験されるべき病態または状態の病理生態学の代表的な細胞または組織から成る。この細胞または組織は、いかなる生命体のものであってもよい。好ましくは、細胞または組織は哺乳類由来のものであり、より好ましくは霊長類由来であり、より好ましくはヒト由来である。例えば、関節疾患を調査するための試験システムの場合、その試験システムは、関節疾患の病理生態学の代表的な細胞または組織を含み得る。１つの実施形態では、その細胞は形質転換細胞株である。別の実施形態では、その細胞は非形質転換細胞株である。１つの実施形態では、試験システムはＯＡの病理生態学の代表的な細胞株を含み、その試験システムは好ましくはインビトロのシステムである。１つの実施形態では、試験システムはＯＡの病理生態学の代表的な細胞株を含み、その試験システムは好ましくはインビトロのシステムである。
【0034】
試験システムが関節疾患を調査するために使用される場合、その試験システムは、好ましくは、炎症反応を産生することができる細胞または組織を包含する。試験システムの細胞または組織は、好ましくは、初代の滑膜細胞培養で観察される「活性化可能な表現型」を保持し、これは、細胞または組織が活性化因子で刺激されたときに炎症反応を生じることを意味する。活性化可能な表現型を有する形質転換細胞株の使用は、初代滑膜細胞培養の変動および拡大限界特性がなくても、滑膜細胞に典型的な炎症反応の研究を可能にする。関節疾患の病理生態学の代表的な試験システムで使用される細胞株は、ヒト線維芽細胞様滑膜細胞（ＨＦＬＳ；滑膜組織由来のヒトプライマリ細胞株；Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｔ．Ｎｏ．４０８Ｋ－０５ａ）、ヒトマクロファージ様滑膜細胞（ＨＭＬＳ；滑膜組織由来のヒトプライマリ細胞株）、ＨＩＧ－８２（ウサギ滑膜細胞株；ＡＴＣＣＣａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ－１８３２；Ｇｅｏｒｇｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４（１０），ｐａｇｅｓ １０１５１０２２，１９８８）、ＳＷ９８２（ヒト滑膜肉腫細胞株；ＡＴＣＣ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＴＢ－９３）、初代骨髄由来間葉系幹細胞（ｂｍＭＳＣ）およびｈＴＥＲＴ不死化ａｄＭＳＣ（ＡＳＣ５２ｔｅｌｏ；ｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣ）を含む間葉系間質細胞、を含むが、これらに限定されない。
【0035】
試験システムの細胞または組織は、活性化因子によって活性化される。代表的な活性化因子には、ホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αが含まれるが、これらに限定されない。活性化可能な表現型を有する細胞または組織が活性化因子で刺激されると、細胞株または組織は、炎症性メディエーターの産生を含む炎症反応を産生することによって応答し、ヒト疾患で観察される炎症反応を模倣する。炎症性メディエーターには、成長因子、サイトカインおよびプロテアーゼが含まれるが、これらに限定されない。代表的な炎症性成長因子およびサイトカインには、ＩＬ－１αおよびＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、白血病阻害因子、オンコスタチン－Ｍ、ＩＬ－８、ＩＬ－１７ないしＩＬ－１８が含まれるが、これらに限定されない。代表的な炎症性プロテアーゼには、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９および／またはＭＭＰ－１３などのＭＭＰが含まれるが、これらに限定されない。好ましい炎症性メディエーターには、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＭＭＰ－１および／またはＭＭＰ－１３などが含まれるが、これらに限定されない。活性化可能な表現型を有する細胞または組織が活性化因子で刺激されると、細胞株または組織もまた、抗炎症メディエーターの産生を含む抗炎症反応を産生することによって応答し、ヒト疾患で観察される炎症反応を模倣する。抗炎症メディエーターには、成長因子、サイトカインおよびプロテアーゼが含まれるが、これらに限定されない。代表的な抗炎症性サイトカインおよび成長因子には、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１受容体拮抗薬（ＩＬ－１ｒａ）、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、骨形態形成タンパク質、インスリン様成長因子Ｉおよび／または線維芽細胞成長因子が含まれるが、これらに限定されない。代表的な抗炎症性プロテアーゼ阻害剤には、メタロプロテアーゼ阻害剤３（ＴＩＭＰ－３）が含まれるが、これに限定されない。好ましい抗炎症性メディエーターには、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－６、および／またはＴＩＭＰ－３が含まれるが、これらに限定されない。
【0036】
活性化因子は、炎症反応を誘発する任意の濃度で使用することができる。炎症反応は、活性化因子を試験システムに添加した後、１つ以上の炎症性メディエーターの濃度を特定することによって測定することができる。１つの実施形態では、活性化因子は、１つ以上の炎症性メディエーターの最大産生（または最大産生の３０％以内）を誘導する濃度で使用される。このような濃度は、活性化因子が試験システムに添加された後の時点（例えば、２４時間、４８時間、もしくは７２時間以上）における用量反応曲線を用いて決定することができる。上述のようないずれの炎症誘発性メディエーターも、観察されて、炎症反応を決定することができる。好ましい実施形態では、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＭＭＰ－１、および／またはＭＭＰ－１３が観察される。さらに好ましい実施形態では、ＴＮＦ－αが観察される。
【0037】
活性化因子は、炎症反応を誘発するのに十分な時間、試験システムで培養され得る。炎症反応は、活性化因子が試験システムに添加された後、１つ以上の炎症性メディエーターの濃度を測定することによって観察することができる。１つ以上の炎症性メディエーターの最大産生（または最大産生の３０％以内）を誘発する活性化因子の濃度は、そのような期間を決定するために使用することができる。１つの実施形態において、１つ以上の炎症性メディエーターの最大産生（または最大産生の３０％以内）を誘発する期間、活性化因子を試験システムで培養する。このような期間は、活性化因子が試験システムに添加された後、１つ以上の炎症性メディエーターの濃度を経時的に（例えば、２４時間、４８時間、７２時間以上）測定することによって決定することができる。上述のようないずれの炎症性メディエーターも、観察されて、炎症反応を決定することができる。好ましい実施形態では、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＭＭＰ１、および／またはＭＭＰ－１３が観察される。さらに好ましい実施形態では、ＴＮＦ－αが観察される。
【0038】
１つの実施形態では、活性化因子とはＴＮＦ－αである。ＴＮＦ－αが活性化因子である場合、ＴＮＦ－αは、上述のように炎症反応を誘発する任意の濃度で、試験システムに添加または試験システムと接触され得る。１つの実施形態では、ＴＮＦ－αは濃度０．１から５０ｎｇ／ｍｌの範囲で使用される。ある程度の好ましい実施形態では、ＴＮＦ－αの濃度は、０．１～３０ｎｇ／ｍｌ、０．５～２０ｎｇ／ｍｌ、０．７５～１５ｎｇ／ｍｌ、１～１５ｎｇ／ｍｌ、２～１０ｎｇ／ｍｌ、５～１５ｎｇ／ｍｌ、もしくは８～１２ｎｇ／ｍｌである。別の好ましい実施形態では、ＴＮＦ－αの濃度は１０ｎｇ／ｍｌである。
【0039】
ＴＮＦ－αが活性化因子である場合、ＴＮＦ－αは、上述したように炎症反応を引き起こすのに十分な期間、試験システムで培養することができる。１つの実施形態では、その期間は１２時間から１４４時間である。ある程度の好ましい実施形態では、その期間は１２～１２０時間、１２～９６時間、１２～７２時間、２４～７２時間、４８～７２時間、６０～８０時間、もしくは６５～７５時間である。別の好ましい実施形態では、その期間は７２時間である。前項で述べたいずれの濃度のＴＮＦ－αも、開示された期間を組み合わせて使用することができる。１つの好ましい実施形態において、開示された期間を組み合わせて使用されるＴＮＦ－αの濃度は、８～１２ｎｇ／ｍｌもしくは１０ｎｇ／ｍｌである。
【0040】
別の実施形態では、活性化因子とはＩＬ－１βである。ＩＬ－１βが活性化因子である場合、ＩＬ－１βは、上述のように炎症反応を誘発する任意の濃度で、試験システムに添加または試験システムと接触され得る。１つの実施形態では、ＩＬ－１βは０．０１から１０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で使用される。ある程度の好ましい実施形態では、ＩＬ－１βの濃度は、０．０１～８ｎｇ／ｍｌ、０．１～７ｎｇ／ｍｌ、０．２５～６ｎｇ／ｍｌ、０．５～５ｎｇ／ｍｌ、０．５～４ｎｇ／ｍｌ、０．７５～３ｎｇ／ｍｌ、もしくは０．５～２ｎｇ／ｍｌである。別の好ましい実施形態では、ＩＬ－１βの濃度は１ｎｇ／ｍｌである。
【0041】
ＩＬ－１βが活性化因子である場合、ＩＬ－１βは、上述したように炎症反応を引き起こすのに十分な期間、試験システムで培養することができる。１つの実施形態では、その期間は１２時間から１４４時間である。ある程度の好ましい実施形態では、その期間は１２～１２０時間、１２～９６時間、１２～７２時間、２４～７２時間、４８～７２時間、６０～８０時間、もしくは６５～７５時間である。別の好ましい実施形態では、その期間は７２時間である。前項で述べたいずれの濃度のＩＬ－１βも、開示された期間を組み合わせて使用することができる。１つの好ましい実施形態において、開示された期間を組み合わせて使用されるＩＬ－１βの濃度は、０．５～２ｎｇ／ｍｌもしくは１ｎｇ／ｍｌである。
【0042】
別の実施形態では、活性化因子はＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αである。ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αが活性化因子である場合、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αは、上述のように炎症反応を誘発する任意の濃度で、試験システムに添加または試験システムと接触され得る。１つの実施形態では、ＴＮＦ－αは０．１から５０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で使用され、ＩＬ－１βは０．０１から１０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で使用される。ある程度の好ましい実施形態では、ＴＮＦ－αの濃度は０．１～３０ｎｇ／ｍｌ、０．５～２０ｎｇ／ｍｌ、０．７５～１５ｎｇ／ｍｌ、１～１５ｎｇ／ｍｌ、２～１０ｎｇ／ｍｌ、５～１５ｎｇ／ｍｌ、もしくは８～１２ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１βの濃度は０．０１～８ｎｇ／ｍｌ、０．１～７ｎｇ／ｍｌ、０．２５～６ｎｇ／ｍｌ、０．５～５ｎｇ／ｍｌ、０．５～４ｎｇ／ｍｌ、０．７５～３ｎｇ／ｍｌ、もしくは０．５～２ｎｇ／ｍｌである。別の好ましい実施形態では、ＴＮＦ－αの濃度は８～１２ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１βの濃度は０．５～２ｎｇ／ｍｌである。別の好ましい実施形態では、ＴＮＦ－αの濃度は１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１βの濃度は１ｎｇ／ｍｌである。
【0043】
ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αが活性化因子である場合、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αは、上述したように炎症反応を引き起こすのに十分な期間、試験システムで培養することができる。１つの実施形態では、その期間は１２時間から１４４時間である。ある程度の好ましい実施形態では、その期間は１２～１２０時間、１２～９６時間、１２～７２時間、２４～７２時間、４８～７２時間、６０～８０時間、もしくは６５～７５時間である。別の好ましい実施形態では、その期間は７２時間である。前項で述べたいずれの濃度のＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αも、開示された期間を組み合わせて使用することができる。１つの好ましい実施形態では、ＴＮＦ－αの濃度は８～１２ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１βの濃度は０．５～２ｎｇ／ｍｌである。別の好ましい実施形態では、ＴＮＦ－αの濃度は１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１βの濃度は１ｎｇ／ｍｌである。
【0044】
活性化因子が試験システムに添加された後、試験システムの細胞または組織は活性化された細胞または組織となる。試験システムの活性化された細胞または組織は、炎症性メディエーターの産生および／または活性の増加、さらに特定の場合には抗炎症性メディエーターの産生および／または活性の増加に伴って、活性化因子に反応するので、本試験システムは生産物または生産物由来の物質が炎症性メディエーターおよび抗炎症性メディエーターの産生および／または活性に及ぼす影響を決定することを可能にする。関節疾患の治療に有用な生産物は、好ましくは、１つまたはそれ以上の炎症性メディエーターの産生および／または活性を減少させ、１つまたはそれ以上の抗炎症性メディエーターの産生および／または活性を増加させ、または１つまたはそれ以上の炎症性メディエーターの産生および／または活性を減少させると同時に１つまたはそれ以上の抗炎症性メディエーターの産生および／または活性を増加させる。そのような炎症性メディエーターおよび抗炎症性メディエーターが本明細書に記載されている。好ましくは、生産物または生産物由来の物質が、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ないしＭＭＰ（ＭＭＰ－１およびＭＭＰ－１３といったものであり、これらに限定されない）の産生および／または活性を阻害し、ないしはＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－６、ないしＴＩＭＰ－３の産生および／または活性を増加させる。
【0045】
生産物または生産物由来の物質が１つまたはそれ以上の炎症誘発性メディエーターの産生および／または活性を低下させるか、または１つまたはそれ以上の抗炎症メディエーターの産生および／または活性を増加させるかどうかを決定する際には、生産物または生産物由来の物質の影響を、活性化因子に曝露されているが生産物には曝露されていない対照と比較する。炎症誘発性メディエーターおよび抗炎症メディエーターは、本技術分野で公知の任意の方法によって検出することができる。タンパク質が検出される場合、好ましい検出方法はＥＬＩＳＡである。市販されているＥＬＩＳＡキットは、本明細書に記載されているメディエーターの全てではないにしても、ほとんどのメディエーターに対して利用可能である。種々のタンパク質に特異的な抗体も同様に産生することができ、市販されている試薬と共に利用することができる。核酸が検出される場合、好ましい検出方法はＰＣＲアッセイである。市販されているＰＣＲキットは、ここに記載されているメディエーターの全てではないにしても、ほとんどのメディエーターに対して利用可能である。種々の核酸に特異的なプローブないしプライマーも同様に産生することができ、市販の試薬とともに利用することができる。
【0046】
ここで使用される用語「産生」は、特定のメディエーターをエンコードするｍＲＮＡの合成および／または特定のメディエーターに対応するタンパク質の合成を意味する。場合によっては、核酸（例えばｍＲＮＡ）の産生の減少が早い時点で起こり、タンパク質の産生の減少が遅い時点で起こる（核酸の産生が減少する場合としない場合がある）。したがって、特定の実施形態において、産生という言葉は核酸の合成を指し、核酸合成に対する生産物または生産物由来の物質の効果の決定は、生産物または生産物由来の物質が試験システムに添加または接触されてから２～４８時間後および／または４８～９６時間後に決定される。特定の実施形態において、産生という言葉はタンパク質の合成を指し、タンパク質合成に対する生産物または生産物由来の物質の効果の決定は、生産物または生産物由来の物質が試験システムに添加または接触されてから２～４８時間後および／または４８～９６時間後に決定される。１つの好ましい実施形態では、産生の減少とはタンパク質の産生の減少を指す。別の好ましい実施形態では、産生の減少とはタンパク質の産生の減少を指し、特にその効果は後の時点（例えば、生産物または生産物由来の物質が試験システムに添加または接触されてから４８～９６時間後）で決定される。
【0047】
炎症性メディエーターの産生の減少は、炎症性メディエーターをエンコードする核酸の産生の減少、炎症性メディエーター蛋白質の産生の減少、または前述のこれらの組み合わせを意味する。特定の実施形態において、炎症性メディエーターをエンコードする核酸の産生の減少は、生産物または生産物由来の物質が試験システムに添加または接触された後の早い時点（例えば２～４８時間）および／または遅い時点（例えば４８～９６時間）で決定される。特定の実施形態において、炎症性メディエーター蛋白質の産生の減少は、生産物または生産物由来の物質が試験システムに添加または接触された後の早い時点（例えば２～４８時間）および／または遅い時点（例えば４８～９６時間）で決定される。
【0048】
１つの好ましい実施形態では、産生の減少とはＴＮＦ－αタンパク質の産生の減少を意味する。別の好ましい実施形態では、産生の減少とはＴＮＦ－αタンパク質の産生の減少を意味し、特にその効果は、生産物または生産物由来の物質が試験システムに添加または接触された後の早い時点（例えば２～４８時間）および／または遅い時点（例えば４８～９６時間）で決定される。
【0049】
別の好ましい実施形態では、産生の減少とはＩＬ－１βタンパク質の産生の減少を意味する。別の好ましい実施形態では、産生の減少はＩＬ－１βタンパク質の産生の減少を意味し、特にその効果は、生産物または生産物由来の物質が試験システムに添加または接触された後の早い時点（例えば２～４８時間）および／または遅い時点（例えば４８～９６時間）で決定される。
【0050】
別の好ましい実施形態では、産生の減少とはＭＭＰタンパク質の産生の減少を意味する。別の好ましい実施形態では、産生の減少はＭＭＰタンパク質の生産の減少を意味し、特にその効果は、生産物または生産物由来の物質が試験システムに添加または接触された後の早い時点（例えば２～４８時間）および／または遅い時点（例えば４８～９６時間）で決定される。特定の態様において、ＭＭＰとはＭＭＰ－１、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、もしくはＭＭＰ－９である。特定の態様において、ＭＭＰはＭＭＰ－１またはＭＭＰ－１３である。
【0051】
別の例として、抗炎症メディエーターの産生の増加は、抗炎症メディエーターをエンコードする核酸（ｍＲＮＡなど）の産生の増加、抗炎症メディエーター蛋白質の産生の増加、または前述のこれらの組み合わせを意味する。特定の実施形態では、抗炎症メディエーターをエンコードするＲＮＡの産生の増加は、生産物または生産物由来の物質が試験システムに添加または接触された後の早い時点（例えば２～４８時間）および／または遅い時点（例えば４８～９６時間）で決定される。特定の実施形態では、抗炎症メディエーター蛋白質の産生の増加は、生産物または生産物由来の物質が試験システムに添加または接触された後の早い時点（例えば２～４８時間）および／または遅い時点（例えば４８～９６時間）で決定される。
【0052】
１つの好ましい実施形態において、産生の増加とはＩＬ－６タンパク質の産生の増加を指す。別の好ましい実施形態では、産生の増加はＩＬ－６タンパク質の産生の増加を指し、特にその効果は、生産物または生産物由来の物質が試験システムに添加または接触された後の早い時点（例えば２～４８時間）および／または遅い時点（例えば４８～９６時間）で決定される。
【0053】
１つの好ましい実施形態において、産生の増加とはＩＬ－１ｒａタンパク質の産生の増加を指す。別の好ましい実施形態では、産生の増加はＩＬ－１ｒａタンパク質の産生の増加を指し、特にその効果は、生産物または生産物由来の物質が試験システムに添加または接触された後の早い時点（例えば２～４８時間）および／または遅い時点（例えば４８～９６時間）で決定される。
【0054】
１つの好ましい実施形態において、産生の増加とはＴＩＭＰ－３タンパク質の産生の増加を指す。別の好ましい実施形態では、産生の増加はＴＩＭＰ－３タンパク質の産生の増加を指し、特にその効果は、生産物または生産物由来の物質が試験システムに添加または接触された後の早い時点（例えば２～４８時間）および／または遅い時点（例えば４８～９６時間）で決定される。
【0055】
試験システムの細胞株または組織は、細胞または組織の生存能力が維持されるような条件下で、保持または培養され得る。本技術を熟知した人であれば、過度な実験をしなくても、そのような条件を決定することができる。本試験システムの細胞株又は組織は、販売業者が推奨する細胞株または組織の条件に従って、維持または培養され得る。細胞株のための典型的な培養条件には、サイトカイン、成長因子、ホルモン、および／またはウシ／ウシ胎児血清が補充された、必須栄養素（アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル）を供給する、適切な完全成長培地の使用が含まれる。細胞株または組織は、Ｏ２および／またはＣＯ２の適切な濃度を有する適切に制御された環境で、物理化学的に調整された環境（例えば、ｐＨ、浸透圧、温度）において、維持または培養され得る。
【0056】
細胞または組織を活性化因子、生産物、または生産物由来の物質に曝露する場合、アッセイ培地が使用され得る。アッセイ培地は、補充されたサイトカイン、成長因子、ホルモン、および／またはウシ／ウシ胎児血清の濃度が成長培地の濃度よりも、例えば５０％以下または以上低いという点で、成長培地と異なる。特定の実施形態では、アッセイ培地はウシ／ウシ胎児血清を０～５０％含み、付加的なサイトカイン、成長因子、あるいはホルモンを含まない。本明細書に記載される試験システムにおいて好ましくは、成長培地は細胞を適切な密度にまで培養するために使用される。細胞が適切な密度に達すると、成長培地は、活性化因子、生産物および／または生産物由来の物質への試験システムの曝露のために、アッセイ培地に置き換えられる。
【0057】
好ましい実施形態では、細胞株はＳＷ９８２細胞株である。ＳＷ９８２細胞は、本明細書に記載のように維持され、培養され得る。１つの実施形態では、ＳＷ９８２細胞は、１０％ウシ胎児血清（コーニングＣｏｍｉｎｇ社、ニューヨーク州コーニング）（Ｌ－１５増殖培地）を添加したライボビッツＬｅｉｂｏｗｉｔｚ Ｌ－１５培地（ハイクローンＨｙＣｌｏｎｅ社、イリノイ州シカゴ）で培養される。ＳＷ９８２細胞は、ＡＴＣＣプロトコルに従って培養、継代された。Ｌ－１５培地は、ＣＯ２のない培養器で使用するために処方されているので、ＳＷ９８２細胞は、ＣＯ２のない培養器の中で、フェノール系のふた（培養器との空気交換を防ぐ）を有するフラスコに入れて培養される。
【0058】
ＳＷ９８２細胞用のアッセイ培地は、Ｌ－１５増殖培地と比較して、低濃度のサイトカイン、成長因子、ホルモン、およびウシ胎児血清を含む。１つの実施形態では、ＳＷ９８２細胞用のアッセイ培地は、５０％（ｖ／ｖ）のＬ－１５増殖培地および５０％の基礎（補充されていない）Ｌ－１５培地を含む。
【0059】
生産物由来の生産物または物質
種々の生産物は、本明細書に記載された方法、組成物およびキットと共に使用することができる。１つの実施形態において、その生産物とは治療用生物学的生産物である。特定の実施形態において、その生産物とは羊膜由来生産物である。
種々の生産物は、本明細書に記載された方法、組成物およびキットと共に使用することができる。１つの実施形態において、その生産物とは治療用生物学的生産物である。特定の実施形態において、その生産物とは羊膜由来生産物である。
【0060】
羊膜環境は、外傷後の組織修復を支持する可能性を有する生物学的成分が豊富である。胎盤膜は、独自の機能を有する多層の独特な組織から成る。その膜の最も内側の層は羊膜と呼ばれ、羊膜は羊膜嚢内に羊水を包含するための柔軟かつ強固なバリアを提供する。胎盤膜の絨毛膜層は、妊娠期間に子宮壁に付着するもので、滑らかで血液はない。さらに、羊膜と絨毛膜は、コラーゲン、プロテオグリカン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞外基質成分を含み、組織内の細胞に強固な足場を提供する。遺伝子発現解析では、羊膜がＩＬ－１αおよびＩＬ－１βを抑制し、ＭＭＰの活性を阻害することによって、周囲組織の抗炎症環境を促進する可能性を示唆している。加えて、羊膜は、インスリン様成長因子Ｉ、ＴＧＦ－β、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、および血管内皮成長因子などの、ただしこれらに限定されない、治療上有用な数多くの成長因子を含む。
【0061】
特定の実施形態において、生産物とはヒト羊膜懸垂同種移植片（ＡＳＡ）である。特定の実施形態において、ヒトＡＳＡは、米国食品医薬品局のＧｏｏｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ要件および米国組織バンク協会の基準に従って処理された、提供されたヒト胎盤から得られる。ＡＳＡは、微粒子化されたヒト羊膜および羊水細胞を含む。これらの成分は結合され、低温保存される。推奨されるＡＳＡはＲｅＮｕ（登録商標）（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓオルガノジェネシス社、マサチューセッツ州カントン）である。別の推奨されるＡＳＡはＮｕＣｅｌ（登録商標）（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓオルガノジェネシス社、マサチューセッツ州カントン）である。
【0062】
１つの実施形態では、生産物由来の物質とは条件培地（ＣＭ）である。ＣＭは、適切な条件下で一定期間（例えば１～６日間）生産物を培養し、培地を収集することによって生成することができる；ＣＭは、将来の利用のために（例えば４°Ｃで）任意に滅菌ろ過して保存することができる。ＣＭは、生産物によって分泌される因子（例えば、サイトカイン、成長因子、プロテアーゼ、および他の因子などであるが、これらに限定されない）を含み、被験体への投与の際の生産物からの成長因子およびサイトカインの放出をモデル化するために使用される。したがって、ＣＭは、被験体への投与の際に生産物によって分泌される因子を反映する。
【0063】
１つの実施形態では、生産物由来の物質とはＡＳＡ由来のＣＭである。このようなＡＳＡ由来のＣＭは、ＡＳＡを適切な培養培地で一定期間（例えば１～６日間）培養し、培養培地を回収することによって調製することができる；ＡＳＡ ＣＭは、将来の利用のために（例えば４°Ｃで）任意に滅菌ろ過して保存することができる。ＡＳＡは、任意の所望する期間、培地の中で培養することができる。１つの実施形態では、その期間は１～６日間である。ＡＳＡ ＣＭは、任意の所望する温度、好ましくは４°Ｃで、生成することができる。特定の実施形態において、ＡＳＡ ＣＭは、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を５～１０％含む成長培地、または、ＦＢＳを０．１～５％含む成長培地で、ＡＳＡを培養することによって調製される。１つの実施形態において、ＡＳＡ ＣＭは、ＦＢＳ（２．５％）、１％Ｌ－グルタミン、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシンとともにＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）の中で、４°Ｃで４日間、オービタルロッカー（振とう機）の上でＡＳＡを培養することによって生成される。使用時には、１００％ＣＭを必要に応じて希釈する（典型的にはＡＭの中で）。凍結保存されたＡＳＡが使用される場合、培養段階の前に、凍結保存されたＡＳＡは解凍され、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）成分を除去するために処理される。ペレット化されたＡＳＡの成分は、適切な培地に再懸濁される。
【0064】
別の実施形態では、生産物由来の物質は、上述のように生成されたＣＭから単離された因子である。特定の実施形態では、因子が単離されたＣＭはＡＳＡ ＣＭである。この分野に精通した人であれば、ＣＭから望ましい因子を精製する方法に気づくであろう。
【0065】
生産物の抗炎症作用を定量する方法
本開示はまた、生産物の抗炎症活性を定量する方法を提供する。本明細書で考察されるように、多くの治療用生物学的生産物は異なる活性および／または特性を有する。例えば、ＡＳＡのような羊膜由来生産物は、２つのドナーに由来すると、異なる抗炎症活性を有する可能性がある。結果として、治療的生物学的生産物、特にＡＳＡのような羊膜由来生産物の、抗炎症活性などの活性を定量する方法を提供することは有益であろう。
本開示はまた、生産物の抗炎症活性を定量する方法を提供する。本明細書で考察されるように、多くの治療用生物学的生産物は異なる活性および／または特性を有する。例えば、ＡＳＡのような羊膜由来生産物は、２つのドナーに由来すると、異なる抗炎症活性を有する可能性がある。結果として、治療的生物学的生産物、特にＡＳＡのような羊膜由来生産物の、抗炎症活性などの活性を定量する方法を提供することは有益であろう。
【0066】
１つの実施形態において、本開示は生産物の抗炎症活性を定量する方法を提供する。第１の実施形態において、生産物の抗炎症活性を定量する方法は、以下の工程を含む：（ｉ）試験システムの細胞または組織に活性化因子を添加すること；（ｉｉ）活性化因子を試験システムの細胞または組織と一定期間培養し、活性化された細胞または組織を生成すること；（ｉｉｉ）生産物または生産物由来の物質を試験システムに添加すること；（ｉｖ）生産物または生産物由来の物質を試験システムの活性化された細胞または組織と一定期間培養すること；（ｖ）生産物または生産物由来の物質が、活性化された細胞または組織からの炎症性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激して、生産物の値を生成する程度を決定すること；また、（ｖｉ）生産物の値を生産物と任意に関連付けること。このような方法は、さらに以下のような工程を含む：（ｖｉｉ）生産物または生産物由来の物質が、活性化された細胞または組織からの抗炎症メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激して、付加的な生産物の値を生成する程度を決定すること；および、（ｖｉｉｉ）付加的な生産物の値を生産物と任意に関連付けること。
【0067】
上記の第1の実施形態の方法では、本明細書に記載される任意の試験システムを使用することができ、試験システムにおける細胞または組織を活性化する任意の方法を使用することができる。
【0068】
第１の実施形態の好ましい態様では、細胞または組織はＳＷ９８２細胞株であり、活性化因子はＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αであり、ＴＮＦ－αは０．１から５０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で使用され、ＩＬ－１βは０．０１から１０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で使用され、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αは試験システムと共に１２時間から１４４時間の間培養される。第１の実施形態のさらに好ましい態様において、ＴＮＦ－αの濃度は、０．１～３０ｎｇ／ｍｌ、０．５～２０ｎｇ／ｍｌ、０．７５～１５ｎｇ／ｍｌ、１～１５ｎｇ／ｍｌ、２～１０ｎｇ／ｍｌ、５～１５ｎｇ／ｍｌ、または８～１２ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１βの濃度は、０．０１～８ｎｇ／ｍｌ、０．１～７ｎｇ／ｍｌ、０．２５～６ｎｇ／ｍｌ、０．５～５ｎｇ／ｍｌ、０．５～４ｎｇ／ｍｌ、０．７５～３ｎｇ／ｍｌ、または０．５～２ｎｇ／ｍｌである。第１の実施形態のさらに好ましい態様において、ＴＮＦ－αの濃度は８～１２ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１βの濃度は０．５～２ｎｇ／ｍｌであるか、またはＴＮＦ－αの濃度は１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１βの濃度は１ｎｇ／ｍｌである。第１の実施形態のさらに好ましい態様において、時間は、１２～１２０時間、１２～９６時間、１２～７２時間、２４～７２時間、４８～７２時間、６０～８０時間、６５～７５時間、または７２時間である。本項に記載されたいかなる濃度のＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αも、開示された時間と組み合わせて使用することができる。好ましくは、ＴＮＦ－αの濃度は８～１２ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１βの濃度は０．５～２ｎｇ／ｍｌであるか、またはＴＮＦ－αの濃度は１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１βの濃度は１ｎｇ／ｍｌである。
【0069】
第２の実施形態において、生産物の抗炎症活性を定量するための方法は、以下の工程を含む：（ｉ）試験システムの活性化された細胞または組織に生産物または生産物由来の物質を添加する工程；（ｉｉ）生産物または生産物由来の物質を試験システムで一定期間培養する工程；（ｉｉｉ）生産物または生産物由来の物質が、活性化された細胞または組織からの炎症性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激して生産物の値を生成する程度を決定する工程；および、（ｉｖ）生産物の値を生産物と任意に関連付ける工程。このような方法は、さらに次の工程を含むことができる：（ｖ）生産物または生産物由来の物質が、活性化された細胞または組織からの抗炎症性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激して、付加的な生産物の値を生成する程度を決定する工程；および（ｖｉ）付加的な生産物の値を生産物と任意に関連付ける工程。
【0070】
第２の実施形態の方法では、本明細書に記載の任意の活性化試験システムを使用することができる。第２の態様の特定の実施形態では、活性化試験システムは、第１の実施形態の好ましい態様についての記載のようにして生成される。
【0071】
第１から第２の実施形態における方法の好ましい態様において、生産物とは、好ましくは羊膜由来生産物であり、これはＡＳＡなどであるがこれに限定されない。好ましいＡＳＡには、限定されないが、ＲｅＮｕ（登録商標）およびＮｕＣｅｌ（登録商標）（オルガノジェネシス社、マサチューセッツ州カントン）を含む。第１および第２の実施形態における方法の好ましい態様において、生産物は、試験システムで２～５日間または３日間培養される。
【0072】
第１および第２の実施形態における方法の好ましい態様において、生産物由来の物質は試験システムの活性化された細胞または組織に添加される。好ましくは、生産物由来の物質とは羊膜由来生産物由来のＣＭであり、これはＡＳＡなどであるがこれに限定されない。好ましいＡＳＡには、限定されないが、ＲｅＮｕ（登録商標）およびＮｕＣｅｌ（登録商標）（オルガノジェネシス社、マサチューセッツ州カントン）を含む。ＣＭは１００％ＣＭであってもよいし、ＣＭが希釈されたものでもよい（７５％ＣＭ、５０％ＣＭ、２５％ＣＭなど）。ＣＭを希釈する場合、アッセイ培地の中で希釈されるのが望ましい。第１および第２の実施形態の方法における好ましい態様において、ＡＳＡ ＣＭは、試験システムで２～５日間または３日間培養される。
【0073】
第１および第２の実施形態における方法の好ましい態様において、生産物または生産物由来の物質は、本明細書に記載される１つまたは複数の炎症誘発性メディエーターの産生および／または活性を減少させ、さらに／または、１つまたは複数の抗炎症メディエーターの産生および／または活性を増加させる。減少される炎症誘発性メディエーターには、成長因子、サイトカイン、およびプロテアーゼが含まれるが、これらに限定されない。減少される代表的な炎症誘発性成長因子及びサイトカインには、ＩＬ－１αおよびＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、白血病阻害因子、オンコスタチン－Ｍ、ＩＬ－８、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８が含まれるが、これらに限定されない。減少される代表的な炎症誘発性プロテアーゼには、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９、および／またはＭＭＰ－１３といったＭＭＰが含まれるが、これらに限定されない。減少される好ましい炎症誘発性メディエーターには、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＭＭＰ－１および／またはＭＭＰ－１３が含まれるが、これらに限定されない。増加する代表的な抗炎症性サイトカイン及び成長因子には、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１受容体拮抗薬（ＩＬ－１ｒａ）、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、骨形態形成タンパク質、インスリン様成長因子－Ｉ、および／または線維芽細胞成長因子が含まれるが、これらに限定されない。増加する代表的な抗炎症性プロテアーゼ阻害剤には、メタロプロテアーゼ阻害剤３（ＴＩＭＰ－３）が含まれるが、これに限定されない。増加する好ましい抗炎症性メディエーターには、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－６、および／またはＴＩＭＰ－３が含まれるが、これらに限定されない。
【0074】
第３の実施形態において、生産物の抗炎症活性を定量する方法は次の工程を含む：（ｉ）ＳＷ９８２細胞株を含む試験システムにＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αを添加する工程；（ｉｉ）活性化ＳＷ９８２細胞株を生成するために、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αを試験システムのＳＷ９８２細胞株と一定期間培養する工程；（ｉｉｉ）試験システムにＡＳＡ ＣＭを添加する工程；（ｉｖ）ＡＳＡ ＣＭを試験システムの活性化ＳＷ９８２細胞株と２～４日間培養する工程；（ｖ）ＡＳＡ ＣＭが、ＴＮＦ－αの産生および任意に活性化ＳＷ９８２細胞株からの１つまたはそれ以上の付加的な炎症性メディエーターの産生を阻害または刺激して、生産物の値を生成する程度を決定する工程；および（ｖｉ）任意に生産物の値を生産物と関連付ける工程。このような方法は、さらに次の工程を含む：（ｖｉｉ）ＡＳＡ ＣＭが活性化ＳＷ９８２細胞株からの抗炎症メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激して、付加的な生産物の値を生成する程度を決定する工程；および（ｖｉｉｉ）付加的な生産物の値を生産物と任意に関連付ける工程。
【0075】
第４の実施形態において、生産物の抗炎症活性を定量する方法は、次の工程を含む：（ｉ）ＡＳＡＣＭを試験システムの活性化ＳＷ９８２細胞株に添加する工程；（ｉｉ）ＡＳＡＣＭを試験システムの活性化ＳＷ９８２細胞株で２～４日間培養する工程；（ｉｉｉ）ＡＳＡ ＣＭが、ＴＮＦ－αの産生および必要に応じて活性化ＳＷ９８２細胞株からの１つ以上の付加的な炎症性メディエーターの産生を阻害または刺激して、生産物の値を生成する程度を決定する工程；および、（ｉｖ）任意に生産物の値を生産物と関連付ける工程。このような方法は、さらに次の工程を含む：（ｖ）ＡＳＡ ＣＭが、活性化ＳＷ９８２細胞株からの抗炎症メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激して、付加的な生産物の値を生成する程度を決定する工程；および、（ｖｉ）付加的な生産物の値を生産物と任意に関連付ける工程。
【0076】
第３および第４の実施形態の方法における好ましい態様において、ＡＳＡとはヒトＡＳＡである。好ましいＡＳＡには、限定はされないが、ＲｅＮｕ（登録商標）およびＮｕＣｅｌ（登録商標）（オルガノジェネシス社、マサチューセッツ州カントン）が含まれる。
【0077】
第３および第４の実施形態の好ましい態様において、ＡＳＡ ＣＭは希釈されない（すなわち１００％ＡＳＡ ＣＭ）。他の好ましい態様においては、ＡＳＡ ＣＭは希釈される（たとえば、７５％ＡＳＡ ＣＭ、５０％ＡＳＡ ＣＭ、２５％ＡＳＡ ＣＭなど）。ＡＳＡ ＣＭが希釈される場合、好ましくは、アッセイ培地で希釈される。第３および第４の実施形態の方法の好ましい態様において、ＡＳＡ ＣＭは試験システムで３日間培養される。
【0078】
第３および第４の実施形態の方法の好ましい態様において、ＡＳＡ ＣＭは、ＴＮＦ－αの産生および任意に１つ以上の付加的な炎症性メディエーターの産生を減少させ、および／または、本明細書に記載される１つ以上の抗炎症性メディエーターの産生および／または活性を増加させる。減少する炎症性メディエーターには、成長因子、サイトカイン、およびプロテアーゼが含まれるが、これらに限定されない。代表的な減少する炎症性成長因子およびサイトカインには、ＩＬ－１αおよびＩＬ－１β、ＩＬ－６、白血病阻害因子、オンコスタチン－Ｍ、ＩＬ－８、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８が含まれるが、これらに限定されない。代表的な減少する炎症性プロテアーゼには、限定はされないが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９および／またはＭＭＰ－１３などのＭＭＰが含まれるが、これらに限定されない。減少する好ましい炎症性メディエーターには、ＴＮＦ－αに加えて、ＩＬ－１β、ＭＭＰ－１、および／またはＭＭＰ－１３が含まれるが、これらに限定されない。代表的な増加する抗炎症性サイトカインおよび成長因子には、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１受容体拮抗薬（ＩＬ－１ｒａ）、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、骨形成タンパク質、インスリン様成長因子－Ｉ、および／または線維芽細胞成長因子が含まれるが、これらに限定されない。増加する阻害剤である代表的な抗炎症性プロテアーゼには、メタロプロテアーゼ阻害剤３（ＴＩＭＰ－３）などが含まれるが、これらに限定されない。好ましい増加する抗炎症性メディエーターには、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－６、および／またはＴＩＭＰ－３が含まれるが、これらに限定されない。
【0079】
第３および第４の実施形態の方法の好ましい態様において、製造業者または販売業者は、生産物が使用に適しているかどうかを決定し、そして／または、医療提供者は、生産物値に基づいて治療決定を行う。第３および第４の実施形態の方法の好ましい態様において、製造業者または販売業者は、生産物が使用に適しているかどうかを決定し、そして／または、医療提供者は、生産物値、付加的な生産物値、または生産物値と付加的な産物値の両方に基づいて、治療決定を行う。
【0080】
上述したように、試験システムの細胞または組織は、炎症性メディエーターおよび／または抗炎症メディエーターの産生および／または活性の増加により、活性化因子に応答する。その結果、本開示の試験システムは、試験システムの細胞または組織によって産生される炎症性および抗炎症メディエーターの産生および／または活性に対する、生産物または生産物由来の物質の影響を決定する方法を提供する。本明細書に記載される試験システムのアウトプットは、炎症性メディエーターが阻害されるかまたは抗炎症メディエーターが刺激される程度を反映する、生産物値および／または付加的な生産物値である。
【0081】
生産物値の例として、生産物がＴＮＦ－αの産生を（対照値と比較して）６０％阻害することが見出され、本明細書に開示される試験システムによって決定されるように５０ｐｇ／ｍｌ濃度のＴＮＦ－αをもたらすことが見出された場合、生産物値はいずれかの値であり得る。定量化された生産物値は、エンドユーザーが生産物の抗炎症活性などの潜在的活性を評価することを可能にする。
【0082】
本明細書に記載のように決定された生産物値は、多くの方法で使用することができる。生産物値は、医療提供者が治療の決定を行うために用いることができる。さらに、生産物値は、生産物を受け入れるか拒否するために用いることができ、従って、再現性のある品質管理関数として機能する。
同様のアプローチは、付加的な生産物値にも適用される。
同様のアプローチは、付加的な生産物値にも適用される。
【0083】
生産物の抗炎症活性を標準化する方法
本開示はまた、生産物の抗炎症活性を標準化する方法を提供する。本明細書で論じられるように、多くの治療的生物学的生産物は異なる活性および／または特性を有する。例えば、２つの供与体由来のＡＳＡなどの羊膜由来生産物は、異なる抗炎症活性を有する可能性がある。その結果、特にＡＳＡのような羊膜由来生産物などといった治療的生物学的生産物の、抗炎症活性などの活性を標準化する方法を提供することは有益であろう。
本開示はまた、生産物の抗炎症活性を標準化する方法を提供する。本明細書で論じられるように、多くの治療的生物学的生産物は異なる活性および／または特性を有する。例えば、２つの供与体由来のＡＳＡなどの羊膜由来生産物は、異なる抗炎症活性を有する可能性がある。その結果、特にＡＳＡのような羊膜由来生産物などといった治療的生物学的生産物の、抗炎症活性などの活性を標準化する方法を提供することは有益であろう。
【0084】
第５の実施形態において、生産物の抗炎症活性を標準化する方法は、次のような工程を含む：（ｉ）試験システムの細胞または組織に活性化因子を添加する工程；（ｉｉ）活性化因子を試験システムの細胞または組織と一定期間培養し、活性化された細胞または組織を生成する工程；（ｉｉｉ）生産物または生産物由来の物質を試験システムに添加する工程；（ｉｖ）生産物または生産物由来の物質を試験システムの活性化された細胞または組織と一定期間培養すること；（ｖ）生産物または生産物由来の物質が活性化された細胞または組織からの炎症性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激して、生産物値を生成する程度を決定する工程；（ｖｉ）生産物値を参照値と比較して、標準値を決定する工程；そして、（ｖｉｉ）標準値を生産物と任意に関連付ける工程。このような方法は、さらに、以下の工程を含む：（ｖｉｉｉ）生産物又は生産物由来の物質が、活性化された細胞又は組織からの抗炎症性メディエーターの産生、活性、又は産生及び活性の両方を阻害又は刺激し、付加的な生産物値を生成する程度を決定する工程；（ｉｘ）付加的な生産物値を付加的な参照値と比較して、付加的な標準値を決定する工程；および、（ｘ）付加的な標準値を生産物と任意に関連付ける工程。
【0085】
第５の実施形態の方法では、本明細書に記載されるいかなる試験システムも使用することができ、試験システムの細胞または組織を活性化するいかなる方法も使用することができる。
【0086】
第５の実施形態の好ましい態様では、細胞または組織とはＳＷ９８２細胞株であり、活性化因子はＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αであり、ＴＮＦ－αは０．１～５０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で使用され、ＩＬ－１βは０．０１～１０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で使用され、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αは試験システムで１２時間から１４４時間の間培養される。第５の実施形態のさらに好ましい態様において、ＴＮＦ－αの濃度は、０．１～３０ｎｇ／ｍｌ、０．５～２０ｎｇ／ｍｌ、０．７５～１５ｎｇ／ｍｌ、１～１５ｎｇ／ｍｌ、２～１０ｎｇ／ｍｌ、５～１５ｎｇ／ｍｌ、または８～１２ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１βの濃度は、０．０１～８ｎｇ／ｍｌ、０．１～７ｎｇ／ｍｌ、０．２５～６ｎｇ／ｍｌ、０．５～５ｎｇ／ｍｌ、０．５～４ｎｇ／ｍｌ、０．７５～３ｎｇ／ｍｌ、または０．５～２ｎｇ／ｍｌである。第５の実施形態のさらに好ましい態様では、ＴＮＦ－αの濃度が８～１２ｎｇ／ｍｌであって、ＩＬ－１βの濃度は０．５～２ｎｇ／ｍｌであるか、または、ＴＮＦ－αの濃度が１０ｎｇ／ｍｌであって、ＩＬ－１βの濃度が１ｎｇ／ｍｌである。第５の実施形態のさらに好ましい態様では、期間は、１２～１２０時間、１２～９６時間、１２～７２時間、２４～７２時間、４８～７２時間、６０～８０時間、６５～７５時間、または７２時間である。本項に記載されたいかなる濃度のＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αも、ここに開示された時間と組み合わせて使用することができる。好ましくは、ＴＮＦ－αの濃度が８～１２ｎｇ／ｍｌであって、ＩＬ－１βの濃度は０．５～２ｎｇ／ｍｌであるか、または、ＴＮＦ－αの濃度が１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１βの濃度は１ｎｇ／ｍｌである。
【0087】
第６の実施形態において、生産物の抗炎症活性を標準化するための方法は、以下の工程を含む：（ｉ）生産物または生産物由来の物質を試験システムの活性化された細胞または組織に添加する工程；（ｉｉ）生産物または生産物由来の物質を試験システムと一定期間培養する工程；（ｉｉｉ）生産物または生産物由来の物質が、活性化された細胞または組織からの炎症性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激して、生産物値を生成する程度を決定する工程；（ｉｖ）生産物値を参照値と比較して標準値を決定する工程；および、（ｖ）標準値を生産物と任意に関連付ける工程。このような方法は、さらに次の工程を含むことができる。（ｖｉ）生産物または生産物由来の物質が、活性化された細胞または組織からの抗炎症性メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激し、付加的な生産物値を生成する程度を決定する工程；（ｖｉｉ）付加的な生産物値を付加的な参照値と比較し、付加的な標準値を決定する工程；および、（ｖｉｉｉ）付加的な標準値を生産物と任意に関連付ける工程。
【0088】
第６の実施形態の方法では、本明細書に記載されているいかなる試験システムも使用することができる。第２の態様の特定の実施形態では、試験システムは、第５の実施形態の好ましい態様について記載されているように、活性化される。
【0089】
第５から第６の実施形態での方法の好ましい態様では、生産物は、好ましくは、限定はされないが、ＡＳＡなどの羊膜由来生産物である。好ましいＡＳＡには、限定はされないが、ＲｅＮｕ（登録商標）およびＮｕＣｅｌ（登録商標）（オルガノジェネシス社、マサチューセッツ州カントン）を含む。第５から第６の実施形態での方法の好ましい態様において、生産物は試験システムと２～５日間または３日間培養される。
【0090】
第５から第６の実施形態での方法の好ましい態様において、生産物由来の物質は試験システムの活性化された細胞または組織に添加される。好ましくは、この生産物由来の物質は、限定はされないが、ＡＳＡなどの羊膜由来生産物からのＣＭである。好ましいＡＳＡには、限定はされないが、ＲｅＮｕ（登録商標）およびＮｕＣｅｌ（登録商標）（オルガノジェネシス社、マサチューセッツ州カントン）が含まれる。ＣＭは１００％ＣＭであってもよいし、希釈した（例えば、７５％ＣＭ、５０％ＣＭ、２５％ＣＭなど）ＣＭでもよい。ＣＭを希釈する場合、アッセイ培地の中で希釈されるのが望ましい。第１から第２の実施形態の方法の好ましい態様において、ＡＳＡ ＣＭは、試験システムと２～５日間または３日間培養される。
【0091】
第５から第６の実施形態の方法の好ましい態様において、生産物または生産物由来の物質は、本明細書に記載される１つ以上の炎症誘発性メディエーターの産生および／または活性を減少させ、および／または、１つ以上の抗炎症メディエーターの産生および／または活性を増加させる。減少する炎症誘発性メディエーターには、限定はされないが、成長因子、サイトカイン、およびプロテアーゼが含まれる。代表的な減少する炎症誘発性成長因子およびサイトカインには、限定はされないが、ＩＬ－１αおよびＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、白血病阻害因子、オンコスタチン－Ｍ、ＩＬ－８、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８が含まれる。代表的な減少する炎症誘発性プロテアーゼには、限定はされないが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９、および／またはＭＭＰ－１３などのＭＭＰが含まれる。好ましい減少する炎症誘発性メディエーターには、限定はされないが、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＭＭＰ－１、および／またはＭＭＰ－１３などが含まれる。代表的な増加する抗炎症性サイトカインおよび成長因子には、限定はされないが、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１受容体拮抗薬（ＩＬ－１ｒａ）、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、骨形成タンパク質、インスリン様成長因子－１、および／または線維芽細胞成長因子などが含まれる。代表的な増加する抗炎症性プロテアーゼ阻害剤には、限定はされないが、メタロプロテアーゼ阻害剤３（ＴＩＭＰ－３）などが含まれる。好ましい増加する抗炎症性メディエーターには、限定はされないが、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－６、および／またはＴＩＭＰ－３が含まれる。
【0092】
第７の実施形態において、生産物の抗炎症活性を標準化する方法は、次の工程を含む：（ｉ）ＳＷ９８２細胞株を含む試験システムに、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αを添加する工程；（ｉｉ）活性化ＳＷ９８２細胞株を生成するために、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αを試験システムのＳＷ９８２細胞株と一定期間培養する工程；（ｉｉｉ）ＡＳＡ ＣＭを試験システムに添加する工程；ＡＳＡ ＣＭを試験システムの活性化ＳＷ９８２細胞株と２～５日間培養する；（ｉｖ）ＡＳＡ ＣＭがＴＮＦ－αの産生、および必要に応じて活性化ＳＷ９８２細胞株から１つ以上の付加的な炎症性メディエーターの産生を阻害または刺激し、生産物値を生成する程度を決定する工程；（ｖｉ）生産物値を参照値と比較して、標準値を決定する工程；および（ｖｉｉ）標準値を生産物と任意に関連付ける工程。このような方法は、さらに次のような工程を含む：（ｖｉｉｉ）ＡＳＡ ＣＭが、活性化ＳＷ９８２細胞株からの抗炎症メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激して、付加的な生産物値を生成する程度を決定する工程；（ｉｘ）付加的な生産物値を付加的な参照値と比較して、付加的な標準値を決定する工程；および（ｘ）付加的な標準値を生産物と任意に関連付ける工程。
【0093】
第８の実施形態において、生産物の抗炎症活性を標準化する方法は、次の工程を含む：（ｉ）ＡＳＡ ＣＭを試験システムの活性化ＳＷ９８２細胞株に添加する工程；（ｉｉ）ＡＳＡ ＣＭを試験システムの活性化ＳＷ９８２細胞株と２～５日間培養する。（ｉｉｉ）ＡＳＡ ＣＭがＴＮＦ－αの産生および必要に応じて活性化ＳＷ９８２細胞株からの１つ以上の付加的な炎症性メディエーターの産生を阻害または刺激して、生産物値を生成する程度を決定する工程；（ｉｖ）生産物値を参照値と比較して、標準値を決定する工程；（ｖ）標準値を生産物と任意に関連付ける工程。このような方法は、さらに次の工程を含む：（ｖｉ）ＡＳＡ ＣＭが活性化ＳＷ９８２細胞株からの抗炎症メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激して、付加的な生産物値を生成する程度を決定する工程；（ｖｉｉ）付加的な生産物値を付加的な参照値と比較して、付加的な標準値を決定する工程；および（ｖｉｉｉ）付加的な標準値を生産物と任意に関連付ける工程。
【0094】
第７および第８の実施形態の方法の好ましい態様において、ＡＳＡはヒトＡＳＡである。好ましいＡＳＡには、限定はされないが、ＲｅＮｕ（登録商標）およびＮｕＣｅｌ（登録商標）（オルガノジェネシス社、マサチューセッツ州カントン）が含まれる。
【0095】
第７および第８の実施形態の好ましい態様において、ＡＳＡ ＣＭとは原液（つまり１００％ＡＳＡ ＣＭ）である。別の好ましい態様において、ＡＳＡ ＣＭは希釈されたもの（たとえば、７５％ＡＳＡ ＣＭ、５０％ＡＳＡ ＣＭ、または２５％ＡＳＡ ＣＭなど）である。ＡＳＡ ＣＭが希釈される場合、好ましくは、アッセイ培地の中で希釈される。第３および第４の実施形態の好ましい態様において、ＡＳＡ ＣＭは試験システムと３日間培養される。
【0096】
第７および第８の実施形態の方法の好ましい態様において、ＡＳＡ ＣＭは、ＴＮＦ－αおよび任意に１つ以上の付加的な炎症性メディエーターの産生を減少させ、および／または、本明細書に記載される１つ以上の抗炎症性メディエーターの産生および／または活性を増加させる。減少する炎症性メディエーターには、限定はされないが、成長因子、サイトカイン、およびプロテアーゼが含まれる。代表的な減少する炎症性成長因子およびサイトカインには、限定はされないが、ＩＬ－１αおよびＩＬ－１β、ＩＬ－６、白血病阻害因子、オンコスタチン－Ｍ、ＩＬ－８、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８が含まれる。代表的な減少する炎症性プロテアーゼには、限定はされないが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９、および／またはＭＭＰ－１３といったＭＭＰが含まれるが、限定はされない。好ましい減少する炎症性メディエーターには、ＴＮＦ－αに加えて、限定はされないが、ＩＬ－１β、ＭＭＰ－１、および／またはＭＭＰ－１３が含まれる。代表的な増加する抗炎症性サイトカインおよび成長因子には、限定はされないが、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１受容体拮抗薬（ＩＬ－１ｒａ）、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－β、骨形態形成タンパク質、インスリン様成長因子－Ｉ、および／または線維芽細胞成長因子が含まれる。代表的な増加する抗炎症性プロテアーゼ阻害剤には、限定はされないが、メタロプロテアーゼ阻害剤３（ＴＥＭＰ－３）が含まれる。好ましい増加する抗炎症性メディエーターには、限定はされないが、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－６、および／またはＴＥＭＰ－３が含まれる。
【0097】
上述したように、試験システムの細胞または組織は、炎症性メディエーターおよび／または抗炎症性メディエーターの産生および／または活性の増加により、活性化因子に応答する。その結果、本開示の試験システムは、試験システムの細胞または組織によって産生される炎症性および抗炎症性メディエーターの産生および／または活性に対する生産物または生産物由来の物質の影響を決定する方法を提供する。本明細書に記載される試験システムのアウトプットは、炎症性メディエーターが阻害されるか、または抗炎症性メディエーターが刺激される程度を反映する、生産物値および／または付加的な生産物値である。生産物値および／または付加的な生産物値は、標準値および付加的な標準値を生成するための参照値と比較することができる。好ましい実施形態では、生産物値は参照値で除算される。これらの値の使用について本明細書に記載されている。
【0098】
参照値はさまざまな方法で生成できる。１つの例として、参照値は規定の値にすることができる。この規定値は、当技術分野で既知の情報（例えば、ＴＮＦ－αの産生の７５％の減少が、疾患または状態の治療に有益であることが知られている）に基づいて決定または設定され得る。ある生産物の生産物値がＴＮＦ－αの産生の７０％の減少であると決定される場合、生産物の標準値は０．９３（生産物値を参照値で割った値；０．７０／０．７５）となるであろう。
【0099】
あるいは、参照値は標準を用いて経験的に決定されてもよい。参照値が経験的に決定される場合、参照値は、生産物値を決定するために使用されるのと同じ試験システムおよび同じ条件を用いて、決定されることが好ましい。参照値は、一度に決定され、複数の生産物値のための参照値として使用されてもよいし、または、生産物値ごと（例えば、参照値は生産物値と並行して決定される）に別々に決定されてもよい。標準の生産物値が、本明細書に開示する試験システムを用いて４５ｐｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αと決定される場合、４５ｐｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αが参照値と決定される。生産物値が５０ｐｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αと決定される場合、生産物の標準値は１．１（生産物値を参照値で割った値；５０／４５）となるであろう。
【0100】
参照値は、単一の炎症性メディエーターおよび／または単一の抗炎症性メディエーターに対して決定することができる。参照値は、複数の炎症性メディエーターおよび／または単一の抗炎症性メディエーターに対して決定することができる。参照値は、単一の炎症性メディエーターおよび／または複数の抗炎症性メディエーターに対して決定することができる。さらに、参照値は、炎症性メディエーターのグループおよび／または抗炎症メディエーターのグループに対して決定することができる。
【0101】
参照値を生成するために、様々な標準を使用することができる。好ましくは、標準は生産物と同じである。たとえば、生産物がＡＳＡの場合、標準もまたＡＳＡである。標準と生産物が同じタイプである場合、標準が生産物の平均的な活性を反映するように、標準は様々な個々の生産物をプーリングして取得できる。特定の実施形態では、生産物はＡＳＡであり、ＡＳＡから生成されたＣＭはここに記載されている試験システムに添加され、さらに標準は複数のＡＳＡ（例えば５～１００の個々のＡＳＡ）から生成されたプールされたＣＭである。別の実施形態では、ＡＳＡ ＣＭおよびプールされたＡＳＡ ＣＭは１００％（原液）で使用される。別の実施形態では、ＡＳＡ ＣＭおよびプールされたＡＳＡ ＣＭは、限定はされないが、２５％、５０％、および／または７５％などの１００％未満（適したＡＭで希釈するのが好ましい）で使用される。別の実施形態では、ＡＳＡ ＣＭおよびプールされたＡＳＡ ＣＭは１００％（原液）および１００％未満（適したＡＭで希釈するのが好ましい）、例えば、限定されないが、２５％、５０％、および／または７５％など、で使用される。このような実施形態では、１つ以上またはすべてのプールされたＡＳＡ ＣＭの値を参照値として使用し、対応するＡＳＡ ＣＭの値と比較して、ここに記載されているように標準値を生成することができる。このような標準値は個別に使用することができ、もしくは、決定された１つ以上またはすべての標準値の平均を取ることもできる。
【0102】
あるいは、標準は、ＡＳＡである生産物と使用するための小分子標準などといった生産物とは異なることがある。このような標準は、疾患または状態に有益な効果を有することが知られている薬物または化合物の濃度となり得る。あるいは、標準は、疾患または状態における炎症反応を低下させることが知られている薬物または化合物の濃度となり得る。さらに、標準は、疾患または状態における、限定はされないがＴＮＦ－αなどの炎症性メディエーターの産生および／または活性を低下させることが知られている薬物または化合物の濃度となり得る。
【0103】
本明細書に記載されているように決定された標準値は、多くの方法で使用することができる。この標準値は、医療提供者が治療の決定を行うために使用することができる。さらに、この標準値は、生産物を受け入れるか拒否するために使用することができ、従って、再現性のある品質管理機能としての役割を果たす。
【0104】
同じアプローチは、抗炎症メディエーター、付加的な生産物値、付加的な参照値、および付加的な標準値にも適用される。
【0105】
生産物による被験体への抗炎症作用が生じやすいかどうかを判定する方法
本開示はまた、抗炎症効果が生産物によって被験体に生じる可能性があるかどうかを決定する方法を提供する。多くの治療的生物学的生産物は異なる活性および／または特性を有するので、生産物が所与の疾患又は状態に及ぼすかもしれない効果を推定することは困難である。炎症を阻害することは関節疾患の治療において重要であるので、生産物が被験者に投与されたときに望むような抗炎症効果を有するかどうかを使用者に知らせる方法を提供することは有益であろう。例えば、第１のＡＳＡを患者に投与するとＯＡの症状は完全に軽減されたが、一方で第２のＡＳＡを患者に投与してもＯＡの症状は部分的にしか軽減されなかった。このような転帰の違いは、患者同士のＯＡの重症度、２つのＡＳＡの抗炎症活性の違い、または２つのＡＳＡが患者に投与された方法に起因する可能性がある。ここに記載された方法を通じて、医療提供者は、治療転帰の違いとなる第２の潜在的な理由を排除することができる。
本開示はまた、抗炎症効果が生産物によって被験体に生じる可能性があるかどうかを決定する方法を提供する。多くの治療的生物学的生産物は異なる活性および／または特性を有するので、生産物が所与の疾患又は状態に及ぼすかもしれない効果を推定することは困難である。炎症を阻害することは関節疾患の治療において重要であるので、生産物が被験者に投与されたときに望むような抗炎症効果を有するかどうかを使用者に知らせる方法を提供することは有益であろう。例えば、第１のＡＳＡを患者に投与するとＯＡの症状は完全に軽減されたが、一方で第２のＡＳＡを患者に投与してもＯＡの症状は部分的にしか軽減されなかった。このような転帰の違いは、患者同士のＯＡの重症度、２つのＡＳＡの抗炎症活性の違い、または２つのＡＳＡが患者に投与された方法に起因する可能性がある。ここに記載された方法を通じて、医療提供者は、治療転帰の違いとなる第２の潜在的な理由を排除することができる。
【0106】
特定の実施形態では、第９の実施形態の被験者は関節疾患に苦しんでいる。本明細書で使用される関節疾患という用語は、炎症反応の亢進を伴う関節に影響を及ぼす疾患および状態を意味する。代表的な関節疾患には、ＯＡ、ＲＡおよび腱炎が含まれるが、これらに限定されない。別の特定の実施形態では、第９の実施形態の被験者はＯＡに苦しんでいる。別の特定の実施形態では、第９の実施形態の被験者はＲＡに苦しんでいる。別の特定の実施形態では、第９実施形態の被験者は腱炎に苦しんでいる。
【0107】
第９の実施形態では、生産物を被験者に投与する前に、生産物によって被験者に抗炎症効果が生じる可能性があるかどうかを決定する方法が提供される。第９の実施形態の一態様において、標準値は、上述した第５から第８の実施形態のいずれかの方法に従って決定され、さらに第５から第８の実施形態に適用される好ましい態様において説明されるようなものを含む。以外に以下のように改変される。さらに、第９の実施形態のこの態様は、標準値を閾値と比較することをさらに含む。標準値が閾値以上である場合、被験者に抗炎症効果が生じる可能性が高い。標準値が閾値未満である場合、被験者に抗炎症効果が生じる可能性は低い。
【0108】
第９の実施形態の例示的な方法を以下に示す。ここでは、標準値は上述の第８の実施形態に従って決定される。
【0109】
生産物を被検者に投与する前に、生産物により被検者に抗炎症効果が生じる可能性があるか否かを決定する方法、この方法は次の工程を含む：（ｉ）試験システムの活性化ＳＷ９８２細胞株にＡＳＡ ＣＭを添加する工程；（ｉｉ）ＡＳＡ ＣＭを試験システムの活性化ＳＷ９８２細胞株と２～５日間培養する工程；（ｉｉｉ）ＡＳＡ ＣＭが、ＴＮＦ－αおよび活性化ＳＷ９８２細胞株からの任意の１つ以上の付加的な炎症性メディエーターの産生を阻害または刺激して、生産物値を生成する程度を決定する工程；（ｉｖ）生産物値を参照値と比較して標準値を決定する工程；（ｖ）標準値を閾値と比較する工程；および（ｖｉ）標準値と閾値との比較を任意に生産物と関連付ける工程、ここでは標準値が閾値以上の場合、被験者に抗炎症効果が生じる可能性が高い。
【0110】
このような方法は、さらに次のような工程を含む：（ｖｉｉ）ＡＳＡ ＣＭが活性化ＳＷ９８２細胞株からの抗炎症メディエーターの産生、活性、または産生と活性の両方を阻害または刺激し、付加的な生産物値を生成する程度を決定する工程；（ｖｉｉｉ）付加的な生産物値を付加的な参照値と比較して、付加的な標準値を決定する工程；（ｉｘ）付加的な標準値を付加的な閾値と比較する工程；および、（ｖｉ）任意で、付加的な標準値と付加的な閾値との比較を生産物に関連付ける工程。ここでは、付加的な標準値が付加的な閾値以上の場合、被験者に抗炎症効果が生じる可能性が高い。
【0111】
上述したように、試験システムの細胞または組織は、炎症性メディエーターの産生および／または活性の増加と共に活性化因子に応答する。その結果、本開示の試験システムは、試験システムの細胞または組織によって産生される炎症性メディエーターおよび／または抗炎症メディエーターの産生および／または活性に対する、生産物または生産物由来の物質の影響を決定することにより、例えば関節疾患などの炎症反応を伴う疾患または状態に対する、生産物の期待できる影響を決定する方法を提供する。本明細書に記載される試験システムのアウトプットは、炎症性メディエーターが阻害されるか抗炎症メディエーターが刺激される程度を反映する、生産物値および／または付加的な生産物値である。生産物値および／または付加的な生産物値を参照値または付加的な参照値と比較して、標準値および付加的な標準値を生成することができる。好ましい実施形態では、生産物値／付加的生産物値は、それぞれ参照値／付加的参照値で除算される。これらの値の使用法は、本明細書に記載される。
【0112】
参照値は、さまざまな方法で生成できる。１つの例として、参照値は規定の値にすることができる。この規定値は、当技術分野で既知の情報（例えば、ＴＮＦ－αの産生の７５％の減少）に基づいて決定または設定されてもよい。生産物の生産物値がＴＮＦ－αの産生の８０％の減少であると決定される場合、生産物の標準値は１．１（生産物値を参照値で除算した値；０．８／０．７５）であろう。
【0113】
あるいは、参照値は標準を用いて経験的に決定されてもよい。参照値が経験的に決定される場合、参照値は生産物値を決定するために使用されるのと同じ試験システムおよび同じ条件を用いて決定されることが好ましい。参照値は、一度に決定され、複数の生産物値の参照値として使用されてもよいし、生産物値ごと（例えば、参照値は生産物値と並行して決定される）に別々に決定されてもよい。標準の生産物値が、本明細書に開示する試験システムを用いて６０ｐｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αと決定される場合、６０ｐｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αが参照値であると決定される。生産物値が５５ｐｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αの産生を有すると決定される場合、生産物の標準値は０．９２（生産物値を参照値で除算した値；５５／６０）となる。
【0114】
参照値は、単一の炎症性メディエーターおよび／または単一の抗炎症性メディエーターに対して決定することができる。参照値は、複数の炎症性メディエーターおよび／または単一の抗炎症性メディエーターに対して決定することができる。参照値は、単一の炎症性メディエーターおよび／または複数の抗炎症性メディエーターに対して決定することができる。さらに、参照値は、炎症性メディエーターのグループおよび／または抗炎症性メディエーターのグループに対して決定することができる。
【0115】
様々な標準は、参照値を生成するために使用することができる。この標準は、ＡＳＡ生産物で使用する低分子標準などといった生産物とは異なる場合がある。このような標準は、疾患または状態に対して有益な効果を有することが知られている薬物または化合物の濃度でありうる。あるいは、標準は、疾患または状態における炎症反応を低下させることが知られている薬物または化合物の濃度でありうる。さらに、標準は、疾患または状態におけるＴＮＦ－αなどであり、これに限定されない、炎症性メディエーターの産生および／または活性を低下させることが知られている薬物または化合物の濃度でありうる。
【0116】
あるいは、標準は生産物と同じものである。たとえば、生産物がＡＳＡの場合、標準もＡＳＡである。好ましくは、標準は、疾患または状態に対して有益な効果を有することが示されており、および／または、疾患または状態における炎症効果を減少させることが示されている。標準と生産物が同じタイプである場合、標準が生産物の平均活性を反映するように、様々な個々の生産物をプーリングすることによって標準を得ることができる。特定の実施形態では、生産物はＡＳＡであり、ＡＳＡから生成されたＣＭは本明細書に記載された試験システムに添加され、また、標準は、複数のＡＳＡ（たとえば、５～１００の個々のＡＳＡ）から生成されたプールされたＣＭである。別の実施形態では、ＡＳＡ ＣＭおよびプールされたＡＳＡ ＣＭは、１００％（原液）で使用される。別の実施形態では、ＡＳＡ ＣＭおよびプールされたＡＳＡ ＣＭは、限定はされないが２５％、５０％、および／または７５％など、１００％未満（適当なＡＭで希釈するのが好ましい）で使用される。別の実施形態では、ＡＳＡ ＣＭおよびプールされたＡＳＡ ＣＭは、１００％（原液）および、限定はされないが２５％、５０％、および／または７５％など、１００％未満（適当なＡＭで希釈するのが好ましい）で使用される。このような実施形態では、１つ以上またはすべてのプールされたＡＳＡ ＣＭ値を参照値として使用し、対応するＡＳＡ ＣＭ値と比較して、本明細書に記載されているように標準値を生成することができる。このような標準値を個別に使用することも、決定された１つ以上またはすべての標準値の平均を取ることもできる。
【0117】
１つの実施形態において、本明細書に記載されているように決定された標準値は、閾値と比較され、生産物の被験者への投与によって抗炎症効果が被験者に生じる可能性があるかどうかを決定する。標準値が閾値以上である場合、生産物は、被験者への投与時に抗炎症効果を有する可能性がありそうだと決定される。反対に、標準値が閾値未満である場合、生産物は、被験者への投与時に抗炎症効果を有する可能性がなさそうだと決定される。
【0118】
閾値は、例えば、ＴＮＦ－α産生の７０％減少または５０ｐｇ／ｍｌ未満のＴＮＦ－α濃度が疾患または状態の治療において有益であること、または疾患または状態における炎症を減少させることが知られているといった知識のような、当該技術分野において公知の情報に基づいて決定され得る。このアプローチでは、ＴＮＦ－α産生の７０％以上の減少または５０ｐｇ／ｍｌ未満のＴＮＦ－α濃度の標準値を有する生産物のみが、被験者に投与されたときに抗炎症効果を有する可能性が高いと決定される。
【0119】
閾値は、参照値（すなわち標準値）に対する生産物値の関係に基づいて決定され得る。閾値は、生産物値が参照値以上である生産物のみが被験者に投与されたときに抗炎症効果を有する可能性が高いとみなされるように、１．０であってもよい。例えば、参照値がＴＮＦ－α産生の６０％阻害であり、生産物値がＴＮＦ－α産生の５８％阻害である場合、標準値は０．９７（生産物値を参照値で除算した値；０．５８／０．６０）であり、生産物は被験者に投与されたときに抗炎症効果を有する可能性が低いであろうと判断される。あるいは、参照値よりわずかに小さいか大きい生産物値を有する生産物が被験者に投与されたときに抗炎症効果を有する可能性が高いとみなされるように、閾値は０．７５であってもよい。例えば、参照値が８０ｐｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αであり、生産物値が６０ｐｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αである場合、標準値は０．７５（生産物値を参照値で除算した値；６０／８０）であり、生産物は被験者に投与されたときに抗炎症効果を有する可能性が高いであろうと判断される。さらには、参照値よりもわずかに高い生産物値を有する生産物が被験者に投与されたときに抗炎症効果を有する可能性が高いとみなされるように、閾値は１．１であってもよい。例えば、参照値が５９ｐｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αであり、生産物値が７１ｐｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αである場合、標準値は１．２（生産物値を参照値で除算した値；７１／５９）であり、この生産物は被験者に投与されたときに抗炎症効果を有する可能性が高いであろうと判断される。
【0120】
閾値は、所定の疾患または状態によって異なることがある。例えば、閾値はＯＡとＲＡで差があり得る。好ましい実施形態では、閾値は、参照値に０．７５～０．９９または０．８５～０．９９または０．９５～０．９９を乗じた値以上である。別の好ましい実施形態では、閾値は、参照値に１～１．２５または１～１．１５または１～１．０５を乗じた値以上である。
【0121】
別の実施形態では、標準値は、生産物の被験者への投与によって抗炎症効果が被験者に生じる可能性があるかどうかを決定するために、直接使用される。１つの実施形態において、標準値が０．７５より大きい場合、０．８０より大きい場合、０．８５より大きい場合、０．９５より大きい場合、その生産物は被験者への投与時に抗炎症効果を有する可能性があると決定される。別の実施形態では、標準値が１、１．１、１．２、または１．２５より大きい場合、その生産物は被験者への投与時に抗炎症効果を有する可能性があると決定される。
【0122】
同じアプローチは、抗炎症メディエーター、付加的な生産物値、付加的な参照値、および付加的な標準値に適用される。
【0123】
キット
本開示はまた、本明細書に記載された第１から第９の実施形態の方法のような、開示された方法を実行するためのキットを提供する。１つの実施形態において、本開示は、生産物の抗炎症活性を定量するためのキットを提供する。別の実施形態において、本開示は、生産物の抗炎症作用を標準化するためのキットを提供する。さらに別の実施形態において、本開示は、生産物を被験者に投与する前に、生産物の被験者への投与が被験者に抗炎症作用を生じさせる可能性があるかどうかを決定するためのキットを提供する。
本開示はまた、本明細書に記載された第１から第９の実施形態の方法のような、開示された方法を実行するためのキットを提供する。１つの実施形態において、本開示は、生産物の抗炎症活性を定量するためのキットを提供する。別の実施形態において、本開示は、生産物の抗炎症作用を標準化するためのキットを提供する。さらに別の実施形態において、本開示は、生産物を被験者に投与する前に、生産物の被験者への投与が被験者に抗炎症作用を生じさせる可能性があるかどうかを決定するためのキットを提供する。
【0124】
特定の実施形態において、本開示のキットは、生産物または生産物由来の物質が、本明細書に記載の活性化された細胞または組織からの炎症性メディエーターおよび／または抗炎症メディエーターの産生および／または活性を阻害または刺激する程度を決定するための、必要な材料および試薬を含む。
【0125】
特定の実施形態において、本開示のキットは、以下の1つ以上を含む。
（ｉ）第１から第９の実施形態の方法で使用するための細胞または組織；好ましくは、細胞または組織は、ヒト一次細胞株またはヒト形質転換細胞株である；より好ましくは、細胞または組織は、ヒト線維芽細胞様滑膜細胞株、ヒトマクロファージ様滑膜細胞、ＨＩＧ－８２細胞株、またはＳＷ９８２細胞株である；
（ｉｉ）細胞または組織、特に（ｉ）に記載された細胞株を刺激するための試薬で、１つ以上の炎症性メディエーターおよび／または１つ以上の抗炎症性メディエーターを産生する；好ましくは、その試薬はＩＬ－１βおよび／またはＴＮＦ－αである；
（ｉｉｉ）生産物、好ましくは羊膜由来生産物、より好ましくはＡＳＡ生産物；好ましいＡＳＡ生産物はＲｅＮｕ（登録商標）またはＮｕＣｅｌ（登録商標）（オルガノジェネシス社、マサチューセッツ州カントン）である；
（ｉｖ）生産物由来の物質、好ましくは生産物によって生成されたＣＭ、より好ましくは（ｉｉｉ）に記載されたＡＳＡによって生成されたＣＭ；
（ｖ）参照値または付加的な参照値を決定するために使用する標準；
（ｖｉ）（ｉ）の細胞または組織を培養するため、および／または（ｉｖ）のＣＭを産生するための細胞培養培地；および
（ｖｉｉ）本明細書に記載された第１から第９の実施形態の１つ以上の方法を実行するための指示。
（ｉ）第１から第９の実施形態の方法で使用するための細胞または組織；好ましくは、細胞または組織は、ヒト一次細胞株またはヒト形質転換細胞株である；より好ましくは、細胞または組織は、ヒト線維芽細胞様滑膜細胞株、ヒトマクロファージ様滑膜細胞、ＨＩＧ－８２細胞株、またはＳＷ９８２細胞株である；
（ｉｉ）細胞または組織、特に（ｉ）に記載された細胞株を刺激するための試薬で、１つ以上の炎症性メディエーターおよび／または１つ以上の抗炎症性メディエーターを産生する；好ましくは、その試薬はＩＬ－１βおよび／またはＴＮＦ－αである；
（ｉｉｉ）生産物、好ましくは羊膜由来生産物、より好ましくはＡＳＡ生産物；好ましいＡＳＡ生産物はＲｅＮｕ（登録商標）またはＮｕＣｅｌ（登録商標）（オルガノジェネシス社、マサチューセッツ州カントン）である；
（ｉｖ）生産物由来の物質、好ましくは生産物によって生成されたＣＭ、より好ましくは（ｉｉｉ）に記載されたＡＳＡによって生成されたＣＭ；
（ｖ）参照値または付加的な参照値を決定するために使用する標準；
（ｖｉ）（ｉ）の細胞または組織を培養するため、および／または（ｉｖ）のＣＭを産生するための細胞培養培地；および
（ｖｉｉ）本明細書に記載された第１から第９の実施形態の１つ以上の方法を実行するための指示。
【0126】
生産物および組成物
本開示はまた、生産物または生産物を含む組成物を提供し、ここでは、生産物または組成物は関連する生産物値を有する。生産物値は、生産物または組成物に直接（例えば、生産物にマイクロプリントされるか、または組成物を含む容器にプリントされる）関連してもよく、もしくは生産物または組成物に間接的に（例えば、生産物または組成物とともに提供される材料にプリントされる）関連してもよい。
本開示はまた、生産物または生産物を含む組成物を提供し、ここでは、生産物または組成物は関連する生産物値を有する。生産物値は、生産物または組成物に直接（例えば、生産物にマイクロプリントされるか、または組成物を含む容器にプリントされる）関連してもよく、もしくは生産物または組成物に間接的に（例えば、生産物または組成物とともに提供される材料にプリントされる）関連してもよい。
【0127】
本開示はまた、生産物または生産物を含む組成物を提供し、ここでは、生産物または組成物は関連する標準値を有する。標準値は、生産物または組成物に直接（例えば、生産物にマイクロプリントされるか、または組成物を含む容器にプリントされる）関連してもよく、もしくは生産物または組成物に間接的に（例えば、生産物または組成物とともに提供される材料にプリントされる）関連してもよい。
【0128】
本開示はまた、生産物または生産物を含む組成物を提供し、ここでは、生産物または組成物は標準値と閾値との関連した比較を有する。標準値と閾値との比較は、生産物または組成物に直接（例えば、生産物にマイクロプリントされるか、または組成物を含む容器にプリントされる）関連してもよく、もしくは生産物または組成物に間接的に（例えば、生産物または組成物とともに提供される材料にプリントされる）関連してもよい。
【0129】
上記のいずれにおいても、生産物が組成物の一部である場合、その組成物は、適切な希釈剤、担体、および培地をさらに含むことができる。
【0130】
上記のいずれにおいても、生産物または生産物を含む組成物は、凍結保存することができる。
【0131】
上記のいずれにおいても、生産物とは生物学的治療用生産物である。上記のいずれにおいても、生産物とは羊膜由来生産物である。上記のいずれにおいても、生産物とはヒトＡＳＡである。上記のいずれにおいても、生産物とはＲｅＮｕ（登録商標）（オルガノジェネシス社、マサチューセッツ州カントン）である。上記のいずれにおいても、生産物とはＮｕＣｅｌ（登録商標）（オルガノジェネシス社、マサチューセッツ州カントン）である。
【0132】
材料と方法
いくつかの実施形態において、ヒト滑膜肉腫細胞（ＳＷ９８２）をＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）から取得して、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）を添加したライボビッツＬ－１５培地（ハイクローン社、イリノイ州シカゴ）で培養した。ＳＷ９８２細胞は、初代ヒト細胞に特徴的な変異および拡大の限界なしに、初代滑膜細胞培養の活性化可能な表現型を保持する滑膜肉腫細胞株である。しかしながら、ＨＩＧ－８２、ヒト線維芽細胞様滑膜細胞またはヒトマクロファージ様滑膜細胞のような他の細胞は、開示された方法に適合する。ＳＷ９８２細胞をＡＴＣＣプロトコルに従って培養し、継代した。ライボビッツＬ－１５培地はＣＯ２のない培養器での使用のために処方されているので、細胞は、培養器との空気交換を起こさないフェノール系のふたを有するフラスコで培養し、ＣＯ２のない培養器に設置した。完全増殖培地はＬ－１５培地＋１０％ウシ胎児血清であった。アッセイ培地は、全ての実験において、Ｌ－１５基礎培地の中の５０％（ｖ／ｖ）完全増殖培地であった。
いくつかの実施形態において、ヒト滑膜肉腫細胞（ＳＷ９８２）をＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）から取得して、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）を添加したライボビッツＬ－１５培地（ハイクローン社、イリノイ州シカゴ）で培養した。ＳＷ９８２細胞は、初代ヒト細胞に特徴的な変異および拡大の限界なしに、初代滑膜細胞培養の活性化可能な表現型を保持する滑膜肉腫細胞株である。しかしながら、ＨＩＧ－８２、ヒト線維芽細胞様滑膜細胞またはヒトマクロファージ様滑膜細胞のような他の細胞は、開示された方法に適合する。ＳＷ９８２細胞をＡＴＣＣプロトコルに従って培養し、継代した。ライボビッツＬ－１５培地はＣＯ２のない培養器での使用のために処方されているので、細胞は、培養器との空気交換を起こさないフェノール系のふたを有するフラスコで培養し、ＣＯ２のない培養器に設置した。完全増殖培地はＬ－１５培地＋１０％ウシ胎児血清であった。アッセイ培地は、全ての実験において、Ｌ－１５基礎培地の中の５０％（ｖ／ｖ）完全増殖培地であった。
【0133】
条件培地（ＣＭ）は羊水懸濁同種移植片（ＡＳＡ、ＲｅＮｕ（登録商標）またはＮｕＣｅｌ（登録商標）、オルガノジェネシス社）を解凍し、続いてＤＭＳＯ成分を除去するために２５０×ｇで５分間遠心分離することにより調製した。上清を除去して廃棄し、ＡＳＡのペレット化成分をＡＳＡ １ｍＬ（元の容量）当たりアッセイ培地１ｍＬの濃度でアッセイ培地中に再懸濁し、４°Ｃで４日間穏やかに回転させて培養した。次に懸濁液を２５０×ｇで５分間遠心分離し、ＣＭの上清を集め、使用前に０．２２ｐｍポリエーテルサルフォン（ＰＥＳ）フィルター（Ｍｉｌｌｅｘ（商標）－ＧＰ滅菌シリンジフィルター、ＳＬＧＰ０３３ＲＳ，ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ社，マサチューセッツ州バーリントン）を用いて滅菌濾過した。
【0134】
細胞播種密度の範囲は約２５，０００細胞／ウェル未満から約３７，０００細胞／ウェル以上であり、２５，０００細胞／ウェルでは開示した方法の経過において適切なコンフルエンシーが得られた。しかし、他の播種密度は開示した方法およびシステムと相性が良い。細胞株によって異なる、互換性のある増殖培地を用いて、播種を行う。ＣＯ２の影響を受けない培養器での培養は、活性化因子のみの処理を施した細胞とＡＳＡ ＣＭ処理の細胞間でのＴＮＦ－α産生レベルにおいてより大きな絶対差をもたらし、それゆえに、ＳＷ９８２細胞を用いた望ましい培養条件である。しかしながら、特に他の細胞株が利用される場合、０％より高い、特に５％またはいくつかの例では５％より高いＣＯ２レベルが可能である。培養は一般的に約３７°Ｃで行われる。Ｐａｒａｆｉｌｍ Ｍ（商標）（Ｂｅｍｉｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．社，ウィスコンシン州ニーナ）または同様のセルフシーリングの熱可塑性被覆材料を使用することは、開示された方法と互換性があるが、任意である。他の非シール性被覆は、細胞の汚濁を低減するのに互換性があるが、細胞へのＣＯ２の接近を防止または低減しない可能性がある。様々な実施形態において、細胞は、フラスコ、ウェルプレート、または他の無菌細胞培養容器で播種される。これらの容器は、密封または被覆される場合もあれば、または密封または被覆されずに放置される場合もある。細胞培養のための容器は、紫外線照射、７０％イソプロピルアルコールとの接触、または当該技術分野で公知の他の滅菌手段によって、滅菌される。
【0135】
一晩付着した後、細胞は任意でスコアリングされるか、または視覚的にコンフルエンシーを評価される。しかしながら、付着は、細胞株および増殖条件によって、より長い期間またはより短い期間の培養時間で起こる。その後、細胞は、ＡＭ単独または活性化因子を含むＡＭで７２時間プライミングされる。プライミング期間は、場合によっては、７２時間以上または未満である。アッセイ培地は、Ｌ－１５基底培地中の５０％（ｖ／ｖ）の完全なＬ－１５増殖培地である。しかし、ＡＭは、いくつかの例で使用される増殖培地の異なる割合で、使用される増殖培地に基づいて変化し得る。特定の実施形態では、活性化因子は、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１β（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎインビトロジェン社カタログ番号ＲＩＬＩＢＩ，カリフォルニア州カールスバッド）および１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社カタログ番号ＧＦ０２３、マサチューセッツ州バーリントン）を含むが、他の濃度のＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αを使用することができ、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αは上記の濃度または他の濃度で単独で使用することができる。炎症反応をより大きくまたはより小さくすることが望まれる場合、一方または両方のサイトカインの異なる濃度が可能である。さらに、ＩＬ－１α、ＩＬ－６、白血病阻害因子、オンコスタチン－Ｍ、ＩＬ－８、ＩＬ－１７、および／またはＩＬ－１８のような他のサイトカインは、ここに開示された方法の他の実施形態において互換性があり、ＩＬ－１βおよび／またはＴＮＦ－αと組み合わせるかまたはその代わりとして使用することができる。活性化因子は、使用する直前に単独でＡＭに添加される；サイトカインは、原液から少量添加される。７２時間後、必要に応じて、ＡＭおよび活性化因子群のサンプルをスコアリングまたは視覚的にコンフルエンシーを調べ、すべての培地は、試験対象となる生産物または生産物由来の物質（たとえばＡＳＡ ＣＭ）とともに新鮮な活性化因子を含む、新鮮なＡＭに置き換えられる。
【0136】
活性化因子がＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αである場合、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－αの投与はアッセイ培地間で最大のアッセイウィンドウを提供し、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１ｂを使用したとき、活性化因子は単独で集団になる。しかしながら、開示された方法では、他の濃度のＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βが予期される。
【0137】
実施例に記載された実験では、細胞は、ＡＭ単独、活性化因子（ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αなど）を有するＡＭ、または、１００％ないし２５～７５％ＡＳＡ ＣＭまたはプールされた陽性対照（ｐｏｏｌｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ：ＰＰＣ）ＣＭ中の活性化因子を有するＡＭのいずれかを受ける。ＰＰＣ ＣＭが望まれる場合、ＮｕＣｅｌの市販ロットを用いて作成され、生産物の様々なバッチからほぼ同等の寄与でＰＰＣ ＣＭが生成されることを確保する。活性化因子は、前述の任意の組み合わせで上記のように使用することができる。炎症性サイトカインは、使用直前にＡＭおよびＣＭの両方に独立して添加される。さらに、各処理条件からの約４００μＬの残りの培地は、細胞のないウェルまたは容器に任意に配置される。処理後約４８時間後、ＡＭおよび活性化因子群のそれぞれからのサンプルは、任意にスコアリングまたは視覚的にコンフルエンシーを評価される。空のウェルまたは容器に配置された各処理群からの残りの培地を構成し、細胞と同じ条件に従う、無細胞対照におけるＴＮＦ－αのレベルは、無細胞対照が望まれない場合に決定される。
【0138】
上清は、炎症性メディエーター／抗炎症性メディエーター産生の分析のために約４８時間培養した後に採取され、ＴＮＦ－αタンパク質産生は好ましい炎症性因子となっている。しかしながら、分析前の他の時間の培養も可能である。上清は、酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）で使用するまで－８０°Ｃの場所に置き保存する。ＴＮＦ－α濃度は市販のキット（例えば、ＤＴＡ００Ｄ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州ミネアポリス）を用いて測定され、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡが実施された。遺伝子発現分析のために、細胞を４００μＬのＲＮＡｚｏｌ中に採取し、－８０°Ｃで保存する。市販のＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）は、本明細書に開示される方法と共に使用することができる。
【0139】
さらに、クオンチキンイムノアッセイ対照群２４８（ＱＣ２４８，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社，ミネソタ州ミネアポリス）のような対照材料が必要に応じて利用される。これらの対照は、製造業者の指示に従って再懸濁し、実行される。ＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡがＣＭ中のＴＮＦ－αタンパク質をリカバリできることを確認するために、リカバリおよび選択性対照が必要に応じて含まれる。標準ＴＮＦ－αは、単独で（リカバリ対照）、およびプライミングに用いる５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－１βとともに（選択性対照）、５００ｐｇ／ｍＬで５０％ＣＭに添加される。しかしながら、アッセイ対照のための他の量の標準ＴＮＦ－αは、開示された方法と互換性がある。
【0140】
遺伝子発現分析が望まれる場合、細胞は上述のように採取され得る。１つの実施形態では、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ（商標）ＭｉｃｒｏＰｒｅｐ Ｐｌｕｓカラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈザイモリサーチ社）を用いてＲＮＡを抽出、単離し、Ｖｅｒｉｔｉ サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓアプライドバイオシステムズ社）上でＶｅｒｓｏ ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃサーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて逆転写によりｃＤＮＡを得る。ＴａｑＭａｎプローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓライフテクノロジーズ社）を用いて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）３リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓアプライドバイオシステムズ社）を使った関連標的の遺伝子発現を評価した。Ｃｔ値はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いたデータから得られ、２ΔΔＣｔ法を用いてハウスキーピング遺伝子（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ＧＡＰＤＨ）と比較したフォールドチェンジを決定した。代表的な炎症性および抗炎症性メディエーターに対する適切なＴａｑＭａｎプローブを以下の表１に示す。
【表1】
【0141】
すべての統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）などの市販のソフトウェアを使用して行われる。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とダネットの多重比較検定を実行する。すべてのグラフについて、平均±標準偏差が報告される。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。すべてのグラフで、塗りつぶされた棒線は１００％の投与を表し、斜線の入った棒線は５０％の投与を表す。他の統計解析の形態は、本明細書には記載されていない実施形態で実施され、開示された方法と互換性がある。
【実施例】
【0142】
次に示す実施例は、上記の方法と結果のある一部を示している。次の実施例は、単なる例示として示してあり、限定するものではない。
【0143】
［実施例１］
細胞密度が３７，０００細胞／ウェルおよび２５，０００細胞／ウェルにおける高継代（古い細胞）および低継代（新しい細胞）の影響を検討した。この実施例では、高継代という用語は、連続的に継代され（１０回以上）、連続的に維持するうちにフラスコ内でコンフルエンシーまたはオーバーコンフルエンシーに達した細胞を指す。低継代という用語は、アッセイで使用する前に約１～５回解凍、継代された細胞を指し、これらの細胞は、継代中に細胞が継代間で９０％より高いコンフルエンシーに達しないように注意深く管理されたものである。
細胞密度が３７，０００細胞／ウェルおよび２５，０００細胞／ウェルにおける高継代（古い細胞）および低継代（新しい細胞）の影響を検討した。この実施例では、高継代という用語は、連続的に継代され（１０回以上）、連続的に維持するうちにフラスコ内でコンフルエンシーまたはオーバーコンフルエンシーに達した細胞を指す。低継代という用語は、アッセイで使用する前に約１～５回解凍、継代された細胞を指し、これらの細胞は、継代中に細胞が継代間で９０％より高いコンフルエンシーに達しないように注意深く管理されたものである。
【0144】
ＳＷ９８２を、密度が２５，０００細胞／ウェルまたは３７，０００細胞／ウェルである８００μＬの増殖培地で１２ウェルプレートの中で播種し、一晩付着させ、これを合計７プレートを用意した。４つのプレートは、継代３０（「新しい細胞」）で２５，０００細胞／ウェルのＳＷ９８２細胞を有し、１つのプレートは、継代３０（「新しい細胞」）で３７，０００細胞／ウェルのＳＷ９８２細胞を有し、１つのプレートは、継代３７で３７，０００細胞／ウェル（「古い細胞」）のＳＷ９８２細胞を有し、そしてもう１つのプレートは、継代３７で２５，０００細胞／ウェル（「古い細胞」）のＳＷ９８２細胞を有した。増殖培地は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したライボビッツＬ－１５培地（ＨｙＣｌｏｎｅハイクローン社、イリノイ州シカゴ）であった。
【0145】
ＳＷ９８２培養のための市販の指示書ではＣＯ２および空気の混合培養条件を推奨していないため、ＣＯ２のない環境を提供するために５％ＣＯ２を含む培養器の中でパラフィルムの中にプレートを被覆することと、ＣＯ２のない培養器の中でパラフィルムＭ（商標）なしでプレートを置くこととの違いも調べた。このようにして、すべてのプレートをパラフィルムＭ（商標）で被覆し、５％ＣＯ２を含む培養条件の下で培養器の中に置いたが、例外的に１つのプレートだけ、パラフィルムＭ（商標）なしで培養器の中に置いた。パラフィルムＭ（商標）なしの追加のプレートを、ＣＯ２がほぼない培養器中に置いた。この実施例においてグループのランダム化も検討し、ランダム化されなかった（つまり、各カラムは同じ条件を表す）プレートを、プレート上の条件をランダムに割り当てたプレートと比較した。ランダム化は、ｒａｎｄｏｍ．ｏｒｇで入手可能なランダマイザーのような、市販のリストランダマイザーを用いて実施した。
【0146】
約２４±４時間の細胞接着の後、アッセイ培地（ＡＭ）単独または活性化因子を含むＡＭで７２時間細胞をプライミングした。アッセイ培地は、Ｌ－１５基底培地の中で５０％（ｖ／ｖ）の完全増殖培地であった。活性化因子は、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１β（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎインビトロジェン社カタログ番号ＲＩＬ１ＢＩ、ロット番号Ｕ１２８７７２１Ａ、カリフォルニア州カールスバッド）と２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅミリポア社カタログ番号ＧＦ０２３、ロット番号２９４６０３６、マサチューセッツ州バーリントン）から成っていた。７２時間後、すべての培地を新鮮な培地と交換した。ＡＭ単独、活性化因子（ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－α）を有するＡＭ、もしくは１００％または５０％ＡＳＡ ＣＭ中の活性化因子を有するＡＭのいずれかを受けた細胞を、前述のように調製した。処理後４８時間後、各細胞密度条件を表すＡＭおよび活性化因子群の各々から１つのウェルをコンフルエンシーについてスコア化し、その結果を表２に示した。一般的に、高継代細胞は低継代細胞よりも速く成長し、よりコンフルエントになるが、一方で、プレートのランダム化およびＰａｒａｆｉｌｍ Ｍ（商標）被覆はほとんど影響しなかった。しかし、ＣＯ２がほぼない培養器で培養した細胞は、Ｐａｒａｆｉｌｍ Ｍ（商標）被覆の有無にかかわらず、５％ＣＯ２の培養条件に曝露した細胞と比較して、より高いコンフルエンシーが得られた。
【表2】
【0147】
培養４８時間後に上清を採取してＴＮＦ－αタンパク質の産生を分析し、本技術分野で広く知られた方法に従ってプレートを４°Ｃで４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。製造業者の指示に従い、直ちに上清をＥＬＩＳＡに使い、市販のキット（ＤＴＡ００Ｄ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州ミネアポリス）を用いてＴＮＦ－α濃度を測定した。
【0148】
市販のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて統計解析を行った。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とダネットの多重比較検定を行った。すべてのグラフで、平均±標準偏差を示している。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。すべてのグラフにおいて、塗りつぶされた棒線は１００％の投与を表し、斜線の入った棒線は５０％の投与を表す。すべての実験のサンプル数を図の凡例で示す。
【0149】
低継代処理群間の細胞密度の比較において、結果は、試験されたどちらの密度もＡＳＡ ＣＭ処理後のＴＮＦ－αダウンレギュレーションの有意な傾向を維持し（ｐ＜０．０００１）、各処理群内で類似のＴＮＦ－αレベルを有することを示す（図１）。さらに、高継代処理群の試験も、有意な傾向を維持することを示し（活性化因子ＩＮＦと比較したＡＳＡ ＣＭのｐ＜０．０００１）、どちらの播種密度も各処理群内で類似のＴＮＦ－αレベルをもたらす。低継代処理群と高継代処理群の両方とも類似のＴＮＦ－αレベルを有し、両処理群ともＡＳＡ ＣＭ処理後にＴＮＦ－αたんぱく質レベルの有意な低下を示した。プレートランダム化の研究では、ＴＮＦ－αの有意なダウンレギュレーションはＡＳＡ ＣＭ処理後に維持され（ｐ＜０．０００１）、ＴＮＦ－αタンパク質レベルは非ランダム化プレートで生成されたものと類似している。従って、図１の結果から、継代数、播種密度、およびプレートランダム化はＴＮＦ－αレベルに有意な影響を与えず、同様に、ウェル条件のプレートランダム化はＴＮＦ－αレベルに有意な影響を与えないように思われる。
【0150】
次に、図２の結果が示すように、培養ＣＯ２条件がＴＮＦ－αタンパク質レベルに及ぼす影響を検討した。細胞をＣＯ２なしの培養器またはフェノール系のふたのあるフラスコ（培養器との空気交換なし）で培養した。細胞を１２ウェルプレートに入れて播種（２５，０００細胞／ウェル）した後、一方のプレートを５％ＣＯ２培養器（パラフィルムなし）に置き、他方のプレートをＣＯ２なしの培養器に置いた。ＣＯ２ありとＣＯ２なしを比較した結果を検討すると、いずれの場合も、ＡＳＡ ＣＭによる処理は活性化因子と比較してＴＮＦ－αレベルを有意に低下させた（ｐ＜０．０００１）。ＴＮＦ－αのダウンレギュレーションが双方の条件においてＡＳＡによる処理の結果として観察された一方、ＣＯ２の影響を受けない培養器で維持されたプレートでは、全体的なＴＮＦ－αレベルは実質的に高かった。さらに、培養中にＣＯ２を伴いＰａｒａｆｉｌｍ Ｍ（商標）で被覆した状態を図１に示す（「２５ｋ新規細胞」群）。この群は、図２に示すように、Ｐａｒａｆｉｌｍ Ｍ（商標）の被覆なしでＣＯ２と培養した２５，０００細胞／ウェル群から生じたものと比較して、実質的に同等のＴＮＦ－αレベルを有することが見出された。これらの結果は、Ｐａｒａｆｉｌｍ Ｍ（商標）被覆が培養中のＣＯ２との相互作用を完全には防止しないことを示す。
【0151】
［実施例２］
この実施例では、ＩＬ－１β濃度を１ｎｇ／ｍＬに一定に保ちつつ、ＳＷ９８２細胞にＴＮＦ－αの量を１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬと変化させて投与した場合の効果を検討する。継代２９のＳＷ９８２細胞を４つの１２ウェルプレートの８００μＬの成長培地中に２５，０００細胞／ウェルの密度で播種し、ＣＯ２のない培養器の中で一晩付着させた。成長培地は１０％ウシ胎児シ血清（ＦＢＳ）を添加したライボビッツＬ－１５培地（ハイクローン社、イリノイ州シカゴ）であった。
この実施例では、ＩＬ－１β濃度を１ｎｇ／ｍＬに一定に保ちつつ、ＳＷ９８２細胞にＴＮＦ－αの量を１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬと変化させて投与した場合の効果を検討する。継代２９のＳＷ９８２細胞を４つの１２ウェルプレートの８００μＬの成長培地中に２５，０００細胞／ウェルの密度で播種し、ＣＯ２のない培養器の中で一晩付着させた。成長培地は１０％ウシ胎児シ血清（ＦＢＳ）を添加したライボビッツＬ－１５培地（ハイクローン社、イリノイ州シカゴ）であった。
【0152】
約２４±４時間の付着後、細胞をアッセイ培地（ＡＭ）単独または活性化因子を含むアッセイ培地で７２時間プライミングした。アッセイ培地は、基底培地（ライボビッツＬ－１５）で５０％（ｖ／ｖ）の完全増殖培地であった。活性化因子は、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１β（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎインビトロジェン社カタログ番号ＲＩＬ１ＢＩ、ロット番号Ｕ１２８７７２１Ａ、カリフォルニア州カールスバッド）と、１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、または２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅミリポア社カタログ番号ＧＦ０２３、ロット番号２９４６０３６、マサチューセッツ州バーリントン）から成っていた。７２時間後、すべての培地を新鮮な培地と交換した。ＡＭ単独、活性化因子（１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１βおよび１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、または２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α）を有するＡＭ、もしくは１００％または５０％ＡＳＡ ＣＭ中の活性化因子（１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１βおよび１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、または２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α）を有するＡＭのいずれかを受けた細胞を、前述のように調製した。活性化因子は使用直前にＡＭとＣＭの両方に独立して添加された。培養４８時間後に上清を採取してＴＮＦ－αタンパク質の産生を分析し、本技術分野で広く知られた方法に従ってプレートを４°Ｃで４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。上清をＥＬＩＳＡで使用するまで－８０°Ｃで保存した。ＴＮＦ－αレベルを市販のキット（ＤＴＡ００Ｄ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州ミネアポリス）を用いて測定し、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡを実施した。
【0153】
統計解析は市販のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて実施された。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とダネットの多重比較検定を行った。すべてのグラフで、平均±標準偏差を示している。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。すべてのグラフにおいて、塗りつぶされた棒線は１００％の投与を表し、斜線の入った棒線は５０％の投与を表す。すべての実験のサンプル数を図の凡例で示す。
【0154】
ＴＮＦ－α応答への活性化因子の効果を特性化して、どのＴＮＦ－α濃度がＡＭ対照と活性化因子単独群の間で最大のアッセイウィンドウをもたらすかを決定した。さらに、これらの異なる濃度のＴＮＦ－α処理におけるＡＳＡ ＣＭへの応答を特性化した。ＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡの結果を図３に示す。１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－αの投与では、活性化因子単独群において高濃度のＴＮＦ－αが認められ、ＡＳＡ ＣＭ処理後にＴＮＦ－αタンパク質レベルが有意に低下した（１００％：ｐ＜０．０００１；５０％：ｐ＜０．００１）。５ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α処理群では、ＴＮＦ－α処理に対する反応はより小さかったが、それでもＡＳＡ ＣＭに反応してＴＮＦ－αタンパク質レベルが有意に低下した（１００％：ｐ＜０．０００１；５０％：ｐ＜０．００１）。２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α処理群では、さらに低い炎症反応が観察され、ＡＳＡ ＣＭに反応してＴＮＦ－αの低下も見られた（１００％：ｐ＜０．０１；５０％：ｎ＝１、統計解析なし）。
【0155】
ＡＳＡ ＣＭ処理が正規化され、図４の下方に減少率として示されたとき、１０ｎｇ／ｍＬおよび５ｎｇ／ｍＬの両方のＴＮＦ－αの投与は、１００％および５０％のＡＳＡ ＣＭ処理後、非常に類似した有意な炎症の低下をもたらした（それぞれ、ｐ＜０．０００１およびｐ＜０．００１）。しかし、２ｎｇ／ｍＬ処理群では、１００％ＣＭでのＴＮＦ－αのより高い減少率の傾向が観察された一方で、全体的な炎症レベルは、１０ｎｇ／ｍＬおよび５ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α処理群で観察されたものよりはるかに低かった（図３）。
【0156】
この研究では、ＳＷ９８２細胞の初期プライミングを検討して、ＡＭ対照と比較した炎症の増加レベルを最適化し、処理終了時に観察される炎症レベルと比較する（図３）。炎症性サイトカインによるプライミングの７２時間後のＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡの結果（処理直前、ｔ０）を図５に示す。１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α処理群では、ＡＭ対照と比較してｔ０でＴＮＦ－αレベルの有意な増加があった（ｐ＜０．０００１）。ｔ０では、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α処理群のＴＮＦ－αレベルは５６０ｐｇ／ｍＬであった（図５）が、実験終了時には、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α処理群のＴＮＦ－αレベルは７５３ｐｇ／ｍＬであった（図３）。５ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α処理群では、ｔ０時のＴＮＦ－αレベルがＡＭ対照と比較して有意な増加があり（ｐ＜０．０００１）、その値はｔ０では３１１ｐｇ／ｍＬ（図５）、研究終了時には２７３ｐｇ／ｍＬ（図３）であった。２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α処理群では、ｔ０時のＴＮＦ－αレベルがＡＭ対照と比較して有意な増加があり（ｐ＜０．００１）、ｔ０では１６４ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ－α（図５）、研究終了時には９９ｐｇ／ｍＬ（図３）であった。１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α処理群では、ＴＮＦ－αレベルで測定されたように、炎症が持続し、ｔ０から研究終了時まで増加する；５ｎｇ／ｍＬおよび２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α処理群では、炎症レベルは一定であるか、ｔ０から最終時点に向けて減少する。持続したＴＮＦ－α減少傾向、アッセイ培地と活性化因子単独群との間のより大きな差、ＣＭ処理群の結果としての減少、およびｔ０から実験終了時までのＴＮＦ－αレベルの持続／増加から、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－αをＳＷ９８２細胞とともに使用することが理想的であると結論づけられた。
【0157】
［実施例３］
プール陽性対照（ＰＰＣ）およびＡＳＡ（ＮｕＣｅｌ（登録商標））ＣＭを市販ロット（ロット番号１８４６７０９０３）から用いて、力価（ｐｏｔｅｎｃｙ）アッセイの再現性を検討した。さらに、用量曲線を実行して、ＡＳＡ ＣＭの異なる割合に対する応答を評価した。ＰＰＣはＮｕＣｅｌの市販ロットを用いて作成し、５バッチ分をそれぞれ３０バイアル作り、ＰＰＣ ＣＭが様々なバッチからほぼ等しい寄与で生成されることが確かめられた。
プール陽性対照（ＰＰＣ）およびＡＳＡ（ＮｕＣｅｌ（登録商標））ＣＭを市販ロット（ロット番号１８４６７０９０３）から用いて、力価（ｐｏｔｅｎｃｙ）アッセイの再現性を検討した。さらに、用量曲線を実行して、ＡＳＡ ＣＭの異なる割合に対する応答を評価した。ＰＰＣはＮｕＣｅｌの市販ロットを用いて作成し、５バッチ分をそれぞれ３０バイアル作り、ＰＰＣ ＣＭが様々なバッチからほぼ等しい寄与で生成されることが確かめられた。
【0158】
継代３１（融解から＋３、１００％コンフルエント）のＳＷ９８２細胞のフラスコを使用し、成長培地中の２５，０００細胞／ウェルで、１つの１２ウェルプレートのすべてと、もう１つの１２ウェルプレートのうちの８ウェルに播種した。用量曲線のために、さらに２つの１２ウェルプレートにこの細胞密度で播種した。すべてのプレートをＣＯ２のない３７°Ｃの培養器に入れた。増殖培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したライボビッツＬ－１５培地（ハイクローン社、イリノイ州シカゴ）であった。
【0159】
一晩付着させた後、ＡＭおよび活性化因子群のそれぞれから１つのウェルをコンフルエンシーについて採点し、細胞をＡＭ単独または活性化因子を含むＡＭで７２時間プライミングした。ＡＭは基底培地で５０％（ｖ／ｖ）の完全増殖培地であった（ライボビッツＬ－１５）。活性化因子は、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１β（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎインビトロジェン社カタログ番号ＲＩＬ１ＢＩ、カリフォルニア州カールスバッド）と１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅミリポア社カタログ番号ＧＦ０２３、マサチューセッツ州バーリントン）から成っていた。活性化因子を使用直前にＡＭに単独で添加した。７２時間後、ＡＭおよび活性化因子群のそれぞれから１つのウェルをコンフルエンシーについて採点し、全ての培地を新鮮な培地と交換した。細胞は、ＡＭ単独、活性化因子（ＩＬ－１ｂおよびＴＮＦ－α）を有するＡＭ、または、１００％または５０％のＰＰＣ ＣＭまたはＡＳＡ ＣＭの活性化因子を有するＡＭのいずれかを受けた。活性化因子を使用直前にＡＭとＣＭの両方に単独で加えた。用量曲線のために、細胞を１００％、７５％、５０％、２５％、または１０％のＡＳＡ ＣＭで処理した。さらに、各処理条件からの約４００μＬの残りの培地を細胞のないウェルの中に置いた。処理の約４８時間後に、ＡＭおよび活性化因子群のそれぞれから１つのウェルをコンフルエンシーについて採点した。各採取点におけるＡＭおよび活性化因子（ＩＮＦ）群の細胞のコンフルエンシーを表３に示す。
【表3】
【0160】
各処理群から残されて空のウェルに置かれ、細胞と同じ条件となった残りの培地から成る、無細胞対照のＴＮＦ－αレベルを図６に示す。これらのＥＬＩＳＡの結果は、全ての無細胞対照のＴＮＦ－αレベルがそれに対応する細胞よりも実質的に低いことを示しており、細胞自体が、各条件内で活性化因子が供給する量を超えて、ＴＮＦ－αを産生していることを示している。
【0161】
上清を約４８時間の培養後に回収し、ＴＮＦ－αタンパク質産生を分析した。上清をー８０°Ｃに置き、ＥＬＩＳＡで使用するまで保存した。ＴＮＦ－αレベルを市販のキット（ＤＴＡ００Ｄ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州ミネアポリス）を用いて測定し、製造業者の指示に従って実施した。すべての統計解析は、市販のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて実施された。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とダネットの多重比較検定を行った。すべてのグラフで、平均±標準偏差を示している。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。すべてのグラフにおいて、塗りつぶされた棒線は１００％の投与を表し、斜線の入った棒線は５０％の投与を表す。
【0162】
アッセイの再現性を評価するため、炎症の減少率を図７に示す。これらの実験をそれぞれの炎症単独の対照値に正規化すると、１００％ ＡＳＡ ＣＭとＰＰＣ ＣＭによる処理に対する反応と５０％のＡＳＡ ＣＭとＰＰＣ ＣＭに対する反応は類似していた。１００％および５０％のＡＳＡ ＣＭとＰＰＣ ＣＭ群の両方とも、投与後のＴＮＦ－αレベルの減少の保持を認めた。
【0163】
アッセイノ再現性ガコレラノ研究デ示サレタ。マタ、細胞ガ無細胞対照カラ測定サレタモノヨリモ高イレベルデＴＮＦ－αヲ過剰ニ産生スルコトガ確認サレ、ＴＮＦ－αノ読ミ出シハ、適用ガアル場合、活性化因子オヨビソノ後ノ処置ニ対スル細胞応答ニ起因スルコトガ示サレタ。
【0164】
［実施例４］
本研究では、２つの臨床ロット（ＴＡ１およびＴＡ２）から生成されたＡＳＡ ＣＭを用いて、比較としてＰＰＣ ＣＭと、また１つの独立したオペレーターとともに、力価アッセイの試行を行った。さらに、ＮｕＣｅｌの市販ロットからのＡＳＡ ＣＭと７５％ＰＰＣ ＣＭの追加投与を用いたＰＰＣ ＣＭによる処理を検討した。臨床ロットとＰＰＣバイアルを研究所で受け取り、市販ベンダーの推奨に従って保管した。
本研究では、２つの臨床ロット（ＴＡ１およびＴＡ２）から生成されたＡＳＡ ＣＭを用いて、比較としてＰＰＣ ＣＭと、また１つの独立したオペレーターとともに、力価アッセイの試行を行った。さらに、ＮｕＣｅｌの市販ロットからのＡＳＡ ＣＭと７５％ＰＰＣ ＣＭの追加投与を用いたＰＰＣ ＣＭによる処理を検討した。臨床ロットとＰＰＣバイアルを研究所で受け取り、市販ベンダーの推奨に従って保管した。
【0165】
ＳＷ９８２細胞を継代２９（融解から＋１、コンフルエント９０％未満）で用いた。１２ウェルプレートに２５，０００細胞／ウェルで播種し、ＣＯ２なしで３７°Ｃで培養器に置いた。増殖培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したライボビッツＬ‐１５培地（ハイクローン社、イリノイ州シカゴ）であった。
【0166】
一晩約２４±４時間の付着後、ＡＭおよび活性化因子群のそれぞれから１つのウェルをコンフルエンシーについて採点し、細胞をＡＭ単独または活性化因子を含むＡＭで７２時間プライミングした。アッセイ培地は基底培地で５０％（ｖ／ｖ）の完全増殖培地であった（ライボビッツＬ‐１５）。活性化因子は、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１β（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎインビトロジェン社カタログ番号ＲＩＬ１ＢＩ、カリフォルニア州カールスバッド）と１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅミリポア社カタログ番号ＧＦ０２３、マサチューセッツ州バーリントン）から成っていた。炎症性サイトカインをＡＭに単独で使用直前に添加した。７２時間後、ＡＭおよび活性化因子群のそれぞれから１つのウェルをコンフルエンシーについて採点し、全ての培地を新鮮な培地と交換した。
【0167】
細胞は、ＡＭ単独、活性化因子（ＩＬ－１ｂおよびＴＮＦ－α）を有するＡＭ、または、１００％または５０％のＰＰＣ ＣＭまたはＡＳＡ ＣＭの活性化因子を有するＡＭのいずれかを受けた。炎症性サイトカインをＡＭとＣＭの両方に単独で使用直前に添加した。用量曲線に対して、細胞を１００％、７５％、または５０％のＡＳＡ ＣＭまたはＰＰＣ ＣＭで処理した。さらに、各処理条件からの約８００μＬの残りの培地を、細胞のないウェルに入れた。処理の約４８時間後、ＡＭおよび活性化因子群のそれぞれから１つのウェルをコンフルエンシーについて採点した。各採取点におけるＡＭおよび活性化因子（ＩＮＦ）群の細胞のコンフルエンシーを表４に示す。
【表4】
【0168】
上清を約４８時間の培養後に回収し、ＴＮＦ－αタンパク質産生を分析した。上清を－８０°Ｃに置き、ＥＬＩＳＡで使用するまで保存した。ＴＮＦ－αレベルを市販のキット（ＤＴＡ００Ｄ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州ミネアポリス）を用いて測定し、製造業者の指示に従って実施した。さらに、クオンチキンイムノアッセイ対照群２４８（ＱＣ２４８，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社，ミネソタ州ミネアポリス）を用いた。これらの対照を、製造業者の指示に従って再懸濁し、実行した。ＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡがＡＳＡ ＣＭ中のＴＮＦ－αタンパク質をリカバリできることを確認するために、リカバリおよび選択性対照を含めた。キットに含まれる標準ＴＮＦ－αを、単独で（リカバリ対照）、およびプライミングに用いる５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－１βとともに（選択性対照）、５００ｐｇ／ｍＬで５０％ＣＭに添加した。
【0169】
すべての統計解析は、市販のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて行った。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とダネットの多重比較検定を実行した。すべてのグラフにおいて、平均±標準偏差を示している。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。すべてのグラフにおいて、塗りつぶされた棒線は１００％の投与を表し、斜線の入った棒線は５０％の投与を表す。
【0170】
ＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡを実行し、２つの臨床ロット（１９０４および１９０５）および対照としてのＰＰＣ ＣＭによる処理後の炎症に対する応答を決定した。これらの結果を図８に示す。ＴＡＩ，ＴＡ２，ＰＰＣ ＣＭからのＡＳＡ ＣＭの追加はすべて、治療後のＴＮＦ－αレベルの有意な低下をもたらす（５０％ ＰＰＣ ＣＭ以外はすべてｐ＜０．０００１；５０％ ＰＰＣ ＣＭはｐ＜０．００１）。これらの結果は、ＣＭの投与量の減少がＴＮＦ－αのより効果の弱いダウンレギュレーションをもたらすことから予想された通りである。さらに、ＰＰＣ ＣＭは試験品と同様の結果を示した。
【0171】
次に、ＡＳＡ ＣＭとＰＰＣ ＣＭの市販ロットを用いて、５０％、７５％、および１００％ ＣＭの投与を行った。ＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡの結果を図９に示す。１００％、７５％、および５０％用量のＮｕＣｅｌ ＣＭおよびＰＰＣ ＣＭによる処理後に、ＴＮＦ－αレベルの有意な低下が観察される（５０％ＰＰＣ ＣＭ以外はすべてｐ＜０．０１；５０％ＰＰＣ ＣＭはｐ＜０．００１）。さらに、明らかな用量反応が観察され、より高用量のＣＭでより大きなレベルの低下が観察される。
【0172】
空のウェルに置いて細胞と同じ条件にさらされた各処理群からの培地で構成された、無細胞対照におけるＴＮＦ－αのレベルを調べた。その結果を図１０および図１１に示す。ＴＡ１およびＴＡ２のＡＳＡ ＣＭと図１０のＰＰＣ ＣＭの値は図８と同じであり、図１１のＡＳＡ ＣＭとＰＰＣ ＣＭの値は図９で示されたものと同じである。図１０と図１１の両方で、無細胞対照のＴＮＦ－αのレベルはすべて、対応する細胞のものよりも低い。この結果は、細胞自体が各条件において炎症刺激がもたらすものを超えてＴＮＦ－αを産生していることを示している。
【0173】
力価アッセイの再現性を評価するために、図１２は図８および図９でのＰＰＭ ＣＭの結果を同じグラフに描いたものであり、図１３は図８および図９でのＰＰＭ ＣＭの結果に対するＴＮＦ－αの減少率を示している。図１２では、１００％および５０％ＰＰＣ ＣＭ処理後のＴＮＦ－αレベルの減少は有意であり、実験間で類似している。各群の平均変動係数（ＣＶ）を比較すると、活性化因子群は１４％ＣＶ、１００％ＰＰＣ ＣＭ群は２３％ＣＶ、５０％ＰＰＣ ＣＭ群は２２％ＣＶであった。図１３では、ＰＰＣ ＣＭの結果を炎症に正規化すると、１００％ＰＰＣ ＣＭ群と５０％ＰＰＣ ＣＭ群の両方で類似した値が得られ、ここでもアッセイの再現性が強調されている。１００％ＰＰＣ ＣＭのＣＶ値は６％であるが、５０％ＰＰＣ ＣＭの値は３４％である。
【0174】
研究により、ＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡがＣＭ中のＴＮＦ－αタンパク質のリカバリを可能にすること、積極的治療であること、を確認した。ＴＮＦ－αレベルの結果を図１４に示す。図１４では、キットに含まれている５００ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ－α標準を、製造業者の指示に従って希釈液中で実行した。これにより、５０１ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ－α値が返された。１００％ＮｕＣｅｌ ＣＭをＴＮＦ－αを添加せずに単独で実行して、８ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ－αが測定された。５０％ＮｕＣｅｌ ＣＭと５００ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ－αを用いたリカバリ対照は５０６ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ－α値を返したが、５０％ＮｕＣｅｌ ＣＭ、５００ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ－α、および５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－１βを含む選択性対照は５５８ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ－αの値を返した。これらの結果は、ＣＭ中のＴＮＦ－αを、ＩＬ－１βの有無の両方で、正確に定量するＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡの能力を確かにするものである。特に、ＡＳＡ ＣＭとＮｕＣｅｌ ＣＭは互換性があるものとして、本研究で使用されている。
【0175】
異なる実験間の相対的な力価を比較するために用いられる、力価に関する単一の報告可能な指標を評価するために、様々な用量でのＴＮＦ－α読み出しの減少率を同じ用量でＰＰＣ ＣＭに正規化し、各用量での相対的な力価を報告し、その後、単一の読み出しに対して平均化した。ＰＰＣ ＣＭと比較して１００％、７５％、および５０％ＡＳＡ ＣＭ用量の相対的な力価を表５に示す。平均値、標準偏差、および平均パーセント変動係数（ＣＶ）を示す。この指標に基づき、ＮｕＣｅｌ ＡＳＡロットは約１０４±７％の力価と示せるであろう。
【表5】
【0176】
この実施例ではアッセイの再現性と、２つのＡＳＡ臨床ロットとＰＰＣ ＣＭがＴＮＦ－αレベルの有意な減少を維持したことを確認した。７５％を含む３用量でのＰＰＣ ＣＭと比較した相対的力価の使用も評価した。加えて、ＴＮＦ－αアッセイのためのイムノアッセイ対照セットの有用性を確認し、リカバリおよび選択性対照もまた、ＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡがＣＭ中のＴＮＦ－αタンパク質を検出できることを確認した。最後に、力価アッセイ間の比較に使用できる相対的力価を計算した。
【0177】
［実施例５］
３つの異なるモデルを用いて、炎症のダウンレギュレーションにおけるＡＳＡの力価を検討した。本研究では、ＨＦＬＳを用いて炎症刺激下に細胞を置くことにより、ＯＡのインビトロのモデルを作成した。プライミング期間の後、これらの細胞をヒトＡＳＡからの条件培地に曝露した。そして、ＨＦＬＳの上清中のタンパク質レベルを測定することにより応答を測定した。ＡＳＡによる処理は、炎症性サイトカインのレベルを低下させ、抗炎症性サイトカインのレベルを増加させた。
３つの異なるモデルを用いて、炎症のダウンレギュレーションにおけるＡＳＡの力価を検討した。本研究では、ＨＦＬＳを用いて炎症刺激下に細胞を置くことにより、ＯＡのインビトロのモデルを作成した。プライミング期間の後、これらの細胞をヒトＡＳＡからの条件培地に曝露した。そして、ＨＦＬＳの上清中のタンパク質レベルを測定することにより応答を測定した。ＡＳＡによる処理は、炎症性サイトカインのレベルを低下させ、抗炎症性サイトカインのレベルを増加させた。
【0178】
ヒト組換えＩＬ‐１β（インビトロジェン社）とＴＮＦ－α（コーニング社）を、ＯＡに対して生理的に関連するレベルで使用した（それぞれ、１ｎｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬ）。ＨＦＬＳ（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社）を、滑膜細胞増殖培地（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社）を用いて製造業者のプロトコルに従って増殖させた。全ての細胞をダブリング４～６で用いた。ＣＭはＡＳＡを解凍し、ＤＭＳＯを除去するために２５０×ｇで５分間遠心分離し、ＡＳＡの元の体積に等しいアッセイ培地（７５％滑膜細胞基礎培地（サプリメントなし）および２５％滑膜細胞増殖培地；低血清）中でペレットを再懸濁させることにより、調製した。再懸濁したＡＳＡをオービタルロッカー上で４°Ｃで４日間調整し、サイトカインの大部分を放出し、新鮮なアッセイ培地中で２５％ｖ／ｖに希釈し、使用前に滅菌ろ過し、放出されたタンパク質のみを残し、膜または細胞成分を残さなかった。
【0179】
炎症性滑膜細胞モデルに対するＡＳＡの効果を研究するために、正常ＨＦＬＳを１２ウェル組織培養プレート中に３７，０００細胞／ウェルの密度で播種し、標準培養条件下で一晩付着させた。細胞を、アッセイ培地（低レベルのサプリメント）または炎症性サイトカイン（１ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－１βおよび１０ｎｇ／ｍＬヒトＴＮＦ－α）を含むアッセイ培地で、７２時間プライミングした。最初のプライミング後、すべての培地を交換し、新鮮な培地および新鮮な炎症性サイトカインに置き換えた。ウェルのうちの半分はＡＳＡ ＣＭ＋新鮮な炎症性サイトカインを受け、残りの半分はアッセイ培地＋新鮮な炎症性サイトカインを受けた。処理の４８時間後、上清と細胞回収して、タンパク質レベルと遺伝子発現をそれぞれ評価した。
【0180】
上清を－８０°Ｃで凍結した後、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いてＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１Ｒａ、および他の関連するタンパク質レベルを分析した。それに続く代表的な条件培地の評価では、ＩＬ－１βとＴＮＦ－αおよび約２ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１ｒａが低レベル～検出不能なレベルであることを明らかにした。ＡＳＡによる処理は、図１５に示すように、炎症性サイトカイン、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βの有意な減少をもたらし、ＴＮＦ－αに見られる最大の効果を示した。また、抗炎症性ＩＬ－１ｒａ濃度に有意な増加が見られ、ＴＩＭＰ－３レベルにも、小さいが有意な増加が見られた（データは示されていない）。
【0181】
全体として、炎症モデルを用いて、正常なヒト線維芽細胞様滑膜細胞をＡＳＡで処理すると、炎症性サイトカインレベルのダウンレギュレーションと抗炎症性サイトカインおよびプロテアーゼ阻害剤のアップレギュレーションが生じることが決定づけられた。
【0182】
ウサギ滑膜細胞（ＨＩＧ－８２）は、初代ウサギ滑膜細胞培養の活性化可能な表現型を保持する自然不死化ウサギ滑膜細胞である。ＨＩＧ－８２細胞株をＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）から得て、１０％ウシ胎児血清（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）と抗生物質ー抗真菌溶液（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）を添加したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）で培養した。アッセイのために、ＨＩＧ‐８２細胞を１２ウェルプレート中に３７，０００細胞／ウェルの密度で播種し、一晩付着させた。実施例５でＨＦＬＳモデルのために上述したのと同じプロトコルに従いつつ、細胞を１ｎｇ／ｍＬウサギＩＬ－１βおよび１０ｎｇ／ｍＬウサギＴＮＦ－αでプライミングした。ＡＳＡ ＣＭを、同実施例５で上述したように、ＨＦＬＳモデルのために調製した。合計１０ロットのＡＳＡをこのモデルで評価した。加えて、羊膜粒子と細胞成分の別々の寄与を評価するのに、異なるドナーからのものを研究所で調製して、その２つの成分を臨床生産物のために混合する前に凍結した、３つのロット材料を用いた。
【0183】
このモデルでは複数のサイトカインを分析したが、ＨＦＬＳモデルに関しては、ＴＮＦ－αレベルに最大の影響が見られ（図１６参照）、ＡＳＡ－ＣＭ（条件培地）の５０％と１００％用量の両方で見られたタンパク質発現の有意な減少があり、平均７９％の減少であった。個々の成分を評価すると、ＴＮＦ－αレベルへの有意な影響が液体成分だけに見られた。
【0184】
遺伝子発現ではいくつかの有意な変化が見られ、最も顕著なものとしては、ＩＬ－１β発現の減少とＭＭＰ－１発現の増加、およびＴＩＭＰ‐１のタンパク質発現の増加であったが、ＩＬ－１β、ＭＭＰ－１、およびＩＬ－１ｒａのタンパク質レベルには、このモデルでは有意な影響は見られなかった。
【0185】
ＳＷ９８２細胞株をＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）から得て、１０％ウシ胎児血清（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）を添加したライボビッツＬ－１５培地（ハイクローン社、シカゴ）で培養した。Ｌ－１５はＣＯ２が存在しない場合で使用するように処方されており、従って、気体の交換を減らすため、培養プレートをパラフィルムで包み、５％ＣＯ２の培養器で培養した。アッセイのために、ＳＷ９８２細胞を１２ウェルプレート中に３７，０００細胞／ウェルの密度で播種し、ヒトＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αをプライミングのために使用したことを除いて、上記実施例５で開示されたＨＩＧ－８２モデルの他のすべての方法に従った。
【0186】
ＨＦＬＳおよびＨＩＧ－８２モデルと同様に、図１７に示すとおり、ＴＮＦ－αレベルに最大の影響が見られた。ＨＩＧ－８２細胞株と比較して、有意な減少が膜と液体成分の両方で別々に見られた。このモデルでは、ＩＬ－１β遺伝子発現の有意な減少と、逆にＩＬ－１βタンパク質レベルの増加が見られ、さらにＩＬ－１ｒａタンパク質レベルの有意な増加も見られた。
【0187】
図１７の非処理炎症群におけるＴＮＦ－αの発現量を比較することでわかるように、このモデルおよび他のモデルで実施された別々の実験では、一定でない炎症反応が認められた。この変動の影響を最小限に抑えるために、ＴＮＦ－αレベルの減少率を、同じ実験で実施された炎症対照と比較して計算することで、データを正規化することができる（図１８参照）。この分析では、ＡＳＡの１０ロットすべてが５０％ＣＭ用量で試験されたときに有意な減少を示し、この１０ロットのうち９ロットは１００％用量レベルで有意な減少を示した（ロット１９１５７０９０３で統計を行うにはサンプルが不十分）。多くのサンプルで、１００％用量で平均７７％（範囲６７～８７％）の減少、および５０％用量で平均５３％（範囲２９～８７％）の減少をともなう用量反応が見られた。
【0188】
上記の結果は、関連するヒト膝滑膜細胞モデルにおいて、ＡＳＡが炎症関連因子のバランスに影響を与え、抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１ｒａおよびＴＩＭＰ－３を増加させ、炎症性サイトカインであるＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βを減少させることを示している。同様の応答は、特にＴＮＦ－αレベルの低下において、２つの形質転換細胞モデル、すなわち、自然形質転換ウサギ滑膜細胞株であるＨＩＧ－８２およびヒト滑膜肉腫細胞株であるＳＷ９８２で見られたことから、両細胞株は制御可能な炎症表現型を保持し、ＡＳＡの力価をモニターするためのインビトロな細胞に基づいた方法として使用できることが確認された。
【0189】
［実施例６］
本発明者らは、２つのＭＳＣ炎症特性評価試験、１つはｂｍＭＳＣとｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣの両方を用いた試験、もうひとつはｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣのみを用いた試験、を実施した。
本発明者らは、２つのＭＳＣ炎症特性評価試験、１つはｂｍＭＳＣとｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣの両方を用いた試験、もうひとつはｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣのみを用いた試験、を実施した。
【0190】
初代骨髄由来ＭＳＣ（ｂｍＭＳＣ）とｈＴＥＲＴ不死化ａｄＭＳＣ（ＡＳＣ５２ｔｅｌｏ；ｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣ）をＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）から得た。プライマリ細胞を、ｂｍＭＳＣ用の間葉系幹細胞増殖キットを補充したＡＴＣＣ ＭＳＣ基礎培地で規定どおりに培養し、製造業者の指示どおりに継代した。ｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）および抗生物質ー抗真菌溶液（Ｐ／Ｓ／Ａ）（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）で規定どおりに培養し、製造業者の指示どおりに継代した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ／Ａは、すべての実験において、アッセイ培地（ＡＭ）の対照として、５％ＦＢＳが補充されたプライマリ細胞および不死化細胞の両方を用いた播種実験のための増殖培地（ＧＭ）として機能した。
【0191】
条件培地（ＣＭ）を調整するために、羊水懸濁同種移植片（ＡＳＡ、オルガノジェネシス社、アラバマ州バーミンガム）を解凍し、６００ｘｇで５分間遠心分離してＤＭＳＯ成分を除去した。上清を除去し、廃棄した。そして、ＡＳＡのペレット化成分を１ｍＬのＡＳＡ（元の体積）当たり１ｍＬのＡＭの濃度でＡＭの中で再懸濁し、穏やかに回転させながら４°Ｃで～３日間培養した。そして、懸濁液を６００ｘｇで５分間遠心分離し、次いで、上清（ＣＭ）を回収し、０．２２ｐｍポリエーテルサルフォン（ＰＥＳ）フィルター（Ｍｉｌｌｅｘ（商標）－ＧＰ滅菌シリンジフィルター、ＳＬＧＰ０３３ＲＳ，ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａミリポアシグマ社，マサチューセッツ州バーリントン）を用いて滅菌濾過して、使用前に未希釈で（１００％）またはＡＭ中で希釈して使用した。
【0192】
２ロットのＡＳＡに対するＭＳＣ応答を、１つのｂｍＭＳＣ（７００１７９９２）およびｈＴＥＲＴ不死化ａｄＭＳＣ（ＡＳＣ５２ｔｅｌｏ、ｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣ）のプライマリーロットを用いて評価した。ＭＳＣを２０，０００細胞／ウェルで１２ウェルプレートに播種し、２０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ－α（ＧＦ０２３、ミリポア社、マサチューセッツ州バーリントン）および１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１β（ＲＩＬ１Ｂ１、インビトロジェン社、カリフォルニア州カールスバッド）でプライミングする前に４～８時間付着させ、炎症表現型を誘導した。約７２時間のプライミング後、細胞を１００％、７５％、または５０％ＡＳＡ ＣＭ（上述のように調製した）で新鮮な炎症性サイトカインと処理した。アッセイ培地対照（炎症刺激を受けないＡＭ）および炎症単独（プライミング後に新鮮なサイトカインを投与されＡＳＡ処理を受けなかったＩＮＦ）はプレートワイズな対照として機能する。処理日に、すべての条件からの残りの処理を空のプレートに加え、無細胞対照として機能させたところ、観察された反応が実際に細胞媒介性のものであることを確認できた。ＴＮＦ－αタンパク質レベルの分析のため、約４８時間の処理後に上清を採取し、細胞をＲＮＡｚｏｌ（４００ｐＬ）の中に採取した。
【0193】
上清を－８０°Ｃに置き、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で使用するまで保存した。ＴＮＦ－αレベルを市販キット（ＤＴＡ００Ｄ、Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）を用いて測定した。ＥＬＩＳＡを製造業者の指示どおりに実施した。
【0194】
ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αによるプライミング後にｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣおよびｂｍＭＳＣをＡＳＡ ＣＭで処理すると、図１９に示すように、両被験物質（２つのＡＳＡロット、それぞれＴＡ１とＴＡ２とする）の１００％、７５％、および５０％用量で有意な減少が示された。すべてのＡＭサンプルは最低標準（１５．６ｐｇ／ｍＬ）以下であり、そのように報告されている。ｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣの３プレートすべての平均ＩＮＦは３０６７．４ｐｇ／ｍＬでＣＶは６．０％であったが、初代ｂｍＭＳＣの平均ＩＮＦは４９４８．２ｐｇ／ｍＬでＣＶは１６．８％であった。
【0195】
また、無細胞対照におけるＴＮＦ－αレベルを細胞上清サンプルと比較して、細胞自体が各処理条件に対して供給されるものを超えてＴＮＦ－αを産生していることを確認した。このデータを図２０に示す。塗りつぶされた棒線は比較のために図１９に示したものと同じであり、無細胞対照は斜線の入った棒線として示されている。注目すべきこととして、すべての用量プレートを処理するために同じストックが使用されるが、ＡＭとＩＮＦの無細胞対照は１００％のグループにのみ示されている。
【0196】
そして、ＩＮＦからの減少率を、各用量で試験された各被験物質について記載されているように計算した（図２１参照）。ＴＡ１およびＴＡ２の被験物質はいずれも、すべての用量でＴＮＦ－αレベルの用量依存的減少がもたらされた。
【0197】
ｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣおよび初代ｂｍＭＳＣの両方とも、１００％、７５％および５０％のＣＭ用量において、ＴＮＦ－αレベルを有意に減少させることができ、用量依存的に、各条件でもたらされたものを超えるＴＮＦ－αレベルを産生した。さらに、両細胞型とも、すべての用量においてＴＮＦ－αレベルの用量依存的な減少があった。
【0198】
２ロットのＡＳＡに対するＭＳＣ応答をｈＴＥＲＴ不死化ａｄＭＳＣ（ＡＳＣ５２ｔｅｌｏ、ｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣ）を用いて評価した。ＭＳＣを２０，０００細胞／ウェルで１２ウェルプレートに播種し、炎症表現型を誘導するために２０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ－α（ＧＦ０２３、ミリポア社、マサチューセッツ州バーリントン）および１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１β（ＲＩＬＩＢＩ、インビトロジェン社、カリフォルニア州カールスバッド）でプライミングする前に４～８時間付着させた。約７２時間のプライミング後、細胞を新鮮な炎症性サイトカインとともに１００％、７５％または５０％ＡＳＡ ＣＭ（上述のように調製）で処理した。アッセイ培地対照（炎症刺激を受けたことのないＡＭ）および炎症単独（プライミング後に新鮮なサイトカインを投与されたがＡＳＡ処理を受けなかったＩＮＦ）はプレートワイズな対照として機能する。処理日に、すべての条件からの残りの処理を空のプレートに加え、無細胞対照として機能させ、観察された反応が実際に細胞媒介であることを確認できた。ＴＮＦ－αタンパク質レベルの分析のために処理の約４８時間後に上清を採取し、細胞をＲＮＡｚｏｌ（４００μＬ）に回収した。
【0199】
上清を－８０°Ｃに置き、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で使用するまで保存した。ＴＮＦ－αレベルは市販キット（ＤＴＡ００Ｄ、Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）を用いて測定した。ＥＬＩＳＡは製造業者の指示どおりに実施した。
【0200】
ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αによるプライミング後にｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣをＡＳＡ条件培地（ＣＭ）で処理すると、図２２に示すように、両被験物質（ＡＳＡロット、それぞれＴＡ１およびＴＡ２とする）の１００％、７５％、および５０％用量で有意なダウンレギュレーションが生じた。すべてのアッセイ培地（ＡＭ）サンプルは最低標準（１５．６ｐｇ／ｍＬ）以下であり、そのように報告されている。３プレートすべての平均ＩＮＦは３５６０．９ｐｇ／ｍＬであり、ＣＶは８．５％であった。
【0201】
また、無細胞対照におけるＴＮＦ－αレベルを処理細胞サンプルと比較して、細胞自体が各処理条件に対して供給される量を超えてＴＮＦ－αを産生していることを確認した。このデータを図２３に示す。塗りつぶされた棒線は比較のために図２２に示すものと同じであり、無細胞対照は斜線の入った棒線として示されている。注目すべきこととして、すべての用量プレートを処理するために同じストックが使用されるが、ＡＭとＩＮＦの無細胞対照は１００％のグループにのみ示されている。
【0202】
次に、各用量で試験された各被験物質について記載されているように、ＩＮＦからの減少率を計算したものを、図２４に示す。１９０６および１９０８の被験物質はいずれも、すべての用量でＴＮＦ－αレベルの用量依存的減少がもたらされた。
【0203】
この結果、ｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣが、試験された１００％、７５％、および５０％のＣＭ用量において、ＴＮＦ－αレベルを有意に減少させることができ、各条件でもたらされたものを超えるＴＮＦ－αレベルを産生したことが示された。さらに、ｈＴＥＲＴ－ａｄＭＳＣは、すべての用量でＴＮＦ－αレベルの用量依存的減少があった。
【0204】
本発明およびその利点を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更、置換および変更を本明細書で行うことができると理解されるべきである。本明細書に記載される方法や、アッセイ、およびその様々な実施形態は例示である。本明細書に記載される方法およびアッセイの、他の様々な実施形態も可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【図21A】
【図21B】
【図22】
【図23】
【図24】
【国際調査報告】