知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ナショナル レジリエンス インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-18
(54)【発明の名称】無細胞ポリペプチド合成のためのシステムおよび方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/00 20060101AFI20240311BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240311BHJP
C12N 1/13 20060101ALN20240311BHJP
C12N 1/15 20060101ALN20240311BHJP
C12N 1/19 20060101ALN20240311BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240311BHJP
【ＦＩ】
C12P21/00 C ZNA
C12N15/09 Z
C12N1/13
C12N1/15
C12N1/19
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023559035
(86)(22)【出願日】2022-03-24
(85)【翻訳文提出日】2023-11-20
(86)【国際出願番号】 US2022021651
(87)【国際公開番号】W WO2022204351
(87)【国際公開日】2022-09-29
(31)【優先権主張番号】63/165,335
(32)【優先日】2021-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522378764
【氏名又は名称】ナショナル レジリエンス インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ヨセップ， ダニエル ジェシカ
(72)【発明者】
【氏名】カイトリンガー， ウエストン ケビン
(72)【発明者】
【氏名】シャー－モラレス， サジータ カロニ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA02
4B064CA19
4B064CA21
4B064CC01
4B064CC24
4B064CC30
4B064CD02
4B064CD09
4B064CD12
4B064CD15
4B064CE03
4B064CE06
4B065AA26X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BB11
4B065BB12
4B065BB15
4B065BD01
4B065BD14
4B065BD18
4B065CA24
(57)【要約】
無細胞ポリペプチド合成のための方法が、本明細書で開示される。上記方法は、細胞を溶解して、細胞溶解物を生成する工程、上記細胞溶解物をフィルターに通して、細胞抽出物を生成する工程、上記細胞抽出物とポリペプチドをコードする核酸とを接触させて、反応混合物を生成する工程、および上記反応混合物をインキュベートして、上記ポリペプチドを生成する工程を包含する。いくつかの実施形態において、無細胞ポリペプチド合成のための方法が、本明細書で開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
無細胞ポリペプチド合成のための方法であって、前記方法は、（ａ）細胞を溶解して、細胞溶解物を生成する工程；
（ｂ）前記細胞溶解物をフィルターに通して、細胞抽出物を生成する工程；
（ｃ）前記細胞抽出物とポリペプチドをコードする核酸とを接触させて、反応混合物を生成する工程；および
（ｄ）前記反応混合物をインキュベートして、前記ポリペプチドを生成する工程、
を包含する方法。
【請求項2】
前記細胞溶解物は、遠心分離を介する清澄化に供されない、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記細胞抽出物は、遠心分離を介する清澄化に供されない、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記反応混合物は、遠心分離を介する清澄化に供されない、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記フィルターに前記通す工程の前に、前記細胞溶解物を凝集させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記フィルターに前記通す工程の前に、前記細胞溶解物を沈殿させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記フィルターは、表面フィルターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記フィルターは、デプスフィルターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記通す工程は、クロスフロー濾過、ベルト濾過、マイクロフィルトレーション、限外濾過、ミクロポーラスろ過、真空ドラム濾過、篩い分け、膜濾過、砂濾過、およびスクリーン濾過を含む群から選択される１またはこれより多くのものを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記フィルターは、約１００ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記フィルターは、約１５ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記フィルターは、約５ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記フィルターは、約０．４ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記フィルターは、約０．２ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記フィルターは、約０．１ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記フィルターは、１００ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記フィルターは、１５ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記フィルターは、５ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記フィルターは、０．４ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記フィルターは、０．２ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記フィルターは、０．１ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記フィルターは、約０．４ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記フィルターは、約０．２ミクロン～約０．４ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
前記フィルターは、約０．２ミクロンのサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
前記フィルターは、直列にまたは並列に配置される少なくとも２つのフィルターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項26】
前記フィルターは、孔サイズを徐々に小さくさせた直列に配置される少なくとも２つのフィルターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項27】
前記フィルターは、（ａ）約０．５ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第１のフィルター；
（ｂ）約０．２ミクロン～約０．５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第２のフィルター；および
（ｃ）約０．２ミクロンのサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第３のフィルター、
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
前記デプスフィルターは、媒体を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項29】
前記媒体は、フローチャネルを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記媒体は、マトリクスを提供するように結合または固定された２つのファイバーを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
前記２つのファイバーのうちの一方は、セルロースファイバーである、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記媒体は、正に荷電されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項33】
前記媒体は、中性に荷電されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項34】
前記媒体は、負に荷電されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項35】
前記デプスフィルターは、濾過助剤を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項36】
前記デプスフィルターは、前記孔のサイズより大きいかまたは小さいかのいずれかであるサイズを有する粒子を保持する孔を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項37】
前記デプスフィルターは、１回使い切りフィルターを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項38】
前記デプスフィルターは、レンチキュラーフィルター、ディープベッドフィルター、パッドフィルター、パネルフィルター、カートリッジタイプデプスフィルター、またはこれらの組み合わせを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項39】
前記フィルターは、（ａ）約０．５ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第１のデプスフィルター；
（ｂ）約０．２ミクロン～約０．５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第２のデプスフィルター；および
（ｃ）滅菌グレードの膜および約０．２ミクロンのサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第３のフィルター、
を含み、ここで前記細胞溶解物は、前記第１のデプスフィルター、次いで、前記第２のデプスフィルター、最後に前記第３のフィルターを経る濾過に供される、請求項２８に記載の方法。
【請求項40】
細胞培養物から細胞を得る工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項41】
前記得る工程は、遠心分離、タンジェンシャルフロー濾過、膜分離、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される１またはこれより多くのものに前記細胞培養物を供する工程を包含する、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記膜分離は、中空ファイバー膜分離を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記溶解する工程は、超音波処理、均質化、窒素キャビテーション、凍結融解、シリンジング、化学的溶解、酵素による溶解、浸透圧による溶解、フレンチプレスによる溶解、ビーズによる破砕、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される１またはこれより多くのものを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項44】
前記細胞抽出物を凍結する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項45】
前記細胞抽出物を凍結乾燥する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項46】
前記細胞は、トランスジェニック細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、またはこれらの組み合わせを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項47】
前記核酸は、ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項48】
前記ＤＮＡは、前記ポリペプチドのオープンリーディングフレームを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記ＤＮＡは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含み、ここで前記オープンリーディングフレームは、前記プロモーターに作動可能に連結される、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記ＤＮＡは、前記オープンリーディングフレームの５’末端の上流に位置するリボソーム結合部位を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
前記ＤＮＡは、前記オープンリーディングフレームの３’末端の下流に位置するターミネーターを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記プロモーターは、Ｔ７プロモーターを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項53】
前記Ｔ７プロモーターは、配列番号１と少なくとも８０％ 配列同一性を有する配列を含む、請求５２に記載の方法。
【請求項54】
前記Ｔ７プロモーターは、配列番号１と少なくとも８５％ 配列同一性を有する配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記Ｔ７プロモーターは、配列番号１と少なくとも９０％ 配列同一性を有する配列を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記Ｔ７プロモーターは、配列番号１と少なくとも９５％ 配列同一性を有する配列を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記Ｔ７プロモーターは、配列番号１を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記ターミネーターは、Ｔ７ターミネーターを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項59】
前記Ｔ７ターミネーターは、配列番号２と少なくとも８０％ 配列同一性を有する配列を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
前記Ｔ７ターミネーターは、配列番号２と少なくとも８５％ 配列同一性を有する配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記Ｔ７ターミネーターは、配列番号２と少なくとも９０％ 配列同一性を有する配列を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記Ｔ７ターミネーターは、配列番号２と少なくとも９５％ 配列同一性を有する配列を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
前記Ｔ７ターミネーターは、配列番号２を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
前記反応混合物は、二価カチオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項65】
前記通す工程は、約１℃～約４０℃の間の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項66】
前記反応混合物は、アミノ酸、ヌクレオチド、塩、補因子、エネルギー源、翻訳テンプレート、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項67】
前記接触させる工程は、前記細胞抽出物に、前記ポリペプチドをコードする核酸、および前記アミノ酸、前記ヌクレオチド、前記塩、前記補因子、前記エネルギー源、前記翻訳テンプレート、またはこれらの組み合わせから選択される１またはこれより多くのものを添加する工程を包含する、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
前記エネルギー源は、リン酸基を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項69】
前記エネルギー源は、非リン酸化エネルギー基を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項70】
前記エネルギー源は、グルタメートを含み、約１０ｍＭ～約４００ｍＭの間の濃度で存在する、請求項６６に記載の方法。
【請求項71】
前記エネルギー源は、ピルベートを含み、約１０ｍＭ～約４００ｍＭの間の濃度で存在する、請求項６６に記載の方法。
【請求項72】
前記エネルギー源は、約１０～約４００ｍＭの間の濃度のグルコースを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項73】
前記塩は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの間の濃度のカリウムを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項74】
前記塩は、約１ｍＭ～約３０ｍＭの間の濃度のマグネシウムを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項75】
前記塩は、約１ｍＭ～約４００ｍＭの間の濃度のアンモニウムを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項76】
前記塩は、（ａ）約１０ｍＭ～約４００ｍＭの間の濃度のカリウム；および
（ｂ）約１ｍＭ～３０ｍＭの間の濃度のマグネシウム、
を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項77】
前記反応混合物から前記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項78】
前記単離する工程は、約１℃～３０℃の間の温度で行われる、請求項７７に記載の方法。
【請求項79】
前記ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）、またはこれらの組み合わせを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項80】
前記反応混合物は、トランスファーＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０２１年３月２４日出願の米国仮特許出願第６３／１６５，３３５号（これはその全体において本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
本出願は、２０２１年３月２４日出願の米国仮特許出願第６３／１６５，３３５号（これはその全体において本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
【0002】
援用の表示
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的におよび個々に参考として援用されることが示されるのと同程度に、本明細書に参考として援用される。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的におよび個々に参考として援用されることが示されるのと同程度に、本明細書に参考として援用される。
【発明の概要】
【0003】
簡潔な要旨
いくつかの実施形態において、無細胞ポリペプチド合成のための方法が、本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、上記方法は、細胞を溶解して、細胞溶解物を生成する工程、上記細胞溶解物をフィルターに通して、細胞抽出物を生成する工程、上記細胞抽出物とポリペプチドをコードする核酸とを接触させて、反応混合物を生成する工程、および上記反応混合物をインキュベートして、上記ポリペプチドを生成する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解物は、遠心分離を介する清澄化に供されない。いくつかの実施形態において、上記細胞抽出物は、遠心分離を介する清澄化に供されない。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、遠心分離を介する清澄化に供されない。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記フィルターに通す工程の前に、上記細胞溶解物を凝集させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記フィルターに通す工程の前に、上記細胞溶解物を沈殿させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、表面フィルターを含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、デプスフィルターを含む。いくつかの実施形態において、上記通す工程は、クロスフロー濾過、ベルト濾過、マイクロフィルトレーション、限外濾過、ミクロポーラスろ過、真空ドラム濾過、篩い分け、膜濾過、砂濾過、およびスクリーン濾過を含む群から選択される１またはこれより多くのものを含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１００ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１５ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、１００ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、１５ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、５ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、０．４ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、０．２ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、０．１ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約０．４ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロンのサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、直列にまたは並列に配置される少なくとも２つのフィルターを含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、孔サイズを徐々に小さくさせた直列に配置される少なくとも２つのフィルターを含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第１のフィルター、約０．２ミクロン～約０．５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第２のフィルター、および約０．２ミクロンのサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第３のフィルターを含む。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、媒体を含む。いくつかの実施形態において、上記媒体は、フローチャネルを形成する。いくつかの実施形態において、上記媒体は、マトリクスを提供するように結合または固定された２つのファイバーを含む。いくつかの実施形態において、上記２つのファイバーのうちの一方は、セルロースファイバーである。いくつかの実施形態において、上記媒体は、正に荷電されている。いくつかの実施形態において、上記媒体は、中性に荷電されている。いくつかの実施形態において、上記媒体は、負に荷電されている。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、濾過助剤を含む。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、上記孔のサイズより大きいかまたは小さいかのいずれかであるサイズを有する粒子を保持する孔を含む。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、１回使い切りフィルターを含む。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、レンチキュラーフィルター、ディープベッドフィルター、パッドフィルター、パネルフィルター、カートリッジタイプデプスフィルター、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第１のデプスフィルター、約０．２ミクロン～約０．５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第２のデプスフィルター、および滅菌グレードの膜および約０．２ミクロンのサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第３のフィルターを含む。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解物は、上記第１のデプスフィルター、次いで、上記第２のデプスフィルター、最後に上記第３のフィルターを経る濾過に供される。いくつかの実施形態において、上記方法は、細胞培養物から細胞を得る工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記得る工程は、遠心分離、タンジェンシャルフロー濾過、膜分離、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される１またはこれより多くのものに上記細胞培養物を供する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記膜分離は、中空ファイバー膜分離を含む。いくつかの実施形態において、上記溶解する工程は、超音波処理、均質化、窒素キャビテーション、凍結融解、フレンチプレスによる溶解、ビーズによる破砕、シリンジング、化学的溶解、酵素による溶解、浸透圧による溶解、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される１またはこれより多くのものを含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記細胞抽出物を凍結する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記細胞抽出物を凍結乾燥する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、トランスジェニック細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上記核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、上記ポリペプチドのオープンリーディングフレームを含む。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含み、ここで上記オープンリーディングフレームは、上記プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、上記オープンリーディングフレームの５’末端の上流に位置するリボソーム結合部位を含む。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、上記オープンリーディングフレームの３’末端の下流に位置するターミネーターを含む。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、Ｔ７プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７プロモーターは、５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ－３’（配列番号１）と少なくとも８０％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７プロモーターは、配列番号１と少なくとも８５％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７プロモーターは、配列番号１と少なくとも９０％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７プロモーターは、配列番号１と少なくとも９５％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７プロモーターは、配列番号１を含む。いくつかの実施形態において、上記ターミネーターは、Ｔ７ターミネーターを含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７ターミネーターは、５’－ＣＴＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＧＴＣＴＴＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧ－３’（配列番号２）と少なくとも８０％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７ターミネーターは、配列番号２と少なくとも８５％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７ターミネーターは、配列番号２と少なくとも９０％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７ターミネーターは、配列番号２と少なくとも９５％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７ターミネーターは、配列番号２を含む。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、二価カチオンを含む。いくつかの実施形態において、上記通す工程は、約１℃～約４０℃の間の温度で行われる。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、アミノ酸、ヌクレオチド、塩、補因子、エネルギー源、翻訳テンプレート、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上記接触させる工程は、上記細胞抽出物に、上記ポリペプチドをコードする核酸、および上記アミノ酸、上記ヌクレオチド、上記塩、上記補因子、上記エネルギー源、上記翻訳テンプレート、またはこれらの組み合わせから選択される１またはこれより多くのものを添加する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記エネルギー源は、リン酸基を含む。いくつかの実施形態において、上記エネルギー源は、非リン酸化エネルギー基を含む。いくつかの実施形態において、上記エネルギー源は、グルタメートを含み、約１０ｍＭ～約４００ｍＭの間の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、上記エネルギー源は、ピルベートを含み、約１０ｍＭ～約４００ｍＭの間の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、上記エネルギー源は、約１０～約４００ｍＭの間の濃度のグルコースを含む。いくつかの実施形態において、上記塩は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの間の濃度のカリウムを含む。いくつかの実施形態において、上記塩は、約１ｍＭ～３０ｍＭの間の濃度のマグネシウムを含む。いくつかの実施形態において、上記塩は、約１０ｍＭ～約４００ｍＭの間の濃度のカリウムおよび約１ｍＭ～３０ｍＭの間の濃度のマグネシウムを含む。いくつかの実施形態において、上記塩は、約１ｍＭ～約４００ｍＭの間の濃度のアンモニウムを含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記反応混合物から上記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記単離する工程は、約１℃～３０℃の間の温度で行われる。いくつかの実施形態において、上記ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、トランスファーＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、無細胞ポリペプチド合成のための方法が、本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、上記方法は、細胞を溶解して、細胞溶解物を生成する工程、上記細胞溶解物をフィルターに通して、細胞抽出物を生成する工程、上記細胞抽出物とポリペプチドをコードする核酸とを接触させて、反応混合物を生成する工程、および上記反応混合物をインキュベートして、上記ポリペプチドを生成する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解物は、遠心分離を介する清澄化に供されない。いくつかの実施形態において、上記細胞抽出物は、遠心分離を介する清澄化に供されない。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、遠心分離を介する清澄化に供されない。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記フィルターに通す工程の前に、上記細胞溶解物を凝集させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記フィルターに通す工程の前に、上記細胞溶解物を沈殿させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、表面フィルターを含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、デプスフィルターを含む。いくつかの実施形態において、上記通す工程は、クロスフロー濾過、ベルト濾過、マイクロフィルトレーション、限外濾過、ミクロポーラスろ過、真空ドラム濾過、篩い分け、膜濾過、砂濾過、およびスクリーン濾過を含む群から選択される１またはこれより多くのものを含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１００ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１５ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、１００ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、１５ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、５ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、０．４ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、０．２ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、０．１ミクロンより小さいサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約０．４ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロンのサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、直列にまたは並列に配置される少なくとも２つのフィルターを含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、孔サイズを徐々に小さくさせた直列に配置される少なくとも２つのフィルターを含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第１のフィルター、約０．２ミクロン～約０．５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第２のフィルター、および約０．２ミクロンのサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第３のフィルターを含む。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、媒体を含む。いくつかの実施形態において、上記媒体は、フローチャネルを形成する。いくつかの実施形態において、上記媒体は、マトリクスを提供するように結合または固定された２つのファイバーを含む。いくつかの実施形態において、上記２つのファイバーのうちの一方は、セルロースファイバーである。いくつかの実施形態において、上記媒体は、正に荷電されている。いくつかの実施形態において、上記媒体は、中性に荷電されている。いくつかの実施形態において、上記媒体は、負に荷電されている。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、濾過助剤を含む。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、上記孔のサイズより大きいかまたは小さいかのいずれかであるサイズを有する粒子を保持する孔を含む。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、１回使い切りフィルターを含む。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、レンチキュラーフィルター、ディープベッドフィルター、パッドフィルター、パネルフィルター、カートリッジタイプデプスフィルター、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第１のデプスフィルター、約０．２ミクロン～約０．５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第２のデプスフィルター、および滅菌グレードの膜および約０．２ミクロンのサイズを有する粒子を保持または除く孔を含む第３のフィルターを含む。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解物は、上記第１のデプスフィルター、次いで、上記第２のデプスフィルター、最後に上記第３のフィルターを経る濾過に供される。いくつかの実施形態において、上記方法は、細胞培養物から細胞を得る工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記得る工程は、遠心分離、タンジェンシャルフロー濾過、膜分離、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される１またはこれより多くのものに上記細胞培養物を供する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記膜分離は、中空ファイバー膜分離を含む。いくつかの実施形態において、上記溶解する工程は、超音波処理、均質化、窒素キャビテーション、凍結融解、フレンチプレスによる溶解、ビーズによる破砕、シリンジング、化学的溶解、酵素による溶解、浸透圧による溶解、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される１またはこれより多くのものを含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記細胞抽出物を凍結する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記細胞抽出物を凍結乾燥する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、トランスジェニック細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上記核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、上記ポリペプチドのオープンリーディングフレームを含む。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含み、ここで上記オープンリーディングフレームは、上記プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、上記オープンリーディングフレームの５’末端の上流に位置するリボソーム結合部位を含む。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、上記オープンリーディングフレームの３’末端の下流に位置するターミネーターを含む。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、Ｔ７プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７プロモーターは、５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ－３’（配列番号１）と少なくとも８０％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７プロモーターは、配列番号１と少なくとも８５％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７プロモーターは、配列番号１と少なくとも９０％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７プロモーターは、配列番号１と少なくとも９５％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７プロモーターは、配列番号１を含む。いくつかの実施形態において、上記ターミネーターは、Ｔ７ターミネーターを含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７ターミネーターは、５’－ＣＴＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＧＴＣＴＴＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧ－３’（配列番号２）と少なくとも８０％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７ターミネーターは、配列番号２と少なくとも８５％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７ターミネーターは、配列番号２と少なくとも９０％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７ターミネーターは、配列番号２と少なくとも９５％ 配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７ターミネーターは、配列番号２を含む。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、二価カチオンを含む。いくつかの実施形態において、上記通す工程は、約１℃～約４０℃の間の温度で行われる。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、アミノ酸、ヌクレオチド、塩、補因子、エネルギー源、翻訳テンプレート、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上記接触させる工程は、上記細胞抽出物に、上記ポリペプチドをコードする核酸、および上記アミノ酸、上記ヌクレオチド、上記塩、上記補因子、上記エネルギー源、上記翻訳テンプレート、またはこれらの組み合わせから選択される１またはこれより多くのものを添加する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記エネルギー源は、リン酸基を含む。いくつかの実施形態において、上記エネルギー源は、非リン酸化エネルギー基を含む。いくつかの実施形態において、上記エネルギー源は、グルタメートを含み、約１０ｍＭ～約４００ｍＭの間の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、上記エネルギー源は、ピルベートを含み、約１０ｍＭ～約４００ｍＭの間の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、上記エネルギー源は、約１０～約４００ｍＭの間の濃度のグルコースを含む。いくつかの実施形態において、上記塩は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの間の濃度のカリウムを含む。いくつかの実施形態において、上記塩は、約１ｍＭ～３０ｍＭの間の濃度のマグネシウムを含む。いくつかの実施形態において、上記塩は、約１０ｍＭ～約４００ｍＭの間の濃度のカリウムおよび約１ｍＭ～３０ｍＭの間の濃度のマグネシウムを含む。いくつかの実施形態において、上記塩は、約１ｍＭ～約４００ｍＭの間の濃度のアンモニウムを含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記反応混合物から上記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記単離する工程は、約１℃～３０℃の間の温度で行われる。いくつかの実施形態において、上記ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、トランスファーＲＮＡを含む。
【0004】
図面の簡単な説明
本開示の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲とともに示される。本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用される例示的実施形態を示す以下の詳細な説明への言及によって得られる。添付の図面は、以下である：
本開示の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲とともに示される。本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用される例示的実施形態を示す以下の詳細な説明への言及によって得られる。添付の図面は、以下である：
【図面の簡単な説明】
【0005】
【0006】
【0007】
【0008】
【0009】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
詳細な説明
無細胞ポリペプチド合成（ＣＦＰＳ）は、粗製細胞抽出物を使用して、所望のポリペプチド生成物を迅速にかつ信頼性高く合成するプラットフォーム技術である。この粗製細胞抽出物は、無細胞反応の出発点である。なぜならそれは、ポリペプチド翻訳（および必要に応じて、ｍＲＮＡ転写）を可能にして、ポリペプチドおよびタンパク質生成物を核酸テンプレート（例えば、プラスミドまたは直線状ＤＮＡ）ならびに補充されたヌクレオチド、アミノ酸、エネルギー源、および他の必要な補因子から生成するその内因性の機構を利用するからである。ＣＦＰＳは、より迅速な発現ライムライン、発現条件をカスタマイズする自由度があること、および直線状またはプラスミドＤＮＡテンプレートの直接的付加によって各合成されたポリペプチドまたはタンパク質について特有の細胞株を生成する必要性を回避することを含む、細胞発現を超える多くの潜在的な利点を有する。
無細胞ポリペプチド合成（ＣＦＰＳ）は、粗製細胞抽出物を使用して、所望のポリペプチド生成物を迅速にかつ信頼性高く合成するプラットフォーム技術である。この粗製細胞抽出物は、無細胞反応の出発点である。なぜならそれは、ポリペプチド翻訳（および必要に応じて、ｍＲＮＡ転写）を可能にして、ポリペプチドおよびタンパク質生成物を核酸テンプレート（例えば、プラスミドまたは直線状ＤＮＡ）ならびに補充されたヌクレオチド、アミノ酸、エネルギー源、および他の必要な補因子から生成するその内因性の機構を利用するからである。ＣＦＰＳは、より迅速な発現ライムライン、発現条件をカスタマイズする自由度があること、および直線状またはプラスミドＤＮＡテンプレートの直接的付加によって各合成されたポリペプチドまたはタンパク質について特有の細胞株を生成する必要性を回避することを含む、細胞発現を超える多くの潜在的な利点を有する。
【0012】
しかし、無細胞抽出物調製法は、時間がかかりかつ骨が折れる。ＣＦＰＳ分野では、一般に、細胞成長、細胞採取、細胞溶解、および溶解後処理から構成される抽出物調製の合理化に多くの努力が払われてきた。製造スケールのポリペプチドまたはタンパク質合成は、高いタンパク質収量を維持しながらエネルギーコストおよび洗浄を低減する溶解後処理の代替の方法を使用し得る。溶解後清澄化は、代表的には、遠心分離に依拠する。多くの報告は、溶解後遠心分離工程の電力需要を低下させる試み（例えば、低速および／または低回転）を記載する。例えば、遠心分離機を使用して細胞溶解物を清澄化するための操作時間は、約３０分から２４時間までの範囲に及び得る。遠心分離設備を清浄にするにはさらなる時間が必要とされる（例えば、大規模になると４８時間までの洗浄時間）。規模に応じて、遠心分離設備は、購入に１０，０００ドル～１，０００，０００ドルのコストがかかる可能性があり、年間の操作コストは、５０，０００ドル～２００，０００ドルになる可能性がある。高速で溶解後処理のために使用される遠心分離は、一般に、交差汚染のリスクを有する高価かつ再使用可能なステンレス鋼の設備を必要とし、多数の生成物、特に、ＧＭＰ条件下で作製されるものに対する使用には、非常に時間のかかる洗浄検証を必要とする。従って、遠心分離の必要性は、溶解後処理を、使い捨て可能な製造法（これは、非常に融通性があり、交差汚染のリスクを有さず、バイオ医薬品産業では現在標準的である）と不適合にしている。遠心分離はまた、ハイスループット抽出物生成のためのハイスループット形式（例えば、マルチウェルプレート）において実行するのが困難であり得る。抽出物調製の間に、遠心分離工程を別の清澄化方法で置き換えるプロセスは、１グラムあたりより低コストおよび／またはより短時間でタンパク質を生成し得ると同時に、改善された抽出方法を使用して生成されるタンパク質の力価は、匹敵し得る。改善されたプロセスは、資源が制限された環境において、ハイスループット抽出物生成のために、より少ない投資で、および既存のまたは新たな使い捨て可能な製造環境において実行され得る。
【0013】
従って、細胞抽出物を効率的にかつ安価に、短縮された時間および低減された設備コストで調製し得る、および資源が制限されるかまたは使い捨て可能な製造環境において実行され得る、規模を大きくしたＣＦＰＳシステムおよび方法の必要性が未だに存在する。
【0014】
本開示は、別段示されなければ、当該分野の技術範囲内である従来の分子生物学技術を使用する。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【0015】
定義
本開示全体を通じて、種々の実施形態は、範囲形式で提示される。範囲形式の記載が、便宜上および簡便性のために過ぎず、任意の実施形態の範囲に対する変更のできない限定として解釈されるべきではないことは、理解されるべきである。よって、範囲の記載は、文脈が別段明らかに規定しなければ、下限の単位の１／１０までの範囲内で、具体的に開示される全ての考えられる部分範囲、ならびに個々の数値を有すると見做されるべきである。例えば、１～６のような範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などのような具体的に開示される部分範囲、ならびにその範囲内の個々の値（例えば、１．１、２、２．３、５、および５．９）を有すると見做されるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず該当する。これらの介在する範囲の上限および下限は、独立して、より小さな範囲の中に含められてもよく、その指定された範囲の中の任意の具体的に排除される境界に従って、本開示の範囲内にも包含される。その指定された範囲が、その境界のうちの一方または両方を含む場合、それらの含められる境界のうちのいずれかまたは両方を除く範囲がまた、文脈が別段明らかに規定しなければ、本開示の中に包含される。
本開示全体を通じて、種々の実施形態は、範囲形式で提示される。範囲形式の記載が、便宜上および簡便性のために過ぎず、任意の実施形態の範囲に対する変更のできない限定として解釈されるべきではないことは、理解されるべきである。よって、範囲の記載は、文脈が別段明らかに規定しなければ、下限の単位の１／１０までの範囲内で、具体的に開示される全ての考えられる部分範囲、ならびに個々の数値を有すると見做されるべきである。例えば、１～６のような範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などのような具体的に開示される部分範囲、ならびにその範囲内の個々の値（例えば、１．１、２、２．３、５、および５．９）を有すると見做されるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず該当する。これらの介在する範囲の上限および下限は、独立して、より小さな範囲の中に含められてもよく、その指定された範囲の中の任意の具体的に排除される境界に従って、本開示の範囲内にも包含される。その指定された範囲が、その境界のうちの一方または両方を含む場合、それらの含められる境界のうちのいずれかまたは両方を除く範囲がまた、文脈が別段明らかに規定しなければ、本開示の中に包含される。
【0016】
本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、任意の実施形態の限定であることは意図されない。本明細書で使用される場合、単数形「ａ（１つの、ある）」、「ａｎ（１つの、ある）」および「ｔｈｅ（上記、この、その）」は、文脈が別段明らかに規定しなければ、複数形をも含むことが意図される。用語「包含する、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「包含する、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書で使用される場合、指定された特徴、整数、工程、操作、要素、および／または構成成分の存在を特定するが、１またはこれより多くの他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成成分および／またはその群の存在または追加を排除しないことがさらに理解される。本明細書で使用される場合、用語「および／または」は、関連付けられた列挙される項目のうちの１またはこれより多くのもののいずれかおよび全ての組み合わせを含む。
【0017】
具体的に特定されなければまたは文脈から明らかでなければ、本明細書で使用される場合、数値または数値の範囲への言及における用語「約」は、その指定された数値および数値±１０％、または範囲に関して列挙された値に関しては、その列挙された下限を１０％下回るおよびその列挙された上限を１０％上回ることを意味することが理解される。
【0018】
用語「細胞溶解」とは、細胞膜の破壊に言及する。溶解は、一般に、細胞タンパク質の不活性化、変性、および分解を制限または防止するように構成された緩衝液中で行われる。
【0019】
用語「細胞溶解物」は、一般に、溶解された細胞の内容物および溶解緩衝液の構成成分を含む。いくらかの場合には、上記細胞溶解物は、細胞培養の間に導入された外来物質を含む。用語「細胞溶解物」および「無細胞溶解物」は、本開示において交換可能に使用される。
【0020】
用語「清澄化する」、「清澄化」、「清澄化工程（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ）」は、一般に、細胞全体、細胞デブリ、および無細胞ポリペプチド合成のために必要とされない細胞溶解物中に存在する外来物質を除去するために行われる、無細胞ポリペプチド合成（ＣＦＰＳ）とともに使用するための細胞抽出物を調製するために使用される１またはこれより多くの工程に言及する。
【0021】
用語「デプスフィルター」とは、フィルターであって、そのフィルター内またはフィルター上の両方に粒子を捕捉または吸収するフィルターである。
【0022】
用語「細胞デブリ」とは、細胞溶解物中に通常存在する細胞タンパク質、膜、細胞壁構成成分、および／またはゲノムＤＮＡに言及する。
【0023】
用語「無細胞抽出物」とは、細胞溶解物を清澄化することによって得られる生成物に言及する。
無細胞ポリペプチド合成
無細胞ポリペプチド合成
【0024】
無細胞ポリペプチド合成（ＣＦＰＳ）は、粗製細胞抽出物を使用して、所望のポリペプチドまたはタンパク質生成物を迅速にかつ信頼性高く合成するプラットフォーム技術である。ＣＦＰＳは、細胞の内因性機構および／または補充されたヌクレオチド、アミノ酸、エネルギー源、および他の必要な補因子を利用して、ｍＲＮＡを核酸テンプレート（例えば、プラスミドまたは直線状ＤＮＡ）から転写および翻訳する。
【0025】
図１に図示されるように、既存の無細胞抽出物ベースのＣＦＰＳ方法（上のパネル）は、以下の工程、細胞培養もしくは細胞成長、遠心分離による細胞採取、均質化による細胞溶解、遠心分離による細胞溶解物清澄化、および遠心分離を介して清澄化した無細胞抽出物を使用するＣＦＰＳを含む。溶解後清澄化プロセスは通常、遠心分離に依拠し、遠心分離は、長い操作時間および遠心分離機のような設備のための相当なコストを必要とし得る。清澄化工程は、細胞全体、細胞デブリ、およびＣＦＰＳに必要とされず、上記抽出物が特異的におよび高収量かつ高品質において所望のポリペプチドまたはタンパク質生成物を作製する能力（翻訳後修飾、折りたたみ、およびタンパク質限定分解が挙げられる）、ならびに抽出物の再現性、低バイオバーデン、および材料特性に干渉し得る細胞溶解物中に存在する外来物質を除去することが意図される。遠心分離工程を、ＣＦＰＳの時間およびコストの両方を低下させることができかつ資源が制限されるかまたは使い捨て可能な製造環境において実行できるもので置き換える溶解後処理方法の必要性が存在する。濾過を介して清澄化した細胞抽出物を使用するＣＦＰＳのための方法およびシステムが、本明細書で開示される。
【0026】
濾過を介する細胞溶解物の清澄化のための方法およびシステム
濾過を介する細胞溶解物の清澄化のための方法
図１に図示されるように、細胞溶解物を清澄化して、ＣＦＰＳのための無細胞抽出物を得るために、遠心分離の代わりに濾過を使用するＣＦＰＳのための方法（下のパネル）が、本明細書で開示される。
濾過を介する細胞溶解物の清澄化のための方法
図１に図示されるように、細胞溶解物を清澄化して、ＣＦＰＳのための無細胞抽出物を得るために、遠心分離の代わりに濾過を使用するＣＦＰＳのための方法（下のパネル）が、本明細書で開示される。
【0027】
いくつかの実施形態において、無細胞ポリペプチド合成（ＣＦＰＳ）のための方法が、本明細書で記載される。いくつかの実施形態において、上記方法は、細胞を得る工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記得る工程は、上記細胞を成長させる工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記得る工程は、上記細胞を培養する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＣＦＰＳに適した細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、上記細胞は、トランスジェニック細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞、および藻類細胞を含む群から選択される１またはこれより多くのものを含み得る。いくつかの実施形態において、上記細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｔｏｂａｃｃｏ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｐｕｔｉｄａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ａｒｃｈａｅａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ、チャイイーズバムスター卵巣細胞、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽細胞、ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、およびそれらの遺伝的に改変されたバリアントを含む群から選択される１またはこれより多くのものを含み得る。
【0028】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記細胞を採取する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記採取する工程は、遠心分離、タンジェンシャルフロー濾過、および膜分離 遠心分離を含む群から選択される１またはこれより多くのものに上記細胞を供する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記採取する工程は、遠心分離、タンジェンシャルフロー濾過、および膜分離 遠心分離を含む群から選択される１またはこれより多くのものに、細胞培養物中の細胞を供する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記膜分離は、タンジェンシャルフロー濾過、ノーマルフロー濾過（ｎｏｒｍａｌ－ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、または中空ファイバー膜分離を含み得る。いくつかの実施形態において、上記採取する工程は、上記細胞を再懸濁する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記細胞は、細胞の湿重量１ｇあたり、約０．０１ｍｌ～５０ｍｌの間の容積、例えば、約０．０１ｍｌ、０．０２ｍｌ、０．０３ｍｌ、０．０４ｍｌ、０．０５ｍｌ、０．０６ｍｌ、０．０７ｍｌ、０．０８ｍｌ、０．０９ｍｌ、０．１ｍｌ、０．１１ｍｌ、０．１２ｍｌ、０．１３ｍｌ、０．１４ｍｌ、０．１５ｍｌ、０．１６ｍｌ、０．１７ｍｌ、０．１８ｍｌ、０．１９ｍｌ、０．２ｍｌ、０．２１ｍｌ、０．２２ｍｌ、０．２３ｍｌ、０．２４ｍｌ、０．２５ｍｌ、０．２６ｍｌ、０．２７ｍｌ、０．２８ｍｌ、０．２９ｍｌ、０．３ｍｌ、０．３１ｍｌ、０．３２ｍｌ、０．３３ｍｌ、０．３４ｍｌ、０．３５ｍｌ、０．３６ｍｌ、０．３７ｍｌ、０．３８ｍｌ、０．３９ｍｌ、０．４ｍｌ、０．４１ｍｌ、０．４２ｍｌ、０．４３ｍｌ、０．４４ｍｌ、０．４５ｍｌ、０．４６ｍｌ、０．４７ｍｌ、０．４８ｍｌ、０．４９ｍｌ、０．５ｍｌ、０．５５ｍｌ、０．６ｍｌ、０．６５ｍｌ、０．７ｍｌ、０．７５ｍｌ、０．８ｍｌ、０．８５ｍｌ、０．９ｍｌ、０．９５ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌ、１１ｍｌ、１２ｍｌ、１３ｍｌ、１４ｍｌ、１５ｍｌ、１６ｍｌ、１７ｍｌ、１８ｍｌ、１９ｍｌ、２０ｍｌ、２１ｍｌ、２２ｍｌ、２３ｍｌ、２４ｍｌ、２５ｍｌ、２６ｍｌ、２７ｍｌ、２８ｍｌ、２９ｍｌ、３０ｍｌ、３１ｍｌ、３２ｍｌ、３３ｍｌ、３４ｍｌ、３５ｍｌ、３６ｍｌ、３７ｍｌ、３８ｍｌ、３９ｍｌ、４０ｍｌ、４１ｍｌ、４２ｍｌ、４３ｍｌ、４４ｍｌ、４５ｍｌ、４６ｍｌ、４７ｍｌ、４８ｍｌ、４９ｍｌ、もしくは約５０ｍｌまたはこれらの間の任意の容積に懸濁され得る。
【0029】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記細胞を溶解して、細胞溶解物を生成する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解物は、遠心分離を介する清澄化に供されない。いくつかの実施形態において、上記溶解する工程は、フレンチプレス、ビーズによる破砕、超音波処理、均質化、窒素キャビテーション、凍結融解、シリンジング、化学的溶解、酵素による溶解、および浸透圧による溶解を含む群から選択される１またはこれより多くのものを含み得る。
【0030】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記細胞溶解物をフィルターに通して、細胞抽出物を生成する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解物は、遠心分離を介する清澄化に供されない。いくつかの実施形態において、上記細胞抽出物は、遠心分離を介する清澄化に供されない。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記フィルターに通す工程の前に、上記細胞溶解物を凝集させる工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記フィルターに通す工程の前に、上記細胞溶解物内の構成成分を沈殿させる工程を包含し得る。
【0031】
いくつかの実施形態において、種々のフィルターが、濾過または清澄化を介して上記細胞溶解物から上記細胞抽出物を生成するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、１つのフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、少なくとも２つのフィルター、例えば、２つのフィルター、３つのフィルター、４つのフィルター、５つのフィルター、６つのフィルター、７つのフィルター、８つのフィルター、９つのフィルター、１０のフィルター、または１０より多くのフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、本明細書で開示されるフィルター、または本明細書で開示されるフィルターのうちの２もしくはこれより多くのものの組み合わせを含み得る。上記フィルターが、少なくとも２つのフィルターを含む場合、上記少なくとも２つのフィルターのうちの一方は、本明細書で開示されるフィルターを含み得る。上記フィルターが、少なくとも２つのフィルターを含む場合、上記少なくとも２つのフィルターの各々は、本明細書で開示されるフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記少なくとも２つのフィルターは、直列に配置され得る。いくつかの実施形態において、上記少なくとも２つのフィルターは、孔サイズを徐々に小さくさせて直列に配置され得る。いくつかの実施形態において、上記方法の通す工程は、上記細胞溶解物を、直列に配置された少なくとも２つのフィルターに通して、上記細胞抽出物を生成する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記通す工程は、上記細胞溶解物が、孔サイズを徐々に小さくさせた一連のフィルターを通して濾過されて、上記細胞抽出物を生成するように、上記細胞溶解物を、直列に配置された上記少なくとも２つのフィルターに通す工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記少なくとも２つのフィルターは、並列に配置され得る。いくつかの実施形態において、上記方法の通す工程は、上記細胞溶解物を、並列に配置された少なくとも２つのフィルターに通して、上記細胞抽出物を生成する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記少なくとも２つのフィルターのうちの全てではないがいくつかのものは、直列に配置され得る。いくつかの実施形態において、上記少なくとも２つのフィルターのうちの全てではないがいくつかのものは、並列に配置され得る。いくつかの実施形態において、上記少なくとも２つのフィルターのうちのいくつかは、直列に配置され得、上記少なくとも２つのフィルターのうちのいくつかは、並列に配置され得る。
【0032】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１００ミクロン～約１０００ミクロンの間のサイズ、例えば、約１００ミクロン、１１０ミクロン、１２０ミクロン、１３０ミクロン、１４０ミクロン、１５０ミクロン、１６０ミクロン、１７０ミクロン、１８０ミクロン、１９０ミクロン、２００ミクロン、２１０ミクロン、２２０ミクロン、２３０ミクロン、２４０ミクロン、２５０ミクロン、２６０ミクロン、２７０ミクロン、２８０ミクロン、２９０ミクロン、３００ミクロン、３１０ミクロン、３２０ミクロン、３３０ミクロン、３４０ミクロン、３５０ミクロン、３６０ミクロン、３７０ミクロン、３８０ミクロン、３９０ミクロン、４００ミクロン、４１０ミクロン、４２０ミクロン、４３０ミクロン、４４０ミクロン、４５０ミクロン、４６０ミクロン、４７０ミクロン、４８０ミクロン、４９０ミクロン、５００ミクロン、５１０ミクロン、５２０ミクロン、５３０ミクロン、５４０ミクロン、５５０ミクロン、５６０ミクロン、５７０ミクロン、５８０ミクロン、５９０ミクロン、６００ミクロン、６１０ミクロン、６２０ミクロン、６３０ミクロン、６４０ミクロン、６５０ミクロン、６６０ミクロン、６７０ミクロン、６８０ミクロン、６９０ミクロン、７００ミクロン、７１０ミクロン、７２０ミクロン、７３０ミクロン、７４０ミクロン、７５０ミクロン、７６０ミクロン、７７０ミクロン、７８０ミクロン、７９０ミクロン、８００ミクロン、８１０ミクロン、８２０ミクロン、８３０ミクロン、８４０ミクロン、８５０ミクロン、８６０ミクロン、８７０ミクロン、８８０ミクロン、８９０ミクロン、９００ミクロン、９１０ミクロン、９２０ミクロン、９３０ミクロン、９４０ミクロン、９５０ミクロン、９６０ミクロン、９７０ミクロン、９８０ミクロン、９９０ミクロン、または約１０００ミクロン、またはこれらの間の任意のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0033】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１００ミクロン～約１０００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１００ミクロン～約９００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１００ミクロン～約８００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１００ミクロン～約７００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１００ミクロン～約６００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１００ミクロン～約５００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１００ミクロン～約４００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１００ミクロン～約３００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１００ミクロン～約２００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２００ミクロン～約１０００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２００ミクロン～約９００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２００ミクロン～約８００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２００ミクロン～約７００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２００ミクロン～約６００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２００ミクロン～約５００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２００ミクロン～約４００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２００ミクロン～約３００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３００ミクロン～約１０００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３００ミクロン～約９００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３００ミクロン～約８００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３００ミクロン～約７００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３００ミクロン～約６００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３００ミクロン～約５００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３００ミクロン～約４００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４００ミクロン～約１０００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４００ミクロン～約９００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４００ミクロン～約８００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４００ミクロン～約７００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４００ミクロン～約６００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４００ミクロン～約５００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５００ミクロン～約１０００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５００ミクロン～約９００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５００ミクロン～約８００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５００ミクロン～約７００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５００ミクロン～約６００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約６００ミクロン～約１０００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約６００ミクロン～約９００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約６００ミクロン～約８００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約６００ミクロン～約７００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約７００ミクロン～約１０００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約７００ミクロン～約９００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約７００ミクロン～約８００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約８００ミクロン～約１０００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約８００ミクロン～約９００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約９００ミクロン～約１０００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0034】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズ、例えば、約１ミクロン、２ミクロン、３ミクロン、４ミクロン、５ミクロン、６ミクロン、７ミクロン、８ミクロン、９ミクロン、１０ミクロン、１１ミクロン、１２ミクロン、１３ミクロン、１４ミクロン、１５ミクロン、１６ミクロン、１７ミクロン、１８ミクロン、１９ミクロン、２０ミクロン、２１ミクロン、２２ミクロン、２３ミクロン、２４ミクロン、２５ミクロン、２６ミクロン、２７ミクロン、２８ミクロン、２９ミクロン、３０ミクロン、３１ミクロン、３２ミクロン、３３ミクロン、３４ミクロン、３５ミクロン、３６ミクロン、３７ミクロン、３８ミクロン、３９ミクロン、４０ミクロン、４１ミクロン、４２ミクロン、４３ミクロン、４４ミクロン、４５ミクロン、４６ミクロン、４７ミクロン、４８ミクロン、４９ミクロン、５０ミクロン、５１ミクロン、５２ミクロン、５３ミクロン、５４ミクロン、５５ミクロン、５６ミクロン、５７ミクロン、５８ミクロン、５９ミクロン、６０ミクロン、６１ミクロン、６２ミクロン、６３ミクロン、６４ミクロン、６５ミクロン、６６ミクロン、６７ミクロン、６８ミクロン、６９ミクロン、７０ミクロン、７１ミクロン、７２ミクロン、７３ミクロン、７４ミクロン、７５ミクロン、７６ミクロン、７７ミクロン、７８ミクロン、７９ミクロン、８０ミクロン、８１ミクロン、８２ミクロン、８３ミクロン、８４ミクロン、８５ミクロン、８６ミクロン、８７ミクロン、８８ミクロン、８９ミクロン、９０ミクロン、９１ミクロン、９２ミクロン、９３ミクロン、９４ミクロン、９５ミクロン、９６ミクロン、９７ミクロン、９８ミクロン、９９ミクロン、もしくは約１００ミクロン、またはこれらの間の任意のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0035】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１０ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１０ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１０ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１０ミクロン～約７０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１０ミクロン～約６０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１０ミクロン～約５０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１０ミクロン～約４０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１０ミクロン～約３０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１０ミクロン～約２０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２０ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２０ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２０ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２０ミクロン～約７０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２０ミクロン～約６０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２０ミクロン～約５０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２０ミクロン～約４０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２０ミクロン～約３０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３０ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３０ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３０ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３０ミクロン～約７０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３０ミクロン～約６０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３０ミクロン～約５０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３０ミクロン～約４０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４０ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４０ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４０ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４０ミクロン～約７０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４０ミクロン～約６０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４０ミクロン～約５０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５０ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５０ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５０ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５０ミクロン～約７０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５０ミクロン～約６０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約６０ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約６０ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約６０ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約６０ミクロン～約７０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約６０ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約７０ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約７０ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約７０ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約８０ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約８０ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約９０ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0036】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１ミクロン～約９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１ミクロン～約８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１ミクロン～約７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１ミクロン～約６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１ミクロン～約５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１ミクロン～約４ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１ミクロン～約３ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約１ミクロン～約２ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２ミクロン～約９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２ミクロン～約８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２ミクロン～約７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２ミクロン～約６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２ミクロン～約５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２ミクロン～約４ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約２ミクロン～約３ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３ミクロン～約９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３ミクロン～約８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３ミクロン～約７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３ミクロン～約６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３ミクロン～約５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約３ミクロン～約４ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４ミクロン～約９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４ミクロン～約８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４ミクロン～約７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４ミクロン～約６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約４ミクロン～約５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５ミクロン～約９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５ミクロン～約８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５ミクロン～約７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約５ミクロン～約６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約６ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約６ミクロン～約９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約６ミクロン～約８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約６ミクロン～約７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約６ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約７ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約７ミクロン～約９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約７ミクロン～約８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約８ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約８ミクロン～約９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約９ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0037】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００１ミクロン～約１．０ミクロンの間のサイズ、例えば、約０．００１ミクロン、０．００２ミクロン、０．００３ミクロン、０．００４ミクロン、０．００５ミクロン、０．００６ミクロン、０．００７ミクロン、０．００８ミクロン、０．００９ミクロン、０．０１ミクロン、０．０２ミクロン、０．０３ミクロン、０．０４ミクロン、０．０５ミクロン、０．０６ミクロン、０．０７ミクロン、０．０８ミクロン、０．０９ミクロン、０．１ミクロン、０．１１ミクロン、０．１２ミクロン、０．１３ミクロン、０．１４ミクロン、０．１５ミクロン、０．１６ミクロン、０．１７ミクロン、０．１８ミクロン、０．１９ミクロン、０．２ミクロン、０．２１ミクロン、０．２２ミクロン、０．２３ミクロン、０．２４ミクロン、０．２５ミクロン、０．２６ミクロン、０．２７ミクロン、０．２８ミクロン、０．２９ミクロン、０．３ミクロン、０．３１ミクロン、０．３２ミクロン、０．３３ミクロン、０．３４ミクロン、０．３５ミクロン、０．３６ミクロン、０．３７ミクロン、０．３８ミクロン、０．３９ミクロン、０．４ミクロン、０．４１ミクロン、０．４２ミクロン、０．４３ミクロン、０．４４ミクロン、０．４５ミクロン、０．４６ミクロン、０．４７ミクロン、０．４８ミクロン、０．４９ミクロン、０．５ミクロン、０．５１ミクロン、０．５２ミクロン、０．５３ミクロン、０．５４ミクロン、０．５５ミクロン、０．５６ミクロン、０．５７ミクロン、０．５８ミクロン、０．５９ミクロン、０．６ミクロン、０．６１ミクロン、０．６２ミクロン、０．６３ミクロン、０．６４ミクロン、０．６５ミクロン、０．６６ミクロン、０．６７ミクロン、０．６８ミクロン、０．６９ミクロン、０．７ミクロン、０．７１ミクロン、０．７２ミクロン、０．７３ミクロン、０．７４ミクロン、０．７５ミクロン、０．７６ミクロン、０．７７ミクロン、０．７８ミクロン、０．７９ミクロン、０．８ミクロン、０．８１ミクロン、０．８２ミクロン、０．８３ミクロン、０．８４ミクロン、０．８５ミクロン、０．８６ミクロン、０．８７ミクロン、０．８８ミクロン、０．８９ミクロン、０．９ミクロン、０．９１ミクロン、０．９２ミクロン、０．９３ミクロン、０．９４ミクロン、０．９５ミクロン、０．９６ミクロン、０．９７ミクロン、０．９８ミクロン、０．９９ミクロン、もしくは約１．０ミクロンまたはこれらの間の任意のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0038】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約１．０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約０．９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約０．８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約０．７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約０．６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約０．５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約０．４ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約０．３ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約０．２ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約１．０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約０．９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約０．８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約０．７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約０．６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約０．５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約０．４ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約０．３ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約１．０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約０．９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約０．８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約０．７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約０．６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約０．５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約０．４ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約１．０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約０．９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約０．８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約０．７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約０．６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約０．５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約１．０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約０．９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約０．８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約０．７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約０．６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約１．０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約０．９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約０．８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約０．７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約１．０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約０．９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約０．８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約１．０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約０．９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約１．０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0039】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０１ミクロン～約０．１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０１ミクロン～約０．０９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０１ミクロン～約０．０８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０１ミクロン～約０．０７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０１ミクロン～約０．０６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０１ミクロン～約０．０５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０１ミクロン～約０．０４ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０１ミクロン～約０．０３ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０１ミクロン～約０．０２ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０２ミクロン～約０．１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０２ミクロン～約０．０９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０２ミクロン～約０．０８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０２ミクロン～約０．０７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０２ミクロン～約０．０６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０２ミクロン～約０．０５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０２ミクロン～約０．０４ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０２ミクロン～約０．０３ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０３ミクロン～約０．１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０３ミクロン～約０．０９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０３ミクロン～約０．０８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０３ミクロン～約０．０７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０３ミクロン～約０．０６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０３ミクロン～約０．０５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０３ミクロン～約０．０４ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０４ミクロン～約０．１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０４ミクロン～約０．０９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０４ミクロン～約０．０８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０４ミクロン～約０．０７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０４ミクロン～約０．０６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０４ミクロン～約０．０５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０５ミクロン～約０．１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０５ミクロン～約０．０９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０５ミクロン～約０．０８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０５ミクロン～約０．０７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０５ミクロン～約０．０６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０６ミクロン～約０．１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０６ミクロン～約０．０９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０６ミクロン～約０．０８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０６ミクロン～約０．０７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０７ミクロン～約０．１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０７ミクロン～約０．０９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０７ミクロン～約０．０８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０８ミクロン～約０．１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０８ミクロン～約０．０９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．０９ミクロン～約０．１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0040】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００１ミクロン～約０．０１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００１ミクロン～約０．００９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００１ミクロン～約０．００８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００１ミクロン～約０．００７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００１ミクロン～約０．００６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００１ミクロン～約０．００５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００１ミクロン～約０．００４ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００１ミクロン～約０．００３ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００１ミクロン～約０．００２ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００２ミクロン～約０．０１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００２ミクロン～約０．００９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００２ミクロン～約０．００８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００２ミクロン～約０．００７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００２ミクロン～約０．００６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００２ミクロン～約０．００５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００２ミクロン～約０．００４ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００２ミクロン～約０．００３ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００３ミクロン～約０．０１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００３ミクロン～約０．００９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００３ミクロン～約０．００８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００３ミクロン～約０．００７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００３ミクロン～約０．００６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００３ミクロン～約０．００５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００３ミクロン～約０．００４ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００４ミクロン～約０．０１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００４ミクロン～約０．００９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００４ミクロン～約０．００８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００４ミクロン～約０．００７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００４ミクロン～約０．００６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００４ミクロン～約０．００５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００５ミクロン～約０．０１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００５ミクロン～約０．００９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００５ミクロン～約０．００８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００５ミクロン～約０．００７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００５ミクロン～約０．００６ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００６ミクロン～約０．０１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００６ミクロン～約０．００９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００６ミクロン～約０．００８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００６ミクロン～約０．００７ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００７ミクロン～約０．０１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００７ミクロン～約０．００９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００７ミクロン～約０．００８ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００８ミクロン～約０．０１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００８ミクロン～約０．００９ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．００９ミクロン～約０．０１ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0041】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約９５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約８５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約７５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約７０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約６５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約６０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約５５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約５０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約４５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約４０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約３５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約３０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約２５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約２０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１ミクロン～約５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0042】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約９５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約８５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約７５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約７０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約６５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約６０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約５５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約５０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約４５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約４０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約３５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約３０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約２５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約２０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．２ミクロン～約５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0043】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約９５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約８５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約７５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約７０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約６５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約６０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約５５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約５０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約４５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約４０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約３５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約３０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約２５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約２０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．３ミクロン～約５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0044】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約９５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約８５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約７５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約７０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約６５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約６０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約５５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約５０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約４５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約４０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約３５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約３０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約２５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約２０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．４ミクロン～約５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0045】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約９５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約８５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約７５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約７０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約６５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約６０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約５５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約５０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約４５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約４０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約３５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約３０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約２５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約２０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．５ミクロン～約５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0046】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約９５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約８５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約７５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約７０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約６５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約６０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約５５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約５０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約４５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約４０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約３５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．１６ミクロン～約３０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約２５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約２０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．６ミクロン～約５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0047】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約９５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約８５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約７５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約７０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約６５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約６０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約５５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約５０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約４５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約４０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約３５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約３０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約２５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約２０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．７ミクロン～約５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0048】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約９５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約８５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約７５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約７０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約６５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約６０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約５５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約５０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約４５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約４０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約３５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約３０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約２５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約２０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．８ミクロン～約５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0049】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約１００ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約９５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約９０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約８５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約８０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約７５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約７０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約６５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約６０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約５５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約５０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約４５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約４０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約３５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約３０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約２５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約２０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約１０ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、約０．９ミクロン～約５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。
【0050】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、表面フィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、は、デプスフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、滅菌グレードの膜を含むフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記滅菌グレードの膜を含むフィルターは、約０．１ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持し得る。いくつかの実施形態において、上記滅菌グレードの膜を含むフィルターは、約０．２ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持し得る。いくつかの実施形態において、上記滅菌グレードの膜を含むフィルターは、約０．４ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＣＦＰＳ方法の通す工程は、以下を含む群から選択される１またはこれより多くのものを使用して行われ得る：クロスフロー濾過、ベルト濾過、マイクロフィルトレーション、限外濾過、ミクロポーラスろ過、真空ドラム濾過、篩い分け、膜濾過、砂濾過、およびスクリーン濾過。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、媒体を含み得る。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターの媒体は、フローチャネルを形成し得る。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターの媒体は、複雑な曲がりくねったフローチャネルを含み得る。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターの媒体は、２つのファイバーを含み得る。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターの媒体は、正に荷電され得る。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターの媒体は、中性に荷電され得る。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターの媒体は、負に荷電され得る。いくつかの実施形態において、上記２つのファイバーは、マトリクスを提供するように結合または固定され得る。いくつかの実施形態において、上記２つのファイバーは、ランダムマトリクスを提供するように結合または固定され得る。いくつかの実施形態において、上記２つのファイバーは、結合剤によって結合され得る。いくつかの実施形態において、上記結合剤は、荷電された樹脂または荷電されていない樹脂を含み得る。いくつかの実施形態において、上記２つのファイバーは、上記細胞溶解物中の粒子を吸収または捕捉し得る。いくつかの実施形態において、上記２つのファイバーのうちの一方は、セルロースファイバーを含み得る。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解物中の粒子は、上記媒体による捕捉を介して分離され得る。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解物中の粒子は、上記媒体への吸着を介して分離され得る。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解物中の粒子は、サイズ排除を介して上記フィルターの中に保持され得る。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解物中の粒子は、疎水性相互作用、イオン性相互作用、または他のタイプの相互作用を介して、上記フィルターの媒体への吸着によって、上記フィルターの中に保持され得る。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、濾過助剤を含み得る。いくつかの実施形態において、上記濾過助剤は、珪藻土を含み得る。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、孔を含み得、その孔は、その孔のサイズより大きいサイズを有する粒子を保持する。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、孔を含み得、その孔は、その孔のサイズより小さいサイズを有する粒子を保持する。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、１回使い切りフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、レンチキュラーフィルター、ディープベッドフィルター、パッドフィルター、パネルフィルター、およびカートリッジタイプデプスフィルターを含む群から選択される１またはこれより多くのものを含み得る。
【0051】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、３つのフィルター、第１のフィルター、第２のフィルター、および第３のフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記第１のフィルターは、本明細書で開示されるフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記第１のフィルターは、約０．５ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含むフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記第２のフィルターは、本明細書で開示されるフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記第２のフィルターは、約０．２ミクロン～約０．５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含むフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記第３のフィルターは、本明細書で開示されるフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記第３のフィルターは、約０．２ミクロンのサイズを有する粒子を保持または除く孔を含むフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記第１のフィルター、第２のフィルターおよび第３のフィルターのうちの少なくとも２つは、直列に配置され得る。いくつかの実施形態において、上記第１のフィルター、第２のフィルターおよび第３のフィルターの３つ全てが、直列に配置され得る。いくつかの実施形態において、上記第１のフィルター、第２のフィルターおよび第３のフィルターのうちの少なくとも２つは、並列に配置され得る。いくつかの実施形態において、上記第１のフィルター、第２のフィルターおよび第３のフィルターの３つ全てが、並列に配置され得る。
【0052】
いくつかの実施形態において、上記フィルターは、３つのフィルター、第１のデプスフィルター、第２のデプスフィルター、および滅菌グレードの膜を含む第３のフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記第１のデプスフィルターは、約０．５ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記第２のデプスフィルターは、約０．２ミクロン～約０．５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、滅菌グレードの膜を含む上記第３のフィルターは、約０．２ミクロンのサイズを有する粒子を保持または除く孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記第１のデプスフィルター、第２のデプスフィルター、および滅菌グレードの膜を含む第３のフィルターのうちの少なくとも２つは、直列に配置され得る。いくつかの実施形態において、上記第１のデプスフィルター、第２のデプスフィルター、および滅菌グレードの膜を含む第３のフィルターの３つ全てが、直列に配置され得る。いくつかの実施形態において、上記第１のデプスフィルター、第２のデプスフィルター、および滅菌グレードの膜を含む第３のフィルターのうちの少なくとも２つは、並列に配置され得る。いくつかの実施形態において、上記第１のデプスフィルター、第２のデプスフィルター、および滅菌グレードの膜を含む第３のフィルターの３つ全てが、並列に配置され得る。上記第１のデプスフィルター、第２のデプスフィルター、および滅菌グレードの膜を含む第３のフィルターの３つ全てが、直列に配置される場合、本明細書で開示される方法の通す工程は、上記細胞溶解物を先ず、上記第１のデプスフィルターに通して第１の細胞抽出物を生成し、次いで、上記第２のデプスフィルターに通して第２の細胞抽出物を生成し、最後に、滅菌グレードの膜を含む上記第３のフィルターに通して第３の細胞抽出物を生成する工程を包含し得る。
【0053】
いくつかの実施形態において、上記細胞溶解物中の固体含有物に基づいて、上記通す工程は、抽出を最適化するために適宜構成され得る。いくつかの実施形態において、上記通す工程は、段階的濾過を含み得る。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解物は、直列に配置されかつ孔サイズを漸減させた少なくとも２つのフィルターを通して濾過され得る。いくつかの実施形態において、フィルター媒体の組成は、よりよい流動、粒子捕捉、および細胞抽出物の品質のために構成され得る。例えば、上記フィルターは、２つのフィルター、第１のフィルターおよび第２のフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記第１のフィルターを使用して、第１の清澄化した細胞溶解物を生成し得、次いで、これを、上記第２のフィルターに通して、第２の清澄化した細胞溶解物、または清澄化した細胞抽出物を生成する。いくつかの実施形態において、上記第１のフィルターは、約１００ミクロン、約５０ミクロン、約３０ミクロン、または約１５ミクロンより大きい粒子を除くまたは保持する孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記第２のフィルターは、約５ミクロン、約２ミクロン、約１ミクロン、約５００ｎｍ、または約２００ｎｍより大きい粒子を除くまたは保持する孔を含み得る。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解物は、上記濾過プロセスを、詰まりにくくしかつフィルター表面積を増加させるために、並列に配置された少なくとも２つのフィルターを通して濾過され得る。いくつかの実施形態において、並列に配置された上記少なくとも２つのフィルターの各々は、同一のフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、同一のフィルターを含む上記少なくとも２つのフィルターは、上記少なくとも２つのフィルターのうちの一方がたとえ詰まっても濾過プロセスが継続し得るように、細胞溶解物と同時に接触させられ得る。
【0054】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記細胞溶解物の特性に応じて、上記細胞抽出物の濾過処理後工程を含み得る。いくつかの実施形態において、上記濾過処理後工程は、上記細胞抽出物を脱塩する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記濾過処理後工程は、上記細胞抽出物を緩衝液交換に供する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記濾過処理後工程は、上記細胞抽出物を透析する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記濾過処理後工程は、上記細胞抽出物をダイアフィルトレーションに供する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記濾過処理後工程は、上記細胞抽出物を凍結する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記濾過処理後工程は、上記細胞抽出物を凍結乾燥する工程を包含し得る。
【0055】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記細胞抽出物とポリペプチドをコードする核酸とを接触させて、反応混合物を生成する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記細胞抽出物は、上記接触させる工程の前に遠心分離を介する清澄化に供されない。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、遠心分離を介する清澄化に供されない。いくつかの実施形態において、上記核酸は、ＲＮＡ翻訳テンプレートを含み得る。いくつかの実施形態において、上記核酸は、外因性ＲＮＡ翻訳テンプレートを含み得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、ＤＮＡ発現テンプレートを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡ発現テンプレートは、上記ポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードし得る。いくつかの実施形態において、上記オープンリーディングフレームは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、上記ＤＮＡ発現テンプレートの転写を指向し得る。
【0056】
いくつかの実施形態において、上記接触させる工程は、上記細胞抽出物に上記ポリペプチドをコードする核酸を添加する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、アミノ酸、ヌクレオチド、塩、補因子、エネルギー源、翻訳テンプレート、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、二価カチオンを含み得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、本明細書で開示される任意の構成成分を含み得る。いくつかの実施形態において、上記接触させる工程は、上記細胞抽出物に、アミノ酸、ヌクレオチド、塩、補因子、エネルギー源、および翻訳テンプレートを含む群から選択される１またはこれより多くのものを添加する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記エネルギー源は、リン酸基を含み得る。いくつかの実施形態において、上記エネルギー源は、非リン酸化エネルギー基を含み得る。上記エネルギー源は、ホスホエノールピルベート、グルタメート、グリセロール、ピルベート、グルコース、およびクレアチンリン酸から選択される１またはこれより多くのものを含み得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物中のヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、酵素補因子を含み得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、代謝産物を含み得る。いくつかの実施形態において、上記代謝産物は、フォリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、コエンザイムＡ、およびシュウ酸ナトリウムを含む群から選択される１またはこれより多くのものを含み得る。
【0057】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、有機アニオンを含み得る。いくつかの実施形態において、上記有機アニオンは、グルタメート、アセテート、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記有機アニオンは、約０ｍＭ～約３００ｍＭの間の濃度、例えば、約０．００１ｍＭ、０．００２ｍＭ、０．００３ｍＭ、０．００４ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００６ｍＭ、０．００７ｍＭ、０．００８ｍＭ、０．００９ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．０１１ｍＭ、０．０１２ｍＭ、０．０１３ｍＭ、０．０１４ｍＭ、０．０１５ｍＭ、０．０１６ｍＭ、０．０１７ｍＭ、０．０１８ｍＭ、０．０１９ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０２１ｍＭ、０．０２２ｍＭ、０．０２３ｍＭ、０．０２４ｍＭ、０．０２５ｍＭ、０．０２６ｍＭ、０．０２７ｍＭ、０．０２８ｍＭ、０．０２９ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．０３１ｍＭ、０．０３２ｍＭ、０．０３３ｍＭ、０．０３４ｍＭ、０．０３５ｍＭ、０．０３６ｍＭ、０．０３７ｍＭ、０．０３８ｍＭ、０．０３９ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０４１ｍＭ、０．０４２ｍＭ、０．０４３ｍＭ、０．０４４ｍＭ、０．０４５ｍＭ、０．０４６ｍＭ、０．０４７ｍＭ、０．０４８ｍＭ、０．０４９ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０５５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０６５ｍＭ、０．０７ｍＭ、０．０７５ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．０８５ｍＭ、０．０９ｍＭ、０．０９５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．１１ｍＭ、０．１２ｍＭ、０．１３ｍＭ、０．１４ｍＭ、０．１５ｍＭ、０．１６ｍＭ、０．１７ｍＭ、０．１８ｍＭ、０．１９ｍＭ、０．２ｍＭ、０．２１ｍＭ、０．２２ｍＭ、０．２３ｍＭ、０．２４ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．２６ｍＭ、０．２７ｍＭ、０．２８ｍＭ、０．２９ｍＭ、０．３ｍＭ、０．３１ｍＭ、０．３２ｍＭ、０．３３ｍＭ、０．３４ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．３６ｍＭ、０．３７ｍＭ、０．３８ｍＭ、０．３９ｍＭ、０．４ｍＭ、０．４１ｍＭ、０．４２ｍＭ、０．４３ｍＭ、０．４４ｍＭ、０．４５ｍＭ、０．４６ｍＭ、０．４７ｍＭ、０．４８ｍＭ、０．４９ｍＭ、０．５ｍＭ、０．５１ｍＭ、０．５２ｍＭ、０．５３ｍＭ、０．５４ｍＭ、０．５５ｍＭ、０．５６ｍＭ、０．５７ｍＭ、０．５８ｍＭ、０．５９ｍＭ、０．６ｍＭ、０．６１ｍＭ、０．６２ｍＭ、０．６３ｍＭ、０．６４ｍＭ、０．６５ｍＭ、０．６６ｍＭ、０．６７ｍＭ、０．６８ｍＭ、０．６９ｍＭ、０．７ｍＭ、０．７１ｍＭ、０．７２ｍＭ、０．７３ｍＭ、０．７４ｍＭ、０．７５ｍＭ、０．７６ｍＭ、０．７７ｍＭ、０．７８ｍＭ、０．７９ｍＭ、０．８ｍＭ、０．８１ｍＭ、０．８２ｍＭ、０．８３ｍＭ、０．８４ｍＭ、０．８５ｍＭ、０．８６ｍＭ、０．８７ｍＭ、０．８８ｍＭ、０．８９ｍＭ、０．９ｍＭ、０．９１ｍＭ、０．９２ｍＭ、０．９３ｍＭ、０．９４ｍＭ、０．９５ｍＭ、０．９６ｍＭ、０．９７ｍＭ、０．９８ｍＭ、０．９９ｍＭ、１ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２ｍＭ、２．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．３ｍＭ、２．４ｍＭ、２．５ｍＭ、２．６ｍＭ、２．７ｍＭ、２．８ｍＭ、２．９ｍＭ、３ｍＭ、３．１ｍＭ、３．２ｍＭ、３．３ｍＭ、３．４ｍＭ、３．５ｍＭ、３．６ｍＭ、３．７ｍＭ、３．８ｍＭ、３．９ｍＭ、４ｍＭ、４．１ｍＭ、４．２ｍＭ、４．３ｍＭ、４．４ｍＭ、４．５ｍＭ、４．６ｍＭ、４．７ｍＭ、４．８ｍＭ、４．９ｍＭ、５ｍＭ、５．１ｍＭ、５．２ｍＭ、５．３ｍＭ、５．４ｍＭ、５．５ｍＭ、５．６ｍＭ、５．７ｍＭ、５．８ｍＭ、５．９ｍＭ、６ｍＭ、６．１ｍＭ、６．２ｍＭ、６．３ｍＭ、６．４ｍＭ、６．５ｍＭ、６．６ｍＭ、６．７ｍＭ、６．８ｍＭ、６．９ｍＭ、７ｍＭ、７．１ｍＭ、７．２ｍＭ、７．３ｍＭ、７．４ｍＭ、７．５ｍＭ、７．６ｍＭ、７．７ｍＭ、７．８ｍＭ、７．９ｍＭ、８ｍＭ、８．１ｍＭ、８．２ｍＭ、８．３ｍＭ、８．４ｍＭ、８．５ｍＭ、８．６ｍＭ、８．７ｍＭ、８．８ｍＭ、８．９ｍＭ、９ｍＭ、９．１ｍＭ、９．２ｍＭ、９．３ｍＭ、９．４ｍＭ、９．５ｍＭ、９．６ｍＭ、９．７ｍＭ、９．８ｍＭ、９．９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、５０ｍＭ、５１ｍＭ、５２ｍＭ、５３ｍＭ、５４ｍＭ、５５ｍＭ、５６ｍＭ、５７ｍＭ、５８ｍＭ、５９ｍＭ、６０ｍＭ、６１ｍＭ、６２ｍＭ、６３ｍＭ、６４ｍＭ、６５ｍＭ、６６ｍＭ、６７ｍＭ、６８ｍＭ、６９ｍＭ、７０ｍＭ、７１ｍＭ、７２ｍＭ、７３ｍＭ、７４ｍＭ、７５ｍＭ、７６ｍＭ、７７ｍＭ、７８ｍＭ、７９ｍＭ、８０ｍＭ、８１ｍＭ、８２ｍＭ、８３ｍＭ、８４ｍＭ、８５ｍＭ、８６ｍＭ、８７ｍＭ、８８ｍＭ、８９ｍＭ、９０ｍＭ、９１ｍＭ、９２ｍＭ、９３ｍＭ、９４ｍＭ、９５ｍＭ、９６ｍＭ、９７ｍＭ、９８ｍＭ、９９ｍＭ、１００ｍＭ、１０５ｍＭ、１１０ｍＭ、１１５ｍＭ、１２０ｍＭ、１２５ｍＭ、１３０ｍＭ、１３５ｍＭ、１４０ｍＭ、１４５ｍＭ、１５０ｍＭ、１５５ｍＭ、１６０ｍＭ、１６５ｍＭ、１７０ｍＭ、１７５ｍＭ、１８０ｍＭ、１８５ｍＭ、１９０ｍＭ、１９５ｍＭ、２００ｍＭ、２０５ｍＭ、２１０ｍＭ、２１５ｍＭ、２２０ｍＭ、２２５ｍＭ、２３０ｍＭ、２３５ｍＭ、２４０ｍＭ、２４５ｍＭ、２５０ｍＭ、２５５ｍＭ、２６０ｍＭ、２６５ｍＭ、２７０ｍＭ、２７５ｍＭ、２８０ｍＭ、２８５ｍＭ、２９０ｍＭ、２９５ｍＭ、もしくは約３００ｍＭ、またはこれらの間の任意の濃度で存在し得る。
【0058】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、ハライドアニオンを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ハライドアニオンは、約０ｍＭ～約３００ｍＭの濃度、例えば、約０．００１ｍＭ、０．００２ｍＭ、０．００３ｍＭ、０．００４ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００６ｍＭ、０．００７ｍＭ、０．００８ｍＭ、０．００９ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．０１１ｍＭ、０．０１２ｍＭ、０．０１３ｍＭ、０．０１４ｍＭ、０．０１５ｍＭ、０．０１６ｍＭ、０．０１７ｍＭ、０．０１８ｍＭ、０．０１９ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０２１ｍＭ、０．０２２ｍＭ、０．０２３ｍＭ、０．０２４ｍＭ、０．０２５ｍＭ、０．０２６ｍＭ、０．０２７ｍＭ、０．０２８ｍＭ、０．０２９ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．０３１ｍＭ、０．０３２ｍＭ、０．０３３ｍＭ、０．０３４ｍＭ、０．０３５ｍＭ、０．０３６ｍＭ、０．０３７ｍＭ、０．０３８ｍＭ、０．０３９ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０４１ｍＭ、０．０４２ｍＭ、０．０４３ｍＭ、０．０４４ｍＭ、０．０４５ｍＭ、０．０４６ｍＭ、０．０４７ｍＭ、０．０４８ｍＭ、０．０４９ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０５５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０６５ｍＭ、０．０７ｍＭ、０．０７５ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．０８５ｍＭ、０．０９ｍＭ、０．０９５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．１１ｍＭ、０．１２ｍＭ、０．１３ｍＭ、０．１４ｍＭ、０．１５ｍＭ、０．１６ｍＭ、０．１７ｍＭ、０．１８ｍＭ、０．１９ｍＭ、０．２ｍＭ、０．２１ｍＭ、０．２２ｍＭ、０．２３ｍＭ、０．２４ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．２６ｍＭ、０．２７ｍＭ、０．２８ｍＭ、０．２９ｍＭ、０．３ｍＭ、０．３１ｍＭ、０．３２ｍＭ、０．３３ｍＭ、０．３４ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．３６ｍＭ、０．３７ｍＭ、０．３８ｍＭ、０．３９ｍＭ、０．４ｍＭ、０．４１ｍＭ、０．４２ｍＭ、０．４３ｍＭ、０．４４ｍＭ、０．４５ｍＭ、０．４６ｍＭ、０．４７ｍＭ、０．４８ｍＭ、０．４９ｍＭ、０．５ｍＭ、０．５１ｍＭ、０．５２ｍＭ、０．５３ｍＭ、０．５４ｍＭ、０．５５ｍＭ、０．５６ｍＭ、０．５７ｍＭ、０．５８ｍＭ、０．５９ｍＭ、０．６ｍＭ、０．６１ｍＭ、０．６２ｍＭ、０．６３ｍＭ、０．６４ｍＭ、０．６５ｍＭ、０．６６ｍＭ、０．６７ｍＭ、０．６８ｍＭ、０．６９ｍＭ、０．７ｍＭ、０．７１ｍＭ、０．７２ｍＭ、０．７３ｍＭ、０．７４ｍＭ、０．７５ｍＭ、０．７６ｍＭ、０．７７ｍＭ、０．７８ｍＭ、０．７９ｍＭ、０．８ｍＭ、０．８１ｍＭ、０．８２ｍＭ、０．８３ｍＭ、０．８４ｍＭ、０．８５ｍＭ、０．８６ｍＭ、０．８７ｍＭ、０．８８ｍＭ、０．８９ｍＭ、０．９ｍＭ、０．９１ｍＭ、０．９２ｍＭ、０．９３ｍＭ、０．９４ｍＭ、０．９５ｍＭ、０．９６ｍＭ、０．９７ｍＭ、０．９８ｍＭ、０．９９ｍＭ、１ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２ｍＭ、２．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．３ｍＭ、２．４ｍＭ、２．５ｍＭ、２．６ｍＭ、２．７ｍＭ、２．８ｍＭ、２．９ｍＭ、３ｍＭ、３．１ｍＭ、３．２ｍＭ、３．３ｍＭ、３．４ｍＭ、３．５ｍＭ、３．６ｍＭ、３．７ｍＭ、３．８ｍＭ、３．９ｍＭ、４ｍＭ、４．１ｍＭ、４．２ｍＭ、４．３ｍＭ、４．４ｍＭ、４．５ｍＭ、４．６ｍＭ、４．７ｍＭ、４．８ｍＭ、４．９ｍＭ、５ｍＭ、５．１ｍＭ、５．２ｍＭ、５．３ｍＭ、５．４ｍＭ、５．５ｍＭ、５．６ｍＭ、５．７ｍＭ、５．８ｍＭ、５．９ｍＭ、６ｍＭ、６．１ｍＭ、６．２ｍＭ、６．３ｍＭ、６．４ｍＭ、６．５ｍＭ、６．６ｍＭ、６．７ｍＭ、６．８ｍＭ、６．９ｍＭ、７ｍＭ、７．１ｍＭ、７．２ｍＭ、７．３ｍＭ、７．４ｍＭ、７．５ｍＭ、７．６ｍＭ、７．７ｍＭ、７．８ｍＭ、７．９ｍＭ、８ｍＭ、８．１ｍＭ、８．２ｍＭ、８．３ｍＭ、８．４ｍＭ、８．５ｍＭ、８．６ｍＭ、８．７ｍＭ、８．８ｍＭ、８．９ｍＭ、９ｍＭ、９．１ｍＭ、９．２ｍＭ、９．３ｍＭ、９．４ｍＭ、９．５ｍＭ、９．６ｍＭ、９．７ｍＭ、９．８ｍＭ、９．９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、５０ｍＭ、５１ｍＭ、５２ｍＭ、５３ｍＭ、５４ｍＭ、５５ｍＭ、５６ｍＭ、５７ｍＭ、５８ｍＭ、５９ｍＭ、６０ｍＭ、６１ｍＭ、６２ｍＭ、６３ｍＭ、６４ｍＭ、６５ｍＭ、６６ｍＭ、６７ｍＭ、６８ｍＭ、６９ｍＭ、７０ｍＭ、７１ｍＭ、７２ｍＭ、７３ｍＭ、７４ｍＭ、７５ｍＭ、７６ｍＭ、７７ｍＭ、７８ｍＭ、７９ｍＭ、８０ｍＭ、８１ｍＭ、８２ｍＭ、８３ｍＭ、８４ｍＭ、８５ｍＭ、８６ｍＭ、８７ｍＭ、８８ｍＭ、８９ｍＭ、９０ｍＭ、９１ｍＭ、９２ｍＭ、９３ｍＭ、９４ｍＭ、９５ｍＭ、９６ｍＭ、９７ｍＭ、９８ｍＭ、９９ｍＭ、１００ｍＭ、１０５ｍＭ、１１０ｍＭ、１１５ｍＭ、１２０ｍＭ、１２５ｍＭ、１３０ｍＭ、１３５ｍＭ、１４０ｍＭ、１４５ｍＭ、１５０ｍＭ、１５５ｍＭ、１６０ｍＭ、１６５ｍＭ、１７０ｍＭ、１７５ｍＭ、１８０ｍＭ、１８５ｍＭ、１９０ｍＭ、１９５ｍＭ、２００ｍＭ、２０５ｍＭ、２１０ｍＭ、２１５ｍＭ、２２０ｍＭ、２２５ｍＭ、２３０ｍＭ、２３５ｍＭ、２４０ｍＭ、２４５ｍＭ、２５０ｍＭ、２５５ｍＭ、２６０ｍＭ、２６５ｍＭ、２７０ｍＭ、２７５ｍＭ、２８０ｍＭ、２８５ｍＭ、２９０ｍＭ、２９５ｍＭ、もしくは約３００ｍＭ、またはこれらの間の任意の濃度の濃度で存在し得る。
【0059】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、有機カチオンを含み得る。いくつかの実施形態において、上記有機カチオンは、ポリアミンを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ポリアミンは、スペルミジン、プトレシン、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記有機カチオンは、約０ｍＭ～約３ｍＭの間の濃度、例えば、約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、１１ｎＭ、１２ｎＭ、１３ｎＭ、１４ｎＭ、１５ｎＭ、１６ｎＭ、１７ｎＭ、１８ｎＭ、１９ｎＭ、２０ｎＭ、２１ｎＭ、２２ｎＭ、２３ｎＭ、２４ｎＭ、２５ｎＭ、２６ｎＭ、２７ｎＭ、２８ｎＭ、２９ｎＭ、３０ｎＭ、３１ｎＭ、３２ｎＭ、３３ｎＭ、３４ｎＭ、３５ｎＭ、３６ｎＭ、３７ｎＭ、３８ｎＭ、３９ｎＭ、４０ｎＭ、４１ｎＭ、４２ｎＭ、４３ｎＭ、４４ｎＭ、４５ｎＭ、４６ｎＭ、４７ｎＭ、４８ｎＭ、４９ｎＭ、５０ｎＭ、５１ｎＭ、５２ｎＭ、５３ｎＭ、５４ｎＭ、５５ｎＭ、５６ｎＭ、５７ｎＭ、５８ｎＭ、５９ｎＭ、６０ｎＭ、６１ｎＭ、６２ｎＭ、６３ｎＭ、６４ｎＭ、６５ｎＭ、６６ｎＭ、６７ｎＭ、６８ｎＭ、６９ｎＭ、７０ｎＭ、７１ｎＭ、７２ｎＭ、７３ｎＭ、７４ｎＭ、７５ｎＭ、７６ｎＭ、７７ｎＭ、７８ｎＭ、７９ｎＭ、８０ｎＭ、８１ｎＭ、８２ｎＭ、８３ｎＭ、８４ｎＭ、８５ｎＭ、８６ｎＭ、８７ｎＭ、８８ｎＭ、８９ｎＭ、９０ｎＭ、９１ｎＭ、９２ｎＭ、９３ｎＭ、９４ｎＭ、９５ｎＭ、９６ｎＭ、９７ｎＭ、９８ｎＭ、９９ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭ、１５０ｎＭ、１６０ｎＭ、１７０ｎＭ、１８０ｎＭ、１９０ｎＭ、２００ｎＭ、２１０ｎＭ、２２０ｎＭ、２３０ｎＭ、２４０ｎＭ、２５０ｎＭ、２６０ｎＭ、２７０ｎＭ、２８０ｎＭ、２９０ｎＭ、３００ｎＭ、３１０ｎＭ、３２０ｎＭ、３３０ｎＭ、３４０ｎＭ、３５０ｎＭ、３６０ｎＭ、３７０ｎＭ、３８０ｎＭ、３９０ｎＭ、４００ｎＭ、４１０ｎＭ、４２０ｎＭ、４３０ｎＭ、４４０ｎＭ、４５０ｎＭ、４６０ｎＭ、４７０ｎＭ、４８０ｎＭ、４９０ｎＭ、５００ｎＭ、５１０ｎＭ、５２０ｎＭ、５３０ｎＭ、５４０ｎＭ、５５０ｎＭ、５６０ｎＭ、５７０ｎＭ、５８０ｎＭ、５９０ｎＭ、６００ｎＭ、６１０ｎＭ、６２０ｎＭ、６３０ｎＭ、６４０ｎＭ、６５０ｎＭ、６６０ｎＭ、６７０ｎＭ、６８０ｎＭ、６９０ｎＭ、７００ｎＭ、７１０ｎＭ、７２０ｎＭ、７３０ｎＭ、７４０ｎＭ、７５０ｎＭ、７６０ｎＭ、７７０ｎＭ、７８０ｎＭ、７９０ｎＭ、８００ｎＭ、８１０ｎＭ、８２０ｎＭ、８３０ｎＭ、８４０ｎＭ、８５０ｎＭ、８６０ｎＭ、８７０ｎＭ、８８０ｎＭ、８９０ｎＭ、９００ｎＭ、９１０ｎＭ、９２０ｎＭ、９３０ｎＭ、９４０ｎＭ、９５０ｎＭ、９６０ｎＭ、９７０ｎＭ、９８０ｎＭ、９９０ｎＭ、１μＭ、１．１μＭ、１．２μＭ、１．３μＭ、１．４μＭ、１．５μＭ、１．６μＭ、１．７μＭ、１．８μＭ、１．９μＭ、２μＭ、２．１μＭ、２．２μＭ、２．３μＭ、２．４μＭ、２．５μＭ、２．６μＭ、２．７μＭ、２．８μＭ、２．９μＭ、３μＭ、３．１μＭ、３．２μＭ、３．３μＭ、３．４μＭ、３．５μＭ、３．６μＭ、３．７μＭ、３．８μＭ、３．９μＭ、４μＭ、４．１μＭ、４．２μＭ、４．３μＭ、４．４μＭ、４．５μＭ、４．６μＭ、４．７μＭ、４．８μＭ、４．９μＭ、５μＭ、５．１μＭ、５．２μＭ、５．３μＭ、５．４μＭ、５．５μＭ、５．６μＭ、５．７μＭ、５．８μＭ、５．９μＭ、６μＭ、６．１μＭ、６．２μＭ、６．３μＭ、６．４μＭ、６．５μＭ、６．６μＭ、６．７μＭ、６．８μＭ、６．９μＭ、７μＭ、７．１μＭ、７．２μＭ、７．３μＭ、７．４μＭ、７．５μＭ、７．６μＭ、７．７μＭ、７．８μＭ、７．９μＭ、８μＭ、８．１μＭ、８．２μＭ、８．３μＭ、８．４μＭ、８．５μＭ、８．６μＭ、８．７μＭ、８．８μＭ、８．９μＭ、９μＭ、９．１μＭ、９．２μＭ、９．３μＭ、９．４μＭ、９．５μＭ、９．６μＭ、９．７μＭ、９．８μＭ、９．９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２１μＭ、２２μＭ、２３μＭ、２４μＭ、２５μＭ、２６μＭ、２７μＭ、２８μＭ、２９μＭ、３０μＭ、３１μＭ、３２μＭ、３３μＭ、３４μＭ、３５μＭ、３６μＭ、３７μＭ、３８μＭ、３９μＭ、４０μＭ、４１μＭ、４２μＭ、４３μＭ、４４μＭ、４５μＭ、４６μＭ、４７μＭ、４８μＭ、４９μＭ、５０μＭ、５１μＭ、５２μＭ、５３μＭ、５４μＭ、５５μＭ、５６μＭ、５７μＭ、５８μＭ、５９μＭ、６０μＭ、６１μＭ、６２μＭ、６３μＭ、６４μＭ、６５μＭ、６６μＭ、６７μＭ、６８μＭ、６９μＭ、７０μＭ、７１μＭ、７２μＭ、７３μＭ、７４μＭ、７５μＭ、７６μＭ、７７μＭ、７８μＭ、７９μＭ、８０μＭ、８１μＭ、８２μＭ、８３μＭ、８４μＭ、８５μＭ、８６μＭ、８７μＭ、８８μＭ、８９μＭ、９０μＭ、９１μＭ、９２μＭ、９３μＭ、９４μＭ、９５μＭ、９６μＭ、９７μＭ、９８μＭ、９９μＭ、１００μＭ、１１０μＭ、１２０μＭ、１３０μＭ、１４０μＭ、１５０μＭ、１６０μＭ、１７０μＭ、１８０μＭ、１９０μＭ、２００μＭ、２１０μＭ、２２０μＭ、２３０μＭ、２４０μＭ、２５０μＭ、２６０μＭ、２７０μＭ、２８０μＭ、２９０μＭ、３００μＭ、３１０μＭ、３２０μＭ、３３０μＭ、３４０μＭ、３５０μＭ、３６０μＭ、３７０μＭ、３８０μＭ、３９０μＭ、４００μＭ、４１０μＭ、４２０μＭ、４３０μＭ、４４０μＭ、４５０μＭ、４６０μＭ、４７０μＭ、４８０μＭ、４９０μＭ、５００μＭ、５１０μＭ、５２０μＭ、５３０μＭ、５４０μＭ、５５０μＭ、５６０μＭ、５７０μＭ、５８０μＭ、５９０μＭ、６００μＭ、６１０μＭ、６２０μＭ、６３０μＭ、６４０μＭ、６５０μＭ、６６０μＭ、６７０μＭ、６８０μＭ、６９０μＭ、７００μＭ、７１０μＭ、７２０μＭ、７３０μＭ、７４０μＭ、７５０μＭ、７６０μＭ、７７０μＭ、７８０μＭ、７９０μＭ、８００μＭ、８１０μＭ、８２０μＭ、８３０μＭ、８４０μＭ、８５０μＭ、８６０μＭ、８７０μＭ、８８０μＭ、８９０μＭ、９００μＭ、９１０μＭ、９２０μＭ、９３０μＭ、９４０μＭ、９５０μＭ、９６０μＭ、９７０μＭ、９８０μＭ、９９０μＭ、１０００μＭ、１．０５ｍＭ、１．１ｍＭ、１．１５ｍＭ、１．２ｍＭ、１．２５ｍＭ、１．３ｍＭ、１．３５ｍＭ、１．４ｍＭ、１．４５ｍＭ、１．５ｍＭ、１．５５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．６５ｍＭ、１．７ｍＭ、１．７５ｍＭ、１．８ｍＭ、１．８５ｍＭ、１．９ｍＭ、１．９５ｍＭ、２ｍＭ、２．０５ｍＭ、２．１ｍＭ、２．１５ｍＭ、２．２ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．３ｍＭ、２．３５ｍＭ、２．４ｍＭ、２．４５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．５５ｍＭ、２．６ｍＭ、２．６５ｍＭ、２．７ｍＭ、２．７５ｍＭ、２．８ｍＭ、２．８５ｍＭ、２．９ｍＭ、２．９５ｍＭ、もしくは約３ｍＭ、またはこれらの間の任意の濃度で存在し得る。
【0060】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、無機カチオンを含み得る。いくつかの実施形態において、上記無機カチオンは、一価カチオンを含み得る。いくつかの実施形態において、上記一価カチオンは、ナトリウム、カリウム、リチウム、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記無機カチオンは、二価カチオンを含み得る。いくつかの実施形態において、上記二価カチオンは、マグネシウム、カルシウム、マンガン、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記二価カチオンはマグネシウムを含む。いくつかの実施形態において、上記マグネシウムは、約１ｍＭ～約５０ｍＭの間の濃度、例えば、約１ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２ｍＭ、２．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．３ｍＭ、２．４ｍＭ、２．５ｍＭ、２．６ｍＭ、２．７ｍＭ、２．８ｍＭ、２．９ｍＭ、３ｍＭ、３．１ｍＭ、３．２ｍＭ、３．３ｍＭ、３．４ｍＭ、３．５ｍＭ、３．６ｍＭ、３．７ｍＭ、３．８ｍＭ、３．９ｍＭ、４ｍＭ、４．１ｍＭ、４．２ｍＭ、４．３ｍＭ、４．４ｍＭ、４．５ｍＭ、４．６ｍＭ、４．７ｍＭ、４．８ｍＭ、４．９ｍＭ、５ｍＭ、５．１ｍＭ、５．２ｍＭ、５．３ｍＭ、５．４ｍＭ、５．５ｍＭ、５．６ｍＭ、５．７ｍＭ、５．８ｍＭ、５．９ｍＭ、６ｍＭ、６．１ｍＭ、６．２ｍＭ、６．３ｍＭ、６．４ｍＭ、６．５ｍＭ、６．６ｍＭ、６．７ｍＭ、６．８ｍＭ、６．９ｍＭ、７ｍＭ、７．１ｍＭ、７．２ｍＭ、７．３ｍＭ、７．４ｍＭ、７．５ｍＭ、７．６ｍＭ、７．７ｍＭ、７．８ｍＭ、７．９ｍＭ、８ｍＭ、８．１ｍＭ、８．２ｍＭ、８．３ｍＭ、８．４ｍＭ、８．５ｍＭ、８．６ｍＭ、８．７ｍＭ、８．８ｍＭ、８．９ｍＭ、９ｍＭ、９．１ｍＭ、９．２ｍＭ、９．３ｍＭ、９．４ｍＭ、９．５ｍＭ、９．６ｍＭ、９．７ｍＭ、９．８ｍＭ、９．９ｍＭ、１０ｍＭ、１０．１ｍＭ、１０．２ｍＭ、１０．３ｍＭ、１０．４ｍＭ、１０．５ｍＭ、１０．６ｍＭ、１０．７ｍＭ、１０．８ｍＭ、１０．９ｍＭ、１１ｍＭ、１１．１ｍＭ、１１．２ｍＭ、１１．３ｍＭ、１１．４ｍＭ、１１．５ｍＭ、１１．６ｍＭ、１１．７ｍＭ、１１．８ｍＭ、１１．９ｍＭ、１２ｍＭ、１２．１ｍＭ、１２．２ｍＭ、１２．３ｍＭ、１２．４ｍＭ、１２．５ｍＭ、１２．６ｍＭ、１２．７ｍＭ、１２．８ｍＭ、１２．９ｍＭ、１３ｍＭ、１３．１ｍＭ、１３．２ｍＭ、１３．３ｍＭ、１３．４ｍＭ、１３．５ｍＭ、１３．６ｍＭ、１３．７ｍＭ、１３．８ｍＭ、１３．９ｍＭ、１４ｍＭ、１４．１ｍＭ、１４．２ｍＭ、１４．３ｍＭ、１４．４ｍＭ、１４．５ｍＭ、１４．６ｍＭ、１４．７ｍＭ、１４．８ｍＭ、１４．９ｍＭ、１５ｍＭ、１５．１ｍＭ、１５．２ｍＭ、１５．３ｍＭ、１５．４ｍＭ、１５．５ｍＭ、１５．６ｍＭ、１５．７ｍＭ、１５．８ｍＭ、１５．９ｍＭ、１６ｍＭ、１６．１ｍＭ、１６．２ｍＭ、１６．３ｍＭ、１６．４ｍＭ、１６．５ｍＭ、１６．６ｍＭ、１６．７ｍＭ、１６．８ｍＭ、１６．９ｍＭ、１７ｍＭ、１７．１ｍＭ、１７．２ｍＭ、１７．３ｍＭ、１７．４ｍＭ、１７．５ｍＭ、１７．６ｍＭ、１７．７ｍＭ、１７．８ｍＭ、１７．９ｍＭ、１８ｍＭ、１８．１ｍＭ、１８．２ｍＭ、１８．３ｍＭ、１８．４ｍＭ、１８．５ｍＭ、１８．６ｍＭ、１８．７ｍＭ、１８．８ｍＭ、１８．９ｍＭ、１９ｍＭ、１９．１ｍＭ、１９．２ｍＭ、１９．３ｍＭ、１９．４ｍＭ、１９．５ｍＭ、１９．６ｍＭ、１９．７ｍＭ、１９．８ｍＭ、１９．９ｍＭ、２０ｍＭ、２０．１ｍＭ、２０．２ｍＭ、２０．３ｍＭ、２０．４ｍＭ、２０．５ｍＭ、２０．６ｍＭ、２０．７ｍＭ、２０．８ｍＭ、２０．９ｍＭ、２１ｍＭ、２１．１ｍＭ、２１．２ｍＭ、２１．３ｍＭ、２１．４ｍＭ、２１．５ｍＭ、２１．６ｍＭ、２１．７ｍＭ、２１．８ｍＭ、２１．９ｍＭ、２２ｍＭ、２２．１ｍＭ、２２．２ｍＭ、２２．３ｍＭ、２２．４ｍＭ、２２．５ｍＭ、２２．６ｍＭ、２２．７ｍＭ、２２．８ｍＭ、２２．９ｍＭ、２３ｍＭ、２３．１ｍＭ、２３．２ｍＭ、２３．３ｍＭ、２３．４ｍＭ、２３．５ｍＭ、２３．６ｍＭ、２３．７ｍＭ、２３．８ｍＭ、２３．９ｍＭ、２４ｍＭ、２４．１ｍＭ、２４．２ｍＭ、２４．３ｍＭ、２４．４ｍＭ、２４．５ｍＭ、２４．６ｍＭ、２４．７ｍＭ、２４．８ｍＭ、２４．９ｍＭ、２５ｍＭ、２５．１ｍＭ、２５．２ｍＭ、２５．３ｍＭ、２５．４ｍＭ、２５．５ｍＭ、２５．６ｍＭ、２５．７ｍＭ、２５．８ｍＭ、２５．９ｍＭ、２６ｍＭ、２６．１ｍＭ、２６．２ｍＭ、２６．３ｍＭ、２６．４ｍＭ、２６．５ｍＭ、２６．６ｍＭ、２６．７ｍＭ、２６．８ｍＭ、２６．９ｍＭ、２７ｍＭ、２７．１ｍＭ、２７．２ｍＭ、２７．３ｍＭ、２７．４ｍＭ、２７．５ｍＭ、２７．６ｍＭ、２７．７ｍＭ、２７．８ｍＭ、２７．９ｍＭ、２８ｍＭ、２８．１ｍＭ、２８．２ｍＭ、２８．３ｍＭ、２８．４ｍＭ、２８．５ｍＭ、２８．６ｍＭ、２８．７ｍＭ、２８．８ｍＭ、２８．９ｍＭ、２９ｍＭ、２９．１ｍＭ、２９．２ｍＭ、２９．３ｍＭ、２９．４ｍＭ、２９．５ｍＭ、２９．６ｍＭ、２９．７ｍＭ、２９．８ｍＭ、２９．９ｍＭ、３０ｍＭ、３０．１ｍＭ、３０．２ｍＭ、３０．３ｍＭ、３０．４ｍＭ、３０．５ｍＭ、３０．６ｍＭ、３０．７ｍＭ、３０．８ｍＭ、３０．９ｍＭ、３１ｍＭ、３１．１ｍＭ、３１．２ｍＭ、３１．３ｍＭ、３１．４ｍＭ、３１．５ｍＭ、３１．６ｍＭ、３１．７ｍＭ、３１．８ｍＭ、３１．９ｍＭ、３２ｍＭ、３２．１ｍＭ、３２．２ｍＭ、３２．３ｍＭ、３２．４ｍＭ、３２．５ｍＭ、３２．６ｍＭ、３２．７ｍＭ、３２．８ｍＭ、３２．９ｍＭ、３３ｍＭ、３３．１ｍＭ、３３．２ｍＭ、３３．３ｍＭ、３３．４ｍＭ、３３．５ｍＭ、３３．６ｍＭ、３３．７ｍＭ、３３．８ｍＭ、３３．９ｍＭ、３４ｍＭ、３４．１ｍＭ、３４．２ｍＭ、３４．３ｍＭ、３４．４ｍＭ、３４．５ｍＭ、３４．６ｍＭ、３４．７ｍＭ、３４．８ｍＭ、３４．９ｍＭ、３５ｍＭ、３５．１ｍＭ、３５．２ｍＭ、３５．３ｍＭ、３５．４ｍＭ、３５．５ｍＭ、３５．６ｍＭ、３５．７ｍＭ、３５．８ｍＭ、３５．９ｍＭ、３６ｍＭ、３６．１ｍＭ、３６．２ｍＭ、３６．３ｍＭ、３６．４ｍＭ、３６．５ｍＭ、３６．６ｍＭ、３６．７ｍＭ、３６．８ｍＭ、３６．９ｍＭ、３７ｍＭ、３７．１ｍＭ、３７．２ｍＭ、３７．３ｍＭ、３７．４ｍＭ、３７．５ｍＭ、３７．６ｍＭ、３７．７ｍＭ、３７．８ｍＭ、３７．９ｍＭ、３８ｍＭ、３８．１ｍＭ、３８．２ｍＭ、３８．３ｍＭ、３８．４ｍＭ、３８．５ｍＭ、３８．６ｍＭ、３８．７ｍＭ、３８．８ｍＭ、３８．９ｍＭ、３９ｍＭ、３９．１ｍＭ、３９．２ｍＭ、３９．３ｍＭ、３９．４ｍＭ、３９．５ｍＭ、３９．６ｍＭ、３９．７ｍＭ、３９．８ｍＭ、３９．９ｍＭ、４０ｍＭ、４０．１ｍＭ、４０．２ｍＭ、４０．３ｍＭ、４０．４ｍＭ、４０．５ｍＭ、４０．６ｍＭ、４０．７ｍＭ、４０．８ｍＭ、４０．９ｍＭ、４１ｍＭ、４１．１ｍＭ、４１．２ｍＭ、４１．３ｍＭ、４１．４ｍＭ、４１．５ｍＭ、４１．６ｍＭ、４１．７ｍＭ、４１．８ｍＭ、４１．９ｍＭ、４２ｍＭ、４２．１ｍＭ、４２．２ｍＭ、４２．３ｍＭ、４２．４ｍＭ、４２．５ｍＭ、４２．６ｍＭ、４２．７ｍＭ、４２．８ｍＭ、４２．９ｍＭ、４３ｍＭ、４３．１ｍＭ、４３．２ｍＭ、４３．３ｍＭ、４３．４ｍＭ、４３．５ｍＭ、４３．６ｍＭ、４３．７ｍＭ、４３．８ｍＭ、４３．９ｍＭ、４４ｍＭ、４４．１ｍＭ、４４．２ｍＭ、４４．３ｍＭ、４４．４ｍＭ、４４．５ｍＭ、４４．６ｍＭ、４４．７ｍＭ、４４．８ｍＭ、４４．９ｍＭ、４５ｍＭ、４５．１ｍＭ、４５．２ｍＭ、４５．３ｍＭ、４５．４ｍＭ、４５．５ｍＭ、４５．６ｍＭ、４５．７ｍＭ、４５．８ｍＭ、４５．９ｍＭ、４６ｍＭ、４６．１ｍＭ、４６．２ｍＭ、４６．３ｍＭ、４６．４ｍＭ、４６．５ｍＭ、４６．６ｍＭ、４６．７ｍＭ、４６．８ｍＭ、４６．９ｍＭ、４７ｍＭ、４７．１ｍＭ、４７．２ｍＭ、４７．３ｍＭ、４７．４ｍＭ、４７．５ｍＭ、４７．６ｍＭ、４７．７ｍＭ、４７．８ｍＭ、４７．９ｍＭ、４８ｍＭ、４８．１ｍＭ、４８．２ｍＭ、４８．３ｍＭ、４８．４ｍＭ、４８．５ｍＭ、４８．６ｍＭ、４８．７ｍＭ、４８．８ｍＭ、４８．９ｍＭ、４９ｍＭ、４９．１ｍＭ、４９．２ｍＭ、４９．３ｍＭ、４９．４ｍＭ、４９．５ｍＭ、４９．６ｍＭ、４９．７ｍＭ、４９．８ｍＭ、４９．９ｍＭ、もしくは約５０ｍＭ、またはこれらの間の任意の濃度で存在し得る。
【0061】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、内因性ヌクレオチド、すなわち、上記細胞抽出物中に存在し、上記細胞から得られるヌクレオチド（例えば、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ））を含み得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、外因性ヌクレオチド、すなわち、上記細胞抽出物に添加されるヌクレオチド（例えば、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）、またはヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ））を含み得る。いくつかの実施形態において、上記ヌクレオチドは、ＮＴＰ、例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ヌクレオチドは、ＮＭＰ、例えば、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、ＮＴＰｓ、ＮＤＰｓおよびＮＭＰｓの組み合わせを含み得る。例えば、上記反応混合物は、ＮＴＰｓおよびＮＤＰｓの混合物、ＮＴＰｓおよびＮＭＰｓの混合物、ＮＤＰｓおよびＮＭＰｓの混合物、またはＮＴＰｓ、ＮＤＰｓおよびＮＭＰｓの混合物を含み得る。
【0062】
いくつかの実施形態において、各ＮＴＰ、例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、またはＵＴＰは、約０．１ｍＭ～約５ｍＭの間の濃度、例えば、約０．１ｍＭ、０．１１ｍＭ、０．１２ｍＭ、０．１３ｍＭ、０．１４ｍＭ、０．１５ｍＭ、０．１６ｍＭ、０．１７ｍＭ、０．１８ｍＭ、０．１９ｍＭ、０．２ｍＭ、０．２１ｍＭ、０．２２ｍＭ、０．２３ｍＭ、０．２４ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．２６ｍＭ、０．２７ｍＭ、０．２８ｍＭ、０．２９ｍＭ、０．３ｍＭ、０．３１ｍＭ、０．３２ｍＭ、０．３３ｍＭ、０．３４ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．３６ｍＭ、０．３７ｍＭ、０．３８ｍＭ、０．３９ｍＭ、０．４ｍＭ、０．４１ｍＭ、０．４２ｍＭ、０．４３ｍＭ、０．４４ｍＭ、０．４５ｍＭ、０．４６ｍＭ、０．４７ｍＭ、０．４８ｍＭ、０．４９ｍＭ、０．５ｍＭ、０．５１ｍＭ、０．５２ｍＭ、０．５３ｍＭ、０．５４ｍＭ、０．５５ｍＭ、０．５６ｍＭ、０．５７ｍＭ、０．５８ｍＭ、０．５９ｍＭ、０．６ｍＭ、０．６１ｍＭ、０．６２ｍＭ、０．６３ｍＭ、０．６４ｍＭ、０．６５ｍＭ、０．６６ｍＭ、０．６７ｍＭ、０．６８ｍＭ、０．６９ｍＭ、０．７ｍＭ、０．７１ｍＭ、０．７２ｍＭ、０．７３ｍＭ、０．７４ｍＭ、０．７５ｍＭ、０．７６ｍＭ、０．７７ｍＭ、０．７８ｍＭ、０．７９ｍＭ、０．８ｍＭ、０．８１ｍＭ、０．８２ｍＭ、０．８３ｍＭ、０．８４ｍＭ、０．８５ｍＭ、０．８６ｍＭ、０．８７ｍＭ、０．８８ｍＭ、０．８９ｍＭ、０．９ｍＭ、０．９１ｍＭ、０．９２ｍＭ、０．９３ｍＭ、０．９４ｍＭ、０．９５ｍＭ、０．９６ｍＭ、０．９７ｍＭ、０．９８ｍＭ、０．９９ｍＭ、１ｍＭ、１．０１ｍＭ、１．０２ｍＭ、１．０３ｍＭ、１．０４ｍＭ、１．０５ｍＭ、１．０６ｍＭ、１．０７ｍＭ、１．０８ｍＭ、１．０９ｍＭ、１．１ｍＭ、１．１１ｍＭ、１．１２ｍＭ、１．１３ｍＭ、１．１４ｍＭ、１．１５ｍＭ、１．１６ｍＭ、１．１７ｍＭ、１．１８ｍＭ、１．１９ｍＭ、１．２ｍＭ、１．２１ｍＭ、１．２２ｍＭ、１．２３ｍＭ、１．２４ｍＭ、１．２５ｍＭ、１．２６ｍＭ、１．２７ｍＭ、１．２８ｍＭ、１．２９ｍＭ、１．３ｍＭ、１．３１ｍＭ、１．３２ｍＭ、１．３３ｍＭ、１．３４ｍＭ、１．３５ｍＭ、１．３６ｍＭ、１．３７ｍＭ、１．３８ｍＭ、１．３９ｍＭ、１．４ｍＭ、１．４１ｍＭ、１．４２ｍＭ、１．４３ｍＭ、１．４４ｍＭ、１．４５ｍＭ、１．４６ｍＭ、１．４７ｍＭ、１．４８ｍＭ、１．４９ｍＭ、１．５ｍＭ、１．５１ｍＭ、１．５２ｍＭ、１．５３ｍＭ、１．５４ｍＭ、１．５５ｍＭ、１．５６ｍＭ、１．５７ｍＭ、１．５８ｍＭ、１．５９ｍＭ、１．６ｍＭ、１．６１ｍＭ、１．６２ｍＭ、１．６３ｍＭ、１．６４ｍＭ、１．６５ｍＭ、１．６６ｍＭ、１．６７ｍＭ、１．６８ｍＭ、１．６９ｍＭ、１．７ｍＭ、１．７１ｍＭ、１．７２ｍＭ、１．７３ｍＭ、１．７４ｍＭ、１．７５ｍＭ、１．７６ｍＭ、１．７７ｍＭ、１．７８ｍＭ、１．７９ｍＭ、１．８ｍＭ、１．８１ｍＭ、１．８２ｍＭ、１．８３ｍＭ、１．８４ｍＭ、１．８５ｍＭ、１．８６ｍＭ、１．８７ｍＭ、１．８８ｍＭ、１．８９ｍＭ、１．９ｍＭ、１．９１ｍＭ、１．９２ｍＭ、１．９３ｍＭ、１．９４ｍＭ、１．９５ｍＭ、１．９６ｍＭ、１．９７ｍＭ、１．９８ｍＭ、１．９９ｍＭ、２ｍＭ、２．０１ｍＭ、２．０２ｍＭ、２．０３ｍＭ、２．０４ｍＭ、２．０５ｍＭ、２．０６ｍＭ、２．０７ｍＭ、２．０８ｍＭ、２．０９ｍＭ、２．１ｍＭ、２．１１ｍＭ、２．１２ｍＭ、２．１３ｍＭ、２．１４ｍＭ、２．１５ｍＭ、２．１６ｍＭ、２．１７ｍＭ、２．１８ｍＭ、２．１９ｍＭ、２．２ｍＭ、２．２１ｍＭ、２．２２ｍＭ、２．２３ｍＭ、２．２４ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．２６ｍＭ、２．２７ｍＭ、２．２８ｍＭ、２．２９ｍＭ、２．３ｍＭ、２．３１ｍＭ、２．３２ｍＭ、２．３３ｍＭ、２．３４ｍＭ、２．３５ｍＭ、２．３６ｍＭ、２．３７ｍＭ、２．３８ｍＭ、２．３９ｍＭ、２．４ｍＭ、２．４１ｍＭ、２．４２ｍＭ、２．４３ｍＭ、２．４４ｍＭ、２．４５ｍＭ、２．４６ｍＭ、２．４７ｍＭ、２．４８ｍＭ、２．４９ｍＭ、２．５ｍＭ、２．５１ｍＭ、２．５２ｍＭ、２．５３ｍＭ、２．５４ｍＭ、２．５５ｍＭ、２．５６ｍＭ、２．５７ｍＭ、２．５８ｍＭ、２．５９ｍＭ、２．６ｍＭ、２．６１ｍＭ、２．６２ｍＭ、２．６３ｍＭ、２．６４ｍＭ、２．６５ｍＭ、２．６６ｍＭ、２．６７ｍＭ、２．６８ｍＭ、２．６９ｍＭ、２．７ｍＭ、２．７１ｍＭ、２．７２ｍＭ、２．７３ｍＭ、２．７４ｍＭ、２．７５ｍＭ、２．７６ｍＭ、２．７７ｍＭ、２．７８ｍＭ、２．７９ｍＭ、２．８ｍＭ、２．８１ｍＭ、２．８２ｍＭ、２．８３ｍＭ、２．８４ｍＭ、２．８５ｍＭ、２．８６ｍＭ、２．８７ｍＭ、２．８８ｍＭ、２．８９ｍＭ、２．９ｍＭ、２．９１ｍＭ、２．９２ｍＭ、２．９３ｍＭ、２．９４ｍＭ、２．９５ｍＭ、２．９６ｍＭ、２．９７ｍＭ、２．９８ｍＭ、２．９９ｍＭ、３ｍＭ、３．０１ｍＭ、３．０２ｍＭ、３．０３ｍＭ、３．０４ｍＭ、３．０５ｍＭ、３．０６ｍＭ、３．０７ｍＭ、３．０８ｍＭ、３．０９ｍＭ、３．１ｍＭ、３．１１ｍＭ、３．１２ｍＭ、３．１３ｍＭ、３．１４ｍＭ、３．１５ｍＭ、３．１６ｍＭ、３．１７ｍＭ、３．１８ｍＭ、３．１９ｍＭ、３．２ｍＭ、３．２１ｍＭ、３．２２ｍＭ、３．２３ｍＭ、３．２４ｍＭ、３．２５ｍＭ、３．２６ｍＭ、３．２７ｍＭ、３．２８ｍＭ、３．２９ｍＭ、３．３ｍＭ、３．３１ｍＭ、３．３２ｍＭ、３．３３ｍＭ、３．３４ｍＭ、３．３５ｍＭ、３．３６ｍＭ、３．３７ｍＭ、３．３８ｍＭ、３．３９ｍＭ、３．４ｍＭ、３．４１ｍＭ、３．４２ｍＭ、３．４３ｍＭ、３．４４ｍＭ、３．４５ｍＭ、３．４６ｍＭ、３．４７ｍＭ、３．４８ｍＭ、３．４９ｍＭ、３．５ｍＭ、３．５１ｍＭ、３．５２ｍＭ、３．５３ｍＭ、３．５４ｍＭ、３．５５ｍＭ、３．５６ｍＭ、３．５７ｍＭ、３．５８ｍＭ、３．５９ｍＭ、３．６ｍＭ、３．６１ｍＭ、３．６２ｍＭ、３．６３ｍＭ、３．６４ｍＭ、３．６５ｍＭ、３．６６ｍＭ、３．６７ｍＭ、３．６８ｍＭ、３．６９ｍＭ、３．７ｍＭ、３．７１ｍＭ、３．７２ｍＭ、３．７３ｍＭ、３．７４ｍＭ、３．７５ｍＭ、３．７６ｍＭ、３．７７ｍＭ、３．７８ｍＭ、３．７９ｍＭ、３．８ｍＭ、３．８１ｍＭ、３．８２ｍＭ、３．８３ｍＭ、３．８４ｍＭ、３．８５ｍＭ、３．８６ｍＭ、３．８７ｍＭ、３．８８ｍＭ、３．８９ｍＭ、３．９ｍＭ、３．９１ｍＭ、３．９２ｍＭ、３．９３ｍＭ、３．９４ｍＭ、３．９５ｍＭ、３．９６ｍＭ、３．９７ｍＭ、３．９８ｍＭ、３．９９ｍＭ、４ｍＭ、４．０１ｍＭ、４．０２ｍＭ、４．０３ｍＭ、４．０４ｍＭ、４．０５ｍＭ、４．０６ｍＭ、４．０７ｍＭ、４．０８ｍＭ、４．０９ｍＭ、４．１ｍＭ、４．１１ｍＭ、４．１２ｍＭ、４．１３ｍＭ、４．１４ｍＭ、４．１５ｍＭ、４．１６ｍＭ、４．１７ｍＭ、４．１８ｍＭ、４．１９ｍＭ、４．２ｍＭ、４．２１ｍＭ、４．２２ｍＭ、４．２３ｍＭ、４．２４ｍＭ、４．２５ｍＭ、４．２６ｍＭ、４．２７ｍＭ、４．２８ｍＭ、４．２９ｍＭ、４．３ｍＭ、４．３１ｍＭ、４．３２ｍＭ、４．３３ｍＭ、４．３４ｍＭ、４．３５ｍＭ、４．３６ｍＭ、４．３７ｍＭ、４．３８ｍＭ、４．３９ｍＭ、４．４ｍＭ、４．４１ｍＭ、４．４２ｍＭ、４．４３ｍＭ、４．４４ｍＭ、４．４５ｍＭ、４．４６ｍＭ、４．４７ｍＭ、４．４８ｍＭ、４．４９ｍＭ、４．５ｍＭ、４．５１ｍＭ、４．５２ｍＭ、４．５３ｍＭ、４．５４ｍＭ、４．５５ｍＭ、４．５６ｍＭ、４．５７ｍＭ、４．５８ｍＭ、４．５９ｍＭ、４．６ｍＭ、４．６１ｍＭ、４．６２ｍＭ、４．６３ｍＭ、４．６４ｍＭ、４．６５ｍＭ、４．６６ｍＭ、４．６７ｍＭ、４．６８ｍＭ、４．６９ｍＭ、４．７ｍＭ、４．７１ｍＭ、４．７２ｍＭ、４．７３ｍＭ、４．７４ｍＭ、４．７５ｍＭ、４．７６ｍＭ、４．７７ｍＭ、４．７８ｍＭ、４．７９ｍＭ、４．８ｍＭ、４．８１ｍＭ、４．８２ｍＭ、４．８３ｍＭ、４．８４ｍＭ、４．８５ｍＭ、４．８６ｍＭ、４．８７ｍＭ、４．８８ｍＭ、４．８９ｍＭ、４．９ｍＭ、４．９１ｍＭ、４．９２ｍＭ、４．９３ｍＭ、４．９４ｍＭ、４．９５ｍＭ、４．９６ｍＭ、４．９７ｍＭ、４．９８ｍＭ、４．９９ｍＭ、もしくは約５ｍＭまたはこれらの間の任意の濃度で上記反応混合物中に存在し得る。
【0063】
いくつかの実施形態において、各ＮＭＰ、例えば、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰは、約０．１ｍＭ～約５ｍＭの間の濃度、例えば、約０．１ｍＭ、０．１１ｍＭ、０．１２ｍＭ、０．１３ｍＭ、０．１４ｍＭ、０．１５ｍＭ、０．１６ｍＭ、０．１７ｍＭ、０．１８ｍＭ、０．１９ｍＭ、０．２ｍＭ、０．２１ｍＭ、０．２２ｍＭ、０．２３ｍＭ、０．２４ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．２６ｍＭ、０．２７ｍＭ、０．２８ｍＭ、０．２９ｍＭ、０．３ｍＭ、０．３１ｍＭ、０．３２ｍＭ、０．３３ｍＭ、０．３４ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．３６ｍＭ、０．３７ｍＭ、０．３８ｍＭ、０．３９ｍＭ、０．４ｍＭ、０．４１ｍＭ、０．４２ｍＭ、０．４３ｍＭ、０．４４ｍＭ、０．４５ｍＭ、０．４６ｍＭ、０．４７ｍＭ、０．４８ｍＭ、０．４９ｍＭ、０．５ｍＭ、０．５１ｍＭ、０．５２ｍＭ、０．５３ｍＭ、０．５４ｍＭ、０．５５ｍＭ、０．５６ｍＭ、０．５７ｍＭ、０．５８ｍＭ、０．５９ｍＭ、０．６ｍＭ、０．６１ｍＭ、０．６２ｍＭ、０．６３ｍＭ、０．６４ｍＭ、０．６５ｍＭ、０．６６ｍＭ、０．６７ｍＭ、０．６８ｍＭ、０．６９ｍＭ、０．７ｍＭ、０．７１ｍＭ、０．７２ｍＭ、０．７３ｍＭ、０．７４ｍＭ、０．７５ｍＭ、０．７６ｍＭ、０．７７ｍＭ、０．７８ｍＭ、０．７９ｍＭ、０．８ｍＭ、０．８１ｍＭ、０．８２ｍＭ、０．８３ｍＭ、０．８４ｍＭ、０．８５ｍＭ、０．８６ｍＭ、０．８７ｍＭ、０．８８ｍＭ、０．８９ｍＭ、０．９ｍＭ、０．９１ｍＭ、０．９２ｍＭ、０．９３ｍＭ、０．９４ｍＭ、０．９５ｍＭ、０．９６ｍＭ、０．９７ｍＭ、０．９８ｍＭ、０．９９ｍＭ、１ｍＭ、１．０１ｍＭ、１．０２ｍＭ、１．０３ｍＭ、１．０４ｍＭ、１．０５ｍＭ、１．０６ｍＭ、１．０７ｍＭ、１．０８ｍＭ、１．０９ｍＭ、１．１ｍＭ、１．１１ｍＭ、１．１２ｍＭ、１．１３ｍＭ、１．１４ｍＭ、１．１５ｍＭ、１．１６ｍＭ、１．１７ｍＭ、１．１８ｍＭ、１．１９ｍＭ、１．２ｍＭ、１．２１ｍＭ、１．２２ｍＭ、１．２３ｍＭ、１．２４ｍＭ、１．２５ｍＭ、１．２６ｍＭ、１．２７ｍＭ、１．２８ｍＭ、１．２９ｍＭ、１．３ｍＭ、１．３１ｍＭ、１．３２ｍＭ、１．３３ｍＭ、１．３４ｍＭ、１．３５ｍＭ、１．３６ｍＭ、１．３７ｍＭ、１．３８ｍＭ、１．３９ｍＭ、１．４ｍＭ、１．４１ｍＭ、１．４２ｍＭ、１．４３ｍＭ、１．４４ｍＭ、１．４５ｍＭ、１．４６ｍＭ、１．４７ｍＭ、１．４８ｍＭ、１．４９ｍＭ、１．５ｍＭ、１．５１ｍＭ、１．５２ｍＭ、１．５３ｍＭ、１．５４ｍＭ、１．５５ｍＭ、１．５６ｍＭ、１．５７ｍＭ、１．５８ｍＭ、１．５９ｍＭ、１．６ｍＭ、１．６１ｍＭ、１．６２ｍＭ、１．６３ｍＭ、１．６４ｍＭ、１．６５ｍＭ、１．６６ｍＭ、１．６７ｍＭ、１．６８ｍＭ、１．６９ｍＭ、１．７ｍＭ、１．７１ｍＭ、１．７２ｍＭ、１．７３ｍＭ、１．７４ｍＭ、１．７５ｍＭ、１．７６ｍＭ、１．７７ｍＭ、１．７８ｍＭ、１．７９ｍＭ、１．８ｍＭ、１．８１ｍＭ、１．８２ｍＭ、１．８３ｍＭ、１．８４ｍＭ、１．８５ｍＭ、１．８６ｍＭ、１．８７ｍＭ、１．８８ｍＭ、１．８９ｍＭ、１．９ｍＭ、１．９１ｍＭ、１．９２ｍＭ、１．９３ｍＭ、１．９４ｍＭ、１．９５ｍＭ、１．９６ｍＭ、１．９７ｍＭ、１．９８ｍＭ、１．９９ｍＭ、２ｍＭ、２．０１ｍＭ、２．０２ｍＭ、２．０３ｍＭ、２．０４ｍＭ、２．０５ｍＭ、２．０６ｍＭ、２．０７ｍＭ、２．０８ｍＭ、２．０９ｍＭ、２．１ｍＭ、２．１１ｍＭ、２．１２ｍＭ、２．１３ｍＭ、２．１４ｍＭ、２．１５ｍＭ、２．１６ｍＭ、２．１７ｍＭ、２．１８ｍＭ、２．１９ｍＭ、２．２ｍＭ、２．２１ｍＭ、２．２２ｍＭ、２．２３ｍＭ、２．２４ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．２６ｍＭ、２．２７ｍＭ、２．２８ｍＭ、２．２９ｍＭ、２．３ｍＭ、２．３１ｍＭ、２．３２ｍＭ、２．３３ｍＭ、２．３４ｍＭ、２．３５ｍＭ、２．３６ｍＭ、２．３７ｍＭ、２．３８ｍＭ、２．３９ｍＭ、２．４ｍＭ、２．４１ｍＭ、２．４２ｍＭ、２．４３ｍＭ、２．４４ｍＭ、２．４５ｍＭ、２．４６ｍＭ、２．４７ｍＭ、２．４８ｍＭ、２．４９ｍＭ、２．５ｍＭ、２．５１ｍＭ、２．５２ｍＭ、２．５３ｍＭ、２．５４ｍＭ、２．５５ｍＭ、２．５６ｍＭ、２．５７ｍＭ、２．５８ｍＭ、２．５９ｍＭ、２．６ｍＭ、２．６１ｍＭ、２．６２ｍＭ、２．６３ｍＭ、２．６４ｍＭ、２．６５ｍＭ、２．６６ｍＭ、２．６７ｍＭ、２．６８ｍＭ、２．６９ｍＭ、２．７ｍＭ、２．７１ｍＭ、２．７２ｍＭ、２．７３ｍＭ、２．７４ｍＭ、２．７５ｍＭ、２．７６ｍＭ、２．７７ｍＭ、２．７８ｍＭ、２．７９ｍＭ、２．８ｍＭ、２．８１ｍＭ、２．８２ｍＭ、２．８３ｍＭ、２．８４ｍＭ、２．８５ｍＭ、２．８６ｍＭ、２．８７ｍＭ、２．８８ｍＭ、２．８９ｍＭ、２．９ｍＭ、２．９１ｍＭ、２．９２ｍＭ、２．９３ｍＭ、２．９４ｍＭ、２．９５ｍＭ、２．９６ｍＭ、２．９７ｍＭ、２．９８ｍＭ、２．９９ｍＭ、３ｍＭ、３．０１ｍＭ、３．０２ｍＭ、３．０３ｍＭ、３．０４ｍＭ、３．０５ｍＭ、３．０６ｍＭ、３．０７ｍＭ、３．０８ｍＭ、３．０９ｍＭ、３．１ｍＭ、３．１１ｍＭ、３．１２ｍＭ、３．１３ｍＭ、３．１４ｍＭ、３．１５ｍＭ、３．１６ｍＭ、３．１７ｍＭ、３．１８ｍＭ、３．１９ｍＭ、３．２ｍＭ、３．２１ｍＭ、３．２２ｍＭ、３．２３ｍＭ、３．２４ｍＭ、３．２５ｍＭ、３．２６ｍＭ、３．２７ｍＭ、３．２８ｍＭ、３．２９ｍＭ、３．３ｍＭ、３．３１ｍＭ、３．３２ｍＭ、３．３３ｍＭ、３．３４ｍＭ、３．３５ｍＭ、３．３６ｍＭ、３．３７ｍＭ、３．３８ｍＭ、３．３９ｍＭ、３．４ｍＭ、３．４１ｍＭ、３．４２ｍＭ、３．４３ｍＭ、３．４４ｍＭ、３．４５ｍＭ、３．４６ｍＭ、３．４７ｍＭ、３．４８ｍＭ、３．４９ｍＭ、３．５ｍＭ、３．５１ｍＭ、３．５２ｍＭ、３．５３ｍＭ、３．５４ｍＭ、３．５５ｍＭ、３．５６ｍＭ、３．５７ｍＭ、３．５８ｍＭ、３．５９ｍＭ、３．６ｍＭ、３．６１ｍＭ、３．６２ｍＭ、３．６３ｍＭ、３．６４ｍＭ、３．６５ｍＭ、３．６６ｍＭ、３．６７ｍＭ、３．６８ｍＭ、３．６９ｍＭ、３．７ｍＭ、３．７１ｍＭ、３．７２ｍＭ、３．７３ｍＭ、３．７４ｍＭ、３．７５ｍＭ、３．７６ｍＭ、３．７７ｍＭ、３．７８ｍＭ、３．７９ｍＭ、３．８ｍＭ、３．８１ｍＭ、３．８２ｍＭ、３．８３ｍＭ、３．８４ｍＭ、３．８５ｍＭ、３．８６ｍＭ、３．８７ｍＭ、３．８８ｍＭ、３．８９ｍＭ、３．９ｍＭ、３．９１ｍＭ、３．９２ｍＭ、３．９３ｍＭ、３．９４ｍＭ、３．９５ｍＭ、３．９６ｍＭ、３．９７ｍＭ、３．９８ｍＭ、３．９９ｍＭ、４ｍＭ、４．０１ｍＭ、４．０２ｍＭ、４．０３ｍＭ、４．０４ｍＭ、４．０５ｍＭ、４．０６ｍＭ、４．０７ｍＭ、４．０８ｍＭ、４．０９ｍＭ、４．１ｍＭ、４．１１ｍＭ、４．１２ｍＭ、４．１３ｍＭ、４．１４ｍＭ、４．１５ｍＭ、４．１６ｍＭ、４．１７ｍＭ、４．１８ｍＭ、４．１９ｍＭ、４．２ｍＭ、４．２１ｍＭ、４．２２ｍＭ、４．２３ｍＭ、４．２４ｍＭ、４．２５ｍＭ、４．２６ｍＭ、４．２７ｍＭ、４．２８ｍＭ、４．２９ｍＭ、４．３ｍＭ、４．３１ｍＭ、４．３２ｍＭ、４．３３ｍＭ、４．３４ｍＭ、４．３５ｍＭ、４．３６ｍＭ、４．３７ｍＭ、４．３８ｍＭ、４．３９ｍＭ、４．４ｍＭ、４．４１ｍＭ、４．４２ｍＭ、４．４３ｍＭ、４．４４ｍＭ、４．４５ｍＭ、４．４６ｍＭ、４．４７ｍＭ、４．４８ｍＭ、４．４９ｍＭ、４．５ｍＭ、４．５１ｍＭ、４．５２ｍＭ、４．５３ｍＭ、４．５４ｍＭ、４．５５ｍＭ、４．５６ｍＭ、４．５７ｍＭ、４．５８ｍＭ、４．５９ｍＭ、４．６ｍＭ、４．６１ｍＭ、４．６２ｍＭ、４．６３ｍＭ、４．６４ｍＭ、４．６５ｍＭ、４．６６ｍＭ、４．６７ｍＭ、４．６８ｍＭ、４．６９ｍＭ、４．７ｍＭ、４．７１ｍＭ、４．７２ｍＭ、４．７３ｍＭ、４．７４ｍＭ、４．７５ｍＭ、４．７６ｍＭ、４．７７ｍＭ、４．７８ｍＭ、４．７９ｍＭ、４．８ｍＭ、４．８１ｍＭ、４．８２ｍＭ、４．８３ｍＭ、４．８４ｍＭ、４．８５ｍＭ、４．８６ｍＭ、４．８７ｍＭ、４．８８ｍＭ、４．８９ｍＭ、４．９ｍＭ、４．９１ｍＭ、４．９２ｍＭ、４．９３ｍＭ、４．９４ｍＭ、４．９５ｍＭ、４．９６ｍＭ、４．９７ｍＭ、４．９８ｍＭ、４．９９ｍＭ、もしくは約５ｍＭ、またはこれらの間の任意の濃度で上記反応混合物中に存在し得る。
【0064】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、上記アミノ酸は、内因性アミノ酸、すなわち、上記細胞抽出物中に存在し、上記細胞に由来するアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、上記アミノ酸は、外因性アミノ酸、すなわち、上記細胞抽出物に添加されるアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから選択される１またはこれより多くの標準アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、各個々のアミノ酸は、約０．１ｍＭ～約５ｍＭの間の濃度、例えば、約０．１ｍＭ、０．１１ｍＭ、０．１２ｍＭ、０．１３ｍＭ、０．１４ｍＭ、０．１５ｍＭ、０．１６ｍＭ、０．１７ｍＭ、０．１８ｍＭ、０．１９ｍＭ、０．２ｍＭ、０．２１ｍＭ、０．２２ｍＭ、０．２３ｍＭ、０．２４ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．２６ｍＭ、０．２７ｍＭ、０．２８ｍＭ、０．２９ｍＭ、０．３ｍＭ、０．３１ｍＭ、０．３２ｍＭ、０．３３ｍＭ、０．３４ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．３６ｍＭ、０．３７ｍＭ、０．３８ｍＭ、０．３９ｍＭ、０．４ｍＭ、０．４１ｍＭ、０．４２ｍＭ、０．４３ｍＭ、０．４４ｍＭ、０．４５ｍＭ、０．４６ｍＭ、０．４７ｍＭ、０．４８ｍＭ、０．４９ｍＭ、０．５ｍＭ、０．５１ｍＭ、０．５２ｍＭ、０．５３ｍＭ、０．５４ｍＭ、０．５５ｍＭ、０．５６ｍＭ、０．５７ｍＭ、０．５８ｍＭ、０．５９ｍＭ、０．６ｍＭ、０．６１ｍＭ、０．６２ｍＭ、０．６３ｍＭ、０．６４ｍＭ、０．６５ｍＭ、０．６６ｍＭ、０．６７ｍＭ、０．６８ｍＭ、０．６９ｍＭ、０．７ｍＭ、０．７１ｍＭ、０．７２ｍＭ、０．７３ｍＭ、０．７４ｍＭ、０．７５ｍＭ、０．７６ｍＭ、０．７７ｍＭ、０．７８ｍＭ、０．７９ｍＭ、０．８ｍＭ、０．８１ｍＭ、０．８２ｍＭ、０．８３ｍＭ、０．８４ｍＭ、０．８５ｍＭ、０．８６ｍＭ、０．８７ｍＭ、０．８８ｍＭ、０．８９ｍＭ、０．９ｍＭ、０．９１ｍＭ、０．９２ｍＭ、０．９３ｍＭ、０．９４ｍＭ、０．９５ｍＭ、０．９６ｍＭ、０．９７ｍＭ、０．９８ｍＭ、０．９９ｍＭ、１ｍＭ、１．０１ｍＭ、１．０２ｍＭ、１．０３ｍＭ、１．０４ｍＭ、１．０５ｍＭ、１．０６ｍＭ、１．０７ｍＭ、１．０８ｍＭ、１．０９ｍＭ、１．１ｍＭ、１．１１ｍＭ、１．１２ｍＭ、１．１３ｍＭ、１．１４ｍＭ、１．１５ｍＭ、１．１６ｍＭ、１．１７ｍＭ、１．１８ｍＭ、１．１９ｍＭ、１．２ｍＭ、１．２１ｍＭ、１．２２ｍＭ、１．２３ｍＭ、１．２４ｍＭ、１．２５ｍＭ、１．２６ｍＭ、１．２７ｍＭ、１．２８ｍＭ、１．２９ｍＭ、１．３ｍＭ、１．３１ｍＭ、１．３２ｍＭ、１．３３ｍＭ、１．３４ｍＭ、１．３５ｍＭ、１．３６ｍＭ、１．３７ｍＭ、１．３８ｍＭ、１．３９ｍＭ、１．４ｍＭ、１．４１ｍＭ、１．４２ｍＭ、１．４３ｍＭ、１．４４ｍＭ、１．４５ｍＭ、１．４６ｍＭ、１．４７ｍＭ、１．４８ｍＭ、１．４９ｍＭ、１．５ｍＭ、１．５１ｍＭ、１．５２ｍＭ、１．５３ｍＭ、１．５４ｍＭ、１．５５ｍＭ、１．５６ｍＭ、１．５７ｍＭ、１．５８ｍＭ、１．５９ｍＭ、１．６ｍＭ、１．６１ｍＭ、１．６２ｍＭ、１．６３ｍＭ、１．６４ｍＭ、１．６５ｍＭ、１．６６ｍＭ、１．６７ｍＭ、１．６８ｍＭ、１．６９ｍＭ、１．７ｍＭ、１．７１ｍＭ、１．７２ｍＭ、１．７３ｍＭ、１．７４ｍＭ、１．７５ｍＭ、１．７６ｍＭ、１．７７ｍＭ、１．７８ｍＭ、１．７９ｍＭ、１．８ｍＭ、１．８１ｍＭ、１．８２ｍＭ、１．８３ｍＭ、１．８４ｍＭ、１．８５ｍＭ、１．８６ｍＭ、１．８７ｍＭ、１．８８ｍＭ、１．８９ｍＭ、１．９ｍＭ、１．９１ｍＭ、１．９２ｍＭ、１．９３ｍＭ、１．９４ｍＭ、１．９５ｍＭ、１．９６ｍＭ、１．９７ｍＭ、１．９８ｍＭ、１．９９ｍＭ、２ｍＭ、２．０１ｍＭ、２．０２ｍＭ、２．０３ｍＭ、２．０４ｍＭ、２．０５ｍＭ、２．０６ｍＭ、２．０７ｍＭ、２．０８ｍＭ、２．０９ｍＭ、２．１ｍＭ、２．１１ｍＭ、２．１２ｍＭ、２．１３ｍＭ、２．１４ｍＭ、２．１５ｍＭ、２．１６ｍＭ、２．１７ｍＭ、２．１８ｍＭ、２．１９ｍＭ、２．２ｍＭ、２．２１ｍＭ、２．２２ｍＭ、２．２３ｍＭ、２．２４ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．２６ｍＭ、２．２７ｍＭ、２．２８ｍＭ、２．２９ｍＭ、２．３ｍＭ、２．３１ｍＭ、２．３２ｍＭ、２．３３ｍＭ、２．３４ｍＭ、２．３５ｍＭ、２．３６ｍＭ、２．３７ｍＭ、２．３８ｍＭ、２．３９ｍＭ、２．４ｍＭ、２．４１ｍＭ、２．４２ｍＭ、２．４３ｍＭ、２．４４ｍＭ、２．４５ｍＭ、２．４６ｍＭ、２．４７ｍＭ、２．４８ｍＭ、２．４９ｍＭ、２．５ｍＭ、２．５１ｍＭ、２．５２ｍＭ、２．５３ｍＭ、２．５４ｍＭ、２．５５ｍＭ、２．５６ｍＭ、２．５７ｍＭ、２．５８ｍＭ、２．５９ｍＭ、２．６ｍＭ、２．６１ｍＭ、２．６２ｍＭ、２．６３ｍＭ、２．６４ｍＭ、２．６５ｍＭ、２．６６ｍＭ、２．６７ｍＭ、２．６８ｍＭ、２．６９ｍＭ、２．７ｍＭ、２．７１ｍＭ、２．７２ｍＭ、２．７３ｍＭ、２．７４ｍＭ、２．７５ｍＭ、２．７６ｍＭ、２．７７ｍＭ、２．７８ｍＭ、２．７９ｍＭ、２．８ｍＭ、２．８１ｍＭ、２．８２ｍＭ、２．８３ｍＭ、２．８４ｍＭ、２．８５ｍＭ、２．８６ｍＭ、２．８７ｍＭ、２．８８ｍＭ、２．８９ｍＭ、２．９ｍＭ、２．９１ｍＭ、２．９２ｍＭ、２．９３ｍＭ、２．９４ｍＭ、２．９５ｍＭ、２．９６ｍＭ、２．９７ｍＭ、２．９８ｍＭ、２．９９ｍＭ、３ｍＭ、３．０１ｍＭ、３．０２ｍＭ、３．０３ｍＭ、３．０４ｍＭ、３．０５ｍＭ、３．０６ｍＭ、３．０７ｍＭ、３．０８ｍＭ、３．０９ｍＭ、３．１ｍＭ、３．１１ｍＭ、３．１２ｍＭ、３．１３ｍＭ、３．１４ｍＭ、３．１５ｍＭ、３．１６ｍＭ、３．１７ｍＭ、３．１８ｍＭ、３．１９ｍＭ、３．２ｍＭ、３．２１ｍＭ、３．２２ｍＭ、３．２３ｍＭ、３．２４ｍＭ、３．２５ｍＭ、３．２６ｍＭ、３．２７ｍＭ、３．２８ｍＭ、３．２９ｍＭ、３．３ｍＭ、３．３１ｍＭ、３．３２ｍＭ、３．３３ｍＭ、３．３４ｍＭ、３．３５ｍＭ、３．３６ｍＭ、３．３７ｍＭ、３．３８ｍＭ、３．３９ｍＭ、３．４ｍＭ、３．４１ｍＭ、３．４２ｍＭ、３．４３ｍＭ、３．４４ｍＭ、３．４５ｍＭ、３．４６ｍＭ、３．４７ｍＭ、３．４８ｍＭ、３．４９ｍＭ、３．５ｍＭ、３．５１ｍＭ、３．５２ｍＭ、３．５３ｍＭ、３．５４ｍＭ、３．５５ｍＭ、３．５６ｍＭ、３．５７ｍＭ、３．５８ｍＭ、３．５９ｍＭ、３．６ｍＭ、３．６１ｍＭ、３．６２ｍＭ、３．６３ｍＭ、３．６４ｍＭ、３．６５ｍＭ、３．６６ｍＭ、３．６７ｍＭ、３．６８ｍＭ、３．６９ｍＭ、３．７ｍＭ、３．７１ｍＭ、３．７２ｍＭ、３．７３ｍＭ、３．７４ｍＭ、３．７５ｍＭ、３．７６ｍＭ、３．７７ｍＭ、３．７８ｍＭ、３．７９ｍＭ、３．８ｍＭ、３．８１ｍＭ、３．８２ｍＭ、３．８３ｍＭ、３．８４ｍＭ、３．８５ｍＭ、３．８６ｍＭ、３．８７ｍＭ、３．８８ｍＭ、３．８９ｍＭ、３．９ｍＭ、３．９１ｍＭ、３．９２ｍＭ、３．９３ｍＭ、３．９４ｍＭ、３．９５ｍＭ、３．９６ｍＭ、３．９７ｍＭ、３．９８ｍＭ、３．９９ｍＭ、４ｍＭ、４．０１ｍＭ、４．０２ｍＭ、４．０３ｍＭ、４．０４ｍＭ、４．０５ｍＭ、４．０６ｍＭ、４．０７ｍＭ、４．０８ｍＭ、４．０９ｍＭ、４．１ｍＭ、４．１１ｍＭ、４．１２ｍＭ、４．１３ｍＭ、４．１４ｍＭ、４．１５ｍＭ、４．１６ｍＭ、４．１７ｍＭ、４．１８ｍＭ、４．１９ｍＭ、４．２ｍＭ、４．２１ｍＭ、４．２２ｍＭ、４．２３ｍＭ、４．２４ｍＭ、４．２５ｍＭ、４．２６ｍＭ、４．２７ｍＭ、４．２８ｍＭ、４．２９ｍＭ、４．３ｍＭ、４．３１ｍＭ、４．３２ｍＭ、４．３３ｍＭ、４．３４ｍＭ、４．３５ｍＭ、４．３６ｍＭ、４．３７ｍＭ、４．３８ｍＭ、４．３９ｍＭ、４．４ｍＭ、４．４１ｍＭ、４．４２ｍＭ、４．４３ｍＭ、４．４４ｍＭ、４．４５ｍＭ、４．４６ｍＭ、４．４７ｍＭ、４．４８ｍＭ、４．４９ｍＭ、４．５ｍＭ、４．５１ｍＭ、４．５２ｍＭ、４．５３ｍＭ、４．５４ｍＭ、４．５５ｍＭ、４．５６ｍＭ、４．５７ｍＭ、４．５８ｍＭ、４．５９ｍＭ、４．６ｍＭ、４．６１ｍＭ、４．６２ｍＭ、４．６３ｍＭ、４．６４ｍＭ、４．６５ｍＭ、４．６６ｍＭ、４．６７ｍＭ、４．６８ｍＭ、４．６９ｍＭ、４．７ｍＭ、４．７１ｍＭ、４．７２ｍＭ、４．７３ｍＭ、４．７４ｍＭ、４．７５ｍＭ、４．７６ｍＭ、４．７７ｍＭ、４．７８ｍＭ、４．７９ｍＭ、４．８ｍＭ、４．８１ｍＭ、４．８２ｍＭ、４．８３ｍＭ、４．８４ｍＭ、４．８５ｍＭ、４．８６ｍＭ、４．８７ｍＭ、４．８８ｍＭ、４．８９ｍＭ、４．９ｍＭ、４．９１ｍＭ、４．９２ｍＭ、４．９３ｍＭ、４．９４ｍＭ、４．９５ｍＭ、４．９６ｍＭ、４．９７ｍＭ、４．９８ｍＭ、４．９９ｍＭ、もしくは約５ｍＭ、またはこれらの間の任意の濃度で上記反応混合物中に存在し得る。
【0065】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、ｔＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ｔＲＮＡは、内因性ｔＲＮＡ、すなわち、上記細胞抽出物中に存在し、上記細胞に由来するｔＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ｔＲＮＡは、外因性ｔＲＮＡ、すなわち、上記細胞抽出物に添加されるｔＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ｔＲＮＡは、約１０μｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬの間の濃度、例えば、約１０μｇ／ｍＬ、１１μｇ／ｍＬ、１２μｇ／ｍＬ、１３μｇ／ｍＬ、１４μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、１７μｇ／ｍＬ、１８μｇ／ｍＬ、１９μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、２１μｇ／ｍＬ、２２μｇ／ｍＬ、２３μｇ／ｍＬ、２４μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、２６μｇ／ｍＬ、２７μｇ／ｍＬ、２８μｇ／ｍＬ、２９μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、３１μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、３３μｇ／ｍＬ、３４μｇ／ｍＬ、３５μｇ／ｍＬ、３６μｇ／ｍＬ、３７μｇ／ｍＬ、３８μｇ／ｍＬ、３９μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、４１μｇ／ｍＬ、４２μｇ／ｍＬ、４３μｇ／ｍＬ、４４μｇ／ｍＬ、４５μｇ／ｍＬ、４６μｇ／ｍＬ、４７μｇ／ｍＬ、４８μｇ／ｍＬ、４９μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５１μｇ／ｍＬ、５２μｇ／ｍＬ、５３μｇ／ｍＬ、５４μｇ／ｍＬ、５５μｇ／ｍＬ、５６μｇ／ｍＬ、５７μｇ／ｍＬ、５８μｇ／ｍＬ、５９μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、６１μｇ／ｍＬ、６２μｇ／ｍＬ、６３μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、６５μｇ／ｍＬ、６６μｇ／ｍＬ、６７μｇ／ｍＬ、６８μｇ／ｍＬ、６９μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、７１μｇ／ｍＬ、７２μｇ／ｍＬ、７３μｇ／ｍＬ、７４μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、７６μｇ／ｍＬ、７７μｇ／ｍＬ、７８μｇ／ｍＬ、７９μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、８１μｇ／ｍＬ、８２μｇ／ｍＬ、８３μｇ／ｍＬ、８４μｇ／ｍＬ、８５μｇ／ｍＬ、８６μｇ／ｍＬ、８７μｇ／ｍＬ、８８μｇ／ｍＬ、８９μｇ／ｍＬ、９０μｇ／ｍＬ、９１μｇ／ｍＬ、９２μｇ／ｍＬ、９３μｇ／ｍＬ、９４μｇ／ｍＬ、９５μｇ／ｍＬ、９６μｇ／ｍＬ、９７μｇ／ｍＬ、９８μｇ／ｍＬ、９９μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１１０μｇ／ｍＬ、１２０μｇ／ｍＬ、１３０μｇ／ｍＬ、１４０μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬ、１６０μｇ／ｍＬ、１７０μｇ／ｍＬ、１８０μｇ／ｍＬ、１９０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、２１０μｇ／ｍＬ、２２０μｇ／ｍＬ、２３０μｇ／ｍＬ、２４０μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、２６０μｇ／ｍＬ、２７０μｇ／ｍＬ、２８０μｇ／ｍＬ、２９０μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、３１０μｇ／ｍＬ、３２０μｇ／ｍＬ、３３０μｇ／ｍＬ、３４０μｇ／ｍＬ、３５０μｇ／ｍＬ、３６０μｇ／ｍＬ、３７０μｇ／ｍＬ、３８０μｇ／ｍＬ、３９０μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、４１０μｇ／ｍＬ、４２０μｇ／ｍＬ、４３０μｇ／ｍＬ、４４０μｇ／ｍＬ、４５０μｇ／ｍＬ、４６０μｇ／ｍＬ、４７０μｇ／ｍＬ、４８０μｇ／ｍＬ、４９０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、５１０μｇ／ｍＬ、５２０μｇ／ｍＬ、５３０μｇ／ｍＬ、５４０μｇ／ｍＬ、５５０μｇ／ｍＬ、５６０μｇ／ｍＬ、５７０μｇ／ｍＬ、５８０μｇ／ｍＬ、５９０μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ、６１０μｇ／ｍＬ、６２０μｇ／ｍＬ、６３０μｇ／ｍＬ、６４０μｇ／ｍＬ、６５０μｇ／ｍＬ、６６０μｇ／ｍＬ、６７０μｇ／ｍＬ、６８０μｇ／ｍＬ、６９０μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、７１０μｇ／ｍＬ、７２０μｇ／ｍＬ、７３０μｇ／ｍＬ、７４０μｇ／ｍＬ、７５０μｇ／ｍＬ、７６０μｇ／ｍＬ、７７０μｇ／ｍＬ、７８０μｇ／ｍＬ、７９０μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、８１０μｇ／ｍＬ、８２０μｇ／ｍＬ、８３０μｇ／ｍＬ、８４０μｇ／ｍＬ、８５０μｇ／ｍＬ、８６０μｇ／ｍＬ、８７０μｇ／ｍＬ、８８０μｇ／ｍＬ、８９０μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬ、９１０μｇ／ｍＬ、９２０μｇ／ｍＬ、９３０μｇ／ｍＬ、９４０μｇ／ｍＬ、９５０μｇ／ｍＬ、９６０μｇ／ｍＬ、９７０μｇ／ｍＬ、９８０μｇ／ｍＬ、９９０μｇ／ｍＬ、もしくは約１．０ｍｇ／ｍＬ、またはこれらの間の任意の濃度で上記反応混合物中に存在し得る。
【0066】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、上記細胞抽出物の酸化還元電位をモジュレートする化学物質を含み得る。いくつかの実施形態において、上記化学物質は、酸化型グルタチオンを含み得る。いくつかの実施形態において、上記化学物質は、還元型グルタチオンを含み得る。いくつかの実施形態において、上記化学物質は、上記ＣＦＰＳ反応を開始する前に、上記抽出物の予備処理としてスルフヒドリル不活性化剤を含み得る。いくつかの実施形態において、上記スルフヒドリル不活性化剤は、ヨードアセトアミドを含み得る。
【0067】
いくつかの実施形態において、上記化学物質は、約０．１ｍＭ～約３０ｍＭの間の濃度、例えば、約０．１ｍＭ、０．１１ｍＭ、０．１２ｍＭ、０．１３ｍＭ、０．１４ｍＭ、０．１５ｍＭ、０．１６ｍＭ、０．１７ｍＭ、０．１８ｍＭ、０．１９ｍＭ、０．２ｍＭ、０．２１ｍＭ、０．２２ｍＭ、０．２３ｍＭ、０．２４ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．２６ｍＭ、０．２７ｍＭ、０．２８ｍＭ、０．２９ｍＭ、０．３ｍＭ、０．３１ｍＭ、０．３２ｍＭ、０．３３ｍＭ、０．３４ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．３６ｍＭ、０．３７ｍＭ、０．３８ｍＭ、０．３９ｍＭ、０．４ｍＭ、０．４１ｍＭ、０．４２ｍＭ、０．４３ｍＭ、０．４４ｍＭ、０．４５ｍＭ、０．４６ｍＭ、０．４７ｍＭ、０．４８ｍＭ、０．４９ｍＭ、０．５ｍＭ、０．５１ｍＭ、０．５２ｍＭ、０．５３ｍＭ、０．５４ｍＭ、０．５５ｍＭ、０．５６ｍＭ、０．５７ｍＭ、０．５８ｍＭ、０．５９ｍＭ、０．６ｍＭ、０．６１ｍＭ、０．６２ｍＭ、０．６３ｍＭ、０．６４ｍＭ、０．６５ｍＭ、０．６６ｍＭ、０．６７ｍＭ、０．６８ｍＭ、０．６９ｍＭ、０．７ｍＭ、０．７１ｍＭ、０．７２ｍＭ、０．７３ｍＭ、０．７４ｍＭ、０．７５ｍＭ、０．７６ｍＭ、０．７７ｍＭ、０．７８ｍＭ、０．７９ｍＭ、０．８ｍＭ、０．８１ｍＭ、０．８２ｍＭ、０．８３ｍＭ、０．８４ｍＭ、０．８５ｍＭ、０．８６ｍＭ、０．８７ｍＭ、０．８８ｍＭ、０．８９ｍＭ、０．９ｍＭ、０．９１ｍＭ、０．９２ｍＭ、０．９３ｍＭ、０．９４ｍＭ、０．９５ｍＭ、０．９６ｍＭ、０．９７ｍＭ、０．９８ｍＭ、０．９９ｍＭ、１ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２ｍＭ、２．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．３ｍＭ、２．４ｍＭ、２．５ｍＭ、２．６ｍＭ、２．７ｍＭ、２．８ｍＭ、２．９ｍＭ、３ｍＭ、３．１ｍＭ、３．２ｍＭ、３．３ｍＭ、３．４ｍＭ、３．５ｍＭ、３．６ｍＭ、３．７ｍＭ、３．８ｍＭ、３．９ｍＭ、４ｍＭ、４．１ｍＭ、４．２ｍＭ、４．３ｍＭ、４．４ｍＭ、４．５ｍＭ、４．６ｍＭ、４．７ｍＭ、４．８ｍＭ、４．９ｍＭ、５ｍＭ、５．１ｍＭ、５．２ｍＭ、５．３ｍＭ、５．４ｍＭ、５．５ｍＭ、５．６ｍＭ、５．７ｍＭ、５．８ｍＭ、５．９ｍＭ、６ｍＭ、６．１ｍＭ、６．２ｍＭ、６．３ｍＭ、６．４ｍＭ、６．５ｍＭ、６．６ｍＭ、６．７ｍＭ、６．８ｍＭ、６．９ｍＭ、７ｍＭ、７．１ｍＭ、７．２ｍＭ、７．３ｍＭ、７．４ｍＭ、７．５ｍＭ、７．６ｍＭ、７．７ｍＭ、７．８ｍＭ、７．９ｍＭ、８ｍＭ、８．１ｍＭ、８．２ｍＭ、８．３ｍＭ、８．４ｍＭ、８．５ｍＭ、８．６ｍＭ、８．７ｍＭ、８．８ｍＭ、８．９ｍＭ、９ｍＭ、９．１ｍＭ、９．２ｍＭ、９．３ｍＭ、９．４ｍＭ、９．５ｍＭ、９．６ｍＭ、９．７ｍＭ、９．８ｍＭ、９．９ｍＭ、１０ｍＭ、１０．１ｍＭ、１０．２ｍＭ、１０．３ｍＭ、１０．４ｍＭ、１０．５ｍＭ、１０．６ｍＭ、１０．７ｍＭ、１０．８ｍＭ、１０．９ｍＭ、１１ｍＭ、１１．１ｍＭ、１１．２ｍＭ、１１．３ｍＭ、１１．４ｍＭ、１１．５ｍＭ、１１．６ｍＭ、１１．７ｍＭ、１１．８ｍＭ、１１．９ｍＭ、１２ｍＭ、１２．１ｍＭ、１２．２ｍＭ、１２．３ｍＭ、１２．４ｍＭ、１２．５ｍＭ、１２．６ｍＭ、１２．７ｍＭ、１２．８ｍＭ、１２．９ｍＭ、１３ｍＭ、１３．１ｍＭ、１３．２ｍＭ、１３．３ｍＭ、１３．４ｍＭ、１３．５ｍＭ、１３．６ｍＭ、１３．７ｍＭ、１３．８ｍＭ、１３．９ｍＭ、１４ｍＭ、１４．１ｍＭ、１４．２ｍＭ、１４．３ｍＭ、１４．４ｍＭ、１４．５ｍＭ、１４．６ｍＭ、１４．７ｍＭ、１４．８ｍＭ、１４．９ｍＭ、１５ｍＭ、１５．１ｍＭ、１５．２ｍＭ、１５．３ｍＭ、１５．４ｍＭ、１５．５ｍＭ、１５．６ｍＭ、１５．７ｍＭ、１５．８ｍＭ、１５．９ｍＭ、１６ｍＭ、１６．１ｍＭ、１６．２ｍＭ、１６．３ｍＭ、１６．４ｍＭ、１６．５ｍＭ、１６．６ｍＭ、１６．７ｍＭ、１６．８ｍＭ、１６．９ｍＭ、１７ｍＭ、１７．１ｍＭ、１７．２ｍＭ、１７．３ｍＭ、１７．４ｍＭ、１７．５ｍＭ、１７．６ｍＭ、１７．７ｍＭ、１７．８ｍＭ、１７．９ｍＭ、１８ｍＭ、１８．１ｍＭ、１８．２ｍＭ、１８．３ｍＭ、１８．４ｍＭ、１８．５ｍＭ、１８．６ｍＭ、１８．７ｍＭ、１８．８ｍＭ、１８．９ｍＭ、１９ｍＭ、１９．１ｍＭ、１９．２ｍＭ、１９．３ｍＭ、１９．４ｍＭ、１９．５ｍＭ、１９．６ｍＭ、１９．７ｍＭ、１９．８ｍＭ、１９．９ｍＭ、２０ｍＭ、２０．１ｍＭ、２０．２ｍＭ、２０．３ｍＭ、２０．４ｍＭ、２０．５ｍＭ、２０．６ｍＭ、２０．７ｍＭ、２０．８ｍＭ、２０．９ｍＭ、２１ｍＭ、２１．１ｍＭ、２１．２ｍＭ、２１．３ｍＭ、２１．４ｍＭ、２１．５ｍＭ、２１．６ｍＭ、２１．７ｍＭ、２１．８ｍＭ、２１．９ｍＭ、２２ｍＭ、２２．１ｍＭ、２２．２ｍＭ、２２．３ｍＭ、２２．４ｍＭ、２２．５ｍＭ、２２．６ｍＭ、２２．７ｍＭ、２２．８ｍＭ、２２．９ｍＭ、２３ｍＭ、２３．１ｍＭ、２３．２ｍＭ、２３．３ｍＭ、２３．４ｍＭ、２３．５ｍＭ、２３．６ｍＭ、２３．７ｍＭ、２３．８ｍＭ、２３．９ｍＭ、２４ｍＭ、２４．１ｍＭ、２４．２ｍＭ、２４．３ｍＭ、２４．４ｍＭ、２４．５ｍＭ、２４．６ｍＭ、２４．７ｍＭ、２４．８ｍＭ、２４．９ｍＭ、２５ｍＭ、２５．１ｍＭ、２５．２ｍＭ、２５．３ｍＭ、２５．４ｍＭ、２５．５ｍＭ、２５．６ｍＭ、２５．７ｍＭ、２５．８ｍＭ、２５．９ｍＭ、２６ｍＭ、２６．１ｍＭ、２６．２ｍＭ、２６．３ｍＭ、２６．４ｍＭ、２６．５ｍＭ、２６．６ｍＭ、２６．７ｍＭ、２６．８ｍＭ、２６．９ｍＭ、２７ｍＭ、２７．１ｍＭ、２７．２ｍＭ、２７．３ｍＭ、２７．４ｍＭ、２７．５ｍＭ、２７．６ｍＭ、２７．７ｍＭ、２７．８ｍＭ、２７．９ｍＭ、２８ｍＭ、２８．１ｍＭ、２８．２ｍＭ、２８．３ｍＭ、２８．４ｍＭ、２８．５ｍＭ、２８．６ｍＭ、２８．７ｍＭ、２８．８ｍＭ、２８．９ｍＭ、２９ｍＭ、２９．１ｍＭ、２９．２ｍＭ、２９．３ｍＭ、２９．４ｍＭ、２９．５ｍＭ、２９．６ｍＭ、２９．７ｍＭ、２９．８ｍＭ、２９．９ｍＭ、もしくは約３０ｍＭ、またはこれらの間の任意の濃度で酸化型または還元型グルタチオンを含み得る。
【0068】
いくつかの実施形態において、上記化学物質は、約１μＭ～約５０００μＭの間の濃度、例えば、約１μＭ、１．１μＭ、１．２μＭ、１．３μＭ、１．４μＭ、１．５μＭ、１．６μＭ、１．７μＭ、１．８μＭ、１．９μＭ、２μＭ、２．１μＭ、２．２μＭ、２．３μＭ、２．４μＭ、２．５μＭ、２．６μＭ、２．７μＭ、２．８μＭ、２．９μＭ、３μＭ、３．１μＭ、３．２μＭ、３．３μＭ、３．４μＭ、３．５μＭ、３．６μＭ、３．７μＭ、３．８μＭ、３．９μＭ、４μＭ、４．１μＭ、４．２μＭ、４．３μＭ、４．４μＭ、４．５μＭ、４．６μＭ、４．７μＭ、４．８μＭ、４．９μＭ、５μＭ、５．１μＭ、５．２μＭ、５．３μＭ、５．４μＭ、５．５μＭ、５．６μＭ、５．７μＭ、５．８μＭ、５．９μＭ、６μＭ、６．１μＭ、６．２μＭ、６．３μＭ、６．４μＭ、６．５μＭ、６．６μＭ、６．７μＭ、６．８μＭ、６．９μＭ、７μＭ、７．１μＭ、７．２μＭ、７．３μＭ、７．４μＭ、７．５μＭ、７．６μＭ、７．７μＭ、７．８μＭ、７．９μＭ、８μＭ、８．１μＭ、８．２μＭ、８．３μＭ、８．４μＭ、８．５μＭ、８．６μＭ、８．７μＭ、８．８μＭ、８．９μＭ、９μＭ、９．１μＭ、９．２μＭ、９．３μＭ、９．４μＭ、９．５μＭ、９．６μＭ、９．７μＭ、９．８μＭ、９．９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２１μＭ、２２μＭ、２３μＭ、２４μＭ、２５μＭ、２６μＭ、２７μＭ、２８μＭ、２９μＭ、３０μＭ、３１μＭ、３２μＭ、３３μＭ、３４μＭ、３５μＭ、３６μＭ、３７μＭ、３８μＭ、３９μＭ、４０μＭ、４１μＭ、４２μＭ、４３μＭ、４４μＭ、４５μＭ、４６μＭ、４７μＭ、４８μＭ、４９μＭ、５０μＭ、５１μＭ、５２μＭ、５３μＭ、５４μＭ、５５μＭ、５６μＭ、５７μＭ、５８μＭ、５９μＭ、６０μＭ、６１μＭ、６２μＭ、６３μＭ、６４μＭ、６５μＭ、６６μＭ、６７μＭ、６８μＭ、６９μＭ、７０μＭ、７１μＭ、７２μＭ、７３μＭ、７４μＭ、７５μＭ、７６μＭ、７７μＭ、７８μＭ、７９μＭ、８０μＭ、８１μＭ、８２μＭ、８３μＭ、８４μＭ、８５μＭ、８６μＭ、８７μＭ、８８μＭ、８９μＭ、９０μＭ、９１μＭ、９２μＭ、９３μＭ、９４μＭ、９５μＭ、９６μＭ、９７μＭ、９８μＭ、９９μＭ、１００μＭ、１１０μＭ、１２０μＭ、１３０μＭ、１４０μＭ、１５０μＭ、１６０μＭ、１７０μＭ、１８０μＭ、１９０μＭ、２００μＭ、２１０μＭ、２２０μＭ、２３０μＭ、２４０μＭ、２５０μＭ、２６０μＭ、２７０μＭ、２８０μＭ、２９０μＭ、３００μＭ、３１０μＭ、３２０μＭ、３３０μＭ、３４０μＭ、３５０μＭ、３６０μＭ、３７０μＭ、３８０μＭ、３９０μＭ、４００μＭ、４１０μＭ、４２０μＭ、４３０μＭ、４４０μＭ、４５０μＭ、４６０μＭ、４７０μＭ、４８０μＭ、４９０μＭ、５００μＭ、５１０μＭ、５２０μＭ、５３０μＭ、５４０μＭ、５５０μＭ、５６０μＭ、５７０μＭ、５８０μＭ、５９０μＭ、６００μＭ、６１０μＭ、６２０μＭ、６３０μＭ、６４０μＭ、６５０μＭ、６６０μＭ、６７０μＭ、６８０μＭ、６９０μＭ、７００μＭ、７１０μＭ、７２０μＭ、７３０μＭ、７４０μＭ、７５０μＭ、７６０μＭ、７７０μＭ、７８０μＭ、７９０μＭ、８００μＭ、８１０μＭ、８２０μＭ、８３０μＭ、８４０μＭ、８５０μＭ、８６０μＭ、８７０μＭ、８８０μＭ、８９０μＭ、９００μＭ、９１０μＭ、９２０μＭ、９３０μＭ、９４０μＭ、９５０μＭ、９６０μＭ、９７０μＭ、９８０μＭ、９９０μＭ、１０００μＭ、１０２０μＭ、１０４０μＭ、１０６０μＭ、１０８０μＭ、１１００μＭ、１１２０μＭ、１１４０μＭ、１１６０μＭ、１１８０μＭ、１２００μＭ、１２２０μＭ、１２４０μＭ、１２６０μＭ、１２８０μＭ、１３００μＭ、１３２０μＭ、１３４０μＭ、１３６０μＭ、１３８０μＭ、１４００μＭ、１４２０μＭ、１４４０μＭ、１４６０μＭ、１４８０μＭ、１５００μＭ、１５２０μＭ、１５４０μＭ、１５６０μＭ、１５８０μＭ、１６００μＭ、１６２０μＭ、１６４０μＭ、１６６０μＭ、１６８０μＭ、１７００μＭ、１７２０μＭ、１７４０μＭ、１７６０μＭ、１７８０μＭ、１８００μＭ、１８２０μＭ、１８４０μＭ、１８６０μＭ、１８８０μＭ、１９００μＭ、１９２０μＭ、１９４０μＭ、１９６０μＭ、１９８０μＭ、２０００μＭ、２０２０μＭ、２０４０μＭ、２０６０μＭ、２０８０μＭ、２１００μＭ、２１２０μＭ、２１４０μＭ、２１６０μＭ、２１８０μＭ、２２００μＭ、２２２０μＭ、２２４０μＭ、２２６０μＭ、２２８０μＭ、２３００μＭ、２３２０μＭ、２３４０μＭ、２３６０μＭ、２３８０μＭ、２４００μＭ、２４２０μＭ、２４４０μＭ、２４６０μＭ、２４８０μＭ、２５００μＭ、２５２０μＭ、２５４０μＭ、２５６０μＭ、２５８０μＭ、２６００μＭ、２６２０μＭ、２６４０μＭ、２６６０μＭ、２６８０μＭ、２７００μＭ、２７２０μＭ、２７４０μＭ、２７６０μＭ、２７８０μＭ、２８００μＭ、２８２０μＭ、２８４０μＭ、２８６０μＭ、２８８０μＭ、２９００μＭ、２９２０μＭ、２９４０μＭ、２９６０μＭ、２９８０μＭ、３０００μＭ、３０２０μＭ、３０４０μＭ、３０６０μＭ、３０８０μＭ、３１００μＭ、３１２０μＭ、３１４０μＭ、３１６０μＭ、３１８０μＭ、３２００μＭ、３２２０μＭ、３２４０μＭ、３２６０μＭ、３２８０μＭ、３３００μＭ、３３２０μＭ、３３４０μＭ、３３６０μＭ、３３８０μＭ、３４００μＭ、３４２０μＭ、３４４０μＭ、３４６０μＭ、３４８０μＭ、３５００μＭ、３５２０μＭ、３５４０μＭ、３５６０μＭ、３５８０μＭ、３６００μＭ、３６２０μＭ、３６４０μＭ、３６６０μＭ、３６８０μＭ、３７００μＭ、３７２０μＭ、３７４０μＭ、３７６０μＭ、３７８０μＭ、３８００μＭ、３８２０μＭ、３８４０μＭ、３８６０μＭ、３８８０μＭ、３９００μＭ、３９２０μＭ、３９４０μＭ、３９６０μＭ、３９８０μＭ、４０００μＭ、４０２０μＭ、４０４０μＭ、４０６０μＭ、４０８０μＭ、４１００μＭ、４１２０μＭ、４１４０μＭ、４１６０μＭ、４１８０μＭ、４２００μＭ、４２２０μＭ、４２４０μＭ、４２６０μＭ、４２８０μＭ、４３００μＭ、４３２０μＭ、４３４０μＭ、４３６０μＭ、４３８０μＭ、４４００μＭ、４４２０μＭ、４４４０μＭ、４４６０μＭ、４４８０μＭ、４５００μＭ、４５２０μＭ、４５４０μＭ、４５６０μＭ、４５８０μＭ、４６００μＭ、４６２０μＭ、４６４０μＭ、４６６０μＭ、４６８０μＭ、４７００μＭ、４７２０μＭ、４７４０μＭ、４７６０μＭ、４７８０μＭ、４８００μＭ、４８２０μＭ、４８４０μＭ、４８６０μＭ、４８８０μＭ、４９００μＭ、４９２０μＭ、４９４０μＭ、４９６０μＭ、４９８０μＭ、もしくは約５０００μＭ、またはこれらの間の任意の濃度でスルフヒドリル不活性化剤を含み得る。
【0069】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、生成される上記ポリペプチドまたはタンパク質の適切な折りたたみおよび／または翻訳後修飾を促進するように働く少なくとも１種の化学物質を含み得る。いくつかの実施形態において、上記化学物質は、タンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、上記化学物質は、シャペロンを含み得る。いくつかの実施形態において、上記化学物質は、酵素を含み得る。いくつかの実施形態において、上記化学物質は、グリコシルトランスフェラーゼを含む。いくつかの実施形態において、上記化学物質は、糖ドナーを含む。いくつかの実施形態において、生成される上記ポリペプチドまたはタンパク質は、プラスミドまたは上記細胞抽出物を生成するために使用される細胞のゲノムから発現され得る。
【0070】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、アルコールを含み得る。いくつかの実施形態において、上記アルコールは、ポリオールを含み得る。いくつかの実施形態において、上記アルコールは、約０％（ｖ／ｖ）～約２５％（ｖ／ｖ）の間の濃度、例えば、約０．１％（ｖ／ｖ）、０．２％（ｖ／ｖ）、０．３％（ｖ／ｖ）、０．４％（ｖ／ｖ）、０．５％（ｖ／ｖ）、０．６％（ｖ／ｖ）、０．７％（ｖ／ｖ）、０．８％（ｖ／ｖ）、０．９％（ｖ／ｖ）、１％（ｖ／ｖ）、１．１％（ｖ／ｖ）、１．２％（ｖ／ｖ）、１．３％（ｖ／ｖ）、１．４％（ｖ／ｖ）、１．５％（ｖ／ｖ）、１．６％（ｖ／ｖ）、１．７％（ｖ／ｖ）、１．８％（ｖ／ｖ）、１．９％（ｖ／ｖ）、２％（ｖ／ｖ）、２．１％（ｖ／ｖ）、２．２％（ｖ／ｖ）、２．３％（ｖ／ｖ）、２．４％（ｖ／ｖ）、２．５％（ｖ／ｖ）、２．６％（ｖ／ｖ）、２．７％（ｖ／ｖ）、２．８％（ｖ／ｖ）、２．９％（ｖ／ｖ）、３％（ｖ／ｖ）、３．１％（ｖ／ｖ）、３．２％（ｖ／ｖ）、３．３％（ｖ／ｖ）、３．４％（ｖ／ｖ）、３．５％（ｖ／ｖ）、３．６％（ｖ／ｖ）、３．７％（ｖ／ｖ）、３．８％（ｖ／ｖ）、３．９％（ｖ／ｖ）、４％（ｖ／ｖ）、４．１％（ｖ／ｖ）、４．２％（ｖ／ｖ）、４．３％（ｖ／ｖ）、４．４％（ｖ／ｖ）、４．５％（ｖ／ｖ）、４．６％（ｖ／ｖ）、４．７％（ｖ／ｖ）、４．８％（ｖ／ｖ）、４．９％（ｖ／ｖ）、５％（ｖ／ｖ）、５．１％（ｖ／ｖ）、５．２％（ｖ／ｖ）、５．３％（ｖ／ｖ）、５．４％（ｖ／ｖ）、５．５％（ｖ／ｖ）、５．６％（ｖ／ｖ）、５．７％（ｖ／ｖ）、５．８％（ｖ／ｖ）、５．９％（ｖ／ｖ）、６％（ｖ／ｖ）、６．１％（ｖ／ｖ）、６．２％（ｖ／ｖ）、６．３％（ｖ／ｖ）、６．４％（ｖ／ｖ）、６．５％（ｖ／ｖ）、６．６％（ｖ／ｖ）、６．７％（ｖ／ｖ）、６．８％（ｖ／ｖ）、６．９％（ｖ／ｖ）、７％（ｖ／ｖ）、７．１％（ｖ／ｖ）、７．２％（ｖ／ｖ）、７．３％（ｖ／ｖ）、７．４％（ｖ／ｖ）、７．５％（ｖ／ｖ）、７．６％（ｖ／ｖ）、７．７％（ｖ／ｖ）、７．８％（ｖ／ｖ）、７．９％（ｖ／ｖ）、８％（ｖ／ｖ）、８．１％（ｖ／ｖ）、８．２％（ｖ／ｖ）、８．３％（ｖ／ｖ）、８．４％（ｖ／ｖ）、８．５％（ｖ／ｖ）、８．６％（ｖ／ｖ）、８．７％（ｖ／ｖ）、８．８％（ｖ／ｖ）、８．９％（ｖ／ｖ）、９％（ｖ／ｖ）、９．１％（ｖ／ｖ）、９．２％（ｖ／ｖ）、９．３％（ｖ／ｖ）、９．４％（ｖ／ｖ）、９．５％（ｖ／ｖ）、９．６％（ｖ／ｖ）、９．７％（ｖ／ｖ）、９．８％（ｖ／ｖ）、９．９％（ｖ／ｖ）、１０％（ｖ／ｖ）、１０．１％（ｖ／ｖ）、１０．２％（ｖ／ｖ）、１０．３％（ｖ／ｖ）、１０．４％（ｖ／ｖ）、１０．５％（ｖ／ｖ）、１０．６％（ｖ／ｖ）、１０．７％（ｖ／ｖ）、１０．８％（ｖ／ｖ）、１０．９％（ｖ／ｖ）、１１％（ｖ／ｖ）、１１．１％（ｖ／ｖ）、１１．２％（ｖ／ｖ）、１１．３％（ｖ／ｖ）、１１．４％（ｖ／ｖ）、１１．５％（ｖ／ｖ）、１１．６％（ｖ／ｖ）、１１．７％（ｖ／ｖ）、１１．８％（ｖ／ｖ）、１１．９％（ｖ／ｖ）、１２％（ｖ／ｖ）、１２．１％（ｖ／ｖ）、１２．２％（ｖ／ｖ）、１２．３％（ｖ／ｖ）、１２．４％（ｖ／ｖ）、１２．５％（ｖ／ｖ）、１２．６％（ｖ／ｖ）、１２．７％（ｖ／ｖ）、１２．８％（ｖ／ｖ）、１２．９％（ｖ／ｖ）、１３％（ｖ／ｖ）、１３．１％（ｖ／ｖ）、１３．２％（ｖ／ｖ）、１３．３％（ｖ／ｖ）、１３．４％（ｖ／ｖ）、１３．５％（ｖ／ｖ）、１３．６％（ｖ／ｖ）、１３．７％（ｖ／ｖ）、１３．８％（ｖ／ｖ）、１３．９％（ｖ／ｖ）、１４％（ｖ／ｖ）、１４．１％（ｖ／ｖ）、１４．２％（ｖ／ｖ）、１４．３％（ｖ／ｖ）、１４．４％（ｖ／ｖ）、１４．５％（ｖ／ｖ）、１４．６％（ｖ／ｖ）、１４．７％（ｖ／ｖ）、１４．８％（ｖ／ｖ）、１４．９％（ｖ／ｖ）、１５％（ｖ／ｖ）、１５．１％（ｖ／ｖ）、１５．２％（ｖ／ｖ）、１５．３％（ｖ／ｖ）、１５．４％（ｖ／ｖ）、１５．５％（ｖ／ｖ）、１５．６％（ｖ／ｖ）、１５．７％（ｖ／ｖ）、１５．８％（ｖ／ｖ）、１５．９％（ｖ／ｖ）、１６％（ｖ／ｖ）、１６．１％（ｖ／ｖ）、１６．２％（ｖ／ｖ）、１６．３％（ｖ／ｖ）、１６．４％（ｖ／ｖ）、１６．５％（ｖ／ｖ）、１６．６％（ｖ／ｖ）、１６．７％（ｖ／ｖ）、１６．８％（ｖ／ｖ）、１６．９％（ｖ／ｖ）、１７％（ｖ／ｖ）、１７．１％（ｖ／ｖ）、１７．２％（ｖ／ｖ）、１７．３％（ｖ／ｖ）、１７．４％（ｖ／ｖ）、１７．５％（ｖ／ｖ）、１７．６％（ｖ／ｖ）、１７．７％（ｖ／ｖ）、１７．８％（ｖ／ｖ）、１７．９％（ｖ／ｖ）、１８％（ｖ／ｖ）、１８．１％（ｖ／ｖ）、１８．２％（ｖ／ｖ）、１８．３％（ｖ／ｖ）、１８．４％（ｖ／ｖ）、１８．５％（ｖ／ｖ）、１８．６％（ｖ／ｖ）、１８．７％（ｖ／ｖ）、１８．８％（ｖ／ｖ）、１８．９％（ｖ／ｖ）、１９％（ｖ／ｖ）、１９．１％（ｖ／ｖ）、１９．２％（ｖ／ｖ）、１９．３％（ｖ／ｖ）、１９．４％（ｖ／ｖ）、１９．５％（ｖ／ｖ）、１９．６％（ｖ／ｖ）、１９．７％（ｖ／ｖ）、１９．８％（ｖ／ｖ）、１９．９％（ｖ／ｖ）、２０％（ｖ／ｖ）、２０．１％（ｖ／ｖ）、２０．２％（ｖ／ｖ）、２０．３％（ｖ／ｖ）、２０．４％（ｖ／ｖ）、２０．５％（ｖ／ｖ）、２０．６％（ｖ／ｖ）、２０．７％（ｖ／ｖ）、２０．８％（ｖ／ｖ）、２０．９％（ｖ／ｖ）、２１％（ｖ／ｖ）、２１．１％（ｖ／ｖ）、２１．２％（ｖ／ｖ）、２１．３％（ｖ／ｖ）、２１．４％（ｖ／ｖ）、２１．５％（ｖ／ｖ）、２１．６％（ｖ／ｖ）、２１．７％（ｖ／ｖ）、２１．８％（ｖ／ｖ）、２１．９％（ｖ／ｖ）、２２％（ｖ／ｖ）、２２．１％（ｖ／ｖ）、２２．２％（ｖ／ｖ）、２２．３％（ｖ／ｖ）、２２．４％（ｖ／ｖ）、２２．５％（ｖ／ｖ）、２２．６％（ｖ／ｖ）、２２．７％（ｖ／ｖ）、２２．８％（ｖ／ｖ）、２２．９％（ｖ／ｖ）、２３％（ｖ／ｖ）、２３．１％（ｖ／ｖ）、２３．２％（ｖ／ｖ）、２３．３％（ｖ／ｖ）、２３．４％（ｖ／ｖ）、２３．５％（ｖ／ｖ）、２３．６％（ｖ／ｖ）、２３．７％（ｖ／ｖ）、２３．８％（ｖ／ｖ）、２３．９％（ｖ／ｖ）、２４％（ｖ／ｖ）、２４．１％（ｖ／ｖ）、２４．２％（ｖ／ｖ）、２４．３％（ｖ／ｖ）、２４．４％（ｖ／ｖ）、２４．５％（ｖ／ｖ）、２４．６％（ｖ／ｖ）、２４．７％（ｖ／ｖ）、２４．８％（ｖ／ｖ）、２４．９％（ｖ／ｖ）、もしくは約２５％（ｖ／ｖ）、またはこれらの間の任意の濃度で存在し得る。
【0071】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物中のエネルギー源は、約１０ｍＭ～約４００ｍＭの間の濃度、例えば、約１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、５０ｍＭ、５１ｍＭ、５２ｍＭ、５３ｍＭ、５４ｍＭ、５５ｍＭ、５６ｍＭ、５７ｍＭ、５８ｍＭ、５９ｍＭ、６０ｍＭ、６１ｍＭ、６２ｍＭ、６３ｍＭ、６４ｍＭ、６５ｍＭ、６６ｍＭ、６７ｍＭ、６８ｍＭ、６９ｍＭ、７０ｍＭ、７１ｍＭ、７２ｍＭ、７３ｍＭ、７４ｍＭ、７５ｍＭ、７６ｍＭ、７７ｍＭ、７８ｍＭ、７９ｍＭ、８０ｍＭ、８１ｍＭ、８２ｍＭ、８３ｍＭ、８４ｍＭ、８５ｍＭ、８６ｍＭ、８７ｍＭ、８８ｍＭ、８９ｍＭ、９０ｍＭ、９１ｍＭ、９２ｍＭ、９３ｍＭ、９４ｍＭ、９５ｍＭ、９６ｍＭ、９７ｍＭ、９８ｍＭ、９９ｍＭ、１００ｍＭ、１０１ｍＭ、１０２ｍＭ、１０３ｍＭ、１０４ｍＭ、１０５ｍＭ、１０６ｍＭ、１０７ｍＭ、１０８ｍＭ、１０９ｍＭ、１１０ｍＭ、１１１ｍＭ、１１２ｍＭ、１１３ｍＭ、１１４ｍＭ、１１５ｍＭ、１１６ｍＭ、１１７ｍＭ、１１８ｍＭ、１１９ｍＭ、１２０ｍＭ、１２１ｍＭ、１２２ｍＭ、１２３ｍＭ、１２４ｍＭ、１２５ｍＭ、１２６ｍＭ、１２７ｍＭ、１２８ｍＭ、１２９ｍＭ、１３０ｍＭ、１３１ｍＭ、１３２ｍＭ、１３３ｍＭ、１３４ｍＭ、１３５ｍＭ、１３６ｍＭ、１３７ｍＭ、１３８ｍＭ、１３９ｍＭ、１４０ｍＭ、１４１ｍＭ、１４２ｍＭ、１４３ｍＭ、１４４ｍＭ、１４５ｍＭ、１４６ｍＭ、１４７ｍＭ、１４８ｍＭ、１４９ｍＭ、１５０ｍＭ、１５１ｍＭ、１５２ｍＭ、１５３ｍＭ、１５４ｍＭ、１５５ｍＭ、１５６ｍＭ、１５７ｍＭ、１５８ｍＭ、１５９ｍＭ、１６０ｍＭ、１６１ｍＭ、１６２ｍＭ、１６３ｍＭ、１６４ｍＭ、１６５ｍＭ、１６６ｍＭ、１６７ｍＭ、１６８ｍＭ、１６９ｍＭ、１７０ｍＭ、１７１ｍＭ、１７２ｍＭ、１７３ｍＭ、１７４ｍＭ、１７５ｍＭ、１７６ｍＭ、１７７ｍＭ、１７８ｍＭ、１７９ｍＭ、１８０ｍＭ、１８１ｍＭ、１８２ｍＭ、１８３ｍＭ、１８４ｍＭ、１８５ｍＭ、１８６ｍＭ、１８７ｍＭ、１８８ｍＭ、１８９ｍＭ、１９０ｍＭ、１９１ｍＭ、１９２ｍＭ、１９３ｍＭ、１９４ｍＭ、１９５ｍＭ、１９６ｍＭ、１９７ｍＭ、１９８ｍＭ、１９９ｍＭ、２００ｍＭ、２０１ｍＭ、２０２ｍＭ、２０３ｍＭ、２０４ｍＭ、２０５ｍＭ、２０６ｍＭ、２０７ｍＭ、２０８ｍＭ、２０９ｍＭ、２１０ｍＭ、２１１ｍＭ、２１２ｍＭ、２１３ｍＭ、２１４ｍＭ、２１５ｍＭ、２１６ｍＭ、２１７ｍＭ、２１８ｍＭ、２１９ｍＭ、２２０ｍＭ、２２１ｍＭ、２２２ｍＭ、２２３ｍＭ、２２４ｍＭ、２２５ｍＭ、２２６ｍＭ、２２７ｍＭ、２２８ｍＭ、２２９ｍＭ、２３０ｍＭ、２３１ｍＭ、２３２ｍＭ、２３３ｍＭ、２３４ｍＭ、２３５ｍＭ、２３６ｍＭ、２３７ｍＭ、２３８ｍＭ、２３９ｍＭ、２４０ｍＭ、２４１ｍＭ、２４２ｍＭ、２４３ｍＭ、２４４ｍＭ、２４５ｍＭ、２４６ｍＭ、２４７ｍＭ、２４８ｍＭ、２４９ｍＭ、２５０ｍＭ、２５１ｍＭ、２５２ｍＭ、２５３ｍＭ、２５４ｍＭ、２５５ｍＭ、２５６ｍＭ、２５７ｍＭ、２５８ｍＭ、２５９ｍＭ、２６０ｍＭ、２６１ｍＭ、２６２ｍＭ、２６３ｍＭ、２６４ｍＭ、２６５ｍＭ、２６６ｍＭ、２６７ｍＭ、２６８ｍＭ、２６９ｍＭ、２７０ｍＭ、２７１ｍＭ、２７２ｍＭ、２７３ｍＭ、２７４ｍＭ、２７５ｍＭ、２７６ｍＭ、２７７ｍＭ、２７８ｍＭ、２７９ｍＭ、２８０ｍＭ、２８１ｍＭ、２８２ｍＭ、２８３ｍＭ、２８４ｍＭ、２８５ｍＭ、２８６ｍＭ、２８７ｍＭ、２８８ｍＭ、２８９ｍＭ、２９０ｍＭ、２９１ｍＭ、２９２ｍＭ、２９３ｍＭ、２９４ｍＭ、２９５ｍＭ、２９６ｍＭ、２９７ｍＭ、２９８ｍＭ、２９９ｍＭ、３００ｍＭ、３０１ｍＭ、３０２ｍＭ、３０３ｍＭ、３０４ｍＭ、３０５ｍＭ、３０６ｍＭ、３０７ｍＭ、３０８ｍＭ、３０９ｍＭ、３１０ｍＭ、３１１ｍＭ、３１２ｍＭ、３１３ｍＭ、３１４ｍＭ、３１５ｍＭ、３１６ｍＭ、３１７ｍＭ、３１８ｍＭ、３１９ｍＭ、３２０ｍＭ、３２１ｍＭ、３２２ｍＭ、３２３ｍＭ、３２４ｍＭ、３２５ｍＭ、３２６ｍＭ、３２７ｍＭ、３２８ｍＭ、３２９ｍＭ、３３０ｍＭ、３３１ｍＭ、３３２ｍＭ、３３３ｍＭ、３３４ｍＭ、３３５ｍＭ、３３６ｍＭ、３３７ｍＭ、３３８ｍＭ、３３９ｍＭ、３４０ｍＭ、３４１ｍＭ、３４２ｍＭ、３４３ｍＭ、３４４ｍＭ、３４５ｍＭ、３４６ｍＭ、３４７ｍＭ、３４８ｍＭ、３４９ｍＭ、３５０ｍＭ、３５１ｍＭ、３５２ｍＭ、３５３ｍＭ、３５４ｍＭ、３５５ｍＭ、３５６ｍＭ、３５７ｍＭ、３５８ｍＭ、３５９ｍＭ、３６０ｍＭ、３６１ｍＭ、３６２ｍＭ、３６３ｍＭ、３６４ｍＭ、３６５ｍＭ、３６６ｍＭ、３６７ｍＭ、３６８ｍＭ、３６９ｍＭ、３７０ｍＭ、３７１ｍＭ、３７２ｍＭ、３７３ｍＭ、３７４ｍＭ、３７５ｍＭ、３７６ｍＭ、３７７ｍＭ、３７８ｍＭ、３７９ｍＭ、３８０ｍＭ、３８１ｍＭ、３８２ｍＭ、３８３ｍＭ、３８４ｍＭ、３８５ｍＭ、３８６ｍＭ、３８７ｍＭ、３８８ｍＭ、３８９ｍＭ、３９０ｍＭ、３９１ｍＭ、３９２ｍＭ、３９３ｍＭ、３９４ｍＭ、３９５ｍＭ、３９６ｍＭ、３９７ｍＭ、３９８ｍＭ、３９９ｍＭ、もしくは約４００ｍＭ、またはこれらの間の任意の濃度で存在し得る。いくつかの実施形態において、上記で列挙される濃度は、本明細書で開示される任意のエネルギー源（リン酸基、非リン酸化エネルギー基、またはホスホエノールピルベート、グルタメート、グリセロール、ピルベート、グルコース、およびクレアチンリン酸から選択される１もしくはこれより多くのものが挙げられるが、これらに限定されない）に適用可能であり得る。
【0072】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物中の塩は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの間の濃度、例えば、約５０ｍＭ、５１ｍＭ、５２ｍＭ、５３ｍＭ、５４ｍＭ、５５ｍＭ、５６ｍＭ、５７ｍＭ、５８ｍＭ、５９ｍＭ、６０ｍＭ、６１ｍＭ、６２ｍＭ、６３ｍＭ、６４ｍＭ、６５ｍＭ、６６ｍＭ、６７ｍＭ、６８ｍＭ、６９ｍＭ、７０ｍＭ、７１ｍＭ、７２ｍＭ、７３ｍＭ、７４ｍＭ、７５ｍＭ、７６ｍＭ、７７ｍＭ、７８ｍＭ、７９ｍＭ、８０ｍＭ、８１ｍＭ、８２ｍＭ、８３ｍＭ、８４ｍＭ、８５ｍＭ、８６ｍＭ、８７ｍＭ、８８ｍＭ、８９ｍＭ、９０ｍＭ、９１ｍＭ、９２ｍＭ、９３ｍＭ、９４ｍＭ、９５ｍＭ、９６ｍＭ、９７ｍＭ、９８ｍＭ、９９ｍＭ、１００ｍＭ、１０１ｍＭ、１０２ｍＭ、１０３ｍＭ、１０４ｍＭ、１０５ｍＭ、１０６ｍＭ、１０７ｍＭ、１０８ｍＭ、１０９ｍＭ、１１０ｍＭ、１１１ｍＭ、１１２ｍＭ、１１３ｍＭ、１１４ｍＭ、１１５ｍＭ、１１６ｍＭ、１１７ｍＭ、１１８ｍＭ、１１９ｍＭ、１２０ｍＭ、１２１ｍＭ、１２２ｍＭ、１２３ｍＭ、１２４ｍＭ、１２５ｍＭ、１２６ｍＭ、１２７ｍＭ、１２８ｍＭ、１２９ｍＭ、１３０ｍＭ、１３１ｍＭ、１３２ｍＭ、１３３ｍＭ、１３４ｍＭ、１３５ｍＭ、１３６ｍＭ、１３７ｍＭ、１３８ｍＭ、１３９ｍＭ、１４０ｍＭ、１４１ｍＭ、１４２ｍＭ、１４３ｍＭ、１４４ｍＭ、１４５ｍＭ、１４６ｍＭ、１４７ｍＭ、１４８ｍＭ、１４９ｍＭ、１５０ｍＭ、１５１ｍＭ、１５２ｍＭ、１５３ｍＭ、１５４ｍＭ、１５５ｍＭ、１５６ｍＭ、１５７ｍＭ、１５８ｍＭ、１５９ｍＭ、１６０ｍＭ、１６１ｍＭ、１６２ｍＭ、１６３ｍＭ、１６４ｍＭ、１６５ｍＭ、１６６ｍＭ、１６７ｍＭ、１６８ｍＭ、１６９ｍＭ、１７０ｍＭ、１７１ｍＭ、１７２ｍＭ、１７３ｍＭ、１７４ｍＭ、１７５ｍＭ、１７６ｍＭ、１７７ｍＭ、１７８ｍＭ、１７９ｍＭ、１８０ｍＭ、１８１ｍＭ、１８２ｍＭ、１８３ｍＭ、１８４ｍＭ、１８５ｍＭ、１８６ｍＭ、１８７ｍＭ、１８８ｍＭ、１８９ｍＭ、１９０ｍＭ、１９１ｍＭ、１９２ｍＭ、１９３ｍＭ、１９４ｍＭ、１９５ｍＭ、１９６ｍＭ、１９７ｍＭ、１９８ｍＭ、１９９ｍＭ、２００ｍＭ、２０１ｍＭ、２０２ｍＭ、２０３ｍＭ、２０４ｍＭ、２０５ｍＭ、２０６ｍＭ、２０７ｍＭ、２０８ｍＭ、２０９ｍＭ、２１０ｍＭ、２１１ｍＭ、２１２ｍＭ、２１３ｍＭ、２１４ｍＭ、２１５ｍＭ、２１６ｍＭ、２１７ｍＭ、２１８ｍＭ、２１９ｍＭ、２２０ｍＭ、２２１ｍＭ、２２２ｍＭ、２２３ｍＭ、２２４ｍＭ、２２５ｍＭ、２２６ｍＭ、２２７ｍＭ、２２８ｍＭ、２２９ｍＭ、２３０ｍＭ、２３１ｍＭ、２３２ｍＭ、２３３ｍＭ、２３４ｍＭ、２３５ｍＭ、２３６ｍＭ、２３７ｍＭ、２３８ｍＭ、２３９ｍＭ、２４０ｍＭ、２４１ｍＭ、２４２ｍＭ、２４３ｍＭ、２４４ｍＭ、２４５ｍＭ、２４６ｍＭ、２４７ｍＭ、２４８ｍＭ、２４９ｍＭ、２５０ｍＭ、２５１ｍＭ、２５２ｍＭ、２５３ｍＭ、２５４ｍＭ、２５５ｍＭ、２５６ｍＭ、２５７ｍＭ、２５８ｍＭ、２５９ｍＭ、２６０ｍＭ、２６１ｍＭ、２６２ｍＭ、２６３ｍＭ、２６４ｍＭ、２６５ｍＭ、２６６ｍＭ、２６７ｍＭ、２６８ｍＭ、２６９ｍＭ、２７０ｍＭ、２７１ｍＭ、２７２ｍＭ、２７３ｍＭ、２７４ｍＭ、２７５ｍＭ、２７６ｍＭ、２７７ｍＭ、２７８ｍＭ、２７９ｍＭ、２８０ｍＭ、２８１ｍＭ、２８２ｍＭ、２８３ｍＭ、２８４ｍＭ、２８５ｍＭ、２８６ｍＭ、２８７ｍＭ、２８８ｍＭ、２８９ｍＭ、２９０ｍＭ、２９１ｍＭ、２９２ｍＭ、２９３ｍＭ、２９４ｍＭ、２９５ｍＭ、２９６ｍＭ、２９７ｍＭ、２９８ｍＭ、２９９ｍＭ、３００ｍＭ、３０１ｍＭ、３０２ｍＭ、３０３ｍＭ、３０４ｍＭ、３０５ｍＭ、３０６ｍＭ、３０７ｍＭ、３０８ｍＭ、３０９ｍＭ、３１０ｍＭ、３１１ｍＭ、３１２ｍＭ、３１３ｍＭ、３１４ｍＭ、３１５ｍＭ、３１６ｍＭ、３１７ｍＭ、３１８ｍＭ、３１９ｍＭ、３２０ｍＭ、３２１ｍＭ、３２２ｍＭ、３２３ｍＭ、３２４ｍＭ、３２５ｍＭ、３２６ｍＭ、３２７ｍＭ、３２８ｍＭ、３２９ｍＭ、３３０ｍＭ、３３１ｍＭ、３３２ｍＭ、３３３ｍＭ、３３４ｍＭ、３３５ｍＭ、３３６ｍＭ、３３７ｍＭ、３３８ｍＭ、３３９ｍＭ、３４０ｍＭ、３４１ｍＭ、３４２ｍＭ、３４３ｍＭ、３４４ｍＭ、３４５ｍＭ、３４６ｍＭ、３４７ｍＭ、３４８ｍＭ、３４９ｍＭ、３５０ｍＭ、３５１ｍＭ、３５２ｍＭ、３５３ｍＭ、３５４ｍＭ、３５５ｍＭ、３５６ｍＭ、３５７ｍＭ、３５８ｍＭ、３５９ｍＭ、３６０ｍＭ、３６１ｍＭ、３６２ｍＭ、３６３ｍＭ、３６４ｍＭ、３６５ｍＭ、３６６ｍＭ、３６７ｍＭ、３６８ｍＭ、３６９ｍＭ、３７０ｍＭ、３７１ｍＭ、３７２ｍＭ、３７３ｍＭ、３７４ｍＭ、３７５ｍＭ、３７６ｍＭ、３７７ｍＭ、３７８ｍＭ、３７９ｍＭ、３８０ｍＭ、３８１ｍＭ、３８２ｍＭ、３８３ｍＭ、３８４ｍＭ、３８５ｍＭ、３８６ｍＭ、３８７ｍＭ、３８８ｍＭ、３８９ｍＭ、３９０ｍＭ、３９１ｍＭ、３９２ｍＭ、３９３ｍＭ、３９４ｍＭ、３９５ｍＭ、３９６ｍＭ、３９７ｍＭ、３９８ｍＭ、３９９ｍＭ、４００ｍＭ、４０１ｍＭ、４０２ｍＭ、４０３ｍＭ、４０４ｍＭ、４０５ｍＭ、４０６ｍＭ、４０７ｍＭ、４０８ｍＭ、４０９ｍＭ、４１０ｍＭ、４１１ｍＭ、４１２ｍＭ、４１３ｍＭ、４１４ｍＭ、４１５ｍＭ、４１６ｍＭ、４１７ｍＭ、４１８ｍＭ、４１９ｍＭ、４２０ｍＭ、４２１ｍＭ、４２２ｍＭ、４２３ｍＭ、４２４ｍＭ、４２５ｍＭ、４２６ｍＭ、４２７ｍＭ、４２８ｍＭ、４２９ｍＭ、４３０ｍＭ、４３１ｍＭ、４３２ｍＭ、４３３ｍＭ、４３４ｍＭ、４３５ｍＭ、４３６ｍＭ、４３７ｍＭ、４３８ｍＭ、４３９ｍＭ、４４０ｍＭ、４４１ｍＭ、４４２ｍＭ、４４３ｍＭ、４４４ｍＭ、４４５ｍＭ、４４６ｍＭ、４４７ｍＭ、４４８ｍＭ、４４９ｍＭ、４５０ｍＭ、４５１ｍＭ、４５２ｍＭ、４５３ｍＭ、４５４ｍＭ、４５５ｍＭ、４５６ｍＭ、４５７ｍＭ、４５８ｍＭ、４５９ｍＭ、４６０ｍＭ、４６１ｍＭ、４６２ｍＭ、４６３ｍＭ、４６４ｍＭ、４６５ｍＭ、４６６ｍＭ、４６７ｍＭ、４６８ｍＭ、４６９ｍＭ、４７０ｍＭ、４７１ｍＭ、４７２ｍＭ、４７３ｍＭ、４７４ｍＭ、４７５ｍＭ、４７６ｍＭ、４７７ｍＭ、４７８ｍＭ、４７９ｍＭ、４８０ｍＭ、４８１ｍＭ、４８２ｍＭ、４８３ｍＭ、４８４ｍＭ、４８５ｍＭ、４８６ｍＭ、４８７ｍＭ、４８８ｍＭ、４８９ｍＭ、４９０ｍＭ、４９１ｍＭ、４９２ｍＭ、４９３ｍＭ、４９４ｍＭ、４９５ｍＭ、４９６ｍＭ、４９７ｍＭ、４９８ｍＭ、４９９ｍＭ、もしくは約５００ｍＭ、またはこれらの間の任意の濃度のカリウムを含み得る。
【0073】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物中の塩は、約１ｍＭ～約３０ｍＭの間の濃度、例えば、約１ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２ｍＭ、２．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．３ｍＭ、２．４ｍＭ、２．５ｍＭ、２．６ｍＭ、２．７ｍＭ、２．８ｍＭ、２．９ｍＭ、３ｍＭ、３．１ｍＭ、３．２ｍＭ、３．３ｍＭ、３．４ｍＭ、３．５ｍＭ、３．６ｍＭ、３．７ｍＭ、３．８ｍＭ、３．９ｍＭ、４ｍＭ、４．１ｍＭ、４．２ｍＭ、４．３ｍＭ、４．４ｍＭ、４．５ｍＭ、４．６ｍＭ、４．７ｍＭ、４．８ｍＭ、４．９ｍＭ、５ｍＭ、５．１ｍＭ、５．２ｍＭ、５．３ｍＭ、５．４ｍＭ、５．５ｍＭ、５．６ｍＭ、５．７ｍＭ、５．８ｍＭ、５．９ｍＭ、６ｍＭ、６．１ｍＭ、６．２ｍＭ、６．３ｍＭ、６．４ｍＭ、６．５ｍＭ、６．６ｍＭ、６．７ｍＭ、６．８ｍＭ、６．９ｍＭ、７ｍＭ、７．１ｍＭ、７．２ｍＭ、７．３ｍＭ、７．４ｍＭ、７．５ｍＭ、７．６ｍＭ、７．７ｍＭ、７．８ｍＭ、７．９ｍＭ、８ｍＭ、８．１ｍＭ、８．２ｍＭ、８．３ｍＭ、８．４ｍＭ、８．５ｍＭ、８．６ｍＭ、８．７ｍＭ、８．８ｍＭ、８．９ｍＭ、９ｍＭ、９．１ｍＭ、９．２ｍＭ、９．３ｍＭ、９．４ｍＭ、９．５ｍＭ、９．６ｍＭ、９．７ｍＭ、９．８ｍＭ、９．９ｍＭ、１０ｍＭ、１０．１ｍＭ、１０．２ｍＭ、１０．３ｍＭ、１０．４ｍＭ、１０．５ｍＭ、１０．６ｍＭ、１０．７ｍＭ、１０．８ｍＭ、１０．９ｍＭ、１１ｍＭ、１１．１ｍＭ、１１．２ｍＭ、１１．３ｍＭ、１１．４ｍＭ、１１．５ｍＭ、１１．６ｍＭ、１１．７ｍＭ、１１．８ｍＭ、１１．９ｍＭ、１２ｍＭ、１２．１ｍＭ、１２．２ｍＭ、１２．３ｍＭ、１２．４ｍＭ、１２．５ｍＭ、１２．６ｍＭ、１２．７ｍＭ、１２．８ｍＭ、１２．９ｍＭ、１３ｍＭ、１３．１ｍＭ、１３．２ｍＭ、１３．３ｍＭ、１３．４ｍＭ、１３．５ｍＭ、１３．６ｍＭ、１３．７ｍＭ、１３．８ｍＭ、１３．９ｍＭ、１４ｍＭ、１４．１ｍＭ、１４．２ｍＭ、１４．３ｍＭ、１４．４ｍＭ、１４．５ｍＭ、１４．６ｍＭ、１４．７ｍＭ、１４．８ｍＭ、１４．９ｍＭ、１５ｍＭ、１５．１ｍＭ、１５．２ｍＭ、１５．３ｍＭ、１５．４ｍＭ、１５．５ｍＭ、１５．６ｍＭ、１５．７ｍＭ、１５．８ｍＭ、１５．９ｍＭ、１６ｍＭ、１６．１ｍＭ、１６．２ｍＭ、１６．３ｍＭ、１６．４ｍＭ、１６．５ｍＭ、１６．６ｍＭ、１６．７ｍＭ、１６．８ｍＭ、１６．９ｍＭ、１７ｍＭ、１７．１ｍＭ、１７．２ｍＭ、１７．３ｍＭ、１７．４ｍＭ、１７．５ｍＭ、１７．６ｍＭ、１７．７ｍＭ、１７．８ｍＭ、１７．９ｍＭ、１８ｍＭ、１８．１ｍＭ、１８．２ｍＭ、１８．３ｍＭ、１８．４ｍＭ、１８．５ｍＭ、１８．６ｍＭ、１８．７ｍＭ、１８．８ｍＭ、１８．９ｍＭ、１９ｍＭ、１９．１ｍＭ、１９．２ｍＭ、１９．３ｍＭ、１９．４ｍＭ、１９．５ｍＭ、１９．６ｍＭ、１９．７ｍＭ、１９．８ｍＭ、１９．９ｍＭ、２０ｍＭ、２０．１ｍＭ、２０．２ｍＭ、２０．３ｍＭ、２０．４ｍＭ、２０．５ｍＭ、２０．６ｍＭ、２０．７ｍＭ、２０．８ｍＭ、２０．９ｍＭ、２１ｍＭ、２１．１ｍＭ、２１．２ｍＭ、２１．３ｍＭ、２１．４ｍＭ、２１．５ｍＭ、２１．６ｍＭ、２１．７ｍＭ、２１．８ｍＭ、２１．９ｍＭ、２２ｍＭ、２２．１ｍＭ、２２．２ｍＭ、２２．３ｍＭ、２２．４ｍＭ、２２．５ｍＭ、２２．６ｍＭ、２２．７ｍＭ、２２．８ｍＭ、２２．９ｍＭ、２３ｍＭ、２３．１ｍＭ、２３．２ｍＭ、２３．３ｍＭ、２３．４ｍＭ、２３．５ｍＭ、２３．６ｍＭ、２３．７ｍＭ、２３．８ｍＭ、２３．９ｍＭ、２４ｍＭ、２４．１ｍＭ、２４．２ｍＭ、２４．３ｍＭ、２４．４ｍＭ、２４．５ｍＭ、２４．６ｍＭ、２４．７ｍＭ、２４．８ｍＭ、２４．９ｍＭ、２５ｍＭ、２５．１ｍＭ、２５．２ｍＭ、２５．３ｍＭ、２５．４ｍＭ、２５．５ｍＭ、２５．６ｍＭ、２５．７ｍＭ、２５．８ｍＭ、２５．９ｍＭ、２６ｍＭ、２６．１ｍＭ、２６．２ｍＭ、２６．３ｍＭ、２６．４ｍＭ、２６．５ｍＭ、２６．６ｍＭ、２６．７ｍＭ、２６．８ｍＭ、２６．９ｍＭ、２７ｍＭ、２７．１ｍＭ、２７．２ｍＭ、２７．３ｍＭ、２７．４ｍＭ、２７．５ｍＭ、２７．６ｍＭ、２７．７ｍＭ、２７．８ｍＭ、２７．９ｍＭ、２８ｍＭ、２８．１ｍＭ、２８．２ｍＭ、２８．３ｍＭ、２８．４ｍＭ、２８．５ｍＭ、２８．６ｍＭ、２８．７ｍＭ、２８．８ｍＭ、２８．９ｍＭ、２９ｍＭ、２９．１ｍＭ、２９．２ｍＭ、２９．３ｍＭ、２９．４ｍＭ、２９．５ｍＭ、２９．６ｍＭ、２９．７ｍＭ、２９．８ｍＭ、２９．９ｍＭ、もしくは３０ｍＭ、またはこれらの間の任意の濃度のマグネシウムを含み得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物中の塩は、上記で開示される濃度のカリウムおよび上記で開示される濃度のマグネシウムを含み得る。
【0074】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物中の塩は、約１ｍＭ～約４００ｍＭの間の濃度、例えば、約１ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２ｍＭ、２．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．３ｍＭ、２．４ｍＭ、２．５ｍＭ、２．６ｍＭ、２．７ｍＭ、２．８ｍＭ、２．９ｍＭ、３ｍＭ、３．１ｍＭ、３．２ｍＭ、３．３ｍＭ、３．４ｍＭ、３．５ｍＭ、３．６ｍＭ、３．７ｍＭ、３．８ｍＭ、３．９ｍＭ、４ｍＭ、４．１ｍＭ、４．２ｍＭ、４．３ｍＭ、４．４ｍＭ、４．５ｍＭ、４．６ｍＭ、４．７ｍＭ、４．８ｍＭ、４．９ｍＭ、５ｍＭ、５．１ｍＭ、５．２ｍＭ、５．３ｍＭ、５．４ｍＭ、５．５ｍＭ、５．６ｍＭ、５．７ｍＭ、５．８ｍＭ、５．９ｍＭ、６ｍＭ、６．１ｍＭ、６．２ｍＭ、６．３ｍＭ、６．４ｍＭ、６．５ｍＭ、６．６ｍＭ、６．７ｍＭ、６．８ｍＭ、６．９ｍＭ、７ｍＭ、７．１ｍＭ、７．２ｍＭ、７．３ｍＭ、７．４ｍＭ、７．５ｍＭ、７．６ｍＭ、７．７ｍＭ、７．８ｍＭ、７．９ｍＭ、８ｍＭ、８．１ｍＭ、８．２ｍＭ、８．３ｍＭ、８．４ｍＭ、８．５ｍＭ、８．６ｍＭ、８．７ｍＭ、８．８ｍＭ、８．９ｍＭ、９ｍＭ、９．１ｍＭ、９．２ｍＭ、９．３ｍＭ、９．４ｍＭ、９．５ｍＭ、９．６ｍＭ、９．７ｍＭ、９．８ｍＭ、９．９ｍＭ、１０ｍＭ、１０．１ｍＭ、１０．２ｍＭ、１０．３ｍＭ、１０．４ｍＭ、１０．５ｍＭ、１０．６ｍＭ、１０．７ｍＭ、１０．８ｍＭ、１０．９ｍＭ、１１ｍＭ、１１．１ｍＭ、１１．２ｍＭ、１１．３ｍＭ、１１．４ｍＭ、１１．５ｍＭ、１１．６ｍＭ、１１．７ｍＭ、１１．８ｍＭ、１１．９ｍＭ、１２ｍＭ、１２．１ｍＭ、１２．２ｍＭ、１２．３ｍＭ、１２．４ｍＭ、１２．５ｍＭ、１２．６ｍＭ、１２．７ｍＭ、１２．８ｍＭ、１２．９ｍＭ、１３ｍＭ、１３．１ｍＭ、１３．２ｍＭ、１３．３ｍＭ、１３．４ｍＭ、１３．５ｍＭ、１３．６ｍＭ、１３．７ｍＭ、１３．８ｍＭ、１３．９ｍＭ、１４ｍＭ、１４．１ｍＭ、１４．２ｍＭ、１４．３ｍＭ、１４．４ｍＭ、１４．５ｍＭ、１４．６ｍＭ、１４．７ｍＭ、１４．８ｍＭ、１４．９ｍＭ、１５ｍＭ、１５．１ｍＭ、１５．２ｍＭ、１５．３ｍＭ、１５．４ｍＭ、１５．５ｍＭ、１５．６ｍＭ、１５．７ｍＭ、１５．８ｍＭ、１５．９ｍＭ、１６ｍＭ、１６．１ｍＭ、１６．２ｍＭ、１６．３ｍＭ、１６．４ｍＭ、１６．５ｍＭ、１６．６ｍＭ、１６．７ｍＭ、１６．８ｍＭ、１６．９ｍＭ、１７ｍＭ、１７．１ｍＭ、１７．２ｍＭ、１７．３ｍＭ、１７．４ｍＭ、１７．５ｍＭ、１７．６ｍＭ、１７．７ｍＭ、１７．８ｍＭ、１７．９ｍＭ、１８ｍＭ、１８．１ｍＭ、１８．２ｍＭ、１８．３ｍＭ、１８．４ｍＭ、１８．５ｍＭ、１８．６ｍＭ、１８．７ｍＭ、１８．８ｍＭ、１８．９ｍＭ、１９ｍＭ、１９．１ｍＭ、１９．２ｍＭ、１９．３ｍＭ、１９．４ｍＭ、１９．５ｍＭ、１９．６ｍＭ、１９．７ｍＭ、１９．８ｍＭ、１９．９ｍＭ、２０ｍＭ、２０．５ｍＭ、２１ｍＭ、２１．５ｍＭ、２２ｍＭ、２２．５ｍＭ、２３ｍＭ、２３．５ｍＭ、２４ｍＭ、２４．５ｍＭ、２５ｍＭ、２５．５ｍＭ、２６ｍＭ、２６．５ｍＭ、２７ｍＭ、２７．５ｍＭ、２８ｍＭ、２８．５ｍＭ、２９ｍＭ、２９．５ｍＭ、３０ｍＭ、３０．５ｍＭ、３１ｍＭ、３１．５ｍＭ、３２ｍＭ、３２．５ｍＭ、３３ｍＭ、３３．５ｍＭ、３４ｍＭ、３４．５ｍＭ、３５ｍＭ、３５．５ｍＭ、３６ｍＭ、３６．５ｍＭ、３７ｍＭ、３７．５ｍＭ、３８ｍＭ、３８．５ｍＭ、３９ｍＭ、３９．５ｍＭ、４０ｍＭ、４０．５ｍＭ、４１ｍＭ、４１．５ｍＭ、４２ｍＭ、４２．５ｍＭ、４３ｍＭ、４３．５ｍＭ、４４ｍＭ、４４．５ｍＭ、４５ｍＭ、４５．５ｍＭ、４６ｍＭ、４６．５ｍＭ、４７ｍＭ、４７．５ｍＭ、４８ｍＭ、４８．５ｍＭ、４９ｍＭ、４９．５ｍＭ、５０ｍＭ、５１ｍＭ、５２ｍＭ、５３ｍＭ、５４ｍＭ、５５ｍＭ、５６ｍＭ、５７ｍＭ、５８ｍＭ、５９ｍＭ、６０ｍＭ、６１ｍＭ、６２ｍＭ、６３ｍＭ、６４ｍＭ、６５ｍＭ、６６ｍＭ、６７ｍＭ、６８ｍＭ、６９ｍＭ、７０ｍＭ、７１ｍＭ、７２ｍＭ、７３ｍＭ、７４ｍＭ、７５ｍＭ、７６ｍＭ、７７ｍＭ、７８ｍＭ、７９ｍＭ、８０ｍＭ、８１ｍＭ、８２ｍＭ、８３ｍＭ、８４ｍＭ、８５ｍＭ、８６ｍＭ、８７ｍＭ、８８ｍＭ、８９ｍＭ、９０ｍＭ、９１ｍＭ、９２ｍＭ、９３ｍＭ、９４ｍＭ、９５ｍＭ、９６ｍＭ、９７ｍＭ、９８ｍＭ、９９ｍＭ、１００ｍＭ、１０１ｍＭ、１０２ｍＭ、１０３ｍＭ、１０４ｍＭ、１０５ｍＭ、１０６ｍＭ、１０７ｍＭ、１０８ｍＭ、１０９ｍＭ、１１０ｍＭ、１１１ｍＭ、１１２ｍＭ、１１３ｍＭ、１１４ｍＭ、１１５ｍＭ、１１６ｍＭ、１１７ｍＭ、１１８ｍＭ、１１９ｍＭ、１２０ｍＭ、１２１ｍＭ、１２２ｍＭ、１２３ｍＭ、１２４ｍＭ、１２５ｍＭ、１２６ｍＭ、１２７ｍＭ、１２８ｍＭ、１２９ｍＭ、１３０ｍＭ、１３１ｍＭ、１３２ｍＭ、１３３ｍＭ、１３４ｍＭ、１３５ｍＭ、１３６ｍＭ、１３７ｍＭ、１３８ｍＭ、１３９ｍＭ、１４０ｍＭ、１４１ｍＭ、１４２ｍＭ、１４３ｍＭ、１４４ｍＭ、１４５ｍＭ、１４６ｍＭ、１４７ｍＭ、１４８ｍＭ、１４９ｍＭ、１５０ｍＭ、１５１ｍＭ、１５２ｍＭ、１５３ｍＭ、１５４ｍＭ、１５５ｍＭ、１５６ｍＭ、１５７ｍＭ、１５８ｍＭ、１５９ｍＭ、１６０ｍＭ、１６１ｍＭ、１６２ｍＭ、１６３ｍＭ、１６４ｍＭ、１６５ｍＭ、１６６ｍＭ、１６７ｍＭ、１６８ｍＭ、１６９ｍＭ、１７０ｍＭ、１７１ｍＭ、１７２ｍＭ、１７３ｍＭ、１７４ｍＭ、１７５ｍＭ、１７６ｍＭ、１７７ｍＭ、１７８ｍＭ、１７９ｍＭ、１８０ｍＭ、１８１ｍＭ、１８２ｍＭ、１８３ｍＭ、１８４ｍＭ、１８５ｍＭ、１８６ｍＭ、１８７ｍＭ、１８８ｍＭ、１８９ｍＭ、１９０ｍＭ、１９１ｍＭ、１９２ｍＭ、１９３ｍＭ、１９４ｍＭ、１９５ｍＭ、１９６ｍＭ、１９７ｍＭ、１９８ｍＭ、１９９ｍＭ、２００ｍＭ、２０５ｍＭ、２１０ｍＭ、２１５ｍＭ、２２０ｍＭ、２２５ｍＭ、２３０ｍＭ、２３５ｍＭ、２４０ｍＭ、２４５ｍＭ、２５０ｍＭ、２５５ｍＭ、２６０ｍＭ、２６５ｍＭ、２７０ｍＭ、２７５ｍＭ、２８０ｍＭ、２８５ｍＭ、２９０ｍＭ、２９５ｍＭ、３００ｍＭ、３０５ｍＭ、３１０ｍＭ、３１５ｍＭ、３２０ｍＭ、３２５ｍＭ、３３０ｍＭ、３３５ｍＭ、３４０ｍＭ、３４５ｍＭ、３５０ｍＭ、３５５ｍＭ、３６０ｍＭ、３６５ｍＭ、３７０ｍＭ、３７５ｍＭ、３８０ｍＭ、３８５ｍＭ、３９０ｍＭ、３９５ｍＭ、もしくは約４００ｍＭ、またはこれらの間の任意の濃度のアンモニウムを含み得る。
【0075】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、核酸転写テンプレートを含み得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、核酸翻訳テンプレートを含み得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、核酸転写テンプレートおよび核酸翻訳テンプレートの両方を含み得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、ポリメラーゼを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ポリメラーゼは、核酸転写テンプレートから核酸翻訳テンプレートを生成し得る。いくつかの実施形態において、上記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ポリメラーゼは、内因性ポリメラーゼ、すなわち、上記細胞抽出物中に存在し、上記細胞に由来するポリメラーゼを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ポリメラーゼは、外因性ポリメラーゼ、すなわち、上記細胞抽出物に添加されるポリメラーゼを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ポリメラーゼは、上記細胞抽出物の調製のために使用される細胞に存在するプラスミドから発現され得る。いくつかの実施形態において、上記ポリメラーゼは、上記細胞抽出物の調製のために使用される細胞のゲノムにおける部位から発現され得る。
【0076】
いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドをコードする核酸は、ＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、上記ポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み得る。上記オープンリーディングフレームは、ポリペプチドのアミノ酸コード配列である。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドのオープンリーディングフレームは、上記プロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、上記オープンリーディングフレームの５’末端にまたは５’末端の上流に位置したリボソーム結合部位を含み得る。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、上記オープンリーディングフレームの３’末端にまたは３’末端の下流に位置したターミネーターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、Ｔ７プロモーターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７プロモーターは、５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ－３’（配列番号１）と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％ 配列同一性を有する配列を含み得る。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７プロモーターは、配列番号１を含み得る。いくつかの実施形態において、上記ターミネーターは、Ｔ７ターミネーターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７ターミネーターは、５’－ＣＴＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＧＴＣＴＴＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧ－３’（配列番号２）と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％ 配列同一性を有する配列を含み得る。いくつかの実施形態において、上記Ｔ７ターミネーターは、配列番号２を含み得る。
【0077】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記反応混合物をインキュベートして、上記ポリペプチドを生成する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物は、上記インキュベートする工程の前に、遠心分離を介する清澄化に供されない。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＣＦＰＳのための方法は、上記反応混合物から上記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含し得る。
【0078】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１℃～約４０℃の間の温度、例えば、約１℃、１．５℃、２℃、２．５℃、３℃、３．５℃、４℃、４．５℃、５℃、５．５℃、６℃、６．５℃、７℃、７．５℃、８℃、８．５℃、９℃、９．５℃、１０℃、１０．５℃、１１℃、１１．５℃、１２℃、１２．５℃、１３℃、１３．５℃、１４℃、１４．５℃、１５℃、１５．５℃、１６℃、１６．５℃、１７℃、１７．５℃、１８℃、１８．５℃、１９℃、１９．５℃、２０℃、２０．５℃、２１℃、２１．５℃、２２℃、２２．５℃、２３℃、２３．５℃、２４℃、２４．５℃、２５℃、２５．５℃、２６℃、２６．５℃、２７℃、２７．５℃、２８℃、２８．５℃、２９℃、２９．５℃、３０℃、３０．５℃、３１℃、３１．５℃、３２℃、３２．５℃、３３℃、３３．５℃、３４℃、３４．５℃、３５℃、３５．５℃、３６℃、３６．５℃、３７℃、３７．５℃、３８℃、３８．５℃、３９℃、３９．５℃、もしくは約４０℃、またはその間の任意の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記で開示される温度は、本明細書で開示される方法の１またはこれより多くの工程（上記細胞を成長させる工程、上記細胞を採取する工程、上記細胞を溶解して、上記細胞溶解物を生成する工程、上記細胞溶解物を上記フィルターに通して、上記細胞抽出物を生成する工程、上記細胞抽出物と上記ポリペプチドをコードする核酸とを接触させて、上記反応混合物を生成する工程、上記反応混合物をインキュベートして、上記ポリペプチドを生成する工程、および上記反応混合物から上記ポリペプチドを単離する工程が挙げられるが、これらに限定されない）に適用可能であり得る。
【0079】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物をインキュベートして、上記ポリペプチドを生成する工程は、適切な温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記反応混合物をインキュベートして、上記ポリペプチドを生成する工程は、約１０℃～約４２℃の間の温度、例えば、約１０℃、１０．５℃、１１℃、１１．５℃、１２℃、１２．５℃、１３℃、１３．５℃、１４℃、１４．５℃、１５℃、１５．５℃、１６℃、１６．５℃、１７℃、１７．５℃、１８℃、１８．５℃、１９℃、１９．５℃、２０℃、２０．５℃、２１℃、２１．５℃、２２℃、２２．５℃、２３℃、２３．５℃、２４℃、２４．５℃、２５℃、２５．５℃、２６℃、２６．５℃、２７℃、２７．５℃、２８℃、２８．５℃、２９℃、２９．５℃、３０℃、３０．５℃、３１℃、３１．５℃、３２℃、３２．５℃、３３℃、３３．５℃、３４℃、３４．５℃、３５℃、３５．５℃、３６℃、３６．５℃、３７℃、３７．５℃、３８℃、３８．５℃、３９℃、３９．５℃、４０℃、４０．５℃、４１℃、４１．５℃、もしくは約４２℃、またはこれらの間の任意の温度で行われ得る。
【0080】
いくつかの実施形態において、上記反応混合物から上記ポリペプチドを単離する工程は、約１℃～約３０℃の間の温度、例えば、約１℃、１．５℃、２℃、２．５℃、３℃、３．５℃、４℃、４．５℃、５℃、５．５℃、６℃、６．５℃、７℃、７．５℃、８℃、８．５℃、９℃、９．５℃、１０℃、１０．５℃、１１℃、１１．５℃、１２℃、１２．５℃、１３℃、１３．５℃、１４℃、１４．５℃、１５℃、１５．５℃、１６℃、１６．５℃、１７℃、１７．５℃、１８℃、１８．５℃、１９℃、１９．５℃、２０℃、２０．５℃、２１℃、２１．５℃、２２℃、２２．５℃、２３℃、２３．５℃、２４℃、２４．５℃、２５℃、２５．５℃、２６℃、２６．５℃、２７℃、２７．５℃、２８℃、２８．５℃、２９℃、２９．５℃、もしくは３０℃、またはこれらの間の任意の温度で行われ得る。
【0081】
いくつかの実施形態において、上記方法は、約１℃～約４０℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約２℃～約３９℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約３℃～約３８℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約４℃～約３７℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約５℃～約３６℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約６℃～約３５℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約７℃～約３４℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約８℃～約３３℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約９℃～約３２℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約１０℃～約３１℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約１１℃～約３０℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約１２℃～約２９℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約１３℃～約２８℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約１４℃～約２７℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約１５℃～約２６℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約１６℃～約２５℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約１７℃～約２４℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約１８℃～約２３℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約１９℃～約２２℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、約２０℃～約２１℃の間の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記で開示される温度は、本明細書で開示される方法のうちの１またはこれより多くの工程（細胞を成長させる工程、細胞を採取する工程、上記細胞を溶解して上記細胞溶解物を生成する工程、上記細胞溶解物を上記フィルターに通して、上記細胞抽出物を生成する工程、上記細胞抽出物と上記ポリペプチドをコードする核酸とを接触させて、上記反応混合物を生成する工程、および上記反応混合物をインキュベートして、上記ポリペプチドを生成する工程が挙げられるが、これらに限定されない）に適用可能であり得る。
【0082】
濾過を介して清澄化した細胞抽出物の特徴付け
本明細書で開示される方法に従って清澄化した細胞抽出物の特性は、特徴づけられ得る。例えば、上記細胞抽出物の生物学的活性は、レポータータンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼ）を生成するバッチ反応の体積収率（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｙｉｅｌｄ）によって特徴づけられ得る。
本明細書で開示される方法に従って清澄化した細胞抽出物の特性は、特徴づけられ得る。例えば、上記細胞抽出物の生物学的活性は、レポータータンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼ）を生成するバッチ反応の体積収率（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｙｉｅｌｄ）によって特徴づけられ得る。
【0083】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従って清澄化した細胞抽出物は、ＣＦＰＳ反応混合物の一部であり得る。反応混合物は、無細胞ポリペプチド合成反応を行うために必要な全ての試薬を含む場合には完全である。反応混合物の構成成分は、別個の容器中に別個に貯蔵され得、各々は、上記構成成分のうちの１またはこれより多くのものを含む。反応混合物の構成成分は、商品化のために別個にパッケージされ得、市販のキットは、反応混合物のための反応構成成分のうちの１またはこれより多くのものを含み得る。本明細書で開示される方法に従って清澄化した細胞抽出物は、ＣＦＰＳ反応混合物キットの構成成分として別個にパッケージングされ得る。
【0084】
濾過を介する細胞溶解物の清澄化のためのシステム
いくつかの実施形態において、無細胞ポリペプチド合成（ＣＦＰＳ）のためのシステムが、本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、上記システムは、ＣＦＰＳのための清澄化した細胞抽出物の調製のために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、バッチ様式、連続様式、または半連続様式で働き得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、閉鎖無菌環境内に閉じ込められ得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、無菌条件下で全体の清澄化プロセスを行い得る。
いくつかの実施形態において、無細胞ポリペプチド合成（ＣＦＰＳ）のためのシステムが、本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、上記システムは、ＣＦＰＳのための清澄化した細胞抽出物の調製のために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、バッチ様式、連続様式、または半連続様式で働き得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、閉鎖無菌環境内に閉じ込められ得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、無菌条件下で全体の清澄化プロセスを行い得る。
【0085】
いくつかの実施形態において、ＣＦＰＳのためのシステムが、本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、上記システムは、本明細書で開示されるデバイスのうちの１またはこれより多くのものを含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、本明細書で開示されるフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、細胞溶解物を受容し得、濾過を介して上記細胞溶解物を清澄化して、ＣＦＰＳのための細胞抽出物を生成し得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、ポンプを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ポンプは、上記システム内部の上記細胞溶解物の流れおよび／または圧力を制御するように構成され得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、少なくとも１つ、２つまたはこれより多くの本明細書で開示されるフィルターを含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、上記フィルターは、上記細胞溶解物から、約０．４ミクロン、約０．２ミクロン、または約０．１ミクロンより大きいサイズを有する粒子を除去するように構成された孔を含む媒体を含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、第１のフィルターおよび第２のフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記第１のフィルターは、デプスフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記デプスフィルターは、レンチキュラーフィルター、ディープベッドフィルター、パッドフィルター、パネルフィルター、カートリッジタイプデプスフィルター、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記第２のフィルターは、表面フィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記第２のフィルターは、デプスフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記第２のフィルターは、滅菌グレードの膜を含むフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、本明細書で開示される他のデバイス（細胞培養容器、細胞採取デバイス、細胞溶解デバイス、ＣＦＰＳのためのデバイス、またはポリペプチド単離デバイスが挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。
【0086】
いくつかの実施形態において、上記ＣＦＰＳシステムは、本明細書で開示されるＣＦＰＳ方法において使用されるデバイスを含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、細胞溶解物の清澄化のために本明細書で開示されるフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、細胞溶解物を受容するように構成され得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、少なくとも２つの本明細書で開示されるフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記少なくとも２つのフィルターは、互いと流体連絡した状態にあり得る。いくつかの実施形態において、上記フィルターは、本明細書で開示されるデプスフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、約０．５ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持する本明細書で開示されるフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、約１５ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持する本明細書で開示される第１のフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、約０．５ミクロン～約１５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持する本明細書で開示される第１のフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、約０．５ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持する本明細書で開示される第２のフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、約０．２ミクロン～約０．５ミクロンの間のサイズを有する粒子を保持する本明細書で開示される第２のフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、本明細書で開示される滅菌グレードの膜を有するフィルターを含み得る。いくつかの実施形態において、滅菌グレードの膜を有する上記フィルターは、約０．１ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持し得る。いくつかの実施形態において、滅菌グレードの膜を有する上記フィルターは、約０．２ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持し得る。いくつかの実施形態において、滅菌グレードの膜を有する上記フィルターは、約０．４ミクロンより大きいサイズを有する粒子を保持し得る。
【0087】
いくつかの実施形態において、上記システムは、バイオリアクターをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、上記バイオリアクターは、ＣＦＰＳのための細胞抽出物を調製するために使用される、本明細書で開示される細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、上記細胞は、本明細書で開示される培養された細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、上記細胞は、少なくとも２種の細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、上記細胞は、本明細書で開示される細胞培養物を含み得る。いくつかの実施形態において、上記バイオリアクターは、バッチバイオリアクター、フェドバッチバイオリアクター、連続式バイオリアクター、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記連続式バイオリアクターは、連続灌流発酵バイオリアクターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記バイオリアクターは、任意の適切な材料を含み得る。いくつかの実施形態において、上記材料は、ステンレス鋼、プラスチック、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記バイオリアクターは、任意の適切なサイズのものであり得る。いくつかの実施形態において、上記バイオリアクターは、１回使い切りバイオリアクターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記１回使い切りバイオリアクターは、可撓性の折りたたみ式バッグの形態にあり得る。
【0088】
いくつかの実施形態において、上記システムは、本明細書で開示される細胞溶解器具を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞溶解プロセスは、上記バイオリアクター中で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、上記細胞膜を破壊して、上記細胞溶解物を生成するために使用される剪断デバイスまたは超音波処理デバイスを含み得る。いくつかの実施形態において、上記バイオリアクターは、上記システムの別の構成成分と流体連絡した状態にあり得る。いくつかの実施形態において、流体は、上記バイオリアクターから細胞溶解デバイスへと再循環され得る。いくつかの実施形態において、流体は、上記バイオリアクターからホモジナイザーへと再循環され得る。いくつかの実施形態において、上記バイオリアクターは、上記フィルターと流体連絡した状態にあり得る。いくつかの実施形態において、細胞溶解物は、上記バイオリアクターから上記フィルターへと流動し得る。
【0089】
いくつかの実施形態において、上記バイオリアクターは、細胞培養にのみ使用されて、上記細胞溶解プロセスに使用されないことがあり、細胞溶解プロセスは、別個の細胞溶解器具（例えば、細胞溶解容器）中で行われる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞溶解デバイスは、本明細書で開示されるフィルターと流体連絡した状態にあり得る。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解容器は、本明細書で開示される細胞溶解プロセスに適した容器を含み得る。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解容器は、本明細書で開示されるＣＦＰＳ方法において使用される、上記細胞培養の容積、採取される細胞の容積、または再懸濁される細胞の容積に基づいて選択され得る。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解容器は、タンク、試験管、ビーカー、フラスコ、マルチウェルプレート、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記細胞溶解デバイスは、ホモジナイザー、ソニケーター、熱交換器、窒素キャビテーションデバイス、凍結融解デバイス、音波溶解デバイス、ビーズによる破砕システム、シリンジ、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記溶解デバイスは、細胞溶解物を生成するために上記溶解容器へと作動可能に連結され得る。
【0090】
いくつかの実施形態において、上記システムは、本明細書で開示されるＣＦＰＳの調製のために使用される細胞培養物を濃縮するために構成されたデバイスを含み得る。いくつかの実施形態において、細胞培養物を濃縮するためのデバイスは、遠心分離機、タンジェンシャルフロー濾過デバイス、中空ファイバー濾過装置、膜分離デバイス、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記膜分離デバイスは、織布膜、不織布膜、エレクトロスピニングによる膜（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、中空ファイバー膜、圧延シート膜（ｒｏｌｌｅｄ ｓｈｅｅｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、フラットシート膜、またはこれらの組み合わせを含み得る。
【0091】
いくつかの実施形態において、上記システムは、レザバを含み得る。いくつかの実施形態において、上記レザバは、懸濁媒体であって、その媒体を上記システムの細胞溶解デバイスに供給するように構成された懸濁媒体を含み得る。いくつかの実施形態において、上記レザバは、懸濁媒体であって、その媒体を、溶解デバイスの内部で細胞を再懸濁するためのデバイスに供給するように構成された媒体を含み得る。いくつかの実施形態において、上記レザバは、懸濁媒体であって、その媒体を本明細書で開示される細胞溶解デバイスに供給するように構成された媒体を含み得る。いくつかの実施形態において、上記溶解デバイスの内部で細胞を再懸濁するためのデバイスは、上記細胞を混合するためのデバイスを含み得る。
【0092】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるシステムの１つの構成要素は、入り口を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるシステムの１つの構成要素は、出口を含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムの１つの構成要素は、上記システムの別の構成要素と流体連絡した状態にあり得る。いくつかの実施形態において、上記システムの１つの構成要素は、上記システムのうちの少なくとも別の構成要素と流体連絡した状態にあり得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるシステムの２つの構成要素はともに、入り口および出口を含み得、一方の構成要素の出口から他方の構成要素の入り口へと流動し得るように、互いと流体連絡した状態にあり得る。
【0093】
いくつかの実施形態において、上記システムは、上記清澄化した細胞抽出物を処理するための清澄化後デバイスを含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、流出反応（ｒｕｎ－ｏｆｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うためにインキュベーターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、上記清澄化した細胞抽出物の無菌性を検証するための、インキュベーターを含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、膜デバイスを含み得る。いくつかの実施形態において、上記膜デバイスは、脱塩または透析のために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記膜デバイスは、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）デバイス、中空ファイバー、透析膜、またはこれらの組み合わせを含み得る。
【0094】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるシステムは、上記清澄化した細胞抽出物を、ＣＦＰＳのためのリアクター容器へと送達するように構成され得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、上記清澄化した細胞抽出物を急速凍結または凍結乾燥するために構成され得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、上記清澄化した細胞抽出物を貯蔵するために構成され得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、上記清澄化した細胞抽出物を液体窒素中で貯蔵するために構成され得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、上記清澄化した細胞抽出物を、約－２００℃～２５℃の間の温度、例えば、約－２００℃、－１９９℃、－１９８℃、－１９７℃、－１９６℃、－１９５℃、－１９４℃、－１９３℃、－１９２℃、－１９１℃、－１９０℃、－１８９℃、－１８８℃、－１８７℃、－１８６℃、－１８５℃、－１８４℃、－１８３℃、－１８２℃、－１８１℃、－１８０℃、－１７９℃、－１７８℃、－１７７℃、－１７６℃、－１７５℃、－１７４℃、－１７３℃、－１７２℃、－１７１℃、－１７０℃、－１６９℃、－１６８℃、－１６７℃、－１６６℃、－１６５℃、－１６４℃、－１６３℃、－１６２℃、－１６１℃、－１６０℃、－１５９℃、－１５８℃、－１５７℃、－１５６℃、－１５５℃、－１５４℃、－１５３℃、－１５２℃、－１５１℃、－１５０℃、－１４９℃、－１４８℃、－１４７℃、－１４６℃、－１４５℃、－１４４℃、－１４３℃、－１４２℃、－１４１℃、－１４０℃、－１３９℃、－１３８℃、－１３７℃、－１３６℃、－１３５℃、－１３４℃、－１３３℃、－１３２℃、－１３１℃、－１３０℃、－１２９℃、－１２８℃、－１２７℃、－１２６℃、－１２５℃、－１２４℃、－１２３℃、－１２２℃、－１２１℃、－１２０℃、－１１９℃、－１１８℃、－１１７℃、－１１６℃、－１１５℃、－１１４℃、－１１３℃、－１１２℃、－１１１℃、－１１０℃、－１０９℃、－１０８℃、－１０７℃、－１０６℃、－１０５℃、－１０４℃、－１０３℃、－１０２℃、－１０１℃、－１００℃、－９９℃、－９８℃、－９７℃、－９６℃、－９５℃、－９４℃、－９３℃、－９２℃、－９１℃、－９０℃、－８９℃、－８８℃、－８７℃、－８６℃、－８５℃、－８４℃、－８３℃、－８２℃、－８１℃、－８０℃、－７９℃、－７８℃、－７７℃、－７６℃、－７５℃、－７４℃、－７３℃、－７２℃、－７１℃、－７０℃、－６９℃、－６８℃、－６７℃、－６６℃、－６５℃、－６４℃、－６３℃、－６２℃、－６１℃、－６０℃、－５９℃、－５８℃、－５７℃、－５６℃、－５５℃、－５４℃、－５３℃、－５２℃、－５１℃、－５０℃、－４９℃、－４８℃、－４７℃、－４６℃、－４５℃、－４４℃、－４３℃、－４２℃、－４１℃、－４０℃、－３９℃、－３８℃、－３７℃、－３６℃、－３５℃、－３４℃、－３３℃、－３２℃、－３１℃、－３０℃、－２９℃、－２８℃、－２７℃、－２６℃、－２５℃、－２４℃、－２３℃、－２２℃、－２１℃、－２０℃、－１９℃、－１８℃、－１７℃、－１６℃、－１５℃、－１４℃、－１３℃、－１２℃、－１１℃、－１０℃、－９℃、－８℃、－７℃、－６℃、－５℃、－４℃、－３℃、－２℃、－１℃、０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、もしくは２５℃、またはこれらの間の任意の温度で貯蔵するために構成され得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、ＣＦＰＳを介して生成されるポリペプチドを単離または抽出するための器具を含み得る。
【0095】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるシステムの構成要素は、プロセス機器ユニットを利用し得る。いくつかの実施形態において、上記プロセス機器ユニットは、ポンプ、バルブ、センサー、または細胞溶解物および細胞抽出物を含む流体の流動を制御するためのデバイスホルダー、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記ポンプは、真空ポンプまたは蠕動ポンプを含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、上記システムの２またはこれより多くの構成要素の間で連続的な流体連絡のために構成され得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、流体が中断することなく上記システムの各構成要素を介して直接流動し得るように構成され得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、バルブ、センサー、検出器、サージタンク、および上記システムの内部の流体の流れを一時的に中断して特定のユニット操作を置き換えるまたは除去し得るように任意のインライン溶液を変更するための機器を含む群から選択される１またはこれより多くのものを含み得る。
【0096】
いくつかの実施形態において、上記システムは、上記システムのプロセスパラメーターを制御および／またはモニターするためのセンサーおよび／またはプローブを含み得る。いくつかの実施形態において、上記プロセスパラメーターは、温度、圧力、ｐＨ、導電率、溶存酸素（ＤＯ）、溶存二酸化炭素、混合速度、流速、任意の他の製品パラメーター、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、上記センサーは、光学センサーを含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、プロセス制御が上記システムの無菌性を損なわない様式で達成されるように構成され得る。いくつかの実施形態において、上記センサーおよび／またはプローブは、上記センサーおよび／またはプローブの出力がターミナルボードおよび／またはリレーボックスに送られるように、センサーエレクトロニクスモジュールへと接続され得る。いくつかの実施形態において、上記感知操作の結果は、種々のパラメーター（温度、重量／容積測定値および純度が挙げられるが、これらに限定されない）の計算および制御のために、ならびにディスプレイおよびユーザーインターフェースのために、コンピューター実装制御システムへと入力され得る。いくつかの実施形態において、上記制御システムは、少なくとも１つのプロセスパラメーターを制御するために、電子システム、機械システム、空気圧システムから選択される１またはこれより多くのものを含み得る。上記制御システムが、他の機能を果たし得ることおよび本明細書で開示される実施形態が上記制御システムをいかなる様式においても任意の特定の機能または一連の機能に限定しないことは、当業者に明らかである。
【0097】
以下の実施例は、本明細書で開示される実施形態の原理および実践を当業者に対してより明らかに例証するために示され、任意の特許請求される実施形態の範囲を限定するとは解釈されるべきではない。別段述べられなければ、全ての部およびパーセンテージは、重量ベースである。
【実施例】
【0098】
実施例
以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を例証する目的で示され、本開示をいかなる様式においても限定することは意味されない。本実施例は、本明細書で記載される方法とともに、現行の好ましい実施形態の代表であり、例示であり、本開示の範囲に対する限定としては意図されない。特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨の範囲内に包含されるそこでの変更および他の使用は、当業者に想起される。
以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を例証する目的で示され、本開示をいかなる様式においても限定することは意味されない。本実施例は、本明細書で記載される方法とともに、現行の好ましい実施形態の代表であり、例示であり、本開示の範囲に対する限定としては意図されない。特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨の範囲内に包含されるそこでの変更および他の使用は、当業者に想起される。
【0099】
実施例１： 濾過を介して清澄化した細胞溶解物を使用する無細胞ポリペプチド合成
この実施例は、遠心分離を介する清澄化の従来法の代わりに、濾過を介して清澄化した粗製細胞抽出物を調製するための方法を例証する。この実施例は、濾過を介する清澄化方法が、無細胞合成反応から生成されるタンパク質の実質的な収量をもたらすことを明らかに示した。
この実施例は、遠心分離を介する清澄化の従来法の代わりに、濾過を介して清澄化した粗製細胞抽出物を調製するための方法を例証する。この実施例は、濾過を介する清澄化方法が、無細胞合成反応から生成されるタンパク質の実質的な収量をもたらすことを明らかに示した。
【0100】
細胞を、図１に図示されるように、従来の方法に従って培養し、採取し、溶解した。無細胞ポリペプチド合成の結果を、遠心分離を介して清澄化した細胞抽出物と濾過を介して清澄化した細胞抽出物との間で比較した。細胞抽出物を、遠心分離を介して清澄化して、Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物調製プロトコールにおいて以前に報告されたように、Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物を生成した。濾過を介して清澄化した上記細胞抽出物を、図２に図示されるプロセスに従って調製した。簡潔には、蠕動ポンプを使用して、濾過媒体を経る細胞抽出物の流れを引き起こした。均質化した細胞溶解物を第１のデプスフィルター（１５μｍ～０．５μｍ）を介して濾過して、第１の清澄化した細胞溶解物を生成した。次いで、その第１の清澄化した細胞溶解物を、第２のデプスフィルター（０．５μｍ～０．２μｍ）を介して濾過して、第２の清澄化した細胞溶解物を生成した。最後に、その第２の清澄化した細胞溶解物を、滅菌フィルター（０．２μｍ）を介して濾過して、無細胞ポリペプチド合成反応のための清澄化した細胞抽出物を生成した。
【0101】
次いで、遠心分離を介して清澄化した細胞抽出物および濾過を介して清澄化した細胞抽出物を、図３に図示されるプロセスに基づく無細胞ポリペプチド合成のために使用した。スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質（ｓｆＧＦＰ）をコードするＤＮＡテンプレートを、遠心分離を介して清澄化した上記細胞抽出物および濾過を介して清澄化した細胞抽出物の両方に添加した。上記ｓｆＧＦＰ ＤＮＡは、ｓｆＧＦＰのコード配列の５’末端においてＴ７プロモーターおよび強いリボソーム結合部位、ならびにｓｆＧＦＰのコード配列の３’末端にＴ７ターミネーターを含んだ。Ｔ７プロモーター配列は、配列番号１であり、Ｔ７ターミネーター配列は、配列番号２であった。これらの調節エレメントは、複雑な抽出物環境内での高レベルの転写および翻訳を確実にした。
【0102】
図４に示されるように、濾過を介して清澄化した細胞抽出物からのタンパク質収量は、ｓｆＧＦＰの合成によって明らかに示されるように、遠心分離を介して清澄化した細胞抽出物からのものに匹敵した。
【0103】
実施例２： ＣＦＰＳのタンパク質収量に対するフィルター孔サイズの効果
この実施例は、濾過を介して清澄化した上記細胞抽出物および上記濾過された細胞抽出物を使用してＣＦＰＳから生成されるタンパク質に対するフィルター孔サイズの効果を例証する。
この実施例は、濾過を介して清澄化した上記細胞抽出物および上記濾過された細胞抽出物を使用してＣＦＰＳから生成されるタンパク質に対するフィルター孔サイズの効果を例証する。
【0104】
図５に図示され、表１に列挙されるように、孔サイズのある範囲、１２～１０ミクロン、５ミクロン、１．２ミクロン、３ミクロン／０．２ミクロン、および０．２ミクロンを有するフィルターを使用して、上記細胞溶解物を濾過し、清澄化した細胞抽出物活性およびＣＦＰＳの全体的な耐容性に対するそれらの効果を評価した。遠心分離を介する細胞溶解物の清澄化のための現在の技術水準の方法と比較した場合、濾過は、無細胞ポリペプチド合成収量において減少を生じたが、なおも耐容性があった。上記細胞抽出物活性は、その宿主細胞タンパク質濃度および光学密度に関連があった。濾過プロセスにおいて使用したフィルター孔サイズが減少するにつれて、宿主細胞タンパク質濃度もまた減少した（相対的［タンパク質］％（相対的タンパク質パーセンテージ）で表示した線）。
表１
表１： 種々の清澄化方法の下でのタンパク質濃度、ＯＤ６００、および相対的タンパク質パーセンテージ（相対的［タンパク質］（％））の値
結果は、表１に列挙されるように、フィルターが宿主細胞タンパク質を捕捉しており、そのうちのいくらかが、ＣＦＰＳのために利用され得ることを示した。同様に、光学密度読み取り値（ＯＤ６００）はまた、孔サイズが小さくなるとともに減少した（ＯＤ６００で表示された線）。これは、さらなるかつより良好な清澄化を示す。これらの２つの変数、すなわち、抽出物タンパク質濃度および抽出物清澄化の程度は、十分に機能する細胞抽出物を生成するためにバランスを取る必要がある。３ミクロン／０．２ミクロンフィルターおよび０．２ミクロンフィルターを使用して調製した細胞抽出物の活性の比較は、０．２ミクロン孔サイズへと至るデプス濾過トレインが、ＣＦＰＳのために有用なそれらの宿主細胞タンパク質のうちのいくらかを、清澄化の類似のレベルを達成しながら保持する一助であることを示した。
表１
【表1】
結果は、表１に列挙されるように、フィルターが宿主細胞タンパク質を捕捉しており、そのうちのいくらかが、ＣＦＰＳのために利用され得ることを示した。同様に、光学密度読み取り値（ＯＤ６００）はまた、孔サイズが小さくなるとともに減少した（ＯＤ６００で表示された線）。これは、さらなるかつより良好な清澄化を示す。これらの２つの変数、すなわち、抽出物タンパク質濃度および抽出物清澄化の程度は、十分に機能する細胞抽出物を生成するためにバランスを取る必要がある。３ミクロン／０．２ミクロンフィルターおよび０．２ミクロンフィルターを使用して調製した細胞抽出物の活性の比較は、０．２ミクロン孔サイズへと至るデプス濾過トレインが、ＣＦＰＳのために有用なそれらの宿主細胞タンパク質のうちのいくらかを、清澄化の類似のレベルを達成しながら保持する一助であることを示した。
【0105】
実施例３： ＣＦＰＳに関するスループットおよび平均流量に対するフィルター孔サイズの効果
この実施例は、溶解物清澄化プロセスの間のスループットおよび平均流量のパラメーターに対するフィルター孔サイズの効果を例証する。
この実施例は、溶解物清澄化プロセスの間のスループットおよび平均流量のパラメーターに対するフィルター孔サイズの効果を例証する。
【0106】
スループット（すなわち、フィルター表面積あたりに濾過される溶解物の容積）および濾液の平均流量（すなわち、時間あたりでフィルター表面積あたりに濾過される溶解物の容積）は、細胞溶解物の濾過が媒介する清澄化プロセスに関する２つのパラメーターであり、濾過プロセスを最適化するために利用できた。以下のフィルターを使用した： １２～１０ミクロン、１．２ミクロン、３ミクロン／０．２ミクロン、０．２ミクロン。
【0107】
図６に図示され、表２に列挙されるように、スループットおよび平均流量を、種々のフィルター孔サイズを使用する一連の濾過プロセスにおいて測定した。
表２
表２： 種々の孔サイズのフィルターを使用する清澄化方法のスループットおよび平均流量の値
濾過プロセスの間に使用される駆動力は、モニターされた圧力とは対照的に、遠心力であった。これは、１２～１０ミクロンフィルター群および５ミクロンフィルター群のスループット間の不一致を説明し得る。なぜなら１２～１０ミクロンフィルターが、それらの比較的大きな孔サイズを与える５ミクロンフィルターより大きいかまたはこれに類似するスループットを有すると予測され得るからである。平均流量は、予測されるように、上記フィルターの孔サイズが小さくなるにつれて減少した。３ミクロン／０．２ミクロンデプスフィルターのスループットは、３ミクロン／０．２ミクロンフィルターが、最終的に小さい方の孔サイズを通って押し出し、より良好な清澄化した抽出物を生成する能力を有するという事実にもかかわらず、１．２ミクロンフィルターのものより大きかった。３ミクロン／０．２ミクロンデプスフィルターはまた、０．２ミクロンフィルター単独より大きいスループットを有した。これは、デプスフィルターまたは連続してより小さい穴を有するフィルタートレインが、類似の清澄化程度でより生産的な抽出物を生じ得るのみならず、それほど時間またはフィルター面積を要しない、従って、操作コストが下がる、より効率的なプロセスをも生じ得ることを示した。
表２
【表2】
濾過プロセスの間に使用される駆動力は、モニターされた圧力とは対照的に、遠心力であった。これは、１２～１０ミクロンフィルター群および５ミクロンフィルター群のスループット間の不一致を説明し得る。なぜなら１２～１０ミクロンフィルターが、それらの比較的大きな孔サイズを与える５ミクロンフィルターより大きいかまたはこれに類似するスループットを有すると予測され得るからである。平均流量は、予測されるように、上記フィルターの孔サイズが小さくなるにつれて減少した。３ミクロン／０．２ミクロンデプスフィルターのスループットは、３ミクロン／０．２ミクロンフィルターが、最終的に小さい方の孔サイズを通って押し出し、より良好な清澄化した抽出物を生成する能力を有するという事実にもかかわらず、１．２ミクロンフィルターのものより大きかった。３ミクロン／０．２ミクロンデプスフィルターはまた、０．２ミクロンフィルター単独より大きいスループットを有した。これは、デプスフィルターまたは連続してより小さい穴を有するフィルタートレインが、類似の清澄化程度でより生産的な抽出物を生じ得るのみならず、それほど時間またはフィルター面積を要しない、従って、操作コストが下がる、より効率的なプロセスをも生じ得ることを示した。
【0108】
実施例４： ＣＦＰＳに対する濾過トレインの効果
この実施例は、ＣＦＰＳに対するフィルタータイプおよびフィルター孔サイズの効果を例証する。
この実施例は、ＣＦＰＳに対するフィルタータイプおよびフィルター孔サイズの効果を例証する。
【0109】
デプス濾過トレインを評価するために、フィルタートレインへの種々のデプスフィルター、膜フィルター、およびこれらの組み合わせを、ＣＦＰＳのための細胞溶解物の清澄化のためのに使用して、抽出物清澄化プロセスにおけるそれらの効率を評価した。この実施例において使用される上記フィルターは、上記デプスフィルター ０．２～３．０ミクロン、０．４～１５．０ミクロン、６．０～３０．０ミクロン、０．２～０．８ミクロン、０．１～０．３ミクロン、０．２～０．５ミクロン、ならびにＰＥＳ媒体またはＰＥＳハイブリッド媒体を有するいくつかの膜フィルターを含んだ。
【0110】
溶解物清澄化の目的で、スループットおよび平均濾液定流量を、適切な測定基準と考えた。これらの測定基準を最適化するにあたって、２つの０．４～１５ミクロンデプスフィルター、続いて、０．２～０．５ミクロンデプスフィルターのトレインは、最大のスループットおよび最大の平均濾液定流量を有することが見出された。このトレインは、２× ０．２～０．８ミクロントレイン、２× ０．２～３．０ミクロントレインから０．１～０．３ミクロントレイン、ならびに６～３０ミクロンから０．２～３．０ミクロントレインより良好であることが見出された。選択したデプス濾過トレインとともに、種々の膜フィルターを試験したところ、ＰＥＳフィルターが、最高のスループットを有することが見出された。そのスループット測定基準を、スケールアップ目的で厳密に検討した。
【0111】
最終的なフィルタートレインの改変されたバージョンを使用して、溶解物清澄化プロセス後の保持された抽出物活性を確認した。上記改変されたフィルタートレインは、１つの０．４～１５ミクロンフィルター、続いて、０．２～０．５ミクロンおよび０．２ミクロンＰＥＳ膜フィルターを含んだ。上記改変されたフィルタートレインを使用して濾過した無細胞抽出物のタンパク質収量を、上記の実施例１において考察されるように、図４に図示した。
【0112】
本開示の好ましい実施形態は、上記に示され、記載されているが、このような実施形態が例証によって提供されるに過ぎないことは、当業者に明らかである。多くのバリエーション、変更、および置換はいまや、本開示から逸脱することなく当業者に想起される。本明細書で記載される開示の実施形態にする種々の変更は、本開示を実施するにあたって使用され得ることは、理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は開示の範囲を規定し、これらの請求項およびそれらの均等物の範囲内の方法および構造はそれらによって網羅されることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】