特表 2024-512297 生体反応性化合物及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-19

(54)【発明の名称】生体反応性化合物及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07C 305/26 20060101AFI20240312BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20240312BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 47/69 20170101ALI20240312BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240312BHJP

【ＦＩ】

C07C305/26 CSP

C07K16/28 ZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/09 Z

C12N9/00

C12P21/02 C

A61K47/69

A61K39/395 C

A61K39/395 D

A61K39/395 Y

A61K47/68

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023553044

(86)(22)【出願日】2022-03-01

(85)【翻訳文提出日】2023-10-10

(86)【国際出願番号】 US2022018381

(87)【国際公開番号】W WO2022187273

(87)【国際公開日】2022-09-09

(31)【優先権主張番号】63/155,222

(32)【優先日】2021-03-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/214,432

(32)【優先日】2021-06-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507127440

【氏名又は名称】ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニア

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ワン，レイ

(72)【発明者】

【氏名】リウ，ジュン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C085

4H006

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064AG26

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BD44

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA41

4B065CA42

4C076AA65

4C076AA95

4C076CC41

4C076DD51

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF31

4C076FF68

4C085AA13

4C085CC22

4C085DD62

4C085EE03

4C085EE05

4H006AA01

4H006AA03

4H006AB20

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA50

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本明細書では、とりわけ、生体反応性の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸を含有する化合物、及びその使用方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ａ）の構造を有する、化合物：

【化1】

【請求項2】

請求項１に記載の化合物を含む、組成物。

【請求項3】

請求項１に記載の化合物を含む、細胞。

【請求項4】

式（Ｂ）の構造を有する生体分子であって、

【化2】

式中、
（ｉ）Ｘが少なくとも１つのアミノ酸を含み、ＹがＯＨであるか、
（ｉｉ）Ｙが少なくとも１つのアミノ酸を含み、ＸがＨであるか、又は
（ｉｉｉ）Ｘ及びＹがそれぞれ、少なくとも１つのアミノ酸を含む、生体分子。

【請求項5】

式（Ｃ）の構造を有する生体分子であって、

【化3】

式中、Ｒ^１が、小分子部分、アミノ酸部分、又はペプチジル部分である、生体分子。

【請求項6】

Ｒ^１が、小分子部分である、請求項５に記載の生体分子。

【請求項7】

Ｒ^１が、アミノ酸部分又はペプチジル部分である、請求項５に記載の生体分子。

【請求項8】

Ｒ^１が、前記ペプチジル部分であり、前記ペプチジル部分が、抗体、抗原結合断片、単鎖可変領域断片、シングルドメイン抗体、又はアフィボディである、請求項５に記載の生体分子。

【請求項9】

Ｒ^１が、標的に結合することができる、請求項５～８のいずれか一項に記載の生体分子。

【請求項10】

Ｒ^１が、細胞の表面上の標的に結合することができる、請求項９に記載の生体分子。

【請求項11】

前記細胞の前記表面上の前記標的が、受容体である、請求項１０に記載の生体分子。

【請求項12】

前記受容体が、膜受容体又はホルモン受容体である、請求項１０に記載の生体分子。

【請求項13】

前記標的が、アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アンジオテンシン受容体、アペリン受容体、胆汁酸受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カンナビノイド受容体、ケメリン受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、クラスＡオーファン受容体、ドーパミン受容体、エンドセリン受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ホルミルペプチド受容体、遊離脂肪酸受容体、ガラニン受容体、グレリン受容体、糖タンパク質ホルモン受容体、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体、Ｇタンパク質共役エストロゲン受容体、ヒスタミン受容体、ヒドロキシカルボン酸受容体、キスペプチン受容体、ロイコトリエン受容体、リゾリン脂質受容体、リゾリン脂質Ｓ１Ｐ受容体、メラニン凝集ホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、モチリン受容体、ニューロメジンＵ受容体、ニューロペプチドＦＦ／ニューロペプチドＡＦ受容体、ニューロペプチドＳ受容体、ニューロペプチドＷ／ニューロペプチドＢ受容体、ニューロペプチドＹ受容体、ニューロテンシン受容体、オピオイド受容体、オプシン受容体、オレキシン受容体、オキソグルタル酸受容体、Ｐ２Ｙ受容体、血小板活性化因子受容体、プロキネチシン受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体、プロスタノイド受容体、プロテアーゼ活性化受容体、ＱＲＦＰ受容体、リラキシンファミリーペプチド受容体、ソマトスタチン受容体、コハク酸受容体、タキキニン受容体、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体、微量アミン受容体、ウロテンシン受容体、及びバソプレッシン受容体の群から選択される受容体である、請求項９に記載の生体分子。

【請求項14】

前記標的が、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１である、請求項９に記載の生体分子。

【請求項15】

前記標的が、タンパク質、核酸又は炭水化物である、請求項９に記載の生体分子。

【請求項16】

請求項４～１５のいずれか一項に記載の生体分子を含む、細胞。

【請求項17】

前記細胞が、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、又は動物細胞である、請求項１６に記載の細胞。

【請求項18】

請求項４～１５のいずれか一項に記載の生体分子を含む、インビトロ翻訳系。

【請求項19】

バイオコンジュゲートリンカーを介して第２の生体分子部分にコンジュゲート化された第１の生体分子部分を含む生体分子コンジュゲートであって、前記バイオコンジュゲートリンカーが、式（Ｄ）の構造を有する、生体分子コンジュゲート。

【化4】

【請求項20】

前記生体分子コンジュゲートが、式（Ｅ）の構造を有し、

【化5】

式中、
Ｒ^１が、前記第１の生体分子部分であり、
Ｒ^２が、前記第２の生体分子部分であり、
Ｌ^１が、結合又は第１の共有結合リンカーであり、
Ｌ^２が、結合又は第２の共有結合リンカーであり、
Ｘ^１が、－ＮＲ^５－、－Ｏ－、－Ｓ－、又は

【化6】

であり、
ここで、環Ａが、置換若しくは非置換ヘテロアリーレン又は置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレンであり、Ａ中の窒素が、前記バイオコンジュゲートリンカーに結合しており、
Ｒ^５が、水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールである、請求項１９に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項21】

式中、
Ｌ^１が、結合、－Ｓ（Ｏ）_２－、－ＮＲ^３Ａ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^３Ａ－、－ＮＲ^３ＡＣ（Ｏ）－、－ＮＲ^３ＡＣ（Ｏ）ＮＲ^３Ｂ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、又は置換若しくは非置換ヘテロアリーレンであり、
Ｌ^２が、結合、－Ｓ（Ｏ）_２－、－ＮＲ^４Ａ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^４Ａ－、－ＮＲ^４ＡＣ（Ｏ）－、－ＮＲ^４ＡＣ（Ｏ）ＮＲ^４Ｂ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、置換若しくは非置換ヘテロアリーレン、又は置換若しくは非置換アルキルアリーレンであり、
Ｒ^３Ａ、Ｒ^３Ｂ、Ｒ^４Ａ及びＲ^４Ｂが独立して、水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールである、請求項２０に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項22】

Ｘ^１が、－ＮＨ－、－Ｏ－、又はイミダゾリレンである、請求項２０又は２１に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項23】

Ｒ^１が、ペプチジル部分、核酸部分、炭水化物部分、又は小分子部分を含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項24】

Ｒ^２が、ペプチジル部分、核酸部分、炭水化物部分、又は小分子部分を含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項25】

Ｒ^２が、ペプチジル部分を含み、Ｒ^２が、リジン、ヒスチジン又はチロシンを介してＬ^２に共有結合している、請求項２４に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項26】

式（Ｉ）、式（ＩＩ）又は式（ＩＩ）の構造を含む、

【化7】

請求項２０、２３、２４又は２５に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項27】

Ｒ^１が、少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項28】

Ｒ^２が、少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項29】

Ｒ^１が、抗体、抗原結合断片、単鎖可変領域断片、シングルドメイン抗体、又はアフィボディを含む、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項30】

Ｒ^２が、受容体を含む、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項31】

前記受容体が、膜受容体又はホルモン受容体である、請求項３０に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項32】

前記受容体が、アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アンジオテンシン受容体、アペリン受容体、胆汁酸受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カンナビノイド受容体、ケメリン受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、クラスＡオーファン受容体、ドーパミン受容体、エンドセリン受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ホルミルペプチド受容体、遊離脂肪酸受容体、ガラニン受容体、グレリン受容体、糖タンパク質ホルモン受容体、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体、Ｇタンパク質共役エストロゲン受容体、ヒスタミン受容体、ヒドロキシカルボン酸受容体、キスペプチン受容体、ロイコトリエン受容体、リゾリン脂質受容体、リゾリン脂質Ｓ１Ｐ受容体、メラニン凝集ホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、モチリン受容体、ニューロメジンＵ受容体、ニューロペプチドＦＦ／ニューロペプチドＡＦ受容体、ニューロペプチドＳ受容体、ニューロペプチドＷ／ニューロペプチドＢ受容体、ニューロペプチドＹ受容体、ニューロテンシン受容体、オピオイド受容体、オプシン受容体、オレキシン受容体、オキソグルタル酸受容体、Ｐ２Ｙ受容体、血小板活性化因子受容体、プロキネチシン受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体、プロスタノイド受容体、プロテアーゼ活性化受容体、ＱＲＦＰ受容体、リラキシンファミリーペプチド受容体、ソマトスタチン受容体、コハク酸受容体、タキキニン受容体、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体、微量アミン受容体、ウロテンシン受容体、又はバソプレシン受容体である、請求項３０に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項33】

前記受容体が、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１である、請求項３０に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項34】

前記受容体が、上皮成長因子受容体であり、Ｒ^１が前記上皮成長因子受容体に結合することができる部分である、請求項３０に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項35】

Ｒ^１が、ペプチジル部分又は小分子部分を含む、請求項３４に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項36】

Ｒ^１が、抗体、抗原結合断片、シングルドメイン抗体、単鎖可変領域断片、又はアフィボディを含む、請求項３４に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項37】

Ｒ^２が、ＰＤ－１であり、Ｒ^１が、ＰＤ－１に結合することができる部分である、請求項３３に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項38】

Ｒ^１が、抗体、抗原結合断片、単鎖可変領域断片、シングルドメイン抗体、又はアフィボディ、小分子、ＰＤ－Ｌ１タンパク質、又はＰＤ－Ｌ１タンパク質の断片を含む、請求項３７に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項39】

Ｒ^２が、ＰＤ－Ｌ１であり、Ｒ^１が、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる部分である、請求項３３に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項40】

Ｒ^１が、抗体、抗原結合断片、シングルドメイン抗体、アフィボディ、小分子、ＰＤ－１タンパク質、又はＰＤ－１タンパク質の断片を含む、請求項３９に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項41】

請求項１９～４０のいずれか一項に記載の生体分子コンジュゲートを含む、細胞。

【請求項42】

Ｒ^２が、前記細胞の表面上のタンパク質である、請求項４１に記載の細胞。

【請求項43】

前記細胞が、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、及び動物細胞からなる群から選択される、請求項４１又は４２に記載の細胞。

【請求項44】

前記動物細胞が、ヒト細胞である、請求項４３に記載の細胞。

【請求項45】

細胞上の標的に結合する方法であって、前記細胞を請求項４～１５のいずれか一項に記載の生体分子と接触させることを含み、ここで、前記生体分子が、前記細胞の表面上の前記標的に特異的に結合することができ、それによって前記生体分子が前記標的と共有結合を形成する、方法。

【請求項46】

前記共有結合が、硫黄－フッ素交換反応によって形成される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記共有結合が、近接により可能になる硫黄－フッ素交換反応によって形成される、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記生体分子及び前記標的が、式（Ｄ）の構造を有するバイオコンジュゲートリンカーによって共有結合される、請求項４５に記載の方法：

【化8】

【請求項49】

配列番号１のアミノ酸配列を有するピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に１つ以上のアミノ酸残基の置換を含む変異体ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素であって、基質結合部位が、配列番号１のアミノ酸配列に記載される１２６位のチロシン残基、１２９位のメチオニン残基、１６８位のバリン残基、２２７位のヒスチジン残基、２２８位のチロシン残基、及び２２９位のリジン残基を含む、変異体ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素。

【請求項50】

配列番号１のアミノ酸配列における前記置換が、（ｉ）Ｙ１２６Ｇ、（ｉｉ）Ｍ１２９Ａ、（ｉｉｉ）Ｖ１６８Ｆ、（ｉｖ）Ｈ２２７Ｔ、Ｈ２２７Ｓ、又はＨ２２７Ｉ、（ｖ）Ｙ２２８Ｐ、及び（ｖｉ）Ｌ２２９Ｉ、Ｌ２２９Ｖ、又はＬ２２９Ｉからなる群から選択される、請求項４９に記載の変異体ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素。

【請求項51】

前記ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に１、２、３、４、５、又は６つのアミノ酸残基の置換を含む、請求項４９又は５０に記載の変異体ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素。

【請求項52】

前記ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に６つを超えるアミノ酸残基の置換を含む、請求項４９又は５０に記載の変異体ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素。

【請求項53】

配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載のピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素。

【請求項54】

請求項４９～５３のいずれか一項に記載のピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含む、ベクター。

【請求項55】

ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする核酸配列を更に含む、請求項５４に記載のベクター。

【請求項56】

請求項４９～５５のいずれか一項に記載のピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含む細胞の、ゲノム。

【請求項57】

ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする核酸を更に含む、請求項５６に記載のゲノム。

【請求項58】

請求項４９～５３のいずれか一項に記載のピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素と、式（Ａ）のフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンとを含む、複合体：

【化9】

【請求項59】

ｔＲＮＡ^Ｐｙｌを更に含む、請求項５８に記載の複合体。

【請求項60】

前記ｔＲＮＡ^Ｐｙｌが、配列番号３に記載の配列を有する、請求項５９に記載の複合体。

【請求項61】

前記ｔＲＮＡ^Ｐｙｌが、アンチコドンを含み、前記アンチコドンが、ＣＵＴ、ＴＴＡ、又はＴＣＡを含む、請求項５９に記載の複合体。

【請求項62】

前記ｔＲＮＡ^Ｐｙｌが、アンチコドンを含み、前記アンチコドンが少なくとも１つの非標準塩基を含む、請求項５９に記載の複合体。

【請求項63】

ｔＲＮＡ^Ｐｙｌと、式（Ａ）のフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンとを含む、複合体：

【化10】

【請求項64】

前記ｔＲＮＡ^Ｐｙｌが、配列番号３に記載の配列を有する、請求項６３に記載の複合体。

【請求項65】

前記ｔＲＮＡ^Ｐｙｌが、アンチコドンを含み、前記アンチコドンが、ＣＵＡ、ＴＴＡ、又はＴＣＡを含む、請求項６３に記載の複合体。

【請求項66】

前記ｔＲＮＡ^Ｐｙｌが、アンチコドンを含み、前記アンチコドンが、少なくとも１つの非標準塩基を含む、請求項６３に記載の複合体。

【請求項67】

請求項４９～５３のいずれか一項に記載のピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素、請求項５４若しくは５４に記載のベクター、請求項５５若しくは５７に記載のゲノム、請求項５８～６６のいずれか一項に記載の複合体、又はそれらの２つ以上の組み合わせを含む、細胞。

【請求項68】

前記細胞が、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、又は動物細胞である、請求項６７に記載の細胞。

【請求項69】

請求項６８に記載の細胞から得られる、細胞質抽出物。

【請求項70】

請求項１９～４０のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートを形成する方法であって、前記方法が、第１の生体分子部分を第２の生体分子部分と接触させることを含み、
前記第１の生体分子部分がフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンを含み、
前記第２の生体分子部分が前記フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンと反応性であり、
それにより、前記生体分子コンジュゲートを形成する、方法。

【請求項71】

前記第１の生体分子部分と前記第２の生体分子部分とが、単一の生体分子内に含まれ、前記バイオコンジュゲートリンカーが分子内リンカーである、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記第１の生体分子部分と前記第２の生体分子部分とが、別個の生体分子内に含まれ、前記バイオコンジュゲートリンカーが分子間リンカーである、請求項７０に記載の方法。

【請求項73】

前記接触が、細胞内で行なわれる、実施形態７０～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記接触が、細胞の表面で行われる、請求項７０～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記接触が、溶液中で行なわれる、実施形態７０～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記接触が、インビトロで行なわれる、実施形態７０～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記接触が、インビボで行なわれる、実施形態７０～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記第１の生体分子部分と前記第２の生体分子部分とが、単一の生体分子内に含まれ、前記バイオコンジュゲートリンカーが分子内リンカーである、請求項１９～２６のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート。

【請求項79】

前記第１の生体分子部分と前記第２の生体分子部分とが、別個の生体分子内に含まれ、前記バイオコンジュゲートリンカーが分子間リンカーである、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の生体分子コンジュゲート。

【請求項80】

前記第１の生体分子部分と前記第２の生体分子部分とを接触させる工程の前に、前記第１の生体分子部分を、ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ、及び式（Ａ）のフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンと接触させる工程を更に含む、請求項７０～７９のいずれか一項に記載の方法。

【化11】

【請求項81】

前記第２の生体分子部分が、前記フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンと反応性である少なくとも１つのリジン、ヒスチジン、又はチロシンを含むペプチジル部分である、請求項７０～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンを含むタンパク質を生成する方法であって、前記方法が、核酸を、ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ、及び式（Ａ）のフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンと接触させることを含み、

【化12】

ここで、前記核酸がタンパク質をコードし、前記核酸が、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌによって認識される少なくとも１つのコドンを含み、それによって前記フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンを含む前記タンパク質を生成する、方法。

【請求項83】

前記接触させる工程が、インビトロで行われる、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記接触させる工程が、細胞内で行われる、請求項８２に記載の方法。

【請求項85】

前記細胞が、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、又は動物細胞である、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

少なくとも１つのフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンを含む、タンパク質。

【請求項87】

前記タンパク質が１つのフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンを含む、請求項８６に記載のタンパク質。

【請求項88】

前記タンパク質が、抗体、抗原結合断片、単鎖可変領域断片、シングルドメイン抗体、又はアフィボディである、請求項８６又は８７に記載のタンパク質。

【請求項89】

前記タンパク質が、膜受容体である、請求項８６又は８７に記載のタンパク質。

【請求項90】

前記タンパク質が、式（ＩＶ）の部分、式（Ｖ）の部分、又は式（ＶＩ）の部分を含む、請求項８６～８９のいずれか一項に記載のタンパク質：

【化13】

【請求項91】

請求項８６～９０のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、細胞。

【請求項92】

配列番号９８に記載のＣＤＲ１と、配列番号９６に記載のＣＤＲ２と、配列番号９７に記載のＣＤＲ３とを含む、ナノボディ。

【請求項93】

配列番号９９に記載のＣＤＲ１と、配列番号９６に記載のＣＤＲ２と、配列番号９７に記載のＣＤＲ３とを含む、ナノボディ。

【請求項94】

配列番号９５として記載のＣＤＲ１と、配列番号９６として記載のＣＤＲ２と、配列番号１００として記載のＣＤＲ３とを含む、ナノボディ。

【請求項95】

配列番号９５として記載のＣＤＲ１と、配列番号９６として記載のＣＤＲ２と、配列番号１０１として記載のＣＤＲ３とを含む、ナノボディ。

【請求項96】

配列番号９０のアミノ酸配列を含む、ナノボディ。

【請求項97】

配列番号９２のアミノ酸配列を含む、ナノボディ。

【請求項98】

配列番号９３のアミノ酸配列を含む、ナノボディ。

【請求項99】

配列番号９４のアミノ酸配列を含む、ナノボディ。

【請求項100】

請求項９２～９９のいずれか一項に記載のナノボディと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２１年６月２４日に提出された米国出願第６３／２１４,４３２号、２０２１年３月１日に提出された米国出願第６３／１５５,２２２号の優先権を主張し、それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府の助成による研究開発において行われた発明に対する権利に関する陳述
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１ＧＭ１１８３８４の下で、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。

【0003】

ＡＳＣＩＩファイルとして提出される「配列表」、表、又はコンピュータプログラムリスト付録書類の参照
２０２２年２月２８に作成され、５５，１６５バイトの、ＩＢＭ－ＰＣ、ＭＳ Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムの機械フォーマットのファイル０４８５３６－７０９００１ＷＯ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔに記載された配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

新しい化学結合のタンパク質への導入は、タンパク質の構造及び機能を操作するための革新的な手段となる。様々な潜在的な生体反応性の官能基を含有する非天然アミノ酸（Ｕａａ）が、最近、遺伝暗号の拡張によってタンパク質に導入されてきている。これは、細胞タンパク質の相互作用を研究するためだけでなく、新規なタンパク質ベースの治療薬を作製するための精巧なツールを提供する。潜在的アリールフルオロ硫酸基を介したＳｕＦＥｘクリックケミストリーは、モジュール有機合成、化学生物学、及び薬物開発の支援における価値が実証されている。米国特許出願公開第２０２１／０００２３２５号に記載されているように、本発明者らは、タンパク質の架橋及び共有結合タンパク質薬物の生成のために、フルオロ硫酸－Ｌ－チロシン（ＦＳＹ）をタンパク質に組み込んだ。

【0005】

当技術分野ではとりわけ、タンパク質の同定、薬物標的の発見、又は生物学的療法に使用することができる新規でその他の非天然アミノ酸が必要とされている。とりわけ、当技術分野におけるこれら及び他の問題に対する解決策を本明細書は提供する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本明細書では、式（Ａ）の構造を有するフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン（ＦＳＫ）を提供する：

【0007】

【化1】

【0008】

本明細書では、式（Ｂ）の構造を有する生体分子を提供し、

【0009】

【化2】

式中、（ｉ）Ｘが少なくとも１つのアミノ酸を含み、ＹがＯＨであるか、（ｉｉ）Ｙが少なくとも１つのアミノ酸を含み、ＸがＨであるか、又は（ｉｉｉ）Ｘ及びＹがそれぞれ、少なくとも１つのアミノ酸を含む。

【0010】

本明細書では、式（Ｃ）の構造を有する生体分子を提供し、

【0011】

【化3】

式中、Ｒ^１は生体分子である。態様では、Ｒ^１はペプチジル部分、核酸部分、炭水化物部分、又は小分子である。態様では、Ｒ^１はペプチジル部分である。

【0012】

本明細書では、バイオコンジュゲートリンカーを介して第２の生体分子部分にコンジュゲート化された第１の生体分子部分を含む生体分子コンジュゲートを提供し、ここでバイオコンジュゲートリンカーは式（Ｄ）の構造を有する：

【0013】

【化4】

【0014】

本明細書では、式（Ｅ）の構造を有する生体分子コンジュゲートを提供し、

【0015】

【化5】

式中、Ｒ^１は第１の生体分子部分であり、Ｒ^２は第２の生体分子部分であり、Ｌ^１、Ｌ^２、及びＸ^１は本明細書で定義される通りである。

【0016】

本明細書では、ＦＳＫを含む生体分子を提供し、ここで、ＦＳＫは式（Ｆ）の構造を有する側鎖を有する：

【0017】

【化6】

態様では、生体分子はタンパク質である。態様では、タンパク質は、抗体、抗体変異体（例えば、抗原結合断片、シングルドメイン抗体、単鎖可変領域断片、アフィボディ）、又は膜受容体である。

【0018】

本開示のこれら及びその他の実施形態及び態様を、本明細書でより詳細に記載する。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1A】タンパク質へのＦＳＫの部位特異的組み込みを示す。図１Ａ：遺伝子コード拡張によるタンパク質へのＦＳＫ組み込みの概略図。図１Ｂ：精製ユビキチン（６ＦＳＫ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。図１Ｃ：インタクトなユビキチン（６ＦＳＫ）の質量スペクトル。理論分子量：９５８９．９Ｄａ；測定値：９５９０．１Ｄａ。

【図1B】タンパク質へのＦＳＫの部位特異的組み込みを示す。図１Ａ：遺伝子コード拡張によるタンパク質へのＦＳＫ組み込みの概略図。図１Ｂ：精製ユビキチン（６ＦＳＫ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。図１Ｃ：インタクトなユビキチン（６ＦＳＫ）の質量スペクトル。理論分子量：９５８９．９Ｄａ；測定値：９５９０．１Ｄａ。

【図1C】タンパク質へのＦＳＫの部位特異的組み込みを示す。図１Ａ：遺伝子コード拡張によるタンパク質へのＦＳＫ組み込みの概略図。図１Ｂ：精製ユビキチン（６ＦＳＫ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。図１Ｃ：インタクトなユビキチン（６ＦＳＫ）の質量スペクトル。理論分子量：９５８９．９Ｄａ；測定値：９５９０．１Ｄａ。

【図2A】遺伝的にコードされたＦＳＫによって長距離でのタンパク質の架橋が可能になることを示す。図２Ａ：ＦＳＹとＦＳＫの化学構造、及びＳｕＦＥｘケミストリーによって近接する求核残基（例えば、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ）と反応するフルオロ硫酸アリールの概略図。図２Ｂ：それらのエネルギーが最小化された状態におけるＣαからＦ原子までの測定されたＦＳＹ及びＦＳＫの反応距離：９．０オングストローム（ＦＳＹ）及び１３．８オングストローム（ＦＳＫ）。図２Ｃ：Ｇｌｕ６５と隣接する求核残基との距離を黄色の点線で示したｅｃＧＳＴの結晶構造（ＰＤＢコード：１Ａ０Ｆ）。図２Ｄ：ｅｃＧＳＴの部位６５に組み込まれたＦＳＫ又はＦＳＹによって誘導されたｅｃＧＳＴ二量体架橋のウェスタンブロット解析。図２Ｅ：Ｌｙｓ４４とＡｌａ９７のＣα間の距離を示したｓｊＧＳＴの結晶構造（ＰＤＢコード：１Ｙ６Ｅ）。図２Ｆ：ＦＳＫ又はＦＳＹによって誘導されたｓｊＧＳＴ二量体架橋のウェスタンブロット解析。^＊は、大腸菌中のｓｊＧＳＴと相互作用する他のタンパク質を示す。

【図2B】遺伝的にコードされたＦＳＫによって長距離でのタンパク質の架橋が可能になることを示す。図２Ａ：ＦＳＹとＦＳＫの化学構造、及びＳｕＦＥｘケミストリーによって近接する求核残基（例えば、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ）と反応するフルオロ硫酸アリールの概略図。図２Ｂ：それらのエネルギーが最小化された状態におけるＣαからＦ原子までの測定されたＦＳＹ及びＦＳＫの反応距離：９．０オングストローム（ＦＳＹ）及び１３．８オングストローム（ＦＳＫ）。図２Ｃ：Ｇｌｕ６５と隣接する求核残基との距離を黄色の点線で示したｅｃＧＳＴの結晶構造（ＰＤＢコード：１Ａ０Ｆ）。図２Ｄ：ｅｃＧＳＴの部位６５に組み込まれたＦＳＫ又はＦＳＹによって誘導されたｅｃＧＳＴ二量体架橋のウェスタンブロット解析。図２Ｅ：Ｌｙｓ４４とＡｌａ９７のＣα間の距離を示したｓｊＧＳＴの結晶構造（ＰＤＢコード：１Ｙ６Ｅ）。図２Ｆ：ＦＳＫ又はＦＳＹによって誘導されたｓｊＧＳＴ二量体架橋のウェスタンブロット解析。^＊は、大腸菌中のｓｊＧＳＴと相互作用する他のタンパク質を示す。

【図2C】遺伝的にコードされたＦＳＫによって長距離でのタンパク質の架橋が可能になることを示す。図２Ａ：ＦＳＹとＦＳＫの化学構造、及びＳｕＦＥｘケミストリーによって近接する求核残基（例えば、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ）と反応するフルオロ硫酸アリールの概略図。図２Ｂ：それらのエネルギーが最小化された状態におけるＣαからＦ原子までの測定されたＦＳＹ及びＦＳＫの反応距離：９．０オングストローム（ＦＳＹ）及び１３．８オングストローム（ＦＳＫ）。図２Ｃ：Ｇｌｕ６５と隣接する求核残基との距離を黄色の点線で示したｅｃＧＳＴの結晶構造（ＰＤＢコード：１Ａ０Ｆ）。図２Ｄ：ｅｃＧＳＴの部位６５に組み込まれたＦＳＫ又はＦＳＹによって誘導されたｅｃＧＳＴ二量体架橋のウェスタンブロット解析。図２Ｅ：Ｌｙｓ４４とＡｌａ９７のＣα間の距離を示したｓｊＧＳＴの結晶構造（ＰＤＢコード：１Ｙ６Ｅ）。図２Ｆ：ＦＳＫ又はＦＳＹによって誘導されたｓｊＧＳＴ二量体架橋のウェスタンブロット解析。^＊は、大腸菌中のｓｊＧＳＴと相互作用する他のタンパク質を示す。

【図2D】遺伝的にコードされたＦＳＫによって長距離でのタンパク質の架橋が可能になることを示す。図２Ａ：ＦＳＹとＦＳＫの化学構造、及びＳｕＦＥｘケミストリーによって近接する求核残基（例えば、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ）と反応するフルオロ硫酸アリールの概略図。図２Ｂ：それらのエネルギーが最小化された状態におけるＣαからＦ原子までの測定されたＦＳＹ及びＦＳＫの反応距離：９．０オングストローム（ＦＳＹ）及び１３．８オングストローム（ＦＳＫ）。図２Ｃ：Ｇｌｕ６５と隣接する求核残基との距離を黄色の点線で示したｅｃＧＳＴの結晶構造（ＰＤＢコード：１Ａ０Ｆ）。図２Ｄ：ｅｃＧＳＴの部位６５に組み込まれたＦＳＫ又はＦＳＹによって誘導されたｅｃＧＳＴ二量体架橋のウェスタンブロット解析。図２Ｅ：Ｌｙｓ４４とＡｌａ９７のＣα間の距離を示したｓｊＧＳＴの結晶構造（ＰＤＢコード：１Ｙ６Ｅ）。図２Ｆ：ＦＳＫ又はＦＳＹによって誘導されたｓｊＧＳＴ二量体架橋のウェスタンブロット解析。^＊は、大腸菌中のｓｊＧＳＴと相互作用する他のタンパク質を示す。

【図2E】遺伝的にコードされたＦＳＫによって長距離でのタンパク質の架橋が可能になることを示す。図２Ａ：ＦＳＹとＦＳＫの化学構造、及びＳｕＦＥｘケミストリーによって近接する求核残基（例えば、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ）と反応するフルオロ硫酸アリールの概略図。図２Ｂ：それらのエネルギーが最小化された状態におけるＣαからＦ原子までの測定されたＦＳＹ及びＦＳＫの反応距離：９．０オングストローム（ＦＳＹ）及び１３．８オングストローム（ＦＳＫ）。図２Ｃ：Ｇｌｕ６５と隣接する求核残基との距離を黄色の点線で示したｅｃＧＳＴの結晶構造（ＰＤＢコード：１Ａ０Ｆ）。図２Ｄ：ｅｃＧＳＴの部位６５に組み込まれたＦＳＫ又はＦＳＹによって誘導されたｅｃＧＳＴ二量体架橋のウェスタンブロット解析。図２Ｅ：Ｌｙｓ４４とＡｌａ９７のＣα間の距離を示したｓｊＧＳＴの結晶構造（ＰＤＢコード：１Ｙ６Ｅ）。図２Ｆ：ＦＳＫ又はＦＳＹによって誘導されたｓｊＧＳＴ二量体架橋のウェスタンブロット解析。^＊は、大腸菌中のｓｊＧＳＴと相互作用する他のタンパク質を示す。

【図2F】遺伝的にコードされたＦＳＫによって長距離でのタンパク質の架橋が可能になることを示す。図２Ａ：ＦＳＹとＦＳＫの化学構造、及びＳｕＦＥｘケミストリーによって近接する求核残基（例えば、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ）と反応するフルオロ硫酸アリールの概略図。図２Ｂ：それらのエネルギーが最小化された状態におけるＣαからＦ原子までの測定されたＦＳＹ及びＦＳＫの反応距離：９．０オングストローム（ＦＳＹ）及び１３．８オングストローム（ＦＳＫ）。図２Ｃ：Ｇｌｕ６５と隣接する求核残基との距離を黄色の点線で示したｅｃＧＳＴの結晶構造（ＰＤＢコード：１Ａ０Ｆ）。図２Ｄ：ｅｃＧＳＴの部位６５に組み込まれたＦＳＫ又はＦＳＹによって誘導されたｅｃＧＳＴ二量体架橋のウェスタンブロット解析。図２Ｅ：Ｌｙｓ４４とＡｌａ９７のＣα間の距離を示したｓｊＧＳＴの結晶構造（ＰＤＢコード：１Ｙ６Ｅ）。図２Ｆ：ＦＳＫ又はＦＳＹによって誘導されたｓｊＧＳＴ二量体架橋のウェスタンブロット解析。^＊は、大腸菌中のｓｊＧＳＴと相互作用する他のタンパク質を示す。

【図3A】ユビキチンにおけるＦＳＫによる分子内共有結合架橋を示す。図３Ａ：Ｌｙｓ２９を標的とするＦＳＫの組み込みのためのＧｌｕ１８を示したユビキチン（ＰＤＢコード：１ＡＡＲ）の構造。図３Ｂ：Ｕｂ（１８ＦＳＫ）のＥＳＩ－ＭＳ。９５８７．９Ｄａのピークは、インタクトなＵｂ（１８ＦＳＫ）に対応する（ＭＷ計算値：９５８７．９Ｄａ）。９５６８．６Ｄａのピークは、Ｌｙｓ２９と反応してＨＦを失うＦＳＫ１８によって分子内架橋されたＵｂに対応する（ＭＷ計算値：９５６７．９）。９５０６．８Ｄａのピークは、ＳＯ_２Ｆを失ったＵｂ（１８ＦＳＫ）（ＭＷ計算値：９５０６．９）に対応し、それはＦＳＫの不純物に起因し得る。トリプシン消化Ｕｂ（１８ＦＳＫ）から同定された架橋ペプチドのタンデム質量スペクトル（図示せず）は、ＦＳＫがデザイン通りにＬｙｓ２９と反応することを示した。

【図3B】ユビキチンにおけるＦＳＫによる分子内共有結合架橋を示す。図３Ａ：Ｌｙｓ２９を標的とするＦＳＫの組み込みのためのＧｌｕ１８を示したユビキチン（ＰＤＢコード：１ＡＡＲ）の構造。図３Ｂ：Ｕｂ（１８ＦＳＫ）のＥＳＩ－ＭＳ。９５８７．９Ｄａのピークは、インタクトなＵｂ（１８ＦＳＫ）に対応する（ＭＷ計算値：９５８７．９Ｄａ）。９５６８．６Ｄａのピークは、Ｌｙｓ２９と反応してＨＦを失うＦＳＫ１８によって分子内架橋されたＵｂに対応する（ＭＷ計算値：９５６７．９）。９５０６．８Ｄａのピークは、ＳＯ_２Ｆを失ったＵｂ（１８ＦＳＫ）（ＭＷ計算値：９５０６．９）に対応し、それはＦＳＫの不純物に起因し得る。トリプシン消化Ｕｂ（１８ＦＳＫ）から同定された架橋ペプチドのタンデム質量スペクトル（図示せず）は、ＦＳＫがデザイン通りにＬｙｓ２９と反応することを示した。

【図4A】ＦＳＫによってＥＧＦＲ受容体を共有結合的に標的化できるようになった７Ｄ１２ナノボディを示す。図４Ａ：ＥＧＦＲと複合体を形成したナノボディ７Ｄ１２の構造（ＰＤＢコード：４ＫＲＬ）を示し、ＥＧＦＲのＨｉｓ３５９を標的とするＦＳＫの組み込みのための７Ｄ１２のＡｒｇ３０及びＳｅｒ３１を示す。図４Ｂ：７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）のＥＳＩ－ＭＳ分析。ＭＷ計算値：１４６７３．１Ｄａ（１対のジスルフィド結合を形成）；ＭＷ測定値：１４６７３．２Ｄａ。図４Ｃ：インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。図４Ｄ：インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のウェスタンブロット解析。７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）のみがＥＧＦＲを共有結合で架橋した。図４Ｅ：Ａ４３１細胞の表面上に発現された天然ＥＧＦＲとのナノボディ７Ｄ１２の架橋のウェスタンブロット解析。７Ｄ１２と７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）を、示された時間間隔でＡ４３１細胞と共にインキュベートして、細胞溶解物を抗Ｈｉｓ抗体で免疫ブロットして、ナノボディ７Ｄ１２を検出した。図４Ｆ：７Ｄ１２（Ｔｙｒ１０９）とＥＧＦＲ（Ｌｙｓ４４３）の間の距離の概略図を示し、Ｌｙｓ４４３をＰＤＢ構造４ＫＲＬにおける部位特異的変異導入後の状態として示した。

【図4B】ＦＳＫによってＥＧＦＲ受容体を共有結合的に標的化できるようになった７Ｄ１２ナノボディを示す。図４Ａ：ＥＧＦＲと複合体を形成したナノボディ７Ｄ１２の構造（ＰＤＢコード：４ＫＲＬ）を示し、ＥＧＦＲのＨｉｓ３５９を標的とするＦＳＫの組み込みのための７Ｄ１２のＡｒｇ３０及びＳｅｒ３１を示す。図４Ｂ：７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）のＥＳＩ－ＭＳ分析。ＭＷ計算値：１４６７３．１Ｄａ（１対のジスルフィド結合を形成）；ＭＷ測定値：１４６７３．２Ｄａ。図４Ｃ：インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。図４Ｄ：インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のウェスタンブロット解析。７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）のみがＥＧＦＲを共有結合で架橋した。図４Ｅ：Ａ４３１細胞の表面上に発現された天然ＥＧＦＲとのナノボディ７Ｄ１２の架橋のウェスタンブロット解析。７Ｄ１２と７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）を、示された時間間隔でＡ４３１細胞と共にインキュベートして、細胞溶解物を抗Ｈｉｓ抗体で免疫ブロットして、ナノボディ７Ｄ１２を検出した。図４Ｆ：７Ｄ１２（Ｔｙｒ１０９）とＥＧＦＲ（Ｌｙｓ４４３）の間の距離の概略図を示し、Ｌｙｓ４４３をＰＤＢ構造４ＫＲＬにおける部位特異的変異導入後の状態として示した。

【図4C】ＦＳＫによってＥＧＦＲ受容体を共有結合的に標的化できるようになった７Ｄ１２ナノボディを示す。図４Ａ：ＥＧＦＲと複合体を形成したナノボディ７Ｄ１２の構造（ＰＤＢコード：４ＫＲＬ）を示し、ＥＧＦＲのＨｉｓ３５９を標的とするＦＳＫの組み込みのための７Ｄ１２のＡｒｇ３０及びＳｅｒ３１を示す。図４Ｂ：７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）のＥＳＩ－ＭＳ分析。ＭＷ計算値：１４６７３．１Ｄａ（１対のジスルフィド結合を形成）；ＭＷ測定値：１４６７３．２Ｄａ。図４Ｃ：インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。図４Ｄ：インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のウェスタンブロット解析。７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）のみがＥＧＦＲを共有結合で架橋した。図４Ｅ：Ａ４３１細胞の表面上に発現された天然ＥＧＦＲとのナノボディ７Ｄ１２の架橋のウェスタンブロット解析。７Ｄ１２と７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）を、示された時間間隔でＡ４３１細胞と共にインキュベートして、細胞溶解物を抗Ｈｉｓ抗体で免疫ブロットして、ナノボディ７Ｄ１２を検出した。図４Ｆ：７Ｄ１２（Ｔｙｒ１０９）とＥＧＦＲ（Ｌｙｓ４４３）の間の距離の概略図を示し、Ｌｙｓ４４３をＰＤＢ構造４ＫＲＬにおける部位特異的変異導入後の状態として示した。

【図4D】ＦＳＫによってＥＧＦＲ受容体を共有結合的に標的化できるようになった７Ｄ１２ナノボディを示す。図４Ａ：ＥＧＦＲと複合体を形成したナノボディ７Ｄ１２の構造（ＰＤＢコード：４ＫＲＬ）を示し、ＥＧＦＲのＨｉｓ３５９を標的とするＦＳＫの組み込みのための７Ｄ１２のＡｒｇ３０及びＳｅｒ３１を示す。図４Ｂ：７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）のＥＳＩ－ＭＳ分析。ＭＷ計算値：１４６７３．１Ｄａ（１対のジスルフィド結合を形成）；ＭＷ測定値：１４６７３．２Ｄａ。図４Ｃ：インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。図４Ｄ：インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のウェスタンブロット解析。７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）のみがＥＧＦＲを共有結合で架橋した。図４Ｅ：Ａ４３１細胞の表面上に発現された天然ＥＧＦＲとのナノボディ７Ｄ１２の架橋のウェスタンブロット解析。７Ｄ１２と７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）を、示された時間間隔でＡ４３１細胞と共にインキュベートして、細胞溶解物を抗Ｈｉｓ抗体で免疫ブロットして、ナノボディ７Ｄ１２を検出した。図４Ｆ：７Ｄ１２（Ｔｙｒ１０９）とＥＧＦＲ（Ｌｙｓ４４３）の間の距離の概略図を示し、Ｌｙｓ４４３をＰＤＢ構造４ＫＲＬにおける部位特異的変異導入後の状態として示した。

【図4E】ＦＳＫによってＥＧＦＲ受容体を共有結合的に標的化できるようになった７Ｄ１２ナノボディを示す。図４Ａ：ＥＧＦＲと複合体を形成したナノボディ７Ｄ１２の構造（ＰＤＢコード：４ＫＲＬ）を示し、ＥＧＦＲのＨｉｓ３５９を標的とするＦＳＫの組み込みのための７Ｄ１２のＡｒｇ３０及びＳｅｒ３１を示す。図４Ｂ：７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）のＥＳＩ－ＭＳ分析。ＭＷ計算値：１４６７３．１Ｄａ（１対のジスルフィド結合を形成）；ＭＷ測定値：１４６７３．２Ｄａ。図４Ｃ：インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。図４Ｄ：インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のウェスタンブロット解析。７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）のみがＥＧＦＲを共有結合で架橋した。図４Ｅ：Ａ４３１細胞の表面上に発現された天然ＥＧＦＲとのナノボディ７Ｄ１２の架橋のウェスタンブロット解析。７Ｄ１２と７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）を、示された時間間隔でＡ４３１細胞と共にインキュベートして、細胞溶解物を抗Ｈｉｓ抗体で免疫ブロットして、ナノボディ７Ｄ１２を検出した。図４Ｆ：７Ｄ１２（Ｔｙｒ１０９）とＥＧＦＲ（Ｌｙｓ４４３）の間の距離の概略図を示し、Ｌｙｓ４４３をＰＤＢ構造４ＫＲＬにおける部位特異的変異導入後の状態として示した。

【図4F】ＦＳＫによってＥＧＦＲ受容体を共有結合的に標的化できるようになった７Ｄ１２ナノボディを示す。図４Ａ：ＥＧＦＲと複合体を形成したナノボディ７Ｄ１２の構造（ＰＤＢコード：４ＫＲＬ）を示し、ＥＧＦＲのＨｉｓ３５９を標的とするＦＳＫの組み込みのための７Ｄ１２のＡｒｇ３０及びＳｅｒ３１を示す。図４Ｂ：７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）のＥＳＩ－ＭＳ分析。ＭＷ計算値：１４６７３．１Ｄａ（１対のジスルフィド結合を形成）；ＭＷ測定値：１４６７３．２Ｄａ。図４Ｃ：インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。図４Ｄ：インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のウェスタンブロット解析。７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）のみがＥＧＦＲを共有結合で架橋した。図４Ｅ：Ａ４３１細胞の表面上に発現された天然ＥＧＦＲとのナノボディ７Ｄ１２の架橋のウェスタンブロット解析。７Ｄ１２と７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）を、示された時間間隔でＡ４３１細胞と共にインキュベートして、細胞溶解物を抗Ｈｉｓ抗体で免疫ブロットして、ナノボディ７Ｄ１２を検出した。図４Ｆ：７Ｄ１２（Ｔｙｒ１０９）とＥＧＦＲ（Ｌｙｓ４４３）の間の距離の概略図を示し、Ｌｙｓ４４３をＰＤＢ構造４ＫＲＬにおける部位特異的変異導入後の状態として示した。

【図5A】哺乳動物細胞におけるタンパク質の架橋のためのタンパク質へのＦＳＫの遺伝的組み込みを示す。図５Ａ：様々な条件下でのＨｅＬａ－ＥＧＦＰ（１８２ＴＡＧ）レポーター細胞の蛍光顕微鏡画像。細胞を、ｐＮＥＵ－ＦＳＫＲＳを用いて、又は用いずにトランスフェクションして、１ｍＭのＦＳＫを用いて、又は用いずに増殖させた。上：明視野；下：ＧＦＰ蛍光チャネル。図５Ｂ：ＨｅＬａ細胞におけるＥＧＦＰへのＦＳＫの組み込みのウェスタンブロット解析。（ａ）のサンプルを溶解させ、抗ＧＦＰ抗体を用いて検出した。ＧＡＰＤＨの発現レベルを参照として使用した。図５Ｃ：哺乳動物細胞におけるＦＳＫによるｅｃＧＳＴ架橋のウェスタンブロット解析。ｐＮＥＵ－ＦＳＫＲＳを、ｐＣＤＮＡ３．１－ｅｃＧＳＴ（ＷＴ）、ｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ）、又はｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ／９２Ａ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションした。ｅｃＧＳＴの二量体架橋を抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出した。ＧＡＰＤＨを参照として使用した。

【図5B】哺乳動物細胞におけるタンパク質の架橋のためのタンパク質へのＦＳＫの遺伝的組み込みを示す。図５Ａ：様々な条件下でのＨｅＬａ－ＥＧＦＰ（１８２ＴＡＧ）レポーター細胞の蛍光顕微鏡画像。細胞を、ｐＮＥＵ－ＦＳＫＲＳを用いて、又は用いずにトランスフェクションして、１ｍＭのＦＳＫを用いて、又は用いずに増殖させた。上：明視野；下：ＧＦＰ蛍光チャネル。図５Ｂ：ＨｅＬａ細胞におけるＥＧＦＰへのＦＳＫの組み込みのウェスタンブロット解析。（ａ）のサンプルを溶解させ、抗ＧＦＰ抗体を用いて検出した。ＧＡＰＤＨの発現レベルを参照として使用した。図５Ｃ：哺乳動物細胞におけるＦＳＫによるｅｃＧＳＴ架橋のウェスタンブロット解析。ｐＮＥＵ－ＦＳＫＲＳを、ｐＣＤＮＡ３．１－ｅｃＧＳＴ（ＷＴ）、ｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ）、又はｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ／９２Ａ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションした。ｅｃＧＳＴの二量体架橋を抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出した。ＧＡＰＤＨを参照として使用した。

【図5C】哺乳動物細胞におけるタンパク質の架橋のためのタンパク質へのＦＳＫの遺伝的組み込みを示す。図５Ａ：様々な条件下でのＨｅＬａ－ＥＧＦＰ（１８２ＴＡＧ）レポーター細胞の蛍光顕微鏡画像。細胞を、ｐＮＥＵ－ＦＳＫＲＳを用いて、又は用いずにトランスフェクションして、１ｍＭのＦＳＫを用いて、又は用いずに増殖させた。上：明視野；下：ＧＦＰ蛍光チャネル。図５Ｂ：ＨｅＬａ細胞におけるＥＧＦＰへのＦＳＫの組み込みのウェスタンブロット解析。（ａ）のサンプルを溶解させ、抗ＧＦＰ抗体を用いて検出した。ＧＡＰＤＨの発現レベルを参照として使用した。図５Ｃ：哺乳動物細胞におけるＦＳＫによるｅｃＧＳＴ架橋のウェスタンブロット解析。ｐＮＥＵ－ＦＳＫＲＳを、ｐＣＤＮＡ３．１－ｅｃＧＳＴ（ＷＴ）、ｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ）、又はｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ／９２Ａ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションした。ｅｃＧＳＴの二量体架橋を抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出した。ＧＡＰＤＨを参照として使用した。

【図6A】実施例に記載されるクローニングに使用するプライマーを示す。

【図6B】実施例に記載されるクローニングに使用するプライマーを示す。

【図7】１８℃で２４時間誘導したＦＳＫＲＳ変異型のＦＳＫ組み込み効率を比較する。

【図8】３０℃で６時間誘導したＦＳＫＲＳ変異型のＦＳＫ組み込み効率を比較する。

【図9】ウェスタンブロットによって検出されたＥＧＦＰ（１８２ＴＡＧ）へのＦＳＫの組み込みを示す。ＦＳＫＲＳをｐＢＡＤ－ＥＧＦＰ（１８２ＴＡＧ）に同時形質転換して、タンパク質の発現を１ｍＭのＦＳＫの存在下、又は非存在下で誘導した。ＥＧＦＰへのＦＳＫの組み込みの成功を、抗ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロットを行うことによって検出した。

【図10】ｓｆＧＦＰ（２ＴＡＧ）及びｓｆＧＦＰ（１５１ＴＡＧ）へのＦＳＫの組み込みを示す。ｐＥＶＯＬ－ＦＳＫＲＳを、それぞれｐＢＡＤ－ｓｆＧＦＰ（２ＴＡＧ）及びｐＢＡＤ－ｓｆＧＦＰ（１５１ＴＡＧ）と共にＤＨ１０ｂ細胞を同時形質転換した。タンパク質の発現を、１ｍＭのＦＳＫの存在下又は非存在下で誘導した。ＥＧＦＰへのＦＳＫの組み込みの成功を、プレートリーダー（励起波長４８５ｎｍ、発光波長５２８ｎｍ）で検出した。プロットは６００ｎｍの光学密度での細菌の増殖に対して正規化した後の値で表した。

【図11】短距離の近接におけるＦＳＹ及びＦＳＫによるＧＳＴの架橋を比較する。ｐＥＶＯＬ－ＦＳＹＲＳ及びｐＥＶＯＬ－ＦＳＫＲＳをそれぞれｅｃＧＳＴ １０３ＴＡＧ／１０７Ａｌａ、ＧＳＴ １０３ＴＡＧ／１０７Ｈｉｓ、ＧＳＴ １０３ＴＡＧ／１０７Ｌｙｓ、ＧＳＴ １０３ＴＡＧ／１０７Ｔｙｒと共発現させ、１ｍＭのＦＳＫ又はＦＳＹの存在下、３７℃で６時間誘導した。ＷＴ ＧＳＴを陰性対照として使用した。ＧＳＴの二量体架橋を、抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロットによって検出した。

【図12A】８６番目の位置におけるＦＳＹ及びＦＳＫによる大腸菌のＧＳＴの架橋を比較する。図１２Ａは、Ｖａｌ８６におけるＦＳＹ／ＦＳＫ架橋の概略図である。図１２Ｂに、１ｍＭのＦＳＫ又はＦＳＹの存在下、３７℃で６時間、ｅｃＧＳＴ ＷＴ又はｐＢＡＤ－ＧＳＴ（８６ＴＡＧ）と共発現させたｐＥＶＯＬ－ＦＳＹＲＳ及びｐＥＶＯＬ－ＦＳＫＲＳの結果を示す。ＷＴ ＧＳＴを陰性対照として使用した。ＧＳＴの二量体架橋を、抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロットによって検出した。

【図12B】８６番目の位置におけるＦＳＹ及びＦＳＫによる大腸菌のＧＳＴの架橋を比較する。図１２Ａは、Ｖａｌ８６におけるＦＳＹ／ＦＳＫ架橋の概略図である。図１２Ｂに、１ｍＭのＦＳＫ又はＦＳＹの存在下、３７℃で６時間、ｅｃＧＳＴ ＷＴ又はｐＢＡＤ－ＧＳＴ（８６ＴＡＧ）と共発現させたｐＥＶＯＬ－ＦＳＹＲＳ及びｐＥＶＯＬ－ＦＳＫＲＳの結果を示す。ＷＴ ＧＳＴを陰性対照として使用した。ＧＳＴの二量体架橋を、抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロットによって検出した。

【図13】Ｔｒｘ及びＣｙｓＨの架橋におけるＦＳＫ及びＦＳＹによる架橋効率を比較する。

【図14】１ｍＭのＦＳＫの存在下及び非存在下での発現における７Ｄ１２（３０ＦＳＫ）及び７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）の精製を示す。

【図15】インビトロでのＥＧＦＲとの架橋における７Ｄ１２（３０ＦＳＫ）、７Ｄ１２（３０ＦＳＹ）、７Ｄ１２（１０９ＦＳＫ）及び７Ｄ１２（１０９ＦＳＹ）の利用を示す。

【図16】インビボでの未知の基質との架橋におけるＴｒｘ（５９ＦＳＫ）、Ｔｒｘ（６２ＦＳＫ）、Ｔｒｘ（５９ＦＳＹ）、Ｔｒｘ（６２ＦＳＹ）の利用を示す。

【図17】生細胞における遺伝的にコードされた化学的架橋によるＴｒｘの基質タンパク質の同定におけるＦＳＫ又はＦＳＹの使用の概略図である。

【図18】フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン（ＦＳＫ）の合成のスキームを示す。

【図19】培地中にＦＳＫが存在しない場合、又は培地中に１ｍＭのＦＳＫが存在する場合の、異なるＦＳＫＲＳを用いたｓｆＧＦＰ（１５１ＴＡＧ）へのＦＳＫの組み込みを示す（＋は培地中に１ｍＭのＦＳＫが存在することを示す）。細胞を３７℃で増殖させ、５．５時間誘導した。ｓｆＧＦＰの蛍光強度を測定して、細胞の光学密度で正規化した。ＮＴｈｉｓは、Ｈｉｓｘ６がＮ端に付加されたことを意味し、ＣＴｈｉｓは、Ｈｉｓｘ６がＣ端に付加されたことを意味する。

【図20】培地中に１ｍＭのＦＳＫが存在しない場合、及び存在する場合の、異なるＦＳＫＲＳを用いたｓｆＧＦＰ（１５１ＴＡＧ）へのＦＳＫの組み込みを示す。細胞を１８℃で増殖させ、２４時間誘導した後、蛍光強度を測定して、ＯＤ正規化した。

【図21A】インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のウェスタンブロット解析を示し、ここで、ナノボディ７Ｄ１２は、１０９位、１１３位、及び１１６位にＦＳＹを含有するか（図２１Ａ）、又は１位、１０９位、若しくは１１３位にＦＳＹを含有する（図２１Ｂ）。ナノボディ７Ｄ１２を、１５μｌのＰＢＳ中の５００ｎＭのＥＧＦＲと共に３７℃で２０時間インキュベートした。ナノボディ７Ｄ１２は、配列番号８８として示される。

【図21B】インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のウェスタンブロット解析を示し、ここで、ナノボディ７Ｄ１２は、１０９位、１１３位、及び１１６位にＦＳＹを含有するか（図２１Ａ）、又は１位、１０９位、若しくは１１３位にＦＳＹを含有する（図２１Ｂ）。ナノボディ７Ｄ１２を、１５μｌのＰＢＳ中の５００ｎＭのＥＧＦＲと共に３７℃で２０時間インキュベートした。ナノボディ７Ｄ１２は、配列番号８８として示される。

【図22A】インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のＳＤＳ Ｐａｇｅ分析（図２２Ａ）及びウェスタンブロット解析（図２２Ｂ）を示し、ここで、ナノボディ７Ｄ１２は１０９位にＦＳＹを含有する。２μＭの精製ナノボディ７Ｄ１２を、１５ｕｌのＰＢＳ中の５００ｎＭのＥＧＦＲと共に３７℃で２０時間インキュベートした。

【図22B】インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のＳＤＳ Ｐａｇｅ分析（図２２Ａ）及びウェスタンブロット解析（図２２Ｂ）を示し、ここで、ナノボディ７Ｄ１２は１０９位にＦＳＹを含有する。２μＭの精製ナノボディ７Ｄ１２を、１５ｕｌのＰＢＳ中の５００ｎＭのＥＧＦＲと共に３７℃で２０時間インキュベートした。

【図23】ナノボディ７Ｄ１２ ＷＴ又は１０９位にＦＳＹを含有するナノボディ７Ｄ１２とＡ４３１細胞株との共有結合架橋のウェスタンブロット解析である。

【図24A】インビトロでナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のＳＤＳ Ｐａｇｅ分析（図２４Ａ）及びウェスタンブロット解析（図２４Ｂ）を示し、ここで、ナノボディ７Ｄ１２は３０位若しくは３１位にＦＳＫを含有するか、又はナノボディ７Ｄ１２は１０９位にＦＳＹを含有する。２μＭの精製ナノボディ７Ｄ１２を、１５ｕｌのＰＢＳ中の５００ｎＭのＥＧＦＲと共に３７℃で２０時間インキュベートした。

【図24B】インビトロでナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のＳＤＳ Ｐａｇｅ分析（図２４Ａ）及びウェスタンブロット解析（図２４Ｂ）を示し、ここで、ナノボディ７Ｄ１２は３０位若しくは３１位にＦＳＫを含有するか、又はナノボディ７Ｄ１２は１０９位にＦＳＹを含有する。２μＭの精製ナノボディ７Ｄ１２を、１５ｕｌのＰＢＳ中の５００ｎＭのＥＧＦＲと共に３７℃で２０時間インキュベートした。

【図25A】インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のＳＤＳ Ｐａｇｅ分析（図２５Ａ）及びウェスタンブロット解析（図２５Ｂ）を示し、ここで、ナノボディ７Ｄ１２は３１位にＦＳＫを含有するか、又はナノボディ７Ｄ１２は１０９位にＦＳＹを含有する。２μＭの精製ナノボディ７Ｄ１２を、１５ｕｌのＰＢＳ中の５００ｎＭのＥＧＦＲと共に３７℃で２０時間インキュベートした。

【図25B】インビトロでのナノボディ７Ｄ１２とＥＧＦＲとの共有結合架橋のＳＤＳ Ｐａｇｅ分析（図２５Ａ）及びウェスタンブロット解析（図２５Ｂ）を示し、ここで、ナノボディ７Ｄ１２は３１位にＦＳＫを含有するか、又はナノボディ７Ｄ１２は１０９位にＦＳＹを含有する。２μＭの精製ナノボディ７Ｄ１２を、１５ｕｌのＰＢＳ中の５００ｎＭのＥＧＦＲと共に３７℃で２０時間インキュベートした。

【発明を実施するための形態】

【0020】

定義
本明細書で使用される略語は、化学的及び生物学的分野内のそれらの従来の意味を有する。本明細書に記載の化学構造及び式は、化学的分野に公知の化学原子価の標準規則に従って構築される。

【0021】

置換基は、左から右に書かれたそれらの従来の化学式によって特定される場合、右から左に構造を書くことから生じるであろう化学的に同一の置換基を等しく包含し、例えば、－ＣＨ_２Ｏ－は－ＯＣＨ_２－と等しい。

【0022】

「アルキル」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、特に明記しない限り、直鎖（すなわち、非分岐）又は分岐炭素鎖（又は炭素）、又はそれらの組み合わせを意味し、これは、完全飽和、一価又は多価不飽和であってもよく、一価、二価、及び多価ラジカルを含むことができる。アルキルは、指定された数の炭素を含んでもよい（例えば、Ｃ_１～Ｃ_１０は、１～１０個の炭素を意味する）。アルキルは非環化鎖である。飽和炭化水素ラジカルの例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、メチルなどの基、例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルなどの相同体及び異性体が挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合又は三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、２－プロペニル、クロチル、２－イソペンテニル、２－（ブタジエニル）、２，４－ペンタジエニル、３－（１，４－ペンタジエニル）、エチニル、１－及び３－プロピニル、３－ブチニル、並びに高級相同体及び異性体が挙げられるが、これらに限定されない。アルコキシは、酸素リンカー（－Ｏ－）を介して分子の残り部分に結合しているアルキルである。アルキル部分は、アルケニル部分であり得る。アルキル部分は、アルキニル部分であり得る。アルキル部分は、完全飽和であり得る。アルケニルは、１つ以上の二重結合に加えて、１つ超の二重結合及び／又は１つ以上の三重結合を含んでもよい。アルキニルは、１つ以上の三重結合に加えて、１つを超える三重結合及び／又は１つ以上の二重結合を含み得る。

【0023】

「アルキレン」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、特に明記しない限り、アルキルに由来する二価のラジカルを意味し、限定はされないが、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－によって例示される。典型的には、アルキル（又はアルキレン）基は、１～２４個の炭素原子を有し、１０個以下の炭素原子を有する基が本明細書では好ましい。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は、概して８個以下の炭素原子を有する短鎖のアルキル基又はアルキレン基である。「アルケニレン」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、特に明記しない限り、アルケンに由来する二価のラジカルを意味する。

【0024】

「ヘテロアルキル」という用語は、単独で、又は別の用語と組み合わせて、別途明記されない限り、少なくとも１個の炭素原子及び少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ、及びＳ）を含む安定した直鎖若しくは分岐鎖、又はそれらの組み合わせを意味し、窒素原子及び硫黄原子は、任意に酸化され得、窒素ヘテロ原子は、任意に四級化され得る。ヘテロ原子は、ヘテロアルキル基内部の任意の位置に、又はアルキル基が分子の残りの部分に結合している位置に配置されていてもよい。ヘテロアルキルは、非環化鎖である。例としては、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２、－Ｓ（Ｏ）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｏ－ＣＨ_３、－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、－ＣＨ_２－ＣＨ＝Ｎ－ＯＣＨ_３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３、－Ｏ－ＣＨ_３、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_３、及び－ＣＮが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、－ＣＨ_２－ＮＨ－ＯＣＨ_３及び－ＣＨ_２－Ｏ－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３などの最大２個又は３個のヘテロ原子が連続し得る。ヘテロアルキル部分は、１個のヘテロ原子を含み得る。ヘテロアルキル部分は、２個の任意に異なるヘテロ原子を含み得る。ヘテロアルキル部分は、３個の任意に異なるヘテロ原子を含み得る。ヘテロアルキル部分は、４個の任意に異なるヘテロ原子を含み得る。ヘテロアルキル部分は、５個の任意に異なるヘテロ原子を含み得る。ヘテロアルキル部分は、最大８個の任意に異なるヘテロ原子を含み得る。「ヘテロアルケニル」という用語は、単独で、又は別の用語と組み合わせて、別途記述されない限り、少なくとも１つの二重結合を含むヘテロアルキルを意味する。ヘテロアルケニルは、任意に、１つ以上の二重結合に加えて、２つ以上の二重結合及び／又は１つ以上の三重結合を含み得る。「ヘテロアルキニル」という用語は、単独で、又は別の用語と組み合わせて、別途記述されない限り、少なくとも１つの三重結合を含むヘテロアルキルを意味する。ヘテロアルキニルは、任意に、１つ以上の三重結合に加えて、２つ以上の三重結合及び／又は１つ以上の二重結合を含み得る。

【0025】

同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、特に明記しない限り、ヘテロアルキルに由来する二価のラジカルを意味し、限定はされないが、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－及び－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－によって例示される。ヘテロアルキレン基については、ヘテロ原子はまた、鎖の末端のうちのいずれか、又は両方を占有し得る（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。なお更に、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基の場合、連結基の配向は、連結基の式が書かれた方向によって暗示されない。例えば、式－Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’－は、－Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’－及び－Ｒ’Ｃ（Ｏ）_２－の両方を表す。上記のように、本明細書で使用されるヘテロアルキル基は、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、－ＮＲ’Ｒ’’、－ＯＲ’、－ＳＲ’、及び／又は－ＳＯ_２Ｒ’などの、ヘテロ原子を介して分子の残り部分に結合している基を含む。「ヘテロアルキル」が列挙された後に特定のヘテロアルキル基、例えば、－ＮＲ’Ｒ’’などが列挙される場合、ヘテロアルキル及び－ＮＲ’Ｒ’’という用語が冗長でも相互排他的でもないことが理解されよう。むしろ、特定のヘテロアルキル基が明確化のために列挙される。したがって、「ヘテロアルキル」という用語は、本明細書では、－ＮＲ’Ｒ’’などの特定のヘテロアルキル基を除外するものとして解釈されるべきではない。

【0026】

「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それ自体で又は他の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、それぞれ「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の環式バージョンを意味する。シクロアルキル及びヘテロシクロアルキルは、芳香族ではない。加えて、ヘテロシクロアルキルの場合、ヘテロ原子は、複素環が分子の残り部分に結合している位置を占有し得る。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、１－シクロヘキセニル、３－シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例としては、１－（１，２，５，６－テトラヒドロピリジル）、１－ピペリジニル、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－モルホリニル、３－モルホリニル、テトラヒドロフラン－２－イル、テトラヒドロフラン－３－イル、テトラヒドロチエン－２－イル、テトラヒドロチエン－３－イル、１－ピペラジニル、２－ピペラジニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。「シクロアルキレン」及び「ヘテロシクロアルキレン」は、単独で、又は別の置換基の一部として、それぞれ、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキルに由来する二価のラジカルを意味する。

【0027】

実施形態では、「シクロアルキル」という用語は、単環式、二環式又は多環式シクロアルキル環系を意味する。態様では、単環式環系は、３～８個の炭素原子を含む環状炭化水素基であり、そのような基は、飽和又は不飽和であり得るが、芳香族ではない。態様では、シクロアルキル基は、完全に飽和している。単環式シクロアルキルの例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが含まれる。二環式シクロアルキル環系は、架橋単環式環又は縮合二環式環である。態様では、架橋単環式環は、単環式環の２つの隣接していない炭素原子がさらなる１～３個の炭素原子のアルキレン架橋（すなわち、式中のｗが１、２、又は３である（ＣＨ_２）_ｗの形態の架橋基）によって連結された単環式シクロアルキル環を含む。二環式環系の代表的な例としては、ビシクロ［３．１．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．２］オクタン、ビシクロ［３．２．２］ノナン、ビシクロ［３．３．１］ノナン、及びビシクロ［４．２．１］ノナンが挙げられるが、これらに限定されない。態様では、縮合二環式シクロアルキル環系は、フェニル、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、単環式ヘテロシクリル、又は単環式ヘテロアリールのいずれかに縮合した単環式シクロアルキル環を含む。態様では、架橋又は縮合二環式シクロアルキルは、単環式シクロアルキル環内に含まれる任意の炭素原子を介して親分子部分に結合される。態様では、シクロアルキル基は、任意選択で、独立してオキソ又はチアである、１つ又は２つの基で置換されている。態様では、縮合二環式シクロアルキルは、フェニル環、５若しくは６員単環式シクロアルキル、５若しくは６員単環式シクロアルケニル、５若しくは６員単環式ヘテロシクリル、又は５若しくは６員単環式ヘテロアリールのいずれかに縮合した５若しくは６員単環式シクロアルキル環であり、縮合二環式シクロアルキルは、任意選択で、独立してオキソ又はチアである、１つ又は２つの基によって置換されている。態様では、多環式シクロアルキル環系は、（ｉ）二環式アリール、二環式ヘテロアリール、二環式シクロアルキル、二環式シクロアルケニル、及び二環式ヘテロシクリルからなる群から選択される１つの環系、又は（ｉｉ）フェニル、二環式アリール、単環式若しくは二環式ヘテロアリール、単環式若しくは二環式シクロアルキル、単環式若しくは二環式シクロアルケニル、及び単環式若しくは二環式ヘテロシクリルからなる群から独立して選択される２つの別の環系のいずれかに縮合した単環式シクロアルキル環（基本環）である。態様では、多環式シクロアルキルは、塩基環内に含まれる任意の炭素原子を介して親分子部分に結合される。態様では、多環式シクロアルキル環系は、（ｉ）二環式アリール、二環式ヘテロアリール、二環式シクロアルキル、二環式シクロアルケニル、及び二環式ヘテロシクリルからなる群から選択される１つの環系、又は（ｉｉ）フェニル、単環式ヘテロアリール、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、及び単環式ヘテロシクリルからなる群から独立して選択される２つの別の環系のいずれかに縮合した単環式シクロアルキル環（基本環）である。多環式シクロアルキル基の例としては、テトラデカヒドロフェナントレニル、ペルヒドロフェノチアジン－１－イル、及びペルヒドロフェノキサジン－１－イルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0028】

実施形態では、シクロアルキルは、シクロアルケニルである。「シクロアルケニル」という用語は、その平易な通常の意味に従って使用される。態様では、シクロアルケニルは、単環式、二環式、又は多環式シクロアルケニル環系である。態様では、単環式シクロアルケニル環系は、３～８個の炭素原子を含む環状炭化水素基であり、そのような基は不飽和である（すなわち、少なくとも１つの環状炭素炭素二重結合を含む）が、芳香族ではない。単環式シクロアルケニル環系の例としては、シクロペンテニル及びシクロヘキセニルが挙げられる。態様では、二環式シクロアルケニル環は、架橋単環式環又は縮合二環式環である。態様では、架橋単環式環は、単環式環の２つの隣接していない炭素原子が１～３個の追加の炭素原子のアルキレン架橋（すなわち、形態（ＣＨ_２）_ｗの架橋基、式中、ｗは、１、２、又は３である）によって連結される単環式シクロアルケニル環を含む。二環式シクロアルケニルの代表的な例としては、ノルボルネニル及びビシクロ［２．２．２］オクト２エニルが挙げられるが、これらに限定されない。態様では、縮合二環式シクロアルケニル環系は、フェニル、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、単環式ヘテロシクリル、又は単環式ヘテロアリールのいずれかに縮合した単環式シクロアルケニル環を含む。態様では、架橋又は縮合二環式シクロアルケニルは、単環式シクロアルケニル環内に含まれる任意の炭素原子を介して親分子部分に結合される。態様では、シクロアルケニル基は、任意選択で、独立してオキソ又はチアである、１つ又は２つの基で置換されている。態様では、多環式シクロアルケニル環は、（ｉ）二環式アリール、二環式ヘテロアリール、二環式シクロアルキル、二環式シクロアルケニル、及び二環式ヘテロシクリルからなる群から選択される１つの環系、又は（ｉｉ）フェニル、二環式アリール、単環式若しくは二環式ヘテロアリール、単環式若しくは二環式シクロアルキル、単環式若しくは二環式シクロアルケニル、及び単環式若しくは二環式ヘテロシクリルからなる群から独立して選択される２つの環系のいずれかに縮合した単環式シクロアルケニル環（基本環）を含有する。態様では、多環式シクロアルケニルは、基礎環内に含まれる任意の炭素原子を介して親分子部分に結合される。態様では、多環式シクロアルケニル環は、（ｉ）二環式アリール、二環式ヘテロアリール、二環式シクロアルキル、二環式シクロアルケニル、及び二環式ヘテロシクリルからなる群から選択される１つの環系、（ｉｉ）フェニル、単環式ヘテロアリール、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、及び単環式ヘテロシクリルからなる群から独立して選択される２つの環系のいずれかに縮合した単環式シクロアルケニル環（基本環）を含有する。

【0029】

実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、ヘテロシクリルである。本明細書で使用される場合、「ヘテロシクリル」という用語は、単環式、二環式又は多環式複素環を意味する。ヘテロシクリル単環式ヘテロ環は、環が飽和又は不飽和であるが芳香族ではない、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む、３、４、５、６、又は７員環である。３又は４員環には、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択された１個のヘテロ原子が含まれる。５員環には、０又は１つの二重結合と、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１、２、又は３個のヘテロ原子とが含まれ得る。６又は７員環には、０、１、又は２つの二重結合と、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１、２、又は３個のヘテロ原子とが含まれ得る。ヘテロシクリル単環式ヘテロ環は、ヘテロシクリル単環式ヘテロ環内に含まれる任意の炭素原子又は任意の窒素原子を介して親分子部分に接続されている。ヘテロシクリル単環式ヘテロ環の代表的な例としては、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３－ジオキサニル、１，３－ジオキソラニル、１，３－ジチオラニル、１，３－ジチアニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソキサゾリニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、チラゾリニル、チアゾリジニル、チオモルホリニル、１，１－ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニル、及びトリチアニルが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクリル二環式ヘテロ環は、フェニル、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、単環式ヘテロ環、又は単環式ヘテロアリールのいずれかに縮合した単環式ヘテロ環である。ヘテロシクリル二環式ヘテロ環は、二環式環系の単環式ヘテロ環部分内に含まれる任意の炭素原子又は任意の窒素原子を介して親分子部分に接続されている。二環式ヘテロシクリルの代表的な例としては、２，３－ジヒドロベンゾフラン－２－イル、２，３－ジヒドロベンゾフラン－３－イル、インドリン－１－イル、インドリン－２－イル、インドリン－３－イル、２，３－ジヒドロベンゾチエン－２－イル、デカヒドロキノリニル、デカヒドロイソキノリニル、オクタヒドロ－１Ｈ－インドリル、及びオクタヒドロベンゾフラニルが挙げられるが、これらに限定されない。態様では、ヘテロシクリル基は、任意選択で、独立してオキソ又はチアである、１つ又は２つの基で置換されている。ある特定の態様では、二環式ヘテロシクリルは、フェニル環、５若しくは６員単環式シクロアルキル、５若しくは６員単環式シクロアルケニル、５若しくは６員単環式ヘテロシクリル、又は５若しくは６員単環式ヘテロアリールに縮合した５若しくは６員単環式シクリル環であり、二環式シクリルは、任意選択で、独立してオキソ又はチアである、１つ又は２つの基によって置換されている。多環式ヘテロシクリル環系は、（ｉ）二環式アリール、二環式ヘテロアリール、二環式シクロアルキル、二環式シクロアルケニル、及び二環式ヘテロシクリルからなる群から選択される１つの環系、又は（ｉｉ）フェニル、二環式アリール、単環式若しくは二環式ヘテロアリール、単環式若しくは二環式シクロアルキル、単環式若しくは二環式シクロアルケニル、及び単環式若しくは二環式ヘテロシクリルからなる群から独立して選択される２つの別の環系のいずれかに縮合した単環式ヘテロシクリル環（基本環）である。多環式ヘテロシクリルは、基礎環内に含まれる任意の炭素原子又は窒素原子を介して親分子部分に結合している。態様では、多環式ヘテロシクリル環系は、（ｉ）二環式アリール、二環式ヘテロアリール、二環式シクロアルキル、二環式シクロアルケニル、及び二環式ヘテロシクリルからなる群から選択される１つの環系、又は（ｉｉ）フェニル、単環式ヘテロアリール、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、及び単環式ヘテロシクリルからなる群から独立して選択される２つの別の環系のいずれかに縮合した単環式ヘテロシクリル環（基本環）である。多環式ヘテロシクリル基の例としては、１０Ｈ－フェノチアジン－１０－イル、９，１０－ジヒドロアクリジン－９－イル、９，１０－ジヒドロアクリジン－１０－イル、１０Ｈ－フェノキサジン－１０－イル、１０，１１－ジヒドロ－５Ｈ－ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン－５－イル、１，２，３，４－テトラヒドロピリド［４，３－ｇ］イソキノリン－２－イル、１２Ｈ－ベンゾ［ｂ］フェノキサジン－１２－イル、及びドデカヒドロ－１Ｈ－カルバゾール－９－イルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0030】

「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、単独で、又は別の置換基の一部として、別途明記されない限り、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素原子を意味する。更に、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、「ハロ（Ｃ_１～Ｃ_４）アルキル」という用語としては、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２－トリフルオロエチル、４－クロロブチル、３－ブロモプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0031】

「アシル」という用語は、別途明記されない限り、－Ｃ（Ｏ）Ｒを意味し、Ｒは、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールである。

【0032】

「アリール」という用語は、別途明記されない限り、多価不飽和、芳香族、炭化水素置換基を意味し、これらは、単一の環、又は一緒に縮合している（すなわち縮合環アリール）若しくは共有結合している多環（好ましくは１～３環）であり得る。縮合環アリールは、縮合環のうちの少なくとも１つがアリール環である、一緒に縮合した複数の環を指す。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ、又はＳなどの少なくとも１個のヘテロ原子を含むアリール基（又は環）を指し、窒素原子及び硫黄原子は任意に酸化され、窒素原子は任意に四級化される。したがって、「ヘテロアリール」という用語は、縮合環ヘテロアリール基（すなわち、縮合環のうちの少なくとも１つが芳香族複素環である、一緒に縮合している複数の環）を含む。５，６－縮合環ヘテロアリーレンは、一方の環が５員を有し、他方の環が６員を有し、少なくとも一方の環がヘテロアリール環である、一緒に縮合している２つの環を指す。同様に、６，６－縮合環ヘテロアリーレンは、一方の環が６員を有し、他方の環が６員を有し、少なくとも一方の環がヘテロアリール環である、一緒に縮合している２つの環を指す。また、６，５－縮合環ヘテロアリーレンは、一方の環が６員を有し、他方の環が５員を有し、少なくとも一方の環がヘテロアリール環である、一緒に縮合している２つの環を指す。ヘテロアリール基は、炭素原子又はヘテロ原子を介して分子の残り部分に結合することができる。アリール基及びヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、ナフチル、ピロリル、ピラゾリル、ピリダジニル、トリアジニル、ピリミジニル、イミダゾリル、ピラジニル、プリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、フリル、チエニル、ピリジル、ピリミジル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラン、イソベンゾフラニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾチオフェニル、イソキノリル、キノキサリニル、キノリル、１－ナフチル、２－ナフチル、４－ビフェニル、１－ピロリル、２－ピロリル、３－ピロリル、３－ピラゾリル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル、ピラジニル、２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、２－フェニル－４－オキサゾリル、５－オキサゾリル、３－イソオキサゾリル、４－イソオキサゾリル、５－イソオキサゾリル、２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル、２－フリル、３－フリル、２－チエニル、３－チエニル、２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル、２－ピリミジル、４－ピリミジル、５－ベンゾチアゾリル、プリニル、２－ベンゾイミダゾリル、５－インドリル、１－イソキノリル、５－イソキノリル、２－キノキサリニル、５－キノキサリニル、３－キノリル、及び６－キノリルが挙げられる。上記のアリール環系及びヘテロアリール環系の各々に対する置換基は、以下に記載の許容される置換基の群から選択される。「アリーレン」及び「ヘテロアリーレン」は、単独で、又は別の置換基の一部として、それぞれ、アリール及びヘテロアリールに由来する二価のラジカルを意味する。ヘテロアリール基置換基は、環ヘテロ原子窒素に－Ｏ－結合していてもよい。

【0033】

縮合環ヘテロシクロアルキル－アリールは、ヘテロシクロアルキルに縮合したアリールである。縮合環ヘテロシクロアルキル－ヘテロアリールは、ヘテロシクロアルキルに縮合したヘテロアリールである。縮合環ヘテロシクロアルキル－シクロアルキルは、シクロアルキルに縮合したヘテロシクロアルキルである。縮合環ヘテロシクロアルキル－ヘテロシクロアルキルは、別のヘテロシクロアルキルに縮合したヘテロシクロアルキルである。縮合環ヘテロシクロアルキル－アリール、縮合環ヘテロシクロアルキル－ヘテロアリール、縮合環ヘテロシクロアルキル－シクロアルキル、又は縮合環ヘテロシクロアルキル－ヘテロシクロアルキルは、各々独立して、非置換であるか、又は本明細書に記載される置換基の１つ以上で置換され得る。

【0034】

スピロ環式環は、隣接する環が単一の原子を介して結合している２つ以上の環である。スピロ環式環内の個々の環は、同一であっても異なっていてもよい。スピロ環式環内の個々の環は、置換であっても非置換であってもよく、一組のスピロ環式環内の他の個々の環とは異なる置換基を有してもよい。スピロ環式環内のそれぞれの環における可能な置換基は、スピロ環式環の一部ではない場合の同じ環で可能な置換基（例えば、シクロアルキル環又はヘテロシクロアルキル環の置換基）である。スピロ環式環は、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、又は置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレンであってもよく、スピロ環式環内の個々の環は、全ての環が１つの種類である場合も含み、直前のリストのうちのいずれかであってもよい（例えば、全ての環が置換ヘテロシクロアルキレンであり、各環が同じ又は異なる置換ヘテロシクロアルキレンであってもよい）。スピロ環式環系について言及するとき、複素環式スピロ環式環は、少なくとも１つの環が複素環式環であり、各環が異なる環であってもよい、スピロ環式環を意味する。スピロ環式環系に言及するとき、置換スピロ環式環は、少なくとも１つの環が置換されており、各置換基が、任意に異なっていてもよいことを意味する。

【0035】

記号

【0036】

【化7】

又は「－」は、分子又は化学式の残りの部分への化学式部分の結合点を示す。

【0037】

「オキソ」という用語は、炭素原子に二重結合している酸素を意味する。

【0038】

本明細書で使用される「アルキルスルホニル」という用語は、式－Ｓ（Ｏ_２）－Ｒ’を有する部分を意味し、Ｒ’は、上記で定義された置換若しくは非置換アルキル基である。Ｒ’は、指定された数の炭素原子を有し得る（例えば、「Ｃ_１～Ｃ_４アルキルスルホニル」）。

【0039】

アルキレン部分（本明細書ではアルキレンリンカーとも称される）に共有結合しているアリーレン部分としての「アルキルアリーレン」という用語。態様では、アルキルアリーレン基は、以下の式を有する：

【0040】

【化8】

【0041】

アルキルアリーレン部分は、アルキレン部分又はアリーレンリンカー（例えば、炭素２、３、４、又は６）において、ハロゲン、オキソ、－Ｎ_３、－ＣＦ_３、－ＣＣｌ_３、－ＣＢｒ_３、－ＣＩ_３、－ＣＮ、－ＣＨＯ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_２ＣＨ_３、－ＳＯ_３Ｈ、－ＯＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_５アルキル、又は置換若しくは非置換２～５員ヘテロアルキル）（例えば、置換基で）置換されていてもよい。態様では、アルキルアリーレン部分は非置換である。

【0042】

上記の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」、及び「ヘテロアリール」）の各々は、示されるラジカルの置換形態及び非置換形態の両方を含む。各種類のラジカルの好ましい置換基が以下に提供される。

【0043】

アルキルラジカル及びヘテロアルキルラジカル（多くの場合、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニルと称される基を含む）の置換基は、ゼロから（２ｍ’＋１）（式中、ｍ’が、そのようなラジカル内の炭素原子の総数である）までの範囲の数で、－ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ－ＯＲ’、－ＮＲ’Ｒ’’、－ＳＲ’、－ハロゲン、－ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ_２Ｒ’、－ＣＯＮＲ’Ｒ’’、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＮＲ’－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲＳＯ_２Ｒ’、－ＮＲ’ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＯＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’ＮＲ’’’Ｒ’’’’、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－ＮＲ’ＳＯ_２Ｒ’’、－ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、－ＮＲ’Ｃ（Ｏ）－ＯＲ’’、－ＮＲ’ＯＲ’’から選択されるが、これらに限定されない様々な基のうちの１つ以上であり得る。Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、及びＲ’’’’は、各々好ましくは独立して、水素、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール（例えば、１～３個のハロゲンで置換されたアリール）、置換若しくは非置換ヘテロアリール、置換若しくは非置換アルキル、アルコキシ、若しくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を指す。本明細書に記載の化合物が、１つ超のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基の各々は、これらの基が１つ超存在するとき、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、及びＲ’’’’基として独立して選択される。Ｒ’及びＲ’’が同じ窒素原子に結合している場合、それらは、窒素原子と組み合わせられて、４、５、６、又は７員環を形成し得る。例えば、－ＮＲ’Ｒ’’には、１－ピロリジニル及び４－モルホリニルが挙げられるが、これらに限定されない。置換基についての上記の考察から、当業者であれば、「アルキル」という用語が、ハロアルキル（例えば、－ＣＦ_３及び－ＣＨ_２ＣＦ_３）及びアシル（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＦ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＯＣＨ_３など）などの水素基以外の基に結合している炭素原子を含む基を含むよう意図されていることを理解するであろう。

【0044】

アルキルラジカルについて記載した置換基と同様に、アリール及びヘテロアリール基の置換基は、変化し、例えば、芳香環系上のゼロから開放原子価の総数までの範囲の数で、－ＯＲ’、－ＮＲ’Ｒ’’、－ＳＲ’、－ハロゲン、－ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ_２Ｒ’、－ＣＯＮＲ’Ｒ’’、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＮＲ’－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲＳＯ_２Ｒ’、－ＮＲ’ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＯＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’ＮＲ’’’Ｒ’’’’、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－Ｒ’、－Ｎ_３、－ＣＨ（Ｐｈ）_２、フルオロ（Ｃ_１～Ｃ_４）アルコキシ、及びフルオロ（Ｃ_１～Ｃ_４）アルキル、－ＮＲ’ＳＯ_２Ｒ’’、－ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、－ＮＲ’Ｃ（Ｏ）－ＯＲ’’、－ＮＲ’ＯＲ’’から選択され、式中、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、及びＲ’’’’が、好ましくは、独立して、水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、及び置換若しくは非置換ヘテロアリールから選択される。本明細書に記載の化合物が、１つ超のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基の各々は、これらの基が１つ超存在するとき、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、及びＲ’’’’基として独立して選択される。

【0045】

環（例えば、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、又はヘテロアリーレン）の置換基は、環の特定の原子上ではなく、環上の置換基（一般に浮遊置換基と称される）として示されてもよい。このような場合、置換基は、（化学原子価の規則に従って）環原子のいずれかに結合してもよく、縮合環又はスピロ環式環の場合、縮合環又はスピロ環式環の１員と結合しているものとして示される置換基（単環上の浮遊置換基）は、縮合環又はスピロ環式環のいずれか上の置換基（多環上の浮遊置換基）であってもよい。置換基が特定の原子ではなく環に結合しており（浮遊置換基）、置換基の下付き文字が１より大きい整数である場合、複数の置換基は、同じ原子、同じ環、異なる原子、異なる縮合環、異なるスピロ環式環上にあってもよく、各置換基は任意に異なっていてもよい。分子の残り部分への環の結合点が単一の原子に限定されない場合（浮遊置換基）、結合点は、その環の任意の原子であってもよく、縮合環又はスピロ環式環の場合、化学原子価の規則に従って、縮合環又はスピロ環式環のうちのいずれかの任意の原子であり得る。環、縮合環、又はスピロ環式環が１つ以上の環ヘテロ原子を含み、環、縮合環、又はスピロ環式環がもう１つの浮遊置換基（分子の残り部分への結合点を含むが、これに限定されない）とともに示される場合、浮遊置換基は、ヘテロ原子に結合してもよい。環ヘテロ原子が浮遊置換基を有する構造又は式において、１つ以上の水素に結合していることが示され（例えば、環原子への２つの結合及び水素への第３の結合を有する環窒素）、ヘテロ原子が浮遊置換基に結合している場合、置換基は、化学原子価の規則に従って、水素を置き換えると理解される。

【0046】

２つ以上の置換基が、任意に連結して、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、又はヘテロシクロアルキル基を形成し得る。このようないわゆる環形成置換基は、必ずとは言えないが典型的には、環状基礎構造に結合した形で認められる。一実施形態では、環形成置換基は、基礎構造の隣接する成員に結合している。例えば、環状基礎構造の隣接する成員に結合している２つの環形成置換基は、縮合環構造を形成する。別の実施形態では、環形成置換基は、基礎構造の単一の成員に結合している。例えば、環状基礎構造の単一の成員に結合している２つの環形成置換基は、スピロ環式構造を創出する。更に別の実施形態では、環形成置換基は、基礎構造の隣接していない成員に結合している。

【0047】

アリール又はヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、任意に、式－Ｔ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＲＲ’）_ｑ－Ｕ－の環を形成し得、式中、Ｔ及びＵは、独立して、－ＮＲ－、－Ｏ－、－ＣＲＲ’－、又は単結合であり、ｑは、０～３の整数である。代替的に、アリール又はヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、任意に、式－Ａ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｂ－の置換基で置き換えられてもよく、式中、Ａ及びＢは、独立して、－ＣＲＲ’－、－Ｏ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’－、又は単結合であり、ｒは、１～４の整数である。そのように形成された新たな環の単結合のうちの１つは、二重結合で任意に置き換えられ得る。代替的に、アリール環又はヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、任意に、式－（ＣＲＲ’）_ｓ－Ｘ’－（Ｃ’’Ｒ’’Ｒ’’’）_ｄ－の置換基で置き換えられてもよく、式中、ｓ及びｄは、独立して、０～３の整数であり、Ｘ’は、－Ｏ－、－ＮＲ’－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）_２－、又は－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’－である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、及びＲ’’’は、好ましくは、独立して、水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、及び置換若しくは非置換ヘテロアリールから選択される。

【0048】

本明細書で使用される場合、「ヘテロ原子」又は「環ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、及びケイ素（Ｓｉ）を含むことを意味する。

【0049】

「置換基」は、本明細書で使用される場合、以下の部分、すなわち、（Ａ）オキソ、ハロゲン、－ＣＣｌ_３、－ＣＢｒ_３、－ＣＦ_３、－ＣＩ_３、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－ＯＣＣｌ_３、－ＯＣＦ_３、－ＯＣＢｒ_３、－ＯＣＩ_３、－ＯＣＨＣｌ_２、－ＯＣＨＢｒ_２、－ＯＣＨＩ_２、－ＯＣＨＦ_２、非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８アルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、又はＣ_１～Ｃ_４アルキル）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２～８員ヘテロアルキル、２～６員ヘテロアルキル、又は２～４員ヘテロアルキル）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキル、Ｃ_３～Ｃ_６シクロアルキル、又はＣ_５～Ｃ_６ヘテロシクロアルキル）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員ヘテロシクロアルキル、３～６員ヘテロシクロアルキル、又は５～６員ヘテロシクロアルキル）、非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０アリール、Ｃ_１０アリール、又はフェニル）、又は非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員ヘテロアリール、５～９員ヘテロアリール、又は５～６員ヘテロアリール）、（Ｂ）（ｉ）オキソ、ハロゲン、－ＣＣｌ_３、－ＣＢｒ_３、－ＣＦ_３、－ＣＩ_３、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－ＯＣＣｌ_３、－ＯＣＦ_３、－ＯＣＢｒ_３、－ＯＣＩ_３－、－ＯＣＨＣｌ_２、－ＯＣＨＢｒ_２、－ＯＣＨＩ_２、－ＯＣＨＦ_２、非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８アルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、又はＣ_１～Ｃ_４アルキル）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２～８員ヘテロアルキル、２～６員ヘテロアルキル、又は２～４員ヘテロアルキル）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキル、Ｃ_３～Ｃ_６シクロアルキル、又はＣ_５～Ｃ_６シクロアルキル）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員ヘテロシクロアルキル、３～６員ヘテロシクロアルキル、又は５～６員ヘテロシクロアルキル）、非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０アリール、Ｃ_１０アリール、又はフェニル）、又は非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員ヘテロアリール、５～９員ヘテロアリール、又は５～６員ヘテロアリール）と、（ｉｉ）（ａ）オキソ、ハロゲン、－ＣＣｌ_３、－ＣＢｒ_３、－ＣＦ_３、－ＣＩ_３、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－ＯＣＣｌ_３、－ＯＣＦ_３、－ＯＣＢｒ_３、－ＯＣＩ_３、－ＯＣＨＣｌ_２、－ＯＣＨＢｒ_２、－ＯＣＨＩ_２、－ＯＣＨＦ_２、非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８アルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、又はＣ_１～Ｃ_４アルキル）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２～８員ヘテロアルキル、２～６員ヘテロアルキル、又は２～４員ヘテロアルキル）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキル、Ｃ_３～Ｃ_６シクロアルキル、又はＣ_５～Ｃ_６シクロアルキル）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員ヘテロシクロアルキル、３～６員ヘテロシクロアルキル、又は５～６員ヘテロシクロアルキル）、非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０アリール、Ｃ_１０アリール、又はフェニル）、又は非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員ヘテロアリール、５～９員ヘテロアリール、又は５～６員ヘテロアリール）、及び（ｂ）オキソ、ハロゲン、－ＣＣｌ_３、－ＣＢｒ_３、－ＣＦ_３、－ＣＩ_３、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－ＯＣＣｌ_３、－ＯＣＦ_３、－ＯＣＢｒ_３、－ＯＣＩ_３、－ＯＣＨＣｌ_２、－ＯＣＨＢｒ_２、－ＯＣＨＩ_２、－ＯＣＨＦ_２、非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８アルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、又はＣ_１～Ｃ_４アルキル）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２～８員ヘテロアルキル、２～６員ヘテロアルキル、又は２～４員ヘテロアルキル）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキル、Ｃ_３～Ｃ_６シクロアルキル、又はＣ_５～Ｃ_６シクロアルキル）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員ヘテロシクロアルキル、３～６員ヘテロシクロアルキル、又は５～６員ヘテロシクロアルキル）、非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０アリール、Ｃ_１０アリール、又はフェニル）、又は非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員ヘテロアリール、５～９員ヘテロアリール、又は５～６員ヘテロアリール）から選択される少なくとも１つの置換基で置換されたアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールから選択される少なくとも１つの置換基で置換されたアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールとから選択される少なくとも１つの置換基で置換されたアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールから選択される基を意味する。

【0050】

本明細書で使用される「サイズ限定置換基（size-limited
substituent）」又は「サイズ限定置換基（サイズ限定置換基）」は、「置換基」について上述した全ての置換基から選択される基を意味し、各置換若しくは非置換アルキルは、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_２０アルキルであり、各置換若しくは非置換ヘテロアルキルは、置換若しくは非置換２～２０員ヘテロアルキルであり、各置換若しくは非置換シクロアルキルは、置換若しくは非置換Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキルであり、各置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルは、置換若しくは非置換３～８員ヘテロシクロアルキルであり、各置換若しくは非置換アリールは、置換若しくは非置換Ｃ_６～Ｃ_１０アリールであり、各置換若しくは非置換ヘテロアリールは、置換若しくは非置換５～１０員ヘテロアリールである。

【0051】

本明細書で使用される「低級置換基（lower substituent）」又は「低級置換基（lower substituent group）」は、「置換基」について上述した全ての置換基から選択される基を意味し、各置換若しくは非置換アルキルは、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_８アルキルであり、各置換若しくは非置換ヘテロアルキルは、置換若しくは非置換２～８員ヘテロアルキルであり、各置換若しくは非置換シクロアルキルは、置換若しくは非置換Ｃ_３～Ｃ_７シクロアルキルであり、各置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルは、置換若しくは非置換３～７員ヘテロシクロアルキルであり、各置換若しくは非置換アリールは、置換若しくは非置換Ｃ_６～Ｃ_１０アリールであり、各置換若しくは非置換ヘテロアリールは、置換若しくは非置換５～９員ヘテロアリールである。

【0052】

実施形態では、本明細書の化合物において記載される各置換基は、少なくとも１つの置換基で置換される。より具体的には、態様では、本明細書の化合物において記載される各置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、及び／又は置換ヘテロアリーレンは、少なくとも１つの置換基で置換される。態様では、これらの基のうちの少なくとも１つ又は全ては、少なくとも１つのサイズ限定置換基で置換される。態様では、これらの基のうちの少なくとも１つ又は全ては、少なくとも１つの低級置換基で置換される。

【0053】

本明細書における化合物の実施形態では、各置換若しくは非置換アルキルは、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_２０アルキルであり得、各置換若しくは非置換ヘテロアルキルは、置換若しくは非置換２～２０員ヘテロアルキルであり、各置換若しくは非置換シクロアルキルは、置換若しくは非置換Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキルであり、各置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルは、置換若しくは非置換３～８員ヘテロシクロアルキルであり、各置換若しくは非置換アリールは、置換若しくは非置換Ｃ_６～Ｃ_１０アリールであり、及び／又は各置換若しくは非置換ヘテロアリールは、置換若しくは非置換５～１０員ヘテロアリールである。本明細書の化合物の態様では、各置換若しくは非置換アルキレンは、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_２０アルキレンであり、各置換若しくは非置換ヘテロアルキレンは、置換若しくは非置換２～２０員ヘテロアルキレンであり、各置換若しくは非置換シクロアルキレンは、置換若しくは非置換Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキレンであり、各置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレンは、置換若しくは非置換３～８員ヘテロシクロアルキレンであり、各置換若しくは非置換アリーレンは、置換若しくは非置換Ｃ_６～Ｃ_１０アリーレンであり、かつ／又は各置換若しくは非置換ヘテロアリーレンは、置換若しくは非置換５～１０員ヘテロアリーレンである。

【0054】

実施形態では、各置換若しくは非置換アルキルは、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_８アルキルであり、各置換若しくは非置換ヘテロアルキルは、置換若しくは非置換２～８員ヘテロアルキルであり、各置換若しくは非置換シクロアルキルは、置換若しくは非置換Ｃ_３～Ｃ_７シクロアルキルであり、各置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルは、置換若しくは非置換３～７員ヘテロシクロアルキルであり、各置換若しくは非置換アリールは、置換若しくは非置換Ｃ_６～Ｃ_１０アリールであり、かつ／又は各置換若しくは非置換ヘテロアリールは、置換若しくは非置換５～９員ヘテロアリールである。態様では、各置換若しくは非置換アルキレンは、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_８アルキレンであり、各置換若しくは非置換ヘテロアルキレンは、置換若しくは非置換２～８員ヘテロアルキレンであり、各置換若しくは非置換シクロアルキレンは、置換若しくは非置換Ｃ_３～Ｃ_７シクロアルキレンであり、各置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレンは、置換若しくは非置換３～７員ヘテロシクロアルキレンであり、各置換若しくは非置換アリーレンは、置換若しくは非置換Ｃ_６～Ｃ_１０アリーレンであり、及び／又は各置換若しくは非置換ヘテロアリーレンは、置換若しくは非置換５～１０員ヘテロアリーレンである。

【0055】

実施形態では、置換若しくは非置換部分（例えば、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、及び／又は置換若しくは非置換ヘテロアリーレン）は、非置換である（例えば、それぞれ、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換アルキレン、非置換ヘテロアルキレン、非置換シクロアルキレン、非置換ヘテロシクロアルキレン、非置換アリーレン、及び／又は非置換ヘテロアリーレンである）。態様では、置換若しくは非置換部分（例えば、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、及び／又は置換若しくは非置換ヘテロアリーレン）は、置換されている（例えば、それぞれ、置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、及び／又は非置換ヘテロアリーレンである）。

【0056】

実施形態では、置換部分（例えば、置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、及び／又は置換ヘテロアリーレン）は、少なくとも１つの置換基で置換され、置換部分が、複数の置換基で置換されている場合、各置換基は、任意に異なっていてもよい。態様では、置換部分が複数の置換基で置換されている場合、各置換基は異なる。

【0057】

実施形態では、置換部分（例えば、置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、及び／又は置換ヘテロアリーレン）は、少なくとも１つのサイズ限定置換基で置換され、置換部分が、複数のサイズ限定置換基で置換されている場合、各サイズ限定置換基は、任意に異なっていてもよい。態様では、置換部分が複数のサイズ限定置換基で置換されている場合、各サイズ限定置換基は異なる。

【0058】

実施形態では、置換部分（例えば、置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、及び／又は置換ヘテロアリーレン）は、少なくとも１つの低級置換基で置換され、置換部分が、複数の低級置換基で置換されている場合、各低級置換基は、任意に異なっていてもよい。態様では、置換部分が複数の低級置換基で置換されている場合、各低級置換基は異なる。

【0059】

実施形態では、置換部分（例えば、置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、及び／又は置換ヘテロアリーレン）は、少なくとも１つの置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換されており、置換部分が、置換基、サイズ限定置換基、及び低級置換基から選択される複数の基で置換される場合、各置換基、サイズ限定置換基、及び／又は低級置換基は、任意に異なっていてもよい。態様では、置換部分が置換基、サイズ限定置換基、及び低級置換基から選択される複数の基で置換されている場合、各置換基、サイズ限定置換基、及び／又は低級置換基は、異なる。

【0060】

本開示のある特定の化合物は、不斉炭素原子（光学中心又はキラル中心）又は二重結合を有し、絶対立体化学の観点から、アミノ酸について（Ｒ）－若しくは（Ｓ）－又は（Ｄ）－若しくは（Ｌ）として定義され得る、鏡像異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体、立体異性体の形態、並びに個々の異性体が、本開示の範囲内に包含される。本開示の化合物は、合成及び／又は単離するには不安定すぎることが当該技術分野で知られている化合物を含まない。本開示は、ラセミ体及び光学的に純粋な形態の化合物を含むよう意図されている。光学的に活性な（Ｒ）－及び（Ｓ）－又は（Ｄ）－及び（Ｌ）－異性体は、キラルシントン又はキラル試薬を使用して調製されても、従来の技法を使用して分解されてもよい。本明細書に記載の化合物がオレフィン結合又は他の幾何不斉中心を含む場合、別途指定されない限り、化合物がＥ幾何異性体及びＺ幾何異性体の両方を含むよう意図されている。

【0061】

本明細書で使用される場合、「異性体」という用語は、同じ数及び種類の原子、ひいては同じ分子量を有するが、原子の構造配置又は立体配置に関しては異なる化合物を指す。

【0062】

本明細書で使用される「互変異性体」という用語は、平衡状態で存在し、ある異性体形態から別の異性体形態に容易に変換される、２つ以上の構造異性体の１つを指す。

【0063】

本開示のある特定の化合物が互変異性体形態で存在してもよく、化合物の全てのかかる互変異性体形態が開示の範囲内であることは、当業者には明らかであろう。

【0064】

特に明記しない限り、本明細書に示される構造はまた、その構造の全ての立体化学形態を含むことを意味し、すなわち、各不斉中心に対するＲ及びＳ配置である。したがって、本化合物の単一の立体化学異性体、並びにエナンチオマー及びジアステレオマー混合物は、本開示の範囲内である。

【0065】

別途記述されない限り、本明細書に示される構造はまた、１個以上の同位体濃縮原子の存在においてのみ異なる化合物を含むようにも意図されている。例えば、重水素若しくは三重水素による水素の代置、又は^１３Ｃ若しくは^１４Ｃ濃縮炭素による炭素の代置を除く、本構造を有する化合物は、本開示の範囲内である。

【0066】

本開示の化合物はまた、そのような化合物を構成する原子のうちの１つ以上で、不自然な割合の原子同位体を含んでもよい。例えば、化合物は、例えば、トリチウム（^３Ｈ）、ヨウ素－１２５（^１２５Ｉ）、又は炭素－１４（^１４Ｃ）などの放射性同位元素で放射性標識化されてもよい。本開示の化合物の全ての同位体変形は、放射性であるか否かにかかわらず、本開示の範囲内に包含される。

【0067】

本出願を通じて、選択肢、例えば、１つ超の可能なアミノ酸を含む各アミノ酸位置は、マーカッシュ群で記載されることに留意されたい。マーカッシュ群の各成員が別個に考慮されるべきであり、それにより、別の実施形態を含み、マーカッシュ群が単一の単位として読まれるべきではないことが特に企図される。

【0068】

「類似体（Analog）」又は「類似体（analogue）」は、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ内のその平易な通常の意味に従って使用され、別の化合物（すなわち、いわゆる「参照」化合物）と構造的に類似しているが、組成、例えば、異なる元素の原子による１つの原子の置き換え、又は特定の官能基の存在下、又は別の官能基による１つの官能基の置き換え、又は参照化合物の１つ以上のキラル中心の絶対立体化学が異なる化合物を指す。したがって、類似体は、参照化合物と機能及び外観の点で同様又は同等であるが、構造又は起源の点では異なる化合物である。

【0069】

本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を意味する。加えて、本明細書で使用される場合、「ａ［ｎ］で置換される」という語句は、特定の基が、指定された置換基のいずれか又は全てのうちの１つ以上で置換され得ることを意味する。例えば、アルキル基又はヘテロアリール基などの基が「非置換Ｃ_１～Ｃ_２０アルキル又は非置換の２～２０員ヘテロアルキルで置換されている」場合、基は、１つ以上の非置換Ｃ_１～Ｃ_２０アルキル及び／又は１つ以上の非置換の２～２０員ヘテロアルキルを含み得る。

【0070】

１つの部分が１つのＲ置換基で置換されている場合、その基は「Ｒ置換」と称されてもよい。ある部分がＲ置換されている場合、その部分は、少なくとも１つのＲ置換基で置換されており、各Ｒ置換基は、任意に異なる。特定のＲ基が化学種（式（Ｉ）など）の説明中に存在する場合、ローマアルファベット記号が、その特定のＲ基の各外観を区別するために使用されてもよい。例えば、複数のＲ^１３置換基が存在する場合、各Ｒ^１３置換基は、Ｒ^１３Ａ、Ｒ^１３Ｂ、Ｒ^１３Ｃ、Ｒ^１３Ｄなどと区別され得、Ｒ^１３Ａ、Ｒ^１３Ｂ、Ｒ^１３Ｃ、Ｒ^１３Ｄなどはそれぞれ、Ｒ^１３の定義の範囲内で定義され、場合によっては、異なる。

【0071】

「検出可能な薬剤」又は「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、磁気共鳴画像法、又は他の物理的手段などの適切な手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な検出可能な薬剤には、^１８Ｆ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４５Ｔｉ、^４７Ｓｃ、^５２Ｆｅ、^５９Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７７Ａｓ、^８６Ｙ、^９０Ｙ。^８９Ｓｒ、^８９Ｚｒ、^９４Ｔｃ、^９４Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^９９Ｍｏ、^１０５Ｐｄ、^１０５Ｒｈ、^１１１Ａｇ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１４９Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^{１５４－１５８１}Ｇｄ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ、^１６９Ｅｒ、^１７５Ｌｕ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１８９Ｒｅ、^１９４Ｉｒ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２１１Ａｔ、^２１１Ｐｂ、^２１２Ｂｉ、^２１２Ｐｂ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ｒａ、^２２５Ａｃ、Ｃｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、^３２Ｐ、フルオロフォア（例えば、蛍光色素）、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、常磁性分子、常磁性ナノ粒子、超小型超常磁性酸化鉄（「ＵＳＰＩＯ」）ナノ粒子、ＵＳＰＩＯナノ粒子凝集体、超常磁性酸化鉄（「ＳＰＩＯ」）ナノ粒子、ＳＰＩＯナノ粒子凝集体、単結晶酸化鉄ナノ粒子、単結晶酸化鉄、ナノ粒子造影剤、ガドリニウムキレート（Ｇｄ－キレート）分子、ガドリニウム、放射性同位元素を含むリポソーム又はその他の送達ビヒクル、放射性核種（例えば、炭素－１１、窒素－１３、酸素－１５、フッ素－１８、ルビジウム－８２）、フルオロデオキシグルコース（例えば、フッ素－１８標識）、任意のガンマ線放出放射性核種、陽電子放出放射性核種、放射性標識グルコース、放射性標識水、放射性標識アンモニア、バイオコロイド、マイクロバブル（例えば、アルブミン、ガラクトース、脂質、及び／又はポリマーを含むマイクロバブルシェルと、空気、重ガス、パーフルオロカーボン、窒素、オクタフルオロプロパン、ペルフレクサン脂質ミクロスフェア、ペルフルトレンなどを含むマイクロバブルガスコアとを含む）、ヨード造影剤（例えば、イオヘキソール、イオジキサノール、イオベルソール、イオパミドール、イオキシラン、イオプロミド、ジアトリゾエート、メトリゾエート、イオキサグレート）、硫酸バリウム、二酸化トリウム、金、金ナノ粒子、金ナノ粒子凝集体、フルオロフォア、２光子フルオロフォア、又はハプテン及びタンパク質、又は、例えば、放射性標識をペプチド、又は標的ペプチドと特異的に反応する抗体に組み込むことによって検出可能にすることができる他の物質が含まれる。検出可能な部分は、一価の検出可能な薬剤又は別の組成物と結合を形成することができる検出可能な薬剤である。

【0072】

本開示の態様による造影剤及び／又は標識剤として使用され得る放射性物質（例えば、放射性同位体）には、^１８Ｆ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４５Ｔｉ、^４７Ｓｃ、^５２Ｆｅ、^５９Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７７Ａｓ、^８６Ｙ、^９０Ｙが挙げられるが、これらに限定されない。^８９Ｓｒ、^８９Ｚｒ、^９４Ｔｃ、^９４Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^９９Ｍｏ、^１０５Ｐｄ、^１０５Ｒｈ、^１１１Ａｇ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１４９Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^{１５４－１５８１}Ｇｄ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ、^１６９Ｅｒ、^１７５Ｌｕ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１８９Ｒｅ、^１９４Ｉｒ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２１１Ａｔ、^２１１Ｐｂ、^２１２Ｂｉ、^２１２Ｐｂ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ｒａ及び^２２５Ａｃ、が含まれる。本開示の態様に従って追加の造影剤として使用することができる常磁性イオンとしては、遷移金属及びランタニド金属（例えば、原子番号が２１～２９、４２、４３、４４、又は５７～７１である金属）のイオンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0073】

本開示の化合物の記載は、当業者に既知である化学結合の原理によって制限される。したがって、基がいくつかの置換基のうちの１つ以上で置換され得る場合、そのような置換は、化学結合の原理に従うように、かつ本質的に不安定ではない、並びに／又は水性、中性、及びいくつかの既知の生理学的条件などの周囲条件下では不安定である可能性が高いと当業者に知られている化合物をもたらすように、選択される。例えば、ヘテロシクロアルキル又はヘテロアリールは、当業者に公知の化学結合の原理に従って、環ヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合し、それによって本質的に不安定な化合物が回避される。

【0074】

当業者であれば、化合物又は化合物属（例えば、本明細書に記載の属）の変数（例えば、部分又はリンカー）が、全ての原子価が満たされた独立型化合物の名称又は式によって記載される場合、その変数の満たされていない原子価は、変数が使用される状況によって決定付けられることを理解するであろう。例えば、本明細書に記載の化合物の変数が単結合を介して化合物の残りの部分に接続（例えば、結合）される場合、その変数は、独立型化合物の一価形態（すなわち、満たされていない原子価に起因して単結合を形成することができる）を表すと理解される（例えば、変数が、一実施形態では「メタン」と名付けられているが、その変数が単結合によって化合物の残りの部分に結合していることが知られている場合、当業者であれば、その変数が実際にはメタンの一価形態、つまり、メチル又は－ＣＨ_３であることを理解するであろう）。同様に、リンカー変数（例えば、本明細書に記載のＬ^１、Ｌ^２、又はＬ^３）の場合、当業者であれば、その変数が独立型化合物の二価形態であることを理解するであろう（例えば、変数がある実施形態では「ＰＥＧ」又は「ポリエチレングリコール」に割り当てられるが、その変数が２つの別個の結合によって化合物の残りの部分に接続されている場合、当業者であれば、その変数が、独立型化合物ＰＥＧではなく、ＰＥＧの二価（すなわち、２つの満たされていない原子価を介して２つの結合を形成することができる）形態であることを理解するであろう。

【0075】

「核酸」とは、一本鎖、二本鎖、若しくは多重鎖のいずれかの形態のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）及びそれらのポリマー、又はそれらの相補体を指す。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴ」などの用語は、通常の慣習的な意味で、ヌクレオチドの直鎖状配列を指す。「ヌクレオチド」という用語は、通常の及び慣習的な意味で、単一のポリヌクレオチド単位、すなわちモノマーを指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はそれらの修飾型であり得る。本明細書で企図されるポリヌクレオチドの例には、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖のＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖のＤＮＡとＲＮＡとの混合物を有するハイブリッド分子が含まれる。本明細書で企図される核酸、例えば、ポリヌクレオチドの例としては、あらゆる種類のＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びガイドＲＮＡ、並びにあらゆる種類のＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、及びミニサークルＤＮＡ、並びにそれらの任意の断片が挙げられる。ポリヌクレオチドの文脈における「二本鎖」という用語は、通常の及び慣習的な意味で、二本鎖性を指す。核酸は、直鎖若しくは分岐鎖であり得る。例えば、核酸は、ヌクレオチドの直鎖であり得るか、又は核酸は、例えば、核酸がヌクレオチドの１つ以上のアーム又は分岐を含むように分岐し得る。任意に、分岐状核酸は、繰り返し分岐して、デンドリマーなどの高次構造を形成する。

【0076】

例えば、ホスホチオエート骨格を有する核酸を含む核酸は、１つ以上の反応性部分を含み得る。本明細書で使用される場合、反応性部分という用語は、共有結合、非共有結合、又は他の相互作用を介して別の分子、例えば、核酸又はポリペプチドと反応することができる任意の基を含む。例として、核酸は、共有結合、非共有結合、又は他の相互作用を介してタンパク質又はポリペプチド上のアミノ酸と反応するアミノ酸反応性部分を含み得る。

【0077】

この用語はまた、既知のヌクレオチド類似体又は修飾された骨格残基若しくは結合を含有する核酸も包含し、合成、天然に存在する、及び天然に存在せず、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される。そのような類似体の例としては、例えば、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオエート（リン酸中の酸素が二重結合硫黄で置換されたホスホロチオエートとしても知られる）、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボキシレート、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、メチルホスホネート、ボロンホスホネート、又はＯ－メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照）、並びに５－メチルシチジン又はシュードウリジンなどにおけるヌクレオチド塩基に対する修飾、またペプチド核酸骨格及び結合を含むホスホジエステル誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。他の核酸類似体としては、正に帯電した骨格、非イオン性骨格、修飾糖、及び米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号、並びにＳａｎｇｈｕｉ及びＣｏｏｋ編集のＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，チャプター６及び７のＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈに記載されているものを含む非リボース骨格（例えば、当技術分野で公知のホスホロジアミデートモルホリノオリゴ又はロックド核酸（ＬＮＡ））を有するものが含まれる。１つ以上の炭素環式糖を含有する核酸も、核酸の１つの定義内に含まれる。リボース－ホスフェート骨格の修飾は、例えば、生理学的環境におけるそのような分子の安定性及び半減期を増加させるために、又はバイオチップ上のプローブとして、様々な理由で行うことができる。天然に存在する核酸と類似体の混合物を作製することができ、あるいは、異なる核酸類似体の混合物、並びに天然に存在する核酸と類似体の混合物を作製してもよい。諸態様では、ＤＮＡのヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体、又は両方の組み合わせである。

【0078】

核酸は、非特異的配列を含み得る。本明細書中で使用される場合、「非特異的配列」という用語は、任意の他の核酸配列に相補的であるように設計されていないか、又は部分的にのみ相補的である一連の残基を含む核酸配列を指し、例として、非特異的核酸配列は、細胞又は生物と接触したときに、阻害性核酸として機能しない核酸残基の配列である。

【0079】

ポリヌクレオチドは、一般的には、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）（ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、チミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ））の特定の配列で構成される。従って、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示であり、あるいは、この用語は、ポリヌクレオチド分子自体に使用される。このアルファベット表示は、中央処理装置を備えたコンピュータのデータベースに入力でき、機能ゲノミクス及び相同性検索などのバイオインフォマティクスアプリケーションに使用できる。ポリヌクレオチドは、１つ以上の非標準ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、及び／又は修飾ヌクレオチドを任意選択で含み得る。

【0080】

本明細書で使用される「相補体」という用語は、相補的なヌクレオチド又はヌクレオチドの配列と塩基対合することができるヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）又はヌクレオチドの配列を指す。本明細書中に記載され、当該技術分野において一般的に公知であるように、アデノシンの相補的（マッチング）ヌクレオチドは、チミジンであり、グアニジンの相補的（マッチング）ヌクレオチドは、シトシンである。したがって、相補体は、第２の核酸配列の対応する相補的ヌクレオチドと塩基対合するヌクレオチドの配列を含み得る。相補体のヌクレオチドは、第２の核酸配列のヌクレオチドと部分的に又は完全に一致し得る。相補体のヌクレオチドが第２の核酸配列の各ヌクレオチドと完全に一致する場合、その相補体は、第２の核酸配列の各ヌクレオチドと塩基対を形成する。相補体のヌクレオチドが第２の核酸配列のヌクレオチドと部分的に一致する場合、相補体のヌクレオチドの一部のみが第２の核酸配列のヌクレオチドと塩基対を形成する。相補配列の例には、コード配列及び非コード配列が含まれ、非コード配列は、コード配列に対する相補的ヌクレオチドを含み、したがって、コード配列の相補体を形成する。相補配列の更なる例は、センス配列及びアンチセンス配列であり、センス配列は、アンチセンス配列に対する相補的ヌクレオチドを含み、したがって、アンチセンス配列の相補体を形成する。

【0081】

本明細書に記載されるように、配列の相補性が部分的である場合、一部の核酸のみが塩基対合に従って一致し、又は完全な場合、全ての核酸が塩基対合に従って一致する。したがって、互いに相補的な２つの配列は、特定のパーセンテージの同一ヌクレオチド（すなわち、特定領域にわたって約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の同一性）を有し得る。

【0082】

「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコード化されたもの、並びに例えばヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンなど、後で修飾されるアミノ酸である。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合しているα炭素を有する化合物を指し、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。かかる類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。「天然に存在しないアミノ酸」及び「非天然アミノ酸」という用語は、天然には見られないアミノ酸類似体、合成アミノ酸、及びアミノ酸模倣体を指す。

【0083】

アミノ酸は、本明細書では、それらの一般的に既知である３文字記号又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字記号のいずれかによって参照され得る。ヌクレオチドはそれらの一般的に認められている一文字コードによって参照され得る。

【0084】

「アミノ酸側鎖」という用語は、アミノ酸に含まれる官能置換基を指す。例えば、アミノ酸側鎖は、天然に存在するアミノ酸の側鎖であり得る。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリン）、並びに後から修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンである。態様では、アミノ酸側鎖は、非天然アミノ酸側鎖であり得る。態様では、アミノ酸側鎖は、Ｈ、

【0085】

【化9】

である。実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖は、

【0086】

【化10】

である。

【0087】

「天然に存在しないアミノ酸の側鎖」又は「非天然アミノ酸の側鎖」又は「Ｕａａ」という用語は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム、アリルアラニン、２－アミノイソ酪酸の官能性置換基を指す。非天然アミノ酸は、天然に存在するか、化学的に合成される非タンパク質原性アミノ酸である。かかる類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。非限定的な例としては、エキソ－シス－３－アミノビシクロ［２．２．１］ヘプト－５－エン－２－カルボン酸塩酸塩、シス－２－アミノシクロヘプタンカルボン酸塩酸塩、シス－６－アミノ－３－シクロヘキセン－１－カルボン酸塩酸塩、シス－２－アミノ－２－メチルシクロヘキサンカルボン酸塩酸塩、シス－２－アミノ－２－メチルシクロペンタンカルボン酸塩酸塩、２－（Ｂｏｃ－アミノメチル）安息香酸、２－（Ｂｏｃ－アミノ）オクタン二酸、Ｂｏｃ－４，５－デヒドロ－Ｌｅｕ－ＯＨ（ジシクロヘキシルアンモニウム）、Ｂｏｃ－４－（Ｆｍｏｃ－アミノ）－Ｌ－フェニルアラニン、Ｂｏｃ－β－Ｈｏｍｏｐｙｒ－ＯＨ、Ｂｏｃ－（２－インダニル）－Ｇｌｙ－ＯＨ、４－Ｂｏｃ－３－モルホリン酢酸、４－Ｂｏｃ－３－モルホリン酢酸、Ｂｏｃ－ペンタフルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、Ｂｏｃ－ペンタフルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ（２－Ｂｒ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ（４－Ｂｒ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｄ－Ｐｈｅ（４－Ｂｒ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｄ－Ｐｈｅ（３－Ｃｌ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ（４－ＮＨ２）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ（３－ＮＯ２）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ（３，５－Ｆ２）－ＯＨ、２－（４－Ｂｏｃ－ピペラジノ）－２－（３，４－ジメトキシフェニル）酢酸ｐｕｒｕｍ、２－（４－Ｂｏｃ－ピペラジノ）－２－（２－フルオロフェニル）酢酸ｐｕｒｕｍ、２－（４－Ｂｏｃ－ピペラジノ）－２－（３－フルオロフェニル）酢酸ｐｕｒｕｍ、２－（４－Ｂｏｃ－ピペラジノ）－２－（４－フルオロフェニル）酢酸ｐｕｒｕｍ、２－（４－Ｂｏｃ－ピペラジノ）－２－（４－メトキシフェニル）－酢酸ｐｕｒｕｍ、２－（４－Ｂｏｃ－ピペラジノ）－２－フェニル酢酸ｐｕｒｕｍ、２－（４－Ｂｏｃ－ピペラジノ）－２－（３－ピリジル）酢酸ｐｕｒｕｍ、２－（４－Ｂｏｃ－ピペラジノ）－２－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－酢酸ｐｕｒｕｍ、Ｂｏｃ－β－（２－キノリル）－Ａｌａ－ＯＨ、Ｎ－Ｂｏｃ－１，２，３，６－テトラヒドロ－２－ピリジンカルボン酸、Ｂｏｃ－β－（４－チアゾリル）－Ａｌａ－ＯＨ、Ｂｏｃ－β－（２－チエニル）－Ｄ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｎ－（４－Ｂｏｃ－アミノブチル）－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｎ－（２－Ｂｏｃ－アミノエチル）－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｎ－（２，４－ジメトキシベンジル）－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－（２－インダニル）－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－ペンタフルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、Ｆｍｏｃ－Ｐｅｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ（２－Ｂｒ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ（４－Ｂｒ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ（３，５－Ｆ２）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－β－（４－チアゾリル）－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－β－（２－チエニル）－Ａｌａ－ＯＨ、４－（ヒドロキシメチル）－Ｄ－フェニルアラニンが挙げられる。実施形態では、非天然アミノ酸は以下の式を有するフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン（ＦＳＫ）である：

【0088】

【化11】

【0089】

「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸及び核酸の両方の配列に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾された変異体」とは、同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指す。遺伝コードの縮重のため、多くの核酸配列が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定される全ての位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく、記載の対応するコドンのいずれかに変更できる。このような核酸バリエーションは、保存的に修飾されたバリエーションの一種である「サイレントバリエーション」である。ポリペプチドをコードする本明細書の全核酸配列は、あらゆる可能な核酸のサイレントバリエーションについても記載する。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が修飾されて、機能的に同一の分子を生じ得ることを理解するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載された各配列の中に暗に示されている。

【0090】

アミノ酸配列に関して、当業者は、コード配列の単一アミノ酸又はごく一部のアミノ酸を変更し、付加し、又は欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、又は付加が、これらの変更により、化学的に類似したアミノ酸でのアミノ酸の置換がもたらされる「保存的に修飾された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本開示の多型変異体、種間相同体、及び対立遺伝子に加えられ、それらを除外しない。

【0091】

次の８つのグループにはそれぞれ、互いに保存的に置換されるアミノ酸が含まれる：（１）Ａｌａｎｉｎｅ（Ａ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｇ）、（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、（７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照されたい）。

【0092】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で交換可能に使用され、実施形態では、ポリマーはアミノ酸から構成されない部分にコンジュゲート化されていてもよい。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに対して適用される。「融合タンパク質」は、単一の部分として組換えにより発現される２つ以上の別個のタンパク質配列をコードするキメラタンパク質を指す。

【0093】

アミノ酸又はヌクレオチド塩基の「位置」は、Ｎ末端（又は５’末端）に対するその位置に基づいて、参照配列中の各アミノ酸（又はヌクレオチド塩基）を順次同定する番号で示される。最適なアラインメントを決定する際に考慮しなければならない欠失、挿入、トランケーション、融合などのため、一般に、単純にＮ末端からカウントすることよって決定される試験配列のアミノ酸残基数は、必ずしも参照配列の対応する位置の数と同じではない。例えば、変異体がアラインメントされた参照配列と比べて欠失を有する場合、欠失部位には参照配列の位置に対応する変異体のアミノ酸は存在しないことになる。アラインメントされた参照配列に挿入がある場合、その挿入は参照配列中の付番されたアミノ酸位置に対応しない。切断又は融合の場合、参照配列又はアラインメントされた配列のいずれかに、対応する配列のいずれのアミノ酸にも対応しないアミノ酸の区間が存在し得る。

【0094】

所与のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列の付番の文脈で使用される場合、「参照して付番される」又は「対応する」という用語は、所与のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列が参照配列と比較された場合の特定の参照配列の残基の付番を指す。

【0095】

タンパク質のアミノ酸残基は、所与の残基と同じタンパク質内の本質的な構造的位置を占める場合、所与の残基に「対応する」。例えば、選択された残基が、配列番号１のＰｙｌＲＳタンパク質中のＴｙｒ１２６と同じ本質的な空間的又は他の構造的な関係を占める場合、選択されたタンパク質中の選択された残基は、配列番号１のＰｙｌＲＳタンパク質中のＴｙｒ１２６に対応する。実施形態では、選択されたタンパク質を最大の相同性でＰｙｌＲＳタンパク質とアラインメントした場合、Ｔｙｒ１２６にアラインメントされた選択されたタンパク質における位置はＴｙｒ１２６に対応すると言われる。一次配列アラインメントの代わりに、例えば、選択されたタンパク質の構造をＰｙｌＲＳタンパク質と最大限に一致するようにアラインメントして、全体の構造を比較する場合、三次元構造アラインメントもまた使用することができる。この場合、構造モデルにおいてＴｙｒ１２６と同じ必須位置を占めるアミノ酸は、Ｔｙｒ１２６残基に対応すると言われている。

【0096】

「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって最適にアラインメントされた２つの配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の部分は、２つの配列のアラインメントを最適にするために参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（すなわちギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を生成し、そのマッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で除算し、その結果に１００を乗算して、配列同一性のパーセンテージを生成することによって計算する。

【0097】

２つ以上の核酸又はポリペプチドの配列の文脈における「同一の」又は「同一性」パーセントという用語は、下記のデフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０の配列比較アルゴリズムを使用して、又はマニュアルアラインメントと目視検査（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／などを参照）によって測定して、同一であるか、又は特定のパーセンテージ（すなわち、比較ウィンドウ又は指定された領域に関して最大限に対応するように比較及びアラインメントを行ったときに、特定の領域について、約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の同一性）で同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する、２つ以上の配列又は部分配列を指す。従って、このような配列は「実質的に同一」である。この定義はまた、試験配列の相補物にも言及してもよく、又はそれに適用されてもよい。定義は、欠失及び／又は付加を有する配列、並びに置換を有する配列も含む。以下に説明するように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを計算することができる。実施形態では、同一性は、少なくとも約２５のアミノ酸長又はヌクレオチド長の領域にわたって、又はより好ましくは５０～１００のアミノ酸長又はヌクレオチド長の領域にわたって存在する。

【0098】

「抗体」という用語は、当技術分野におけるその一般的に既知の意味に従って使用される。抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼによる消化によって産生された多くのよく特徴付けられた断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下の抗体を消化して、それ自体がジスルフィド結合によってＶ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１に結合した軽鎖であるＦａｂの二量体、Ｆ（ａｂ）’_２を産生する。Ｆ（ａｂ）’_２は、穏やかな条件下で還元されてヒンジ領域のジスルフィド結合を破壊し、それによってＦ（ａｂ）’_２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ ｅｄ．，３ｄ ｅｄ．１９９３参照）。インタクトな抗体の消化に関して様々な抗体断片が定義されているが、当業者は、かかる断片が化学的に又は組換えＤＮＡ方法論を使用してデノボ合成できることを理解するであろう。したがって、本明細書で使用される抗体という用語はまた、抗体全体の修飾によって産生される抗体断片、若しくは、組換えＤＮＡ方法論（例えば、一本鎖Ｆｖ）を用いてデノボ合成されたもの、又はファージディスプレイライブラリを用いて同定されたもの（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２～５５４（１９９０）を参照）を含む。

【0099】

抗体は入り組んだ内部構造を有する大きく複雑なタンパク質である。天然の抗体分子は、２つの同一のポリペプチド鎖のペアを含み、各ペアは１本の軽鎖及び１本の重鎖を有している。軽鎖と重鎖はそれぞれ、順に標的抗原の結合に関与する可変（「Ｖ」）領域と、免疫系の他の構成要素と相互作用する定常（「Ｃ」）領域の２つの領域からなる。軽鎖及び重鎖の可変領域は、三次元空間で一体となって、抗原（例えば、細胞の表面上の受容体）に結合する可変領域を形成する。軽鎖又は重鎖の各可変領域内には、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる３つの短いセグメント（平均１０アミノ酸の長さ）がある。抗体可変ドメインの６つのＣＤＲ（軽鎖から３つ及び重鎖から３つ）が三次元空間で一緒に折り畳まれて、実際の抗体結合部位を形成し、標的抗原にドッキングする。ＣＤＲの位置と長さは、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，アメリカ保健社会福祉省，１９８７によって正確に定義されている。ＣＤＲに含まれない可変領域の部分はフレームワーク（「ＦＲ」）と呼ばれ、ＣＤＲの周囲を形成する。

【0100】

例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対からなり、各対は、１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１本の「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定している。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を指す。Ｆｃ（すなわち、断片結晶化可能領域）は、免疫グロブリンの「基部」又は「尾部」であり、典型的には、抗体のクラスに応じて、２つ又は３つの定常ドメインに寄与する２つの重鎖で構成される。Ｆｃ領域は、特定のタンパク質に結合することにより、各抗体が特定の抗原に対して適切な免疫応答を引き起こすことを保証する。Ｆｃ領域は、また、Ｆｃ受容体などの様々な細胞受容体、及び補体タンパク質などの他の免疫分子に結合する。

【0101】

本明細書で提供される「抗体変異体」は、受容体タンパク質又は抗原に結合することができ、抗体又はその断片の１つ以上の構造ドメインを含むポリペプチドを指す。抗体変異体の非限定的な例としては、シングルドメイン抗体（ナノボディ）、アフィボディ（モノクローナル抗体より小さく（例えば約６ｋＤＡ）、高い親和性で受容体タンパク質又は抗原に結合することができ、モノクローナル抗体を模倣することができるポリペプチド）、抗原結合断片（Ｆａｂ）、Ｆａｂ二量体（単特異性Ｆａｂ_２、二重特異性Ｆａｂ_２）、三重特異性Ｆａｂ_３、一価ＩｇＧｓ、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、二重特異性ダイアボディ、三重特異性トリアボディ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ミニボディ、ＩｇＮＡＲ、Ｖ－ＮＡＲ、ｈｃＩｇＧ、ＶｈＨ、又はペプチボディが挙げられる。本明細書で提供される「ペプチボディ」は、抗体のＦｃドメインに（共有結合又は非共有結合リンカーを介して）付着したペプチド部分を指す。当技術分野で知られている抗体変異体のさらなる非限定的な例としては、軟骨魚類又はラクダ類によって産生される抗体が挙げられる。ラクダ類からの抗体及びそれらの可変領域、並びにそれらの産生、単離、及び使用の方法の一般的な説明は、参考文献のＷＯ９７／４９８０５及びＷＯ９７／４９８０５に見ることができ、参照によりそれらの全体が全ての目的で本明細書に組み込まれる。同様に、軟骨魚類からの抗体及びその可変領域、並びにそれらの産生、単離、及び使用の方法は、ＷＯ２００５／１１８６２９に見出すことができ、参照によりその全体が全ての目的で本明細書に組み込まれる。

【0102】

「シングルドメイン抗体」又は「ナノボディ」は、単一の単量体可変領域抗体ドメインを有する抗体断片を指す。これは、抗体全体と同様に、特定の抗原に選択的に結合することができる。実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒト又はヒト化シングルドメイン抗体である。

【0103】

単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、典型的には、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であり、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで接続されている。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンを多く含み得、溶解性のためにセリン又はスレオニンを多く含み得る。リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続することができ、又はその逆も可能である。

【0104】

本明細書で提供される「抗原」という用語は、本明細書で提供される抗体結合ドメインに結合することができる分子を指す。本明細書で提供される「抗原結合ドメイン」は、抗原（エピトープ）に結合する抗体の領域である。上記のように、抗原結合ドメインは、重鎖及び軽鎖のそれぞれの１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメイン（それぞれ、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１）を含み得る。実施形態では、抗原結合ドメインは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む。実施形態では、抗原結合ドメインは、軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメイン及び／又は重鎖定常ドメインを含まない。パラトープ又は抗原結合部位は、抗原結合ドメインのＮ末端に形成される。抗原結合ドメインの２つの可変ドメインは、抗原のエピトープに結合し得る。

【0105】

抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼによる消化によって産生された多くのよく特徴付けられた断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下の抗体を消化して、それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ－ＣＨ１に結合した軽鎖であるＦａｂの二量体、Ｆ（ａｂ）’２を産生する。Ｆ（ａｂ）’２は、穏やかな条件下で還元されてヒンジ領域のジスルフィド結合を破壊し、それによってＦ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は本質的にヒンジ領域の一部を有する抗原結合部分である（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ ｅｄ，３ｄ ｅｄ．１９９３）。インタクトな抗体の消化に関して様々な抗体断片が定義されているが、当業者は、かかる断片が化学的に又は組換えＤＮＡ方法論を使用してデノボ合成できることを理解するであろう。したがって、本明細書で使用される抗体という用語は、また、全抗体の修飾によって産生される抗体断片、若しくは、組換えＤＮＡ方法論（例えば、一本鎖Ｆｖ）を用いてデノボ合成されたもの、又はファージディスプレイライブラリを用いて同定されたもの（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）を参照されたい）を含む。

【0106】

抗体のエピトープは、抗体が結合するその抗原の領域である。２つの抗体は、それぞれが他方の抗原への結合を競合的に阻害（ブロック）する場合、同じ又は重複するエピトープに結合する。つまり、一方の抗体の１倍、５倍、１０倍、２０倍、又は１００倍の過剰は、競合結合アッセイの測定において、他方の結合を、少なくとも３０％、好ましくは５０％、７５％、９０％、又は更には９９％阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０を参照）。代替的に、一方の抗体の結合を低減又は排除する抗原中の本質的に全てのアミノ酸変異が他方の抗体の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を減少又は排除するいくつかのアミノ酸変異が他方の抗体の結合を減少又は排除する場合、２つの抗体は重複するエピトープを有する。

【0107】

抗体、例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体は、当技術分野で公知の多くの技術によって調製することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５～４９７（１９７５）、Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）、Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｐｐ７７～９６，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）、及びＧｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．１９８６））。目的の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローン化することができ、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子は、ハイブリドーマからクローン化することができ、組換えモノクローナル抗体を産生するために使用することができる。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子ライブラリは、ハイブリドーマ又は形質細胞からも作製され得る。重鎖と軽鎖の遺伝子産物のランダムな組み合わせは、様々な抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生成する（例えば、Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３ｒｄ ｅｄ．１９９７を参照）。一本鎖抗体又は組換え抗体の産生技術（米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第４，８１６，５６７号）は、ポリペプチドに対する抗体を生成するために使用することができる。また、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳動物などの他の生物を使用して、ヒト化抗体又はヒト抗体を発現させてもよい（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９～７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６～８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２～１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５～５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６（１９９６）、並びにＬｏｎｇｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３（１９９５）を参照されたい）。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体及びヘテロマーのＦａｂ断片を同定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２～５５４（１９９０）、Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９～７８３（１９９２）を参照）。抗体は、二重特異性、すなわち２つの異なる抗原を認識できるようにすることもできる（例えば、ＷＯ９３／０８８２９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：１０：３６５５～３６５９（１９９１），及びＳｕｒｅｓｈら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０（１９８６）を参照）。抗体はまた、ヘテロコンジュゲート（例えば、２つの共有結合した抗体）又は免疫毒素であってもよい（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号を参照）。

【0108】

非ヒト抗体をヒト化又は霊長類化するための方法は当技術分野において公知である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、同第５，５３０，１０１号、同第５，８５９，２０５号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、同第５，７７７，０８５号、同第６，１８０，３７０号、同第６，２１０，６７１号、及び第６，３２９，５１１号、国際公開第８７／０２６７１号、欧州特許出願第０１７３４９４号、Ｊｏｎｅｓら，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２及びＶｅｒｈｏｙｅｎら，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４）。ヒト化抗体は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３にさらに記載されている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしばインポート残基と呼ばれ、典型的にはインポート可変ドメインから取得される。ヒト化は、本質的にげっ歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置き換えることにより、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法に従って行うことができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８１：６８５１～６８５５（１９８４）、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２～５２５（１９８６），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３～３２７（１９８８）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＯｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５～９２（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４～１５３６（１９８８）及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３～５９６（１９９２）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，２８：４８９～４９８（１９９１）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，３１（３）：１６９～２１７（１９９４）を参照）。したがって、そのようなヒト化抗体はキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及びおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。例えば、ヒト化免疫グロブリンフレームワーク領域をコードする第１の配列及び所望の免疫グロブリン相補性決定領域をコードする第２の配列セットを含むポリヌクレオチドが、合成的に、又は適切なｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡセグメントを組み合わせることによって産生され得る。ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、様々なヒト細胞から周知の手順に従って単離することができる。

【0109】

「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が異なる若しくは改変されたクラス、エフェクター機能及び／若しくは種の定常領域に連結されるように、又はキメラ抗体に新しい特性を与える完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などに連結されるように、定常領域又はその一部が改変、置換、又は交換された、あるいは（ｂ）可変領域又はその一部が、異なる又は改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置換、又は交換された抗体分子である。実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ヒト化及び／又はキメラモノクローナル抗体を含む。

【0110】

抗体又は抗原に「特異的に（又は選択的に）結合する」又は「特異的に（又は選択的に）免疫反応する」という語句は、タンパク質又はペプチドを指す場合、多くはタンパク質及び他の生物製剤の不均一な集団において、タンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定の抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０～１００倍超で特定のタンパク質に結合する。このような条件下での抗体への特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性のために選択された抗体が必要である。例えば、ポリクローナル抗体は、選択された抗原と特異的に免疫反応性があり、他のタンパク質とは免疫反応性がない抗体サブセットのみを得るように選択され得る。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を差し引くことによって達成することができる。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性のある抗体を選択するために、様々なイムノアッセイフォーマットを使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用される（例えば、特異的免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイの形式及び条件の記載については、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９８）を参照されたい）。

【0111】

「受容体タンパク質」又は「膜受容体」は、細胞の原形質膜に埋め込まれている受容体（タンパク質）を指す。実施形態では、受容体タンパク質は、細胞の細胞外ドメイン、細胞の膜貫通ドメイン、又は細胞の細胞内ドメインに位置する。実施形態では、受容体タンパク質は、細胞表面受容体である。実施形態では、受容体タンパク質は細胞外ドメインにある。実施形態では、受容体タンパク質は膜貫通ドメインにある。実施形態では、受容体タンパク質は、イオンチャネル連結型受容体、酵素共役型受容体、又はＧタンパク質共役受容体である。実施形態では、受容体タンパク質は、ホルモン受容体である。

【0112】

本明細書で使用される「生体分子」という用語は、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、及び核酸などの巨大分子、並びに例えば、一次代謝産物及び二次代謝産物などの小分子を指す。態様では、「生体分子」は、タンパク質を指す。態様では、「生体分子」は核酸を指す。態様では、「生体分子」は、炭水化物を指す。実施形態では、タンパク質は、シングルドメイン抗体である。実施形態では、タンパク質は、膜受容体である。

【0113】

「生体分子部分」という用語は、生体分子を形成するペプチジル部分、炭水化物部分、脂質部分、又は核酸部分を指す。

【0114】

本明細書で使用される「ペプチジル部分」という用語は、生体分子又は生体分子コンジュゲートの一部を形成し得るタンパク質、タンパク質断片、又はペプチドを指す。態様では、ペプチジル部分は、生体分子（例えば、タンパク質）の一部を形成する。態様では、ペプチジル部分は、バイオ（例えば、タンパク質）コンジュゲートの一部を形成する。ペプチジル部分はまた、追加の化学部分（例えば、追加のＲ置換基）で置換されてもよい。態様では、ペプチジル部分は、シングルドメイン抗体の一部を形成する。態様では、ペプチジル部分は、膜受容体の一部を形成する。

【0115】

本明細書で使用される「アミノ酸部分」という用語は、アミノ酸が本明細書に記載される式（Ｂ）の化合物などの別の化合物又は部分に連結され得るような一価のアミノ酸を指す。

【0116】

本明細書で使用される「炭水化物部分」という用語は、炭水化物、例えば、ポリヒドロキシアルデヒド、ケトン、アルコール、酸、それらの単純な誘導体、及びアセタール型の結合を有するそれらのポリマーを指し、それは、生体分子又はバイオコンジュゲートの一部を形成し得る。態様では、炭水化物部分は、生体分子の一部を形成する。態様では、炭水化物部分は、生体分子コンジュゲートの一部を形成する。炭水化物部分はまた、更なる化学部分（例えば、更なるＲ置換基）で置換されてもよい。

【0117】

本明細書で使用される「核酸部分」という用語は、核酸、例えば、生体分子又はバイオコンジュゲートの一部を形成し得るＤＮＡ及びＲＮＡを指す。態様では、核酸部分は、生体分子の一部を形成する。態様では、核酸部分は、バイオコンジュゲートの一部を形成する。核酸部分はまた、更なる化学部分（例えば、更なるＲ置換基）で置換されてもよい。

【0118】

「小分子」は、１０，０００ダルトン以下の分子量を有する、天然又は合成の低分子量有機化合物である。低分子への結合は、例としてアルキル基、カルボニル、アミド、スルフィド、エーテル、エステル、アレーン、ヘテロアレーン、ケタール、オキシム、イミン、エナミン、アルケン、アルキン、又は他の基が挙げられるが、これらに限定されない構造と低分子との間の任意の共有結合を介して生じ得る。

【0119】

「小分子部分」は、生体分子の一部を形成し得るか、又は式（Ｆ）によって表される１つ以上のＦＳＫアミノ酸側鎖を含有し得る小分子を指す。実施形態では、小分子部分は、一価の小分子である。

【0120】

「ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素」という用語は、ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素活性を有する酵素（ホモログ、アイソフォーム、及びそれらの機能性断片を含む）を指す。ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、α－アミノ酸のピロリシンをコグネイトｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^ｐｙｌ）に結合させ、それによって、タンパク質の生合成中のアンバー終止コドン（例えば、ＴＡＧ）におけるピロリシンの取り込みを可能にするために必要な反応を触媒するアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）である。この用語は、（例えば、野生型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素と比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは１００％の活性の範囲内で）ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素活性を維持するピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素又はその変異体、ホモログ、又はアイソフォームの任意の組換え型又は天然型を含む。態様では、変異体、ホモログ、又はアイソフォームは、天然に存在するピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素と比較して、配列の全体又は配列の一部（例えば、５０、１００、１５０、又は２００の連続したアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列の同一性を有する。態様では、ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１に記載の配列を含む。態様では、ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１に記載の配列である。

【0121】

「変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素」又は「変異型ＰｙｌＲＳ」又は「変異体ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素」又は「変異体ＰｙｌＲＳ」という用語は、野生型アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する任意のピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素を指す。実施形態では、変異体ＰｙｌＲＳは、配列番号１に記載のメタノメチロフィラス・アルブスのピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素の野生型アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する任意のピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素を指す。態様では、「変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素」は、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌへのフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンの結合を触媒する任意のピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素を指す。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、１２６位のチロシン、１２９位のメチオニン、１６８位のバリン、２２７位のヒスチジン、２２８位のチロシン、及び２２９位のリジンからなる群から選択される１つ以上の残基に変異を有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、以下の５つの変異を有する配列番号１を含む：（ｉ）Ｙ１２６Ｇ、（ｉｉ）Ｍ１２９Ａ、（ｉｉｉ）Ｖ１６８Ｆ、（ｉｖ）Ｈ２２７Ｔ、Ｈ２２７Ｓ、又はＨ２２７Ｉ、及び（ｖ）Ｙ２２８Ｐ。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、以下の６つの変異を有する配列番号１を含む：（ｉ）Ｙ１２６Ｇ、（ｉｉ）Ｍ１２９Ａ、（ｉｉｉ）Ｖ１６８Ｆ、（ｉｖ）Ｈ２２７Ｔ、Ｈ２２７Ｓ、又はＨ２２７Ｉ、（ｖ）Ｙ２２８Ｐ、及び（ｖｉ）Ｌ２２９Ｖ又はＬ２２９Ｉ。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、以下の６つの変異を有する配列番号１を含む：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｔ、Ｙ２２８Ｐ、及びＬ２２９Ｉ。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、以下の６つの変異を有する配列番号１を含む：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｓ、Ｙ２２８Ｐ、及びＬ２２９Ｖ。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、以下の６つの変異を有する配列番号１を含む：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｉ、及びＹ２２８Ｐ。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、以下の６つの変異を有する配列番号１を含む：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｓ、Ｙ２２８Ｐ、及びＬ２２９Ｉ。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に記載の配列を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に記載の配列である。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に記載の配列によってコードされる。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｎ端及び／又はＣ端に６つのヒスチジン残基を更に含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｎ端に６つのヒスチジン残基を更に含む。態様では、変異型ピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｃ端に６つのヒスチジン残基を更に含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８６に記載の配列を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８６に記載の配列である。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８６に記載の配列によってコードされる。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８７に記載の配列を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８７に記載の配列である。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８７に記載の配列によってコードされる。態様では、「変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素」は「ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素」と呼ばれ、当業者は、野生型の配列番号１との比較に基づいて、ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素が変異型であるかどうかを容易に認識できる。

【0122】

実施形態では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｃ端及び／又はＮ端（例えば、Ｍ残基の後）に１～１０個のヒスチジン残基を有し、１２６位のチロシン、１２９位のメチオニン、１６８位のバリン、２２７位のヒスチジン、２２８位のチロシン、及び２２９位のリジンからなる群から選択される１つ以上の残基に変異を有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｃ端及び／又はＮ端（例えば、Ｍ残基の後）に１～１０個のヒスチジン残基を有し、以下の５つの変異：（ｉ）Ｙ１２６Ｇ、（ｉｉ）Ｍ１２９Ａ、（ｉｉｉ）Ｖ１６８Ｆ、（ｉｖ）Ｈ２２７Ｔ、Ｈ２２７Ｓ、又はＨ２２７Ｉ、及び（ｖ）Ｙ２２８Ｐを有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｃ端及び／又はＮ端（例えば、Ｍ残基の後）に１～１０個のヒスチジン残基を有し、以下の６つの変異：（ｉ）Ｙ１２６Ｇ、（ｉｉ）Ｍ１２９Ａ、（ｉｉｉ）Ｖ１６８Ｆ、（ｉｖ）Ｈ２２７Ｔ、Ｈ２２７Ｓ、又はＨ２２７Ｉ、（ｖ）Ｙ２２８Ｐ、及び（ｖｉ）Ｌ２２９Ｖ又はＬ２２９Ｉを有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｃ端及び／又はＮ端（例えば、Ｍ残基の後）に１～１０個のヒスチジン残基を有し、以下の６つの変異：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｔ、Ｙ２２８Ｐ、及びＬ２２９Ｉを有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｃ端に６つのヒスチジン残基を有し、以下の６つの変異：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｔ、Ｙ２２８Ｐ、及びＬ２２９Ｉを有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｎ端（Ｍ残基の後）に６つのヒスチジン残基を有し、以下の６つの変異：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｔ、Ｙ２２８Ｐ、及びＬ２２９Ｉを有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｃ端及び／又はＮ端（例えば、Ｍ残基の後）に１～１０個のヒスチジン残基を有し、以下の６つの変異：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｓ、Ｙ２２８Ｐ、及びＬ２２９Ｖを有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｃ端に６つのヒスチジン残基を有し、以下の６つの変異：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｓ、Ｙ２２８Ｐ、及びＬ２２９Ｖを有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｎ端（Ｍ残基の後）に６つのヒスチジン残基を有し、以下の６つの変異：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｓ、Ｙ２２８Ｐ、及びＬ２２９Ｖを有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｃ端及び／又はＮ端（例えば、Ｍ残基の後）に１～１０個のヒスチジン残基を有し、以下の６つの変異：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｉ、及びＹ２２８Ｐを有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｃ端に６つのヒスチジン残基を有し、以下の６つの変異：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｉ、及びＹ２２８Ｐを有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｎ端（Ｍ残基の後）に６つのヒスチジン残基を有し、以下の６つの変異：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｉ、及びＹ２２８Ｐを有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｃ端及び／又はＮ端（例えば、Ｍ残基の後）に１～１０個のヒスチジン残基を有し、以下の６つの変異：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｓ、Ｙ２２８Ｐ、及びＬ２２９Ｉを有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｃ端に６つのヒスチジン残基を有し、以下の６つの変異：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｓ、Ｙ２２８Ｐ、及びＬ２２９Ｉを有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｎ端（Ｍ残基の後）に６つのヒスチジン残基を有し、以下の６つの変異：Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆ、Ｈ２２７Ｓ、Ｙ２２８Ｐ、及びＬ２２９Ｉを有する配列番号１を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８６に記載の配列を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８６に記載の配列である。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８６に記載の配列によってコードされる。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８７に記載の配列を含む。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８７に記載の配列である。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８７に記載の配列によってコードされる。

【0123】

「ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ」という用語は、鎖内の塩基対合によって折り畳まれて、特定のアミノ酸（例えば、ピロリシン、ＦＳＫ）を担持し、それをタンパク質合成中にｍＲＮＡ上のその対応するコドン（すなわち、ｔＲＮＡのアンチコドンに相補的なもの）にマッチさせる特徴的なクローバー葉構造を形成する約５０～約１００ヌクレオチドを含有する一本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｔＲＮＡ^Ｐｙｌの略称「Ｐｙｌ」は、ピロリシンを表す。実施形態では、アンチコドンは、ＣＵＡ、ＴＴＡ、又はＴＣＡを含む。実施形態では、アンチコドンはＣＵＡを含む。実施形態では、アンチコドンはＴＴＡを含む。実施形態では、アンチコドンはＴＣＡを含む。実施形態では、アンチコドンは、少なくとも１つの非標準塩基を含む。アンチコドンＣＵＡは、アンバー終止コドンに相補的である。態様では、ｔＲＮＡ^ＰｙｌはＦＳＫに結合される。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、約５０～約１００ヌクレオチドを含有する一本鎖ＲＮＡ分子を指す。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、約６０～約９０ヌクレオチドを含有する一本鎖ＲＮＡ分子を指す。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、約６５～約８５ヌクレオチドを含有する一本鎖ＲＮＡ分子を指す。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、約７０～約９０ヌクレオチドを含有する一本鎖ＲＮＡ分子を指す。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、約６０～約８０ヌクレオチドを含有する一本鎖ＲＮＡ分子を指す。

【0124】

本明細書で使用される「基質結合部位」という用語は、基質と一時的な結合又は相互作用を形成する酵素活性部位に位置する残基を指す。態様では、ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位は、アミノ酸基質と一時的な結合又は相互作用を形成するピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素の活性部位に位置する残基を指す。態様では、ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位は、以下の残基、すなわち、：配列番号１のアミノ酸配列に記載の１２６位のチロシン、１２９位のメチオニン、１６８位のバリン、２２７位のヒスチジン、２２８位のチロシン、及び２２９位のリジンのうちの１つ以上を含む。

【0125】

「プラスミド」、「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、遺伝子及び／又は遺伝子の発現に必要な調節エレメントをコードする核酸分子を指す。プラスミドからの遺伝子の発現は、シス又はトランスで起こり得る。遺伝子がシスで発現される場合、遺伝子と調節エレメントは同じプラスミドにコードされる。トランスでの発現とは、遺伝子及び調節エレメントが別個のプラスミドによってコードされている場合を指す。

【0126】

「複合体」という用語は、２つ以上の構成要素を含み、構成要素が一緒に結合して機能単位を形成する組成物を指す。態様では、本明細書に記載の複合体は、本明細書に記載の変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素とアミノ酸基質（例えば、ＦＳＫ）とを含む。態様では、本明細書に記載の複合体は、本明細書に記載の変異型ピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素とｔＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）とを含む。態様では、本明細書に記載の複合体は、本明細書に記載の変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素、アミノ酸基質（例えば、ＦＳＫ）、及びｔＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）を含む。態様では、本明細書に記載の複合体は、本明細書に記載の変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素、アミノ酸基質（例えば、ＦＳＫ）、ｔＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）を含有するポリペプチドからなる群から選択される少なくとも２つの成分を含む。

【0127】

「トランスフェクション」、「形質導入」、「トランスフェクトする」又は「形質導入する」という用語は、交換可能に使用することができ、核酸分子及び／又はタンパク質を細胞に導入するプロセスとして定義される。非ウイルスの又はウイルスベースの方法を使用して、核酸を細胞に導入することができる。核酸分子は、完全なタンパク質又はその機能的部分をコードする遺伝子配列であってよい。トランスフェクションの非ウイルス方法は、核酸分子を細胞に導入するための送達システムとしてウイルスＤＮＡ又はウイルス粒子を使用しない任意の適切なトランスフェクション方法を含む。例示的な非ウイルストランスフェクション方法としては、カルシウムホスフェートトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、ヒートショックを通じたトランスフェクション、マグネトフェクション及びエレクトロポレーションが挙げられる。態様では、核酸分子は、当技術分野において公知の標準的な手順に従って、エレクトロポレーションを使用して細胞に導入される。ウイルスベースの方法の場合、任意の有用なウイルスベクターを本明細書に記載の方法で使用することができる。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。態様では、核酸分子は、当技術分野で周知の標準的な手順に従って、レトロウイルスベクターを使用して細胞に導入される。「トランスフェクション」又は「形質導入」という用語はまた、外部環境から細胞にタンパク質を導入することを指す。典型的には、タンパク質の形質導入又はトランスフェクションは、細胞膜を横断できるペプチド又はタンパク質の、目的のタンパク質への付着に依存する。例えば、Ｆｏｒｄら（２００１）、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１～４及びＰｒｏｃｈｉａｎｔｚ（２００７）、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：１１９～２０が参照できる。

【0128】

「単離された」という用語は、核酸又はタンパク質に適用される場合、核酸又はタンパク質が天然の状態で関連する他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。これは、例えば、均一な状態であることができ、乾燥又は水溶液のいずれかであってもよい。純度及び均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して決定される。製剤中に主たる種として存在するタンパク質は、実質的に精製されている。

【0129】

「接触させる」は、その単純な通常の意味に従って使用され、少なくとも２つの異なる種（例えば、生体分子、生体分子部分を含む化学化合物、又は細胞）が反応、相互作用する、又は物理的に触れるように十分に近接することを可能にするプロセスを指す。しかしながら、結果として生じる反応生成物は、添加された試薬間の反応から直接、又は反応混合物中に生成され得る、添加された試薬のうちの１つ以上からの中間体から生成され得ることが理解されるべきである。

【0130】

「接触させる」という用語は、２つの種が反応、相互作用、又は物理的に触れることを可能にすることを含み、ここで２つの種は、本明細書に記載の生体分子及び／又は生体分子部分であり得る。態様では、接触させることは、本明細書に記載の２つの生体分子部分を相互作用させることを含み、ここで生体分子部分は、共有結合してコンジュゲートを形成する。

【0131】

本明細書で使用される場合、「バイオコンジュゲート反応性部分」及び「バイオコンジュゲート反応性基」という用語は、バイオコンジュゲート反応性基の原子又は分子間の会合の結果としてバイオコンジュゲート（例えば、共有結合リンカー）を形成することができる部分又は基を指す。会合は、直接的又は間接的であり得る。例えば、本明細書で示される第１のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、－ＮＨ２、－ＣＯＯＨ、－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、又は－マレイミド）と第２のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、スルフヒドリル、硫黄含有アミノ酸、アミン、アミン側鎖含有アミノ酸、又はカルボキシレート）との間のコンジュゲートは、例えば、共有結合若しくはリンカー（例えば、第２のリンカーの第１のリンカー）による直接的なもの、又は、例えば、非共有結合（例えば、静電相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子－双極子、双極子－誘起双極子、ロンドン分散）、環スタッキング（ｐｉ効果）、疎水性相互作用）などによる間接的なものであってもよい。態様では、バイオコンジュゲート又はバイオコンジュゲートリンカーは、求核置換（例えば、アミン及びアルコールと、ハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、及び炭素－炭素及び炭素－ヘテロ原子の多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールス・アルダー付加）を含むがこれらに限定されない、バイオコンジュゲート化学（すなわち、２つのバイオコンジュゲート反応性基の会合）を使用して形成される。これら及び他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６、及びＦｅｅｎｅｙら，Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２で考察されている。態様では、第１のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、マレイミド部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、スルフヒドリル）に共有結合で結合している。態様では、第１のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、ハロアセチル部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、スルフヒドリル）に共有結合で結合している。態様では、第１のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、ピリジル部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、スルフヒドリル）に共有結合で結合している。態様では、第１のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、アミン）に共有結合で結合している。態様では、第１のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、マレイミド部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、スルフヒドリル）に共有結合で結合している。態様では、第１のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、－スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、アミン）に共有結合している。

【0132】

本明細書のバイオコンジュゲート化学に使用される有用なバイオコンジュゲート反応性基としては、（ａ）カルボキシル基及びＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、及び芳香族エステルを含むがこれらに限定されないそれらの様々な誘導体、（ｂ）エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換され得るヒドロキシル基（ｃ）ハロゲン化物が、後に、例えば、アミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルボアニオン、又はアルコキシドイオンなどの求核基で置き換えられ得、それにより、ハロゲン原子の部位で新しい基の共有結合が生じる、ハロアルキル基、（ｄ）例えば、マレイミド又はマレイミド基など、ディールス・アルダー反応に関与することができるジエノフィル基、（ｅ）例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン、若しくはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、又はグリニャール付加若しくはアルキルリチウム付加などの機序を介して、後続する誘導体化が可能であるような、アルデヒド又はケトン基、（ｆ）例えば、スルホンアミドを形成するためのアミンとの後続する反応のためのハロゲン化スルホニル基、（ｇ）ジスルフィドへの変換、ハロゲン化アシルとの反応、金などの金属への結合、マレイミドとの反応が可能な、チオール基、（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化、又は酸化され得る、アミン又はスルフヒドリル基（例えば、システインに存在するもの）、（ｉ）例えば、付加環化、アシル化、マイケル付加などを受け得る、アルケン、（ｊ）例えば、アミン及びヒドロキシル化合物と反応し得る、エポキシド、（ｋ）核酸合成に有用なホスホルアミダイト及び他の標準的な官能基、（ｌ）金属酸化ケイ素結合、（ｍ）例えば、リン酸ジエステル結合を形成するための反応性リン基（例えば、ホスフィン）への金属結合、（ｎ）銅触媒による付加環化クリックケミストリーを使用してアルキンに結合したアジドが挙げられ、（ｏ）ビオチンコンジュゲートは、アビジン又はストレプトアビジンと反応して、アビジン－ビオチン複合体又はストレプトアビジン－ビオチン複合体を形成することができる。

【0133】

バイオコンジュゲート反応性基は、それらが本明細書に記載のコンジュゲートの化学的安定性に関与しない、又は干渉しないように選択することができる。代替的に、反応性官能基は、保護基の存在によって架橋反応に関与することから保護することができる。態様では、バイオコンジュゲートは、マレイミドなどの不飽和結合とスルフヒドリル基との反応から得られる分子エンティティを含む。

【0134】

「インビトロ翻訳系」という用語は、遺伝子産物の同定（例えば、プロテオミクス）、トランケートされた遺伝子産物の合成による変異の局在化、タンパク質のフォールディングの研究、及びタンパク質への修飾アミノ酸又は非天然アミノ酸の組み込みを提供し得る、セルフリー抽出物中におけるタンパク質のインビトロ合成を提供する系を指す。実施形態において、インビトロ翻訳系は、タンパク質への修飾アミノ酸又は非天然アミノ酸（例えば、ＦＳＫ）の組み込みを提供する系を指す。例示的なインビトロ翻訳系は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．のＰｕｒｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｉｎ ＶｉｔｒｏＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔである。インビトロ翻訳系の例示的な成分としては、アミノ酸、コムギ胚芽抽出物、タンパク質合成のための細胞成分（例えば、ｔＲＮＡ、リボソーム、開始因子、伸長因子、終結因子）、塩（例えば、Ｍｇ^２＋、Ｋ^＋）が挙げられる。実施形態では、インビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球系又はコムギ胚芽抽出物系である。

【0135】

「フルオロ硫酸－Ｌ－チロシン」及び「ＦＳＹ」という用語は、以下の構造を有する非天然アミノ酸：

【0136】

【化12】

又はその立体異性体：

【0137】

【化13】

を指す。

【0138】

ＦＳＹは、以下の式のアミノ酸側鎖を含む：

【0139】

【化14】

【0140】

「フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン」及び「ＦＳＫ」という用語は、式（Ａ）の構造を有する非天然アミノ酸：

【0141】

【化15】

を指し、その立体異性体も包含する：

【0142】

【化16】

を有する、請求項１に記載の化合物。

【0143】

ＦＳＫは、式（Ｆ）のアミノ酸側鎖を含む：

【0144】

【化17】

【0145】

「ＦＳＫ生体分子」という用語は、ＦＳＫ非天然アミノ酸及び／又はそのアミノ酸側鎖を含む生体分子を指す。

【0146】

「バイオコンジュゲート」又は「ＦＳＫバイオコンジュゲート」という用語は、式（Ｄ）の構造を有するバイオコンジュゲートリンカー（「ＦＳＫバイオコンジュゲートリンカー」）を含む任意の生体分子を指す：

【0147】

【化18】

【0148】

「ＦＳＫタンパク質」という用語は、ＦＳＫ非天然アミノ酸及び／又はそのアミノ酸側鎖を含むタンパク質を指す。

【0149】

「タンパク質コンジュゲート」又は「ＦＳＫタンパク質コンジュゲート」という用語は、式（Ｄ）の構造を有するバイオコンジュゲートリンカーを含む任意のタンパク質を指す：

【0150】

【化19】

【0151】

「硫黄－フッ素交換反応」又は「ＳｕＦＥｘ」という用語は、例えば、Ｄｏｎｇら，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，５３（３６）：９３４０～９４４８（２０１４）、Ｗａｎｇら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１４０（１５）：４９９５～４９９９（２０１８）によって詳細に記載され、また本明細書の実施例に記載されているクリックケミストリーのタイプを指す。「近接により可能になる」ＳｕＦＥｘという用語は、反応性の種が互いに近接している場合、すなわち、ＳｕＦＥｘ反応が生じるために十分に空間的に近い場合に起きる硫黄－フッ素交換反応を指す。近接は、単一の生体分子（例えば、タンパク質）内で、又は２つの異なる生体分子（例えば、タンパク質）間で生じ得る。当業者は、反応性の種が、反応（例えば、バイオコンジュゲート、式（Ａ）、（Ｂ）、若しくは（Ｃ）の部分、又は式（Ｉ）、（ＩＩ）、若しくは（ＩＩＩ）のタンパク質を形成するＦＳＫとリジン、ヒスチジン、又はチロシンとの間の硫黄－フッ素物交換反応）が生じるために十分に近いかどうかを容易に判定することができる。

【0152】

「分子間リンカー」という用語は、２つの異なる生体分子間の連結基を指す。例えば、式（Ｅ）、（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物が分子間リンカーを有する場合、Ｒ^１のペプチジル部分は第１のタンパク質であり、Ｒ^２のペプチジル部分は第２のタンパク質であり、その結果、第１のタンパク質と第２のタンパク質は、式（Ｅ）、（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の部分を介して共有結合で結合される。態様では、第１のタンパク質と第２のタンパク質は異なるタンパク質であり、例えば、シングルドメイン抗体と膜受容体のような２つの異なるタンパク質の間に分子間リンカーを提供する。

【0153】

「分子内リンカー」という用語は、単一の生体分子内の連結基を指す。例えば、式（Ｅ）、（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）の化合物が分子内リンカーを有する場合、Ｒ^１のペプチジル部分とＲ^２のペプチジル部分は同じタンパク質の中にある。態様では、第１のタンパク質と第２のタンパク質は同じタンパク質であり、すなわち、単一のタンパク質内に分子間リンカーを提供する。

【0154】

生体分子及びバイオコンジュゲート
本明細書では、生体分子及び潜在的な生体反応性の非天然アミノ酸と天然に存在するアミノ酸との相互作用によって形成されるバイオコンジュゲートを提供する。潜在的な生体反応性の非天然アミノ酸であるフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン（ＦＳＫ又はＮ６－（４－（（フルオロスルホニル）オキシ）ベンゾイル）－Ｌ－リジン）は、クリックケミストリー反応（例えば、硫黄－フッ素交換反応（ＳｕＦＥｘ））によって、近接する標的アミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、チロシン）との共有結合の形成を促進する。例えば、ＦＳＫは、天然に存在するタンパク質中のアミノ酸に挿入されてもよく、又はアミノ酸を置換してもよく、それによって、そのタンパク質に、そのタンパク質自体上の近接して位置付けられた標的アミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、チロシン）、又はそれが天然に相互作用するタンパク質と共有結合を形成する能力を与える。ＦＳＫは、細胞に対して非毒性であることを少なくとも部分的に理由として、インビトロの条件及びインビボの条件の両方においてタンパク質間又はタンパク質内における共有結合の形成を促進するために使用することができる。したがって、潜在的な生体反応性の非天然アミノ酸ＦＳＫは、生体分子（例えば、タンパク質、炭水化物、核酸）を共有結合で連結させてバイオコンジュゲートを形成するために有用である。態様では、潜在的な生体反応性の非天然アミノ酸ＦＳＫは、単一の生体分子（例えば、タンパク質）内の生体分子部分（例えば、ペプチジル部分）を共有結合で連結させるために有用である。態様では、潜在的な生体反応性の非天然アミノ酸ＦＳＫは、異なる生体分子中の生体分子部分（例えば、ペプチジル部分）を共有結合で連結させる（例えば、２つのタンパク質を共有結合で連結させる）ために有用である。態様では、潜在的な生体反応性の非天然アミノ酸ＦＳＫは、シングルドメイン抗体を膜受容体に共有結合で連結させるために有用である。

【0155】

本明細書中に示されるように、潜在的な生体反応性の非天然アミノ酸としてのＦＳＫは、以前に説明された生体反応性の非天然アミノ酸と比較して、優れた化学的機能性（すなわち、優れた特性）を示した。例えば、ＦＳＫは、細胞内で安定で非毒性かつ非反応性であるが、標的残基の近接して配置されたとき、細胞の条件下で反応性になる。ＦＳＫは、生理学的条件下で、タンパク質内及びタンパク質間の近接により可能になるＳｕＦＥｘ反応によって、リジン、ヒスチジン及びチロシンと特異的に、高い選択性で反応することができる。

【0156】

本明細書では、１つ以上の潜在的な生体反応性の非天然アミノ酸を含む生体分子を提供する。態様では、生体分子は、タンパク質、核酸、又は炭水化物である。態様では、生体分子は、タンパク質である。態様では、ＦＳＫ及びリジン、ヒスチジン、又はチロシンは、タンパク質のαヘリックス中にある。態様では、ＦＳＫ及びリジン、ヒスチジン、又はチロシンは、タンパク質のβシート中にある。態様では、タンパク質はシングルドメイン抗体である。態様では、タンパク質は膜受容体である。態様では、潜在的な生体反応性の非天然アミノ酸は、式（Ａ）の構造を有するフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン（ＦＳＫ）である：

【0157】

【化20】

態様では、生体分子は、ＦＳＫ非天然アミノ酸を含むタンパク質である。態様では、タンパク質は少なくとも１つのＦＳＫを含む。実施形態では、タンパク質は１つのＦＳＫを含む。態様では、タンパク質は２つ以上のＦＳＫを含む。態様では、タンパク質は２つのＦＳＫを含む。態様では、タンパク質は３つのＦＳＫを含む。態様では、生体分子は、式（Ｆ）で表されるＦＳＫアミノ酸側鎖を含むタンパク質である：

【0158】

【化21】

態様では、タンパク質は、リジン、ヒスチジン、チロシン、又はそれらの２つ以上の組み合わせに近接するＦＳＫを含む。態様では、タンパク質は、リジンに近接するＦＳＫを含む。態様では、タンパク質は、ヒスチジンに近接するＦＳＫを含む。態様では、タンパク質は、チロシンに近接するＦＳＫを含む。態様では、タンパク質は、抗体又は抗体変異体である。態様では、タンパク質は、抗体、抗原結合断片、単鎖可変領域断片、シングルドメイン抗体、又はアフィボディである。

【0159】

「近接する」は、ＦＳＫとリジン、ヒスチジン、又はチロシンが、ＳｕＦＥｘ反応が成功裏に生じるように互いに十分に近いことを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～５０アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～４５アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～４０アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～３５アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～３０アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～２５アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～２０アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～１５アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～１０アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～９アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～８アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～７アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～６アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～５アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～４アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～３アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンの１～２アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近接する」は、ＦＳＫがリジン、ヒスチジン、又はチロシンに隣接していることを意味する。

【0160】

本明細書では、バイオコンジュゲートリンカーを介して第２の生体分子部分にコンジュゲート化された第１の生体分子部分を含むバイオコンジュゲートを提供し、ここで、バイオコンジュゲートリンカーは式（Ｄ）の構造を有する：

【0161】

【化22】

態様では、第１の生体分子部分と第２の生体分子部分はそれぞれ独立して、ペプチジル部分である。態様では、バイオコンジュゲートはタンパク質コンジュゲートである。態様では、バイオコンジュゲートはタンパク質コンジュゲートであり、ここでバイオコンジュゲートリンカーは分子内リンカーである。態様では、タンパク質コンジュゲートは、複数の分子内リンカーを含む。態様では、バイオコンジュゲートはタンパク質コンジュゲートであり、ここでバイオコンジュゲートリンカーは分子間リンカーである。態様では、タンパク質コンジュゲートは複数の分子間リンカーを含む。態様では、タンパク質コンジュゲートは分子内リンカー及び分子間リンカーを含む。

【0162】

実施形態では、バイオコンジュゲートは、式（Ｅ）の構造を有するか

【0163】

【化23】

あるいは次式を有すると記載される：
Ｒ^１－Ｌ^１－Ａ－Ｘ^１－Ｌ^２－Ｒ^２
式中、Ａは式（Ｄ）のバイオコンジュゲートリンカーであり、Ｒ^１は第１の生体分子部分であり、Ｒ^２は第２のバイオコンジュゲート部分であり、Ｌ^１は、結合又は第１の共有結合リンカーであり、Ｌ^２は、第２の共有結合リンカーの結合であり、Ｘ^１は、－ＮＲ^５－、－Ｏ－、－Ｓ－、又は

【0164】

【化24】

であり、ここで、環Ａは、置換若しくは非置換ヘテロアリーレン又は置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレンであり、Ａ中の窒素はバイオコンジュゲートリンカーに結合している。Ｒ^５は、水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールである。

【0165】

Ｌ^１は、結合、－Ｓ（Ｏ）_２－、－ＮＲ^３Ａ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^３Ａ－、－ＮＲ^３ＡＣ（Ｏ）－、－ＮＲ^３ＡＣ（Ｏ）ＮＲ^３Ｂ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、又は置換若しくは非置換ヘテロアリーレンである。Ｒ^３Ａ及びＲ^３Ｂは独立して、水素、置換若しくは非置換アルキルイル、置換若しくは非置換ヘテロアルキルイル、置換若しくは非置換シクロアルキルイル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルイル、置換若しくは非置換アリールイル、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールイルである。

【0166】

Ｌ^２は、結合、－Ｓ（Ｏ）_２－、－ＮＲ^４Ａ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^４Ａ－、－ＮＲ^４ＡＣ（Ｏ）－、－ＮＲ^４ＡＣ（Ｏ）ＮＲ^４Ｂ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、又は置換若しくは非置換ヘテロアリーレン、又は置換若しくは非置換アルキルアリーレンである。実施形態では、Ｌ^２は、結合、－Ｓ（Ｏ）_２－、－ＮＲ^４Ａ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^４Ａ－、－ＮＲ^４ＡＣ（Ｏ）－、－ＮＲ^４ＡＣ（Ｏ）ＮＲ^４Ｂ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、又は置換若しくは非置換ヘテロアリーレンである。Ｒ^４Ａ及びＲ^４Ｂは独立して、水素、置換若しくは非置換アルキルイル、置換若しくは非置換ヘテロアルキルイル、置換若しくは非置換シクロアルキルイル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルイル、置換若しくは非置換アリールイル、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールイルである。

【0167】

Ｘ^１は、－ＮＲ^５－、－Ｏ－、－Ｓ－、又は

【0168】

【化25】

であり、式中、環Ａは、置換若しくは非置換ヘテロアリーレン、又は置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレンである。態様では、Ｘ^１は－ＮＲ^５－である。態様では、Ｘ^１は－Ｏ－である。態様では、Ｘ^１は－Ｓ－である。態様では、Ｘ^１は

【0169】

【化26】

では、環Ａは置換若しくは非置換ヘテロアリーレンである。態様では、環Ａは置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレンである。態様では、環Ａは非置換ヘテロアリーレンである。態様では、環Ａは非置換ヘテロシクロアルキレンである。態様では、環Ａは置換ヘテロシクロアルキレン（例えば、３～８員、３～６員、４～６員、４～５員、又は５～６員）である。態様では、環Ａは非置換ヘテロシクロアルキレン（例えば、３～８員、３～６員、４～６員、４～５員、又は５～６員）である。態様では、環Ａは置換若しくは非置換ヘテロアリーレン（例えば、５～１０員、５～９員、又は５～６員）である。態様では、環Ａは置換ヘテロアリーレン（例えば、５～１０員、５～９員、又は５～６員）である。態様では、環Ａは非置換ヘテロアリーレン（例えば、５～１０員、５～９員、又は５～６員）である。実施形態では、Ｌ^１は結合である。

【0170】

実施形態では、Ｒ^５は、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールである。態様では、Ｒ^５は水素である。

【0171】

実施形態では、Ｒ^５は、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換アルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換ヘテロアルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換シクロアルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換アリール、又は置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換ヘテロアリールである。

【0172】

実施形態では、Ｒ^５は、水素、置換若しくは非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_２０、Ｃ_１～Ｃ_１０、Ｃ_１～Ｃ_５）、置換若しくは非置換ヘテロアルキル（例えば、２～２０員、２～１０員、２～５員）、置換若しくは非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_３～Ｃ_５）、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、３～５員）、置換若しくは非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０、Ｃ_６～Ｃ_８、Ｃ_６～Ｃ_５）、又は置換若しくは非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～８員、又は５～６員）である。

【0173】

実施形態では、Ｒ^５は、水素、非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_２０、Ｃ_１～Ｃ_１０、Ｃ_１～Ｃ_５）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２～２０員、２～１０員、２～５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、又はＣ_３～Ｃ_５）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、又は３～５員）、非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０、Ｃ_６～Ｃ_８、Ｃ_６～Ｃ_５）、又は非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～８員、又は５～６員）である。

【0174】

実施形態では、Ｌ^１は、結合、－Ｓ（Ｏ）_２－、－ＮＲ^３Ａ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^３Ａ－、－ＮＲ^３ＡＣ（Ｏ）－、－ＮＲ^３ＡＣ（Ｏ）ＮＲ^３Ｂ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、又は置換若しくは非置換ヘテロアリーレンである。

【0175】

実施形態では、Ｌ^１は、結合、－Ｓ（Ｏ）_２－、－ＮＲ^３Ａ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^３Ａ－、－ＮＲ^３ＡＣ（Ｏ）－、－ＮＲ^３ＡＣ（Ｏ）ＮＲ^３Ｂ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、又は置換若しくは非置換ヘテロアリーレンである。態様では、Ｌ^１は、結合、置換若しくは非置換アルキレン、又は置換若しくは非置換ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^１は、結合、非置換アルキレン、又は非置換ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^１は非置換アルキレンである。態様では、Ｌ^１は非置換ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^１は結合である。

【0176】

実施形態では、Ｌ^１は、－Ｏ－、－Ｓ－、Ｒ^３２－置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_２アルキレン（例えば、Ｃ_１若しくはＣ_２）又はＲ^３２－置換若しくは非置換２員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^１は、Ｒ^３２－置換若しくは非置換アルキレン（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８アルキレン、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、又はＣ_１～Ｃ_４アルキレン）、Ｒ^３２－置換若しくは非置換ヘテロアルキレン（例えば、２～１０員ヘテロアルキレン、２～６員ヘテロアルキレン、又は２～４員ヘテロアルキレン）、Ｒ^３２－置換若しくは非置換シクロアルキレン（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキレン、Ｃ_３～Ｃ_６シクロアルキレン、又はＣ_５～Ｃ_６シクロアルキレン）、Ｒ^３２－置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン（例えば、３～８員ヘテロシクロアルキレン、３～６員ヘテロシクロアルキレン、又は５～６員ヘテロシクロアルキレン）、Ｒ^３２－置換若しくは非置換アリーレン（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０アリーレン、Ｃ_１０アリーレン、又はフェニレン）、又はＲ^３２－置換若しくは非置換ヘテロアリーレン（例えば、５～１０員ヘテロアリーレン、５～９員ヘテロアリーレン、又は５～６員ヘテロアリーレン）である。態様では、Ｌ^１は独立して、－Ｏ－、－Ｓ－、非置換Ｃ_１～Ｃ_２アルキレン（例えば、Ｃ_１又はＣ_２）又は非置換２員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^１は独立して、非置換メチレンである。態様では、Ｌ^１は独立して、非置換エチレンである。態様では、Ｌ^１は、置換２員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^１は、置換３員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^１は、置換４員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^１は、非置換２員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^１は、非置換３員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^１は、非置換４員ヘテロアルキレンである。

【0177】

Ｒ^３２は独立して、オキソ、ハロゲン、－ＣＸ^３２ _３、－ＣＨＸ^３２ _２、－ＣＨ_２Ｘ^３２、－ＯＣＸ^３２ _３、－ＯＣＨ_２Ｘ^３２、－ＯＣＨＸ^３２ _２、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＯＨ、－Ｎ_３、Ｒ^３３－置換若しくは非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８、Ｃ_１～Ｃ_６、Ｃ_１～Ｃ_４、又はＣ_１～Ｃ_２）、Ｒ^３３－置換若しくは非置換ヘテロアルキル（例えば、２～８員、２～６員、４～６員、２～３員、又は４～５員）、Ｒ^３３－置換若しくは非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_４～Ｃ_６、Ｃ_５～Ｃ_６）、Ｒ^３３－置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、４～６員、４～５員、又は５～６員）、Ｒ^３３－置換若しくは非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０又はフェニル）、又はＲ^３３－置換若しくは非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～９員、又は５～６員）である。態様では、Ｒ^３２は独立して、オキソ、ハロゲン、－ＣＸ^３２ _３、－ＣＨＸ^３２ _２、－ＣＨ_２Ｘ^３２、－ＯＣＸ^３２ _３、－ＯＣＨ_２Ｘ^３２、－ＯＣＨＸ^３２ _２、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）－ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－Ｎ_３、非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８、Ｃ_１～Ｃ_６、Ｃ_１～Ｃ_４、又はＣ_１～Ｃ_２）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２～８員、２～６員、４～６員、２～３員、又は４～５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_４～Ｃ_６、又はＣ_５～Ｃ_６）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、４～６員、４～５員、又は５～６員）、非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０又はフェニル）、又は非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～９員、又は５～６員）である。Ｘ^３２は独立して、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、又は－Ｉである。

【0178】

実施形態では、Ｒ^３２は独立して、非置換メチルである。態様では、Ｒ^３２は独立して、非置換エチルである。

【0179】

Ｒ^３３は独立して、オキソ、ハロゲン、－ＣＸ^３３ _３、－ＣＨＸ^３３ _２、－ＣＨ_２Ｘ^３３、－ＯＣＸ^３３ _３、－ＯＣＨ_２Ｘ^３３、－ＯＣＨＸ^３３ _２、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）－ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－Ｎ_３、Ｒ^３４－置換若しくは非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８、Ｃ_１～Ｃ_６、Ｃ_１～Ｃ_４、又はＣ_１～Ｃ_２）、Ｒ^３４－置換若しくは非置換ヘテロアルキル（例えば、２～８員、２～６員、４～６員、２～３員、又は４～５員）、Ｒ^３４－置換若しくは非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_４～Ｃ_６、又はＣ_５～Ｃ_６）、Ｒ^３４－置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、４～６員、４～５員、又は５～６員）、Ｒ^３４－置換若しくは非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０又はフェニル）、又はＲ^３４－置換若しくは非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～９員、又は５～６員）である。態様では、Ｒ^３３は独立して、オキソ、ハロゲン、－ＣＸ^３３ _３、－ＣＨＸ^３３ _２、－ＣＨ_２Ｘ^３３、－ＯＣＸ^３３ _３、－ＯＣＨ_２Ｘ^３３、－ＯＣＨＸ^３３ _２、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）－ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－Ｎ_３、非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８、Ｃ_１～Ｃ_６、Ｃ_１～Ｃ_４、又はＣ_１～Ｃ_２）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２～８員、２～６員、４～６員、２～３員、又は４～５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_４～Ｃ_６、又はＣ_５～Ｃ_６）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、４～６員、４～５員、又は５～６員）、非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０又はフェニル）、又は非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～９員、又は５～６員）である。Ｘ^３３は独立して、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、又は－Ｉである。

【0180】

実施形態では、Ｒ^３３は独立して、非置換メチルである。態様では、Ｒ^３３は独立して、非置換エチルである。

【0181】

Ｒ^３４は独立して、オキソ、ハロゲン、－ＣＸ^３４ _３、－ＣＨＸ^３４ _２、－ＣＨ_２Ｘ^３４、－ＯＣＸ^３４ _３、－ＯＣＨ_２Ｘ^３４、－ＯＣＨＸ^３４ _２、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）－ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－Ｎ_３、非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８、Ｃ_１～Ｃ_６、Ｃ_１～Ｃ_４、又はＣ_１～Ｃ_２）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２～８員、２～６員、４～６員、２～３員、又は４～５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_４～Ｃ_６、又はＣ_５～Ｃ_６）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、４～６員、４～５員、又は５～６員）、非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０又はフェニル）、又は非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～９員、又は５～６員）である。Ｘ^３４は独立して、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、又は－Ｉである。

【0182】

実施形態では、Ｒ^３４は独立して、非置換メチルである。態様では、Ｒ^３４は独立して、非置換エチルである。

【0183】

実施形態では、Ｒ^３Ａは、水素、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、又は置換若しくは非置換ヘテロアリーレンである。

【0184】

実施形態では、Ｒ^３Ａは、水素、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換アルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換ヘテロアルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換シクロアルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換アリール、又は置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換ヘテロアリールである。

【0185】

実施形態では、Ｒ^３Ａは、水素、置換若しくは非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_２０、Ｃ_１～Ｃ_１０、Ｃ_１～Ｃ_５）、置換若しくは非置換ヘテロアルキル（例えば、２～２０員、２～１０員、２～５員）、置換若しくは非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_３～Ｃ_５）、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、３～５員）、置換若しくは非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０、Ｃ_６～Ｃ_８、Ｃ_６～Ｃ_５）、又は置換若しくは非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～８員、５～６員）である。

【0186】

実施形態では、Ｒ^３Ａは、水素、非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_２０、Ｃ_１～Ｃ_１０、Ｃ_１～Ｃ_５）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２～２０員、２～１０員、２～５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_３～Ｃ_５）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、３～５員）、非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０、Ｃ_６～Ｃ_８、Ｃ_６～Ｃ_５）、又は非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～８員、５～６員）である。

【0187】

実施形態では、Ｒ^３Ｂは、水素、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、又は置換若しくは非置換ヘテロアリーレンである。

【0188】

実施形態では、Ｒ^３Ｂは、水素、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換アルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換ヘテロアルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換シクロアルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換アリール、又は置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換ヘテロアリールである。

【0189】

実施形態では、Ｒ^３Ｂは、水素、置換若しくは非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_２０、Ｃ_１～Ｃ_１０、Ｃ_１～Ｃ_５）、置換若しくは非置換ヘテロアルキル（例えば、２～２０員、２～１０員、２～５員）、置換若しくは非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_３～Ｃ_５）、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、３～５員）、置換若しくは非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０、Ｃ_６～Ｃ_８、Ｃ_６～Ｃ_５）、又は置換若しくは非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～８員、５～６員）である。

【0190】

実施形態では、Ｒ^３Ｂは、水素、非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_２０、Ｃ_１～Ｃ_１０、Ｃ_１～Ｃ_５）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２～２０員、２～１０員、２～５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_３～Ｃ_５）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、３～５員）、非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０、Ｃ_６～Ｃ_８、Ｃ_６～Ｃ_５）、又は非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～８員、５～６員）である。

【0191】

実施形態では、Ｌ^２は、結合、－Ｓ（Ｏ）_２－、－ＮＲ^４Ａ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^４Ａ－、－ＮＲ^４ＡＣ（Ｏ）－、－ＮＲ^４ＡＣ（Ｏ）ＮＲ^４Ｂ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、置換若しくは非置換ヘテロアリーレン、又は置換若しくは非置換アルキルアリーレンである。実施形態では、Ｌ^２は、結合、－Ｓ（Ｏ）_２－、－ＮＲ^５－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^４Ａ－、－ＮＲ^４ＡＣ（Ｏ）－、－ＮＲ^４ＡＣ（Ｏ）ＮＲ^４Ｂ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、又は置換若しくは非置換ヘテロアリーレンである。

【0192】

実施形態では、Ｌ^２は、結合、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換アルキルアリーレンである。実施形態では、Ｌ^２は、結合、置換若しくは非置換アルキレン、又は置換若しくは非置換ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^２は、結合、非置換アルキレン、又は非置換ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^２は、非置換アルキレンである。態様では、Ｌ^２は、非置換ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^２は、結合である。態様では、Ｌ^２は、結合、又は置換若しくは非置換アルキルアリーレンである。態様では、Ｌ^２は、結合又は非置換アルキルアリーレンである。態様では、Ｌ^２は、非置換アルキルアリーレンである。態様では、Ｌ^２はベンジレンである。

【0193】

実施形態において、Ｌ^２は、－Ｏ－、－Ｓ－、Ｒ^３５－置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_２アルキレン（例えば、Ｃ_１若しくはＣ_２）又はＲ^３５－置換若しくは非置換２員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^２は、結合、Ｒ^３５－置換若しくは非置換アルキレン（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８アルキレン、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、又はＣ_１～Ｃ_４アルキレン）、Ｒ^３５－置換若しくは非置換ヘテロアルキレン（例えば、２～８員ヘテロアルキレン、２～６員ヘテロアルキレン、又は２～４員ヘテロアルキレン）、Ｒ^３５－置換若しくは非置換シクロアルキレン（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキレン、Ｃ_３～Ｃ_６シクロアルキレン、又はＣ_５～Ｃ_６シクロアルキレン）、Ｒ^３５－置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン（例えば、３～８員ヘテロシクロアルキレン、３～６員ヘテロシクロアルキレン、又は５～６員ヘテロシクロアルキレン）、Ｒ^３５－置換若しくは非置換アリーレン（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０アリーレン、Ｃ_１０アリーレン、又はフェニレン）、又はＲ^３５－置換若しくは非置換ヘテロアリーレン（例えば、５～１０員ヘテロアリーレン、５～９員ヘテロアリーレン、又は５～６員ヘテロアリーレン）である。態様では、Ｌ^２は、－Ｏ－、－Ｓ－、非置換Ｃ_１～Ｃ_２アルキレン（例えば、Ｃ_１又はＣ_２）又は非置換２員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^２は、非置換メチレンである。態様では、Ｌ^２は、非置換エチレンである。態様では、Ｌ^２は、置換２員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^２は、置換３員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^２は、置換４員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ^２は、非置換２員ヘテロアルキルである。態様では、Ｌ^２は、非置換３員ヘテロアルキルである。態様では、Ｌ^２は、非置換４員ヘテロアルキルである。

【0194】

Ｒ^３５は独立して、オキソ、ハロゲン、－ＣＸ^３５ _３、－ＣＨＸ^３５ _２、－ＣＨ_２Ｘ^３５、－ＯＣＸ^３５ _３、－ＯＣＨ_２Ｘ^３５、－ＯＣＨＸ^３５ _２、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）－ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－Ｎ_３、Ｒ^３６－置換若しくは非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８、Ｃ_１～Ｃ_６、Ｃ_１～Ｃ_４、又はＣ_１～Ｃ_２）、Ｒ^３６－置換若しくは非置換ヘテロアルキル（例えば、２～８員、２～６員、４～６員、２～３員、又は４～５員）、Ｒ^３６－置換若しくは非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_４～Ｃ_６、又はＣ_５～Ｃ_６）、Ｒ^３６－置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、４～６員、４～５員、又は５～６員）、Ｒ^３６－置換若しくは非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０又はフェニル）、又はＲ^３６－置換若しくは非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～９員、又は５～６員）である。態様では、Ｒ^３５は独立して、オキソ、ハロゲン、－ＣＸ^３５ _３、－ＣＨＸ^３５ _２、－ＣＨ_２Ｘ^３５、－ＯＣＸ^３５ _３、－ＯＣＨ_２Ｘ^３５、－ＯＣＨＸ^３５ _２、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）－ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－Ｎ_３、非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８、Ｃ_１～Ｃ_６、Ｃ_１～Ｃ_４、又はＣ_１～Ｃ_２）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２～８員、２～６員、４～６員、２～３員、又は４～５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_４～Ｃ_６、又はＣ_５～Ｃ_６）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、４～６員、４～５員、又は５～６員）、非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０又はフェニル）、又は非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～９員、又は５～６員）である。Ｘ^３５は独立して、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、又は－Ｉである。

【0195】

実施形態では、Ｒ^３５は独立して、非置換メチルである。態様では、Ｒ^３５は独立して、非置換エチルである。

【0196】

Ｒ^３６は独立して、オキソ、ハロゲン、－ＣＸ^３６ _３、－ＣＨＸ^３６ _２、－ＣＨ_２Ｘ^３６、－ＯＣＸ^３６ _３、－ＯＣＨ_２Ｘ^３６、－ＯＣＨＸ^３６ _２、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）－ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－Ｎ_３、Ｒ^３７－置換若しくは非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８、Ｃ_１～Ｃ_６、Ｃ_１～Ｃ_４、又はＣ_１～Ｃ_２）、Ｒ^３７－置換若しくは非置換ヘテロアルキル（例えば、２～８員、２～６員、４～６員、２～３員、又は４～５員）、Ｒ^３７－置換若しくは非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_４～Ｃ_６、又はＣ_５～Ｃ_６）、Ｒ^３７－置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、４～６員、４～５員、又は５～６員）、Ｒ^３７－置換若しくは非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０又はフェニル）、又はＲ^３７－置換若しくは非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～９員、又は５～６員）である。態様では、Ｒ^３６は独立して、オキソ、ハロゲン、－ＣＸ^３６ _３、－ＣＨＸ^３６ _２、－ＣＨ_２Ｘ^３６、－ＯＣＸ^３６ _３、－ＯＣＨ_２Ｘ^３６、－ＯＣＨＸ^３６ _２、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）－ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－Ｎ_３、非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８、Ｃ_１～Ｃ_６、Ｃ_１～Ｃ_４、又はＣ_１～Ｃ_２）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２～８員、２～６員、４～６員、２～３員、又は４～５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_４～Ｃ_６、又はＣ_５～Ｃ_６）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、４～６員、４～５員、又は５～６員）、非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０又はフェニル）、又は非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～９員、又は５～６員）である。Ｘ^３６は独立して、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、又は－Ｉである。

【0197】

実施形態では、Ｒ^３６は独立して、非置換メチルである。態様では、Ｒ^３６は独立して、非置換エチルである。

【0198】

Ｒ^３７は独立して、オキソ、ハロゲン、－ＣＸ^３７ _３、－ＣＨＸ^３７ _２、－ＣＨ_２Ｘ^３７、－ＯＣＸ^３７ _３、－ＯＣＨ_２Ｘ^３７、－ＯＣＨＸ^３７ _２、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＳＯ_３Ｈ、－ＳＯ_４Ｈ、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＮＨＮＨ_２、－ＯＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、－ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_２Ｈ、－ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（Ｏ）－ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－Ｎ_３、非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_８、Ｃ_１～Ｃ_６、Ｃ_１～Ｃ_４、又はＣ_１～Ｃ_２）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２～８員、２～６員、４～６員、２～３員、又は４～５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_４～Ｃ_６、又はＣ_５～Ｃ_６）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、４～６員、４～５員、又は５～６員）、非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０又はフェニル）、又は非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～９員、又は５～６員）である。Ｘ^３７は独立して、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、又は－Ｉである。

【0199】

実施形態では、Ｒ^３７は独立して、非置換メチルである。態様では、Ｒ^３７は独立して、非置換エチルである。

【0200】

実施形態では、Ｒ^４Ａは、水素、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、又は置換若しくは非置換ヘテロアリーレンである。

【0201】

実施形態では、Ｒ^４Ａは、水素、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換アルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換ヘテロアルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換シクロアルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換アリール、又は置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換ヘテロアリールである。

【0202】

実施形態では、Ｒ^４Ａは、水素、置換若しくは非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_２０、Ｃ_１～Ｃ_１０、Ｃ_１～Ｃ_５）、置換若しくは非置換ヘテロアルキル（例えば、２～２０員、２～１０員、２～５員）、置換若しくは非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_３～Ｃ_５）、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、３～５員）、置換若しくは非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０、Ｃ_６～Ｃ_８、Ｃ_６～Ｃ_５）、又は置換若しくは非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～８員、５～６員）である。

【0203】

実施形態では、Ｒ^４Ａは、水素、非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_２０、Ｃ_１～Ｃ_１０、Ｃ_１～Ｃ_５）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２～２０員、２～１０員、２～５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_３～Ｃ_５）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、３～５員）、非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０、Ｃ_６～Ｃ_８、Ｃ_６～Ｃ_５）、又は非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～８員、５～６員）である。

【0204】

実施形態では、Ｒ^４Ｂは、水素、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、又は置換若しくは非置換ヘテロアリーレンである。

【0205】

実施形態では、Ｒ^４Ｂは、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換アルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換ヘテロアルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換シクロアルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換アリール、又は置換（例えば、置換基、サイズ限定置換基、又は低級置換基で置換された）若しくは非置換ヘテロアリールである。

【0206】

実施形態では、Ｒ^４Ｂは、水素、置換若しくは非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_２０、Ｃ_１～Ｃ_１０、Ｃ_１～Ｃ_５）、置換若しくは非置換ヘテロアルキル（例えば、２～２０員、２～１０員、２～５員）、置換若しくは非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_３～Ｃ_５）、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、３～５員）、置換若しくは非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０、Ｃ_６～Ｃ_８、Ｃ_６～Ｃ_５）、又は置換若しくは非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～８員、５～６員）である。

【0207】

実施形態では、Ｒ^４Ｂは、水素、非置換アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_２０、Ｃ_１～Ｃ_１０、Ｃ_１～Ｃ_５）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２～２０員、２～１０員、２～５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８、Ｃ_３～Ｃ_６、Ｃ_３～Ｃ_５）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３～８員、３～６員、３～５員）、非置換アリール（例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０、Ｃ_６～Ｃ_８、Ｃ_６～Ｃ_５）、又は非置換ヘテロアリール（例えば、５～１０員、５～８員、５～６員）である。

【0208】

実施形態では、Ｘ^１は、イミダゾリレン、－ＮＨ－又は－Ｏ－である。態様では、Ｘ^１は、イミダゾリレン（すなわち、二価イミダゾール）である。態様では、Ｘ^１は、－ＮＨ－である。態様では、Ｘ^１は、－Ｏ－である。

【0209】

実施形態では、第１の生体分子部分は、ペプチジル部分である。態様では、第２の生体分子部分は、ペプチジル部分である。態様では、第１の生体分子部分は、ペプチジル部分であり、第２の生体分子部分は、ペプチジル部分である。態様では、第１の生体分子部分と第２の生体分子部分中のペプチジル部分は同じタンパク質中にある。態様では、第１の生体分子部分と第２の生体分子部分中のペプチジル部分は異なるタンパク質中にある。実施形態では、異なるタンパク質は、シングルドメイン抗体と膜受容体である。実施形態では、異なるタンパク質は、抗体と膜受容体である。実施形態では、異なるタンパク質は、抗原結合断片と膜受容体である。実施形態では、異なるタンパク質は、アフィボディと膜受容体である。実施形態では、異なるタンパク質は、単鎖可変領域断片と膜受容体である。

【0210】

実施形態では、－Ｌ^１－Ｒ^１はペプチジル部分である。実施形態では、－Ｌ^２－Ｒ^２はペプチジル部分である。態様では、－Ｌ^１－Ｒ^１のペプチジル部分と－Ｌ^２－Ｒ^２のペプチジル部分は同じタンパク質中にある。態様では、－Ｌ^１－Ｒ^１のペプチジル部分と－Ｌ^２－Ｒ^２のペプチジル部分は異なるタンパク質中にある。態様では、Ｌ^１は結合である。態様では、Ｌ^２は結合である。態様では、Ｌ^１とＬ^２は結合である。実施形態では、異なるタンパク質は、シングルドメイン抗体と膜受容体である。実施形態では、異なるタンパク質は、抗体と膜受容体である。実施形態では、異なるタンパク質は、単鎖可変領域断片と膜受容体である。実施形態では、異なるタンパク質は、アフィボディと膜受容体である。実施形態では、異なるタンパク質は、抗原結合断片と膜受容体である。

【0211】

実施形態では、第１の生体分子部分は核酸部分又は炭水化物部分である。実施形態では、第１の生体分子部分は核酸部分である。実施形態では、第１の生体分子部分は炭水化物部分である。実施形態では、第２の生体分子部分は核酸部分又は炭水化物部分である。実施形態では、第２の生体分子部分は核酸部分である。実施形態では、第２の生体分子部分は炭水化物部分である。

【0212】

実施形態では、－Ｌ^１－Ｒ^１は核酸部分又は炭水化物部分である。態様では、－Ｌ^１－Ｒ^１は核酸部分である。態様では、－Ｌ^１－Ｒ^１は炭水化物部分である。態様では、－Ｌ^２－Ｒ^２は核酸部分又は炭水化物部分である。態様では、－Ｌ^２－Ｒ^２は核酸部分である。態様では、－Ｌ^２－Ｒ^２は炭水化物部分である。態様では、Ｌ^１は結合である。態様では、Ｌ^２は結合である。態様では、Ｌ^１とＬ^２は結合である。

【0213】

実施形態では、第１の生体分子部分は、小分子部分、ペプチジル部分、核酸部分、及び炭水化物部分からなる群から選択される。態様では、第２の生体分子部分は、小分子部分、ペプチジル部分、核酸部分、及び炭水化物部分からなる群から選択される。態様では、第１の生体分子部分は、第２の生体分子部分と同じである。態様では、第１の生体分子部分は、第２の生体分子部分とは異なる。態様では、第１の生体分子部分と第２の生体分子部分は、同じ生体分子内にある。態様では、第１の生体分子部分及び第２の生体分子部分は、異なる生体分子内にある。態様では、第１の生体分子部分は小分子部分であり、第２の生体分子部分はペプチジル部分である。態様では、第１の生体分子部分はペプチジル部分であり、第２の生体分子部分は小分子部分である。

【0214】

実施形態では、第１の生体分子部分は、ペプチジル部分、核酸部分、及び炭水化物部分からなる群から選択される。態様では、第２の生体分子部分は、ペプチジル部分、核酸部分、及び炭水化物部分からなる群から選択される。態様では、第１の生体分子部分は、第２の生体分子部分と同じである。態様では、第１の生体分子部分は、第２の生体分子部分とは異なる。態様では、第１の生体分子部分と第２の生体分子部分は、同じ生体分子内にある。態様では、第１の生体分子部分及び第２の生体分子部分は、異なる生体分子内にある。態様では、第１の生体分子部分と第２の生体分子部分はそれぞれ独立して、ペプチジル部分である。

【0215】

実施形態では、－Ｌ^１－Ｒ^１は、小分子部分、ペプチジル部分、核酸部分及び炭水化物部分からなる群から選択される。態様では、－Ｌ^２－Ｒ^２は、小分子部分、ペプチジル部分、核酸部分及び炭水化物部分からなる群から選択される。態様では、－Ｌ^１－Ｒ^１は小分子部分である。態様では、－Ｌ^２－Ｒ^２は小分子部分である。態様では、Ｌ^１は結合である。態様では、Ｌ^２は結合である。態様では、Ｌ^１とＬ^２は結合である。

【0216】

実施形態では、－Ｌ^１－Ｒ^１は、ペプチジル部分、核酸部分及び炭水化物部分からなる群から選択される。態様では、－Ｌ^２－Ｒ^２は、ペプチジル部分、核酸部分及び炭水化物部分からなる群から選択される。態様では、－Ｌ^１－Ｒ^１は、－Ｌ^２－Ｒ^２と同じである。態様では、－Ｌ^１－Ｒ^１は、－Ｌ^２－Ｒ^２とは異なる。態様では、－Ｌ^１－Ｒ^１及び－Ｌ^２－Ｒ^２はそれぞれ独立して、ペプチジル部分である。態様では、Ｌ^１は結合である。態様では、Ｌ^２は結合である。態様では、Ｌ^１とＬ^２は結合である。

【0217】

態様では、本開示は、式（ＩＶ）の部分、式（Ｖ）の部分、式（ＶＩ）の部分、又はそれらの２つ以上の組み合わせを含むタンパク質を提供する：

【0218】

【化27】

【0219】

態様では、タンパク質は式（ＩＶ）の部分を含む。態様では、タンパク質は式（Ｖ）の部分を含む。態様では、タンパク質は式（ＶＩ）の部分を含む。態様では、タンパク質は式（ＩＶ）の部分と式（Ｖ）の部分を含む。態様では、タンパク質は式（ＩＶ）の部分と式（ＶＩ）の部分を含む。態様では、タンパク質は式（Ｖ）の部分と式（ＶＩ）の部分を含む。態様では、タンパク質は式（ＩＶ）の部分と、式（Ｖ）の部分と、式（ＶＩ）の部分とを含む。態様では、式（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）の部分、又はそれらの組み合わせは、分子内共有結合を形成する。態様では、式（ＩＶ）の部分は分子内共有結合を形成する。態様では、式（Ｖ）の部分は分子内共有結合を形成する。態様では、式（ＶＩ）の部分は分子内共有結合を形成する。態様では、式（ＩＶ）と（Ｖ）の部分は分子内共有結合を形成する。態様では、式（ＩＶ）と（ＶＩ）の部分は分子内共有結合を形成する。態様では、式（Ｖ）と（ＶＩ）の部分は分子内共有結合を形成する。態様では、式（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）の部分は分子内共有結合を形成する。態様では、式（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）の部分、又はそれらの組み合わせは、分子間共有結合を形成する。態様では、式（ＩＶ）の部分は分子間共有結合を形成する。態様では、式（Ｖ）の部分は分子間共有結合を形成する。態様では、式（ＶＩ）の部分は分子間共有結合を形成する。態様では、式（ＩＶ）及び（Ｖ）の部分は分子間共有結合を形成する。態様では、式（ＩＶ）及び（ＶＩ）の部分は分子間共有結合を形成する。態様では、式（Ｖ）及び（ＶＩ）の部分は分子間共有結合を形成する。態様では、式（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）の部分は分子間共有結合を形成する。

【0220】

態様では、本開示は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、又は式（ＩＩＩ）のタンパク質を提供し、

【0221】

【化28】

を有する化合物であって、

【0222】

【化29】

式中、Ｒ^１及びＲ^２は各々独立して、一緒に結合されたペプチジル部分であり、すなわち、式（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）のタンパク質は分子内共有結合を含む。態様では、タンパク質は式（Ｉ）のものである。態様では、タンパク質は式（ＩＩ）のものである。態様では、タンパク質は式（ＩＩＩ）のものである。態様では、Ｒ^１のペプチジル部分及びＲ^２のペプチジル部分は、タンパク質αストランドを含む。態様では、Ｒ^１のペプチジル部分及びＲ^２のペプチジル部分は、タンパク質βストランドを含む。態様では、Ｒ^１のペプチジル部分がタンパク質αストランドを含み、Ｒ^２のペプチジル部分はタンパク質βストランドを含む。態様では、Ｒ^１のペプチジル部分がタンパク質βストランドを含み、Ｒ^２のペプチジル部分はタンパク質αストランドを含む。

【0223】

態様では、本開示は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、又は式（ＩＩＩ）のタンパク質を提供し、

【0224】

【化30】

を有する化合物であって、

【0225】

【化31】

式中、Ｒ^１は第１のタンパク質のペプチジル部分であり、Ｒ^２は第２のタンパク質のペプチジル部分であり、すなわち、２つのタンパク質の間に分子間共有結合が存在する。態様では、分子間結合は２つの異なるタンパク質の間にある。態様では、分子間結合は２つの同じタンパク質（例えば、分子間結合されている同じアミノ酸配列を有する２つのタンパク質）の間にある。態様では、第１のタンパク質が式（ＩＶ）の部分を介して第２のタンパク質に共有結合して、式（Ｉ）の分子間結合タンパク質を形成する。態様では、第１のタンパク質が式（Ｖ）の部分を介して第２のタンパク質に共有結合して、式（ＩＩ）の分子間結合タンパク質を形成する。態様では、第１のタンパク質が式（ＶＩ）の部分を介して第２のタンパク質に共有結合して、式（ＩＩＩ）の分子間結合タンパク質を形成する。態様では、第１のタンパク質は、式（ＩＶ）の部分及び式（ＩＶ）の部分を介して第２のタンパク質に共有結合している。態様では、第１のタンパク質は、式（ＩＶ）の部分及び式（ＶＩ）の部分を介して第２のタンパク質に共有結合している。態様では、第１のタンパク質は、式（Ｖ）の部分及び式（ＶＩ）の部分を介して第２のタンパク質に共有結合している。態様では、第１のタンパク質は、式（ＩＶ）の部分、式（Ｖ）の部分、及び式（ＶＩ）の部分を介して第２のタンパク質に共有結合している。態様では、第１のタンパク質はホルモンであり、第２のタンパク質はホルモン受容体である。態様では、第１のタンパク質は抗体又は抗体変異体であり、第２のタンパク質は膜受容体である。態様では、第１のタンパク質は抗体であり、第２のタンパク質は膜受容体である。態様では、第１のタンパク質は抗体変異体であり、第２のタンパク質は膜受容体である。態様では、第１のタンパク質は、抗体、抗原結合断片、単鎖可変領域断片、シングルドメイン抗体、又はアフィボディであり、第２のタンパク質は膜受容体である。態様では、第１のタンパク質は抗体結合断片であり、第２のタンパク質は膜受容体である。態様では、第１のタンパク質は単鎖可変領域断片であり、第２のタンパク質は膜受容体である。態様では、第１のタンパク質はシングルドメイン抗体であり、第２のタンパク質は膜受容体である。態様では、第１のタンパク質はアフィボディであり、第２のタンパク質は膜受容体である。態様では、第１のタンパク質はシングルドメイン抗体であり、第２のタンパク質はホルモン受容体である。態様では、ペプチジル部分Ｒ^１及びＲ^２はタンパク質αヘリックスを含む。態様では、ペプチジル部分Ｒ^１及びＲ^２はタンパク質βシートを含む。態様では、ペプチジル部分Ｒ^１がタンパク質αヘリックスを含み、ペプチジル部分Ｒ^２はタンパク質βシートを含む。態様では、ペプチジル部分Ｒ^１がタンパク質βシートを含み、ペプチジル部分Ｒ^２はタンパク質αヘリックスを含む。態様では、Ｒ^１は抗体又は抗体変異体であり、Ｒ^２は膜受容体である。態様では、Ｒ^１は抗体であり、Ｒ^２は膜受容体である。態様では、Ｒ^１は抗体変異体であり、Ｒ^２は膜受容体である。態様では、Ｒ^１は、抗体、抗原結合性断片、単鎖可変領域断片、シングルドメイン抗体、又はアフィボディであり、Ｒ^２は膜受容体である。態様では、Ｒ^１は抗原結合断片であり、Ｒ^２は膜受容体である。態様では、Ｒ^１は単鎖可変領域断片であり、Ｒ^２は膜受容体である。態様では、Ｒ^１はシングルドメイン抗体であり、Ｒ^２は膜受容体である。態様では、Ｒ^１はアフィボディであり、Ｒ^２は膜受容体である。態様では、Ｒ^１は膜受容体であり、Ｒ^２は抗体又は抗体変異体である。態様では、Ｒ^１は膜受容体であり、Ｒ^２は抗体である。態様では、Ｒ^１は膜受容体であり、Ｒ^２は抗体変異体である。態様では、Ｒ^１は膜受容体であり、Ｒ^２は抗体、抗原結合断片、単鎖可変領域断片、シングルドメイン抗体、又はアフィボディである。態様では、Ｒ^１は膜受容体であり、Ｒ^２は抗原結合断片である。態様では、Ｒ^１は膜受容体であり、Ｒ^２は単鎖可変領域断片である。態様では、Ｒ^１は膜受容体であり、Ｒ^２はシングルドメイン抗体である。態様では、Ｒ^１は膜受容体であり、Ｒ^２はアフィボディである。

【0226】

態様では、タンパク質コンジュゲートは、３つ以上の異なる及び／又は別個のタンパク質を含み得る。例えば、第１のタンパク質は、式（ＩＶ）の部分、式（Ｖ）の部分、式（ＶＩ）の部分、又はそれらの２つ以上の組み合わせを介して第２のタンパク質に共有結合され、第２のタンパク質は、式（ＩＶ）の部分、式（Ｖ）の部分、式（ＶＩ）の部分、又はそれらの２つ以上の組み合わせを介して第３のタンパク質に共有結合される。別の例として、第１のタンパク質は、式（ＩＶ）の部分、式（Ｖ）の部分、式（ＶＩ）の部分、又はそれらの２つ以上の組み合わせを介して第２のタンパク質に共有結合され、第１のタンパク質はまた、式（ＩＶ）の部分、式（Ｖ）の部分、式（ＶＩ）の部分、又はそれらの２つ以上の組み合わせを介して第３のタンパク質に共有結合される。これらの態様のそれぞれにおいて、第１のタンパク質、第２のタンパク質、及び第３のタンパク質はそれぞれ、任意で、式（ＩＶ）の部分、式（Ｖ）の部分、式（ＶＩ）の部分、又はそれらの２つ以上の組み合わせを更に含んでもよく、ここで、Ｒ^１とＲ^２のペプチジル部分は、それぞれ、第１のタンパク質、第２のタンパク質、又は第３のタンパク質内で分子内結合を形成する。

【0227】

実施形態において、本開示は、非天然アミノ酸を含む、小分子部分、膜受容体、抗体、抗原結合断片、単鎖可変領域断片、シングルドメイン抗体、又はアフィボディを提供し、ここで、非天然アミノ酸は式（Ｆ）の側鎖を有する：

【0228】

【化32】

【0229】

実施形態にでは、本開示は、式（Ｆ）の非天然アミノ酸側鎖を含む抗体、抗原結合断片、単鎖可変領域断片、シングルドメイン抗体、又はアフィボディを提供する。実施形態では、本開示は、式（Ｆ）の非天然アミノ酸側鎖を含む膜受容体を提供する。実施形態では、本開示は、式（Ｆ）の非天然アミノ酸側鎖を含む小分子部分を提供する。実施形態では、本開示は、式（Ｆ）の非天然アミノ酸側鎖を含む抗体を提供する。実施形態では、本開示は、式（Ｆ）の非天然アミノ酸側鎖を含む抗原結合断片、単鎖可変領域断片を提供する。実施形態では、本開示は、式（Ｆ）の非天然アミノ酸側鎖を含む単鎖可変領域断片を提供する。実施形態では、本開示は、式（Ｆ）の非天然アミノ酸側鎖を含むシングルドメイン抗体を提供する。実施形態では、本開示は、式（Ｆ）の非天然アミノ酸側鎖を含むアフィボディを提供する。

【0230】

実施形態では、本明細書に記載される生体分子及びタンパク質は膜受容体を含む。実施形態では、膜受容体は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）受容体、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）受容体、５－ヒドロキシトリプタミン受容体、アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アデノシンＡ２Ａ受容体、アデノシンＡ２Ｂ受容体、アンジオテンシン受容体、アペリン受容体、胆汁酸受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カンナビノイド受容体、ケメリン受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、クラスＡオーファン受容体、ドーパミン受容体、エンドセリン受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ホルミルペプチド受容体、遊離脂肪酸受容体、ガラニン受容体、グレリン受容体、糖タンパク質ホルモン受容体、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体、Ｇタンパク質共役受容体、Ｇタンパク質共役エストロゲン受容体、ヒスタミン受容体、ヒドロキシカルボン酸受容体、キスペプチン受容体、ロイコトリエン受容体、リゾリン脂質受容体、リゾリン脂質Ｓ１Ｐ受容体、メラニン凝集ホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、モチリン受容体、ニューロメジンＵ受容体、ニューロペプチドＦＦ／ニューロペプチドＡＦ受容体、ニューロペプチドＳ受容体、ニューロペプチドＷ／ニューロペプチドＢ受容体、ニューロペプチドＹ受容体、ニューロテンシン受容体、オピオイド受容体、オプシン受容体、オレキシン受容体、オキソグルタル酸受容体、Ｐ２Ｙ受容体、血小板活性化因子受容体、プロキネチシン受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体、プロスタノイド受容体、プロテアーゼ活性化受容体、ＱＲＦＰ受容体、リラキシンファミリーペプチド受容体、ソマトスタチン受容体、コハク酸受容体、タキキニン受容体、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体、微量アミン受容体、ウロテンシン受容体、又はそれらの２つ以上の組み合わせである。

【0231】

実施形態では、膜受容体はＰＤ－１受容体又はＰＤ－Ｌ１受容体である。実施形態では、膜受容体はＰＤ－１受容体である。実施形態では、膜受容体はＰＤ－Ｌ１受容体である。

【0232】

実施形態では、膜受容体は、がん細胞上に発現される受容体である。実施形態では、膜受容体は、対照と比較してがん細胞上に過剰発現される受容体である。

【0233】

実施形態では、膜受容体はＧタンパク質共役受容体である。実施形態では、膜受容体は受容体型チロシンキナーゼである。実施形態では、膜受容体はＥｒｂＢ受容体である。実施形態では、膜受容体は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）である。実施形態では、膜受容体は上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）である。実施形態では、膜受容体は上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）である。実施形態では、膜受容体は上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）である。実施形態では、膜受容体は上皮成長因子受容体４（ＨＥＲ４）である。

【0234】

実施形態では、膜受容体はＥＧＦＲである。実施形態では、膜受容体は、がん細胞上に発現されるＥＧＦＲである。実施形態では、膜受容体は、対照と比較してがん細胞上に過剰発現されるＥＧＦＲである。

【0235】

本明細書では、ＦＳＫ又はＦＳＹで修飾されたナノボディ７Ｄ１２を提供する。ナノボディ７Ｄ１２は配列番号８８で示され、ここで、ＣＤＲ１は配列番号９５に示され、ＣＤＲ２は配列番号９６に示され、ＣＤＲ３は配列番号９７に示される。

【0236】

配列番号８８ ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧ ＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬ ＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲ ＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡ ＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧ ＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹ ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤ ＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤ ＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡ ＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥ ＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶ ＴＶＳＳ

【0237】

配列番号９５＝ＲＴＳＲＳＹＧＭＧ

【0238】

配列番号９６＝ＧＩＳＷＲＧＤＳ

【0239】

配列番号９７＝ＡＡＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥＹＤＹ

【0240】

本明細書では、ナノボディ中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＫであるナノボディ７Ｄ１２を提供する。実施形態では、ナノボディは、配列番号９５に記載のＣＤＲ１と、配列番号９６に記載のＣＤＲ２と、配列番号９７に記載のＣＤＲ３とを含み、ここで、３０位又は３１位に対応する位置のアミノ酸がＦＳＫである。実施形態では、ナノボディは、配列番号９５に記載のＣＤＲ１と、配列番号９６に記載のＣＤＲ２と、配列番号９７に記載のＣＤＲ３とを含み、ここで、３０位に対応する位置のアミノ酸がＦＳＫである（すなわち、３０位は配列番号９５における４位に対応する）。実施形態では、ナノボディは、配列番号９５に記載のＣＤＲ１と、配列番号９６に記載のＣＤＲ２と、配列番号９７に記載のＣＤＲ３とを含み、ここで、３１位に対応する位置のアミノ酸がＦＳＫである（すなわち、３１位は配列番号９５の５位に対応する）。実施形態では、ナノボディは、配列番号９８に記載のＣＤＲ１と、配列番号９６に記載のＣＤＲ２と、配列番号９７に記載のＣＤＲ３とを含む。実施形態では、ナノボディは、配列番号９９に記載のＣＤＲ１と、配列番号９６に記載のＣＤＲ２と、配列番号９７に記載のＣＤＲ３とを含む。配列において、Ｘ^ＦＳＫはＦＳＫである。

【0241】

配列番号９８＝ＲＴＳＸ^ＦＳＫＳＹＧＭＧ

【0242】

配列番号９９＝ＲＴＳＲＸ^ＦＳＫＹＧＭＧ

【0243】

実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は、配列番号３５又は配列番号８８に記載のアミノ酸配列を有し、ここで、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸はＦＳＫである。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は配列番号３５に記載のアミノ酸配列を有し、ここで、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＫである。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は配列番号８８に記載のアミノ酸配列を有し、ここで、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＫである。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は配列番号８８に記載のアミノ酸配列を有し、ここで、３０位又は３１位に対応する位置のアミノ酸がＦＳＫである。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は配列番号８８に記載のアミノ酸配列を有し、ここで、位置３０に対応する位置のアミノ酸がＦＳＫである（すなわち、配列番号８９）。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は配列番号８８に記載のアミノ酸配列を有し、ここで、位置３１に対応する位置のアミノ酸がＦＳＫである（すなわち、配列番号９０）。

【0244】

実施形態では、ナノボディは配列番号８９を含む。実施形態では、ナノボディは配列番号８９で記載される。実施形態では、ナノボディは配列番号８９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号８９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号８９に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号８９に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号８９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号８９に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号８９に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。配列同一性が１００％未満の実施形態では、ナノボディは、配列番号８９の３０位に対応する位置にＦＳＫを含有しなければならない。実施形態において、ナノボディの配列番号８９に対する配列同一性が１００％未満の場合、ナノボディは、配列番号８９内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に対して１００％の配列同一性を有する。配列番号８９において、Ｘ^ＦＳＫはＦＳＫである。

【0245】

配列番号８９ ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧ ＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬ ＴＣＡＡＳＧＲＴＳＸ^ＦＳＫ ＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡ ＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧ ＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹ ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤ ＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤ ＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡ ＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥ ＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶ ＴＶＳＳ

【0246】

実施形態では、ナノボディは配列番号９０を含む。実施形態では、ナノボディは配列番号９０で記載される。実施形態では、ナノボディは配列番号９０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９０に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９０に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９０に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９０に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。配列同一性が１００％未満の実施形態では、ナノボディは、配列番号９０の３１位に対応する位置にＦＳＫを含有しなければならない。実施形態において、ナノボディの配列番号９０に対する配列同一性が１００％未満の場合、ナノボディは、配列番号９０内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に対して１００％の配列同一性を有する。配列番号９０において、Ｘ^ＦＳＫはＦＳＫである。

【0247】

配列番号９０ ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧ ＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬ ＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲ Ｘ^ＦＳＫＹＧＭＧＷＦＲＱＡ ＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧ ＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹ ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤ ＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤ ＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡ ＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥ ＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶ ＴＶＳＳ

【0248】

本明細書では、ナノボディ中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＹであるナノボディ７Ｄ１２を提供する。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は、配列番号９５に記載のＣＤＲ１と、配列番号９６に記載のＣＤＲ２と、配列番号９７に記載のＣＤＲ３とを含み、ここで、１０９位又は１１３位に対応する位置のアミノ酸がＦＳＹである。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は、配列番号９５に記載のＣＤＲ１と、配列番号９６のＣＤＲ２と、配列番号９７に記載のＣＤＲ３とを含み、ここで、１０９位に対応する位置のアミノ酸がＦＳＹである（すなわち、ここで、１０９位は配列番号９７における１１位に対応する）。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は、配列番号９５に記載のＣＤＲ１と、配列番号９６に記載のＣＤＲ２と、配列番号１００に記載のＣＤＲ３とを含む。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は、配列番号９５に記載のＣＤＲ１と、配列番号９６に記載のＣＤＲ２と、配列番号１０１に記載のＣＤＲ３とを含む。配列において、Ｘ^ＦＳＹはＦＳＹである。

【0249】

配列番号１００＝ＡＡＧＳＡＷＹＧＴＬＸ^ＦＳＹＥＹＤＹ

【0250】

配列番号１０１＝ＡＡＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥＹＤＸ^ＦＳＹ

【0251】

実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は、配列番号３５又は配列番号８８に記載のアミノ酸配列を有し、ここで、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＹである。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は配列番号３５に記載のアミノ酸配列を有し、ここで、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＹである。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は配列番号８８に記載のアミノ酸配列を有し、ここで、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＹである。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は配列番号８８に記載のアミノ酸配列を有し、１位、１０９位、１１３位、又は１１６位に対応する位置のアミノ酸がＦＳＹである。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は配列番号８８に記載のアミノ酸配列を有し、１位に対応する位置のアミノ酸がＦＳＹである（すなわち、配列番号９１）。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は配列番号８８に記載のアミノ酸配列を有し、１０９位に対応する位置のアミノ酸がＦＳＹである（すなわち、配列番号９２）。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は配列番号８８に記載のアミノ酸配列を有し、１１３位に対応する位置のアミノ酸がＦＳＹである（すなわち、配列番号９３）。実施形態では、ナノボディ７Ｄ１２は配列番号８８に記載のアミノ酸配列を有し、１１６位に対応する位置のアミノ酸がＦＳＹである（すなわち、配列番号９４）。

【0252】

実施形態では、ナノボディは配列番号９１を含む。実施形態では、ナノボディは配列番号９１で記載される。実施形態では、ナノボディは配列番号９１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９１に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９１に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９１に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。配列同一性が１００％未満の実施形態では、ナノボディは、配列番号９１の１位に対応する位置にＦＳＹを含有しなければならない。実施形態において、ナノボディの配列番号９１に対する配列同一性が１００％未満の場合、ナノボディは、配列番号９１内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に対して１００％の配列同一性を有し、ナノボディは、配列番号９１の１位に対応する位置にＦＳＹを有する。配列番号９１において、Ｘ^ＦＳＹはＦＳＹである。

【0253】

配列番号９１ Ｘ^ＦＳＹＶＫＬＥＥＳＧＧＧ ＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬ ＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲ ＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡ ＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧ ＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹ ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤ ＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤ ＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡ ＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥ ＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶ ＴＶＳＳ

【0254】

実施形態では、ナノボディは配列番号９２を含む。実施形態では、ナノボディは配列番号９２で記載される。実施形態では、ナノボディは配列番号９２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９２に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９２に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９２に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９２に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。配列同一性が１００％未満の実施形態では、ナノボディは、配列番号９２の１０９位に対応する位置にＦＳＹを含有しなければならない。実施形態では、ナノボディの配列番号９２に対する配列同一性が１００％未満の場合、ナノボディは、配列番号９２内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に対して１００％の配列同一性を有する。配列番号９２において、Ｘ^ＦＳＹはＦＳＹである。

【0255】

配列番号９２ ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧ ＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬ ＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲ ＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡ ＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧ ＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹ ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤ ＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤ ＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡ ＧＳＡＷＹＧＴＬＸ^ＦＳＹＥ ＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶ ＴＶＳＳ

【0256】

実施形態では、ナノボディは配列番号９３を含む。実施形態では、ナノボディは配列番号９３で記載される。態様では、ナノボディは配列番号９３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。態様では、ナノボディは配列番号９３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、ナノボディは配列番号９３に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する。態様では、ナノボディは配列番号９３に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する。態様では、ナノボディは配列番号９３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、ナノボディは配列番号９３に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。態様では、ナノボディは配列番号９３に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。配列同一性が１００％未満の実施形態では、ナノボディは、配列番号９３の１１３位に対応する位置にＦＳＹを含有しなければならない。実施形態において、ナノボディの配列番号９３に対する配列同一性が１００％未満の場合、ナノボディは、配列番号９３内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に対して１００％の配列同一性を有する。配列番号９３において、Ｘ^ＦＳＹはＦＳＹである。

【0257】

配列番号９３ ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧ ＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬ ＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲ ＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡ ＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧ ＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹ ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤ ＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤ ＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡ ＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥ ＹＤＸ^ＦＳＹＷＧＱＧＴＱＶ ＴＶＳＳ

【0258】

実施形態では、ナノボディは配列番号９４を含む。実施形態では、ナノボディは配列番号９４で記載される。実施形態では、ナノボディは配列番号９４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９４に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９４に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９４に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。実施形態では、ナノボディは配列番号９４に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。配列同一性が１００％未満の実施形態では、ナノボディは、配列番号９４の１１６位に対応する位置にＦＳＹを含有しなければならない。実施形態において、ナノボディの配列番号９４に対する配列同一性が１００％未満の場合、ナノボディは、配列番号９４内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に対して１００％の配列同一性を有し、ナノボディは、配列番号９４の１１６位に対応する位置にＦＳＹを有する。配列番号９４において、Ｘ^ＦＳＹはＦＳＹである。

【0259】

配列番号９４ ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧ ＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬ ＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲ ＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡ ＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧ ＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹ ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤ ＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤ ＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡ ＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥ ＹＤＹＷＧＸ^ＦＳＹＧＴＱＶ ＴＶＳＳ

【0260】

実施形態において、本開示は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＫであるナノボディ７Ｄ１２（本明細書に記載される実施形態を含む）と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。実施形態では、医薬組成物は、配列番号８９（その実施形態を含む）と、薬学的に許容される担体とを含む。実施形態では、医薬組成物は、配列番号９０（その実施形態を含む）と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、配列番号９８に記載のＣＤＲ１、配列番号９６に記載のＣＤＲ２、配列番号９７に記載のＣＤＲ３を含むナノボディと、薬学的に許容される賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、配列番号９９に記載のＣＤＲ１、配列番号９６に記載のＣＤＲ２、配列番号９７に記載のＣＤＲ３を含むナノボディと、薬学的に許容される賦形剤とを含む。

【0261】

実施形態では、本開示は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＫであり（本明細書に記載の実施形態を含む）、ＦＳＫのアミノ酸側鎖を介してＥＧＦＲタンパク質中のリジン、ヒスチジン、又はチロシンのアミノ酸に共有結合したナノボディ７Ｄ１２を含むバイオコンジュゲートを提供する。実施形態では、本開示は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＫであり（本明細書に記載の実施形態を含む）、ＦＳＫのアミノ酸側鎖を介してＥＧＦＲタンパク質中のリジンに共有結合したナノボディ７Ｄ１２を含むバイオコンジュゲートを提供する。実施形態では、本開示は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＫであり（本明細書に記載の実施形態を含む）、ＦＳＫのアミノ酸側鎖を介してＥＧＦＲタンパク質中のヒスチジンに共有結合したナノボディ７Ｄ１２を含むバイオコンジュゲートを提供する。実施形態では、本開示は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＫであり（本明細書に記載の実施形態を含む）、ＦＳＫのアミノ酸側鎖を介してＥＧＦＲタンパク質中のチロシンに共有結合したナノボディ７Ｄ１２を含むバイオコンジュゲートを提供する。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＫを介してＥＧＦＲ中のリジン、ヒスチジン、又はチロシンのアミノ酸に共有結合した配列番号８９（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＫを介してＥＧＦＲ中のリジンのアミノ酸に共有結合した配列番号８９（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＫを介してＥＧＦＲ中のヒスチジンのアミノ酸に共有結合した配列番号８９（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＫを介してＥＧＦＲ中のチロシンのアミノ酸に共有結合した配列番号８９（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＫを介してＥＧＦＲ中のリジン、ヒスチジン、又はチロシンのアミノ酸に共有結合した配列番号９０（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＫを介してＥＧＦＲ中のリジンのアミノ酸に共有結合した配列番号９０（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＫを介してＥＧＦＲ中のヒスチジンのアミノ酸に共有結合した配列番号９０（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＫを介してＥＧＦＲ中のチロシンのアミノ酸に共有結合した配列番号９０（その実施形態を含む）を含む。

【0262】

実施形態では、本開示は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＹであるナノボディ７Ｄ１２（本明細書に記載の実施形態を含む）と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。実施形態では、医薬組成物は、配列番号９１（その実施形態を含む）と、薬学的に許容される担体とを含む。実施形態では、医薬組成物は、配列番号９２（その実施形態を含む）と、薬学的に許容される担体とを含む。実施形態では、医薬組成物は、配列番号９３（その実施形態を含む）と、薬学的に許容される担体とを含む。実施形態では、医薬組成物は、配列番号９４（その実施形態を含む）と、薬学的に許容される担体とを含む。実施形態では、医薬組成物は、配列番号９５に記載のＣＤＲ１、配列番号９６に記載のＣＤＲ２、配列番号１００に記載のＣＤＲ３を含むナノボディと、薬学的に許容される担体とを含む。実施形態では、医薬組成物は、配列番号９５に記載のＣＤＲ１、配列番号９６に記載のＣＤＲ２、配列番号１０１に記載のＣＤＲ３を含むナノボディと、薬学的に許容される担体とを含む。

【0263】

実施形態では、本開示は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＹであり（本明細書に記載の実施形態を含む）、ＦＳＹのアミノ酸側鎖を介してＥＧＦＲタンパク質中のリジン、ヒスチジン、又はチロシンのアミノ酸に共有結合したナノボディ７Ｄ１２を含むバイオコンジュゲートを提供する。実施形態では、本開示は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＹであり（本明細書に記載の実施形態を含む）、ＦＳＹのアミノ酸側鎖を介してＥＧＦＲタンパク質中のリジンに共有結合したナノボディ７Ｄ１２を含むバイオコンジュゲートを提供する。実施形態では、本開示は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＹであり（本明細書に記載の実施形態を含む）、ＦＳＹのアミノ酸側鎖を介してＥＧＦＲタンパク質中のヒスチジンに共有結合したナノボディ７Ｄ１２を含むバイオコンジュゲートを提供する。実施形態では、本開示は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸がＦＳＹであり（本明細書に記載の実施形態を含む）、ＦＳＹのアミノ酸側鎖を介してＥＧＦＲタンパク質中のチロシンに共有結合したナノボディ７Ｄ１２を含むバイオコンジュゲートを提供する。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のリジン、ヒスチジン、又はチロシンのアミノ酸に共有結合した配列番号９１（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のリジンのアミノ酸に共有結合した配列番号９１（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のヒスチジンのアミノ酸に共有結合した配列番号９１（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のチロシンのアミノ酸に共有結合した配列番号９１（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のリジン、ヒスチジン、又はチロシンのアミノ酸に共有結合した配列番号９２（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のリジンのアミノ酸に共有結合した配列番号９２（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のヒスチジンのアミノ酸に共有結合した配列番号９２（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のチロシンのアミノ酸に共有結合した配列番号９２（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のリジン、ヒスチジン、又はチロシンのアミノ酸に共有結合した配列番号９３（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のリジンのアミノ酸に共有結合した配列番号９３（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のヒスチジンのアミノ酸に共有結合した配列番号９３（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のチロシンのアミノ酸に共有結合した配列番号９３（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のリジン、ヒスチジン、又はチロシンのアミノ酸に共有結合した配列番号９４（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のリジンのアミノ酸に共有結合した配列番号９４（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のヒスチジンのアミノ酸に共有結合した配列番号９４（その実施形態を含む）を含む。実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＦＳＹを介してＥＧＦＲ中のチロシンのアミノ酸に共有結合した配列番号９４（その実施形態を含む）を含む。

【0264】

ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素
本明細書に記載されるように、非天然アミノ酸（例えば、ＦＳＫ）は、生体分子（例えば、タンパク質）中の天然に存在するアミノ酸に挿入されてもよく、又はそれを置換してもよい。非天然アミノ酸を生体分子（例えば、タンパク質）中のアミノ酸に挿入又は置換するためには、タンパク質の形成中に、それを組み込むことができなければならない。従って、非天然アミノ酸は、翻訳中に使用され得るようにトランスファーＲＮＡ分子（ｔＲＮＡ）上に存在しなければならない。アミノ酸のローディングは、適切なアミノ酸のｔＲＮＡ分子への結合を促進する酵素であるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によって生じる。しかし、非天然アミノ酸のｔＲＮＡへの結合は、必ずしも天然に存在するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によって達成されなくてもよい。操作されたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（例えば、変異型ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ））は、非天然アミノ酸をｔＲＮＡに結合させるために有用であり得る。ＰｙｌＲＳ変異型ライブラリを作製した。以前に記載されたＰｙｌＲＳ変異型ライブラリと比較して、本明細書で作製されたＰｙｌＲＳ変異型ライブラリは、より多数のアミノ酸残基（例えば、１０アミノ酸残基）を同時に変異させることを可能にする新しいスモールインテリジェント変異誘発アプローチを使用して構築された。選択及びスクリーニングした全体のクローンのうち、４つのＰｙｌＲＳ変異型がＦＳＫを結合させることができ、１つのＰｙｌＲＳがＦＳＫの結合において特に有効であると同定された。

【0265】

本開示は、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に少なくとも５つのアミノ酸残基の置換を含む変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素を提供する。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列中に少なくとも５つのアミノ酸残基の置換を含む。態様では、少なくとも５つのアミノ酸の置換は、配列番号１のアミノ酸配列に示される１２６位のチロシン残基、１２９位のメチオニン残基、１６８位のバリン残基、２２７位のヒスチジン残基、及び２２８位のチロシン残基で生じる。態様では、少なくとも５つのアミノ酸の置換は、配列番号１のアミノ酸配列中の（ｉ）Ｙ１２６Ｇ、（ｉｉ）Ｍ１２９Ａ、（ｉｉｉ）Ｖ１６８Ｆ、（ｉｖ）Ｈ２２７Ｔ、Ｈ２２７Ｓ、又はＨ２２７Ｉ、及び（ｖ）Ｙ２２８Ｐである。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列中に少なくとも６つのアミノ酸残基の置換を含む。態様では、少なくとも６つのアミノ酸の置換は、配列番号１のアミノ酸配列に示される１２６位のチロシン残基、１２９位のメチオニン残基、１６８位のバリン残基、２２７位のヒスチジン残基、２２８位のチロシン残基、及び２２９位のリジン残基で生じる。態様では、少なくとも６つのアミノ酸残基の置換は、配列番号１のアミノ酸配列中の（ｉ）Ｙ１２６Ｇ、（ｉｉ）Ｍ１２９Ａ、（ｉｉｉ）Ｖ１６８Ｆ、（ｉｖ）Ｈ２２７Ｔ、Ｈ２２７Ｓ、又はＨ２２７Ｉ、（ｖ）Ｙ２２８Ｐ、及び（ｖｉ）Ｌ２２９Ｖ又はＬ２２９Ｉである。

【0266】

実施形態では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２の核酸配列によってコードされる。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２の配列を含む核酸配列によってコードされる。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する核酸配列によってコードされる。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。あるいは、配列番号２はＦＳＫＲＳと称される。

【0267】

実施形態では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８６の核酸配列によってコードされる。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８６の配列を含む核酸配列によってコードされる。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する核酸配列によってコードされる。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８６に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８６に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８６に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８６に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８６に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素の配列番号８６に対する配列同一性が１００％未満の場、Ｎ端の最初の７つのアミノ酸は常にＭＨ_６である。あるいは、配列番号８６はＦＳＫＲＳＮＴｈｉｓと呼ばれる。

【0268】

実施形態では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８７の核酸配列によってコードされる。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８７の配列を含む核酸配列によってコードされる。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する核酸配列によってコードされる。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８７に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８７に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８７に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８７に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号８７に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素の配列番号８７に対する配列同一性が１００％未満の場合、Ｃ端の最後の６つのアミノ酸は常にヒスチジンである。あるいは、配列番号８７はＦＳＫＲＳＣＴｈｉｓと呼ばれる。

【0269】

ベクター
本明細書で提供される組成物（例えば、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）は、当技術分野で公知の方法を使用して細胞に送達され得ることが企図される。したがって、１つの態様において、その実施形態を含む本明細書に記載の変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含むベクターを提供する。態様では、ベクターは、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に少なくとも５つのアミノ酸残基の置換を含む変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする核酸配列を更に含む。態様では、ベクターは、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に少なくとも５つのアミノ酸残基の置換を含む変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは、配列番号１のアミノ酸配列中に少なくとも５つのアミノ酸残基の置換を含む変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含む。態様では、少なくとも５つのアミノ酸の置換は、配列番号１のアミノ酸配列に示される１２６位のチロシン残基、１２９位のメチオニン残基、１６８位のバリン残基、２２７位のヒスチジン残基、及び２２８位のチロシン残基で生じる。態様では、少なくとも５つのアミノ酸の置換は、配列番号１のアミノ酸配列中の（ｉ）Ｙ１２６Ｇ、（ｉｉ）Ｍ１２９Ａ、（ｉｉｉ）Ｖ１６８Ｆ、（ｉｖ）Ｈ２２７Ｔ、Ｈ２２７Ｓ、又はＨ２２７Ｉ、及び（ｖ）Ｙ２２８Ｐである。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列中に少なくとも６つのアミノ酸残基の置換を含む。態様では、少なくとも５つのアミノ酸の置換は、配列番号１のアミノ酸配列に示される１２６位のチロシン残基、１２９位のメチオニン残基、１６８位のバリン残基、２２７位のヒスチジン残基、２２８位のチロシン残基、及び２２９位のリジン残基で生じる。態様では、少なくとも６つのアミノ酸残基の置換は、配列番号１のアミノ酸配列中の（ｉ）Ｙ１２６Ｇ、（ｉｉ）Ｍ１２９Ａ、（ｉｉｉ）Ｖ１６８Ｆ、（ｉｖ）Ｈ２２７Ｔ、Ｈ２２７Ｓ、又はＨ２２７Ｉ、（ｖ）Ｙ２２８Ｐ、及び（ｖｉ）Ｌ２２９Ｖ又はＬ２２９Ｉである。態様では、ベクターは配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号８６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号８７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする核酸配列を更に含む。

【0270】

実施形態では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする核酸配列は以下である：ＧＧＧＧＧＡＣＧＧＴＣＣＧＧＣＧＡＣＣＡＧＣＧＧＧＴＣＴＣＴＡＡＡＡＣＣＴＡＧＣＣＡＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＡＣＧＣＣＣＣＧＧＴＣＴＣＴＣＧＣＣＡ（配列番号３）。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする核酸配列は、配列番号３に記載の配列を含む。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする核酸配列は、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を有する。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする核酸配列は、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする核酸配列は、配列番号３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を有する。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする核酸配列は、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする核酸配列は、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする核酸配列は、配列番号３に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を有する。

【0271】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、それは、追加のＤＮＡセグメントをライゲーションできる線形又は円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）において自律複製することができる。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。実施形態において、本開示は、本明細書に記載のピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素（例えば、その実施形態及び態様を含む配列番号１、配列番号２、配列番号８６、又は配列番号８７）をコードする核酸配列を含む細胞のゲノムを提供する。実施形態において、本開示は、本明細書に記載のピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素（例えば、その実施形態及び態様を含む配列番号１、配列番号２、配列番号８６、又は配列番号８７）をコードする核酸配列、及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする核酸配列（例えば、その実施形態及び態様を含む配列番号３）を含む細胞のゲノムを提供する。更に、特定のベクターは、それらが動作可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、多くの場合プラスミドの形態である。プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であることから、「プラスミド」と「ベクター」は交換可能に使用することができる。しかしながら、本開示は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などのそのような他の形態の発現ベクターを含むことを意図している。更に、いくつかのウイルスベクターは、特定の細胞型を特異的又は非特異的に標的化することができる。使用できる例示的なベクターとしては、ｐＥｖｏｌベクター、ｐＭＰベクター、ｐＥＴベクター、ｐＴａｋベクター、ｐＢａｄベクターが挙げられるが、これらに限定されない。

【0272】

複合体
１つの態様では、その実施形態を含む本明細書に記載の変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素と、式（Ａ）のフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン（ＦＳＫ）とを含む複合体を提供する：

【0273】

【化33】

【0274】

態様では、複合体は、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内の少なくとも５つのアミノ酸残基の置換を含む変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素を含む。態様では、複合体は、配列番号１のアミノ酸配列中に少なくとも５つのアミノ酸残基の置換を含む変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含む。態様では、少なくとも５つのアミノ酸の置換は、配列番号１のアミノ酸配列に示される１２６位のチロシン残基、１２９位のメチオニン残基、１６８位のバリン残基、２２７位のヒスチジン残基、及び２２８位のチロシン残基で生じる。態様では、少なくとも５つのアミノ酸の置換は、配列番号１のアミノ酸配列中の（ｉ）Ｙ１２６Ｇ、（ｉｉ）Ｍ１２９Ａ、（ｉｉｉ）Ｖ１６８Ｆ、（ｉｖ）Ｈ２２７Ｔ、Ｈ２２７Ｓ、又はＨ２２７Ｉ、及び（ｖ）Ｙ２２８Ｐである。態様では、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列中に少なくとも６つのアミノ酸残基の置換を含む。態様では、少なくとも６つのアミノ酸の置換は、配列番号１のアミノ酸配列に示される１２６位のチロシン残基、１２９位のメチオニン残基、１６８位のバリン残基、２２７位のヒスチジン残基、２２８位のチロシン残基、及び２２９位のリジン残基で生じる。態様では、少なくとも６個のアミノ酸残基の置換は、配列番号１のアミノ酸配列中の（ｉ）Ｙ１２６Ｇ、（ｉｉ）Ｍ１２９Ａ、（ｉｉｉ）Ｖ１６８Ｆ、（ｉｖ）Ｈ２２７Ｔ、Ｈ２２７Ｓ、又はＨ２２７Ｉ、（ｖ）Ｙ２２８Ｐ、及び（ｖｉ）Ｌ２２９Ｖ又はＬ２２９Ｉである。態様では、複合体は配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。態様では、複合体は配列番号８６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。態様では、複合体は配列番号８７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。

【0275】

実施形態では、複合体は、その実施形態を含む本明細書に記載の変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素、フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン、及びその実施形態を含む本明細書に記載のｔＲＮＡ^Ｐｙｌを含む。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、配列番号３によってコードされるアミノ酸配列を含む。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、配列番号３によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、配列番号３によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、配列番号３によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、配列番号３によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。

【0276】

組成物
本開示は、その実施形態及び態様を含む本明細書において提供される組成物を提供する。実施形態において、組成物は、式（Ａ）を有するフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン（ＦＳＫ）を含む：

【0277】

【化34】

実施形態では、組成物は、インビトロ翻訳系の構成要素、本明細書に記載の変異体ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載のｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載のベクター（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載の複合体（その実施形態及び態様を含む）、又はそれらの２つ以上の組み合わせを更に含む。

【0278】

実施形態では、組成物は、その実施形態及び態様を含む本明細書に記載の変異体ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素を含む。実施形態では、組成物は、ＦＳＫ、本明細書に記載のｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載の複合体（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載のベクター（その実施形態及び態様を含む）、又はそれらの２つ以上の組み合わせを含む。

【0279】

実施形態では、組成物は、その実施形態及び態様を含む本明細書に記載のｔＲＮＡ^Ｐｙｌを含む。実施形態では、細胞は、ＦＳＫ、本明細書に記載の変異体ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載の複合体（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載のベクター（その実施形態及び態様を含む）、又はそれらの２つ以上の組み合わせを更に含む。

【0280】

実施形態では、組成物は、式（Ａ）を有するＦＳＫと、ｔＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されるような）、補因子（例えば、開始因子、伸長因子、終結因子）、エネルギー再生系（例えば、真核生物系のクレアチンリン酸及び／又はクレアチンホスホキナーゼ、並びに細菌系のホスホエノールピルビン酸及び／又はピルビン酸キナーゼ）、ペプチド、塩（例えば、マグネシウム塩、カリウム塩）、タンパク質、及びリボソーム（例えば、７０Ｓリボソーム、８０Ｓリボソーム）からなる群から選択される１つ以上の化合物とを含む。実施形態では、組成物は、式（Ａ）を有するＦＳＫと、ｔＲＮＡ、補因子、エネルギー再生系、塩、タンパク質、リボソーム、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される化合物とを含む。実施形態では、組成物は、式（Ａ）を有するＦＳＫと、補因子、エネルギー再生系、塩、リボソーム、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される化合物とを含む。実施形態では、組成物は、式（Ａ）を有するＦＳＫと、ｔＲＮＡ、開始因子、伸長因子、終結因子、クレアチンリン酸、クレアチンホスホキナーゼ、マグネシウム塩、カリウム塩、８０Ｓリボソーム、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される化合物とを含む。実施形態では、組成物は、式（Ａ）を有するＦＳＫと、ｔＲＮＡ、開始因子、伸長因子、終結因子、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、マグネシウム塩、カリウム塩、７０Ｓリボソーム、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される化合物とを含む。

【0281】

インビトロ翻訳系
実施形態において、本開示は、その実施形態及び態様を含む、本明細書に記載の生体分子、例えば、式（Ｂ）、式（Ｃ）、式（Ｄ）、式（Ｅ）、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）の生体分子を含むインビトロ翻訳系を提供する。実施形態では、インビトロ翻訳系は、コムギ胚芽抽出物のインビトロ翻訳系又はウサギ網状赤血球溶解物のインビトロ翻訳系である。実施形態において、インビトロ翻訳系は、コムギ胚芽抽出物のインビトロ翻訳系である。実施形態において、インビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物のインビトロ翻訳系である。

【0282】

細胞組成物
本開示は、その実施形態及び態様を含む本明細書で提供される組成物及び複合体を含む細胞を提供する。実施形態では、細胞は、式（Ａ）を有するフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン（ＦＳＫ）を含む：

【0283】

【化35】

実施形態では、細胞は、本明細書に記載の変異体ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載のｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載のベクター（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載の複合体（その実施形態及び態様を含む）、又はこれらの２つ以上の組み合わせを更に含む。

【0284】

実施形態では、細胞は、その実施形態及び態様を含む本明細書に記載の変異体ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素を含む。実施形態では、細胞は、ＦＳＫ、本明細書に記載のｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載の複合体（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載のベクター（その実施形態及び態様を含む）、又はそれらの２つ以上の組み合わせを更に含む。

【0285】

実施形態では、細胞は、その実施形態及び態様を含む本明細書に記載されるｔＲＮＡ^Ｐｙｌを含む。実施形態では、細胞は、ＦＳＫ、本明細書に記載の変異体ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載の複合体（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載のベクター（その実施形態及び態様を含む）、又はそれらの２つ以上の組み合わせを更に含む。

【0286】

態様では、細胞は、その実施形態及びその態様を含む本明細書に記載のベクターを含む。態様では、細胞は、ＦＳＫ、本明細書に記載される変異体ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載のｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載の複合体（その実施形態及び態様を含む）、又はそれらの２つ以上の組み合わせを更に含む。

【0287】

実施形態では、その実施形態及びその態様を含む、本明細書に記載の複合体を含む細胞が提供される。態様では、細胞は、ＦＳＫ、本明細書に記載の変異体ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載のｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（その実施形態及び態様を含む）、本明細書に記載のベクター（その実施形態及び態様を含む）又はそれらの２つ以上の組み合わせを更に含む。

【0288】

実施形態では、ＦＳＫは細胞内で生合成され、それによってＦＳＫを含有する細胞を生成する。態様では、ＦＳＫは、細胞外の培地に含有され、細胞に浸透して、それによってＦＳＫを含有する細胞を生成する。態様では、細胞はＦＳＫ生体分子を含む。態様では、細胞はＦＳＫタンパク質を含む。複数の態様では、細胞は、細胞内で合成されたＦＳＫ生体分子を含む。複数の態様では、細胞は、細胞内で合成されたＦＳＫタンパク質を含む。態様では、細胞は、細胞外で合成され、細胞内に浸透するＦＳＫ生体分子を含む。態様では、細胞は、細胞外で合成され、細胞内に浸透するＦＳＫタンパク質を含む。

【0289】

実施形態では、細胞は、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを含む。態様では、細胞は、バイオコンジュゲートリンカーを介して第２の生体分子部分にコンジュゲート化された第１の生体分子部分を含むバイオコンジュゲートを含み、ここで、バイオコンジュゲートリンカーは、次式を有する：

【0290】

【化36】

態様では、細胞は、式Ｒ^１－Ｌ^１－Ａ－Ｘ^１－Ｌ^２－Ｒ^２のバイオコンジュゲートを含み、ここで、式中の置換基は、本明細書で定義される通りである。態様では、第１及び第２の生体分子部分はそれぞれ独立して、ペプチジル部分、核酸部分、又は炭水化物部分である。態様では、第１及び第２の生体分子部分はそれぞれ、同じタンパク質内のペプチジル部分である。態様では、第１及び第２の生体分子部分はそれぞれ、異なるタンパク質内（例えば、シングルドメイン抗体内及び膜受容体内）のペプチジル部分である。

【0291】

実施形態では、細胞は、式（ＩＶ）の部分、式（Ｖ）の部分、又は式（ＶＩ）の部分を含むタンパク質を含む：

【0292】

【化37】

を有する、請求項３に記載の化合物。態様では、式（Ａ）、（Ｂ）、又は（Ｃ）の部分は、タンパク質内で分子内共有結合を形成する。態様では、式（Ａ）、（Ｂ）、又は（Ｃ）の部分は、２つのタンパク質の間に分子間共有結合を形成する。

【0293】

実施形態では、細胞は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、又は式（ＩＩＩ）のタンパク質を含み、

【0294】

【化38】

を有する化合物であって、

【0295】

【化39】

ここで、式中のＲ^１及びＲ^２はそれぞれ独立してペプチジル部分である。態様では、Ｒ^１とＲ^２は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）のタンパク質が分子内結合を含むように、一緒に結合される。態様では、Ｒ^１及びＲ^２は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）のタンパク質が２つのタンパク質の間の分子間結合を含むように、２つの異なるタンパク質中のペプチジル部分である。実施形態では、Ｒ^１はシングルドメイン抗体中のペプチジル部分であり、Ｒ^２は膜受容体中のペプチジル部分である。実施形態では、Ｒ^１は膜受容体中のペプチジル部分であり、Ｒ^２はシングルドメイン抗体中のペプチジル部分である。

【0296】

細胞は、任意の原核細胞又は真核細胞であることができる。態様では、細胞は原核細胞である。態様では、細胞は真核細胞である。態様では、細胞は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、又は動物細胞である。態様では、動物細胞は昆虫細胞又は哺乳動物細胞である。態様では、細胞は細菌細胞である。態様では、細胞は真菌細胞である。態様では、細胞は植物細胞である。態様では、細胞は古細菌細胞である。態様では、細胞は動物細胞である。態様では、細胞は昆虫細胞である。態様では、細胞は哺乳動物細胞である。態様では、細胞はヒト細胞である。例えば、本明細書に記載の組成物のいずれも、例えば大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母又は哺乳動物細胞（例えば、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣＯＳ細胞）において発現させることができる。態様では、細胞は、未成熟の哺乳動物細胞、すなわち、多能性幹細胞である。態様では、細胞は、他のヒト組織に由来する。他の適切な細胞が当業者には知られている。

【0297】

生体分子又はバイオコンジュゲートを形成する方法
本明細書で提供する組成物は、生体分子又はバイオコンジュゲートを形成するために有用である。したがって、１つの態様において、生体分子、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ、及び式（Ａ）を有するフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン（ＦＳＫ）、

【0298】

【化40】

を接触させてＦＳＫ生体分子を形成し、それによって、ＦＳＫ生体分子、すなわち、ＦＳＫの非天然アミノ酸を含む生体分子を生成する方法を提供する。本方法によって生成される生体分子は、式（Ｆ）の非天然アミノ酸側鎖を含む：

【0299】

【化41】

生体分子を生成する方法に使用される変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、本明細書に記載のいずれかである。生体分子を生成する方法に使用されるｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、本明細書に記載のいずれかである。態様では、生体分子はタンパク質である。態様では、生体分子は核酸である。態様では、生体分子は、炭水化物である。態様では、反応はインビトロで行われる。態様では、反応はインビボで行なわれる。態様では、反応は、１つ以上の生細胞内で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生きている細菌細胞内で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生きている哺乳動物細胞内で行われる。態様では、反応は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、及び動物細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞内で行われる。態様では、反応は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞内で行われる。

【0300】

実施形態において、本開示は、タンパク質、変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ、及び式（Ａ）を有するフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン（ＦＳＫ）、

【0301】

【化42】

を接触させてＦＳＫタンパク質を生成し、それによりＦＳＫタンパク質、すなわち、ＦＳＫの非天然アミノ酸を含むタンパク質を生成する方法を提供する。本方法によって生成されるタンパク質は、式（Ｆ）の非天然アミノ酸側鎖を含む：

【0302】

【化43】

タンパク質を生成する方法に使用される変異型ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素は、本明細書に記載のいずれかである。タンパク質を生成する方法に使用されるｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、本明細書に記載のいずれかである。態様では、ＦＳＫタンパク質は、リジン、ヒスチジン、チロシン、又はそれらの２つ以上を更に含む。態様では、ＦＳＫタンパク質は、リジン、ヒスチジン、チロシン、又はそれらのうちの２つ以上に近接するＦＳＫを含む。態様では、ＦＳＫタンパク質は、リジンに近接するＦＳＫを含む。態様では、ＦＳＫタンパク質は、ヒスチジンに近接するＦＳＫを含む。態様では、ＦＳＫタンパク質は、チロシンに近接するＦＳＫを含む。用語「近接する」は、本明細書で説明される。態様では、反応はインビトロで行われる。態様では、反応はインビボで行なわれる。態様では、反応は、１つ以上の生細胞内で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生きている細菌細胞内で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生きている哺乳動物細胞内で行われる。態様では、反応は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、及び動物細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞内で行われる。態様では、反応は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞内で行われる。

【0303】

実施形態において、本開示は、ＦＳＫを含む第１の生体分子部分を第２の生体分子部分と接触させてバイオコンジュゲートを形成する方法を提供し、ここで、第２の生体分子部分は第１の生体分子部分中のＦＳＫと反応性であり、それによってバイオコンジュゲートが形成される。態様では、ＦＳＫを含む第１の生体分子部分は、式（Ｂ）の化合物であり、

【0304】

【化44】

ここで、式中のＸとＹは本明細書で定義される通りである。態様では、ＦＳＫを含む第１の生体分子部分は、式（Ｃ）の化合物であり、

【0305】

【化45】

ここで、式中のＲ^１は本明細書に定義される通りである。態様では、ＦＳＫを含む第１の生体分子部分は、式（Ｆ）のアミノ酸側鎖を有する生体分子である：

【0306】

【化46】

態様では、第２の生体分子部分は、第１の生体分子中のＦＳＫと反応性であるリジン、ヒスチジン、又はチロシンを含む。態様では、バイオコンジュゲートを形成する反応は、近接により可能になるクリックケミストリー（例えば、第１の生体分子部分上のＦＳＫと第２の生体分子部分上のリジン、ヒスチジン、又はチロシンとの間）によって生じる。態様では、バイオコンジュゲートを形成する反応は、硫黄－フッ素交換反応（例えば、第１の生体分子部分上のＦＳＫと、第２の生体分子部分上のリジン、ヒスチジン、又はチロシンとの間）によって生じる。態様では、バイオコンジュゲートを形成する反応は、近接により可能になる硫黄－フッ素交換反応（例えば、第１の生体分子部分上のＦＳＫと、第２の生体分子部分上のリジン、ヒスチジン、又はチロシンとの間）によって生じる。態様では、反応はインビトロで行われる。態様では、反応はインビボで行なわれる。態様では、反応は、１つ以上の生細胞内で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生きている細菌細胞内で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生きている哺乳動物細胞内で行われる。態様では、反応は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、及び動物細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞内で行われる。態様では、反応は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞内で行われる。

【0307】

実施形態において、本開示は、１つ以上の分子内共有結合を含むタンパク質（例えば、タンパク質コンジュゲート）を提供する。態様では、ＦＳＫと近接するリジン、ヒスチジン、又はチロシンとが反応して分子内共有結合を形成し、それにより式（ＩＶ）の部分、式（Ｖ）の部分、若しくは式（ＶＩ）の部分、又はこれらの２つ以上の組み合わせが得られる：

【0308】

【化47】

ＦＳＫ及びそれに近接するリジン、ヒスチジン、又はチロシンは、タンパク質のαヘリックス及び／又はタンパク質のβシート上に存在してもよい。態様では、ＦＳＫとリジン、ヒスチジン、又はチロシンとの間に分子内共有結合を形成する反応は、クリックケミストリーによって実現される。態様では、ＦＳＫとリジン、ヒスチジン、又はチロシンとの間に分子内共有結合を形成する反応は、近接により可能になるクリックケミストリーによって実現される。態様では、ＦＳＫとリジン、ヒスチジン、又はチロシンとの間に分子内共有結合を形成する反応は、硫黄－フッ素交換反応によって実現される。態様では、ＦＳＫとリジン、ヒスチジン、又はチロシンとの間に分子内共有結合を形成する反応は、近接により可能になる硫黄－フッ素交換反応によって実現される。態様では、反応はインビトロで行われる。態様では、反応はインビボで行なわれる。態様では、反応は、１つ以上の生細胞内で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生きている細菌細胞内で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生きている哺乳動物細胞内で行われる。態様では、反応は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、及び動物細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞内で行われる。態様では、反応は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞内で行われる。

【0309】

実施形態において、本開示は、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のタンパク質コンジュゲートを提供し、ここで、Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立してペプチジル部分である：

【0310】

【化48】

態様では、Ｒ^１とＲ^２は一緒に結合して、分子内でコンジュゲート化されたタンパク質を形成する。態様では、Ｒ^１とＲ^２は一緒には結合していない。態様では、タンパク質コンジュゲートを形成する反応は、クリックケミストリーによって実現される。態様では、タンパク質コンジュゲートを形成する反応は、近接により可能になるクリックケミストリーによって実現される。態様では、タンパク質コンジュゲートを形成する反応は、硫黄－フッ素交換反応によって実現される。態様では、タンパク質コンジュゲートを形成する反応は、近接により可能になる硫黄－フッ素交換反応によって実現される。態様では、反応はインビトロで行われる。態様では、反応はインビボで行なわれる。態様では、反応は、１つ以上の生細胞内で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生きている細菌細胞内で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生きている哺乳動物細胞内で行われる。態様では、反応は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、及び動物細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞内で行われる。態様では、反応は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞内で行われる。

【0311】

実施形態では、２つ以上のタンパク質を、本明細書に記載の方法及び組成物によって共有結合させることができる。態様では、ＦＳＫは第１のタンパク質中の非天然アミノ酸であり、リジン、ヒスチジン、又はチロシンは第２のタンパク質中のアミノ酸であり、第１のタンパク質と第２のタンパク質は異なる。第１のタンパク質中のＦＳＫは、第２のタンパク質中のリジン、ヒスチジン又はチロシンと反応して、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間に分子間共有結合を形成する。２つのタンパク質を連結する分子間共有結合は、式（ＩＶ）の部分、式（Ｖ）の部分、式（ＶＩ）の部分、又はそれらの２つ以上の組み合わせによって表される：

【0312】

【化49】

ＦＳＫ及びリジン、ヒスチジン、又はチロシンは、それらのそれぞれのタンパク質のαヘリックス及び／又はそれらのそれぞれのタンパク質のβシート上に存在してもよい。態様では、第１のタンパク質中のＦＳＫと第２のタンパク質中のリジン、ヒスチジン、又はチロシンとの間に分子間共有結合を形成する反応は、クリックケミストリーによって実現される。態様では、第１のタンパク質中のＦＳＫと第２のタンパク質中のリジン、ヒスチジン、又はチロシンとの間に分子間共有結合を形成するための反応は、近接により可能になるクリックケミストリーによって実現される。態様では、第１のタンパク質中のＦＳＫと第２のタンパク質中のリジン、ヒスチジン、又はチロシンとの間に分子間共有結合を形成する反応は、硫黄－フッ素交換によって実現される。態様では、第１のタンパク質中のＦＳＫと第２のタンパク質中のリジン、ヒスチジン、又はチロシンとの間に分子間共有結合を形成する反応は、近接により可能になる硫黄－フッ素交換によって実現される。態様では、反応はインビトロで行われる。態様では、反応はインビボで行なわれる。態様では、反応は、１つ以上の生細胞内で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生きている細菌細胞内で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生きている哺乳動物細胞内で行われる。態様では、反応は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、及び動物細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞内で行われる。態様では、反応は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞内で行われる。

【0313】

実施形態において、本開示は、バイオコンジュゲートリンカーを介して第２の生体分子部分にコンジュゲート化された第１の生体分子部分を含むバイオコンジュゲートを提供し、ここで、バイオコンジュゲートリンカーは式（Ｄ）を有する：

【0314】

【化50】

態様では、バイオコンジュゲートは式（Ｅ）：

【0315】

【化51】

を有するか、又はバイオコンジュゲートは式Ｒ^１－Ｌ^１－Ａ－Ｘ^１－Ｌ^２－Ｒ^２を有し、ここで、式中の置換基は本明細書で定義される通りである。態様では、バイオコンジュゲートを形成する反応は、クリックケミストリーによって実現される。態様では、バイオコンジュゲートを形成する反応は、近接により可能になるクリックケミストリーによって実現される。態様では、バイオコンジュゲートを形成する反応は、硫黄－フッ素交換反応によって実現される。態様では、バイオコンジュゲートを形成する反応は、近接により可能になる硫黄－フッ素交換反応によって実現される。態様では、反応はインビトロで行われる。態様では、反応はインビボで行なわれる。態様では、反応は、１つ以上の生細胞内で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生きている細菌細胞内で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生きている哺乳動物細胞内で行われる。態様では、反応は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、及び動物細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞内で行われる。態様では、反応は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞内で行われる。

【0316】

標的に結合する方法
本明細書では、式（Ｃ）の構造を有する生体分子を提供し、

【0317】

【化52】

式中、Ｒ^１は、小分子部分、アミノ酸部分、又はペプチジル部分である。実施形態では、Ｒ^１は小分子部分である。実施形態では、Ｒ^１はアミノ酸部分又はペプチジル部分である。実施形態では、Ｒ^１はアミノ酸部分である。実施形態では、Ｒ^１はペプチジル部分である。実施形態では、Ｒ^１は抗体、抗原結合断片、単鎖可変領域断片、シングルドメイン抗体、又はアフィボディである。実施形態では、Ｒ^１は抗体である。実施形態では、Ｒ^１は抗原結合断片である。実施形態では、Ｒ^１は単鎖可変領域断片である。実施形態では、Ｒ^１はシングルドメイン抗体である。実施形態では、Ｒ^１はアフィボディである。実施形態では、Ｒ^１は標的に結合することができる。実施形態では、Ｒ^１は細胞の表面上の標的に結合することができる。実施形態では、細胞の表面上の標的は受容体である。実施形態において、受容体は、膜受容体又はホルモン受容体である。

【0318】

実施形態において、標的は、アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アンジオテンシン受容体、アペリン受容体、胆汁酸受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カンナビノイド受容体、ケメリン受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、クラスＡオーファン受容体、ドーパミン受容体、エンドセリン受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ホルミルペプチド受容体、遊離脂肪酸受容体、ガラニン受容体、グレリン受容体、糖タンパク質ホルモン受容体、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体、Ｇタンパク質共役エストロゲン受容体、ヒスタミン受容体、ヒドロキシカルボン酸受容体、キスペプチン受容体、ロイコトリエン受容体、リゾリン脂質受容体、リゾリン脂質Ｓ１Ｐ受容体、メラニン凝集ホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、モチリン受容体、ニューロメジンＵ受容体、ニューロペプチドＦＦ／ニューロペプチドＡＦ受容体、ニューロペプチドＳ受容体、ニューロペプチドＷ／ニューロペプチドＢ受容体、ニューロペプチドＹ受容体、ニューロテンシン受容体、オピオイド受容体、オプシン受容体、オレキシン受容体、オキソグルタル酸受容体、Ｐ２Ｙ受容体、血小板活性化因子受容体、プロキネチシン受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体、プロスタノイド受容体、プロテアーゼ活性化受容体、ＱＲＦＰ受容体、リラキシンファミリーペプチド受容体、ソマトスタチン受容体、コハク酸受容体、タキキニン受容体、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体、微量アミン受容体、ウロテンシン受容体、及びバソプレシン受容体の群から選択される受容体である。実施形態では、標的はＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１である。実施形態では、標的はＰＤ－１である。実施形態では、標的はＰＤ－Ｌ１である。実施形態では、標的はタンパク質、核酸、又は炭水化物である。実施形態では、標的はタンパク質である。実施形態では、標的は核酸である。実施形態では、標的は炭水化物である。

【0319】

本明細書では、細胞を式（Ｂ）の生体分子又は式（Ｃ）の生体分子と接触させることを含む細胞上の標的を結合する方法を提供し、ここで、生体分子は細胞の表面上の標的に特異的に結合することができ、それによって生体分子は標的と共有結合を形成する。実施形態では、本方法は、細胞を式（Ｂ）の生体分子と接触させることを含み、ここで、生体分子は細胞の表面上の標的に特異的に結合することができ、それによって生体分子は標的と共有結合を形成する。実施形態では、本方法は、細胞を式（Ｃ）の生体分子と接触させることを含み、ここで、生体分子は細胞の表面上の標的に特異的に結合することができ、それによって生体分子は標的と共有結合を形成する。実施形態では、硫黄－フッ素交換反応によって共有結合が形成される。実施形態では、近接によって可能になる硫黄－フッ素交換反応によって共有結合が形成される。実施形態では、生体分子と標的は、式（Ｄ）の構造を有するバイオコンジュゲートリンカーによって共有結合される：

【0320】

【化53】

【0321】

「標的」とは、Ｒ^１と共有結合又は非共有結合することができる任意の化合物を指す（例えば、タンパク質）。実施形態では、「標的」として、小分子、ペプチド、タンパク質、酵素、抗体、抗原、脂質、代謝産物、ホルモン、炭水化物、核酸、細胞、受容体、ウイルス、又はＲ^１と共有結合若しくは非共有結合することができる任意の他の部分が挙げられるが、これらに限定されない。実施形態では、Ｒ^１及びそのアミノ酸側鎖（すなわち、式（Ｆ））の両方が標的に結合することができる。本発明のいかなる理論にも拘束されることを意図するものではないが、例示のみを目的として、近接により誘導されるカップリングにおいて、Ｒ^１は、最初に非共有結合を介して標的に係合し、その後、ＦＳＫアミノ酸側鎖を介して共有結合し得る。

【0322】

実施形態１～５７
実施形態１．バイオコンジュゲートリンカーを介して第２の生体分子部分にコンジュゲート化された第１の生体分子部分を含む生体分子コンジュゲートであって、バイオコンジュゲートリンカーが、次式：

【0323】

【化54】

を有する、生体分子コンジュゲート。
実施形態２．生体分子コンジュゲートが、式：Ｒ^１－Ｌ^１－Ａ－Ｘ^１－Ｌ^２－Ｒ^２を有し、式中、Ａが、バイオコンジュゲートリンカーであり、Ｒ^１が、前記第１の生体分子部分であり、Ｒ^２が、前記第２の生体分子部分であり、Ｌ^１が、結合又は第１の共有結合リンカーであり、Ｌ^２が、結合又は第２の共有結合リンカーであり、Ｘ^１が、－ＮＲ^５－、－Ｏ－、－Ｓ－、又は

【0324】

【化55】

であり、式中、環Ａが、置換若しくは非置換ヘテロアリーレン又は置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレンであり、Ａ中の窒素がバイオコンジュゲートリンカーに結合しており、Ｒ^５が、水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールであり、ここで、Ｒ^１及びＲ^２が任意で一緒に結合されて、分子内でコンジュゲート化された生体分子コンジュゲートを形成する、実施形態１の生体分子コンジュゲート。
実施形態３．Ｌ^１が、結合、－Ｓ（Ｏ）_２－、－ＮＲ^３Ａ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^３Ａ－、－ＮＲ^３ＡＣ（Ｏ）－、－ＮＲ^３ＡＣ（Ｏ）－、－ＮＲ^３ＡＣ（Ｏ）ＮＲ^３Ｂ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、又は置換若しくは非置換ヘテロアリーレンであり、Ｌ^２が、結合、－Ｓ（Ｏ）_２－、－ＮＲ^４Ａ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^４Ａ－、－ＮＲ^４ＡＣ（Ｏ）－、－ＮＲ^４ＡＣ（Ｏ）ＮＲ^４Ｂ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換シクロアルキレン、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換若しくは非置換アリーレン、又は置換若しくは非置換ヘテロアリーレンであり、Ｒ^３Ａ、Ｒ^３Ｂ、Ｒ^４Ａ、及びＲ^４Ｂが独立して、水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールである、実施形態２の生体分子コンジュゲート。
実施形態４．Ｘ^１が、－ＮＨ－、－Ｏ－、又はイミダゾリレンである、実施形態２又は３の生体分子コンジュゲート。
実施形態５．前記第１の生体分子部分が、ペプチジル部分、核酸部分、又は炭水化物部分である、実施形態１～４のいずれか１つの生体分子コンジュゲート。
実施形態６．前記第１の生体分子部分がペプチジル部分であり、前記ペプチジル部分が、リジン、ヒスチジン、又はチロシンを介して前記バイオコンジュゲートリンカーに共有結合している、実施形態５の生体分子コンジュゲート。
実施形態７．前記第２の生体分子部分が、ペプチジル部分、核酸部分、又は炭水化物部分である、実施形態１～４のいずれか１つの生体分子コンジュゲート。
実施形態８．前記第２の生体分子部分がペプチジル部分であり、前記ペプチジル部分が、リジン、ヒスチジン、又はチロシンを介して前記バイオコンジュゲートリンカーに共有結合している、実施形態７の生体分子コンジュゲート。
実施形態９．－Ｌ^１－Ｒ^１が、ペプチジル部分、核酸部分、又は炭水化物部分である、実施形態２～４のいずれか１つの生体分子コンジュゲート。
実施形態１０．－Ｌ^２－Ｒ^２が、ペプチジル部分、核酸部分、又は炭水化物部分である、実施形態２～４のいずれか１つの生体分子コンジュゲート。
実施形態１１．前記ペプチジル部分がシングルドメイン抗体又は膜受容体を含む、実施形態５～１０のいずれか１つの生体分子。
実施形態１２．Ｒ^１中のペプチジル部分がシングルドメイン抗体を含み、Ｒ^２中のペプチジル部分が膜受容体を含むか、又はＲ^１中のペプチジル部分が膜受容体を含み、Ｒ^２中のペプチジル部分がシングルドメイン抗体を含む、実施形態１～４のいずれか１つの生体分子。
実施形態１３．前記バイオコンジュゲートリンカーが分子間リンカーである、実施形態１～１１のいずれか１つの生体分子コンジュゲート。
実施形態１４．前記バイオコンジュゲートリンカーが分子内リンカーである、実施形態１～１１のいずれか１つの生体分子コンジュゲート。
実施形態１５．式（Ｉ）、式（ＩＩ）、又は式（ＩＩＩ）のタンパク質であって、

【0325】

【化56】

式中、Ｒ^１及びＲ^２がそれぞれ独立してペプチジル部分であり、Ｒ^１及びＲ^２が任意で一緒に結合して分子内コンジュゲートタンパク質を形成するタンパク質。
実施形態１６．前記タンパク質が式（Ｉ）である、実施形態１５のタンパク質。
実施形態１７．前記タンパク質が式（ＩＩ）である、実施形態１５のタンパク質。
実施形態１８．前記タンパク質が式（ＩＩＩ）である、実施形態１５のタンパク質。
実施形態１９．Ｒ^１及びＲ^２がそれぞれ独立してタンパク質αヘリックス又はタンパク質βシートを含む、実施形態１５～１８のいずれか１つのタンパク質。
実施形態２０．Ｒ^１及びＲ^２が一緒に結合していない、実施形態１５～１９のいずれか１つのタンパク質。
実施形態２１．Ｒ^１のペプチジル部分がシングルドメイン抗体を含み、Ｒ^２のペプチジル部分が膜受容体を含む、実施形態１５～２０のいずれか１つのタンパク質。
実施形態２２．Ｒ^１のペプチジル部分が膜受容体を含み、Ｒ^２のペプチジル部分がシングルドメイン抗体を含む、実施形態１５～２０のいずれか１つのタンパク質。
実施形態２３．Ｒ^１及びＲ^２が一緒に結合して分子内コンジュゲートタンパク質を形成する、実施形態１５～１９のいずれか１つのタンパク質。
実施形態２４．配列番号１のアミノ酸配列を有するピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に少なくとも６つのアミノ酸残基の置換を含むピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素であって、前記基質結合部位が、配列番号１のアミノ酸配列に記載される、１２６位のチロシン残基、１２９位のメチオニン残基、１６８位のバリン残基、２２７位のヒスチジン残基、２２８位のチロシン残基、及び２２９位のリジン残基を含む、ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素。
実施形態２５．前記配列番号１のアミノ酸配列における少なくとも６つのアミノ酸残基の置換が、（ｉ）Ｙ１２６Ｇ、（ｉｉ）Ｍ１２９Ａ、（ｉｉｉ）Ｖ１６８Ｆ、（ｉｖ）Ｈ２２７Ｔ、Ｈ２２７Ｓ、又はＨ２２７Ｉ、（ｖ）Ｙ２２８Ｐ、及び（ｖｉ）Ｌ２２９Ｉ、Ｌ２２９Ｖ、又はＬ２２９Ｉである、実施形態２４のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素。
実施形態２６．配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施形態２４のピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素。
実施形態２７．実施形態２４～２６のいずれか１つのピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含むベクター。
実施形態２８．ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする核酸を更に含む、実施形態２７のベクター。
実施形態２９．実施形態２４～２６のいずれか１つのピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素と、以下の式:を有するフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンとを含む複合体：

【0326】

【化57】

を有する、請求項１に記載の化合物。
実施形態３０．ｔＲＮＡ^Ｐｙｌを更に含む、実施形態２９の複合体。
実施形態３１．実施形態１～１４のいずれか１つの生体分子コンジュゲートを含む細胞。
実施形態３２．実施形態１５～２３のいずれか１つのタンパク質を含む細胞。
実施形態３３．実施形態２４～２６のいずれか１つのピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素を含む細胞。
実施形態３４．実施形態２７～２８のいずれか１つのベクターを含む細胞。
実施形態３５．実施形態２９～３０のいずれか１つの複合体を含む細胞。
実施形態３６．次式のフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンを含む細胞：

【0327】

【化58】

を有する、請求項１に記載の化合物。
実施形態３７．配列番号１のアミノ酸配列を有するピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に少なくとも６つのアミノ酸残基の置換を含むピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素を更に含み、ここで、前記基質結合部位が、配列番号１のアミノ酸配列に記載される、１２６位のチロシン残基、１２９位のメチオニン残基、１６８位のバリン残基、２２７位のヒスチジン残基、２２８位のチロシン残基、及び２２９位のリジン残基を含む、実施形態３６の細胞。
実施形態３８．前記配列番号１のアミノ酸配列における少なくとも６つのアミノ酸残基の置換が、（ｉ）Ｙ１２６Ｇ、（ｉｉ）Ｍ１２９Ａ、（ｉｉｉ）Ｖ１６８Ｆ、（ｉｖ）Ｈ２２７Ｔ、Ｈ２２７Ｓ、又はＨ２２７Ｉ、（ｖ）Ｙ２２８Ｐ、及び（ｖｉ）Ｌ２２９Ｖ又はＬ２２９Ｉである、実施形態３７の細胞。
実施形態３９．前記ピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施形態３７の細胞。
実施形態４０．ｔＲＮＡ^Ｐｙｌを更に含む、実施形態３６～３９のいずれか１つの細胞。
実施形態４１．前記細胞が、細菌細胞又は哺乳動物細胞である、実施形態３１～４０のいずれか１つの細胞。
実施形態４２．実施形態１３の生体分子コンジュゲートを形成する方法であって、フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン生体分子内のフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン部分を、第２の生体分子部分を含む化合物と接触させることを含み、ここで、前記第２の生体分子がフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン部分と反応性であり、それにより、分子間リンカーを有する生体分子コンジュゲートを形成する、方法。
実施形態４３．実施形態１４の生体分子コンジュゲートを形成する方法であって、フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン生体分子内のフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン部分を、フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン生体分子中の第２の生体分子部分と接触させることを含み、ここで、前記第２の生体分子はフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン部分と反応性であり、それにより、分子内リンカーを有する生体分子コンジュゲートを形成する、方法。
実施形態４４．前記接触が細胞内で行なわれる、実施形態４２又は４３の方法。
実施形態４５．接触させる前に、生体分子と、実施形態２４～２６のいずれか１つのピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素と、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌと、次式を有するフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンとを接触させる工程を更に含む、

【0328】

【化59】

フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン生体分子を形成する、実施形態４２～４４のいずれか１つの方法。
実施形態４６．実施形態２０～２２のいずれか１つのタンパク質を形成する方法であって、フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンタンパク質中のフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンを、第２のタンパク質中のリジン、ヒスチジン、又はチロシンと接触させ、それにより、分子間でコンジュゲート化されたタンパク質を形成することを含む方法。
実施形態４７．実施形態２３のタンパク質を形成する方法であって、フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リシンタンパク質を、リシン、ヒスチジン又はチロシンを含む第２のタンパク質と接触させ、それにより、分子内でコンジュゲート化されたタンパク質を形成することを含む方法。
実施形態４８．タンパク質と、実施形態２４～２６のいずれか１つのピロリジル－ｔＲＮＡ合成酵素と、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌと、次式を有するフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンとを接触させ、

【0329】

【化60】

それにより、フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジンタンパク質を生成することを更に含む、実施形態４６又は４７の方法。
実施形態４９．接触が硫黄－フッ素交換反応を含む、実施形態４８の方法。
実施形態５０．接触が近接により可能になる硫黄－フッ素交換反応を含む、実施形態４８の方法。
実施形態５１．接触が細胞内で行なわれる、実施形態４６～５０のいずれか１つの方法。
実施形態５２．非天然アミノ酸を含むタンパク質であって、非天然アミノ酸が次式の側鎖：

【0330】

【化61】

を有する、タンパク質。
実施形態５３．タンパク質がシングルドメイン抗体である、実施形態５２のタンパク質。
実施形態５４．タンパク質が膜受容体である、実施形態５２のタンパク質。
実施形態５５．非天然アミノ酸がリジン、ヒスチジン、又はチロシンに近接する、実施形態５２～５４のいずれか１つのタンパク質。
実施形態５６．式（ＩＶ）の部分、式（Ｖ）の部分、式（ＶＩ）の部分、又はそれらの２つ以上の組み合わせを含むタンパク質：

【0331】

【化62】

実施形態５７．実施形態５２～５６のいずれか１つのタンパク質を含む、細胞。

【0332】

タンパク質についての遺伝的にコードされたＳｕＦＥｘクリックケミストリーの範囲を更に拡大するために、本発明者らは、新しい潜在的な生体反応性Ｕａａフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン（ＦＳＫ）を設計し、大腸菌及び哺乳動物細胞においてそれを遺伝的にコードするための新しい合成酵素を展開した。アリールフルオロ硫酸を有するリジン誘導体として、ＦＳＫは、ＦＳＹよりも大きな反応距離を提供し、より柔軟である。本発明者らは、ＦＳＫが、分子内及び分子間の両方で、ＦＳＹでは到達不可能な長い距離で隔てられたタンパク質の部位を連結するための共有結合を生成するために有用であり、インビトロ及び細胞中の使用に適合することを実証した。ＦＳＫは、ＦＳＹを補完し、一般的な適用において、より広い範囲のタンパク質の部位へのＳｕＦＥｘケミストリーによる共有結合の導入を可能にする。

【0333】

実施例
以下の実施例は、本開示の特定の実施形態及び態様を更に説明することを意図している。実施例は、開示又は特許請求の精神又は範囲を限定することを意図するものではない。

【0334】

実施例１
タンパク質側鎖は、システインのみによって共有結合を自然に形成することができる。この天然の障壁は、近接により可能になる反応性によって、遺伝的にコードされた潜在的な生体反応性の非天然アミノ酸（Ｕａａ）と近傍の天然の残基との間に形成された新たな共有結合をタンパク質に加えることによって打破されている。（参考文献１、２）。ハロゲン、アクリルアミド、ビニルスルホン、アリールカルバメート、フルオロスルフェート、又はキノンメチドを含有する生体反応性Ｕａａのコレクションが、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、及び他の求核性残基を標的とするように遺伝子的にコードされている。（参考文献３～８）。これらの新しい共有結合は、光学的、熱的、及び様々なタンパク質の特性を増強するために、並びにタンパク質の構造及び機能を光調節するために、タンパク質中に組み込まれている。（参考文献１、３、９～１１）。共有結合はまた、タンパク質の間で形成することができ、それは、弱い一過性のタンパク質相互作用を捕捉して同定するために利用されている。（参考文献１２、１３）。

【0335】

生体反応性の官能基の中で、フルオロ硫酸は、その非常に優れた生体適合性、近接依存性の反応性、及び多標的の能力のために特に興味深い。（参考文献１４～１７）。それは、非相互作用タンパク質とランダムには反応しないが、それらが近接して位置する場合にのみＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒを含む求核性残基と効率的に反応する優れた潜在性の基である。（参考文献７）。本発明者らは、最近、フルオロ硫酸－Ｌ－チロシン（ＦＳＹ）を遺伝的にコードし、タンパク質の架橋だけでなく、インビボのがんのための共有結合タンパク質薬物を生成においてのその使用を実証した。（参考文献７、１８）。それにもかかわらず、チロシン誘導体として、ＦＳＹは比較的剛直な側鎖と制限された反応半径を有し、それは空間において更に離れて位置する標的残基を架橋することができない。タンパク質の共有結合の生成においてフルオロ硫酸の使用の能力を最大化するために、本発明で、本発明者らは、ＦＳＹよりも大きな柔軟性及び長い反応距離を提供する長い脂肪族側鎖を有するフルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン（ＦＳＫ）を設計し、遺伝的にコードした。本発明者らは、ＦＳＫが、ＦＳＹでは短すぎるタンパク質内及びタンパク質間の共有結合を可能にすることを示し、インビトロ及び細胞における様々な応用におけるＦＳＫの多くの使用を実証した。

【0336】

ＦＳＫの設計及びタンパク質への遺伝的組み込み
フルオロ硫酸に柔軟性と長い反応半径を与えるために、本発明者らは、生体適合性及びＳｕＦＥｘ反応性に重要なアリールフルオロ硫酸基をＬｙｓ骨格に結合させることによってＦＳＫを設計した（図１Ａ）。次いで、本発明者らは、以前に記載された指向性進化ストラテジーを使用して、ＦＳＫを特異的に組み込むためのオルソゴナルな合成酵素を遺伝子操作した。（参考文献１９）。数回進化させた後、細胞を緑色蛍光にする増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）にＦＳＫを効率的に組み込むことができる４つのヒットが同定された。それらの中で、ｈｉｔ１（配列番号２）は、１８℃及び３０℃の両方で最も高い抑制効率でＥＧＦＰにＦＳＫを組み込み、したがってＦＳＫＲＳ（図７～８）と命名した。ＥＧＦＰ（１８２ＴＡＧ）の発現のウェスタンブロット解析もまた、ＦＳＫＲＳがＦＳＫのみを組み込み、天然アミノ酸を組み込まないことを示した（図９）。本発明者らはまた、２位及び１５１位におけるスーパーフォルダＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）へのＦＳＫ組み込みを試験した。両方の位置で、ＦＳＫを含まない対照サンプルと比較して、ＦＳＫを増殖培地に添加した場合に強いｓｆＧＦＰの蛍光が検出され（図１０）、Ｕａａに対するＦＳＫＲＳの特異性が確認された。組み込みの忠実度を更に評価するために、本発明者らは、ＦＳＫを小タンパク質のユビキチンに６位で組み込み、精製タンパク質のインタクトな質量をＥＳＩ－ＭＳで測定した。測定された９５９０．１Ｄａの分子量は、理論値（９５８９．９Ｄａ）とよく一致し、天然アミノ酸の誤った組み込みに対応する他のピークは同定されず、ＦＳＫＲＳによるＦＳＫの組み込みの高い忠実度を示した（図１Ｂ）。

【0337】

ＦＳＫは、細胞中でＦＳＹが到達できない距離でのタンパク質間の架橋を可能にする。
本発明者らは、ＦＳＹ及びＦＳＫがタンパク質に組み込まれ、ＳｕＦＥｘ反応によって近接する標的の天然の残基と反応する場合のＦＳＹ及びＦＳＫの反応距離の選択性を検討した（図２Ａ）。エネルギー最小化の状態では、ＣαとＦ原子の間の距離は、ＦＳＹが９．０Å、ＦＳＫが１３．８Åであった（図２Ｂ）。これらの長さをガイドとして用いて、本発明者らは、ホモ二量体タンパク質である大腸菌グルタチオントランスフェラーゼ（ｅｃＧＳＴ）に対するそれらのタンパク質間架橋能を試験した。ＦＳＹ又はＦＳＫを、先ず二量体界面のｅｃＧＳＴの１０３位に組み込み、その付近で他の単量体のＨｉｓ１０６及びＬｙｓ１０７を潜在的な標的残基とした。ｅｃＧＳＴの結晶構造に基づいて、残基１０３のＣαは、Ｈｉｓ１０６のδ－Ｎ原子から８．５Åであり、Ｌｙｓ１０７のε－Ｎ原子から６．０Åである。（参考文献２０）。ＦＳＹを組み込んだ場合に強いｅｃＧＳＴ二量体の架橋が見られたが、ＦＳＫを組み込んだ場合には明らかな二量体架橋は検出されず（図１２）、このことは、ＦＳＫが二量体界面の制限された空間においてあまりに近くに位置する標的の残基に適していないことを示している。

【0338】

本発明者らは次に、ＦＳＹには遠すぎる標的の残基を架橋するＦＳＫの能力を試験した。本発明者らは、その周りに複数の求核性残基（Ｌｙｓ９３、Ｔｙｒ１００、Ｌｙｓ１３２、Ｔｙｒ１３５）が存在し、α炭素までの距離が９．２～１３．３ÅであるｅｃＧＳＴの６５位にＦＳＹ又はＦＳＫを組み込むことを選択した（図２Ｃ）。この距離は、ＦＳＫの反応には好都合であるが、ＦＳＹには遠すぎるはずである。実際に、６５位にＦＳＹ又はＦＳＫを組み込んだ後、本発明者らは、ＦＳＫが有意なｅｃＧＳＴ二量体架橋を誘導するが、ＦＳＹは誘導しないことを見出した（図２Ｄ）。本発明者らはまた、Ｔｙｒ９２及びＴｙｒ７２がそれぞれ９．５Å及び１１．３Å離れて位置するｅｃＧＳＴの８６位にＦＳＫ又はＦＳＹを組み込んだ（図１３Ａ）。同様の結果が得られ、ＦＳＫはｅｃＧＳＴを架橋して二量体にしたが、同じ位置に組み込まれたＦＳＹは明らかな架橋を誘導しなかった（図１３Ｂ）。

【0339】

ホモ二量体ｅｃＧＳＴを架橋することに加えて、本発明者らはまた、ヘテロなタンパク質の相互作用におけるＦＳＹ及びＦＳＫの架橋能を比較した。大腸菌チオレドキシン（Ｔｒｘ）は、３’－ホスホアデノシン－５’－ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）レダクターゼと相互作用する。本発明者らは、以前に、大腸菌Ｔｒｘの６０位にＦＳＹを組み込んでも、ＴｒｘをＰＡＰＳレダクターゼと効率的には架橋できないことを見出した。（参考文献７）。ＰＡＰＳとの複合体におけるＴｒｘの構造の検討から、最も近い可能な標的の残基はＰＡＰＳのＨｉｓ２４２であり、それはＴｒｘの残基６０のＣαから１２．２Å離れていることが示された。は（参考文献２１）。したがって、本発明者らは、同じ部位へのＦＳＫの組み込みが、ＦＳＫの長い可撓性アームによって架橋効率を改善するかどうかを試験した。満足なことに、ＦＳＹではわずかな架橋しか検出できなかったが、ＦＳＫではウェスタンブロットにおいてＴｒｘとＰＡＰＳレダクターゼとの間を強固に架橋することができた（図１４）。

【0340】

次に、本発明者らは、ＦＳＫがどの求核性の天然の残基と反応し得るかを調べた。本発明者らは、Ａｌａ９７のＣαからＬｙｓ４４のＮεの距離が１１．７ÅであるｓｊＧＳＴタンパク質の残基対Ａｌａ９７及びＬｙｓ４４を使用して、その残基特異性を試験した。（参考文献２２）。本発明者らは、Ｌｙｓ４４をＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒに変異させて一連の変異型を作製し、またＦＳＫを９７位に組み込んだ（図２Ｅ）。ウェスタンブロット解析から、ＦＳＫがＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ残基と架橋して、安定なｓｊＧＳＴ二量体を形成することが示された（図２Ｆ）。以前に報告されたように、ＦＳＹもまた、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、及びＬｙｓと安定な架橋を形成する。（参考文献７）。ＦＳＹ及びＦＳＫは両方とも同じアリールフルオロ硫酸基を含むように設計されていることから、ＦＳＹとＦＳＫには同じ反応性が予想される。更に、本発明者らはまた、これらの変異型の９７位にＦＳＹを組み込んだが、何ら明確な二量体ｓｊＧＳＴ架橋が観察されず（図２Ｆ）、ＦＳＫとＦＳＹとの間の距離の差が更に裏付けられた。まとめると、ＦＳＫは、ＦＳＹと同じ多標的の反応特異性を有し、ＦＳＹでは到達不可能な距離でのタンパク質の架橋を可能にした。

【0341】

ＦＳＫは、分子内でのタンパク質の共有結合を可能にする。
ペプチド又はタンパク質内への分子内架橋の遺伝的な導入は、熱安定性及び細胞透過性などの特性を操作するためにタンパク質の残基をステープル留め又は架橋する革新的な方法である。現在の方法は、主に、２つのＣｙｓ残基間のジスルフィド結合形成、又は生体反応性のＵａａ上に導入されたハロゲン若しくはマイケル受容体によるＣｙｓのチオール基の標的化に依存している。このことにより、架橋されたペプチド又はタンパク質について生成できるコンフォメーション及び立体配置の数が大きく制限される。ＦＳＫは、タンパク質中にＣｙｓよりも豊富な複数の求核性残基と反応し、好ましいより長い反応アームを有するため、本発明者らは、ＦＳＫが、タンパク質の遺伝的にコードされた分子内架橋についての架橋パターンの多様性を拡大すると推論した。概念の実証として、本発明者らは、モデルタンパク質のユビキチンに対するＦＳＫの分子内架橋能力を検討した。本発明者らは、Ｌｙｓ２９との近接のためにユビキチン（Ｕｂ）の１８位にＦＳＫを組み込んだ（図３Ａ）。（参考文献２３）。インタクトなタンパク質の質量分析は２０Ｄａの質量損失を有する主要なピーク（強度７５％）を示し、分子内架橋の形成の成功を示唆した（図３Ｂ）。Ｕｂの結晶構造から予測されるように、ＦＳＫとＬｙｓ２９との間で架橋が生じたかどうかを決定するために、本発明者らは更に、架橋されたＵｂ（１８ＦＳＫ）をトリプシン消化し、高分解能のタンデム質量分析を用いて分析した。架橋ペプチドがタンデム質量分析によって同定され（示さず）、架橋ペプチドの一連のｂ及びｙイオンによって、ＦＳＫ１８がＵｂ中のＬｙｓ２９と反応したことが明白に示された。この架橋ペプチドに加えて、本発明者らはまた、ＦＳＫ組み込みペプチドを同定し（タンデム質量の分析結果は示さず）、それは他のペプチドとはランダムに反応せず、分子内タンパク質架橋の生成におけるＦＳＫの高い特異性を示した。

【0342】

ＦＳＫ及びＦＳＹは、様々な位置でのナノボディによるＥＧＦＲ受容体の共有結合の標的化を可能にする。
細胞上の天然の受容体をインビボで抗体やナノボディなどの様々なタンパク質バインダーと共有結合で標的化する能力は、イメージング、診断、及び治療のための強力な手段を提供すると思われ、ＥＧＦＲは様々ながんにおける貴重なマーカーであることから、本発明者らは、それをナノボディと共有結合で標的化することを目指した。（参考文献２４）。ＦＳＫ及びＦＳＹは異なる反応距離を有することから、本発明者らは、ＦＳＫ又はＦＳＹをナノボディに組み込むことによってＥＧＦＲの異なる位置を標的化することができるはずである。Ｅ^２５と複合体化したナノボディ７Ｄ１２の結晶構造に基づいて、２つの位置のＣαからＨｉｓ３５９のδ－Ｎ原子の距離が、それぞれ１１．９及び１２．３Åであるので（図４Ａ）、本発明者らは、ナノボディ７Ｄ１２の３０位又は３１位へのＦＳＫの組み込みが、ＥＧＦＲのＨｉｓ３５９と架橋する可能性があると予測した。同様に、ナノボディ７Ｄ１２の１０９位へのＦＳＹの組み込みは、１０９位の残基のＣαからＬｙｓ４４３のε－Ｎ原子までの距離７．１Åを有する（図４Ｆ）ＥＧＦＲのＬｙｓ４４３を標的とするはずである。この距離は、ＦＳＫに対してはうまく機能しないはずである。

【0343】

これらの予測を試験するために、本発明者らは、大腸菌中でＦＳＫを７Ｄ１２に組み込み、７Ｄ１２（３０ＦＳＫ）及び７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）を高純度で単離した（図１４）。完全長７Ｄ１２ナノボディは発現中にＦＳＫを増殖培地に添加した場合にのみ得られ、精製ナノボディの質量分析により、ＦＳＫのみが組み込まれたことが確認された（図４Ｂ）。次に、本発明者らは、７Ｄ１２（３０ＦＳＫ）又は７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）をＥＧＦＲとインキュベートしてインビトロでの架橋を評価した。インキュベートしたサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から、７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）とのインキュベーション後にＥＧＦＲのゲルバンドはほぼ完全にアップシフトしたが、７Ｄ１２（３０ＦＳＫ）又は７Ｄ１２（ＷＴ）とのインキュベーション後ではアップシフトしないことが示された（図４Ｃ）。このアップシフトしたバンドは、ウェスタンブロットにおいて、ＥＧＦＲとナノボディ７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）との共有結合架橋であることが確認された（図４Ｄ）。これらの結果は、ナノボディ７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）が高い効率でＥＧＦＲを架橋したことを示している。比較すると、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析において、架橋距離の短い１０９位では、ＥＧＦＲは、７Ｄ１２（１０９ＦＳＹ）によって架橋されたが、７Ｄ１２（１０９ＦＳＫ）では架橋されなかった（図１５）。更に、本発明者らはまた、７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）のがん細胞表面上に発現されるネイティブなＥＧＦＲレセプターを架橋する能力を評価した。ヒト類表皮癌細胞株Ａ４３１を７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）又は７Ｄ１２（ＷＴ）と共にインキュベートした。細胞溶解物のウェスタンブロット解析は、７Ｄ１２（ＷＴ）は細胞と架橋できなかったが、７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）はＥＧＦＲと共有結合で架橋し、架橋効率が１～８時間で時間とともに増加したことを示している（図４Ｅ）。これらの結果は、ＦＳＫとＦＳＹが異なる反応距離で効率的な架橋を構築するように互いに補完することができ、ナノボディをＥＧＦＲ受容体と不可逆的に結合させることができ、共有結合の様式で機能する新規なタンパク質ベースの診断薬及び治療薬の創出を可能にすることを示している。

【0344】

哺乳動物細胞におけるＦＳＫの組み込み及び架橋
哺乳動物細胞におけるＦＳＫの適用を可能にするために、本発明者らは、ヒトＨｅＬａ細胞におけるＦＳＫの組み込み及びインビボでの架橋を試験した。ＦＳＫＲＳとｔＲＮＡ^Ｐｙｌを発現するプラスミドｐＮＥＵ－ＦＳＫＲＳを、ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ（１８２ＴＡＧ）レポーター細胞にトランスフェクトした。（参考文献２６）。ゲノムに組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子の１８２ＴＡＧコドンの抑制によって、細胞を緑色蛍光にする全長ＥＧＦＰが産生される。細胞培養物にＦＳＫを添加した場合にのみ、共焦点顕微鏡を用いて細胞から強いＥＧＦＰの蛍光が観察された（図５Ａ）。抗ＥＧＦＰ抗体を用いた細胞溶解物のウェスタンブロット解析もまた、全長ＥＧＦＰが、ＦＳＫを与えた細胞でのみ産生されたことを示し（図５Ｂ）、ＥＧＦＰへのＦＳＫの組み込みを示した。

【0345】

本発明者らは次に、ＦＳＫの哺乳動物細胞環境におけるタンパク質の架橋について検討した。プラスミドｐＮＥＵ－ＦＳＫＲＳを、ＧＳＴ（ＷＴ）、ＧＳＴ（８６ＴＡＧ）、又はＧＳＴ（８６ＴＡＧ／９２Ａ）を発現するプラスミドｐＣＤＮＡ３．１と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトし、細胞を１ｍＭのＦＳＫの存在下で増殖させた。細胞溶解物をウェスタンブロットで解析して、ＧＳＴ二量体架橋を検出した。図５Ｃに示すように、ＧＳＴの８６位へのＦＳＫの組み込みは、ＧＳＴ二量体架橋を成功裏に与え、これは陰性対照のＧＳＴ（ＷＴ）及びＧＳＴ（８６ＴＡＧ／９２Ａ）では観察されなかった。これらの結果は、ＦＳＫを進化させたＦＳＫＲＳを用いて哺乳動物系のタンパク質に組み込み、更に細胞中でのタンパク質の架橋に用いることができることを示している。

【0346】

ＦＳＹ又はＦＳＫによる化学架橋による大腸菌におけるＴｒｘインタラクトームの同定
以前は、ハロアルカンＵａａのみが保存されたシステインを含有するその基質タンパク質をプローブするために酵素の活性部位に組み込まれていた。ＦＳＫとＦＳＹは、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＴｙｒに対する多標的の能力を有することから、本発明者らは、これらが、Ｃｙｓを有さないが、相互作用界面にＬｙｓ、Ｈｉｓ、又はＴｙｒを有するより広い範囲の相互作用するタンパク質を捕捉するために使用できると推論した。更に、ＦＳＹとＦＳＫは、活性部位又は結合界面の内側ではなく、結合界面の周辺に組み込むことができ、タンパク質相互作用との潜在的な干渉を最小限にすることができる。複合体タンパク質の環境におけるＦＳＫ及びＦＳＹの反応距離の選択性を更に調べるために、本発明者らは、遺伝的にコードされた化学的架橋（ＧＥＣＸ）によって生細胞における酵素の未知の基質の同定におけるそれらの利用を検討した（図１７Ａ）。具体的には、本発明者らは、ＦＳＫ又はＦＳＹを大腸菌細胞中のチオレドキシン（Ｔｒｘ）の５９位又は６２位に組み込んだ。これらの２つの位置はＴｒｘの活性部位から離れており、Ｔｒｘとその基質との結合界面の周辺に位置している可能性が高い。６２位に組み込んだ場合に、ＷＴのＴｒｘと比較して、ＦＳＫとＦＳＹの両方は可能性のある基質タンパク質を効率的に架橋した（図１６）。これらの架橋タンパク質を取り出して、トリプシンで消化し、タンデム質量分析で分析した。架橋タンパク質の解析のためにＯｐｅｎＵａａソフトウェアを使用して、本発明者らは、Ｔｒｘ（ＦＳＫ）サンプル及びＴｒｘ（ＦＳＹ）サンプルからＴｒｘの１２個の基質タンパク質を同定した。これらの基質タンパク質の中で、ＡＨＰＣ、ＴＰＸ、ＳＤＨＡ、ＨＰＴＧ、ＣＨ１０は、以前に報告された公知のＴｒｘ基質である。（参考文献２７）。ＦＳＫ又はＦＳＹの使用によって、ＤＮＡＫ、ＡＰＨＣ、及びＴＰＸなど、Ｔｒｘのいくつかの重複する基質が存在する。しかし、ＦＳＫ及びＦＳＹは、同じ基質タンパク質ＡＨＰＣ及びＤＮＡＫに対して異なる残基選択性を示した。これらの重複する基質タンパク質の他に、ＦＳＫ及びＦＳＹはそれぞれ、それ自体の別の９つの異なる基質を有した（表１～２）。これらの結果は、複合体タンパク質の環境において基質を同定する際のＦＳＹ及びＦＳＫの明確かつ相補的な価値を示している。

【0347】

表１（ＦＳＫ）及び表２（ＦＳＹ）に、Ｔｒｘの基質タンパク質及びＦＳＫ又はＦＳＹによって架橋されたそれらのペプチドを特定し、ここで太字下線は架橋残基であり、配列番号１８中の小文字下線はＩＡＭによってアルキル化されたＣｙｓである。

【0348】

【表1】

【0349】

【表2】

【0350】

考察
要約すると、本発明者らは、大きく離れたタンパク質残基の共有結合のための、新規なフルオロ硫酸を含有する潜在性の生体反応性Ｕａａ、ＦＳＫを開発した。以前に開発された多標的の生体反応性ＵａａであるＦＳＹが、ＦＳＹのより短い反応半径によって、共有結合の架橋を生成することができなかった場所に、ＦＳＫは、そのより長く柔軟な側鎖によって効率的に共有結合で連結することができた。この拡張によって、顕著により広い範囲のタンパク質の部位を共有結合で連結することができる。タンパク質間架橋に加えて、ＦＳＫはまた、分子内架橋のためにも使用でき、これにより、タンパク質の架橋パターンの多様性を大きく拡張して、新規なタンパク質特性の操作を促進する。更に、本発明者らは、ＦＳＫをナノボディに組み込むことに成功し、それらをＥＧＦＲに対する共有結合バインダーに変換し、それはインビトロで、またがん細胞の表面上でＥＧＦＲに不可逆的に結合し、それによりがんのイメージング及び治療のための新規な手段を提供し得る。最後に、本発明者らは、細菌及び哺乳動物細胞の両方において、ＦＳＫをタンパク質に組み込むことができ、共有結合でタンパク質の架橋を生成し得ることを実証した。Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＴｙｒに対する同じ多標的の能力を共有する一方で、ＦＳＫは、より長くより柔軟な側鎖でＦＳＹを補完する。それらは共に、ほとんど全てのタンパク質及びタンパク質－タンパク質相互作用について、ＳｕＦＥｘケミストリーによる共有結合を生成するための強力な潜在的生体反応性の系を提供することができる。従って、本発明者らは、ＦＳＫが基礎的な生物学的研究並びにタンパク質工学において大きな用途を有することを期待している。

【0351】

実験手順
試薬及び分子生物学
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって、プライマーは合成されて精製され、プラスミドはＧＥＮＥＷＩＺによって配列決定された。全ての分子生物学試薬は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ又はＶａｚｙｍｅから入手した。Ｈｉｓ－ＨＰＲ抗体、ＧＦＰモノクローナル抗体、ＧＡＰＤＨ－ＨＲＰ抗体はＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ Ｇｒｏｕｐから入手した。ｐＢＡＤ－ユビキチン（６ＴＡＧ）及びｐＢＡＤ－ｅｃＧＳＴ
ＷＴ及びｅｃＧＳＴ変異型を以前に記載されたように使用した。（Ｌｉｕら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１９，１４１（２４），９４５８～９４６２）。ｅｃＧＳＴ
ＨｉｎｄＩＩＩ－ｐｃＤＮＡ及びｅｃＧＳＴ Ｘｈｏｌ－ｐｃＤＮＡプライマーを使用して、ｅｃＧＳＴ ＷＴ及びｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ）、ｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ／９２Ａ）、ｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ／９２Ａ／７２Ａ）をｐｃＤＮＡ
３．１にクローニングした。クローニングに使用したプライマーを図６に示す。

【0352】

ＦＳＫＲＳアミノ酸の配列を配列番号２に示す。

【0353】

配列番号２
ＭＴＶＫＹＴＤＡＱＩ ＱＲＬＲＥＹＧＮＧＴ ＹＥＱＫＶＦＥＤＬＡ ＳＲＤＡＡＦＳＫＥＭ ＳＶＡＳＴＤＮＥＫＫ
ＩＫＧＭＩＡＮＰＳＲ ＨＧＬＴＱＬＭＮＤＩ ＡＤＡＬＶＡＥＧＦＩ ＥＶＲＴＰＩＦＩＳＫ ＤＡＬＡＲＭＴＩＴＥ
ＤＫＰＬＦＫＱＶＦＷ ＩＤＥＫＲＡＬＲＰＭ ＬＡＰＮＬＧＳＶＡＲ ＤＬＲＤＨＴＤＧＰＶ ＫＩＦＥＭＧＳＣＦＲ
ＫＥＳＨＳＧＭＨＬＥ ＥＦＴＭＬＮＬＦＤＭ ＧＰＲＧＤＡＴＥＶＬ ＫＮＹＩＳＶＶＭＫＡ ＡＧＬＰＤＹＤＬＶＱ
ＥＥＳＤＶＹＫＥＴＩ ＤＶＥＩＮＧＱＥＶＣ ＳＡＡＶＧＰＴＰＩＤ ＡＡＨＤＶＨＥＰＷＳ ＧＡＧＦＧＬＥＲＬＬ
ＴＩＲＥＫＹＳＴＶＫ ＫＧＧＡＳＩＳＹＬＮ ＧＡＫＩＮ

【0354】

ｓｆＧＦＰ（２ＴＡＧ）。プライマーｓｆＧＦＰ２ＴＡＧ Ｆｏｒ及びｓｆＧＦＰ２ＴＡＧ Ｒｅｖを使用して、ｐＢＡＤ－ｓｆＧＦＰ（２ＴＡＧ）（配列番号２８、ここで太字下線：２位のアンバーコドンＴＡＧ）を構築した。

【0355】

【表3】

【0356】

ｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ）。プライマーｅｃＧＳＴ ＮｄｅＩ～ＧＳＴ８６ＴＡＧ－Ｒｅｖを使用して、オーバーラップＰＣＲによってｐＢＡＤ－ｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ）を構築した。（配列番号２９、ここで太字下線：８６位のアンバーコドンＴＡＧ）

【0357】

【表4】

【0358】

ｅｃＧＳＴ（６５ＴＡＧ）。ｐＢＡＤ－ｅｃＧＳＴ（６５ＴＡＧ）を、プライマーｅｃＧＳＴ６５ＴＡＧ－Ｆｏｒ及びｅｃＧＳＴ６５ＴＡＧ－Ｒｅｖを用いた部位特異的変異導入によって構築した（配列番号３０、ここで太字下線：６５位のアンバーコドンＴＡＧ）。

【0359】

【表5】

【0360】

ｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ／９２Ａ）。ｐＢＡＤ－ｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ／９２Ａ）を、プライマーｅｃＧＳＴ８６ＴＡＧ９２Ａ－Ｆｏｒ及びｅｃＧＳＴ８６ＴＡＧ９２Ａ－Ｒｅｖを用いた部位特異的変異導入によって構築した。（配列番号３１、ここで太字下線：８６位のアンバーコドンＴＡＧ。太字イタリック体：９２Ａ）

【0361】

【表6】

【0362】

ｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ／９２Ａ／７２Ａ）。ｐＢＡＤ－ｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ／９２Ａ／７２Ａ）を、プライマーｅｃＧＳＴ８６ＴＡＧ９２Ａ７２Ａ－Ｆｏｒ及びｅｃＧＳＴ８６ＴＡＧ９２Ａ７２Ａ－Ｒｅｖを用いた部位特異的変異誘導によって構築した。（配列番号３２、ここで太字下線：８６位のアンバーコドンＴＡＧ。太字イタリック体：７２／９２Ａ）。

【0363】

【表7】

【0364】

ｓｊＧＳＴ ＷＴ。ｐＢＡＤ－ｓｊＧＳＴ ＷＴを、プライマーＨＲ－ｓｊＧＳＴ ＮｄｅＩ及びＨＲ－ｓｊＧＳＴ ＨｉｎｄＩＩＩを用いてクローニングした。（配列番号３３）

【0365】

配列番号３３
ＭＴＳＭＳＰＩＬＧＹＷＫＩＫＧＬＶＱＰＴＲＬＬＬＥＹＬＥＥＫＹＥＥＨＬＹＥＲＤＥＧＤＫＷＲＮＫＫＦＥＬＧＬＥＦＰＮＬＰＹＹＩＤＧＤＶＫＬＴＱＳＭＡＩＩＲＹＩＡＤＫＨＮＭＬＧＧＣＰＫＥＲＡＥＩＳＭＬＥＧＡＶＬＤＩＲＹＧＶＳＲＩＡＹＳＫＤＦＥＴＬＫＶＤＦＬＳＫＬＰＥＭＬＫＭＦＥＤＲＬＣＨＫＴＹＬＮＧＤＨＶＴＨＰＤＦＭＬＹＤＡＬＤＶＶＬＹＭＤＰＭＣＬＤＡＦＰＫＬＶＣＦＫＫＲＩＥＡＩＰＱＩＤＫＹＬＫＳＳＫＹＩＡＷＰＬＱＧＷＱＡＴＦＧＧＧＤＨＰＰＫＳＤＬＶＰＲＧＳＨＨＨＨＨＨ

【0366】

ｓｊＧＳＴ（９７ＴＡＧ）及びｓｊＧＳＴ（９７ＴＡＧ／４４変異型）。ｐＢＡＤ－ｓｊＧＳＴ（９７ＴＡＧ）及びｐＢＡＤ－ｓｊＧＳＴ（９７ＴＡＧ／４４Ａ）を、プライマーＨＲ－ｓｊＧＳＴ ＮｄｅＩ、ｓｊＧＳＴ ｓｊＧＳＴ９７ＴＡＧ－Ｆｏｒ、ｓｊＧＳＴ９７ＴＡＧ－Ｒｅｖ、ＨＲ－ｓｊＧＳＴ
ＨｉｎｄＩＩＩ ｒｅｖ、ｓｊＧＳＴ４４Ａ－Ｆｏｒ、及びｓｊＧＳＴ４４Ａ－Ｒｅｖによって構築し、プライマーセット４４Ｓ－Ｆｏｒ、４４Ｓ－Ｒｅｖ、４４Ｔ－Ｆｏｒ、４４Ｔ－Ｒｅｖ、４４Ｙ－Ｆｏｒ、４４Ｒ－Ｒｅｖ、４４Ｈ－Ｆｏｒ、４４Ｈ－Ｒｅｖを用いて、ｐＢＡＤ－ｓｊＧＳＴ（９７ＴＡＧ／４４Ｓ）、ｐＢＡＤ－ｓｊＧＳＴ（９７ＴＡＧ／４４Ｔ）、ｐＢＡＤ－ｓｊＧＳＴ（９７ＴＡＧ／４４Ｙ）及びｐＢＡＤ－ｓｊＧＳＴ（９７ＴＡＧ／４４Ｈ）を調製した。（配列番号３４、ここで、太字下線：９７位のアンバーコドンＴＡＧ。太字イタリック体：対を形成したＬｙｓ４４及びそのＡ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｙへの変異。）

【0367】

【表8】

【0368】

７Ｄ１２。プライマー７Ｄ１２ ＮｄｅＩ及び７Ｄ１２ ＨｉｎｄＩＩＩを使用して、７Ｄ１２ ＷＴをｐＢＡＤプラスミドにクローニングした。（配列番号３５）

【0369】

配列番号３５
ＭＧＱＶＫＬＥＥＳＧ ＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬ ＲＬＴＣＡＡＳＧＲＴ ＳＲＳＹＧＭＧＷＦＲ ＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶ ＳＧＩＳＷＲＧＤＳＴ ＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦ ＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴ ＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰ ＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡ ＡＡＧＳＡＷＹＧＴＬ ＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴ ＱＶＴＶＳＳ

【0370】

７Ｄ１２（３０ＴＡＧ）。ｐＢＡＤ－７Ｄ１２（３０ＴＡＧ）を、プライマー７Ｄ１２ ３０ＴＡＧ－Ｆｏｒ及び７Ｄ１２ ３０ＴＡＧ－ＲＥを用いた部位特異的変異導入によって構築した。（配列番号３６、ここで、太字下線：３０位のアンバーコドンＴＡＧ。）

【0371】

【表9】

【0372】

７Ｄ１２（３１ＴＡＧ）。ｐＢＡＤ－７Ｄ１２（３１ＴＡＧ）を、プライマー７Ｄ１２ ３１ＴＡＧ－Ｆｏｒ及び７Ｄ１２ ３１ＴＡＧ－Ｒｅｖを用いた部位特異的変異導入によって構築した。（配列番号３７、ここで太字下線：３１位のアンバーコドンＴＡＧ）

【0373】

【表10】

【0374】

ライブラリの構築及びＦＳＫＲＳ変異型の選択
ＦＳＫの組み込みに効率的な合成酵素をスクリーニングするために、プライマーＭａＰｙｌＲＳ ＮｄｅＩからＭａＰｙｌＲＳ ＰｓｔＩを用いて、メタノメチロフィルス・アルバスのＰｙｌＲＳ－ｔＲＮＡ合成酵素（配列番号１）の活性部位をランダム化して、ＦＳＫのスクリーニングのためのライブラリを作製した。ＦＳＫの組み込みにおけるオルソゴナルな合成酵素の選択は、先に記載した手順に従った。（Ｌｉｕら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１８，１４０（２８），８８０７～８８１６、Ｌｉｕら，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｅｄ．ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ）２０１８，５７（３９），１２７０２～１２７０６を参照）。候補ヒットを、プライマーＨＲｐＥＶＯＬ－Ｆｏｒ及びＨＲｐＥＶＯＬ－Ｒｅｖを用いてｐＥＶＯＬプラスミドに再クローニングし、続いてｐＢＡＤ－ＥＧＦＰ（１８２ＴＡＧ）への組み込みの効率を調べた。ヒットについての組み込み効率を、６００ｎｍでのＯＤで正規化した緑色蛍光（４８５ｎｍで励起、５２８ｎｍで発光）を読み取って比較した。以下の表３に示すように、４つの候補ヒットが同定された。

【0375】

配列番号１
ＭＴＶＫＹＴＤＡＱＩ ＱＲＬＲＥＹＧＮＧＴ ＹＥＱＫＶＦＥＤＬＡ ＳＲＤＡＡＦＳＫＥＭ ＳＶＡＳＴＤＮＥＫＫ ＩＫＧＭＩＡＮＰＳＲ ＨＧＬＴＱＬＭＮＤＩ ＡＤＡＬＶＡＥＧＦＩ ＥＶＲＴＰＩＦＩＳＫ ＤＡＬＡＲＭＴＩＴＥ ＤＫＰＬＦＫＱＶＦＷ ＩＤＥＫＲＡＬＲＰＭ ＬＡＰＮＬＹＳＶＭＲ ＤＬＲＤＨＴＤＧＰＶ ＫＩＦＥＭＧＳＣＦＲ ＫＥＳＨＳＧＭＨＬＥ ＥＦＴＭＬＮＬＶＤＭ ＧＰＲＧＤＡＴＥＶＬ ＫＮＹＩＳＶＶＭＫＡ ＡＧＬＰＤＹＤＬＶＱ ＥＥＳＤＶＹＫＥＴＩ ＤＶＥＩＮＧＱＥＶＣ ＳＡＡＶＧＰＨＹＬＤ ＡＡＨＤＶＨＥＰＷＳ ＧＡＧＦＧＬＥＲＬＬ ＴＩＲＥＫＹＳＴＶＫ ＫＧＧＡＳＩＳＹＬＮ ＧＡＫＩＮ

【0376】

【表11】

【0377】

ＥＧＦＰ（１８２ＴＡＧ）、ｓｆＧＦＰ（１５１ＴＡＧ）、ｓｆＧＦＰ（２ＴＡＧ）へのＦＳＫの組み込み
ｐＢＡＤ－ｓｆＧＦＰ（２ＴＡＧ）、ｐＢＡＤ－ｓｆＧＦＰ（１５１ＴＡＧ）又はｐＢＡＤ－ＥＧＦＰ（１８２ＴＡＧ）をｐＥＶＯＬ－ＦＳＫＲＳと共にＤＨ１０ｂに同時形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンと３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを添加したＬＢ寒天プレートに播種した。単一コロニーを採取して、１ｍＬの２ｘＹＴ（５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１６ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物）に接種した。細胞を３７℃、２２０ｒｐｍで十分に通気しながら一晩置いてＯＤが０．５になるまで増殖させた。翌朝、細胞を、１ｍＭのＦＳＫを含む又は含まない、適切な抗生物質、０．２％アラビノースを補充した新鮮な２ＸＹＴ中に１０倍に希釈した。次いで、細胞を３０℃で６時間又は１８℃で一晩のいずれかで誘導した。蛍光を、上記のようにプレートリーダーで検出した。

【0378】

発現及び精製のためのタンパク質へのＦＳＫの一般的組み込み
ユビキチン（６ＴＡＧ）、ユビキチン（１８ＴＡＧ）、７Ｄ１２（３０ＴＡＧ）、及び７Ｄ１２（３１ＴＡＧ）へのＦＳＫの組み込みについての形質転換の手順は上記と同じである。形質転換後、単一コロニーを採取して、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩増殖させた。翌朝、細胞培養物を１００倍に希釈し、次いで、十分に通気し、適切な抗生物質を選択して、３０～１００ｍＬのスケールでＯＤが０．５になるまで再増殖させた。次いで、培地に１ｍＭのＦＳＫを含む又は含まない０．２％アラビノースを添加して、１８℃、２２０ｒｐｍで１８時間、１８℃又は３０℃で６時間発現させた。ＩＭＡＣクロマトグラフィーを使用してタンパク質を精製した。そして、Ｌｉｕら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１９，１４１（２４），９４５８～９４６２に記載されている手順を行った。

【0379】

大腸菌内でのタンパク質の架橋におけるｅｃＧＳＴ、ｓｊＧＳＴ及びそれらの変異型へのＦＳＫ及びＦＳＹの利用
生きている大腸菌の細胞内でのｅｃＧＳＴ又はｓｊＧＳＴ及びそれらの変異型の架橋をプローブするため。ｐＢＡＤ－ｅｃＧＳＴ ＷＴ、ｐＢＡＤ－ｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ）、ｐＢＡＤ－ｅｃＧＳＴ（６５ＴＡＧ）、ｐＢＡＤ－ｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ／９２Ａ）、ｐＢＡＤ－ｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ／９２Ａ／７２Ａ）、又はｓｊＧＳＴ ＷＴ、ｓｊＧＳＴ（９７ＴＡＧ）、ｓｊＧＳＴ（９７ＴＡＧ／４４Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、又はＹ）をｐＥＶＯＬ－ＦＳＹＲＳ又はｐＥＶＯＬ－ＦＳＫＲＳのいずれかと共にＤＨ１０ｂ細胞に同時形質転換した。ＯＤが約０．５になるまで細胞が増殖したときに、ＦＳＹ又はＦＳＫをそれぞれ０．２％アラビノースと共に細胞に添加して誘導した。細胞をタンパク質発現のために３７℃で６時間増殖させ、次いで、これをベンチトップ型の遠心分離機で遠心分離して回収し、１００ｍＭのＤＴＴを含有する２ｘＳＤＳローディングダイで処理して、９５℃で５分間煮沸した。架橋によるＧＳＴの二量体化を、抗ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロットによってモニターした。

【0380】

７Ｄ１２へのＦＳＹ又はＦＳＫの組み込み
ｐＢＡＤ－７Ｄ１２（ｘｘｘＴＡＧ、ここでｘｘｘは組み込み位置を示す）を、ｐＥＶＯＬ－ＦＳＹＲＳ（ＦＳＹの組み込み用）又はｐＥＶＯＬ－ＦＳＫＲＳ（ＦＳＫの組み込み用）と共にＤＨ１０ｂに同時形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンと３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＬＢ寒天プレートに播種した。形質転換後、単一コロニーを採取して、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩増殖させた。翌朝、細胞培養物を１００倍に希釈し、次いで、十分に通気し、適切な抗生物質を選択して、３０～１００ｍＬのスケールでＯＤが０．５になるまで再増殖させた。次いで、培地に１ｍＭのＦＳＹ又はＦＳＫを含む又は含まない０．２％アラビノースを添加し、３０℃で１２時間発現させた。Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いてタンパク質を精製した。

【0381】

７Ｄ１２及びＥＧＦＲのインビトロでの架橋
７Ｄ１２とＥＧＦＲのインビトロでの架橋を調べるために、精製した２μＭの７Ｄ１２ ＷＴ、７Ｄ１２（３０ＦＳＫ）又は７Ｄ１２（３１ＦＳＫ）を、ｐＨ７．４、１５μＬの１ｘＰＢＳ中で、それぞれ５００ｎＭの組換えヒトＥＧＦＲタンパク質（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１５５７２６）と共にインキュベートした。３７℃で１６時間インキュベートした後、サンプルを最終１ｘＳＤＳローディングダイで処理し、９５℃で５分間煮沸した。架橋を、クマシーブルーＳＤＳ－ＰＡＧＥ又は１：１００００抗ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロットを行なって調べた。

【0382】

７Ｄ１２とＥＧＦＲの細胞内での架橋
ＥＧＦＲを過剰発現したＡ４３１哺乳動物細胞への７Ｄ１２の直接架橋のために、Ａ４３１細胞を２４ウェルプレートに播種し（ウェル当たり２×１０^６細胞）、３７℃で一晩培養した。細胞を１μＭの７Ｄ１２及び７Ｄ１２（３１ＴＡＧ）で１、２、４、８及び１２時間処理した。トリプシンで消化した後、細胞を３００ｇで５分間遠心分離して収集し、１×のプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む１００μＬのＲＩＰＡ緩衝液を添加して溶解させた。サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、１：１００００抗ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロットで検出した。抗ＧＡＰＤＨ抗体を参照タンパク質として使用した。

【0383】

Ｈｅｌａ ＧＦＰ（１８２ＴＡＧ）へのＦＳＫの遺伝的組み込み
細胞集団が８０％コンフルエンスに達したときに、プラスミドｐＮＥＵ－ＦＳＫＲＳ（１μｇ）を、２ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地中、３μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）でＨｅｌａ－ＧＦＰ１８２（ＴＡＧ）細胞にトランスフェクトした。ブランクのＨｅｌａ－ＧＦＰ１８２（ＴＡＧ）細胞群を陰性対照として使用した。トランスフェクションの６時間後に細胞を１ｍＭのＦＳＫで処理して、あるいは処理せずに、更に４８時間培養した。細胞を１ＸＰＢＳで１回洗浄して、顕微鏡画像解析を行なった後、回収して、抗ＧＦＰ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。抗ＧＡＰＤＨ抗体を参照タンパク質として使用した。

【0384】

哺乳動物細胞におけるｅｃＧＳＴ変異型へのＦＳＫの遺伝的組み込み
哺乳動物細胞におけるタンパク質の架橋をプローブするため。細胞集団が８０％コンフルエンスに達したときに、プラスミドｐＮＥＵ－ＦＳＫＲＳ（１．５μｇ）を、１μｇの
ｐＣＤＮＡ３．１ ｅｃＧＳＴ ＷＴ、１．５μｇのｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ）、１．５μｇのｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ／９２Ａ）、及び１．５μｇのｅｃＧＳＴ（８６ＴＡＧ／９２Ａ／７２Ａ）とそれぞれ、２ｍＬのＤＭＥＭ培地中、９μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）でＨＥＫ（２９３Ｔ）細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後に細胞を１ｍＭのＦＳＫで処理して、あるいは処理せずに、更に４８時間培養した。細胞を回収して、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。抗ＧＡＰＤＨ抗体を参照タンパク質として使用した。

【0385】

質量分析
質量分析測定は、前記のように行った。（Ｌｉｅら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１７，１３９（９），３４３０～３４３７）。簡潔には、エレクトロスプレーイオン化質量分析では、インタクトなタンパク質の質量スペクトルを、ＬＣ－２０ＡＤ（Ｓｈｉｍａｚｕ）液体クロマトグラフィーユニットに接続され、ポジティブエレクトロスプレーイオン化（＋ＥＳＩ）モードで動作するＱＴＯＦ Ｕｌｔｉｍａ（Ｗａｔｅｒｓ）質量分析計を使用して得た。タンパク質サンプルを、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（３００Å、３．５μｍ、２．１ｍｍｘ５０ｍｍ）上で、０．１％ギ酸を含む３０～７１．４％のアセトニトリル勾配を用いて、逆相クロマトグラフィーによって小分子から分離した。各分析は、室温で０．２ｍＬ／分の一定流速下、２５分で行なった。データは、３５０から２５００までのｍ／ｚで、１秒／スキャンの速度で取得した。あるいは、スペクトルを、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４逆相カラム（３００Å、１．７μｍ、２．１ｍｍｘ１５０ｍｍ）でＸｅｖｏ Ｇ２－Ｓ ＱＴＯＦによって取得した。０．１％のギ酸を含む５％～９５％のアセトニトリル勾配を、５分間の実行時間にわたって、室温で０．５ｍＬ／分の一定流速で使用した。スペクトルは、３５０から２０００までのｍ／ｚで、１秒／スキャンの速度で取得した。ＭａｓｓＬｙｎｘで最大エントロピーを使用してスペクトルをデコンボリューションした。タンデム質量分析では、Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＬＣシステムと接続したＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐを使用して、ペプチドの分析及び配列決定を行った。Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐによるデータ取得は以下の通りであった。１０μＬのトリプシン消化タンパク質をオートサンプラーを介して，Ａｃｅ ＵｌｔｒａＣｏｒｅ ｓｕｐｅｒ Ｃ１８逆相カラム（３００Å、２．５μｍ、７５ｍｍ×２．１ｍｍ）にロードした。０．１％ギ酸を含む５％～９５％のアセトニトリル勾配を、４５分の実行時間にわたって、室温で、０．２ｍＬ／分の一定流速で使用した。ＭＳデータを、２８、３０、３５ｅＶの段階的に正規化された衝突エネルギーを使用して、ＨＣＤの断片化のためのサーベイスキャンから最も豊富な前駆体イオンを動的に選択するデータ依存トップ１０法を使用して取得した。Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ上、２００のｍ／ｚにおいて７０，０００の分解能でサーベイスキャンを取得した。ペプチドの同位体パターンの理論的パターンは、ＵＣＳＦ ＭＳ－ＩＳＯＴＯＰＥ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｆｓ．ｅｄｕ）又はｅｎｖｉＰａｔ Ｗｅｂ２．１（Ｌｏｏｓら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１５，８７（１１），５７３８～５７４４）を用いて計算した。

【0386】

実施例２
アリールフルオロ硫酸の合成は、［４－（アセチルアミノ）フェニル］イミドジスルフリルジフルオリド（ＡＩＳＦ）試薬を使用して硫黄（ＩＶ）フッ化物を合成する最近の方法に基づいていた。フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン（５、ＦＳＫ）の合成スキームを図１８に示す。

【0387】

４－（（フルオロスルホニル）オキシ）安息香酸（２）の合成。２００ｍＬの丸底フラスコに、４－ヒドロキシ安息香酸（１、１．３８ｇ、１０ｍｍｏｌ）及び［４－（アセチルアミノ）フェニル］－イミドジスルフリルジフルオリド（ＡＩＳＦ）試薬（３．７８ｇ、１２ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えた。混合物を無水テトラヒドロフラン５０ｍＬに溶解し、撹拌しながら１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（３．３５ｍＬ、２２ｍｍｏｌ、２．２当量）を滴下した。次いで、溶液を室温で２０分間撹拌した。次いで、反応物を５０ｍＬの酢酸エチルで希釈し、１ＭのＨＣｌ（１００ｍＬｘ２）及び食塩水（１００ｍＬｘ１）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。次いで、粗生成物を、ＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２（１：１００）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物の４－（（フルオロスルホニル）オキシ）安息香酸を白色固体（２、１．７２ｇ、７．８ｍｍｏｌ、７８％）として単離した。

【0388】

フルオロスルホニルオキシベンゾイル－Ｌ－リジン（５、ＦＳＫ）の合成。４－（（フルオロスルホニル）オキシ）安息香酸（２、０．２２ｇ、１ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ_２ＣＬ_２（１５ｍＬ）溶液に、撹拌しながら、塩化オキサリル（０．２１ｍｌ、２．５ｍｍｏｌ、２．５当量）をアルゴン下、０℃で滴下した。次いで、ジメチルホルムアミド（０．１ｍＬ）を触媒として添加した。次いで、反応混合物を室温で５時間撹拌した。次いで、溶液を真空下で濃縮して、黄色油状物を得た。粗４－（クロロカルボニル）フェニルスルホフルオリデート（３、約１ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）に再溶解させて０℃に冷却した。次いで、Ｎ－ＢＯＣ－Ｌｙｓ－^ｔＢｕ（４、０．３４ｇ、１ｍｍｏｌ、１当量）を加え、その後、Ｅｔ_３Ｎ（０．１５ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ、１．１当量）を滴下した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応物を２０ｍＬのＨ_２Ｏでクエンチし、１ＭのＨＣｌ（２０ｍＬｘ２）で洗浄した。水層を合わせて酢酸エチル（５０ｍＬｘ２）で抽出した。有機層を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。次いで、粗生成物を、ＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２（１：１００）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物のＮ－ＢＯＣ－ＦＳＫ－^ｔＢｕを黄色油状物として単離した（０．２５ｇ、０．５０ｍｍｏｌ、５０％）。

【0389】

Ｎ－ＢＯＣ－ＦＳＫ－^ｔＢｕ（０．２５ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）をシンチレーションバイアルに入れて、ジオキサン中の４ＭのＨＣｌ（１０ｍＬ）に溶解させた。反応物を一晩撹拌した。生じた固体を濾別し、冷エーテル（１０ｍＬｘ２）で洗浄して、生成物のＦＳＫ－ＨＣｌを白色固体として得た（５、１５８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ、８１％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）：δ（ｐｐｍ）７．８９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９９（ｔ，Ｊ＝６．０，１Ｈ），３．４３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．０３－１．９４（ｍ，２Ｈ），１．７２－１．６６（ｍ，２Ｈ），１．５５－１．４９（ｍ，２Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）：δ（ｐｐｍ）１７３．５，１６９．９，１５２．４，１３５．２，１３０．２，１２１．９，５３．９，４０．１，３０．２，２８．５，２２．３。ＨＲ－ＥＳＩ（＋）ｍ／ｚ：Ｃ_１３Ｈ_１７ＦＮ_２ＮａＯ_６Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］^＋の計算値、３７１．０６８４；実測値３７１．０６９０。

【0390】

実施例３
ＦＳＫＲＳ（配列番号２）のＣ端にＨｉｓｘ６タグを付加すると、ＦＳＫの組み込み効率が約９６％増加した。ＦＳＫＲＳのＮ端にＨｉｓｘ６タグを付加しても、ＦＳＫの組み込み効率は増加しなかった。細胞を３７℃で培養した場合、増加は安定していた。結果を図１９に示し、ここで、ＦＬ／ＯＤは、左から右に、５４１０（ＦＳＫＲＳ）、３３５６３（ＦＳＫＲＳ＋）、７５４６（ＦＳＫＲＳＮＴｈｉｓ）、３１３７９（ＦＳＫＲＳＮＴｈｉｓ＋）、４７４６（ＦＳＫＲＳＣＴｈｉｓ）、及び６５７３５（ＦＳＫＲＳＣＴｈｉｓ＋）であり、ここで、ＦＳＫＲＳは配列番号２であり、ＦＳＫＲＳ－ＮＴｈｉｓは配列番号８６であり、ＦＳＫＲＳ－ＣＴｈｉｓは配列番号８７である。

【0391】

ＦＳＫの組み込みを１８℃で試験した場合、１ｍＭのＦＳＫの存在下でのｓｆＧＦＰの蛍光強度の増加は、図２０に示されるように、ＦＳＫＲＳ－ＣＴｈｉｓｘ６においてＦＳＫＲＳに対して有意ではなかった。図２０を参照すると、ＦＳＫＲＳの＋ＵＡＡのＦＬ／ＯＤは７１６８５であり、ＦＳＫＲＳの－ＵＡＡは３２７４であり、ＦＳＫＲＳ－ＣＴｈｉｓの＋ＵＡＡのＦＬ／ＯＤは７６２１４であり、ＦＳＫＲＳ－ＣＴｈｉｓの－ＵＡＡは２６０２であり、ＦＳＫＲＳ－ＮＴｈｉｓの＋ＵＡＡのＦＬ／ＯＤは５３６８７であり、ＦＳＫＲＳ－ＮＴｈｉｓの－ＵＡＡは４０５５であった。

【0392】

－ＦＳＫに対する＋ＦＳＫの蛍光強度比は、ＦＳＫＲＳ（２１．９倍）よりもＦＳＫＲＳ－ＣＴＨｉｓｘ６（２９．３倍）の方が高く、これは主に、ＦＳＫが存在しない場合のＦＳＫＲＳ－ＣＴＨｉｓｘ６のバックグラウンドが低いためである。ＦＳＫＲＳ－ＮＴＨｉｓｘ６についての－ＦＳＫに対する＋ＦＳＫの蛍光強度比は１３．２倍であった。３７℃及び１８℃での結果の比較から、ＦＳＫＲＳのＣ端に付加されたＨｉｓｘ６タグによって合成酵素の熱安定性が向上したことが示された。したがって、ＦＳＫの組み込み効率に対するＨｉｓｘ６タグの増加効果は、約１８℃～約３７℃の温度で有効である。実施形態において、温度は約２５℃～約３０℃である。

【0393】

ｓｆＧＦＰ（１５１ＴＡＧ）にＦＳＹを組み込むためにＦＳＹＲＳを用いて行なった同様の実験は、そのような効果を示さず、ＦＳＫＲＳに対するＨｉｓｘ６の効果が独特かもしれないことを示唆した。他のタグもＦＳＫＲＳに対して同様の効果を有し得る。

【0394】

要約すると、ＦＳＫＲＳのＣ端にＨｉｓｘ６タグを付加することにより、３７℃でのＦＳＫの組み込み率が増加した。

【0395】

配列番号８６（ＦＳＫＲＳ－ＮＴＨｉｓ６）
ＭＨＨＨＨＨＨＴＶＫＹＴＤＡＱＩＱＲＬＲＥＹＧＮＧＴＹＥＱＫＶＦＥＤＬＡＳＲＤＡＡＦＳＫＥＭＳＶＡＳＴＤＮＥＫＫＩＫＧＭＩＡＮＰＳＲＨＧＬＴＱＬＭＮＤＩＡＤＡＬＶＡＥＧＦＩＥＶＲＴＰＩＦＩＳＫＤＡＬＡＲＭＴＩＴＥＤＫＰＬＦＫＱＶＦＷＩＤＥＫＲＡＬＲＰＭＬＡＰＮＬＧＳＶＡＲＤＬＲＤＨＴＤＧＰＶＫＩＦＥＭＧＳＣＦＲＫＥＳＨＳＧＭＨＬＥＥＦＴＭＬＮＬＦＤＭＧＰＲＧＤＡＴＥＶＬＫＮＹＩＳＶＶＭＫＡＡＧＬＰＤＹＤＬＶＱＥＥＳＤＶＹＫＥＴＩＤＶＥＩＮＧＱＥＶＣＳＡＡＶＧＰＴＰＩＤＡＡＨＤＶＨＥＰＷＳＧＡＧＦＧＬＥＲＬＬＴＩＲＥＫＹＳＴＶＫＫＧＧＡＳＩＳＹＬＮＧＡＫＩＮ^＊

【0396】

配列番号８７（ＦＳＫＲＳ－ＣＴＨｉｓ６）
ＭＴＶＫＹＴＤＡＱＩＱＲＬＲＥＹＧＮＧＴＹＥＱＫＶＦＥＤＬＡＳＲＤＡＡＦＳＫＥＭＳＶＡＳＴＤＮＥＫＫＩＫＧＭＩＡＮＰＳＲＨＧＬＴＱＬＭＮＤＩＡＤＡＬＶＡＥＧＦＩＥＶＲＴＰＩＦＩＳＫＤＡＬＡＲＭＴＩＴＥＤＫＰＬＦＫＱＶＦＷＩＤＥＫＲＡＬＲＰＭＬＡＰＮＬＧＳＶＡＲＤＬＲＤＨＴＤＧＰＶＫＩＦＥＭＧＳＣＦＲＫＥＳＨＳＧＭＨＬＥＥＦＴＭＬＮＬＦＤＭＧＰＲＧＤＡＴＥＶＬＫＮＹＩＳＶＶＭＫＡＡＧＬＰＤＹＤＬＶＱＥＥＳＤＶＹＫＥＴＩＤＶＥＩＮＧＱＥＶＣＳＡＡＶＧＰＴＰＩＤＡＡＨＤＶＨＥＰＷＳＧＡＧＦＧＬＥＲＬＬＴＩＲＥＫＹＳＴＶＫＫＧＧＡＳＩＳＹＬＮＧＡＫＩＮＨＨＨＨＨＨ^＊

【0397】

参考文献：（１）Ｘｉａｎｇ，Ｚ．、Ｒｅｎ，Ｈ．、Ｈｕ，Ｙ．Ｓ．、Ｃｏｉｎ，Ｉ．、Ｗｅｉ，Ｊ．、Ｃａｎｇ，Ｈ．、Ｗａｎｄ，Ｌ．、Ａｄｄｉｎｇ ａｎ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｂｏｎｄ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３，１０（９），８８５～８８８。（２）Ｗａｎｇ，Ｌ．、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｎｅｗ Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７，３８（Ｐｔ Ａ），１６～２５。（３）Ｘｉａｎｇ，Ｚ、Ｌａｃｅｙ，Ｖ．Ｋ．、Ｒｅｎ，Ｈ．、Ｘｕ，Ｊ．、Ｂｕｒｂａｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｐ．Ａ．、Ｗａｎｇ，Ｌ．、Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ－Ｅｎａｂｌｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｈａｌｏａｌｋａｎｅ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１４，５３（８），２１９０～２１９３。（４）Ｆｕｒｍａｎ，Ｊ．Ｌ．、Ｋａｎｇ，Ｍ．、Ｃｈｏｉ，Ｓ．、Ｃａｏ，Ｙ．、Ｗｏｌｄ，Ｅ．Ｄ．、Ｓｕｎ，Ｓ．Ｂ．、Ｓｍｉｄｅｒ，Ｖ．Ｖ．、Ｓｃｈｕｌｔｓ，Ｐ．Ｇ．、Ｋｉｍ，Ｃ．Ｈ．、Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ａｚａ－Ｍｉｃｈａｅｌ Ａｃｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｃｒｏｓｓ－Ｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４，１３６（２３），８４１１～８４１７。（５）Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．、Ｈｏｐｐｍａｎｎ，Ｃ．、Ｙａｎｇ，Ｂ．、Ｗａｎｇ，Ｌ．、Ｕｓｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｎｆｉｎｅｄ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｔｏ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１６，１３８（４５），１４８３２～１４８３５。（６）Ｘｕａｎ，Ｗ．、Ｓｈａｏ，Ｓ．、Ｓｃｈｕｌｔｓ，Ｐ．Ｇ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｂｙ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ａｒｙｌ Ｃａｒｂａｍａｔｅ Ｓｉｄｅ Ｃｈａｉｎｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１７，５６（１８），５０９６～５１００。（７）Ｗａｎｇ，Ｎ．、Ｙａｎｇ，Ｂ．、Ｆｕ，Ｃ．、Ｚｈｕ，Ｈ．、Ｚｈｅｎｇ，Ｆ．、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．、Ｌｉｕ，Ｊ．、Ｌｉ，Ｓ．、Ｍａ，Ｃ．、Ｗａｎｇ，Ｐ．Ｇ．、Ｗａｎｇ，Ｑ．、Ｗａｎｇ，Ｌ．、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｏｓｕｌｆａｔｅ－Ｌ－Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｔｏ Ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ Ｌｙｓｉｎｅ、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，ａｎｄ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｖｉａ ＳｕＦＥｘ ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１８，１４０（１５），４９９５～４９９９。（８）Ｌｉｕ，Ｊ．、Ｌｉ，Ｓ．、Ａｓｌａｍ，Ｎ．Ａ．、Ｚｈｅｎｇ，Ｆ．、Ｙａｎｇ，Ｂ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｒ．、Ｗａｎｇ，Ｎ．、Ｒｏｚｏｖｓｋｙ，Ｓ．、Ｗａｎｇ，Ｐ．Ｇ．、Ｗａｎｇ，Ｑ．、Ｗａｎｇ，Ｌ．、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ Ｑｕｉｎｏｎｅ Ｍｅｔｈｉｄｅ ｔｏ Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１９，１４１（２４），９４５８～９４６２。（９）Ｘｕａｎ，Ｗ．、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｄ．、Ｋｏｈ，Ｍ．、Ｓｈａｏ，Ｓ．、Ｙａｏ，Ａ．、Ｘｉａｏ，Ｈ．、Ｇａｒｎｅｒ，Ｐ．、Ｓｃｈｕｌｔｓ，Ｐ．Ｇ．、Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｉｎｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１８，１３（３），５７８～５８１。（１０）Ｈｏｐｐｍａｎｎ，Ｃ．、Ｌａｃｅｙ，Ｖ．Ｋ．、Ｌｏｕｉｅ，Ｇ．Ｖ．、Ｗｅｉ，Ｊ．、Ｎｏｅｌ，Ｊ．Ｐ．、Ｗａｎｇ，Ｌ．、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ Ｃｌｉｃｋ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１４，５３（１５），３９３２～３９３６。（１１）Ｈｏｐｐｍａｎｎ，Ｃ．、Ｍａｓｌｅｎｎｉｋｏｖ，Ｉ．、Ｃｈｏｅ，Ｓ．、Ｗａｎｇ，Ｌ．、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｚｏ Ｂｒｉｄｇｅ ｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ ｂｙ Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｌｉｇｈｔ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１５，１３７（３５），１１２１８～１１２２１。（１２）Ｃｏｉｎ，Ｉ．、Ｋａｔｒｉｔｃｈ，Ｖ．、Ｓｕｎ，Ｔ．、Ｘｉａｎｇ，Ｚ．、Ｓｉｕ，Ｆ．Ｙ．、Ｂｅｙｅｒｍａｎｎ，Ｍ．、Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｒ．Ｃ．、Ｗａｎｇ，Ｌ．、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐａｔｈ ｏｆ Ｕｒｏｃｏｒｔｉｎ－Ｉ ｔｏ ＣＲＦ Ｃｌａｓｓ Ｂ ＧＰＣＲ．Ｃｅｌｌ ２０１３，１５５（６），１２５８～１２６９。（１３）Ｙａｎｇ，Ｂ．、Ｔａｎｇ，Ｓ．、Ｍａ，Ｃ．、Ｌｉ，Ｓ．Ｔ．、Ｓｈａｏ，Ｇ．Ｃ．、Ｄａｎｇ，Ｂ．、ＤｅＧｒａｄｏ，Ｗ．Ｆ．、Ｄｏｎｇ，Ｍ．Ｑ．、Ｗａｎｇ，Ｐ．Ｇ．、Ｄｉｎｇ，Ｓ．、Ｗａｎｇ，Ｌ．、Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｒｏｓｓ－Ｌｉｎｋｉｎｇ ｉｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７，８（１），２２４０。（１４）Ｄｏｎｇ，Ｊ．、Ｋｒａｓｎｏｖａ，Ｌ．、Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．、Ｓｕｌｆｕｒ（ＶＩ）Ｆｌｕｏｒｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ（ＳｕＦＥｘ）：Ａｎｏｔｈｅｒ Ｇｏｏｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１４，５３（３６），９４３０～９４４８。（１５）Ｃｈｅｎ，Ｗ．、Ｄｏｎｇ，Ｊ．、Ｐｌａｔｅ，Ｌ．、Ｍｏｒｔｅｎｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．、Ｂｒｉｇｈｔｙ，Ｇ．Ｊ．、Ｌｉ，Ｓ．、Ｌｉｕ，Ｙ．、Ｇａｌｍｏｚｚｉ，Ａ．、Ｌｅｅ．，Ｐ．Ｓ．、Ｈｕｌｃｅ，Ｊ．Ｊ．、Ｃｒａｖａｔｔ，Ｂ．Ｆ．、Ｓａｅｚ，Ｅ．、Ｐｏｗｅｒｓ，Ｅ．Ｔ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．、Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｗ．、Ａｒｙｌｆｌｕｏｒｏｓｕｌｆａｔｅｓ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ）Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＳｕＦＥｘ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｔｙｒ Ｒｅｓｉｄｕｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１６，１３８（２３），７３５３～７３６４。（１６）Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｈ．、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｏｓｕｌｆａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｂｅｓ．ＡＣＳ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１８，９（７），５８４～５８６。（１７）Ｚｈｅｎｇ，Ｑ．、Ｗｏｅｈｌ，Ｊ．Ｌ．、Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｓ．、Ｓａｎｔｏｓ－Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｄ．、Ｓｍｅｄｌｅｙ，Ｃ．Ｊ．、Ｌｉ，Ｇ．、Ｆｏｒｌｉ，Ｓ．、Ｍｏｓｅｓ，Ｊ．Ｅ．、Ｗｏｌａｎ，Ｄ．Ｗ．、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．、ＳｕＦＥｘ－Ｅｎａｂｌｅｄ，Ａｇｎｏｓｔｉｃ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｅｌａｓｔａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１９，１１６（３８），１８８０８～１８８１４。（１８）Ｌｉ，Ｑ．、Ｃｈｅｎ，Ｑ．、Ｋｌａｕｓｅｒ，Ｐ．Ｃ．、Ｌｉ，Ｍ．、Ｚｈｅｎｇ，Ｆ．、Ｗａｎｇ，Ｎ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｚｈａｎｇ，Ｑ．、Ｆｕ，Ｘ．、Ｗａｎｇ，Ｑ．、Ｘｕ，Ｙ．、Ｗａｎｇ，Ｌ．、Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇｓ ｖｉａ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ－Ｅｎａｂｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｅｌｌ ２０１７，１８２（１），８５～９７．ｅ１６。（１９）Ｌｉｕ，Ｊ．、Ｚｈｅｎｇ，Ｆ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｒ．、Ｌｉ，Ｓ．、Ｒｏｚｏｖｓｋｙ，Ｓ．、Ｗａｎｇ，Ｑ．、Ｗａｎｇ，Ｌ．、Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎ Ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ ａｎｄ Ｐａｌｌａｄｉｕｍ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１８，１４０（２８），８８０７～８８１６。（２０）Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｍ．、Ｈａｒａｄａ，Ｓ．、Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｓ．、Ｓａｔｏｗ，Ｙ．、Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．、Ｔｈｒｅｅ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ Ｓ－Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｕｌｆｏｎａｔｅ：Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ｃｙｓ１０ ａｎｄ Ｈｉｓ１０６．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８，２８１（１），１３５～１４７。（２１）Ｃｈａｒｔｒｏｎ，Ｊ．、Ｓｈｉａｕ，Ｃ．、Ｓｔｏｕｔ，Ｃ．Ｄ．、Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｋ．Ｓ．、３’－Ｐｈｏｓｐｈｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ－５’－Ｐｈｏｓｐｈｏｓｕｌｆａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎｅ：ａ Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ Ｓｎａｐｓｈｏｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｃｙｃｌｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００７，４６，３９４２～３９５１。（２２）Ｒｕｆｅｒ，Ａ．Ｃ．、Ｔｈｉｅｂａｃｈ，Ｌ．、Ｂａｅｒ，Ｋ．、Ｋｌｅｉｎ，Ｈ．Ｗ．、Ｈｅｎｎｉｎｇ，Ｍ．、Ｘ－Ｒａｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｆｒｏｍ Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ Ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ｉｎ ａ Ｎｅｗ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｆｏｒｍ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｓｅｃｔ Ｆ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２００５，６１（Ｐｔ３），２６３～２６５。（２３）Ｃｏｏｋ，Ｗ．Ｊ．、Ｊｅｆｆｒｅｙ，Ｌ．Ｃ．、Ｃａｒｓｏｎ，Ｍ．、Ｃｈｅｎ，Ｚ．、Ｐｉｃｋａｒｔ，Ｃ．Ｍ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｄｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｎｄ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｅ２）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，２６７（２３），１６４６７～１６４７１。（２４）Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｈ．、Ｘｉａｎｇ，Ｚ．、Ｈｕ，Ｙ．Ｓ．、Ｌａｃｅｙ，Ｖ．Ｋ．、Ｃａｎｇ，Ｈ．、Ｗａｎｇ，Ｌ．、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｉｃ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｐｌｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｎａｔｉｖｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１４，９（９），１９５６～１９６１。（２５）Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｋ．Ｒ．、Ｂａｇｃｈｉ，Ａ．、Ｒｏｏｖｅｒｓ，Ｒ．Ｃ．、ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎ ｅｎ Ｈｅｎｅｇｏｕｗｅｎ，Ｐ．Ｍ．Ｐ．、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＧＦＲ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ／ＶＨＨ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
，２０１３，２１（７），１２２４～１２２４。（２６）Ｗａｎｇ，Ｗ．、Ｔａｋｉｍｏｔｏ，Ｊ．Ｋ．、Ｌｏｕｉｅ，Ｇ．Ｖ．、Ｂａｉｇａ，Ｔ．Ｊ．、Ｎｏｅｌ，Ｊ．Ｐ．、Ｌｅｅ，Ｋ．－Ｆ．、Ｓｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｐ．Ａ．、Ｗａｎｇ，Ｌ．、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００７，１０（８），１０６３～１０７２。（２７）Ｌｕら、Ｆｒｅｅ．Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６６：７５～８７（２０１４）。

【0398】

本明細書に記載の実施例及び実施形態は例示目的のみのためであり、それを考慮した様々な修正又は変更が当業者に示唆され、本出願及び添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図25A】

【図25B】

【配列表】

2024512297000001.app

【国際調査報告】