(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-19
(54)【発明の名称】複雑な多段階の抗体相互作用を解明するための方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/543 20060101AFI20240312BHJP
G01N 21/41 20060101ALI20240312BHJP
【ＦＩ】
G01N33/543 595
G01N33/543 ZNA
G01N21/41 101
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023549818
(86)(22)【出願日】2022-02-15
(85)【翻訳文提出日】2023-10-02
(86)【国際出願番号】 EP2022053569
(87)【国際公開番号】W WO2022175217
(87)【国際公開日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】21157850.5
(32)【優先日】2021-02-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】クリストペイト トニー
(72)【発明者】
【氏名】シュロットハウアー ティルマン
【テーマコード（参考）】
2G059
【Ｆターム（参考）】
2G059AA05
2G059BB04
2G059BB13
2G059CC17
2G059EE04
2G059FF04
(57)【要約】
本明細書には、抗体－ＦｃＲｎ相互作用を測定するための方法が報告されており、当該方法は、表面プラズモン共鳴計測に適した固体表面上にＦｃＲｎを固定化する工程、工程ａ）で得られた固体表面に異なる濃度の抗体を含む溶液を個別に塗布し、各濃度に対する会合速度定数および解離速度定数を測定する工程、ならびに工程ｂ）で得られた速度を用いて抗体－ＦｃＲｎ相互作用のＫＤ値を測定する工程を含み、固定化されたＦｃＲｎは、単量体のＦｃＲｎであり、単量体のＦｃＲｎは、前記固体表面に直接結合している官能（捕捉）基を用いて固定化され、固体表面は、分岐グルカンを含まず、かつ固定化は、ｐＨ７～ｐＨ８のｐＨ値で行われる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗体－ＦｃＲｎ相互作用を測定するための方法であって、ａ）表面プラズモン共鳴計測に適した固体表面上にＦｃＲｎを固定化する工程、
ｂ）異なる濃度の抗体を含む溶液を、工程ａ）で得られた固体表面に個別に塗布し、各濃度に対する会合速度定数および解離速度定数を測定する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた速度を用いて、前記抗体－ＦｃＲｎ相互作用のＫＤ値を測定する工程
を含み、
固定化されたＦｃＲｎは、単量体のＦｃＲｎであり、
前記単量体のＦｃＲｎは、前記固体表面に直接結合している官能（捕捉）基を用いて固定化され、
前記固体表面は、分岐グルカンを含まず、かつ
前記ＦｃＲｎの前記固定化は、ｐＨ７～ｐＨ８のｐＨ値で行われる、
方法。
【請求項2】
前記固定化が、約ｐＨ７．４のｐＨ値で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＦｃＲｎが、５０～１５０ＲＵの密度で固定化される、請求項１または２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項4】
前記ＦｃＲｎが、一本鎖ＦｃＲｎ（ｓｃＦｃＲｎ）である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記ｓｃＦｃＲｎが、（ＧＧＧＧＳ）４ペプチドリンカーによって互いにコンジュゲートされたベータ－２－ミクログロブリンとヒトＦｃＲｎ融合ポリペプチドとの融合ポリペプチドであり、前記融合ポリペプチドはＣ末端Ａｖｉタグを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ＦｃＲｎが、アミンカップリングまたはビオチン／ストレプトアビジンカップリングを用いて固定化される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記ＦｃＲｎが、約５０～１５０ｐｇ／ｍｍ２チップ表面の密度で固定化される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記固定化が、ｐＨ７．４のｐＨ値で１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中に約２５０μｇ／ｍｌの濃度でＦｃＲｎを含む溶液を用いて行われる、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
工程ｂ）において前記固定化されたＦｃＲｎに塗布される前記抗体の前記溶液が、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、または４００ｍＭ ＮａＣｌ、または４００ｍＭ ＮａＣｌおよび２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコールを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
工程ｂ）において前記固定化されたＦｃＲｎに塗布される前記抗体の前記溶液が、ｐＨ５．８のｐＨ値で１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０もしくは４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｐ－２０、および任意選択で２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコールを含むか、またはｐＨ７．４のｐＨ値で１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭもしくは４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｐ－２０、および任意選択で２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコールを含むかのどちらかである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記分岐グルカンが、デキストランである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
安定性（ｌｏｇ ｋｄ、オフレート）がｘ軸に示され／対応し、かつ認識（ｌｏｇ ｋａ、オンレート）がｙ軸に示される／対応する、２次元／３次元ダイアグラムを使用して、Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用とＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用が分けられ、かつ可視化される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体の特徴付けの分野におけるものである。より詳細には、本明細書には、表面プラズモン共鳴を使用し、コーティング密度および相互作用のタイプを考慮に入れた、抗体－ＦｃＲｎ相互作用の特徴付けのための新しい方法が提供される。この新しい方法により、Ｆｃ領域とＦｃＲｎに対する抗体親和性の決定の改善が提供される。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
ＩｇＧの半減期は、ＦｃＲｎへのｐＨ依存性結合に依存する細胞リサイクリング機構に左右される。ＦｃＲｎに対するコアの相互作用部位がＣＨ２－ＣＨ３エルボー領域に位置することは十分に確立されているが、Ｆａｂアームも受容体結合に寄与することを、興味深い新たなデータが強く示唆している。理論上は、ＩｇＧ分子は、複数のＦｃＲｎ結合部位を有する。実験データはまた、ＩｇＧ抗体の可変ドメイン内のアミノ酸の変化が、細胞輸送、ＦｃＲｎ結合および半減期を大きく調節し得ることを裏付けている。したがって、ＩｇＧ－ＦｃＲｎ相互作用の複雑な多段階の化学量論を完全に理解する必要がある。
ＩｇＧの半減期は、ＦｃＲｎへのｐＨ依存性結合に依存する細胞リサイクリング機構に左右される。ＦｃＲｎに対するコアの相互作用部位がＣＨ２－ＣＨ３エルボー領域に位置することは十分に確立されているが、Ｆａｂアームも受容体結合に寄与することを、興味深い新たなデータが強く示唆している。理論上は、ＩｇＧ分子は、複数のＦｃＲｎ結合部位を有する。実験データはまた、ＩｇＧ抗体の可変ドメイン内のアミノ酸の変化が、細胞輸送、ＦｃＲｎ結合および半減期を大きく調節し得ることを裏付けている。したがって、ＩｇＧ－ＦｃＲｎ相互作用の複雑な多段階の化学量論を完全に理解する必要がある。
【0003】
ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）は、リアルタイムのタンパク質間相互作用を計測する、バイオセンサーをベースとした技術である。ＳＰＲ技術は、バイオ医薬品の研究開発において標準的なツールとなっており（例えば、Ｍ．Ａ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓ．１（２００２）５１５－５２８（非特許文献１）；Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２（１９９９）３９０－４０８（非特許文献２）；Ｒ．Ｌ．Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３（２０００）３８８－４０７（非特許文献３）；Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｒｉｃｈ，Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ３（２０００）３１０－３１７（非特許文献４）；Ｒ．Ｋａｒｌｓｓｏｎ ａｎｄ Ａ．Ｆａｅｌｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２００（１９９７）１２１－１３３（非特許文献５）を参照のこと）、高分子相互作用の速度定数を測定するためによく使用されている。分子の相互作用の会合動態および解離動態を測定する能力は、複合体形成の機構を理解する上での手掛かりとなる（例えば、Ｔ．Ａ．Ｍｏｒｔｏｎ，Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９５（１９９８）２６８－２９４（非特許文献６）を参照のこと）。この情報は、モノクローナル抗体および他のバイオ医薬品の選択および最適化プロセスの不可欠な部分になりつつある（例えば、Ｋ．Ｎａｇａｔａ ａｎｄ Ｈ．Ｈａｎｄａ，ｉｎ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０００（非特許文献７）；Ｒ．Ｌ．Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１（２０００）５４－６１（非特許文献８）；Ａ．Ｃ．Ｍａｌｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｃ．Ａ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８３（１９９５）７－１３（非特許文献９）；Ｗ．Ｈｕｂｅｒ ａｎｄ Ｆ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１２（２００６）３９９９－４０２１（非特許文献１０）を参照のこと）。さらに、ＳＰＲ技術は、例えば標的に結合する抗体の結合活性（結合能）の測定を可能にする。
【0004】
１０年以上前から、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、抗体－抗原または抗体－受容体の相互作用を調べるために、例えば、ヒト胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する抗体のｐＨ依存性結合親和性を測定して、抗体リサイクリング効率に対するその寄与を理解するために、使用されてきた。両方の結合パートナーの複雑さを考慮すると、単一の１：１ラングミュア速度論的適合を適用して評価することができるＳＰＲ相互作用アッセイを定義によって確立することは不可能である。
【0005】
ＦｃＲｎサルベージ経路を利用することによって治療用タンパク質および内因性抗体の血清持続性を調節するために、ＦｃＲｎを増強する／無効にする変異、Ｆｃ融合タンパク質、およびＦｃＲｎ結合の競合阻害を含む種々のストラテジーが用いられている。しかしながら、治療用ＩｇＧは、ｈｕＦｃＲｎ親和性と相関しないとみられる非常に異なる半減期を有し得る（Ｇｉｒａｇｏｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．１４（２０１３）７６４－７９０（非特許文献１１））。
【0006】
ＷＯ２０１３／１８１０８７（特許文献１）では、インビボ安定性、薬物動態および有効性が改善された多量体複合体が報告された。
【0007】
米国特許出願公開第２０１７／００３７１２１号（特許文献２）では、１つ以上のシステイン残基、免疫グロブリンＣＨ２ドメインおよび免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部をＮ末端からＣ末端への方向で各々含む第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むポリペプチドであって、ｉ）その第１および第２のポリペプチドは、変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３ＡおよびＹ４３６Ａを含むか、またはｉｉ）その第１および第２のポリペプチドは、変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４ＤおよびＬ４３２Ｄを含むか、またはｉｉｉ）その第１および第２のポリペプチドは、変異Ｌ２５１Ｓ、Ｌ３１４ＳおよびＬ４３２Ｓを含む、ポリペプチドが報告された。
【0008】
米国特許出願公開第２０２０／０３５３０７８（特許文献３）では、単離されたＩＬ－３３タンパク質、その活性なフラグメントおよびＩＬ－３３タンパク質に対する抗体、その抗原結合フラグメントが報告された。例えば免疫障害および炎症性障害を処置する目的で、サイトカイン活性を調節する方法も提供されている。
【0009】
Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．Ｅ．らは、胎児性Ｆｃ受容体によるｐＨ依存性抗体結合の構造的根拠を報告した（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（１９９８）６３－７３（非特許文献１２））。
【0010】
したがって、抗体－ＦｃＲｎ相互作用を特に技術的により高度な方法で分析して、根底にある複雑さに対処する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】ＷＯ２０１３／１８１０８７
【特許文献2】米国特許出願公開第２０１７／００３７１２１号
【特許文献3】米国特許出願公開第２０２０／０３５３０７８
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Ｍ．Ａ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓ．１（２００２）５１５－５２８
【非特許文献2】Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２（１９９９）３９０－４０８
【非特許文献3】Ｒ．Ｌ．Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３（２０００）３８８－４０７
【非特許文献4】Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｒｉｃｈ，Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ３（２０００）３１０－３１７
【非特許文献5】Ｒ．Ｋａｒｌｓｓｏｎ ａｎｄ Ａ．Ｆａｅｌｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２００（１９９７）１２１－１３３
【非特許文献6】Ｔ．Ａ．Ｍｏｒｔｏｎ，Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９５（１９９８）２６８－２９４
【非特許文献7】Ｋ．Ｎａｇａｔａ ａｎｄ Ｈ．Ｈａｎｄａ，ｉｎ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０００
【非特許文献8】Ｒ．Ｌ．Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１（２０００）５４－６１
【非特許文献9】Ａ．Ｃ．Ｍａｌｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｃ．Ａ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８３（１９９５）７－１３
【非特許文献10】Ｗ．Ｈｕｂｅｒ ａｎｄ Ｆ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１２（２００６）３９９９－４０２１
【非特許文献11】Ｇｉｒａｇｏｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．１４（２０１３）７６４－７９０
【非特許文献12】Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（１９９８）６３－７３
【発明の概要】
【0013】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、組換え胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのＩｇＧの結合を計測するためによく使用されるが、信頼できる結合動態を得るためにデータを解釈することは簡単ではない。本明細書では、適切なＦｃＲｎ結合評価のための新規のＳＰＲベースのＦｃＲｎ結合アッセイが報告される。このアッセイは、ＦｃＲｎ結合動態に対する抗体のＦｃ領域およびＦａｂアームの寄与の詳細な理解を得るために、好適な可視化と組み合わされ得る。
【0014】
すなわち、本明細書では、抗体－ＦｃＲｎ結合評価のための個々のＦａｂ－ＦｃＲｎおよびＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用を説明する新規のＳＰＲベースの抗体－ＦｃＲｎ結合アッセイが報告される。本発明のこの態様は、例えばＳＰＲチップなどの固相に対するｐＨ依存性ＦｃＲｎコーティングの効果に関する知見に少なくとも部分的に基づく。
【0015】
本明細書では、抗体－ＦｃＲｎ相互作用を測定するための方法が報告されており、
－ ＦｃＲｎ固定化表面は、ＳＰＲチップであり、捕捉基が固体表面（層）に直接結合しており、（固体）表面がデキストランマトリックス／基を含まず（デキストランで誘導体化されておらず）、
－ 捕捉試薬は、単離された形態、すなわち、二量体化または多量体化されていない形態で提供され、すなわち、捕捉試薬は、アナライト（標的分子）に対するただ１つの結合部位を有し、したがって、捕捉試薬は単量体であり、
－ 固定化に使用されるランニング緩衝液は、固定化中、すなわち単量体の形態または二量体／多量体として維持される場合、捕捉試薬の凝集状態を制御する。
－ ＦｃＲｎ固定化表面は、ＳＰＲチップであり、捕捉基が固体表面（層）に直接結合しており、（固体）表面がデキストランマトリックス／基を含まず（デキストランで誘導体化されておらず）、
－ 捕捉試薬は、単離された形態、すなわち、二量体化または多量体化されていない形態で提供され、すなわち、捕捉試薬は、アナライト（標的分子）に対するただ１つの結合部位を有し、したがって、捕捉試薬は単量体であり、
－ 固定化に使用されるランニング緩衝液は、固定化中、すなわち単量体の形態または二量体／多量体として維持される場合、捕捉試薬の凝集状態を制御する。
【0016】
本発明の１つの態様は、抗体－ＦｃＲｎ相互作用を測定するための方法であり、
ａ）表面プラズモン共鳴計測に適した固体表面上にＦｃＲｎを固定化する工程、
ｂ）異なる濃度の抗体を含む溶液を、工程ａ）で得られた固体表面に個別に塗布し、各濃度に対する抗体－ＦｃＲｎ相互作用の会合速度定数ならびに解離速度定数を測定する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた速度を用いて、抗体－ＦｃＲｎ相互作用のＫＤ値を測定する工程
を含み、
固定化されたＦｃＲｎは、単量体のＦｃＲｎであり、
単量体のＦｃＲｎは、（前記固体表面上に直接（結合している）官能（捕捉）基を用いて）固定化され、
固体表面は、分岐グルカンを含まず、かつ
ＦｃＲｎの固定化は、ｐＨ７～ｐＨ８のｐＨ値でなされる／行われる。
ａ）表面プラズモン共鳴計測に適した固体表面上にＦｃＲｎを固定化する工程、
ｂ）異なる濃度の抗体を含む溶液を、工程ａ）で得られた固体表面に個別に塗布し、各濃度に対する抗体－ＦｃＲｎ相互作用の会合速度定数ならびに解離速度定数を測定する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた速度を用いて、抗体－ＦｃＲｎ相互作用のＫＤ値を測定する工程
を含み、
固定化されたＦｃＲｎは、単量体のＦｃＲｎであり、
単量体のＦｃＲｎは、（前記固体表面上に直接（結合している）官能（捕捉）基を用いて）固定化され、
固体表面は、分岐グルカンを含まず、かつ
ＦｃＲｎの固定化は、ｐＨ７～ｐＨ８のｐＨ値でなされる／行われる。
【0017】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、ＦｃＲｎの固定化は、約ｐＨ７．４のｐＨ値でなされる／行われる。
【0018】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、ＦｃＲｎは、５０～１５０反応単位（ＲＵ）の密度で固定化される。好ましい１つの実施形態において、ＦｃＲｎは、８０～１２０ＲＵの密度で固定化される。
【0019】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、ＦｃＲｎは、一本鎖ＦｃＲｎ（ｓｃＦｃＲｎ）である。１つの実施形態において、ｓｃＦｃＲｎは、（ＧＧＧＧＳ）４－ペプチドリンカーによって互いにコンジュゲートされたベータ－２－ミクログロブリンとヒトＦｃＲｎポリペプチドとの融合ポリペプチドであり、融合ポリペプチドは、Ｃ末端Ｈｉｓ（１０）－Ａｖｉタグ（配列番号０７）を含む。
【0020】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、ＦｃＲｎは、アミンカップリングを用いて、１ｍｍ２チップ表面あたり約１ｐｇ以上、ある特定の実施形態では約１０ｐｇ以上、ある特定の実施形態では約５０～１５０ｐｇの（ｓｃ）ＦｃＲｎの密度で固定化される。好ましい１つの実施形態において、ＦｃＲｎは、アミンカップリングを用いて約８０～１２０ｐｇ（ｓｃ）ＦｃＲｎ／ｍｍ２チップ表面の密度で固定化される。
【0021】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、ＦｃＲｎは、ビオチン／ストレプトアビジンカップリングを用いて、１ｍｍ２チップ表面あたり約１ｐｇ以上、ある特定の実施形態では約１０ｐｇ以上、ある特定の実施形態では約５０～１５０ｐｇの（ｓｃ）ＦｃＲｎの密度で固定化される。
【0022】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、固定化は、約ｐＨ７．４のｐＨ値で１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中に約２５０μｇ／ｍｌの濃度でＦｃＲｎを含む溶液を用いて行われる。
【0023】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、工程ｂ）において固定化されたＦｃＲｎに塗布される抗体の溶液は、ｉ）１５０ｍＭ ＮａＣｌ、またはｉｉ）４００ｍＭ ＮａＣｌ、またはｉｉｉ）４００ｍＭ ＮａＣｌおよび２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコールを含む。
【0024】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、工程ｂ）は、ｉ）１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む抗体の溶液を用いて、ならびにｉｉ）４００ｍＭ ＮａＣｌを含む抗体の溶液、または／および４００ｍＭ ＮａＣｌと２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコールとを含む抗体の溶液を用いて実施される。１つの実施形態において、４００ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液または／および４００ｍＭ ＮａＣｌと２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコールとを含む溶液は、Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用を低減または排除する。１つの実施形態において、４００ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液または／および４００ｍＭ ＮａＣｌと２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコールとを含む溶液を使用して、分子間相互作用およびＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用を低減または排除する。これにより、単離されたＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用の測定が達成される。
【0025】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、工程ｂ）において固定化されたＦｃＲｎに塗布される抗体の溶液は、ｐＨ５．８のｐＨ値で１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０もしくは４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０（Ｐ－２０）、および任意選択で２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコールを含むか、またはｐＨ７．４のｐＨ値で１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭもしくは４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ－２０、および任意選択で２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコールを含むかのどちらかである。
【0026】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、分岐グルカンは、複合分岐グルカンである。グルカンは、グルコースの縮合によって得られる多糖である。１つの実施形態において、複合分岐グルカンは、デキストランである。１つの実施形態において、複合分岐グルカンは、主にＣ－１～Ｃ－６’’のグリコシド結合を有する微生物起源の分岐ポリ－α－ｄ－グルコシドである。１つの実施形態において、デキストランは、３ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する。
【0027】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、安定性（ｌｏｇ ｋｄ、オフレート）がｘ軸に示され／対応し、かつ認識（ｌｏｇ ｋａ、オンレート）がｙ軸に示される／対応する２次元／３次元ダイアグラムを使用して、Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用とＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用は分けられ、かつ可視化される。
【0028】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、ＦｃＲｎと抗体のＦｃ領域との間の相互作用が分析されるべきである：
－ センサー表面は、カルボキシメチル化表面を有するＳＰＲチップであり、カルボキシル基は、（固体）表面（層）に直接結合しており、ＳＰＲチップは、デキストランマトリックスを含まず、
－ Ｃ末端Ｈｉｓ（１０）－Ａｖｉタグを含む、ベータ－２－ミクログロブリン－ヒトＦｃＲｎ融合ポリペプチド（これらの基は（ＧＧＧＧＳ）４－ペプチドリンカーによって連結されている）が、中性ｐＨ（ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中、約２５０μｇ／ｍｌ）でアミンカップリングを用いてセンサー表面に固定化され、
－ ランニング緩衝液は、１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．８、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ－２０または１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ－２０のどちらかである。
－ センサー表面は、カルボキシメチル化表面を有するＳＰＲチップであり、カルボキシル基は、（固体）表面（層）に直接結合しており、ＳＰＲチップは、デキストランマトリックスを含まず、
－ Ｃ末端Ｈｉｓ（１０）－Ａｖｉタグを含む、ベータ－２－ミクログロブリン－ヒトＦｃＲｎ融合ポリペプチド（これらの基は（ＧＧＧＧＳ）４－ペプチドリンカーによって連結されている）が、中性ｐＨ（ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中、約２５０μｇ／ｍｌ）でアミンカップリングを用いてセンサー表面に固定化され、
－ ランニング緩衝液は、１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．８、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ－２０または１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ－２０のどちらかである。
【0029】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、センサー表面は、カルボキシメチル化表面を有するＳＰＲチップであり、カルボキシル基は、（固体）表面（層）に直接結合しており、そのチップは、デキストランを含まない。この実施形態において、Ｃ末端Ｈｉｓ（１０）－Ａｖｉタグを含む、ベータ－２－ミクログロブリン－ヒトＦｃＲｎ融合ポリペプチド（これらの基は（ＧＧＧＧＳ）４－ペプチドリンカーによって連結されている）が、中性ｐＨ（ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中、約２５０μｇ／ｍｌ）でアミンカップリングを用いて（固体）表面に固定化され、使用されるランニング緩衝液は、１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．８、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ－２０または１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ－２０のどちらかである。
【0030】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、上記方法は、ｐＨ依存性のＦｃＲｎ媒介性抗体リサイクリングまたは／および長いインビボ半減期を有する抗体を選択するためのものであり、選択される抗体は、ｐＨ５．５～６．０で１００～４００ｎＭの範囲のｐＨ依存性の全体的な抗体－ＦｃＲｎ相互作用の強度を有する。その全体的な抗体－ＦｃＲｎ相互作用の強度は、Ｆｃ－ＦｃＲｎおよびＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用を含む。
【0031】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、上記方法は、ｐＨ依存性のＦｃＲｎ媒介性抗体リサイクリングまたは／および長いインビボ半減期を有する抗体を選択するためのものであり、選択される抗体は、ｐＨ５．５～ｐＨ６．５の範囲のｐＨ値で２５ｎＭ以上の片側のＦｃ領域－ＦｃＲｎ結合強度を有する。１つの実施形態において、結合強度は、１００ｎＭ以上、または２００ｎＭ以上、または３００ｎＭ以上である。１つの実施形態において、追加のＦａｂ－ＦｃＲｎ結合親和性が、特にｐＨ７．４において存在しない場合、片側のＦｃ領域－ＦｃＲｎ結合親和性について１００（２００）ｎＭ未満の結合強度が使用される。これは、ｐＨ７．４以上での低いまたは検出不能な結合強度に関係があるはずである。１つの実施形態において、結合強度は、２５ｎＭ以上であり、抗体は、ｐＨ７．４でＦｃＲｎから解離する。これは、改善された薬物動態学的特性を有する抗体バリアントの選択に使用され得る。
【0032】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、上記方法は、改変されたＦｃ領域を有するバリアント抗体を選択するためのものであり、この方法は、親抗体と、Ｆｃ領域のアミノ酸配列が異なる少なくとも２つのバリアント抗体とを用いて工程ｂ）を実行／実施することを含み、工程ｃ）は、相互作用スポットパターンを決定することであり、親抗体の相互作用スポットパターンと類似／一致する相互作用スポットパターンを有するバリアント抗体が選択され、スポットパターンは、安定性（ｌｏｇ ｋｄ、オフレート）がｘ軸に示され／対応し、認識（ｌｏｇ ｋａ、オンレート）がｙ軸に示される／対応する２次元／３次元ダイアグラムである。
【0033】
上述の実施形態と後述の実施形態および態様の１つの実施形態において、上記方法は、Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の種類を決定するためのものであり、すなわち、電荷に基づく相互作用または疎水性に基づく相互作用が存在するかを決定するためのものであり、該方法は、第１に、第１の相互作用スポットパターンを得るために、ｐＨ７．４のｐＨ値で１０ｍＭ ＭＥＳまたはＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ－２０を含む溶液中の抗体を用い、第２に、第２の相互作用スポットパターンを得るために、ｐＨ７．４のｐＨ値で１０ｍＭ ＭＥＳまたはＨＥＰＥＳ，４００ｍＭ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ－２０を含む溶液中の抗体を用い、および第３に、第３の相互作用スポットパターンを得るためにｐＨ７．４のｐＨ値で１０ｍＭ ＭＥＳまたはＨＥＰＥＳ，４００ｍＭ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ－２０および２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコールを含む溶液中の抗体を用いて、工程ｂ）を実行／実施することを含み、第１の相互作用スポットパターンと第２の相互作用スポットパターンとが異なる場合、Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の種類は、電荷ベースであり、第１の相互作用スポットパターンと第２の相互作用スポットパターンとが類似しており、第３の相互作用スポットパターンが異なる場合、Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の種類は、疎水性ベースであり、相互作用スポットパターンは、安定性（ｌｏｇ ｋｄ、オフレート）がｘ軸に示され／対応し、認識（ｌｏｇ ｋａ、オンレート）がｙ軸に示され／対応する２次元／３次元ダイアグラムである。
【0034】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、抗体は、二重特異性抗体である。
【0035】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、二重特異性抗体は、ドメイン交換抗体である。
【0036】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、二重特異性抗体は、１アーム一本鎖抗体である。
【0037】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、二重特異性抗体は、２アーム一本鎖抗体である。
【0038】
上記と下記の実施形態および態様の１つの実施形態において、二重特異性抗体は、一般的な軽鎖二重特異性抗体である。
【0039】
本発明の１つの態様は、抗体を選択するため／抗体選択のための本発明に係る方法である。１つの実施形態において、本発明に係る方法は、ＦｃＲｎ相互作用が異なる少なくとも２つの抗体を用いて実施され、それにより、最も高い／より高い親和性／強度の（単離された）Ｆｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用を有する抗体が選択される。
【0040】
本発明の１つの態様は、抗体操作のための本発明に係る方法である。１つの実施形態において、本発明に係る方法は、Ｆｃ領域および／またはＦａｂのアミノ酸配列が異なる少なくとも２つの抗体を用いて実施され、それにより、Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用とＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用との比が最も大きい／より大きい抗体が選択される。
【0041】
本発明の１つの態様は、Ｆａｂ－ＦｃＲｎおよびＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用を測定するための本発明に係る方法の使用である。
【0042】
本発明の１つの態様は、抗体のインビボ半減期に対する抗体－Ｆｃ領域変異の効果を測定するための本発明に係る方法の使用である。
【0043】
本発明の１つの態様は、インビボ半減期が改変／改善された（より長いまたはより短い）抗体を選択するための本発明に係る方法の使用である。
【0044】
本発明の１つの態様は、抗体のＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用およびＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用を測定するための本発明に係る方法の使用である。
【0045】
本発明の１つの態様は、抗体のＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用およびＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用を描写するための本発明に係る方法の使用である。
【0046】
本発明の１つの態様は、抗体のＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用およびＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用を別々に分析するための本発明に係る方法の使用である。
【0047】
本明細書では、任意の態様と任意の個々の実施形態との組み合わせまたは実施形態の組み合わせも、そのままではなかったとしても開示されていることを明確に指摘する。本明細書中に報告される態様は、本発明を実施する個々の独立した方法に関するものであり、ある実施形態は、本発明の１つ以上の態様を実施する特定の依存的な方法に関するものである。
【発明を実施するための形態】
【0048】
発明の詳細な説明
本明細書では、抗体－ＦｃＲｎ結合の評価における個々のＦａｂ－ＦｃＲｎおよびＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用を説明する新規のＳＰＲベースの抗体－ＦｃＲｎ結合アッセイが報告される。本発明のこの態様は、例えばＳＰＲチップなどの固相上のｐＨ依存性ＦｃＲｎコーティングに少なくとも部分的に基づく。
本明細書では、抗体－ＦｃＲｎ結合の評価における個々のＦａｂ－ＦｃＲｎおよびＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用を説明する新規のＳＰＲベースの抗体－ＦｃＲｎ結合アッセイが報告される。本発明のこの態様は、例えばＳＰＲチップなどの固相上のｐＨ依存性ＦｃＲｎコーティングに少なくとも部分的に基づく。
【0049】
本発明のこの態様に係る方法は、ただ１つの活性なＦｃＲｎ結合部位を用いて抗体の複雑さをＦｃ領域のみにまで低下させ、その後、その分子のさらなるドメインを次々に追加し戻すことによって、確認されている。
【0050】
本発明は、Ｆｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用を測定するためのＳＰＲ設定が多くの変動を含むという知見に少なくとも部分的に基づく。
【0051】
本発明はさらに、ＳＰＲセンサー表面上のＦｃＲｎの意図的な固定化を用いることによって、すなわち、意図的な緩衝液設定と組み合わせてＦｃＲｎ捕捉を用いることによって、すべての抗体－ＦｃＲｎ相互作用、すなわちＦａｂ－ＦｃＲｎおよびＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用に関する情報を得ることができるという知見に少なくとも部分的に基づく。
【0052】
本発明は、多様なＩｇＧ－ＦｃＲｎ相互作用が一斉に解釈／理解されなければならないという知見に少なくとも部分的に基づく。個々の結合工程および結合相互作用を精査した後にのみ、全体的な結合に寄与する個々の分子相互作用を理解することが可能である。この相互作用の精査に基づいてのみ、抗体を首尾よく操作すること、すなわちＦｃ－ＦｃＲｎおよびＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用を別々に操作することによって操作することができる。
【0053】
本発明は、抗体重鎖の対称性に起因して、異なる結合事象の組み合わせが起こり、制御された量、すなわち規定された量のＦｃＲｎをＳＰＲセンサー表面上に固定化することが重要であるという知見に少なくとも部分的に基づく。これは、本発明に係る方法において、固定化工程中にＦｃＲｎの二量体化、例えばヘテロ二量体の形成を制御することによって達成される。ＦｃＲｎは、ｐＨ依存的様式で二量体化することが見出されている。一本鎖ＦｃＲｎを使用することによって、ＳＰＲセンサー表面上のＦｃＲｎの非常に均一な表面を提供することができる。
【0054】
本発明は、ｉ）ＳＰＲチップ、特に一本鎖ＦｃＲｎの使用および中性／生理学的ｐＨ（すなわち、ｐＨ７～ｐＨ８の範囲）での固定化を制御すること、ならびにｉｉ）緩衝液条件を調整することによって、抗体とＦｃＲｎとの間の多段階の結合機構を精査し、薬物動態学的特性に関して、操作された抗体の選択およびスクリーニングに使用することができるという知見に少なくとも部分的に基づく。ある特定の実施形態では、抗体は単純化され、かつ／またはｘ軸上の安定性（ｌｏｇ ｋｄ）およびｙ軸上の認識（ｌｏｇ ｋａ）を用いた適切な可視化が、異なる抗体－ＦｃＲｎ相互作用を分離するために使用され、かつ／または薬物動態特性は、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合である。
【0055】
本発明は、ｐＨ依存性の抗体－ＦｃＲｎ相互作用の強度が、好適なｐＨ依存性のＦｃＲｎ媒介性抗体リサイクリングおよびそれにより長いインビボ半減期を有する抗体を選択するためにｐＨ５．５～６．０で１００～４００ｎＭの範囲内でなければならないという知見に少なくとも部分的に基づく。ある特定の実施形態において、抗体－ＦｃＲｎ相互作用の強度は、全体的な抗体－ＦｃＲｎ相互作用の強度である。その全体的な抗体－ＦｃＲｎ相互作用の強度は、Ｆｃ－ＦｃＲｎおよびＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用を含む。ある特定の実施形態において、抗体－ＦｃＲｎ相互作用の強度は、Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用の強度である。
【0056】
本発明は、ＳＰＲ固体表面上、すなわちチップ上の固定化されたｓｃＦｃＲｎ（一本鎖ＦｃＲｎ）の密度が高いほど、より高い親和性を有する集団、すなわち原点（２次元／３次元ダイアグラムの左下隅）により近いスポットの割合が増加するという知見に少なくとも部分的に基づく。
【0057】
定義
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられている。重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されているＫａｂａｔナンバリングシステムに従ってナンバリングされ得、本明細書では「Ｋａｂａｔに従うナンバリング」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔナンバリングシステム（６４７～６６０頁を参照のこと）が、カッパーおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３頁を参照のこと）が、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３であって、この場合、本明細書中では「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従うナンバリング」に言及することによってさらに明確にしている）に使用される。
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられている。重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されているＫａｂａｔナンバリングシステムに従ってナンバリングされ得、本明細書では「Ｋａｂａｔに従うナンバリング」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔナンバリングシステム（６４７～６６０頁を参照のこと）が、カッパーおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３頁を参照のこと）が、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３であって、この場合、本明細書中では「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従うナンバリング」に言及することによってさらに明確にしている）に使用される。
【0058】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のそのような細胞および当業者に公知であるその等価物などを含む。同様に、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上の」および「少なくとも１つの」も、本明細書中で交換可能に使用され得る。
【0059】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」も交換可能に使用され得ることに留意すべきである。
【0060】
当業者にとっては、例えばペプチドリンカーまたは融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、対応するコード核酸配列に変換する手順および方法は、周知である。ゆえに、核酸は、個々のヌクレオチドからなる核酸配列、および同様に、それによってコードされるペプチドリンカーまたは融合ポリペプチドのアミノ酸配列によって特徴付けられる。
【0061】
組換えＤＮＡ技術を使用することにより、核酸の誘導体の生成が可能になる。このような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失または挿入によって、個々のまたはいくつかのヌクレオチド位置において改変され得る。改変または誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて行われ得る。そのような改変は、当業者によって容易に行われ得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと）。
【0062】
本発明を行うための有用な方法および手法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ｔｏ ＩＩＩ（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８５），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ．），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。
【0063】
用語「約」は、その後に続く数値の＋／－２０％の範囲を表す。１つの実施形態において、約という用語は、その後に続く数値の＋／－１０％の範囲を表す。１つの実施形態において、約という用語は、その後に続く数値の＋／－５％の範囲を表す。
【0064】
「親和性」または「結合親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性の相互作用の合計強度のことを指す。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、概して、解離定数（ＫＤ）によって表され得、この解離定数は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋｏｆｆおよびｋｏｎ）との比である。したがって、速度定数の比が同じままである限り、同等の親和性は、異なる速度定数を含んでもよい。親和性は、本明細書中に記載されるものを含む、当該分野で公知の一般的な方法によって計測され得る。親和性を計測するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【0065】
本明細書中の用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、少なくともＦｃ領域を含む限り、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体）および抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
【0066】
抗体は、一般に、２つのいわゆる軽鎖ポリペプチド（軽鎖）および２つのいわゆる重鎖ポリペプチド（重鎖）を含む。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの各々は、抗原と相互作用できる結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（一般にポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含む。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの各々は、定常領域（一般にカルボキシル末端部分）を含む。重鎖の定常領域は、ｉ）食細胞などのＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を有する細胞への、またはｉｉ）Ｂｒａｍｂｅｌｌ受容体としても知られる胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を有する細胞への抗体の結合を媒介する。重鎖の定常領域は、（Ｃ１ｑ）成分などの古典的補体系の因子を含むいくつかの因子への結合も媒介する。抗体重鎖の定常ドメインは、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むのに対して、軽鎖は、カッパーアイソタイプまたはラムダアイソタイプであり得るただ１つの定常ドメインＣＬを含む。
【0067】
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは、異なるセグメント、すなわち４つのフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。
【0068】
抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプのことを指す。抗体には、以下の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。
【0069】
用語「（ＦｃＲｎへの）結合」は、インビトロアッセイにおける（ヒト）ＦｃＲｎへの、抗体、または少なくとも抗体Ｆｃ領域、または融合ポリペプチドを含む抗体Ｆｃ領域の結合を表す。１つの実施形態において、結合は、結合アッセイにおいて測定され、そのアッセイでは、（ヒト）ＦｃＲｎが、固体表面、例えばセンサーチップに結合し、抗体（または単離されたＦｃ領域もしくは融合ポリペプチドを構成するＦｃ領域）の結合が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって計測される。
【0070】
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体のことを指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、例えば、天然に存在する変異を含むかもしくはモノクローナル抗体調製物の作製中に生じる存在し得るバリアント抗体を除いては、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合し、そのようなバリアントは通常、少量で存在する。モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の特徴を、抗体の実質的に均一な集団から得られると示すものであり、任意の特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない種々の手法によって作製され得、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法および他の例示的な方法は、本明細書中に記載される。
【0071】
本明細書中で使用される用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、配列が超可変性であり（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）、かつ／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ／または抗原に接触する残基（「抗原接触」）を含む、抗体可変ドメインの領域の各々のことを指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲ：ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。本明細書中の例示的なＨＶＲとして、以下のものが挙げられる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）および９６～１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）および９３～１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））；ならびに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）および９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の組み合わせ。
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）および９６～１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）および９３～１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））；ならびに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）および９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の組み合わせ。
【0072】
別段示されない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔらに従って本明細書ではナンバリングされる。
【0073】
本願において使用される用語「～価」は、（抗体）分子内に特定の数の結合部位が存在することを表す。したがって、用語「二価」、「四価」および「六価」は、（抗体）分子内にそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位および６つの結合部位が存在することを表す。本明細書中に報告されるような二重特異性抗体は、１つの好ましい実施形態では、「二価」である。
【0074】
用語「結合親和性」は、単一の結合部位とそのそれぞれの標的との相互作用の強度を表す。実験的には、親和性は、例えば、平衡状態における抗体とＦｃＲｎとの会合（ｋＡ）および解離（ｋｄ）のカイネティック定数／速度を計測することによって、測定され得る。
【0075】
用語「結合アビディティー」は、１つの分子（抗体）の複数の結合部位と同じ標的との相互作用の強度の合算を表す。したがって、アビディティーは、結合の合計ではなく、結合親和性の相乗的な強度の合算である。アビディティーに必要なものは、抗体などの分子、または１つの標的の機能性多量体（ＦｃＲｎ）の多価性である。
【0076】
複合体（一価または二価）のＦｃ会合は、アフィン結合とアビド結合との間で異ならない。しかしながら、アビド結合のための複合体の解離は、関与するすべての結合部位の同時解離に依存する。ゆえに、（アフィン結合と比較して）アビド結合による結合強度の増加は、解離のカイネティクス／複合体の安定性に依存する：複合体の安定性が大きい（高い）ほど、関与するすべての結合部位の同時解離は起こりにくく；非常に安定な複合体の場合、アフィン結合とアビド結合との差は、本質的に０になり；複合体の安定性が小さい（低い）ほど、関与するすべての結合部位の同時解離が起こる可能性が高く；アフィン結合とアビド結合との差が大きくなる。
【0077】
多重特異性抗体
ある特定の実施形態においては、本発明に係る方法において使用される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、１つの抗原上の少なくとも２つの異なる部位または少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、結合特異性の一方は、第１の抗原に対するものであり、他方は、異なる第２の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、多重特異性抗体は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。
ある特定の実施形態においては、本発明に係る方法において使用される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、１つの抗原上の少なくとも２つの異なる部位または少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、結合特異性の一方は、第１の抗原に対するものであり、他方は、異なる第２の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、多重特異性抗体は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。
【0078】
多重特異性抗体を作製するための手法としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０５（１９８３）５３７－５４０、ＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０（１９９１）３６５５－３６５９を参照のこと）、および「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」工学（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作することによっても作製され得る（ＷＯ２００９／０８９００４）。
【0079】
抗体はまた、ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２、ＷＯ２００９／０８０２５３、ＷＯ２００９／０８０２５４、ＷＯ２０１０／１１２１９３、ＷＯ２０１０／１１５５８９、ＷＯ２０１０／１３６１７２、ＷＯ２０１０／１４５７９２またはＷＯ２０１０／１４５７９３に記載されているような多重特異性抗体であり得る。
【0080】
その抗体は、ＷＯ２０１２／１６３５２０に開示されているような多重特異性抗体（「ＤｕｔａＦａｂ」とも呼ばれる）であってもよい。
【0081】
二重特異性抗体は、一般に、同じ抗原上の２つの異なる重複しないエピトープまたは異なる抗原上の２つのエピトープに特異的に結合する抗体分子である。
【0082】
種々の二重特異性抗体フォーマットが知られている。
【0083】
本明細書中に報告されるような方法において使用され得る例示的な二重特異性抗体フォーマットは、以下である。
【0084】
－ ドメイン交換抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマット）：第１のＦａｂフラグメントおよび第２のＦａｂフラグメントを含む多重特異性ＩｇＧ抗体であって、第１のＦａｂフラグメントにおいて、
ａ）ＣＨ１およびＣＬドメインのみが、互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂフラグメントの軽鎖は、ＶＬおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂフラグメントの重鎖は、ＶＨおよびＣＬドメインを含む）か；
ｂ）ＶＨおよびＶＬドメインのみが、互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂフラグメントの軽鎖は、ＶＨおよびＣＬドメインを含み、第１のＦａｂフラグメントの重鎖は、ＶＬおよびＣＨ１ドメインを含む）か；または
ｃ）ＣＨ１およびＣＬドメインが、互いに置き換えられており、ＶＨおよびＶＬドメインが、互いに置き換えられており（すなわち、第１のＦａｂフラグメントの軽鎖は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂフラグメントの重鎖は、ＶＬおよびＣＬドメインを含む）；
第２のＦａｂフラグメントは、ＶＬおよびＣＬドメインを含む軽鎖、ならびにＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖を含み；
そのドメイン交換抗体は、ＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖およびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖を含み得、両方のＣＨ３ドメインが、第１の重鎖と改変された第２の重鎖とのヘテロ二量体化を助けるために、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２／０５８７６８、ＷＯ２０１３／１５７９５４またはＷＯ２０１３／０９６２９１（参照により本明細書中に援用される）に開示されているような、それぞれのアミノ酸置換によって相補的な様式で操作されている、多重特異性ＩｇＧ抗体；
－ １アーム一本鎖抗体（１アーム一本鎖フォーマット）：第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位および第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む抗体であって、個々の鎖が以下の通りである、抗体：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖カッパー定常ドメイン）
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）；
－ ２アーム一本鎖抗体（２アーム一本鎖フォーマット）：第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位および第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む抗体であって、個々の鎖が以下の通りである、抗体：
－ 軽鎖／重鎖１の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 軽鎖／重鎖２の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ 一般的な軽鎖二重特異性抗体（一般的な軽鎖二重特異性抗体フォーマット）：第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位および第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む抗体であって、個々の鎖が以下の通りである、抗体：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン）
－ 重鎖１（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖２（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）。
ａ）ＣＨ１およびＣＬドメインのみが、互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂフラグメントの軽鎖は、ＶＬおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂフラグメントの重鎖は、ＶＨおよびＣＬドメインを含む）か；
ｂ）ＶＨおよびＶＬドメインのみが、互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂフラグメントの軽鎖は、ＶＨおよびＣＬドメインを含み、第１のＦａｂフラグメントの重鎖は、ＶＬおよびＣＨ１ドメインを含む）か；または
ｃ）ＣＨ１およびＣＬドメインが、互いに置き換えられており、ＶＨおよびＶＬドメインが、互いに置き換えられており（すなわち、第１のＦａｂフラグメントの軽鎖は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂフラグメントの重鎖は、ＶＬおよびＣＬドメインを含む）；
第２のＦａｂフラグメントは、ＶＬおよびＣＬドメインを含む軽鎖、ならびにＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖を含み；
そのドメイン交換抗体は、ＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖およびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖を含み得、両方のＣＨ３ドメインが、第１の重鎖と改変された第２の重鎖とのヘテロ二量体化を助けるために、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２／０５８７６８、ＷＯ２０１３／１５７９５４またはＷＯ２０１３／０９６２９１（参照により本明細書中に援用される）に開示されているような、それぞれのアミノ酸置換によって相補的な様式で操作されている、多重特異性ＩｇＧ抗体；
－ １アーム一本鎖抗体（１アーム一本鎖フォーマット）：第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位および第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む抗体であって、個々の鎖が以下の通りである、抗体：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖カッパー定常ドメイン）
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）；
－ ２アーム一本鎖抗体（２アーム一本鎖フォーマット）：第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位および第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む抗体であって、個々の鎖が以下の通りである、抗体：
－ 軽鎖／重鎖１の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 軽鎖／重鎖２の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ 一般的な軽鎖二重特異性抗体（一般的な軽鎖二重特異性抗体フォーマット）：第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位および第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む抗体であって、個々の鎖が以下の通りである、抗体：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン）
－ 重鎖１（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖２（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）。
【0085】
１つの態様において、二重特異性抗体は、ドメイン交換抗体である。
【0086】
１つの実施形態において、二重特異性抗体は、１アーム一本鎖抗体である。
【0087】
１つの実施形態において、二重特異性抗体は、２アーム一本鎖抗体である。
【0088】
１つの実施形態において、二重特異性抗体は、一般的な軽鎖二重特異性抗体である。
【0089】
表面プラズモン共鳴法
ＦｃＲｎに対する抗体のカイネティック結合パラメータは、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、表面プラズモン共鳴によって調べられ得る。
ＦｃＲｎに対する抗体のカイネティック結合パラメータは、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、表面プラズモン共鳴によって調べられ得る。
【0090】
一般に、標的抗原に対する抗体の親和性計測の場合、抗ＩｇＧ抗体、例えば、抗ヒトＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧ抗体が、分析されるそれぞれの抗体の捕捉および提示のために、アミンカップリングを介してＣＭ５チップなどのセンサーチップ上に固定化される。
【0091】
例えば、約２，０００～１２，０００反応単位（ＲＵ）の１０～３０μｇ／ｍｌ抗ＩｇＧ抗体が、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用することによって、１０～３０μｌ／分でｐＨ５．０においてＢＩＡｃｏｒｅ Ｂ４０００またはＴ２００装置内のＣＭ５センサーチップのフローセル（例えば、スポット１および５は活性であり、スポット２および４は参照スポットであるか、またはスポット１および２は反応性であり、スポット３および４は参照スポットであるなど）のいくつかのスポット上にカップリングされる。
【0092】
同族抗原への抗体の結合は、ＨＢＳ緩衝液（ＨＢＳ－Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０，ｐＨ７．４）またはＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ＰＳ２０，ｐＨ７．４）またはＨＢＳ－ＥＴ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０））中、２５℃で（または代替的に１２℃～３７℃の範囲の異なる温度で）測定され得る。
【0093】
したがって、抗体を、それぞれの緩衝液に１０ｎＭ～１μＭの範囲の濃度で３０秒間注入し、各フローセルの反応性スポットに結合させる。
【0094】
その後、対応する抗原を、抗体の親和性に応じて、例えば、１４４ｎＭ、４８ｎＭ、１６ｎＭ、５．３３ｎＭ、１．７８ｎＭ、０．５９ｎＭ、０．２０ｎＭおよび０ｎＭなどの様々な濃度で溶液中に注入し、１０～３０μｌ／分の流速で２０秒～１０分の注入時間で会合を測定する。
【0095】
チップ表面をそれぞれの緩衝液で３～１０分間洗浄することによって、解離を測定する。
【0096】
ＫＤ値は、製造者のソフトウェアおよび指示書を用いて１：１ラングミュア結合モデルを使用して推定される。システム固有のベースラインドリフトの補正およびノイズシグナルの低減のために、サンプル曲線から陰性対照データ（例えば、緩衝液曲線）を差し引く。
【0097】
本発明の特定の実施形態
抗体の構造に起因して、分子レベルでのＦｃＲｎの結合は、非常に複雑である。
抗体の構造に起因して、分子レベルでのＦｃＲｎの結合は、非常に複雑である。
【0098】
したがって、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は同じであるがＦａｂが異なる抗体は、それらのＦｃＲｎ相互作用において異なる挙動を示す（図１を参照のこと；抗体を含む異なるヒト化／キメラヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＳＰＲセンサーグラム（探索的および立証済み）；同じ濃度および同じ単量体濃度で同じＳＰＲ条件下においてセンサーグラムを記録した；唯一の相違点は、抗原結合部位である）。
【0099】
本発明は、ＦｃＲｎ設定が多くの変動を含み、ＳＰＲセンサー表面上のＦｃＲｎの固定化、すなわちＦｃＲｎ捕捉を使用することによって、すべての抗体－ＦｃＲｎ相互作用に関する情報、すなわちＦａｂおよびＦｃ領域の情報を得ることができるという知見に少なくとも部分的に基づく。
【0100】
本発明は、古典的なＫＤの解釈によって、多様なＩｇＧ－ＦｃＲｎ相互作用を一斉に解釈しないことが好ましくないという知見に少なくとも部分的に基づく。個々の結合工程を精査した後にのみ、結合に寄与する分子相互作用を理解することが可能である。この理解があって初めて、Ｆｃ操作の適応Ｆａｂという意味で、必要な操作を適用することができる。
【0101】
本発明は、抗体重鎖の対称性に起因して、異なる結合事象の組み合わせが存在し、ゆえに、制御された量、すなわち規定された量のＦｃＲｎをＳＰＲセンサー表面上に固定化することが重要であるという知見に少なくとも部分的に基づく。これは、ＦｃＲｎの二量体化、例えば、ヘテロ二量体の形成を制御することによって達成される。ＦｃＲｎは、ｐＨ依存的様式で二量体化することが見出されている。一本鎖ＦｃＲｎを使用することによって、ＳＰＲセンサー表面上のＦｃＲｎの非常に均一な表面を提供することができる。
【0102】
安定性（ｌｏｇ ｋｄ、オフレート）がｘ軸に対応し、認識（ｌｏｇ ｋａ、オンレート）がｙ軸に対応する２次元／３次元ダイアグラムを用いて、抗体－ＦｃＲｎ相互作用、すなわちＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用とＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用は分けられ得、かつ可視化され得る（例えば、図５を参照のこと）。そのような２次元／３次元ダイアグラムを生成するために、例えばＲｉｄｇｅｖｉｅｗ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｍａｐ（ＩＭ）ソフトウェアなどの任意の適切なソフトウェアを使用することができる。
【0103】
したがって、理論から、ＦｃＲｎとの／ＦｃＲｎに対する結合部位を厳密に１つ有するＦｃ領域間の相互作用を分析する場合、スポットは１つだけ存在するはずである。
【0104】
図２には、単離されたＦａｂレスＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用、すなわち、単離された抗体Ｆｃ領域と、１つのＦｃ領域ポリペプチドに変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ（本明細書中ではＫａｂａｔに従うナンバリングが使用される）を導入することによって得られる単一のＦｃＲｎ結合部位との理論上の１：１相互作用の３次元ダイアグラム（ｘ軸に安定性（ｌｏｇ ｋｄ）、ｙ軸に認識（ｌｏｇ ｋａ）、ｚ軸に強度を有する）が示されている。基礎となる理論にもかかわらず、２つのスポットが存在するが、１つのＦｃ領域ポリペプチドは、ＦｃＲｎ相互作用に関して不活性であり、すなわちＦｃＲｎに結合することができないことが分かる。より高い親和性を有する集団の一部分、すなわち原点により近いスポット（ダイアグラムの左下隅）は、ＳＰＲ固体表面上、すなわちチップ上の固定化されたｓｃＦｃＲｎ（一本鎖ＦｃＲｎ）の密度が高くなるにつれて増加することが見出された。
【0105】
図３には、ＳＰＲ固体表面上の完全長の単一特異性抗ジゴキシゲニン抗体とＦｃＲｎとの相互作用の２次元ダイアグラムが示されている。この場合、３つのスポットさえ見えることが分かる。
【0106】
事前に上記２つの例に示されたような相互作用の違いは、少なくとも部分的に、相互作用モードに起因し、すなわち、それがそれぞれ抗体とＦｃＲｎとの「複雑」な相互作用であるかまたは「単純」な相互作用であるかに起因する。
【0107】
したがって、これらの相互作用をすべて適切に解明するためには、改善されたＳＰＲ法を使用しなければならない。
【0108】
そのような改善された方法が本発明において提供される。
【0109】
より詳細には、本発明は、抗体－ＦｃＲｎ相互作用を検出するための方法を提供し、
－ 固定化表面は、表面を有するＳＰＲチップであり、捕捉基が、表面層に直接結合しており、そのチップは、デキストランマトリックスを有さず、
－ 捕捉試薬は、単離された形態、すなわち、二量体化または多量体化されていない形態で提供され、すなわち、捕捉試薬は、アナライト（標的分子）に対する単一の結合部位のみを有し、
－ 固定化に使用されるランニング緩衝液は、固定化中の捕捉試薬の凝集状態、すなわち単量体の形態として維持されるか、または二量体／多量体として維持されるかを制御する。
－ 固定化表面は、表面を有するＳＰＲチップであり、捕捉基が、表面層に直接結合しており、そのチップは、デキストランマトリックスを有さず、
－ 捕捉試薬は、単離された形態、すなわち、二量体化または多量体化されていない形態で提供され、すなわち、捕捉試薬は、アナライト（標的分子）に対する単一の結合部位のみを有し、
－ 固定化に使用されるランニング緩衝液は、固定化中の捕捉試薬の凝集状態、すなわち単量体の形態として維持されるか、または二量体／多量体として維持されるかを制御する。
【0110】
この方法では、少量の捕捉試薬、すなわち５０～１５０ＲＵの範囲の捕捉試薬を固体表面に共有結合的にコンジュゲートすることができる。
【0111】
したがって、ＦｃＲｎとＦｃ領域／抗体との間の相互作用が分析されるべきである本発明の１つの態様において、
－ センサー表面は、カルボキシメチル化表面を有するＳＰＲチップであり、カルボキシル基は、表面層に直接結合しており、そのチップは、デキストランマトリックスを有さず、
－ Ｃ末端Ｈｉｓ（１０）－Ａｖｉタグを含む、ベータ－２－ミクログロブリン－ヒトＦｃＲｎ融合ポリペプチド（これらの基は（ＧＧＧＧＳ）４－ペプチドリンカーによって連結されている）は、中性ｐＨ（ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中、約２５０μｇ／ｍｌ）でアミンカップリングを用いてセンサー表面上に固定化され、
－ ランニング緩衝液は、１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．８、０．０５％Ｐ－２０またはＨＢＳ－Ｐ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｐ－２０）のどちらかである。
－ センサー表面は、カルボキシメチル化表面を有するＳＰＲチップであり、カルボキシル基は、表面層に直接結合しており、そのチップは、デキストランマトリックスを有さず、
－ Ｃ末端Ｈｉｓ（１０）－Ａｖｉタグを含む、ベータ－２－ミクログロブリン－ヒトＦｃＲｎ融合ポリペプチド（これらの基は（ＧＧＧＧＳ）４－ペプチドリンカーによって連結されている）は、中性ｐＨ（ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中、約２５０μｇ／ｍｌ）でアミンカップリングを用いてセンサー表面上に固定化され、
－ ランニング緩衝液は、１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．８、０．０５％Ｐ－２０またはＨＢＳ－Ｐ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｐ－２０）のどちらかである。
【0112】
本発明に係る方法では、少量のｓｃＦｃＲｎ、すなわち約８０～１２０ＲＵまたは５０～１００ＲＵを固体表面に共有結合的にコンジュゲートすることができる。固定化は、ｐＨ７．４で行われるので、ｓｃＦｃＲｎが単量体の形態で固定化され、凝集物を形成しないことが確保される。その効果は、図４に示されており、センサーグラムが図５に示されており、単純なＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用、すなわち、１つのＦｃ領域ポリペプチドに変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａを導入し、対応する野生型Ｆｃ領域ポリペプチドをそれぞれの他のＦｃ領域ポリペプチドとしてアミンカップリングによって低ＦｃＲｎ固定化レベルで維持することによって得られる単一のＦｃＲｎ結合部位と、単離されたＦａｂレス抗体Ｆｃ領域との１：１相互作用の対応する２次元ダイアグラム（ｘ軸に安定性（ｌｏｇ ｋｄ）、ｙ軸に認識（ｌｏｇ ｋａ）を有する）が示されている。単一のスポットのみが存在することが分かる。
【0113】
これとは対照的に、ｓｃＦｃＲｎの固定化が、ｐＨ５．５で行われる場合、このｐＨ値で生じるヘテロ二量体化に起因して、二量体ｓｃＦｃＲｎが固定化される。単量体ｓｃＦｃＲｎとの相互作用と比較して、シグナル強度が２倍高いことから、二量体ｓｃＦｃＲｎが２つのＦｃ領域に結合できることが示される。
【0114】
図６には、複雑なＩｇＧ１完全長抗体－ＦｃＲｎ相互作用のセンサーグラムが示されている。図７および図８には、アミンカップリングを使用した低ＦｃＲｎ固定化レベルとビオチン／アビジンカップリングを使用した高ＦｃＲｎ固定化レベルでの複雑なＩｇＧ１完全長抗体－ＦｃＲｎ相互作用の２次元ダイアグラムがそれぞれ示されている。Ｆｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用の他に、追加のスポットおよびそれによる相互作用が存在することが分かる。
【0115】
したがって、Ｆｃ領域にＦａｂを付加することによって（１つのＦｃ領域ポリペプチド中に変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａおよびそれぞれの他のＦｃ領域ポリペプチド中に野生型）、単離されたＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の効果を測定することができる。
【0116】
第１の例では、図９～図１１において、これは、単一のＦｃＲｎ結合部位（１つのＦｃ領域ポリペプチド中に変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａおよびそれぞれの他のＦｃ領域ポリペプチド中に野生型；抗体の略図については、図４２－ａを参照のこと）を有するＦｃ領域に付加された抗ジゴキシゲニンＦａｂを用いて示されている。使用される緩衝液条件に応じて、相互作用を強めるまたは弱めることができる（低密度ＦｃＲｎ、約８０ＲＵ）：
－ １５０ｍＭ塩化ナトリウム（図９）：分子内相互作用（１２５０ｎＭ；略図については、図１６のスポット１を参照のこと）および分子間相互作用（２０．５ｎＭ；略図については、図１６のスポット２を参照のこと）；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウム（図１０）：分子内相互作用（１０６０ｎＭ；１５０ｍＭ塩化ナトリウムと比較して強まっている）および分子間相互作用（６０ｎＭ）；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウムおよび２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコール（ＭＷ＝６２．０７ｇ／ｍｏｌ）（図１１）：分子内相互作用のみ（３２３０ｍＭ；他の条件と比較して弱まっている）、および分子間相互作用なし。
－ １５０ｍＭ塩化ナトリウム（図９）：分子内相互作用（１２５０ｎＭ；略図については、図１６のスポット１を参照のこと）および分子間相互作用（２０．５ｎＭ；略図については、図１６のスポット２を参照のこと）；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウム（図１０）：分子内相互作用（１０６０ｎＭ；１５０ｍＭ塩化ナトリウムと比較して強まっている）および分子間相互作用（６０ｎＭ）；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウムおよび２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコール（ＭＷ＝６２．０７ｇ／ｍｏｌ）（図１１）：分子内相互作用のみ（３２３０ｍＭ；他の条件と比較して弱まっている）、および分子間相互作用なし。
【0117】
したがって、高い緩衝液イオン強度と組み合わせて本発明に係る方法を適用することによって、Ｆａｂ－ＦｃＲｎを減少させることまたは排除することさえできる。この理論に拘束されるものではないが、すべての分子間相互作用とＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用が排除され、これらの条件下で測定される相互作用は、Ｆｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用であると仮定される。
【0118】
第２の例では、１つのＦｃ領域ポリペプチドに変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ（Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用を排除する）、およびそれぞれの他のＦｃ領域ポリペプチドに変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用の強度を増加させる）を有する非対称抗体についても、相互作用の強度の同じ変化が示されている（抗体の略図については図４２－ｂを参照のこと）：
－ １５０ｍＭ塩化ナトリウム：分子内相互作用（１８４ｎＭ；略図については、図１６のスポット１を参照のこと）および分子間相互作用（４．７ｎＭ；略図については、図１６のスポット２を参照のこと）；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウム：分子内相互作用（１６６ｎＭ；１５０ｍＭ塩化ナトリウムと比較して強まっている）および分子間相互作用（６．２ｎＭ）。
－ １５０ｍＭ塩化ナトリウム：分子内相互作用（１８４ｎＭ；略図については、図１６のスポット１を参照のこと）および分子間相互作用（４．７ｎＭ；略図については、図１６のスポット２を参照のこと）；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウム：分子内相互作用（１６６ｎＭ；１５０ｍＭ塩化ナトリウムと比較して強まっている）および分子間相互作用（６．２ｎＭ）。
【0119】
１つのＦｃ領域ポリペプチドに変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ、およびそれぞれの他のＦｃ領域ポリペプチドに変異Ｔ３０７Ｈ／Ｎ４３４Ｈを有する非対称抗体についても、相互作用の強度の同じ変化が測定されている（抗体の略図については図４２－ｃを参照のこと）：
－ １５０ｍＭ塩化ナトリウム：分子内相互作用（３９１ｎＭ；略図については、図１６のスポット１を参照のこと）および分子間相互作用（１０．４ｎＭ；略図については、図１６のスポット２を参照のこと）；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウム：分子内相互作用（３２５ｎＭ；１５０ｍＭ塩化ナトリウムと比較して強まっている）および分子間相互作用（４．３ｎＭおよび３９ｎＭ）。
－ １５０ｍＭ塩化ナトリウム：分子内相互作用（３９１ｎＭ；略図については、図１６のスポット１を参照のこと）および分子間相互作用（１０．４ｎＭ；略図については、図１６のスポット２を参照のこと）；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウム：分子内相互作用（３２５ｎＭ；１５０ｍＭ塩化ナトリウムと比較して強まっている）および分子間相互作用（４．３ｎＭおよび３９ｎＭ）。
【0120】
したがって、使用される緩衝液中の塩濃度の上昇は、Ｆｃ領域非対称抗体における分子内相互作用を強める。ゆえに、１つの実施形態において、その測定が、非対称抗体、すなわち、完全長、Ｙ形、二価の二重特異性抗体の分子内相互作用の測定であるとき、緩衝液は、約４００ｍＭの塩、好ましくは塩化ナトリウムを含む。
【0121】
野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に接続された同じ抗ジゴキシゲニンＦａｂを使用すると、異なる効果が見られる（低密度ＦｃＲｎ，約８０ＲＵ；図１２～図１４）：
－ １５０ｍＭ塩化ナトリウム（図１２）：３８２ｎＭにおいて分子内結合１＋２（略図については図１５を参照のこと）、０．１６ｎＭにおいて分子内結合１＋２＋１＋２（略図については図１５を参照のこと）；５．７ｎＭにおいて分子間結合１＋２’（略図については図１５を参照のこと）、１２６ｎＭにおいて分子間結合１＋１’（略図については図１５を参照のこと）；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウム（図１３）：８４０ｎＭにおいて分子内結合１＋２（略図については図１５を参照のこと）、０．３３ｎＭにおいて分子内結合１＋２＋１＋２（略図については図１５を参照のこと）；４．８ｎＭにおいて分子間結合１＋２’（略図については図１５を参照のこと）、１００ｎＭにおいて分子間結合１＋１’（略図については図１５を参照のこと）；１５０ｍＭ塩化ナトリウムと比較して、分子内相互作用は弱まり、分子間相互作用は強まっている；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウムおよび２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコール（ＭＷ＝６２．０７ｇ／ｍｏｌ）（図１４）：１１４０ｎＭにおいて分子内結合１＋２（略図については図１５を参照のこと）および７５ｎＭにおいて分子間結合１＋１’（略図については図１５を参照のこと）；１５０ｍＭ塩化ナトリウムと比較して、分子内相互作用は弱まり、分子間相互作用が強まっている（すなわち、他のスポットと比較してより優勢である）。
－ １５０ｍＭ塩化ナトリウム（図１２）：３８２ｎＭにおいて分子内結合１＋２（略図については図１５を参照のこと）、０．１６ｎＭにおいて分子内結合１＋２＋１＋２（略図については図１５を参照のこと）；５．７ｎＭにおいて分子間結合１＋２’（略図については図１５を参照のこと）、１２６ｎＭにおいて分子間結合１＋１’（略図については図１５を参照のこと）；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウム（図１３）：８４０ｎＭにおいて分子内結合１＋２（略図については図１５を参照のこと）、０．３３ｎＭにおいて分子内結合１＋２＋１＋２（略図については図１５を参照のこと）；４．８ｎＭにおいて分子間結合１＋２’（略図については図１５を参照のこと）、１００ｎＭにおいて分子間結合１＋１’（略図については図１５を参照のこと）；１５０ｍＭ塩化ナトリウムと比較して、分子内相互作用は弱まり、分子間相互作用は強まっている；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウムおよび２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコール（ＭＷ＝６２．０７ｇ／ｍｏｌ）（図１４）：１１４０ｎＭにおいて分子内結合１＋２（略図については図１５を参照のこと）および７５ｎＭにおいて分子間結合１＋１’（略図については図１５を参照のこと）；１５０ｍＭ塩化ナトリウムと比較して、分子内相互作用は弱まり、分子間相互作用が強まっている（すなわち、他のスポットと比較してより優勢である）。
【0122】
両方のＦｃ領域ポリペプチドに変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域に接続された同じ抗ジゴキシゲニンＦａｂを使用すると、同じ効果が見られる（低密度ＦｃＲｎ，約８０ＲＵ）（抗体の略図については図４２－ｄを参照のこと）：
－ １５０ｍＭ塩化ナトリウム：９２ｎＭにおいて分子内結合１＋２（略図については図１５を参照のこと）、分子内結合１＋２＋１＋２（略図については図１５を参照のこと）；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウム：９２ｎＭにおいて分子内結合１＋２（略図については図１５を参照のこと）、１．６ｎＭにおいて分子内結合１＋２＋１＋２（略図については図１５を参照のこと）。
－ １５０ｍＭ塩化ナトリウム：９２ｎＭにおいて分子内結合１＋２（略図については図１５を参照のこと）、分子内結合１＋２＋１＋２（略図については図１５を参照のこと）；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウム：９２ｎＭにおいて分子内結合１＋２（略図については図１５を参照のこと）、１．６ｎＭにおいて分子内結合１＋２＋１＋２（略図については図１５を参照のこと）。
【0123】
高いＦｃ結合強度において見られるように、Ｆｃ領域が、非常に強いＦｃＲｎ結合のために操作されている場合、Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用によって駆動されるスポットとＦａｂ－Ｆｃ媒介性のアビディティースポットとの間のバランスは、Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用のみにシフトする。
【0124】
両方のＦｃ領域ポリペプチドに変異Ｔ３０７Ｈ／Ｎ４３４Ｈを有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域に接続された同じ抗ジゴキシゲニンＦａｂを使用すると、同じ効果が見られる（低密度ＦｃＲｎ，約８０ＲＵ）（抗体の略図については図４２－ｅを参照のこと）：
－ １５０ｍＭ塩化ナトリウム：１７７ｎＭにおいて分子内結合１＋２（略図については図１５を参照のこと）、０．１２ｎＭにおいて分子内結合１＋２＋１＋２（略図については図１５を参照のこと）；３ｎＭにおいて分子間結合１＋２’（略図については図１５を参照のこと）、７１ｎＭにおいて分子間結合１＋１’（略図については図１５を参照のこと）；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウム：１５６ｎＭにおいて分子内結合１＋２（略図については図１５を参照のこと）、０．１３ｎＭにおいて分子内結合１＋２＋１＋２（略図については図１５を参照のこと）；２５ｎＭにおいて分子間結合１＋１’（略図については図１５を参照のこと）。
－ １５０ｍＭ塩化ナトリウム：１７７ｎＭにおいて分子内結合１＋２（略図については図１５を参照のこと）、０．１２ｎＭにおいて分子内結合１＋２＋１＋２（略図については図１５を参照のこと）；３ｎＭにおいて分子間結合１＋２’（略図については図１５を参照のこと）、７１ｎＭにおいて分子間結合１＋１’（略図については図１５を参照のこと）；
－ ４００ｍＭ塩化ナトリウム：１５６ｎＭにおいて分子内結合１＋２（略図については図１５を参照のこと）、０．１３ｎＭにおいて分子内結合１＋２＋１＋２（略図については図１５を参照のこと）；２５ｎＭにおいて分子間結合１＋１’（略図については図１５を参照のこと）。
【0125】
ｐＨ依存性ＦｃＲｎ相互作用の増強のために抗体を操作することによる抗体－ＦｃＲｎ相互作用の劇的な増加は、必ずしも同様に改善された薬物動態特性をもたらすわけではないことが見出された。
【0126】
さらに、例えば、ＹＴＥ変異を導入するとき、抗体は、改変された熱安定性を有し得るので、抗体の薬物動態学的操作の場合のシフトパターンよりも、親抗体と一致する相互作用スポットパターンを有することが好ましいことが見出された（図３６を参照のこと）。
【0127】
複雑な多段階の抗体－ＦｃＲｎ結合機構は、以下を含む多変量の機構である：
－ ｐＨ依存性親和性：ＦｃＲｎ結合を単純な１：１相互作用で説明することはできない。
－ ｐＨ依存性アビディティー：両方のＦｃ領域重鎖が、Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用に関与している；
－ Ｆａｂの寄与：追加かつ同時のＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用に起因して、いくつかの相互作用が合わさって不均一な結合パターンになる。
－ ｐＨ依存性親和性：ＦｃＲｎ結合を単純な１：１相互作用で説明することはできない。
－ ｐＨ依存性アビディティー：両方のＦｃ領域重鎖が、Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用に関与している；
－ Ｆａｂの寄与：追加かつ同時のＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用に起因して、いくつかの相互作用が合わさって不均一な結合パターンになる。
【0128】
【0129】
本発明は、ｉ）ＳＰＲチップ、特に一本鎖ＦｃＲｎの使用および中性／生理学的ｐＨ（すなわち、ｐＨ７～ｐＨ８の範囲）での固定化を制御すること、ならびにｉｉ）緩衝液条件を調整することによって、抗体とＦｃＲｎとの間の多段階結合機構を薬物動態学的特性に関して、操作された抗体の選択およびスクリーニングに使用することができるという知見に少なくとも部分的に基づく。ある特定の実施形態では、抗体は単純化され、かつ／またはｘ軸上の安定性（ｌｏｇ ｋｄ）およびｙ軸上の認識（ｌｏｇ ｋａ）を用いた適切な可視化が、異なる抗体－ＦｃＲｎ相互作用を分離するために使用され、かつ／または薬物動態特性は、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合である。
【0130】
したがって、本発明に係る方法を用いて実行される計測は、単量体の固定化ＦｃＲｎを用いて行われる。これにより、以下を解明することが可能である：
－ 結合／相互作用の結合価の影響
－ Ｆａｂ電荷の影響
－ チップ表面上のＦｃＲｎ密度の影響
－ 緩衝液組成の影響。
－ 結合／相互作用の結合価の影響
－ Ｆａｂ電荷の影響
－ チップ表面上のＦｃＲｎ密度の影響
－ 緩衝液組成の影響。
【0131】
まず、ＳＰＲチップの表面に（ｓｃ）ＦｃＲｎを固定化するためにアミンカップリングまたはビオチン／アビジンカップリングを使用することによって、コーティング密度が低レベルに制御され（図１９～図２６を参照のこと）、すなわち、チップ表面上のＦｃＲｎ密度が、他の方法と比べて低下される。これにより、当該方法の感度が向上し、種々の相互作用を、個別化された形態で可視化することができる。安定性（ｌｏｇ ｋｄ）をｘ軸に、認識（ｌｏｇ ｋａ）をｙ軸に有する２次元または３次元ダイアグラムを使用することによって、すなわち、適切な可視化によって、抗体－ＦｃＲｎ相互作用全体に対する、一方ではＦｃ操作の影響、他方ではＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の影響を可視化することができる。特に、Ｆｃ－ＦｃＲｎ結合強度とＦａｂ－ＦｃＲｎ結合強度との相互関係を分離することができる（図１７および図１８を参照のこと）。
【0132】
そのような２次元または３次元ダイアグラムを生成するために、例えば、Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｍａｐ（ＩＭ）ソフトウェアなどの任意の好適なソフトウェアを使用することができる。
【0133】
図２１および図２２には、約１７００ＲＵのコーティング密度でビオチン／アビジンカップリングを用いて得られた分割が示されている。図２３および図２４には、約８０ＲＵのコーティング密度でビオチン／アビジンカップリングを用いて得られた分割が示されている。図２５および図２６には、約８０ＲＵのコーティング密度でビオチン／アビジンカップリングを用いて得られた分割が示されている。
【0134】
好ましい１つの実施形態において、本発明に係る方法においてアミンカップリングを用いたコーティング密度は、約８０～１１５ｐｇ（ｓｃ）ＦｃＲｎ／ｍｍ２チップ表面（８０～１１５ＲＵに対応する）である。
【0135】
好ましい１つの実施形態において、本発明に係る方法においてビオチン／アビジンカップリングを用いたコーティング密度は、約１７００ｐｇ（ｓｃ）ＦｃＲｎ／ｍｍ２チップ表面（１７００ＲＵに対応する）である。
【0136】
第２に、ＳＰＲチップコーティングをｐＨ依存的様式で行うことによって、制御されたｓｃＦｃＲｎ単量体の固定化が達成される。したがって、固定化は、ｓｃＦｃＲｎが単量体の形態で固定化され、固定化プロセス中に二量体または多量体を形成しないことを確保するためにｐＨ７．４で行われる。それにより、少量のｓｃＦｃＲｎ、すなわち約８０～１２０ＲＵを固体表面に共有結合的にコンジュゲートすることができる。これとは対照的に、ｓｃＦｃＲｎの固定化が、ｐＨ５．５で行われる場合、このｐＨ値で生じるヘテロ二量体化に起因して、二量体ｓｃＦｃＲｎが固定化される。
【0137】
１つの具体的な実施形態において、センサー表面は、カルボキシメチル化表面を有するＳＰＲチップであり、カルボキシル基は、表面層に直接結合しており、そのチップは、デキストランマトリックスを含まない。この実施形態では、Ｃ末端Ｈｉｓ（１０）－Ａｖｉタグを含む、ベータ－２－ミクログロブリン－ヒトＦｃＲｎ融合ポリペプチド（これらの基は（ＧＧＧＧＳ）４－ペプチドリンカーによって連結されている）を、中性ｐＨ（ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中、約２５０μｇ／ｍｌ）でアミンカップリングを用いて固体表面に固定化する。これにより、約８０ＲＵのＦｃＲｎが、固体表面に共有結合的にコンジュゲートされる。使用されるランニング緩衝液は、１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．８、０．０５％Ｐ－２０またはＨＢＳ－Ｐ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｐ－２０）のどちらかである。
【0138】
本発明に係る方法を用いて、Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用とＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用の効果を分析することができる。図２７には、同じ親抗ＣＤ４４抗体の５つのＦａｂ電荷バリアントの２次元ダイアグラムが示されている。改変の種類に応じて、Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用が変化することが分かる。図２８には、同じ親抗ＣＤ４４抗体の４つのＦｃ領域バリアントの２次元ダイアグラム（左上の図）が示されている。改変の種類に応じて、Ｆｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用が変化することが分かる。
【0139】
したがって、本発明で描写される効果は、解離定数（安定性；ｌｏｇ ｋｄ）がｘ軸上に示され、会合定数（認識；（ｌｏｇ ｋａ）がｙ軸に示されている、２次元または３次元ダイアグラムを用いて示され得る。このような２次元または３次元ダイアグラムを使用することにより、抗体－ＦｃＲｎ相互作用全体に対する、一方ではＦｃ操作の影響、他方ではＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の影響を可視化することができる。特に、Ｆｃ－ＦｃＲｎ結合強度とＦａｂ－ＦｃＲｎ結合強度との相互関係を分離することができる（図１７および図１８を参照のこと）。
【0140】
そのような２次元または３次元ダイアグラムを生成するために、例えば、Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｍａｐ（ＩＭ）ソフトウェアなどの任意の好適なソフトウェアを使用することができる。
【0141】
【0142】
本発明は、ｐＨ依存性の全体的な抗体－ＦｃＲｎ相互作用の強度が、好適なｐＨ依存性のＦｃＲｎ媒介性抗体リサイクリングを有することによって長いインビボ半減期を有する抗体を選択するために、ｐＨ５．５～６．０で１００～４００ｎＭの範囲でなければならないという知見に少なくとも部分的に基づく。その全体的な抗体－ＦｃＲｎ相互作用の強度は、Ｆｃ－ＦｃＲｎおよびＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用を含む。
【0143】
ｐＨ５．５～ｐＨ６．５の範囲の高い片側のＦｃ結合強度（例えば、２００ｎＭ以上）は、ｐＨ７．４以上での低いまたは検出不能な結合強度に関係があるはずである。これは、改善された薬物動態学的特性を有する抗体バリアントの選択に使用され得る。
【0144】
Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用から生じる全相互作用の割合は、２次元もしくは３次元ダイアグラムに見られる追加のスポットから、および／またはＦｃ領域の相互作用を別々に分析することによって、導き出され得る（例えば、Ｆａｂフラグメントを切断した後）。追加のスポットの数／影響を受けたスポットの数が多いほど、Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用が多く存在する。
【0145】
前記Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用は、例えば、Ｆａｂ内の残基を変異させることによって減少され得るか、またはｐＨ依存性のＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用は、例えば、Ｆｃ操作によって増加され得る。最善においては、両方の操作技術が組み合わされる。
【0146】
例えば、図３１および図３２における抗体ｍＡｂ－１、ｍＡｂ－２およびｍＡｂ－３は、変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａを導入することによって１つのＦｃ領域ポリペプチドにおけるＦｃＲｎ結合がサイレントであり、変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６ＥおよびＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｙをそれぞれ導入することによって、それぞれの他のＦｃ領域ポリペプチドにおいて増大したＦｃＲｎ親和性を有する。Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用が減少し、Ｆｃ領域－ＦｃＲｎ親和性が増加していることが分かる。これにより、抗体－ＦｃＲｎ相互作用が、Ｆｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用のみに依存するようになり、Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の寄与／それによる歪みがほとんど排除される。
【0147】
Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用を改善する／増加させるための上限は、ｐＨ依存性結合の完全な排除である。そのような排除は、例えば、ヒトＩｇＧ１ ｗｔ－Ｆｃ領域（例えば、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８７（２０１１）１０１５－１０２２）に変異ＭＳＴ－ＨＮを導入すること（Ｍｅｔ２５２からＴｙｒへ、Ｓｅｒ２５４からＴｈｒへ、Ｔｈｒ２５６からＧｌｕへ、Ｈｉｓ４３３からＬｙｓへ、Ａｓｎ４３４からＰｈｅへ）によって達成される。
【0148】
ＦａｂとＦｃＲｎとの間にどのような種類の相互作用が存在するか、すなわち電荷または疎水性に基づくかは、ＳＰＲ分析において異なる緩衝液組成を使用して明らかにすることができる。例えば、ＳＰＲ緩衝液にエチレングリコールを加えることにより、Ｆｃ－ＦｃＲｎ／Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用比が上昇する場合、疎水性Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の存在が見られる。同様に、イオン性／電荷駆動性のＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の存在は、ＳＰＲ緩衝液に塩を加えることにより、Ｆｃ－ＦｃＲｎ／Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用比が上昇する場合に見られる（図９～図１４および図２９～図３２を参照のこと）。
【0149】
これは、図３３に要約されている。
【0150】
本発明に係る方法では、異なる抗体－ＦｃＲｎ相互作用を別々に分析することができる（図３４を参照のこと）。
【0151】
異なる相互作用の分離に基づいて、本発明に係る方法は、抗体の開発および選択／スクリーニングにおける複数の用途に使用され得る。
【0152】
１つの態様は、抗体スクリーニングのための本発明に係る方法である。抗体スクリーニングでは、Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用の親和性／強度が選択基準である。分子内アビディティーは、塩の増加／添加によって測定され／弱められ得る。分子間アビディティーは、溶液密度によって弱められ得る。これは、図３５に模式的に示されている。
【0153】
１つの態様は、抗体操作のための本発明に係る方法である。抗体操作では、Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用とＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用との比の上昇が、標的の基準である。例えば、異なるＦｃ領域操作、すなわちＦｃＲｎ結合に影響する異なる変異の導入は、異なるパターンをもたらす（図３６を参照のこと）。
【0154】
抗体－ＦｃＲｎ相互作用に対するＦｃ領域操作の効果を示すために、抗体ブリアキヌマブ（Ｏｚｅｓｐａ（商標））およびウステキヌマブ（Ｓｔｅｌａｒａ（商標））をモデル系として使用した。ブリアキヌマブとウステキヌマブの両方が、完全ヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体である。それらは、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）およびインターロイキン２３（ＩＬ－２３）の同じヒトｐ４０サブユニットに結合し、対応するマウスＩＬ－１２およびＩＬ－２３に対して交差反応性ではない。ブリアキヌマブおよびウステキヌマブは、それぞれＶＨ５およびＶκ１Ｄ生殖細胞系列ファミリーの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを有するＩｇＧ１κ抗体、ならびにＶＨ３およびＶλ１生殖細胞系列ファミリーの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを有するＩｇＧ１λ抗体である。異なる可変ドメインに加えて、ブリアキヌマブおよびウステキヌマブは、定常ドメインにおいていくつかのアロタイプ特異的アミノ酸の違いを示す（図４０および図４１におけるアラインメントを参照のこと；ブリアキヌマブおよびウステキヌマブの軽鎖および重鎖の配列アラインメント－ＶＨおよびＶＬ領域がイタリックで示されている；ＣＤＲにアスタリスク（＊）が付されている）。
【0155】
しかしながら、それらのアミノ酸の相違は、（同族の）ＦｃＲｎ結合領域の外側にあるので、ＦｃＲｎ依存性薬物動態において役割を果たさないと考えられ得る（例えば、Ｒｏｐｅｅｎｉａｎ，Ｄ．Ｃ．ａｎｄ Ａｋｉｌｅｓｈ，Ｓ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（２００７）７１５－７２５を参照のこと）。興味深いことに、ウステキヌマブは、２２日という終末相半減期の（報告された）中央値（Ｚｈｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９（２００９）１６２－１７５）を有するのに対して、ブリアキヌマブは、わずか８～９日という終末相半減期を有する（Ｇａｎｄｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃｕｔａｎ．Ｍｅｄ．Ｓｕｒｇ．２９（２０１０）４８－５２；Ｌｉｍａ，Ｘ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．９（２００９）１１０７－１１１３；Ｗｅｇｅｒ，Ｗ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１６０（２０１０）８１０－８２０を参照のこと）。
【0156】
抗体ブリアキヌマブのアミノ酸配列は、ＷＯ２０１３／０８７９１１（配列番号０１および配列番号０２）に報告されており、抗体ウステキヌマブのアミノ酸配列は、ＷＯ２０１３／０８７９１１（配列番号０３および配列番号０４）に報告されており、抗体ベバシズマブのアミノ酸配列は、Ｄｒｕｇ ＢａｎｋエントリーＤＢ００１１２に報告されている。
【0157】
インビボ半減期を延長する、ＹＴＥ変異を有するウステキヌマブとＦｃＲｎとの相互作用のｐＨ依存性２次元ダイアグラムが図３７に示されている。この相互作用は、低ｐＨ値で強く、生理学的ｐＨ値では弱いことが分かる。これは、効率的なｐＨ依存性ＦｃＲｎ媒介性リサイクリング、したがって長いインビボ半減期をもたらす。
【0158】
インビボ半減期を延長する、ＹＴＥ変異を有するブリアキヌマブおよびブリアキヌマブの相互作用のｐＨ依存性２次元ダイアグラムが、それぞれ図３８および図３９に示されている。この相互作用は、低ｐＨ値と生理学的ｐＨ値で強いことが分かる。これは、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ媒介性リサイクリングを損ない、したがって短いインビボ半減期をもたらす。ブリアキヌマブの場合のＦｃ領域の操作は、Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用を増加させることも分かる。
【0159】
さらに、２次元または３次元ダイアグラムにおけるスポットのシフトは、ｗｔ－Ｆｃ領域の操作から生じるＦｃ領域の歪みの指標である。
【0160】
したがって、抗体－ＦｃＲｎ相互作用の２次元または３次元の可視化を用いることによって、インビボ効果を、例えば、ＦｃＲｎカラムクロマトグラフィーと比較して、分析することができる。
【0161】
要旨
抗体半減期は、ＦｃＲｎによって左右される。基礎となるリサイクリング機構は、ＦｃＲｎに対する抗体のｐＨ依存性結合に基づく。抗体ＦｃＲｎ相互作用が二又の結合機構であることは以前に記載されている（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍ．１６（２０１７）４５１－４５６）。この機構は、水素－重水素交換（ＨＤＸ）によって明らかにされた。
抗体半減期は、ＦｃＲｎによって左右される。基礎となるリサイクリング機構は、ＦｃＲｎに対する抗体のｐＨ依存性結合に基づく。抗体ＦｃＲｎ相互作用が二又の結合機構であることは以前に記載されている（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍ．１６（２０１７）４５１－４５６）。この機構は、水素－重水素交換（ＨＤＸ）によって明らかにされた。
【0162】
抗体Ｆｃ領域は、２つの重鎖を含む。表面に結合したＦｃＲｎを利用するすべてのアッセイ設定は、速度論的挙動が２：１の相互作用と１：１の相互作用との組み合わせであるという問題によって妨げられている。塗布されたＦｃＲｎコーティング密度に応じて、Ｆｃ領域は、両方または１つだけの結合部位と相互作用することができる。
【0163】
古典的なカップリング化学は、通常、ＳＰＲチップのランダムな占有しか可能にしない。チップ上のより低いＦｃＲｎ濃度によって、局所的な高いＦｃＲｎ密度の確率だけが導かれ得る。
【0164】
本発明に係る方法では、ＦｃＲｎがｐＨ依存性自己相互作用も示すことを実証することができた。この相互作用は、機構の詳細に関するより詳細な情報を与えるアッセイ設定について考慮されなければならない。
【0165】
したがって、本発明のこの態様は、Ｆｃ－ＦｃＲｎの結合評価における個々の相互作用を説明する新規のＳＰＲベースのＦｃ－ＦｃＲｎ結合アッセイである。
【0166】
本発明のこの態様は、例えばＳＰＲチップなどの固相上のｐＨ依存性ＦｃＲｎコーティングに少なくとも部分的に基づく。
【0167】
本発明のこの態様に係る方法は、ただ１つの活性なＦｃＲｎ結合部位を用いて抗体の複雑さをＦｃ領域のみにまで低下させ、その後、その分子のさらなるドメインを次々に追加し戻すことによって、確認されている。
【0168】
複雑なカイネティクスは、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｍａｐというソフトウェアを使用して解明され得る。これにより、同時に起きる抗体－ＦｃＲｎ相互作用の特徴付けおよび単離が可能になった。
【0169】
本発明に係る方法を用いて得られたデータをそれぞれの野生型抗体の結合プロファイルと比較することによって、ヒト上皮リサイクリングアッセイ（ＨＥＲＡ）およびヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおいて、インビボ薬物動態などの抗体輸送およびリサイクリング（のより高い複雑性）についての本発明に係るインビトロアッセイの予測性が示された。
【0170】
抗Ｄｉｇ抗体の場合、Ｆａｂ－ＦｃＲｎ結合の寄与は非常に強く、ヒトトランスジェニックマウスモデルにおいて、対称なＹＴＥ操作抗体に明確な差をインビボでは観察できないことが実証された。
【0171】
以下の実施例および図は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示されている。本発明の趣旨から逸脱することなく、示された手順に修正を加えることができると理解される。
【図面の簡単な説明】
【0172】
【図1】抗体を含む異なるヒト化／キメラヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＳＰＲセンサーグラム（探索的および立証済み）；同じ濃度および同じ単量体濃度で同じＳＰＲ条件下においてセンサーグラムを記録した；唯一の相違点は、抗原結合部位である。
【図2】単離されたＦａｂレスＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用、すなわち、単離された抗体Ｆｃ領域と、１つのＦｃ領域ポリペプチドに変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ（本明細書中ではＫａｂａｔに従うナンバリングが使用される）を導入することによって得られる単一のＦｃＲｎ結合部位との理論上の１：１相互作用の３次元ダイアグラム（ｘ軸に安定性（ｌｏｇ ｋｄ）、ｙ軸に認識（ｌｏｇ ｋａ）、ｚ軸に強度を有する）。
【図3】ＳＰＲ固体表面上の完全長の単一特異性抗ジゴキシゲニン抗体とＦｃＲｎとの相互作用の２次元ダイアグラム。
【図4】単純なＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用、すなわち、１つのＦｃ領域ポリペプチドに変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａを導入し、対応する野生型Ｆｃ領域ポリペプチドをそれぞれの他のＦｃ領域ポリペプチドとしてアミンカップリングによって低ＦｃＲｎ固定化レベルで維持することによって得られる単一のＦｃＲｎ結合部位と、単離されたＦａｂレス抗体Ｆｃ領域との１：１相互作用のセンサーグラム。
【図5】単純なＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用、すなわち、１つのＦｃ領域ポリペプチドに変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａを導入し、対応する野生型Ｆｃ領域ポリペプチドをそれぞれの他のＦｃ領域ポリペプチドとしてアミンカップリングによって低ＦｃＲｎ固定化レベルで維持することによって得られる単一のＦｃＲｎ結合部位と、単離されたＦａｂレス抗体Ｆｃ領域との１：１相互作用の２次元ダイアグラム（ｘ軸に安定性（ｌｏｇ ｋｄ）、ｙ軸に認識（ｌｏｇ ｋａ）を有する）。
【図6】複雑なＩｇＧ１完全長抗体－ＦｃＲｎ相互作用のセンサーグラム。
【図7】アミンカップリングを使用した低ＦｃＲｎ固定化レベルでの複雑なＩｇＧ１完全長抗体－ＦｃＲｎ相互作用の２次元ダイアグラム。
【図8】ビオチン／アビジンカップリングを使用した高ＦｃＲｎ固定化レベルでの複雑なＩｇＧ１完全長抗体－ＦｃＲｎ相互作用の２次元ダイアグラム。
【図9】１５０ｍＭ塩化ナトリウムで測定された、単一のＦｃＲｎ結合部位（１つのＦｃ領域ポリペプチド中に変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａおよびそれぞれの他のＦｃ領域ポリペプチド中に野生型）を有するＦｃ領域に付加された抗ジゴキシゲニンＦａｂの単離されたＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の効果。
【図10】４００ｍＭ塩化ナトリウムで測定された、単一のＦｃＲｎ結合部位（１つのＦｃ領域ポリペプチド中に変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａおよびそれぞれの他のＦｃ領域ポリペプチド中に野生型）を有するＦｃ領域に付加された抗ジゴキシゲニンＦａｂの単離されたＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の効果。
【図11】４００ｍＭ塩化ナトリウムおよび２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコール（ＭＷ＝６２．０７ｇ／ｍｏｌ）で測定された、単一のＦｃＲｎ結合部位（１つのＦｃ領域ポリペプチド中に変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａおよびそれぞれの他のＦｃ領域ポリペプチド中に野生型）を有するＦｃ領域に付加された抗ジゴキシゲニンＦａｂの単離されたＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の効果。
【図12】１５０ｍＭ塩化ナトリウムで測定された、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に付加された抗ジゴキシゲニンＦａｂの単離されたＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の効果。
【図13】４００ｍＭ塩化ナトリウムで測定された、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に付加された抗ジゴキシゲニン－Ｆａｂの単離されたＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の効果。
【図14】４００ｍＭ塩化ナトリウムおよび２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコール（ＭＷ＝６２．０７ｇ／ｍｏｌ）で測定された、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に付加された抗ジゴキシゲニン－Ｆａｂの単離されたＦａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の効果。
【図15】異なる分子内Ｆａｂ－ＦｃＲｎおよびＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用を示している略図。
【図16】分子内および分子間の抗体ＦｃＲｎ相互作用を示している略図。
【図17】Ｆｃ－ＦｃＲｎおよびＦａｂ－ＦｃＲｎの結合強度の相互関係が分離されたセンサーグラムを分離することができる。
【図18】Ｆｃ－ＦｃＲｎおよびＦａｂ－ＦｃＲｎの結合強度の相互関係が分離された２次元ダイアグラム。
【図19】ＳＰＲチップの表面に（ｓｃ）ＦｃＲｎを固定化するためのビオチン／アビジンカップリング密度。
【図20】コーティング密度を低レベルに制御するためにＳＰＲチップの表面に（ｓｃ）ＦｃＲｎを固定化するためのアミンカップリング。
【図21】ビオチン／アビジンカップリングによって捕捉された約１７００ＲＵの（ｓｃ）ＦｃＲｎを有するチップを使用した、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有する抗ジゴキシゲニン抗体のＦｃ－ＦｃＲｎおよびＦａｂ－ＦｃＲｎの結合強度を示している２次元ダイアグラム。
【図22】ビオチン／アビジンカップリングによって捕捉された約１７００ＲＵの（ｓｃ）ＦｃＲｎとの、対称のＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有する抗ジゴキシゲニン抗体のＦｃ－ＦｃＲｎおよびＦａｂ－ＦｃＲｎの結合強度を示している２次元ダイアグラム。
【図23】ビオチン／アビジンカップリングによって捕捉された約８０ＲＵの（ｓｃ）ＦｃＲｎを有するチップを使用した、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有する抗ジゴキシゲニン抗体のＦｃ－ＦｃＲｎおよびＦａｂ－ＦｃＲｎの結合強度を示している２次元ダイアグラム。
【図24】ビオチン／アビジンカップリングによって捕捉された約８０ＲＵの（ｓｃ）ＦｃＲｎとの、対称のＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有する抗ジゴキシゲニン抗体のＦｃ－ＦｃＲｎおよびＦａｂ－ＦｃＲｎの結合強度を示している２次元ダイアグラム。
【図25】アミンカップリングによって捕捉された約８０ＲＵの（ｓｃ）ＦｃＲｎを有するチップを使用した、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有する抗ジゴキシゲニン抗体のＦｃ－ＦｃＲｎおよびＦａｂ－ＦｃＲｎの結合強度を示している２次元ダイアグラム。
【図26】アミンカップリングによって捕捉された約８０ＲＵの（ｓｃ）ＦｃＲｎとの、対称のＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有する抗ジゴキシゲニン抗体のＦｃ－ＦｃＲｎおよびＦａｂ－ＦｃＲｎの結合強度を示している２次元ダイアグラム。
【図27】親および同じ親抗ＣＤ４４抗体の５つのＦａｂ電荷バリアントのＦａｂ－ＦｃＲｎおよびＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用の２次元ダイアグラム。
【図28】Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用、および同じ親抗ＣＤ４４抗体の４つのＦｃ領域バリアントのＦａｂ－ＦｃＲｎおよびＦｃ領域－ＦｃＲｎ相互作用の２次元ダイアグラム（左上のダイアグラム）が示されている。
【図29】１アームＦａｂ－Ｆｃ領域融合物を使用した、抗体－ＦｃＲｎ相互作用全体に対する抗体内のＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異、すなわち単一改変の導入の効果のモニタリング。
【図30】１アームＦａｂ－Ｆｃ領域融合物を使用した、抗体－ＦｃＲｎ相互作用全体に対する抗体内のＶ３０８Ｐ／Ｙ４３６Ｈ変異、すなわち単一改変の導入の効果のモニタリング。
【図31】１アームＦａｂ－Ｆｃ領域融合物を使用した、抗体－ＦｃＲｎ相互作用全体に対するＩ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ変異、すなわち単一改変の導入、および抗体内のＦａｂの除去（対 図２９のｍＡｂ－２）の効果のモニタリング。
【図32】１アームＦａｂ－Ｆｃ領域融合物を使用した、抗体－ＦｃＲｎ相互作用全体に対する抗体内のＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４ＡおよびさらにはＶ３０８Ｐ／Ｙ４３６Ｈ変異、すなわち２つの単一改変の導入の効果のモニタリング。
【図33】疎水性および電荷駆動性の抗体－ＦｃＲｎ相互作用の脱直線化。
【図34】種々の抗体－ＦｃＲｎ相互作用の分析。
【図35】塩の増加／添加による分子内アビディティーの測定／弱化および溶液密度による分子間アビディティーの測定／弱化を示している２次元スキーム。
【図36】例えば、ＹＴＥ変異を導入するとき、抗体は、改変された熱安定性を有し得るので、抗体の薬物動態学的操作の場合のシフトスポットパターンよりも、親抗体の相互作用スポットパターンと一致することが好ましいことを示している相互作用スポットパターン。
【図37】ＹＴＥ変異を有するウステキヌマブとＦｃＲｎとの相互作用のｐＨ依存性２次元ダイアグラム。
【図38】ブリアキヌマブとＦｃＲｎとの相互作用のｐＨ依存性２次元ダイアグラム。
【図39】ＹＴＥ変異を有するブリアキヌマブとＦｃＲｎとの相互作用のｐＨ依存性２次元ダイアグラム。
【図40】ウステキヌマブおよびブリアキヌマブの軽鎖アミノ酸配列のアラインメント；ＣＤＲにアスタリスク（＊）が付されている。
【図41】ウステキヌマブおよびブリアキヌマブの重鎖アミノ酸配列のアラインメント；ＣＤＲにはアスタリスク（＊）が付されている。
【図42】実施例で使用された抗体の略図。
【0173】
材料
製造者による情報：
センサーチップＣ１は、カルボキシメチル化された平らな表面を有する。センサーチップＣＭ５と同じ機能を提供するが、デキストランマトリックスを有しない（カルボキシル基が表面層に直接結合している）。表面マトリックスが存在しないことにより、センサーチップＣ１はセンサーチップＣＭ５よりも親水性が低くなる。実験プロトコルは、センサーチップＣ１およびセンサーチップＣＭ５に対して同じ原理に従う。表面マトリックスが存在しないと、同等の条件下のセンサーチップＣＭ５上で得られる固定化収率のおよそ１０％である固定化収率がもたらされる。
製造者による情報：
センサーチップＣ１は、カルボキシメチル化された平らな表面を有する。センサーチップＣＭ５と同じ機能を提供するが、デキストランマトリックスを有しない（カルボキシル基が表面層に直接結合している）。表面マトリックスが存在しないことにより、センサーチップＣ１はセンサーチップＣＭ５よりも親水性が低くなる。実験プロトコルは、センサーチップＣ１およびセンサーチップＣＭ５に対して同じ原理に従う。表面マトリックスが存在しないと、同等の条件下のセンサーチップＣＭ５上で得られる固定化収率のおよそ１０％である固定化収率がもたらされる。
【0174】
アミンカップリングは、リガンドのＮ末端およびリジン残基のε－アミノ基を利用する。
【0175】
固定化の手順
一般に、固定化の手順は、以下の３つの異なる部分からなる：
活性化：別の分子と共有結合を形成することができるようなセンサーチップのプライミング
カップリング：センサー表面と共有結合を形成するようなリガンドの注入
不活性化：残りの活性な表面基をクエンチするための低分子反応基の注入
一般に、固定化の手順は、以下の３つの異なる部分からなる：
活性化：別の分子と共有結合を形成することができるようなセンサーチップのプライミング
カップリング：センサー表面と共有結合を形成するようなリガンドの注入
不活性化：残りの活性な表面基をクエンチするための低分子反応基の注入
【0176】
活性化：
デキストランベースのセンサーチップ上の共有結合性アミン結合化学の場合、カルボキシル基は、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）とＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）との混合物で活性化されて、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステルを生成する。活性化時間を変化させることによって、より多いまたはより少ないカルボキシル基が活性化される。さらに、ＮＨＳ／ＥＤＣ混合物の濃度を変化させて、活性化カルボキシル基の量を制御することができる。活性化された基の量は、リガンドがセンサー表面にどれだけ結合できるかを測定する。ＢＩＡＣＯＲＥのＣＭ５センサーチップの標準的な活性化時間は、５μｌ／分の流速において０．０５Ｍ ＮＨＳ／０．２Ｍ ＥＤＣを用いたとき７分である。
デキストランベースのセンサーチップ上の共有結合性アミン結合化学の場合、カルボキシル基は、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）とＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）との混合物で活性化されて、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステルを生成する。活性化時間を変化させることによって、より多いまたはより少ないカルボキシル基が活性化される。さらに、ＮＨＳ／ＥＤＣ混合物の濃度を変化させて、活性化カルボキシル基の量を制御することができる。活性化された基の量は、リガンドがセンサー表面にどれだけ結合できるかを測定する。ＢＩＡＣＯＲＥのＣＭ５センサーチップの標準的な活性化時間は、５μｌ／分の流速において０．０５Ｍ ＮＨＳ／０．２Ｍ ＥＤＣを用いたとき７分である。
【0177】
カップリング：
選択されたｐＨでのリガンドの反応性は、リガンドが活性化表面に結合する速度を測定する。プレコンセントレーションの速度は、固定化溶液のリガンド濃度およびｐＨに直接関係する。リガンド濃度が高すぎると、リガンドのプレコンセントレーション応答が高くなるが、適切な量のリガンドを固定化することも困難になる。リガンドが活性化表面と接触している時間と、結合したリガンドの量との間の関係は、センサーチップが飽和に達するので、直線的ではない。
選択されたｐＨでのリガンドの反応性は、リガンドが活性化表面に結合する速度を測定する。プレコンセントレーションの速度は、固定化溶液のリガンド濃度およびｐＨに直接関係する。リガンド濃度が高すぎると、リガンドのプレコンセントレーション応答が高くなるが、適切な量のリガンドを固定化することも困難になる。リガンドが活性化表面と接触している時間と、結合したリガンドの量との間の関係は、センサーチップが飽和に達するので、直線的ではない。
【0178】
固定化するリガンドの量：
固定化されるリガンドの量は、用途に依存する。
固定化されるリガンドの量は、用途に依存する。
【0179】
特異性の計測の場合、良好なシグナルがもたらされる限り、ほぼいずれのリガンド密度でもよい。
【0180】
濃度の計測は、物質移動の制限を容易にするために最も高いリガンド密度を必要とする。総物質移動制御実験では、結合はアナライト濃度に依存し、リガンドとアナライトとの間の結合カイネティクスには依存しない。
【0181】
親和性の順位付けは、低密度から中密度のセンサーチップを用いて行われ得る。アナライトが適切な時間枠内でリガンドを飽和させることが重要である。
【0182】
カイネティクスは、物質移動または立体障害などの二次的要因によって妨害されることなく依然として良好な応答を与える最低のリガンド密度で行われるべきである。
【0183】
低分子量結合は、適切なシグナルを得るために可能な限り多くのアナライトに結合するために、高密度センサーチップを用いて行われるべきである。
【0184】
一般に、カイネティック計測では、アナライトが注入されたとき（１），（２）、多くとも１００ＲＵの全アナライト応答が望ましい（物質輸送を参照のこと）。この値（Ｒｍａｘ）を念頭に置いて、固定化されるリガンドの量（反応単位）は、以下を用いて計算され得る：Ｒｍａｘ応答／リガンド応答。
【0185】
不活性化：
不活性化溶液は、残りのすべての活性化部位を過剰の試薬でブロッキングし、その高いイオン強度および高いｐＨが理由で、その溶液は、静電的に結合したリガンドの大部分を洗い流す。アミンカップリングの手順は、通常、エタノールアミンでブロッキングされるが、ＢＳＡまたはカゼインの使用も可能である。高い塩濃度がリガンドにとって有害である場合、実験者は、すべての活性部位が減衰してカルボキシル基に戻るまで待つことができる。ブロッキングの目的は、活性化された基を除去し、表面を可能な限り不活性にすることである。
不活性化溶液は、残りのすべての活性化部位を過剰の試薬でブロッキングし、その高いイオン強度および高いｐＨが理由で、その溶液は、静電的に結合したリガンドの大部分を洗い流す。アミンカップリングの手順は、通常、エタノールアミンでブロッキングされるが、ＢＳＡまたはカゼインの使用も可能である。高い塩濃度がリガンドにとって有害である場合、実験者は、すべての活性部位が減衰してカルボキシル基に戻るまで待つことができる。ブロッキングの目的は、活性化された基を除去し、表面を可能な限り不活性にすることである。
【0186】
正に帯電したアナライトを分析している場合、センサー表面の負電荷を低減するため、ひいては非特異的結合の可能性を低減するために、表面をエチレンジアミンでブロッキングすることができる。
【0187】
参考文献：
（１）Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ Ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｗ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２９－２４０；（１９９１）．
（２）Ｍｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｔｈｅ １９９８ ｏｐｔｉｃａｌ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２：３９０－４０８；（１９９９）．
（１）Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ Ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｗ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２９－２４０；（１９９１）．
（２）Ｍｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｔｈｅ １９９８ ｏｐｔｉｃａｌ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２：３９０－４０８；（１９９９）．
【0188】
アミンカップリング
アミンカップリングは、リガンドのＮ末端およびリジン残基のε－アミノ基を利用する。ナンバリングされた点は、固定化の手順における異なる段階のことを指す。
アミンカップリングは、リガンドのＮ末端およびリジン残基のε－アミノ基を利用する。ナンバリングされた点は、固定化の手順における異なる段階のことを指す。
【0189】
１）連続流（５μｌ／分）による未修飾センサーチップ表面のベースライン。
【0190】
２）カルボキシメチル基をＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルに修飾することによって表面を活性化するためのＮＨＳ／ＥＤＣの３５μｌ注入。
【0191】
３）活性化後のベースライン。表面の活性化は、ＳＰＲシグナル（１００～２００ＲＵ）にごくわずかな影響しか及ぼさない。
【0192】
４）リガンド（１０～２００μｇ／ｍｌ）の注入は、表面マトリックスへの静電引力およびカップリングをもたらす。この時点において、リガンド溶液は、依然としてセンサー表面と接触しており、応答には、固定化されたリガンドと非共有結合的に結合したリガンドとの両方が含まれる。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルは、リガンド上のアミンと自発的に反応して共有結合を形成する（１）。
【0193】
５）不活性化前の固定化されたリガンド。リガンドがセンサー表面を通過し、共有結合していないタンパク質の大部分が溶出する。
【0194】
６）ＮａＯＨでｐＨ８．５に調整された３５μｌの１Ｍエタノールアミン塩酸塩を使用した未反応ＮＨＳエステルの不活性化。ＳＰＲシグナルの増加は、バルク屈折率の変化に起因する。不活性化プロセスはまた、残りの静電気的に結合したリガンドを除去する。
【0195】
７）点７－点３により、不活性化後の固定化されたリガンドの量がもたらされる。
【0196】
アミンカップリングは、カップリングする新しい分子での第１選択である。しかしながら、酸性リガンド（ｐＩ＜３．５）を固定化することは困難である。また、遊離アミン基が、生物学的活性部位に存在するとき、他の化学のうちの１つを調べなければならない。
【0197】
参考文献
（１）Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ａ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｄｅｘｔｒａｎ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｏｌｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｆｏｒ ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｅｎｓｏｒｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８：２６８－２７７；（１９９１）．
（１）Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ａ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｄｅｘｔｒａｎ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｏｌｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｆｏｒ ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｅｎｓｏｒｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８：２６８－２７７；（１９９１）．
【実施例】
【0198】
実施例１
Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用を測定するための一般的なＳＰＲ法
すべての計測は、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して２５℃で行われた。ビオチン化された一本鎖ヒトＦｃＲｎをすべての相互作用研究に使用した。
Ｆｃ－ＦｃＲｎ相互作用を測定するための一般的なＳＰＲ法
すべての計測は、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して２５℃で行われた。ビオチン化された一本鎖ヒトＦｃＲｎをすべての相互作用研究に使用した。
【0199】
ＦｃＲｎを、低密度固定化および高密度固定化の２つの異なる方法で固定化した。
【0200】
低密度固定化の場合、標準的なアミンカップリングを用いてＣ１チップにＦｃＲｎを固定化した。ゆえに、タンパク質を緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．４）で０．２４５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、チップ表面上に６０秒間注入した。この固定化により、およそ８０ＲＵの固定化レベルがもたらされた。
【0201】
高密度固定化の場合、ビオチン捕捉によってＦｃＲｎを固定化した。最初に、標準的なアミンカップリングを用いて、ニュートラアビジン（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＣ１チップ上に固定化した。ニュートラアビジンをｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸Ｎａ緩衝液で０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、チップ表面上に６分間注入した。この固定化により、およそ１０００ＲＵの固定化がもたらされた。ニュートラアビジンの固定化後、ビオチン化されたタンパク質を０．２４ｍｇ／ｍｌの濃度でチップ上に５分間注入することによってＦｃＲｎを捕捉した。この捕捉により、およそ１７００ＲＵの固定化レベルがもたらされた。
【0202】
異なる抗体との相互作用の計測のために、ｐＨ５．８の１０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％Ｐ－２０からなる緩衝液を使用した。抗体－ＦｃＲｎ相互作用を、単サイクルまたは多サイクルのカイネティクスおよび２倍または３倍の希釈系列を使用して分析試験した。記録されたセンサーグラムは、参照フローセルおよびブランク注入を使用して差し引かれたダブルリファレンスだった。得られたセンサーグラムを、ＴｒａｃｅＤｒａｗｅｒソフトウェア（Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＢ）を使用して評価した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【配列表】
【国際調査報告】