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▶ ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-19
(54)【発明の名称】免疫療法のための高効力のＴ細胞受容体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240312BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240312BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240312BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240312BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240312BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240312BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240312BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240312BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240312BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240312BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/10
C07K19/00
A61K35/17
A61K35/12
A61K35/76
A61K45/00
A61K48/00
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023554926
(86)(22)【出願日】2022-03-04
(85)【翻訳文提出日】2023-11-07
(86)【国際出願番号】 US2022018975
(87)【国際公開番号】W WO2022192087
(87)【国際公開日】2022-09-15
(31)【優先権主張番号】63/158,131
(32)【優先日】2021-03-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＰＹＴＨＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】515158308
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100114557
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 英仁
(74)【代理人】
【識別番号】100078868
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 登夫
(72)【発明者】
【氏名】ガルシア，ケナン クリストファー
(72)【発明者】
【氏名】ザオ，シャン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZB26
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA02
4C087NA14
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）配列、そのような配列を発現する細胞、及びその使用方法が提供される。操作された受容体は、インビトロで変異誘発され、オフターゲット交差反応性を低減するために十分に低いｐＭＨＣ親和性の選択と組み合わせて、標的活性化効力のために選択される。いくつかの実施形態では、操作されたＴＣＲは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、ヒトＭＡＧＥ－Ａ３を認識する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＭＡＧＥ－Ａ３に特異的な操作されたαβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、Ｄ２８、Ａ３０、Ｉ５１、Ｑ５２、Ｓ５３、及びＳ５４から選択される１つ以上の残基において、標的活性化効力を増強するための少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、配列番号１のアルファ鎖又はその成熟バージョンを含み、
番号付けが成熟ポリペプチド配列に対して行われる、
操作されたαβＴ細胞受容体。
【請求項2】
ＭＡＧＥ－Ａ３及びＨＬＡ－Ａ１についての３Ｄ ｌｏｇ ＫＤ（μＭ）が、約０．５～約１００μＭである、請求項１に記載の操作されたαβＴＣＲ。
【請求項3】
ＴＣＲベータ鎖が、配列番号１６の配列又はその成熟バージョンを含む、請求項１又は２に記載の操作されたαβＴＣＲ。
【請求項4】
前記アミノ酸修飾が、Ｄ２８Ｈ、Ｄ２８Ｎ、Ｄ２８、Ｄ２８Ｋ、Ｄ２８Ｓ、Ａ３０Ｈ、Ａ３０Ｓ、Ａ３０Ｅ、Ａ３０Ｎ、Ａ３０Ｇ、Ｉ５１Ｖ、Ｑ５２Ｒ、Ｑ５２Ｈ、Ｓ５３Ｐ、Ｓ５４Ｙ、Ｓ５４Ｎ、Ｓ５４Ｒ、Ｓ５４Ｅ、Ｓ５４Ｄ、Ｓ５４Ｈのうちの１つ以上である、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作されたαβＴＣＲ。
【請求項5】
ＴＣＲαが、配列番号２～配列番号１５から選択される配列、又はそれに由来するバリアントを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作されたαβＴＣＲ。
【請求項6】
ＴＣＲαが、配列番号２～配列番号１５から選択される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたαβＴＣＲ。
【請求項7】
ヒトＨＬＡ－Ｂ３５及びＨＩＶペプチドに特異的な操作されたαβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、配列番号１７のアルファ鎖及び配列番号１８のベータ鎖を含み、配列番号１７ Ａ９８Ｄ、Ａ９８Ｅ、Ａ９８Ｆ、Ａ９８Ｑ、Ａ９８Ｙ、Ａ９８Ｈ及び配列番号１８ Ａ５０Ｄ、Ａ５０Ｅ、Ａ５０Ｆ、Ａ５０Ｈ、Ａ５０Ｎ、Ａ５０Ｑ、Ａ５０Ｓ、Ａ５０Ｔ、Ａ５０Ｙから選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、
操作されたαβＴ細胞受容体。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載のＴＣＲアルファ鎖又はＴＣＲベータ鎖をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項9】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項10】
ＴＣＲ配列が、プロモーターに作動可能に連結される、請求項９に記載のベクター。
【請求項11】
宿主細胞ゲノムに組み込まれる、請求項９又は１０に記載のベクター。
【請求項12】
請求項８に記載のポリヌクレオチド又は請求項９～１１に記載のベクターを含む、操作された細胞。
【請求項13】
請求項８に記載のポリヌクレオチド又は請求項９～１１に記載のベクターを含む、治療有効用量の操作された細胞集団。
【請求項14】
前記ポリヌクレオチドが、細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１２又は１３に記載の操作された細胞又は細胞集団。
【請求項15】
細胞がＴ細胞である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の操作された細胞又は細胞集団。
【請求項16】
細胞が、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ９、ＴＨ１１、ＴＨ２２、ＴＦＨ、調節性Ｔ細胞、例えば、ＴＲ１、天然ＴＲｅｇ、誘導性ＴＲｅｇ、メモリＴ細胞、例えば、セントラルメモリＴ細胞、エフェクターメモリＴ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞から選択される、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の操作された細胞又は細胞集団。
【請求項17】
ＭＡＧＥ－Ａ３発現がんについて個体を治療する方法であって、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の有効量の操作された細胞集団を前記個体に投与することを含み、
操作された細胞によるがん細胞の殺傷が増加する、方法。
【請求項18】
治療が、追加のがん療法と組み合わせられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記がんが、メラノーマである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項20】
前記がんが、メラノーマ、小細胞肺がん、血液悪性腫瘍、乳房、皮膚、神経膠腫、神経芽細胞腫、腸、結腸直腸、卵巣、及び腎臓の新生物から選択される、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項21】
低減したオフターゲット交差反応性と組み合わせて、標的活性化効力についてＴＣＲのバリアントを選択する方法であって、最適化のためにＴＣＲ配列のＣＤＲループ上の所定のアミノ酸残基にアミノ酸変動を含むポリヌクレオチド配列のライブラリを生成することと、
発現のために前記ライブラリを哺乳類Ｔ細胞に導入することと、
同族抗原の標識されたｐＭＨＣ多量体を前記Ｔ細胞に結合することと、
約０．１～約１００ｍＭの３Ｄ ｌｏｇ ＫＤ（μＭ）に対応する低レベルの結合を選択することと、
Ｔ細胞を活性化するために十分な期間の間、選択された細胞のプールを同族抗原源とともにインキュベートすることと、
高レベルの活性化を有するＴ細胞を選択することと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
適応免疫応答は、主要組織適合性分子によって提示されるペプチド（ｐＭＨＣ）のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識によって開始される。アゴニストｐＭＨＣとのＴＣＲの関与は、ＣＤ３免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化をもたらし、Ｔ細胞活性化をもたらす下流シグナル伝達のカスケードを開始する。ＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用の低い３Ｄ親和性（ＫＤ１－１００μＭ）にもかかわらず、Ｔ細胞応答の効力は、一般に、特定の相互作用の強度又は持続時間を反映することが示されている。
【0002】
ＴＣＲシグナル伝達は、ｐＭＨＣに対するＴＣＲの親和性以外のパラメータによって影響を受ける。例えば、力依存性相互作用は、アゴニストｐＭＨＣリガンドの特徴である。ＴＣＲは、アゴニストリガンドとのキャッチボンド（ｃａｔｃｈ ｂｏｎｄ）を形成し、その間、相互作用の結合寿命は力の下で延長される。キャッチボンドは、力の下での分子相互作用の正味の利得を表し、ＴＣＲ認識及びその後の活性化を関連付けるプルーフリーディング機構として組み込まれた動的多様性の更なるレベルを明らかにする。これは、ＴＣＲライゲーション及び活性化がＴＣＲリガンド識別を調節するために結合又は分離することができるトリガー機構を提供する。
【0003】
腫瘍抗原に対する操作された特異性を有するＴリンパ球の養子移入は、かかる治療を受ける患者において強力な抗腫瘍活性を有する、がんを標的とするための有望なアプローチである。しかしながら、ほとんどの腫瘍抗原は自己タンパク質に由来するため、天然の高親和性腫瘍特異的Ｔ細胞を単離することは困難であり、受容体配列は、エクスビボ操作によって増強されなければならない。
【0004】
しかしながら、重要なことに、ＴＣＲ抗原親和性のかなりの増加が、ピコモル範囲まで下がっても報告されているが、この親和性レベルは、治療誘発毒性のリスクを増加させ得る。場合によっては、毒性は、「オンターゲット」の反応性と関連しており、標的抗原が、正常細胞、例えば、メラノーマ抗原を発現するメラノサイトにおいて発現される。
【0005】
親和性成熟は、また、ＴＣＲが、がん細胞の外部の組織上の他のペプチド－ＭＨＣ分子に交差反応する可能性を増加させ、オフターゲット毒性及び場合により患者の有害事象又は死亡をもたらす。これは、ヒト腫瘍抗原ＭＡＧＥ－Ａ３を標的とする親和性成熟ＴＣＲで実証されており、これらのＴＣＲ－Ｔ細胞は、タイチンと呼ばれる心臓ペプチドと交差反応し、患者に致命的な結果をもたらしている。
【0006】
この問題は、ＴＣＲは通常、低い親和性を有し、腫瘍上に発現されるもののような自己抗原を発現する細胞を殺傷しないため、全てのＴＣＲ－Ｔ療法の自然な制限である。本開示は、この問題に対処するスクリーニング方法及び有用なＴＣＲ配列を提供する。
【発明の概要】
【0007】
操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）配列、かかる配列を発現する細胞、及びその使用方法が提供される。操作された受容体は、インビトロで変異誘発され、オフターゲット交差反応性を低減するために十分に低いｐＭＨＣ親和性の選択と組み合わせて、標的活性化効力のために選択される。ｐＭＨＣ親和性は、適切なウィンドウ内に含まれ、この閾値レベルを超えると、有効性及び特異性が損なわれる。いくつかの実施形態では、操作されたＴＣＲを発現する細胞は、がんを治療するための養子Ｔ細胞療法に使用される。いくつかの実施形態では、操作されたＴＣＲは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、ヒトＭＡＧＥ－Ａ３を認識する。いくつかの実施形態では、ＴＡＡは、ヒトＨＬＡ－Ａ１の文脈で認識される。
【0008】
いくつかの実施形態では、ＭＡＧＥ－Ａ３に特異的な操作されたＴＣＲは、シグナル配列を欠く配列番号１のアルファ鎖（ＴＣＲα）又はその成熟バージョンを含み、標的活性化効力を増強するための少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、修飾は、Ｄ２８、Ａ３０、Ｉ５１、Ｑ５２、Ｓ５３及びＳ５４（成熟タンパク質配列に対する番号付け）から選択される１つ以上の残基で行われる。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｄ２８Ｈ／Ｎ／Ｇ／Ｋ／Ｓ、Ａ３０Ｈ／Ｓ／Ｅ／Ｎ／Ｇ、Ｉ５１Ｖ、Ｑ５２Ｒ／Ｈ、Ｓ５３Ｐ、Ｓ５４Ｙ／Ｎ／Ｒ／Ｅ／Ｄ／Ｈから選択される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲαは、配列番号２～配列番号１５から選択される配列、又はそれに由来するバリアントを有する。バリアントは、配列番号２～１５の参照配列に対する少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性を含み得る。かかる実施形態のうちのいずれかでは、ベータ鎖（ＴＣＲβ）は、シグナル配列を欠く、配列番号１６に示される配列又はその成熟バージョンを有し得る。ＭＡＧＥ－Ａ３操作されたＴＣＲは、ヒトタイチン配列に対して顕著な親和性を有しない。
【0009】
操作されたＴＣＲ、例えば、ＭＡＧＥ－Ａ３に特異的なＴＣＲは、約０．５～約１００ｍＭの３Ｄ ｌｏｇ ＫＤ（μＭ）を有し得、約１～約１００μＭ、約１～約５０μＭであり得る。操作されたＴＣＲは、抗原に応答するＴ細胞増殖、抗原に応答するＩＬ－２の放出、抗原に応答するＴ細胞上のＣＤ６９の上方調節などを含むが、これらに限定されない、任意の好都合なアッセイによって測定される標的活性化効力のために望ましく選択される。
【0010】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＣＲは、ＴＣＲ５５アルファ鎖（配列番号１７）及びＴＣＲ５５ベータ鎖（配列番号１８）のアミノ酸修飾に基づいて、ＨＬＡ－Ｂ３５によって提示されるＨＩＶペプチドに特異的である。アミノ酸修飾としては、Ｂ３５－ＨＩＶによってＴＣＲ５５を活性化させるための配列番号１７ Ａ９８Ｄ、Ａ９８Ｅ、Ａ９８Ｆ、Ａ９８Ｑ、Ａ９８Ｙ、Ａ９８Ｈが挙げられるが、これらに限定されない。ＴＣＲ５５ベータ鎖（配列番号１８）におけるアミノ酸修飾としては、Ｂ３５－ＨＩＶによってＴＣＲ５５を活性化させるためのＡ５０Ｄ、Ａ５０Ｅ、Ａ５０Ｆ、Ａ５０Ｈ、Ａ５０Ｎ、Ａ５０Ｑ、Ａ５０Ｓ、Ａ５０Ｔ、Ａ５０Ｙが挙げられるが、これらに限定されない。
【0011】
いくつかの実施形態では、通常、ＴＣＲα及びＴＣＲβ配列の両方の導入によって修飾される、操作されたＴＣＲコード配列の導入によって細胞が修飾された、操作された細胞が提供される。いかなる細胞も、この目的のために使用できる。いくつかの実施形態では、細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ９、ＴＨ１１、ＴＨ２２、ＴＦＨ、調節性Ｔ細胞、例えばＴＲ１、天然ＴＲｅｇ、誘導性ＴＲｅｇ、メモリＴ細胞、例えば、セントラルメモリＴ細胞、エフェクターメモリＴ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞及びＣＡＲ－Ｔ細胞を含むかかるＴ細胞の操作されたバリアントなどを含むが、これらに限定されないＴ細胞である。他の実施形態では、操作された細胞は、幹細胞、例えば、造血幹細胞、リンパ球前駆細胞などである。いくつかの実施形態では、細胞は、対象に導入する前にエクスビボ手順において遺伝子修飾される。操作された細胞は、療法のための単位用量で提供され得、意図されたレシピエントに関して同種異系、自家などであり得る。コード配列の導入は、任意の適切なベクター、例えば、ウイルスベクター、組み込みベクターなどを使用して、インビボ又はインビトロで行うことができる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を含むが、これに限定されない遺伝子編集システムを使用して、配列を操作された細胞のゲノムに組み込む。
【0012】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＴＣＲ配列をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターが提供され、コード配列は、所望の細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的又は誘導性であり得る。例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ミニサークルベクターなどの様々なベクターが、当該技術分野において既知であり、この目的のために使用することができ、これらのベクターは、標的細胞ゲノムに組み込むことができるか、又はエピソームにより維持することができる。ベクターは、キットで提供され得る。
【0013】
いくつかの実施形態では、治療方法が提供され、方法は、それを必要とするレシピエントに有効量の操作された細胞集団を導入することを含み、細胞集団は、本明細書に開示される操作されたＴＣＲをコードする配列の導入によって修飾されている。細胞集団は、エクスビボで操作され得、通常、レシピエントに関して自家又は同種異系である。レシピエントは、操作された細胞集団の投与によってがんの治療を受けることができる。レシピエントは、当技術分野で既知の免疫療法、化学療法、放射線療法、手術などを含む追加の治療組成物又はモダリティと組み合わせて、操作された細胞集団で治療され得る。導入されたＴ細胞は、同族抗原を発現する標的化細胞の殺傷を増加させ得る。
【0014】
いくつかの実施形態では、オフターゲット交差反応性を低減するために十分に低いｐＭＨＣ親和性の選択と組み合わせて、標的活性化効力のためにＴＣＲのバリアント、例えば、ＴＣＲα又はＴＣＲβなどを選択する方法が提供され、このアプローチは、「キャッチボンドフィッシング」と称され得る。スクリーニングは、活性化効力が結合親和性から分離され得るという知見に基づいている。この方法によって、ｐＭＨＣ親和性は、オフターゲット毒性を低減するために適切なウィンドウ内に含まれるように選択される。
【0015】
最適化のための開始ＴＣＲは、既知の標的に対する既知の配列を含むが、これらに限定されない、目的の標的に特異的なＴＣＲであり得る。目的の抗原としては、限定されないが、例えば、患者に関連するＭＨＣの状況、例えば、ヒトＨＬＡ抗原において提示される、ＨＥＲ２、ＰＳＡ、ＴＲＰ－２、ＥｐＣＡＭ、ＧＰＣ３、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＭＡＧＥ、ＥＧＦＲなどを含む腫瘍関連抗原が挙げられる。また、病原体抗原、例えば、ウイルス抗原、細菌抗原なども目的のものである。
【0016】
かかるスクリーニング方法では、最適化のために、ＴＣＲ配列上の所定のアミノ酸残基におけるアミノ酸変動を含むライブラリを生成する。変異誘発のために選択される残基は、通常、ＴＣＲのＣＤＲ領域のうちの１つ以上内にある。ＴＣＲα配列は、変異誘発され、非変異誘発ＴＣＲβと対合され得るか、又はＴＣＲβ配列は、変異誘発され、非変異誘発ＴＣＲαと対合され得る。ライブラリは、発現のために哺乳類細胞（哺乳類Ｔ細胞株を含む）に導入される。細胞は、最初に、同族ｐＭＨＣへの低親和性結合、例えば、標識ｐＭＨＣ四量体、多量体などへの結合、及びフローサイトメトリーなどによる選別によって、例えば、約０．１～約１００μＭの３Ｄ ｌｏｇ ＫＤ（μＭ）での低親和性結合のために選択される。
【0017】
低親和性ＴＣＲ配列を、抗原に応答してＴ細胞を活性化する能力についてスクリーニングする。最初のスクリーニングがＴ細胞において行われた場合、Ｔ細胞は、直接スクリーニングされてもよく、代替的に、低親和性結合ＴＣＲの配列が、活性化スクリーニングのためにＴ細胞に導入される。低抗原親和性を有するＴＣＲを発現するＴ細胞の集団は、抗原源、例えば、同族抗原を発現する標的細胞、ｐＭＨＣ基質、抗原性ペプチドでパルスされた抗原提示細胞などとともに、Ｔ細胞を活性化するために十分な期間インキュベートされる。Ｔ細胞は、例えば、増殖、ＩＬ－２放出、ＣＤ６９上方調節などにより、高レベルの活性化のために選択される。好都合に、ＣＤ６９の上方調節は、抗体染色及びフローサイトメトリーによって選択される。かかる選択は、上位２０％、上位１０％、上位５％、上位１％の細胞が選択される相対値に基づいてもよい。得られた操作されたＴＣＲは、低オフターゲット交差反応性及び高オンターゲット活性化について検証され得る。
【0018】
いくつかの実施形態では、スクリーニングのためのキットが提供され、これは、例えば、スクリーニングに好適な細胞株、変異誘発ＴＣＲの発現のためのベクター、細胞を標識するためのｐＭＨＣ四量体、細胞を標識するための抗ＣＤ６９抗体などを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【0019】
本発明は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を読むと最もよく理解される。一般的な実施によれば、図面の様々な特徴は、縮尺どおりでないことが強調される。逆に、様々な特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大又は縮小される。図面には、以下の図が含まれる。
【0020】
【図1】ＴＣＲのキャッチボンドエ操作の作業フローを示す。ＴＣＲライブラリを、ランダム化残基を有するｄｓＤＮＡとして合成した。ライブラリを、ギブソンアセンブリによってレンチウイルスベクターにクローニングした。組換えレンチウイルスベクターのライブラリを使用して、ＳＫＷ－３ Ｔ細胞株に感染するレンチウイルスのライブラリを産生した。ＳＫＷ－３ Ｔ細胞上のＴＣＲライブラリの表示を、抗ＴＣＲ（クローンＩＰ２６）染色によって検出した。Ｔ細胞ライブラリを、１０μＭの抗原ペプチドでパルスした抗原提示細胞と１４時間共培養し、Ｔ細胞ライブラリを抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及び特異的ｐＭＨＣ四量体で染色した。高レベルの抗ＣＤ６９染色及び低レベルの四量体染色を有する任意のクローンを、更なるラウンドの選別又は分析のために選別した。
【図2】ＴＣＲキャッチボンド操作の選別戦略を示す。ラウンド０において、Ｔ細胞ライブラリ又はＷＴ ＴＣＲトランスフェクタントを、抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及び特異的ｐＭＨＣ四量体で染色した。ＷＴ ＴＣＲトランスフェクタントと比較して類似のレベルの抗ＣＤ６９及び四量体染色を有するＴ細胞ライブラリクローンを選別して、任意の高親和性又は自己応答性クローンを除去した。その後、Ｔ細胞ライブラリを、１０μＭの抗原ペプチドでパルスした抗原提示細胞と１４時間共培養し、Ｔ細胞ライブラリを抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及び特異的ｐＭＨＣ四量体で染色した。高レベルの抗ＣＤ６９染色及び低レベルの四量体染色を有する任意のクローンを選別した。ラウンド２と同じ選別手順を更に２～３ラウンド繰り返して、ある特定の変異体を更に富化した。
【図3A】ＴＣＲ５５ライブラリの設計を示す。Ｂ３５－ＨＩＶ－ＴＣＲ５５（ＰＤＢ ＩＤ：６ＢＪ３）の構造に基づいて、ＴＣＲ５５アルファ鎖上の残基（Ｓｅｒ２８、Ｌｙｓ６９、Ａｌａ９８）を選択し、５５ａライブラリとしてＶＲＷコドンにランダム化した。
【図3B】ＴＣＲ５５ライブラリの設計を示す。ＴＣＲ５５ｂベータ鎖上の残基ＣＤＲ１及びＣＤＲ２（Ａｓｎ２８、Ｓｅｒ３１、Ａｌａ５０及びＳｅｒ５１）を選択し、５５ｂ１２ライブラリとしてＶＲＷコドンにランダム化した。
【図3C】ＴＣＲ５５ライブラリの設計を示す。ＴＣＲ５５ｂベータ鎖上の残基ＣＤＲ３（Ｌｙｓ７１、Ｔｈｒ９５及びＬｅｕ１００）を選択し、５５ｂ３ライブラリとしてＶＲＷコドンにランダム化した。
【図4-1】ＴＣＲ５５ライブラリの５ラウンドの選択を示す。各ラウンドにおいて、Ｔ細胞ライブラリを、１０μＭのＨＩＶペプチドでパルスしたＫＧ－１細胞と１４時間共培養し、Ｔ細胞ライブラリを、抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及びＨＬＡ－Ｂ３５－ＨＩＶ四量体で染色した。高レベルの抗ＣＤ６９染色及び低レベルの四量体染色を有する任意のクローンを選別した。ゲーティングは、ＴＣＲ５５ ＷＴトランスフェクタントの抗ＣＤ６９及びＢ３５－ＨＩＶ四量体染色に基づいている。
【図4-2】ＴＣＲ５５ライブラリの５ラウンドの選択を示す。各ラウンドにおいて、Ｔ細胞ライブラリを、１０μＭのＨＩＶペプチドでパルスしたＫＧ－１細胞と１４時間共培養し、Ｔ細胞ライブラリを、抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及びＨＬＡ－Ｂ３５－ＨＩＶ四量体で染色した。高レベルの抗ＣＤ６９染色及び低レベルの四量体染色を有する任意のクローンを選別した。ゲーティングは、ＴＣＲ５５ ＷＴトランスフェクタントの抗ＣＤ６９及びＢ３５－ＨＩＶ四量体染色に基づいている。
【図4-3】ＴＣＲ５５ライブラリの５ラウンドの選択を示す。各ラウンドにおいて、Ｔ細胞ライブラリを、１０μＭのＨＩＶペプチドでパルスしたＫＧ－１細胞と１４時間共培養し、Ｔ細胞ライブラリを、抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及びＨＬＡ－Ｂ３５－ＨＩＶ四量体で染色した。高レベルの抗ＣＤ６９染色及び低レベルの四量体染色を有する任意のクローンを選別した。ゲーティングは、ＴＣＲ５５ ＷＴトランスフェクタントの抗ＣＤ６９及びＢ３５－ＨＩＶ四量体染色に基づいている。
【図5】ＴＣＲ５５ａ－Ａ９８Ｈは、Ｂ３５－ＨＩＶによって活性化され得るキャッチボンド操作されたＴＣＲである。Ａ．ＴＣＲ５５ ＷＴ、ＴＣＲ５５ａ－Ａ９８Ｈ、ＴＣＲ５５ａ－Ｓ２８Ｇ又はＴＣＲ５５ａ－Ｓ２８Ｇ Ａ９８Ｈ Ｔ細胞トランスフェクタントを、滴定したＨＩＶペプチドでパルスしたＫＧ－１細胞と１４時間共培養し、抗ＣＤ６９で染色した。実験を、フローサイトメトリーによって分析した。Ｂ～Ｃ．固定化されたＢ３５－ＨＩＶと流動したＴＣＲ５５ａ－Ａ９８Ｈタンパク質との間の３Ｄ結合親和性を測定するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を示す。Ｄ．Ｂ３５－ＨＩＶタンパク質とＴＣＲ５５ ＷＴ又はＴＣＲ５５ａ－Ａ９８Ｈ Ｔ細胞トランスフェクタントとの間の結合寿命を測定するための生体膜力プローブ（ＢＦＰ）実験を示す。
【図6A】ＴＣＲ５５ａ－Ａｌａ９８は、キャッチボンド操作のホットスポットである。Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｑ、Ｙ及びＨへのＴＣＲ５５ａ－Ａ９８変異をＴ細胞トランスフェクタントとして作製し、滴定したＨＩＶペプチドでパルスしたＫＧ－１細胞により１４時間刺激し、抗ＣＤ６９で染色した。実験を、フローサイトメトリーによって分析した。
【図6B】ＴＣＲ５５ａ－Ａｌａ９８は、キャッチボンド操作のホットスポットである。Ｃ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ及びＷへのＴＣＲ５５ａ－Ａ９８変異をＴ細胞トランスフェクタントとして作製し、滴定したＨＩＶペプチドでパルスしたＫＧ－１細胞により刺激した。分析はＡと同じであった。
【図6C】ＴＣＲ５５ａ－Ａｌａ９８は、キャッチボンド操作のホットスポットである。刺激性ＴＣＲ５５ａ－Ａ９８変異体のＥｍａｘと３Ｄ結合親和性（ＫＤ）との間の相関関係を示す。
【図6D】ＴＣＲ５５ａ－Ａｌａ９８は、キャッチボンド操作のホットスポットである。刺激性ＴＣＲ５５ａ－Ａ９８変異体のＥＣ５０と３Ｄ ＫＤとの間の相関関係を示す。
【図6E】ＴＣＲ５５ａ－Ａｌａ９８は、キャッチボンド操作のホットスポットである。Ｂ３５－ＨＩＶタンパク質と相互作用するＴＣＲ５５ａ－Ａ９８Ｈ、ＴＣＲ５５ａ－Ａ９８Ｅ及びＴＣＲ５５ａ－Ａ９８Ｑ Ｔ細胞トランスフェクタントの結合寿命のＢＦＰ測定を示す。
【図7A】ＭＡＧＥライブラリの設計を示す。ＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥＡ３－ＭＡＧ－ＩＣ３（ＰＤＢ ＩＤ：５ＢＲＺ）の構造に基づいて、ＴＣＲアルファ鎖上の残基（Ａｓｐ２８、Ａｌａ３０、Ｓｅｒ５４及びＧｌｎ５２）を選択し、ライブラリとしてＶＲＷコドンにランダム化した。
【図7B】ＭＡＧＥライブラリの設計を示す。ＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥＡ３－ＭＡＧ－ＩＣ３（ＰＤＢ ＩＤ：５ＢＲＺ）の構造に基づいて、ＴＣＲベータ鎖上の残基（Ｔｈｒ５４、Ｍｅｔ９８及びＡｓｐ１００）を選択し、ライブラリとしてＶＲＷコドンにランダム化した。
【図8】ＭＡＧＥライブラリの３ラウンドの選択を示す。各ラウンドにおいて、Ｔ細胞ライブラリを、１０μＭのＭＡＧＥＡ３ペプチドでパルスした抗原提示細胞と１４時間共培養し、Ｔ細胞ライブラリを、抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及びＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥＡ３四量体で染色した。高レベルの抗ＣＤ６９染色及び低レベルの四量体染色を有する任意のクローンを選別した。ゲーティングは、ＭＡＧＥＡ３ ＷＴ ＴＣＲトランスフェクタントの抗ＣＤ６９及びＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥＡ３四量体染色に基づいている。
【図9】複数のＴＣＲ変異体が、ＭＡＧＥＡ３腫瘍抗原によって活性化されることが同定された。Ａ．８つの高効力変異体Ｔ細胞を、滴定したＭＡＧＥＡ３ペプチドでパルスした２９３Ｔ－ＨＬＡ－Ａ１細胞と１４時間共培養した。Ｔ細胞を、抗ＣＤ６９で染色し、フローサイトメトリーで分析した。Ｂ．５つの中効力変異体Ｔ細胞を、滴定したＭＡＧＥＡ３ペプチドでパルスした２９３Ｔ－ＨＬＡ－Ａ１細胞と１４時間共培養した。Ｔ細胞を、抗ＣＤ６９で染色し、フローサイトメトリーで分析した。Ｃ．８つの高効力変異体Ｔ細胞を、滴定したタイチンペプチドでパルスした２９３Ｔ－ＨＬＡ－Ａ１細胞と１４時間共培養した。Ｔ細胞を、抗ＣＤ６９で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【図10】Ａ３Ａ ＴＣＲと比較して高い効力であるがより低い親和性を有するいくつかのＭＡＧＥ ＴＣＲ変異体の同定を示す。Ａ．ＷＴ ＴＣＲ、Ａ３Ａ ＴＣＲ、８つの高効力変異体及び５つの中効力変異体のＥｍａｘとＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥＡ３四量体染色陽性パーセンテージとの間の相関関係を示す。Ｂ．ＷＴ、Ａ３Ａ、又は６つの他の選択されたＴＣＲ変異体に結合する固定化されたＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥＡ３のＥｍａｘと３Ｄ親和性（３Ｄ ＫＤ）との間の相関関係を示す。Ｃ．ＷＴ、Ａ３Ａ、又は６つの他の選択されたＴＣＲ変異体に結合する固定化されたＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥＡ３のＥＣ５０と３Ｄ ＫＤとの間の相関関係を示す。
【図11】毒性スクリーニング。反復１：ヒト初代Ｔ細胞細胞傷害性アッセイを示す。抗原提示細胞：腫瘍細胞株（Ａ３７５、ＨＣＴ－１１６）－ＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥＡ３＋、２７ａ－５：１つのＭＡＧＥ ＴＣＲ変異体である。
【図12】全てのＭＡＧＥ ＴＣＲ変異体のアミノ酸置換を示す。全ての変異体は、Ａｓｐ２８、Ａｌａ３０、Ｉｌｅ５１、Ｇｌｎ５２、Ｓｅｒ５３及びＳｅｒ５４のＴＣＲアルファ鎖残基にのみ変異を有する。各変異体の特定の変異残基をここに列挙する。
【図13-1】操作されたＭＡＧＥ ＴＣＲ配列の選択された部分のアラインメントを示す。
【図13-2】操作されたＭＡＧＥ ＴＣＲ配列の選択された部分のアラインメントを示す。
【図14A】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＡ３７５メラノーマ細胞株の殺傷を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図14B】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＡ３７５メラノーマ細胞株の殺傷を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図14C】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。Ａ３７５メラノーマ細胞株によって誘導された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＩＦＮ－ψ、ＴＮＦ及び細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図14D】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。Ａ３７５メラノーマ細胞株によって誘導された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＩＦＮ－ψ、ＴＮＦ及び細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図14E】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。Ａ３７５メラノーマ細胞株によって誘導された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＩＦＮ－ψ、ＴＮＦ及び細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図14F】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＨＣＴ－１１６結腸がん細胞株の殺傷を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図14G】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＨＣＴ－１１６結腸がん細胞株の殺傷を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図14H】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。ＨＣＴ－１１６結腸がん細胞株によって誘導された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＩＦＮ－ψ、ＴＮＦ及び細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図14I】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。ＨＣＴ－１１６結腸がん細胞株によって誘導された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＩＦＮ－ψ、ＴＮＦ及び細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図14J】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。ＨＣＴ－１１６結腸がん細胞株によって誘導された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＩＦＮ－ψ、ＴＮＦ及び細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図14K】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。ＭＡＧＥ－３ペプチドの滴定でパルスしたＨＬＡ－Ａ１＋２９３Ｔ細胞によって誘導された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞による細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図14L】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。ＭＡＧＥ－３ペプチドの滴定でパルスしたＨＬＡ－Ａ１＋２９３Ｔ細胞によって誘導された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞による細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図14M】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。ＭＡＧＥ－３ペプチドの滴定でパルスしたＨＬＡ－Ａ１＋２９３Ｔ細胞によって誘導された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞による細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図14N】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。タイチンペプチドの滴定でパルスしたＨＬＡ－Ａ１＋２９３Ｔ細胞によって誘導された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞による細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）、ＴＮＦ及びＩＦＮ－ψを示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図14O】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。タイチンペプチドの滴定でパルスしたＨＬＡ－Ａ１＋２９３Ｔ細胞によって誘導された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞による細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）、ＴＮＦ及びＩＦＮ－ψを示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図14P】キャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの細胞傷害性及び特異性を示す。タイチンペプチドの滴定でパルスしたＨＬＡ－Ａ１＋２９３Ｔ細胞によって誘導された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞による細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）、ＴＮＦ及びＩＦＮ－ψを示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図15A】酵母表示ｐＭＨＣライブラリによるＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲバリアントの交差反応性スクリーニングを示す。一本鎖ＨＬＡ－Ａ＊０１酵母表示ペプチドライブラリの設計。ＤＮＡペプチドライブラリ設計は、ＨＬＡ－Ａ＊０１によって表示されたペプチドを最大にするために、アンカー位置Ｐ３（ＧＡＫ）及びＰ９（ＴＡＹ）を除く全ての位置のＮＮＫコドンライブラリを示す。一本鎖三量体構築物は、酵母上での発現のためにＡｇａ２に融合したＭｙｃタグに対してＮ末端である。
【図15B】酵母表示ｐＭＨＣライブラリによるＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲバリアントの交差反応性スクリーニングを示す。選択のラウンドにわたって酵母上のｍｙｃタグ発現を増加させることは、ペプチドＨＬＡ－Ａ＊０１の富化及びライブラリの正の選択を表す。
【図15C】酵母表示ｐＭＨＣライブラリによるＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲバリアントの交差反応性スクリーニングを示す。ペプチドごとに検出されたリードの数を占めるアミノ酸によるペプチド位置を示す、ラウンド４の選択されたペプチドのヒートマップ。枠で囲まれたアミノ酸は、ＭＡＧＥ－Ａ３ペプチド（配列番号１９）ＥＶＤＰＩＧＨＬＹを表す。暗色は、その位置でのより富化されたアミノ酸を表す。
【図15D-1】酵母表示ｐＭＨＣライブラリによるＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲバリアントの交差反応性スクリーニングを示す。ＭＡＧＥ－Ａ３、タイチン、ＤＭＳＯ（黒いドット）及び６０の予測されたペプチド（ＭＡＧＥ－Ａ６；ＦＡＴ２）を使用して、２９３Ｔ－ＨＬＡ－Ａ１細胞をパルスし、異なるＴＣＲを発現するＳＫＷ３ Ｔ細胞を１４時間刺激した。ペプチドは、ＭＡＧＥ－Ａ３（配列番号１９）ＥＶＤＰＩＧＨＬＹ、タイチン（配列番号２０）ＥＳＤＰＩＶＡＱＹ、ＭＡＧＥ－Ａ６（配列番号２１）ＥＶＤＰＩＧＨＶＹ、ＦＡＴ２（配列番号２２）ＥＴＤＰＶＮＨＭＶであった。
【図15D-2】酵母表示ｐＭＨＣライブラリによるＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲバリアントの交差反応性スクリーニングを示す。ＭＡＧＥ－Ａ３、タイチン、ＤＭＳＯ（黒いドット）及び６０の予測されたペプチド（ＭＡＧＥ－Ａ６；ＦＡＴ２）を使用して、２９３Ｔ－ＨＬＡ－Ａ１細胞をパルスし、異なるＴＣＲを発現するＳＫＷ３ Ｔ細胞を１４時間刺激した。ペプチドは、ＭＡＧＥ－Ａ３（配列番号１９）ＥＶＤＰＩＧＨＬＹ、タイチン（配列番号２０）ＥＳＤＰＩＶＡＱＹ、ＭＡＧＥ－Ａ６（配列番号２１）ＥＶＤＰＩＧＨＶＹ、ＦＡＴ２（配列番号２２）ＥＴＤＰＶＮＨＭＶであった。
【図15E-1】酵母表示ｐＭＨＣライブラリによるＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲバリアントの交差反応性スクリーニングを示す。抗ＣＤ６９－ＡＰＣ染色を行い、フローサイトメトリーで分析した。２９３－ＨＬＡ－Ａ１細胞を、滴定したＭＡＧＥ－Ａ３（配列番号１９）、タイチン（配列番号２０）、ＭＡＧＥ－Ａ６（配列番号２１）又はＦＡＴ２（配列番号２２）ペプチドでパルスして、ＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲバリアントを発現するＳＫＷ３ Ｔ細胞を１４時間刺激した。抗ＣＤ６９－ＡＰＣ染色を行い、フローサイトメトリーで分析した。
【図15E-2】酵母表示ｐＭＨＣライブラリによるＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲバリアントの交差反応性スクリーニングを示す。抗ＣＤ６９－ＡＰＣ染色を行い、フローサイトメトリーで分析した。２９３－ＨＬＡ－Ａ１細胞を、滴定したＭＡＧＥ－Ａ３（配列番号１９）、タイチン（配列番号２０）、ＭＡＧＥ－Ａ６（配列番号２１）又はＦＡＴ２（配列番号２２）ペプチドでパルスして、ＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲバリアントを発現するＳＫＷ３ Ｔ細胞を１４時間刺激した。抗ＣＤ６９－ＡＰＣ染色を行い、フローサイトメトリーで分析した。
【図16A】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。ライブラリの選択の各ラウンドにおける、ＭＡＧＥ－Ａ３ ＷＴ ＴＣＲ ＳＫＷ３トランスフェクタントのＡ１－ＭＡＧＥ－Ａ３四量体染色及び抗ＣＤ６９染色を示す。
【図16B】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。ＳＫＷ３細胞における異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体のＥｍａｘとＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３四量体染色－高集団のパーセンテージとの間の相関関係を示す。
【図16C】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。ＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３に結合する選択されたＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体のｌｏｇ１０ＥＣ５０と３Ｄ結合親和性ＫＤとの間の相関関係を示す。
【図16D】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＡ３７５メラノーマ細胞株の殺傷を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図16E】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＡ３７５メラノーマ細胞株の殺傷を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図16F】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。Ａ３７５メラノーマ細胞株によって刺激された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＩＦＮ－ψ、ＴＮＦ及び細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図16G】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。Ａ３７５メラノーマ細胞株によって刺激された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＩＦＮ－ψ、ＴＮＦ及び細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図16H】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。Ａ３７５メラノーマ細胞株によって刺激された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＩＦＮ－ψ、ＴＮＦ及び細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図16I】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＨＣＴ－１１６結腸がん細胞株の殺傷を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図16J】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＨＣＴ－１１６結腸がん細胞株の殺傷を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図16K】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。ＨＣＴ－１１６結腸がん細胞株によって刺激された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＩＦＮ－ψ、ＴＮＦ及び細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図16L】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。ＨＣＴ－１１６結腸がん細胞株によって刺激された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＩＦＮ－ψ、ＴＮＦ及び細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図16M】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。ＨＣＴ－１１６結腸がん細胞株によって刺激された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞によるＩＦＮ－ψ、ＴＮＦ及び細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）を示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図16N】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。滴定したＭＡＧＥ－Ａ３ペプチドでパルスしたＨＬＡ－Ａ１＋２９３Ｔ細胞によって刺激された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞による細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）、ＴＮＦ及びＩＦＮ－ψを示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図16O】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。滴定したＭＡＧＥ－Ａ３ペプチドでパルスしたＨＬＡ－Ａ１＋２９３Ｔ細胞によって刺激された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞による細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）、ＴＮＦ及びＩＦＮ－ψを示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図16P】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。滴定したＭＡＧＥ－Ａ３ペプチドでパルスしたＨＬＡ－Ａ１＋２９３Ｔ細胞によって刺激された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞による細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）、ＴＮＦ及びＩＦＮ－ψを示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図16Q】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。滴定したタイチンペプチドでパルスしたＨＬＡ－Ａ１＋２９３Ｔ細胞によって刺激された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞による細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）、ＴＮＦ及びＩＦＮ－ψを示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図16R】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。滴定したタイチンペプチドでパルスしたＨＬＡ－Ａ１＋２９３Ｔ細胞によって刺激された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞による細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）、ＴＮＦ及びＩＦＮ－ψを示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図16S】他のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体によって媒介される殺傷、サイトカイン応答及び顆粒放出を示す。滴定したタイチンペプチドでパルスしたＨＬＡ－Ａ１＋２９３Ｔ細胞によって刺激された、異なるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代Ｔ細胞による細胞傷害性顆粒放出（ＣＤ１０７ａ染色）、ＴＮＦ及びＩＦＮ－ψを示す。データは、３つの独立した実験を表す。データは、技術的反復の平均値±標準偏差として示される。ｎｓ：有意ではない；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１である。
【図17A】ＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３に結合するＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体のＳＰＲ実験を示す。ＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３に結合するＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体タンパク質のＳＰＲ実験を示す。ビオチン化ＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３単量体をストレプトアビジンチップ上に固定化し、ＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体タンパク質をチップを通して流した。ＳＰＲによるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体とＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３との間の３Ｄ親和性の決定を示す。
【図17B】ＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３に結合するＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体のＳＰＲ実験を示す。２５℃でＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３ ｐＭＨＣに結合するＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体の平衡曲線を示す。示されるデータを平衡（黒いドット）で測定した。黒い線は、１：１結合曲線への適合を示す。
【図18A】ＨＬＡ－Ａ１－タイチンに結合するＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体のＳＰＲ実験を示す。ＨＬＡ－Ａ１－タイチンに結合するＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体タンパク質のＳＰＲ実験を示す。ビオチン化ＨＬＡ－Ａ１－タイチン単量体をストレプトアビジンチップ上に固定化し、ＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体タンパク質をチップを通して流した。
【図18B】ＨＬＡ－Ａ１－タイチンに結合するＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体のＳＰＲ実験を示す。ＳＰＲによるＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体とＨＬＡ－Ａ１－タイチンとの間の３Ｄ親和性の決定を示す。２５℃でＨＬＡ－Ａ１－タイチンｐＭＨＣに結合するＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体の平衡曲線を示す。示されるデータを平衡（黒いドット）で測定した。黒い線は、１：１結合曲線への適合を示す。
【図19A】Ａ１－タイチンに結合する９４ａ－１４ＴＣＲ又は２０ａ－１８ＴＣＲ結合の結合寿命力曲線を測定するための生体膜力プローブ実験を示す。データは、力曲線当たり５００＋の個々の結合寿命の平均値±ＳＥＭとして示される。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明の方法及び組成物を説明する前に、本発明は記載された特定の方法又は組成物に限定されるものではなく、それ自体が勿論、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語が単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、制限することが意図されないことも理解されたい。なぜなら、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるからである。
【0022】
値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、その範囲の上限と下限との間の各々の介在する値も、下限の単位の１０分の１まで具体的に開示されていることを理解されたい。任意の記載値又は記載された範囲内の間に介在する値と、任意の他の記載値又はその記載された範囲内の間に介在する値との間の、各々のより小さい範囲が、本発明に包含される。これらの小さい範囲の上限及び下限は、独立して範囲に含まれていても、除外されていてもよく、いずれか、どちらでもない、又は両方の限定が小さい範囲に含まれている各範囲も、記載されている範囲の中で任意の具体的に除外されている限定に従うことを条件として、本発明に包含される。記載された範囲が限定の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限定のいずれか又は両方を除外する範囲も、同様に本発明に含まれる。
【0023】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験に使用することができるが、ここでは、いくつかの潜在的かつ好ましい方法及び材料を説明する。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用されることに関連して方法及び／又は材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、本開示は、組み込まれた刊行物の任意の開示に優先されることを理解されたい。
【0024】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」への言及は、複数のかかる細胞を含み、「ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅ（ペプチド）」への言及は、当業者に既知の１つ以上のペプチド及びその等価物、例えばポリペプチドなどへの言及を含む。
【0025】
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のために単に提供されている。本明細書におけるいかなる内容も、本発明が先行発明を理由に、そのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる場合がある。
【0026】
操作されたＴＣＲ、かかるＴＣＲをコードする配列、及び操作された抗原受容体を発現するように操作された細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団などの細胞の集団）が提供される。いくつかの実施形態では、本発明の免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はそれらの組み合わせである。一態様では、本発明の細胞は、ヒト細胞である。
【0027】
いくつかの実施形態では、対象は、腫瘍抗原の発現に関連する疾患、例えば、増殖性疾患、前がん状態、がん、及び腫瘍抗原の発現に関連する非がん関連適応症を有する。いくつかの実施形態では、対象は、メラノーマ、小細胞肺がん、血液悪性腫瘍、乳房、皮膚、神経膠腫、神経芽細胞腫、腸、結腸直腸、卵巣、及び腎臓の新生物を含むがこれらに限定されない、ＭＡＧＥ－Ａ３発現がんを有する。本発明は、がんの治療のための本明細書に記載の組成物の使用及び／又は方法を提供する。
【0028】
本発明は、操作されたＴＣＲをコードする核酸を、該核酸が細胞のゲノムに組み込まれるように、細胞に導入することを含む、ＴＣＲ発現細胞の製造方法を更に提供する。
【0029】
Ｔ細胞受容体操作されたＴ細胞養子療法。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）操作されたＴ細胞は、がん及び他の状態の治療のために使用される養子細胞療法の選択肢である。例えば、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、例えば、エクスビボで拡大した自家ＴＩＬを使用する養子細胞療法は、ある特定のがんを治療するための有効なアプローチとして使用されている。しかしながら、治療上有用な用量の抗原特異的ＴＩＬを得ることは困難であり得る。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）操作技術を使用して、適切な治療ＴＣＲを発現させるようにＴ細胞を操作することができる。したがって、腫瘍抗原特異的ＴＣＲ遺伝子操作されたＴ細胞は、がん患者のための潜在的な「既製の」治療とみなされる。
【0030】
例えば、Ｔ細胞は、患者の血液又は腫瘍組織から単離され得る。本明細書に開示される方法によって操作されたＴＣＲα鎖及びβ鎖は、好適なベクター、例えば、レンチウイルス、レトロウイルスなど、又は遺伝子編集システムで提供され、患者から単離したＴ細胞を修飾して所望のＴＣＲαβ配列をコードするために使用される。次いで、これらの修飾されたＴ細胞をインビトロで拡大して、治療のための十分な数を得て、患者に再注入する。代替的に、同種異系Ｔ細胞は、この目的のために使用することができる。ＴＣＲ操作されたＴ細胞は、適切な抗原を発現するがん細胞を標的とし、殺傷することができる。
【0031】
上述の方法において使用するための細胞は、対象又はドナーから収集することができるか、所望の細胞を富化する技法によって細胞の混合物から分離され得るか、又は分離することなく操作され、培養され得る。適切な溶液が、分散又は懸濁に使用され得る。かかる溶液は、概して、低濃度、概して５～２５ｍＭの許容可能な緩衝液と併せて、好都合に、ウシ胎仔血清又は他の天然に存在する因子を補充された、平衡塩溶液、例えば、標準の生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩溶液などである。好都合な緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などが挙げられる。
【0032】
親和性分離のための技法としては、抗体コーティングされた磁気ビーズを使用した磁気分離、親和性クロマトグラフィ、モノクローナル抗体に結合した、又はモノクローナル抗体と併せて使用される細胞傷害性薬剤、例えば、補体及び細胞傷害性細胞、並びに固体マトリックス、例えばプレートに結合した抗体を用いた「パニング」、又は他の好都合な技法が挙げられ得る。正確な分離を提供する技法としては、蛍光活性化セルソーターが挙げられ、これは、複数のカラーチャネル、低角度及び鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなどの様々な程度の洗練度（ｓｏｐｈｉｓｔｉｃａｔｉｏｎ）を有することができる。細胞は、死細胞と会合する染料（例えば、ヨウ化プロピジウム）を用いることによって、死細胞に対して選択され得る。選択された細胞の生存率に過度に損害を与えない任意の技法が用いられ得る。親和性試薬は、上述の細胞表面分子に対する特異的受容体又は配位子であってもよい。抗体試薬に加えて、ペプチド－ＭＨＣ抗原及びＴ細胞受容体対、ペプチド配位子及び受容体、エフェクター分子及び受容体分子などが使用されてもよい。
【0033】
分離された細胞は、通常、収集管の底部に血清クッションを有する、細胞の生存率を維持する任意の適切な培地に収集され得る。頻繁にウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したｄＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ｄＰＢＳ、ＲＰＭＩ、Ｉｓｃｏｖｅ培地などの様々な培地が市販されており、細胞の性質に応じて使用され得る。
【0034】
収集され、任意選択的に富化された細胞集団は、遺伝子修飾のために直ちに使用されてもよく、又は液体窒素温度で凍結され、保管されてもよく、解凍されて再利用可能である。細胞は、通常、１０％のＤＭＳＯ、５０％のＦＣＳ、４０％のＲＰＭＩ１６４０培地中に保存される。
【0035】
操作された細胞は、任意の生理学的に許容される培地において、通常は血管内の任意の便利な投与経路によって対象に注入され得るが、それらは、また、他の経路によって導入され得、細胞は、成長のための適切な部位を見つけ得る。通常、少なくとも１×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０７個の細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０８個の細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０９個の細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０１０個の細胞／ｋｇ、又はそれ以上が投与され、通常、収集中に得られるＴ細胞の数によって制限される。
【0036】
多くの腫瘍特異的抗原が同定されている。これらの抗原は、免疫応答を誘導することができ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ニューヨーク食道扁平上皮細胞がん（ＮＹ－ＥＳＯ）－１、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｐ５３、新抗原などの、ワクチン接種又はＴ細胞療法で使用するための有望な候補標的である。
【0037】
「自家」という用語は、後で個体に再導入されることになる同じ個体に由来する任意の材料を指す。
【0038】
「同種異系」という用語は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、２つ以上の個体は互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様では、同じ種の個体からの同種異系材料は、抗原的に相互作用するように遺伝的に十分に異なっていてもよい。
【0039】
「刺激」という用語は、刺激性分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）の、その同族のリガンド（又はＴＣＲの場合は腫瘍抗原）との結合によって誘導され、それによって、限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達又はＣＡＲの適切なＮＫ受容体若しくはシグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介する、一次応答を指す。刺激は、ある特定の分子の発現の変化を媒介することができる。
【0040】
「刺激性分子」という用語は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの態様について刺激的な方法で免疫細胞の活性化を調節する細胞質シグナル伝達配列を提供する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）によって発現される分子を指す。一態様では、シグナルは、例えば、ペプチドが装填されたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって開始され、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答の媒介をもたらす一次シグナルである。刺激的な様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
【0041】
「共刺激性分子」という用語は、共刺激性リガンドと特異的に結合し、それにより、これに限定されないが、増殖などのＴ細胞による共刺激性応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族の結合パートナーを指す。共刺激性分子は、効率的な免疫応答に寄与する、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激性分子には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体、並びにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）が含まれるが、これらに限定されない。
【0042】
「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」という用語は、その表面上に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成した外来抗原を表示するアクセサリー細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など）などの免疫系細胞を指す。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこれらの複合体を認識し得る。ＡＰＣは抗原を処理し、それらをＴ細胞に提示する。
【0043】
「免疫エフェクター細胞」は、その用語が本明細書で使用される場合、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞及びガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、並びにマクロファージが挙げられる。
【0044】
「免疫エフェクター機能又は免疫エフェクター応答」は、その用語が本明細書で使用される場合、例えば、標的細胞の免疫攻撃を増強又は促進する免疫エフェクター細胞の機能又は応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能又は応答は、標的細胞の殺傷又は成長若しくは増殖の阻害を促進するＴ細胞又はＮＫ細胞の特性を指す。
【0045】
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、本明細書では互換的に使用され、特定の生物学的結果を達成するために有効な本明細書に記載される化合物、製剤、材料又は組成物の量を指す。
【0046】
「がん関連抗原」又は「腫瘍抗原」という用語は、互換的に、完全に又は断片（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）としてのいずれかで、がん細胞の表面上に発現され、がん細胞に対する薬理学的薬剤の優先的標的化に有用な分子（典型的には、タンパク質、炭水化物又は脂質）を指す。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、正常細胞及びがん細胞の両方によって発現されるマーカー、例えば、系統マーカー、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、正常細胞と比較して、がん細胞において過剰発現される、例えば、正常細胞と比較して、１倍の過剰発現、２倍の過剰発現、３倍以上の過剰発現である、細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、がん細胞において不適切に合成される細胞表面分子、例えば、正常細胞上で発現される分子と比較して、欠失、付加又は変異を含む分子である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、がん細胞の細胞表面上にのみ、完全に又は断片（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として発現され、正常細胞の表面上で合成又は発現されない。
【0047】
「実質的に精製された」細胞という用語は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞は、また、天然に存在する状態で通常会合している他の細胞型から分離された細胞も指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の均質な集団を指す。他の例では、この用語は、単に、それらが天然状態で天然に会合する細胞から分離された細胞を指す。いくつかの態様では、細胞はインビトロで培養される。他の態様では、細胞は、インビトロで培養されない。
【0048】
ＭＡＧＥ－Ａ３は、腫瘍特異的タンパク質であり、メラノーマ、小細胞肺がん、血液悪性腫瘍、乳房、皮膚、神経膠腫、神経芽細胞腫、腸、結腸直腸、卵巣、及び腎臓の新生物などを含む多くの腫瘍で同定されており、睾丸及び胎盤を除く全ての正常なヒト組織でサイレントである。ヒトタンパク質ｒｅｆｓｅｑは、ＮＰ＿００５３５３でアクセスすることができる。例えば、Ｓａｉａｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｅｎｅｆｉｔ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ＭＡＧＥ－Ａ３ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ（ＰＲＥＤＩＣＴ）．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１６；２７：１９４７－１９５３、Ｐｕｊｏｌ ｅｔ ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＭＡＧＥ－Ａ３ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｄｊｕｖａｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｅｃｔｅｄ ｓｔａｇｅ ＩＢ ｔｏ ＩＩＩ ＭＡＧＥ－Ａ３－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ． ２０１５；１０：１４５８－１４６７を参照されたい。
【0049】
ＭＨＣの状況。ＭＨＣ分子の機能は、形質転換細胞に由来する病原体又は異常タンパク質に由来するペプチド断片に結合し、適切なＴ細胞による認識のためにそれらを細胞表面に表示することである。したがって、Ｔ細胞受容体認識は、抗原を提示しているＭＨＣタンパク質によって影響を受け得る。ＭＨＣ状況という用語は、特定のＭＨＣタンパク質によって提示されるとき、所与のペプチドのＴＣＲによる認識を指す。
【0050】
ペプチドリガンドは、Ｔリンパ球抗原特異的応答を伴う免疫応答が生成され得るペプチド抗原である。そのような抗原としては、自己免疫疾患、感染症、がん新抗原、グルテンなどの食品、アレルギー又は組織移植拒絶に関連する抗原が挙げられる。抗原には、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生虫及び腫瘍細胞に由来する抗原を含むが、これに限定されない、例えば、感染症、ワクチン接種などに見られる様々な微生物抗原も含まれる。腫瘍抗原としては、腫瘍特異的抗原、例えば、免疫グロブリンイディオタイプ及びＴ細胞抗原受容体；がん遺伝子、例えば、ｐ２１／ｒａｓ、ｐ５３、ｐ２１０／ｂｃｒ－ａｂｌ融合産物など；発達抗原、例えば、ＭＡＲＴ－１／メランＡ；ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３；ＧＡＧＥファミリー；テロメラーゼなど；ウイルス抗原、例えば、ヒトパピローマウイルス、エプスタインバールウイルスなど；組織特異的自己抗原、例えば、チロシナーゼ；ｇｐ１００；前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、前立腺特異的膜抗原；チログロブリン、α－フェトプロテインなど；及び自己抗原、例えば、ｈｅｒ－２／ｎｅｕ；がん胎児性抗原、ｍｕｃ－１などが挙げられる。
【0051】
ＭＨＣタンパク質は、哺乳類ＭＨＣタンパク質のいずれかを含む。ヒトＨＬＡタンパク質、特にＨＬＡクラスＩタンパク質、例えば、ヒトＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃが目的のものである。当業者によって理解されるように、ＨＬＡ遺伝子座は、高度に多型であり、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、最大ＨＬＡ－Ａ＊８０までの対立遺伝子のいずれか及びそれらの血清型、並びにＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、最大ＨＬＡ－Ｂ＊８３まで、及びそれらの血清型を含むが、これらに限定されない多数の配列バリアントが既知であり、当該技術分野において記載されている。いくつかの実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ及びＨＬＡ－ＤＲＢ１が、目的のものである。スクリーニング目的で使用されるＭＨＣ配列は、典型的には、ペプチド結合領域、例えば、アルファ１及びアルファ２ドメイン、又はペプチド結合複合体、ペプチド抗原との複合体を形成するために必要なこれらのドメインの部分を含む。
【0052】
キャッチボンドは、その寿命が、結合に適用される引張力とともに増加する受容体－リガンド結合である（その寿命が、結合に作用する引張力によって短縮される、より一般的なスリップボンドとは対照的に）。例えば、リガンド結合ドメインは、結合ポケットに対して遠位の隣接する調節ドメインと密接に接触し得る。リガンド－受容体複合体への引張力の適用は、結合ポケットと結合ポケットを活性化する調節ドメインとの間の界面の構造的緩みをもたらす。したがって、受容体－リガンド複合体の少なくとも２つの構造状態、すなわち、短命状態及び長命状態を共存させることができ、これらの各々は、異なるリガンドオンレート及びオフレートを有する。ドメイン－ドメイン界面における機械的摂動は、結合ポケットに急速に伝播して、それを長命状態に切り替えることができる。
【0053】
短命状態及び長命状態は、他の手段によって、例えば、熱活性化によっても克服することができるエネルギー障壁によって分離されるため、機械的力は、キャッチボンドの活性化を加速するだけであることがしばしば示されている。したがって、力の役割は、エネルギー障壁を越えて短命状態から長命状態に移行するプロセスを加速することだけである。
【0054】
「がん」、「新生物」、「腫瘍」、及び「がん腫」という用語は、細胞増殖の制御の著しい喪失を特徴とする異常な成長表現型を示すように、比較的自律的な成長を示す細胞を指すように本明細書において互換的に使用される。一般に、本出願における検出又は治療のための目的の細胞には、前がん性（例えば、良性）、悪性、前転移性、転移性、及び非転移性細胞が含まれる。がん細胞の検出は、特に目的のものである。「正常細胞」の文脈で使用される「正常」という用語は、形質転換されていない表現型の細胞、又は検査される組織型の形質転換されていない細胞の形態を示すことを意味する。「がん性表現型」は、概して、がん細胞の特徴である様々な生物学的現象のいずれかを指し、その現象は、がんの種類によって変化し得る。がん性表現型は、概して、例えば、細胞の成長又は増殖（例えば、制御されていない成長又は増殖）、細胞周期の調節、細胞移動性、細胞－細胞相互作用、又は転移などの異常によって同定される。
【0055】
本発明の主題方法を使用して治療することができるがんの種類としては、副腎皮質がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆道がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳がん、中枢神経系（ＣＮＳ）がん、末梢神経系（ＰＮＳ）がん、乳がん、子宮頸がん、小児非ホジキンリンパ腫、結腸及び直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイング腫瘍（例えば、ユーイング肉腫）、眼がん、胆嚢がん、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍、妊娠トロホブラスト疾患、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん及び下咽頭がん、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、小児白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、肝臓がん、肺がん、肺カルチノイド腫瘍、非ホジキンリンパ腫、男性乳がん、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、口腔及び中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、メラノーマ皮膚がん、非メラノーマ皮膚がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん（例えば、子宮肉腫）、移行細胞がん、膣がん、外陰部がん、中皮腫、扁平上皮細胞又は類表皮がん、気管支腺腫、絨毛がん、頭頸部がん、奇形腫、又はヴァルデンストロームマクログロブリン血症が挙げられるが、これらに限定されない。
【0056】
「抗がん効果」という用語は、例えば、腫瘍体積の減少、がん細胞の数の減少、転移の数の減少、平均余命の増加、がん細胞増殖の減少、がん細胞生存の減少、又はがん性状態に関連する様々な生理学的症状の改善を含むが、これらに限定されない、様々な手段によって明らかにすることができる生物学的効果を指す。「抗がん効果」は、そもそもがんの発生の予防における操作された細胞の能力によっても明らかにすることができる。「抗腫瘍効果」という用語は、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、又は腫瘍細胞生存の減少を含むが、これらに限定されない、様々な手段によって明らかにすることができる生物学的効果を指す。
【0057】
「本明細書に記載される腫瘍抗原の発現に関連する疾患」という語句には、本明細書に記載される腫瘍抗原の発現に関連する疾患、又は本明細書に記載される腫瘍抗原を発現する細胞に関連する状態が含まれ、例えば、がん若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、又は骨髄異形成、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前がん性状態、又は本明細書に記載される腫瘍抗原を発現する細胞に関連する非がん関連適応症が含まれるが、これらに限定されない。一態様では、本明細書に記載される腫瘍抗原の発現に関連するがんは、血液がんである。一態様では、本明細書に記載される腫瘍抗原の発現に関連するがんは、固形がんである。本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する更なる疾患としては、例えば、非定型及び／若しくは非古典的がん、悪性腫瘍、前がん性状態、又は本明細書に記載される腫瘍抗原の発現に関連する増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される腫瘍抗原の発現に関連する非がん関連適応症としては、例えば、自己免疫疾患（例えば、ループス）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）、並びに移植が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するか、又は任意の時点で発現する。一実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原タンパク質（例えば、野生型又は変異体）を産生し、腫瘍抗原タンパク質は、正常レベル又は低減レベルで存在し得る。一実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、ある時点で検出可能なレベルの腫瘍抗原タンパク質を産生し、その後、実質的に検出可能な腫瘍抗原タンパク質を産生しなかった。
【0058】
本明細書で使用される場合、「治療的」という用語は、治療を意味する。治療効果は、疾患状態の低減、抑制、寛解、又は根絶によって得られる。
【0059】
本明細書で使用される場合、「予防」という用語は、疾患又は疾患状態の防止又は保護的治療を意味する。
【0060】
発現構築物。ード配列は、発現ベクター上で操作される細胞内に導入され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、コード配列を標的細胞に導入することができる。Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクションすることによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系をヒト細胞に直接適用することができる。ＣＲＩＳＰＲ構成要素のウイルス送達は、レンチウイルス及びレトロウイルスベクターを使用して広範囲に実証されている。アデノウイルス及びアデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）などの非組み込みウイルスによってコードされるＣＲＩＳＰＲによる遺伝子編集もまた報告されている。より小さなＣａｓタンパク質の最近の発見は、ＡＡＶベクターなどの安全性プロファイル及び効率にますます成功を収めたベクターとのこの技術の組み合わせを可能にし、強化した。操作されたＴＣＲ配列は、内因性ＴＣＲ配列を置き換え得るか、又は内因性配列は、そうでなければ不活性化され得る。
【0061】
ＴＣＲ配列をコードする核酸を、発現及び／又は組み込みのためにベクターに挿入する。多くのそのようなベクトルが利用可能である。ベクター構成要素は、一般に、以下の複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。ベクターとしては、ウイルスベクター、プラスミドベクター、組み込みベクターなど、例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルス及びＡＡＶベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。
【0062】
発現ベクターは、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含有し得る。この遺伝子は、選択的培養培地中で成長した形質転換宿主細胞の生存若しくは成長に必要なタンパク質、又は抗体ベースの検出を可能にする表面マーカーをコードする切断遺伝子をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培地中では生存しない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、若しくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠陥を補完する、又は（ｃ）複合培地から入手できない重要な栄養素を供給する、又は（ｄ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）若しくは磁気分離を介した単離のための表面抗体ベースの検出を可能にする、タンパク質、例えば、ＮＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９の切断型をコードする。
【0063】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「作動可能に連結される」。例えば、シグナル配列のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌をシグナル伝達する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結され、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合、連続しており、読み取り段階であることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続している必要はない。
【0064】
特に指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句は、また、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンでイントロンを含み得る範囲内でイントロンを含み得る。
【0065】
発現ベクターは、宿主生物によって認識され、構築物コード配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーターは、それらが作動可能に連結される特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する、構造遺伝子の開始コドンの上流（５’）に位置する非翻訳配列である（一般に、約１００～１０００ｂｐ以内）。そのようなプロモーターは、典型的には、誘導性及び構成性の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件のいくらかの変化、例えば、栄養素の有無又は温度の変化に応答して、それらの制御下のＤＮＡから増加したレベルの転写を開始するプロモーターである。様々な潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターは、周知である。
【0066】
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鳥痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、鳥肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルスＬＴＲ（マウス幹細胞ウイルスなど）、Ｂ型肝炎ウイルス、及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーターによって、異種哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）若しくは免疫グロブリンプロモーターによって、又は熱ショックプロモーターによって制御され得るが、かかるプロモーターは宿主細胞系と互換性があることを条件とする。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。
【0067】
高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加し得る。エンハンサーは、長さが通常約１０～３００ｂｐのＤＮＡのシス作用要素であり、プロモーターに作用して、その転写を増加させる。エンハンサーは、イントロン内、並びにコード配列自体内で、転写単位に対して５’及び３’であることが見出されているため、相対的に配向及び位置に依存しない。現在、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン及びインスリン）からの多くのエンハンサー配列が知られている。しかしながら、典型的には、真核生物ウイルスからのエンハンサーを使用する。例えば、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、コード配列の５’又は３’の位置で発現ベクターにスプライスされ得るが、好ましくは、プロモーターから５’の部位に位置する。
【0068】
真核生物宿主細胞で使用するための発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。かかる配列は、真核生物又はウイルスＤＮＡ若しくはｃＤＮＡの５’及び場合によっては３’の非翻訳領域から一般的に入手可能である。上記の構成要素のうちの１つ以上を含有する好適なベクターの構築は、標準的な技法を用いる。
【0069】
構築物のクローニングに好適な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は他の真核生物細胞である。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、マウスＬ細胞（Ｌ－Ｍ［Ｋ－］、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－２６４８）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胎児性腎臓株（浮遊培養における成長のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１ ５８７）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝細胞腫（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
【0070】
Ｔ細胞、幹細胞などを含む宿主細胞を、構築物発現のために上述の発現ベクターでトランスフェクトすることができる。細胞は、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に修飾された従来の栄養培地中で培養されてもよい。哺乳類宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。ハムのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコの修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞の培養に好適である。これらの培地のうちのいずれかに、必要に応じて、ホルモン及び／若しくは他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びホスファートなど）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質、微量元素、並びにグルコース又は同等のエネルギー源を補充してもよい。任意の他の必要な補充物も、また、当業者に既知の適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともに以前に使用されているものであり、当業者には明らかである。
【0071】
「相同」又は「同一性」という用語は、２つの高分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子若しくは２つのＲＮＡ分子などの２つの核酸分子間、又は２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が、同じ単量体サブユニットによって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置が、アデニンによって占められている場合、それらは、その位置で相同であるか、又は同一である。２つの配列間の相同性は、一致又は相同位置の数の直接関数であり、例えば、２つの配列における位置の半分（例えば、高分子１０サブユニットの長さにおける５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば、１０のうちの９つ）が一致又は相同である場合、２つの配列は９０％相同である。
【0072】
「作動可能に連結された」又は「転写制御」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指し、後者の発現をもたらす。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関連性にあるとき、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、互いに隣接することができ、例えば、必要な場合、２つのタンパク質コード領域を結合するために、同じリーディングフレーム内にある。
【0073】
「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体又は抗体断片の結合特徴に顕著な影響を及ぼさないか、又は変化させないアミノ酸修飾を指す。かかる保存的修飾としては、アミノ酸置換、付加、及び欠失が挙げられる。修飾は、部位指向性変異誘発及びＰＣＲ媒介性変異誘発などの当技術分野で既知の標準技法によって、本発明の抗体又は抗体断片に導入され得る。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐状側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、本発明のＴＣＲ内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、変化したＴＣＲは、本明細書に記載の機能的アッセイを使用して試験することができる。
【0074】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、また、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーにも適用される。
【0075】
「配列同一性」という用語は、ポリペプチド又はＤＮＡ配列に関して本明細書で使用される場合、２つの分子間のサブユニット配列同一性を指す。両方の分子におけるサブユニット位置が、同じ単量体サブユニット（例えば、同じアミノ酸残基又はヌクレオチド）によって占められている場合、分子は、その位置で同一である。２つのアミノ酸又は２つのヌクレオチド配列間の類似性は、同一の位置の数の一次関数である。一般に、配列は、最高次の一致が得られるように整列される。必要な場合、同一性は、公開された技法、及びＧＣＳプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）などの広く利用可能なコンピュータプログラムを使用して計算することができる。
【0076】
「由来する」は、その用語が本明細書で使用される場合、第１の分子と第２の分子との間の関係を示す。これは、一般に、第１の分子と第２の分子との間の構造的類似性を指し、第１の分子に対するプロセス又は供給源の制限を暗示する又は含むものではない。
【0077】
本明細書で「タンパク質バリアント」又は「バリアントタンパク質」又は「バリアントポリペプチド」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって野生型タンパク質とは異なるタンパク質を意味する。親ポリペプチドは、天然に存在する又は野生型（ＷＴ）のポリペプチドであり得るか、又はＷＴポリペプチドの修飾バージョンであり得る。バリアントポリペプチドは、ポリペプチド自体、ポリペプチドを含む組成物、又はそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。好ましくは、バリアントポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して、約１～約１０個のアミノ酸修飾、好ましくは、約１～約５つのアミノ酸修飾を有する。
【0078】
本明細書で使用される場合、「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」、又は「前駆体タンパク質」とは、バリアントを生成するようにその後修飾される非修飾ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、野生型（又は天然）ポリペプチド、又は野生型ポリペプチドのバリアント若しくは操作されたバージョンであり得る。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、又はそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。
【0079】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在する及び合成のアミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ－カルボキシグルタマート、及びＯ－ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」は、天然に存在するアミノ酸、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合するα－炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムと同じ基本化学構造を有する化合物を指す。かかる類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。「アミノ酸模倣物」は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。
【0080】
本明細書に開示されるアミノ酸修飾には、アミノ酸置換、欠失、及び挿入、特にアミノ酸置換が含まれ得る。バリアントタンパク質は、また、サイトカイン及び／又は受容体の他の位置（例えば、親和性操作に関与する位置以外の位置）での保存的修飾及び置換を含み得る。かかる保存的置換には、Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５（１９７８）のＤａｙｈｏｆｆ、及びＥＭＢＯ Ｊ．，８：７７９－７８５（１９８９）のＡｒｇｏｓに記載されているものが含まれる。例えば、以下のグループ、グループＩ：Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、グループＩＩ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、グループＩＩＩ：Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、グループＩＶ：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；グループＶ：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、及びグループＶＩ：Ａｓｐ、Ｇｌｕのうちの１つに属するアミノ酸は、保存的変化を表す。更に、指定されたアミノ酸によるアミノ酸置換は、保存的変化で置き換えられ得る。
【0081】
「単離された」という用語は、その天然環境を実質的に含まない分子を指す。例えば、単離されたタンパク質は、それが由来する細胞又は組織源からの細胞材料又は他のタンパク質を実質的に含まない。この用語は、単離されたタンパク質が、治療用組成物として投与されるために十分に純粋であるか、又は少なくとも７０％～８０％（ｗ／ｗ）純粋、より好ましくは少なくとも８０％～９０％（ｗ／ｗ）純粋、更により好ましくは９０～９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（ｗ／ｗ）純粋である調製物を指す。「分離された」化合物は、化合物が得られた試料の少なくとも１つの構成要素の少なくとも９０％から取り出された化合物を指す。本明細書に記載の任意の化合物は、単離された又は分離された化合物として提供され得る。
【0082】
ライブラリ。本発明のいくつかの実施形態では、通常、ＣＤＲループの１つ以上の残基で修飾された異なるＴＣＲのライブラリである、ポリペプチド又はかかるポリペプチドをコードする核酸のライブラリが提供される。コード配列を組み立てる従来の方法を使用することができる。配列の多様性を生成するために、当該技術分野で既知のランダム化、エラープローンＰＣＲ、変異原性プライマーなどを使用して、一組のポリヌクレオチドを生成する。ポリヌクレオチドのライブラリは、典型的には、目的の宿主細胞に好適なベクターにライゲーションされる。様々な実施形態では、ライブラリは、ポリペプチドをコードする精製されたポリヌクレオチド組成物として提供され、細胞集団は、哺乳類Ｔ細胞であり得るが、これに限定されず、細胞はポリペプチドライブラリを発現するように誘導される。
【0083】
「好適な状態」は、この用語が使用される文脈に依存する意味を有するものとする。すなわち、ｐＭＨＣ複合体へのＴ細胞受容体の結合と関連して使用される場合、用語は、ＴＣＲが同族ペプチドリガンドに結合することを可能にする状態を意味するものとする。この用語が核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用される場合、用語は、少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸が、それに相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズすることを可能にする状態を意味するものとする。細胞への薬剤の接触に関連して使用される場合、この用語は、そうすることができる薬剤が細胞に侵入し、意図した機能を実施することを可能にする状態を意味するものとする。一実施形態では、本明細書で使用される場合、「好適な状態」という用語は、生理学的状態を意味する。
【0084】
「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、治療のために評価される及び／又は治療される哺乳動物を指すために本明細書で互換的に使用される。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、限定されないが、疾患を有する個体を包含する。対象はヒトであってもよいが、他の哺乳動物、特に、ヒト疾患のための実験室モデルとして有用な哺乳動物、例えば、マウス、ラットなども含む。
【0085】
患者に関連しての「試料」という用語は、生体起源の血液及び他の液体試料、生検標本若しくは組織培養物又はそれらに由来する細胞などの固体組織試料、並びにその子孫を包含する。この用語は、また、試薬での処理、洗浄、又は異常細胞などのある特定の細胞集団の富化など、それらの調達後に任意の方法で操作された試料も包含する。定義は、特定の種類の分子、例えば、核酸、ポリペプチドなどについて富化された試料も含む。「生体試料」という用語は、臨床試料を包含し、外科的切除によって得られた組織、生検によって得られた組織、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、組織試料、臓器、骨髄、血液、血漿、血清なども含む。「生体試料」は、患者の異常細胞から得られた試料、例えば、患者の異常細胞から得られるポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを含む試料（例えば、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを含む細胞溶解物又は他の細胞抽出物）、並びに患者からの異常細胞を含む試料を含む。患者からの異常細胞を含む生体試料は、非異常細胞を含むこともできる。
【0086】
「診断」という用語は、本明細書では、対象、個体、又は患者における分子又は病理学的状態、疾患若しくは状態の同定を指すために使用される。
【0087】
「予後」という用語は、本明細書では、対象、個体、又は患者における、再発、広がり、及び薬剤耐性を含む、死亡又は疾患進行の可能性の予測を指すために使用される。「予測」という用語は、本明細書では、観察、経験、又は科学的推論に基づいて、対象、個体、又は患者が特定の事象又は臨床転帰を経験する可能性を予測又は推定する行為を指すために使用される。一例では、医師は、患者が生存する可能性を予測しようとし得る。
【0088】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」などの用語は、対象、個体、又は患者に対する、又は患者における効果を得る目的で、薬剤を投与すること、又は手順を実施することを指す。この効果は、疾患若しくはその症状を完全に若しくは部分的に防止するという点で予防的であり得、かつ／又は疾患及び／若しくは疾患の症状に対する部分的若しくは完全な治癒をもたらすという点で治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおけるがんの治療を含み、（ａ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること、及び（ｂ）疾患又はその症状を緩和すること、すなわち、疾患又はその症状の後退を引き起こすことを含む。
【0089】
治療するとは、疾患の治療若しくは改善若しくは予防の成功のいかなる兆候をも指し得、これには、症状の軽減、寛解、縮小、あるいは患者に対して疾患状態をより許容可能にすること、変性若しくは減少の速度の遅延、又は変性の最終点を衰弱しにくくすることなどの任意の客観的若しくは主観的パラメータが含まれる。症状の治療又は改善は、医師による検査の結果を含む、客観的又は主観的パラメータに基づき得る。したがって、「治療する」という用語は、疾患又は他の疾患に関連する症状又は状態の発症を予防若しくは遅延させるか、緩和するか、又は阻止若しくは阻害するために、操作された細胞を投与することを含む。「治療効果」という用語は、対象における疾患、疾患の症状、又は疾患の副作用の低減、排除、又は予防を指す。
【0090】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、疾患又は障害を治療又は管理するために十分な治療剤のその量を指す。治療有効量とは、疾患の発症を遅延又は最小限にするために十分な、例えば、がんの成長及び拡散を遅延又は最小限にするために十分な治療剤の量を指すことができる。治療有効量は、また、疾患の治療又は管理において治療的利益を提供する治療剤の量を指す場合がある。更に、本発明の治療剤に関しての治療有効量は、疾患の治療若しくは管理において治療的利益を提供する治療剤単独の、又は他の療法と組み合わせた量を意味する。
【0091】
本明細書で使用される場合、「投与レジメン」という用語は、対象に個別に、典型的には、期間で区切られて投与される一連の単位用量（典型的には、２つ以上）を指す。いくつかの実施形態では、所与の治療剤は、１つ以上の用量を含み得る、推奨される投与レジメンを有する。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、複数の用量を含み、各用量は、同じ長さの期間によって互いに分離され、いくつかの実施形態では、投与レジメンは、複数の用量を含み、少なくとも２つの異なる期間が個々の用量を分離する。いくつかの実施形態では、投与レジメン内の全ての用量は、同じ単位用量の量である。いくつかの実施形態では、投与レジメン内の異なる用量は、異なる量である。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、第１の投薬量の第１の用量、続いて、第１の投薬量とは異なる第２の投薬量の１つ以上の追加の用量を含む。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、第１の投薬量の第１の用量、続いて、第１の投薬量と同じ第２の投薬量の１つ以上の追加の用量を含む。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、関連集団にわたって投与されるときに、所望の又は有益な転帰と相関する（すなわち、治療的投与レジメンである）。
【0092】
「との組み合わせ」、「併用療法」、及び「併用生成物」は、ある特定の実施形態では、本明細書に記載の操作されたタンパク質及び細胞を、追加の療法、例えば、手術、放射線、化学療法などと組み合わせて患者に同時投与することを指す。組み合わせて投与する場合、各構成要素は、同時に、又は異なる時点で任意の順序で順次投与することができる。したがって、各構成要素は、所望の治療効果を提供するために、別々に、しかし時間内に十分に近い間隔で投与することができる。
【0093】
「併用投与」とは、組み合わせが治療効果を有するような時間で、操作されたタンパク質及び細胞、既知の治療剤などの１つ以上の構成要素の投与を意味する。かかる併用投与は、構成要素の同時投与（すなわち、同時に）、事前投与、又は後続投与を伴い得る。当業者であれば、投与の適切なタイミング、順番、及び投与量を決定することに困難はない。
【0094】
「組み合わせて」という用語の使用は、障害を有する対象に予防剤及び／又は治療剤を投与する順序を限定するものではない。第１の予防剤又は治療剤は、障害を有する対象への第２の予防剤又は治療剤の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）に、それと同時に、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与され得る。
【0095】
化学療法には、Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ（メトトレキサート注射）、Ａｂｒａｘａｎｅ（パクリタキセル注射）、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（ブレンツキシマブベドチン注射）、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（ドキソルビシン）、Ａｄｒｕｃｉｌ注射（５－ＦＵ（フルオロウラシル））、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（エベロリムス）、Ａｆｉｎｉｔｏｒ Ｄｉｓｐｅｒｚ（エベロリムス）、Ａｌｉｍｔａ（ＰＥＭＥＴ ＥＸＥＤ）、Ａｌｋｅｒａｎ注射（メルファラン注射）、Ａｌｋｅｒａｎ錠（メルファラン）、Ａｒｅｄｉａ（パミドロネート）、Ａｒｉｍｉｄｅｘ（アナストロゾール）、Ａｒｏｍａｓｉｎ（エクセメスタン）、Ａｒｒａｎｏｎ（ネララビン）、Ａｒｚｅｒｒａ（オファツムマブ注射）、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ）、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（ブレオマイシン）、Ｂｏｓｕｌｉｆ（ボスチニブ）、Ｂｕｓｕｌｆｅｘ注射（ブスルファン注射）、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（イリノテカン）、Ｃａｐｒｅｌｓａ（バンデタニブ）、Ｃａｓｏｄｅｘ（ビカルタミド）、ＣｅｅＮＵ（ロムスチン）、ＣｅｅＮＵ用量包装（ロムスチン）、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（ダウノルビシン）、Ｃｌｏｌａｒ（クロファラビン注射）、Ｃｏｍｅｔｒｉｑ（カボザンチニブ）、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（ダクチノマイシン）、ＣｙｔｏｓａｒＵ（シタラビン）、Ｃｙｔｏｘａｎ（シトキサン）、Ｃｙｔｏｘａｎ注射（シクロホスファミド注射）、Ｄａｃｏｇｅｎ（デシタビン）、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（ダウノルビシン脂質複合体注射）、Ｄｅｃａｄｒｏｎ（デキサメタゾン）、ＤｅｐｏＣｙｔ（シタラビン脂質複合体注射）、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ Ｉｎｔｅｎｓｏｌ（デキサメタゾン）、Ｄｅｘｐａｋ Ｔａｐｅｒｐａｋ（デキサメタゾン）、Ｄｏｃｅｆｒｅｚ（ドセタキセル）、Ｄｏｘｉｌ（ドキソルビシン脂質複合体注射）、Ｄｒｏｘｉａ（ヒドロキシ尿素）、ＤＴＩＣ（ダカルバジン）、Ｅｌｉｇａｒｄ（リュープロリド）、Ｅｌｌｅｎｃｅ（Ｅｌｌｅｎｃｅ（エピルビシン））、Ｅｌｏｘａｔｉｎ（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（オキサリプラチン））、Ｅｌｓｐａｒ（アスパラギナーゼ）、Ｅｍｃｙｔ（エストラムスティン）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、Ｅｒｉｖｅｄｇｅ（ビスモデギブ）、Ｅｒｗｉｎａｚｅ（アスパラギナーゼＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、Ｅｔｈｙｏｌ（アミフォスチン）、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（エトポシド注射）、Ｅｕｌｅｘｉｎ（フルタミド）、Ｆａｒｅｓｔｏｎ（トレミフェン）、Ｆａｓｌｏｄｅｘ（フルベストラント）、Ｆｅｍａｒａ（レトロゾール）、Ｆｉｒｍａｇｏｎ（デガレリックス注射）、Ｆｌｕｄａｒａ（フルダラビン）、Ｆｏｌｅｘ（メトトレキサート注射）、Ｆｏｌｏｔｙｎ（プララトレキサート注射）、ＦＵＤＲ（ＦＵＤＲ（フロクスウリジン））、Ｇｅｍｚａｒ（ゲムシタビン）、Ｇｉｌｏｔｒｉｆ（アファチニブ）、Ｇｌｅｅｖｅｃ（メシル酸イマチニブ）、Ｇｌｉａｄｅｌ Ｗａｆｅｒ（カルムスチンウェハー）、Ｈａｌａｖｅｎ（エリブリン注射）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（アルトレタミン）、Ｈｙｃａｍｔｉｎ（トポテカン）、Ｈｙｃａｍｔｉｎ（トポテカン）、Ｈｙｄｒｅａ（ヒドロキシ尿素）、ｌｃｌｕｓｉｇ（ポナチニブ）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ ＰＦＳ（イダルビシン）、Ｉｆｅｘ（イホスファミド）、Ｉｎｌｙｔａ（アキシチニブ）、Ｉｎｔｒｏｎ Ａ ａｌｆａｂ（インターフェロンアルファ－２ａ）、Ｉｒｅｓｓａ（ゲフィチニブ）、Ｉｓｔｏｄａｘ（ロミデプシン注射）、Ｉｘｅｍｐｒａ（イキサベピロン注射）、Ｊａｋａｆｉ（ルクソリチニブ）、Ｊｅｖｔａｎａ（カバジタキセル注射）、Ｋａｄｃｙｌａ（アドトラスツズマブエムタンシン）、Ｋｙｐｒｏｌｉｓ（カルフィルゾミブ）、Ｌｅｕｋｅｒａｎ（クロラムブシル）、Ｌｅｕｋｉｎｅ（サルグラモスチム）、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（クラドリビン）、Ｌｕｐｒｏｎ（リュープロリド）、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（リュープロリド）、Ｌｕｐｒｏｎ ＤｅｐｏｔＰＥＤ（リュープロリド）、Ｌｙｓｏｄｒｅｎ（ミトタン）、Ｍａｒｑｉｂｏ Ｋｉｔ（ビンクリスチン Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ注射）、Ｍａｔｕｌａｎｅ（プロカルバジン）、Ｍｅｇａｃｅ（メゲストロール）、Ｍｅｋｉｎｉｓｔ（トラメチニブ）、Ｍｅｓｎｅｘ（メスナ）、Ｍｅｓｎｅｘ（メスナ注射）、Ｍｅｔａｓｔｒｏｎ（ストロンチウム－８９クロリド）、Ｍｅｘａｔｅ（メトトレキサート注射）、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（メクロレタミン）、Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（マイトマイシン）、Ｍｙｌｅｒａｎ（ブスルファン）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオゾガマイシン）、Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（ビノレルビン）、Ｎｅｏｓａｒ注射（シクロホスファミド注射）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（フィルグラスチム）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（ペグフィルグラスチム）、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（フィルグラスチム）、Ｎｅｘａｖａｒ（ソラフェニブ）、Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（ニルタミド））、Ｎｉｐｅｎｔ（ペントスタチン）、Ｎｏｌｖａｄｅｘ（タモキシフェン）、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（ミトキサントロン）、Ｏｎｃａｓｐａｒ（ペグアスパラガーゼ）、Ｏｎｃｏｖｉｎ（ビンクリスチン）、Ｏｎｔａｋ（デニロイキンジフチトクス）、Ｏｎｘｏｌ（パクリタキセル注射）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（アリトレチノイン）、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（カルボプラチン）、Ｐｅｒｊｅｔａ（ペルツズマブ注射）、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（シスプラチン）、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（シスプラチン注射）、ＰｌａｔｉｎｏｌＡＱ（シスプラチン）、ＰｌａｔｉｎｏｌＡＱ（シスプラチン注射）、Ｐｏｍａｌｙｓｔ（ポマリドミド）、Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ Ｉｎｔｅｎｓｏｌ（プレドニゾン）、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（アルデスロイキン）、Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（メルカプトプリン）、Ｒｅｃｌａｓｔ（ゾレドロン酸）、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（レナリドマイド）、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（メトトレキサート）、Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ）、ＲｏｆｅｒｏｎＡ ａｌｆａａ（インターフェロンアルファ－２ａ）、Ｒｕｂｅｘ（ドキソルビシン）、Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ（オクトレオチド）、Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ ＬＡＲ Ｄｅｐｏｔ（オクトレオチド）、Ｓｏｌｔａｍｏｘ（タモキシフェン）、Ｓｐｒｙｃｅｌ（ダサチニブ）、Ｓｔｅｒａｐｒｅｄ（プレドニゾン）、Ｓｔｅｒａｐｒｅｄ ＤＳ（プレドニゾン）、Ｓｔｉｖａｒｇａ（レゴラフェニブ）、Ｓｕｐｐｒｅｌｉｎ ＬＡ（ヒストレリンインプラント）、Ｓｕｔｅｎｔ（スニチニブ）、Ｓｙｌａｔｒｏｎ（ペグインターフェロンアルファ－２ｂ注射（Ｓｙｌａｔｒｏｎ））、Ｓｙｎｒｉｂｏ（オマセタキシン注射）、Ｔａｂｌｏｉｄ（チオグアニン）、Ｔａｆｌｉｎａｒ（ダブラフェニブ）、Ｔａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）、Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ Ｃａｐｓｕｌｅｓ（ベキサロテン）、Ｔａｓｉｇｎａ（ダカルバジン）、Ｔａｘｏｌ（パクリタキセル注射）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（ドセタキセル）、Ｔｅｍｏｄａｒ（テモゾロミド）、Ｔｅｍｏｄａｒ（テモゾロミド注射）、Ｔｅｐａｄｉｎａ（チオテパ）、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（サリドマイド）、ＴｈｅｒａＣｙｓ ＢＣＧ（ＢＣＧ）、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（チオテパ）、ＴＩＣＥ ＢＣＧ（ＢＣＧ）、Ｔｏｐｏｓａｒ（エトポシド注射）、Ｔｏｒｉｓｅｌ（テムシロリムス）、Ｔｒｅａｎｄａ（塩酸ベンダムスチン）、Ｔｒｅｌｓｔａｒ（トリプトレリン注射）、Ｔｒｅｘａｌｌ（メトトレキサート）、Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（三酸化ヒ素）、Ｔｙｋｅｒｂ（ラパチニブ）、Ｖａｌｓｔａｒ（バルルビシン膀胱内）、Ｖａｎｔａｓ（ヒストレリンインプラント）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（パニツムマブ）、Ｖｅｌｂａｎ（ビンブラスチン）、Ｖｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミブ）、Ｖｅｐｅｓｉｄ（エトポシド）、Ｖｅｐｅｓｉｄ（エトポシド注射）、Ｖｅｓａｎｏｉｄ（トレチノイン）、Ｖｉｄａｚａ（アザシチジン）、Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ（ビンクリスチン）、Ｖｉｎｃｒｅｘ（ビンクリスチン）、Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（パゾパニブ）、Ｖｕｍｏｎ（テニポシド）、Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ ＩＶ（ロイコボリン注射）、Ｘａｌｋｏｒｉ（クリゾチニブ）、Ｘｅｌｏｄａ（カペシタビン）、Ｘｔａｎｄｉ（エンザルタミド）、Ｙｅｒｖｏｙ（イピリムマブ注射）、Ｚａｌｔｒａｐ（Ｚｉｖ－アフリベルセプト注射）、Ｚａｎｏｓａｒ（ストレプトゾシン）、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（ベムラフェニブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（イブリツモマブチウキセタン）、Ｚｏｌａｄｅｘ（ゴセレリン）、Ｚｏｌｉｎｚａ（ボリノスタット）、Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロン酸）、Ｚｏｒｔｒｅｓｓ（エベロリムス）、Ｚｙｔｉｇａ（アビラテロン）、ニモツズマブ、並びにＰＤ－１を標的とするニボルマブ、ペンブロリズマブ／ＭＫ－３４７５、ピジリズマブ及びＡＭＰ－２２４などの免疫チェックポイント阻害剤、並びにＰＤ－Ｌ１を標的とするＢＭＳ－９３５５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ及びＭＳＢ００１０７１８Ｃ、並びにイピリムマブなどのＣＴＬＡ－４を標的とするものが含まれ得る。
【0096】
放射線療法とは、病気を治療するために放射線、通常はＸ線の使用を意味する。Ｘ線は、１８９５年に発見され、それ以来放射線は、診断及び調査（Ｘ線）及び治療（放射線療法）のための医学において使用されてきた。放射線療法は、Ｘ線、コバルト照射、電子、及びより稀に陽子などの他の粒子を使用して、体外から外部放射線療法として行われ得る。放射性金属又は液体（同位体）を使用して、がんを治療する内部放射線療法として、体内からも使用することができる。
【0097】
操作されたＴ細胞受容体及び細胞組成物
操作されたＴＣＲ配列を含むポリペプチド構築物及び組成物が提供される。いくつかの実施形態では、操作されたＴＣＲは、ＭＡＧＥ－Ａ３に特異的であり、配列番号１のアルファ鎖（ＴＣＲα）又はその成熟タンパク質、すなわち、残基１～１８のシグナル配列を欠いており、Ｄ２８、Ａ３０、Ｉ５１、Ｑ５２、Ｓ５３、及びＳ５４（成熟タンパク質配列に対する番号付け）から選択される１つ以上の残基で標的活性化効力を増強するための少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｄ２８Ｈ／Ｎ／Ｇ／Ｋ／Ｓ、Ａ３０Ｈ／Ｓ／Ｅ／Ｎ／Ｇ、Ｉ５１Ｖ、Ｑ５２Ｒ／Ｈ、Ｓ５３Ｐ、Ｓ５４Ｙ／Ｎ／Ｒ／Ｅ／Ｄ／Ｈから選択される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲαは、配列番号２～配列番号１５から選択される配列、又はそれに由来するバリアントを有する。バリアントは、配列番号２～１５の参照配列に対する少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性を含み得る。かかる実施形態のいずれかでは、ベータ鎖（ＴＣＲβ）は、配列番号１６に示される配列を有し得る。ＭＡＧＥ－Ａ３操作されたＴＣＲは、ヒトタイチン配列に対して顕著な親和性を有しない。
操作されたＴＣＲ配列を含むポリペプチド構築物及び組成物が提供される。いくつかの実施形態では、操作されたＴＣＲは、ＭＡＧＥ－Ａ３に特異的であり、配列番号１のアルファ鎖（ＴＣＲα）又はその成熟タンパク質、すなわち、残基１～１８のシグナル配列を欠いており、Ｄ２８、Ａ３０、Ｉ５１、Ｑ５２、Ｓ５３、及びＳ５４（成熟タンパク質配列に対する番号付け）から選択される１つ以上の残基で標的活性化効力を増強するための少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｄ２８Ｈ／Ｎ／Ｇ／Ｋ／Ｓ、Ａ３０Ｈ／Ｓ／Ｅ／Ｎ／Ｇ、Ｉ５１Ｖ、Ｑ５２Ｒ／Ｈ、Ｓ５３Ｐ、Ｓ５４Ｙ／Ｎ／Ｒ／Ｅ／Ｄ／Ｈから選択される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲαは、配列番号２～配列番号１５から選択される配列、又はそれに由来するバリアントを有する。バリアントは、配列番号２～１５の参照配列に対する少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性を含み得る。かかる実施形態のいずれかでは、ベータ鎖（ＴＣＲβ）は、配列番号１６に示される配列を有し得る。ＭＡＧＥ－Ａ３操作されたＴＣＲは、ヒトタイチン配列に対して顕著な親和性を有しない。
【0098】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＣＲは、ＴＣＲ５５アルファ鎖（配列番号１７）及びＴＣＲ５５ベータ鎖（配列番号１８）のアミノ酸修飾に基づいて、ＨＬＡ－Ｂ３５によって提示されるＨＩＶペプチドに特異的である。アミノ酸修飾としては、Ｂ３５－ＨＩＶによってＴＣＲ５５を活性化させるための配列番号１７ Ａ９８Ｄ、Ａ９８Ｅ、Ａ９８Ｆ、Ａ９８Ｑ、Ａ９８Ｙ、Ａ９８Ｈが挙げられるが、これらに限定されない。ＴＣＲ５５ベータ鎖（配列番号１８）におけるアミノ酸修飾としては、Ｂ３５－ＨＩＶによってＴＣＲ５５を活性化させるためのＡ５０Ｄ、Ａ５０Ｅ、Ａ５０Ｆ、Ａ５０Ｈ、Ａ５０Ｎ、Ａ５０Ｑ、Ａ５０Ｓ、Ａ５０Ｔ、Ａ５０Ｙが挙げられるが、これらに限定されない。
【0099】
操作されたＴＣＲ、例えば、ＭＡＧＥ－Ａ３に特異的なＴＣＲは、約０．５～約１００μＭの３Ｄ ｌｏｇ ＫＤ（μＭ）を有し得、約１～約１００μＭ、約１～約５０μＭであり得る。「親和性」は、結合の強さを指し、結合親和性の増加は、より低いＫＤと相関する。一実施形態では、親和性は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステムによって使用される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される。１つの分子の別の分子に対する親和性は、相互作用の結合速度、例えば、２５℃で測定することによって決定される。操作されたＴＣＲは、抗原に応答するＴ細胞増殖、抗原に応答するＩＬ－２の放出、抗原に応答するＴ細胞上のＣＤ６９の上方調節などを含むが、これらに限定されない、任意の好都合なアッセイによって測定される標的活性化効力のために望ましく選択される。
【0100】
また、操作されたＴＣＲ配列及びその構築物をコードする単離された核酸、核酸を含むベクター及び宿主細胞、並びにポリペプチド構築物の産生のための組換え技法も提供される。目的の核酸は、提供されるポリペプチド配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％同一であるポリペプチドをコードする。ポリヌクレオチド配列は、提供される配列のいずれか又は全てをコードし得る。
【0101】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＣＲ配列又は操作されたＴＣＲ構築物をコードするコード配列を含むベクターが提供され、コード配列は、所望の細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結されているか、又は例えば、ＣＲＩＳＰＲによるゲノム挿入に好適なベクターにおいて提供される。様々なベクター、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ミニサークルベクターが、当該技術分野において既知であり、この目的のために使用することができ、これらのベクターは、標的細胞ゲノムに組み込むことができるか、又はエピソームにより維持することができる。
【0102】
本発明の別の実施形態では、単離されたポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む製造物品が提供される。製造物品は、容器及びラベルを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、例えば、がんを治療するための治療組成物であり得るポリペプチド又はポリヌクレオチド組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。容器上の、又は容器に関連するラベルは、組成物が選択された状態を治療するために使用されることを示す。更なる容器は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液又はデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を保持し得る製造物品とともに提供され得る。製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、及び使用説明書を伴うパッケージインサートを含む、商業的及び使用者の立場から望ましい他の材料を更に含み得る。
【0103】
いくつかの実施形態では、細胞組成物が提供される。細胞は、療法のための単位用量で提供され得、意図されたレシピエントに関して同種異系、自己などであり得る。方法は、生体試料から単離され得るか、又はインビトロで前駆細胞源に由来し得る、所望の細胞、例えば、Ｔ細胞、造血幹細胞などを得るステップを含み得る。細胞は、操作されたＴＣＲをコードする配列を含むベクターによって形質導入又はトランスフェクトされ、このステップは、任意の好適な培養培地において実施され得る。例えば、細胞は、患者から収集され、エクスビボで修飾され、対象に再導入され得る。対象から収集された細胞は、例えば、末梢血（例えば、対象の末梢血）、生検（例えば、対象からの生検）などを含む任意の便利で適切な供給源から収集され得る。
【0104】
自家細胞の使用が望ましくない場合、例えば、患者が修飾のためのＴ細胞を十分に有しない場合、自家細胞を拡大する時間が不十分である場合などに、同種異系細胞、例えば、健常なドナーからのＴ細胞又は幹細胞が使用され得る。かかる同種異系細胞は、ＧＶＨＤを低減するために、宿主対移植片応答を低減するなどのために、遺伝子修飾することができる。
【0105】
操作された細胞は、治療的使用、例えばヒト治療に好適な薬学的組成物中に提供され得る。かかる細胞を含む治療製剤は、水溶液の形態で、凍結されるか、又は生理学的に許容される担体、賦形剤若しくは安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））とともに投与するために調製され得る。細胞は、良好な医療行為と一致する様式で製剤化、投薬、及び投与される。この文脈で考慮される因子には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール、及び医師に既知の他の因子が含まれる。
【0106】
エフェクターＴ細胞は、目的の抗原を発現する標的細胞に対して細胞溶解活性を有する自家又は同種異系の免疫細胞を含む。エフェクター細胞は、Ｔ細胞抗原受容体による認識を通して細胞溶解活性を有する。「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ３及び／又はＴ細胞抗原受容体の発現によって特徴付けられ得る哺乳類免疫エフェクター細胞を指す。
【0107】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、治療を必要とする個体から単離された免疫細胞、例えば、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の複雑な混合物を含む。例えば、Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２０１６）Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：２７９－９４，“Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ；Ｆｅｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．４２（４）：６２６－３９ “Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ ＮＣＴ０１１７４１２１，“Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｕｓｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｏｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ”、Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４（６１８４）６４１－６４５，“Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ”を参照されたい。
【0108】
他の実施形態では、操作されたＴ細胞は、治療される個体に関して同種異系である。レビューについては、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌｓ．７（１０）Ｅ１５５を参照されたい。いくつかの実施形態では、同種遺伝子操作Ｔ細胞は、完全にマッチングされたＨＬＡである。しかしながら、全ての患者が完全に一致するドナーを有するわけではなく、ＨＬＡタイプとは独立した全ての患者に好適な細胞製品が代替手段を提供する。普遍的な「既製の」Ｔ細胞産物は、採取及び製造の均一性に利点を提供する。
【0109】
Ｔ細胞は、遺伝子修飾され得る。例えば、内因性ＴＣＲαβ受容体は、異なる遺伝子編集技法によってノックアウトすることができる。ＴＣＲαβはヘテロ二量体であり、アルファ鎖及びベータ鎖の両方が発現するために存在する必要がある。アルファ鎖のための単一の遺伝子コード（ＴＲＡＣ）が存在する一方で、ベータ鎖のための遺伝子コードは２つ存在するため、ＴＲＡＣ遺伝子座ＫＯは、この目的のために欠失されている。この欠失を達成するために、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、メガヌクレアーゼ、操作されたＩ－ＣｒｅＩホーミングエンドヌクレアーゼなどのいくつかの異なるアプローチが使用されている。
【0110】
同種異系Ｔ細胞は、リンパ枯渇の強化と組み合わせて投与されて、例えば、アレムツズマブ（モノクローナル抗ＣＤ５２）、プリン類似体などの投与によって、操作されたＴ細胞が、宿主免疫回復前に拡大し、悪性細胞を除去することを可能にしてもよい。同種異系Ｔ細胞は、アレムツズマブに対する耐性のために修飾され得、現在臨床試験中である。遺伝子編集は、また、例えば、β２－ミクログロブリンの欠失によって、ＣＡＲ－Ｔ細胞上のＨＬＡクラスＩ分子の発現を防止するためにも使用されている（ＮＣＴ０３１６６８７８を参照されたい）。
【0111】
対象又はドナーから収集した上述の操作のためのＴ細胞は、所望の細胞を富化する技法によって細胞の混合物から分離され得るか、又は分離することなく操作され、培養され得る。適切な溶液が、分散又は懸濁に使用され得る。かかる溶液は、概して、低濃度、概して５～２５ｍＭの許容可能な緩衝液と併せて、好都合に、ウシ胎仔血清又は他の天然に存在する因子を補充された、平衡塩溶液、例えば、標準の生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩溶液などである。好都合な緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などが挙げられる。
【0112】
細胞は、任意の好適な手段、通常は非経口的手段によって投与することができる。非経口注入としては、筋肉内、静脈内（ボーラス又はゆっくりとした点滴）、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、又は皮下投与が挙げられる。
【0113】
操作された細胞は、治療的使用、例えばヒト治療に好適な薬学的組成物中に提供され得る。かかる細胞を含む治療製剤は、水溶液の形態で、凍結されるか、又は生理学的に許容される担体、賦形剤若しくは安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））とともに投与するために調製され得る。細胞は、良好な医療行為と一致する様式で製剤化、投薬、及び投与される。この文脈で考慮される因子には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール、及び医師に既知の他の因子が含まれる。
【0114】
治療方法
操作されたＴ細胞は、任意の生理学的に許容される培地、通常は血管内で対象に注入され得るが、それらは、また、細胞が成長のための適切な部位を見出すことができる任意の他の好都合な部位に導入され得る。通常、少なくとも１×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０７個の細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０８個の細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０９個の細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０１０個の細胞／ｋｇ以上が投与され、通常、収集中に得られるＴ細胞の数によって制限される。
操作されたＴ細胞は、任意の生理学的に許容される培地、通常は血管内で対象に注入され得るが、それらは、また、細胞が成長のための適切な部位を見出すことができる任意の他の好都合な部位に導入され得る。通常、少なくとも１×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０７個の細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０８個の細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０９個の細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０１０個の細胞／ｋｇ以上が投与され、通常、収集中に得られるＴ細胞の数によって制限される。
【0115】
例えば、本発明の実施における使用のための細胞の投与の典型的な範囲は、治療の経過ごとに、対象の体重１ｋｇ当たり約１×１０５～５×１０８個の生存細胞の範囲である。したがって、体重に関して調整すると、ヒト対象における生存細胞の投与の典型的な範囲は、治療経過ごとに、およそ１×１０６～およそ１×１０１３個の生存細胞、代替的に、およそ５×１０６～およそ５×１０１２個の生存細胞、代替的に、およそ１×１０７～およそ１×１０１２個の生存細胞、代替的に、およそ５×１０７～およそ１×１０１２個の生存細胞、代替的に、およそ１×１０８～およそ１×１０１２個の生存細胞、代替的に、およそ５×１０８～およそ１×１０１２個の生存細胞、代替的に、およそ１×１０９～およそ１×１０１２個の生存細胞の範囲である。一実施形態では、細胞の用量は、治療経過ごとに２．５～５×１０９個の生存細胞の範囲内である。
【0116】
治療の経過は、単回投与又は一定期間にわたる複数回投与であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、単回用量で投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２１、２８、３０、６０、９０、１２０、又は１８０日間にわたって投与される２つ以上の分割用量で投与される。このような分割投薬プロトコルで投与される操作された細胞の量は、各投与において同じであっても、異なるレベルで提供されてもよい。時間周期にわたる複数日間の投与プロトコルは、上記で考察した治療の副作用及びそれらの調節を含む治療に対する対象の応答を考慮して、細胞の投与を監視する当業者（例えば、医師）によって提供され得る。
【0117】
一実施形態では、本発明は、養子Ｔ細胞療法（例えば、がん）による治療に修正可能な疾患、障害、又は状態に罹患している対象を、有効量の本明細書に開示される操作された細胞の投与によって治療する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、異常な細胞集団（例えば、腫瘍）の存在に関連する疾患、障害に罹患している哺乳類対象の治療方法を提供し、該細胞集団は、１つ以上の表面抗原（例えば、腫瘍抗原）の発現を特徴とし、方法は、（ａ）個体からＴ細胞を含む生体試料を得るステップと、（ｂ）Ｔ細胞の存在のために生体試料を富化するステップと、（ｃ）Ｔ細胞を、操作されたＴＣＲをコードする核酸配列を含む１つ以上の発現ベクターでトランスフェクトするステップと、（ｄ）ＴＣＲ発現Ｔ細胞の集団をエクスビボで拡大するステップと、（ｅ）薬学的に有効な量のＴＣＲ発現Ｔ細胞を哺乳動物に投与するステップとを含む。一実施形態では、前述した方法は、Ｔ細胞療法過程の開始前の哺乳動物のリンパ枯渇又は免疫抑制と関連付けられる。別の実施形態では、前述した方法は、哺乳類のリンパ枯渇及び／又は免疫抑制の不在下で実施される。
【0118】
治療的使用のための好ましい製剤は、意図される投与様式及び治療的用途に依存する。組成物は、また、所望の製剤に応じて、薬学的に許容される非毒性担体又は希釈剤を含み得、これらは、動物又はヒトの投与のための薬学的組成物を製剤化するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を与えないように選択される。かかる希釈剤の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液である。加えて、薬学的組成物又は製剤は、他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤なども含み得る。
【0119】
更にいくつかの他の実施形態では、薬学的組成物は、また、タンパク質などの大きな、ゆっくりと代謝された巨大分子、キトサンなどの多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びコポリマー（ラテックス官能化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、アガロース、セルロースなど）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び脂質凝集体（油滴又はリポソームなど）を含むことができる。
【0120】
許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒であり、ホスファート、シトラート及び他の有機酸などの緩衝液、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤（例えば、オクタデシイジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール、メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール及びｍ－クレゾール）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリジンなどのアミノ酸、単糖、二糖、及びグルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、ショ糖、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）、並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【0121】
インビボ投与に使用される製剤は、典型的には滅菌である。本発明の組成物の滅菌は、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成され得る。
【0122】
典型的には、組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして注射剤として調製され得るが、注射前の液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に好適な固体形態も調製され得る。調製物は、また、上記で考察したように、増強されたアジュバント効果のために、ポリラクチド、ポリグリコリド若しくはコポリマーなどのリポソーム又は微粒子中に乳化又は封入することができる。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７，１９９０及びＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８：９７－１１９，１９９７。本発明の薬剤は、活性成分の持続的又は脈動的放出を可能にするような様式で製剤化することができるデポ注射又はインプラント調製物の形態で投与することができる。薬学的組成物は、一般に、滅菌で、実質的に等張であり、Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎの全てのＧｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）規則に完全に準拠しているように製剤化される。
【0123】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物、方法、及びキットは、Ｔ細胞媒介性免疫応答を増強するために使用される。いくつかの実施形態では、免疫応答は、標的細胞、例えば、がん細胞、感染細胞、自己免疫疾患に関与する免疫細胞などを枯渇又は調節することが望ましい状態に向けられる。いくつかの実施形態では、状態は、がんである。本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、細胞の異常な、制御されていない成長によって引き起こされる様々な状態を指す。「がん細胞」と称されるがんを引き起こすことができる細胞は、制御不能な増殖、不死性、転移能、速い成長及び増殖速度、並びに／又はある特定の典型的な形態学的特徴などの特徴のある特性を有する。がんは、限定されないが、腫瘍の存在を検出すること（例えば、臨床又は放射線手段により）、腫瘍内又は別の生体試料から（例えば、組織生検から）の細胞を調べること、がんを示す血液マーカーを測定すること、及びがんを示す遺伝子型を検出することを含む、いくつかの方法のうちのいずれかで検出され得る。しかしながら、上記の検出方法のうちの１つ以上における陰性結果は、必ずしもがんの不在を示すわけではなく、例えば、がん治療に対して完全な応答を示した患者は、その後の再発によって証明されるように、依然としてがんを有し得る。
【0124】
スクリーニングの方法
高いシグナル伝達活性化及び低いオフターゲット交差反応性のためのＴＣＲ配列を変異誘発し選択するための組成物及び方法が提供される。かかるスクリーニング方法では、最適化のために、ＴＣＲ配列上の所定のアミノ酸残基におけるアミノ酸変動を含むライブラリを生成する。変異誘発のために選択される残基は、通常、ＴＣＲのＣＤＲ領域のうちの１つ以上内にある。ＴＣＲα配列は、変異誘発され、非変異誘発ＴＣＲβと対合され得るか、又はＴＣＲα配列は、変異誘発され、非変異誘発ＴＣＲβと対合され得る。ライブラリは、発現のために哺乳類細胞（哺乳類Ｔ細胞株を含む）に導入される。細胞は、最初に、同族ｐＭＨＣへの低親和性結合、例えば、標識ｐＭＨＣ四量体、多量体などへの結合、及びフローサイトメトリーなどによる選別によって、例えば、約０．１～約１００μＭの３Ｄ ｌｏｇ ＫＤ（μＭ）での低親和性結合のために選択される。
高いシグナル伝達活性化及び低いオフターゲット交差反応性のためのＴＣＲ配列を変異誘発し選択するための組成物及び方法が提供される。かかるスクリーニング方法では、最適化のために、ＴＣＲ配列上の所定のアミノ酸残基におけるアミノ酸変動を含むライブラリを生成する。変異誘発のために選択される残基は、通常、ＴＣＲのＣＤＲ領域のうちの１つ以上内にある。ＴＣＲα配列は、変異誘発され、非変異誘発ＴＣＲβと対合され得るか、又はＴＣＲα配列は、変異誘発され、非変異誘発ＴＣＲβと対合され得る。ライブラリは、発現のために哺乳類細胞（哺乳類Ｔ細胞株を含む）に導入される。細胞は、最初に、同族ｐＭＨＣへの低親和性結合、例えば、標識ｐＭＨＣ四量体、多量体などへの結合、及びフローサイトメトリーなどによる選別によって、例えば、約０．１～約１００μＭの３Ｄ ｌｏｇ ＫＤ（μＭ）での低親和性結合のために選択される。
【0125】
例えば、ＭＨＣは、例えば、フローサイトメトリー、質量サイトメトリーなどのために、検出可能な標識を有する試薬に多量体化され得る。例えば、ＦＡＣＳ選別を使用して、ＴＣＲに結合するペプチドリガンドを有する細胞の濃度を増加させることができる。技法としては、蛍光活性化セルソーターが挙げられ、これは、複数のカラーチャネル、低角度及び鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなどの様々な程度の洗練度（ｓｏｐｈｉｓｔｉｃａｔｉｏｎ）を有することができる。
【0126】
低親和性ＴＣＲ配列を、抗原に応答してＴ細胞を活性化する能力についてスクリーニングする。最初のスクリーニングがＴ細胞において行われた場合、Ｔ細胞は、直接スクリーニングされてもよく、代替的に、低親和性結合ＴＣＲの配列が、活性化スクリーニングのためにＴ細胞に導入される。低抗原親和性を有するＴＣＲを発現するＴ細胞の集団は、抗原源、例えば、同族抗原を発現する標的細胞、ｐＭＨＣ基質、抗原性ペプチドでパルスされた抗原提示細胞などとともに、Ｔ細胞を活性化するために十分な期間インキュベートされる。Ｔ細胞は、例えば、増殖、ＩＬ－２放出、ＣＤ６９上方調節などにより、高レベルの活性化のために選択される。好都合に、ＣＤ６９の上方調節は、抗体染色及びフローサイトメトリーによって選択される。かかる選択は、上位２０％、上位１０％、上位５％、上位１％の細胞が選択される相対値に基づいてもよい。選択された集団が所望のレベルの親和性及び活性化を有するまで、選択ラウンドが実施される。通常は、少なくとも３ラウンド、より通常は少なくとも４ラウンドの選択が実施される。得られた操作されたＴＣＲは、低オフターゲット交差反応性及び高オンターゲット活性化について検証され得る。
【0127】
最後の選択ラウンドの後、ポリヌクレオチドは選択された宿主細胞から単離され、選択されたＴＣＲの配列は、通常、ハイスループット配列決定によって決定される。所望の親和性は、約１０－６Ｍ～約１０－９ＭのＫＤにあり得る。
【0128】
ペプチド配列結果及びデータベース検索結果は、それらの使用を容易にするために、様々な媒体で提供され得る。「媒体」は、本発明の発現レパートリー情報を含む製造物を指す。本発明のデータベースは、コンピュータ可読媒体、例えば、コンピュータによって直接読み取り、アクセスすることができる任意の媒体に記録され得る。かかる媒体としては、限定されないが、磁気ディスク、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープなどの磁気記憶媒体、ＣＤ－ＲＯＭなどの光学記憶媒体、ＲＡＭ及びＲＯＭなどの電気記憶媒体、並びに磁気／光学記憶媒体などのこれらのカテゴリのハイブリッドが挙げられる。当業者は、現在知られているコンピュータ可読媒体のいずれかを使用して、本データベース情報の記録を含む製造物を作成する方法を容易に理解することができる。「記録された」とは、当該技術分野で既知である任意のかかる方法を使用して、コンピュータ可読媒体に情報を記憶するためのプロセスを指す。記憶された情報にアクセスするために使用される手段に基づいて、任意の好都合なデータ記憶構造が選択され得る。様々なデータプロセッサプログラム及びフォーマット、例えば、ワードプロセッシングテキストファイル、データベースフォーマットなどを、記憶に使用することができる。
【0129】
本明細書で使用される場合、「コンピュータベースのシステム」は、本発明の情報を分析するために使用されるハードウェア手段、ソフトウェア手段、及びデータ記憶手段を指す。本発明のコンピュータベースのシステムの最小ハードウェアは、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、及びデータ記憶手段を備える。当業者は、現在利用可能なコンピュータベースのシステムのいずれか１つが本発明での使用に好適であることを容易に理解することができる。データ記憶手段は、上述の現在の情報の記録を含む任意の製造物を含み得るか、又はかかる製造物にアクセスすることができるメモリアクセス手段を含み得る。
【0130】
入力及び出力手段のための様々な構造フォーマットを使用して、本発明のコンピュータベースのシステムにおいて情報を入力及び出力することができる。かかる提示は、当業者に類似性のランク付けを提供し、試験発現レパートリーに含まれる類似性の程度を同定する。
【0131】
実験
以下の実施例は、当業者に、本発明の作製及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示されるものであり、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図せず、また、以下の実験が行われる全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に対する正確性を確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。別様に示されない限り、部とは重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。
以下の実施例は、当業者に、本発明の作製及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示されるものであり、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図せず、また、以下の実験が行われる全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に対する正確性を確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。別様に示されない限り、部とは重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。
【0132】
実施例１
ＴＣＲライブラリを、ランダム化残基を有するｄｓＤＮＡとして合成した。ライブラリを、ギブソンアセンブリによってレンチウイルスベクターにクローニングした。組換えレンチウイルスベクターのライブラリを使用して、ＳＫＷ－３ Ｔ細胞株に感染するレンチウイルスのライブラリを産生した。ＳＫＷ－３ Ｔ細胞上のＴＣＲライブラリの表示を、抗ＴＣＲ（クローンＩＰ２６）染色によって検出した。Ｔ細胞ライブラリを、１０μＭの抗原ペプチドでパルスした抗原提示細胞と１４時間共培養し、Ｔ細胞ライブラリを抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及び特異的ｐＭＨＣ四量体で染色した。高レベルの抗ＣＤ６９染色及び低レベルの四量体染色を有する任意のクローンを、図１に示される概略図である、更なるラウンドの選別又は分析のために選別した。
ＴＣＲライブラリを、ランダム化残基を有するｄｓＤＮＡとして合成した。ライブラリを、ギブソンアセンブリによってレンチウイルスベクターにクローニングした。組換えレンチウイルスベクターのライブラリを使用して、ＳＫＷ－３ Ｔ細胞株に感染するレンチウイルスのライブラリを産生した。ＳＫＷ－３ Ｔ細胞上のＴＣＲライブラリの表示を、抗ＴＣＲ（クローンＩＰ２６）染色によって検出した。Ｔ細胞ライブラリを、１０μＭの抗原ペプチドでパルスした抗原提示細胞と１４時間共培養し、Ｔ細胞ライブラリを抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及び特異的ｐＭＨＣ四量体で染色した。高レベルの抗ＣＤ６９染色及び低レベルの四量体染色を有する任意のクローンを、図１に示される概略図である、更なるラウンドの選別又は分析のために選別した。
【0133】
ラウンド０において、Ｔ細胞ライブラリ又はＷＴ ＴＣＲトランスフェクタントを、抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及び特異的ｐＭＨＣ四量体で染色した。ＷＴ ＴＣＲトランスフェクタントと比較して類似のレベルの抗ＣＤ６９及び四量体染色を有するＴ細胞ライブラリクローンを選別して、任意の高親和性又は自己応答性クローンを除去した。その後、Ｔ細胞ライブラリを、１０μＭの抗原ペプチドでパルスした抗原提示細胞と１４時間共培養し、Ｔ細胞ライブラリを抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及び特異的ｐＭＨＣ四量体で染色した。高レベルの抗ＣＤ６９染色及び低レベルの四量体染色を有する任意のクローンを選別した。ラウンド２と同じ選別手順を更に２～３ラウンド繰り返して、ある特定の変異体を更に富化した。
【0134】
ＴＣＲ５５ライブラリの設計。Ｂ３５－ＨＩＶ－ＴＣＲ５５（ＰＤＢ ＩＤ：６ＢＪ３）の構造に基づいて、ＴＣＲ５５アルファ鎖上の残基（Ｓｅｒ２８、Ｌｙｓ６９、Ａｌａ９８）を選択し、５５ａライブラリ（Ａ）としてＶＲＷコドンにランダム化した。ＴＣＲ５５ｂベータ鎖上の残基ＣＤＲ１及びＣＤＲ２（Ａｓｎ２８、Ｓｅｒ３１、Ａｌａ５０及びＳｅｒ５１）を選択し、５５ｂ１２ライブラリ（Ｂ）としてＶＲＷコドンにランダム化した。ＴＣＲ５５ｂベータ鎖上の残基ＣＤＲ３（Ｌｙｓ７１、Ｔｈｒ９５及びＬｅｕ１００）を選択し、５５ｂ３ライブラリとしてＶＲＷコドンにランダム化した（Ｃ）。
【0135】
ＴＣＲ５５ライブラリを、５ラウンドの選択のために選別した。各ラウンドにおいて、Ｔ細胞ライブラリを、１０μＭのＨＩＶペプチドでパルスしたＫＧ－１細胞と１４時間共培養し、Ｔ細胞ライブラリを、抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及びＨＬＡ－Ｂ３５－ＨＩＶ四量体で染色した。高レベルの抗ＣＤ６９染色及び低レベルの四量体染色を有する任意のクローンを選別した。ゲーティングは、ＴＣＲ５５ ＷＴトランスフェクタントの抗ＣＤ６９及びＢ３５－ＨＩＶ四量体染色に基づいている。
【0136】
ＴＣＲ５５ａ－Ａ９８Ｈは、Ｂ３５－ＨＩＶによって活性化され得るキャッチボンド操作されたＴＣＲである。図５に示すように、ＴＣＲ５５ ＷＴ、ＴＣＲ５５ａ－Ａ９８Ｈ、ＴＣＲ５５ａ－Ｓ２８Ｇ、又はＴＣＲ５５ａ－Ｓ２８Ｇ Ａ９８Ｈ Ｔ細胞トランスフェクタントを、滴定したＨＩＶペプチドでパルスしたＫＧ－１細胞と１４時間共培養し、抗ＣＤ６９で染色した。実験を、フローサイトメトリーによって分析した。固定化されたＢ３５－ＨＩＶと流動したＴＣＲ５５ａ－Ａ９８Ｈタンパク質との間の３Ｄ結合親和性を測定するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験。Ｂ３５－ＨＩＶタンパク質とＴＣＲ５５ ＷＴ又はＴＣＲ５５ａ－Ａ９８Ｈ Ｔ細胞トランスフェクタントとの間の結合寿命を測定するための生体膜力プローブ（ＢＦＰ）実験。
【0137】
図６に示すように、ＴＣＲ５５ａ－Ａｌａ９８は、キャッチボンド操作のホットスポットである。Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｑ、Ｙ、及びＨへのＴＣＲ５５ａ－Ａ９８変異をＴ細胞トランスフェクタントとして作製し、滴定したＨＩＶペプチドでパルスしたＫＧ－１細胞により１４時間刺激し、抗ＣＤ６９で染色した。実験を、フローサイトメトリーによって分析した。Ｂ．Ｃ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ及びＷへのＴＣＲ５５ａ－Ａ９８変異をＴ細胞トランスフェクタントとして作製し、滴定したＨＩＶペプチドでパルスしたＫＧ－１細胞により刺激した。分析はＡと同じであった。Ｃ．刺激性ＴＣＲ５５ａ－Ａ９８変異体のＥｍａｘと３Ｄ結合親和性（ＫＤ）との間の相関関係。Ｄ．刺激性ＴＣＲ５５ａ－Ａ９８変異体のＥＣ５０と３Ｄ ＫＤとの間の相関関係。Ｅ．Ｂ３５－ＨＩＶタンパク質と相互作用するＴＣＲ５５ａ－Ａ９８Ｈ、ＴＣＲ５５ａ－Ａ９８Ｅ及びＴＣＲ５５ａ－Ａ９８Ｑ Ｔ細胞トランスフェクタントの結合寿命のＢＦＰ測定。
【0138】
図７は、ＴＣＲ５５アルファ鎖（配列番号１７）及びＴＣＲ５５ベータ鎖（配列番号１８）のタンパク質配列を示す。Ａ．ＴＣＲ５５アルファ鎖におけるハイライト及び下線付きＡは、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｑ、Ｙ、及びＨに変異させて、Ｂ３５－ＨＩＶによってＴＣＲ５５を活性化させることができるＡｌａ９８ホットスポットである。Ｂ．ＴＣＲ５５ベータ鎖におけるハイライト及び下線付きＡは、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、及びＹに変異させて、Ｂ３５－ＨＩＶによってＴＣＲ５５を活性化させることができるＡｌａ５０ホットスポットである。
【0139】
ＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥＡ３－ＭＡＧ－ＩＣ３（ＰＤＢ ＩＤ：５ＢＲＺ）の構造に基づいて、図８に示される、ＴＣＲアルファ鎖上の残基（Ａｓｐ２８、Ａｌａ３０、Ｓｅｒ５４、及びＧｌｎ５２）を選択し、ａライブラリ（Ａ）としてＶＲＷコドンにランダム化し、ＴＣＲベータ鎖上の残基（Ｔｈｒ５４、Ｍｅｔ９８、及びＡｓｐ１００）を選択し、ｂライブラリ（Ｂ）としてＶＲＷコドンにランダム化した。
【0140】
ＭＡＧＥライブラリを選択した。各ラウンドにおいて、Ｔ細胞ライブラリを、１０μＭのＭＡＧＥＡ３ペプチドでパルスした抗原提示細胞と１４時間共培養し、Ｔ細胞ライブラリを、抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及びＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥＡ３四量体で染色した。高レベルの抗ＣＤ６９染色及び低レベルの四量体染色を有する任意のクローンを選別した。ゲーティングは、ＭＡＧＥＡ３ ＷＴ ＴＣＲトランスフェクタントの抗ＣＤ６９及びＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥＡ３四量体染色に基づく。
【0141】
複数のＴＣＲ変異体が、ＭＡＧＥＡ３腫瘍抗原によって活性化されることが同定された。８つの高効力変異体Ｔ細胞を、滴定したＭＡＧＥＡ３ペプチドでパルスした２９３Ｔ－ＨＬＡ－Ａ１細胞と１４時間共培養した。図１０に示される、Ｔ細胞を、抗ＣＤ６９で染色し、フローサイトメトリーで分析した。５つの中効力変異体Ｔ細胞を、滴定したＭＡＧＥＡ３ペプチドでパルスした２９３Ｔ－ＨＬＡ－Ａ１細胞と１４時間共培養した。Ｔ細胞を、抗ＣＤ６９で染色し、フローサイトメトリーで分析した。８つの高効力変異体Ｔ細胞を、滴定したタイチンペプチドでパルスした２９３Ｔ－ＨＬＡ－Ａ１細胞と１４時間共培養した。Ｔ細胞を、抗ＣＤ６９で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【0142】
図１１は、Ａ３Ａ ＴＣＲと比較して高い効力であるがより低い親和性を有するいくつかのＭＡＧＥ ＴＣＲ変異体の同定を示す。Ａ．ＷＴ ＴＣＲ、Ａ３Ａ ＴＣＲ、８つの高効力変異体及び５つの中効力変異体のＥｍａｘとＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥＡ３四量体染色陽性パーセンテージとの間の相関関係。Ｂ．ＷＴ、Ａ３Ａ、又は６つの他の選択されたＴＣＲ変異体に結合する固定化されたＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥＡ３のＥｍａｘと３Ｄ親和性（３Ｄ ＫＤ）との間の相関関係。Ｃ．ＷＴ、Ａ３Ａ、又は６つの他の選択されたＴＣＲ変異体に結合する固定化されたＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥＡ３のＥＣ５０と３Ｄ ＫＤとの間の相関関係。
【0143】
図１３。ＭＡＧＥＡ３ ＷＴ ＴＣＲアルファ鎖（配列番号１）及びベータ鎖（配列番号１６）のタンパク質配列。全ての変異体は、ＴＣＲアルファ鎖にのみ変異体を有する。Ａ．ＭＡＧＥＡ３ ＷＴ ＴＣＲアルファ鎖タンパク質配列。ＴＣＲアルファ鎖におけるハイライト及び下線付きの残基は、Ａｓｐ２８、Ａｌａ３０、Ｉｌｅ５１、Ｇｌｎ５２、Ｓｅｒ５３、及びＳｅｒ５４である。ＭＡＧＥＡ３ ＷＴ ＴＣＲベータ鎖タンパク質配列。
【0144】
図１４には、全てのＭＡＧＥ ＴＣＲ変異体、配列番号１～１６の配列が示される。全ての変異体は、Ａｓｐ２８、Ａｌａ３０、Ｉｌｅ５１、Ｇｌｎ５２、Ｓｅｒ５３及びＳｅｒ５４のＴＣＲアルファ鎖残基にのみ変異を有する。各変異体の特定の変異残基をここに列挙する。
【0145】
材料及び方法
細胞株。別段の定めがない限り、細胞株を、５％のＣＯ２で３７℃の加湿インキュベーターに保持した。初代ヒトＴ細胞を、ＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０％の熱不活性化ＦＣＳ、２％の熱不活性化ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ、１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン中で培養した。ＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加して、１００Ｕ／ｍｌの最終濃度にした。血液試料で行われた作業は、スタンフォード機関審査委員会の規則及び規制に従って実施された。
細胞株。別段の定めがない限り、細胞株を、５％のＣＯ２で３７℃の加湿インキュベーターに保持した。初代ヒトＴ細胞を、ＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０％の熱不活性化ＦＣＳ、２％の熱不活性化ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ、１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン中で培養した。ＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加して、１００Ｕ／ｍｌの最終濃度にした。血液試料で行われた作業は、スタンフォード機関審査委員会の規則及び規制に従って実施された。
【0146】
Ｔ細胞株を、５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及び５０Ｕ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補充した１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ＋グルタマックス（ｇｌｕｔａｍａｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。ＫＧ－１細胞は、急性骨髄性白血病を有する雄由来のＨＬＡ－Ｂ３５＊０１発現細胞である。ＫＧ－１細胞を抗原提示細胞として使用し、ＩＭＤＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）＋１０％のＦＢＳ及び５０Ｕ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で培養した。
【0147】
四量体富化及びＴ細胞クローニング。四量体富化細胞は、ＢＤ Ａｒｉａセルソーターを用いて、１００μｌの培地（ＲＰＭＩ、１０％の熱不活性化ＦＣＳ、２％の熱不活性化ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ、１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン）を含有する丸底９６ウェルプレートに選別した。セシウム１３７照射器中で４０００ラドで照射した２～３つのランダムなＨＬＡバフィーコートからのＰＢＭＣからフィーダー細胞を調製した。ＪＹ細胞（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に１２０００ラドを照射した。７５，０００個のＰＢＭＣ、７，５００個のＪＹ細胞、及び１６０，０００個の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｌ ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する１００μｌを、選別後に各ウェルに添加した。ＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加して、１００Ｕ／ｍｌの最終濃度にした。細胞を、５％のＣＯ２で３７℃の加湿インキュベーターに保持した。必要に応じて、ＩＬ－２及び培地を交換した。
【0148】
ＴＣＲのレンチウイルス形質導入。ＴＣＲα鎖及びβ鎖を別々にレンチウイルスベクターにクローニングした。プラスミドＤＮＡ配列の完全性を、自動蛍光ジデオキシ（Ｓａｎｇｅｒ）配列決定（Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ）により検証した。１×１０６個のＰｈｏｅｎｉｘ（２９３）細胞を、６ウェルプレート中の３．５ｍｌのＤＭＥＭ完全培地（１０％のＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、Ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ、Ｌ－グルタメート）にプレーティングした。低温バイアル（Ｆｉｓｈｅｒ）中で１８２μＬの未補充ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、１８μＬのＦｕＧＥＮＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、室温で５分間インキュベートした。ＴＣＲα、ＴＣＲβ、又はＣＤ３ベクターのいずれかからの５．５ｍｇのＤＮＡを、１．１ｍｇのｐＣＬ－１０Ａ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｇｉｃａｌｓ）と混合し、ＤＭＥＭ－ＦｕＧＥＮＥ混合物に添加し、室温で３０分間インキュベートした。ＴＣＲα、ＴＣＲβ、又はＣＤ３コードプラスミドのトランスフェクション混合物を、Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞の別個のウェルに添加し、３７℃で一晩放置した。培地を翌日に交換し、３２℃のインキュベーターに移した。翌朝、上清を採取し、収集し、新鮮な完全ＤＭＥＭと交換した。上清を４℃で保持した。翌日、上清を採取し、収集し、合わせた（ＴＣＲα、ＴＣＲβ、及びＣＤ３）。ウイルスを含有する上清を０．４５μｍフィルタを通して濾過し、総体積が０．５～１ｍｌに達するまで１００ｋＤａスピンフィルタ（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して濃縮した。濃縮したウイルスを、１００ｋＤＡフィルタを使用して完全ＲＰＭＩ中に緩衝液交換し、再び０．５～１ｍｌに濃縮した。濃縮したウイルスを１２のウェルプレート中の２×１０６個のいずれかの細胞に添加した。細胞及びウイルスを含有するプレートを２５００ｒｐｍで３２℃で２時間回転させた。遠心分離後、プレートを３７℃のインキュベーターに戻した。５日後、フローサイトメトリーにより、抗体及び四量体染色によりＴＣＲ発現を確認した。ＴＣＲ＋ＣＤ３＋集団を、更なる使用のために選別した。
【0149】
ＣＤ６９の上方調節。Ｔ細胞を一晩、又は新鮮な完全ＲＰＭＩ中で２～３時間静置させた。ＫＧ－１抗原提示細胞を、所望の濃度のペプチドで２～３時間パルスし、３７℃でインキュベートした。ＫＧ－１細胞を洗浄して、過剰なペプチドを除去し、静置させたＳＫＷ３ Ｔ細胞で再懸濁した。細胞を１４時間共培養した。細胞を、抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ－１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１：１００）及び抗ｈＣＤ６９（１：１００）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で、ＰＢＳＡ（ＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡ）中で、氷上で１時間染色した。細胞を１回洗浄し、Ａｃｃｕｒｉ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＣｙｔｏｆｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）上でフローサイトメトリーを介して分析した。アッセイは、生物学的及び技術的な３連で実施した。ＥＣ５０は、Ｐｒｉｓｍで決定した。
【0150】
実施例２
キャッチボンド動員による生理学的親和性を有する高感度Ｔ細胞受容体の操作
操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用する養子細胞療法は、がん抗原を標的とするための有望なアプローチであるが、腫瘍反応性ＴＣＲは、しばしば、それらの標的リガンド（ｐＭＨＣ）に対して弱い応答性のみである。親和性成熟ＴＣＲは、ＴＣＲ－Ｔ療法の有効性を増強することができるが、標的抗原交差反応性及びレシピエント臓器の免疫病理も示し得る。我々は、剪断力下で結合寿命を延長するキャッチボンドの獲得を通じて、逆説的に低親和性ｐＭＨＣ結合と結合した高い活性化シグナルを示したＴＣＲ変異体をスクリーニングすることによって、代替戦略を開発した。このアプローチを使用して、我々は、以前に心臓抗原との致死的交差反応性を示した高親和性ＴＣＲと比較して、オフターゲット反応性を獲得することなく、生理学的親和性を維持しながらも同等以上の標的殺傷効力を示した臨床的に試験された腫瘍抗原ＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの類似体を操作した。キャッチボンド動員は、有害な交差反応性の可能性を低減した、操作されたＴ細胞療法のための強力なＴＣＲを生成するための生物物理学に基づく戦略である。
キャッチボンド動員による生理学的親和性を有する高感度Ｔ細胞受容体の操作
操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用する養子細胞療法は、がん抗原を標的とするための有望なアプローチであるが、腫瘍反応性ＴＣＲは、しばしば、それらの標的リガンド（ｐＭＨＣ）に対して弱い応答性のみである。親和性成熟ＴＣＲは、ＴＣＲ－Ｔ療法の有効性を増強することができるが、標的抗原交差反応性及びレシピエント臓器の免疫病理も示し得る。我々は、剪断力下で結合寿命を延長するキャッチボンドの獲得を通じて、逆説的に低親和性ｐＭＨＣ結合と結合した高い活性化シグナルを示したＴＣＲ変異体をスクリーニングすることによって、代替戦略を開発した。このアプローチを使用して、我々は、以前に心臓抗原との致死的交差反応性を示した高親和性ＴＣＲと比較して、オフターゲット反応性を獲得することなく、生理学的親和性を維持しながらも同等以上の標的殺傷効力を示した臨床的に試験された腫瘍抗原ＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲの類似体を操作した。キャッチボンド動員は、有害な交差反応性の可能性を低減した、操作されたＴ細胞療法のための強力なＴＣＲを生成するための生物物理学に基づく戦略である。
【0151】
ここでは、多くの接着性細胞表面タンパク質－タンパク質相互作用を媒介する生物物理学的パラメータを利用する「キャッチボンドフィッシング」と呼ばれる代替のＴＣＲ操作戦略を報告する。原理の証明実験として、我々は、非応答性の親ＴＣＲクローンに対して同等の３Ｄ結合親和性を有するが、全ての場合においてキャッチボンドの獲得と並行していた機能的シグナル伝達に対する高い感度を有するＴＣＲを産生したキャッチボンドフィッシングＴＣＲ表示ライブラリをスクリーニングすることによって、非刺激性ＴＣＲを強力に活性化したＴＣＲに変換した。次いで、非常に弱い活性化及び殺傷能力を有するメラノーマ抗原ＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲにキャッチボンド操作戦略を適用した。我々は、オフターゲット交差反応性及び毒性を示したＡ３Ａ ＴＣＲの臨床親和性成熟バージョンのものと同等以上の標的殺傷効力を有するいくつかのＴＣＲ変異体を同定した。応答感受性のこの獲得にもかかわらず、我々のキャッチボンド操作されたＴＣＲは、生理学的親和性を維持し、親和性成熟臨床ＴＣＲと比較して既知のオフターゲット抗原又はヒトプロテオームからのＨＬＡ関連ペプチドの広範なアレイのいずれとも交差反応しなかった。総合すると、これらの知見は、有効なＴＣＲ－リガンド相互作用におけるキャッチボンドの重要な役割についての更なる強力なエビデンスを提供し、キャッチボンド動員が、ＴＣＲ－Ｔ療法の主要な制限を克服するための一般的なアプローチとして利用され得ることを示唆する。
【0152】
結果
「キャッチボンドフィッシング」ライブラリの設計。我々の以前の研究は、ＴＣＲ５５が、生理学的親和性を有するＨＬＡ－Ｂ３５ ＭＨＣ分子によって提示されるＨＩＶペプチド（Ｐｏｌ４４８－４５６）に結合するが、このＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用は、測定可能なＴ細胞活性化をもたらさないか、又は結合事象中にキャッチボンドを形成しないことを示した。しかしながら、ｐｅｐ２０などのＨＬＡ－Ｂ３５酵母ｐＭＨＣライブラリから単離されたＨＩＶペプチド変異体は、非刺激性親ｐＭＨＣと同等の親和性を維持しながら、ＴＣＲ５５及びこの受容体を有する強力に活性化されたＴ細胞とのキャッチボンドを形成する能力を獲得した。ここでは、機能的スクリーニングが、相互的に、キャッチボンド能力の獲得と併せて「非刺激性」ＨＩＶペプチドによって誘発される機能的Ｔ細胞応答を可能にするＴＣＲ５５の変異体を単離することができるか否かを問うた。
「キャッチボンドフィッシング」ライブラリの設計。我々の以前の研究は、ＴＣＲ５５が、生理学的親和性を有するＨＬＡ－Ｂ３５ ＭＨＣ分子によって提示されるＨＩＶペプチド（Ｐｏｌ４４８－４５６）に結合するが、このＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用は、測定可能なＴ細胞活性化をもたらさないか、又は結合事象中にキャッチボンドを形成しないことを示した。しかしながら、ｐｅｐ２０などのＨＬＡ－Ｂ３５酵母ｐＭＨＣライブラリから単離されたＨＩＶペプチド変異体は、非刺激性親ｐＭＨＣと同等の親和性を維持しながら、ＴＣＲ５５及びこの受容体を有する強力に活性化されたＴ細胞とのキャッチボンドを形成する能力を獲得した。ここでは、機能的スクリーニングが、相互的に、キャッチボンド能力の獲得と併せて「非刺激性」ＨＩＶペプチドによって誘発される機能的Ｔ細胞応答を可能にするＴＣＲ５５の変異体を単離することができるか否かを問うた。
【0153】
力依存性トリガーにおけるキャッチボンド源は、ＴＣＲの複数の構造要素に起因すると考えられているが、我々のライブラリ設計はＴＣＲ－ｐＭＨＣ界面に焦点を当てた。我々のＴＣＲライブラリ設計は、脱離に先立つＴＣＲ／ｐＭＨＣ剪断ステップ中に遭遇する水素結合及び／又は塩橋の一過性形成によって媒介されるキャッチボンドの生物物理学的特徴によって導かれた。これは、結合を解除する前に一過性の抵抗力として現れる延長された結合寿命をもたらす。したがって、我々の戦略は、ＴＣＲ５５の相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を軽く変異させて、分離中にｐＭＨＣ結合表面上のＨ結合及び／又は塩橋残基（ｐｒｅｙ）をプローブするための釣り針（ベイト）として機能する極性又は荷電アミノ酸をコードすることであった。重要なことに、親和性成熟ＴＣＲを単純に選択することを最小限に抑えるために、ｐＭＨＣから遠すぎて結合状態で直接接触を形成しないライブラリのＴＣＲ ＣＤＲ残基位置を選択した。
【0154】
ＴＣＲ５５－ＨＩＶ－Ｂ３５複合体の構造に基づいて、ライブラリ位置について、ＴＣＲ５５α鎖上の３つの残基及びＴＣＲ５５β鎖上の４つの残基を選択した（図１Ｃ）。このライブラリの理論的根拠は、ｐＭＨＣ表面に近接しているが、ｐＭＨＣと直接接触していないＴＣＲ５５のＣＤＲループ内の残基を選択することであった。我々は、直接ＴＣＲ／ｐＭＨＣ接触をランダム化することによって、相互作用を「親和性成熟」させることを回避したかった。我々の選択されたコドン使用、ＶＷＲは、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、セリン、及びヒスチジンを含む、主に荷電及び極性残基として翻訳される１２の異なるコドンをコードし、新しい極性相互作用を形成する可能性を高める。哺乳類細胞ライブラリの実用的な多様性はおよそ１０６～１０７であるため、ＴＣＲ５５α鎖上の３つのランダム化残基を、１，７２８の多様性を有する１つのライブラリとして組み合わせ（Ｖαライブラリ）、ＴＣＲ５５β鎖上の４つのランダム化残基を、２０，７３６の多様性を有する１つのライブラリとして組み合わせた（Ｖｂライブラリ）。完全長ＴＣＲ５５ライブラリを合成し、レンチウイルス骨格ベクターにクローニングした。レンチウイルスライブラリを構築し、低い感染多重度でＳＫＷ３ Ｔ細胞株を感染させるために使用し、ＴＣＲライブラリをＴ細胞の表面上で発現させた。形質導入ＳＫＷ３細胞において、Ｖαライブラリを野生型ＴＣＲ５５β鎖と対合し、Ｖβライブラリを野生型ＴＣＲ５５α鎖と対合した。
【0155】
我々は、機能選択を実行して、ＴＣＲトリガーがｐＭＨＣ結合強度から分離される、キャッチボンド動員を示す可能性がある「高効力／低親和性」ＴＣＲクローンを直接スクリーニングした。ライブラリを１０μＭのＨＩＶペプチドで刺激し、活性化抗原ＣＤ６９高（抗ＣＤ６９ ＭＦＩに基づく上位５％の集団）集団の共染色とともに、ｐＭＨＣ四量体染色低（ＷＴ ＴＣＲ５５のｐＭＨＣ四量体染色よりも高くない）について選別して、「低親和性／高効力」ＴＣＲ変異体を富化した。
【0156】
ＴＣＲ５５における単一のアミノ酸置換は、キャッチボンド形成を介して活性化を誘発する。我々は、ＴＣＲ５５αＣＤＲライブラリ（多様性：１，７２８）に対して３ラウンドのＦＡＣＳ選別の選択を実施し、四量体－低ＣＤ６９－高染色表現型を有する集団を富化した。およそ１００個の単一細胞クローンを回収し、ＨＩＶ（Ｐｏｌ）ペプチドによる活性化について個々に試験した。このｐＭＨＣリガンドに対する最も強力な応答を示した２つのクローン（クローン８及びクローン１７）（図Ｓ３Ｃ）は、ＴＣＲ５５α鎖上で同一のＴＣＲ変異、Ｓ２８Ｇ及びＡ９８Ｈをコードした。同定された変異が増大した効力を付与したか否かを直接調べるために、ＳＫＷ３ Ｔ細胞に、ＴＣＲ５５α－Ｓ２８Ｇ Ａ９８Ｈ及びＷＴ ＴＣＲ５５β鎖を形質導入し、Ｂ３５関連ＨＩＶペプチドにより刺激した。どの変異が活性化に関与したかを逆畳み込みするために、変異を個々に試験し（図Ｓ３Ｄ～Ｓ３Ｅ）、ＴＣＲ５５αＣＤＲ３におけるアラニンからヒスチジンへの単一変異が、Ｂ３５－ＨＩＶ ｐＭＨＣへの曝露時に活性化のためのシグナルである能力を非応答性ＴＣＲ５５に付与するために十分であることを見出した。
【0157】
Ｂ３５－ＨＩＶ ｐＭＨＣに結合するＴＣＲ５５α－Ａ９８Ｈの３Ｄ親和性を、ＫＤ＝５．９μＭとして表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。これは、Ｂ３５－ＨＩＶに結合するＷＴ ＴＣＲ５５よりもおよそ３倍低い（ＫＤ＝１７μＭ）が、依然としてＴＣＲ／ｐＭＨＣ相互作用の生理学的親和性範囲内であり、ＴＣＲ５８９のＢ３５－ＨＩＶへの結合（ＫＤ＝４μＭ）、アゴニストの質を有する受容体－リガンド対の結合に関して測定されたものよりも高い。ＴＣＲ５５α－Ａ９８ＨがＢ３５－ＨＩＶと相互作用するときにキャッチボンドを形成するか否かを決定するために、生体分子力プローブ（ＢＦＰ）実験を実施した。非応答性ＷＴ ＴＣＲ５５は、スリップボンド形成と一致して、力の増加とともに漸進的に短い結合寿命を示した。対照的に、力の適用は、ＴＣＲ５５α－Ａ９８ＨとＢ３５－ＨＩＶとの間の結合寿命を増加させ、キャッチボンド形成を示す。以前に公開されたＢ３５－ＨＩＶに結合したＴＣＲ５５の構造の分析は、Ｂ３５ ＭＨＣ重鎖分子上の残基Ｑ６５及びＴ６９が、ＴＣＲ５５α上のＨ９８と新しい結合を形成し得ることを示唆する。Ｑ６５又はＴ６９は、アラニンに変異し、Ｑ６５Ａ変異のみが、ＴＣＲ５５α－Ａ９８Ｈの活性化を顕著に抑制し、キャッチボンドの誘発が、Ｂ３５－Ｑ６５とＴＣＲ５５α－Ａ９８Ｈとの間の相互作用を伴い得ることを示唆した。ＢＦＰは、Ｂ３５－Ｑ６５Ａ－ＨＩＶがＴＣＲ５５α－Ａ９８Ｈとキャッチボンドを形成したが、Ｂ３５－ＨＩＶ／ＴＣＲ５５α－Ａ９８Ｈ相互作用のピーク結合寿命が短かったことを示した。しかしながら、キャッチボンドの形成は動的プロセスであり、かかる近接性にない代替的な残基もまた伴い得る。
【0158】
結合寿命によるＴＣＲ５５シグナル伝達強度の較正。ＴＣＲ５５の単一点変異体によるキャッチボンド形成と一致するＢ３５－ＨＩＶ（Ｐｏｌ）によるＴ細胞活性化の獲得は、アミノ酸置換と活性化強度との間の構造－機能関係を調査する機会を提供した。我々は、この位置での残基同一性がＴＣＲシグナル伝達の強さにどのように影響を及ぼすかを調査するために、ＴＣＲ５５α－Ａ９８を１２個の異なるアミノ酸に変異させた。我々は、ヒスチジンに加えて、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グルタミン、及びチロシンへの変異が、異なる程度にもかかわらず、リンパ球活性化のためのＢ３５－ＨＩＶ（Ｐｏｌ）関与を介したＴＣＲ５５シグナル伝達を可能にすることもできることを見出した。対照的に、システイン、リジン、アスパラギン、アルギニン、セリン、スレオニン、及びトリプトファンへの変異は、ＴＣＲ５５を活性化しなかった。したがって、残基ＴＣＲ５５α－Ａ９８を置き換える選択された極性の芳香族の荷電アミノ酸のみが、変異体にＢ３５－ＨＩＶに応答して効果的にシグナル伝達する能力を付与した。シグナル伝達能力と結合強度との間に相関があったか否かを調査するために、我々は、Ｂ３５－ＨＩＶ ｐＭＨＣに結合する異なるＴＣＲ５５α－Ａ９８変異体の各々について、ＳＰＲを介して３Ｄ親和性を測定した。ほとんどの変異体は、ＫＤ＝３μＭ～ＫＤ＝２０μＭの狭い範囲の親和性を有する。驚くべきことに、刺激性変異体の最大ＣＤ６９ ＭＦＩ（Ｒ２＝０．１８９３）もＥＣ５０（Ｒ２＝０．０２８５５）も、刺激性変異体のＳＰＲ親和性に相関しておらず、３Ｄ親和性は、刺激性変異体によって示される機能の獲得を説明することができないことを示唆する。実際、ＷＴ－ＴＣＲ５５（ＫＤ＝１９μＭ）よりも高い親和性を示したバリアントであるＴＣＲ５５α－Ａ９８Ｗ（ＫＤ＝６．５μＭ）は、Ｂ３５－ＨＩＶ（Ｐｏｌ）に応答してＴＣＲ依存性活性化を可能にしなかった。更に、ＴＣＲ変異体の中で最もリガンド感受性のＴＣＲ５５α－Ａ９８Ｈ（ＫＤ＝５．９μＭ）は、最も高い親和性を有せず、応答性ＴＣＲ５５α－Ａ９８Ｑ変異体（ＫＤ＝８．０μＭ）は、非応答性ＴＣＲ５５α－Ａ９８Ｗ変異体（ＫＤ＝６．５μＭ）よりも低い親和性を有した。シグナル伝達能力がキャッチボンドの強度と相関するか否かを調査するために、ＢＦＰ測定を、２つのＢ３５－ＨＩＶ応答性変異体：ＴＣＲ５５α－Ａ９８Ｅ及びＴＣＲ５５α－Ａ９８Ｑについて行った。我々は、Ｅｍａｘが親和性よりもむしろピーク結合寿命（Ｒ２＝０．９９６）と相関したことを見出した。したがって、キャッチボンドの強度は、アゴニストＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用と非アゴニストＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用との間の区別のための重要なパラメータである。
【0159】
ＴＣＲ５５ｂ ＣＤＲライブラリ（多様性：２０，７３６）について同じワークフローを使用して並行スクリーニングを実施し、Ｂ３５－ＨＩＶ（Ｐｏｌ）によるＴ細胞活性化の高レベルを示したＴＣＲ５５バリアント、クローン３６を同定した。クローン３６は、ＣＤＲ１変異ＴＣＲ５５β－Ｎ２８Ｑ及びＣＤＲ２変異ＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｄの２つの変異を含んだ。我々は、単離されたＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｄ変異が、必要に応じてかつＢ３５－ＨＩＶによるＴ細胞活性化を可能にするために十分であることを同定した。ＴＣＲ５５β－Ａ５０の位置を代替アミノ酸に置き換えることにより、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、及びチロシンが、Ｂ３５－ＨＩＶに対するＴＣＲ５５変異体応答を異なる程度に支持したが、システイン、リシン、アルギニン、及びトリプトファンは、有効なシグナル伝達を支持しなかったことが示された。ＴＣＲ５５β－Ａ５０変異体のＳＰＲ親和性を測定し、ＴＣＲ５５α変異体と同様に、ＫＤ＝２～２０μＭの範囲を示し、ＴＣＲ親和性の自然な生理学的範囲内に入る。ＴＣＲ５５β－Ａ５０変異体中の最大ＣＤ６９ ＭＦＩと３Ｄ結合親和性ＫＤ（Ｒ２＝０．７５５８）との間には、ＴＣＲ５５α－Ａ９８変異体よりも良好な相関があった。しかしながら、ＥＣ５０は、３Ｄ親和性（Ｒ２＝０．３５４３）と相関しておらず、再び、親和性単独では、これらの変異体ＴＣＲによる機能の獲得を説明するために十分ではないことを示唆した。したがって、我々は再び、ＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｅ、ＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｄ、ＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｈ、及びＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｔ変異体を用いてＢＦＰ実験を実施した。ＴＣＲ５５α変異体については、ピーク結合寿命は、Ｂ３５－ＨＩＶ ｐＭＨＣリガンドによって刺激されたＴＣＲ５５β－Ａ５０変異体のＥｍａｘと相関した（Ｒ２＝０．８６４４）。ＴＣＲ５５－ＨＩＶ－Ｂ３５複合体の結晶構造の分析は、Ｂ３５－ＨＩＶ ｐＭＨＣ上の残基Ｔ６９及びＱ７２が、ＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｅとの新しい水素結合の形成を潜在的に媒介することを示す。この仮説を試験するために、Ｂ３５－Ｔ６９Ａを形質導入されたＫ５６２細胞は、ＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｅを有するＴ細胞の活性化を防止したが、Ｂ３５－Ｑ７２Ａ変異は効果を有しなかった。ＢＦＰ測定は、Ｂ３５－Ｔ６９Ａ－ＨＩＶがＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｅとのスリップボンドのみを形成したことを示し、これもまた、Ｂ３５－Ｔ６９Ａ－ＨＩＶによるＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｅの活性化がないことを示唆する。したがって、この単一のペアワイズ相互作用は、キャッチボンドの形成及びＴＣＲ誘発を支持するために必要である。
【0160】
キャッチボンド操作されたＴＣＲのシグナル伝達ランドスケープ。キャッチボンド操作されたＴＣＲ５５変異体が、Ｂ３５－ＨＩＶ ｐＭＨＣリガンドに応答してＴ細胞における細胞内シグナル伝達にどのように影響を及ぼすかを評価するために、我々は、ＥＲＫ、ｐ３８、及びＮＦＡＴ２シグナル伝達経路の活性化動態を測定するために、生細胞イメージングレポーターシステムを用いた。これらの細胞において、これらの細胞内シグナル伝達分子の蛍光バージョンの転座は、リアルタイムで可視化され、単一の細胞ベースで定量化され得る。これらのレポーターの３つ全てが、ＣＤ２８共刺激とは独立して、ＴＣＲ刺激に応答して転座することが示されている。ＨＩＶペプチドパルスされたＢ３５発現抗原提示細胞との関与時に、示されるキャッチボンド操作されたＴＣＲバリアントを発現するレポーターＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、刺激性ＴＣＲ５８９を陽性対照として使用して、無応答の親ＴＣＲ５５と比較した場合、経路活性化が増強されたことを示した。ＴＣＲ５５α－Ａ９８Ｈ及びＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｅ変異体の両方が、集団レベルで同様の期間、ＥＲＫ及びｐ３８シグナル伝達経路を活性化することができたが、ＮＦＡＴ２活性化動態における実質的な差異が観察された。これらの結果は、単一細胞ＡＵＣ（曲線下面積）分析によって定量化し、これは、全ての試験されたＴＣＲバリアントについてのＥＲＫ及びＮＦＡＴ２シグナル伝達応答の両方において顕著な差異を示した。ｐ３８－ＫＴＲレポーターの実質的に低いシグナル対ノイズ比により、ＥＲＫ又はＮＦＡＴ２活性化と比較して、平均ＡＵＣ分布の同じ階層に従うより微妙なｐ３８シグナル伝達の差異を観察した。我々は、平均ＥＲＫ（Ｒ２＝０．９３７０）又はＮＦＡＴ２（Ｒ２＝０．９４１５）ＡＵＣ分布とピーク結合寿命との間に強い相関を見出し、再び、キャッチボンド強度が、機能的な細胞内シグナル伝達をもたらすＴＣＲ－リガンド関与において重要な役割を果たすことを示唆する。
【0161】
生理学的ｐＭＨＣ密度でのＴＣＲの適用された力活性化。極めて低いが、生理学的に関連するレベルのｐＭＨＣ（ＨＩＶ／ＨＬＡ－Ｂ３５）でのキャッチボンド操作されたＴＣＲ５５の誘発を調査するために、我々は、最近開発されたＢＡＴＴＬＥＳ技法（大規模な外因性ｐＭＨＣスクリーニングのための生体力学的に支援されたＴ細胞誘発）を使用した。ＢＡＴＴＬＥＳ技法は、生理学的密度（３～４．５ｐＭＨＣ／細胞）で表示されたｐＭＨＣタンパク質でコーティングされた温度感受性ポリマービーズを使用して、ビーズ表面と相互作用するＴ細胞に傾斜力（推定最大マグニチュード＝２０～２７．５ｐＮ／秒）を適用する。力の活性化時に、我々は、ＨＩＶペプチドと相互作用するＴＣＲ５５α－Ａ９８Ｈ、ＴＣＲ５５α－Ａ９８Ｅ、ＴＣＲ５５α－Ａ９８Ｑ、ＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｅ、ＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｈ、ＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｄ、又はＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｔ置換のいずれかを含有する操作されたＴＣＲ５５ｓを形質導入された＞１，０００ＳＫＷ３ Ｔ細胞についてＣａ２＋シグナル伝達（これは、初期Ｔ細胞誘発と相関する）を監視した。いくつかのＴ細胞は、細胞Ｃａ２＋フラックスの持続的な増加を示したが、ほとんどの細胞は、蛍光強度の減少を示し、負の蓄積シグナルをもたらし、誘発を示さない。これは、最適な力であっても、Ｔ細胞のごく一部のみが低いｐＭＨＣ密度で活性化されることを示す以前の文献と一致する。
【0162】
次いで、我々は、時間の経過とともにゼロよりも高い統合された細胞当たりの蛍光を有する事象について、全ての操作されたＴＣＲ５５ｓを調べた。ＴＣＲ５５β－Ａ５０Ｔを除く全ての試験された置換は、ＷＴと比較して、より高い統合された細胞当たりのＣａ２＋シグナルをもたらし、統合されたシグナルのマグニチュードは、測定されたピーク結合寿命と強い相関を示した。これらの結果は、単一Ｔ細胞の力誘導活性化を使用して、操作されたＴＣＲがインビボで遭遇した低密度ｐＭＨＣ条件下で効率的な活性化を駆動することができるという証拠を提供する。
【0163】
ＴＣＲ－Ｔ細胞療法へのＴＣＲキャッチボンド操作の適用。ＴＣＲ５５モデルシステムを用いた実験は、キャッチボンド操作が、生理学的親和性レジームに残っている間、ＴＣＲシグナル伝達を増強することができることを示す。これは、多くの野生型腫瘍反応性ＴＣＲが、腫瘍ｐＭＨＣに低い親和性結合を有し、関連する腫瘍関連抗原に応答してシグナル伝達に低い感受性を有し、効率的な腫瘍殺傷をもたらさないため、ＴＣＲ－Ｔ細胞との作用に影響を及ぼす。メラノーマ抗原ＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ（ＷＴ）を、キャッチボンド操作のために選択した。抗原は、ＷＴ ＴＣＲに対してＫＤ＝５００μＭの報告された３Ｄ ＳＰＲ結合親和性でＨＬＡ－Ａ１制限されている。このＴＣＲは、腫瘍抗原ＭＡＧＥ－Ａ３に応答して非常に低いＴ細胞活性化を示し、一方、ＷＴ ＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲの親和性成熟変異体であるＡ３Ａ ＴＣＲは、同じリガンドによるＴ細胞活性化を大幅に増強する。しかしながら、メラノーマの臨床試験では、Ａ３Ａ ＴＣＲが提示されたタイチンペプチドと交差反応することが見出され、これは主に心血管組織で発現され、高レベルの心臓毒性をもたらす。そうでなければ非刺激性ＴＣＲ５５－リガンド対に新しいキャッチボンドを導入することによるＴ細胞活性化の促進の成功に基づいて、我々は、このアプローチを使用して、低応答性の野生型ＴＣＲのＭＡＧＥ－Ａ３リガンドに対する感受性を改善する一方で、低親和性を維持して、タイチンとの交差反応性を回避することができるか否かを問うた。
【0164】
ＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３との低親和性ＷＴ ＴＣＲ複合体の結晶構造を有していなかったが、ＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３複合体とのＴＣＲの親和性成熟バージョンの構造が利用可能であった。したがって、我々は、ＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３へのＷＴ ＴＣＲ結合をモデル化し、ＴＣＲ α鎖上にライブラリを設計した。ＴＣＲ５５の設計戦略に従って、ライブラリのために選択された残基（ＣＤＲ１αの２８位、３０位；ＣＤＲ２αの５２位、５４位）は、ＣＤＲループ内にあり、ｐＭＨＣに比較的近いが、ｐＭＨＣに直接接触しない。ＳＫＷ３ Ｔ細胞株に低ＭＯＩでライブラリを形質導入し、ＣＤ６９－ｈｉ／四量体－ｌｏクローンを前述のように選択した。３ラウンドの選択の後、富化された集団からおよそ１００個の単一細胞クローンを選択し、ＴＣＲ依存性活性化について試験した。我々は、親ＷＴ ＴＣＲを発現するＴ細胞を誘発することができない濃度でＭＡＧＥ－Ａ３ペプチドに対する増強された応答性を示した１３個の異なる変異体形質導入ＳＫＷ３クローンを単離した。ＴＣＲ変異体のＥｍａｘを比較することにより、Ａ３Ａ ＴＣＲと比較して、８つのクローンを「高効力」変異体として定義し、５つのクローンを「中効力」変異体として定義した。我々は、ＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３に結合する６つの高効力変異体及び２つの中効力変異体についてのＳＰＲ ３Ｄ ＫＤを測定した。親和性は、ＫＤ＝１０～５０μＭの範囲であり、ＫＤ＝１．２４μＭであるＡ３Ａの親和性よりも顕著に低い親和性であった。我々は、Ｅｍａｘと３Ｄ親和性との間の相関を観察しなかった（Ｒ２＝０．３７１８）が、ＥＣ５０と親和性との間の弱い相関を観察した（Ｒ２＝０．５９９８）。８つの高効力変異体が、タイチンペプチドに対する交差反応性機能応答を示したか否かを試験した。Ａ３Ａ形質導入ＳＫＷ３細胞は、タイチンｐＭＨＣリガンドによって強く活性化された。４つの変異体（２０ａ－１８、２０ａ－新規１２、９４ａ－１４、及び９４ａ－３０）は、タイチンペプチドとの交差反応性を示さなかったが、残りの４つは高いペプチド濃度でのみタイチンによる非常に弱い活性化を示した。
【0165】
我々は、また、全てのキャッチボンド操作されたＴＣＲ変異体のＨＬＡ－Ａ１－タイチンへの結合親和性を測定し、それらは、非常に低い又は測定不可能な３Ｄ結合親和性（ＫＤ＞１００μＭ）を有したが、タイチンに対するＡ３Ａ親和性は、ＫＤ＝７．７μＭであった。ＢＦＰ実験を、ＷＴ ＴＣＲ、Ａ３Ａ ＴＣＲ、ＴＣＲ変異体９４ａ－１４及び２０ａ－１８について実施し、全てが、ＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３とキャッチボンドを形成し、変異体９４ａ－１４は、Ａ３Ａ及びＷＴ ＴＣＲよりも高いピーク結合寿命を有する。ＷＴ、Ａ３Ａ、９４ａ－１４、及び２０ａ－１８ ＴＣＲのピーク結合寿命は、測定された最大ＣＤ６９ ＭＦＩとよく相関した（Ｒ２＝０．９７８１）。今日まで、ＣＤ８：ＴＣＲ：アゴニストに対する約１０ｐＮの力が、最適なエフェクターシグナル伝達を促進することが実証されている。約１０ｐＮの力で、９４ａ－１４ ＴＣＲは、ＷＴ及びＡ３Ａ ＴＣＲの両方よりも顕著に高いピーク結合寿命を有する。ＨＬＡ－Ａ１－タイチンによる９４ａ－１４又は２０ａ－１８ ＴＣＲのＢＦＰ実験は、９４ａ－１４及び２０ａ－１８ ＴＣＲによるタイチン交差反応性の損失と一致して、両方のＴＣＲについてスリップボンドの形成のみが観察されたことを示す。
【0166】
ＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲ変異体がＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３＋腫瘍細胞を効率的に殺傷することができるか否かを試験するために、ヒト初代Ｔ細胞にＷＴ、Ａ３Ａ、及びＴＣＲ変異体を形質導入し、ＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３＋メラノーマ細胞株Ａ３７５又はＨＬＡ－Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３＋結腸がん細胞株ＨＣＴ－１１６と共培養した。Ａ３７５細胞に応答して、操作されたＴＣＲ ９４ａ－１４及び２０ａ－１８は、ＷＴ ＴＣＲよりも標的殺傷において均一に優れており、少なくとも同等であり、場合によっては、分析された測定基準（ＩＦＮ－ψ、ＴＮＦ、脱顆粒）に応じて、標的刺激エフェクター活性においてＡ３Ａよりも優れていた。低レベルのＭＡＧＥ－Ａ３抗原を発現するＨＣＴ－１１６細胞に応答して、同様の傾向が見られた。変異体２０ａ－５及び２７ａ－５は、ヒト初代Ｔ細胞においても試験され、Ａ３７５メラノーマ細胞及びＨＣＴ－１１６結腸がん細胞に対する高レベルの細胞傷害性を示した。
【0167】
ＴＣＲクローン９４ａ－１４及び２０ａ－１８がタイチンに対して交差反応性を示したか否かを調べるために、それぞれのＴＣＲを形質導入された初代ヒトＴ細胞を、ＭＡＧＥ－Ａ３又はタイチンペプチドパルスされた抗原提示細胞と共培養した。２０ａ－１８又は９４ａ－１４は、ＭＡＧＥ－Ａ３パルスされた細胞との共培養後に、増強された細胞傷害性、脱顆粒、及びサイトカイン分泌を示したが、これらのＴＣＲクローンはいずれも、提示されたタイチンペプチドに応答しなかった。同様に、２０ａ－５及び２７ａ－５クローンは、ＭＡＧＥ－Ａ３に対する強力な細胞傷害性応答を媒介したが、高濃度のペプチドでは、タイチンに対しては最小限の交差反応性しか媒介しなかった。
【0168】
操作されたＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲの交差反応性のプロファイリング。操作されたＴＣＲは、タイチンペプチドとの実質的な反応性を欠いていたが、操作されたＴＣＲが、キャッチボンド動員の結果として、新たな望ましくないペプチド反応性を獲得したか否かを問うた。我々は、元々ＴＣＲの交差反応性を特徴付け、腫瘍に存在するＴ細胞に由来するＴＣＲの新規特異性を明らかにするために使用された、以前に記載された酵母表示ｐＭＨＣライブラリシステムに着目する。我々は、まず、野生型、親和性成熟Ａ３Ａ、及び３つのキャッチボンド操作されたＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲバリアントの交差反応性ランドスケープを調査するために、ＨＬＡ－Ａ＊０１ ９－ｍｅｒペプチドライブラリを生成した。ライブラリは、ＨＬＡ－Ａ＊０１に結合することが知られているペプチド配列に基づいて設計され、Ｐ３位のアンカー残基をアスパラギン酸及びグルタミン酸に固定し、Ｐ９をチロシンに固定して、ＨＬＡ溝内のペプチドの適切な提示を確実にした。残りの全ての位置は、１．８×１０８のライブラリ多様性のために、２０個全てのアミノ酸への柔軟性を可能にした。
【0169】
我々は、野生型ＭＡＧＥ－Ａ３（ＷＴ）ＴＣＲ、Ａ３Ａ、９４ａ－１４、２０ａ－１８、又は９４ａ－３０の可溶性の組換え形態を用いて、確立された方法に従って選択を行った。ＷＴ ＴＣＲは、おそらくＭＡＧＥ－Ａ３に対する非常に低い３Ｄ結合親和性（ＫＤ＞５００μＭ）により、任意の酵母クローンを富化することができなかったが、高親和性Ａ３Ａ及び操作された変異体は、酵母クローンの集団を強く富化した。その後、選択されたライブラリプールを配列決定して、個々の配列を単離した。我々は、選択されたペプチドが、Ａ３Ａについて前述したように、Ｃ末端特異性の欠如を伴って、全てのＴＣＲバリアントについてＮ末端で強力な収束を示したことを観察した。固定アンカー残基とは別に、Ｐ１ ＧＬＵ、Ｐ４ ＰＲＯ、及びＰ５ ＩＳＯは、強力な保存性を示し、特に、ＭＡＧＥ－Ａ３及びタイチンペプチドの両方に存在する。３つのキャッチボンド操作されたＴＣＲバリアントは、非常に類似した配列嗜好性を示し、ＴＣＲの特異性が、キャッチボンド操作によって最小限に変更されたことを示した。
【0170】
ディープシーケンシングデータを使用して、以前に開発された統計的方法を使用してオフターゲット予測を行った。Ａ３Ａ ＴＣＲについては、タイチン及びＭＡＧＥ－Ａ３の両方が上位ランクの予測であり、それぞれ１及び７にランク付けされた。しかしながら、３つのキャッチボンド操作されたＴＣＲについては、タイチンは、上位３５個のペプチドにおいて予測されなかったが、ＭＡＧＥ－Ａ３ペプチドは、３つのキャッチボンド操作されたＴＣＲの全てに結合することが予測された。
【0171】
我々は、Ｔ細胞活性化アッセイを用いて、Ａ３Ａ ＴＣＲ及びキャッチボンド操作されたＴＣＲの上位２０の推定オフターゲット予測を試験した。各ＴＣＲについて予測される上位２０個のペプチドを合成し、各ＴＣＲ反復ペプチドを除去した後に合計６０個のペプチドをスクリーニングするために使用した。Ａ３Ａ ＴＣＲに関して、我々は、ＭＡＧＥ－Ａ３及びタイチンに加えて、それは、また、以前に発見された２つのエピトープＭＡＧＥ－Ａ６及びＦＡＴ２によっても活性化されたことを見出した。３つのキャッチボンド操作されたＴＣＲ（９４ａ－１４、２０ａ－１８、及び９４ａ－３０）については、ＭＡＧＥ－Ａ３ペプチドのみがベースラインを超えてＴ細胞を顕著に活性化した。ＷＴ ＴＣＲについては、ペプチドのいずれも、ＤＭＳＯ対照と比較して、Ｔ細胞を顕著に刺激しなかった。これらの交差反応性プロファイリング実験の集合的な結果は、スクリーニングが、高親和性Ａ３Ａ ＴＣＲの既知のオンターゲット特異性及びオフターゲット特異性の両方を同定することができ、キャッチボンド操作が、ヒトプロテオームの既知の配列に対応する有害な特異性を導入しなかったことを示す。酵母提示ｐＭＨＣスクリーニングは、予期しないヒト抗原交差反応性の不在を示す一方で、Ａ３Ａ ＴＣＲで見られる心臓毒性の原因を明確に同定する、厳格な試験を表す。
【0172】
細胞－細胞相互作用が剪断応力に曝される環境では、機械的力が様々な受容体－リガンド系によるシグナル伝達に重要な役割を果たすことが明らかになった。実際、キャッチボンドは、カドヘリン、セレクチン、及びノッチ、並びにより最近ではＴＣＲを伴うものなどの様々な低親和性細胞表面接着系において、天然のシグナル増強機構として観察されている。抗原提示細胞上のアゴニストｐＭＨＣリガンドとの関与時の有効なＴＣＲシグナル伝達は、引く力の適用時に受容体－リガンド相互作用の寿命を延長するキャッチボンドの形成を伴う。実際、ペプチド抗原におけるキャッチボンド残基の有無は、ＴＣＲ誘発をｐＭＨＣ結合強度の従来の測定値から分離することができる。しかしながら、ｐＭＨＣによる有効なＴＣＲ刺激におけるキャッチボンド関与の普遍性は不明であり、この新しい洞察の臨床的価値の可能性は調査されていない。ここで、適度な溶液親和性であるが、リガンド誘導シグナル伝達に対する高い感受性の組み合わせを有する変異体ＴＣＲをスクリーニングするための新しいアッセイを使用して、単離された有効な変異体ＴＣＲの中で、増加したキャッチボンド形成を伴うＴＣＲが優勢であること、及びこれらの新たに獲得されたキャッチボンドが、ＴＣＲをヒト抗原交差反応性の増加の素因にはなってないことを示す。これは、遅いオフフレート自体がｐＭＨＣ結合時に効果的なＴＣＲシグナル伝達を可能にすることができるが、キャッチボンドが抗原応答性ＴＣＲについて決定論的な役割を果たすことができることを示唆する。
【0173】
この生物物理学的機構は、ＴＣＲシグナル伝達有効性からのＴＣＲ結合強度の分離を可能にする際に明確な実用的価値を有する。実際、スクリーニングにおいてかかるＴＣＲを同定することが容易であることを考えると、我々の知見は、キャッチボンドが、全体的な動作ＴＣＲレパートリーにおいて実質的な役割を果たす可能性があり、特定のｐＭＨＣに対する測定された溶液結合親和性と、Ｔ細胞活性化の観点からアゴニスト特性を示すそれらのｐＭＨＣの能力との間の文献における既存の矛盾を説明するために役立つことを示唆する。この概念は、抗原提示細胞又は標的細胞上のリガンドをスキャンするときのＴリンパ球の運動性を考えると理にかなっている。このバルク運動は、細胞フィリポディア（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｉｌｉｐｏｄｉａ）の活性とともに、引張力又は剪断力によって破壊され得る固有の遅いオフレート結合と比較して、効果的なホスファターゼ排除を可能にするために、キャッチボンド形成によるＴＣＲ－リガンド相互作用の延長を好むそのような力を提供する。この知見は、ＴＣＲの本質的に弱い「自己」腫瘍反応性が臨床活性に制限を提示する、ＴＣＲ－Ｔ療法の新たな分野に直接的な意味を有する。
【0174】
我々の選択戦略は、いくつかの理由から、リガンド感受性であるが低親和性のクローンの単離を成功させるために重要であった。第一に、我々のライブラリを、ＴＣＲ／ｐＭＨＣの離脱中に不定の極性相互作用に関与する変異体置換の可能性を最大にすることができる極性及び荷電残基に焦点を当てた。第二に、選択が高親和性（特に遅いオフレート）ＴＣＲを単純に分離しないように、ｐＭＨＣと直接接触していない残基に焦点を当てるようにライブラリを設計した。我々は、ＴＣＲ ＣＤＲ残基の「第２のシェル」内にあった残基、すなわち、ｐＭＨＣ表面に近接しているが、基底状態複合体において直接相互作用を形成するには遠すぎる残基を選択した。これらの残留物は、ＴＣＲ／ｐＭＨＣ界面の剪断中に「フック」として機能するように理想的に配置される。第三に、我々の機能選択戦略は、シグナル伝達活性（ＣＤ６９－ｈｉ）だが、低親和性（四量体低）のクローンを直接単離した。単離されたクローンの３Ｄ結合親和性ＫＤは、ＷＴ ＴＣＲよりもわずかに親和性が高い傾向にあるが、親和性は生理学的レジームにしっかり残っており、３Ｄ結合親和性ＫＤは活性と相関しておらず、スクリーニング原理を検証している。
【0175】
これらの結果は、キャッチボンド操作されたＴＣＲが、ホットスポット位置で異なるアミノ酸置換を走査することによって感度について「調整」され得ることを示す。かかる調整可能性は、活性化対親和性の所望のバランスを有するクローンの慎重なキュレーションを可能にする。ＴＣＲシグナル伝達は、ＴＣＲ親和性成熟又はキャッチボンド操作の両方によって影響を受ける可能性があり、それらは互いに排他的である必要はないことを強調する。実際、ＴＣＲ変異体の感受性と親和性との間には弱い正の相関があった。しかしながら、キャッチボンド操作は、生理学的親和性を維持しながら効力増強を可能にし、親和性成熟ＴＣＲと比較して、オフターゲット交差反応性に向かう素因を減少させる。
【0176】
操作されたＴ細胞療法の安全性は、最終的には、健康な組織に対する標的腫瘍抗原の優先的な発現の程度に依存するが、生理学的親和性を維持し、更に強力なアゴニストシグナル伝達応答を維持するためのキャッチボンド操作の戦略は、臨床的に指向されたＴＣＲについての他のｐＭＨＣとの望ましくない交差反応性の可能性を低減することができる。臨床ＴＣＲの有効性を向上させることは、概して、親和性成熟を伴う。しかしながら、いくつかの親和性成熟ＴＣＲは、オフターゲット毒性を示した。キャッチボンド操作されたＴＣＲの極端なペプチド選択性は、健康な組織対がん性組織における腫瘍抗原の相対的な発現レベルに基づいて治療指標を増強することによって、オンターゲット／腫瘍外（ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ）反応性を軽減するためにも役立ち得る。かかる変異体を単離することが相対的に容易であり、スクリーニングが単純であることを考えると、これ自体がＴＣＲ－Ｔ臨床開発パイプラインにおける一般的なアプローチに十分に役立つと感じる。ＴＣＲ５５の場合、キャッチボンドライブラリは、解決された結晶構造の事前知識に基づいて設計されたが、ＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲの場合、我々は、同一ではないが関連するＴＣＲ構造に基づいて構造をモデル化した。したがって、我々は、キャッチボンド操作は、関連した結晶学的データからのガイダンスを必要としないと考えている。強力な新しいＷｅｂベースの人工知能構造予測ツール、及び解決されたＴＣＲ／ｐＭＨＣ複合体構造の大規模なデータベースは、特殊な構造的洞察なしでキャッチボンド操作のためのライブラリ設計を行うことを可能にするはずである。
【0177】
材料及び方法
細胞株。ＳＫＷ３ Ｔ細胞（ＤＳＭＺ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び５０Ｕ／ｍＬのＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補完したＲＰＭＩ－１６４０＋ＧｌｕＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、３７℃及び５％のＣＯ２で培養した。ＬｅｎｔｉＸ細胞及び２９３Ｔ細胞を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び５０Ｕ／ｍＬのＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、３７℃及び５％のＣＯ２で培養した。ＫＧ－１細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％のＦＢＳ及び５０Ｕ／ｍＬのＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＩＭＤＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、３７℃及び５％のＣＯ２で培養した。ＳＦ９細胞を、１０％のＦＢＳ及び１０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンスルファート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を補充したＳＦ９００－ＩＩＩ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で、２７℃及び大気ＣＯ２で培養した。Ｈｉ５細胞を、１０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンスルファート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を補充した昆虫細胞培地（発現系）において、２７℃及び大気ＣＯ２で成長させた。Ｊｕｒｋａｔ細胞株を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び５０μＭのβ－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ １６４０中で、３７℃及び５％のＣＯ２で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、及び１８ｍＭのＨＥＰＥＳを補充したＤＭＥＭ中で、３７℃及び５％のＣＯ２で培養した。
細胞株。ＳＫＷ３ Ｔ細胞（ＤＳＭＺ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び５０Ｕ／ｍＬのＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補完したＲＰＭＩ－１６４０＋ＧｌｕＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、３７℃及び５％のＣＯ２で培養した。ＬｅｎｔｉＸ細胞及び２９３Ｔ細胞を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び５０Ｕ／ｍＬのＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、３７℃及び５％のＣＯ２で培養した。ＫＧ－１細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％のＦＢＳ及び５０Ｕ／ｍＬのＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＩＭＤＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、３７℃及び５％のＣＯ２で培養した。ＳＦ９細胞を、１０％のＦＢＳ及び１０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンスルファート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を補充したＳＦ９００－ＩＩＩ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で、２７℃及び大気ＣＯ２で培養した。Ｈｉ５細胞を、１０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンスルファート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を補充した昆虫細胞培地（発現系）において、２７℃及び大気ＣＯ２で成長させた。Ｊｕｒｋａｔ細胞株を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び５０μＭのβ－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ １６４０中で、３７℃及び５％のＣＯ２で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、及び１８ｍＭのＨＥＰＥＳを補充したＤＭＥＭ中で、３７℃及び５％のＣＯ２で培養した。
【0178】
レンチウイルスのパッケージング。ＨＥＫ２９３Ｔ由来のＬｅｎｔｉＸ細胞を、３×１０５細胞／ｍＬ（合計２ｍＬ）の密度で６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞の各ウェルについて、７５０ｎｇの目的のプラスミド、５００ｎｇのｐｓＰＡＸ、２６０ｎｇのｐＭＤ２．Ｇを、１００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中の４．５μＬのＦｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、２０分間静置した。新鮮なｃＲＰＭＩ培地を各ウェルに添加した。次いで、ＤＮＡ／Ｆｕｇｅｎｅ混合物を各ウェルに添加した。任意選択的に、トランスフェクションの１２時間後、各ウェルの上清を２ｍＬの新鮮なｃＲＰＭＩと交換した。トランスフェクションの４８時間後、上清は、１０６個の細胞に感染させる準備ができていた。
【0179】
ＴＣＲライブラリのクローニング。ＴＣＲライブラリのｄｓＤＮＡを、ＧｅｎｅＡｒｔ技術（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって商業的に合成し、ＨｉＦｉアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によりｐＨＲレンチウイルスベクターにクローニングした。具体的には、ＴＣＲライブラリの２０ｎｇのｄｓＤＮＡ、１００ｎｇの線形化ｐＨＲベクター、及び１０μＬのＨｉＦｉアセンブリマスターミックスを混合し、５０℃で１時間インキュベートした（８回反復を行う）。１０μＬのアセンブリ産物をアガロースゲル上で分析して、アセンブリの成功を確認した。残りのアセンブリ産物を、ＰＣＲ産物クリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、３０μＬの水中で溶出した。エレクトロコンピテント細胞のＭｅｇａＸ ＤＨ１０Ｂ（商標）Ｔ１Ｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐ（商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を氷上で３０分間解凍した。次いで、５０μＬのＭｅｇａＸ細胞を５μＬ（＞１００ｎｇ）のＨｉＦｉアセンブリ産物と混合した。チューブを３回軽くたたき、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細菌／ＤＮＡミックスを冷却したエレクトロポレーションキュベットに移した。エレクトロポレーションを、２．０ｋＶ、２００Ω、２５μＦで実施した。細胞を、直ちに１０００μＬのＳＯＣ培地中で回収した。次いで、コンピテント細胞培養物を、３７℃、２２５ｒｐｍで１時間回収した。回収後、１０μＬ及び１０００μＬの細胞培養物を四角いバイオアッセイ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上にプレーティングし、３７℃で一晩培養した。コロニー形成単位（ｃｆｕ）を計算するために、１０μＬの培養物をプレーティングした四角いバイオアッセイ皿を使用した。全てのコロニーを四角いバイオアッセイ皿から削り取り、プラスミドをマキシプレプ（ｍａｘｉｐｒｅｐ）（Ｑｉａｇｅｎ）により抽出した。
【0180】
Ｔ細胞によるＴＣＲライブラリ表示。ＴＣＲライブラリのレンチウイルスを、上記の方法によりパッケージングした。ＴＣＲ５５Ｖαライブラリのレンチウイルスを、滴定して野生型ＴＣＲ５５βレンチウイルスとＳＫＷ３ Ｔ細胞に共感染させた。ＴＣＲ５５Ｖβライブラリのレンチウイルスを、滴定して野生型ＴＣＲ５５αレンチウイルスとＳＫＷ３ Ｔ細胞に共感染させた。ＭＡＧＥライブラリのレンチウイルスを、滴定して野生型ＭＡＧＥ－Ａ３ＴＣＲβレンチウイルスとＳＫＷ３ Ｔ細胞に共感染させた。感染の４８時間後、ＴＣＲ陽性集団のパーセンテージを、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）染色により決定し、フローサイトメトリーにより分析した。２０％の感染効率をもたらしたレンチウイルスの滴定を使用して、低ＭＯＩを有するように１億～２億個のＳＫＷ３ Ｔ細胞に感染させた。ＴＣＲ陽性細胞を選別し（Ｓｏｎｙ ＳＨ８００Ｓ）、更なる選別選択に使用した。
【0181】
ＴＣＲライブラリ選択。１０００万個のＫＧ－１細胞を、製造業者のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従ってＣＦＳＥで標識した。次いで、ＫＧ－１細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で３時間、１０μＭのＨＩＶペプチドでパルスした。ＫＧ－１細胞を５×１０５細胞／ｍＬで再懸濁し、ウェル当たり２００μＬで９６ウェルプレートに等分した。ＫＧ－１細胞を１回洗浄して、過剰なペプチドを除去した。１０００万個のＴ細胞のライブラリを５×１０５個の細胞／ｍＬで再懸濁し、ウェル当たり２００μＬでＫＧ－１細胞を有する９６ウェルプレートに等分した。１４時間の活性化後、細胞を、抗ＣＤ６９－ＡＰＣ（クローンＦＮ５０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＢ３５－ＨＩＶ－ＰＥ四量体（ｐＭＨＣ四量体の作製方法は以下に記載される）で、氷上で３０分間染色した。細胞を選別して、四量体染色－低（ＴＣＲ５５ ＷＴ細胞の四量体染色に相当する）、抗ＣＤ６９染色－高（抗ＣＤ６９ ＭＦＩに関して上位５％）の集団を選択した。細胞をＦＢＳに選別して、細胞の健康を維持した。選別した細胞を、ｃＲＰＭＩ中で培養した。次の選択ラウンドを続けるために十分な細胞を成長させることに２週間かかった。３～５ラウンドの選択の後、細胞を２．５細胞／ｍＬに希釈し、２００μＬの細胞希釈液を９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに等分することによって、単一細胞クローンを得た。単一細胞クローンから十分な数の細胞を成長させることに２～４週間かかった。各単一細胞クローンを、以下に記載のＴＣＲ５５シグナル伝達アッセイにより試験した。
【0182】
ＴＣＲ変異体の配列決定。予測される表現型を有するＳＫＷ３ Ｔ細胞の単一細胞クローンを使用して、製造業者のプロトコルに従ってゲノムＤＮＡを抽出した。ＴＣＲ変異体ＤＮＡ断片をＰＣＲによりクローニングし、ｐＨＲベクターにライゲーションした。ライゲーションの産物を使用してコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、ＴＣＲ変異体を配列決定するために３０個の単一コロニーを採取した。各単一細胞クローン中に２つ以上のＴＣＲ配列が見出され得（各Ｔ細胞は依然として、開始時に２つ以上のレンチウイルス粒子を形質導入され得る）、各ＴＣＲ配列は、更なるＴＣＲ活性化シグナル伝達アッセイのためにＳＫＷ３ Ｔ細胞を形質導入することによって個々に試験されるべきである。
【0183】
ＴＣＲ５５シグナル伝達アッセイ。ペプチドをＤＭＳＯに溶解し、滴定した。ＫＧ－１細胞をＣＦＳＥで標識し、次いで５×１０５細胞／ｍＬで再懸濁した。２００μＬのＫＧ－１細胞を、９６ウェルＵ底プレートの各ウェルに等分した。ＫＧ－１細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で３時間、滴定したペプチドでパルスした。その後、ＫＧ－１細胞を１回洗浄して、過剰なペプチドを除去した。ＳＫＷ３ Ｔ細胞トランスフェクタントを５×１０５細胞／ｍＬで再懸濁し、２００μＬのＴ細胞をペプチドパルスされたＫＧ－１細胞を含む各ウェルに添加した。刺激を、３７℃、５％のＣＯ２で１４時間実施した。刺激後、細胞を、抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及び抗αｂＴＣＲ－ＢＶ４２１（クローンＩＰ２６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で、氷上で３０分間染色し、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ）により分析した。蛍光体－ＥＲＫ染色のために、刺激を３７℃、５％のＣＯ２で１５分間だけ実施した。刺激後、細胞を直ちに４％のＰＦＡで固定し、１５分間振盪した。次いで、細胞をＰＢＳ（０．５％のＢＳＡ）で洗浄し、氷上で３０分間、氷冷メタノール中で透過処理した。次いで、細胞をＰＢＳ（０．５％のＢＳＡ）で２回洗浄し、抗ｐＥＲＫ１／２（クローン１９７Ｇ２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ）の１：５０希釈液で、振盪しながら室温で１時間染色した。細胞を１回洗浄し、ＣｙｔｏＦＬＥＸにより分析した。
【0184】
ＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲシグナル伝達アッセイ。ＭＡＧＥ－Ａ３（ＥＶＤＰＩＧＨＬＹ、配列番号１９）又はタイチン（ＥＳＤＰＩＶＡＱＹ、配列番号２０）ペプチド（８０％の純度、Ｅｌｉｍペプチド）をＤＭＳＯ中に溶解し、滴定した。ＨＬＡ－Ａ１－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰレンチウイルスベクターを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、ＧＦＰ陽性細胞を選別して抗原提示細胞（２９３Ｔ－Ａ１）として使用した。２９３Ｔ－Ａ１細胞を５×１０５細胞／ｍＬで再懸濁し、３７℃、５％のＣＯ２で３時間、滴定したペプチドでパルスした。２００μＬのＫＧ－１細胞を、９６ウェルＵ底プレートの各ウェルに等分した。パルス後、２９３Ｔ－Ａ１細胞を１回洗浄して、過剰なペプチドを除去した。ＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ変異体を形質導入したＳＫＷ３細胞を５×１０５細胞／ｍＬで再懸濁し、２００μＬのＴ細胞を、ペプチドパルスした２９３Ｔ－Ａ１細胞を含む各ウェルに添加した。刺激を、３７℃、５％のＣＯ２で１４時間実施した。刺激後、細胞を、抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及び抗Ｖｂ５．１－ＢＶ４２１（クローンＬＣ４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、氷上で３０分間染色し、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ）により分析した。
【0185】
ＴＣＲによるヒト初代Ｔ細胞の形質導入。健常な匿名のボランティアドナーからのヒト全血は、ＡＰＢ－２７４９－ＫＧ１０１８の承認されたプロトコルに従ってＳｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｋ Ｂａｎｋから購入した。６ウェルプレートを、２ｍＬの２．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３クローン）で一晩コーティングした。翌日、ヒトＰＢＭＣを、５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８を含むプレートに添加し、３７℃、５％のＣＯ２で３日間培養した。４００万個のＬｅｎｔｉＸ細胞を１０ｃｍの皿に播種し、ＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ α鎖又はβ鎖のレンチウイルスベクターでトランスフェクトした。上述のようにレンチウイルスを作製した。合計４０ｍＬのＴＣＲウイルスを、１００ｋＤａカットオフフィルタを使用して５００μＬに濃縮した。５００万個の事前活性化ヒトＰＢＭＣを５００μＬの培地に再懸濁し、５００μＬの濃縮ＴＣＲウイルス及び５μｇ／ｍＬのポリブレン並びに１００Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ－２と混合した。ウイルス／細胞混合物を、２８００ｒｐｍ、３２℃で２時間スピン感染で処理した。
【0186】
腫瘍細胞の殺傷アッセイ。２０，０００個のＡ３７５又はＨＣＴ－１１６細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。６０，０００個のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代細胞を腫瘍細胞とともに各ウェルに添加し、２４時間共培養した。プレートをＥＤＴＡ不含緩衝液で洗浄し、７－ＡＡＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びアネキシンＶ－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ）で１０分間染色した。プレートをＣｙｔｏＦＬＥＸにより分析した。
【0187】
細胞傷害性サイトカイン及び顆粒放出アッセイ。２００，０００個の腫瘍細胞又はペプチドパルスされた２９３Ｔ－Ａ１細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに一晩播種した。翌日、２００，０００個のＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ形質導入ヒト初代細胞を、１：１００の抗ＣＤ１０７ａ－ＰＥ（クローンＨ４Ａ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及び１：１０００のブレフェルジンＡと混合し、次いで、各ウェルに添加した。共培養を３７℃、５％のＣＯ２で６時間行った。６時間後、プレートを、抗ＣＤ８－ＢＶ４２１（クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗Ｖｂ５．１－ＡＰＣで染色した。次いで、プレートをＩＣ固定で固定し、透過処理緩衝液によって透過処理した。プレートを、抗ＩＦＮ－ψ－ＢＶ６０５（クローンＢ２７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及び抗ＴＮＦ－ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＭＡｂ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で、３０分間氷上で更に染色した。次いで、プレートを洗浄し、ＣｙｔｏＦＬＥＸにより分析した。
【0188】
ＭＨＣ及びｂ－２－ミクログロブリン包含体の産生。Ｂ３５ ＭＨＣ重鎖及びヒトβ－２－ミクログロブリンのタンパク質を、包含体としてＥ．ｃｏｌｉにおいて作製した。具体的には、Ｂ３５ ＭＨＣ重鎖又はヒトβ－２－ミクログロブリンをｐＥＴ２８ａベクターにクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ株に形質転換した。単一コロニーを採取し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１０ｍＬのＬＢ培地に再懸濁し、２５０ｒｐｍ、３７℃で１２～１６時間振盪した。次いで、１０ｍＬの培養物を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１ＬのＬＢ培地に添加し、ＯＤ＝０．５～０．６になるまで、２５０ｒｐｍ、３７℃で約３時間振盪した。ＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度で培養物に添加し、更に３時間振盪し続けた。細菌培養物を６０００ｒｐｍで２０分間沈降させた。細菌ペレットを５０ｍＬの緩衝液１（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ｍＭのＰＭＳＦ）に再懸濁した。次いで、細菌を、２分間の超音波処理＋２分間の静置のプログラム下で超音波処理した。超音波処理プログラムを４回連続して繰り返した。その後、細菌を１５分間７５００ｒｐｍで回転させた。それを更に２回繰り返して、緩衝液１に細菌ペレットを再懸濁し、超音波処理を行った。次いで、細菌ペレットを５０ｍＬの緩衝液２（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。次いで、細菌を、２分間の超音波処理＋２分間の静置のプログラム下で超音波処理した。超音波処理プログラムを４回連続して繰り返した。その後、細菌を１５分間７５００ｒｐｍで回転させた。それを更に１回繰り返して、緩衝液２に細菌ペレットを再懸濁し、超音波処理を行った。包含体をペレット化し、２５ｍＬの緩衝液（８Ｍの尿素、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ）中に可溶化した。
【0189】
ｐＭＨＣの再折り畳み。再折り畳み緩衝液を、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、４００ｍＭのアルギニン、５Ｍの尿素、０．５ｍＭの酸化グルタチオン、５ｍＭの還元グルタチオン、２ｍＭのＥＤＴＡとして調製した。３０ｍｇのペプチドをＤＭＳＯに溶解し、各リットルの再折り畳み緩衝液に添加した。各リットルの再折り畳み緩衝液について、３０ｍｇのＭＨＣ重鎖包含体及び３０ｍｇのヒトβ－２－ミクログロブリン包含体をシリンジに混合し、再折り畳み緩衝液の各リットルに１滴ずつ添加した。次いで、再折り畳み緩衝液／タンパク質を透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ）に注ぎ、１０Ｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０に透析した。１０Ｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０緩衝液を１２時間毎に交換し、合計４回繰り返した。次いで、弱陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥセルロース、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、タンパク質を精製した。具体的には、ＤＥＡＥ－セルロースを、カラム中の１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化した。次いで、透析された再び折り畳まれたタンパク質溶液は、一滴ずつセルロースカラムを通って流れ、流すことをもう一度繰り返した。再び折り畳まれたタンパク質を、３０ｍＬの１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０＋０．５ＭのＮａＣｌにおいて溶出した。タンパク質を１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に緩衝液交換し、５００μＬに濃縮し、一晩ビオチン化した。ビオチン化された再び折り畳まれたタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びイオン交換（ＭｏｎｏＱ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、ＡＫＴＡＰｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分析した。
【0190】
ｐＭＨＣ四量体。各１０００万個の細胞を染色するために、２０μｇのビオチン化ｐＭＨＣタンパク質及び３０μｇのストレプトアビジン－ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を等分した。ストレプトアビジン－ＰＥの総量の２０％を、毎回１時間の間隔時間でビオチン化ｐＭＨＣに添加し、５回繰り返した。間隔時間中、四量体を氷上でインキュベートした。使用する前に、ｐＭＨＣ四量体を４℃で一晩保存した。
【0191】
Ｅｘｐｉ２９３によるＴＣＲタンパク質の産生。ＳＰＲに使用されるＴＣＲタンパク質をＥｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において産生した。具体的には、ＴＣＲα鎖を塩基性ジッパーを用いてｐＤ６４９ベクターにクローニングし、ＴＣＲβ鎖を酸性ジッパーを用いてｐＤ６４９ベクターにクローニングした。１５μｇのＴＣＲα鎖構築物及び１５μｇのＴＣＲβ鎖構築物を、製造業者のプロトコルに従って、７５００万個のＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４日後、細胞培養物を４００ｇで５分間沈降させ、上清を保存した。１倍体積のＰＢＳを上清に添加し、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０緩衝液の最終濃度を添加した。２ｍＬのニッケル－ＮＴＡを上清に添加し、溶液を４℃で一晩回転させた。次いで、溶液をカラムに流して、Ｎｉ－ＮＴＡ及び結合したタンパク質を収集した。１０ｍＭのイミダゾールを含有する１倍のＨＢＳ ｐＨ７．２を使用して、Ｎｉ－ＮＴＡ及びタンパク質を１回洗浄し、タンパク質を３００ｍＭのイミダゾールを含有する１倍のＨＢＳ ｐＨ７．２により溶出した。タンパク質を３０ｋＤａフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に濃縮し、１×ＨＢＳ ｐＨ７．２中で緩衝液交換した。タンパク質を、ＡＫＴＡＰｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィにより精製した。精製されたタンパク質を、サイズに基づいて一致する画分から収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで実行して、サイズ及び１：１化学量論を確認した。
【0192】
昆虫細胞によるＴＣＲタンパク質の産生。ＴＣＲα鎖を塩基性ジッパーを用いてｐＡｃＧＰ６７ａベクターにクローニングし、ＴＣＲβ鎖を酸性ジッパーを用いてｐＡｃＧＰ６７ａベクターにクローニングした。２μＬのバキュロウイルス直鎖ＤＮＡ及び２μｇのＴＣＲ構築物を１００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び６．６μＬのＦｕｇｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、１５分間静置させた。混合物を２００万個のＳＦ９細胞に添加し、６～７日間待機した。細胞培養物を２０００ｒｐｍで８分間沈降させた。上清をＰ０ウイルスとして保存した。Ｐ１ウイルスは、２５μＬのＰ０ウイルスを２００万個の細胞／ｍＬで２５ｍＬのＳＦ９細胞に添加することにより作製した。２５ｍＬの培地を２４時間後に培養物に添加した。６～７日後、Ｐ１ウイルスを、２０００ｒｐｍで８分間細胞培養物を沈降させ、上清を保存することにより収集した。ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のＰ１ウイルスを使用し、滴定して、２００万個のＨｉ５細胞を共感染させ、最高量の１：１の発現を得るために使用されるＰ１ウイルスの最適量を決定した。通常、各鎖について１～４ｍＬのＰ１ウイルスを１ＬのＨｉ５細胞（２００万個の細胞／ｍＬ）に使用した。ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のＰ１ウイルスの最適量をＨｉ５細胞に添加した。共感染の７２時間後、細胞培養物を１５００ｒｐｍで１５分間沈降させた。上清を収集し、各リットルの上清について、１００ｍＬの１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＬの１ＭのＮｉＣｌ２、及び１ｍＬの５ＭのＣａＣｌ２を添加し、３０分間撹拌した。その後、溶液を６０００ｒｐｍで１５分間沈降させた。上清を収集し、３ｍＬのＮｉ－ＮＴＡを各リットルの溶液に添加した。溶液を５時間又は一晩撹拌した。次いで、溶液をブフナー漏斗を通して濾過し、Ｎｉ－ＮＴＡをフィルタカラムに移した。タンパク質結合型Ｎｉ－ＮＴＡを、２０ｍＭのイミダゾールを含有する５００ｍＬの１×ＨＢＳ ｐＨ７．２で洗浄した。次いで、タンパク質を、３００ｍＭのイミダゾールを含有する１５ｍＬの１×ＨＢＳ ｐＨ７．２で溶出した。タンパク質を３０ｋＤａのフィルタに濃縮し、１×ＨＢＳ ｐＨ７．２で１回洗浄した。タンパク質を、ＡＫＴＡＰｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィにより精製した。精製されたタンパク質を、サイズに基づいて一致する画分から収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで実行して、サイズ及び１：１化学量論を確認した。
【0193】
表面プラズモン共鳴。特異的ｐＭＨＣへのＴＣＲ結合の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での表面プラズモン共鳴により測定した。再び折り畳まれたｐＭＨＣタンパク質をビオチン化し、ストレプトアビジンチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定化した。ＴＣＲタンパク質を３Ｃプロテアーゼで処理して、塩基性／酸性ジッパーを除去した。ｐＭＨＣタンパク質を、１００～２００ＲＵの増加まで固定化し、滴定したＴＣＲタンパク質を、２５℃でフローセルを通して流した。定常状態の親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅソフトウェアにより決定した。解離後、試料が完全にベースラインに戻ったため、表面再生は必要なかった。
【0194】
ＢＦＰアッセイ。ＢＦＰ力クランプアッセイは、以前に詳細に説明されている。要約すると、目的のＴ細胞を、Ｌａｂｖｉｅｗ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）プログラムによって制御されるピエゾ駆動マイクロピペット上に吸引した。ＥＺ－ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でビオチン化された吸引されたＲＢＣとして対向するマイクロピペットを使用した。このＲＢＣの頂点には、目的のｐＭＨＣ（ＨＬＡ Ｂ３５－ＨＩＶ（Ｐｏｌ４４８－４５６）、Ｂ３５－Ｐｅｐ２０、Ａ１－ＭＡＧＥ－Ａ３、又はＡ１－タイチン）でコーティングされたストレプトアビジン－マレイミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）結合ガラスビーズがあった。このＲＢＣ：ビーズ複合体は、力プローブセンサーとして機能した。各Ｔ細胞を繰り返し接触させ、保持し、次いで、ピエゾアクチュエータによって制御される距離まで後退させた。後退及び保持相は、Ｔ細胞が後退した距離に基づいて、ＴＣＲ：ＭＨＣ結合上に力を生成し、これは変更され得る。ビーズの縁の位置は、３ｎｍ未満の変位精度で高解像度カメラ（１，６００フレーム／秒）によって追跡された。次いで、カメラは、Ｔ細胞がガラスビーズを離脱することにかかった時間を記録し、これは、ＲＢＣが後退し、ビーズがその開始位置に戻ることによって視覚的に見ることができる。複数の反復サイクル（力－クランプサイクルとして知られる）は、ＴＣＲとペプチド：ＭＨＣ複合体との間の平均結合寿命を生成するために、単一の力で運ばれ得る。力のレベルを変化させ、平均結合寿命及び結合形成の種類の決定を可能にする寿命を記録する。
【0195】
ＴＣＲシグナル伝達レポータープラスミドの分子クローニング。ＬＣＡＧ－ＨＢＧ及びＬＥＧ１１－ＮＦＡＴ２レンチウイルス発現プラスミドを、前述のスプリット－ＧＦＰシステムに基づいて、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙクローニングによって作製した。ＥＦ１α－ＥＲＫ－ ＫＴＲ－ｍＳｃａｒｌｅｔ又はＥＦ１α－ｐ３８－ＫＴＲ－ｍＳｃａｒｌｅｔレンチウイルス発現ベクターを、Ｍａｒｋｕｓ Ｃｏｖｅｒｔ ｌａｂ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃５９１５０又は＃５９１５５）からのＥＲＫ－ＫＴＲ－Ｃｌｏｖｅｒ又はｐ３８－ＫＴＲ－ｍＣｅｒｕｌｅａｎ３プラスミドに基づくＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙクローニングにより生成した。
【0196】
Ｊｕｒｋａｔ ＥＲＫ及びｐ３８－ＮＦＡＴ２レポーター細胞株。ＧＦＰ１－１０発現を有する生細胞核マーカーを作製するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞株に、ＬＣＡＧ－ＨＢＧレンチウイルス発現ベクターを形質導入した。安定したＨ２Ｂ－ｔＢＦＰ＋Ｊｕｒｋａｔ細胞をＦＡＣＳ選別によって単離し、ＬＥ－ＥＫＳレンチウイルス発現ベクターを形質導入した。次いで、安定したＥＲＫ－ＫＴＲ－ｍＳｃａｒｌｅｔ＋Ｊｕｒｋａｔ細胞をＦＡＣＳ選別により単離して、ＥＲＫレポーター細胞株を作製した。ｐ３８－ＮＦＡＴ２レポーター細胞株を作製するために、Ｈ２Ｂ－ｔＢＦＰ＋Ｊｕｒｋａｔ細胞に、ＬＥ－３８ＫＳ及びＬＥＧ１１－ＮＦＡＴ２レンチウイルス発現ベクターを形質導入した。安定したｐ３８－ＫＴＲ－ｍＳｃａｒｌｅｔ＋及びＧＦＰ１－１１－ＮＦＡＴ２＋Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＦＡＣＳ選別により単離した。
【0197】
生細胞共焦点顕微鏡法。生細胞蛍光タイムラプスイメージングデータを、６３倍のＮＡ １．４油対物レンズ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｅｃｔｉｏｎ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｂｒａｎｃｈ，ＮＩＡＩＤ）を備えたＬｅｉｃａ ＳＰ８顕微鏡を使用して収集した。ガラス底８ウェルイメージングチャンバを、４℃で一晩ポリＤ－リジンでコーティングし、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、５％のＣＯ２で加熱した３７℃の環境で撮像した。イメージングデータは、Ｉｍａｒｉｓ Ｃｅｌｌモジュール、カスタマイズされたバッチ分析及びＴｒａｎｓｌｏｃＱパイプラインにより処理された。
【0198】
ＢＡＴＴＬＥＳ。熱応答性「スマートビーズ」（直径約４７μｍ）を産生するために、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＡＰＭ、９．２％ｗ／ｖ）、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ、ＭＷ＝７００、２．８４３７％ｖ／ｖ）、ランタニドナノ蛍光体、アクリル酸ナトリウム（１Ｍ、５．５％ｖ／ｖ）、及びフェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィネートリチウム（ＬＡＰ、３９．２ｍｇ／ｍＬ、２．５％ｖ／ｖ）の混合物を生成した。次いで、この混合物と、２％のイオン性Ｋｒｙｔｏｘ １５７ ＦＳＨ界面活性剤及び０．０５％ｖ／ｖアクリル酸を含むフッ素化ＨＦＥ７５００油懸濁液とをマイクロ流体液滴生成器に注入して、後に１００％の振幅（ランプから７”離れた、電力＝約５０～６０ｍＷ／ｃｍ２）の投光ＵＶ照明（ＩｎｔｅｌｌｉＲａｙ、ＵＶ０３３８）下で２分間固体ビーズに重合させた、油中水型液滴を産生した（４８）。重合後、カルボキシル化された「スマートビーズ」を、２ｍＬのジメチルホルムアミドで２０秒間、２ｍＬのジクロロメタンで１０秒間、及び２ｍＬのメタノールで２０秒間洗浄した後、１ｍＬのＰＢＳＴ緩衝液に再懸濁した。ストレプトアビジンで「スマートビーズ」をコーティングするために、エンドオーバーエンド回転子（１０ｒｐｍ）上で、室温で３．５時間、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０を補充した４００μＬの０．１ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝４．５）中１％ｗ／ｖのＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ′－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）で約２００，０００個のビーズを事前に活性化した。ビーズを沈降させ、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０を補充した１ｍＬの０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８．５）で洗浄し、その後、４００μＬの同じ緩衝液に再懸濁した。次いで、１６μＬのストレプトアビジン溶液（１ｍｇ／ｍＬで１倍のＰＢＳに溶解）を混合物に添加し、混合物を４℃で一晩回転させた。翌日、混合物に０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８．５）中０．２５Ｍのエタノールアミン１０μＬを添加し、４℃で３０分間回転させることによって、コンジュゲーション反応をクエンチした。最終産物をＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、２００μＬの同じ緩衝液に再懸濁し、更なる使用のために４℃で保管した。ｐＭＨＣ官能化「スマートビーズ」を、５０μＬのＰＢＳＴ緩衝液中の約２０，０００のストレプトアビジン「スマート」ビーズと１０ｎＭのビオチン－ｐＭＨＣの０．５μＬとを混合することによって生成した。次いで、ＰＤＭＳマイクロウェルアレイ（１４４０ウェル）を使用して、ｐＭＨＣコーティングされたビーズ及びカルシウム色素（Ｃａｌ－２５０、２μＭ）染色されたＴ細胞を共局在化した。ビーズ関連Ｔ細胞に機械的負荷を加えるために、チップを加熱し、３７℃で１分間維持し、次いで冷却し、３４℃で２分間保持した。冷却直後、４秒間隔で合計１５０枚のＣａ２＋蛍光画像を取得した。単一のＴ細胞の統合されたＣａ２＋シグナルを、ＩｍａｇｅＪ及び特注のＭＡＴＬＡＢ（登録商標）コードにより分析した。
【0199】
酵母表示ＨＬＡ－Ａ１－ペプチドライブラリ。酵母表示ＨＬＡ－Ａ１ペプチドライブラリを、前述のプロトコルと同様に生成した。ＨＬＡ－Ａ１－ペプチドを発現するために、リンカーによって接続されたペプチドライブラリ、ｂ－２－ミクログロブリン（ｂ２Ｍ）及びＡ１重鎖の一本鎖フォーマットを、Ｎ末端でＡｇａ２に融合させた。Ａ１重鎖は、ＭＨＣ溝の末端で開口部を可能にするＹ８４Ａ変異を含み、リンカーは、ペプチドをｂ２Ｍと接続することができる。ペプチドライブラリについて、Ｐ３及びＰ９を、限られた多様性：アスパラギン酸又はグルタマートとしてのＰ３、チロシンのみとしてのＰ９を有するアンカー残基として設定した。ペプチドライブラリの他の位置について、ＮＮＫコドンを使用して、２０個全てのアミノ酸を可能にした。ペプチドライブラリを、ＰＣＲを介して増幅してｐＭＨＣ－Ａｇａ２インサートの一本鎖を生成した短いヌクレオチドプライマーとして合成した。酵母表示ＨＬＡ－Ａ１－ペプチドライブラリを生成するために、コンピテントなＥＢＹ－１００酵母細胞を、ｐＭＨＣ－Ａｇａ２ライブラリインサート及び線形ｐＹＡＬベクターでエレクトロポレーションした。ｐＭＨＣ－Ａｇａ２ライブラリインサートを、相同組換えを介して、酵母細胞内のｐＹＡＬベクターにライゲーションした。最初の酵母ライブラリを１：１０，０００、１：１，０００、１：１００、及び１：１０でプレーティングすることによって、ライブラリサイズを、１．８×１０８の機能的多様性を有するように計算した。酵母ライブラリを、ＳＤＣＡＡ ｐＨ４．５培地中で成長させた。次いで、酵母ライブラリを、ＳＧＣＡＡ ｐＨ４．５培地中で成長させることによって、ｐＭＨＣライブラリタンパク質を発現させるように誘導した。
【0200】
酵母表示ＨＬＡ－Ａ１－ペプチドライブラリの選択。酵母表示ＨＬＡ－Ａ１－ペプチドライブラリを、ビオチン化ＴＣＲタンパク質でコーティングされたストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズで選択した。各ラウンドの選択に使用される酵母細胞の数は、最後の選択ステップの多様性より１０倍高くするべきである（ラウンド１は、ナイーブライブラリ多様性の１０倍の酵母細胞数を使用すべきである）。酵母ライブラリを、最初に１０ｍＬのＰＢＥ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％のＦＢＳ＋１ｍＭのＥＤＴＡ）中の２５０μＬのストレプトアビジン磁気ビーズとともにインキュベートし、４℃で１時間回転させて、負の選択を行い、ストレプトアビジン磁気ビーズへの非特異的結合を除去した。インキュベーション後、酵母－ビーズ混合物をＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に通し、ＰＢＥ緩衝液で３回洗浄し、全てのフロースルーを収集した。ＴＣＲタンパク質でコーティングされたストレプトアビジン磁気ビーズを、４℃で１５分間、４．７ｍＬのＰＢＥ緩衝液中で４００ｎＭのビオチン化ＴＣＲ単量体と２５０μＬのストレプトアビジンビーズとを混合することによって調製した。フロースルーをＴＣＲビーズとともに、回転子上で４℃で３時間インキュベートした。酵母細胞を洗浄し、５０００ｇで１分間ペレット化した。酵母細胞を５ｍＬのＰＢＥ緩衝液に再懸濁し、ＬＳカラムに通し、ＰＢＥ緩衝液で３回洗浄した。フロースルーを廃棄した。カラム中の細胞を５ｍＬのＰＢＥ緩衝液によって溶出させ、ペレット化した。ペレットをＳＤＣＡＡ培地で１回洗浄し、３ｍＬのＳＤＣＡＡ培地に再び再懸濁して、一晩成長させた。ＯＤが２を超える場合、次の選択ラウンドの前の２～３日間、ＳＧＣＡＡ中で酵母細胞を誘導した。酵母ライブラリを、選択の各ラウンドの後、特異的ＴＣＲ四量体及び抗Ｍｙｃ抗体で染色した。ＴＣＲ単量体及びストレプトアビジン－Ａ６４７を５：１の比で混合することによって、最終濃度４００ｎＭでＴＣＲ四量体を調製した。１００，０００個の酵母細胞を、ＴＣＲ四量体及び２μＬの抗ｃ－Ｍｙｃ－４８８抗体（９４０２Ｓ、細胞シグナル伝達）で２００μＬの緩衝液中で染色した。ＦＡＣＳプロットを、ＳＧＣＡＡによって誘導された酵母細胞に基づいてゲーティングし、ストレプトアビジン－Ａ６４７で染色した。５００μＬのＰＢＥ中のＴＣＲの有無にかかわらず、５０μＬのストレプトアビジンコーティングされたビーズのみを使用して、負及び正の選択に対して行われた修飾のみを有する、１０×１０８の酵母で更なる選択のラウンドを繰り返した。
【0201】
ディープシーケンシング。５０００万個の酵母細胞から各ラウンドの選択のために、酵母ＤＮＡを、Ｚｙｍｏｐｒｅｐ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって抽出した。各ＤＮＡ試料について最初にバーコード化ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をゲル抽出によって精製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＰＣＲ産物をｎａｎｏｄｒｏｐによって定量化した。４０μＬの８ｎＭの溶液を得るために必要な各Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＰＣＲ産物及び水の量を計算し、等分し、一緒に混合した。低多様性ライブラリのために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｖ２ ２ｘ３００サイクルキットを製造業者のプロトコルに従って使用した。
【0202】
ディープシーケンシングデータの分析及び酵母選択からの野生型ペプチドの予測。配列決定結果を最初にＰＡＮＤＡＳＥＱにより対合した。次いで、対合した配列をＧｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアにインポートして、各ラウンドの選択のバーコードを解析した。独自のペプチドを配列からトリミングし、アミノ酸の頻度を以前に使用した特注Ｐｅｒｌスクリプトによって計数した。各ＴＣＲの野生型ペプチドを予測するために、ラウンド３の選択からのペプチドに基づいて位置頻度マトリックスを決定した。ヒトプロテオームデータにおける９－ｍｅｒペプチドをスコア化するために、１０超計数された独自のペプチドを使用して、位置重みマトリックス（ＰＷＭ）を生成した。次いで、個々のＴＣＲ選択からの各ＰＷＭを使用して、ヒトプロテオームからの野生型ペプチドを予測した。使用されたＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓプロテオームは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ＩＤ ＵＰ０００００５６４０；２０２０年６月更新）からのものであった。Ｐｙｔｈｏｎは、重み付けされた位置頻度マトリックスのアルゴリズム及び参照プロテオームのランク付けに使用された。
【0203】
予測される野生型ペプチドのスクリーニング。ＴＣＲ Ａ３Ａ、９４ａ－１４、２０ａ－１８、９４ａ－３０について上位２０個の予測される野生型ペプチドを合成し、反復ペプチドを除去した後、５９個の異なるペプチドが一緒に存在した。ＭＡＧＥ－Ａ１２は、以前の研究で交差反応性であることが示されたため、ＨＬＡ－Ａ１制限ＭＡＧＥ－Ａ１２ペプチドも合成し、試験した。合計６０個の異なる野生型ペプチドを使用して、異なるＴＣＲの活性をスクリーニングした。簡潔に述べると、９６ウェルプレートの各ウェルにおいて、３７℃、５％のＣＯ２で３時間、１００，０００個の２９３－Ａ１細胞を異なる野生型ペプチドでパルスした。次いで、２９３－Ａ１細胞を完全なＲＰＭＩで洗浄して、過剰なペプチドを除去した。異なるＴＣＲを発現する１００，０００個のＳＫＷ３細胞を各ウェルに添加し、３７℃、５％のＣＯ２で１４時間共培養した。細胞の抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及び抗ＴＣＲ－ＢＶ４２１染色を氷上で行い、フローサイトメーターで分析した。ＭＡＧＥ－Ａ３、タイチン、ＭＡＧＥ－Ａ６、及びＦＡＴ２ペプチドの用量応答を行うために、９６ウェルプレートの各ウェルにおいて、３７℃、５％のＣＯ２で３時間、１００，０００個のＨＬＡ－Ａ１細胞を滴定したペプチドでパルスした。次いで、２９３－Ａ１細胞を完全なＲＰＭＩで１回洗浄して、過剰なペプチドを除去した。異なるＴＣＲを発現する１００，０００個のＳＫＷ３細胞を各ウェルに添加し、３７℃、５％のＣＯ２で１４時間共培養した。細胞の抗ＣＤ６９－ＡＰＣ及び抗ＴＣＲ－ＢＶ４２１染色を氷上で行い、フローサイトメーターで分析した。
【0204】
全てのデータは、図の凡例、結果、及び方法の詳細に記載されている、平均値±標準偏差（ＳＤ）（技術的反復の場合）又は平均値±標準誤差（ＳＥＭ）（生物学的反復の場合）として表される。ｎの正確な値及びｎが表すもの（例えば、細胞数、単一分子リガンド結合事象、又は実験的反復）は、図の凡例及び結果に記載される。滞留時間測定値（方法の詳細及び以下）を除く全てのデータをプロットし、Ｐｒｉｓｍで分析した。
【0205】
前述した内容は、本発明の原理を単に例示しているに過ぎない。当業者は、本明細書に明示的に記載又は示されていないが、本発明の原理を具現化し、その精神及び範囲内に含まれる様々な配置を考案することができることが理解される。更に、本明細書に列挙された全ての例及び条件的文言は、主として本発明の原理及び発明者らにより当該技術の促進のために寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、かかる具体的に列挙された例及び条件への限定ではないと解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、及び実施形態、並びにその具体的な例を列挙する本明細書における全ての記述は、その構造的及び機能的等価物の両方を包含することを意図している。加えて、かかる同等物は、現在知られている同等物及び将来開発される同等物の両方、すなわち、構造に関係なく、同じ機能を実施する開発される任意の要素を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示及び記載の例示的な実施形態に限定されることを意図していない。むしろ、本発明の範囲及び精神は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。
【0206】
配列
ＷＴ（配列番号１、シグナル配列を含む）
ＭＥＴＬＬＧＬＬＩＬＷＬＱＬＱＷＶＳＳＫＱＥＶＴＱＩＰＡＡＬＳＶＰＥＧＥＮＬＶＬＮＣＳＦＴＤＳＡＩＹＮＬＱＷＦＲＱＤＰＧＫＧＬＴＳＬＬＬＩＱＳＳＱＲＥＱＴＳＧＲＬＮＡＳＬＤＫＳＳＧＲＳＴＬＹＩＡＡＳＱＰＧＤＳＡＴＹＬＣＡＶＲＰＧＧＡＧＳＹＱＬＴＦＧＫＧＴＫＬＳＶＩＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ
ＷＴ（配列番号１、シグナル配列を含む）
ＭＥＴＬＬＧＬＬＩＬＷＬＱＬＱＷＶＳＳＫＱＥＶＴＱＩＰＡＡＬＳＶＰＥＧＥＮＬＶＬＮＣＳＦＴＤＳＡＩＹＮＬＱＷＦＲＱＤＰＧＫＧＬＴＳＬＬＬＩＱＳＳＱＲＥＱＴＳＧＲＬＮＡＳＬＤＫＳＳＧＲＳＴＬＹＩＡＡＳＱＰＧＤＳＡＴＹＬＣＡＶＲＰＧＧＡＧＳＹＱＬＴＦＧＫＧＴＫＬＳＶＩＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ
【0207】
Ａ３Ａ（配列番号２、シグナル配列を含む）
ＭＥＴＬＬＧＬＬＩＬＷＬＱＬＱＷＶＳＳＫＱＥＶＴＱＩＰＡＡＬＳＶＰＥＧＥＮＬＶＬＮＣＳＦＴＤＳＡＩＹＮＬＱＷＦＲＱＤＰＧＫＧＬＴＳＬＬＬＶＲＰＹＱＲＥＱＴＳＧＲＬＮＡＳＬＤＫＳＳＧＲＳＴＬＹＩＡＡＳＱＰＧＤＳＡＴＹＬＣＡＶＲＰＧＧＡＧＳＹＱＬＴＦＧＫＧＴＫＬＳＶＩＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ
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【0208】
２０ａ－１８（配列番号３、シグナル配列を含む）
ＭＥＴＬＬＧＬＬＩＬＷＬＱＬＱＷＶＳＳＫＱＥＶＴＱＩＰＡＡＬＳＶＰＥＧＥＮＬＶＬＮＣＳＦＴＨＳＨＩＹＮＬＱＷＦＲＱＤＰＧＫＧＬＴＳＬＬＬＩＲＳＮＱＲＥＱＴＳＧＲＬＮＡＳＬＤＫＳＳＧＲＳＴＬＹＩＡＡＳＱＰＧＤＳＡＴＹＬＣＡＶＲＰＧＧＡＧＳＹＱＬＴＦＧＫＧＴＫＬＳＶＩＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ
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【0209】
２０ａ－５（配列番号４、シグナル配列を含む）
ＭＥＴＬＬＧＬＬＩＬＷＬＱＬＱＷＶＳＳＫＱＥＶＴＱＩＰＡＡＬＳＶＰＥＧＥＮＬＶＬＮＣＳＦＴＧＳＨＩＹＮＬＱＷＦＲＱＤＰＧＫＧＬＴＳＬＬＬＩＲＳＮＱＲＥＱＴＳＧＲＬＮＡＳＬＤＫＳＳＧＲＳＴＬＹＩＡＡＳＱＰＧＤＳＡＴＹＬＣＡＶＲＰＧＧＡＧＳＹＱＬＴＦＧＫＧＴＫＬＳＶＩＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ
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【0210】
２０ａ－新規１２（配列番号５、シグナル配列を含む）
ＭＥＴＬＬＧＬＬＩＬＷＬＱＬＱＷＶＳＳＫＱＥＶＴＱＩＰＡＡＬＳＶＰＥＧＥＮＬＶＬＮＣＳＦＴＨＳＨＩＹＮＬＱＷＦＲＱＤＰＧＫＧＬＴＳＬＬＬＩＲＳＲＱＲＥＱＴＳＧＲＬＮＡＳＬＤＫＳＳＧＲＳＴＬＹＩＡＡＳＱＰＧＤＳＡＴＹＬＣＡＶＲＰＧＧＡＧＳＹＱＬＴＦＧＫＧＴＫＬＳＶＩＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ
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【0211】
２７ａ－５（配列番号６、シグナル配列を含む）
ＭＥＴＬＬＧＬＬＩＬＷＬＱＬＱＷＶＳＳＫＱＥＶＴＱＩＰＡＡＬＳＶＰＥＧＥＮＬＶＬＮＣＳＦＴＧＳＨＩＹＮＬＱＷＦＲＱＤＰＧＫＧＬＴＳＬＬＬＩＲＳＥＱＲＥＱＴＳＧＲＬＮＡＳＬＤＫＳＳＧＲＳＴＬＹＩＡＡＳＱＰＧＤＳＡＴＹＬＣＡＶＲＰＧＧＡＧＳＹＱＬＴＦＧＫＧＴＫＬＳＶＩＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ
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【0212】
２９ａ－７（配列番号７、シグナル配列を含む）
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【0213】
６８ａ－２（配列番号８、シグナル配列を含む）
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【0214】
９４ａ－１４（配列番号９、シグナル配列を含む）
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【0215】
９４ａ－３０（配列番号１０、シグナル配列を含む）
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【0216】
６８ａ－３８（配列番号１１、シグナル配列を含む）
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【0217】
６８ａ－新規９（配列番号１２、シグナル配列を含む）
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【0218】
（配列番号１３、シグナル配列を含む）
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【0219】
９４－１０（配列番号１４、シグナル配列を含む）
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【0220】
２０ａ－５（配列番号１５、シグナル配列を含む）
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【0221】
配列番号１６、シグナル配列を含む
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【0222】
ＴＣＲ５５アルファ鎖。Ａｌａ９８ホットスポットを、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｑ、Ｙ、及びＨに変異させて、Ｂ３５－ＨＩＶによってＴＣＲ５５を活性化させることができる。配列番号１７
ＭＬＦＳＳＬＬＣＶＦＶＡＦＳＹＳＧＳＳＶＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＥＧＧＡＱＫＬＶＦＧＱＧＴＲＬＴＩＮＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ
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【0223】
ＴＣＲ５５ベータ鎖。Ａｌａ５０ホットスポットをＤ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ及びＹに変異させて、Ｂ３５－ＨＩＶによってＴＣＲ５５を活性化させることができる。配列番号１８
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【0224】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月８日に出願された米国仮特許出願第６３／１５８，１３１号の利益及び優先権を主張し、その全開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年３月８日に出願された米国仮特許出願第６３／１５８，１３１号の利益及び優先権を主張し、その全開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0225】
テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
配列表は、２０２２年３月１日に作成され、５６，０００バイトのサイズを有するテキストファイル（ＳＴＡＮ－１８３２ＷＯ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ）で本明細書とともに提供される。テキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表は、２０２２年３月１日に作成され、５６，０００バイトのサイズを有するテキストファイル（ＳＴＡＮ－１８３２ＷＯ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ）で本明細書とともに提供される。テキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0226】
連邦政府による資金提供の記載
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与された契約５Ｒ０１ＡＩ１０３８６７下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与された契約５Ｒ０１ＡＩ１０３８６７下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図14E】
【図14F】
【図14G】
【図14H】
【図14I】
【図14J】
【図14K】
【図14L】
【図14M】
【図14N】
【図14O】
【図14P】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D-1】
【図15D-2】
【図15E-1】
【図15E-2】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図16F】
【図16G】
【図16H】
【図16I】
【図16J】
【図16K】
【図16L】
【図16M】
【図16N】
【図16O】
【図16P】
【図16Q】
【図16R】
【図16S】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図】
【配列表】
【国際調査報告】