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特表2024-512257ブルガダ症候群の診断のためのタンパク質及び代謝産物血液バイオマーカー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-19
(54)【発明の名称】ブルガダ症候群の診断のためのタンパク質及び代謝産物血液バイオマーカー
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240312BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240312BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240312BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240312BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240312BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240312BHJP
C12Q 1/6883 20180101ALI20240312BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
G01N33/50 Z
G01N33/50 P
C12Q1/02
C12Q1/6869 Z
C12N15/12
C12Q1/686 Z
C12Q1/6883 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023550263
(86)(22)【出願日】2022-02-24
(85)【翻訳文提出日】2023-10-23
(86)【国際出願番号】 IB2022051626
(87)【国際公開番号】W WO2022180559
(87)【国際公開日】2022-09-01
(31)【優先権主張番号】21159669.7
(32)【優先日】2021-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＮＯＮＩＤＥＴ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522325090
【氏名又は名称】カーディオミックス エス．アール．エル．
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パポーネ、カルロ
(72)【発明者】
【氏名】アナスタシア、ルイジ
(72)【発明者】
【氏名】チコンテ、ジュゼッペ
(72)【発明者】
【氏名】エスピノーザ アンギャリーカ、ウラジミール
(72)【発明者】
【氏名】ヴィセドミニ、ガブリエル
(72)【発明者】
【氏名】ペトレット、エンリコ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CA25
2G045CA26
2G045DA02
2G045DA13
2G045DA14
2G045DA20
2G045DA35
2G045DA36
2G045DA44
2G045DA80
2G045FA40
2G045FB01
2G045FB02
2G045FB03
2G045FB06
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QQ58
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS32
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
本発明は、ヒトにおけるブルガダ症候群（ＢｒＳ）の診断のための血中タンパク質及び代謝産物バイオマーカーの特定のセット、並びに関連する検出方法に関する。本発明はさらに、ブルガダ症候群の予測及び診断のための変異したＰｒｇ４遺伝子、Ｅｐｘ遺伝子、及びＰｏｎ１遺伝子、並びに関連タンパク質に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉ）以下の７つのタンパク質からなるサブセット：【表1】
及び、
ｉｉ）以下の３種類の代謝産物からなるサブセット：
フマル酸；
Ｏ－パルミトオレオイルカルニチン（O-palmitoleoylcarnitine）；
Ｌ－グルタミン酸
を少なくとも含む、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のためのバイオマーカーのセット。
【請求項2】
ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための、以下の追加的なバイオマーカーのうちの１つ又は複数をさらに含む、請求項１に記載のバイオマーカーのセット。ｉ）以下からなる群から選択されるタンパク質：
【表2】
及び／又は代謝産物である２－ヒドロキシデカノエート；
又はこれらの組合せ。
【請求項3】
ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための、以下を含む、請求項２に記載のバイオマーカーのセット。ｉ）以下の１２種類のタンパク質からなるサブセット：
【表3】
及び、
ｉｉ）以下の４種類の代謝産物からなるサブセット：
フマル酸；
Ｏ－パルミトオレオイルカルニチン（O-palmitoleoylcarnitine）；
Ｌ－グルタミン酸；
２－ヒドロキシデカノエート；
又はこれらの組合せ。
【請求項4】
ヒトの生体試料中における請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のセットに含まれるバイオマーカーのうちの１つの存在を検出する、又はその出現の濃度を測定する、インビトロ方法。
【請求項5】
ａ）ウエスタンブロット、ドットブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、酵素活性アッセイ、標的化ＭＳ、マルチプレックスタンパク質分析、ＰｒｏＱｕａｎｔｕｍ高感度イムノアッセイ、又はこれらの組合せを含む群から選択されるアッセイによって、サブセットｉ）の少なくとも７種類、最大１２種類のタンパク質の存在を検出するステップと、ｂ）ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ、蛍光アッセイ若しくは比色アッセイ、ＮＭＲ、ナノプローブを用いた分光法、酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ、又はこれらの組合せを含む群から選択されるアッセイなどのアッセイによる、サブセットｉｉ）の少なくとも３種類、最大４種類の前記代謝産物の検出ステップと
を含み、
正常対照と比較した前記バイオマーカーの全ての陽性検出が、ブルガダ症候群に罹患した患者の同定を可能にする、
請求項４に記載の前記セットに含まれるバイオマーカーのうちの１つの存在を検出するためのインビトロ方法。
【請求項6】
ａ）ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、酵素活性アッセイ、標的化ＭＳ、マルチプレックスタンパク質分析、ＰｒｏＱｕａｎｔｕｍ高感度イムノアッセイ、又はこれらの組合せなどの定量的技術による、サブセットｉ）の少なくとも７種類、最大１２種類のタンパク質の定量的決定ステップと、ｂ）ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＮＭＲ分析、ＥＬＯＮＡ、又はそれらの組合せなどの技術による、サブセットｉｉ）の少なくとも３種類、最大４種類の前記代謝産物の定量的測定ステップと
を含み、
正常対照と比較した前記バイオマーカーの濃度の増加又は減少が、ブルガダ症候群の診断を示す、
請求項４に記載の前記セットに含まれるバイオマーカーのうちの１つの濃度を測定するインビトロ方法。
【請求項7】
前記生体試料が、血漿、ＰＢＭＣ、全血、血清及び末梢血、又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４～請求項６のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項8】
前記ヒトが、無症候性である、請求項４～請求項７のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項9】
前記ヒトが、家族歴、過去における心臓の心房細動及び／又は心室細動の事象、糖尿病、又は肥満に起因して、ブルガダ症候群のリスクが高い、請求項４～請求項７のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項10】
前記ヒトが、約４０歳以下である、請求項４～請求項９のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項11】
請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のサブセットｉ）のタンパク質の各々に特異的な抗体を含むキットであって、それら抗体が、標識されているか、又は固体支持体に結合している、
前記キット。
【請求項12】
ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための遺伝子診断マーカーとして使用するための、ヌクレオチド配列の１８６，３０４，８６２位に有害変異Ｃ→Ｔが存在することを特徴とする、Ｐｒｇ４遺伝子（ＥＮＳＧ０００００１１６６９０）のＲＮＡ又はＤＮＡであるオリゴヌクレオチド配列。
【請求項13】
ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための遺伝子診断マーカーとして使用するための、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド配列によってコードされる、変異したＰＲＧ４タンパク質。
【請求項14】
ヒトにおけるブルガダ症候群を診断するための遺伝子診断マーカーとして使用するための、遺伝子配列の５８，１９３，７３３位に有害変異Ｇ→Ｃが存在することを特徴とする、Ｅｐｘヒト遺伝子（ＥＮＳＧ０００００１２１０５３）のＲＮＡ又はＤＮＡであるオリゴヌクレオチド配列。
【請求項15】
ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための遺伝子診断マーカーとして使用するための、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド配列によってコードされる、変異したＥＰＸタンパク質。
【請求項16】
ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための遺伝子診断マーカーとして使用するための、遺伝子配列の９５，３１６，７７２位に有害変異Ａ→Ｔが存在することを特徴とする、Ｐｏｎ１ヒト遺伝子（ＥＮＳＧ０００００００５４２１）のＲＮＡ又はＤＮＡであるオリゴヌクレオチド配列。
【請求項17】
ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための遺伝子診断マーカーとして使用するための、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド配列によってコードされる、変異したＰＯＮ１タンパク質。
【請求項18】
生体試料での検出によるヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための、請求項１２～請求項１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド配列又は変異タンパク質の１つ又は複数の使用であって、前記生体試料が、血漿、ＰＢＭＣ、全血、血清及び末梢血、又はそれらの組合せからなる群から選択される、
前記使用。
【請求項19】
ＰＣＲ又はＤＮＡ配列決定による遺伝子分析によって、請求項１２、請求項１４、請求項１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド配列のうちの１つ又は複数の存在を検出する、インビトロ方法。
【請求項20】
ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための、請求項１２、請求項１４、請求項１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド配列のうちの１つ又は複数に相補的なプライマー又はプローブを含む、キット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒトにおけるブルガダ症候群（ＢｒＳ）の診断のための血中タンパク質及び代謝産物バイオマーカーの特定のセット、並びに関連する検出方法に関する。本発明はさらに、ブルガダ症候群の予測及び診断のための変異したＰｒｇ４遺伝子、Ｅｐｘ遺伝子、及びＰｏｎ１遺伝子、並びに関連タンパク質に関する。
【背景技術】
【0002】
ブルガダ症候群（ＢｒＳ）とは、構造的に正常な心臓を有する患者における、心電図で右前胸部誘導におけるコブド型ＳＴセグメント上昇、及び心臓性突然死（ＳＣＤ）のリスク増加によって定義される、遺伝性不整脈原性疾患である［１～４］。ブルガダ症候群は心臓性突然死の５～４０％の原因であると報告されており、乳児及び小児にもまた発生するとしても［１］、４０歳未満の個体における重要な死因である［５～７］。この症候群はアジア地域で流行しており［６］、男性では女性よりも８倍～１０倍多いようである。
【0003】
この症候群は、典型的には、３０代及び４０代で起こる心停止又は失神を呈する［３、４、６］が、しかしながら、患者の大部分は構造的に正常な心臓で無症候性であり、かつ通常は偶発的に診断される。
【0004】
特に無症候性患者におけるブルガダ症候群のリスク層別化は、依然として臨床的課題である。
【0005】
不整脈基質の程度は、心室細動（ＶＦ）及び心室頻拍（ＶＴ）の誘導能の唯一の独立した予測因子であり、かつリスク層別化及び治療の新規マーカーと見なされ得ることが実証された［８］。
【0006】
現在、自発性１型ＥＣＧパターン、及び不整脈起源の致死的心臓性突然死又は失神を有する対象は、将来の不整脈事象のリスクが最も高いので、医療機器に関連する合併症及び不適切なショックのリスクがあるにもかかわらず、植込み型除細動器（ＩＣＤ）治療が推奨されている。
【0007】
今日まで、ブルガダ症候群の診断は、自発的（１型）であってもよいか、又はナトリウムチャネル遮断薬、例えばアジュマリン若しくはフレカイニドなどの静脈内投与による薬理学的負荷試験によって誘導され得る、典型的なＥＣＧトレースシグナルの同定に基づいている。ＢｒＳの診断と見なされるために、ＥＣＧで見られるパターンは、右前胸部誘導におけるコブド型ＳＴ上昇、主に（２番目～４番目までの）上位右肋間腔に配置されたＶ１及びＶ２を含む。
【0008】
アジュマリン負荷とは、自発性１型ＥＣＧパターンを有しない個体においてブルガダ症候群を診断するための、今日までの最も正確な試験である。正常な心臓細胞を有する患者では、アジュマリンはＥＣＧにほとんど又は全く影響を及ぼさない。この薬物は、ブルガダ１型パターンを解明する際の強力なツールであること［１０］、及び３６％の偽陰性率に関連するフレカイニドよりも正確であることが証明されている［１１］。しかしながら、アジュマリンン投与は診断処置中にＶＴ／ＶＦを引き起こす可能性がある。結果として、アジュマリンン負荷を用いたブルガダ診断試験もまた、安全上の理由からスクリーニング試験としていくつかの国で許可されない可能性がある。さらに、この処置に関連したリスクを考慮して、患者自身が処置を受けることを拒否する。さらに、この処置には、体外式膜型人工肺（ＥＣＭＯ）チームを有する病院の経験豊富なスタッフが必要である。したがって、患者が処置のために長距離を移動する必要があり得ることを示唆しており、この処置は広く利用可能ではない。経済的な観点から、この処置は高価であり、公的国民保健制度にとってかなりの負担である。結果として、潜在的な患者は、適時に診断試験を受けず、又は全く受けず、心臓性突然死のかなりのリスクに曝される。
【0009】
さらに、ブルガダ症候群は、さらに無視できない遺伝的処置を有し、これは、不完全な浸透度を有する常染色体優性形質として遺伝する、不均一なチャネル病である［９］。
【0010】
今日までに、２５種類の遺伝子のうち約３００種類の病的バリアントがブルガダ症候群の対象において同定されているが、それらのほとんど（２５％～３０％）は、心臓ナトリウムチャネルＮａＶ１．５のα－サブユニットをコードする、染色体３ｐ２２上のＳＣＮ５Ａ遺伝子を含む［１０］。ブルガダ症候群に関連した他の遺伝子病変には、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＳＣＮ１０Ａ、ＰＫＰ２、ＴＲＰＭ４、ＫＣＮＨ２、及び少なくとも１８種類の他の遺伝子における、ヘテロ接合性バリアントが含まれる。ＳＣＮ５Ａヘテロ接合性変異は、全てのブルガダ症候群症例の１１％～２８％を占める［１１］。
【0011】
しかしながら、ブルガダ症候群患者の約９０％は、ＳＣＮ５Ａ遺伝子に変異を有していない
【0012】
遺伝子評価をさらに複雑にするのは、ＳＣＮ５Ａ遺伝子以外の遺伝子の変異によって引き起こされる様々な関連するブルガダ症候群の存在である。例えば、ブルガダ症候群－２（表現型ＭＩＭ番号：６１１７７７）は、ＧＰＤ１Ｌ遺伝子の変異によって引き起こされる。ブルガダ症候群－３（表現型ＭＩＭ番号：６１１８７５）及びブルガダ症候群－４（表現型ＭＩＭ番号：６１１８７６）は、ＥＣＧ上のＱＴ間隔の短縮を表現型に含み、それぞれ、ＣＡＣＮＡ１Ｃ遺伝子及びＣＡＣＮＢ２遺伝子の変異によって引き起こされる。ブルガダ症候群－５（表現型ＭＩＭ番号：６１２８３８）は、ＳＣＮ１Ｂ遺伝子の変異によって引き起こされる。ブルガダ症候群－６（表現型ＭＩＭ番号：６１３１１９）は、ＫＣＮＥ３遺伝子の変異によって引き起こされる。ブルガダ症候群－７（表現型ＭＩＭ番号：６１３１２０）は、ＳＣＮ３Ｂ遺伝子の変異によって引き起こされる。ブルガダ症候群－８（表現型ＭＩＭ番号：６１３１２３）は、ＨＣＮ４遺伝子の変異によって引き起こされる。
【0013】
科学界は依然としてブルガダ症候群をイオンチャネル病と見なしているが、さらなる証拠により、この症候群が追加的な要因にもまた起因し得ることが示唆されている。例えば、αトロポミオシンのヘテロ接合性変異は、ある研究においてＨＣＭとブルガダ症候群とを関連付けるようであり、これは、サルコメア症（sarcomeropathy）の役割を示唆している［１２］。本発明者らによって公表された別の研究は、ＭＹＢＰＣ３遺伝子における病的バリアント、及びブルガダ症候群とのその潜在的関連性を初めて実証した［１３］。実際、変化したサルコメア特性は、催不整脈及び突然死に直接関係している［１４～１６］。
【0014】
この多因子障害の複雑さ、及び分子レベルでの疾患の多くの遺伝的バリアントの存在を考慮すると、遺伝子試験は、ブルガダ症候群の臨床診断を確認するためだけに使用され得るが、任意の対象における疾患の診断を行うのには適していない。
【0015】
遺伝子スクリーニングのこれらの制限は、既に罹患している患者の予後を確立するために、ブルガダ症候群の確認も目的とするバイオマーカーを探す緊急の必要性を強調している。
【0016】
この方向では、ナトリウムチャネル遮断薬を用いたブルガダ症候群のマスキング解除における能動的スクリーニングの体系的な導入は、疾患の診断及び発生率を大幅に増加させたが、その真の有病率は依然として不明である［１７］。それにもかかわらず、診断に使用される薬物負荷は、潜在的に生命を脅かす心室性不整脈の発生に関連する可能性があり、したがって、安全な病院環境がない場合のその広範な使用を制限する。
【0017】
上記を考慮すると、ブルガダ症候群を診断するための時間及び費用効率がより高く、高感度で、かつ非侵襲的な検査が必要とされており、これは、最終的に薬物チャレンジに取って代わる可能性があるか、又は少なくともそのような初期検査室スクリーニングに対して陽性であり、かつ遺伝子スクリーニングの限界を克服する個体に薬物負荷を制限する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
本発明の著者らは、現在、先行技術に影響を及ぼす様々な技術的問題を克服することを可能にする循環バイオマーカーのセットを同定しており、本明細書にはまた、無症候性対象、ブルガダ症候群の家族歴のない患者、及び心臓性突然死の家族歴のない患者も含まれる、任意の患者におけるブルガダ症候群の診断のための信頼性が高くかつ高感度の方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0019】
具体的には、著者らは、ブルガダ症候群に罹患した患者が、末梢血で検出可能である疾患の徴候を保有することを見出した。特に、ブルガダ症候群に罹患した患者に見られる変異遺伝子の数及び多様性の増加に基づいて、著者らは、この疾患が心臓に存在するもの以外の細胞及び細胞内区画（ミトコンドリアなど）に影響を及ぼし得ると仮定した。この目的のために、病理学の複雑さ及び患者集団間の不均一性を考慮して、これらは、広範で統合されたバイオインフォマティクス及び機械学習（ＭＬ）アプローチによって支持される、末梢血漿及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のマルチオミクス（ゲノム、プロテオミクス、メタボロミクス、及びリピドミクス）特性評価を大規模に適用することで、ブルガダ症候群に統計的に有意なバイオマーカーの一義的なセットの同定をもたらした。
【0020】
本発明のバイオマーカーのセットの使用の重要な利点は、ＳＣＮ５Ａ遺伝子などの他の公知の遺伝子バイオマーカーの遺伝子型又は発現にかかわらず、広範なサブタイプのセットのブルガダ症候群における診断及び予後の有用性を含む。
【0021】
本発明のバイオマーカーのセットはまた、ブルガダ症候群患者のリスク認証にも非常に有用であり得る。さらに、本発明のバイオマーカーのセットでの陽性結果は、症候性であるか否かとは無関係に、かつ、過去におけるブルガダ症候群の家族歴又は過去における心臓性突然死（ＳＣＤ）の家族歴とは無関係に、ブルガダ疾患に罹患した患者を同定することを可能にする。
【0022】
したがって、本発明の目的は、
ｉ）以下の表１に列挙される７種類のタンパク質からなるサブセット：
ｉｉ）以下の３種類の代謝産物からなるサブセット：
フマル酸；
Ｏ－パルミトオレオイルカルニチン（O-palmitoleoylcarnitine）；
Ｌ－グルタミン酸；
を少なくとも含む、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための１０種類のバイオマーカーのセット（コアセット）である。
ｉ）以下の表１に列挙される７種類のタンパク質からなるサブセット：
【表1】
ｉｉ）以下の３種類の代謝産物からなるサブセット：
フマル酸；
Ｏ－パルミトオレオイルカルニチン（O-palmitoleoylcarnitine）；
Ｌ－グルタミン酸；
を少なくとも含む、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための１０種類のバイオマーカーのセット（コアセット）である。
【0023】
本発明の１０種類のバイオマーカーのコアセットは、約７４％の全体的な平均精度及び約０．８１の平均曲線下面積（ＡＵＣ）で、任意の対象のＰＢＭＣ／血漿についてのブルガダ症候群の疾患の診断を可能にする。
【0024】
本発明のサブセットは、上記に列挙されたタンパク質及び代謝産物のサブセット（ｉ）～（ｉｉ）に属する、追加のバイオマーカーをさらに含み得る。
【0025】
したがって、本発明の別の目的は、以下の追加のバイオマーカーのうちの１つ又は複数をさらに含む、１０種類のバイオマーカーのセットである
ｉ）下記の表２に列挙される群から選択されるタンパク質：
及び代謝産物である２－ヒドロキシデカノエート；
又はこれらの組合せ。
ｉ）下記の表２に列挙される群から選択されるタンパク質：
【表2】
及び代謝産物である２－ヒドロキシデカノエート；
又はこれらの組合せ。
【0026】
好ましくは、上に列挙した全ての追加的バイオマーカーが本発明のバイオマーカーのセットに含まれるが、それらの一部のみが含まれる中間的な解決策もまた、本発明の範囲内で企図される。
【0027】
したがって、さらなる好ましい実施形態によれば、本発明の別の目的は、以下を含む、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための１６種類のバイオマーカーのセット（拡張セット）である。
ｉ）以下の表３に列挙される１２種類のタンパク質からなるサブセット：
及び、
ｉｉ）以下の４種類の代謝産物からなるサブセット：
フマル酸；
Ｏ－パルミトオレオイルカルニチン（O-palmitoleoylcarnitine）；
Ｌ－グルタミン酸；
２－ヒドロキシデカノエート。
ｉ）以下の表３に列挙される１２種類のタンパク質からなるサブセット：
【表3】
及び、
ｉｉ）以下の４種類の代謝産物からなるサブセット：
フマル酸；
Ｏ－パルミトオレオイルカルニチン（O-palmitoleoylcarnitine）；
Ｌ－グルタミン酸；
２－ヒドロキシデカノエート。
【0028】
実施例１の表４に報告されているように、異なる患者サブグループのＰＢＭＣ／形質細胞集団について１６種類のバイオマーカー（拡張セット）を用いると、試験の全体の精度は７５％～８０％であり、ＡＵＣは０．８３～０．８９である。
【0029】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記生体試料は、全血、血漿、血清、末梢血、及びＰＢＭＣからなる群から選択される。好ましくは、生体試料は、血漿及び／又はＰＢＭＣである。
【0030】
代替的な実施形態によれば、前記生体試料は、成人対象又は子供、男性対象又は女性対象から同様に得ることができる。
【0031】
本発明の好ましい実施形態では、前記ヒトは、無症候性（すなわち、構造的に正常な心臓を有する）か、又は家族歴、過去における心臓の心房細動及び／又は心室細動の事象、糖尿病、又は肥満に起因するブルガダ症候群のリスクが高いかのいずれであってもよい。
【0032】
本発明の別の目的は、ヒトの生体試料中における上記に列挙されたセットに含まれるバイオマーカーのうちの１つの存在を検出する、又はその出現の濃度を測定する、インビトロ方法である。
【0033】
信頼できる結果を提供するために、インビトロ方法は、１０種類以上のコアセットのバイオマーカー、最大１６種類の拡張されたバイオマーカーのセットの存在の検出、又はその濃度の測定を少なくとも予見すべきである。
【0034】
特定の実施形態では、本発明は、
ａ）ウエスタンブロット、ドットブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、酵素活性アッセイ、標的化ＭＳ、マルチプレックスタンパク質分析、ＰｒｏＱｕａｎｔｕｍ高感度イムノアッセイ、又はこれらの組合せを含む群から選択されるアッセイによる、サブセットｉ）の７種類以上、最大１２種類のタンパク質の検出ステップと、
ｂ）アッセイ、例えば、ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ、蛍光若しくは比色アッセイ、ＮＭＲ、ナノプローブを用いた分光法、酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ、又はこれらの組合せを含む群から選択されるものなどのアッセイによる、サブセットｉｉ）の３種類以上、最大４種類の代謝産物の検出ステップと
を含み、
正常対照と比較した前記バイオマーカーの全ての陽性検出は、ブルガダ症候群に罹患した患者の同定を可能にする、
ヒトの生体試料中における上記に列挙されたセットに含まれるバイオマーカーのうちの１つの存在を検出するインビトロ方法を提供する。
ａ）ウエスタンブロット、ドットブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、酵素活性アッセイ、標的化ＭＳ、マルチプレックスタンパク質分析、ＰｒｏＱｕａｎｔｕｍ高感度イムノアッセイ、又はこれらの組合せを含む群から選択されるアッセイによる、サブセットｉ）の７種類以上、最大１２種類のタンパク質の検出ステップと、
ｂ）アッセイ、例えば、ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ、蛍光若しくは比色アッセイ、ＮＭＲ、ナノプローブを用いた分光法、酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ、又はこれらの組合せを含む群から選択されるものなどのアッセイによる、サブセットｉｉ）の３種類以上、最大４種類の代謝産物の検出ステップと
を含み、
正常対照と比較した前記バイオマーカーの全ての陽性検出は、ブルガダ症候群に罹患した患者の同定を可能にする、
ヒトの生体試料中における上記に列挙されたセットに含まれるバイオマーカーのうちの１つの存在を検出するインビトロ方法を提供する。
【0035】
代替的な実施形態によれば、本発明は、
ａ）ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、酵素活性アッセイ、標的化ＭＳ、マルチプレックスタンパク質分析、ＰｒｏＱｕａｎｔｕｍ高感度イムノアッセイ、又はこれらの組合せなどの定量的技術による、サブセットｉ）の少なくとも７種類、最大１２種類のタンパク質の定量的決定ステップと、
ｂ）ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＮＭＲ分析、ＥＬＯＮＡ、又はこれらの組合せなどの技術による、サブセットｉｉ）の少なくとも３種類、最大４種類の代謝産物の定量的決定ステップと、
を含み、
（図３に示されるように）正常対照と比較したバイオマーカーの濃度の増加又は減少は、ブルガダ症候群の診断を示す、
ヒトの生体試料中における上記に列挙されたセットに含まれるバイオマーカーのうちの１つの濃度を測定するインビトロ方法に関する。
ａ）ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、酵素活性アッセイ、標的化ＭＳ、マルチプレックスタンパク質分析、ＰｒｏＱｕａｎｔｕｍ高感度イムノアッセイ、又はこれらの組合せなどの定量的技術による、サブセットｉ）の少なくとも７種類、最大１２種類のタンパク質の定量的決定ステップと、
ｂ）ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＮＭＲ分析、ＥＬＯＮＡ、又はこれらの組合せなどの技術による、サブセットｉｉ）の少なくとも３種類、最大４種類の代謝産物の定量的決定ステップと、
を含み、
（図３に示されるように）正常対照と比較したバイオマーカーの濃度の増加又は減少は、ブルガダ症候群の診断を示す、
ヒトの生体試料中における上記に列挙されたセットに含まれるバイオマーカーのうちの１つの濃度を測定するインビトロ方法に関する。
【0036】
全てのバイオマーカーの組合せは、そのような患者が無症候性又は症候性であるという事実とは無関係に、その患者がブルガダ症候群に罹患していることを予測することができることを意味する。
【0037】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記生体試料は、血漿、ＰＢＭＣ血清、末梢血、及び全血、又はこれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、生体試料は、血漿及び／又はＰＢＭＣである。前述の方法の代替的な実施形態によれば、出発生体試料は、成人対象又は子供、男性対象又は女性対象から同様に得ることができる。
【0038】
本発明の好ましい実施形態では、前記ヒトは、無症候性（すなわち、構造的に正常な心臓を有する）か、又は家族歴、過去における心臓の心房細動及び／又は心室細動の事象、糖尿病、又は肥満に起因するブルガダ症候群のリスクが高いかのいずれであってもよい。
【0039】
より好ましくは、前記ヒトは、約４０歳以下である。
【0040】
本発明はさらに、少なくとも７種類の表１のタンパク質のサブセットｉ）、最大１２種類の表３のタンパク質のサブセットｉ）の検出のためのキットを対象とし、前記キットは、サブセットｉ）のタンパク質のいずれか１つに特異的な抗体を含み、それら抗体は、標識されているか、又は固体支持体に結合している。
【0041】
好ましくは、前記抗体は、蛍光で標識される。
【0042】
前記固体支持体は、好ましくはマルチウェルプレートである。好ましくは、前記キットは、ＥＬＩＳＡキットである。好ましい実施形態では、本発明の抗体とのインキュベーション後の細胞検出は、フローサイトメトリーによって行われる。
【0043】
本発明はさらに、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための遺伝子診断マーカーとして使用するための、ヌクレオチド配列のエキソン６の１８６，３０４，８６２位に有害変異Ｃ→Ｔが存在することを特徴とする、Ｐｒｇ４遺伝子（Ｇｅｎｅ Ｅｎｓｅｍｂｌｅ ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１１６６９０；配列番号１）のオリゴヌクレオチド配列に関し、前記オリゴヌクレオチド配列は、ＲＮＡ又はＤＮＡである。好ましくは、前記変異オリゴヌクレオチド配列は、配列番号７を含むか、又は配列番号７からなる。
【0044】
本発明の別の目的は、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための遺伝子診断マーカーとして使用するための、上述したＰｒｇ４遺伝子の変異オリゴヌクレオチド配列によってコードされる、変異ＰＲＧ４タンパク質である。特定の好ましい実施形態では、前記変異ＰＲＧ４タンパク質は、配列番号２を含むか、又は配列番号２からなり、１８０位でアミノ酸変化Ｒ→Ｗが生じている。
【0045】
本発明は、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための遺伝子診断マーカーとして使用するための、遺伝子配列のエキソン４の５８，１９３，７３３位に有害変異Ｃ→Ｔが存在することを特徴とする、Ｅｐｘヒト遺伝子（Ｇｅｎｅ Ｅｎｓｅｍｂｌｅ ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１２１０５３；配列番号３）のオリゴヌクレオチド配列に関し、前記オリゴヌクレオチド配列は、ＲＮＡ又はＤＮＡである。好ましくは、前記変異オリゴヌクレオチド配列は、配列番号８を含むか、又は配列番号８からなる。
【0046】
本発明の別の目的は、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための遺伝子診断マーカーとして使用するための、上述したＥｐｘヒト遺伝子の変異オリゴヌクレオチド配列によってコードされる、変異ＥＰＸタンパク質である。特定の好ましい実施形態では、前記変異ＥＰＸタンパク質は、配列番号４を含むか、又は配列番号４からなり、１２２位で変異Ｑ→Ｈが生じている。
【0047】
本発明の別の目的は、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための遺伝子診断マーカーとして使用するための、遺伝子配列のエキソン３の９５，３１６，７７２位に有害変異Ａ→Ｔが存在することを特徴とする、Ｐｏｎ１ヒト遺伝子（ＥＮＳＧ０００００００５４２１；配列番号５）のオリゴヌクレオチド配列に関し、前記オリゴヌクレオチド配列は、ＲＮＡ又はＤＮＡである。好ましくは、前記変異オリゴヌクレオチド配列は、配列番号９を含むか、又は配列番号９からなる。
【0048】
本発明のさらなる目的は、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための遺伝子診断マーカーとして使用するための、上述したＰｏｎ１ヒト遺伝子の変異オリゴヌクレオチド配列によってコードされる、変異ＰＯＮ１タンパク質である。特定の好ましい実施形態では、前記変異ＰＯＮ１タンパク質は、配列番号６を含むか、又は配列番号６からなり、５５位でアミノ酸変化Ｌ→Ｍが生じている。
【0049】
本発明はさらに、生体試料での検出によるヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための、上記の変異オリゴヌクレオチド配列又は変異タンパク質の１つ又は複数の使用に関し、前記生体試料は、血漿、ＰＢＭＣ、全血、血清及び末梢血、又はそれらの組合せからなる群から選択される。
【0050】
さらに、本発明は、ＰＣＲ又はＤＮＡ配列決定による遺伝子分析によって、上記で詳述したＰｒｇ４遺伝子、Ｅｐｘ遺伝子、及びＰｏｎ１遺伝子のオリゴヌクレオチド配列のうちの１つ又は複数の存在を検出するインビトロ方法を提供する。
【0051】
最後に、本発明のさらなる一目的は、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための、上記で詳述したＰｒｇ４遺伝子、Ｅｐｘ遺伝子、及びＰｏｎ１遺伝子のオリゴヌクレオチド配列のうちの１つ又は複数に相補的なプライマー又はプローブを含む、キットである。
【0052】
したがって、代謝経路及び疾患（例えば、ＰＲＧ４、ＰＯＮ１）、アルコール代謝（例えば、ＡＬＤＨ３Ｂ１）、並びにミトコンドリアＴＣＡサイクルの調節不全代謝産物の直接同定（例えば、フマル酸塩）における、ブルガダ症候群患者での調節不全のいくつかのバイオマーカータンパク質の役割を考慮すると、これらの調節不全代謝プロセスとブルガダ症候群との間の因果関係は、本発明の中心的な発見である。ブルガダ症候群患者において変異したいくつかのバイオマーカータンパク質のさらなる同定は、この疾患との因果関係をさらに示唆している。
【0053】
本発明は、ここで、非限定的な例示目的で、その好ましい実施形態によって、添付の図面を特に参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【0054】
【図1】４つの独立したモデル（ＳＶＭ、ＰＬＳ－ＤＡ、ＲＦ、及びＬＲ）による、本発明の１０種類のバイオマーカーのコアセットの精度及びＡＵＣ推定値を示す図である。各モデルでは、各実行において、６７％（２／３）のトレーニング用患者及び３３％（１／３）のテスト用患者の異なるランダムセットを用いて、１００回の実行によるモンテカルロ交差検証（ＭＣＣＶ）を適用した。ＭＣＣＶ法によって得られたＡＵＣ曲線は青色で示され、ここで、ＡＵＣの９５％信頼区間（９５％ＣＩ）は、１００個のＭＣＣＶ試料によって推定される。さらに、ホールドアウト法を用いたＡＵＣ曲線及びＡＵＣ推定値が報告され、ここで、４０９人の対象（７０％）がトレーニング用データセットとして使用され、１７６人の対象（３０％）がテスト用データセットとして使用された。ホールドアウト法により得られたＡＵＣ曲線を赤紫色で示す。
【図2】４つの独立したモデル（ＳＶＭ、ＰＬＳ－ＤＡ、ＲＦ、及びＬＲ）による、本発明のバイオマーカーの拡張セットの精度及びＡＵＣ推定値を示す図である。各モデルでは、各実行において、６７％（２／３）のトレーニング用患者及び３３％（１／３）のテスト用患者の異なるランダムセットを用いて、１００回の実行によるモンテカルロ交差検証（ＭＣＣＶ）を適用した。ＭＣＣＶ法によって得られたＡＵＣ曲線は青色で示され、ここで、ＡＵＣの９５％信頼区間（９５％ＣＩ）は、１００個のＭＣＣＶ試料によって推定される。さらに、ホールドアウト法を用いたＡＵＣ曲線及びＡＵＣ推定値が報告され、ここで、４６５人の対象（７９％）がトレーニング用データセットとして使用され、１２０人の対象（２１％）がテスト用データセットとして使用された。ホールドアウト法により得られたＡＵＣ曲線を赤紫色で示す。
【図3A】ブルガダ症候群の診断のためのバイオマーカーコアセット及び拡張セットに属する、各代謝産物のＰＢＭＣ及び血漿におけるＡＵＣ及びボックスプロットを示す図である。
【図3B】ブルガダ症候群の診断のためのバイオマーカーコアセット及び拡張セットに属する、各タンパク質のＰＢＭＣ及び血漿におけるＡＵＣ及びボックスプロットを示す図である。
【図3C】ブルガダ症候群の診断のためのバイオマーカーコアセット及び拡張セットに属する、各タンパク質のＰＢＭＣ及び血漿におけるＡＵＣ及びボックスプロットを示す図である。
【図3D】ブルガダ症候群の診断のためのバイオマーカーコアセット及び拡張セットに属する、各タンパク質のＰＢＭＣ及び血漿におけるＡＵＣ及びボックスプロットを示す図である。
【図4】ブルガダ症候群におけるＴＣＡサイクルのタンパク質及び代謝産物の調節不全を示す図である。
【図5】ブルガダ症候群におけるＳＬＣ２５Ａ５ミトコンドリアタンパク質及びＶＤＡＣ１ミトコンドリアタンパク質の調節不全を示す図である。ＳＬＣ２５Ａ５タンパク質及びＶＤＡＣ１タンパク質の両方は、ミトコンドリアによるＡＴＰ／ＡＤＰ輸送活性及びエネルギー代謝に不可欠である。
【図6】ブルガダ症候群患者由来の血液ＰＢＭＣにおける９９５種類の調節不全タンパク質のＳＴＲＩＮＧ ｖ１１．０ｂ（https://string-db.org/）に由来するタンパク質間相互作用（ＰＰＩ）ネットワーク（ＦＤＲ≦５％）を示す図であり、これは、「代謝経路」（ＫＥＧＧ）で有意に濃縮された７９種類のタンパク質を示す（ＦＤＲ＝０．０００９９）。
【図7】ＣＹＰ２Ｅ１によるＲＯＳの生成をもたらすエタノール代謝経路の一部であるブルガダ症候群患者における調節不全タンパク質を示す。６０を超える特徴が採用された場合、試験の精度の曲線がプラトーに到達した。
【図8】バイオマーカータンパク質（表２に列挙された拡張セット）をコードする、ＥＰＣ遺伝子、ＰＯＮ１遺伝子、及びＰＲＧ４遺伝子における有害変異の数、並びに各遺伝子に少なくとも１つの機能傷害性の有害変異を有するブルガダ症候群患者の（試験した１８６人のうちの）数を説明するグラフを示す。比較目的のために、ＷＧＳ分析によって試験した１８６人のブルガダ症候群患者において検出されたＳＣＮ５Ａ（すなわち、変異がブルガダ症候群において最も一般的に見られる遺伝子）における、傷害性の有害変異の数を報告した。
【発明を実施するための形態】
【0055】
以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲を限定すると見なされるべきではない。
【0056】
実施例１：試験の精度
精度及びＡＵＣは、４つのＭＬ法：サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）、ランダムフォレスト（ＲＦ）、及びロジスティック回帰分析（ＬＲ）を用いて、バイオマーカーのコアセット及び拡張セットについて独立して推定されており、これらは、非常に類似した一貫性の高い推定値を提供した（図１）。
精度及びＡＵＣは、４つのＭＬ法：サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）、ランダムフォレスト（ＲＦ）、及びロジスティック回帰分析（ＬＲ）を用いて、バイオマーカーのコアセット及び拡張セットについて独立して推定されており、これらは、非常に類似した一貫性の高い推定値を提供した（図１）。
【0057】
精度を評価するために、各実行において、６７％（２／３）のトレーニング用患者及び３３％（１／３）のテスト用患者の異なるランダムセットを用いて、１００回の実行によるモンテカルロ交差検証（ＭＣＣＶ）法を適用した。
【0058】
本発明の１０種類のバイオマーカーのコアセットは、約７４％の全体的な平均精度及び約０．８１の平均曲線下面積（ＡＵＣ）で、任意の対象のＰＢＭＣ／血漿上のブルガダ症候群の疾患の診断を可能にする。
【0059】
バイオマーカーの数を１０（コアセット）から１６（拡張セット）まで増加させることにより、方法全体にわたって、約７４％～約７７％のＰＢＭＣ／血漿集団及び０．８１４～０．８２２のＡＵＣについての試験の全体の精度に達することが可能である（図２）。
【0060】
表４に報告されているように、異なる患者サブグループのＰＢＭＣ／形質細胞集団について１６種類のバイオマーカー（拡張セット）を用いると、試験の全体の精度は７５％～８０％であり、ＡＵＣは０．８３～０．８９である。
【0061】
【表4】
【0062】
したがって、１６種類のバイオマーカーのセット（拡張セット）は、過去におけるブルガダ症候群の家族歴がないヒト（ＡＵＣ約０．８９、精度約７９％）、又は過去におけるＳＣＤの家族歴がないヒト（ＡＵＣ約０．８８、精度約７９％）、又はブルガダ症候群の症状がないヒト（精度約７６％）において、ブルガダ症候群の診断について高い精度及び有意に高いＡＵＣを有する。
【0063】
１６種類のバイオマーカーのセット（拡張セット）は、ＳＣＮ５Ａ遺伝子に変異を有しないブルガダ症候群患者において、高精度（約７６％）及び有意なＡＵＣ（約０．８４）を有する。１６種類のバイオマーカーのセット（拡張セット）は、「若年」患者（ＡＵＣ約０．８７、精度約８１％）及び「高齢」患者（ＡＵＣ約０．８３、精度約７５％）の両方において、ブルガダ症候群の診断に高い精度を有する。
【0064】
セット（コアセット又は拡張セット又は中間セットのいずれか）に属するバイオマーカーの全体的な組合せに関連した陽性結果は、患者が無症候性又は症候性であるという事実とは無関係に、そのような患者がブルガダ症候群に罹患していることを意味する。換言すれば、単一の上方制御された（又は下方制御された）タンパク質又は代謝産物ではなく、上方制御された又は下方制御されたタンパク質又は代謝産物の組合せは、患者が無症候性又は症候性であるという事実とは無関係に、そのような患者がブルガダ症候群に罹患していることを予測する。
【0065】
【0066】
ＦＮ１（フィブロネクチン１）タンパク質は、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための、１０種類のバイオマーカー（コアセット）のうちの１つ、及び１６種類のバイオマーカー（拡張セット）のうちの１つである。ＦＮ１タンパク質レベルは、植込み型除細動器（ＩＣＤ）の存在によって変化することが以前に報告されている［２０］。本発明者らの患者コホート（ｎ＝５８５）では、血漿中のＦＮ１タンパク質レベルは、ＩＣＤを有しないブルガダ患者（ｎ＝２０３）と比較して、２標本コルモゴロフ・スミルノフ検定によりＰ＝０．００１で、ＩＣＤインプラントを有するブルガダ患者（ｎ＝９１）では有意に上昇している（約３倍）。しかしながら、ＩＣＤインプラントを有する全てのブルガダ患者がＦＮ１の一貫して高い発現を有するわけではない。
【0067】
これにもかかわらず、ブルガダ症候群の診断のバイオマーカーとしてのＦＮ１の高い予測能力は、血漿中のＦＮ１タンパク質レベルの増加に関連したブルガダ症候群を有するというオッズ比（ＯＲ）＝１．９５で、ＩＣＤインプラントを有しない患者のサブセット（ｎ＝４９４、精度約６６％、ＡＵＣ＝０．６１４、Ｐ＝１０－５）において保持される。表５は、ＩＣＤインプラントを有する患者、及びＩＣＤインプラントを有しない患者における、ＦＮ１（フィブロネクチン１）バイオマーカーの精度を報告する。
【0068】
【表5】
【0069】
フマル酸塩（フマル酸）の血漿レベルは、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための、１０種類のバイオマーカー（コアセット）のうちの１つ、及び１６種類のバイオマーカー（拡張セット）のうちの１つである。フマル酸塩の血漿レベルの低下は、ブルガダ症候群と有意に関連しており（調整したＰ＝８．２×１０－５）、これは、ブルガダ症候群患者におけるＴＣＡサイクル（トリカルボン酸サイクル）の調節不全を示唆している。ＴＣＡサイクルの関連酵素（ＭＤＨ２、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２；ＩＤＨ２、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ（＋））２；ＡＣＯ１、アコニターゼ１；ＦＨ、フマル酸ヒドラターゼ）及び代謝産物（コハク酸塩、リンゴ酸塩、αケトグルタル酸塩、アコニット酸塩、クエン酸塩）をコードする他のタンパク質は、ブルガダ症候群患者の血液では、有意に調節不全（Ｐ＜０．０５）である。図４を参照されたい。これは、ミトコンドリアにおけるＴＣＡサイクルの全体的な下方制御を示し、ミトコンドリア機能障害をブルガダ症候群に関連付けている。
【0070】
ＴＣＡサイクルは、炭水化物、脂肪、及びタンパク質の代謝をつなぐ重要な代謝経路である。したがって、ブルガダ症候群患者における、フマル酸塩（上記のブルガダ症候群のバイオマーカー、表１、表５）、いくつかの他の代謝産物（ＴＣＡサイクル中間体）、及び核及びミトコンドリアタンパク質（ミトコンドリアにおけるＴＣＡサイクルの酵素）の低下したレベルの同定によれば、さらに好ましい実施形態では、本発明の別の目的は、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のためのミトコンドリア機能障害及び／又はＴＣＡサイクルの調節不全である。
【0071】
別のバイオマーカータンパク質（拡張セット）である、ＡＮＴ２としてもまた公知のＳＬＣ２５Ａ５（溶質輸送体ファミリー２５メンバー５）は、ブルガダ症候群患者由来のＰＢＭＣ（Ｐ＝１．４×１０－８）では有意に下方制御され（平均約４５％）、これは、ミトコンドリア輸送体ファミリーＳＬＣ２５に属する。ＳＬＣ２５Ａ５は、脳、肺、腎臓、膵臓、心臓、骨格筋、脾臓／内膜及びミトコンドリア膜を含む、組織の特定の呼吸活性に依存したレベルで遍在的に発現される、重要なミトコンドリアＡＴＰトランスポータである。ＳＬＣ２５Ａ５は、大部分がミトコンドリア内膜に局在するミトコンドリア輸送体をコードする（図５）；ＳＬＣ２５タンパク質ファミリーは、酸化的リン酸化、ＴＣＡサイクル、脂肪酸酸化、糖新生、脂質生合成、ケトン体の生成及び利用、尿素合成、アミノ酸分解、ミトコンドリアマトリックスにおけるヌクレオチドプール及びデオキシヌクレオチドプールの調節、熱生成を含む、多様な代謝経路に関与している［２１］。内膜ミトコンドリアタンパク質ＳＬＣ２５Ａ５と共に、外膜ミトコンドリアタンパク質ＶＤＡＣ１も、ブルガダ症候群患者由来の血液ＰＢＭＣにおいて有意に下方制御されているようであり、両タンパク質は、ミトコンドリアによるＡＴＰ／ＡＤＰ輸送活性及びエネルギー代謝にとって重要である（図５）。ＶＤＡＣ１レベルは、ブルガダ症候群ではＳＬＣ２５Ａ５のレベルよりも変化が少ない（Ｌｏｇ２ＦＣ＝－０．１３３［ＳＬＣ２５Ａ５］対Ｌｏｇ２ＦＣ＝－０．０３３［ＶＤＡＣ１］）にもかかわらず、ミトコンドリア外膜でのＶＤＡＣ１の位置により、１００種類を超えるタンパク質と相互作用し、いくつかのシグナル伝達経路を介してミトコンドリア活性と細胞活性との相互作用を統合させる［２２］。
【0072】
ブルガダ症候群におけるＳＬＣ２５Ａ５及びＶＤＡＣ１ミトコンドリアタンパク質の両方の下方制御は、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のためのミトコンドリア機能障害の本発明の別の目的である。
【0073】
ブルガダ症候群患者由来の血液ＰＢＭＣにおいて調節不全であるタンパク質の機能分析（ｎ＝９９５タンパク質、偽発見率（ＦＤＲ）≦５％）により、代謝に関与する７９種類のタンパク質（ＣＯＸ１５、ＮＡＮＳ、ＨＭＯＸ１、ＭＴＨＦＤ１、ＮＡＭＰＴ、ＰＯＬＲ３Ｂ、ＧＡＰＤＨ、ＴＰＩ１、ＧＯＴ２、ＬＡＭＡ５、ＰＩ４ＫＡ、ＮＴ５Ｅ、ＧＮＳ，ＬＰＣＡＴ２、ＤＧＵＯＫ、ＢＳＴ１、ＰＡＰＳＳ１、ＨＥＸＡ、ＩＭＰＡ２、ＰＧＤ、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＬＰＣＡＴ１、ＲＰＩＡ、ＡＴＰ５Ｇ３、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ１、ＰＣＹＴ１Ａ、ＡＧＬ、ＲＰＮ１、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＤＵＦＢ８、ＡＴＰ５Ｌ、ＣＨＳＹ３、ＧＵＳＢ、ＤＴＹＭＫ、ＧＡＡ、ＡＳＬ、ＰＡＮＫ２、ＧＹＳ１、ＢＣＫＤＨＢ、ＰＫＭ、ＭＤＨ２、ＮＤＵＦＶ２、ＩＤＨ２、ＳＨＭＴ２、ＡＣＳＬ４、ＡＲＧ１、ＲＥＶ３Ｌ、ＡＤＳＳ、ＳＤＨＣ、ＤＰＹＤ、ＰＧＡＭ１、ＰＬＣＥ１、ＡＫＲ１Ａ１、ＰＧＫ１、ＡＤＯ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＡＬＯＸ５、ＣＤＡ、ＰＳＡＴ１、ＵＱＣＲＱ、ＸＤＨ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＰＦＫＰ、ＢＰＧＭ、Ｇ６ＰＤ、ＰＬＡ２Ｇ４Ｆ、ＨＬＣＳ、ＨＰＳＥ、ＣＨＫＢ、ＳＭＳ、ＩＤＨ１、ＮＡＰＲＴ、ＣＰＳ１、ＩＴＰＫＢ、ＧＡＬＫ１、ＰＬＣＧ２、ＰＬＣＢ２、ＡＬＤＨ３Ｂ１）の有意な濃縮が同定された（代謝経路（ＫＥＧＧ、https://www.genome.jp/kegg/）、ｈｓａ０１１００）、ＦＤＲ＝９．９×１０－４）。図６を参照されたい。これは、臨床レベルで観察される代謝異常と一致している、ブルガダ症候群患者における代謝プロセスの調節不全を示唆している。
【0074】
代謝に重要なこれらのタンパク質のうち、ＰＬＣＢ２タンパク質及びＡＬＤＨ３Ｂ１タンパク質もまた、ブルガダ症候群のバイオマーカー（コアセット及び拡張セット）の一部である（上記の表２～表３、図３を参照されたい）。
【0075】
ＰＬＣＢ２（ホスホリパーゼＣβ２）タンパク質は、主に形質膜及びサイトゾルに局在し、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための、１６のバイオマーカー（拡張セット）のうちの１つである。対照と比較して、ＰＬＣＢ２タンパク質レベルは、ブルガダ症候群患者の血液ＰＢＭＣにおいて有意に上昇している（Ｌｏｇ２ＦＣ＝０．０７３、Ｐ＝３．３×１０－６）。ＰＬＣＢは、イノシトール脂質を代謝する重要な酵素であり、かつ細胞の増殖及び移動性を含む一連の細胞プロセスを調節する複数の膜貫通シグナル伝達経路において極めて重要な役割を有する、ＰＬＣタンパク質ファミリーに属する［２３］。ＰＬＣＢファミリーは、それらの一次構造を共有する４つのアイソザイムＰＬＣＢ１～Ｂ４からなり、ＰＬＣＢ１は、ｂ細胞インスリン分泌を調節する重要な分子であり、かつ真性糖尿病における治療的介入の候補と考えることができる［２４］。しかしながら、真性糖尿病におけるＰＬＣＢ２の役割に関するデータは入手できず、ブルガダ症候群におけるＰＬＣＢ２の機能は新規であり、本発明の目的であることを示唆している。
【0076】
ＡＬＤＨ３Ｂ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ３ファミリーメンバーＢ１）タンパク質は、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のための１６種類のバイオマーカー（拡張セット）のうちの１つである。対照と比較して、ＡＬＤＨ３Ｂ１タンパク質レベルは、ブルガダ症候群患者の血液ＰＢＭＣにおいて有意に上昇している（Ｌｏｇ２ＦＣ＝０．１０５、Ｐ＝２．４ｘ１０－８）。アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）は、対応するカルボン酸への酸化によって毒性アルデヒドを解毒する。長鎖脂肪族アルデヒドは、主に、エーテルグリセロ脂質、脂肪アルコール、スフィンゴ脂質などのいくつかの脂質の異化代謝によって生成される。ヘキサナール、オクタナール、及び４－ヒドロキシ－２－ノネナール（４ＨＮＥ）などの中鎖脂肪族アルデヒドは、酸化ストレス中の脂質過酸化によって生成され、ＡＬＤＨ３Ｂ１は、中鎖アルデヒド及び長鎖アルデヒドの両方を酸化することができる。ヘキサデカナール（ＨＸＡＬ）などのＣ１６アルデヒドは、通常、形質膜上のスフィンゴ脂質代謝によって産生され、パルミチン酸（ＰＡＬＭ）に酸化され得る。４ＨＮＥは、他の反応性中鎖アルデヒドの中でも、４－ヒドロキシノネン酸（４ＨＮＡ）への酸化を介してＡＬＤＨ３Ｂ１によって解毒され得るので、したがって、酸化ストレスに対するＡＬＤＨ３Ｂ１の潜在的な生理学的役割を示している。したがって、ＡＬＤＨ３Ｂ１は、アルコール代謝及び脂質過酸化によって産生されるアルデヒドの解毒において主要な役割を果たす［２５］。アルコール中毒とは、ブルガダ症候群の潜在的に過小評価されているが重要な原因である；したがって、ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のためのバイオマーカーとしてのＡＬＤＨ３Ｂ１の同定は、調節不全のアルコール代謝とブルガダ症候群との関連性をさらに示し、本発明の別の目的である。
【0077】
ブルガダ症候群患者由来の血液ＰＢＭＣにおいて調節不全である他のタンパク質は、アルコール代謝をブルガダ症候群に結び付ける。「ＣＹＰ２Ｅ１によるＲＯＳの生成をもたらすエタノール代謝（ＷＰ４２６９）」の有意な濃縮が同定されており（図７参照）、ここで、ＣＹＰ２Ｅ１誘導による酸化ストレスの増加は、エタノール媒介性肝毒性の主な結果であることが知られている［２６］。経路にとって重要であるブルガダ症候群で調節不全な３種類のタンパク質は、ＭＡＰＫ１（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ１）、ＭＡＰＫ２（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ２）、及びＰＲＫＣＱ（プロテインキナーゼＣθ）である。図７を参照されたい。
【0078】
全てのタンパク質（ｎ＝ＰＢＭＣ中９９５種類のタンパク質、ＦＤＲ≦５％；ｎ＝血漿中２５種類のタンパク質、ＦＤＲ≦５％）、及び代謝産物（ｎ＝血漿中２７５種類の代謝産物、ＦＤＲ≦５％）の統合機能分析により、ブルガダ症候群患者由来の血液中で調節不全が認められ、有意なタンパク質－代謝産物相互作用ネットワークが同定された（図８）。このネットワークは、Human Metabolome Database（ＨＭＤＢ）（現在、１１４，１００種類の代謝産物及び５，７７９種類のタンパク質を網羅）［２７］、及びＳＴＩＴＣＨデータベース（現在、９，６４３，７６３種類のタンパク質、４３００００種類の化学物質、１６億種類の相互作用を網羅）［２８］からのタンパク質と代謝産物との間の機能的相互作用の既存の知識を用いることによって誘導される。
【0079】
ネットワークは、７種類の代謝産物（Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸；Ｌ－アスパラギン酸；尿酸、Ｌ－アラニン、コリン、タウロリトコール酸３－硫酸）、及び１種類のタンパク質（ＡＢＣＢ）を含む、「アラニン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸の代謝」経路について有意に濃縮されており（Ｐ＝３．２×１０－９）、これらは全て、ブルガダ症候群患者において調節不全である。
【0080】
ネットワークの中心的な「ハブ」ノードは、細胞内ＮＡＤ（Ｈ）酸化還元バランスにおいて重要な役割を果たす、リンゴ酸－アスパラギン酸シャトル（ＭＡＳ）のメンバーであるＧＯＴ２（グルタミン酸－オキサロ酢酸トランスアミナーゼ２）（ミトコンドリア内アイソフォーム）である。リンゴ酸アスパラギン酸シャトルは、ミトコンドリアリンゴ酸デヒドロゲナーゼＭＤＨ２を含む様々な成分の協調作用を必要とし、これもまた、ブルガダ症候群患者では調節不全である。図８を参照されたい。したがって、同じタンパク質－代謝産物相互作用ネットワークにおいて同定されたＧＯＴ２タンパク質及びＭＤＨ２タンパク質の両方が、ミトコンドリアとサイトゾルとの間のリンゴ酸－アスパラギン酸代謝産物交換及びアミノ酸代謝に不可欠である。ブルガダ症候群患者におけるＧＯＴ２タンパク質及びＭＤＨ２タンパク質の調節不全と一致して、リンゴ酸代謝産物もまた、対照と比較してブルガダ症候群患者において調節不全である（減少している）（Ｌｏｇ２ＦＣ＝－０．１２、Ｐ＝２．６×１０－５）。図４を参照されたい。ミトコンドリアリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ２）をコードする遺伝子の変異及びグルタミン酸－オキサロ酢酸トランスアミナーゼ２（ＧＯＴ２）をコードする遺伝子の変異に起因するＭＡＳの欠陥が記載されている［２９］。したがって、ブルガダ症候群患者において調節不全のＧＯＴ２タンパク質及びＭＤＨ２タンパク質の両方の同定は、ブルガダ症候群における調節不全ＭＡＳの間の関連性をさらに示し、かつこれは本発明の別の目的である。
【0081】
実施例２：本発明のブルガダ症候群のバイオマーカーのセットのマルチオミクス同定
材料及び方法
倫理に関する声明
ヒト参加者を含む研究で行われた全ての処置は、施設及び／又は国家研究会議（ｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の倫理基準、並びにヘルシンキ宣言及びその後の改正又は同等の倫理基準に従った。研究デザインは、San Raffaele Hospital（プロトコルベース－バージョン０７／０１／２００４）の倫理委員会によって検討された。
材料及び方法
倫理に関する声明
ヒト参加者を含む研究で行われた全ての処置は、施設及び／又は国家研究会議（ｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の倫理基準、並びにヘルシンキ宣言及びその後の改正又は同等の倫理基準に従った。研究デザインは、San Raffaele Hospital（プロトコルベース－バージョン０７／０１／２００４）の倫理委員会によって検討された。
【0082】
患者登録
集団研究は、ブルガダ（ＢｒＧ）群及び対照（ＣＧ）群の２つの群（対象３００人／群）で構成されている。予想される登録期間は２４ヶ月であった。
集団研究は、ブルガダ（ＢｒＧ）群及び対照（ＣＧ）群の２つの群（対象３００人／群）で構成されている。予想される登録期間は２４ヶ月であった。
【0083】
・全血球数、肝臓、甲状腺、及び凝固機能を含む、ベースライン臨床検査
・経胸壁ＥＣＧ
について患者を評価した。
・経胸壁ＥＣＧ
について患者を評価した。
【0084】
２つの群の選択／除外基準はそれぞれ以下のとおりであった。
・ブルガダ群：１８歳超で、アジュマリン試験が陽性であるか、又はＳＣＤのリスクが高く、かつ心外膜アブレーションを受けていると考えられる、全ての継続的なブルガダ症候群患者をこの研究に登録する。
・対照群：ブルガダ症候群の非存在を裏付けるアジュマリン試験陰性である構造的に正常な心臓を持つ患者の集団。
・ブルガダ群：１８歳超で、アジュマリン試験が陽性であるか、又はＳＣＤのリスクが高く、かつ心外膜アブレーションを受けていると考えられる、全ての継続的なブルガダ症候群患者をこの研究に登録する。
・対照群：ブルガダ症候群の非存在を裏付けるアジュマリン試験陰性である構造的に正常な心臓を持つ患者の集団。
【0085】
対照群の選択基準：
・年齢＞１８歳
・アジュマリンン試験に裏付けられるブルガダ症候群の非存在
・年齢＞１８歳
・アジュマリンン試験に裏付けられるブルガダ症候群の非存在
【0086】
対照群の除外基準：
・駆出率＜５５％
・血行再建を必要とする冠動脈疾患
・過去における心臓手術
・心臓弁膜症に対する最近の外科的／経皮的介入（６ヶ月以内）
・平均余命＜１年
・処置及び研究に対する同意を得ることができない。
・駆出率＜５５％
・血行再建を必要とする冠動脈疾患
・過去における心臓手術
・心臓弁膜症に対する最近の外科的／経皮的介入（６ヶ月以内）
・平均余命＜１年
・処置及び研究に対する同意を得ることができない。
【0087】
血漿のメタボローム分析
試料は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙの自動化ＭｉｃｒｏＬａｂ ＳＴＡＲ（登録商標）システムを用いて調製した。ＱＣ目的のための抽出プロセスの第１の工程の前に、いくつかの回収標準を追加した。タンパク質を除去し、タンパク質に結合したか又は沈殿したタンパク質マトリックスに捕捉された小分子を解離させ、化学的に多様な代謝産物を回収するために、タンパク質を２分間激しく振盪しながらメタノールで沈殿させ（Ｇｌｅｎ Ｍｉｌｌｓ ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ ２０００）、続いて遠心分離した。得られた抽出物を５つの画分へと分けた：２つは正イオンモードエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いた２つの別個の逆相（ＲＰ）／ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法による分析用であり、１つは負イオンモードＥＳＩを用いたＲＰ／ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析用であり、１つは負イオンモードＥＳＩを用いたＨＩＬＩＣ／ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析用であり、１つの試料はバックアップ用に保存した。試料を、ＴｕｒｂｏＶａｐ（登録商標）（Ｚｙｍａｒｋ）に短時間配置して、有機溶媒を除去した。試料抽出物を窒素下において一晩保存した後、分析のために調製した。
試料は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙの自動化ＭｉｃｒｏＬａｂ ＳＴＡＲ（登録商標）システムを用いて調製した。ＱＣ目的のための抽出プロセスの第１の工程の前に、いくつかの回収標準を追加した。タンパク質を除去し、タンパク質に結合したか又は沈殿したタンパク質マトリックスに捕捉された小分子を解離させ、化学的に多様な代謝産物を回収するために、タンパク質を２分間激しく振盪しながらメタノールで沈殿させ（Ｇｌｅｎ Ｍｉｌｌｓ ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ ２０００）、続いて遠心分離した。得られた抽出物を５つの画分へと分けた：２つは正イオンモードエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いた２つの別個の逆相（ＲＰ）／ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法による分析用であり、１つは負イオンモードＥＳＩを用いたＲＰ／ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析用であり、１つは負イオンモードＥＳＩを用いたＨＩＬＩＣ／ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析用であり、１つの試料はバックアップ用に保存した。試料を、ＴｕｒｂｏＶａｐ（登録商標）（Ｚｙｍａｒｋ）に短時間配置して、有機溶媒を除去した。試料抽出物を窒素下において一晩保存した後、分析のために調製した。
【0088】
ＱＡ／ＱＣ
実験試料と協調していくつかのタイプの対照を分析した。少量の各実験試料を取得することによって産生されたプールされたマトリックス試料（又は代替的に、充分に特徴付けられたヒト血漿のプールの使用）は、データセット全体を通して技術的複製として機能し；抽出水試料はプロセスブランクとして機能し；かつ、内因性化合物の測定を妨害しないように慎重に選択されたＱＣ標準のカクテルを分析された全ての試料に添加して、機器の性能モニタリングを可能にし、クロマトグラフィーアライメントを支援した。
実験試料と協調していくつかのタイプの対照を分析した。少量の各実験試料を取得することによって産生されたプールされたマトリックス試料（又は代替的に、充分に特徴付けられたヒト血漿のプールの使用）は、データセット全体を通して技術的複製として機能し；抽出水試料はプロセスブランクとして機能し；かつ、内因性化合物の測定を妨害しないように慎重に選択されたＱＣ標準のカクテルを分析された全ての試料に添加して、機器の性能モニタリングを可能にし、クロマトグラフィーアライメントを支援した。
【0089】
以下の表６及び表７は、分析に用いられたＭｅｔａｂｏｌｏｎ ＱＣ試料及び標準について記載する。
【0090】
【表6】
【0091】
【表7】
【0092】
質量分析計に注入する前に各試料へと添加した標準物質の中央値相対標準偏差（ＲＳＤ）を計算することによって、機器の変動性を決定した。全体的なプロセス変動性を、プールされたマトリックス試料の１００％に存在する全ての内因性代謝産物（すなわち、非機器標準）の中央値ＲＳＤを計算することによって決定した。実験試料は、図１に概説されるように、注入間で均等に間隔を置いたＱＣ試料を用いてプラットフォーム実行にわたってランダム化した。図１は、クライアント特有の技術的複製物の調製を示し、ここで、各クライアント試料（着色シリンダ）の少量アリコートをプールして、ＣＭＴＲＸ技術的複製試料（多色シリンダ）を作製し、次いで、これをプラットフォーム実行全体にわたって周期的に注入する。一貫して検出された生化学物質間の変動性を使用して、全体的なプロセス及びプラットフォームの変動性の推定値を計算することができる。
【0093】
超高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）
全ての方法は、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ－ＩＩ）源及び３５，０００質量分解能で動作するＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計とインターフェースされた、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）及びＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ高分解能／精密質量分析計を利用した。試料抽出物を乾燥させ、次いで、４つの方法の各々に適合する溶媒中で再構成した。各再構成溶媒は、注入及びクロマトグラフィーの一貫性を確保するために、固定濃度で一連の標準を含有していた。酸性正イオン条件を用いて１つのアリコートを分析し、より親水性の高い化合物についてクロマトグラフィーにより最適化した。この方法では、抽出物を、０．０５％パーフルオロペンタン酸（ＰＦＰＡ）及び０．１％ギ酸（ＦＡ）を含有する水及びメタノールを用いて、Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８－２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）から勾配溶出した。酸性正イオン条件を用いて別のアリコートもまた分析したが、しかしながら、より疎水性の化合物についてクロマトグラフィーにより最適化した。この方法では、抽出物を、メタノール、アセトニトリル、水、０．０５％ＰＦＰＡ、及び０．０１％ＦＡを用いて、前述同様のＣ１８カラムから勾配溶出し、かつ全体的により高い有機含有量で操作した。別のアリコートを、別個の専用Ｃ１８カラムを用いて塩基性負イオン最適化条件を用いて分析した。塩基性抽出物を、メタノール及び水を用いてカラムから勾配溶出したが、しかしながら、ｐＨ８で６．５ｍＭ重炭酸アンモニウムを使用した。第４のアリコートを、ＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＢＥＨアミド２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ）からの溶出後の負イオン化を介して、１０ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ１０．８を含む水及びアセトニトリルからなる勾配を用いて分析した。ＭＳ分析は、動的排除を用いてＭＳスキャンとデータ依存性ＭＳｎスキャンとを交互に行った。スキャン範囲は、方法間で緩やかに変化したが、７０～１０００ｍ／ｚを網羅した。生データファイルは、以下に説明するようにアーカイブ及び抽出される。
全ての方法は、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ－ＩＩ）源及び３５，０００質量分解能で動作するＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計とインターフェースされた、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）及びＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ高分解能／精密質量分析計を利用した。試料抽出物を乾燥させ、次いで、４つの方法の各々に適合する溶媒中で再構成した。各再構成溶媒は、注入及びクロマトグラフィーの一貫性を確保するために、固定濃度で一連の標準を含有していた。酸性正イオン条件を用いて１つのアリコートを分析し、より親水性の高い化合物についてクロマトグラフィーにより最適化した。この方法では、抽出物を、０．０５％パーフルオロペンタン酸（ＰＦＰＡ）及び０．１％ギ酸（ＦＡ）を含有する水及びメタノールを用いて、Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８－２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）から勾配溶出した。酸性正イオン条件を用いて別のアリコートもまた分析したが、しかしながら、より疎水性の化合物についてクロマトグラフィーにより最適化した。この方法では、抽出物を、メタノール、アセトニトリル、水、０．０５％ＰＦＰＡ、及び０．０１％ＦＡを用いて、前述同様のＣ１８カラムから勾配溶出し、かつ全体的により高い有機含有量で操作した。別のアリコートを、別個の専用Ｃ１８カラムを用いて塩基性負イオン最適化条件を用いて分析した。塩基性抽出物を、メタノール及び水を用いてカラムから勾配溶出したが、しかしながら、ｐＨ８で６．５ｍＭ重炭酸アンモニウムを使用した。第４のアリコートを、ＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＢＥＨアミド２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ）からの溶出後の負イオン化を介して、１０ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ１０．８を含む水及びアセトニトリルからなる勾配を用いて分析した。ＭＳ分析は、動的排除を用いてＭＳスキャンとデータ依存性ＭＳｎスキャンとを交互に行った。スキャン範囲は、方法間で緩やかに変化したが、７０～１０００ｍ／ｚを網羅した。生データファイルは、以下に説明するようにアーカイブ及び抽出される。
【0094】
データ抽出及び化合物同定
生データを抽出し、ピーク同定し、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎのハードウェア及びソフトウェアを用いてＱＣを処理した。化合物を、精製標準又は回帰未知実体のライブラリーエントリーとの比較によって同定した。Ｍｅｔａｂｏｌｏｎは、ライブラリー中に存在する全ての分子に関する、保持時間／指数（ＲＩ）、質量電荷比（ｍ／ｚ）、及びクロマトグラフィーデータ（ＭＳ／ＭＳスペクトルデータを含む）を含有する、認証標準に基づくライブラリーを維持する。さらに、生化学的同定は、提案された同定の狭いＲＩウィンドウ内の保持指数、ライブラリー±１０ｐｐｍとの正確な質量一致、並びに実験データと真正標準との間のＭＳ／ＭＳフォワードスコア及びリバーススコアの３つの基準に基づく。ＭＳ／ＭＳスコアは、実験スペクトルに存在するイオンとライブラリースペクトルに存在するイオンとの比較に基づく。これらの因子の１つに基づいてこれらの分子間に類似性があり得るが、一方で３つ全てのデータ点の使用を利用して、生化学を区別及び識別することができる。３３００を超える市販の精製標準化合物が取得され、それらの分析特性を決定するための全てのプラットフォームでの分析に登録されている。構造的に名前が付けられていない生化学物質については、追加の質量スペクトルエントリーが作製されており、これらは、反復的な性質（クロマトグラフィー及び質量スペクトルの両方）によって同定されている。これらの化合物は、マッチング精製標準の将来の取得によって、又は古典的な構造分析によって同定される可能性を有する。
生データを抽出し、ピーク同定し、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎのハードウェア及びソフトウェアを用いてＱＣを処理した。化合物を、精製標準又は回帰未知実体のライブラリーエントリーとの比較によって同定した。Ｍｅｔａｂｏｌｏｎは、ライブラリー中に存在する全ての分子に関する、保持時間／指数（ＲＩ）、質量電荷比（ｍ／ｚ）、及びクロマトグラフィーデータ（ＭＳ／ＭＳスペクトルデータを含む）を含有する、認証標準に基づくライブラリーを維持する。さらに、生化学的同定は、提案された同定の狭いＲＩウィンドウ内の保持指数、ライブラリー±１０ｐｐｍとの正確な質量一致、並びに実験データと真正標準との間のＭＳ／ＭＳフォワードスコア及びリバーススコアの３つの基準に基づく。ＭＳ／ＭＳスコアは、実験スペクトルに存在するイオンとライブラリースペクトルに存在するイオンとの比較に基づく。これらの因子の１つに基づいてこれらの分子間に類似性があり得るが、一方で３つ全てのデータ点の使用を利用して、生化学を区別及び識別することができる。３３００を超える市販の精製標準化合物が取得され、それらの分析特性を決定するための全てのプラットフォームでの分析に登録されている。構造的に名前が付けられていない生化学物質については、追加の質量スペクトルエントリーが作製されており、これらは、反復的な性質（クロマトグラフィー及び質量スペクトルの両方）によって同定されている。これらの化合物は、マッチング精製標準の将来の取得によって、又は古典的な構造分析によって同定される可能性を有する。
【0095】
キュレーション
様々なキュレーション手順を実行して、高品質のデータセットが統計分析及びデータ解釈に利用可能になることを確実にした。ＱＣ及びキュレーションプロセスは、真の化学成分の正確かつ一貫した同定を確実にし、並びにシステムアーチファクト、誤割り当て、及びバックグラウンドノイズを表すものを除去するようにデザインされた。各化合物のライブラリーマッチを各試料についてチェックし、必要に応じて補正した。
様々なキュレーション手順を実行して、高品質のデータセットが統計分析及びデータ解釈に利用可能になることを確実にした。ＱＣ及びキュレーションプロセスは、真の化学成分の正確かつ一貫した同定を確実にし、並びにシステムアーチファクト、誤割り当て、及びバックグラウンドノイズを表すものを除去するようにデザインされた。各化合物のライブラリーマッチを各試料についてチェックし、必要に応じて補正した。
【0096】
代謝産物定量化及びデータ正規化
曲線下面積を用いてピークを定量化した。複数日にわたる研究のために、データ正規化工程を実施して、機器の日間調整差から生じる変動を補正した。本質的に、各化合物は、中央値を等しくなるように記録し（１．００）、各データ点を比例的に正規化することによって、実行日ブロックで補正された（「ブロック補正」と称される）。１日を超える分析を必要としなかった研究では、データの視覚化の目的以外では正規化は必要ない。特定の例では、生化学データは、各試料中に存在する材料の量の違いに起因する代謝産物レベルの違いを説明するために、追加の因子（例えば、細胞数、ブラッドフォードアッセイによって決定される総タンパク質、重量オスモル濃度など）に対して正規化されている可能性がある。
曲線下面積を用いてピークを定量化した。複数日にわたる研究のために、データ正規化工程を実施して、機器の日間調整差から生じる変動を補正した。本質的に、各化合物は、中央値を等しくなるように記録し（１．００）、各データ点を比例的に正規化することによって、実行日ブロックで補正された（「ブロック補正」と称される）。１日を超える分析を必要としなかった研究では、データの視覚化の目的以外では正規化は必要ない。特定の例では、生化学データは、各試料中に存在する材料の量の違いに起因する代謝産物レベルの違いを説明するために、追加の因子（例えば、細胞数、ブラッドフォードアッセイによって決定される総タンパク質、重量オスモル濃度など）に対して正規化されている可能性がある。
【0097】
血漿のリピドミクス分析
Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＵＳＡにより、リピドミクス分析が行われた。Lofgren et al.［１９］の方法に従って自動ＢＵＭＥ抽出を用いて、重水素化内部標準の存在下で血漿から脂質を抽出した。抽出物を窒素下において乾燥させ、酢酸アンモニウムジクロロメタン：メタノール中で再構成した。
Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＵＳＡにより、リピドミクス分析が行われた。Lofgren et al.［１９］の方法に従って自動ＢＵＭＥ抽出を用いて、重水素化内部標準の存在下で血漿から脂質を抽出した。抽出物を窒素下において乾燥させ、酢酸アンモニウムジクロロメタン：メタノール中で再構成した。
【0098】
抽出物を注入ＭＳ分析のためにバイアルに移し、ｎａｎｏ ＰＥＥＫ ｔｕｂｉｎｇ及びＳｃｉｅｘ ＳｅｌｅｘＩｏｎ－５５００ ＱＴＲＡＰを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣで実施した。ポジティブモードエレクトロスプレー及びネガティブモードエレクトロスプレーの両方を介して試料を分析した。５５００ＱＴＲＡＰを、合計で１，１００を超えるＭＲＭを用いてＭＲＭモードで操作した。
【0099】
個々の脂質種を、割り当てられた内部標準のシグナル強度に対する各標的化合物のシグナル強度の比率を取得し、次いで、試料に添加された内部標準の濃度を乗じることによって、定量化した。脂質クラス濃度は、クラス内の全ての分子種の合計から計算し、脂肪酸組成は、個々の脂肪酸に含まれる各クラスの割合を計算することによって決定した。
【0100】
血漿及びＰＢＭＣに対するプロテオミクス分析
Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ，ＵＳＡにより、血漿及びＰＢＭＣ試料についてのプロテオミクス分析が行われた。血漿試料から上位１４の高存在量タンパク質を枯渇させて、低存在量タンパク質の検出可能性を改善した。１１－ｐｌｅｘのＴＭＴ標識プロテオミクスアプローチを利用して、各バッチの異なる試料にわたる定量的プロテオミクス情報を明らかにした。
Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ，ＵＳＡにより、血漿及びＰＢＭＣ試料についてのプロテオミクス分析が行われた。血漿試料から上位１４の高存在量タンパク質を枯渇させて、低存在量タンパク質の検出可能性を改善した。１１－ｐｌｅｘのＴＭＴ標識プロテオミクスアプローチを利用して、各バッチの異なる試料にわたる定量的プロテオミクス情報を明らかにした。
【0101】
従来の試料調製を行い、１２００個の臨床検体の各々からペプチドーム試料を産生した。各試料をマルチプレックス定量的プロテオミクスアッセイに割り当て、全てのマルチプレックス定量的アッセイは、この研究全体を通して観察されると予想される異なるプロテオームの完全なプロファイルを最も良好に表すために、１００個のランダムに選択された疾患試料と対照試料とを組み合わせることによって、プロジェクトの開始時に作製される同じ参照試料を共有している。大規模定量的プロテオミクスアッセイを最先端のＨＰＬＣ及びＬＣＭＳ機器で実施し、分析結果及び生データを生データ転送のさらなる合意の下で提供した。
【0102】
化学物質及び試薬
ＴＣＥＰ（ＴＣＥＰ（トリス－（２－カルボキシエチル）ホスフィン）はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から購入した。ＬｙｓＣ及びトリプシンプロテアーゼはＰｒｏｍｅｇａ（Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）から購入した。試料調製用のＣ１８カートリッジ、並びにｂＲＰＬＣ及び三連四重極型質量分析計のオンラインＨＰＬＣ用のクロマトグラフィーカラムは、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から購入した。アセトニトリルをＪＴ Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入し、ギ酸をＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）から得た。ＭｙＰｒｏ－Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ、ＭｙＰｒｏ－Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ、及びＭｙＰｒｏ－Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩを、Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ，ＵＳＡ）によって利用した。他の全ての試薬は、特に明記しない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から購入した。
ＴＣＥＰ（ＴＣＥＰ（トリス－（２－カルボキシエチル）ホスフィン）はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から購入した。ＬｙｓＣ及びトリプシンプロテアーゼはＰｒｏｍｅｇａ（Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）から購入した。試料調製用のＣ１８カートリッジ、並びにｂＲＰＬＣ及び三連四重極型質量分析計のオンラインＨＰＬＣ用のクロマトグラフィーカラムは、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から購入した。アセトニトリルをＪＴ Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入し、ギ酸をＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）から得た。ＭｙＰｒｏ－Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ、ＭｙＰｒｏ－Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ、及びＭｙＰｒｏ－Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩを、Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ，ＵＳＡ）によって利用した。他の全ての試薬は、特に明記しない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から購入した。
【0103】
クロマトグラフィー溶液の調製
ｂＲＰＬＣ溶媒Ａは、１０ｍＭ ＴＥＡＢＣを含有し；ｂＲＰＬＣ溶媒Ｂは、１０ｍＭ ＴＥＡＢＣ、９０％（体積／体積）アセトニトリルを含有し；ＳＲＭ質量分析溶媒Ａは、０．１％（体積／体積）ギ酸を有する水で構成され；ＳＲＭ溶媒Ｂは、０．１％（体積／体積）ギ酸を含むアセトニトリルであった。
ｂＲＰＬＣ溶媒Ａは、１０ｍＭ ＴＥＡＢＣを含有し；ｂＲＰＬＣ溶媒Ｂは、１０ｍＭ ＴＥＡＢＣ、９０％（体積／体積）アセトニトリルを含有し；ＳＲＭ質量分析溶媒Ａは、０．１％（体積／体積）ギ酸を有する水で構成され；ＳＲＭ溶媒Ｂは、０．１％（体積／体積）ギ酸を含むアセトニトリルであった。
【0104】
血漿試料枯渇
血漿中における、上位１４の最も豊富なタンパク質（アルブミン、ＩｇＧ、α２－アンチトリプシン、ＩｇＡ、ＩｇＭ、トランスフェリン、ハプトグロビン、α２マクログロブリン、フィブリノーゲン、補体Ｃ３、α１－酸性糖タンパク質（オロソムコイド）、ＨＤＬ（アポリポタンパク質Ａ－Ｉ及びＡ－ＩＩ）、及びＬＤＬ（主に、アポリポタンパク質Ｂ））を、Ｓｅｐｐｒｏ ＩｇＹ１４カラムシステムを用いて枯渇させた。血漿試料を、ＩｇＹ希釈緩衝液で５倍希釈し、濾過し（０．２２μｍ）、次いで、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムに取り付けられたＩｇＹ ＬＣ１０カラムへと注入した。未保持の画分を収集した。
血漿中における、上位１４の最も豊富なタンパク質（アルブミン、ＩｇＧ、α２－アンチトリプシン、ＩｇＡ、ＩｇＭ、トランスフェリン、ハプトグロビン、α２マクログロブリン、フィブリノーゲン、補体Ｃ３、α１－酸性糖タンパク質（オロソムコイド）、ＨＤＬ（アポリポタンパク質Ａ－Ｉ及びＡ－ＩＩ）、及びＬＤＬ（主に、アポリポタンパク質Ｂ））を、Ｓｅｐｐｒｏ ＩｇＹ１４カラムシステムを用いて枯渇させた。血漿試料を、ＩｇＹ希釈緩衝液で５倍希釈し、濾過し（０．２２μｍ）、次いで、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムに取り付けられたＩｇＹ ＬＣ１０カラムへと注入した。未保持の画分を収集した。
【0105】
タンパク質調製
溶液中枯渇血漿試料又はＰＢＭＣ細胞を、改良「濾過支援試料調製」（ＦＡＳＰ）法を用いる、Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ，ＵＳＡ）によってさらに処理した。簡潔には、タンパク質試料を９Ｍ ＵＲＥＡ中に懸濁し、次いで、５ｍＭ ＴＣＥＰを用いて６０℃で１５分間還元し、還元システインを１０ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を用いて２５℃で１時間ブロックした。次いで、タンパク質試料（１００μｇタンパク質）を、Ａｍｉｃｏｎ Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、９Ｍ尿素で３回、及びＭｙＰｒｏ－Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）で２回洗浄した。次いで、試料を、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）で１２時間にわたり３７℃にてタンパク質分解した。次いで、ペプチド溶液を、１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加することによって酸性化し、室温で１５分間インキュベートした。Ｓｅｐ－Ｐａｋ ｌｉｇｈｔ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、５ｍＬの１００％（体積／体積）アセトニトリルを負荷することによって活性化し、３．５ｍＬの０．１％ＴＦＡ溶液によって２回洗浄した。酸性化消化ペプチド溶液を、１，８００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清をカートリッジに充填した。カートリッジに結合したペプチドを脱塩するために、１ｍＬ、３ｍＬ、及び４ｍＬの０．１％ＴＦＡを順次使用した。カートリッジからペプチドを溶出するために、０．１％ＴＦＡを含む２ｍＬの４０％（体積／体積）アセトニトリルを使用し、この溶出を、（合計６ｍＬの溶出物について）さらに２回繰り返した。各連続洗浄及び溶出溶液を適用する前に、カートリッジが滴下を停止したことを確実にすることが重要であった。溶出したペプチドを、一晩凍結乾燥し、３７μＬのＭｙＰｒｏ－Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）中で再構成した。
溶液中枯渇血漿試料又はＰＢＭＣ細胞を、改良「濾過支援試料調製」（ＦＡＳＰ）法を用いる、Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ，ＵＳＡ）によってさらに処理した。簡潔には、タンパク質試料を９Ｍ ＵＲＥＡ中に懸濁し、次いで、５ｍＭ ＴＣＥＰを用いて６０℃で１５分間還元し、還元システインを１０ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を用いて２５℃で１時間ブロックした。次いで、タンパク質試料（１００μｇタンパク質）を、Ａｍｉｃｏｎ Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、９Ｍ尿素で３回、及びＭｙＰｒｏ－Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）で２回洗浄した。次いで、試料を、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）で１２時間にわたり３７℃にてタンパク質分解した。次いで、ペプチド溶液を、１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加することによって酸性化し、室温で１５分間インキュベートした。Ｓｅｐ－Ｐａｋ ｌｉｇｈｔ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、５ｍＬの１００％（体積／体積）アセトニトリルを負荷することによって活性化し、３．５ｍＬの０．１％ＴＦＡ溶液によって２回洗浄した。酸性化消化ペプチド溶液を、１，８００×ｇで５分間にわたり遠心分離し、上清をカートリッジに充填した。カートリッジに結合したペプチドを脱塩するために、１ｍＬ、３ｍＬ、及び４ｍＬの０．１％ＴＦＡを順次使用した。カートリッジからペプチドを溶出するために、０．１％ＴＦＡを含む２ｍＬの４０％（体積／体積）アセトニトリルを使用し、この溶出を、（合計６ｍＬの溶出物について）さらに２回繰り返した。各連続洗浄及び溶出溶液を適用する前に、カートリッジが滴下を停止したことを確実にすることが重要であった。溶出したペプチドを、一晩凍結乾燥し、３７μＬのＭｙＰｒｏ－Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）中で再構成した。
【0106】
マルチプレックスＴＭＴ標識
３７μＬ容量のＭｙＰｒｏ－Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ中の各試料からの消化ペプチドを、１１ｐｌｅｘのＴＭＴ試薬を用いて標識した。２時間後、標識反応をクエンチし、各実験に属する異なる定量的チャネルをプールし、乾燥させて有機溶媒を除去し、続いて、５００ｕＬのＭｙＰｒｏ－Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）中で再構成した。プールした試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣシステムを用いてＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｇｕａｒｄ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を介してｂＲＰＬＣ（塩基性逆相液体クロマトグラフィー）カラム（ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ、５μｍ、２．１×１００ｍｍ）で分画した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために、各画分中のペプチドを乾燥させ、３％アセトニトリルを含む８μＬの０．１％ギ酸中に再懸濁した。
３７μＬ容量のＭｙＰｒｏ－Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ中の各試料からの消化ペプチドを、１１ｐｌｅｘのＴＭＴ試薬を用いて標識した。２時間後、標識反応をクエンチし、各実験に属する異なる定量的チャネルをプールし、乾燥させて有機溶媒を除去し、続いて、５００ｕＬのＭｙＰｒｏ－Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）中で再構成した。プールした試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣシステムを用いてＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｇｕａｒｄ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を介してｂＲＰＬＣ（塩基性逆相液体クロマトグラフィー）カラム（ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ、５μｍ、２．１×１００ｍｍ）で分画した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために、各画分中のペプチドを乾燥させ、３％アセトニトリルを含む８μＬの０．１％ギ酸中に再懸濁した。
【0107】
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）
ＳｕｐｅｒＢ Ｃ１８ ＨＩＦＩ、５μｍ、１００Å（Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）がどちらも充填された２ｃｍトラップカラム及び７５μｍ×２０ｃｍ分析カラムを含む、分析ナノフローカラムシステムを備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＥＡＳＹ－ｎＬＣ １０００（商標）ＨＰＬＣシステムによって、ペプチドーム試料を分画した。溶出した試料を、４５，０００質量分解能で動作するＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を備えたＦＴ ＨＣＤ ＭＳ２フラグメンテーションモードを用いて、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ－Ｘ質量分析計で分析されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＥＡＳＹＳｐｒａｙ（商標）源を介してイオン化した。ペプチドを、２．０ｋＶのスプレー電圧で１５μｍエミッタ（Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）を通してエレクトロスプレーした。逆相溶媒勾配は０．１％ギ酸からなり、１３０分間にわたって０．１％ギ酸中９０％アセトニトリルのレベルを増加させた。Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ－Ｘ機器を操作して、フルスキャンＭＳとＭＳ／ＭＳ取得とを自動的に切り替えた。前回のフルスキャンからの予測ＡＧＣに基づいてイオンを目標値まで蓄積した後、Ｏｒｂｉｔｒａｐにおいて４５，０００分解能で、サーベイフルスキャンＭＳスペクトル（ｍ／ｚ３５０～１８００）を取得した。強い多重荷電イオン（ｚ≧２）を順次単離し、軸方向高エネルギー衝突誘起解離（Ｈｉｇｈｅｒ ｅｎｅｒｇｙ Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＨＣＤ）セルにおいて、ＡＧＣ標的１ｅ５により３０％で正規化されたＨＣＤ衝突エネルギー及び４５，０００の分解能で４００ｍｓの最大注入時間を用いて断片化した。
ＳｕｐｅｒＢ Ｃ１８ ＨＩＦＩ、５μｍ、１００Å（Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）がどちらも充填された２ｃｍトラップカラム及び７５μｍ×２０ｃｍ分析カラムを含む、分析ナノフローカラムシステムを備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＥＡＳＹ－ｎＬＣ １０００（商標）ＨＰＬＣシステムによって、ペプチドーム試料を分画した。溶出した試料を、４５，０００質量分解能で動作するＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を備えたＦＴ ＨＣＤ ＭＳ２フラグメンテーションモードを用いて、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ－Ｘ質量分析計で分析されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＥＡＳＹＳｐｒａｙ（商標）源を介してイオン化した。ペプチドを、２．０ｋＶのスプレー電圧で１５μｍエミッタ（Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）を通してエレクトロスプレーした。逆相溶媒勾配は０．１％ギ酸からなり、１３０分間にわたって０．１％ギ酸中９０％アセトニトリルのレベルを増加させた。Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ－Ｘ機器を操作して、フルスキャンＭＳとＭＳ／ＭＳ取得とを自動的に切り替えた。前回のフルスキャンからの予測ＡＧＣに基づいてイオンを目標値まで蓄積した後、Ｏｒｂｉｔｒａｐにおいて４５，０００分解能で、サーベイフルスキャンＭＳスペクトル（ｍ／ｚ３５０～１８００）を取得した。強い多重荷電イオン（ｚ≧２）を順次単離し、軸方向高エネルギー衝突誘起解離（Ｈｉｇｈｅｒ ｅｎｅｒｇｙ Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＨＣＤ）セルにおいて、ＡＧＣ標的１ｅ５により３０％で正規化されたＨＣＤ衝突エネルギー及び４５，０００の分解能で４００ｍｓの最大注入時間を用いて断片化した。
【0108】
ＭＳデータ分析
質量分析生ファイルを、ペプチド同定及び定量化サービスのために開発された、ＭｙＰｒｏｔ－ＩＤ ｐｉｐｅｌｉｎｅ（Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）を通して処理した。検索パラメータには、メチオニンの酸化、異なる可変修飾としての残基Ｎ及び残基Ｑの脱アミド化が含まれた。前駆体及び断片質量の質量許容差を、それぞれ、１５ｐｐｍ及び０．０３Ｄａに設定した。ペプチド・バリデータ・ノードを、０．０１のストリンジェントなカットオフ、及び０．０５の緩和されたカットオフ（偽発見率）でのペプチド検証に使用した。
質量分析生ファイルを、ペプチド同定及び定量化サービスのために開発された、ＭｙＰｒｏｔ－ＩＤ ｐｉｐｅｌｉｎｅ（Ｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）を通して処理した。検索パラメータには、メチオニンの酸化、異なる可変修飾としての残基Ｎ及び残基Ｑの脱アミド化が含まれた。前駆体及び断片質量の質量許容差を、それぞれ、１５ｐｐｍ及び０．０３Ｄａに設定した。ペプチド・バリデータ・ノードを、０．０１のストリンジェントなカットオフ、及び０．０５の緩和されたカットオフ（偽発見率）でのペプチド検証に使用した。
【0109】
バイオマーカータンパク質のウエスタンブロット
タンパク質発現分析のために、ＰＢＭＣ及び血漿試料を２つの異なる前処理処置に供して、それぞれ、タンパク質を抽出又は濃縮した。ＰＢＭＣを、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍｍ ＮａＣｌ中１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル）で溶解し、氷中で３０分間インキュベートし、次いで、４℃にて１５分間にわたり１３０００×ｇで遠心分離した。上清を収集し、タンパク質の総量を、製造業者の指示に従ってＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）で決定した。血漿試料（１０ｕＬ）を、製造業者の指示に従って、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｓｐｉｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｈｕｍａｎ １４（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、豊富なタンパク質から枯渇させた。ＰＢＭＣ及び血漿由来のタンパク質（４０ｕｇ）を、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離し、続いて、エレクトロブロッティングによってニトロセルロース膜に転写した。検出されたタンパク質の正規化のために使用される、転写されたタンパク質の総量は、ＲＥＶＥＲＴ Ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ ｋｉｔ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造業者の説明書に従って用いて決定した。膜を、ブロッキング緩衝液（ＴＢＳ：１０ｍｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍｍ ＮａＣｌ、５％（重量／体積）ウシ血清アルブミンを含有する０．１％（体積／体積）Ｔｗｅｅｎ ２０）と共に室温で１時間インキュベートし、次いで、一次抗体を添加し、ブロッキング緩衝液中で４℃にて一晩インキュベートした。以下の一次抗体、すなわち、ＰＢＭＣに対する抗ＥＰＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＰＡ５－４２０６２）、抗ＡＬＤＨ３Ｂ１（Ｏｒｉｇｅｎｅ、カタログ番号ＴＡ８１１４６３）、抗ＳＬＣ２５Ａ５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＰＡ５－９０５９２）、抗ＡＰ２Ｓ１（Ａｂｎｏｖａ、カタログ番号Ｈ００００１１７５－Ｍ０１）、及び抗ＦＮ１、抗ＰＲＧ４、抗ＩＴＩＨ３を使用した
タンパク質発現分析のために、ＰＢＭＣ及び血漿試料を２つの異なる前処理処置に供して、それぞれ、タンパク質を抽出又は濃縮した。ＰＢＭＣを、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍｍ ＮａＣｌ中１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル）で溶解し、氷中で３０分間インキュベートし、次いで、４℃にて１５分間にわたり１３０００×ｇで遠心分離した。上清を収集し、タンパク質の総量を、製造業者の指示に従ってＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）で決定した。血漿試料（１０ｕＬ）を、製造業者の指示に従って、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｓｐｉｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｈｕｍａｎ １４（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、豊富なタンパク質から枯渇させた。ＰＢＭＣ及び血漿由来のタンパク質（４０ｕｇ）を、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離し、続いて、エレクトロブロッティングによってニトロセルロース膜に転写した。検出されたタンパク質の正規化のために使用される、転写されたタンパク質の総量は、ＲＥＶＥＲＴ Ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ ｋｉｔ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造業者の説明書に従って用いて決定した。膜を、ブロッキング緩衝液（ＴＢＳ：１０ｍｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍｍ ＮａＣｌ、５％（重量／体積）ウシ血清アルブミンを含有する０．１％（体積／体積）Ｔｗｅｅｎ ２０）と共に室温で１時間インキュベートし、次いで、一次抗体を添加し、ブロッキング緩衝液中で４℃にて一晩インキュベートした。以下の一次抗体、すなわち、ＰＢＭＣに対する抗ＥＰＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＰＡ５－４２０６２）、抗ＡＬＤＨ３Ｂ１（Ｏｒｉｇｅｎｅ、カタログ番号ＴＡ８１１４６３）、抗ＳＬＣ２５Ａ５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＰＡ５－９０５９２）、抗ＡＰ２Ｓ１（Ａｂｎｏｖａ、カタログ番号Ｈ００００１１７５－Ｍ０１）、及び抗ＦＮ１、抗ＰＲＧ４、抗ＩＴＩＨ３を使用した
【0110】
膜を、ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ２０により１０分間にわたって３回洗浄し、次いで、適切な二次抗体で２時間インキュベートした。以下の二次抗体、すなわち、抗マウスＨＲＰコンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、抗ウサギＨＲＰコンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ抗マウス（Ｌｉｃｏｒ）、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ抗ウサギ（Ｌｉｃｏｒ）、ＩＲＤｙｅ ６８０ＣＷ抗マウス（Ｌｉｃｏｒ）、及びＩＲＤｙｅ ６８０ＣＷ抗ウサギ（Ｌｉｃｏｒ）を使用した。ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄した後、タンパク質を、ＥＣＬ検出キット（Ｃｙａｎａｇｅｎ）を用いて、又はＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて適切な波長での赤外線取得により検出した。
【0111】
統計分析及びバイオマーカー同定
プロテオミクス分析（ｎ＝５９１個体の血漿、及びｎ＝５８７個体のＰＢＭＣにおいて）、リピドミクス分析（ｎ＝６００個体の血漿において）、及びメタボロミクス分析（ｎ＝６００個体の血漿において）により、プロテオミクス、リピドミクス、及びメタボロミクスの測定値が利用可能な共通する５８５個体のセットが得られた。
プロテオミクス分析（ｎ＝５９１個体の血漿、及びｎ＝５８７個体のＰＢＭＣにおいて）、リピドミクス分析（ｎ＝６００個体の血漿において）、及びメタボロミクス分析（ｎ＝６００個体の血漿において）により、プロテオミクス、リピドミクス、及びメタボロミクスの測定値が利用可能な共通する５８５個体のセットが得られた。
【0112】
ヒトにおけるブルガダ症候群の診断のためのマルチオミクス・バイオマーカー・シグネチャを同定するために、以下のように、多工程手順が採用されている。
【0113】
工程１：各オミクスデータセット内で、ブルガダ症候群患者と対照との間で有意に異なる特徴（すなわち、差次的に発現した（ＤＥ）特徴）（すなわち、タンパク質、代謝産物、脂質）が同定された。
【0114】
工程２：（工程１からの）全てのＤＥ特徴は、タンパク質（ＰＢＭＣ及び血漿）、代謝産物（血漿）、及び脂質（血漿）を含む、単一のマルチオミクスデータセットで組み合わされた。
【0115】
工程３：（工程２からの）単一のマルチオミクスデータセットを用いて、ブルガダ症候群の診断のための特徴（すなわち、タンパク質、代謝産物、脂質）を独立して予測する６つの方法が採用され、各方法についてのその相対的な「重要度」及び「頻度」に基づいて各特徴をランク付けする。
【0116】
工程４：（工程３からの）特徴の予測及びランク付けを用いて、各方法によって一貫して予測されない特徴が除去され、次いで、全ての方法にわたって一貫して検出された特徴の「重要度」及び「頻度」ランクが組み合わされて、各特徴について単一のランク（「重要度」及び「頻度」）が導出される。
【0117】
この多工程手順（上記）は、
（１）患者コホート全体（２９４人のブルガダ症候群患者及び２９１人の対照を含む５８５人の個体）
（２）男性のみの患者コホート（２０２人のブルガダ症候群患者及び１６９人の対照を含む３７１人の個体）
（３）女性のみの患者コホート（９２人のブルガダ症候群患者及び１２２人の対照を含む２１４人の個体）
で別々に実施される。
（１）患者コホート全体（２９４人のブルガダ症候群患者及び２９１人の対照を含む５８５人の個体）
（２）男性のみの患者コホート（２０２人のブルガダ症候群患者及び１６９人の対照を含む３７１人の個体）
（３）女性のみの患者コホート（９２人のブルガダ症候群患者及び１２２人の対照を含む２１４人の個体）
で別々に実施される。
【0118】
バイオマーカー特徴の予測は、患者コホート全体、男性、及び女性で重複していたが、同一ではなかった。したがって、全患者コホートにおいて見出されたバイオマーカーの特徴、並びに男性コホート及び女性コホートにおいて見出されたバイオマーカーの特徴を交差適合させて、ブルガダ症候群の診断のための「コアセット」と称される、共通の特徴セットを同定した。コアセットは、男性及び女性、並びにコホート全体におけるブルガダ症候群の診断のための特徴を含んでいた。患者コホート全体で同定された特徴として、「拡張セット」と称される、ブルガダ症候群の診断のためのより大きな拡張セットの特徴が同定された。各工程の技術的詳細は以下のとおりである。
【0119】
工程１
プロテオミクスデータ分析
全ＰＢＭＣ及び血漿プロテオミクスＰＳＭ（ペプチドスペクトルマッチスコア）データマトリックス（各々、約１７ｋのタンパク質）を、５０％を超える欠測値を有する種を除去するために間引きした。それらをＲのＤＥｑＭＳツール［３０］で処理し、（ランダムな欠測［ＭＡＲ］パターンに続く）欠測値を、ｋ近傍関数を用いて代入し、得られたマトリックスを等中央値正規化関数を用いて正規化した。正規化マトリックスを使用してＤＥタンパク質を同定し、スペクトル・カウント・イーベイズ（Spectral Count eBayes）関数を用いて、定量化に使用されるタンパク質あたりのＰＳＭの最小数に基づいて分散推定のバイアスを補正した。
プロテオミクスデータ分析
全ＰＢＭＣ及び血漿プロテオミクスＰＳＭ（ペプチドスペクトルマッチスコア）データマトリックス（各々、約１７ｋのタンパク質）を、５０％を超える欠測値を有する種を除去するために間引きした。それらをＲのＤＥｑＭＳツール［３０］で処理し、（ランダムな欠測［ＭＡＲ］パターンに続く）欠測値を、ｋ近傍関数を用いて代入し、得られたマトリックスを等中央値正規化関数を用いて正規化した。正規化マトリックスを使用してＤＥタンパク質を同定し、スペクトル・カウント・イーベイズ（Spectral Count eBayes）関数を用いて、定量化に使用されるタンパク質あたりのＰＳＭの最小数に基づいて分散推定のバイアスを補正した。
【0120】
メタボロミクスデータ分析
メタボロミクスマトリックスは、ＲのＭｅｔａｂｏＤｉｆｆツール［３１］を用いて処理した。欠測値の数は、試料全体にわたってかなり低く（１５％未満であり、ＭＡＲパターンに従った）、かつｋ近傍関数を用いて代入された。代入されたマトリックスを、分散安定化正規化（ＶＳＮ）関数を用いて正規化し、差次的に発現されたタンパク質を、スチューデントのｔ検定統計に依存して同定し、一方で、複数の検定のためのｐ値の偽発見率（ＦＤＲ）補正を、ベンジャミニ・ホフバーグ（ＢＨ）手順を用いて行った。
メタボロミクスマトリックスは、ＲのＭｅｔａｂｏＤｉｆｆツール［３１］を用いて処理した。欠測値の数は、試料全体にわたってかなり低く（１５％未満であり、ＭＡＲパターンに従った）、かつｋ近傍関数を用いて代入された。代入されたマトリックスを、分散安定化正規化（ＶＳＮ）関数を用いて正規化し、差次的に発現されたタンパク質を、スチューデントのｔ検定統計に依存して同定し、一方で、複数の検定のためのｐ値の偽発見率（ＦＤＲ）補正を、ベンジャミニ・ホフバーグ（ＢＨ）手順を用いて行った。
【0121】
リピドミクスデータ分析
リピドミクスマトリックスは、Ｒのｌｉｐｉｄｒツール［３２］を用いて処理した。ＭＡＲパターン後の欠測値の数が少ないことをＫＮＮ関数で推量し、ＶＳＮ正規化法を使用して、存在量の低い脂質の割合が高いことに対処した。ブルガダ患者と対照との間の脂質の差次的存在量は、ｔ検定に基づき、多重試験のｐ値補正のためのＢＨ手順に依存して、ｌｉｍｍａパッケージ［３３］を用いて同定された。
リピドミクスマトリックスは、Ｒのｌｉｐｉｄｒツール［３２］を用いて処理した。ＭＡＲパターン後の欠測値の数が少ないことをＫＮＮ関数で推量し、ＶＳＮ正規化法を使用して、存在量の低い脂質の割合が高いことに対処した。ブルガダ患者と対照との間の脂質の差次的存在量は、ｔ検定に基づき、多重試験のｐ値補正のためのＢＨ手順に依存して、ｌｉｍｍａパッケージ［３３］を用いて同定された。
【0122】
プロテオミクスデータセット、メタボロミクスデータセット、及びリピドミクスデータセットの各ＤＥ分析について、性別、年齢、バッチ、及びプロトコルの影響を考慮し、ｌｉｍｍａパッケージ［３３］における線形モデリングを用いて補正した。各データセットにおいて同定されたＤＥ特徴（ＦＤＲ≦５％）の数は、ＰＢＭＣにおいて９９５種類のＤＥタンパク質；血漿において２５種類のＤＥタンパク質；血漿において８９種類のＤＥ代謝産物（４４種類の生体異物及び非アノテーション代謝産物を除去した）；血漿において２３０種類のＤＥ脂質である。
【0123】
工程２：工程１からのＤＥタンパク質、脂質、及び代謝産物を、単一のデータセットに組み合わせる。これにより、ブルガダ症候群における１，３３９種類のタンパク質／代謝産物／脂質ＤＥのセットが定義され、これは、５８５人の患者で測定される。このデータマトリックスの１，３３９種類の特徴（タンパク質／代謝産物／脂質）×５８５（個体）は、次の工程におけるバイオマーカー予測のための入力として使用される。
【0124】
工程３：データマトリックスがオートスケーリングされた後、以下の６つの方法、すなわち、（１）ブルガダ症候群の予測のためのＡＵＲＯＣ（受信者動作特性下面積）又はＡＵＣ（曲線下面積）を決定するための受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）；（２）ブルガダ症候群患者と対照との間のタンパク質／代謝産物／脂質存在量の差異のＰ値；（３）線形カーネルを有するサポートベクターマシン（ＳＶＭ）［３４］；（４）ランダムフォレスト（ＲＦ）［３５］；（５）部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）［３６］、（６）スパース部分的最小二乗判別分析（ｓＰＬＳ－ＤＡ）が使用された。各特徴について、単変量ＡＵＣ及びＰ値は、特徴重要性の定量化を提供するが、一方で、多変量機械学習（ＭＬ）法、ＳＶＭ、ＲＦ、及びＰＬＳ－ＤＡは、特徴「重要度」及び特徴「頻度」の定量化を提供する（すなわち、各ＭＣＣＶにおいて試料の三分の二（２／３）が各特徴の重要度及び頻度を評価するために使用される、平衡サブサンプリングを用いた１００回のモンテカルロ交差検証（ＭＣＣＶ））。多変量ｓＰＬＳ－ＤＡは、同時の特徴選択及び次元削減を提供するために採用され［３７］、したがって、ブルガダ症候群の診断のための有益な特徴の数を減らし、過剰適合を制限する。ＰＬＳ－ＤＡ及びｓＰＬＳ－ＤＡについては、有意成分の最適数がＲ２及びＱ２を用いて決定されている［３８］。
【0125】
工程４：ＡＵＣ、Ｐ値、ＳＶＭ、ＲＦ、ＰＬＳ－ＤＡ、及びｓＰＬＳ－ＤＡを用いたバイオマーカー予測は、全ての方法で一般的に検出される３３０種類の特徴のセットを提供した。各特徴には、その相対的な「重要度」（ＡＵＣ、Ｐ値、ＳＶＭ、ＲＦ、ＰＬＳ－ＤＡ）及び「頻度」（ＳＶＭ、ＲＦ、ＰＬＳ－ＤＡ）のランクが割り当てられ、また、ｓＰＬＳ－ＤＡによって「スパース」特徴選択モデルで特徴を見つけることも必要である（スパースＰＬＳ回帰が関連する特徴を見つけるための高い予測力と精度の両方を達成する方法の詳細については、［３７］を参照されたい）。追加的な要件は、各特徴がそれ自体ある程度の予測力を有することであり、したがって、ＡＵＣ＞０．６を必要とする追加のフィルタリングが採用されている。ＡＵＣ＞０．６を課す全ての方法によって予測され、ｓＰＬＡ－ＤＡによる「スパース」特徴選択モデルで検出された共通の特徴を用いて、患者コホート全体（５８５人の個体）におけるブルガダ症候群の診断のための１６個の特徴を同定した。同様に、女性患者コホート（２１４人の個体）の分析では２９個の特徴が同定され、男性患者コホート（３７１人の個体）の分析では２８個の特徴が同定された。以下の表８に報告されるように、患者コホート全体と女性及び男性の両方の患者コホートとの間で共通する特徴のセットは、１０個の特徴（コアセット）からなり、一方で、患者コホート全体で同定されたセット特徴は、コアセット内の全ての特徴を含む１６種類の特徴（拡張セット）からなる。
【0126】
【表8】
【0127】
実施例３：本発明のタンパク質バイオマーカーにおける有害変異の同定
材料及び方法
ＰｏｌｙＰｈｅｎ［３９］及び／又はＳＩＦＴ［４０］の両方による全ゲノム配列決定（ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＷＧＳ）により、ブルガダ症候群患者のサブグループ（ｎ＝１８６）における遺伝子分析を行った。
材料及び方法
ＰｏｌｙＰｈｅｎ［３９］及び／又はＳＩＦＴ［４０］の両方による全ゲノム配列決定（ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＷＧＳ）により、ブルガダ症候群患者のサブグループ（ｎ＝１８６）における遺伝子分析を行った。
【0128】
ＳＩＦＴは、代替アミノ酸間の配列相同性及び物理化学的類似性に基づいて、アミノ酸置換がタンパク質機能に影響を及ぼし得るかどうかを予測する。各アミノ酸置換について提供されるデータは、スコア及び定性的予測（「許容」又は「有害」のいずれか）である。スコアは、アミノ酸変化が許容される正規化確率であるため、０に近いスコアほど有害である可能性が高い。定性的予測は、スコア＜０．０５の置換が「有害である」と称され、他の全てが「許容される」と称されるように、このスコアから導出される。
【0129】
ＰｏｌｙＰｈｅｎ－２は、配列相同性、Ｐｆａｍアノテーション、入手可能なＰＤＢからの３Ｄ構造、並びにいくつかの他のデータベース及びツール（ＤＳＳＰ、ｎｃｏｉｌｓなどを含む）を用いて、タンパク質の構造及び機能に対するアミノ酸置換の効果を予測する。ＳＩＦＴと同様に、予測を計算することが可能であった各アミノ酸置換について、定性的予測（「おそらく機能障害」、「機能障害の可能性がある」、「良性」、又は「未知」のうちの１つ）及びスコアの両方を提供した。ＰｏｌｙＰｈｅｎスコアは置換が有害である確率を表すため、１に近い値はより確実に有害であるものと予測される。定性的予測は、予測を行うために使用される分類器モデルの偽陽性率に基づく。
【0130】
結果
多くのブルガダ症候群患者は、変異がブルガダ症候群で最も一般的に見られるＳＣＮ５Ａ遺伝子と比較した場合であっても、有意に多数の有害変異を保有する［１０、１１］。
多くのブルガダ症候群患者は、変異がブルガダ症候群で最も一般的に見られるＳＣＮ５Ａ遺伝子と比較した場合であっても、有意に多数の有害変異を保有する［１０、１１］。
【0131】
具体的には、バイオマーカータンパク質であるＥＰＸ（好酸球ペルオキシダーゼ）、ＰＯＮ１（パラオキソナーゼ１）、及びＰＲＧ４（プロテオグリカン４）をコードする遺伝子は、図８に示すように、それぞれ変異を有する９１人の患者、１１０人の患者、及び１２３人の患者において、同じ変異を保有する。
【0132】
最も高度に変異した遺伝子は、プロテオグリカンファミリーのメンバーであるプロテオグリカン４（ＰＲＧ４）であり、これは、代謝病態を含む多様な生理学的機構及び病理学的機構の役割を果たす［４１］。プロテオグリカン４は、遍在的に発現され、循環中に分泌され、かつ、体重増加、脂質異常症、及びインスリン抵抗性に寄与する可能性のある因子として転写レベルとタンパク質レベルとの両方においてヒト関連研究から明らかになり、ＰＲＧ４血漿レベルは、肥満及び体重減少に関連することが見出された［４２～４３］。マウス研究は、エネルギー代謝の調節におけるＰＲＧ４の因果的役割を示し［４４］、２型糖尿病を有する肥満個体におけるＰＲＧ４の上方制御を考慮すると、ＰＲＧ４がヒトにおける代謝障害の発症においてもまた因果的役割を果たすことを示唆し得る。
【0133】
調節不全バイオマーカータンパク質をコードする別の高度に変異した遺伝子は、循環中に分泌され、かつ血液中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と会合する、肝臓由来糖タンパク質であるパラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）である。ＰＯＮ１は抗アテローム硬化性因子として重要な役割を果たすものと考えられている。この酵素は抗酸化特性及び抗アテローム生成特性を呈し、さらに、循環ＰＯＮ１活性の変化は、真性糖尿病、肥満、肝疾患及び腎疾患、乾癬、がん、並びに関節リウマチを含む、様々な疾患に関連している［４５］。したがって、ＰＯＮ１濃度及び活性を様々な疾患の検出のためのバイオマーカーとして使用することもまた示唆されている［４６］。しかしながら、ＰＯＮ１の活性は、遺伝的制御及び環境的制御（年齢、性別、及び生活様式、並びに薬学的介入を含む）の両方の下にあり、個体間で大きく異なることが示されている［４７］。ブルガダ症候群患者のＰＯＮ１で検出された非常に多数の変異（＞１００）は、糖尿病患者における乳がんのような他の疾患について示されているように、ブルガダ症候群疾患におけるこの遺伝子の原因的役割、及びおそらくは酸化ストレス制御の機能的役割を示唆している［４８］。
【0134】
以下の表９は、最も高度に変異した遺伝子の配列バリアントについて報告する（ＰＲＧ４配列バリアント：１－１８６３０４８６２ Ｃ－＞Ｔ、ＥＰＸ配列バリアント：１７－５８１９３７３３ Ｇ－＞Ｃ、及びＰＯＮ１配列バリアント：７－９５３１６７７２ Ａ－＞Ｔ）。有害変異に関する全ての詳細は、ブルガダ症候群患者において検出された：染色体（Ｃｈｒ．）、ＤＮＡ鎖（ストランド）、ゲノム位置、参照遺伝子及び変異対立遺伝子、コドン及びアミノ酸の変化。
【0135】
【表9】
【0136】
最後に、ブルガダ患者コホート並びに参照ヨーロッパ系アメリカ人集団及びアフリカ系アメリカ人集団における変異頻度が検出され、以下の表１０に報告されている。変異対立遺伝子の集団頻度は、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｇｎｏｍＡＤ）データベースｖ３．１（https://gnomad.broadinstitute.org/）から検索された。
【0137】
【表10】
【0138】
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【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】