特表 2024-512375 酵母のグリコシド阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-19

(54)【発明の名称】酵母のグリコシド阻害剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/064 20060101AFI20240312BHJP

   A61K 31/716 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 31/736 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240312BHJP

   A23L 33/145 20160101ALI20240312BHJP

【ＦＩ】

A61K36/064

A61K31/716

A61K31/736

A61P1/00

A61P31/04

A61P31/04 171

A61P1/00 171

A23L33/145

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023554878

(86)(22)【出願日】2022-03-15

(85)【翻訳文提出日】2023-11-02

(86)【国際出願番号】 FR2022050459

(87)【国際公開番号】W WO2022195212

(87)【国際公開日】2022-09-22

(31)【優先権主張番号】2102618

(32)【優先日】2021-03-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】506261567

【氏名又は名称】ルサッフル・エ・コンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＬＥＳＡＦＦＲＥ ＥＴ ＣＯＭＰＡＧＮＩＥ

(71)【出願人】

【識別番号】517124033

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・クレルモン・オーヴェルニュ

(71)【出願人】

【識別番号】518338518

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・リール

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＩＬＬＥ

(71)【出願人】

【識別番号】505351201

【氏名又は名称】セントレ ナシオナル デ ラ ルシェルシェ シエンティフィーク

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(74)【代理人】

【識別番号】100165157

【弁理士】

【氏名又は名称】芝 哲央

(74)【代理人】

【識別番号】100126000

【弁理士】

【氏名又は名称】岩池 満

(72)【発明者】

【氏名】バレー ナタリー

(72)【発明者】

【氏名】ヴァンデカークコーヴ パスカル

(72)【発明者】

【氏名】ゲラーデル ヤン

(72)【発明者】

【氏名】ユー シン－イー

(72)【発明者】

【氏名】シヴィニョン アデリン

(72)【発明者】

【氏名】バルニック ニコラス

【テーマコード（参考）】

4B018

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B018LB10

4B018LE01

4B018LE02

4B018LE03

4B018MD33

4B018MD81

4B018ME11

4B018ME14

4B018MF01

4B018MF03

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA20

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA52

4C086NA14

4C086ZA66

4C086ZB35

4C086ZC61

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC12

4C087NA14

4C087ZA66

4C087ZB35

4C087ZC61

(57)【要約】

本出願は、β（１，６）－グルカン、好ましくはマンナンおよびα－グルカンも含む酵母多糖類の組成物に関し、前記酵母多糖類が酵母壁断片の抽出物であることを特徴とする。典型的には、β－グルカンはβ－（１，６）－グルカンである。本発明はまた、酵母壁組成物を分画し、不溶性画分を抽出する少なくとも１つのステップと、ステップａ）において得られた不溶性画分から可溶性画分を抽出する少なくとも１つのステップとを含む、このような組成物を得るための方法にも関する。本出願は最後に、病原性微生物に関連する胃腸病状の治療のための、ヒトまたは獣医学的治療目的を有する組成物、ならびに腸の快適性を改善するためのその非治療的使用にも関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

β（１，６）－グルカンを含む酵母多糖類の組成物であって、前記酵母多糖類は酵母細胞壁断片から抽出されることを特徴とする、組成物。

【請求項2】

酵母はサッカロミセス属の酵母から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

酵母は、サッカロミセス・セレビシエ種の酵母から選択され、特に、番号ＣＮＣＭ Ｉ－３７９９、ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６、ＣＮＣＭ Ｉ－４４０７、ＣＮＣＭ Ｉ－４５６３、ＣＮＣＭ Ｉ－４８１２、ＣＮＣＭ Ｉ－４９７８、ＣＮＣＭ Ｉ－５１２８、ＣＮＣＭ Ｉ－５１２９、ＣＮＣＭ Ｉ－５２６８、およびＣＮＣＭ Ｉ－５２６９としてＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに寄託された株のいずれかから得られる、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

５～２５％、特に１０～２０％のα－グルカンと、
３０～５０％、特に３５～４５％のβ－グルカンと、
３０～５５％、特に４０～５０％のマンナンと
を含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載された酵母多糖類の組成物。

【請求項5】

ａ）酵母細胞壁の組成物を分画し、その最後に不溶性画分を収集する少なくとも１つのステップと、
ｂ）ステップａ）において得られた不溶性画分から可溶性画分を弱酸溶液中で抽出する少なくとも１つのステップと
を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の酵母組成物を得るための方法。

【請求項6】

薬物としての使用のための、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物、または請求項５に記載の方法によって得られた組成物。

【請求項7】

病原性微生物に関連する胃腸病状の治療のための、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物、または請求項５に記載の方法によって得られた組成物。

【請求項8】

前記組成物は獣医学的用途のためである、請求項６または７に記載の使用のための組成物。

【請求項9】

前記病原性微生物は、腸粘膜に関連する大腸菌（粘膜関連大腸菌）である、請求項７または８に記載の使用のための組成物。

【請求項10】

ヒトもしくは動物における、胃腸の快適性を改善すること、および／または腸内細菌叢を改善することを目的とした食品組成物を調製するための、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物、または請求項５に記載の方法によって得られた組成物の非治療的使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、酵母細胞壁多糖類の組成物を得るための方法、および胃腸病状（ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）の治療または腸の快適さを改善することを目的とした栄養補助食品（ｆｏｏｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）の調製のためのその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

微生物叢の炎症促進性細菌種と抗炎症性細菌種の不均衡、ならびに特定の細菌科（腸内細菌科、フソバクテリウム）の優勢または他の種（クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ））の希少性は、慢性炎症性腸疾患（ＣＩＢＤ）を有する人々において説明されている。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）の特殊化された株も、下痢、食中毒、尿路感染症、敗血症および髄膜炎の原因となる（Ｋａｐｅｒ Ｊ．Ｂ．， Ｎａｔａｒｏ Ｊ．Ｐ．， Ｍｏｂｌｅｙ Ｈ．Ｌ． － Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００４， ２， １２３－１４０）。さらに、現在、多くの研究により、腸内微生物叢が結腸直腸がんのリスクを調節し得る主要な環境要因であるという概念が支持されている。したがって、微生物叢の共生細菌は直接的に発がん性がある可能性がある。これは、例えば、コリバクチンと呼ばれる遺伝毒性物質を腸管腔内においてインビボ（生体内、ｉｎ ｖｉｖｏ）で産生する特定の大腸菌の株の場合であり、このコリバクチンは、電離ガンマ線による照射によって誘発されるのと同様に腸細胞にＤＮＡ損傷を誘発する（Ｃｕｅｖａｓ－Ｒａｍｏｓ Ｇら、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉｄｕｃｅｓ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」）。ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ２０１０， １０７， １１５３７－１１５４２）。

【0003】

例えば、国際公開第２００６／０２１９６５号に記載されているように、多くの微生物がヒトの消化管への有益な適用およびそれらの栄養価について既に文献に記載されている。次いでこれらの微生物は、一般にプロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）という用語で呼ばれており、これは、十分な量で投与された場合に宿主に健康上の利点を提供できる生きている微生物に相当する（Ｊｏｉｎｔ ＦＡＯ／ＷＨＯ Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ， Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ ｆｏｏｄ， ＦＡＯ Ｆｏｏｄ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｐａｐｅｒ Ｎｏ．８５， ＩＳＢＮ ９２－５－１０５５１３－０）。

【0004】

より具体的には、腸内細菌科に関連する病状を治療するためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母の使用が知られている。したがって、先願の仏国特許第２９２８６５２号は、酵母株Ｓ．セレビシエ（ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６、ＳｃＰｒｏｌ）が、特にこれらの微生物によるコロニー形成および／または腸内への侵入を抑制（ｌｉｍｉｔ）することによって、病原性微生物に関連する胃腸病状の治療にとって治療的および予防的関心となっていることを教示している。特に、この酵母の投与は結腸内の腸内細菌科の減少につながる。この結果は、酵母株（ＳｃＰｒｏｌおよび／またはＳＣＢ１）から抽出されたマンノプロテインが豊富な画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）が、主要なＣＩＢＤの１つであるクローン病に関連する大腸菌株（ＡＩＥＣ（接着性侵入性大腸菌）株）によるヒト上皮細胞の接着および侵入をインビトロ（試験管内試験、ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で阻害できることを示す。また、Ｓｉｖｉｇｎｏｎらの研究（Ｉｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ． ２０１５； ２１（２）：２７６－２８６）による研究は、ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６株由来の細胞壁化合物が、クローン病を模倣したマウスモデルにおいてＡＩＥＣ細菌による腸管定着（腸内コロニー形成、ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）および関連する大腸炎の症状を軽減することも教示している。腸壁へのＡＩＥＣの接着を阻害すると、腸組織へのＡＩＥＣの侵入が大幅に減少し、したがってその感染力が大幅に減少する。

【0005】

近年、酵母の細胞壁から単離されたグルカンにますます注目が集まっている。したがって、酵母細胞壁グルカンは、正常または低下している免疫学的機能を有するヒトおよび動物において免疫応答を強化または刺激するために使用されている（Ｇ． Ｈｅｔｌａｎｄ． Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． － Ａｎｔｉ－ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ ２００３， ２：１３５；Ｐ．Ｊ． Ｒｉｃｅ， Ｂ．Ｅ． Ｌｏｃｋｈａｒｔ， Ｌ．Ａ． Ｂａｒｋｅｒ， Ｅ．Ｌ． Ａｄａｍｓ， Ｈ．Ｅ． Ｅｎｓｌｅｙ， Ｄ．Ｌ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ． Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２００４， ３３：８２９）。特許出願の国際公開第２００９／１０３８８４号は、酵母細胞壁β－グルカン（特にＣＮＣＭ Ｉ－３８５６株）が腸炎を抑制することをより具体的に教示している。Ｊａｗａｈａｒａら（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１２； ７（７）：ｅ４０６４８）は、Ｓ．セレビシエ酵母（特にＬＹＳＣ ３１８．２株）のβ－グルカン画分が、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）の病原性作用を阻害できることをさらに開示している。最後に、Ｐｅｎｇｋｕｍｓｒｉら（Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ， Ｃａｍｐｉｎａｓ ２０１７， ３１（１）：１２４－１３０）は、β－グルカン画分がヒト大腸炎の治療に有用であり得る免疫調節特性を有することを開示している。

【0006】

本発明者の知る限り、現在、ＣＩＢＤに対する満足のいく治療法はまだ存在していない。小腸の損傷部分を切除する外科手術が考慮されることもあるが、これは頻繁に再発する、身体に障害をもたらす手術である。したがって、一般に、炎症（ステロイド性または非ステロイド性抗炎症薬および炎症性サイトカインを標的とする抗体による）および慢性疼痛（典型的にはカンナビノイドなどの鎮痛薬による）などの症状のみが治療される。疾患が進行性である患者では、医師は、発作を止め、新たな病変の出現を防ぎ、慢性炎症状態に関連する腫瘍発生のリスクを防ぐために、免疫調節療法を迅速に開始する。しかしながら、これらの治療はまた、中長期的に重大な副作用を伴う。したがって、コルチコステロイド（Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）の使用はますます少なくなっている。したがって、一方では既存の予防的治療を開発および改善し、健康な対象の腸の快適性を改善することを可能にし、他方ではリスクのある対象の病状の発症を予防し、ＣＩＢＤなどの胃腸病状に罹患している患者に効果的で耐用性が高い治療法を開発することが不可欠である。

【発明の概要】

【0007】

したがって、胃腸病状、特に感染性因子に関与する病状に罹患している患者の生活の質を改善する有効性を高める新しい解決策を特定する（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）ために、革新的なアプローチを継続することが依然として重要である。特に、抗接着（ａｎｔｉ－ａｄｈｅｓｉｏｎ）作用および／または抗侵入作用に関してより大きな有効性を有する新しい活性成分（有効成分、ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ）または組成物を特定することは、非常に重要であろう。

【0008】

β－グルカンおよび／またはα－グルカンおよび／またはマンナンを含む酵母多糖類の組成物が提案され、当該酵母多糖類は酵母細胞壁から抽出されることを特徴とする。典型的には、β－グルカンはβ（１，６）－グルカンである。いくつかの実施形態では、組成物はマンナンおよびα－グルカンをさらに含む。特に、本特許出願は、５～２５％、特に１０～２０％のα－グルカン、３０～５０％、特に３５～４５％のβ－グルカン（特にβ６－グルカン）、および３０～５５％、特に４０～５０％のマンナンを含む組成物を提案する。典型的には、酵母はサッカロミセス属の酵母の中から選択される。したがって、それらは、番号ＣＮＣＭ Ｉ－３７９９、ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６、ＣＮＣＭ Ｉ－４４０７、ＣＮＣＭ Ｉ－４５６３、ＣＮＣＭ Ｉ－４８１２、ＣＮＣＭ Ｉ－４９７８、ＣＮＣＭ Ｉ－５１２８、ＣＮＣＭ Ｉ－５１２９、ＣＮＣＭ Ｉ－５２６８およびＣＮＣＭ Ｉ－５２６９としてＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託された株、ならびにＣｏｌｌｅｚｉｏｎｅ ｄｅｉ Ｌｉｅｖｉｔｉ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉ（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｙｅａｓｔｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された株ＤＢＶＰＧ ６７６３を含む群から選択され得る。

【0009】

別の態様によれば、酵母組成物を得るための方法であって、
ａ）酵母細胞壁の組成物を（典型的には高温インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）によって）分画し（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅ）、不溶性画分（「不溶性画分ａ」と呼ばれる）を収集（抽出）する少なくとも１つのステップと、
ｂ）不溶性画分ａ）から可溶性画分（「可溶性画分ｂ」と呼ばれる）を抽出する少なくとも１つのステップであって、前記画分は、β－グルカン（特にβ６－グルカン）、好ましくはまたマンナンおよび一般にα－グルカンを含有し、このステップは、典型的には、可溶性画分ａ）を弱酸溶液中でインキュベートし、可溶性画分（「可溶性画分ｂ」）を収集（抽出）する少なくとも１つのステップを含む、ステップと
を含む、方法が提供される。

【0010】

典型的には、この方法は、不溶性酵母細胞壁画分を得る予備ステップを含む。

【0011】

この方法は、好ましくは、不溶性画分ａ）を強塩基溶液中でインキュベートし、その後、不溶性画分（不溶性画分ａ１と呼ばれる）を収集するステップａ１）を含む。この中間ステップが実施されると、次いで上記のステップｂ）の弱酸溶液中でインキュベートされた画分（または組成物）は「不溶性画分ａ１」となる。

【0012】

本開示はまた、胃腸病状の治療および／または予防における使用のための、本特許出願に記載されるβ－グルカン、マンナン、およびα－グルカンを含む酵母多糖類の組成物、特に本明細書に記載される方法に従って得られる酵母多糖類の組成物にも関する。

【0013】

本発明は最後に、胃腸の快適性を改善すること、および／または腸内細菌叢の恒常性を改善し、維持することを目的とした食品組成物を調製するための、本開示で定義される組成物、特に本明細書に記載される方法に従って得られる組成物の非治療的使用に関する。

【0014】

以下の段落で説明される特徴は、任意選択で実施することができる。それらは、互いに独立してまたは互いに組み合わせて実施することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

他の特徴、詳細、および利点は、以下の詳細な説明を読み、添付の図面を分析することにより明らかになるであろう。

【0016】

【図1】実施される様々なプロトコルを例示する図である。上の図（Ａ）は、酵母全体または酵母細胞壁からの異なる酵母多糖類画分の抽出を例示する。下の図（Ｂ）は、異なる酵母多糖類画分が酵母細胞壁から抽出される本発明の方法に対応する。

【図2】Ｔ８４およびＣａｃｏ－２腸上皮細胞に対するプレインキュベーションプロトコルの図である。酵母から抽出された画分は、まずＡＩＥＣ細菌とインキュベートされ、次に上皮に組織化された腸上皮細胞の培養物に添加される。次に、細菌株ＡＩＥＣ ＬＦ８２の残留接着レベルを、酵母画分の濃度を減少させて推定する（１；０．５；０．２５；０．１ｍｇ／ｍＬ）。

【図3】「可溶性画分ａ」（ホスホペプチドマンナン抽出プロトコルのため、フェーリング（Ｆｅｈｌｉｎｇ）マンナンとも呼ばれる）（画分１、「可溶性画分ａ」とも呼ばれる）、または酵母株ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６全体から得られた「可溶性画分ｂ」（画分３）の存在下でのＴ８４細胞に対する株ＡＩＥＣ ＬＦ８２の残留接着レベル（パーセンテージ）（プレインキュベーションプロトコル）（平均±ＳＥＭ；^＊＊：ｐ＜０．０１、^＊＊＊：ｐ＜０．００１、ｔ検定）。

【図4】酵母株ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６全体から得られたβ３－グルカン－ホスフェート（画分６）の存在下でのＴ８４細胞に対する株ＡＩＥＣ ＬＦ８２の残留接着レベル（パーセンテージ）（プレインキュベーションプロトコル）（平均±ＳＥＭ；^＊＊：ｐ）＜０．０１、ｔ検定）。

【図5】酵母株ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６全体またはＣＮＣＭ Ｉ－３８５６酵母細胞壁から得られた「可溶性画分ｂ」（画分３）の存在下でのＴ８４細胞に対する株ＡＩＥＣ ＬＦ８２の残留接着レベル（パーセンテージ）（プレインキュベーションプロトコル）（平均±ＳＥＭ；^＊：ｐ＜０．０５；^＊＊：ｐ＜０．０１；^＊＊＊：ｐ＜０．００１；ｔ検定）。

【図6】ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６酵母細胞壁またはＣＮＣＭ Ｉ－５２６８酵母細胞壁から得られた「可溶性画分ｂ」（画分３）の存在下でのＴ８４細胞に対する株ＡＩＥＣ ＬＦ８２の残留接着レベル（パーセンテージ）（プレインキュベーションプロトコル）（平均±ＳＥＭ；^＊：ｐ＜０．０５；^＊＊：ｐ＜０．０１；^＊＊＊：ｐ＜０．００１；ｔ検定）。

【図7】ＣＮＣＭ Ｉ－５２６８酵母細胞株に由来する「可溶性画分ｂ」（画分３）、α－グルカン（画分５）、またはβ６－グルカン（画分４）の存在下でのＴ８４細胞に対するＡＩＥＣ ＬＦ８２細胞の残留接着レベル（パーセンテージ）（プレインキュベーションプロトコル）（平均±ＳＥＭ；^＊：ｐ＜０．０５；^＊＊＊：ｐ＜０．００１；ｔ検定）。

【図8】酵母株ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６全体もしくは酵母株ＬＶ０４から得られた「可溶性画分ａ」（画分１）、または酵母株ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６全体、もしくはＣＮＣＭ Ｉ－５２６８酵母細胞壁から得られた「可溶性画分ｂ」（画分３）の存在下でのＴＣ７／Ｃａｃｏ－２に対する株ＡＩＥＣ ＬＦ８２の残留接着レベル（パーセンテージ）（プレインキュベーションプロトコル）（平均±ＳＥＭ；^＊＊：ｐ＜０．０１、^＊＊＊：ｐ＜０．００１、ｔ検定）。

【図9】ＣＮＣＭ Ｉ－５２６８酵母細胞壁に由来する「可溶性画分ｂ」（画分３）の存在下での細菌株ＡＩＥＣ ＬＦ８２によるＴＣ７／Ｃａｃｏ－２細胞の残留侵入レベル（パーセンテージ）（プレインキュベーションプロトコル）。

【図10】マウス（ＡＩＥＣ定着のマウスモデル）における酵母画分（ＹＦ：酵母画分）についてのインビボ投与プロトコルを表すグラフ。酵母画分を５ｍｇ／マウスの用量で経口投与する。試験した画分：酵母株ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６全体から得られた「可溶性ａ」（画分１）、または酵母株ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６全体もしくはＣＮＣＭ Ｉ－５２６８酵母細胞壁から得られた「可溶性ｂ」（画分３）。

【図11】投与された酵母画分の関数としての、動物の感染から２または３日後のマウスの糞便中のＡＩＥＣ ＬＦ８２細菌の数の推定。結果は、糞便１ｇあたりのＡＩＥＣ細菌数として示される（箱ひげ図、最小値から最大値まで）（ＷＦ：細胞壁画分）。

【図12】感染から４日後の、酵母画分による、処置マウスまたは未処置マウスの腸粘膜に関連するＡＩＥＣ ＬＦ８２細菌の定量。結果は、組織１ｇあたりのＡＩＥＣ細菌数（箱ひげ図、最小値から最大値まで）（ＷＦ：細胞壁画分）で示される。

【発明を実施するための形態】

【0017】

図面および以下の説明の大部分は、本質的に確実である要素を含む。したがって、それらは本開示のより良い理解を提供するのに役立ち得るだけでなく、必要に応じてその定義にも寄与し得る。

【0018】

本出願における「約」は、示された数値に対して２０％、特に１５％、１０％、または５％の変動以内を意味すると理解される。一例として、「約１００℃の温度」という表現は、８０℃～１２０℃、特に８５℃～１１５℃、より特には９０℃～１１０℃、好ましくは９５℃～１０５℃の温度として理解されるべきである。

【0019】

本出願の発明者らは、酵母細胞壁断片の組成物を得ることができる新しい方法を開発し、特に細菌接着および侵入、特に接着性および侵入性の大腸菌（ＡＩＥＣ）を阻害する際のその組成物の有効性は、先行技術に記載されている酵母全体または誘導体と比較して顕著に増加している。

【0020】

より具体的には、本発明者らは、全く驚くべき方法で、酵母細胞壁断片（酵母壁または細胞壁とも呼ばれる）から抽出された酵母多糖類の組成物が、多糖類が酵母全体から得られる酵母多糖類組成物よりも大幅に優れている接着および細菌侵入阻害活性を示すことを実証した。また驚くべきことに、特にβ１，６－グルカン、ならびに必要に応じてマンナンおよびα－グルカンを含有する本発明による酵母多糖類組成物も、以前に記載されているマンナン画分よりも高い活性を示す。腸細胞の表面上に発現した糖タンパク質によって露出されたマンノシド構造（ｍａｎｎｏｓｉｄｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）は、１型線毛（ｐｉｌｉ）の表面上に露出された線毛構造（ＦｉｍＨ）を介して細菌細胞への付着だけに関与していると考えられていたため、この結果は予想外である（Ｂａｒｎｉｃｈ ｅｔ ａｌ．ＪＣＩ，２００７）。

【0021】

したがって、本開示は、β－グルカンを含む酵母細胞壁多糖類の組成物に関する。典型的には、β－グルカンは、β（１，６）－グルカン（以下、特に実施例ではβ６－グルカンとも呼ばれる）を含む。典型的には、前記組成物はマンナンおよび／またはα－グルカンをさらに含む。

【0022】

酵母細胞は、殻または壁とも呼ばれるエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）、および内容物から概略的に構成される。したがって、本出願では、本明細書に記載される多糖類または酵母断片を修飾する用語「壁側」、「殻」、または「壁」は同義的に使用される。したがって、「細胞壁多糖類」という用語は、酵母の壁（または殻）を構成する多糖類を意味する。

【0023】

多糖類の３つの主な群が、特にサッカロミセス・セレビシエ酵母において酵母細胞壁を形成する。酵母細胞壁の乾燥質量の約４０％を占めるマンノース（またはマンナン）のポリマーと、細胞壁の乾燥質量の約６０％を占めるグルコースのポリマー（β－グルカンおよびα－グルカン）と細胞壁の乾燥質量の約２％を占めるＮ－アセチルグルコサミン（キチン）のポリマーと、である。

【0024】

グルカンは、分岐していても分岐していなくてもよいグルコースモノマーから構成される多糖類である。それらは、グルコースの結合様式に応じて異なるサブタイプに分類され得る。α－グルカンは、主にα結合（１－４）によって結合されるグルコースモノマーのポリマーである。

【0025】

酵母β－グルカンは、グルコースモノマーから構成される多糖類であり、グルコースの結合様式に応じて２つのサブタイプに分類され得る。酵母β－グルカンの約８５％を占める約１５００のβ－１，３－グルコース単位の長鎖、および酵母β－グルカンの約１５％を占める約１５０のβ－１，６－グルコース単位の短鎖である（Ｋｌｉｓ，Ｆ．，Ｍｏｌ，Ｐ．，Ｈｅｌｌｉｎｇｗｅｒｆ，Ｋ．ａｎｄ Ｂｒｕｌ，Ｓ．（２００２）”Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ”． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２６，２３９－２５６）。

【0026】

β－１，６－グルカンの短鎖は、β－１，３－グルカン、マンノプロテイン、およびキチンとの共有結合に関与している。これらの架橋はまた、細胞壁のモジュール構造にも寄与し得る（Ｋｏｌｌａｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）”Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ． β－（１，６）－ｇｌｕｃａｎ ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｓ ｍａｎｎｏｐｒｏｔｅｉｎ，β－（１，３）－ｇｌｕｃａｎ，ａｎｄ ｃｈｉｔｉｎ”． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０，１７７６２－１７７７５）。

【0027】

マンナンは、Ｎ－グリカンコアを介して結合されるマンノースのポリマーまたはオリゴマーである。特に、サッカロミセス・セレビシエ酵母マンナンは、末端α１，３を有するα１，２で分岐したα１，６マンノースのポリマーである（特にＳｅｎｄｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｓｃｉ（Ｐａｒｉｓ）．２００９；２５（５）：４７３－４８２を参照のこと）。本特許出願によるマンナンが豊富な画分は、少なくとも３０％のマンナン、特に少なくとも３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％のマンナンを含む。

【0028】

β６－グルカン画分は、β－１，６－グルカン多糖類が豊富な画分を意味すると理解される。典型的には、そのような画分は、少なくとも３０％のβ－１，６－グルカン、特に少なくとも３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％のβ－１，６－グルカンポリマーを含む。

【0029】

β３－グルカン画分は、β１，３－グルカンが豊富な画分を意味すると理解される。典型的には、そのような画分は、少なくとも３０％のβ－１，３－グルカンポリマー、特に少なくとも３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％のβ－１，３－グルカンポリマーを含む。

【0030】

α－グルカン（またはグリコーゲン）画分は、α１，４ α１，６グルカンが豊富な画分を意味すると理解される。典型的には、そのような画分は、少なくとも６０％のα１，４ α１，６グルカンポリマー、特に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％のα１，４－α１，６グルカンポリマーを含む。

【0031】

先行技術に記載され、典型的に酵母全体から得られる酵母多糖類組成物は、典型的には６０～８０％のα－グルカン、通常は６５～７５％のα－グルカン、５～２５％のβ－グルカン、通常は１０～２０％のβ－グルカン、および５～２５％のマンナン、通常は１０～２０％のマンナンを含む。

【0032】

本発明者らは、酵母細胞壁画分から得られた多糖類組成物が、β－グルカン、典型的にはβ６グルカンが豊富であり、好ましくはマンナンも豊富であることを示した。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、本発明者らは、酵母細胞壁画分から得られる組成物は、上記のように、α－グルカン、β－グルカン（特にβ－６グルカン）、およびマンナンから構成される、強力で非解離性の（ｎｏｎ－ｄｉｓｓｏｃｉａｂｌｅ）、典型的には共有結合によって結合した不均一なポリマーを含むと考えている。

【0033】

したがって、本発明の酵母多糖類組成物は、典型的には少なくとも３０％のβ－グルカン、特に３０～５０％のβ－グルカン、好ましくは３５～４５％のβ－グルカン、特にβ（１，６）－グルカンを含む。

【0034】

好ましくは、本開示の酵母多糖類組成物はマンナンをさらに含む。典型的には、本特許出願の組成物はマンナンが豊富であり、３０～５５％のマンナン、特に４０～５０％のマンナンを含むことができる。

【0035】

好ましくは、本開示による酵母多糖類組成物は、α－グルカン、特に５～２５％、特に１０～２０％のα－グルカンを含む。

【0036】

特定の実施形態では、前記組成物は、以下の割合の多糖類を含む。
５～２５％のα－グルカン、好ましくは１０～２０％のα－グルカンと、
３０～５０％のβ－グルカン、好ましくは３５～４５％のβ－グルカン、特にβ（１，６）－グルカンと、
３０～５５％のマンナン、好ましくは４０～５０％のマンナンと、を含む。

【0037】

本出願で使用される酵母の壁（または殻）は、１つまたは複数の種類の酵母に由来し得る。酵母は、真菌界（ｆｕｎｇｉ ｋｉｎｇｄｏｍ）に属する単細胞の真核微生物である。本開示を実施するのに特に適した酵母は、サッカロミセス属の酵母である。これらの酵母は、菌糸体を形成しない子嚢菌の分類学的属を構成し、食品産業において発酵剤として使用されるいくつかの種を含む。従来、サッカロミセス属に属する酵母は、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．ウヴァルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、またはＳ．パストゥリアヌス（Ｓ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）などの食品酵母の中から選択され得る。酵母は、好ましくは、サッカロミセス・セレビシエ種（ビール酵母または醸造用酵母またはパン酵母、Ｓ．セレビシエ・バー・ブラウディ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｖａｒ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉ））の株である。例えば、番号ＣＮＣＭ Ｉ－３７９９、ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６、ＣＮＣＭ Ｉ－４４０７、ＣＮＣＭ Ｉ－４５６３、ＣＮＣＭ Ｉ－４８１２、ＣＮＣＭ Ｉ－４９７８、ＣＮＣＭ Ｉ－５１２８、ＣＮＣＭ Ｉ－５１２９、ＣＮＣＭ Ｉ－５２６８、およびＣＮＣＭ Ｉ－５２６９としてＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに寄託されたサッカロマイセス・セレビシエ酵母株が、本開示に特によく適している。

【0038】

本開示の組成物は、異なる株または異なる種の１つまたは複数の酵母から得ることができる。

【0039】

本開示の組成物は、典型的には、細胞内容物（細胞質）から分離された酵母壁調製物または酵母壁断片から、特に酵母壁断片からの細胞壁多糖類の抽出によって得られる。酵母壁または酵母壁断片を得るための方法は、本開示の技術分野において周知である。これに関しては、参考文献”Ｙｅａｓｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，Ｇ．Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｔ．Ｗ．Ｎａｇｏｄａｗａｗｉｔｈａｎａ，Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄにより発行，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＩＳＢＮ０－４４４－３１８９２－８を参照することができる。

【0040】

簡潔に述べると、酵母細胞壁断片または酵母殻断片は、化学的（溶媒、酸、塩基）、物理的（超音波処理、高圧）、酵素的（典型的にはプロテアーゼおよびヌクレアーゼの使用）、または自己分解性（内在性酵素）である酵母細胞の溶解、その後の、例えば、遠心分離および不溶性画分（または部分）の収集などの物理的手段による可溶性部分および不溶性の分離によって得ることができる。典型的には、溶解した酵母細胞バイオマスの遠心分離により、上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）および遠心分離ペレットが得られる。上清は主に、タンパク質の分解によって生じる遊離アミノ酸およびペプチド、ならびに核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）の分解によって生じるヌクレオチドから構成される。遠心分離ペレットは、内容物が空になった酵母細胞の形態で無傷または部分的に分解された酵母壁を含有する。

【0041】

酵母の自己分解（ａｕｔｏｌｙｓｉｓ）は、酵母自身の酵素による酵母の細胞内容物の加水分解である。これは典型的には、酵母細胞の懸濁液を特定の物理的培地条件下に置くか、ならびに／または酵母細胞のアポトーシスおよびその酵素の細胞体への放出を引き起こす活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ）と接触させることによって得られる。細胞内容物の加水分解により、可溶性化合物が生成される。分離ステップの後に収集された不溶性画分は、酵母細胞壁と呼ばれる生成物を構成し、酵母細胞骨格ならびに自己分解または異種溶解（ｈｅｔｅｒｏｌｙｓｉｓ）によって可溶化されなかった膜および成分を含む。この不溶性画分は、多くの場合、水性酵母細胞壁懸濁液（または組成物）の形態で回収される。

【0042】

酵母細胞壁は、液体形態（１５～２０％の乾燥物質）、乾燥形態（８５％超の乾燥物質）、またはペースト形態（２５～８５％の乾燥物質）であり得る。酵母細胞壁は、好ましくは乾燥形態で存在する。いくつかの実施形態では、ＣＮＣＭ Ｉ－５２６８酵母の壁断片が、本明細書に記載される組成物および／または方法の例として使用される。

【0043】

本明細書に記載される本発明を実施するために、同じ種類の酵母または異なる種類（株）もしくは異なる種の酵母に由来する、酵母の細胞壁もしくは殻、またはそれらを含む任意の組成物を使用することができる。

【0044】

本開示はまた、上記の酵母細胞壁多糖類の組成物を得るための方法にも関する。好ましくは、当該方法は特に以下を含む。
（ａ）酵母細胞壁の組成物を分画し、不溶性画分を収集する少なくとも１つのステップ、特に酵母細胞壁の組成物からの不溶性画分（本特許出願の実施例において「不溶性画分ａ」とも呼ばれる）の熱抽出の少なくとも１つのステップ、および
（ｂ）弱酸溶液中で抽出する少なくとも１つのステップ、典型的には、「不溶性画分ａ」を弱酸溶液中でインキュベートし、その後、可溶性画分（「可溶性画分ｂ」と呼ばれる）を収集するステップ。

【0045】

典型的には、当該方法は、酵母細胞壁画分を収集することからなる予備ステップを含む。実際には、このステップは典型的には、上述したように、酵母加水分解物（特に酵母自己溶解物（ａｕｔｏｌｙｓａｔｅ））から不溶性画分を得ることによって行われる。このステップは特に、壁に結合しないか、または弱く結合する化合物の全部または一部（少なくとも６０％、特に少なくとも７５％、より特には少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、さらにより特には少なくとも９５％）を除去することを目的とする（これに関しては、上記の酵母細胞壁画分を得るための方法を参照のこと）。

【0046】

熱抽出（または熱加水分解）のステップａ）は、典型的に、７５℃を超える温度、特に８０～１８０℃、より特には９０～１５０℃、より特には９５～１４５℃で、中性ｐＨに緩衝化された溶液中での酵母細胞壁断片の高温インキュベーションによって実施され得る。典型的には、約１２０℃の温度である。中性ｐＨは、約７のｐＨ、特に６～８のｐＨを意味すると理解される。高温インキュベーションは、典型的には少なくとも３０分間、特に少なくとも１時間、典型的には１時間～４時間、または１時間～３時間維持される。好ましくは、インキュベーションは約１．５時間維持される。緩衝液は典型的には、クエン酸緩衝液（約２０ｍＭ）に基づく溶液、または現場での任意の他の同等の緩衝液である。インキュベーション後、可溶性画分および不溶性画分は、典型的には遠心分離によって分離され、不溶性画分（不溶性ａ）が収集される。典型的には、遠心分離は、４０００～６０００ｒｐｍ、好ましくは約５０００ｒｐｍの速度で、少なくとも２０分間、特に２０分～４０分、好ましくは約３０分間実施され得る。このステップは２～４回、好ましくは２回繰り返すことができる。この熱加水分解ステップの最後に収集される可溶性画分は、典型的には、細胞壁多糖類と強く結合していない（典型的には非共有結合的に結合している）ホスホペプチドマンナンを含む。

【0047】

この方法は、好ましくは、強塩基溶液中で不溶性画分を抽出するステップａ１）を含み、典型的には、ステップａ）の最後に得られた不溶性画分（「不溶性画分ａ」と呼ばれる）を強塩基溶液でインキュベートし、その最後に不溶性画分（「不溶性画分ａ１」と呼ばれる）を収集するステップを含む。この中間ステップが実施されると、上記のステップｂ）の弱酸溶液中でインキュベートされた画分（または組成物）は、次いで「不溶性画分ａ１」になる。

【0048】

強塩基溶液中で抽出するステップａ１）は、典型的には、強塩基溶液中で不溶性画分ａ）をインキュベートするステップを含む。強塩基溶液は、典型的には、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）または任意の他の等価物の溶液であり、好ましくは約１Ｎに濃縮される。強塩基溶液中でのインキュベーションは、典型的には、室温、好ましくは１６～２４℃、特に約２０℃で行われる。それは理想的には、少なくとも１６時間、典型的には、１６時間～３２時間、好ましくは２４時間、撹拌しながら行われる。次いで、可溶性画分および不溶性画分は、典型的には遠心分離によって分離され、不溶性画分ａ１）が回収される。典型的には、遠心分離は、５０００～８０００ｒｐｍ、好ましくは約７０００ｒｐｍの速度で、少なくとも２０分間、特に２０～４０分間、好ましくは約３０分間行うことができる。遠心分離の後に高温インキュベーションステップが続く。本発明者らは、このステップにより残留ホスホペプチドマンナンを除去できると考えている。

【0049】

弱酸溶液中で抽出するステップｂ）は、典型的には、弱酸溶液中で「不溶性画分ａ」または「ａ１」（強塩基中で抽出する中間ステップが実施されている場合）をインキュベートするステップを含む。弱酸溶液は、典型的には、酢酸または任意の他の等価物の溶液であり、好ましくは約０．５Ｎに濃縮される。弱酸溶液中でのインキュベーションは、典型的には、少なくとも７０℃、特に７５℃～１３０℃、より特には７５～１１５℃、より特には約９０℃の温度で行われる。それは理想的には、好ましくは撹拌しながら、少なくとも１時間、典型的には２～４時間、好ましくは３時間行われる。次いで、可溶性画分および不溶性画分は、好ましくは遠心分離によって分離され、可溶性画分（可溶性画分ｂと呼ばれる）が収集される。典型的には、遠心分離は、４０００～６０００ｒｐｍ、好ましくは約５０００ｒｐｍの速度で、少なくとも２０分間、特に２０～４０分間、好ましくは約３０分間行うことができる。このステップは、少なくとも２回、特に少なくとも３回、４回、５回、６回、７回、８回、特に３～８回繰り返される。

【0050】

典型的には、本特許出願の方法の遠心分離ステップは、室温、好ましくは１６～２４℃、特に約２０℃で行われる。

【0051】

典型的には、本明細書に記載されるプロトコルに従って得られる「可溶性画分ｂ」は、β－グルカン、特にβ－６グルカン、好ましくはまたマンナン（上記で定義した通り）が豊富な画分である。このような画分はまた、典型的には、α－グルカンも含有する。したがって、本発明の方法は、特に上述したような組成物を得ることが可能であり、本明細書で特許請求されるような有利な効果を有する。

【0052】

β３－グルカン画分（すなわち、典型的には、上記のようにβ－３グルカンが豊富である）は、不溶性画分（「不溶性画分ｂ」とも呼ばれる）が、ステップｂ）の最後に収集される場合、本開示に従って酵母細胞壁断片（殻）から得ることができることに留意されたい。同様に、このステップｂ）は、少なくとも２回、特に少なくとも３回、４回、５回、６回、７回、８回、特に３～８回繰り返すことができる。

【0053】

特定の実施形態では、β６－グルカンが豊富な画分（好ましくは少なくとも６０％、特に少なくとも６５、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％のβ６－グルカンを含有する）は、ステップｂ）の最後に得られる可溶性画分（「可溶性画分ｂ」）から得ることができる。したがって、β６－グルカンの単離された画分は、例えば、典型的にはアミログルコシダーゼ（例えば、アルペルギウス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来）を用いた酵素処理によって得ることができる。しかしながら、好ましくは、ステップｂ）の終わりに得られる可溶性画分（「可溶性画分ｂ」）は、ヨウ素溶液で処理することができる（実施例に示すように）。ヨウ素溶液中でのインキュベーションは、典型的には室温（好ましくは１６～２４℃、特に約２０℃）で行われる（それは理想的には、少なくとも１５分間、典型的には２０～４５分間、好ましくは３０分間、撹拌しながら行われる）。ヨウ素溶液での処理後、次に可溶性画分および不溶性画分は、典型的には遠心分離によって分離され、可溶性画分（「可溶性画分ｃ」とも呼ばれる）が収集される。典型的には、遠心分離は、４０００～６０００ｒｐｍ、好ましくは約５０００ｒｐｍの速度で、少なくとも２０分間、特に２０～４０分間、好ましくは約３０分間行うことができる。次いで、エタノール溶液を上清に添加することができ、溶液を以前と同じ条件下で遠心分離することができる。強酸の濃縮溶液（典型的には少なくとも２Ｎ、好ましくは約３Ｎに濃縮された塩酸溶液）をペレットに添加して、β６－グルカンおよびα－グルカン複合体を解離させ、次いで沈殿させる（エタノールまたは任意の等価物を用いた従来の方法において）。この２番目の方法により、単離されたβ６－グルカンおよびα－グルカンが豊富な画分を収集することが可能になる（結果に記載されている方法も参照のこと）。

【0054】

上記に示したように、本発明者らによって得られたデータは、酵母細胞壁から得られた「可溶性画分ｂ」が、ＡＩＥＣ型病原性細菌の接着を非常に顕著に阻害し、その結果、腸組織においてＡＩＥＣ（接着性侵入性大腸菌）細菌の侵入を大幅に減少させ、したがってそれらの感染力を大幅に減少させることを示した。ＡＩＥＣはまた、ＣＥＡＣＡＭ６として知られるマンノースが豊富な糖タンパク質に結合することによって腸細胞に接着することも示されている。したがって、ヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質を発現するトランスジェニックマウスは、ＡＩＥＣ感染に対して非常に感受性が高くなるが、この病原型は一般にげっ歯動物に対してあまり毒性がない（ｖｉｒｕｌｅｎｔ）。酵母株または同定された酵母誘導体に感染したマウスの処置により、ＡＩＥＣ細菌による消化管の定着が減少したので、インビトロデータを検証した。

【0055】

いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、本発明者らは、本明細書に記載される「可溶性画分ｂ」は、アルファ（１－４）および（１－６）グルコシド単位ならびにマンノシド単位を含むと考えており、これは、結合構造の提示または３Ｄ立体構造にとって重要である。そのため、そのような画分によって腸壁への細菌の接着を効果的に阻害することが可能になる。

【0056】

したがって、本特許出願は、本明細書に記載され、および／または本開示の方法に従って得られる有利な活性を示す組成物の医薬としての使用に関する。特に、本明細書に記載される組成物は、胃腸病状または疾患の治療または予防に特に適している。前記組成物は、典型的には、好ましくはサッカロミセス属の酵母細胞壁から得られ、β－グルカン（特にβ６グルカン）、有利にはマンナンも豊富な組成物である。好ましくは、前記組成物は少なくとも３０％のβ－グルカンを含み、有利には少なくとも３０％のマンナンを含む。

【0057】

本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」という用語は、疾患および／または疾患の任意の症状、特に胃腸疾患、腸障害または機能性腸障害を、治癒、軽減、回復、改善し、および／または影響を与えることを目的として、それを必要とする患者への本明細書に記載される組成物の投与として定義される。特に、「治療する」または「治療」という用語は、疾患に関連する少なくとも１つの望ましくない臨床症状、例えば、疼痛、炎症、下痢、悪心もしくは嘔吐、食欲不振、または疲労の低減または軽減を示す。本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防」という用語は、疾患の発症もしくはその症状の少なくとも１つを予防すること、および／またはその症状の少なくとも１つの重症度を低減することを目的として、それを必要とする患者への本明細書に記載される組成物の投与として定義される。

【0058】

特定の実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載される病状の治療または予防のための臨床栄養学において使用することができる。

【0059】

患者は、典型的には、哺乳動物、特にヒトであることを意味すると理解される。場合によっては、患者は寛解状態にあってもよく、本特許出願による組成物の投与は、再発の予防または抑制、特に再発の事象における疾患または機能性障害の症状のうちの少なくとも１つの重症度の低減を目的としてもよい。

【0060】

特定の実施形態では、本発明の組成物は、獣医学的使用、典型的には動物の健康を目的とする。このような実施形態では、患者は非ヒト哺乳動物であり、典型的には、飼育動物もしくは愛玩動物（ネコまたはイヌなど）または家畜（反芻動物、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ロバなど）の中から選択される。

【0061】

本特許出願の対象となる胃腸病状は、慢性的であってもなくてもよく、下痢または便秘に関連している可能性がある。それらには、典型的には、機能性腸障害、感染性腸疾患、結腸直腸がんおよび／または炎症性腸疾患が含まれる。

【0062】

機能性腸障害には、特に、過敏性腸症候群、機能性腹部膨満、機能性便秘、機能性下痢、および任意の他の不特定の機能性腸障害が含まれる（特に、Ｐ．ｄｅ Ｓａｕｓｓｕｒｅ ＆ Ｄ Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ；Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ ２００６；ｖｏｌｕｍｅ ２．３１６４９，”Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ ｅｖｉｄｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ”を参照のこと）。感染性腸疾患には、典型的には、ウイルス、細菌、または寄生生物が原因の胃腸炎、食中毒、および／または下痢が含まれる。慢性炎症性腸疾患（ＣＩＢＤ）には、典型的には、クローン病および潰瘍性大腸炎が含まれる。

【0063】

本特許出願の組成物は、病原性微生物による胃腸定着を阻止し、腸粘膜への接着を減少させ、さらには病原性微生物に対する腸のバリア機能を強化するのに特に有用である。試験組成物とのプレインキュベーションの有無にかかわらず、Ｔ８４株などの腸上皮培養物、または患者の腸生検から得られた腸細胞への病原性微生物の接着を阻害するための試験は、特に本出願の結果ならびに国際公開第２００９／１０３８８４号の出願およびＳｉｖｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．（ＩＢＤ，２０１５，ｖｏｌ ２１（２）：２７６－２８６）による論文に記載されている。

【0064】

上記に示したように、感染性胃腸病変、ならびにＣＩＢＤおよび結腸直腸がんは一般に、病原性微生物の存在および／または特定の病原性微生物の侵入性に関連する腸内細菌叢の不均衡（腸内毒素症）と関連している（Ｒａｈｍｏｕｎｉ Ｏ，Ｄｕｂｕｑｕｏｙ Ｌ，Ｄｅｓｒｅｕｍａｕｘ Ｐ，Ｎｅｕｔ Ｃ．”Ｅｎｔｅｒｉｃ ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ”．Ｍｅｄ Ｓｃｉ（Ｐａｒｉｓ）．２０１６ Nov；３２（１１）：９６８－９７３；Ｋａｐｅｒ Ｊ．Ｂ．，Ｎａｔａｒｏ Ｊ．Ｐ．，Ｍｏｂｌｅｙ Ｈ．Ｌ．－Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ），Ｃｕｅｖａｓ－Ｒａｍｏｓ Ｇ ｅｔ ａｌ．，”Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎｄｕｃｅｓ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ”． ＰＮＡＳ ＵＳＡ，２０１０，１０７，１１５３７－１１５４２を参照のこと）。

【0065】

一般に、本特許出願では、本明細書に記載される組成物が、特に上記に列挙した病状に対して、胃および／または腸粘膜への付着および侵入、ならびに関連する炎症を低減するのに特に有用であることが示されている。

【0066】

本明細書に記載される組成物が標的とする病原性微生物は、典型的には、腸内病原体であり、典型的には、腸内細菌科の細菌種（サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、クレブシエラ属菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、セラチア属菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐｐ．）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）など）、クロストリディオイデス・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）種の細菌、またはカンジダ・アルビカンス種の酵母、有利には、細胞への接着に１型線毛接着性ＦｉｍＨ（ａｄｈｅｓｏｎ、ａｄｈｅｓｉｏｎ）が関与する細菌がある。結腸粘膜に関連する大腸菌（粘膜関連大腸菌）が好ましくは標的とされ、特に以下の種類の大腸菌：ＡＩＥＣ（接着性侵入性大腸菌）、ＥＴＥＣ（腸内毒素原性大腸菌）、ＥＩＥＣ（腸管侵入性大腸菌）、ＥＰＥＣ（腸管病原性大腸菌）、ＥＨＥＣ（腸管出血性大腸菌）、ＥＡＥＣ（腸管凝集性大腸菌）、ＤＡＥＣ（びまん性接着性大腸菌）、ＵＰＥＣ（尿路病原性大腸菌）が標的とされる。特定の実施形態では、コリバクチン産生大腸菌は、特に結腸直腸がんに罹患しているか、結腸直腸がんに罹患していたか、または結腸直腸がんを発症するリスクがある患者において特に興味深い。

【0067】

本特許出願はまた、腸の快適性の改善もしくは維持、および／または腸内細菌叢の改善を目的とした、栄養補給食品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）、栄養補助食品、または機能性食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ）の形態での、上記の組成物の非治療的使用にも関する（典型的には、病原性共生細菌による腸内定着を抑制することによる）。腸の快適性の改善または維持は、特に、ヒトまたは動物において、腸の膨満を抑制もしくは予防すること、空気嚥下を抑制もしくは予防すること、および／または消化を調節することを意味すると理解される。

【0068】

本特許出願による組成物は、酵母細胞壁から抽出された活性画分（上記の多糖類細胞壁画分から構成され、好ましくは記載される方法に従って得られる）に加えて、製薬分野において、または栄養補助食品、栄養補給食品もしくは機能性食品の製剤化のために従来的に使用されており、前記活性画分（すなわち、β－グルカン、マンナンおよび酵母細胞壁のα－グルカン、特に一例として示される「可溶性画分ｂ」）と化学的に適合する、任意の賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）、担体、および／またはアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）を含んでもよい。例えば、本発明の組成物は、ビタミン、微量元素、アミノ酸、ならびに栄養摂取および／または動物もしくはヒトの健康を目的とした他の添加剤の中から選択される成分を含んでもよい。

【0069】

機能性食品または栄養補給食品は、有益な健康効果を有するか、または生理学的機能、特に本明細書では消化器の健康を改善できる成分を含む食品を意味すると理解される。栄養補助食品は、ＥＵ指令２００２／４６／ＥＣに従って、通常の食事を補うことを目的とした食品を意味すると理解される。栄養補助食品は、少量で単独または組み合わせて摂取すると、栄養学的または生理学的効果を有する栄養素または他の物質の濃縮源を構成する。特定の栄養を目的とした食品は、乳児、幼児、または運動選手などの明確に定義された集団群を対象とした、特定の栄養目的を備えた食品を意味すると理解される。

【0070】

生理学的に許容されるアジュバント、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）、および賦形剤は、典型的には、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」，second ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９４に記載されている。本発明に従って医薬組成物を製剤化するために、当業者はまた、有利には、欧州薬局方または米国薬局方（ＵＳＰ）の最新版を参照することができる。一般的に使用される担体、賦形剤、およびアジュバントには、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、防腐剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ）、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ）、ならびに吸収遅延剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0071】

組成物は、薬物もしくは活性成分として、または非治療的使用の状況において、典型的には栄養補助食品として使用され得る。次いで活性画分の配合および用量は、選択された用途に適合される。

【0072】

治療用途の状況において、組成物は経口または腸内投与用に製剤化され得る。

【0073】

医薬組成物または栄養補助食品の状況において、本発明による食品の組成物は、液体形態またはカプセル、糖衣錠、丸薬（錠剤、ｐｉｌｌ）、粉末、座薬、または任意の他の投薬製剤の形態などの異なる剤形であってもよい。機能性食品として、本発明による食品の組成物は、多種多様な食品および飲料の形態、例えばジュースまたは乳ベースの調製物で提供され得る。

【実施例】

【0074】

〔材料および方法〕
〔フェーリング溶液による「可溶性画分ａ」ホスホペプチドマンナンを抽出するための方法〕
１．５０ｇの酵母を３００ｍＬの０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、オートクレーブ中で１２１℃、９０分間滅菌した。
２．５０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離する。上清を収集する。
３．ペレットを３００ｍＬの０．０２Ｍクエン酸緩衝液に懸濁し、再度１２１℃で９０分間オートクレーブ処理する。次に、再度遠心分離して上清およびペレットを分離する。
４．２つの上清を一緒に合わせる（ＸｍＬ）。
５．同量のフェーリング溶液（ＸｍＬ）を上清に加え、４℃で一晩撹拌する。沈殿物が形成される。ホスホペプチドマンナン－銅複合体は灰色がかっている青色である。５０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して沈殿物を収集する。
６．１００ｍＬの３Ｎ ＨＣｌを沈殿物に加え、次いで沈殿物が溶解するまで４℃で撹拌する。銅複合体が分解し、溶液が緑色に変わる。
７．３００ｍＬのエタノールを加えてホスホペプチドマンナンを沈殿させ、４℃で一晩撹拌する。５０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して沈殿物（白色）を収集する。
８．ホスホペプチドマンナンの沈殿物を５０ｍＬの水に溶解する。４℃で一晩水に対して透析（ＭＷＣＯ３５００）する。次いで、透析したマンナンを乾燥させ、凍結乾燥させる。

【0075】

〔フェーリング溶液の調製（新たに使用した緩衝液ＡとＢを混合する）〕
〔緩衝液Ａ〕
１．３５ｇの硫酸銅（ＩＩ）。５Ｈ_２Ｏを３００ｍＬのＨ_２Ｏに溶解する。
２．５ｍＬの２Ｎ硫酸を加える。
３．水を５００ｍＬに加える。
〔緩衝液Ｂ（腐食性）〕
１．７７ｇの水酸化ナトリウム＋１７５ｇの酒石酸カリウムナトリウム。
２．Ｈ_２Ｏを５００ｍＬに加える。

【0076】

参考文献：Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｙｅａｓｔ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｍａｎｎａｎ （１９６９） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖ．１００，ｐ１１７５。

【0077】

〔「可溶性画分ｂ」の取得：高温希酢酸溶液によるβ１，３グルカンおよびβ１，６グルカン（グリコーゲン、すなわちα－グルカンを含む）の分離〕
１．５０ｇの酵母全体または酵母細胞壁画分（高温クエン酸緩衝液で抽出後の不溶性画分、「不溶性画分ａ」とも呼ばれる）から得られたペレットを１Ｌの１Ｎ ＮａＯＨ溶液中に収集し、次いで室温で２４時間撹拌して、ホスホペプチドマンナン残留物を除去する。
２．７０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した後、ペレット（不溶性画分ａ１）を収集する。ペレットを１Ｌの水で洗浄し、再度遠心分離し、ペレットを保存する。
３．ペレットを８００ｍＬの０．５Ｎ酢酸で抽出し、９０℃の温度で３時間撹拌する。冷却させた後、７０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離する。上清およびペレットを保存する。ペレットを９０℃で３時間撹拌しながら８００ｍＬの０．５Ｎ酢酸で再度抽出し、その後新たに遠心分離する。
４．５Ｌの上清（主にグリコーゲンおよびβ６－グルカンから構成され、「可溶性画分ｂ」とも呼ばれる）を収集するまで、ステップ３を少なくとも５回繰り返す。上清をＮａＯＨ溶液で中和し、水エバポレーターによって濃縮した。次いで、水に対して４℃で一晩透析（ＭＷＣＯ３５００）する。得られた画分は可溶性画分ｂを構成する。この画分の分析により、グルカンポリマーに強く結合した（すなわち、熱抽出ステップによって解離されない）β－６グルカン、α－グルカン（グリコーゲン）、およびマンナンが含まれることが実証される。
５．ペレット（主にβ３グルカンから構成される）を水に対して４℃で一晩透析する。
６．透析試料を凍結乾燥させる。

【0078】

〔参考文献〕
１．Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂ（１－＞３）－Ｄ－ｇｌｕｃａｎ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，ｖ．１３５，ｐ１９。
２．Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｗａｌｌ ｇｌｕｃａｎ ｏｆ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ （２００４） Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，ｖ．３３９，ｐ２２５５。

【0079】

〔グリコーゲンおよびβ６－グルカンの分離〕
１．５００ｍｇ量の「可溶性画分ｂ」の組成物を５０ｍＬの作業溶液に添加する。撹拌した後、室温で３０分間静置させる。赤茶色の顆粒が形成される（グリコーゲン－ヨウ素沈殿物）。
２．室温、５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。上清およびペレットを保存する。５０ｍＬの作業溶液を上清に加え、次いで１００ｍＬのエタノールを加え、室温で３０分間撹拌する。
３．再度遠心分離する。顆粒（ペレット１、主にグリコーゲン）を単一の画分に合わせる。上清にさらに６００ｍＬのエタノールを加え、室温で３０分間撹拌する。淡黄色の顆粒が形成される。
４．遠心分離して顆粒（ペレット２、主にβ６－グルカン）を収集する。
５．グリコーゲンからヨウ素を解離するために、１００ｍＬの３Ｎ ＨＣｌをペレット１に加え、ペレット１が溶解する（茶色の溶液）まで撹拌する。次いで３００ｍＬのエタノールを加え、室温で３０分間撹拌する。次いで黒紫色の顆粒が形成される。遠心分離し、ペレットを保存する。次いで、さらに１００ｍＬの３Ｎ ＨＣｌを加えて錠剤を溶解する。さらに３００ｍＬのエタノールを加え、室温で３０分間撹拌すると、白い球が形成される。遠心分離し、顆粒（ペレット３、グリコーゲン）を保存する。
６．ペレット２および３をそれぞれ５０ｍＬの水に溶解する。次いで水に対して４℃で一晩透析する。
７．透析試料を凍結乾燥させる。

【0080】

〔作業溶液（ヨウ素）の調製〕
１．１６６．５ｍＬの水中に、４．３５ｇのヨウ素および４３．５ｇのヨウ化カリウムを溶かす。
２．１０．５ｍＬの飽和ＣａＣｌ_２溶液を加える。

【0081】

参考文献：Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒｏｉｌｅｒ ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｉｖｅｒ （２００７） Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖ．８６，ｐ．２６５３。

【0082】

〔使用した酵母〕
ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６：番号ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６として寄託された生サッカロミセス・セレビシエ酵母
ＬＶ０４サッカロミセス・セレビシエビール酵母全体（Ｌｅｓａｆｆｒｅ内部収集）
酵母ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６（ＦＰ Ｉ－３８５６）の細胞壁画分（殻）
酵母ＣＮＣＭ Ｉ－５２６８（ＦＰ Ｉ－５２６８）の細胞壁画分（殻）。

【0083】

〔酵母全体または酵母細胞壁（細胞壁画分）の組成物から得た試験画分〕
可溶性ｂ
β６－グルカン
グリコーゲン
β３－グルカンリン酸
ホスホペプチドマンナン（フェーリングホスホペプチドマンナンまたは「マンナン」とも呼ばれる）。

【0084】

〔プレインキュベーションについてのプロトコル（図２を参照）〕
接着試験：試験は、４８ウェルプレートに１．５×１０^５細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ_２を含む雰囲気下で、３７℃で４８時間インキュベートしたＴ８４またはＣａｃｏ－２／ＴＣ７細胞に対して実施した。１．２×１０^７ＣＦＵ／ｍＬのＡＩＥＣ ＬＦ８２細菌を、Ｓｔｕａｒｔ（登録商標）オービタルシェーカーで室温にて、酵母試料の濃度を増加させながら（１：１比）、１時間インキュベートした。４８時間の培養後、細胞を細菌／酵母抽出物混合物に３７℃、５％ＣＯ_２を含む雰囲気下で３時間感染させた。細胞は、１０細菌／細胞の感染多重度で感染した。平均接着率（少なくとも３回の独立した実験から得られる）を残留接着パーセンテージとして表し、これは酵母の存在下での細菌接着と、１００％とみなされる酵母の非存在下での接着との比である。エラーバーは平均値の標準誤差またはＳＥＭに対応する。

【0085】

侵入試験：プロトコルは接着試験のプロトコルと同じである。しかしながら、３時間のインキュベーション期間の後、細胞外細菌を除去し、侵入細菌のみをカウントするために、細胞をゲンタマイシン（１００μｇ／ｍＬ）と１時間インキュベートする。

【0086】

〔結果〕
最初に、全ての画分をＴ８４細胞への接着のプロトコルで試験した。次に、Ｃａｃｏ－２／ＴＣ７細胞に対して侵入プロトコルで追加の試験を実施した。

【0087】

図３に示すように、ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６酵母全体由来の「可溶性ａ」（ホスホペプチドマンナン）画分は、Ｔ８４上皮細胞へのＡＩＥＣ細菌の接着を顕著に阻害する。しかしながら、驚くべきことに、この同じ酵母全体由来の「可溶性ｂ」画分も、ＡＩＥＣ細菌の接着に対して顕著な阻害活性を示す。

【0088】

図４は、ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６酵母全体由来のリン酸化β３－グルカン画分も、より中程度ではあるが、Ｔ８４上皮細胞へのＡＩＥＣ細菌の接着を顕著に阻害することを示す。

【0089】

図５は、酵母全体（ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６）またはこの同じ酵母の細胞壁画分から得られた「可溶性ｂ」画分の、Ｔ８４上皮細胞へのＡＩＥＣ細菌の接着に対する阻害活性の比較を示す。どちらも顕著な阻害活性を示すが、細胞壁画分から得られた画分は酵母全体から得られたものよりも高い活性を示す（１ｍｇ／ｍＬの用量での残留接着はそれぞれ１７％および４２％である）。これらの異なる活性は、「可溶性ｂ」画分の異なる組成と相関する。

【0090】

得られた結果が試料の細胞毒性活性に関連していないことを検証するために、可溶性画分ｂの用量を増加させて細胞毒性試験を実施した。細胞毒性効果は観察されなかった。

【0091】

図６は、２つの酵母細胞壁画分：ＣＮＣＭ Ｉ－５２６８またはＣＮＣＭ Ｉ－３８５６から得られた「可溶性ｂ」画分の、Ｔ８４上皮細胞へのＡＩＥＣ細菌の接着に対する阻害活性の比較を示す。非常に顕著な阻害活性がこれらの２つの画分で観察される。等用量の残留接着パーセンテージは同じ程度であるため、この結果は、阻害活性の増加が使用した菌株（ＣＮＣＭ Ｉ－５２６８対ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６）に直接関連しているのではなく、むしろ生産プロセスに関連していることを強く示唆している。換言すれば、酵母細胞壁画分から得られる「可溶性ｂ」画分は、酵母全体から得られる「可溶性ｂ」画分で観察されるものよりもはるかに強い、ＡＩＥＣ細菌の上皮細胞への接着に対する阻害活性を示す。

【0092】

図７は、ＣＮＣＭ Ｉ－５２６８酵母細胞壁画分から得られた「可溶性ｂ」画分、グリコーゲンまたはβ６－グルカンの存在下での、ＡＩＥＣ ＬＦ８２細菌のＴ８４上皮細胞への残留接着を示す。結果は、β６－グルカンは「可溶性ｂ」画分よりも効果が低く、グリコーゲン画分は中間の活性を有することを示す。「可溶性ｂ」画分が最も効果的な画分である。

【0093】

図８は、酵母全体（ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６、またはＬＶ０４）から得られたマンナン画分（フェーリングマンナン）、ＣＮＣＭ Ｉ３８５６酵母全体またはＣＮＣＭ Ｉ－５２６８酵母細胞壁画分から得られた「可溶性ｂ」画分の存在下での、ＴＣ７／Ｃａｃｏ－２細胞へのＡＩＥＣ ＬＦ８２細菌の残留接着（パーセンテージとして）を示す。これらの新しい結果は、Ｔ８４細胞で以前に得られた結果、すなわち酵母細胞壁画分から得られた「可溶性ｂ」画分が最大の阻害活性を有することを裏付ける。

【0094】

図９は、ＣＮＣＭ Ｉ－５２６８酵母の細胞壁画分から得られた「可溶性ｂ」画分の用量を増加させてプレインキュベートしたＡＩＥＣ ＬＦ８２細菌によるＴＣ７／Ｃａｃｏ－２細胞の侵入の強力な阻害を示す結果を示す。

【0095】

〔ＡＩＥＣ ＬＦ８２細菌株に感染したＣＥＡＢＡＣ１０トランスジェニックマウスにおける酵母画分の活性に関するインビボ研究〕
ＡＩＥＣ ＬＦ８２株による腸管の定着は、クローン病の状況においてＡＩＥＣ細菌の受容体として機能するヒトタンパク質ＣＥＡＣＡＭ６を発現するＣＥＡＢＡＣ１０トランスジェニックマウスで実施した。

【0096】

ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６ Ｓ．セレビシエ酵母抽出物が、ＡＩＥＣ ＬＦ８２細菌による結腸の定着を減少させ、したがって大腸炎の症状の軽減につながることが以前に示されている（Ｓｉｖｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．ＩＢＤ，２０１５）。

【0097】

現在、インビトロで試験した新しい画分について予備的な結果が得られている。

【0098】

適用されるプロトコルを図１０に示す。

【0099】

簡潔に述べると、酵母画分を－７日目から０日目までは１日１回、１日目から３日目までは１日２回（５時間間隔）経口投与した。画分を２５ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに可溶化し（毎日）、０．２ｍＬ／マウスの量を強制経口投与した（５ｍｇ／マウス）。－３日目から＋４日目まで、マウスに飲料水中の０．５％ＤＳＳを与えた。－１日目に、マウスをストレプトマイシン（５ｍｇ／マウス）で経口により処置した。

【0100】

同時に、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）培地にＡＩＥＣ ＬＦ８２細菌株を（１／１００で）接種し、対数増殖期まで撹拌しながら３７℃でインキュベートした。遠心分離後、細菌を２．５×１０^１０細菌／ｍＬに濃縮した。次いで、０．２ｍＬの量、すなわち５×１０^９細菌／ｍＬをマウスに強制経口投与（ｇａｖａｇｅ）した。

【0101】

感染後４日間、マウスの体重および大腸炎の症状をモニタリングした。細菌の定着を評価するために、感染後１、２、３、および４日目に糞便を採取した。

【0102】

感染後４日目にマウスを安楽死させ、粘膜（回腸＋結腸）に関連する細菌の定着（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を評価するために腸を摘出した。
試験した画分は以下の通りであった。
Ａ：未処置バッチ（ｎ＝１０）、
Ｂ：ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６酵母全体の可溶性画分ａ）（ｎ＝８）、
Ｃ：ＣＮＣＭ Ｉ－３８５６酵母全体の可溶性画分ｂ）（ｎ＝８）、
Ｄ：ＣＮＣＭ Ｉ－５２６８酵母細胞壁画分から得られた可溶性画分ｂ）（ｎ＝８）。

【0103】

図１１は、投与された酵母画分の関数として、感染後２日および３日のマウス糞便中の推定細菌数を示す。結果は、未処置群と比較してＣＮＣＭ Ｉ－５２６８酵母細胞壁画分から得られた可溶性画分ｂ）での処置に応答して糞便中の細菌の量が２５減少することを示しており、これは、前臨床モデルにおいてインビトロで実証されたこの画分の優れた抗接着特性を裏付けている。

【0104】

図１２は、感染４日後の、酵母画分で処置したマウスまたは未処置のマウスにおける腸粘膜に関連するＡＩＥＣ ＬＦ８２細菌の定量化を示す。結果は、ＣＮＣＭ Ｉ－５２６８酵母細胞壁画分から得られた可溶性画分ｂ）で処置したマウスの１００％に細菌が存在しないことを示し、したがって糞便中で得られた結果を裏付ける。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【国際調査報告】