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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-19
(54)【発明の名称】組成物およびその使用
(51)【国際特許分類】
C08B 37/00 20060101AFI20240312BHJP
A61K 9/12 20060101ALI20240312BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240312BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20240312BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240312BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240312BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240312BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240312BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20240312BHJP
A61K 35/74 20150101ALI20240312BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20240312BHJP
A61M 15/08 20060101ALI20240312BHJP
【ＦＩ】
C08B37/00 P
A61K9/12
A61K9/08
A61K9/06
A61P27/02
A61P31/12
A61P31/04
A61P31/00
A61K9/19
A61K35/74 Z
C12N1/20 A
A61M15/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023548562
(86)(22)【出願日】2022-02-10
(85)【翻訳文提出日】2023-09-22
(86)【国際出願番号】 EP2022053270
(87)【国際公開番号】W WO2022171748
(87)【国際公開日】2022-08-18
(31)【優先権主張番号】21305183.2
(32)【優先日】2021-02-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
(71)【出願人】
【識別番号】515301144
【氏名又は名称】ダンスター フェルメント アーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100153693
【弁理士】
【氏名又は名称】岩田 耕一
(72)【発明者】
【氏名】デュモン，フレデリック
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C087
4C090
【Ｆターム（参考）】
4B065AA15X
4B065AC20
4B065BA22
4B065BC02
4B065BC03
4B065BC14
4B065BC50
4B065BD08
4B065BD33
4B065BD41
4B065BD50
4B065CA22
4B065CA44
4C076AA06
4C076AA09
4C076AA11
4C076AA24
4C076AA99
4C076BB01
4C076BB25
4C076BB31
4C076CC10
4C076CC31
4C076CC35
4C076FF68
4C076GG06
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC64
4C087CA10
4C087CA14
4C087CA23
4C087MA13
4C087MA17
4C087MA28
4C087MA52
4C087MA59
4C087MA63
4C087NA14
4C087ZA33
4C087ZB32
4C087ZB33
4C090AA01
4C090BA91
4C090BC19
4C090BC20
4C090BD37
4C090CA42
4C090DA22
4C090DA23
4C090DA24
(57)【要約】
本開示は、海洋細菌によって産生される菌体外多糖、その組成物、前記組成物の使用、および生物学的表面および／または非生物学的表面への前記微生物病原体の定着を阻害または低減することによって、細菌感染またはウイルス感染のいずれかの微生物病原体感染の病原性を減弱させるための方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
４０～４０００ｋＤａの範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）であって、海洋細菌の発酵によって得られるか、または得ることができる、単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）。
【請求項2】
４０～２０００ｋＤａ、４０～１４００ｋＤａ、４０～１０００ｋＤａ、４０～５００ｋＤａ、４０～４００ｋＤａ、４０～３００ｋＤａ、４０～２００ｋＤａ、４０～１５０ｋＤａ、または４０～１００ｋＤａ、好ましくは４０～１５０ｋＤａの範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、請求項１に記載の単離されたＥＰＳ。
【請求項3】
４０～１５０ｋＤａの範囲のＭｗを有し、任意選択で２６～１００ｋＤａの範囲の数平均分子量（Ｍｎ）および／または１．２～１．８の範囲の多分散性指数（Ｍｗ／Ｍｎ）を有する、請求項１または２に記載の単離されたＥＰＳ。
【請求項4】
前記ＥＰＳのグリコシル単位の総数に対して、３０～９０％の中性グリコシル単位、１０～７０％のアミノグリコシル単位、および０～１５％の酸性グリコシル単位を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離されたＥＰＳ。
【請求項5】
マンノース、ガラクトース、グルコース、Ｎ－アセチルガラクトサミンおよびＮ－アセチルグルコサミンを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたＥＰＳ。
【請求項6】
リボース、アラビノース、ラムノース、フルクトースおよび／またはフコースを実質的に含まない、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離されたＥＰＳ。
【請求項7】
前記海洋細菌がグラム陽性好熱性細菌であり、好ましくは、前記グラム陽性好熱性細菌がバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniforms）であり、より好ましくは、前記グラム陽性好熱性細菌が、２０２０年１月２７日に寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７でＮＣＩＭＢ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ， Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ）に寄託されたバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniforms）ＬＰ－Ｔ１４である、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離されたＥＰＳ。
【請求項8】
免疫応答を誘導する能力を実質的に欠く、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離されたＥＰＳ。
【請求項9】
以下のステップ：海洋細菌を第１の培養培地で培養して培養海洋細菌を得るステップ；
前記培養海洋細菌を発酵培地で発酵させるステップ；
前記発酵培地を熱処理するステップ；
前記発酵培地を遠心分離して上清を得るステップ；および
前記上清を濾過して単離されたＥＰＳを得るステップ
を含む、４０～４０００ｋＤａの範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）を得るためのプロセス。
【請求項10】
前記単離されたＥＰＳが、請求項２～６のいずれか一項に定義されるとおりであり；前記海洋細菌がグラム陽性好熱性細菌であり、好ましくは、前記グラム陽性好熱性細菌がバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）であり、より好ましくは、前記グラム陽性好熱性細菌が、２０２０年１月２７日に寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７でＮＣＩＭＢ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ， Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ）に寄託されたバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４であり;
前記発酵培地が、海塩（４０ｇ／Ｌ）、トリプトン（６ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（６ｇ／Ｌ）、消泡剤（０．３３ｍＬ／Ｌ）、デキストロース（１２ｇ／Ｌ）および脱イオンＨ２Ｏ（ｑｓｐ）を含み；
前記発酵をｐＨ５～８、４０℃で２０～４０時間、３０～５０％の酸素添加下で行い；
発酵培地の前記熱処理を、前記発酵培地を８５℃で１時間加熱することにより行い；
前記発酵培地の前記遠心分離を、流速２００～８００Ｌ／ｈのディスクスタック遠心分離機を用いて１４０００ｇで行い；および／または
上清の前記濾過が、１．６０～０．２２μｍ濾過ステップを用いた連続濾過、および／または１０～１００ｋＤａカットオフフィルターカートリッジを用いた限外濾過を含む、
請求項９に記載のプロセス。
【請求項11】
前記単離されたＥＰＳを自由乾燥させて凍結乾燥ＥＰＳを得ることをさらに含み、任意選択で、前記自由乾燥が－２０℃で少なくとも１６時間行われる、請求項９または１０に記載のプロセス。
【請求項12】
請求項１～８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）、または請求項９～１１のいずれか一項に記載のプロセスにより得られるか、もしくは得ることができる少なくとも１つの単離されたＥＰＳ、および適切な担体を含む組成物。
【請求項13】
経口組成物、鼻用組成物、局所組成物、経皮組成物、眼科用組成物、または医療用デバイスに適用するために製剤化された組成物である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
請求項１～８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）、または請求項９～１１のいずれか一項に記載のプロセスにより得られるか、もしくは得ることができる少なくとも１つの単離されたＥＰＳを含む鼻送達システム。
【請求項15】
前記鼻送達システムが、少なくとも１つの単離されたＥＰＳを点鼻薬、液体スプレー、乾燥スプレー、ゲルまたは軟膏として送達する；前記少なくとも１つの単離されたＥＰＳが、生理食塩水溶液をさらに含む組成物中で製剤化される；
前記鼻送達システムが、それを必要とする対象において微生物病原体感染を処置および／または予防するためのものであり；および／または
前記鼻送達システムが、それを必要とする対象の鼻腔への微生物病原体による定着を阻害または低減させることにより、前記微生物病原体の病原性を減弱させるためのものである、請求項１４に記載の鼻送達システム。
【請求項16】
微生物病原体による表面への定着を防止または低減するために非生物学的表面に適用するためのものであり、任意選択で、前記表面が医療用デバイスの表面である、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離されたＥＰＳ、請求項９～１１のいずれか一項に記載のプロセスによって得られるか、もしくは得ることができる単離されたＥＰＳ、または請求項１２または１３に記載の組成物の非治療的使用。
【請求項17】
それを必要とする対象における微生物病原体感染を処置および／または予防するための方法において使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）、請求項９～１１のいずれか一項に記載のプロセスによって得られるか、もしくは得ることができる単離されたＥＰＳ、請求項１２もしくは１３に記載の組成物、または請求項１４もしくは１５に記載の鼻送達システム。
【請求項18】
微生物病原体の病原性を減弱させるための方法において使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）、請求項９～１１のいずれか一項に記載のプロセスによって得られるか、もしくは得ることができる単離されたＥＰＳ、請求項１２もしくは１３に記載の組成物、または請求項１４もしくは１５に記載の鼻送達システム。
【請求項19】
それを必要とする対象において微生物病原体感染を処置および／または予防する方法であって、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）、請求項９～１１のいずれか一項に記載のプロセスによって得られるか、もしくは得ることができる単離されたＥＰＳ、または請求項１２もしくは１３に記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む方法。
【請求項20】
それを必要とする対象における微生物病原体感染の病原性を減弱させるための方法であって、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）、請求項９～１１のいずれか一項に記載のプロセスによって得られるか、もしくは得ることができる単離されたＥＰＳ、または請求項１２もしくは１３に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項21】
前記単離されたＥＰＳまたは前記組成物が、前記微生物病原体の感染前、感染中、および／または感染後に前記対象に投与され、それにより、前記対象の少なくとも１つの生体組織上への前記微生物病原体の定着および／または前記微生物病原体の内在化が予防、阻害、または低減され、前記少なくとも１つの生体組織が、口腔、鼻腔、呼吸器、咽頭、耳、眼科領域、泌尿生殖器、皮膚、頭皮、毛髪、爪、およびその組合せなどの上皮を含み；前記微生物病原体が細菌病原体であり、前記単離されたＥＰＳまたは前記組成物の前記対象への投与が、初期の細菌バイオフィルム形成を低減または阻害すること、および／または初期の細菌バイオフィルムを破壊することによって、前記細菌病原体感染の病原性を減弱させ；および／または
前記微生物病原体がウイルス病原体であり、前記単離されたＥＰＳまたは前記組成物の前記対象への投与が、同等の未処理細胞と比較して前記ウイルス病原体を接種された対象細胞の死亡率を低下させること、接種された対象細胞からのビリオンの放出を防止または減少させること、および／または未接種の隣接対象細胞の感染を防止または低減させることにより、ウイルス病原体感染の病原性を減弱させる、
請求項１７もしくは１８に記載の使用のための単離されたＥＰＳもしくは組成物、または請求項１９もしくは２０に記載の方法。
【請求項22】
前記微生物病原体が以下：キューティバクテリウム（Cutibacterium）属、ヘモフィルス（Haemophilus）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、モラクセラ（Moraxella）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、および／またはストレプトコッカス（Streptococcus）属から任意選択で選択される細菌病原体であり；好ましくは、前記細菌病原体がキューティバクテリウム・アクネス（Cutibacterium acnes）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、モラクセラ・カタラリス（Moraxella catharalis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）および／またはストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）種から任意選択で選択される細菌病原体；
インフルエンザＡ、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１／２００９／ｐｄｍ０９、インフルエンザＡ亜型Ｈ１、インフルエンザＡ亜型Ｈ３、インフルエンザＢ（オルソミクソウイルス）、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＨＫＵ１、コロナウイルスＮＬ６３、コロナウイルスＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（コロナウイルス）、パラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３、パラインフルエンザウイルス４、呼吸器合胞体ウイルスＡ／Ｂ、ヒトメタニューモウイルスＡ／Ｂ（パラミクソウイルス）、アデノウイルスおよび／もしくはライノウイルス／エンテロウイルス（ピコルナウイルス）から任意選択で選択されるウイルス病原体；または
真菌病原体
の少なくとも１つである、請求項１５に記載の鼻送達システム、請求項１６に記載の使用、請求項１７、１８もしくは２１のいずれか一項に記載の使用のための単離されたＥＰＳもしくは組成物、または請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記微生物病原体が、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）および/またはストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）種から選択される細菌病原体である、請求項２２に記載の鼻送達システム、使用、使用のための単離されたＥＰＳ、使用のための組成物、または方法。
【請求項24】
前記微生物病原体が、コロナウイルスＯＣ４３、アデノウイルス、および／またはライノウイルス／エンテロウイルス（ピコルナウイルス）から選択されるウイルス病原体である、請求項２２に記載の鼻送達システム、使用、使用のための単離されたＥＰＳ、使用のための組成物、または方法。
【請求項25】
前記組成物の総重量に基づく前記組成物中の前記少なくとも１つの単離されたＥＰＳの量が、０．００００５～０．５％ｗ／ｗ、好ましくは０．０００１～０．１％ｗ／ｗ、またはより好ましくは０．０００５～０．０５％ｗ／ｗの範囲である、請求項１２もしくは１３に記載の組成物、請求項１６に記載の使用、請求項１７、１８および２１～２４のいずれか一項に記載の使用のための組成物、または請求項１９～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
鼻腔内への微生物病原体による定着を阻害または低減させることにより、微生物病原体感染の病原性を減弱させるための鼻用組成物を製剤化する方法であって、海洋細菌に由来する少なくとも１つの単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）を、生理食塩水溶液および任意選択で適切な担体と混合し、０．１％～１０％ｗ／ｗ、好ましくは０．５％～５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．７％～３％ｗ／ｗの濃度の塩を含む鼻用組成物を得るステップを含む方法。
【請求項27】
前記少なくとも１つの単離されたＥＰＳが、請求項１～８のいずれか一項に定義されるとおりである、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記塩濃度が約０．９％ｗ／ｗ、約２．２％ｗ／ｗまたは約２．７％ｗ／ｗである、請求項２７または２８に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、海洋細菌に由来する菌体外多糖（ＥＰＳ）、その組成物、前記ＥＰＳおよび組成物の非治療的使用、ならびに前記ＥＰＳおよび組成物の治療的使用に関する。本発明はまた、前記ＥＰＳを得るためのプロセスに関する。本発明はさらに、少なくとも１つの単離された菌体外多糖を含む鼻送達システム、および前記鼻送達システムの治療的使用に関する。本発明はまた、鼻用組成物を製剤化する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
感染性疾患は通常、体内に侵入して広がる微生物によって引き起こされる。病原性微生物とも呼ばれる感染性生物には多くの種類がある。これらの微生物がどのように体内に侵入し得るのかについての例のいくつかをここに示す：口、目、鼻から、性的接触から、傷口または咬傷から、汚染された医療用デバイス。
【0003】
人々は主に汚染された水を飲んだり、または汚染された食品を食べたりすることによって、このような微生物に感染する。胞子もしくは埃を吸入したり、または他人の咳もしくはくしゃみから汚染された飛沫を吸い込んだりすることもある。また、汚染された物（例えばドアの取っ手）を扱ったり、または汚染された人と直接接触し、目、鼻、または口に触れたりすることもある。
【0004】
微生物の中には、血液、精液、および便などの体液中に拡散するものもある。例えば、感染したパートナーとの性的接触によって体内に侵入することもある。ヒトおよび動物の咬み傷、および皮膚に穴を開けるような他の創傷によって、病原性微生物が体内に侵入する可能性がある。
【0005】
病原性微生物は、体内に埋め込まれた医療用デバイス（例えばカテーテル、人工関節、または人工心臓弁）にも付着し得る。偶発的にデバイスが汚染された場合、移植時にデバイスに付着していることもある。また、他の場所からの感染物質が血流にのって広がり、すでに埋め込まれているデバイスに付着することもある。埋め込まれたデバイスは自然な防御を欠くため、このような微生物は容易に増殖および拡散し、病気を引き起こし得る。
【0006】
人体に侵入した後、病原性微生物は、感染症を引き起こすために増殖または拡散しなければならない。増殖または拡散が始まった後、３つのシナリオが起こり得る：１）微生物は増殖を続け、宿主生物の防御を圧倒する。２）均衡状態に達し、慢性感染を引き起こす。３）宿主生物が、医学的処置の有無にかかわらず、侵入微生物を破壊および排除する。
【0007】
既存の解決策（すなわち、抗生物質、抗ウイルス剤）の病原性感染を取り除く有効性は、病原体を迅速に認識した後、微生物が表面に不可逆的に付着する前に病原体抑制組成物を適用することに依存する。微生物病原体の表面への不可逆的な付着を制限し、処置に対する抵抗性の現象および、したがって関連する医療費への影響の低減を可能にする、異なるアプローチを提供されることが非常に望ましい。
【発明の概要】
【0008】
第１の態様によれば、本開示は、４０～４０００ｋＤａの範囲の重量平均分子量を有する単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）を提供し、ここで、ＥＰＳは、海洋細菌の発酵によって得られるか、または得ることができる。一実施形態において、単離されたＥＰＳは、４０～２０００ｋＤａ、４０～１４００ｋＤａ、４０～１０００ｋＤａ、４０～５００ｋＤａ、４０～４００ｋＤａ、４０～３００ｋＤａ、４０～２００ｋＤａ、４０～１５０ｋＤａ、または４０～１００ｋＤａの範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。好ましい実施形態において、単離されたＥＰＳは、４０～１５０ｋＤａの範囲のＭｗを有する。一実施形態において、単離されたＥＰＳは、４０～１５０ｋＤａの範囲のＭｗを有し、任意選択で、２６～１００ｋＤａの範囲の数平均分子量（Ｍｎ）および／または１．２～１．８の範囲の多分散性指数（Ｍｗ／Ｍｎ）を有する。一実施形態において、本明細書に記載される単離されたＥＰＳは、前記ＥＰＳのグリコシル単位の総数に関して、３０～９０％の中性グリコシル単位、１０～７０％のアミノグリコシル単位、および０～１５％の酸性グリコシル単位を含み得る。別の実施形態において、本明細書に記載される単離されたＥＰＳは、マンノース、ガラクトース、グルコース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、およびＮ－アセチルグルコサミンを含み得る。いくつかのさらなる実施形態において、本明細書に記載される単離されたＥＰＳは、リボース、アラビノース、ラムノース、フルクトースおよび／またはフコースを実質的に含まない場合がある。別の実施形態において、海洋細菌は、グラム陽性好熱性細菌、好ましくはバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、より好ましくは２０２０年１月２７日に寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７でＴｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）に寄託されたバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４であってもよい。別の実施形態において、本明細書に記載される単離されたＥＰＳは、免疫応答を誘導する能力を実質的に欠いていてもよい。
【0009】
第２の態様によれば、本開示は、以下のステップを含む、４０～４０００ｋＤａの範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）を得るためのプロセスを提供する：海洋細菌を第１の培養培地で培養して培養海洋細菌を得るステップ；培養海洋細菌を発酵培地で発酵させるステップ；発酵培地を熱処理するステップ；発酵培地を遠心分離して上清を得るステップ；および上清を濾過して単離されたＥＰＳを得るステップ。単離されたＥＰＳは、本明細書に記載される単離されたＥＰＳであってもよい。一実施形態において、海洋細菌は、グラム陽性好熱性細菌、好ましくはバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、より好ましくは２０２０年１月２７日に寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７でＴｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）に寄託されたバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４であってもよい。一実施形態において、発酵培地は、海塩（４０ｇ／Ｌ）、トリプトン（６ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（６ｇ／Ｌ）、消泡剤（０．３３ｍＬ／Ｌ）、デキストロース（１２ｇ／Ｌ）および脱イオンＨ２Ｏ（ｑｓｐ．）を含み得る。一実施形態において、発酵は、ｐＨ５～８、４０℃で２０～４０時間、３０～５０％の酸素添加下で実施することができる。一実施形態において、発酵培地の熱処理は、発酵培地を８５℃で１時間加熱することによって実施し得る。一実施形態において、発酵培地の遠心分離は、流速２００～８００Ｌ／ｈのディスクスタック遠心分離機を使用して、１４０００ｇで行うことができる。一実施形態において、上清の濾過は、１．６０～０．２２μｍの濾過ステップを使用する連続濾過、および／または１０～１００ｋＤａカットオフフィルターカートリッジを使用する限外濾過を含む。一実施形態において、本開示のプロセスは、単離されたＥＰＳを自由乾燥させて自由乾燥ＥＰＳを得ることをさらに含み得る。一実施形態において、自由乾燥は、－２０℃で少なくとも１６時間行われる。
【0010】
第３の態様によれば、本開示は、本明細書に記載される少なくとも１つの単離されたＥＰＳおよび適切な担体を含む組成物を提供する。本発明の組成物は、経口組成物、鼻用組成物、局所組成物、経皮組成物、眼科用組成物、または医療用デバイスに適用するために製剤化された組成物であり得る。
【0011】
第４の態様によれば、本開示は、本明細書に記載される少なくとも１つの単離されたＥＰＳ、または本明細書に記載されるプロセスによって得られるか、もしくは得ることができる少なくとも１つの単離されたＥＰＳを含む鼻送達システムを提供する。一実施形態において、鼻送達システムは、少なくとも１つの単離されたＥＰＳを点鼻薬、液体スプレー、乾燥スプレー、ゲルまたは軟膏として送達し得る。別の実施形態において、少なくとも１つの単離されたＥＰＳは、生理食塩水溶液をさらに含む組成物中に製剤化され得る。別の実施形態において、本明細書に記載される鼻送達システムは、それを必要とする対象における微生物病原体感染を処置および／または予防するためのものであってもよい。別の実施形態において、本明細書に記載される鼻送達システムは、それを必要とする対象における微生物病原体感染の処置および／または予防における使用のためのものであってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される鼻送達システムは、それを必要とする対象の鼻腔への微生物病原体による定着を阻害または低減することによって、微生物病原体の病原性を減弱させるためのものであってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される鼻送達システムは、それを必要とする対象の鼻腔への微生物病原体による定着を阻害または低減することによって、微生物病原体の病原性を減弱させるために使用するためのものであってもよい。
【0012】
第５の態様によれば、本開示は、微生物病原体による表面への定着を防止または低減するために非生物学的表面を処理するための、本明細書に記載される単離されたＥＰＳ、または本明細書に記載されるプロセスによって得られるか、もしくは得ることができる単離されたＥＰＳ、または本明細書に記載される組成物の非治療的使用を提供する。一実施形態において、表面は医療用デバイスの表面であり得る。
【0013】
第６の態様によれば、本開示は、それを必要とする対象における微生物病原体感染を処置および／または予防するための方法において使用するための、本明細書に記載される単離されたＥＰＳ、または本明細書に記載されるプロセスによって得られるか、もしくは得ることができる単離されたＥＰＳ、本明細書に記載される組成物、または本明細書に記載される鼻送達システムを提供する。
【0014】
第７の態様によれば、本開示は、微生物病原体感染の処置および／または予防のための医薬の製造のための、本明細書に記載される単離されたＥＰＳ、または本明細書に記載されるプロセスによって得られるか、もしくは得ることができる単離されたＥＰＳ、本明細書に記載される組成物、または本明細書に記載される鼻送達システムの使用を提供する。
【0015】
第８の態様によれば、本開示は、微生物病原体の病原性を減弱させるための方法において使用するための、本明細書に記載される単離されたＥＰＳ、または本明細書に記載されるプロセスによって得られるか、もしくは得ることができる単離されたＥＰＳ、本明細書に記載される組成物、または鼻送達システムを提供する。
【0016】
第９の態様によれば、本開示は、微生物病原体の病原性を減弱させるための医薬の製造のための、本明細書に記載される単離されたＥＰＳ、または本明細書に記載されるプロセスによって得られるか、もしくは得ることができる単離されたＥＰＳ、本明細書に記載される組成物、または本明細書に記載される鼻送達システムの使用を提供する。
【0017】
第１０の態様によれば、本開示は、それを必要とする対象において微生物病原体感染を処置および／または予防する方法であって、本明細書に記載される単離されたＥＰＳ、または本明細書に記載されるプロセスによって得られるか、もしくは得ることができる単離されたＥＰＳ、または本明細書に記載される組成物の有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0018】
第１１の態様によれば、本開示は、それを必要とする対象における微生物病原体感染の病原性を減弱させるための方法であって、本明細書に記載される単離されたＥＰＳ、または本明細書に記載されるプロセスによって得られるか、もしくは得ることができる単離されたＥＰＳ、または本明細書に記載される組成物の有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0019】
第１２の態様によれば、本開示は、鼻腔内への微生物病原体による定着を阻害または低減することによって、微生物病原体感染の病原性を減弱させるための鼻用組成物を製剤化する方法であって、海洋細菌に由来する少なくとも１つの単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）を生理食塩水溶液と混合して、０．１％～１０％ｗ／ｗの濃度の塩を含む鼻用組成物を得るステップを含む方法を提供する。一実施形態において、少なくとも１つの単離されたＥＰＳは、本開示による単離されたＥＰＳであり得る。好ましい実施形態において、得られる鼻用組成物は、０．５％～５％ｗ／ｗの濃度の塩を含む。より好ましくは、得られる鼻用組成物は、０．７％～３％ｗ／ｗの濃度の塩を含む。一実施形態において、得られる組成物は、約０．９％ｗ／ｗの濃度の塩を含む。一実施形態において、得られる組成物は、約２．２％ｗ／ｗの塩濃度を含む。一実施形態において、得られる組成物は、約２．７％ｗ／ｗの塩濃度を含む。
【0020】
本開示による使用のための単離されたＥＰＳ、本開示による使用のための組成物、または本開示の方法のいずれかによれば、本明細書に記載される少なくとも１つの単離されたＥＰＳまたは組成物は、微生物病原体の感染前、感染中、および／または感染後に対象に投与してよく、それにより、対象の少なくとも１つの生体組織における微生物病原体の定着および／または微生物病原体の内在化を予防、阻害、または低減し得る。一実施形態において、少なくとも１つの生体組織は、口腔、鼻腔、呼吸器、咽頭、耳、眼科領域、泌尿生殖器、皮膚、頭皮、毛髪、爪、およびその組合せから選択し得る。別の実施形態において、微生物病原体は細菌病原体であってもよく、単離されたＥＰＳまたは組成物の対象への投与は、初期の細菌バイオフィルム形成を低減または阻害すること、および／または初期の細菌バイオフィルムを破壊することによって、細菌病原体感染の病原性を減弱させる。別の実施形態において、微生物病原体はウイルス病原体であってもよく、単離されたＥＰＳまたは組成物の対象への投与は、同等の未処理細胞と比較してウイルス病原体に感染した対象細胞の死亡率を低下させることによって、接種された対象細胞からのビリオンの放出を防止または減少させることによって、および／または感染していない隣接する対象細胞の感染を防止または低減させることによって、ウイルス病原体感染の病原性を減弱させる。
【0021】
本開示の鼻送達システム、本開示の非治療的使用、本開示による使用のための単離されたＥＰＳ、本開示による使用のための組成物、または本開示の方法のいずれかによれば、微生物病原体は、細菌病原体、ウイルス病原体、または真菌病原体のうちの少なくとも１つであり得る。一実施形態において、前記少なくとも１つの細菌病原体は、キューティバクテリウム（Cutibacterium）属、ヘモフィルス（Haemophilus）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、モラクセラ（Moraxella）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、およびストレプトコッカス（Streptococcus）属から選択し得る。いくつかの実施形態において、細菌病原体の少なくとも１つは、キューティバクテリウム・アクネス（Cutibacterium acnes）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、モラクセラ・カタラリス（Moraxella catharalis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）またはストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）種であり得る。一実施形態において、少なくとも１つの細菌病原体は、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、および／またはストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）種から選択し得る。別の実施形態において、前記少なくとも１つのウイルス病原体は、インフルエンザＡ、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１／２００９／ｐｄｍ０９、インフルエンザＡ亜型Ｈ１、インフルエンザＡ亜型Ｈ３、インフルエンザＢ（オルソミクソウイルス）、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＨＫＵ１、コロナウイルスＮＬ６３、コロナウイルスＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（コロナウイルス）、パラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３、パラインフルエンザウイルス４、呼吸器合胞体ウイルスＡ／Ｂ、ヒトメタニューモウイルスＡ／Ｂ（パラミクソウイルス）、アデノウイルスまたはライノウイルス／エンテロウイルス（ピコルナウイルス）から選択し得る。さらなる実施形態において、少なくとも１つのウイルス病原体は、コロナウイルスＯＣ４３、アデノウイルス、および／またはライノウイルス／エンテロウイルス（ピコルナウイルス）から選択し得る。
【0022】
本開示の組成物または本開示の方法および使用に従って使用される組成物中の少なくとも１つのＥＰＳの量は、組成物の総重量に基づいて、０．００００５～０．５％ｗ／ｗ、好ましくは０．０００１～０．１％ｗ／ｗ、より好ましくは０．０００５～０．０５％ｗ／ｗの範囲内であってよい。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】本開示のＥＰＳの製造に使用されるステップバイステップのプロセスを表す。
【図2】異なるＥＰＳ濃度における様々な細菌病原体のバイオフィルム形成（％）を示す。バイオフィルム形成は、未処理の細菌細胞（対照）に対して正規化した。エラーバーは、三連（ｎ＝３）で実施した２回の独立実験（Ｎ＝２）の標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５ｖｓ対照；＊＊ｐ＜０．０１ｖｓ対照；
【図3】三連（ｎ＝３）で実施した２回の独立実験（Ｎ＝２）における、様々な細菌病原体の培養増殖に対するＥＰＳ濃度の増加の抗菌効果評価を示し、ＯＤ６００値、平均±ＳＤを比較した。ＥＰＳ非存在下での増殖培養を対照として用いた；
【図4】２時間および２４時間の間、ＥＰＳ濃度を増加させながら培養したＨＮＥｐＣの生存率を示す。完全培地で２時間および２４時間培養したＴＯ－ＰＲＯ３陰性細胞の生存率を対照（Ｃ）として用いた。エラーバーは、三連（ｎ＝３）で実施した１回の実験（Ｎ＝１）の標準偏差を表す；
【図5】緑膿菌（P.aeruginosa）および黄色ブドウ球菌（S.aureus）のＨＮＥｐＣへの付着の減少を、漸増濃度のＥＰＳの存在下で示す。バイオフィルム形成（細胞付着）は、未処理細胞（対照）に対して正規化した。エラーバーは、三連（ｎ＝３）で実施した２～４回の独立実験（Ｎ＝２～４）の平均値の標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１ｖｓ対照；
【図6】様々な濃度のＥＰＳ溶液を植物油と混合した後、２４時間の休息期間を置いた後の乳化活性指数を示す。エラーバーは３回の独立実験（Ｎ＝３）の標準偏差を表す；
【図7】アデノウイルスまたはライノウイルスに感染させたＨＮＥｐＣの生存率、または高用量ウイルス感染前または感染後にＥＰＳ（４００μｇ／ｍＬ）で２時間処理したＨＮＥｐＣの生存率を示す。ＢＥＢＭ完全培地で４８時間培養した細胞を陽性対照として用い、ＥＰＳ処理なしのウイルス接種細胞を陰性対照として用いた。数値は、三連（ｎ＝３）で実施した２回の独立実験（Ｎ＝２）のＴＯ－ＰＲＯ－３陰性（生存細胞）の平均値±ＳＤを表す；
【図8】図８Ａおよび図８Ｂは、それぞれアデノウイルスまたはライノウイルスに感染させたＨＮＥｐＣ、または高用量ウイルス感染前または感染後にＥＰＳ（２００μｇ／ｍＬ）で２時間処理したＨＮＥｐＣの生存率を示す。ＢＥＢＭ完全培地で４８時間培養した細胞を陽性対照として用い、ＥＰＳ処理なしのウイルス接種細胞を陰性対照として用いた。数値は、三連（ｎ＝３）で実施した２回の独立実験（Ｎ＝２）のＴＯ－ＰＲＯ－３陰性（生存細胞）の平均値±ＳＤを表す；
【図9】アデノウイルスまたはライノウイルスに感染させたＨＮＥｐＣ、または感染前にＥＰＳ（４００μｇ／ｍＬ）で２時間前処理したＨＮＥｐＣ、または５日間ＥＰＳを添加して後処理したＨＮＥｐＣ、または５日間毎日ＥＰＳを置き換えて後処理したＨＮＥｐＣの生存率を示す。ＢＥＢＭ完全培地での５日間培養後のＴＯ－ＰＲＯ－３陰性細胞の生存率を対照として用いた。エラーバーは、二連（ｎ＝２）で実施した２回の独立実験（Ｎ＝２）の標準偏差を表す；
【図10】図１０Ａおよび図１０Ｂは、それぞれアデノウイルスまたはライノウイルスに感染させたＨＮＥｐＣ、または感染前にＥＰＳ（２００μｇ／ｍＬ）で２時間前処理したＨＮＥｐＣ、または５日間ＥＰＳを添加して後処理したＨＮＥｐＣ、または５日間毎日ＥＰＳを置き換えて後処理したＨＮＥｐＣの生存率を示す。ＢＥＢＭ完全培地での５日間培養後のＴＯ－ＰＲＯ－３陰性細胞の生存率を対照として用いた。エラーバーは、三連（ｎ＝３）で実施した２回の独立実験（Ｎ＝２）の標準偏差を表す；
【図11】コロナウイルス（１ ＴＣＩＤ５０または０．００１ ＴＣＩＤ５０）に感染させたＨＮＥｐＣ、または感染前にＥＰＳ（２００～４００μｇ／ｍＬ）で２時間前処理したＨＮＥｐＣ、またはＥＰＳを１用量添加して５日間後処理したＨＮＥｐＣの生存率を示す。ＢＥＢＭ完全培地での５日間培養後のＴＯ－ＰＲＯ－３陰性細胞の生存率を対照として用いた。エラーバーは、三連（ｎ＝３）で実施した２回の独立実験（Ｎ＝２）の標準偏差を表す；
【図12】図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＥＰＳサンプル（４００μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激したときのＩＬ－８産生ＨＮＥｐＣおよびＩＬ－６産生ＨＮＥｐＣの割合をそれぞれ示す。未刺激の細胞またはＩＬ－１βで刺激した細胞を、それぞれ陰性対照および陽性対照として用いた。データは３回の独立実験（Ｎ＝３）の結果を表し、エラーバーはＳＤを表す；
【図13A】図１３Ａおよび図１３Ｂは、Ａ）ＥＰＳサンプル（４００μｇ／ｍＬ）で２４時間培養した樹状細胞（ＤＣ）上の活性化／成熟分子（ＣＤ８３、ＣＤ４０およびＣＤ２５）の発現を示す。陰性対照および陽性対照として、それぞれ未刺激の細胞またはリポ多糖（ＬＰＳ、１μｇ／ｍＬ）で刺激した細胞を用いた。棒グラフは示した分子のＭＦＩの平均値±ＳＥＭを示す。２人の異なるドナーから得たＰＢＭＣ由来のＤＣを二連で実験に用いた（Ｎ＝２、ｎ＝２）。エラーバーはＳＤを表す；Ｂ）ＥＰＳサンプル（４００μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激したときのＩＬ－８産生ＤＣおよびＩＬ－６産生ＤＣの割合。陰性対照および陽性対照として、それぞれ未刺激の細胞またはＬＰＳで刺激した細胞を用いた。データは３回の独立実験（Ｎ＝２、ｎ＝２）の結果を表し、エラーバーはＳＤを表す。
【図13B】（上記の通り。）
【発明を実施するための形態】
【0024】
本開示では、病原体の表面への付着を低減または防止することからなる手段に基づく、新規な病原体感染管理アプローチを提案する。そこで、パナレア島（イタリア）周辺海域の浅い熱水噴出孔から単離された海洋細菌が放出する化学成分を研究し、細菌、真菌、およびウイルスなどの病原性微生物の生物学的および非生物学的表面への可逆的付着ステップを妨害、制御、および／または阻害する能力を調べた。
【0025】
海洋源由来の細菌、すなわち２０２０年１月２７日、Ｄａｎｓｔａｒ Ｆｅｒｍｅｎｔ Ａ．Ｇ．（Ｐｏｓｔｓｔｒａｓｓｅ ３０，Ｚｕｇ，６３００、スイス）から寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７で寄託されたＮＣＩＭＢ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ、ＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ． Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１ ９ＹＡ、スコットランド、ＵＫ）に寄託されたバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４は、高温（５０℃）、塩水（導電率４２．９０ｍＳ．ｃｍ－１）、ｐＨ５．４、高濃度の硫化水素および重金属などの極限環境条件下で生育する特異な能力を有し、このような海洋菌株から分泌される菌体外多糖はユニークな物理化学的特性を有することが見出された。
【0026】
したがって、本開示は、海洋菌株バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４によって放出される新規な菌体外多糖（ＥＰＳ）が、未処理の表面と比較して、処理表面への病原体の付着を防止および／または減少させることにより、病原体感染の病原性を減弱させる能力を有することを実証する。
【0027】
本開示は、微生物病原体感染の病原性を減弱させるためのＥＰＳ、その組成物、その組成物の使用および方法を提供する。本開示において、微生物病原体感染の病原性は、生物学的表面および／または非生物学的表面上の感染の原因となる微生物病原体の定着を阻害または低減することによって減弱される。
【0028】
本開示の文脈において、本明細書で使用される「病原性」という用語は、微生物（すなわち、細菌、ウイルス、酵母、真菌）が増殖し、および／または生体内に拡散し、それによって身体の防御機構を圧倒する能力を意味する。したがって、予防的および／または治療的処置として使用される場合、本開示の組成物は、宿主の免疫系を（間接的に）支援し、宿主が任意の種類の病原性微生物感染に対して効果的に防御できるようにする。
【0029】
なおも本開示の文脈において、「定着を阻害または低減する」という表現は、本明細書に開示される組成物に関連し、表面への病原性細菌の設置、したがってそれらの増殖を妨害する：すなわち、以下に限定されないが、初期バイオフィルムの形成の阻害または低減、初期バイオフィルムの破壊または分解（部分的または全体的）、高度バイオフィルムの破壊または分解（部分的または全体的）の効果を有する任意の作用を指す。
【0030】
本開示の文脈において、「定着を阻害または低減する」という表現は、生体におけるウイルスの確立を局所的に撹乱する効果を有する、本明細書に開示される組成物に関連する任意の作用を指す。したがって、組成物は、限定されるものではないが、生細胞内でのウイルスの内在化を部分的にまたは完全に防止する効果、および／または感染細胞から隣接する生細胞へのビリオンの拡散を制限する効果を有する。
【0031】
菌体外多糖およびその組成物
海洋源由来の細菌は、高温、塩水、高濃度の硫化水素および重金属などの極限環境条件下で生育する特異な能力を有しており、海洋生物種が産生する菌体外多糖（ＥＰＳ）はユニークな物理学的特性および分子構造を有することが見出されている。そのため、海洋細菌のＥＰＳは、水溶性、生分解性、生体適合性、生体付着性、耐熱性、膨潤性、ゲル化力などの特異な特性により、バイオテクノロジー、医療、および医薬品など幅広い分野で応用されている。
海洋源由来の細菌は、高温、塩水、高濃度の硫化水素および重金属などの極限環境条件下で生育する特異な能力を有しており、海洋生物種が産生する菌体外多糖（ＥＰＳ）はユニークな物理学的特性および分子構造を有することが見出されている。そのため、海洋細菌のＥＰＳは、水溶性、生分解性、生体適合性、生体付着性、耐熱性、膨潤性、ゲル化力などの特異な特性により、バイオテクノロジー、医療、および医薬品など幅広い分野で応用されている。
【0032】
ＥＰＳは多糖であり、細菌発酵によって産生された後、培養培地中に放出される。グリコシド結合を介して互いに結合した単糖から構成される。ＥＰＳは１種類以上の単糖から構成され、整列した、またはランダムに分布した単糖ブロックの繰り返し単位を観察することができる。ＥＰＳ骨格は直鎖状でも分岐状でもよく、この場合、分岐アームは異なる長さを有し、同じ単糖単位または異なる単糖単位のいずれかを含み得る。
【0033】
一実施形態において、少なくとも１つの単離されたＥＰＳは、海洋細菌およびその許容される担体の発酵によって得られるか、または得ることができる。別の実施形態において、本開示の組成物は、グラム陽性好熱性細菌の発酵によって得られるか、または得ることができる少なくとも１つの単離されたＥＰＳ、およびその許容される担体を含む。別の実施形態において、本開示の組成物は、バシラス（Bacillus）属に属する細菌の発酵によって得られるか、または得ることができる少なくとも１つの単離されたＥＰＳ、およびその許容される担体を含む。別の実施形態において、本開示の組成物は、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）種に属する細菌の発酵によって得られるか、または得ることができる少なくとも１つの単離されたＥＰＳ、およびその許容される担体を含む。さらに別の実施形態において、本開示の組成物は、特定の細菌株、ＮＣＩＭＢ ４３５５７でｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）に寄託された極限好熱性海洋バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４の発酵によって得られる、または得ることができる少なくとも１つの単離されたＥＰＳ、およびその許容される担体を含む。
【0034】
一実施形態において、海洋細菌の発酵は、海塩（４０ｇ／Ｌ）、トリプトン（６ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（６ｇ／Ｌ）、消泡剤（０．３３ｍＬ／Ｌ）、デキストロース（１２ｇ／Ｌ）および脱イオンＨ２Ｏ（ｑｓｐ．）を含む発酵培地中で、ｐＨ５～８、４０℃で２０～４０時間、３０～５０％の酸素添加下で行われる。発酵終了後、ＥＰＳ単離の前に、発酵培地を８５℃で１時間加熱することにより、海洋細菌および前記海洋細菌由来のタンパク質の両方を不活性化することができる。
【0035】
用語「単離された」は、それが自然に産生される元の環境、例えばこの場合では発酵培地から物質的に取り出されたことを意味すると考えられるべきである。取り出された物質は、通常、それが産生された環境から精製される。一実施形態において、単離された形態のＥＰＳは、理想的には、有意量の細菌株を含まず、これは、いくつかの実施形態において、部分的または完全に不活性化されていてもよい。いくつかの別の実施形態において、単離された形態のＥＰＳは、無視できる量の細菌株を含む。さらなる実施形態において、単離された形態のＥＰＳは、多くとも１０１ＣＦＵ／ｇのＥＰＳ、多くとも１０２ＣＦＵ／ｇのＥＰＳ、多くとも１０３ＣＦＵ／ｇのＥＰＳ、多くとも１０４ＣＦＵ／ｇのＥＰＳ、または多くとも１０５ＣＦＵ／ｇのＥＰＳを含む。一実施形態において、単離された形態のＥＰＳは、それを産生するために使用された細菌株由来の検出可能な量のタンパク質を欠いており、これは、いくつかの実施形態において、Ｌｏｗｒｙアッセイ（実施例４）によって分析される場合、部分的にまたは完全に不活性化されていてもよい。いくつかの実施形態において、単離された形態のＥＰＳは、Ｌｏｗｒｙアッセイ（実施例４）によって分析される場合、それを産生するために使用された細菌株由来のタンパク質を無視できる量含む。いくつかのさらなる実施形態において、単離された形態のＥＰＳは、Ｌｏｗｒｙアッセイ（実施例４）によって分析される場合、それを産生するために使用された細菌株由来のタンパク質を、多くとも０．１％ｗ／ｗ、多くとも０．５％ｗ／ｗ、多くとも１％ｗ／ｗ、多くとも２％ｗ／ｗ、多くとも３％ｗ／ｗ含む。さらに、他の細菌培養培地構成要素の主要部分から分離した後、本開示の単離されたＥＰＳは、限定されないが、濾過、限外濾過、蒸発、噴霧乾燥もしくは凍結乾燥、またはその組合せによって濃縮され得る。したがって、本開示の単離されたＥＰＳは、濃縮物、懸濁液、粉末、または凍結乾燥物の形態である。
【0036】
一実施形態において、本開示の組成物中に含まれる単離されたＥＰＳは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ－ＳＥＣ）によって決定される、４０～４０００ｋＤａ、４０～２０００ｋＤａ、４０～１０００ｋＤａ、４０～５００ｋＤａ、４０～４００ｋＤａ、４０～３００ｋＤａ、４０～２００ｋＤａの範囲の少なくとも１つの重量平均分子量分布を示す。一実施形態において、前記単離されたＥＰＳは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ－ＳＥＣ）によって決定される、それぞれ４０～４０００ｋＤａ、４０～２０００ｋＤａ、４０～１０００ｋＤａ、４０～５００ｋＤａ、４０～４００ｋＤａ、４０～３００ｋＤａ、４０～２００ｋＤａの範囲の少なくとも２つの重量平均分子量分布を呈する。
【0037】
一実施形態において、本開示の単離されたＥＰＳは、中性グリコシル単位、アミノグリコシル単位、および酸性グリコシル単位を含む。中性グリコシル単位の例としては、グルコース、ラムノース、マンノース、キシロースおよびガラクトースが挙げられるが、これらに限定されない。アミノグリコシル単位の例としては、ガラクトサミン、グルコサミン、Ｎ－アセチルグルコサミンおよびＮ－アセチルガラクトサミンが挙げられるが、これらに限定されない。酸性グリコシル単位の例としては、グルクロン酸、ガラクツロン酸およびヘクスロン酸を含むウロン酸が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、本開示の単離されたＥＰＳは、グルコース、ラムノース、マンノース、キシロースおよびガラクトースを含む中性グリコシル単位を含む。一実施形態において、本開示の単離されたＥＰＳは、Ｎ－アセチルグルコサミンおよびＮ－アセチルガラクトサミンを含むアミノグリコシル単位を含む。一実施形態において、本開示の単離されたＥＰＳは、グルクロン酸を含む酸性グリコシル単位を含み得る。一実施形態において、本開示の単離されたＥＰＳは、前記ＥＰＳのグリコシル単位の総数に関して、３０～９０％、３５～８０％、４０～７５％の間の中性グリコシル単位を含む。一実施形態において、本開示の単離されたＥＰＳは、前記ＥＰＳのグリコシル単位の総数に関して、１０～７０％、１５～６５％、２０～６０％の間のアミノグリコシル単位を含む。一実施形態において、本開示の単離されたＥＰＳは、前記ＥＰＳのグリコシル単位の総数に関して、０～１５％、０～１０％、０～５％の間の酸性グリコシル単位を含む。別の実施形態において、本開示の単離されたＥＰＳは、マンノース、ガラクトース、グルコース、Ｎ－アセチルガラクトサミンおよびＮ－アセチルグルコサミンを含むグリコシル単位から構造的に構成される。別の実施形態において、本開示の単離されたＥＰＳは、リボース、アラビノース、ラムノース、フルクトースおよび／またはフコースから構造的に構成されない。別の実施形態において、本開示の単離されたＥＰＳは、リボース、アラビノース、ラムノース、フルクトースおよび／またはフコースを実質的に含まない。
【0038】
本開示の単離されたＥＰＳは、低濃度であっても強い乳化活性を呈する（すなわち、０．００５％のＥＰＳに相当する５０μｇ．ｍＬ－１のみを用いて５０％のＥ２４に到達した）。
【0039】
一実施形態において、本開示の方法は、任意選択で組成物として提供される、有効量の少なくとも１つのＥＰＳの投与を含む。「有効量の」という表現は、未処理表面と比較した場合に、処理表面上への微生物病原体による定着の阻害または低減によって、微生物病原体感染の病原性の減弱を確実にするのに十分な単離されたＥＰＳの濃度を意味する。いくつかの実施形態において、単離されたＥＰＳの濃度は、組成物の総重量に基づいて０．００００５％～０．５％ｗ／ｗの範囲である。いくつかの別の実施形態において、単離されたＥＰＳの濃度は、組成物の総重量に基づいて０．０００１％～約０．１％ｗ／ｗの範囲である。さらに別の実施形態において、単離されたＥＰＳの濃度は、組成物の総重量に基づいて、０．０００５％～約０．０８％ｗ／ｗの範囲である。
【0040】
別の実施形態において、本開示の組成物は、組成物の少なくとも０．０００００５％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも０．００００１％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも０．００００２％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも０．００００５％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも０．０００１％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも０．０００２％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも０．０００５％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも０．００１％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも０．００２％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも０．００４％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも０．００５％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも０．００７５％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも０．０１％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも０．０１５％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも０．０２％ｗ／ｗの、処理表面上への前記微生物病原体による定着を阻害または低減することによって微生物病原体感染の病原性を減弱させる能力を有する少なくとも１つの単離されたＥＰＳを含む。
【0041】
他の実施形態において、本開示の組成物は、約０．５～５０００μｇ．ｍＬ－１、約１～１０００μｇ．ｍＬ－１、約５～５００μｇ．ｍＬ－１の、処理表面への前記微生物病原体による定着を阻害または低減することによって微生物病原体感染の病原性を減弱させる能力を有する少なくとも１つの単離されたＥＰＳを含む水溶液または懸濁液であり得る。
【0042】
別の実施形態において、本開示の組成物は、少なくとも５０ｎｇ．ｍＬ－１、少なくとも１００ｎｇ．ｍＬ－１、少なくとも２００ｎｇ．ｍＬ－１、少なくとも５００ｎｇ．ｍＬ－１、少なくとも１μｇ．ｍＬ－１、少なくとも２μｇ．ｍＬ－１、少なくとも５μｇ．ｍＬ－１、少なくとも１０μｇ．ｍＬ－１、少なくとも２０μｇ．ｍＬ－１、少なくとも４０μｇ．ｍＬ－１、少なくとも５０μｇ．ｍＬ－１、少なくとも７５μｇ．ｍＬ－１、少なくとも１００μｇ．ｍＬ－１、少なくとも１５０μｇ．ｍＬ－１、少なくとも２００μｇ．ｍＬ－１の、処理表面上への前記微生物病原体による定着を阻害または低減することによって微生物病原体感染の病原性を減弱させる能力を有する少なくとも１つの単離されたＥＰＳを含む水溶液または懸濁液であり得る。
【0043】
本明細書に開示される組成物は、海洋細菌に由来する少なくとも１つの単離された菌体外多糖と、適切な担体とを含む。担体（複数可）の選択は、最終製剤の種類に応じて行われる。一実施形態において、本明細書における組成物の担体は、組成物の生物学的活性（すなわち、抗バイオフィルム活性および／または抗ウイルス活性）を増加させることができるが、減少させることはできない。別の実施形態において、本明細書における組成物の担体は、免疫学的に不活性である。別の実施形態において、本明細書における組成物の担体は、１つまたは複数の担体の組合せであり得る。
【0044】
一実施形態において、本明細書に開示される組成物は、別のＥＰＳをさらに含み得る。別の実施形態において、本明細書に開示される組成物は、ポリグルタミン酸をさらに含み得る。
【0045】
一実施形態において、その抗バイオフィルム活性（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ）を別にすれば、任意選択で組成物として提供される、本明細書に記載される単離されたＥＰＳは、病原性細菌の増殖に悪影響を及ぼさず、より一般的には、ＥＰＳの存在は、試験された全ての細菌株の増殖速度に影響を及ぼさない。別の実施形態において、任意選択で組成物として提供される、本明細書に記載される単離されたＥＰＳは、その濃度および考慮される病原性細菌とは独立して、殺菌効果、静菌効果、および抗生物質効果を有さない。別の実施形態において、任意選択で組成物として提供される、本明細書に記載される単離されたＥＰＳはまた、生体組織上に存在する天然の微生物叢の完全性を尊重する。別の実施形態において、任意選択で組成物として提供される、本明細書に記載される単離されたＥＰＳは、その濃度およびそのインキュベーション期間にかかわらず、それらを受けることが意図される対象において細胞毒性を誘導しない。
【0046】
別の実施形態において、任意選択で組成物として提供される、本明細書に記載される単離されたＥＰＳは、免疫（細胞性および／または体液性）応答を誘導する能力を実質的に欠いている。いくつかの実施形態において、任意選択で組成物として提供される、本明細書に記載される単離されたＥＰＳは、炎症応答および／またはアネルギーのような、任意の免疫学的応答を誘導する能力を欠いている。別の実施形態において、任意選択で組成物として提供される、本明細書に記載される単離されたＥＰＳは、免疫刺激性抗原提示細胞への樹状細胞の成熟に対する検出可能な効果を欠く。さらに別の実施形態において、任意選択で組成物として提供される、本明細書に記載される単離されたＥＰＳは、樹状細胞からＣＤ８３、ＣＤ４０および／またはＣＤ２５発現を誘導しない。別の実施形態において、任意選択で組成物として提供される、本明細書に記載される単離されたＥＰＳは、ＩＬ－６および／またはＩＬ－８を発現する細胞の増殖を誘導することができない。いくつかの別の実施形態において、任意選択で組成物として提供される、本明細書に記載される単離されたＥＰＳは、サイトカイン、ケモカインおよび／またはプロスタグランジンなどの炎症性メディエーターの産生を誘導できない。さらに別の実施形態において、任意に組成物として提供される、本明細書に記載される単離されたＥＰＳは、ＩＬ－６および／またはＩＬ－８の産生を誘導できない。
【0047】
抗バイオフィルム活性
細菌病原体の場合、病原性バイオフィルムは、様々な粘膜および上皮細胞、口腔、鼻腔、肺、消化器、皮膚、眼科、および泌尿生殖器だけでなく、中心静脈、尿および腹膜透析カテーテル、気管内チューブ、ペースメーカー、人工関節および機械的心臓弁のような非生物学的および疎水性非極性表面（例えば、テフロン、ガラスおよびプラスチック）上でも発達し得る。
細菌病原体の場合、病原性バイオフィルムは、様々な粘膜および上皮細胞、口腔、鼻腔、肺、消化器、皮膚、眼科、および泌尿生殖器だけでなく、中心静脈、尿および腹膜透析カテーテル、気管内チューブ、ペースメーカー、人工関節および機械的心臓弁のような非生物学的および疎水性非極性表面（例えば、テフロン、ガラスおよびプラスチック）上でも発達し得る。
【0048】
このようなマトリクスに埋め込まれた微生物病原体は、独自の生態系を形成して生存することができ、ここでは身体の免疫防御および外因性処置によって生成される代謝物または物質から身を守ると同時に、細胞間コミュニケーション（クオラムセンシングなど）を介して耐性遺伝子などの新たな能力を獲得し、環境に適応して立ち向かうことができる。したがって臨床的には、バイオフィルムの形成は、処置が困難な感染症のいくつかにおいて、その成立と持続の重要な要因であることが知られている。例えば、病原性細菌から産生される菌体外多糖は、病原性細菌を保護し、それによって抗菌剤処置に対して難治性になっている。
【0049】
したがって、細菌感染の病原性を減弱させることを目的とする本開示は、活性または確立された細菌感染だけでなく、細菌感染につながる病原性の初期発症、すなわち細菌が表面上に可逆的に付着する初期のバイオフィルム形成の阻害も対象とする。
【0050】
一実施形態において、本開示の組成物は、未処理表面と比較して、合成表面上で最適条件下でインキュベートされた種々の細菌病原体に対してバイオフィルム形成阻害効果を付与する。別の実施形態において、本開示によるＥＰＳによる表面前処理は、未処理表面と比較して、低濃度で適用された場合であっても、初期のバイオフィルム形成を阻害する。別の実施形態において、本開示の組成物の使用は、合成表面上で最適条件下でインキュベートされた種々の細菌病原体からのバイオフィルム形成の低減をもたらす。別の実施形態において、組成物による表面前処理は、未処理表面と比較して、低濃度で適用された場合であっても、初期のバイオフィルム形成を低減させる。別の実施形態において、本開示の組成物は、未処理合成表面と比較して、合成表面上での病原性細菌のバイオフィルム形成を少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％減少させる。別の実施形態において、少なくとも２００μｇ／ｍＬのＥＰＳ濃度を有する本開示の組成物は、未処理合成表面と比較して、合成表面上の病原性細菌のバイオフィルム形成を少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％減少させる。別の実施形態において、４００μｇ／ｍＬのＥＰＳ濃度を有する本開示の組成物は、未処理合成表面と比較して、合成表面上の病原性細菌のバイオフィルム形成を少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％減少させる。
【0051】
一実施形態において、本開示のＥＰＳは、その起源にかかわらず、生物学的表面上における細菌バイオフィルム設置の結果を低減および／または制限する能力を有する。実際、バイオフィルムの形成を低減および／または防止する実証された予防効果に加えて、本開示による組成物による表面洗浄は、バイオフィルムから病原性細菌細胞を除去するその能力により、治療活性も有し得る。別の実施形態において、本明細書による組成物は、表面上のバイオフィルムの破壊または溶解（既存の定着および予め形成または蓄積されたバイオフィルムの低減）を促進する。いくつかの実施形態において、本明細書による組成物は、表面上の初期のバイオフィルム破壊または溶解を促進する。別の実施形態において、本開示による組成物による表面処理は、表面上への細菌の再定着を防止、低減および／または阻害する。別の実施形態において、本開示のＥＰＳ組成物は、未処理の生物学的表面と比較して、生物学的表面上の病原性細菌のバイオフィルム形成を少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％減少させる。別の実施形態において、少なくとも２００μｇ／ｍＬのＥＰＳ濃度を有する本開示の組成物は、未処理の生物学的表面と比較して、生物学的表面上の病原性細菌のバイオフィルム形成を少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％減少させる。別の実施形態において、４００μｇ／ｍＬのＥＰＳ濃度を有する本開示の組成物は、生物学的表面と比較して、生物学的表面上の病原性細菌のバイオフィルム形成を少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％減少させる。
【0052】
別の実施形態において、本開示による組成物による表面処理は、病原性細菌との接触後、遅くとも８時間以内、遅くとも６時間以内、遅くとも４時間以内、遅くとも３時間以内、遅くとも２時間以内、遅くとも１時間以内に行われる。本開示による組成物による表面処理はまた、病原性細菌との接触直後に適用することもできる。本開示による組成物による表面処理はまた、病原性細菌と接触する前に予防措置として適用することもできる。したがって、本開示による組成物による表面処理は、病原性細菌との潜在的な接触の少なくとも５分前、少なくとも１０分前、少なくとも１５分前、少なくとも３０分前、少なくとも６０分前、少なくとも２時間前、少なくとも３時間前、少なくとも４時間前、少なくとも６時間前、少なくとも８時間前に適用することができる。
【0053】
抗ウイルス活性
ウイルス性疾患または感染症は、１つまたは複数の特定の箇所において身体を攻撃するウイルスによって伝達される。例えば、すでに病気にかかっている他の個体との直接的な接触、すなわち、体液またはエアロゾルならびに感染した表面との接触を介してウイルス性疾患に感染することがある。
ウイルス性疾患または感染症は、１つまたは複数の特定の箇所において身体を攻撃するウイルスによって伝達される。例えば、すでに病気にかかっている他の個体との直接的な接触、すなわち、体液またはエアロゾルならびに感染した表面との接触を介してウイルス性疾患に感染することがある。
【0054】
一旦体内に接種されると、ウイルスは特定の宿主細胞に入り込み、増殖するために細胞機構を転換し、このようにして合成されたビリオンが次に拡散し、隣接する細胞に感染する。
【0055】
本開示はまた、処理表面上へのウイルス病原体の定着を阻害および／または低減させることによって、ウイルス感染の病原性を減弱させることも対象とする。換言すれば、ウイルス病原体の表面定着の低減および／または阻害は、未処理細胞と比較して生細胞の死亡率を低下させることによって、および／またはビリオンの放出ならびに隣接する生細胞への拡散を防止することによって達成される。
【0056】
一実施形態において、ウイルス接種の前に本開示による組成物で生細胞を前処理することによって、考慮されるウイルスにかかわらず、ウイルス感染に対するＥＰＳ組成物の予防的特性が強調される。一実施形態において、ウイルス接種前の本開示による組成物による生細胞の前処理は、未処理の細胞に比べて細胞の死亡率を低下させる。さらに別の実施形態において、本開示による組成物による生細胞の前処理（すなわち、生細胞へのウイルス接種の前）は、ウイルス接種の前に単回用量で投与される。別の実施形態において、ウイルス接種前に本開示による組成物で生細胞を前処理すると、未処理の細胞の生存と比較して、（考慮されるウイルスに関係なく）ウイルス感染後の細胞の生存が増加する。別の実施形態において、ウイルス接種（１ ＴＣＩＤ５０）の前に本開示による組成物で生細胞を前処理すると、未処理の細胞生存率と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％細胞生存率が増加する。別の実施形態において、ウイルス接種（０．００１ ＴＣＩＤ５０）の前に本開示による組成物で生細胞を前処理すると、未処理の細胞生存率と比較して、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％細胞生存率が増加する。
【0057】
一実施形態において、本開示による組成物による生細胞の後処理（すなわち、生細胞へのウイルス接種後）は、ビリオンの放出ならびに隣接細胞へのそれらの拡散を防止する。別の実施形態において、本開示による組成物による生細胞の後処理（すなわち、生細胞へのウイルス接種後）は、ウイルス接種の少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、未処理細胞に比べてウイルス感染の病原性を低下させる治療効果を提供する。さらに別の実施形態において、本開示による組成物による生細胞の後処理（すなわち、生細胞へのウイルス接種後）は、ウイルス接種後に単回用量で投与される。別の実施形態において、理論に拘束されることを望むものではないが、ヒト生細胞への本開示によるＥＰＳ組成物の投与は、考慮されるウイルスにかかわらず、ウイルスの内在化を立体的に妨げる細胞外「バリア」を形成する。一実施形態において、ウイルス接種後の、本開示によるＥＰＳ組成物による生細胞の後処理は、未処理の細胞の生存率と比較して、細胞の生存率を増加させる。別の実施形態において、ウイルス接種後（１ ＴＣＩＤ５０）の、本開示によるＥＰＳ組成物による生細胞の後処理は、未処理の細胞生存率と比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％細胞生存率を増加させる。いくつかの別の実施形態において、ウイルス接種（０．００１ ＴＣＩＤ５０）後の本開示による組成物による生細胞の後処理は、未処理の細胞生存率と比較して、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％細胞生存率を増加させる。
【0058】
別の実施形態において、本開示による組成物による表面処理は、表面上へのウイルスの再定着を防止、低減および／または阻害する。
【0059】
別の実施形態において、本開示による組成物による表面処理は、ウイルスとの接触後、遅くとも８時間以内、遅くとも６時間以内、遅くとも４時間以内、遅くとも３時間以内、遅くとも２時間以内、遅くとも１時間以内に行われる。本開示によるＥＰＳ組成物による表面処理は、ウイルスとの接触直後に適用することもできる。本開示による組成物による表面処理はまた、ウイルスとの接触前の予防措置として適用することもできる。したがって、本開示による組成物による表面処理は、ウイルスとの潜在的な接触の少なくとも５分前、少なくとも１０分前、少なくとも１５分前、少なくとも３０分前、少なくとも６０分前、少なくとも２時間前、少なくとも３時間前、少なくとも４時間前、少なくとも６時間前、少なくとも８時間前に適用することができる。
【0060】
病原体
本開示による組成物は、特許請求される組成物で処理された表面上への細菌、真菌、酵母およびウイルスなどの微生物の定着を阻害または低減することによって、微生物病原体感染の病原性を減弱させるために有効である。
本開示による組成物は、特許請求される組成物で処理された表面上への細菌、真菌、酵母およびウイルスなどの微生物の定着を阻害または低減することによって、微生物病原体感染の病原性を減弱させるために有効である。
【0061】
一実施形態において、本開示による組成物は、細菌の定着を阻害または低減することによって、細菌病原体感染の病原性を減弱させるために有効である。いくつかの実施形態において、本開示が専用の用途に関連し得る細菌としては、限定されるものではないが、スタフィロコッカス（Staphylococcus）種、ストレプトコッカス（Streptococcus）種、エンテロコッカス科（Enterococcaceae）およびエンテロコッカス（Enterococcus）種、ナイセリア（Neisseria）またはブランハメラ（Branhamella）種、バシラス（Bacillus）種、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）種、コリネバクテリウム（Corynebacterium）種、リステリア（Listeria）種、クロストリジウム（Clostridium）種、エスケリキア（Escherichia）種、エンテロバクター（Enterobacter）種、プロテウス（Proteus）種、シュードモナス（Pseudomonas）種、クレブシエラ（Klebsiella）種、サルモネラ（Salmonella）種、シゲラ（Shigella）種、カンピロバクター（Campylobacter）種、アクチノマイセス（Actinomyces）種、アクチノバチルス（Actinobacillus）種、アシネトバクター（Acinetobacter）種、アグリゲイティバクター（Aggregatibacter）種、フソバクテリウム（Fusobacterium）種、ヘモフィルス（Haemophilus）種、マイコバクテリウム（Mycobacterium）種、シュードモナス（Pseudomonas）種、ポルフィロモナス（Porphyromonas）種、バクテロイデス（Bacteriodes）種、トレポネーマ（Treponema）種、プレボテラ（Prevotella）種、またはユーバクテリウム（Eubacterium）種に属する細菌などのグラム陰性およびグラム陽性細菌の両方が挙げられる。いくつかの別の実施形態において、本開示が専用の用途に関連し得る細菌としては、グラム陰性およびグラム陽性細菌の両方、例えば、限定されるものではないが、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）（Methicilin Resistant Staphylococcus aureus）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）（Ａ群）、ストレプトコッカス（Streptococcus）属（ビリダンス（viridans）群）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）（Ｂ群）、ウシレンサ球菌（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス（Streptococcus）（嫌気性種）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、Ｓ．サンギス（S.sanguis）、Ｓ．オラリス（S.oralis）、Ｓ．ミティス（S.mitis）、Ｓ．サリバリウス（S.salivarius）、Ｓ．ゴルドニ（S.gordonii）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、ブランハメラ・カタルハリス（Branhamella catarrhalis）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheriae）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、大腸菌（Escherichia coli）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetumcomitans）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、バクテリオデス・フォルシサス（Bacteriodes forcythus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、プレボテラ・インターメディア（Prevotella intermedia）、またはユーバクテリウム・ノダトゥム（Eubacterium nodatum）が挙げられる。一実施形態において、細菌種は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、モラクセラ・カタラリス（Moraxella catarrhalis）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）（キューティバクテリウム・アクネス（Cutibacterium acnes）としても知られる）、またはその組合せである。さらに別の実施形態において、細菌種は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、モラクセラ・カタラリス（Moraxella catharalis）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）（キューティバクテリウム・アクネス（Cutibacterium acnes）としても知られる）、またはその組合せである。
【0062】
したがって、本開示による組成物は、限定されるものではないが、以下を含む微生物感染（複数可）を予防、減弱、および／または微生物感染（複数可）の可能性を低減するために、処理表面上への定着を阻害および／または低減することによって、細菌病原体感染の病原性を減弱させるために有用であり得る：菌血症、敗血症、肺炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、う蝕、歯周病、副鼻腔炎、鼻炎、ピンクアイ、尿路感染、破傷風、壊疽、大腸炎、急性胃腸炎、膿痂疹、にきび、ざ瘡、赤み、アトピー性皮膚炎、乾癬、創傷感染、熱傷感染、筋膜炎、気管支炎、または種々の膿瘍、院内感染、および／または日和見感染。
【0063】
別の実施形態において、本開示による組成物は、表面上または上皮上へのウイルスの定着を阻害または低減することによって、ウイルス病原体感染の病原性を減弱させるために有効である。本開示によるＥＰＳ組成物は、特定のウイルス、例えば、ＨＩＶ、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルスおよび／またはヒトパピローマウイルスに対して有効であるが、ライノウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、インフルエンザ、ラウスサコーマウイルス、パラインフルエンザ、メタニューモウイルスおよび／またはエプスタイン－バーウイルスに対しても有効である。
【0064】
したがって、本開示による組成物はまた、風邪、インフルエンザ、冷え症、性器ヘルペス、いぼなどの感染症を予防および／または処置するために有効であり、および／またはＨＩＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するために有効である。いくつかの実施形態において、ウイルスは、インフルエンザ、コロナウイルス、ＳＡＲｓ－ＣｏＶ－２、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、メタニューモウイルス、またはその組合せである。
【0065】
生物学的表面適用
一実施形態において、本開示による組成物および方法は、ヒト、またはより一般的には、限定されるものではないが、細胞、上皮細胞および／または粘膜を含む動物組織に適用可能である。本開示において考慮される生物学的表面は、限定されないが：口腔、歯面、鼻腔、呼吸器、咽頭、耳、眼科領域、泌尿生殖器、皮膚、頭皮、毛髪および／または爪である。いくつかの実施形態において、本開示による組成物の投与方法は、鼻腔、呼吸器および／または頬経路である。
一実施形態において、本開示による組成物および方法は、ヒト、またはより一般的には、限定されるものではないが、細胞、上皮細胞および／または粘膜を含む動物組織に適用可能である。本開示において考慮される生物学的表面は、限定されないが：口腔、歯面、鼻腔、呼吸器、咽頭、耳、眼科領域、泌尿生殖器、皮膚、頭皮、毛髪および／または爪である。いくつかの実施形態において、本開示による組成物の投与方法は、鼻腔、呼吸器および／または頬経路である。
【0066】
一実施形態において、本開示による組成物および方法は、無傷の健康な組織を有する健康な対象に投与することができるが、対象が、局所的および／または全身的な感染症につながる可能性のある創傷または引っかき傷の後に破壊された組織を有する場合に有用である。別の実施形態において、本開示による組成物および方法は、感染しやすい対象に投与し得る。別の実施形態において、本開示による組成物および方法は、感染した対象に投与し得る。
【0067】
一実施形態において、本開示による組成物および方法で投与される対象は動物である。別の実施形態において、本開示による組成物および方法で投与される対象は、哺乳動物である。さらに別の実施形態において、本開示による組成物および方法で投与される対象はヒトである。
【0068】
一実施形態において、鼻腔内投与のために、本開示による組成物は、鼻粘膜に直接適用される軟膏またはゲルの形態で投与され得る。別の実施形態において、本開示による組成物は、点鼻薬、液体スプレー、例えばプラスチックボトルアトマイザー、バッグオンバルブエアロゾルおよび／または定量吸入器を介して投与され得る。鼻用液剤は、通常、滴剤またはスプレーで鼻腔に投与されるように設計された水溶液であり、正常な毛様体作用が維持され得るように、多くの点で鼻汁に類似するように調製される。一実施形態において、水性鼻用液剤は、通常、等張性であり、または高張性であってもよく、鼻用組成物の総重量に基づいて０．１％～１０％ｗ／ｗの間の最終生理食塩水濃度を呈する。いくつかの実施形態において、水性鼻用液剤は、通常、等張性であり、または高張性であってもよく、鼻用組成物の総重量に基づいて０．５％～５％ｗ／ｗの間の最終生理食塩水濃度を呈する。いくつかの別の実施形態において、水性鼻用液剤は通常、等張性であり、または高張性であってもよく、鼻用組成物の総重量に基づいて０．７％～３％ｗ／ｗの間の最終生理食塩水濃度を呈する。
【0069】
吸入、ネブライゼーションまたは気腹としても知られる呼吸器投与の場合、本開示による組成物は、液化ガス推進剤と併用して、微粉末懸濁剤または液剤として加圧エアロゾルを介して投与される。適切なバルブおよび経口アダプターを介して放出されると、組成物は対象の気道に推進される。微細なミストは、加圧エアロゾル（すなわち、気腹器、ネブライザー）によって生成されるため、その使用が有利であると考えられる。加圧エアロゾルは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、窒素、二酸化炭素または他の適切なガスなどの適切な推進剤を含み得る。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を供給するためのバルブを設けることによって決定することができる。
【0070】
本開示による組成物は、いくつかの従来の方法で、口腔の粘膜組織、口腔の歯肉組織、および／または歯の表面に局所的に適用し得る。例えば、歯肉組織または粘膜組織は、本開示による組成物を含む液剤（例えば、口内洗浄剤、口内スプレー）で濯いでもよく；または本開示による組成物が歯磨剤（例えば、練り歯みがき、歯用ゲルまたは歯用粉末）の形態である場合、歯肉／粘膜組織または歯は、歯を磨くことによって生成される液体および／または泡に浸される。他の非限定的な例としては、特許請求される組成物を含む非研磨性ゲルまたはペーストを、以下に記載される口腔ケア器具の有無にかかわらず、歯肉／粘膜組織または歯に直接適用すること；特許請求される組成物を含むガムを噛むこと；特許請求される組成物を含む口臭タブレット、ロゼンジまたは溶解性ストリップを噛むことまたは吸うことが挙げられる。いくつかの実施形態において、組成物を歯肉／粘膜組織および／または歯に適用する方法は、口内洗浄液による濯ぎを介して、または歯磨剤によるブラッシングを介して行われる。いくつかの別の実施形態において、本開示による組成物を歯肉／粘膜組織および／または歯に適用する方法は、プラスチックボトルアトマイザーまたはバッグオンバルブエアロゾルを介して行われる。本開示によるＥＰＳ組成物を歯肉／粘膜組織および歯の表面に局所的に適用する他の方法は、当業者には明らかである。
【0071】
膣投与のためには、本開示による組成物は、活性成分に加えて、当技術分野で適切であることが知られているような担体を含むペッサリー、タンポン、坐剤、クリーム、ゲル、ペースト、発泡体、またはスプレーとして提示され得る。
【0072】
局所投与用に製剤化される場合、本開示による組成物は、担体、ビヒクルまたは媒体のような、局所用医薬組成物、創傷包帯のような医療用デバイスまたは化粧品組成物において典型的な成分を含有し得る。具体的には、担体、ビヒクル、または媒体は、それが適用される組織、例えば、口腔、歯面、鼻腔、呼吸器、咽頭、耳、眼科領域、泌尿生殖器、皮膚、頭皮、毛髪、爪、または粘膜に適合する。本開示の組成物および成分は、過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー応答などを伴わずに、感染組織と接触させるため、または対象に一般的に使用するために適している。本開示によるＥＰＳ組成物は、考慮される分野で従来使用されている任意の追加成分を適宜含み得る。
【0073】
それらの形態の観点から、本開示による組成物は、液剤、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）、懸濁剤、クリーム、ローション、ゲル、粉末、または組成物が使用され得る皮膚および他の組織への適用に使用される他の典型的な固体もしくは液体組成物を含み得る。このような組成物は、以下：抗菌剤、保湿剤および水和剤、浸透剤、防腐剤、乳化剤、天然油または合成油、溶媒、界面活性剤、洗浄剤、ゲル化剤、エモリエント剤、酸化防止剤、香料、充填剤、増粘剤、ワックス、臭気吸収剤、染料、着色剤、粉末、粘度調整剤または水を含むことができ、任意選択で、麻酔剤、かゆみ止め活性剤、植物抽出物、コンディショニング剤、暗色化剤または明色化剤、光輝剤、保湿剤、雲母、ミネラル、ポリフェノール、シリコーンまたはその誘導体、日焼け止め、ビタミン、またはフィトメディシナルを含む。さらに別の実施形態において、本開示によるＥＰＳ組成物は、ＥＰＳ組成物に長期安定性を提供する上記の成分と共に製剤化され、これは継続的または長期的な処置に必要とされ得る。
【0074】
投与方法の観点から、本開示による組成物の担体は、適用後少なくとも１分、または少なくとも５分、または少なくとも１０分、または少なくとも１５分、または少なくとも２０分、または少なくとも２５分、または少なくとも３０分、または少なくとも１時間、または少なくとも２時間、または少なくとも４時間、または少なくとも８時間の、処理表面上の組成物の滞留時間を提供するように選択し得る。
【0075】
液体製剤の場合、特許請求される組成物の容量は、所定のヒトまたは動物について、処置される組織の全表面積の推定に従って調整し得る。例えば、洗口剤製剤の場合、約１ｍＬ～約３０ｍＬ、例えば、約３ｍＬ～約２５ｍＬ、または約５ｍＬ～約２０ｍＬ；または鼻用スプレー製剤の場合、約０．０５ｍＬ～約２ｍＬ、例えば、約０．１ｍＬ～約１．５ｍＬである。いくつかの実施形態において、鼻用製剤専用の特許請求される組成物の容量は、鼻孔あたり約５０μＬ～約３００μＬ、またはバッグオンバルブエアロゾル送達の場合は鼻孔あたり約１００μＬ～約２００μＬである。いくつかの別の実施形態において、鼻用製剤専用の特許請求される組成物の容量は、プラスチックボトルアトマイザー送達の場合は鼻孔あたり約０．３ｍＬ～２ｍＬ、または約０．６ｍＬ～１．２ｍＬである。溶解性ストリップのような他の送達媒体は、濃度および当業者に公知の他の因子の調整を考慮して、これらの範囲から得られる投与量を有することができる。
【0076】
本開示による組成物の１日投与量は、典型的には、対象の状態（予防的処置の場合は健康であるか、または治癒的処置の場合は病気である）に依存し、また処置される表面にも依存する。１日の投与量は、１日１回であってもよいし、１日２回以上の用量に分けて１日２回以上投与してもよい。
【0077】
一実施形態において、本開示による組成物は、少なくとも１日、少なくとも３日、少なくとも５日、または少なくとも１週間、または少なくとも２週間、または少なくとも３週間、または少なくとも４週間、または少なくとも１カ月、または少なくとも２カ月、または少なくとも３カ月である期間、毎日投与される。非限定的な一実施形態において、処理表面上で病原性細菌が検出されなくなるまで処理を継続することが所望され得る。別の実施形態において、本開示によるＥＰＳ組成物は、１日１回または１日２回のような未決定の期間、予防的処置として、対象に投与される。
【0078】
本開示による組成物は、単独でまたは別の抗生物質／抗菌剤／抗ウイルス剤と組み合わせて使用され得る。例えば、バイオフィルム産生の阻害によって、微生物病原体を、別の抗生物質／抗菌剤／抗ウイルス剤、例えば微生物病原体特異的なものを処置するために従来使用されているものの作用に対してはるかに感受性になるであろう。同様に、本開示による組成物はまた、単独でまたは別のＥＰＳと組み合わせて使用することができる。
【0079】
非生物学的表面適用
一実施形態において、本開示による組成物はまた、限定されるものではないが、疎水性および非極性表面を含む非生物学的表面に適用し得る。本質的に、病原性微生物によって定着されやすい、および／またはバイオフィルムによって少なくとも部分的に被覆されている任意の医療用デバイスが、本開示の実施に適切であり、これには、コンタクトレンズ、コンタクトレンズケース、眼科用およびレンズ治療用溶液容器、または他の関連製品、電気化学的グルコースセンサなどの分析物感知デバイス、インスリンポンプなどの薬物送達デバイス、人工内耳などの聴覚を増強するデバイス、尿接触デバイス（例えば、尿道ステント、尿道カテーテル）、血液接触デバイス（心臓血管ステント、静脈アクセスデバイス、弁、血管グラフト、血液透析および胆道ステントを含む）、または体組織および組織液接触デバイス（バイオセンサー、インプラントおよび人工臓器を含む）が含まれる。本組成物で処理され得る医療用デバイスとしては、永久カテーテル、（例えば、中心静脈カテーテル、透析カテーテル、長期トンネル型中心静脈カテーテル、短期中心静脈カテーテル、末梢挿入中心静脈カテーテル、末梢静脈カテーテル、肺動脈Ｓｗａｎ－Ｇａｎｚカテーテル、尿道カテーテル、または腹膜カテーテル）、長期尿デバイス、組織接着尿デバイス、血管グラフト、血管カテーテルポート、創傷ドレーンチューブ、心室カテーテル、水頭症シャント、脳または脊髄シャント、心臓弁、心臓補助デバイス（例えば、左心室補助デバイス）、ペースメーカーカプセル、失禁器具、陰茎インプラント、小型または一時的な人工関節、尿拡張器、カニューレ、エラストマー、ヒドロゲル、外科器具、歯科器具、静脈チューブ、呼吸チューブ、歯科用水ライン、歯科用ドレーンチューブ、または栄養チューブなどのチューブ類、布、紙、インジケーターストリップ（紙製インジケーターストリップまたはプラスチック製インジケーターストリップ）、接着剤（例えば、ヒドロゲル接着剤、ホットメルト接着剤、または溶剤系接着剤）、包帯、創傷被覆材、整形外科用インプラント、または医療分野で使用されるその他のデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる医療用デバイスには、ヒトまたは他の動物に挿入または埋め込まれる可能性のある、または挿入部位または移植部位付近の皮膚などの挿入部位または移植部位に配置される可能性があり、バイオフィルムに埋め込まれた微生物による定着を受けやすい少なくとも１つの表面を含むデバイスも含まれるが、これらに限定されない。医療用デバイスはまた、医療用デバイスの少なくとも１つの表面上でバイオフィルムに埋め込まれた微生物が増殖または成長するのを防止するため、または手術室、救急室、病室、診療所、または浴室の機器の表面など、医療用デバイスの少なくとも１つの表面からバイオフィルム埋込微生物を除去または清浄化するために所望され得るか、または必要とされ得る任意の他の表面を含む。
一実施形態において、本開示による組成物はまた、限定されるものではないが、疎水性および非極性表面を含む非生物学的表面に適用し得る。本質的に、病原性微生物によって定着されやすい、および／またはバイオフィルムによって少なくとも部分的に被覆されている任意の医療用デバイスが、本開示の実施に適切であり、これには、コンタクトレンズ、コンタクトレンズケース、眼科用およびレンズ治療用溶液容器、または他の関連製品、電気化学的グルコースセンサなどの分析物感知デバイス、インスリンポンプなどの薬物送達デバイス、人工内耳などの聴覚を増強するデバイス、尿接触デバイス（例えば、尿道ステント、尿道カテーテル）、血液接触デバイス（心臓血管ステント、静脈アクセスデバイス、弁、血管グラフト、血液透析および胆道ステントを含む）、または体組織および組織液接触デバイス（バイオセンサー、インプラントおよび人工臓器を含む）が含まれる。本組成物で処理され得る医療用デバイスとしては、永久カテーテル、（例えば、中心静脈カテーテル、透析カテーテル、長期トンネル型中心静脈カテーテル、短期中心静脈カテーテル、末梢挿入中心静脈カテーテル、末梢静脈カテーテル、肺動脈Ｓｗａｎ－Ｇａｎｚカテーテル、尿道カテーテル、または腹膜カテーテル）、長期尿デバイス、組織接着尿デバイス、血管グラフト、血管カテーテルポート、創傷ドレーンチューブ、心室カテーテル、水頭症シャント、脳または脊髄シャント、心臓弁、心臓補助デバイス（例えば、左心室補助デバイス）、ペースメーカーカプセル、失禁器具、陰茎インプラント、小型または一時的な人工関節、尿拡張器、カニューレ、エラストマー、ヒドロゲル、外科器具、歯科器具、静脈チューブ、呼吸チューブ、歯科用水ライン、歯科用ドレーンチューブ、または栄養チューブなどのチューブ類、布、紙、インジケーターストリップ（紙製インジケーターストリップまたはプラスチック製インジケーターストリップ）、接着剤（例えば、ヒドロゲル接着剤、ホットメルト接着剤、または溶剤系接着剤）、包帯、創傷被覆材、整形外科用インプラント、または医療分野で使用されるその他のデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる医療用デバイスには、ヒトまたは他の動物に挿入または埋め込まれる可能性のある、または挿入部位または移植部位付近の皮膚などの挿入部位または移植部位に配置される可能性があり、バイオフィルムに埋め込まれた微生物による定着を受けやすい少なくとも１つの表面を含むデバイスも含まれるが、これらに限定されない。医療用デバイスはまた、医療用デバイスの少なくとも１つの表面上でバイオフィルムに埋め込まれた微生物が増殖または成長するのを防止するため、または手術室、救急室、病室、診療所、または浴室の機器の表面など、医療用デバイスの少なくとも１つの表面からバイオフィルム埋込微生物を除去または清浄化するために所望され得るか、または必要とされ得る任意の他の表面を含む。
【0080】
本開示による組成物は、生物学的表面と接触することになる汚染除去された非生物学的表面上に、許容される担体を付加して投与することができる。いくつかの場合において、本開示による組成物の機能性または物理的安定性はまた、水溶液または懸濁液への種々の添加剤の添加によって増加させることができる。限定されるものではないが、ポリオール（糖を含む）、アミノ酸、界面活性剤、ポリマー、他のタンパク質または特定の塩などの添加剤を使用することができる。本開示による組成物および方法は、単独で、または別の殺菌処理と組み合わせて使用することができる。例えば、バイオフィルム産生の阻害により、微生物病原体は、処理表面から微生物病原体特異的なものを死滅させるかまたは廃棄するために従来使用されているような別の殺菌処理の作用に対してはるかに感受性になるであろう。
【0081】
一実施形態において、本開示による組成物は、医療用デバイスまたは器具が汚染された環境に遭遇する前に、および／または物体または器具が対象の組織に遭遇する前に、医療用デバイスまたは器具上に適用、浸漬および／またはコーティングされる。別の実施形態において、病原体の付着を制限するため、および／または（一旦対象の組織と接触すると）感染のリスクを低減するために、対象の組織および前記組織と接触する医療用デバイスまたは器具の両方を、本開示による組成物で処理することができる。別の実施形態において、本開示による組成物は、再使用可能な医療材料または機器の汚染除去プロセスを促進するために使用し得る。いくつかのさらなる実施形態において、本開示による組成物は、医療材料または機器の滅菌の前および／または後に、再使用可能な医療材料または機器の汚染除去プロセスを促進するために使用し得る。
【0082】
噴霧または浸漬によって、本開示による組成物で処理される表面は、前記表面への病原体の付着を低減するために、部分的に覆われるか、または完全に覆われる必要がある。本開示による適用されたＥＰＳ組成物は、例えば、全表面の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、処理表面の実質的な割合を覆うのに有効であり得る。
【実施例】
【0083】
[実施例１：ＥＰＳ産生プロセス]
ＥＰＳ産生のために実施される７段階のプロセスを図１に示す。簡単に説明する：
再活性化および前培養：バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）を含むクライオチューブの内容物を、前培養チューブに分離し、次いで、無菌条件を遵守して、９ｍＬの適合液体Ｚｏｂｅｌｌ培地に懸濁した。この前培養チューブを４０℃のオービタル攪拌下に置き、１５０ｍＬ Ｅｒｌｅｎ中、４０℃、５時間の攪拌下に液体Ｚｏｂｅｌｌ培地で作製した液体培地試験物の播種に使用した。次に、５Ｌの発酵槽４槽に１５０ｍＬのＥｒｌｅｎ前培養物を播種し、４０℃で４～８時間、攪拌、酸素添加（３０～６０％）、およびｐＨ（５～８）の制御下、光学密度（ＯＤ）＞２になるまで静置し、菌の増殖が指数相の初期であることを確認した。
ＥＰＳ産生のために実施される７段階のプロセスを図１に示す。簡単に説明する：
再活性化および前培養：バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）を含むクライオチューブの内容物を、前培養チューブに分離し、次いで、無菌条件を遵守して、９ｍＬの適合液体Ｚｏｂｅｌｌ培地に懸濁した。この前培養チューブを４０℃のオービタル攪拌下に置き、１５０ｍＬ Ｅｒｌｅｎ中、４０℃、５時間の攪拌下に液体Ｚｏｂｅｌｌ培地で作製した液体培地試験物の播種に使用した。次に、５Ｌの発酵槽４槽に１５０ｍＬのＥｒｌｅｎ前培養物を播種し、４０℃で４～８時間、攪拌、酸素添加（３０～６０％）、およびｐＨ（５～８）の制御下、光学密度（ＯＤ）＞２になるまで静置し、菌の増殖が指数相の初期であることを確認した。
【0084】
発酵：５００Ｌの発酵槽に、海塩（４０ｇ／Ｌ）、トリプトン（６ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（６ｇ／Ｌ）、消泡剤（０．３３ｍＬ／Ｌ）、デキストロース（１２ｇ／Ｌ）、脱イオンＨ２Ｏ（ｑｓｐ．）から構成される１５０Ｌの滅菌発酵培地を充填した。発酵培養培地に５Ｌの発酵前培養物を接種し、４０℃で２０～４０時間、攪拌、酸素添加３０～６０％、およびｐＨ５～８の制御下に置いた。菌株の増殖（ＯＤ）およびグルコース消費の両方を、発酵終了までモニターした。
【0085】
熱処理：４００Ｌのジャケット付き攪拌槽で８５℃、１時間の熱処理を行い、酵素および細菌を不活性化した。
遠心分離：培養培地全体をディスクスタック遠心分離機（１４０００ｇ、流速２００～８００Ｌ／ｈ）で遠心分離し、バイオマスと上清を分離した。
濾過および限外濾過：上清をさらに連続濾過（１．６０～０．２２μｍ）および限外濾過ステップ（１０～１００ｋＤａカットオフカートリッジ中空糸ポリサルホン）で処理し、高分子量化合物、すなわちＥＰＳのみを精製および回収した。
凍結乾燥：ＥＰＳを－２０℃で少なくとも１６時間凍結した後、１００ｋｇの氷容積を持つ凍結乾燥機で凍結乾燥した。
包装：凍結乾燥されたＥＰＳは、適切な製剤に製剤化される前に、真空下で密封された低密度ポリエチレン袋に包装され、ラベルが付された。各バッチのサンプルは、標準的な手順に従って特性評価を行った。
遠心分離：培養培地全体をディスクスタック遠心分離機（１４０００ｇ、流速２００～８００Ｌ／ｈ）で遠心分離し、バイオマスと上清を分離した。
濾過および限外濾過：上清をさらに連続濾過（１．６０～０．２２μｍ）および限外濾過ステップ（１０～１００ｋＤａカットオフカートリッジ中空糸ポリサルホン）で処理し、高分子量化合物、すなわちＥＰＳのみを精製および回収した。
凍結乾燥：ＥＰＳを－２０℃で少なくとも１６時間凍結した後、１００ｋｇの氷容積を持つ凍結乾燥機で凍結乾燥した。
包装：凍結乾燥されたＥＰＳは、適切な製剤に製剤化される前に、真空下で密封された低密度ポリエチレン袋に包装され、ラベルが付された。各バッチのサンプルは、標準的な手順に従って特性評価を行った。
【0086】
[実施例２：ＥＰＳ特性評価－平均分子量決定]
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
【0087】
ＥＰＳは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ－ＳＥＣ）装置、すなわち、屈折率検出器、およびレーザー光散乱検出器および粘度計検出器を備えたＴＤＡ ３０２（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ）により分析した。このシステムは、分子量、多分散性指数、および固有粘度が認証されたプルラン標準物質（ＰｏｌｙＣＡＬ－ＰｕｌｌｕｌａｎＳＴＤ－１０５ｋ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で校正された。移動相（０．２Ｍ ＮａＮＯ３＋０．０５％ ＮａＮ３、ｐＨ６．８１）に溶解したＥＰＳサンプル（１００μＬ、１ｍｇ／ｍＬ）を、ＧＭＰＷＸカラム（７．８ｍｍｘ３０ｃｍ、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に０．６ｍＬ／分の流速で４０℃で注入した。
【0088】
分析結果（ＥＰＳサンプルあたり２回の分析の平均値）は、重量平均分子量（Ｍｗ；４０～１５０ｋＤａ）、数平均分子量（Ｍｎ；２６～１００ｋＤａ）、および多分散性指数（Ｍｗ／Ｍｎ；１．２～１．８）の観点で、全てｄｎ／ｄｃパラメータ０．１３５～０．１４７を使用して、および回収％（９４～９９％）の観点で報告されており、これは屈折率検出器から算出した濃度と実験濃度の間の比を表す。
【0089】
[実施例３：ＥＰＳ特性評価－グリコシル組成の決定]
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
【0090】
ＥＰＳのグリコシル組成は、２つの特性評価法、すなわち酢酸アルジトール法（Pena et al. (2012) Methods Enzymol. 510:121-39）およびＴＭＳ誘導体化メチルグリコシド法(Santander et al. (2013) Microbiology 159:1471)に従って行った。簡単に説明する：
【0091】
酢酸アルジトール（ＡＡ）法によるグリコシル組成分析：酢酸アルジトールの複合ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により、グリコシル組成分析を行った。ＥＰＳサンプル（２５０μｇ）を２Ｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中、密閉チューブ中で１２０℃、２時間加水分解し、ＮａＢＤ４で還元し、無水酢酸／ＴＦＡを用いてアセチル化した。得られた酢酸アルジトールは、５９７５Ｃ ＭＳＤに接続したＡｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａ ＧＣ上で、電子衝撃イオン化モードで分析した。分離は３０ｍのＳｕｐｅｌｃｏ ＳＰ－２３３１結合相フューズドシリカキャピラリーカラム上で行った。アミノ糖の分離は別のＥＣ－１カラムを使用して達成した。
【0092】
ＴＭＳ誘導体化メチルグリコシドのＧＣ－ＭＳによるグリコシル組成分析：酸性メタノリシスによりサンプルから生成した単糖メチルグリコシドのパー－Ｏ－トリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体の複合ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ－ＭＳ）によりグリコシル組成分析を行った。ＥＰＳサンプル（２５０μｇ）を密閉したねじ口ガラス試験管中でメタノール性ＨＣｌと共に８０℃で１８時間加熱した。冷却後、窒素気流下で溶媒を除去した後、サンプルを再度Ｎ－アセチル化し、再び乾燥させた。その後、サンプルをＴｒｉ－Ｓｉｌ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ）で８０℃、３０分間誘導体化した。ＴＭＳメチルグリコシドのＧＣ／ＭＳ分析は、５９７５Ｃ ＭＳＤに接続したＡｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａ ＧＣで、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｅｑｕｉｔｙ－１ フューズドシリカキャピラリーカラム（３０ｍｘ０．２５ｍｍ ＩＤ）を用いて行った。
【0093】
２つの組成法から、マンノースが、検出される主なヘキソース糖であり、Ｎ－アセチルガラクトサミンが、検出される主なアミノ糖であることが示される。また、サンプル中にはガラクトース、グルコース、およびＮ－アセチルグルコサミンもかなりの量存在する。低い割合のキシロースも検出されたが、グルクロン酸はＴＭＳ法でのみ検出された。しかし、表１に示すように、リボース、アラビノース、ラムノース、フコース、フルクトースは、どちらの特性評価方法を使用しても検出されなかった。
【0094】
【表1】
【0095】
[実施例４：ＥＰＳタンパク質および核酸含量分析]
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
【0096】
ＥＰＳタンパク質含量分析：タンパク質含量を、改変Ｌｏｗｒｙアッセイ、すなわちＢｉｏＲａｄ総タンパク質染色を用いて決定した。この分析は、製造者の説明書に従い、ＥＰＳのニートサンプルについて実施し、ＢＳＡ標準曲線を用いて定量化した。簡単に説明すると、サンプル１０μＬを試薬の１：４希釈液２００μＬと混合した。１０分後、サンプルを５９５ｎｍの吸光度によって分析した。ＥＰＳ中のタンパク質の混入は０．０５２±０．０１９ｍｇ．ｍＬ－１と評価され、単離されたＥＰＳの総重量に基づいて約０．００５％ｗ／ｗを示した。
【0097】
２６０／２８０および２６０／２３０分析によるＥＰＳ核酸含有量の測定：ＥＰＳサンプル２μＬをＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計で２６０／２８０および２６０／２３０ｎｍで分析した。ＥＰＳ中の核酸混入は５８．０±８．７ｎｇ．μＬ－１と評価され、単離されたＥＰＳの総重量に基づいて約０．００６％ｗ／ｗを示した。
【0098】
[実施例５：細菌病原体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＰＳ抗バイオフィルム活性]
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
【0099】
以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験により、病原性菌株のバイオフィルム形成すなわち：グラム陰性菌［Ｂ型インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）ＡＴＣＣ９７９５、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）ＡＴＣＣ８０４７および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３］およびグラム陽性菌［黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ２９２１３、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）血清３型ＡＴＣＣ６３０３およびストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）ＤＳＭ２０５２３］に対するＥＰＳの阻害効果を記載している。
【0100】
細菌病原体のバイオフィルム形成は、９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートで行い、各細菌病原体の一晩培養物１８０μｌ（１．５×１０８菌．ｍＬ－１）のアリコートを、異なる濃度（５０、１００、２００および４００μｇ．ｍｌ－１）のＰＢＳ中ＥＰＳ溶液２０μｌ、または対照としてＰＢＳ２０μｌと共に接種した。プレートは３７℃で２４時間（肺炎レンサ球菌（St. pneumoniae））、48時間（インフルエンザ菌（H.influenzae）、緑膿菌（P.aeruginosa）、肺炎桿菌（K. pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（S. aureus））、96時間（St.ミュータンス（St. mutans））インキュベートし、各菌株の増殖速度を配慮し、バイオフィルム産生のために振盪を行わなかった。インキュベーション培地も各菌株に合わせ、したがって、微好気性株、または嫌気性株のインキュベーションは、５％ＣＯ２または嫌気条件下でそれぞれ行った。非付着菌は蒸留滅菌水で３回洗浄して除去し、付着菌（バイオフィルム）は９６％ｖｏｌ（ｗ／ｖ）のエタノール中０．１％クリスタルバイオレット溶液で２５分間染色した。過剰な染色液は吸引して除去し、プレートを蒸留滅菌水で洗浄（５回）し、風乾（１５分間）した。染色したバイオフィルムを９６％エタノールで可溶化し、マイクロタイタープレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ（商標）ＧＯ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて５８５ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定した。バイオフィルム形成（％）は以下の式に従って算出した：
【0101】
【数1】
【0102】
これらの実験では、病原性細菌株は最適な条件下で、適合した培地中で、既存の他の病原体との競合がない状態で培養され、インキュベートされた。バイオフィルム形成のパーセンテージはＯＤで計算されるため、洗浄後にクリスタルバイオレット標識細胞が多く測定されるほど、より多くの細胞がプレートに付着していることになり、インキュベーション期間中により多くのバイオフィルムが形成されたことになる。バイオフィルム形成の低減は、関与する病原性株に関係なく観察されている。ＥＰＳの予防的抗バイオフィルム作用を図２に示す。病原性細菌の接種後、最初の２時間以内にＥＰＳを添加した場合、最大の効果が観察された（データは示さず）。接種から４時間後にＥＰＳを添加した場合、バイオフィルム形成に対する効果はわずかに低下する（データは示さず）。
【0103】
[実施例６：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＰＳ抗菌活性実験]
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
【0104】
細菌病原体によるバイオフィルム形成に対するＥＰＳの阻害作用が、直接的な増殖阻害によるものである可能性があるかどうかを調べるために、２回の独立した機会（Ｎ＝２）において、三連（Ｎ＝３）で実施例５と同様の実験を行い、抗菌活性を評価した。簡単に説明すると：ポリスチレンマイクロタイタープレートに、試験株（ＯＤ６００＝０．１）のそれぞれの最適培地（１８０μｌ）中の、最終濃度５０、１００、２００および４００μｇ．ｍｌ－１のＰＢＳ溶液中ＥＰＳ２０μｌ、または対照としてＰＢＳ２０μｌを含む、一晩病原性細菌培養物を充填した。プレートは、好気性、微好気性または嫌気性の条件下で、振盪することなく、３７℃で２４時間～９６時間（最適な増殖期間は試験株によって異なる）の範囲でインキュベートした。抗菌活性は、マイクロタイタープレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ（商標）ＧＯ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いてＯＤ６００値を測定し、対照ウェルの平均ＯＤ６００を各試験条件の平均ＯＤ６００と比較した。
【0105】
様々な細菌病原体の培養増殖に対するＥＰＳの抗菌効果を、それぞれの最適増殖期間後の処理細胞ｖｓ無処理細胞のＯＤ６００値、平均±ＳＤを比較して、図３に示す。サンプルの濁度測定（例えばＯＤ６００）は、培地中の細菌濃度を推定するために分光光度計で一般的に使用され、これによって細胞集団の経時的な増殖を測定することができる。ＥＰＳ非存在下での増殖培養物を対照として用いた。
【0106】
図３に示す結果は、ＥＰＳの有無にかかわらず、同じ病原性細菌の増殖レベルが達成されたことを示す。これは、様々な濃度（５０～４００μｇ．ｍｌ－１）のＥＰＳの存在が病原性細菌の増殖に悪影響を及ぼさないことを示しており、より一般的には、ＥＰＳの存在は試験した全ての細菌株の増殖速度に影響を及ぼさなかった。したがって、ＥＰＳは、その濃度および考慮する病原性細菌とは独立して、殺菌効果、静菌効果、抗生物質効果を示さない。したがって、殺生物効果を持たないＥＰＳの存在は、生体組織上に存在するはずの天然微生物叢の完全性を尊重することが実証されている。
【0107】
[実施例７：ＥＰＳ細胞傷害性アッセイ]
本明細書の実施例で使用されるＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
本明細書の実施例で使用されるＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
【0108】
ヒト鼻上皮細胞（ＨＮＥｐＣ）に対するＥＰＳの推定細胞傷害性効果の予備試験をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施した。ヒト鼻上皮細胞（ＨＮＥｐＣ）を、ＢＥＢＭ完全培地中で８０％コンフルエントになるまで製造者が推奨するように増殖した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３７℃、５％ＣＯ２培地中で、０（対照）～８００μｇ．ｍＬ－１の範囲のＥＰＳと共に２時間または２４時間培養した。培養後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、回収し、生存率色素ＴＯ－ＰＲＯ３で染色することによって生存率を評価した。培養物中の生存細胞を示すＴＯ－ＰＲＯ３陰性細胞のパーセンテージを、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓフローサイトメーターで評価した。
【0109】
２時間後および２４時間後のＨＮＥｐＣの生存率に対するＥＰＳの濃度増加の時間依存的影響を図４に示す。ＨＮＥｐＣ細胞は感受性が高いためモデルとして選ばれ、ＥＰＳの投与量を増やしながら２時間および２４時間、連続してインキュベートした。図４に示すように、細胞生存率は対照と同じであった。この結果は、濃度およびインキュベーション時間にかかわらず、ＥＰＳの存在は細胞傷害性を誘導しないことを示している。
【0110】
[実施例８：ＨＮＥｐＣ細胞を用いたＥｘ Ｖｉｖｏ ＥＰＳアッセイ]
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
【0111】
次に、ヒト鼻上皮細胞の単層から２つの細菌株、すなわち黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を除去するＥＰＳ組成物の有効性を評価した。
【0112】
ヒト鼻上皮細胞（ＨＮＥｐＣ；ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、カタログ番号Ｃ－１２６２０）をＢＥＢＭ完全培地中で８０％コンフルエントになるまで製造者が推奨するように培養した。ＨＮＥｐＣ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、病原性細菌（緑膿菌（P. Aeruginosa）または黄色ブドウ球菌（S. Aureus））と共に、３７℃、５％ＣＯ２、抗生物質無添加培地中で２時間培養した。緑膿菌（P.aeruginosa）はＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉブロスで、黄色ブドウ球菌（S. aureus）はトリプトンソイブロスで増殖させた。ブロスでの一晩培養時に、細菌は光学密度（ＯＤ６００）０．１でＰＢＳで希釈し、実験に使用した。汚染されたＨＮＥｐＣ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＢＥＢＭ完全培地にＥＰＳを０（対照）、５０、１００、２００、および４００μｇ．ｍＬ－１で添加し２時間放置した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＨＮＥｐＣ細胞を死滅および剥離させ、残存細菌を全て回収するために、蒸留Ｈ２Ｏで１０分間最終洗浄を行った。その後、上清（死滅細胞および細菌を含む）を回収し、適切な希釈後にＡＧＡＲ培地（緑膿菌（P. aeruginosa）はセトリミド寒天培地、黄色ブドウ球菌（S. aureus）はマンニトール塩寒天培地）に播種した。細菌増殖は、２４時間後にプレート内の細菌コロニー（ＣＦＵ）をカウントすることによって分析した。
【0113】
ヒト鼻上皮細胞（ＨＮＥｐＣ）単層からの緑膿菌（P. auroginosa）および黄色ブドウ球菌（S. aureus）の除去に対するＥＰＳのｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性を図５に示す。これらの実験は、２～４回の独立した機会（Ｎ＝２～４）の間で、三連（ｎ＝３）で行った。統計学的有意性は、Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ一元配置分散分析により決定した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。事後解析はＤｕｎｎ検定を用いて行った。
【0114】
浸透圧ショック（脱イオン水による洗浄）前に鼻腔細胞に付着していた病原性細菌の数を測定することにより、これらの実験は、病原性細菌の支持体、すなわち鼻腔上皮細胞（ＨＮＥｐＣ）からの剥離に対するＥＰＳの効果を間接的に測定した。したがって、これらの結果は、ＥＰＳが、その起源によらず、生物学的表面上における細菌バイオフィルム設置の結果を制限する能力を有することを示した。実際、バイオフィルムの形成がＥＰＳの存在によって影響を受けた実施例５で実証された予防効果に加えて、本明細書では、ＥＰＳ洗浄がその病原性細菌細胞除去効果により治療活性を有し得ることが実証された（図５）。
【0115】
[実施例９：ＥＰＳの乳化／界面活性特性]
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
【0116】
ＥＰＳの乳化／界面活性剤としての活性は、Ｓｏｎｇら（Preparation of Calcipotriol Emulsion using bacterial Exopolysaccharides as Emulsifier for percoutaneous treatment of Psoriasis Vulgaris. Int J Mol Sci. 2019, 20;21(1) 2019）によって記載される方法によって決定した。簡単に説明すると、凍結乾燥したＥＰＳをＰＢＳに再懸濁し、５～８００μｇ．ｍＬ－１の範囲のいくつかの濃度に達するようにした。各ＥＰＳ溶液の２．０ｍＬの容積を、２．０ｍＬの植物油を含むガラス管内に添加した。その後、得られた不均一な溶液を乳化のためにボルテックスミキサーを用い、３０００ｒｐｍで２分間混合した。「植物油＋ＰＢＳ」と「植物油＋サポニン（１％）」をそれぞれ陰性対照および陽性対照として使用した。乳化指数評価（Ｅ２４）に先立ち、サンプルは攪拌せずに室温で２４時間静置した。Ｅ２４は、乳化層の高さを全液柱高で割った値に１００を乗じた値で表される。
【0117】
図６に示す３つの独立した実験（Ｎ＝３）の結果から、ＥＰＳは低濃度でも強い乳化活性を示すことが実証された（すなわち、ＥＰＳ ０，００５％に相当する５０μｇ．ｍＬ－１のみでＥ２４ ５０％に達した）。さらに、環境中のＥＰＳの量が多いほど、乳化作用が大きくなることが明確に示された。
【0118】
[実施例１０：高用量のアデノウイルスまたはライノウイルスを接種したＨＮＥｐＣに対するＥＰＳのＥｘ ｖｉｖｏ予防的抗ウイルス活性]
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
【0119】
ヒトアデノウイルス２（ＡＴＣＣ ＶＲ－８４６）およびヒトライノウイルス１６（ＡＴＣＣ ＶＲ－２８３）を接種した生存ヒト鼻上皮細胞のウイルス感染を予防するＥＰＳの能力を評価した。以下に簡単に説明する
【0120】
ヒト鼻上皮細胞（ＨＮＥｐＣ）をＢＥＢＭ完全培地中で８０％コンフルエントになるまで製造者が推奨するように培養した。細胞を４００μｇ．ｍＬ－１のＥＰＳで処理し、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、ライノウイルスまたはアデノウイルスの高負荷（１ ＴＣＩＤ５０、４８時間後に接種細胞の５０％に細胞障害効果を引き起こすウイルス量を表す）を同じ条件で接種し、インキュベートした。あるいは、生存ＨＮＥｐＣを３７℃、５％ＣＯ２で２時間同じ接種物に感染させ、洗浄した後、ＥＰＳ ４００μｇ．ｍＬ－１で３７℃、５％ＣＯ２でさらに２時間処理した。未処理の生細胞（ＢＥＢＭ完全培地のみ）を陽性対照とし、ＥＰＳ処理なしのウイルス接種生細胞を陰性対照とした。ＰＢＳで洗浄した後、前処理細胞（すなわち、ウイルス接種前にＥＰＳ組成物で処理した細胞）、後処理細胞（すなわち、ウイルス接種後にＥＰＳ組成物で処理した細胞）および対照を、ＢＥＢＭ培地で４８時間、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。４８時間培養後、細胞を回収し、生存率色素ＴＯ－ＰＲＯ－３による染色で生存率を評価した。培養物中の生存細胞を示すＴＯ－ＰＲＯ－３陰性細胞のパーセンテージを、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓフローサイトメーターで評価した。
【0121】
高用量のアデノウイルスまたはライノウイルスに感染したＨＮＥｐＣに対するＥＰＳ（４００μｇ．ｍＬ－１）の抗ウイルス活性を図７に報告する。陰性対照（ウイルス接種のみ）では、４８時間後にＨＮＥｐＣの半数がウイルス接種の影響を受けた。しかし、ウイルス接種前に細胞をＥＰＳで前処理すると、観察された細胞死亡率は陰性対照の半分に低下した。したがって、このような前処理は、ウイルス感染後の細胞の生存率を向上させ、考慮されるウイルスとは独立した、ウイルス感染に対するＥＰＳの予防的特性を明らかにしている。事前にウイルス負荷を接種した鼻上皮細胞のＥＰＳ処理は、前処理よりも顕著ではない（図７）。理論に拘束されることを望むものではないが、このような観察結果は、２時間で大量のウイルスがＨＮＥｐＣ内に内在化し、細胞の大部分の急速なビリオンによる汚染が可能になる、高ウイルス負荷接種によって説明できる。これらの結果は、ＥＰＳが細胞内効果（すなわち免疫反応の誘発）を促進するのではなく、むしろウイルスの内在化を立体的に妨げる細胞外の「バリア」効果を有することを間接的に示した。にもかかわらず、このような高いウイルス負荷（すなわち１ ＴＣＩＤ５０）の接種は、より低いウイルス量（すなわち０．００１ ＴＣＩＤ５０）の接種が関与するウイルス感染の実態を反映していないことは言及に値する。
【0122】
ＥＰＳ濃度を２００μｇ．ｍＬ－１に下げた以外は、同じ条件でさらなる抗ウイルス実験を行った。高用量のアデノウイルスまたはライノウイルスを接種したＨＮＥｐＣに対するＥＰＳ（２００μｇ．ｍＬ－１）の抗ウイルス活性を、それぞれ図８Ａおよび図８Ｂに報告する。これらの結果は、高用量のＥＰＳで観察されたものと同等の予防的抗ウイルス活性を示した。
【0123】
[実施例１１：低用量のアデノウイルスまたはライノウイルスを接種したＨＮＥｐＣに対するＥＰＳのｅｘ ｖｉｖｏ治療的抗ウイルス活性]
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
【0124】
ウイルス接種によって接種された細胞からビリオンが放出された後の細胞感染の拡散を防止するＥＰＳの能力を測定した。ウイルス感染の実態とより一致させるために、これらの実験は、ヒトアデノウイルス２（ＡＴＣＣ ＶＲ－８４６）およびヒトライノウイルス１６（ＡＴＣＣ ＶＲ－２８３）の両方のウイルス負荷量を実施例１０で示したよりも低く（すなわち、０．００１ ＴＣＩＤ５０）使用して、一方、接種後のウイルス拡散を可能にするために細胞培養期間を５日まで延長して実施した。また、保護効果を発揮するためにはＥＰＳの一貫した存在が必要なのか、またはＨＮＥｐＣとの最初の接触で十分なのかを理解することも求められた。そこで、ＥＰＳを前処理としてのみ添加するか（実施例１０と同様）、またはウイルス接種後にさらに添加する（５日間培養の最初に１回添加するか、または５日間毎日添加する）、異なる細胞培養条件を実施した。簡単に説明すると、生存ヒト鼻上皮細胞（ＨＮＥｐＣ）を、ＢＥＢＭ完全培地中で８０％コンフルエントになるまで製造者が推奨するように増殖した。ｉ）陽性対照として、生存ＨＮＥｐＣをＢＥＢＭ培地で培養し、陰性対照として、ウイルス接種物（低用量、０．００１ ＴＣＩＤ５０）を２時間接種し、ＰＢＳで洗浄して内在化しなかったウイルスを除去し、５日間培養したＨＮＥｐＣを含めた。ｉｉ）生存ＨＮＥｐＣを４００μｇ．ｍＬ－１のＥＰＳで２時間処理し、ＰＢＳで洗浄し、ウイルス接種物（低用量、０．００１ ＴＣＩＤ５０）を２時間接種し、ＰＢＳで洗浄して５日間培養した。ｉｉｉ）生存ＨＮＥｐＣにウイルス接種物（低用量、０．００１ ＴＣＩＤ５０）を２時間接種し、ＰＢＳで洗浄し、ＥＰＳ（４００μｇ．ｍＬ－１）存在下で、５日間培養し、１日目にＥＰＳ溶液を１ショットで添加した。ｉｖ）生存ＨＮＥｐＣにウイルス接種物（低用量、０．００１ ＴＣＩＤ５０）を２時間接種し、ＰＢＳで洗浄し、ＥＰＳ（４００μｇ．ｍＬ－１）存在下で５日間培養し、毎日ＥＰＳ（４００μｇ．ｍＬ－１）を培養物に添加した。培養５日後、細胞を回収し、ＴＯ－ＰＲＯ３により生存率を評価した。ＴＯ－ＰＲＯ－３陰性細胞（生存細胞を表す）のパーセンテージは、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓフローサイトメーターによって各条件について評価した。
【0125】
低用量のアデノウイルスまたはライノウイルスを接種したＨＮＥｐＣに対するＥＰＳ抗ウイルス活性を図９に報告し：陰性対照（低用量のウイルス接種のみ）は、５日後にＨＮＥｐＣの半数以上がウイルス接種の影響を受けていたことを示した。実施例１０で観察されたウイルス感染に対するＥＰＳ前処理（すなわち、ウイルスを接種する前にＥＰＳ組成物で処理した細胞）の予防的特性は、５日間の培養後、陽性対照に近い細胞生存率により確認された。さらに、ウイルス接種後にＥＰＳ組成物を適用した場合（すなわち、後処理細胞）、ウイルスは陰性対照（すなわち、ＥＰＳ処理なしのウイルス）と同じ細胞死亡率を誘導できなかったことが示されている。
【0126】
２つの後処理実験（５日間で１回のＥＰＳ適用、および５日間１日１回のＥＰＳ適用）でも同様の結果が得られ（図９）、ＥＰＳはビリオンの放出だけでなく、隣接する細胞への拡散も防止することが実証された。したがって、ＥＰＳは、５日間のインキュベーション後、ウイルス接種の病原性を５０％低下させる治療効果を提供する（図９）。これらの結果は、実施例１０の観察を補強するものであり、ここでウイルスの内在化を立体的に妨げる細胞外「バリア」効果がここで問題となるであろう。
【0127】
したがって、これらの２つの複合効果、すなわち予防効果（ウイルス接種前の細胞のＥＰＳ前処理で観察）と治療効果（ウイルス接種後の細胞のＥＰＳ後処理で観察）は、ウイルス感染の消滅を促進する。このようなＥＰＳの投与は、したがって、標的とするウイルス株に対する特異性が証明されていないことから、任意の種類のウイルス感染から効果的に自身を防御するための細胞機構のサポートとして機能する可能性がある。
【0128】
ＥＰＳ濃度を２００μｇ．ｍＬ－１に下げた以外は同じ条件で、さらなる抗ウイルス実験を行った。低用量のアデノウイルスまたはライノウイルスを接種したＨＮＥｐＣに対するＥＰＳ（２００μｇ．ｍＬ－１）の抗ウイルス活性を、それぞれ図１０Ａおよび図１０Ｂに報告する。これらの結果は、高用量のＥＰＳで観察されたものと同等の予防的および治療的抗ウイルス活性の両方を示した。
【0129】
[実施例１２：低用量および高用量のコロナウイルスに感染したＨＮＥｐＣに対するＥＰＳのｅｘ ｖｉｖｏ治療的抗ウイルス活性]
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
【0130】
高濃度（１ ＴＣＩＤ５０）および低濃度（０．００１ ＴＣＩＤ５０）のウイルス負荷でヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）を接種した生存ヒト鼻上皮細胞のウイルス感染を防止するＥＰＳの能力を測定した。本明細書の試験で使用したヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）は、ヒトの呼吸器感染症の５～３０％を占める、ヒト感染症に最も一般的に関連するウイルスである（Lau SKP et al., 2011, Journal of Virology）。簡単に説明すると、ヒト鼻上皮細胞（ＨＮＥｐＣ）をＢＥＢＭ完全培地中で８０％コンフルエントになるまで製造者が推奨するように培養した。細胞を２００～４００μｇ．ｍＬ－１のＥＰＳで処理し、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、コロナウイルス用量（１ ＴＣＩＤ５０または０．００１ ＴＣＩＤ５０）を同じ条件で接種してインキュベートした。あるいは、生存ＨＮＥｐＣに同じ接種物を３７℃、５％ＣＯ２で２時間接種し、洗浄した後、ＥＰＳ ２００～４００μｇ．ｍＬ－１で３７℃、５％ＣＯ２でさらに２時間処理した。未処理の生細胞（ＢＥＢＭ完全培地のみ）を陽性対照として用い、ＥＰＳ処理なしのウイルス接種生細胞を陰性対照として用いた。ＰＢＳで洗浄後、前処理細胞（すなわち、ウイルス感染前にＥＰＳ組成物で処理した細胞）、後処理細胞（すなわち、ウイルス感染後にＥＰＳ組成物で処理した細胞）および対照を、ＢＥＢＭ培地で４８時間、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。４８時間培養後、細胞を回収し、生存率色素ＴＯ－ＰＲＯ－３による染色で生存率を評価した。培養物中の生細胞を表すＴＯ－ＰＲＯ－３陰性細胞のパーセンテージをＳｙｍｐｈｏｎｙ ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓフローサイトメーターで評価した。
【0131】
高用量または低用量のコロナウイルスを接種したＨＮＥｐＣに対するＥＰＳ（２００～４００μｇ．ｍＬ－１）の抗ウイルス活性を図１１に報告する。これらの結果は、ＥＰＳが：ｉ）本明細書の実施例１０に記載される予防的抗ウイルス活性、およびｉｉ）本明細書の実施例１１に記載される治療的抗ウイルス活性を、考慮されるウイルスとは独立して提供することを実証した。
【0132】
[実施例１３：ＥＰＳ製剤－鼻用製剤]
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
【0133】
鼻用製剤１：海水および脱塩海水を、洗浄したバルクタンク中で所望の塩濃度（製剤に従って０．９％または２．２％または２．７％）に達するまで室温で混合した。本開示の凍結乾燥ＥＰＳを可溶化するために、一定容積のバルク溶液（１０Ｌ）を採取し、２００μｇ／ｍＬまたは４００μｇ／ｍＬ（所望の製剤による）に相当する０．０２％または０．０４％の所望のＥＰＳ濃度に到達させた。ＥＰＳとバルク溶液の両方を少なくとも３０分間均質化した後、０．２２μｍで濾過した。鼻用スプレー缶に充填する前に、この操作を１回繰り返した。
【0134】
鼻用製剤２：塩化ナトリウムを室温で水に溶解し、洗浄したバルクタンクで所望の塩濃度０．９％、２．２％または２．７％（所望の製剤による）に達するようにした。次に、本開示のＥＰＳを上記のバルク溶液内に溶解し、２００μｇ／ｍＬまたは４００μｇ／ｍＬ（所望の製剤による）に相当する０．０２％または０．０４％の所望のＥＰＳ濃度に到達させた。ＥＰＳおよびバルク溶液の両方を少なくとも３０分間均質化した後、０．２２μｍで濾過した。鼻用スプレー缶に充填する前に、この操作を１回繰り返した。
【0135】
[実施例１４：ＥＰＳ製剤－局所製剤（クリーム）]
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
【0136】
ポリアクリレートクロスポリマー－６（１．５％ｗ／ｗ）および水（６３．０％ｗ／ｗ）を、キサンタンガム（４．０％ｗ／ｗ）およびグリセリン（２．０）の添加前に十分に混合した。得られた混合物（相Ａ）を連続混合下で７０～７５℃に加温した。スクロースポリステアレート（３．０％ｗ／ｗ）、ジベヘン酸グリセリル（１．７％ｗ／ｗ）、水素化ホホバ油（２１．０％ｗ／ｗ）の混合物を７０～７５℃に加温した後、連続混合下で相Ａに添加し、相Ｂを得た。相Ｂを７０～７５℃で２０分間乳化のために混合した後、乳化した相Ｂを３０℃まで冷却した。ＥＰＳ（０．０２～０．０４％ｗ／ｗ）、ビタミンＥ酢酸塩および香料を３０℃で乳化したＢ相に一定の攪拌下で添加した。得られた混合物のｐＨを、水中のクエン酸溶液（ｑｓｐ．）でｐＨ４．５～５．０に調整した。
【0137】
[実施例１５：本明細書に開示したＥＰＳの薬理学的／免疫学的特性]
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
本明細書の実施例で使用したＥＰＳは、実施例１に記載したように、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４（寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７）の発酵によって得た。
【0138】
海洋細菌が産生するＥＰＳは、白血球および組織細胞において制御性サイトカインの選択されたパターンを誘導し得ることが報告されているため（Okutani K. et al. Bull Jpn Soci Sci Fish 1984;50:1035-7）、これらのアッセイの目的は、本開示のＥＰＳが、ＥＰＳが接触するであろう細胞においてどの程度免疫応答を誘導し得るかを決定することであった。したがって、２つの異なるシステム、すなわち、自然免疫系の上皮細胞および白血球が、細菌由来の物質と接触した場合に修飾を受けやすいと考えられるため、本明細書におけるアッセイを、それぞれ、ヒト鼻上皮細胞（ＨＮＥｐＣ）およびヒト単球由来樹状細胞（ＤＣ）上で実施した。
【0139】
より詳細には、ｉ）ＨＮＥｐＣとのＥＰＳサンプルとの培養後の、ＩＬ－６およびＩＬ－８などの炎症経路に関与する主要なサイトカインの産生、およびｉｉ）ＣＤ８３、ＣＤ４０およびＣＤ２５などの最も重要な活性化／成熟マーカーの発現および炎症性サイトカイン（ＩＬ－６およびＩＬ－８）の産生を評価するためにＥＰＳ刺激後のＤＣの活性化状態を評価するために、以下の一連の実験を行った。
【0140】
ｉ）ＨＮＥｐＣに対する本開示のＥＰＳの効果：
ヒト鼻上皮細胞（ＨＮＥｐＣ）をＢＥＢＭ完全培地中でコンフルエントになるまで増殖させ、ＥＰＳサンプル（４００μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激した。未刺激のまま放置した細胞、またはＩＬ－１β（５０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した細胞を、それぞれ陰性対照および陽性対照として用いた。ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（タンパク質輸送阻害剤）としてモネンシンおよびブレフェルジンを用い、培養の最後の１２時間に添加した。細胞を回収し、１％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中のサポニン０．１％（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で透過処理し、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ＩＬ－８抗体および抗ＩＬ－６抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した後、フローサイトメトリーで分析した。
ヒト鼻上皮細胞（ＨＮＥｐＣ）をＢＥＢＭ完全培地中でコンフルエントになるまで増殖させ、ＥＰＳサンプル（４００μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激した。未刺激のまま放置した細胞、またはＩＬ－１β（５０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した細胞を、それぞれ陰性対照および陽性対照として用いた。ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（タンパク質輸送阻害剤）としてモネンシンおよびブレフェルジンを用い、培養の最後の１２時間に添加した。細胞を回収し、１％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中のサポニン０．１％（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で透過処理し、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ＩＬ－８抗体および抗ＩＬ－６抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した後、フローサイトメトリーで分析した。
【0141】
これら２つのサイトカインは、炎症経路および炎症性現象を起こす免疫細胞のリクルートメントに関与する主要なメディエーターである。図１２Ａおよび図１２Ｂに図示されているように、未刺激のＨＮＥｐＣと比較すると、本開示のＥＰＳで２４時間刺激した後のＨＮＥｐＣによるＩＬ－６およびＩＬ－８の産生は見られなかった。驚くべきことに、ＨＮＥｐＣは、典型的な炎症分子（すなわち、ＩＬ－１β）で適切に刺激されると、これらのサイトカインを産生する能力があるにもかかわらず、ＥＰＳ曝露時にはサイトカイン産生が観察されなかった。したがって、これらの結果は、本開示のＥＰＳが炎症反応を誘導できないことを示している。
【0142】
ｉｉ）ＤＣに対する本開示のＥＰＳの効果
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により２人の健常ドナーから単離した。単球は、プラスチック表面に３７℃、５％ＣＯ２で４５分間付着させることにより単離した。その後、非付着細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することによって除去した。得られた細胞は、ＩＬ－４（２０ｎｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ）とＧＭ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍＬ、Ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）の存在下で完全ＲＰＭＩ培地で培養した。６日間の培養後、非付着細胞はＣＤ１４－／ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ８３－の表現型を示し、これは未成熟樹状細胞（ＤＣ）に特徴的である。
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により２人の健常ドナーから単離した。単球は、プラスチック表面に３７℃、５％ＣＯ２で４５分間付着させることにより単離した。その後、非付着細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することによって除去した。得られた細胞は、ＩＬ－４（２０ｎｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ）とＧＭ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍＬ、Ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）の存在下で完全ＲＰＭＩ培地で培養した。６日間の培養後、非付着細胞はＣＤ１４－／ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ８３－の表現型を示し、これは未成熟樹状細胞（ＤＣ）に特徴的である。
【0143】
ＤＣを、本明細書に開示されたＥＰＳ（４００μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激した。未刺激で放置した細胞、またはリポ多糖（ＬＰＳ、１μｇ／ｍＬ）で刺激した細胞を、それぞれ陰性対照および陽性対照として用いた。サイトカイン産生分析のために、モネンシンおよびブレフェルジンをＧｌｏｇｉＳｔｏｐとして用い、添加してＤＣ培養の最後の１２時間の間放置した。Ａ）ＤＣ活性化：２４時間後、ＤＣを回収し、抗ＣＤ８３（抗ＣＤ８３－ＰＥ）、抗ＣＤ４０（抗ＣＤ４０－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７）および抗ＣＤ２５（抗ＣＤ２５－ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）モノクローナル抗体で４℃、２０分間染色した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、フローサイトメトリーで示す活性化分子の表面発現レベルを分析した。Ｂ）サイトカイン産生：ＤＣを回収し、１％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中のサポニン０．１％（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で透過処理し、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ＩＬ－８抗体および抗ＩＬ－６抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【0144】
ＤＣに対する本開示のＥＰＳの効果は、図１３Ａに表されるように、ＣＤ８３、ＣＤ４０およびＣＤ２５の発現レベルをＭｅａｎ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）として分析することにより、ＤＣ活性化の両方を評価することによって評価した。ＥＰＳ刺激後のＤＣの分析により、本開示のＥＰＳは、ＣＤ８３、ＣＤ４０およびＣＤ２５の発現レベルが非常に低く、刺激していないＤＣと同程度のままであることによって示されるように、ＤＣの成熟に影響を及ぼさないことが明らかになった。
【0145】
図１３Ｂに図示されているように、２４時間の刺激後のＤＣおよびそのサイトカイン産生、すなわちＩＬ－８およびＩＬ－６に対する本開示のＥＰＳの効果を、サイトカイン産生細胞のパーセンテージとして評価した。未刺激のＤＣと比較して、ＥＳＰで２４時間刺激した後のＤＣによるＩＬ－６およびＩＬ－８の産生は見られなかった。
【0146】
これらの実験系で用いられたヒト細胞種（ＨＮＥｐＣおよびＤＣ）はいずれも、細菌を含む病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の存在を感知するパターン認識受容体（ＰＲＲ）を十分に備えていることは注目に値する。ＤＣは炎症プロセスを開始するために、潜在的なＰＡＭＰを感知する能力が極めて高い。加えて、グラム陰性菌由来であり、陽性対照としてＤＣ実験で使用されるＬＰＳは、１μｇ／ｍｌ、すなわち試験したＥＰＳ濃度より４００倍低い濃度で有効であったことにも留意されたい（図１３）。したがって、本開示のＥＰＳには免疫（細胞性および／または体液性）応答を誘導する能力がないことが実証された。
【0147】
本発明をその特定の実施形態に関連して説明してきたが、特許請求の範囲は、実施例に記載された好ましい実施形態によって限定されるべきではなく、全体としての記載と一致する最も広い解釈が与えられるべきであることは理解されるであろう。
【0148】
本発明のさらなる態様および実施形態は、以下の番号付き項に記載されている：
１． 海洋細菌に由来する少なくとも１つの単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）および適切な担体を含む組成物であって、少なくとも１つの単離されたＥＰＳが４０～４０００ｋＤａの範囲の平均分子量を有し、少なくとも１つの単離されたＥＰＳが海洋細菌の発酵によって得ることができる、組成物。
２． 各々独立して、４０～４０００ｋＤａの範囲の平均分子量を有する少なくとも２つの菌体外多糖を含む、項１に記載の組成物。
３． ＥＰＳの平均分子量が４０～２０００ｋＤａ、任意選択で１００～１４００ｋＤａである、項１または２に記載の組成物。
４． 海洋細菌がグラム陽性好熱性細菌であり、任意選択で、前記グラム陽性好熱性細菌がバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）であり、好ましくは、前記グラム陽性好熱性細菌が、２０２０年１月２７日にＴｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ， Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）に寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７で寄託されたバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４である、項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
５． 項１～４のいずれか一項に記載の組成物であって、
（ｉ）前記組成物が、経口組成物、鼻用組成物、局所組成物、経皮組成物、眼科用組成物、または医療用デバイスを処理するために製剤化された組成物であり、好ましくは、前記組成物が鼻用組成物である；および／または
（ｉｉ）前記担体が生理食塩水溶液である、組成物。
６． 海洋細菌に由来する少なくとも１つの単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む鼻送達システムであって、少なくとも１つの単離されたＥＰＳが、４０～４０００ｋＤａの範囲の平均分子量を有し、少なくとも１つの単離されたＥＰＳが、海洋細菌の発酵によって得ることができる、鼻送達システム。
７． 項６に記載の鼻送達システムであって、ここで：
（ｉ）少なくとも１つの単離されたＥＰＳの平均分子量が、４０～２０００ｋＤａ、任意選択で１００～１４００ｋＤａである；および／または
（ｉｉ）海洋細菌がグラム陽性好熱性細菌であり、任意選択で、前記グラム陽性好熱性細菌がバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）であり、好ましくは、前記グラム陽性好熱性細菌がＮＣＩＭＢに寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７で寄託されているバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４である；
（ｉｉｉ）鼻送達システムが、少なくとも１つの単離されたＥＰＳを点鼻薬、液体スプレー、乾燥スプレー、ゲルまたは軟膏として送達する；
（ｉｖ）少なくとも１つの単離されたＥＰＳが、生理食塩水溶液をさらに含む組成物中で製剤化される；
（ｖ）鼻送達システムが、それを必要とする患者における微生物病原体感染を処置および／または予防するためのものである；および／または
（ｖｉ）鼻送達システムが、それを必要とする患者の鼻腔への微生物病原体による定着を阻害または低減させることにより、微生物病原体の病原性を減弱させるためのものである、
鼻送達システム。
８． 微生物病原体による表面への定着を防止または低減するために非生物学的表面を処理するための、項１～５のいずれか一項に記載の組成物の非治療的使用であって、任意選択で、表面が医療用デバイスの表面である、使用。
９． それを必要とする患者における微生物病原体感染を処置および／または予防するための方法において使用するための、項１～５のいずれか一項に記載の組成物、または項６もしくは７に記載の鼻送達システム。
１０． 微生物病原体の病原性を減弱させるための方法における使用のための、項１～５のいずれか一項に記載の組成物、または項６もしくは７に記載の鼻送達システム。
１１． それを必要とする患者において微生物病原体感染を処置および／または予防する方法であって、項１～５のいずれか一項に記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む方法。
１２． それを必要とする患者における微生物病原体感染の病原性を減弱させるための方法であって、項１～５のいずれか一項に記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む方法。
１３． （ｉ）組成物が、微生物病原体の感染前、感染中、および／または感染後に患者に投与され、それにより、患者の少なくとも１つの生体組織における微生物病原体の定着および／または微生物病原体の内在化が予防、阻害、または低減され、任意選択で、少なくとも１つの生体組織が、口腔、鼻腔、呼吸器、咽喉、耳、眼科領域、泌尿生殖器、皮膚、頭皮、毛髪、爪、およびその組合せから選択され、好ましくは、少なくとも１つの生体組織が鼻腔であり；および／または
（ｉｉ）微生物病原体が細菌病原体であり、患者への組成物の投与が、初期の細菌バイオフィルム形成を低減もしくは阻害すること、および／または初期の細菌バイオフィルムを破壊することによって、細菌病原体感染の病原性を減弱させる；または
（ｉｉｉ）微生物病原体がウイルス病原体であり、患者への組成物の投与が、同等の未処理細胞と比較してウイルス病原体に感染した患者細胞の死亡率を低下させること、感染した患者細胞からのビリオンの放出を防止または減少させること、および／または感染していない隣接する患者細胞の感染を防止または減少させることにより、ウイルス病原体感染の病原性を減弱させる、項９もしくは１０に記載の使用のための組成物、または項１１もしくは１２に記載の方法。
１４． 微生物病原体が、以下：
（ｉ）キューティバクテリウム（Cutibacterium）属、ヘモフィルス（Haemophilus）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、モラクセラ（Moraxella）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、および／またはストレプトコッカス（Streptococcus）属から任意選択で選択される細菌病原体であり、好ましくは、細菌病原体がキューティバクテリウム・アクネス（Cutibacterium acnes）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、モラクセラ・カタラリス（Moraxella catharalis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）またはストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）種、またはその組合せである；
（ｉｉ）インフルエンザＡ、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１／２００９／ｐｄｍ０９、インフルエンザＡ亜型Ｈ１、インフルエンザＡ亜型Ｈ３、インフルエンザＢ（オルソミクソウイルス）、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＨＫＵ１、コロナウイルスＮＬ６３、コロナウイルスＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（コロナウイルス）、パラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３、パラインフルエンザウイルス４、呼吸器合胞体ウイルスＡ／Ｂ、ヒトメタニューモウイルスＡ／Ｂ（パラミクソウイルス）、アデノウイルスもしくはライノウイルス／エンテロウイルス（ピコルナウイルス）、またはその組合せから任意選択で選択されるウイルス病原体；
（ｉｉｉ）真菌病原体；または
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の１つまたは複数の混合物である、
項６もしくは７に記載の鼻送達システム、項８に記載の使用、項９、１０もしくは１３に記載の使用のための組成物、または項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
１５． 組成物の総重量に基づく組成物中の少なくとも１つのＥＰＳの量が、０．００００５～０．５％ｗ／ｗ、好ましくは０．０００１～０．１％ｗ／ｗ、より好ましくは０．０００５～０．０５％ｗ／ｗの範囲である、項１～５のいずれか一項に記載の組成物、項８に記載の使用、項９、１０、１３および１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物、または項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
１６． 鼻腔内への微生物病原体による定着を阻害または低減させることにより、微生物病原体感染の病原性を減弱させるための鼻用組成物を製剤化する方法であって、海洋細菌に由来する少なくとも１つの単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）を、生理食塩水溶液および任意選択で適切な担体と混合し、０．１％～１０％ｗ／ｗ、好ましくは０．５％～５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．７％～３％ｗ／ｗの濃度の塩を含む鼻用組成物を得るステップを含む方法。
１． 海洋細菌に由来する少なくとも１つの単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）および適切な担体を含む組成物であって、少なくとも１つの単離されたＥＰＳが４０～４０００ｋＤａの範囲の平均分子量を有し、少なくとも１つの単離されたＥＰＳが海洋細菌の発酵によって得ることができる、組成物。
２． 各々独立して、４０～４０００ｋＤａの範囲の平均分子量を有する少なくとも２つの菌体外多糖を含む、項１に記載の組成物。
３． ＥＰＳの平均分子量が４０～２０００ｋＤａ、任意選択で１００～１４００ｋＤａである、項１または２に記載の組成物。
４． 海洋細菌がグラム陽性好熱性細菌であり、任意選択で、前記グラム陽性好熱性細菌がバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）であり、好ましくは、前記グラム陽性好熱性細菌が、２０２０年１月２７日にＴｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ， Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）に寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７で寄託されたバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４である、項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
５． 項１～４のいずれか一項に記載の組成物であって、
（ｉ）前記組成物が、経口組成物、鼻用組成物、局所組成物、経皮組成物、眼科用組成物、または医療用デバイスを処理するために製剤化された組成物であり、好ましくは、前記組成物が鼻用組成物である；および／または
（ｉｉ）前記担体が生理食塩水溶液である、組成物。
６． 海洋細菌に由来する少なくとも１つの単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む鼻送達システムであって、少なくとも１つの単離されたＥＰＳが、４０～４０００ｋＤａの範囲の平均分子量を有し、少なくとも１つの単離されたＥＰＳが、海洋細菌の発酵によって得ることができる、鼻送達システム。
７． 項６に記載の鼻送達システムであって、ここで：
（ｉ）少なくとも１つの単離されたＥＰＳの平均分子量が、４０～２０００ｋＤａ、任意選択で１００～１４００ｋＤａである；および／または
（ｉｉ）海洋細菌がグラム陽性好熱性細菌であり、任意選択で、前記グラム陽性好熱性細菌がバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）であり、好ましくは、前記グラム陽性好熱性細菌がＮＣＩＭＢに寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５５７で寄託されているバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＬＰ－Ｔ１４である；
（ｉｉｉ）鼻送達システムが、少なくとも１つの単離されたＥＰＳを点鼻薬、液体スプレー、乾燥スプレー、ゲルまたは軟膏として送達する；
（ｉｖ）少なくとも１つの単離されたＥＰＳが、生理食塩水溶液をさらに含む組成物中で製剤化される；
（ｖ）鼻送達システムが、それを必要とする患者における微生物病原体感染を処置および／または予防するためのものである；および／または
（ｖｉ）鼻送達システムが、それを必要とする患者の鼻腔への微生物病原体による定着を阻害または低減させることにより、微生物病原体の病原性を減弱させるためのものである、
鼻送達システム。
８． 微生物病原体による表面への定着を防止または低減するために非生物学的表面を処理するための、項１～５のいずれか一項に記載の組成物の非治療的使用であって、任意選択で、表面が医療用デバイスの表面である、使用。
９． それを必要とする患者における微生物病原体感染を処置および／または予防するための方法において使用するための、項１～５のいずれか一項に記載の組成物、または項６もしくは７に記載の鼻送達システム。
１０． 微生物病原体の病原性を減弱させるための方法における使用のための、項１～５のいずれか一項に記載の組成物、または項６もしくは７に記載の鼻送達システム。
１１． それを必要とする患者において微生物病原体感染を処置および／または予防する方法であって、項１～５のいずれか一項に記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む方法。
１２． それを必要とする患者における微生物病原体感染の病原性を減弱させるための方法であって、項１～５のいずれか一項に記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む方法。
１３． （ｉ）組成物が、微生物病原体の感染前、感染中、および／または感染後に患者に投与され、それにより、患者の少なくとも１つの生体組織における微生物病原体の定着および／または微生物病原体の内在化が予防、阻害、または低減され、任意選択で、少なくとも１つの生体組織が、口腔、鼻腔、呼吸器、咽喉、耳、眼科領域、泌尿生殖器、皮膚、頭皮、毛髪、爪、およびその組合せから選択され、好ましくは、少なくとも１つの生体組織が鼻腔であり；および／または
（ｉｉ）微生物病原体が細菌病原体であり、患者への組成物の投与が、初期の細菌バイオフィルム形成を低減もしくは阻害すること、および／または初期の細菌バイオフィルムを破壊することによって、細菌病原体感染の病原性を減弱させる；または
（ｉｉｉ）微生物病原体がウイルス病原体であり、患者への組成物の投与が、同等の未処理細胞と比較してウイルス病原体に感染した患者細胞の死亡率を低下させること、感染した患者細胞からのビリオンの放出を防止または減少させること、および／または感染していない隣接する患者細胞の感染を防止または減少させることにより、ウイルス病原体感染の病原性を減弱させる、項９もしくは１０に記載の使用のための組成物、または項１１もしくは１２に記載の方法。
１４． 微生物病原体が、以下：
（ｉ）キューティバクテリウム（Cutibacterium）属、ヘモフィルス（Haemophilus）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、モラクセラ（Moraxella）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、および／またはストレプトコッカス（Streptococcus）属から任意選択で選択される細菌病原体であり、好ましくは、細菌病原体がキューティバクテリウム・アクネス（Cutibacterium acnes）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、モラクセラ・カタラリス（Moraxella catharalis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）またはストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）種、またはその組合せである；
（ｉｉ）インフルエンザＡ、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１／２００９／ｐｄｍ０９、インフルエンザＡ亜型Ｈ１、インフルエンザＡ亜型Ｈ３、インフルエンザＢ（オルソミクソウイルス）、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＨＫＵ１、コロナウイルスＮＬ６３、コロナウイルスＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（コロナウイルス）、パラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３、パラインフルエンザウイルス４、呼吸器合胞体ウイルスＡ／Ｂ、ヒトメタニューモウイルスＡ／Ｂ（パラミクソウイルス）、アデノウイルスもしくはライノウイルス／エンテロウイルス（ピコルナウイルス）、またはその組合せから任意選択で選択されるウイルス病原体；
（ｉｉｉ）真菌病原体；または
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の１つまたは複数の混合物である、
項６もしくは７に記載の鼻送達システム、項８に記載の使用、項９、１０もしくは１３に記載の使用のための組成物、または項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
１５． 組成物の総重量に基づく組成物中の少なくとも１つのＥＰＳの量が、０．００００５～０．５％ｗ／ｗ、好ましくは０．０００１～０．１％ｗ／ｗ、より好ましくは０．０００５～０．０５％ｗ／ｗの範囲である、項１～５のいずれか一項に記載の組成物、項８に記載の使用、項９、１０、１３および１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物、または項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
１６． 鼻腔内への微生物病原体による定着を阻害または低減させることにより、微生物病原体感染の病原性を減弱させるための鼻用組成物を製剤化する方法であって、海洋細菌に由来する少なくとも１つの単離された菌体外多糖（ＥＰＳ）を、生理食塩水溶液および任意選択で適切な担体と混合し、０．１％～１０％ｗ／ｗ、好ましくは０．５％～５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．７％～３％ｗ／ｗの濃度の塩を含む鼻用組成物を得るステップを含む方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【国際調査報告】