特表 2024-512386 非活性化抗体バリアント

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-19

(54)【発明の名称】非活性化抗体バリアント

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240312BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20240312BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240312BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240312BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240312BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240312BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/00

C07K16/18

C07K16/30

C12N15/13

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C12P21/08

A61K39/395 T

A61P35/00

A61P31/00

A61P37/02

A61K39/395 W

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023555192

(86)(22)【出願日】2022-03-11

(85)【翻訳文提出日】2023-11-07

(86)【国際出願番号】 EP2022056416

(87)【国際公開番号】W WO2022189667

(87)【国際公開日】2022-09-15

(31)【優先権主張番号】21162341.8

(32)【優先日】2021-03-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】507316398

【氏名又は名称】ジェンマブ エー／エス

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】デ・クルーク，バート－ジャン

(72)【発明者】

【氏名】ヒバート，リチャード

(72)【発明者】

【氏名】スクールマン，ジャニーン

(72)【発明者】

【氏名】ラブライン，アラン・エフ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC23

4C085DD61

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

Ｆｃ領域等、例えばモノクローナル抗体、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含むタンパク質が本明細書で提供され、ここで、Ｆｃ領域は、治療目的のために、及びエフェクター機能は望ましくない場合に、Ｆｃ媒介性エフェクター機能を排除又は強く低下させるように修飾されており、同時に良好な発達性を可能にする。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むタンパク質であって、前記第１及び第２のポリペプチドがそれぞれ、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖の少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域をそれぞれ含み、前記第１及び第２のポリペプチドの少なくとも１つが修飾されており、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を含み、アミノ酸位置がＥｕナンバリングによって定義される通りである、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むタンパク質。

【請求項2】

前記第１及び第２のポリペプチドの少なくとも一方の位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸が、それぞれＦ、Ｅ及びＲで置換されている、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項3】

前記第１及び第２のポリペプチドの一方が、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸に対応するアミノ酸の前記置換を含み、他方が修飾されており、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＤ２６５のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を含み、好ましくは、前記置換がそれぞれＦ、Ｅ及びＡである、請求項１又は請求項２に記載のタンパク質。

【請求項4】

第１及び第２のポリペプチドの両方が、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６に対応するアミノ酸の前記置換を含む、請求項１又は請求項２に記載のタンパク質。

【請求項5】

前記第１及び第２のポリペプチドの各々が免疫グロブリンＣＨ１領域を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項6】

前記タンパク質が、第１及び第２の結合領域を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項7】

前記第１及び第２の結合領域がそれぞれ第１の免疫グロブリン重鎖可変領域及び第１の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、前記第２の結合領域が第２の免疫グロブリン重鎖可変領域及び第２の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項６に記載のタンパク質。

【請求項8】

前記免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域が、ヒト又はヒト化免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域である、請求項７に記載のタンパク質。

【請求項9】

前記第１及び第２のポリペプチドが免疫グロブリン重鎖であり、前記第１及び第２のポリペプチドがそれぞれ前記第１及び第２の免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項７又は８に記載のタンパク質。

【請求項10】

前記タンパク質が、第１の免疫グロブリン軽鎖定常領域及び第２の免疫グロブリン軽鎖定常領域を含む、請求項６～９のいずれかに記載のタンパク質。

【請求項11】

前記タンパク質が、第１及び第２の免疫グロブリン軽鎖を含み、前記免疫グロブリン軽鎖が、前記それぞれの第１及び第２の免疫グロブリン軽鎖可変領域並びに前記それぞれの第１及び第２の免疫グロブリン定常軽鎖領域を含む、請求項１０に記載のタンパク質。

【請求項12】

前記第１の免疫グロブリン軽鎖がジスルフィド架橋を介して前記第１の免疫グロブリン重鎖と接続され、前記第２の免疫グロブリン軽鎖がジスルフィド架橋を介して前記第２の免疫グロブリン重鎖と接続され、それによって前記第１の結合領域及び前記第２の結合領域をそれぞれ形成し、前記第１及び第２の免疫グロブリン重鎖がジスルフィド架橋を介して接続されている、請求項１１に記載のタンパク質。

【請求項13】

抗体である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項14】

単一特異性抗体である、請求項４～１２のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項15】

前記第１及び第２のポリペプチド鎖が、同一のアミノ酸配列を有する、請求項４～１４に記載のタンパク質。

【請求項16】

前記第１及び第２のポリペプチドが、更なるアミノ酸置換、好ましくはＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７及びＫ４０９、例えばＦ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒからなる群から選択されるアミノ酸の置換を含む、請求項１５に記載のタンパク質。

【請求項17】

前記単一特異性抗体が、細胞標的、サイトカイン、毒素、病原体、癌抗原、血漿タンパク質からなる群から選択される抗原に結合する、請求項１４～１６のいずれかに記載のタンパク質。

【請求項18】

二重特異性抗体である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項19】

前記第１及び第２のポリペプチドが、前記第１及び第２のポリペプチド由来のそれぞれのＣＨ２及びＣＨ３領域の配列が異なるように、前記それぞれのＣＨ２及びＣＨ３領域に更なる置換を含み、前記置換が、前記第１及び第２のポリペプチドを含む前記ポリペプチドを得ることを可能にする、請求項１８に記載の二重特異性抗体。

【請求項20】

前記第１のポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖のＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置のアミノ酸の少なくとも一つが置換されており、前記第２のポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖中のＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置のアミノ酸の少なくとも一つが置換されており、前記第１及び第２のポリペプチドの前記置換は同じ位置にはない、請求項１９に記載の二重特異性抗体。

【請求項21】

前記第１のポリペプチドにおいてＦ４０５に相当する位置のアミノ酸がＬであり、前記第２のポリペプチドにおいてＫ４０９に相当する位置のアミノ酸がＲであるか、又はその逆も同様である、請求項１９に記載の二重特異性抗体。

【請求項22】

前記二重特異性抗体が、前記第１及び第２のポリペプチドの両方において、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸のＦ、Ｅ及びＲによる置換、並びに前記第１のポリペプチドにおいてＬによる位置Ｆ４０５のアミノ酸の置換、及び前記第２のポリペプチドにおいてＲによるＫ４０９のアミノ酸の置換からなる修飾を有するか、又はその逆も同様である、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項23】

前記第１及び第２のポリペプチドが、請求項１～４及び１９～２２のいずれか一項に記載の置換からなる置換を有する、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項24】

前記第１及び第２のポリペプチドが、配列番号１によるアミノ酸配列を含み、前記第１及び第２のポリペプチドに含まれる前記アミノ酸配列が、請求項１～４及び１８～２２に定義されるアミノ酸置換を有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項１８～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項25】

配列番号１に従う前記アミノ酸配列が末端リジンを含まない、請求項２４に記載のタンパク質又は二重特異性抗体。

【請求項26】

前記結合領域の１つが癌抗原に結合する、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項27】

前記結合領域の１つがエフェクター細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ又は好中球に結合する、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項28】

前記結合領域の一方がエフェクター細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ又は好中球に結合し、他方の結合領域が癌抗原に結合する、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項29】

前記第１又は第２のポリペプチドが、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６に対応するアミノ酸の前記置換を含み、好ましくは、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６の前記置換がそれぞれＦ、Ｅ及びＲである、請求項４～１７及び２４～２５のいずれか一項に記載の前記第１又は第２のポリペプチドをコードする核酸。

【請求項30】

前記第１又は第２のポリペプチドが免疫グロブリン重鎖である、請求項２９に記載の核酸。

【請求項31】

請求項２９又は３０に記載の核酸を含む宿主細胞。

【請求項32】

請求項１～１７のいずれかに記載のタンパク質又は請求項１８～２８のいずれかに記載の二重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項33】

疾患の治療における使用のための、請求項１～１７のいずれかに記載のタンパク質、又は請求項１８～２８のいずれかに記載の二重特異性抗体、又は請求項３２に記載の医薬組成物。

【請求項34】

請求項３３に記載の、癌、感染症、又は自己免疫疾患の治療を含む使用のためのタンパク質、二重特異性抗体、又は医薬組成物。

【請求項35】

請求項１～１７のいずれかに記載のタンパク質、又は請求項１８～２８のいずれかに記載の二重特異性抗体、又は請求項３２に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、治療方法。

【請求項36】

前記対象が、癌、感染症、又は自己免疫疾患等の疾患に罹患している、請求項３５に記載の治療方法。

【請求項37】

二重特異性抗体を調製する方法であって、
ｆ）
ａ．ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖のそれぞれ少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖であって、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６におけるアミノ酸の、それぞれＦ、Ｅ及びＲによる置換を含む、免疫グロブリン重鎖と、
ｂ．免疫グロブリン軽鎖と、
を含む、第１の抗体を提供することと、
ｇ）
ａ．ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖のそれぞれ少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖であって、
－位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５、好ましくはそれぞれＦ、Ｅ、及びＡである置換、
又は、
－位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸の、それぞれＦ、Ｅ及びＲによる置換を含む、免疫グロブリン重鎖と、
ｂ．免疫グロブリン軽鎖と、
を含む、第２の抗体を提供することと、
ｈ）ここで、前記それぞれの第１及び第２の抗体の前記第１及び第２のＣＨ３領域の配列は異なり、前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が前記第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用のそれぞれよりも強くなるようなものであり、
ｉ）前記ヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合異性化を受けるのを可能にするのに十分な還元条件下で、前記第１の抗体を前記第２の抗体と一緒にインキュベートすることと、
ｊ）前記第１の抗体の前記第１の免疫グロブリン重鎖及び前記第１の免疫グロブリン軽鎖と、前記第２の抗体の前記第２の免疫グロブリン重鎖及び前記第２の免疫グロブリン軽鎖とを含む前記二重特異性抗体を得ることと、
を含む、二重特異性抗体を調製する方法。

【請求項38】

工程ｃ）において、前記配列の差異が、請求項１９～２５のいずれか一項による、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

請求項１８～２８のいずれかに定義される二重特異性抗体を調製するための、請求項３７又は請求項３８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｆｃ領域等、例えばモノクローナル抗体、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含むポリペプチドに関し、ここで、Ｆｃ領域は、治療目的のために、及びエフェクター機能は望ましくない場合に、Ｆｃ媒介性エフェクター機能を排除又は強く低下させるように修飾されており、同時に、すなわち良好な発達性を可能にする。

【背景技術】

【0002】

抗体は、特に癌の治療及び免疫調節のための治療分子として成功することが証明されている。腫瘍標的特異的抗体は、典型的には補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）等のＦｃ媒介性エフェクター機能を介して腫瘍細胞傷害性を達成することができる。免疫細胞標的化抗体は、Ｔ細胞及びマクロファージ等の免疫系の細胞を増強することができ、腫瘍細胞の細胞傷害性を促進することができる。免疫系の成分を標的とする抗体を使用して、免疫系の機能を調節することができる。

【0003】

特定のシナリオでは、抗体療法による免疫系又はその成分の活性化は、（ｉ）サイトカインを全身的に中和する、（ｉｉ）特異的免疫細胞受容体を遮断する、又は（ｉｉｉ）エフェクター細胞を疾患組織を標的化するようにリダイレクトするための二重特異性抗体を使用する場合等に適用される場合、望ましくない可能性がある（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２０１９；５１（１１）：１－９）。例えば、免疫細胞標的化抗体がそのＦｃ領域を介して補体成分Ｃ１ｑと係合すると、古典的補体系の活性化が開始され、例えば、望ましくない標的免疫細胞のＣＤＣがもたらされ得る。また、抗体Ｆｃ領域はまた、エフェクター細胞の望ましくない枯渇をもたらすか、又は高レベルのサイトカイン分泌を介して免疫関連毒性を誘導する、ある範囲の免疫細胞上に発現されるＦｃ受容体に結合し得る。

【0004】

望ましくないＦｃ媒介性エフェクター機能を回避するために、抗体は、Ｆｃ媒介性エフェクター機構の一部又は全部を抑制又は排除するＦｃ部分に突然変異（非活性化突然変異とも呼ばれる）を有するように操作されている。

【0005】

Ｆｃ媒介性エフェクター機能を排除するためにＩｇＧ１アイソタイプ抗体の定常重鎖領域にアミノ酸置換及びその組合せを導入した広範囲の異なる非活性化抗体フォーマットが開発されている（例えば、Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１９ Ｄｅｃ；８（４）：５５；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０２０ Ｎｏｖ １７；９（４）：６４；２９（１０）：４５７－６６；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２００１ Ｍａｒ ２；２７６（９）：６５９１－６０４を参照されたい）。そのような置換の例としては、Ｎ２９７Ｇ非活性化突然変異の導入（Ｔａｏ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８９；１４３（８）：２５９５－６０１）、Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－ｄｅｌＧ２３６－Ｓ２６７Ｋ非活性化突然変異の導入（Ｍｏｏｒｅ ａｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１９；１５４：３８－５０）、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ非活性化突然変異の導入（Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２０１６；２９（１０）：４５７－６６）、又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化突然変異（本明細書ではＦＥＡ又はＦＥＡフォーマットとも呼ばれる、Ｅｎｇｅｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ２０２０；５２：１０２６２５；米国特許第１０５９０２０６号明細書）が挙げられる。Ｆｃ媒介性エフェクター機能を更に排除するための抗体の定常重鎖領域におけるアミノ酸置換と組み合わせて、エフェクター機能が低減したＩｇＧサブクラスの１つであるＩｇＧ４を使用して、他の非活性化フォーマットを開発した（例えば、国際公開第２０１５／１４３０７９号に記載されているＥ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ非活性化突然変異の導入、又はＶａｆａ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１４；６５：１１４－１２６によって記載されているＦ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ非活性化突然変異の導入）。

【0006】

しかしながら、そのような抗体工学の結果として、治療薬としての抗体の潜在的な開発を制限し得る開発可能性及び製造可能性の問題が生じ得る。例えば、ウイルス不活性化は、潜在的な抗体治療薬の開発における重要な工程を構成する。標準的なウイルス不活化プロトコルは、低いｐＨ保持を必要とする。しかしながら、抗体等の操作されたタンパク質は、低ｐＨ条件に異なって応答し、潜在的にタンパク質不安定性をもたらし得る。例えば、抗体の開発及び製造可能性において評価される必要がある他の条件は、凍結解凍サイクルの繰り返し及び貯蔵温度の変動である。したがって、そのような製品の製造及び流通の容易さ並びに臨床使用を可能にするので、そのような条件等に曝露された場合にタンパク質安定性を保持することを可能にする抗体治療薬の操作を提供することが望ましい。

【0007】

したがって、Ｆｃ媒介性エフェクター機能を欠き、治療的使用のために容易に開発及び製造することができる抗体に適した更なる非活性化フォーマットを提供する必要がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】米国特許第１０５９０２０６号明細書

【特許文献2】国際公開第２０１５／１４３０７９号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２０１９；５１（１１）：１－９

【非特許文献2】Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１９ Ｄｅｃ；８（４）：５５

【非特許文献3】Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０２０ Ｎｏｖ １７；９（４）：６４；２９（１０）：４５７－６６

【非特許文献4】Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２００１ Ｍａｒ ２；２７６（９）：６５９１－６０４

【非特許文献5】Ｔａｏ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８９；１４３（８）：２５９５－６０１

【非特許文献6】Ｍｏｏｒｅ ａｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１９；１５４：３８－５０

【非特許文献7】Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２０１６；２９（１０）：４５７－６６

【非特許文献8】Ｅｎｇｅｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ２０２０；５２：１０２６２５

【非特許文献9】Ｖａｆａ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１４；６５：１１４－１２６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異（本明細書ではＦＥＡ又はＦＥＡフォーマットとも呼ばれる）は、優れた安全性プロファイル及びＦｃ媒介性エフェクター機能を強く抑制する能力を有することが示されている。それにもかかわらず、ＦＥＡ変異を有する補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の強力な誘導物質であるＩｇＧ１抗体は、いくらかの残留ＣＤＣを示し得ることが観察された（とりわけ、実施例３及び５を参照）。更に、ＦＥＡフォーマットを有する組換え発現抗体は、それらのＮ－グリカンの更なるプロセシングの結果として、野生型ＩｇＧ１Ｆｃ領域と比較して増加したグリコシル化不均一性を示し得ることが観察され（データは示さず、実施例１４も参照されたい）、低ｐＨ条件によって誘導される凝集に対してより感受性であることも示された（例えば、実施例２０を参照のこと）。

【0011】

したがって、本発明者らは、残留ＣＤＣ活性を回避することができ、野生型様グリコシル化プロファイルを提供することができ、及び／又は低ｐＨ条件に対してより耐性であり得る改善された非活性化フォーマットを提供することを試みた。驚くべきことに、本発明者らがＩｇＧ１抗体において突然変異Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＧ２３６Ｒ（本明細書ではＦＥＲ又はＦＥＲフォーマットとも呼ばれる）を組み合わせたとき、これは潜在的な残留ＣＤＣ活性を回避することができ、野生型様グリコシル化を提供し、低ｐＨ条件に対する改善された耐性を有する改善された不活性フォーマットをもたらした。それにより、本発明者らはここで、臨床開発及び臨床使用に十分に適した非常に有利な更なる非活性化抗体フォーマットを提供する。実施例の節に示されるように、この更なる非活性化フォーマットは、例えば融合タンパク質等の抗体以外の状況でも有用であり得るが、クラス最高の非活性化フォーマットであると見なすことができる。

【課題を解決するための手段】

【0012】

したがって、本発明は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域を有するポリペプチドのための新しい不活性フォーマットを提供し、当該領域は、Ｅｕナンバリングに従って、２３４、２３５及び２３６の位置に置換を有し、好ましくはそれぞれ置換Ｆ、Ｅ及びＲを有する。この不活性フォーマットは、単一特異性及び二重特異性抗体に特に有用である。本発明によるそのような置換を有するそのようなポリペプチド、例えば単一特異性又は二重特異性抗体は、非活性化ＩｇＧ１Ｆｃ領域を有すると称され得る。

【0013】

二重特異性抗体の場合、この不活性フォーマットはまた、不活性フォーマット置換に関してヘテロ二量体フォーマットで組み合わされてもよく、例えば、二重特異性抗体は、本発明による不活性フォーマット置換を有する１つの鎖から構成されてもよく、他方の鎖は、異なる不活性フォーマット置換、例えばＦＥＡを含んでもよい。したがって、本発明による不活性フォーマットは、例えば、臨床用途のための開発を既に受けている既存の候補抗体と、必要とされる全てのアッセイを再設計及び再実行する必要なく組み合わせるのに十分に適しており、それにより、制御されたＦａｂアーム交換等の技術を利用して、それと共に二重特異性抗体を迅速に生成することが可能になる。

【0014】

したがって、一実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むタンパク質であって、当該第１及び第２のポリペプチドがそれぞれ、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖の少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域をそれぞれ含み、当該第１及び第２のポリペプチドの少なくとも１つが修飾されており、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を含み、アミノ酸位置がＥｕナンバリングによって定義される通りである、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むタンパク質が提供される。当該のように、好ましくは、当該第１及び第２のポリペプチドの少なくとも一方のＬ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６の位置のアミノ酸は、それぞれＦ、Ｅ及びＲで置換されている。

【0015】

別の実施形態では、本発明による当該タンパク質が提供され、第１及び第２のポリペプチドの一方は、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸に対応するアミノ酸の当該置換を含み、他方が修飾されており、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＤ２６５のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を含み、好ましくは、当該置換はそれぞれＦ、Ｅ及びＡである。

【0016】

別の更なる実施形態では、本発明による当該タンパク質が提供され、第１及び第２のポリペプチドの両方は、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６に対応するアミノ酸の当該置換を含む。

【0017】

本発明によるタンパク質は、非活性化であるＦｃ領域を有することから利益を得ることができる任意のタンパク質であり得ることが理解される。これは、例えば機能的ドメインがＦｃ領域と融合され、それにより、例えば改善された血漿半減期を有する機能的ドメインを提供する融合タンパク質を含み得る。

【0018】

当該のように、本発明によるタンパク質は、好ましくは、第１及び第２の結合領域を含む。第１及び第２の結合領域を有する本発明による例示的かつ好ましいタンパク質は、抗体である。

【0019】

したがって、別の更なる実施形態では、本発明によるタンパク質は抗体である。別の更なる実施形態では、タンパク質の第１及び第２のポリペプチドは、本発明によるタンパク質又は抗体において同一である。別の実施形態では、そのような抗体は、これらが典型的には同じ結合ドメインを有し得るので、単一特異性抗体である。そのような単一特異性抗体は、その後、本発明に従って二重特異性抗体を作製するために使用され得る。

【0020】

したがって、更に別の更なる実施形態では、本発明によるタンパク質は二重特異性抗体である。好ましくは、本発明による二重特異性抗体が提供され、当該第１及び第２のポリペプチドは、当該第１及び第２のポリペプチド由来のそれぞれのＣＨ２及びＣＨ３領域の配列が異なるように、当該それぞれのＣＨ２及びＣＨ３領域に更なる置換を含み、当該置換は、当該第１及び第２のポリペプチドを含む当該ポリペプチドを得ることを可能にする。そのような置換の好ましい例としては、位置Ｆ４０５のアミノ酸のＬによる置換及び位置Ｋ４０９のアミノ酸のＲによる置換を含む第１及び第２のポリペプチドの一方を有することが挙げられる。あるいは、ヘテロ二量体を提供することを可能にする他の置換又は方法（とりわけ、二重特異性抗体を提供するために異なる第１及び第２のポリペプチドを組み合わせること）が本発明に従って企図され得る。

【0021】

したがって、一実施形態では、本発明による二重特異性抗体を調製するための方法が提供され、当該方法は、
ａ）ａ．ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖のそれぞれ少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖であって、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６におけるアミノ酸の、それぞれＦ、Ｅ及びＲによる置換を含む、免疫グロブリン重鎖と、ｂ．免疫グロブリン軽鎖と、を含む、第１の抗体を提供することと、
ｂ）ａ．ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖のそれぞれ少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖であって、－位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５、好ましくは当該置換はそれぞれＦ、Ｅ、及びＡであり、又は、－位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸の、それぞれＦ、Ｅ及びＲによる置換を含む、免疫グロブリン重鎖と、ｂ．免疫グロブリン軽鎖と、を含む、第２の抗体を提供することと、
ｃ）ここで、当該それぞれの第１及び第２の抗体の当該第１及び第２のＣＨ３領域の配列は異なり、当該第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が当該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用のそれぞれよりも強くなるようなものであり、
ｄ）当該ヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合異性化を受けるのを可能にするのに十分な還元条件下で、当該第１の抗体を当該第２の抗体と一緒にインキュベートすることと、
ｅ）当該第１の抗体の当該第１の免疫グロブリン重鎖及び当該第１の免疫グロブリン軽鎖と、当該第２の抗体の当該第２の免疫グロブリン重鎖及び当該第２の免疫グロブリン軽鎖とを含む当該二重特異性抗体を得ることと、
を含む。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】抗ヒトＣＤ２０抗体バリアントによる標的結合を示す図である。重鎖に非活性化変異を有するＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントによる、Ｒａｊｉ細胞上に存在するＣＤ２０への結合が示されている。結合は、抗体濃度対ＭＦＩ－ＰＥ中央値（データセットをＡ及びＢに分割）として示される。データは、４回の独立した反復から得られた平均値±ＳＥＭである。

【0023】

試験したバリアントは、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＡＡＧ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＲＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１ｌｈ２－Ｓ２６７Ｋ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＡＥＡＳＳ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ｂ１２、ＩｇＧ４ｌｈ２－Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４－ＰＡＡ、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐであり、ここで、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＡＡＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ、ＲＲ：Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ、ＩｇＧ１ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、ＡＥＡＳＳ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、及びＰＡＡ：Ｓ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａである。

【図2】定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０抗体バリアントによるＲａｊｉ細胞のＣＤＣを示す図である。定常重鎖領域に非活性化変異を有するＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントによって誘導されたＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞のＣＤＣを、補体の供給源としてＮＨＳを使用して評価した。細胞溶解を、フローサイトメトリーによるＰＩ陽性細胞のパーセンテージの分析によって決定する。ＣＤＣは、非結合コントロール抗体ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型ＩｇＧ１（１００％）に対して正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）として示されている。データは、３回の独立した反復から得られた平均値±ＳＥＭである。試験したバリアントは、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＡＡＧ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＲＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１ｌｈ２－Ｓ２６７Ｋ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＡＥＡＳＳ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ｂ１２、ＩｇＧ４ｌｈ２－Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４－ＰＡＡ、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐであり、ここで、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＡＡＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ、ＲＲ：Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ、ＩｇＧ１ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、ＡＥＡＳＳ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、及びＰＡＡ：Ｓ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａである。

【図3】定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントによるＣ１ｑ結合を示す図である。結合は、抗体濃度対ＭＦＩ－ＦＩＴＣ中央値として示される。データは、１回の実験の３回の測定から得られた平均値（±ＳＤ）である。試験したバリアントは、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－ｂ１２であり、ここで、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ及びＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒである。

【図4】定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ抗体バリアントによって誘導されたＲａｊｉ細胞のＣＤＣを示す図である。定常重鎖領域に非活性化変異を有するＩｇＧ１－ＨＬＡ－ＤＲ－４（Ａ）及びＩｇＧ１－ＨＬＡ－ＤＲ－１Ｄ０９Ｃ３（Ｂ）抗体バリアント、並びにＨＬＡ－ＤＲ標的化Ｆ（ａｂ’）２断片によって誘導されたＲａｊｉ細胞のＣＤＣを、ＮＨＳを補体の供給源として使用するインビトロＣＤＣアッセイで評価した。細胞溶解を、フローサイトメトリーによるＰＩ陽性細胞のパーセンテージの分析によって決定する。ＣＤＣは、Ｋ４０９Ｒ変異を有するＩｇＧ１抗体に対して正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）として示されている（ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒ、１００％）。データは、５つ（野生型及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒバリアント）又は２つ（Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒバリアント、又はＦ（ａｂ’）２断片）の独立したレプリケートからの平均値±ＳＥＭである。試験したバリアントは、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒ、Ｆ（ａｂ’）２であり、式中、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ及びＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒである。

【図5】ＥＬＩＳＡプレートに対する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントの捕捉を示す図である。抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２断片による重鎖領域の非活性化変異を有するＩｇＧ１及びＩｇＧ４バリアントのＥＬＩＳＡプレートへの固定。結合は、野生型ＩｇＧ１（１００％）に対して正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）として示される。データは、３回の独立した反復から得られた平均値（±ＳＥＭ）である。検出は、抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃγ－ＨＲＰ及びＡＢＴＳを用いて行った。試験したバリアントは、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＡＡＧ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＲＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１ｌｈ２－Ｓ２６７Ｋ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＡＥＡＳＳ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ４ｌｈ２－Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４－ＰＡＡ、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐであり、ここで、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＡＡＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ、ＲＲ：Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ、ＩｇＧ１ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、ＡＥＡＳＳ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、及びＰＡＡ：Ｓ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａである。

【図6】ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ（アロタイプ１３１Ｈ及び１３１Ｒ）、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプ１５８Ｆ及び１５８Ｖ）に対する、定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントの結合を示す図である。ＥＬＩＳＡアッセイで試験したときの、ＦｃγＲＩａ（Ａ）、ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ（Ｂ）、ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｒ（Ｃ）、ＦｃγＲＩＩｂ（Ｄ）、ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｆ（Ｅ）及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖ（Ｆ）の単量体及び二量体のＨｉｓタグ付きビオチン化細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への、非活性化変異を有する固定化ＩｇＧ１及びＩｇＧ４バリアントの結合。結合は、野生型ＩｇＧ１（１００％）に対して正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）として示される。データは、３回の独立した反復から得られた平均値（±ＳＥＭ）である。ストレプトアビジン－ｐｏｌｙＨＲＰ及びＡＢＴＳを用いて検出を行った。試験したバリアントは、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＡＡＧ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＲＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１ｌｈ２－Ｓ２６７Ｋ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＡＥＡＳＳ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ４ｌｈ２－Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４－ＰＡＡ、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐであり、ここで、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＡＡＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ、ＲＲ：Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ、ＩｇＧ１ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、ＡＥＡＳＳ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、及びＰＡＡ：Ｓ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａである。

【図7】標的発現Ｒａｊｉ細胞及びＦｃｙＲ発現レポーター細胞を使用して測定される、重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントによるＦｃγＲ活性化を示す図である。（Ａ～Ｆ）発光レベル（ＲＬＵ）によって測定される、（Ａ）ＦｃγＲＩａ、（Ｂ）ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、（Ｃ）ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｒ、（Ｄ）ＦｃγＲＩＩｂ、（Ｅ）ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｆ、又は（Ｆ）ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖのいずれかを安定に発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞株の、ＣＤ２０を発現し、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントの異なる濃度を発現するＲａｊｉ細胞と共培養したときの活性化。活性化は、非結合対照ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型ＩｇＧ１（１００％）に対して標準化された用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）として実験複製物１つ当たり示される。３回の独立した実験反復からのデータ平均値（±ＳＥＭ）。試験したバリアントは、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＡＡＧ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＲＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１ｌｈ２－Ｓ２６７Ｋ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＡＥＡＳＳ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ｂ１２、ＩｇＧ４ｌｈ２－Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４－ＰＡＡ、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐであり、ここで、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＡＡＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ、ＲＲ：Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ、ＩｇＧ１ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、ＡＥＡＳＳ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、及びＰＡＡ：Ｓ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａである。

【図8】ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ＥｕＴＤＡ ＴＲＦ細胞毒性アッセイを用いて測定した、重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントによって誘導されたＡＤＣＣを示す図である。（Ａ～Ｂ）ＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣを、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）並びに抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントとの共インキュベーション時の、ＢＡＴＤＡ標識ＣＤ２０発現Ｒａｊｉ細胞からのＥｕＴＤＡ試薬の放出レベルによって測定した。いくつかのバリアントについて、ＡＤＣＣは、実験的複製ごとに非結合対照ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型ＩｇＧ１（１００％）に対して正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）として示される（Ａ）。データは、４つ（野生型及びＫ４０９Ｒバリアント）又は２つ（Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒバリアント）の独立した反復から得られた平均値（±ＳＥＭ）である。いくつかのバリアントについて、ＡＤＣＣは、実験複製物当たりの非結合対照ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型ＩｇＧ１（１００％）と比較した１０μｇ／ｍｌの抗体濃度での（Ｂ）溶解パーセンテージとして示されている。データは、２つの独立した実験からの６人のドナーから得られた平均値（±ＳＥＭ）である。試験したバリアントは、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＡＡＧ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＲＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１ｌｈ２－Ｓ２６７Ｋ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＡＥＡＳＳ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ｂ１２、ＩｇＧ４ｌｈ２－Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４－ＰＡＡ、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐであり、ここで、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＡＡＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ、ＲＲ：Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ、ＩｇＧ１ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、ＡＥＡＳＳ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、及びＰＡＡ：Ｓ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａである。

【図9】定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ３抗体ＩｇＧ１又はＩｇＧ４－ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４のバリアントによるＴ細胞活性化を示す図である。（Ａ～Ｂ）示された変異を有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントによって誘導されたＰＢＭＣ共培養物中のＴ細胞上の初期Ｔ細胞活性化の尺度としてのＣＤ６９発現の上方制御（フローサイトメトリー分析によって測定）。ＣＤ６９のアップレギュレーションは、（Ａ）ＣＤ６９^＋Ｔ細胞のパーセンテージ（ＣＤ２８^＋）に対する用量応答として、又は（Ｂ）ドナー及び実験複製物当たりの野生型抗体バリアントＩｇＧ１－Ｆ４０５Ｌ（１００％）に対して正規化された用量応答曲線下面積（ＡＵＣ）として示される。データは、３回の独立した実験レプリケート（実験レプリケート当たり２人の独立したドナー）からの平均値（±ＳＥＭ）である。試験したバリアントは、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１－ＡＡＧ－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１－ＲＲ－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１ｌｈ２－Ｓ２６７Ｋ－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ｇ－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１－ＡＥＡＳＳ－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ４ｌｈ２－Ｓ２２８Ｐ－Ｆ４０５Ｌ－Ｒ４０９Ｋ、ＩｇＧ４－ＰＡＡ－Ｆ４０５Ｌ－Ｒ４０９Ｋ、ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐであり、ここで、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＡＡＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ、ＲＲ：Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ、ＩｇＧ１ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、ＡＥＡＳＳ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、及びＰＡＡ：Ｓ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａである。

【図10】非活性化二重特異性抗体バリアントによるインビトロＴ細胞媒介性細胞傷害性を示す図である。（Ａ～Ｃ）ＰＢＭＣ共培養物中のＨＥＲ２陽性ＳＫ－ＯＶ－３細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性を、二重特異性抗体バリアント、ＣＤ３ｘＨＥＲ２（Ａ）、ＣＤ３ｘｂ１２（Ｂ；標的細胞に結合しない）又はｂ１２ｘＨＥＲ２（Ｃ；Ｔ細胞への結合なし）を使用して評価し、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅを使用して定常重鎖領域に非活性化突然変異を保有した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して５９０ｎｍでの吸光度を測定し、スタウロスポリン処理細胞が１００％の細胞傷害性を表し、培地対照（抗体なし、ＰＢＭＣなし）が０％の細胞傷害性を表すドナー及び実験複製物ごとに生細胞の割合を計算した。データは、用量応答曲線対生存ＳＫ－ＯＶ－３細胞％として提示される。データは、３回の独立した実験レプリケート（実験レプリケート当たり２人の独立したドナー）からの平均値（±ＳＥＭ）である。試験した二重特異性抗体バリアントは、ＢｉｓＧ１Ｆ４０５ＬｘＫ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＡ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＡＡＧ－Ｆ４０５ＬｘＡＡＧ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＲＲ－Ｆ４０５ＬｘＲＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ｌｈ２Ｓ２６７Ｋ－Ｆ４０５ＬｘＳ２６７Ｋ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ４ｌｈ２Ｓ２２８Ｐ－Ｆ４０５Ｌ－Ｒ４０９ＫｘＳ２２８Ｐ、ＢｉｓＧ１Ｎ２９７Ｇ－Ｆ４０５ＬｘＮ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＡＥＡＳＳ－Ｆ４０５ＬｘＡＥＡＳＳ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ４ＰＡＡ－Ｆ４０５Ｌ－Ｒ４０９ＫｘＰＡＡであり、ここで、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＡＡＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ、ＲＲ：Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ、Ｇ１ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、ＡＥＡＳＳ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ、Ｇ４ｌｈ２：Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ、及びＰＡＡ：Ｓ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａである。

【図11】抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１又は抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１（ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４）抗体バリアントを注射したマウスから採取した血液試料で測定した総ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）濃度を示す図である。（Ａ）注射後の異なる時点で野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－ＣＤ２０－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＣＤ２０－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ及びＩｇＧ１－ＣＤ２０－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒを注射したマウスから採取した血液試料中の総ｈＩｇＧ濃度。データは、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ（２匹のマウス）を除いて、１群当たり３匹のマウスから得られた平均値（±ＳＥＭ）である。（Ｂ）注射後の異なる時点で野生型抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－ＣＤ３－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１－ＣＤ３－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌを注射したマウスから採取した血液試料中の総ｈＩｇＧ濃度。データは、１群当たり３匹のマウスから得られた平均値（±ＳＥＭ）である。（Ｃ）抗体投与後２１日目までのクリアランスを、Ｄ、注射用量及びＡＵＣ、濃度－時間曲線の曲線下面積を用いて式Ｄ＊１０００／ＡＵＣに従って決定した。全ての図において、点線は、ＳＣＩＤマウスにおける野生型ＩｇＧ１抗体についての予測されたＩｇＧ１濃度を時間的に表している。示されるデータは、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ（２匹のマウス）を除いて、１群当たり３匹のマウスから得られる。試験したバリアントは、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１であり、ここで、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ及びＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ．である。

【図12】実施例１４で試験したＩｇＧ１抗体バリアントで検出された異なるグリカン種の概略図を示す図である。

【図13】ｂｓＡｂバリアントの生成のための制御されたＦａｂアーム交換（ｃＦＡＥ）の効率を示す図である。二重特異性抗体（ＢｉｓＧ１として示される）は、１つの単一特異性抗体（ＩｇＧ１－Ａとして示される）がＦ４０５Ｌ変異を有し、別の単一特異性抗体（ＩｇＧ１－Ｂとして示される）がＫ４０９Ｒ変異を有するｃＦＡＥによって作製される。ｂｓＡｂバリアントの作製のためのｃＦＡＥの効率を、（Ａ；２０データポイント）両方の単一特異性抗体がＦ４０５Ｌ及びＫ４０９Ｒ変異に加えてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）非活性化変異を保有し、（Ｂ；１６データポイント）第１の単一特異性抗体がＦ４０５Ｌ変異に加えてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）変異を保有し、第２の単一特異性抗体がＫ４０９Ｒ変異に加えてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（ＦＥＡ）変異を保有し、（Ｃ；１２データポイント）第１の単一特異性抗体がＦ４０５Ｌ変異に加えてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（ＦＥＡ）変異を保有し、第２の単一特異性抗体がＫ４０９Ｒ変異に加えてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）変異を保有する、バリアントについて評価した。ｂｓＡｂ又は残留単一特異性抗体バリアント（ＩｇＧ１－Ａ又はＩｇＧ１－Ｂ）の割合（％）を示し、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計を使用して決定した。ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ及びＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ。

【図14】Ｆ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒのいずれかに加えて、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（ＦＥＡ）のいずれかの非活性化変異を定常重鎖領域に有する抗体バリアントの産生レベルを示す図である。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で抗体バリアントを産生した。生産力価は、散乱ドットプロットでｍｇ／Ｌとして表され、平均値（±ＳＥＭ）が示されている。各ドットは、示された変異を有する特定の抗体クローンの産生収量データ（その特定のクローンについてより多くの産生データが利用可能であった場合の平均値）を表す。比較を可能にするために、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ抗体バリアント（ＦＥＡ－Ｆ４０５Ｌ；白い丸）及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ抗体バリアント（ＦＥＲ－Ｆ４０５Ｌ；黒い丸）についての適合クローンの産生力価を示す。同様に、Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ抗体バリアント（ＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、白い四角）及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ抗体バリアント（ＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、黒い四角）についての適合クローンの産生力価を示す。

【図15】単一特異性抗体（Ａ）及び二重特異性抗体（Ｂ）の例示的な概略図を示す図である。（Ａ）黒色で示される重鎖；白色で示される軽鎖。個々の抗体の重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインは、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３及びＶ_Ｈ（定常重鎖ドメイン（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨ））、Ｃ_Ｌ及びＶ_Ｌ（ＣＬ、ＶＬ、定常及び可変軽鎖ドメイン）として示されている。（Ｂ）Ｆａｂアームの２つの異なる特異性を有する２つの半分子（それぞれ黒色及び白色の重鎖及び軽鎖として示される１つの半分子；重鎖及び軽鎖の縞模様で示された１つの半分子）からなる二重特異性抗体、例えば、制御されたＦａｂアーム交換によって生成される二重特異性抗体。ヒンジ領域、Ｆａｂアーム及びＦｃドメインは、示される通りである。

【図16】重鎖定常領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントによるＣ１ｑ結合を示す図である。結合は、非結合コントロール抗体ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型ＩｇＧ１－ＣＤ２０（１００％）に対して正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）として示されている。データは、３つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。試験した抗体バリアントは、ＩｇＧ１－ＣＤ２０野生型（ＩｇＧ１）及びそのバリアント、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＡ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＡ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒであり、ここで、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ及びＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａである。

【図17】重鎖定常領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントによるＲａｊｉ細胞のＣＤＣを示す図である。重鎖定常領域に非活性化変異を有するＩｇＧ１－ＣＤ２０抗体バリアントによって誘導されたＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞のＣＤＣを、補体の供給源としてＮＨＳを使用して評価した。細胞溶解を、フローサイトメトリーによるＰＩ陽性細胞のパーセンテージの分析によって決定する。ＣＤＣは、非結合コントロール抗体ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型ＩｇＧ１－ＣＤ２０（１００％）に対して正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）として示されている。データは、３回の独立した反復から得られた平均値±ＳＥＭである。試験した抗体バリアントは、ＩｇＧ１－ＣＤ２０野生型（ＩｇＧ１）及びそのバリアント、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＡ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＡ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒであり、ここで、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ及びＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａである。

【図18】非活性化二重特異性抗体バリアントによるインビトロＴ細胞媒介性細胞傷害性を示す図である。（Ａ～Ｂ）アラマーブルーを使用して、Ｆｃ領域に非対称非活性化変異を有する二重特異性抗体バリアントＣＤ３ｘＨＥＲ２（Ａ）又はＣＤ３ｘｂ１２（Ｂ；標的細胞に結合しない）を使用して、ＰＢＭＣ共培養物中のＨＥＲ２陽性ＳＫ－ＯＶ－３細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性を評価した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して、５９０ｎｍでの吸光度を測定し、スタウロスポリン処理ＳＫ－ＯＶ－３細胞が１００％の細胞傷害性を表し、培地対照（ＳＫ－ＯＶ－３細胞、抗体なし、ＰＢＭＣなし）が０％の細胞傷害性を表すドナー及び実験複製物ごとに生細胞の割合を計算した。データは、生存ＳＫ－ＯＶ－３細胞のパーセンテージに対する用量応答曲線として提示される。データは、２つの独立した実験からの４人のドナーから得られた平均値±ＳＥＭである（独立した実験当たり２人のドナー）。試験したＣＤ３ｘＨＥＲ２及びＣＤ３ｘｂ１２二重特異性抗体バリアントは、ＢｉｓＧ１Ｆ４０５ＬｘＫ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＫ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＡＡＧ－Ｋ４０９Ｒ、及びＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＮ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒであり、式中、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、及びＡＡＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇである。

【図19】非活性化二重特異性ＣＤ３ｘＨＥＲ２抗体バリアントによるＴ細胞活性化を示す図である。ヒトＰＢＭＣ共培養物中のＴ細胞上の初期Ｔ細胞活性化の尺度としてのＣＤ６９発現（フローサイトメトリー分析によって測定）の上方制御を、野生型のようなＣＤ３ｘＨｅｒ２二重特異性抗体バリアント及びＦｃ領域に示された対称又は非対称の非活性化変異を有するそのバリアントを使用して評価した。ＣＤ６９アップレギュレーションは、ドナー及び実験複製物当たりの非結合陰性対照ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型様ＩｇＧ１二重特異性抗体バリアント（ＢｉｓＧ１Ｆ４０５ＬｘＫ４０９Ｒ、１００％）について測定されたＡＵＣ値に対して正規化された用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）として示される。データは、２つの独立した実験（独立した実験当たり２人のドナー）において４人のドナーから得られた平均値（±ＳＥＭ）である。試験したＣＤ３ｘＨＥＲ２二重特異性抗体バリアントは、ＢｉｓＧ１Ｆ４０５ＬｘＫ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＫ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＡＡＧ－Ｋ４０９Ｒ、及びＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＮ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒであり、式中、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、及びＡＡＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇである。

【図20】ＮＨＳを補体の供給源として使用するインビトロＣＤＣアッセイで評価した、重鎖定常領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０抗体バリアントによって誘導されたＲａｊｉ細胞のＣＤＣを示す図である。ＣＤＣを誘導する能力を、重鎖定常領域にＣ末端リジンを含有するか又は欠くように産生されたバリアント間で比較した。細胞溶解を、フローサイトメトリーによるＰＩ陽性細胞のパーセンテージの分析によって決定する。ＣＤＣは、野生型ＩｇＧ１－ＣＤ２０抗体（ＩｇＧ１；１００％）及び抗体対照試料なし（０％）に対して正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）として示されている。データは、３つの独立した実験からの平均値±ＳＥＭである。試験したバリアントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－ｄｅｌＫ、ＩｇＧ１－ＦＥＡ、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－ｄｅｌＫ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－ｄｅｌＫであり、式中、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ｄｅｌＫ：ＨＣ Ｃ末端リジンの組換え欠失である。

【図21】標的発現Ｒａｊｉ細胞及びＦｃγＲ発現レポーター細胞を使用して測定した場合の、重鎖定常領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０抗体バリアントによるヒトＦｃγＲ活性化を示す図である。ＦｃγＲ活性化を誘導する能力を、重鎖定常領域にＣ末端リジンを含有するか又は欠くように産生されたバリアント間で比較した。（Ａ～Ｄ）ＣＤ２０を発現するＲａｊｉ細胞、及び様々な濃度のＩｇＧ１－ＣＤ２０又はＩｇＧ１－ＣＤ２０－ｄｅｌＫ抗体バリアントと共培養したときの発光レベルによって測定される、（Ａ）ＦｃγＲＩａ、（Ｂ）ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、（Ｃ）ＦｃγＲＩＩｂ、又は（Ｄ）ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖのいずれかを安定に発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞株の活性化。活性化は、非結合対照ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型ＩｇＧ１（１００％）に対して標準化された用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）として実験複製物１つ当たり示される。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＥＭである。試験したバリアントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－ｄｅｌＫ、ＩｇＧ１－ＦＥＡ、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－ｄｅｌＫ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－ｄｅｌＫであり、式中、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ｄｅｌＫ：ＨＣ Ｃ末端リジンの組換え欠失である。

【図22】ＮＨＳを補体源として使用するインビトロＣＤＣアッセイで評価した、野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体のアロタイプバリアント及び重鎖定常領域に非活性化変異を有するそのバリアントによって誘導されたＲａｊｉ細胞のＣＤＣを示す図である。細胞溶解を、フローサイトメトリーによるＰＩ陽性細胞のパーセンテージの分析によって決定する。ＣＤＣは、野生型抗ヒトＣＤ２０抗体（アロタイプＩｇＧ１（ｆ）；１００％）及び抗体対照試料なし（０％）に対して正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）として示されている。データは、３つの独立した実験からの平均値±ＳＥＭである。試験したバリアントは、ＩｇＧ１（ｆａ）、ＩｇＧ１（ｚａｘ）、ＩｇＧ１（ｚａｖ）、ＩｇＧ１（ｚａ）、及びＩｇＧ１（ｆ）であり、式中、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒである。

【図23】標的発現Ｒａｊｉ細胞及びＦｃｙＲ発現レポーター細胞を使用して測定した場合の、異なるＩｇＧ１アロタイプバリアントの重鎖定常領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントによるヒトＦｃγＲ活性化を示す図である。（Ａ～Ｄ）ＣＤ２０を発現するＲａｊｉ細胞、及び様々な濃度のＩｇＧ１－ＣＤ２０抗体バリアントと共培養したときの発光レベルによって測定される、（Ａ）ＦｃγＲＩａ、（Ｂ）ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、（Ｃ）ＦｃγＲＩＩｂ、又は（Ｄ）ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖのいずれかを安定に発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞株の活性化。活性化は、非結合対照ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型ＩｇＧ１（ｆ）（１００％）に対して標準化された用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）として実験複製物１つ当たり示される。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＥＭである。試験したバリアントは、ＩｇＧ１（ｆ）、ＩｇＧ１（ｚａ）、ＩｇＧ１（ｚａｖ）、ＩｇＧ１（ｚａｘ）、ＩｇＧ１（ｆａ）、及びＦＥＲ又はＦＥＡ変異を有するバリアントであり、式中ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ及びＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａである。

【図24】ＮＨＳを補体源として使用するインビトロＣＤＣアッセイで評価した、野生型抗ヒトＣＤ２０抗体のサブクラスバリアント及び重鎖定常領域に非活性化変異を有するそのバリアントによって誘導されたＲａｊｉ細胞のＣＤＣを示す図である。（Ａ）野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体（アロタイプＩＧＨＧ３＊０１［ＩｇＧ３］及びＩＧＨＧ３＊０４［ＩｇＧ３ｒｃｈ２］）及びその非活性化バリアントによって誘導されるＣＤＣ。（Ｂ）野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体並びにその非活性化バリアントによって誘導されるＣＤＣ。細胞溶解を、フローサイトメトリーによるＰＩ陽性細胞のパーセンテージの分析によって決定する。ＣＤＣは、野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体（ＩｇＧ１；１００％）及び抗体対照試料なし（０％）に対して正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）として示されている。データは、３つの独立した実験からの平均値±ＳＥＭである。ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＥＡ：Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、及びＥＲ：Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ。

【図25】標的発現Ｒａｊｉ細胞及びＦｃｙＲ発現レポーター細胞を使用して測定した場合の、重鎖定常領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４抗体バリアントによるヒトＦｃγＲ活性化を示す図である。（Ａ～Ｄ）ＣＤ２０を発現するＲａｊｉ細胞、及び様々な濃度のＩｇＧ－ＣＤ２０抗体バリアントと共培養したときの発光レベルによって測定される、（Ａ）ＦｃγＲＩａ、（Ｂ）ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、（Ｃ）ＦｃγＲＩＩｂ、又は（Ｄ）ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖのいずれかを安定に発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞株の活性化。活性化は、非結合対照ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型ＩｇＧ１（１００％）に対して標準化された用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）として実験複製物１つ当たり示される。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＥＭである。試験したバリアントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３＊０１）、ＩｇＧ３ｒｃｈ２（ＩＧＨＧ３＊０４）、ＩｇＧ４、及びＥＲ、ＥＡ、ＦＥＲ、又はＦＥＡ突然変異を内包するそのバリアントであり、ここでＥＲ：Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＥＡ：Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、及びＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａである。

【図26】標的発現Ｒａｊｉ細胞及びＦｃｙＲ発現レポーター細胞を使用して測定した場合の、重鎖定常領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０マウスＩｇＧ２ａ抗体バリアントによるヒトＦｃγＲ活性化を示す図である。（Ａ～Ｄ）ＣＤ２０を発現するＲａｊｉ細胞、及び様々な濃度のマウスＩｇＧ２ａ－ＣＤ２０抗体バリアントと共培養したときの発光レベルによって測定される、（Ａ）ＦｃγＲＩａ、（Ｂ）ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、（Ｃ）ＦｃγＲＩＩｂ、又は（Ｄ）ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖのいずれかを安定に発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞株の活性化。活性化は、実験反復１回当たり非結合対照ＩｇＧ２ａ－ｂ１２（０％）及び野生型ＩｇＧ２ａ－ＣＤ２０（１００％）に対して正規化した用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）として提示する。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＥＭである。試験したバリアントは、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ａ－ＦＥＲ、ＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡ、及びＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡＰＧであり、式中、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＬＡＬＡ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ、及びＬＡＬＡＰＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇである。

【図27】Ｃ１ｑの供給源として正常ヒト血清（ＮＨＳ）を用いてＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞をオプソニン化した場合の、重鎖定常領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０マウスＩｇＧ２ａ抗体バリアントによるＣ１ｑ結合を示す図である。結合は、非結合コントロール抗体ＩｇＧ２ａ－ｂ１２（０％）及び野生型マウスＩｇＧ２ａ－ＣＤ２０（１００％）に対して正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）として示される。データは、３つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。試験した抗体バリアントは、野生型ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ａ－ＦＥＲ、ＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡ、及びＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡＰＧであり、式中、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＬＡＬＡ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ、及びＬＡＬＡＰＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇである。

【図28】重鎖定常領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０マウスＩｇＧ２ａ抗体バリアントによるＲａｊｉ細胞のＣＤＣを示す図である。重鎖定常領域に非活性化変異を有するＩｇＧ２ａ－ＣＤ２０抗体バリアントによって誘導されたＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞のＣＤＣを、補体の供給源として正常ヒト血清（ＮＨＳ）を使用して評価した。細胞溶解を、フローサイトメトリーによるＰＩ陽性細胞のパーセンテージの分析によって決定する。ＣＤＣは、非結合コントロール抗体ＩｇＧ２ａ－ｂ１２（０％）及び野生型マウスＩｇＧ２ａ－ＣＤ２０（１００％）に対して正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）として示されている。データは、３回の独立した反復から得られた平均値±ＳＥＭである。試験した抗体バリアントは、野生型ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ａ－ＦＥＲ、ＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡ、及びＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡＰＧであり、式中、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＬＡＬＡ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ、及びＬＡＬＡＰＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇである。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本明細書に記載されるように、抗体のＦｃ領域中のアミノ酸位置における特定の修飾は、タンパク質をＦｃ機能に関して基本的に不活性にする非活性化修飾であると同時に、製造の観点から有利な特性を有することが証明されている。

【0025】

本明細書で使用される「非活性化」という用語は、補体経路を活性化するための、単球等の広範囲のエフェクター細胞上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）又はＣ１ｑとの本発明によるタンパク質の相互作用の阻害又は消失を指すことを意図している。本明細書で使用される「非活性化」には、ＣＤＣ活性の低下、Ｃ１ｑ結合の低下、ＡＤＣＣの低下、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ）、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）への結合の低下又は非存在、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ）、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）を介した活性化及びシグナル伝達の低下又は非存在が含まれる。「非活性化」はまた、ＣＤ３を標的とするという観点で使用される場合（例えば、ＣＤ３を標的とする単一特異性抗体において、又は腫瘍関連抗原非依存的様式で二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体との関連で使用される場合）、Ｔ細胞活性化を誘導しないことを含む。そのような「非活性化」特徴は、好ましくは、「非活性化」ではないタンパク質と比較して、例えば本明細書に記載されるような、野生型様機能を有する未修飾Ｆｃ領域を有する抗体を本発明による修飾Ｆｃ領域と比較して評価されるべきであることが理解される。本明細書で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、Ｎ末端からＣ末端に向かう方向に、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む領域を指すことを意図している。

【0026】

本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、互いに共有結合したアミノ酸の１又は複数の鎖を含む大きな生物学的分子を指すことを意図している。そのような結合は、ペプチド結合及び／又はジスルフィド架橋を介してもよい。アミノ酸の一本鎖は、「ポリペプチド」とも呼ばれ得る。したがって、本発明の文脈におけるタンパク質は、１又は複数のポリペプチドからなり得る。本発明によるタンパク質は、抗体又は親抗体のバリアント等の任意の種類のタンパク質、又は融合タンパク質であり得る。

【0027】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、約２４時間以上、約４８時間以上、約３、４、５、６、７日間以上等、又は任意の他の関連する機能的に定義された期間（例えば、抗原への抗体結合に関連する生理学的応答を誘導、促進、増強及び／又は調節するのに十分な時間並びに／あるいは抗体がエフェクター活性を動員するのに十分な時間）等の有意な期間の半減期で、典型的な生理学的条件下で抗原に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、又はそれらのいずれかの誘導体を指すことを意図している。抗原と相互作用する結合領域（又は本明細書中で使用され得る結合ドメイン（両方とも同じ意味を有する））は、免疫グロブリン分子の重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含む。抗体の定常領域（Ａｂ）は、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞等）及び補体活性化の古典的経路における第１の成分であるＣ１ｑ等の補体系の成分を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。

【0028】

上記のように、本明細書における抗体という用語は、特に明記しない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、抗原に特異的に相互作用する、例えば結合する能力を保持する抗体の断片を含む。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。「抗体」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ’若しくはＦａｂ断片、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ及びＣ_Ｈ１ドメインからなる一価断片、又は国際公開第２００７０５９７８２号（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ）に記載されている一価抗体；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈドメイン及びＣ_Ｈ１ドメインから本質的になるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_Ｌドメイン及びＶ_Ｈドメインから本質的になるＦｖ断片；（ｖ）Ｖ_Ｈドメインから本質的になり、ドメイン抗体とも呼ばれるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４１，５４４－５４６（１９８９））（Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３ Ｎｏｖ；２１（１１）：４８４－９０）；（ｖｉ）ラクダ科動物又はナノボディ（Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｊａｎ；５（１）：１１１－２４）；並びに（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を使用して、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって連結され得る（一本鎖抗体又は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られており、例えばＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３－４２６（１９８８）ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５，５８７９－５８８３（１９８８）を参照されたい）。そのような一本鎖抗体は、特に明記されない限り、又は文脈によって明確に示されない限り、抗体という用語に包含される。そのような断片は一般に抗体の意味の範囲内に含まれるが、それらは集合的に及びそれぞれ独立して本発明の固有の特徴であり、異なる生物学的特性及び有用性を示す。本発明の文脈におけるこれら及び他の有用な抗体断片は、本明細書で更に論じられる。抗体という用語は、特に明記しない限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体及びヒト化抗体等の抗体様ポリペプチド、並びに酵素的切断、ペプチド合成、及び組換え技術等の任意の公知の技術によって提供される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体断片（抗原結合断片）も含むことも理解されるべきである。生成された抗体は、任意のアイソタイプを有することができる。

【0029】

抗体が結合断片等の断片である場合、当該断片が本明細書に記載のＦｃ領域に融合されることは、本発明の文脈内で理解されるべきである。それにより、抗体は、本発明の範囲内に入る融合タンパク質であり得る。したがって、一実施形態では、タンパク質は融合タンパク質である。

【0030】

抗体に関連して本明細書で使用される「ヒト化」という用語は、ヒト抗体定常ドメインと、ヒト可変ドメインに対して高レベルの配列相同性を含むように修飾された非ヒト可変ドメインとを含む、遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。これは、一緒に抗原結合部位を形成する非ヒト抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）を相同ヒトアクセプターフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトすることによって達成することができる（とりわけ、国際公開第９２／２２６５３号及び欧州特許第０６２９２４０号明細書を参照されたい）。親抗体結合領域の結合親和性及び結合特異性を完全に再構成するために、親抗体（すなわち、非ヒト抗体）からヒトフレームワーク領域へのフレームワーク残基の置換（復帰突然変異）が必要とされ得る。構造相同性モデリングは、抗体結合領域の結合特性に重要なフレームワーク領域内のアミノ酸残基を同定するのに役立ち得る。したがって、ヒト化可変領域又は抗体は、非ヒトＣＤＲ配列、主に、非ヒトアミノ酸配列に対する１又は複数のアミノ酸復帰突然変異が含まれていてもよいヒトフレームワーク領域を含み得る。必ずしも復帰突然変異ではない更なるアミノ酸修飾が適用されていてもよく、例えば脱アミドを回避し、「不活性Ｆｃ領域」を提供し、ヘテロ二量体化を増強し、及び／又は製造を改善する修飾を含むように、特定の有用な親和性及び生化学的特性等の好ましい特性を有するヒト化抗体又はヒト化可変領域を得ることができる。

【0031】

「ヒト」という用語は、抗体の可変領域及び抗体に関連して本明細書で使用される場合、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及びフレームワーク領域と、ヒト免疫グロブリン定常ドメインに由来する定常ドメインとを有する、遺伝子操作され得る抗体を含むことが意図される。本発明のヒト可変領域又はヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム又は部位特異的突然変異誘発又はインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異、挿入又は欠失）を含み得る。「ヒト抗体」は、例えばＬｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，３２（４）２０１４ ｐｐ ３５５－６３ ａｎｄ Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ａｐｒｉｌ ８，２０１４ １１１（１４）５１４７－５２等に記載されているようなトランスジェニック動物において、ヒトのヒト生殖系列免疫グロブリン配列から生成されたＶＨ及びＶＬ配列を組み込むことができる。そのようなＶＨ及びＶＬ配列は、ヒト免疫グロブリン定常ドメインに由来する定常ドメインに融合され得るヒトＶＨ及びＶＬ配列と考えられる。必ずしも復帰突然変異ではない更なるアミノ酸修飾が適用されていてもよく、例えば脱アミドを回避し、「不活性Ｆｃ領域」を提供し、ヘテロ二量体化を増強し、及び／又は製造を改善する修飾を含むように、特定の有用な親和性及び生化学的特性等の好ましい特性を有するヒト抗体又はヒト可変領域を得ることができる。したがって、「ヒト抗体」は、操作された抗体を含み得る。

【0032】

本明細書で使用される「補体依存性細胞傷害」（「ＣＤＣ」）という用語は、抗体が細胞又はビリオン上のその標的に結合したときにＭＡＣアセンブリによって作り出される膜の孔の結果として細胞又はビリオンの溶解をもたらす抗体媒介補体活性化のプロセスを指すことを意図している。

【0033】

本明細書で使用される「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（「ＡＤＣＣ」）という用語は、結合した抗体の定常領域を認識するＦｃ受容体を発現する細胞による、抗体でコーティングされた標的細胞又はビリオンの死滅機構を指すことを意図している。

【0034】

本明細書で使用される「免疫グロブリン重鎖」又は「免疫グロブリンの重鎖」という用語は、免疫グロブリンの重鎖の１つを指すことを意図している。重鎖は、典型的には、免疫グロブリンのアイソタイプを定義する重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び重鎖定常領域（本明細書ではＣＨと略す）から構成される。重鎖定常領域は、典型的には、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３から構成される。ＣＨ１及びＣＨ２は、典型的にはヒンジ領域を介して連結される。

【0035】

本明細書で使用される「免疫グロブリン」という用語は、２対のポリペプチド鎖、１対の軽（Ｌ）低分子量鎖及び１対の重（Ｈ）鎖からなる構造的に関連する糖タンパク質のクラスを指すことを意図しており、４つ全てがジスルフィド結合によって相互接続されている可能性がある。免疫グロブリンの構造は十分に特徴付けられている（例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい）。免疫グロブリンの構造内で、２つの重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」でジスルフィド結合を介して相互に連結されている。重鎖と同様に、各軽鎖は、典型的には、いくつかの領域：軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、典型的には、１つのドメインＣＬで構成される。更に、ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる超可変領域（又は配列及び／又は構造的に定義されたループの形態で超可変であり得る超可変領域）の領域に更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される（Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｊａｎ：２７（１）：５５－７７（２００３）も参照のこと）。

【0036】

本明細書で使用される「第１のポリペプチド」及び「第２のポリペプチド」という用語は、アミノ酸配列が同一であっても異なっていてもよい一組のポリペプチドを指す。したがって、第１及び第２のポリペプチドは、ホモ二量体又はヘテロ二量体を形成し得る。第１及び第２のポリペプチドは、更なるポリペプチドと会合し得る。

【0037】

本明細書で使用される「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ）若しくはそのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）又はその任意のアロタイプを指す。ＩｇＧ１のアロタイプとしては、ＩｇＧ１ｍ（ｚａ）及びＩｇＧ１ｍ（ｆ）が挙げられる。したがって、一実施形態では、タンパク質は、ＩｇＧ１クラスの免疫グロブリン又はその任意のアロタイプの重鎖を含む。更に、各重鎖アイソタイプは、カッパ（κ）及び／又はラムダ（λ）軽鎖、又はそれらの任意のアロタイプと組み合わせることができる。

【0038】

本明細書で使用される「ヒンジ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域を指す。したがって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ－ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，ｐｐ ６６２，６８０，６８９（１９９１）に記載されている）に示されるようなＥｕナンバリングによるアミノ酸２１６～２３０に対応する。

【0039】

ＶＨ及びＶＬ領域は、「ヒトＶＨ及びＶＬ領域」又は「ヒト化ＶＨ及びＶＬ領域」であり得る。ヒトＶＨ及び／又はヒトＶＬ領域に関して、そのような領域は、典型的には、ヒト生殖細胞系配列に由来する又はヒト生殖細胞系配列中に見出されるように、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成されることが理解される。そのようなＶＨ及びＶＬ領域は、ヒト化動物モデル又はヒトに由来し得る。例えば、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合された、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス等のトランスジェニック又はトランスクロモソーマル非ヒト動物から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生され得る。ヒトモノクローナル抗体は、ヒトＢ細胞又は形質細胞に由来し得る。本明細書で使用される「ヒト化ＶＨ及びＶＬ領域」という用語は、ヒト可変ドメインに対する高レベルの配列相同性を含有するように修飾された、非ヒト抗体に由来する遺伝子操作されたＶＨ及びＶＬ領域を指す。これは、一緒に抗原結合部位を形成する非ヒト抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）を相同ヒトアクセプターフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトすることによって達成することができる（とりわけ、国際公開第９２／２２６５３号及び欧州特許第０６２９２４０号明細書を参照されたい）。親抗体の結合親和性及び結合特異性を完全に再構成するために、親抗体（すなわち、非ヒト抗体）からヒトフレームワーク領域へのフレームワーク残基の置換（復帰突然変異）が必要とされ得る。構造相同性モデリングは、抗体の結合特性に重要なフレームワーク領域内のアミノ酸残基を同定するのに役立ち得る。したがって、ヒト化ＶＨ及びＶＬ領域は、非ヒトＣＤＲ配列、主に、非ヒトアミノ酸配列に対する１又は複数のアミノ酸復帰突然変異が含まれていてもよいヒトフレームワーク領域を含み得る。必ずしも復帰突然変異ではない更なるアミノ酸修飾が適用されていてもよく、例えば脱アミドを回避するための修飾を含むため、及び／又は製造を改善するために、特定の有用な親和性及び生化学的特性等の好ましい特徴を有するヒト化又はヒトＶＨ及びＶＬ領域を得ることができる。

【0040】

本明細書で使用される「ＣＨ２領域」又は「ＣＨ２ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ２領域を指す。したがって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２領域は、Ｅｕナンバリングシステムによるアミノ酸２３１～３４０に対応する。しかしながら、ＣＨ２領域はまた、本明細書中に記載されるような他のサブタイプのいずれかであり得る。

【0041】

本明細書で使用される「ＣＨ３領域」又は「ＣＨ３ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ３領域を指す。したがって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ３領域は、Ｅｕナンバリングシステムによるアミノ酸３４１～４４７に対応する。しかしながら、ＣＨ３領域はまた、本明細書中に記載されるような他のサブタイプのいずれかであり得る。

【0042】

本明細書で使用される「完全長抗体」という用語は、野生型抗体に通常見られるものに対応する全ての重鎖及び軽鎖定常ドメイン及び可変ドメインを含み、すなわち、重鎖にそれぞれＶＨ、ＣＨ１、リンカー、ＣＨ２、ＣＨ３領域を有し、軽鎖にそれぞれＶＬ及びＣＬ領域を有する抗体（例えば、親抗体又はバリアント抗体）、例えばヒト（又はヒト化）ＩｇＧ１重鎖等、又はヒト（又はヒト化）カッパ若しくはラムダ軽鎖を指す。二重特異性抗体はまた、完全長抗体であってもよく、すなわち、野生型抗体等に通常見られるような異なる重鎖及び／又は軽鎖を含むものであってもよいことが理解される。全長抗体は、例えば、本発明に従って本明細書で定義される置換又は修飾を含むように操作され得る。

【0043】

本明細書で使用される「位置に対応するアミノ酸」という用語は、ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸位置番号を指す。特に明記しない限り、又は文脈と矛盾しない限り、定常領域配列のアミノ酸は、本明細書ではナンバリングのＥｕインデックス（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ－ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，ｐｐ ６６２，６８０，６８９（１９９１）に記載されている）に従ってナンバリングされる。したがって、別の配列中のアミノ酸又はセグメント「に対応する」１つの配列中のアミノ酸又はセグメントは、典型的にはデフォルト設定で、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ又は同様の標準的な配列アラインメントプログラムを使用して他のアミノ酸又はセグメントとアライメントするものであり、ヒトＩｇＧ１重鎖に対して少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性を有する。配列又は配列中のセグメントを整列させ、それによって本発明によるアミノ酸位置に対する配列中の対応する位置を決定する方法は、当技術分野で周知であると考えられる。

【0044】

本発明の文脈において、アミノ酸は、保存的又は非保存的クラスによって定義され得る。したがって、アミノ酸のクラスは、以下の表の１又は複数に反映され得る。

【表1】

【表2】

本発明の文脈において、タンパク質中の置換は、以下のように示される。

【0045】

元のアミノ酸－位置－置換アミノ酸；
アミノ酸についてよく認識されている命名法を参照すると、任意のアミノ酸残基を示すコードＸａａ及びＸを含む３文字コード又は１文字コードが使用される。したがって、「Ｌ２３４Ｆ」又は「Ｌｅｕ２３４Ｐｈｅ」という表記は、タンパク質が、野生型タンパク質の２３４位のアミノ酸に対応するタンパク質アミノ酸位においてロイシンのフェニルアラニンへの置換を含むことを意味する。

【0046】

所与の位置のアミノ酸の任意の他のアミノ酸への置換は、以下のように呼ばれる。

【0047】

元のアミノ酸－位置；又は例えば「Ｌ２３４」である。

【0048】

（１又は複数の）元のアミノ酸及び／又は（１又は複数の）置換アミノ酸が複数のアミノ酸を含み得るが、（１又は複数の）全てのアミノ酸を含むわけではない修飾の場合、複数のアミノ酸は「、」又は「／」によって分離され得る。例えば、２３４番目のフェニルアラニン、アルギニン、リジン又はトリプトファンのロイシンへの置換は、「Ｌｅｕ２３４Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ」又は「Ｌ２３４Ｆ、Ｒ、Ｋ、Ｗ」又は「Ｌ２３４Ｆ／Ｒ／Ｋ／Ｗ」又は「Ｌ２３４からＦ、Ｒ、Ｋ又はＷ」である。

【0049】

そのような指定は、本発明の文脈において交換可能に使用され得るが、同じ意味及び目的を有する。

【0050】

更に、交換可能に使用することができる「置換」又は「変異」という用語は、他の１９個の天然アミノ酸のいずれか１つへの、又は非天然アミノ酸等の他のアミノ酸への置換を包含する。例えば、位置２３４のアミノ酸Ｌの置換は、以下の置換：２３４Ａ、２３４Ｃ、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｇ、２３４Ｈ、２３４Ｉ、２３４Ｋ、２３４Ｍ、２３４Ｎ、２３４Ｑ、２３４Ｒ、２３４Ｓ、２３４Ｔ、２３４Ｖ、２３４Ｗ、２３４Ｐ、及び２３４Ｙのそれぞれを含む。これは、例として、名称２３４Ｘに相当し、ここで、Ｘは、元のアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。これらの置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｃ等、又はＬ２３４Ａ、Ｃ等、又はＬ２３４Ａ／Ｃ／等とも呼ばれ得る。同じことが、本明細書中で言及されるそれぞれのあらゆる位置に類推によって適用され、具体的には、そのような置換のいずれか１つを本明細書中に含む。アミノ酸配列が「Ｘ」又は「Ｘａａ」を含む場合、当該Ｘ又はＸａａが任意のアミノ酸を表すことは当技術分野で周知である。したがって、Ｘ又はＸａａは、典型的には、２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかを表し得る。本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、以下のアミノ酸残基のいずれか１つを指す。グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン及びシステイン。「アミノ酸」及び「アミノ酸残基」という用語は、互換的に使用され得る。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）、好ましくはバージョン５．０．０以降のＮｅｅｄｌｅプログラムで実施されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して決定することができる。使用されるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ拡張ペナルティ、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られた）「最長同一性」とラベル付けされた針の出力は、同一性パーセントとして使用され、以下のように計算される。

【0051】

（同一の残基×１００）／（アライメントの長さ－アライメントにおけるギャップの総数）
同様の残基の保持はまた、又は代替的に、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、標準設定ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｏｐｅｎ Ｇａｐ＝１１、及びＥｘｔｅｎｄｅｄ Ｇａｐ＝１を使用してＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ２．２．８）の使用によって決定される類似性スコアによって測定されてもよい。

【0052】

一実施形態では、当該第１及び第２のポリペプチドの少なくとも１つにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖のＬ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６の位置に対応する位置のアミノ酸は、それぞれＬ、Ｌ及びＧではない。第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むタンパク質が提供され、当該第１及び第２のポリペプチドはそれぞれ、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖の少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域をそれぞれ含み、当該第１及び第２のポリペプチドの少なくとも１つが修飾されており、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を含み、アミノ酸位置がＥＵナンバリングによって定義される通りである。好ましくは、当該第１及び第２のポリペプチドの少なくとも一方のＬ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６の位置の当該アミノ酸は、それぞれＦ、Ｅ及びＲで置換される。

【0053】

本明細書で使用されるアミノ酸位置に関して、これらはＥｕナンバリングに従ってナンバリングされ、これはＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ－ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，ｐｐ ６６２，６８０，６８９（１９９１）に記載されているようなナンバリングのＥｕインデックスに従う。本発明による有用なアミノ酸配列の配列もまた、太字の示されたアミノ酸修飾と共に本明細書で提供される（表１参照）。

【0054】

例えば、実施例の節に示されるように、本発明によるタンパク質の一例は、２つの同一の重鎖（第１及び第２のポリペプチドに対応する）及び２つの同一の軽鎖からなる抗体であり得る。しかしながら、第１及び第２のポリペプチドの両方が同じ置換を有することは要件ではなく、例えば、第１及び第２のポリペプチドの一方がＬ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６位に当該置換を有し得、他方が例えば異なる置換を有し得る。したがって、他の鎖は、例えば、別の不活性フォーマット、例えばＦＥＡフォーマットの置換を有し得る。本発明の文脈において、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６における非活性化置換の更なる利点は、他のポリペプチドが異なる不活性フォーマット、例えばＦＥＡフォーマットを有する「非対称」様式で存在する場合でも、Ｆｃ媒介性エフェクター機能を効果的に抑制することであると考えられる。これにより、新たに開発された抗体とＦＥＲ不活性フォーマットとを、ＦＥＡフォーマット等の他の非活性化置換を有する以前に製造された抗体と組み合わせることによって、多重特異性抗体を製造することが可能になる。

【0055】

したがって、更なる実施形態では、本発明によるタンパク質が提供され、第１及び第２のポリペプチドの一方は、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸に対応するアミノ酸の当該置換を含み、他方が修飾されており、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＤ２６５のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を含み、好ましくは、当該置換はそれぞれＦ、Ｅ及びＡである。

【0056】

別の実施形態では、本発明によるタンパク質において、当該第１及び第２のポリペプチドの両方が、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６に対応するアミノ酸の当該置換を含み、これは好ましくはそれぞれＦ、Ｅ及びＲによる置換である。

【0057】

更なる実施形態では、当該第１及び第２のポリペプチドの各々は、免疫グロブリンＣＨ１領域を含む。当該ＣＨ１領域は、好ましくはヒンジ領域に連結されており、すなわち、当該ポリペプチドにヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域をそれぞれ提供する。好ましくは、ＣＨ１領域はヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖のものである。例えば、ＣＨ１領域は、配列番号４に列挙される配列を有する配列であり得る。本明細書で定義されるＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域は、配列番号５に列挙される配列であり得る。そのような配列は、本明細書中に記載されるような置換を有していてもよく、例えば、本明細書中で定義されるようなＦＥＲ置換及び／又は更なる置換が提供される。

【0058】

別の実施形態では、本発明によるタンパク質は、第１及び第２の結合領域を含む。任意の結合領域で十分であり得るが、結合領域は、ヒト抗体又はヒト化抗体等の免疫グロブリン結合領域に由来することが好ましい場合がある。

【0059】

本明細書で使用される「結合領域」又は「結合ドメイン」という用語は、例えば細胞、例えば癌細胞、細菌又はビリオン上に存在するポリペプチド等の抗原に結合することができるタンパク質の領域を指す。結合領域は、ポリペプチド配列、例えば、タンパク質、タンパク質リガンド、受容体、抗原結合領域、又は細胞、細菌若しくはビリオンに結合することができるリガンド結合領域であり得る。具体的には、結合領域は、抗原結合領域である。結合領域が例えば受容体である場合、タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃドメインと当該受容体との融合タンパク質として調製されていてもよい。結合領域が抗原結合領域である場合、本発明によるタンパク質は、抗体、キメラ抗体、又はヒト化若しくはヒト結合領域抗体若しくは重鎖のみの抗体若しくはＳｃＦｖ－Ｆｃ融合を有する抗体であり得る。

【0060】

本明細書で使用される「結合」という用語は、リガンドとして抗体及び分析種として抗原を使用するバイオレイヤー干渉法によって決定された場合、Ｋ_Ｄが１Ｅ^－６Ｍ以下、例えば５Ｅ^－７Ｍ以下、１Ｅ^－７Ｍ以下、例えば５Ｅ^－８Ｍ以下、例えば１Ｅ^－８Ｍ以下、例えば５Ｅ^－９Ｍ以下、又は例えば１Ｅ^－９Ｍ以下に対応する結合親和性で所定の抗原又は標的に抗体が結合し、Ｋ_Ｄが所定の抗原又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対する親和性よりも少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１，０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低い親和性で所定の抗原に結合することを指す。

【0061】

したがって、更なる実施形態では、本発明によるタンパク質は、それぞれ第１の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び第１の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む当該第１及び第２の結合領域を含み、当該第２の結合領域は、第２の免疫グロブリン重鎖可変領域及び第２の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。これらの領域は、好ましくはヒト又はヒト化ＶＨ及びＶＬ領域であることが理解される。したがって、ＶＨ及びＶＬ領域は、ヒト又はヒト由来のフレームワーク領域を有し、ヒト又はヒト由来又はマウス又はラット等の他の種起源のＣＤＲ１－３配列を有し得る。したがって、別の更なる実施形態では、当該免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域は、ヒト又はヒト化免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域である。

【0062】

前述のように、本発明によるタンパク質は抗体を含む。したがって、別の実施形態では、当該第１及び第２のポリペプチドは免疫グロブリン重鎖であり、当該第１及び第２のポリペプチドはそれぞれ当該第１及び第２の免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。そのような重鎖は、ヒト又はヒト化可変領域及びヒト定常領域を含むと理解されるヒト可変領域を含む場合、ヒト重鎖又はヒト化重鎖であることが好ましい場合があることが理解される。更に、当該タンパク質は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常領域及び第２の免疫グロブリン軽鎖定常領域を含み得、より好ましくは、当該タンパク質は、第１及び第２の免疫グロブリン軽鎖を含み、当該免疫グロブリン軽鎖は、当該それぞれの第１及び第２の免疫グロブリン軽鎖可変領域並びに当該それぞれの第１及び第２の免疫グロブリン定常軽鎖領域を含む。そのような軽鎖は、非ヒト由来ＣＤＲ領域を含む場合、ヒト軽鎖又はヒト化軽鎖であることが非常に好ましいことが理解される。軽鎖は、軽鎖可変領域及びヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域を有し得る。更なる実施形態では、ヒトκ軽鎖定常領域は、配列番号６に列挙されている通りである。別の更なる実施形態では、ヒトラムダ軽鎖定常領域は、配列番号７に列挙される通りである。そのような軽鎖は、カッパ軽鎖若しくはラムダ軽鎖、又はその両方を含み得、例えば、本発明によるタンパク質は２つの異なる軽鎖を含み得るので、タンパク質は１つのカッパ軽鎖及び１つのラムダ軽鎖を含む。したがって、そのような軽鎖は、ヒト又はヒト化カッパ軽鎖若しくはラムダ軽鎖のいずれか、又はその両方であり得、例えば、本発明によるタンパク質は２つの異なる軽鎖を含み得るので、タンパク質は１つのヒトカッパ軽鎖及び１つのヒトラムダ軽鎖を含む。

【0063】

ヒト又はヒト化重鎖及び軽鎖は、本明細書に記載の突然変異に加えて、好ましい特徴を提供するための更なる修飾、例えば脱アミドを回避する及び／又はヘテロ二量体化を増強するための修飾、製造及び分離を改善するための修飾等を含む、特定の有用な親和性及び生化学的特性を提供するための更なる修飾を含み得ることが理解される。

【0064】

したがって、好ましい実施形態では、当該第１及び第２のポリペプチドを含む本発明によるタンパク質は、第１及び第２の免疫グロブリン軽鎖、並びに第１及び第２の重鎖からなるか、又はそれらを含み、後者は第１及び第２のポリペプチドに対応する。本発明によるそのようなタンパク質は、ジスルフィド架橋を介して当該第１の免疫グロブリン重鎖と連結された第１の免疫グロブリン軽鎖と、ジスルフィド架橋を介して当該第２の免疫グロブリン重鎖と連結された当該第２の免疫グロブリン軽鎖とを有することができ、それによって当該第１の結合領域及び当該第２の結合領域をそれぞれ形成し、当該第１及び第２の免疫グロブリン重鎖も同様にジスルフィド架橋を介して連結される。本明細書で使用される「ジスルフィド架橋」という用語は、２つのシステイン残基間の共有結合を指し、すなわち当該相互作用はまた、Ｃｙｓ－Ｃｙｓ相互作用と呼ばれ得る。

【0065】

好ましい実施形態であり得る更なる実施形態では、本発明によるタンパク質は、好ましくは全長抗体である、抗体である。なおも別の更なる実施形態では、全長抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであるか、又はヒトＩｇＧ１アイソタイプに由来する。

【0066】

本発明によれば、当該位置の置換は、例えば抗体に含まれる場合、Ｆｃ媒介性エフェクター機能の低下をもたらすことが理解される。そのようなＦｃ媒介性エフェクター機能の低下には、ＣＤＣ活性の低下（とりわけ実施例３及び５を参照）、Ｃ１ｑ結合の低下（とりわけ実施例４）、ＡＤＣＣの低下（とりわけ実施例９）、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ）、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）への検出可能な結合の非存在（とりわけ実施例６）、並びにヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ）、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）を介した検出可能な活性化及びシグナル伝達の非存在（実施例７）が含まれ、ＣＤ３を標的化するという観点では腫瘍関連抗原非依存性Ｔ細胞活性化を誘導せず（とりわけ実施例１０）、並びに薬物動態を有し、とりわけ、ヒトＦｃＲｎ結合特性が野生型ヒトＩｇＧ１と類似しており、グリコシル化が野生型ヒトＩｇＧ１抗体等と非常に類似していることに起因し、そのようなサブステーションが抗体の文脈に含まれる場合である（例えば、実施例１２及び１４を参照されたい）。更に、これらの置換は、低ｐＨ（とりわけ実施例２０－２３）での改善されたｐＨ安定性を提供することができる。本発明によるタンパク質は、非常に好ましい実施形態であり得る抗体の文脈において有用であるだけでなく、少なくとも１つのヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む本発明による当該第１及び第２のポリペプチドを有し、当該第１及び第２のポリペプチドの少なくとも１つが修飾されており、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を含む、融合タンパク質等の他のフォーマットのタンパク質も同様に企図され、アミノ酸位置はＥＵナンバリングによって定義される通りである。

【0067】

Ｆｃ媒介性エフェクター機能に言及する場合に本明細書で使用される「低減した」又は「検出不能な」という用語は、野生型ＩｇＧ１領域等を有する同じタンパク質と比較して、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ、Ｃ１ｑ結合、ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ）、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）結合を誘導し、ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ）、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）を介して活性化及びシグナル伝達し、ＣＤ３を標的化するという観点でＴ細胞を活性化する抗体等の本発明によるタンパク質の能力に関し、これは、例えば、実施例の節に記載されているような抗体等との関連において、当該エフェクター機能を誘導する完全な能力を有する。これらの特徴について「減少した」又は「検出不能な結合」を決定するための例示的なアッセイは当技術分野で公知であり、例えば全体を通して実施例の節に十分に記載されている。実施例の節では、完全長抗体等の抗体との関連でこれらの特徴の特性を記載する。本発明によるヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖の修飾ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域のそれぞれの有利な特性は、融合タンパク質等の他の形式においても有用であり得るので、非常に好ましい特性は、実施例の節に記載されているような状況で決定され、これは、本発明によるタンパク質が抗体に限定されると理解されることを意味しないことが理解される。それにもかかわらず、本発明は、特に抗体との関連で適用される場合の使用を見出し、本明細書に示される。

【0068】

補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導するタンパク質の能力は、当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。簡潔には、未修飾の完全に機能的なＦｃ領域を有する参照タンパク質、例えば、強力なＣＤＣ誘導物質であるＩｇＧ１抗体を、ヒト血清の存在下で、細胞表面に標的抗原を提示する細胞と共にインビトロアッセイでインキュベートし、続いて、細胞溶解の割合を決定し、これを１００％に設定する。修飾されたＦｃ領域を有する本発明によるタンパク質、例えばＦＥＲ Ｆｃ領域を有する抗体の細胞溶解の割合は、同じ条件下で、細胞を標的としない、又はＦｃ領域を有しない対照タンパク質（例えばＦ（ａｂ’）２等）を用いて生じる細胞溶解と比較される。１００％に設定された未修飾参照と比較して溶解率を決定する。使用され得る適切な方法の例は、例３又は例５に記載されている通りである。本発明によるタンパク質は、代わりにＦＥＡフォーマットを有するＦｃ領域を有する同じタンパク質と比較した場合にＣＤＣ活性が低下しており、及び／又は例えばＦ（ａｂ’）２）と比較した場合に同様のＣＤＣ活性を有する。

【0069】

タンパク質がＣ１ｑ結合を低下させる能力は、当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。簡潔には、（未修飾の）完全に機能的なＦｃ領域を有するタンパク質、例えば抗体を、ヒト血清の存在下で、細胞表面に標的抗原を提示する細胞を用いたインビトロアッセイでインキュベートし、その後、Ｃ１ｑ結合のパーセンテージを、例えばポリクローナルウサギ抗ヒトＣ１ｑ補体ＦＩＴＣ抗体（Ｄａｋｏ、カタログ番号Ｆ０２５４、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）との結合及び製造者の説明書に従ったＦＡＣＳ分析によって決定する。（修飾されていない）完全に機能的なＦＣ領域を有するタンパク質の検出されたシグナルを、修飾されたＦｃ領域を有するタンパク質、例えば強力なＣＤＣ誘導物質であるＩｇＧ１抗体と比較する。使用され得る本発明による適切な方法の詳細な例は、実施例４に記載されている。本発明によるタンパク質は、代わりにＦＥＡフォーマットを有するＦｃ領域を有する同じタンパク質と比較した場合にＣＤＣ活性が低下しており、及び／又は例えば非結合コントロール抗体と比較した場合に同様のＣＤＣ活性を有する。本発明によるタンパク質は、完全長ＩｇＧ１抗体とＦＥＲとの関連において、実施例４に記載されるように、同じ配列を有するがＦＥＲを含まない抗体と比較した場合、好ましくは１５％以下のＣ１ｑ結合活性を有する。

【0070】

抗原依存性細胞傷害性を低下させる能力は、当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。例えば、野生型抗体及びその非活性化バリアントのＡＤＣＣ能力を決定するために、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ＥｕＴＤＡ ＴＲＦ（時間分解蛍光）細胞傷害性キット（カタログ番号ＡＤ０１１６、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を製造者の説明書に従って使用することができる。簡単に記載すると、標的抗原を提示する細胞を、例えば、ビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２”－ターピリジン－６，６”－ジカルボキシレート試薬溶液（ＤＥＬＦＩＡ ＢＡＴＤＡ試薬、カタログ番号Ｃ１３６－１００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を製造者の説明書に従って使用して細胞内標識する。続いて、これらの細胞を、ＰＢＭＣの存在下で、その細胞表面に標的抗原を提示するＰＢＭＣ細胞と共に、（未修飾の）完全に機能的なＦｃ領域を有するタンパク質、例えば標的抗原に対する野生型抗体、及びその非活性化バリアントと共にインキュベートする。ＮＫ媒介ＡＤＣＣの評価は、完全機能コントロールＩｇＧ１抗体（１００％に設定）及び非結合陰性ＩｇＧ１コントロール抗体（０％に設定）を参照して決定される。使用され得る適切な方法の詳細な例は、例９に記載されている。本発明によるタンパク質は、例えば完全長ＩｇＧ１抗体をＦＥＲと比較した場合、実施例９に記載されているように、同じ配列を有するがＦＥＲを含まない抗体と比較した場合、好ましくは３５％以下の残存ＡＤＣＣ活性を有する。本発明によるタンパク質は、代わりにＦＥＡフォーマットを有するＦｃ領域を有する同じタンパク質と比較した場合、同様に低下したＡＤＣＣ活性を有する。

【0071】

ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ）、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）への結合については、ＥＬＩＳＡを用いて測定することができる。本発明によるタンパク質の結合は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、Ｈｉｓタグ付きＣ末端ビオチン化ＦｃγＲ、ＦｃγＲＩａのモノマーＥＣＤ（配列番号１５）（モノマー）、又はＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈの二量体ＥＣＤ（配列番号１６）、ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｒ（配列番号１７）、ＦｃγＲＩＩｂ（配列番号１８）、ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｆ（配列番号１９）、及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖ（配列番号２０）への結合を決定することによって評価することができる。簡潔には、例えば、Ｆｃ領域を有するＩｇＧ１抗体を抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体でコーティングしたプレートに結合させ、続いてそれぞれの細胞外ドメインのそれぞれとインキュベートし、続いてストレプトアビジン－ポリＨＲＰ（ＣＬＢ、カタログ番号Ｍ２０３２、１：１０．０００）を用いてその結合を定量する。使用され得る本発明による適切な方法の詳細な例は、実施例６に記載されている。本発明によるタンパク質、例えば抗体は、当該Ｈｉｓタグ化Ｃ末端ビオチン化ＦｃγＲモノマーＥＣＤを利用するＥＬＩＳＡアッセイにおいて、当該Ｆｃγ受容体と検出可能に結合しない。本発明によるタンパク質は、例えば実施例６に示すように、ＩｇＧ１抗体と、ＦＥＲを含むＦｃ領域と、例えばＦＥＡとを比較した場合に観察される、当該Ｆｃγ受容体に対する同様の検出不能な結合を有する。

【0072】

ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｒ）、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）を介した活性化及びシグナル伝達に関して、これは市販のレポーターアッセイで決定することができる。例えば、レポーターアッセイを使用して、標的発現細胞及び示されたＦｃγＲを発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞株を使用して、本発明によるタンパク質の活性化及び結合を決定することができる（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＦｃγＲＩａ：カタログ番号ＣＳ１７８１Ｃ０８；ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ：カタログ番号Ｇ９９９１；ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｒ：カタログ番号ＣＳ１７８１Ｂ０８；ＦｃγＲＩＩｂ：カタログ番号ＣＳ１７８１Ｅ０４；ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｆ：カタログ番号Ｇ９７９０；ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖ：カタログ番号Ｇ７０１０）。例えば、ＣＤ２０標的化抗体の場合、ＣＤ２０発現Ｒａｊｉ細胞を標的細胞として使用することができる。抗体等の本発明によるタンパク質は、例えば実施例７に示すように、例えば抗体をＦＥＲ等の本発明によるＦｃ領域とＦＥＡと比較した場合に観察されるような、当該Ｆｃγ受容体を介した同様の取り外し不能な活性化及びシグナル伝達を有する。

【0073】

ＣＤ３の標的化との関連におけるＴ細胞の活性化の低減に関して、そのようなことは、ヒトＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合する結合領域、例えば、本明細書の実施例に記載されるようなヒトＣＤ３に結合する典型的な二価単一特異性抗体を含む本発明によるタンパク質に適用されることが理解される。Ｔ細胞の活性化の低下は、例えば、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域にそれぞれ、ＥＵナンバリングでＬ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６の位置のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を含む抗ＣＤ３抗体の用量応答系列を、本発明による２つのポリペプチドの両方において、新たに単離されたＰＢＭＣと共にインキュベートし、続いて、当該細胞をマウス抗ヒトＣＤ２８－ＰＥ（カタログ番号１３０－０９２－９２１；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；Ｔ細胞マーカー）及びマウス抗ヒトＣＤ６９－ＡＰＣ抗体（カタログ番号３４０５６０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色することによって決定することができる。これにより、Ｔ細胞活性化の尺度であるＴ細胞のＣＤ６９アップレギュレーションが決定される。そのようなアッセイの詳細は、実施例１０に記載されている。本発明によるタンパク質、例えばヒトＣＤ３を標的化する抗体は、野生型様Ｆｃ領域を有するヒトＣＤ３を標的化するＩｇＧ１抗体と比較して、ＣＤ６９アップレギュレーションを防止するか、又は高度に低減することができる。

【0074】

本発明によるタンパク質、すなわち、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６の位置のアミノ酸に対応するアミノ酸、好ましくはそれぞれＦ、Ｅ及びＲで少なくとも置換されたヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むタンパク質に関して、これらは、好ましくは野生型ＩｇＧ１配列と非常に類似したグリコシル化を有する。より具体的には、本発明によるタンパク質のガラクトシル化及び／又は荷電グリカンの存在は、好ましくは、同じ細胞株及び同じ産生条件を用いて産生された野生型ＩｇＧ１アミノ酸配列について見出されるのと同じ範囲にある。ＣＨＯ細胞株を含む製造に適した哺乳動物宿主細胞は、当技術分野で周知である（とりわけ、Ｂｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ｓｐｅａｒｍａｎ，２０１４，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ，Ｄｅｃ；３０：１０７－１２を参照されたい）。総ガラクトシル化率は、好ましくは、配列番号１等の野生型ＩｇＧ１配列を含む同じタンパク質において観察されるガラクトシル化率の合計と比較して、プラス又はマイナス２０％の範囲にある。例えば、野生型ＩｇＧ１配列等のガラクトシル化率が２５％であれば、合計で５％－４５％の範囲とすることができる。総ガラクトシル化率は、好ましくは、ＦＥＲフォーマットを含まない本発明によるタンパク質で観察される総ガラクトシル化率と比較して、プラス又はマイナス２０％の範囲内である。荷電グリカンの総百分率は、好ましくは、配列番号１等の野生型ＩｇＧ１配列を含むタンパク質において観察される荷電グリカンの総百分率と比較して、プラス又はマイナス３％の範囲にある。例えば、野生型ＩｇＧ１配列等が１％の荷電グリカンのパーセンテージを有する場合、荷電グリカンの総パーセンテージは０％－４％の範囲内であり得る。荷電グリカンの総百分率は、好ましくは、ＦＥＲフォーマットを含まない本発明によるタンパク質において観察される荷電グリカンの総百分率と比較して、プラス又はマイナス３％の範囲にある。荷電グリカンの全パーセンテージ及び／又は抗体等の本発明によるタンパク質のガラクトシル化のパーセンテージは、好ましくは、配列番号１等の野生型ＩｇＧ１配列を含む同じタンパク質で観察される全ガラクトシル化パーセンテージと比較して、荷電グリカンの全パーセンテージの±３％及び±２０％の範囲内である。抗体等の本発明によるタンパク質の荷電グリカン及び／又はガラクトシル化の総百分率は、好ましくは、ＦＥＲフォーマットを含まない本発明によるタンパク質で観察されるガラクトシル化の総百分率と比較して、荷電グリカンの総百分率の±３％及び±２０％の範囲内である。

【0075】

抗体等の本発明によるタンパク質のガラクトシル化及び／又は荷電グリカンの割合は、当技術分野で公知の方法を使用して決定することができる。そのような方法は、例えば実施例１４に記載されている。適切な方法としては、２－アミノベンズアミドラベリング及びその後の実施例１４に記載されるようなＨＰＬＣ分析、又はＯｒｂｉｔｒａｐ Ｑ－Ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓｓ質量分析計を使用したＬＣ－ＭＣが挙げられる。ここで、ガラクトシル化及び荷電グリカンの割合はそれぞれ、Ａ２Ｆグリカン構造を有する全てのグリカンに対するオリゴ糖中のガラクトース又は荷電グリカンの占有率として計算される。本明細書でパーセンテージと呼ばれる量は、モル量、すなわち質量ではなく分子数を表す。荷電グリカン及び／又はガラクトシル化の割合は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で産生された場合、抗体等の本発明によるタンパク質について決定することができる。例えば、実施例のセクションに示すように、野生型ＩｇＧ１配列を有するＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で産生されるタンパク質の荷電グリカンのパーセンテージ及びガラクトシル化のパーセンテージは、それぞれ約０．５％及び約１５％～２５％である。したがって、本発明によるタンパク質は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で産生された場合、好ましくはそれぞれ好ましくは０～４％～５～４５％である荷電グリカンのパーセンテージ及びガラクトシル化のパーセンテージを有する。

【0076】

少なくともＬ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６の位置のアミノ酸に対応するアミノ酸の、好ましくはそれぞれＦ、Ｅ及びＲによる置換を有するヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む本発明によるタンパク質に関して、これらは好ましくは、野生型ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域と同様のヒトＦｃＲｎ結合を有するものである。本明細書で選択される置換は、ＦｃＲｎ結合機能に影響を及ぼさない置換であり得ることが理解される。したがって、そのようなタンパク質の薬物動態は、野生型ＩｇＧ１Ｆｃ領域を有する対応するタンパク質の薬物動態と類似しており、例えば、とりわけ、実施例のセクションで説明する。しかしながら、例えば半減期の延長又は半減期の短縮等、ＦｃＲｎ機能を修飾することが有用である場合、それが有用であるシナリオでは、そのための更なる置換を含むことが企図され得ることが理解される。抗体、例えば完全長単一特異性及び二重特異性抗体について、一実施形態では、ヒトＦｃＲｎ結合特性は、野生型ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域を有する同じ抗体と異ならない。そのような結合特性は当技術分野で公知であり、本明細書の実施例の項に記載されるように決定することができる。したがって、ｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合は、対応する野生型ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域で観察されるのと同様に起こり、ｐＨ７．４では検出可能な結合は起こらない。

【0077】

更なる実施形態では、当該第１及び第２のポリペプチドを含む本発明によるタンパク質は、同一のアミノ酸配列を有する。これは、宿主細胞において１つのポリペプチドをコードする単一の発現カセットから産生されるタンパク質を含み、すなわち、第１及び第２のポリペプチドは、その１つのポリペプチドのホモ二量体であり得ることが理解される。そのようなタンパク質の例としては、抗体、例えば２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する抗体（図１５Ａ参照）が挙げられ、２つの重鎖の両方が同一であり、軽鎖の両方も同様である。そのような抗体は二価であり、各々が同じ標的抗原、すなわち同じエピトープに結合することができる２つの結合領域を有する。したがって、更なる実施形態では、本発明のタンパク質は、第１及び第２のポリペプチドを含み、当該第１及び第２のポリペプチドは、アミノ酸配列が同一である免疫グロブリン重鎖であり、アミノ酸配列が同一である第１及び第２の免疫グロブリン軽鎖を更に含む。

【0078】

更なる実施形態では、本発明によるタンパク質は、更なる置換を含む。本発明による好ましい更なる置換には、ヘテロ二量体の形成を可能にする、すなわち第１及び第２のポリペプチドを含むタンパク質を提供することを可能にする修飾が含まれ、第１及び第２のポリペプチドは異なる。そのようなタンパク質の例としては、二重特異性抗体、例えば２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する抗体（図１５Ｂ参照）が挙げられ、少なくとも２つの重鎖は同一ではなく、抗体中の重鎖対及び軽鎖対の各々は異なる抗原を標的とすることができる。第１及び第２のポリペプチドのＩｇＧ１配列のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域に分化修飾を導入することは必ずしも必要ではない場合があり、第１及び第２のポリペプチド配列のこれらの領域は同一であり得る。そのようにして、ホモ二量体及びヘテロ二量体の混合物が形成され得、これを使用することはそれ自体が有利であり得るか、又はヘテロ二量体及びホモ二量体はその混合物から容易に分離され得る（例えば、サイズ及び／又は電荷、親和性等の違いを介して）。しかしながら、二重特異性抗体等の生成を可能にするか又は駆動する更なる修飾を導入することが好ましい。したがって、本発明によるタンパク質は、第１及び第２のポリペプチドのＩｇＧ１配列のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域に更なる置換を含み得る。このようにして、ＩｇＧ１配列のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域に関して異なる配列を含む第１及び第２のポリペプチドを、本発明に従ってタンパク質中で有利に組み合わせることができる。そのようなタンパク質、すなわちそのような置換を有する免疫グロブリン又は免疫グロブリン様タンパク質の例としては、トリオーマブ／クアドロマ（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｒｏｃｈｅ、国際公開第２０１１０６９１０４号）、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、国際公開第９８５０４３１号）、交差ＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ、国際公開第２０１１１１７３２９号）及び静電気的に一致した（Ａｍｇｅｎ、欧州特許第１８７０４５９号及び国際公開第２００９０８９００４号；Ｃｈｕｇａｉ、米国特許出願公開第２０１０００１５５１３３号明細書；Ｏｎｃｏｍｅｄ、国際公開第２０１０１２９３０４号）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＤＩＧボディ及びＰＩＧボディ（Ｐｈａｒｍａｂｃｉｎｅ）、鎖交換操作ドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ、国際公開第２００７１１０２０５号）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（Ｍｅｒｕｓ）、ＦｃΔＡｄｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ、国際公開第２０１０１５７９２号）、二重特異性ＩｇＧ１及びＩｇＧ２（Ｐｆｉｚｅｒ／Ｒｉｎａｔ、国際公開第１１１４３５４５号）、アジメトリックスキャフォールド（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ／Ｍｅｒｃｋ、国際公開第２０１２０５８７６８号）、ｍＡｂ－Ｆｖ（Ｘｅｎｃｏｒ、国際公開第２０１１０２８９５２号）、二価二重特異性抗体（Ｒｏｃｈｅ）及びＤｕｏＢｏｄｙ（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ、国際公開第２０１１１３１７４６号）等の相補的ＣＨ３ドメインを有するタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0079】

特定の実施形態では、本発明によるタンパク質、当該第１及び第２のポリペプチドは、更なるアミノ酸置換、好ましくはＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及びＫ４０９、例えばＦ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒからなる群から選択されるアミノ酸の置換を含む。タンパク質がホモ二量体、例えば同一の第１及び第２のポリペプチドを有する場合、両方とも同じ置換を有し得ることが理解される。本発明によるそのようなタンパク質、例えば単一特異性抗体は、実施例の節及び例えば国際公開第２０１１１３１７４６号に記載されているような二重特異性抗体の調製に非常に有利に使用することができる。

【0080】

したがって、更なる実施形態では、本発明によるタンパク質は単一特異性抗体である。本発明の文脈において、「単一特異性」は、その結合領域を有する同じエピトープに結合する、すなわち結合することができるタンパク質を指す。特に、そのような単一特異性タンパク質又は抗体は、好ましくは、標的分子、細胞標的及び病原体から選択される抗原に結合する。

【0081】

企図され得る標的分子としては、サイトカイン、成長因子、リガンド等の分子が挙げられる。例えば癌細胞、腫瘍細胞、エフェクター細胞（例えば、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞及びＴ細胞）上に存在する受容体又は接着分子等の細胞表面の分子を含むと考えられ得る細胞標的。標的とされ得る病原体には、ウイルス、細菌、原虫、寄生虫等が含まれる。したがって、企図され得る本発明によるタンパク質には、サイトカイン、増殖因子、リガンド、癌細胞、腫瘍細胞、エフェクター細胞、ウイルス及び細菌の群から選択される抗原又は標的に対する結合領域を有するタンパク質、例えば単一特異性抗体が含まれる。

【0082】

しかしながら、本発明は、単一特異性抗体等の単一特異性タンパク質に限定されず、二重特異性抗体等の多重特異性タンパク質にも関する。更なる実施形態では、本発明によるタンパク質は二重特異性又は多重特異性抗体である。これは、本発明によるタンパク質の結合領域が、同じエピトープではなく、異なるエピトープに結合することを意味する。したがって、本発明によるタンパク質の第１及び第２の結合領域は、例えばアミノ酸配列に関して異なる。異なるエピトープは、同じ標的実体、例えば同じ標的分子によって提示される及び／又は同じ標的細胞によって提示される異なるエピトープに由来し得るが、異なる標的実体に由来し得る。

【0083】

本発明による非常に有利な二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体は、第１及び第２の結合領域の一方がエフェクター細胞を標的とし、第１及び第２の結合領域の他方が癌抗原を標的とするタンパク質を含む。そのような多重特異性抗体を使用することによって、特定のクラスのエフェクター細胞を癌細胞と係合させ、それによって例えばエフェクター細胞による癌細胞の死滅を誘導することができる。一実施形態では、当該結合領域の１つが癌抗原に結合する、本発明による二重特異性抗体が提供される。別の実施形態では、当該結合領域の１つは、エフェクター細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞呼び出し、単球又は好中球に結合する。更に別の実施形態では、当該結合領域の一方がエフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞に結合し、他方の結合領域が癌抗原に結合する。

【0084】

二重特異性抗体による受容体阻害又はＴ細胞動員等、エフェクター細胞又は補体への治療用抗体のＦｃ領域のＦｃ結合が不要であるか、又は望ましくない細胞傷害性に寄与し得るので望ましくない適用がある。したがって、ヒトＴ細胞受容体に対する１つの結合領域と結合する二重特異性抗体は、ヒト細胞傷害性Ｔ細胞を有利に動員することができる。したがって、ヒトＣＤ３に対する１つの結合領域と結合し、細胞傷害性Ｔ細胞を動員することができる、本明細書中の二重特異性抗体が提供される。活性化ＩｇＧ Ｆｃ領域を有する二重特異性抗体を含むＣＤ３抗体は、ＦｃγＲ発現細胞による架橋、ＦｃγＲ発現細胞の不適切な活性化及びその後のサイトカインストーム及び関連する毒性作用、又は血小板凝集を介して、腫瘍細胞の非存在下で望ましくないアゴニズムを誘導することができる。したがって、非活性化Ｆｃ領域を有するＣＤ３二重特異性抗体は、潜在的な望ましくない細胞活性化を防止するのに有利である。

【0085】

したがって、１つの実施形態では、第１及び第２の結合領域のうちの少なくとも１つは、ＣＤ３に結合する、すなわち、ＣＤ３に結合することができる。特定の実施形態では、当該第１の結合領域はＣＤ３に結合し、当該第２の結合領域は任意の他の目的の標的に結合する、すなわち結合することができる。そのような他の標的は、癌抗原であり得る。そのような他の標的は、腫瘍特異的標的又は癌特異的標的であり得る。好ましくは、本発明による当該タンパク質は二重特異性抗体である。当該タンパク質二重特異性抗体は、好ましくは、ＣＤ３に結合することができる第１の結合領域と、癌特異的標的に結合することができる第２の結合領域とを有する。

【0086】

単一特異性、二重特異性又は多重特異性抗体を含む抗体は、本発明によるヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＦｃ領域等を含み得ることが理解される。抗体フォーマット、例えば、とりわけ、以下では、そのようなＩｇＧ１Ｆｃ領域を含まないであろうが、そのような抗体は、例えば、そのような抗体のＦｃ領域を、本発明に従ってＦＥＲを含むヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域で置き換えることによって、又は、そのような抗体がＦｃ領域を含まない場合には、例えば、融合及び／又はコンジュゲーションによって、そのような抗体をそれと共に提供することによって、それと共に提供され得る。したがって、抗体が本発明によるヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む限り、任意の抗体フォーマットが本発明に従って企図され得る。

【0087】

本発明において使用され得る二重特異性抗体分子の例には、（ｉ）異なる抗原結合領域を含む２つのアームを有する単一抗体、（ｉｉ）例えば、余分なペプチドリンカーによってタンデムに連結された２つのｓｃＦｖを介して、２つの異なるエピトープに対する特異性を有する単鎖抗体；（ｉｉｉ）各軽鎖及び重鎖が短いペプチド連結を介してタンデムに２つの可変ドメインを含有する、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０））；（ｉｖ）化学結合二重特異性（Ｆａｂ’）_２断片；（ｖ）標的抗原の各々に対して２つの結合部位を有する四価二重特異性抗体をもたらす２つの一本鎖ダイアボディの融合物であるＴａｎｄａｂ；（ｖｉ）多価分子をもたらすｓｃＦｖとダイアボディとの組み合わせである屈曲体；（ｖｉｉ）Ｆａｂに適用されると、異なるＦａｂ断片に連結された２つの同一のＦａｂ断片からなる三価二重特異性結合タンパク質を生じ得る、プロテインキナーゼＡの「二量体化及びドッキングドメイン」に基づく、いわゆる「ドック及びロック」分子；（ｖｉｉｉ）例えば、ヒトＦａｂアームの両末端に融合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるＳｃｏｒｐｉｏｎ分子；並びに（ｉｘ）ダイアボディを含む。

【0088】

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、本発明に記載されるような制御されたＦａｂアーム交換（例えば、国際公開第１１／１３１７４６号に記載されるような）を介して得られるダイアボディ、クロスボディ又は二重特異性抗体である。

【0089】

異なるクラスの二重特異性抗体の例としては、限定されないが、（ｉ）ヘテロ二量体化を強制する、相補的なＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子；（ｉｉ）分子の両面がそれぞれ、少なくとも２つの異なる抗体のＦａｂ断片又はＦａｂ断片の一部を含有する、組換えＩｇＧ様二重標的化分子；（ｉｉｉ）完全長ＩｇＧ抗体が余分なＦａｂ断片又はＦａｂ断片の一部に融合されているＩｇＧ融合分子；（ｉｖ）一本鎖Ｆｖ分子又は安定化ダイアボディが重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域又はその一部に融合されている、Ｆｃ融合分子；（ｖ）異なるＦａｂ断片が一緒に融合され、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域又はその一部に融合されたＦａｂ融合分子；（ｖｉ）異なる一本鎖Ｆｖ分子若しくは異なるダイアボディ又は異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が互いに、又は重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域若しくはその一部に融合した別のタンパク質若しくは担体分子に融合したＳｃＦｖ及びダイアボディ系及び重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が挙げられる。

【0090】

相補的ＣＨ３ドメイン分子を有する二重特異性ＩｇＧ様分子等の例としては、トリオーマブ／クアドロマ（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｒｏｃｈｅ、国際公開第２０１１０６９１０４号）、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、国際公開第９８５０４３１号）、交差ＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ、国際公開第２０１１１１７３２９号）及び静電気的に一致した（Ａｍｇｅｎ、欧州特許第１８７０４５９号及び国際公開第２００９０８９００４号；Ｃｈｕｇａｉ、米国特許出願公開第２０１０００１５５１３３号明細書；Ｏｎｃｏｍｅｄ、国際公開第２０１０１２９３０４号）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＤＩＧボディ及びＰＩＧボディ（Ｐｈａｒｍａｂｃｉｎｅ）、鎖交換操作ドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ、国際公開第２００７１１０２０５号）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（Ｍｅｒｕｓ）、ＦｃΔＡｄｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ、国際公開第２０１０１５７９２号）、二重特異性ＩｇＧ１及びＩｇＧ２（Ｐｆｉｚｅｒ／Ｒｉｎａｔ、国際公開第１１１４３５４５号）、アジメトリックスキャフォールド（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ／Ｍｅｒｃｋ、国際公開第２０１２０５８７６８号）、ｍＡｂ－Ｆｖ（Ｘｅｎｃｏｒ、国際公開第２０１１０２８９５２号）、二価二重特異性抗体（Ｒｏｃｈｅ）及びＤｕｏＢｏｄｙ（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ、国際公開第２０１１１３１７４６号）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0091】

組換えＩｇＧ様二重標的化分子の例としては、限定されないが、Ｄｕａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、Ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ Ｍａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ^２（Ｆ－Ｓｔａｒ、国際公開第２００８００３１１６号）、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（Ｚｙｎｇｅｎｉａ）、共通軽鎖を用いたアプローチ（Ｃｒｕｃｅｌｌ／Ｍｅｒｕｓ、米国特許第７，２６２，０２８号明細書）、κλＢｏｄｉｅｓ（ＮｏｖＩｍｍｕｎｅ）及びＣｏｖＸ－ｂｏｄｙ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。

【0092】

ＩｇＧ融合分子の例としては、限定されないが、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ（Ａｂｂｏｔｔ、米国特許第７，６１２，１８１号明細書）、二重ドメインダブルヘッド抗体（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ；ＳａｎｏｆｉＡｖｅｎｔｉｓ、国際公開第２０１００２２６９２３号）、ＩｇＧ様二重特異性（ＩｍＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＲＥＳ（ＢｉｏｇｅｎＩｄｅｃ、米国特許第００７９５１９１８号）、ｓｃＦｖ融合（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ｓｃＦｖ融合（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ａｄａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、中国特許第１０２２５０２４６号）及びＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ、国際公開第２０１２０２５５２５号、国際公開第２０１２０２５５３０号）が挙げられる。

【0093】

Ｆｃ融合分子の例としては、ＳｃＦｖ／Ｆｃ Ｆｕｓｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）、Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ－ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ、国際公開第２００８１５７３７９号、国際公開第２０１０／０８０５３８号）及びＤｕａｌ（ＳｃＦｖ）_２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－Ｃｈｉｎａ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0094】

Ｆａｂ融合二重特異性抗体の例としては、Ｆ（ａｂ）_２（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）、Ｄｕａｌ－Ａｃｔｉｏｎ又はＢｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、二価二重特異性（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）及びＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0095】

ＳｃＦｖ系、ダイアボディ系及びドメイン抗体の例としては、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、二重親和性リターゲティング技術（ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、単鎖ダイアボディ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ，ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二重標的化ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的化重鎖のみのドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0096】

更なる実施形態では、本発明による二重特異性抗体が提供され、当該第１及び第２のポリペプチドは、当該第１及び第２のポリペプチド由来のそれぞれのＣＨ２及びＣＨ３領域の配列が異なるように、当該それぞれのＣＨ２及びＣＨ３領域に更なる置換を含み、当該置換は、当該第１及び第２のポリペプチドを含む当該ポリペプチドを得ることを可能にする。特定の実施形態では、当該第１のポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖のＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置のアミノ酸の少なくとも一つが置換されており、当該第２のポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖中のＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置のアミノ酸の少なくとも一つが置換されており、当該第１及び当該第２のポリペプチドの当該置換は同じ位置にはない。これに関連して、「置換された」という用語は、別のタイプのアミノ酸で置換された特定のアミノ酸位置のアミノ酸を指す。したがって、ヒトＩｇＧ１重鎖の位置に対応する位置の「置換」アミノ酸は、特定の位置のアミノ酸がＩｇＧ１重鎖のその位置の天然に存在するアミノ酸とは異なることを意味する。

【0097】

更に、本発明による二重特異性抗体が提供され、当該第１のポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖のＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置のアミノ酸の少なくとも一つが置換されており、当該第２のポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖中のＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置のアミノ酸の少なくとも一つが置換されており、当該第１及び当該第２のポリペプチドの当該置換は同じ位置にはない。

【0098】

更なる実施形態では、ヒトＩｇＧ１重鎖のＦ４０５に対応する位置のアミノ酸は、当該第１のポリペプチド中のＬであり、ヒトＩｇＧ１重鎖のＫ４０９に対応する位置のアミノ酸は、当該第２のポリペプチド中のＲであり、又はその逆も同様である。

【0099】

別の実施形態では、本発明による二重特異性抗体が提供され、Ｆ４０５に対応する位置のアミノ酸は当該第１のポリペプチドにおいてＬであり、Ｋ４０９に対応する位置のアミノ酸は当該第２のポリペプチドにおいてＲであり、又はその逆も同様である。別の実施形態では、本発明による二重特異性抗体が提供され、ここで、当該第１のポリペプチドにおいて、Ｆ４０５及びＫ４０９に対応する位置のアミノ酸はそれぞれＬ及びＫであり、当該第２のポリペプチドにおいて、Ｆ４０５及びＫ４０９に対応する位置のアミノ酸はそれぞれＦ及びＲであり、又はその逆も同様である。

【0100】

更に別の実施形態では、本発明による二重特異性抗体が提供され、ここで、当該二重特異性抗体は、当該第１及び第２のポリペプチドの両方において、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６位のアミノ酸のＦ、Ｅ及びＲによる置換、並びにＦ４０５位のアミノ酸の当該第１のポリペプチドにおけるＬ及びＫ４０９における当該第２のポリペプチドにおけるＲによる置換を含む修飾を有し、又はその逆も同様である。

【0101】

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体が提供され、ここで、当該二重特異性抗体は、当該第１及び第２のポリペプチドの一方において、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６位のアミノ酸のＦ、Ｅ及びＲによる置換、並びにＦ４０５位のアミノ酸の当該第１のポリペプチドにおけるＬ及びＫ４０９における当該第２のポリペプチドにおけるＲによる置換を含む修飾を有し、又はその逆も同様である。

【0102】

更に別の実施形態では、本発明による二重特異性抗体が提供され、ここで、当該二重特異性抗体は、当該第１及び第２のポリペプチドにおいて、第１の第２のポリペプチドにおける位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸のＦ、Ｅ及びＲによる置換、並びに当該第２のポリペプチドにおける位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＤ２６５のアミノ酸のＦ、Ｅ及びＡによる置換、並びに当該第１のポリペプチドにおける位置Ｆ４０５のアミノ酸のＬによる置換、並びに当該第２のポリペプチドにおけるＫ４０９のＲによる置換を含む修飾を有する。

【0103】

なお別の実施形態では、本発明による二重特異性抗体が提供され、ここで、当該二重特異性抗体は、当該第１及び第２のポリペプチドにおいて、第１の第２のポリペプチドにおける位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸のＦ、Ｅ及びＲによる置換、並びに当該第２のポリペプチドにおける位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＤ２６５のアミノ酸のＦ、Ｅ及びＡによる置換、並びに当該第２のポリペプチドにおける位置Ｆ４０５のアミノ酸のＬによる置換、並びに当該第１のポリペプチドにおけるＫ４０９のＲによる置換を含む修飾を有する。

【0104】

更に別の実施形態では、本発明による二重特異性抗体が提供され、ここで、当該二重特異性抗体は、当該第１及び第２のポリペプチドの両方において、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６位のアミノ酸のＦ、Ｅ及びＲによる置換、並びにＦ４０５位のアミノ酸の当該第１のポリペプチドにおけるＬ及びＫ４０９における当該第２のポリペプチドにおけるＲによる置換を含む修飾を有し、又はその逆も同様である。

【0105】

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体が提供され、ここで、当該二重特異性抗体は、当該第１及び第２のポリペプチドの一方において、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６位のアミノ酸のＦ、Ｅ及びＲによる置換、並びにＦ４０５位のアミノ酸の当該第１のポリペプチドにおけるＬ及びＫ４０９における当該第２のポリペプチドにおけるＲによる置換を含む修飾を有し、又はその逆も同様である。

【0106】

更に別の実施形態では、本発明による二重特異性抗体が提供され、ここで、当該二重特異性抗体は、当該第１及び第２のポリペプチドにおいて、第１の第２のポリペプチドにおける位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸のＦ、Ｅ及びＲによる置換、並びに当該第２のポリペプチドにおける位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＤ２６５のアミノ酸のＦ、Ｅ及びＡによる置換、並びに当該第１のポリペプチドにおける位置Ｆ４０５のアミノ酸のＬによる置換、並びに当該第２のポリペプチドにおけるＫ４０９のＲによる置換を含む修飾を有する。

【0107】

なお別の実施形態では、本発明による二重特異性抗体が提供され、ここで、当該二重特異性抗体は、当該第１及び第２のポリペプチドにおいて、第１の第２のポリペプチドにおける位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸のＦ、Ｅ及びＲによる置換、並びに当該第２のポリペプチドにおける位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＤ２６５のアミノ酸のＦ、Ｅ及びＡによる置換、並びに当該第２のポリペプチドにおける位置Ｆ４０５のアミノ酸のＬによる置換、並びに当該第１のポリペプチドにおけるＫ４０９のＲによる置換を含む修飾を有する。

【0108】

本発明による当該タンパク質は、配列番号１で定義されるヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域に基づくことができる。ヒトＩｇＧ１の当該ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域は、アロタイプＩｇＧ１ｍ（ｆ）に対応する。もちろん、ＩｇＧ１免疫グロブリンクラス内の任意の他のヒトＩｇＧ１アロタイプ（例えば、ＩｇＧ１ｍ（ｚａ）、ＩｇＧ１ｍ（ｚａｘ）、ＩｇＧ１ｍ（ｚａｖ）又はＩｇＧ１ｍ（ｆａ）；とりわけＶｉｄａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０ Ｏｃｔを参照、及びＩＭＧＴデータベース（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に提供されているように）が企図され得、等しく適している。

【0109】

Ｆｃ領域は、そのＣ末端にリジンを有し得る。このリジンの起源は、これらのＦｃ領域が由来するヒトに見られる天然に存在する配列である。組換え抗体の細胞培養生産中、この末端リジンは、（１又は複数の）内因性カルボキシペプチダーゼによるタンパク質分解によって切断され、同じ配列を有するがＣ末端リジンを欠く定常領域をもたらすことができる。抗体の製造目的のために、この末端リジンをコードするＤＮＡは、リジンなしで抗体が産生されるように配列から省くことができる。例えば、ＣＨＯベースの産生系で産生された抗体を使用する場合、末端リジンのプロセシングの程度が典型的には高いため、末端リジンをコードするか、又はコードしない核酸配列から産生された抗体は、配列及び機能が実質的に同一である（Ｄｉｃｋ，Ｌ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００８；１００：１１３２－１１４３）。本明細書中に列挙される定常領域配列は、末端リジン（Ｋ）（とりわけ配列番号１を参照されたい）を列挙し、末端リジン（Ｋ）をコードする配列を本明細書中の実施例の節で使用した。したがって、抗体等の本発明によるタンパク質は、本明細書において配列番号１～３、５及び９～１４に列挙されるような末端リジンをコード又は有することなく生成することができることが理解される。

【0110】

したがって、本発明によるタンパク質、又は本発明による二重特異性抗体は、配列番号１に従って本明細書で定義されるアミノ酸配列を含む第１及び第２のポリペプチドを含み得、当該第１及び第２のタンパク質は、本明細書で定義されるアミノ酸置換を有する。本発明によるタンパク質、又は本発明による二重特異性抗体であって、当該第１及び第２のポリペプチドが、好ましくは配列番号１によるアミノ酸配列を含み、当該第１及び第２のポリペプチドに含まれる当該アミノ酸配列が、本明細書で定義されるアミノ酸置換を有する、タンパク質又は二重特異性抗体。更に、本明細書で定義される置換を有する、配列番号１によって定義される当該アミノ酸配列は、末端リジンを含まなくてもよい。

【0111】

したがって、本発明による全長抗体であり得るタンパク質、又は単一特異性若しくは二重特異性抗体は、配列番号２で定義されるアミノ酸配列を含み得る。本発明によるタンパク質は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のＦ、Ｅ及びＲによる当該置換をヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域配列内に含むことに加えて、その中に更なる置換を含み得る。好ましくは、更なる置換の数は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域内の最大５個の更なる置換の範囲内である。したがって、一実施形態では、配列番号２で定義される配列を含むタンパク質は、配列番号２で定義される当該配列中に更なる置換を含み、更なる置換の数は最大５個の置換からなる。別の実施形態では、配列番号２で定義される配列を含み、配列番号２で定義される当該配列中に更なる置換を含み、更なる置換の数が最大１０個の置換からなる、本発明によるタンパク質が提供される。別の実施形態では、本発明によるタンパク質は、配列番号１で定義された配列、又は別のアロタイプのヒトＩｇＧ１の対応する配列を含み得、そのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域配列内で、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のＦ、Ｅ及びＲによる当該置換が提供され得、置換も更に含み得、例えば最大５個の更なる置換を含み得る。本明細書で定義されるＲ／Ｌ置換を有する等、更なる置換を有するのに非常に適した更なる置換を有する配列番号２で定義されるポリペプチドを含むようなタンパク質の例は、配列番号１１及び１２で定義されるアミノ酸配列で定義される通りである。更に、本明細書で定義される任意の更なる置換を有する、配列番号２、又は１１及び１２によって定義される当該アミノ酸配列は、末端リジンが欠失していてもよい。

【0112】

更に、本明細書で定義される抗体又は全長抗体であり得る本発明によるタンパク質が提供され、第１及び第２のポリペプチドの両方が、配列番号２、１１、又は１２で定義されるアミノ酸配列を含む。

【0113】

別の実施形態では、本明細書で定義される二重特異性抗体であり得るタンパク質が提供され、第１及び第２のポリペプチドは、それぞれ配列番号２及び３で定義されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本明細書で定義される二重特異性抗体であり得るタンパク質が提供され、第１及び第２のポリペプチドは、それぞれ配列番号１１及び１２、又は１１及び１４、又は１２及び１３で定義されるアミノ酸配列を含む。そのようなポリペプチドは、ヒンジ領域に隣接するＣＨ１領域、例えば配列番号４によって定義されるヒトＣＨ１領域を含み得る。

【0114】

更なる実施形態では、本発明に従って提供されるタンパク質、又は単一特異性若しくは二重特異性抗体は、配列番号２で定義された配列と少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するか、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｅｕナンバリングによって定義された２３４、２３５及び２３６に対応する位置のアミノ酸残基は、それぞれＦ、Ｅ及びＲである。

【0115】

更なる実施形態では、本発明に従って提供されるタンパク質、又は単一特異性若しくは二重特異性抗体は、配列番号１１に定義される配列と少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するか、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２３４、２３５及び２３６に対応する位置のアミノ酸残基はそれぞれＦ、Ｅ及びＲであり、４０５に対応する位置のアミノ酸残基はＬであり、アミノ酸番号はＥｕナンバリングによって定義される通りである。

【0116】

更なる実施形態では、本発明に従って提供されるタンパク質、又は単一特異性若しくは二重特異性抗体は、配列番号１２に定義される配列と少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するか、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２３４、２３５及び２３６に対応する位置のアミノ酸残基はそれぞれＦ、Ｅ及びＲであり、４０９に対応する位置のアミノ酸残基はＲであり、アミノ酸番号はＥｕナンバリングによって定義される通りである。

【0117】

いくつかの実施形態では、本発明に従って提供されるタンパク質又は二重特異性抗体は、第１及び第２のポリペプチドを含み、ここで、
当該第１のポリペプチドは、配列番号２で定義された配列と少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するか、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２３４、２３５及び２３６に対応する位置のアミノ酸残基は、それぞれＦ、Ｅ及びＲであり、
及び
当該第２のポリペプチドは、配列番号３で定義された配列と少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するか、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２３４、２３５及び２６５に対応する位置のアミノ酸残基は、それぞれＦ、Ｅ及びＡであり、
アミノ酸番号はＥｕナンバリングによって定義される通りである。

【0118】

なお更なる実施形態では、本発明に従って提供されるタンパク質又は二重特異性抗体は、第１及び第２のポリペプチドを含み、ここで、
当該第１のポリペプチドは、配列番号１１で定義される配列と少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するか、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２３４、２３５及び２３６に対応する位置のアミノ酸残基はそれぞれＦ、Ｅ及びＲであり、４０５に対応する位置のアミノ酸残基はＬであり、
及び
当該第２のポリペプチドは、配列番号１２で定義される配列と少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するか、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２３４、２３５及び２３６に対応する位置のアミノ酸残基はそれぞれＦ、Ｅ及びＲであり、４０９に対応する位置のアミノ酸残基はＲであり、
アミノ酸番号はＥｕナンバリングによって定義される通りである。

【0119】

なお更なる実施形態では、本発明に従って提供されるタンパク質又は二重特異性抗体は、第１及び第２のポリペプチドを含み、ここで、
当該第１のポリペプチドは、配列番号１２で定義される配列と少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するか、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２３４、２３５及び２３６に対応する位置のアミノ酸残基はそれぞれＦ、Ｅ及びＲであり、４０９に対応する位置のアミノ酸残基はＲであり、
及び
当該第２のポリペプチドは、配列番号１３で定義される配列と少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するか、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２３４、２３５及び２３６に対応する位置のアミノ酸残基はそれぞれＦ、Ｅ及びＡであり、４０５に対応する位置のアミノ酸残基はＬであり、
アミノ酸番号はＥｕナンバリングによって定義される通りである。

【0120】

なお更なる実施形態では、本発明に従って提供されるタンパク質又は二重特異性抗体は、第１及び第２のポリペプチドを含み、ここで、
当該第１のポリペプチドは、配列番号１１で定義される配列と少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するか、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２３４、２３５及び２３６に対応する位置のアミノ酸残基はそれぞれＦ、Ｅ及びＲであり、４０５に対応する位置のアミノ酸残基はＬであり、
及び
当該第２のポリペプチドは、配列番号１４で定義される配列と少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するか、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２３４、２３５及び２６５に対応する位置のアミノ酸残基はそれぞれＦ、Ｅ及びＡであり、４０９に対応する位置のアミノ酸残基はＲであり、
アミノ酸番号はＥｕナンバリングによって定義される通りである。

【0121】

本明細書において配列番号２として特定される配列は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６がＦ、Ｅ及びＲで置換されたヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ（ｆ）のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のＦ、Ｅ及びＲによる当該置換をヒンジ内で行ったヒトＩｇＧ１の他のアロタイプの定常領域（それぞれＣＨ１領域を含む）の対応する配列、そのＣＨ２及びＣＨ３領域配列は、配列番号２７（ＦＥＲ置換を有するヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ（ｆａ）のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域）、配列番号２９（ＦＥＲ置換を有するヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ（ｚａ）のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域）、配列番号３１（ＦＥＲ置換を有するヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ（ｚａｖ）のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域）、配列番号３３（ＦＥＲ置換を有するヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ（ｚａｘ）のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域）として提供される。別の実施形態では、本明細書で定義される当該第１又は第２のポリペプチドをコードする核酸が提供され、当該第１及び第２のポリペプチドの両方は、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６に対応するアミノ酸の当該置換を含み、最も好ましくは、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６の当該置換は、それぞれＦ、Ｅ及びＲである。別の更なる実施形態では、本明細書で定義される当該第１又は第２のポリペプチドをコードする核酸が提供され、当該第１又は第２のポリペプチドは、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６に対応するアミノ酸の当該置換を含み、好ましくは、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６の当該置換は、それぞれＦ、Ｅ及びＲである。

【0122】

一実施形態では、第１又は第２のポリペプチドをコードする核酸が提供され、当該第１又は第２のポリペプチドは、配列番号２、１１、又は１２によって定義されるアミノ酸配列を含む。そのような核酸は、ヒンジ領域に隣接するＣＨ１領域、例えば配列番号４によって定義されるＣＨ１領域を含むポリペプチドを更にコードし得る。好ましくは、当該核酸は免疫グロブリン重鎖をコードする。最も好ましくは、ヒト免疫グロブリン可変領域又はヒト化免疫グロブリン可変領域を含むそのような免疫グロブリン重鎖。第１又は第２のポリペプチドをコードするそのような核酸は、コード配列から末端リジンが欠失していてもよい。これらの核酸は、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸等と組み合わせてもよい。

【0123】

一実施形態では、非活性化Ｆｃ領域を有する本発明によるタンパク質を産生するための構築物を提供する方法であり、当該タンパク質は、配列番号１に定義されるようなヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域等を含むＦｃ領域を有する第１及び第２のポリペプチドを含み、当該方法は、
ａ）ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む第１及び／又は第２のポリペプチド配列をコードする核酸配列を含む、第１及び／又は第２のポリペプチドの発現のための１又は複数の構築物を提供する工程と、
ｂ）ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域においてアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６に対応するアミノ酸をコードする当該核酸配列を、これらがそれぞれＦ、Ｅ及びＲをコードするように修飾する工程と、
ｃ）それにより、非活性化Ｆｃ領域を有するタンパク質を産生するための１又は複数の構築物を提供する工程と、
を含む。

【0124】

別の実施形態では、非活性化Ｆｃ領域を有するタンパク質を産生するための構築物を提供する方法であり、当該タンパク質は、配列番号１に定義されるもの等のヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＦｃ領域を有する第１及び第２のポリペプチドを含み、当該方法は、
ａ）配列番号１に定義されるもの等のヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域をコードする核酸配列を提供する工程と、
ｂ）ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域においてアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６に対応するアミノ酸をコードする当該核酸配列を、これらがそれぞれＦ、Ｅ及びＲをコードするように修飾する工程と、
ｃ）本発明によるタンパク質の第１及び／又は第２のポリペプチドの発現のための工程ｂ）で得られた修飾配列を使用して構築物を作製する工程であって、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域内のアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６がそれぞれＦ、Ｅ及びＲをコードするように修飾されている、当該第１及び／又は第２のポリペプチドをコードする核酸配列を含み、それにより、非活性化Ｆｃ領域を有する本発明によるタンパク質を産生するための構築物を提供する、工程と、
を含む。

【0125】

更なる実施形態では、非活性化Ｆｃ領域を有する抗体を産生するための構築物を提供する方法が提供され、当該抗体が、配列番号１に定義されるヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域等を含むＦｃ領域を有する重鎖を含み、当該方法は、
ａ）ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む抗体の重鎖配列をコードする核酸配列を含む抗体の重鎖の発現のための構築物を提供する工程と、
ｂ）ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域のアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６に対応するアミノ酸をコードする当該核酸配列を、これらがそれぞれＦ、Ｅ及びＲをコードするように修飾する工程と、
ｃ）それにより、非活性化Ｆｃ領域を有する抗体を産生するための構築物を提供する工程と、
を含む。

【0126】

なお他の実施形態では、非活性化Ｆｃ領域を有する抗体を産生するための構築物を提供する方法が提供され、当該抗体が、配列番号１に定義されるヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域等を含むＦｃ領域を有する重鎖を含み、当該方法は、
ａ）配列番号１に定義されるようなヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域をコードする核酸配列を提供する工程と、
ｂ）ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域のアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６に対応するアミノ酸をコードする当該核酸配列を、これらがそれぞれＦ、Ｅ及びＲをコードするように修飾する工程と、
ｃ）ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む抗体の重鎖配列をコードする核酸配列を含む抗体の重鎖の発現のために工程ｂ）で得られた修飾配列を使用して構築物を作製する工程であって、前記ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域は、それぞれＦ、Ｅ及びＲをコードするように修飾されたアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６を有し、それにより、非活性化Ｆｃ領域を有する抗体を作製するための構築物を提供する工程と、
を含む。

【0127】

上記の構築物を提供する方法では、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＦｃ領域を有するポリペプチド又は重鎖は、本発明に従って本明細書で定義されるような、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む任意のそのようなＦｃ領域であり得ることが理解される。そのような方法は、ＦＥＲ置換を導入することによって抗体の安全性プロファイルを改善するため、又はＦｃ媒介性エフェクター機能を抑制するために特に有用である。そのような方法は、当該ＦＥＲ置換を導入することによって、タンパク質、抗体等の安全性プロファイルを改善するために有用である。そのような方法はまた、ＦＥＲ置換を導入することによって、タンパク質又は抗体等のＦｃ媒介性エフェクター機能を抑制するのに有用である。そのような方法は、ＦＥＲ置換を導入することによって、安全性プロファイルを改善し、タンパク質、抗体等のＦｃ媒介性エフェクター機能を抑制するのに特に有用である。当該方法により、本発明に従って、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＦｃ領域を有するタンパク質を得るための核酸を提供することができる。

【0128】

そのような核酸は、本発明によるタンパク質、例えば、本明細書で定義される本発明による第１及び第２のポリペプチドを含む重鎖及び軽鎖を含む抗体を産生するのに特に有用である。そのような抗体は、単一特異性抗体又は二重特異性抗体であり得る。したがって、別の態様では、例えば抗体の配列をコードする発現ベクターに使用するための、本発明による当該第１又は第２のポリペプチドをコードする核酸が提供される。したがって、抗体を産生し得るハイブリドーマを含むそのような発現ベクターを含む宿主細胞、及びそのような宿主細胞又はハイブリドーマを適切な条件下で培養することによってそのような抗体を産生し、それによって抗体等の本発明によるタンパク質が産生され、回収されていてもよい、方法が提供される。

【0129】

したがって、宿主細胞は、本発明に従って核酸を提供され得、当該核酸は、例えば、実施例の節等に記載されるような発現ベクターに組み込まれる。本発明の文脈における発現ベクターは、染色体、非染色体及び合成核酸ベクター（適切な発現制御エレメントのセットを含む核酸配列）を含む任意の適切なベクターであり得る。そのようなベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせに由来するベクター、及びウイルス又は非ウイルス核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ベクターが挙げられる。一実施形態では、抗体コード核酸は、例えば、線状発現エレメント（例えばＳｙｋｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７，３５５－５９（１９９７）に記載されているように）、圧縮核酸ベクター（例えば、米国特許第６，０７７，８３５号及び／又は国際公開第００／７００８７号に記載されているように）、ｐｃＤＮＡ３．３（本明細書に記載）、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８、若しくはｐＵＣ１１８／１１９等のプラスミドベクター、「中間部」最小サイズの核酸ベクター（例えばＳｃｈａｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ３，７９３－８００（２００１）に記載されているように）を含む裸のＤＮＡ若しくはＲＮＡベクターに、又はＣａＰＯ_４ ^－沈殿構築物（例えばＷＯ００／４６１４７，Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｈｅｆ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３，９５５１－５５（１９８６），Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４，７２５（１９７８），ａｎｄ Ｃｏｒａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７，６０３（１９８１）に記載されているように）等の沈殿核酸ベクター構築物として含まれる。そのような核酸ベクター及びその使用法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，５８９，４６６号明細書及び米国特許第５，９７３，９７２号明細書を参照）。

【0130】

一実施形態では、ベクターは細菌細胞における発現に適している。そのようなベクターの例としては、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，５５０３－５５０９（１９８９））、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）等の発現ベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、又は代替において、酵母系における発現に適したベクターであり得る。酵母系での発現に適した任意のベクターを使用することができる。適切なベクターとしては、例えば、α因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨ等の構成的プロモーター又は誘導性プロモーターを含むベクターが挙げられる（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７），ａｎｄ Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３，５１６－５４４（１９８７）に概説される）。

【0131】

核酸及び／又はベクターはまた、新生ポリペプチド鎖等のポリペプチドをペリプラズム空間又は細胞培養培地に標的化することができる分泌／局在化配列をコードする核酸配列を含み得る。そのような配列は当技術分野で公知であり、分泌リーダー又はシグナルペプチド、オルガネラ標的化配列（例えば、核局在化配列、ＥＲ保持シグナル、ミトコンドリア移行配列、葉緑体移行配列）、膜局在化／アンカー配列（例えば、転送配列の停止、ＧＰＩアンカー配列）等を含む。

【0132】

本発明の発現ベクターにおいて、本発明による核酸は、任意の適切なプロモーター、エンハンサー、及び他の発現促進エレメントを含むか、又はそれらと会合し得る。そのような要素の例としては、強力な発現プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサー並びにＲＳＶ、ＳＶ４０、ＳＬ３－３、ＭＭＴＶ及びＨＩＶ ＬＴＲプロモーター）、有効なポリ（Ａ）終結配列、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミド産物の複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、及び／又は簡便なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）が挙げられる。核酸はまた、ＣＭＶ ＩＥ等の構成的プロモーターとは対照的に、誘導性プロモーターを含み得る（当業者は、そのような用語が特定の条件下での遺伝子発現の程度の実際の記述子であることを認識するであろう）。

【0133】

したがって、本発明による抗体をコードする核酸配列を含む宿主細胞が提供され、当該抗体は、それぞれヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖の少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖であって、それぞれ位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸のＦ、Ｅ及びＲでの置換を含む免疫グロブリン重鎖と、免疫グロブリン軽鎖とを含む。そのような宿主細胞は、本明細書に記載されるような、当該第１及び第２のポリペプチドを含む２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖とを有する単一特異性抗体の製造に特に有用であり得る。特に、重鎖の配列が異なり、アームの交換を可能にするそのような抗体のうちの２つが提供される場合、例えば、実施例の節において記載されるように、そのような２つの抗体は、二重特異性抗体の調製のために非常に有利に使用され得る。

【0134】

上記のように、二重特異性抗体の第１及び第２のポリペプチドの両方が、位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６においてＦ、Ｅ及びＲで同じ置換を有することは必要とされない場合がある。例えば、異なる置換を有していてもよい。これにより、二重特異性抗体が新しい製品として生成及び／又は開発され得る抗体の異なる組み合わせをスクリーニングするために、必ずしも毎回新しい構築物及び／又は細胞株を作成する必要はなく、それにより、かなりの時間及び労力が節約されるため、例えば二重特異性抗体の便利な製造が可能になる。

【0135】

したがって、１つの実施形態では、本発明による二重特異性抗体を調製する方法が提供され、方法は、
ａ）
ａ．位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６におけるアミノ酸の、それぞれＦ、Ｅ及びＲによる置換を含む、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖のそれぞれ少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖と、
ｂ．免疫グロブリン軽鎖と、
を含む、第１の抗体を提供することと、
ｂ）
ａ．ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖のそれぞれ少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖であって、
－位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５におけるアミノ酸の置換であって、好ましくは当該置換はそれぞれＦ、Ｅ、及びＡである、アミノ酸の置換
又は、
－位置Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６のアミノ酸の、それぞれＦ、Ｅ及びＲによる置換
を含む、免疫グロブリン重鎖と、
ｂ．免疫グロブリン軽鎖と、
を含む、第２の抗体を提供することと、
ｃ）ここで、当該それぞれの第１及び第２の抗体の当該第１及び第２のＣＨ３領域の配列は異なり、当該第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が当該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用のそれぞれよりも強くなり、
ｄ）ヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合異性化を受けるのを可能にするのに十分な還元条件下で、当該第１の抗体を当該第２の抗体と一緒にインキュベートすることと、
ｅ）当該第１の抗体の当該第１の免疫グロブリン重鎖及び当該第１の免疫グロブリン軽鎖と、当該第２の抗体の当該第２の免疫グロブリン重鎖及び当該第２の免疫グロブリン軽鎖とを含む当該二重特異性抗体を得ることと、
を含む。

【0136】

更なる実施形態では、二重特異性抗体の代わりに、多重特異性抗体を産生することができる。

【0137】

工程ａ）及びｂ）で提供される第１及び第２の抗体は、好ましくは単一特異性抗体であることが理解される。より好ましくは、当該単一特異性抗体は完全長抗体である。最も好ましくは、当該抗体は、ヒト又はヒト化可変領域を含み、本明細書で定義される置換を含むヒト定常領域を有する。上記の方法に非常に適した例示的な第１及び第２の抗体は、それぞれ配列番号１１及び１２、１１及び１４、又は１２及び１３で定義されるアミノ酸配列を含む第１及び第２の抗体である。二重特異性抗体を調製するそのような方法は、とりわけ本明細書の実施例に記載されており、（Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｏｃｔ；９（１０）：２４５０－６３）にも十分に記載されている。当然のことながら、本明細書に記載されるような他の適切な違いが工程ｃ）において企図され得る。

【0138】

医薬組成物
一態様では、本発明は、本明細書に記載の態様及び実施形態のいずれかで定義される抗体等のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

【0139】

医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に開示されているもの等の従来の技術に従って、薬学的に許容される担体又は希釈剤並びに任意の他の既知のアジュバント及び賦形剤と共に製剤化され得る。

【0140】

薬学的に許容される担体又は希釈剤、並びに任意の他の既知のアジュバント及び賦形剤は、本発明のタンパク質、バリアント又は抗体及び選択された投与様式に適しているべきである。医薬組成物の担体及び他の成分の適合性は、抗原結合に対する本発明の選択された化合物又は医薬組成物（例えば、実質的な衝撃未満（１０％以下の相対阻害、５％以下の相対阻害等））の所望の生物学的特性に対する有意な悪影響の欠如に基づいて決定される。

【0141】

本発明の医薬組成物はまた、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０又はＴｗｅｅｎ－８０等の非イオン性洗剤）、安定剤（例えば、糖又はタンパク質を含まないアミノ酸）、保存剤、組織固定剤、可溶化剤、及び／又は医薬組成物に含めるのに適した他の材料を含み得る。

【0142】

本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に有毒になることなく、特定の患者、組成物、及び投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化させることができる。選択される投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物又はそのアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態及び以前の病歴、並びに医学分野で周知の同様の因子を含む様々な薬物動態学的因子に依存する。

【0143】

医薬組成物は、任意の適切な経路及び様式によって投与され得る。本発明のタンパク質、バリアント又は抗体をインビボ及びインビトロで投与する適切な経路は、当技術分野で周知であり、当業者によって選択され得る。

【0144】

一実施形態では、本発明の医薬組成物は非経口投与される。

【0145】

本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という語句は、通常は注射による経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、表皮、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外及び胸骨内の注射及び注入を含む。

【0146】

一実施形態では、その医薬組成物は、静脈内又は皮下注射又は注入によって投与される。

【0147】

注射用の医薬組成物は、典型的には、製造及び貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適した他の秩序構造として製剤化され得る。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルを含有する水性又は非水性溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウム等の多価アルコールを組成物に含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る。滅菌注射溶液は、必要に応じて、例えば上に列挙した成分の１つ又は組み合わせを含む適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、続いて滅菌精密濾過することによって調製され得る。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体及び例えば上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法の例は、真空乾燥及び凍結乾燥（凍結乾燥）であり、これにより、活性成分＋任意の更なる所望の成分の粉末が、以前に滅菌濾過されたその溶液から得られる。

【0148】

滅菌注射液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙した成分の１つ又は組合せと共に適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌精密濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法の例は、真空乾燥及び凍結乾燥（凍結乾燥）であり、これにより、活性成分＋任意の更なる所望の成分の粉末が、以前に滅菌濾過されたその溶液から得られる。

【0149】

治療用途
別の態様では、本発明は、医薬品として使用するための、本明細書に記載の任意の態様又は実施形態で定義されるタンパク質、例えば抗体、又は本発明の医薬組成物に関する。

【0150】

別の態様では、本発明は、疾患の治療に使用するための、本明細書に記載の任意の態様又は実施形態で定義されるタンパク質、例えば抗体、又は本発明の医薬組成物に関する。

【0151】

更なる態様では、疾患の当該治療は、癌、感染性疾患、炎症性疾患、又は自己免疫疾患の治療を含む。別の態様では、本発明は、疾患が癌である使用に関する。そのような使用がヒトにおける使用を含むことが非常に好ましいことが理解される。

【0152】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の態様又は実施形態で定義される本発明のタンパク質、例えば抗体又は医薬組成物をヒト対象に投与することを含む治療方法に関する。

【0153】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の態様又は実施形態で定義される本発明のタンパク質、例えば抗体又は医薬組成物を、疾患に罹患しているヒト対象に投与することを含む治療方法に関する。更なる態様では、当該疾患は、癌、炎症性、感染性疾患又は自己免疫疾患を含む。別の態様では、当該疾患は癌である。

【0154】

本発明のタンパク質、バリアント、抗体又は医薬組成物は、野生型抗体に見られるような抗体ＩｇＧ１Ｆｃ領域の免疫エフェクター機能が望ましくない場合に治療と同様に使用することができる。例えば、タンパク質、バリアント又は抗体は、癌、感染症、炎症性又は自己免疫障害等の障害を治療又は予防するために、培養中の細胞、例えばインビトロ又はエクスビボに、又はヒト対象、例えばインビボに投与され得る。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、典型的には、タンパク質、バリアント、抗体、又は医薬組成物に応答するヒトである。対象には、例えば、直接的又は間接的に、標的機能を調節することによって、又は細胞の死滅をもたらすことによって修正又は改善され得る障害を有するヒト患者が含まれ得る。

【0155】

別の態様では、本発明は、Ｔ細胞の動員が治療又は予防に寄与する、癌等の障害を治療又は予防する方法を提供し、この方法は、治療有効量の本発明のタンパク質、バリアント、抗体又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。例えば、本発明によるそのようなタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞、例えばＣＤ３及び癌抗原を標的とする二重特異性抗体と係合することができる。腫瘍特異的標的を過剰発現する細胞は、タンパク質、バリアント又は抗体の２つの結合領域のうちの１つによるＴ細胞の動員がＴ細胞の細胞傷害活性を引き起こすことができるので、本発明のそのようなタンパク質、バリアント又は抗体にとって特に良好な標的である。細胞傷害活性の誘発は癌細胞の排除において適切に機能しない可能性があるので、この機構を得ることは通常困難である。

【0156】

別の態様では、本明細書に記載されるような本発明による抗体及び二重特異性抗体を含むタンパク質は、別の分子にコンジュゲートされる。このようなタンパク質は、タンパク質又は抗体若しくはその断片のＮ末端側又はＣ末端側に他の分子を化学的に結合させることにより製造することができる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｏｓａｍｕ Ｋａｎｅｍｉｔｓｕ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｃｈｉｊｉｎ Ｓｈｏｋａｎ（１９９４）を参照のこと）。そのようなコンジュゲート化抗体誘導体はまた、必要に応じて、内部残基又は糖におけるコンジュゲーションによって生成され得る。好ましい態様では、本発明による抗体及び二重特異性抗体を含むタンパク質は、治療分子にコンジュゲートされる。適切な治療用分子には、例えば、アプタマー、リボザイム、アンチセンス分子、又はＲＮＡｉ誘導剤等の核酸が含まれ得る。企図され得る他の治療分子としては、細胞毒、化学療法薬、免疫抑制剤又は放射性同位体が挙げられる。そのようなコンジュゲートは、免疫コンジュゲートと呼ばれ得る。１又は複数の細胞毒素を含む免疫抱合体は、免疫毒素と呼ぶことができる。

【0157】

本発明の免疫抱合体を形成するのに適した治療分子としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５－フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチン及び他の白金誘導体、例えばカルボプラチン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ））、ジフテリア毒素及び関連分子（例えばジフテリアＡ鎖及びその活性断片及びハイブリッド分子）、リシン毒素（例えばリシンＡ又は脱グリコシル化リシンＡ鎖毒素）、コレラ毒素、志賀様毒素（ＳＬＴ Ｉ、ＳＬＴ ＩＩ、ＳＬＴ ＩＩＶ）、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆Ｂｏｗｍａｎ－Ｂｉｒｋプロテアーゼ阻害剤、シュードモナス外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ゼラチン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、又はエノマイシン毒素が挙げられ得る。

【0158】

方法は、典型的には、障害を治療又は予防するのに有効な量のタンパク質、バリアント又は抗体を対象に投与することを含む。

【0159】

タンパク質、バリアント又は抗体の効率的な投与量及び投与レジメンは、治療される疾患又は状態に依存し、当業者によって決定され得る。

【0160】

例えば、治療的使用のための「有効量」は、疾患の進行を安定化させるその能力によって測定され得る。癌を阻害する化合物の能力は、例えば、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価され得る。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に公知のインビトロアッセイによって、細胞増殖を阻害するか、又は細胞傷害性を誘導するタンパク質、バリアント又は抗体の能力を調べることによって評価され得る。治療化合物、すなわち本発明による治療用タンパク質、バリアント、抗体又は医薬組成物の治療有効量は、対象の腫瘍サイズを減少させるか、そうでなければ症状を改善し得る。

【0161】

一実施形態では、タンパク質、抗体又はバリアントは、維持療法によって、例えば、定義された期間にわたって一定の間隔で、又は疾患進行まで投与され得る。タンパク質、抗体又はバリアントはまた、癌を発症するリスクを低下させるため、癌の進行における事象の発生を遅延させるため、及び／又は癌が寛解状態にあるときに再発のリスクを低下させるために予防的に投与され得る。

【0162】

タンパク質、バリアント、抗体、又は抗体はまた、癌を発症するリスクを低下させるため、癌の進行における事象の発生を遅延させるため、及び／又は癌が寛解状態にあるときに再発のリスクを低下させるために予防的に投与され得る。

【0163】

診断アプリケーション
本発明の非活性化タンパク質はまた、本明細書に記載のタンパク質を含む組成物を使用して、診断目的に有用であり得る。したがって、本発明は、本明細書に記載のタンパク質を使用する診断方法及び組成物を提供する。そのような方法及び組成物は、純粋に診断目的、例えば、疾患の検出又は同定、並びに治療的治療の進行のモニタリング、疾患進行のモニタリング、治療後の状態の評価、疾患の再発のモニタリング、疾患発症のリスクの評価等に使用することができる。本発明に従ってそのようなタンパク質を使用することにより、これは、例えば、診断用途に干渉し得るＦｃ領域によって及ぼされる任意の望ましくない効果を回避することを可能にする。

【0164】

一態様では、本発明のタンパク質は、患者から採取された試料中の細胞表面上の目的の標的又は目的の標的を発現する細胞のレベルを検出することによって、目的の特定の標的を発現し、タンパク質が結合する細胞が疾患を示すか、又は発病に関与する、疾患を診断する等、エクスビボで使用される。これは、例えば、標的へのタンパク質の結合を可能にする条件下で、試験される試料を、場合により対照試料と共に、本発明によるタンパク質と接触させることによって達成され得る。次いで、複合体形成を検出することができる（例えば、ＥＬＩＳＡを使用すること）。試験試料と共に対照試料を使用する場合、タンパク質又はタンパク質－標的複合体のレベルは両方の試料で分析され、試験試料中の統計的に有意な高レベルのタンパク質又はタンパク質－標的複合体は、対照試料と比較して試験試料中の標的の高レベルを示す。

【0165】

本発明のタンパク質を使用することができる従来のイムノアッセイの例としては、限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳアッセイ、プラズモン共鳴アッセイ、クロマトグラフィーアッセイ、組織免疫組織化学、ウエスタンブロット及び／又は免疫沈降が挙げられる。

【0166】

一実施形態では、本発明は、試料中の標的又は標的を発現する細胞の存在を検出する方法であって、
－試料中の標的へのタンパク質の結合を可能にする条件下で、試料を本発明のタンパク質と接触させることと、
－複合体が形成されているかどうかを分析することと、
を含む。典型的には、試料は生物学的試料である。

【0167】

一実施形態では、試料は、特定の標的及び／又は標的を発現する細胞を含有することが知られている又は疑われる組織試料である。例えば、標的発現のｉｎ ｓｉｔｕ検出は、患者から組織学的検体を取り出し、そのような検体に本発明のタンパク質を提供することによって達成され得る。タンパク質は、タンパク質を検体に適用することによって、又はタンパク質を検体に重ねることによって提供することができ、次いで、適切な手段を使用して検出される。次いで、標的又は標的発現細胞の存在だけでなく、試験された組織中の標的又は標的発現細胞の分布も決定することが可能である（例えば、癌細胞の広がりを評価することの関連において）。本発明を使用すると、当業者は、そのようなｉｎ ｓｉｔｕ検出を達成するために、多種多様な組織学的方法（染色手順等）のいずれかが変更され得ることを容易に認識するであろう。

【0168】

上記のアッセイでは、タンパク質を検出可能な物質で標識して、結合したタンパク質を検出することができる。あるいは、結合した（一次）特異的タンパク質は、検出可能な物質で標識され、一次特異的タンパク質に結合する抗体によって検出され得る。

【0169】

試料中の標的のレベルは、検出可能な物質及び標識されていない標的特異的タンパク質で標識された標的標準を利用する競合免疫アッセイによって推定することもできる。この種のアッセイでは、生物学的試料、（１又は複数の）標識標的標準及び標的特異的タンパク質を組み合わせ、非標識標的特異的タンパク質に結合した標識標的標準の量を決定する。生体試料中の標的の量は、標的特異的タンパク質に結合した標識標的標準物の量に反比例する。

【0170】

インビトロ診断技術で使用される標的特異的タンパク質、二次抗体及び／又は標的標準に適した標識としては、限定されないが、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質及び放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル及びフィコエリトリンが挙げられ；発光材料としては、例えば、ルミノールが挙げられ；適切な放射性物質の例には、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、及び^３Ｈが挙げられる。

【0171】

一実施形態では、本発明は、本発明の標的特異的タンパク質を検出促進放射線不透過剤にコンジュゲートさせ、コンジュゲートさせたタンパク質を、例えば血流への注射によって宿主に投与し、宿主中の標識タンパク質の存在及び位置をアッセイするインビボイメージング方法を提供する。本明細書で提供されるこの技術及び任意の他の診断方法を通して、本発明は、ヒト患者又はヒト患者から採取された生物学的試料における疾患関連細胞の存在についてスクリーニングするための、及び／又は標的特異的ＡＤＣ療法の前に標的特異的タンパク質の分布を評価するための方法を提供する。

【0172】

画像診断のために、放射性同位体は、中間官能基を使用することによって直接的又は間接的に標的－特異性タンパク質に結合され得る。有用な中間官能基としては、キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸及びジエチレントリアミン五酢酸が挙げられる（例えば、米国特許第５，０５７，３１３号明細書参照）。

【0173】

放射性同位元素及び放射線不透過剤に加えて、診断方法は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）（例えば、ＭＲＩ技術及びＭＲＩ増強剤にコンジュゲートされたタンパク質の調製を記載している、米国特許第６，３３１，１７５号明細書を参照されたい）のための色素（ビオチン－ストレプトアビジン複合体等）、造影剤、蛍光化合物又は分子及び増強剤（例えば常磁性イオン）にコンジュゲートされた標的特異的タンパク質を使用して実施され得る。そのような診断／検出剤は、ＭＲＩで使用するための薬剤及び蛍光化合物から選択することができる。したがって、本発明は、診断標的特異的タンパク質を提供し、標的特異的タンパク質は、例えば、ガンマ、ベータ、アルファ、オージェ電子又は陽電子放出同位体であり得る造影剤（例えば、磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影法、又は超音波造影剤のために）又は放射性核種にコンジュゲートされる。

【0174】

更なる態様では、本発明は、試料中の標的抗原又は標的を発現する細胞の存在を検出するためのキットであって、
－本発明の標的特異的抗体と、
－キットの使用説明書と、
を含むキットに関する。

【0175】

一実施形態では、本発明は、標的特異的タンパク質を含む容器と、標的への標的特異的タンパク質の結合を検出するための１又は複数の試薬とを含む、癌を診断するためのキットを提供する。試薬は、例えば、蛍光タグ、酵素タグ、又は他の検出可能なタグを含み得る。試薬はまた、酵素反応のための二次又は三次抗体又は試薬を含むことができ、酵素反応は可視化され得る生成物を生成する。一実施形態では、本発明は、標識の性質に応じて、適切な（１又は複数の）容器内の標識形態又は非標識形態の本発明の１又は複数の標的特異的タンパク質、間接的アッセイのためのインキュベーションのための試薬、及びそのようなアッセイにおける検出のための基質又は誘導体化剤を含む診断キットを提供する。（１又は複数の）対照試薬及び使用説明書も含まれ得る。

【0176】

診断キットはまた、組織試料又は宿主中の標的の存在を検出するために、標識された標的特異的タンパク質等の標的特異的タンパク質と共に使用するために供給され得る。そのような診断キットにおいて、同様にまた、本明細書中の他の箇所に記載される治療的使用のためのキットにおいて、標的特異的タンパク質は、典型的には、単独で、又は、標的細胞若しくはペプチドに特異的な更なる抗体と併せて、容器において凍結乾燥形態で提供される場合がある。典型的には、薬学的に許容される担体（例えば、不活性希釈剤）及び／又はその成分、例えば、トリス、ホスファート若しくはカルボナート緩衝液、安定剤、保存剤、殺生物剤、不活性タンパク質、例えば、血清アルブミン等（典型的には、混合のための別個の容器に含まれる）並びに追加の試薬（また典型的には、（１又は複数の）別個の容器において）も含まれる。特定のキットには、典型的には別個の容器に存在する標的特異的タンパク質に結合することができる二次抗体も含まれる。第２の抗体は、典型的には、標識にコンジュゲートされ、本発明の標的特異的タンパク質と同様の様式で製剤化される。上記及び本明細書の他の箇所に記載される方法を使用して、標的特異的タンパク質を使用して、癌／腫瘍細胞のサブセットを定義し、そのような細胞及び関連腫瘍組織を特徴付けることができる。

【表3】

［実施例］
序論
野生型ＩｇＧ１として補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）の誘導に非常に効率的であるＩｇＧ１アイソタイプの抗体においてＦＥＡ不活性フォーマット（Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ）を利用すると、ＣＤＣ活性が強く抑制される。しかしながら、調査実験では、ＦＥＡ置換を有するＩｇＧ１抗体は、低い残留ＣＤＣ活性を依然として保持することが時折示されたが、これは、想定される治療抗体の有害作用又は用量制限毒性がＣＤＣ等のＦｃ媒介性エフェクター機能に非常に依存し得る場合には望ましくない場合がある。更に、本発明者らはまた、野生型様フォーマットと比較して、グリコシル化不均一性がＦＥＡ不活性フォーマットを有する抗体で増加し、ガラクトシル化及び荷電グリカンの存在が増加することも観察した。グリコシル化プロファイルの変化は、有効性及び薬物動態特性に影響を及ぼす可能性があり、これは製造において監視及び制御される必要がある。ＦＥＡ不活性フォーマットを含む抗体のグリカンプロフィールを評価すると、グリコシル化不均一性の増加、ガラクトシル化レベルの増加、及び荷電グリカンレベルの増加をＤ２６５Ａ置換に割り当てることができることが観察された。ＦＥＡの可能性のある残留ＣＤＣ活性を考慮して、及びＦＥＡのグリコシル化プロファイルを考慮して、本発明者らは改善された形式を提供しようと努めた。

【0177】

改善を求めて、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＧ２３６Ｒ置換を組み合わせることが企図された。しかしながら、特定の突然変異の任意の選択は言うまでもなく、任意の突然変異を組み合わせることは本質的に予測不可能である。更に、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＧ２３６Ｒ変異を組み合わせること、すなわち、多数の修飾が一緒に詰め込まれることは、そのような多数の変化の構造的及び／又は機能的影響を予測することができないので、容易ではない。したがって、本発明者らは、パイロット実験において、組合せＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＧ２３６Ｒ（ＦＥＲ）がＣＤＣをサイレンシングする能力並びに抗体のグリコシル化プロファイルに及ぼす影響を試験した。驚くべきことに、これらの初期実験は、ＦＥＲ変異の導入によるＣＤＣをサイレンシングする能力が、個々の置換と比較して、及びＦＥＡ置換と比較して非常に改善されたことを示した。更に、グリコシル化プロファイルの評価により、現在ＦＥＲ不活性フォーマットを有する抗体が、対応する野生型様抗体に類似するグリカンプロファイルを有することが明らかになった。したがって、これらの初期実験は、以下の実施例に記載されるＦＥＲ不活性フォーマットの臨床的適合性を完全に分析するように促した。驚くべきことに、試験した全ての特徴において、ＦＥＡ不活性フォーマットと比較した場合、並びに他の不活性フォーマットと比較した場合、ＦＥＲ不活性フォーマットについて非常に有利な特性が観察された。これは、新しいＦＥＲフォーマットが臨床開発及び臨床使用に十分に適していることを示している。例えば融合タンパク質等の抗体以外の状況でも有用であり得るこの非活性化フォーマットは、非常に有利であり、クラス最高の非活性化フォーマットであると見なすことができる。

【0178】

［実施例１］
抗体バリアントの作製及び精製並びに二重特異性抗体バリアントの作製
抗体の発現構築物
ヒト又はヒト化結合ドメインを有する抗体の発現のために、可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖ドメインの配列を含む抗体構築物を、デノボ遺伝子合成（ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製し、選択された結合ドメインに適切な、ヒトＩｇＧ１ｍ（ｆ）アロタイプ（本出願の実施例セクションを通してＩｇＧ１とも呼ばれる；配列番号５）、又はヒトＩｇＧ１ｍ（ｆａ）アロタイプ（配列番号２３）、又はヒトＩｇＧ１ｍ（ｚａ）アロタイプ（配列番号２４）、又はヒトＩｇＧ１ｍ（ｚａｘ）アロタイプ（配列番号２５）、又はヒトＩｇＧ１ｍ（ｚａｖ）アロタイプ（配列番号２６）、又はＣ末端リジンの組換え欠失を有するヒトＩｇＧ１ｍ（ｆ）アロタイプ（ＩｇＧ１－ｄｅｌＫともいう；配列番号３５）、又はそのバリアント；ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、配列番号８；ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、配列番号４６）又はそのバリアントのヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（すなわち、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域）；ヒトＩｇＧ３アロタイプＩＧＨＧ３＊０１（配列番号４０）若しくはヒトＩｇＧ３アロタイプＩＧＨＧ３＊０４（ＩｇＧ３ｒｃｈ２とも呼ばれる；配列番号４１）のヒトＩｇＧ３重鎖定常領域、又はそのバリアント；マウスＩｇＧ２ａ重鎖定常領域（配列番号３８）又はそのバリアント；又はヒトκ軽鎖（配列番号６）、又はヒトλＬＣ（配列番号７）、又はマウスκＬＣ（配列番号４９）の定常領域を含有するｐｃＤＮＡ３．３発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）にクローニングした。バリアントを生成するための所望の置換を遺伝子合成によって導入し、以下に記載する。本出願におけるＣＤ２０抗体バリアントは、以前に記載されたＩ型抗ヒトＣＤ２０抗体に由来するＶＨ及びＶＬ配列を有する（Ｅｎｇｅｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。本出願におけるＨＬＡ－ＤＲ抗体バリアントは、以前に記載されたＨＬＡ－ＤＲ抗体ＩｇＧ１－ＨＬＡ－ＤＲ－４（米国特許第６８９４１４９号明細書）及びＩｇＧ１－ＨＬＡ－ＤＲ－１Ｄ０９Ｃ３（米国特許第７５２１０４７号明細書）に由来するＶＨ及びＶＬ配列を有する。本出願におけるＣＤ３抗体及びそのバリアントは、以前に記載されたＣＤ３抗体（すなわち、ＣＤ３－ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４：Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１３ Ｍａｒ ２６；１１０（１３）：５１４５－５０，ａｎｄ Ｅｎｇｅｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）に由来するＶＨ及びＶＬ配列を有する。本出願におけるＨＥＲ２抗体バリアントは、ＩｇＧ１－ＨＥＲ２－１０１４－１６９（国際公開第２０１２１４３５２４号）に由来するＶＨ及びＶＬ配列を含む。ｂ１２のＶＨ／ＶＬを含むヒトＩｇＧ１抗体、すなわちＨＩＶ１ｇｐ１２０特異的抗体を、いくつかの実験において陰性対照として使用した（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９３ Ａｐｒ ５；２３０（３）：８１２－２）。

【0179】

非活性化抗体バリアント
Ｆ４０５Ｌ変異（配列番号９）又はＫ４０９Ｒ変異（配列番号１０）を有する野生型ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（すなわち、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域）又はその野生型様バリアントを、示されるように、コントロール抗体において使用する。いくつかの例では、ＩｇＧ４の定常領域を有する野生型抗体バリアント（配列番号８）又は配列番号８にＳ２２８Ｐ変異を有するそのＩｇＧ４バリアントを対照として使用する。

【0180】

非活性化Ｆｃドメインは、抗体が免疫細胞上に存在するＦｃ受容体又はＣ１ｑと相互作用して古典的補体経路を活性化するのを妨げる。以下の実施例において本明細書に記載されるように、いくつかの非活性化抗体バリアントを作製し、Ｆｃ機能をサイレンシングする能力について試験した。いくつかの例では、非活性化抗体バリアントのサブセットを薬物動態特性、免疫原性又は発生能について試験した。

【0181】

種々の非活性化抗体バリアントを、上で示され記載されるような異なるＶＨ配列及びＶＬ配列を用いて作製した。アミノ酸がＥｕナンバリングによって定義される通りである以下の置換を、二重特異性非活性化抗体バリアントの生成を可能にするために、配列番号１のＩｇＧ１ｍ（ｆ）ＨＣ領域に、同様にＦ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒ変異のいずれかと組み合わせて導入した：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（ｉ．ａ．米国特許第１０５９０２０６号明細書）単独（配列番号３）、又はＦ４０５Ｌ（配列番号１３）又はＫ４０９Ｒ（配列番号１４）と組み合わせて、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ単独（配列番号２）、又はＦ４０５Ｌ（配列番号１１）又はＫ４０９Ｒ（配列番号１２）と組み合わせて、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ（Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）単独、又はＦ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒ、Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ（ＵＳ２００６／０２３５２０８Ａ１、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＭＡｂｓ）のいずれかと組み合わせて、Ｆ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒのいずれかと組み合わせて、Ｆ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒのいずれかと組み合わせたＥ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－ｄｅｌＧ２３６－Ｓ２６７Ｋ（Ｍｏｏｒｅ ａｔ ａｌ．，２０１９，Ｍｅｔｈｏｄｓ）、Ｆ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒのいずれかと組み合わせたＮ２９７Ｇ（Ｔａｏ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８９，ＪＩ）、及びＦ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒのいずれかと組み合わせたＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ（ＵＳ８６１３９２６ｋ）。配列番号３５のＨＣ Ｃ末端リジン（ＩｇＧ１－ｄｅｌＫとも呼ばれる）を組換え欠失させたＩｇＧ１ｍ（ｆ）ＨＣ領域に以下の変異を導入した：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（配列番号３６）及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（配列番号３７）。以下の変異を配列番号２３のＩｇＧ１ｍ（ｆａ）ＨＣ領域に導入した：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（配列番号２７）及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（配列番号２８）。以下の変異を配列番号２４のＩｇＧ１ｍ（ｚａ）ＨＣ領域に導入した：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（配列番号２９）及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（配列番号３０）。以下の変異を配列番号２５のＩｇＧ１ｍ（ｚａｘ）ＨＣ領域に導入した：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（配列番号３３）及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（配列番号３４）。以下の変異を配列番号２６のＩｇＧ１ｍ（ｚａｖ）ＨＣ領域に導入した：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（配列番号３１）及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（配列番号３２）。以下の変異を配列番号４０のＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３＊０１）ＨＣ領域に導入した：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（配列番号４２）及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（配列番号４３）。以下の変異を配列番号４１のＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３＊０４；ＩｇＧ３ｒｃｈ２ともいう）ＨＣ領域に導入した：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（配列番号４４）及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（配列番号４５）。以下の変異を、単独で、又はＦ４０５Ｌ－Ｒ４０９Ｋ変異と組み合わせて、配列番号８のＩｇＧ４ＨＣ領域に導入して、二重特異性非活性化抗体バリアントの生成を可能にした：Ｓ２２８Ｐ－Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－ｄｅｌＧ２３６（ＷＯ２０１５／１４３０７９）、又はＦ４０５Ｌ－Ｒ４０９Ｋ、Ｓ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ（Ａｌｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９４，Ｊｕｎ １５；５７（１１）：１５３７－４３ ａｎｄ Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９３，Ｊａｎ；３０（１）：１０５－８）と組み合わせて、又はＦ４０５Ｌ－Ｒ４０９Ｋ、Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（配列番号４７）、及びＬ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（配列番号４８）と組み合わせて。以下の変異を配列番号３８のマウスＩｇＧ２ａＨＣ領域に導入した：配列番号３８：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（配列番号３９）、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ（Ａｒｄｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１５ Ｆｅｂ；６３（２）：４５６－６３）、及びＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１７ Ｍａｒ ３；２９２（９）：３９００－３９０８）。

【0182】

一過性発現
抗体をヒトＩｇＧ１κ、ＩｇＧ１λ、ＩｇＧ３κ、ＩｇＧ４κ、又はマウスＩｇＧ２ａκとして発現させた。抗体の重鎖及び軽鎖の両方をコードするプラスミドＤＮＡ混合物を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１４５２５）を製造者の説明書に従って使用してＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１４５２７）に一過性にトランスフェクトした。要するに、ＤＮＡ（１：１ ＨＣ／ＬＣ比）及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅの両方を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号５１９８５０３４）でそれぞれ２０μｇ／ｍｌ及び５．４％（ｖ／ｖ）に別々に希釈する。両方の溶液を５分間インキュベートし、混合し、１０～２０分間インキュベートした後、ペン／ｓｔｒｅｐ（最終ＤＮＡ濃度１μｇ／ｍｌ）を補充した新鮮なＯｐｔｉ－ＭＥＭ中の３×１０^６Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞／ｍｌに添加する。トランスフェクションの約１６～２４時間後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｉ（０．５（ｖ／ｖ）％）及びＩＩ（５（ｖ／ｖ）％）を添加する。上清を典型的にはトランスフェクションの５日後に回収する。上清中の抗体濃度を２８０ｎｍでの吸光度によって測定した。抗体を以下のように精製した。

【0183】

抗体精製及び品質評価
抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。培養上清を０．２０μＭデッドエンドフィルタで濾過し、５ｍＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ｃｙｔｉｖａ）に負荷し、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム－ＮａＯＨ（ｐＨ５．０）で洗浄し、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム－ＮａＯＨ（ｐＨ３）で溶出した。溶出液をＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ／ＣｙｔｉｖａによってＧｅｎｍａｂ用に調製された８．６５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４無水物、１．９ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４一水和物、１４０．３ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４緩衝液）に対して透析した。必要に応じて、タンパク質を分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で更に精製して凝集体を除去した。緩衝液交換又はＳＥＣの後、試料を０．２μｍのデッドエンドフィルタで滅菌濾過した。精製されたタンパク質の品質を、質量分析、キャピラリー電気泳動（非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳ）及び高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ－ＳＥＣ）によって分析した。濃度は２８０ｎｍでの吸光度によって測定した。精製した抗体を２～８℃で保存した。

【0184】

二重特異性抗体の作製
ＩｇＧ１二重特異性抗体を、本質的に以前に報告されたように、上に列挙した非活性化変異に加えて、ＣＨ３ドメインにＦ４０５Ｌ変異を有する単一特異性抗体とＣＨ３ドメインにＫ４０９Ｒ変異を有する単一特異性抗体との間の制御されたＦａｂ－Ａｒｍ交換（ｃＦＡＥ）によって作製した（Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｏｃｔ；９（１０）：２４５０－６３）。ＩｇＧ４二重特異性バリアントの場合、一方の単一特異性抗体は、位置４０９に天然のアルギニン（Ｒ）を有し、他方の単一特異性抗体は、抗体のＣＨ３ドメインにＦ４０５Ｌ－Ｒ４０９Ｋ変異を有するものであった。簡潔には、両方の単一特異性抗体を等モル濃度で混合し、７５ｍＭの２－メルカプトエチルアミン－ＨＣｌ（２－ＭＥＡ）と共に３１℃で５時間インキュベートした。その後、４℃で一晩、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（１０Ｋ ＭＷＣＯ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＢＳとの緩衝液交換によって２－ＭＥＡを除去した。透析緩衝液を２回交換した。生成した二重特異性抗体をカセットから回収し、濃度を２８０ｎｍでの吸光度によって測定した。精製した二重特異性抗体を２～８℃で保存し、典型的にはＣＥ－ＳＤＳ及びＨＰ－ＳＥＣによって分析して、生成した二重特異性抗体の単量体状態を評価し、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた質量分析によって、ｃＦＡＥの効率及び二重特異性抗体含有量を決定した。

【0185】

Ｆ（ａｂ’）２断片の生成
ＨＬＡ－ＤＲを標的とするＦ（ａｂ’）２断片を、ＦｒａｇＩＴキット（Ｇｅｎｏｖｉｓ ＡＢ）を使用して本質的に製造業者の推奨に従って作製した。簡潔には、アガロースビーズにカップリングされたＦ（ａｂ’）２及びＦｃ／２断片の均一なプールを生成するヒンジ領域の下の特定の部位でＩｇＧを消化するＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ酵素を有する樹脂であるＦｒａｇＩＴを有するスピンカラムを消化緩衝液（Ｇｅｎｏｖｉｓ ＡＢ）で平衡化する。続いて、Ｅ４３０Ｇ変異を有する抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ抗体バリアントＩｇＧ１－ＨＬＡ－ＤＲ－１Ｄ０９Ｃ３をカラムに適用し、室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を溶出し、カラムから回収する。精製されたＦ（ａｂ’）２断片を、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル（ＣＥ－ＳＤＳ）上でキャピラリー電気泳動によって分析した。濃度は２８０ｎｍでの吸光度によって測定した。精製した抗体を２～８℃で保存した。

【0186】

［実施例２］
Ｒａｊｉ細胞に対する抗ヒトＣＤ２０抗体及びその非活性化バリアントの標的結合
野生型Ｆｃ及びＫ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ－Ｋ４０９Ｒ、Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ－Ｓ２６７Ｋ－Ｋ４０９Ｒ、Ｎ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ－Ｋ４０９Ｒを有するバリアントを有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体と、野生型Ｆｃ及びＳ２２８Ｐ、Ｓ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ又はＳ２２８Ｐ－Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌを有するバリアントを有するＩｇＧ４抗体との標的結合を、ＣＤ２０を発現するＲａｊｉ細胞を用いて評価した。抗ＨＩＶ１ｇｐ１２０ ＩｇＧ１野生型抗体（ＩｇＧ１－ｂ１２）を非結合対照として使用した。

【0187】

このために、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、カタログ番号ＢＥ１７－５１７Ｑ、Ｌｏｎｚａ；０．１％ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ、カタログ番号１０７３５０８６００１、Ｍｅｒｃｋ；０．０２％ＮａＮ_３、カタログ番号４１９２００４４－３、Ｂｉｏ－ｗｏｒｌｄ）中のＲａｊｉ細胞（３×１０^４細胞、カタログ番号ＣＣＬ－８６、ＡＴＣＣ）をポリスチレン丸底９６ウェルプレート（カタログ番号６５０１８０、Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎ）中で、総体積５０μＬで３０分間、ＣＤ２０（０．００１３～２０μｇ／ｍＬの最終濃度；５倍希釈）を標的とする一連の精製抗体の濃度で４℃でインキュベートした。その後、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液の添加によって２回洗浄し、続いて遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を除去した。結合した抗体を、５０μＬのヤギＦ（ａｂ’）_２抗ヒトκ－ＰＥ（最終濃度２．５μｇ／ｍＬ、カタログ番号２０６２－０９、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を４℃で３０分間添加することによって染色した。その後、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液の添加によって２回洗浄し、続いて遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を除去した。ヒトＣＤ２０への抗体バリアントの結合を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でのフローサイトメトリーによって、蛍光強度中央値を測定することによって検出した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における非線形アゴニスト用量－反応モデルを使用して分析した。データは、４つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。

【0188】

抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントの標的結合の評価により、重鎖定常領域に変異を有する全ての抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントについて同様の標的結合が明らかになった（図１Ａ～Ｂ）。重鎖定常領域にＳ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ又はＳ２２８Ｐ－Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ非活性化変異を有するものを含む全ての抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ４抗体バリアントは、ＩｇＧ１抗体バリアントと比較して、いくらか低下した標的結合を示した。

【0189】

要約すると、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体の重鎖における非活性化変異の導入は、それらの標的ＣＤ２０に結合するそれらの能力に影響を及ぼさなかった。

【0190】

［実施例３］
抗ヒトＣＤ２０抗体及びその非活性化バリアントによる補体依存性細胞傷害
治療効果が免疫系のエフェクター分子（補体タンパク質Ｃ１ｑ及びＦｃγ受容体等）との相互作用とは無関係であり、有害作用又は用量制限毒性がこの相互作用に高度に依存する治療用モノクローナル抗体の場合、非活性化Ｆｃドメインは治療域を増加させると考えられ得る。抗体とＣ１ｑタンパク質とのエンゲージメントは、古典的補体経路を開始させ、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす。ここでは、ＣＤＣを誘導する能力を、ＣＤＣ（Ｇｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７，Ｓｅｐ；４４（１６）：３８２３－３７）の効率的かつ強力な誘導のために選択されたＩ型抗ヒトＣＤ２０抗体、並びに定常重鎖領域に非活性化変異を有するそのような抗体のバリアントについて評価した。

【0191】

野生型としての抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体、又はＫ４０９Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体、又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ－Ｋ４０９Ｒ、Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ－Ｓ２６７Ｋ－Ｋ４０９Ｒ、Ｎ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するその非活性化バリアント、並びに野生型、変異Ｓ２２８Ｐを有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ４抗体、及びＳ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ又はＳ２２８Ｐ－Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ４抗体を、補体源として２０％正常ヒト血清（ＮＨＳ、カタログ番号Ｍ０００８、Ｓａｎｑｕｉｎ）を用いたＲａｊｉ細胞に対するインビトロＣＤＣアッセイにおいて、ある範囲の濃度（０．００２４～１０μｇ／ｍＬの最終濃度；４倍希釈）で試験した。０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、カタログ番号１０７３５０８６００１、Ｍｅｒｃｋ）及びペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、最終濃度５０単位／ｍＬペニシリンカリウム及び５０μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、カタログ番号ＤＥ１７－６０３Ｅ、Ｌｏｎｚａ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（カタログ番号ＢＥ１２－１１５Ｆ、Ｌｏｎｚａ）中のＲａｊｉ細胞（３×１０^４細胞／ウェル）を、８０μＬの総体積でＣＤ２０を標的とする一連の精製抗体の濃度で室温（ＲＴ）で１５分間、ポリスチレン丸底９６ウェルプレート（カタログ番号６５０１８０、Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ）中でインキュベートした。その後、２０μＬのＮＨＳ（最終濃度２０％（ｖ／ｖ））を添加し、細胞を３７℃で４５分間インキュベートした。プレートを氷上に置いた後、遠心分離によって細胞をペレット化し、ＰＢＳ（カタログ番号ＳＨ３Ａ３８３０．０３、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中の３０μＬの２μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ、カタログ番号Ｐ４１７０、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で上清を置き換えることによって、反応を停止させた。ＰＩ陽性細胞の数をＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅスクリーナー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でフローサイトメトリーによって決定した。細胞溶解のパーセンテージに対応するＰＩ陽性細胞のパーセンテージを、（ＰＩ陽性細胞の数／細胞の総数）×１００％として計算した。非線形アゴニスト用量－反応モデルを用いてデータを分析し、抗体コントロールをベースラインとして用いないＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度を用いて、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、続いて、非結合コントロール抗体ＩｇＧ１－ｂ１２について測定したＡＵＣ値（０％）及び野生型ＩｇＧ１抗体バリアントについて測定したＡＵＣ値（抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１、１００％）に対する実験反復１回当たりの正規化を行った。データは、３つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。

【0192】

抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４バリアントのＣＤＣ能力の評価により、重鎖定常領域に非活性化変異を導入することによってＣＤＣを排除する能力を２つの群に分けることができることが明らかになった。Ｋ４０９Ｒ変異に加えて、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ、Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ－Ｓ２６７Ｋ、Ｎ２９７Ｇ、及びＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアント、並びにＳ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ又はＳ２２８Ｐ－Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ非活性化変異を有するＩｇＧ４抗体バリアントについては、ＣＤＣを誘導する能力が排除された。しかしながら、野生型ＩｇＧ１と比較して、変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒを有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントについて残留ＣＤＣが観察された（図２）。

【0193】

結論として、新規バリアントＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ及びＫ４０９Ｒ変異を有するＩｇＧ１抗体は、古典的補体経路の活性化のほぼ完全な欠如を示した。新規Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異のみを有し、Ｋ４０９Ｒ変異を有さない抗体でも同様の効果が観察された。これは、とりわけ残留ＣＤＣが観察されるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ及びＫ４０９Ｒ変異を有するＩｇＧ１抗体バリアントに対して大幅な進歩を表す。

【0194】

［実施例４］
抗ヒトＣＤ２０抗体及びその非活性化バリアントへのＣ１ｑ結合の評価
実施例３では、ＣＤＣを誘導する効力が、Ｆｃ媒介性エフェクター機能を抑制する突然変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントによって強く低下することが示された。ここで、定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントへの補体タンパク質Ｃ１ｑの結合を、ＣＤ２０を発現するＲａｊｉ細胞を用いて評価した。

【0195】

Ｃ１ｑの供給源として２０％正常ヒト血清（ＮＨＳ、Ｍ０００８、Ｓａｎｑｕｉｎ）を用いたＲａｊｉ細胞に対するＣ１ｑ結合アッセイを使用し、抗ヒトＣＤ２０抗体及びその非活性化バリアントを様々な濃度（０．０１４～１０μｇ／ｍＬの最終濃度；３倍希釈）で試験した。０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、カタログ番号１０７３５０８６００１、Ｍｅｒｃｋ）及びペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、最終濃度５０単位／ｍＬペニシリンカリウム及び５０μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、カタログ番号ＤＥ１７－６０３Ｅ、Ｌｏｎｚａ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（カタログ番号ＢＥ１２－１１５Ｆ、Ｌｏｎｚａ）中のＲａｊｉ細胞（１×１０^５細胞／ウェル）を、８０μＬの総体積でＣＤ２０を標的とする一連の精製抗体の濃度で１５分間、３７℃で、ポリスチレン丸底９６ウェルプレート（カタログ番号６５０１８０、Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ）中でインキュベートした。ＮＨＳの添加時のＣＤＣの活性化を防ぐために、プレートを氷上に置くことによって細胞を冷却した。続いて、２０μＬのＮＨＳ（最終濃度２０％（ｖ／ｖ））を添加し、細胞を４℃で４５分間インキュベートした後、遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を除去した。次に、１５０μＬのＦＡＣＳバッファー（１×ＰＢＳ、カタログ番号ＢＥ１７－５１７Ｑ、Ｌｏｎｚａ；０．１％ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ；０．０２％ＮａＮ_３、カタログ番号４１９２００４４－３、Ｂｉｏ－ｗｏｒｌｄ）を添加して細胞を２回洗浄した後、遠心分離により細胞をペレット化し、上清を除去した。結合したＣ１ｑを、５０μＬのポリクローナルウサギ抗ヒトＣ１ｑ補体－ＦＩＴＣ（最終濃度２０μｇ／ｍＬ、Ｄａｋｏ、カタログ番号Ｆ０２５４、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を４℃で３０分間添加することによって染色した。その後、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液の添加によって２回洗浄し、続いて遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を除去した。抗体バリアントへのＣ１ｑ結合を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅスクリーナー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でのフローサイトメトリーによって、蛍光強度中央値－ＦＩＴＣを測定することによって検出した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における非線形アゴニスト用量－反応モデルを使用して分析した。データは、１回の実験の３回の測定から得られた平均値（±ＳＤ）である。

【0196】

Ｃ１ｑの抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントへの結合の評価により、Ｋ４０９Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１は、標的Ｒａｊｉ細胞上のＣＤ２０に結合すると補体タンパク質Ｃ１ｑと効率的に係合するが、抗ＨＩＶ１ｇｐ１２０抗体（ＩｇＧ１－ｂ１２；ＣＤ２０非結合対照）はＣ１ｑと係合しないことが明らかになった。Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異のいずれかの導入は、Ｃ１ｑ結合を劇的に減少させた（図３）。Ｃ１ｑの結合は、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントと比較して、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントに対してより強く低下する。これは、実施例３に示されるように、これらの非活性化変異のＣＤＣの活性化に対する効果と一致している。

【0197】

結論として、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を有する非活性化抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントは、ＣＤＣの観察された減少と一致して、Ｃ１ｑ結合の大幅な減少を示す。

【0198】

［実施例５］
抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ抗体及びその非活性化バリアントによる補体依存性細胞傷害
実施例３では、定常重鎖に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０抗体バリアントによる古典的補体経路の活性化を、インビトロＣＤＣアッセイを使用して評価した。実施例３のデータは、新規Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ及びＫ４０９Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントが古典的補体経路の活性化を妨げることを明らかにした。この実施例では、本発明者らは、ＩｇＧ１骨格と共に使用した場合にＣＤＣの強力な誘導物質であるヒトＨＬＡ－ＤＲを標的とする２つの抗体を使用して、非活性化抗体バリアントのＣＤＣ能力を更に評価した。

【0199】

インビトロＣＤＣアッセイを、本質的には実施例３に記載のように、補体源として２０％ＮＨＳを含むＲａｊｉ細胞に対して行った。簡潔には、Ｋ４０９Ｒ変異を有する抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ抗体ＩｇＧ１－ＨＬＡ－ＤＲ－４及びＩｇＧ１－ＨＬＡ－ＤＲ－１Ｄ０９Ｃ３、又は定常重鎖領域においてＫ４０９Ｒと組み合わせた非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ若しくはＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒを有するそのバリアント、並びにＨＬＡ－ＤＲ標的化Ｆ（ａｂ’）２断片を、ある濃度範囲（０．０１４～１０μｇ／ｍＬの最終濃度；３倍希釈）で試験した。細胞溶解の尺度としてのＰＩ陽性細胞の数を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅスクリーナー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でフローサイトメトリーによって決定した。非線形アゴニスト用量－反応モデルを使用してデータを分析し、抗体対照をベースラインとして用いないＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度を使用して、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、続いて実験反復１回当たりを野生型ＩｇＧ１抗体バリアントについて測定されたＡＵＣ値（１００％）に正規化した。データは、５つ（野生型及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒバリアント）又は２つ（Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒバリアント、又はＦ（ａｂ’）２断片）の独立した実験に基づく。

【0200】

抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ抗体バリアントのＣＤＣ能力の評価により、Ｋ４０９Ｒ変異に加えてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ変異を有する抗体バリアントは、Ｒａｊｉ細胞のＣＤＣを誘導する能力を保持することが明らかになった（図４Ａ、図４Ｂ）。しかしながら、ＩｇＧ１－ＨＬＡ－ＤＲ－４－Ｋ４０９Ｒ及びＩｇＧ１－ＨＬＡ－ＤＲ－１Ｄ０９Ｃ３－Ｋ４０９Ｒ抗体バリアントにおけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異の導入は、ＣＤＣを誘導する効力を劇的に低下させた。更に、ＩｇＧ１－ＨＬＡ－ＤＲ－１Ｄ０９Ｃ３について観察されるように、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ抗体バリアントによってＣＤＣを誘導する効力は、Ｆｃ領域を欠き、したがって補体タンパク質Ｃ１ｑと相互作用しないＨＬＡ－ＤＲ標的化Ｆ（ａｂ’）２断片によって誘導されるＣＤＣと同じレベルである（図４Ｂ）。

【0201】

要約すると、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異を有する抗体バリアントは、ヒト補体系に関与できないＦ（ａｂ’）２断片によって誘導されるＣＤＣと同様のレベルまでＣＤＣを効率的に減少させた。

【0202】

［実施例６］
抗ヒトＣＤ２０抗体及びその非活性化バリアントによるＦｃγ受容体への結合
当該のように、治療効果が免疫系のエフェクター分子（補体タンパク質Ｃ１ｑ及びＦｃγ受容体等）との相互作用とは無関係であり、有害作用又は用量制限毒性がこの相互作用に高度に依存する治療用モノクローナル抗体の場合、非活性化Ｆｃドメインは治療域を増加させると考えられ得る。実施例３～５のデータは、抗体の定常重鎖領域に非活性化変異を導入すると、補体タンパク質Ｃ１ｑと係合する能力が低下し、ＣＤＣの誘導が低下することを示した。ここで、本発明者らは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ヒトＦｃγＲＩａ（配列番号１５）の単量体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、又はヒトＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ（配列番号１６）、ヒトＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｒ（配列番号１７）、ヒトＦｃγＲＩＩｂ（配列番号１８）、ヒトＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｆ（配列番号１９）及びヒトＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖ（配列番号２０）の二量体ＥＣＤへの、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗ヒトＣＤ２０抗体及び定常重鎖領域に非活性化変異を有するその抗体バリアントの結合を評価した。

【0203】

このために、抗ヒトＣＤ２０抗体ＩｇＧ１野生型、ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ－Ｋ４０９Ｒ、Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ－Ｓ２６７Ｋ－Ｋ４０９Ｒ、Ｎ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するその非活性化バリアント、並びにＩｇＧ４野生型、ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ、及びＳ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ又はＳ２２８Ｐ－Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ変異を有する非活性化バリアントを、ヒトＦｃγ受容体への結合についてある濃度範囲（５倍希釈段階で０．００１３～２０μｇ／ｍＬ）で試験した。単量体及び二量体ＦｃγＲバリアントへの結合を検出するために、９６ウェルマイクロロンＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬヤギＦ（ａｂ’）_２－抗ヒトＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）_２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号１０９－００６－０９７）で４℃で一晩コーティングし、続いて洗浄し、０．２％ＢＳＡ（ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ）を補充した２００μＬ／ウェルＰＢＳで室温（ＲＴ）で１時間ブロックした。インキュベーション間（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ（カタログ番号Ｐ１３７９、Ｓｉｇｍａ）；ＰＢＳＴ；＋０．２％ＢＳＡ；ＰＢＳＴ／０．２％ＢＳＡ）で洗浄しながら、プレートを、ＰＢＳＴ／０．２％ＢＳＡ中の抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントの希釈系列１００μｌ／ウェルと共に振盪しながら室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳＴ／０．２％ＢＳＡ中の単量体又は二量体のＨｉｓタグ付きＣ末端ビオチン化ＦｃγＲ ＥＣＤバリアント（１μｇ／ｍＬ）１００μＬ／ウェルと共に振盪しながら室温で１時間インキュベートした。最後に、上記のように洗浄した後、プレートを、振盪しながら室温で３０分間、抗体を検出するものとして、ＰＢＳＴ／０．２％ＢＳＡ中１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン－ポリＨＲＰ（ＣＬＢ、カタログ番号Ｍ２０３２、１：１０．０００）と共にインキュベートした。１ｍｇ／ｍＬのＡＢＴＳ（カタログ番号１１１１２４２２００１及び１１１１２５９７００１、Ｒｏｃｈｅ）による展開を約１０分間（Ｉａ）、１５分間（ＩＩａ－１３１Ｈ、ＩＩａ－１３１Ｒ、ＩＩＩａ－１５８Ｖ、ＩＩＩａ－１５８Ｆ）又は３０分間（ＩＩｂ）行った。その後、１００μＬ／ウェルの２％シュウ酸（Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎ、カタログ番号３３５０６）を用いて反応を停止した。マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｙ、ＶＴ）を使用して、４０５ｎｍで吸光度を測定した。

【0204】

抗体バリアントの固定化を測定し、導入された非活性化変異がＥＬＩＳＡプレートへの捕捉に影響するかどうかを評価するために、９６ウェルマイクロロンＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号６５５０９２、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬヤギＦ（ａｂ’）_２－抗ヒト－ＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）_２（カタログ番号１０９－００６－０９７、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で４℃で一晩コーティングした。その後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、０．２％ＢＳＡ（ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ）を補充した２００μＬ／ウェルＰＢＳで室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。異なるインキュベーション工程（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）＋０．２％ＢＳＡを補充したＰＢＳ；ＰＢＳＴ／０．２％ＢＳＡ）の間で洗浄しながら、プレートを、振盪しながら室温で１時間、ＰＢＳＴ／０．２％ＢＳＡ中１００μｌ／ウェルの抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントの希釈系列（５倍希釈工程で０．００１３～２０μｇ／ｍＬ）、及び振盪しながら室温で３０分間、抗体を検出しながらＰＢＳＴ／０．２％ＢＳＡ中１００μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃγ（カタログ番号１０９－０３５－０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；１：１０，０００）と共に連続的にインキュベートした。１ｍｇ／ｍＬのＡＢＴＳ（カタログ番号１１１１２４２２００１及び１１１１２５９７００１、Ｒｏｃｈｅ）による発色を約５分間行い、その後、１００μＬ／ウェルの２％シュウ酸を用いて反応を停止させた。マイクロプレートリーダーを使用して、４０５ｎｍで吸光度を測定した。

【0205】

非線形アゴニスト用量－反応モデルを使用してデータを分析し、ＥＬＩＳＡバックグラウンドシグナル（抗体対照なし）をベースラインとして用いるＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度を使用して、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、続いて実験反復１回当たりを野生型ＩｇＧ１抗体バリアントについて測定されたＡＵＣ値（抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１、１００％）に正規化した。データは３回の独立した反復に基づく。

【0206】

全ての抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントを同様の様式でＥＬＩＳＡプレートに固定化し、ＩｇＧ４骨格を有する抗体バリアントについてわずかな減少が観察された（図５）。したがって、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントの重鎖領域における非活性化変異の導入は、抗ヒトＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２断片による固定化に影響を及ぼさないと結論付けられた。ＥＬＩＳＡによるＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａへの抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントの結合の評価により、定常重鎖領域に非活性化変異を有する全ての抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントがＦｃγ受容体と相互作用しないことが明らかになった（図６Ａ～Ｆ）。更に、非活性化ＩｇＧ４バリアントはまた、ＦｃγＲＩＩａ－１３１Ｒに対する残留結合を示したＳ２２８Ｐ－Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－ｄｅｌＧ２３６変異を有するＩｇＧ４抗体バリアントを除いて、Ｆｃγ受容体と相互作用することができなかった（図６Ｃ）。

【0207】

要約すると、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を有するＩｇＧ１抗体バリアントは、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ及びＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ等の以前に記載された非活性化Ｆｃバリアントと同様に、ＦｃγＲ結合を示さなかった。

【0208】

［実施例７］
抗ヒトＣＤ２０抗体及びその非活性化バリアントによるＦｃγ受容体を介した活性化及びシグナル伝達
実施例６では、ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａに対する、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体、及び定常重鎖に非活性化変異を有するそのバリアントの結合を検討した。試験した全ての非活性化抗体バリアントは、ＦｃγＲＩＩａ－１３１Ｒに対する残留結合を示したＳ２２８Ｐ－Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－ｄｅｌＧ２３６変異を有するＩｇＧ４抗体バリアントを除いて、試験したＦｃγＲに対する結合を示さなかった。しかしながら、ＥＬＩＳＡ結合アッセイでは、直接結合に対する効果のみが評価される。エフェクター細胞に対するＦｃ受容体の抗原結合、標的媒介性抗体クラスター化及びその後の標的媒介性クラスター化の効果は存在しない。ここで、本発明者らは、実施例６で述べたように、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ４抗体の重鎖定常領域における非活性化変異の導入が、標的発現Ｒａｊｉ細胞及び示されたＦｃγＲを発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞株を使用するＰｒｏｍｅｇａレポーターアッセイにおいてＦｃγＲ活性化及びシグナル伝達に影響を及ぼすかどうかを研究した。

【0209】

上記の抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体バリアントによるＦｃγＲ媒介シグナル伝達の活性化を、ＣＤ２０発現Ｒａｊｉ細胞を標的細胞として用いたレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＦｃγＲＩａ：カタログ番号ＣＳ１７８１Ｃ０８；ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ：カタログ番号Ｇ９９９１；ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｒ：カタログ番号ＣＳ１７８１Ｂ０８；ＦｃγＲＩＩｂ：カタログ番号ＣＳ１７８１Ｅ０４；ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｆ：カタログ番号Ｇ９７９０；ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖ：カタログ番号Ｇ７０１０）を使用して定量した。エフェクター細胞として、レポーター細胞キットは、示されたＦｃγＲ及びホタルルシフェラーゼの発現を駆動する活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）応答エレメントの核因子を安定に発現するように操作されたＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞を含む。アッセイは、製造業者の推奨に従って実施される。手短に言えば、Ｒａｊｉ細胞（５，０００細胞／ウェル）を、１２％低ＩｇＧ血清（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７１１Ａ）を補充したアッセイバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７１９Ａ）中の白色ＯｐｔｉＰｌａｔｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００７２９０）の３８４ウェルに播種し、抗体濃度系列（ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ、５倍希釈で０．００１～１５μｇ／ｍＬの最終濃度；ＦｃγＲＩａ、２５倍希釈物中の最終濃度０．０００００００６～１５μｇ／ｍＬ）及び解凍したＰｒｏｍｅｇａ ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞（３０，０００細胞／ウェル）を含む３０μＬの総体積で３７℃／５％ＣＯ_２で５時間インキュベートした。その後、プレートを室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートし、続いて３０μＬのＢｉｏ Ｇｌｏ Ａｓｓａｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅａｇｅｎｔを添加した。次いで、プレートを室温で５分間インキュベートした。ルシフェラーゼ産生を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）での発光読み出しによって定量した。中程度の（Ｒａｊｉ細胞なし、抗体なし、エフェクター細胞なし）試料から決定されたバックグラウンド発光シグナルを使用して、発光シグナルを正規化した。非線形アゴニスト用量－反応モデルを使用してデータを分析し、抗体対照なし（Ｒａｊｉ細胞及びエフェクター細胞のみ）のＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度をベースラインとして使用して、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。実験ごとに、ＡＵＣ値を、非結合対照ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１（１００％）とインキュベートした細胞について観察されたレポーター活性に対して正規化した。データは３回の独立した反復に基づく。

【0210】

Ｐｒｏｍｅｇａレポーターアッセイを使用したＦｃγＲＩａ－、ＦｃγＲＩＩａ－、ＦｃγＲＩＩｂ－及びＦｃγＲＩＩＩａ媒介活性化の評価により、ＩｇＧ１の重鎖定常領域におけるＫ４０９Ｒ変異と組み合わせたＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒの導入は、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１非活性化バリアントＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ－Ｋ４０９Ｒ、及びＥ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ－Ｓ２６７Ｋ－Ｋ４０９Ｒと同様に、ＦｃγＲ媒介活性化を防止することが明らかになった（図７Ａ～Ｆ）。Ｎ２９７Ｇ及びＫ４０９Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントによるＦｃγＲＩａを介した部分的活性化（図７Ａ）、並びにＳ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ又はＳ２２８Ｐ－Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ変異を有するＩｇＧ４抗体バリアントによる部分的ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂを介した活性化、並びにＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ－Ｋ４０９Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントによる部分的ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂを介した活性化（図７Ｂ～Ｄ）を除いて、重鎖定常領域に非活性化変異を有する他のＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体バリアントについてもＦｃγＲを介した活性化の欠如が観察された。対照として、抗体バリアント抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及び抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒは、試験した全てのＦｃγＲの活性化を誘導したが、抗体バリアントＩｇＧ４及びＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐは、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩａ媒介活性化を誘導したが、ＦｃγＲＩＩＩａ媒介活性化を欠いていた（図７Ａ～Ｆ）。

【0211】

いくつかのバリアントでは、Ｆｃγ受容体の１又は複数について、部分的なＦｃγＲ媒介活性化が観察され、すなわち、Ｎ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒ又はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するＩｇＧ１バリアント、及びＳ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ又はＳ２２８Ｐ－Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ変異を有するＩｇＧ４抗体バリアント、有利には、Ｋ４０９Ｒ変異に加えて重鎖定常領域に新規Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を有するＩｇＧ１抗体バリアントによるＦｃγＲ媒介活性化を誘導する能力が効率的に抑止された。

【0212】

［実施例８］
抗ヒトＣＤ２０抗体及びその非活性化バリアントによる新生児Ｆｃ受容体への結合
新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、ＩｇＧを分解から保護することによってＩｇＧの長い血漿中半減期を担う。抗体の内部移行時に、ＦｃＲｎはエンドソーム中の抗体Ｆｃ領域と係合し、この場合、相互作用は弱酸性環境で安定である（ｐＨ６．０）。環境が中性（ｐＨ７．４）である原形質膜に再循環すると、相互作用が破壊され、抗体が放出されて循環に戻る。これは、ＩｇＧの血漿中半減期に影響を及ぼす。ここでは、実施例６及び７で述べたように、定常重鎖領域に非活性化変異を含む抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ４抗体並びにそれらのバリアントのヒトＦｃＲｎへの結合を評価するためにＥＬＩＳＡを行った。

【0213】

Ｓｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ９６ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１７３４７７６００１）を、室温（ＲＴ）で振盪しながら２時間、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）＋０．２％ＢＳＡを補充したＰＢＳで希釈した、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ；配列番号２２）を含む二量体としてのＣ末端Ｈｉｓタグ（ＦｃＲｎＥＣＤＨｉｓ；配列番号２１）を有するヒトＦｃＲｎの組換え生産ビオチン化細胞外ドメイン（ＦｃＲｎＥＣＤＨｉｓ－Ｂ２Ｍ－ＢＩＯ）、すなわちヒトＦｃＲｎの細胞外ドメイン５μｇ／ｍＬ（１００μＬ／ウェル）でコーティングした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。段階希釈した抗体試料（ＰＢＳＴ／０．２％ＢＳＡ、ｐＨ６．０又はｐＨ７．４中の５倍希釈物中の０．００１３～２０μｇ／ｍＬの最終濃度）を添加し、室温で振盪しながら１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ／０．２％ＢＳＡ、ｐＨ６．０又はｐＨ７．４で洗浄した。ＰＢＳＴ／０．２％ＢＳＡ、ｐＨ６．０又はｐＨ７．４で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ポリクローナルヤギ抗ヒトカッパ軽鎖（１：５，０００；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ－７１６４）を添加し、プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ／０．２％ＢＳＡ、ｐＨ６．０又はｐＨ７．４で洗浄した後、１００μＬの２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンズチアゾリン－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ；１ｍｇ／ｍＬ；Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１１１２４２２００１及び１１１１２５９７００１）を基質として添加し、プレートを光から保護したＲＴで１５分間インキュベートした。１００μＬの２％シュウ酸（Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎ、カタログ番号３３５０６）を用いて反応を停止させ、室温で１０分間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｙ、ＶＴ）を使用して、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。非線形アゴニスト用量－反応モデルを使用してデータを分析し、ＥＬＩＳＡバックグラウンドシグナル（抗体対照なし）をベースラインとして、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度を使用して、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。データは３回の独立した反復に基づく。

【0214】

ＦｃＲｎ結合ＥＬＩＳＡアッセイは、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体の定常重鎖領域における非活性化変異の導入がｐＨ６．０でＦｃＲｎ結合を阻害しないことを示した。逆に、ｐＨ７．４では、抗ヒトＣＤ２０抗体ＩｇＧ１及びＩｇＧ４野生型を含む全ての試験したＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体バリアントは、ヒトＦｃＲｎへの結合を示さなかった。

【0215】

まとめると、これらの結果は、試験した他のバリアントと同様に、新規Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を有する抗体ＩｇＧ１バリアントが、野生型ＩｇＧ１抗体と同様のＦｃＲｎ結合特性を保持したことを示す。

【0216】

［実施例９］
抗ヒトＣＤ２０抗体及びその非活性化バリアントによる抗体依存性細胞傷害性の誘導
非活性化抗ヒトＣＤ２０抗体へのＦｃγＲ結合並びに非活性化抗ヒトＣＤ２０抗体による活性化及びシグナル伝達を、それぞれ実施例６及び７で評価した。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、ＦｃγＲＩＩＩａとの結合に依存する。ここで、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１野生型、ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ－Ｋ４０９Ｒ、Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ－Ｓ２６７Ｋ－Ｋ４０９Ｒ、Ｎ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するその非活性化バリアント、並びにＩｇＧ４野生型、ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ及びＳ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ変異を有する非活性化バリアントによってＡＤＣＣを誘導する能力、又はＳ２２８Ｐ－Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ変異を、ＣＤ２０発現Ｒａｊｉ細胞及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＮＫ細胞の供給源として用いたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ＥｕＴＤＡ ＴＲＦ（時間分解蛍光）細胞傷害性アッセイを用いて評価した。

【0217】

バフィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ）は、健常志願者から採取した全血から得て、凝固活性化を防ぐためにクエン酸リン酸デキストロース（２０％最終濃度（ｖ／ｖ））で抗凝固処理し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、カタログ番号ＳＨ３Ａ３８３０．０３、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で３．６倍希釈した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造者の説明書にいくつかの修正を加えて記載されているように、リンパ球分離培地（カタログ番号２５－０７２－Ｃｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含有するＬｅｕｃｏｓｅｐ（商標）チューブ（カタログ番号２２７２９０、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）を使用する密度勾配遠心分離によってＰＢＳ希釈バフィーコートから単離した。手短に言えば、密度勾配遠心分離は、遠心分離機のブレーキを３に設定して、室温（ＲＴ）で８００×ｇで２０分間の遠心分離によって行った。その後、濃縮した細胞画分を５０ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、続いて３００×ｇで１０分間遠心分離した。単離したＰＢＭＣを培養培地（２ｍＭのＬ－グルタミン及び２５ｍＭのＨｅｐｅｓを含むＲＰＭＩ－１６４０、カタログ番号ＢＥ１２－１１５Ｆ、Ｌｏｎｚａ；鉄を含む１０％ドナーウシ血清を補足、ＤＢＳＩ、カタログ番号２０３７１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁した。抗ＣＤ２０野生型抗体及びその非活性化バリアントのＡＤＣＣ能力を決定するために、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ＥｕＴＤＡ ＴＲＦ（時間分解蛍光）細胞傷害性キット（カタログ番号ＡＤ０１１６、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を製造者の説明書に従って使用した。２つの別個の実験セットを実施した。

【0218】

第１組の実験のために、Ｒａｊｉ細胞を培養培地中に１×１０^６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、水浴中３７℃で２０分間、０．１６％（ｖ／ｖ）ビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシレート試薬溶液（ＤＥＬＦＩＡ ＢＡＴＤＡ試薬、カタログ番号Ｃ１３６－１００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で標識した。疎水性ＢＡＴＤＡ標識は、細胞膜を自由に通過することができ、もはや細胞膜を通過しない親水性ＴＤＡ標識（２，２’：６’，２”－ターピリジン－６，６”－ジカルボン酸）に細胞内で変換される。その後、標識された細胞を培養培地で３回洗浄して、過剰のＢＡＴＤＡ試薬を除去した。続いて、細胞をある濃度範囲の野生型抗ＣＤ２０抗体及びその非活性化バリアント（０．０１～１００００ｎｇ／ｍＬの最終濃度；１０倍希釈）と混合し、ＲＴで１５分間インキュベートし、新たに単離したＰＢＭＣを、Ｖ底９６ウェルプレート（カタログ番号６５１１０１、Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ）において２００μＬの総体積で培養培地中、Ｅ：Ｔ比１００：１で混合物に添加した。プレートを、５％ＣＯ_２の加湿（８５％）空気雰囲気中、３７℃で２時間インキュベートした。０％のＡＤＣＣを表す標識細胞からの自発的ＢＡＴＤＡ放出をＰＢＭＣ及び抗体の非存在下で決定し、１００％のＡＤＣＣを表す最大ＢＡＴＤＡ放出を、標識細胞をＤＥＬＦＩＡ（登録商標）溶解緩衝液（５％最終濃度（ｖ／ｖ）、カタログ番号４００５－００１０、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）とインキュベートすることによって決定した。２時間後、プレートを５００×ｇで５分間スピンダウンし、２０μＬの無細胞上清を平底９６ウェル白色不透明ＯｐｔｉＰｌａｔｅ（カタログ番号６００５２９０、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に移した。その後、２００μＬのＤＥＬＦＩＡユウロピウム溶液（カタログ番号Ｃ１３５－１００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を移した上清に添加し、試料を暗所でＲＴで１５分間インキュベートした。放出されたＴＤＡ標識から形成されたＥｕＴＤＡキレートの蛍光を、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。ＡＤＣＣの尺度としての比放出パーセントを、以下の式を使用して計算した：
％比放出＝（（蛍光試料－蛍光自発放出）／（蛍光最大－蛍光自発放出））×１００％
非線形アゴニスト用量－反応モデルを用いてデータを分析し、ベースラインとしてのバックグラウンド株（抗体対照なし）による、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度を用いて、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、続いて、非結合陰性対照ＩｇＧ１－ｂ１２について測定したＡＵＣ値（０％）及び野生型ＩｇＧ１抗体バリアントについて測定したＡＵＣ値（抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１、１００％）に対する実験反復１回当たりの正規化を行った。データは、４つ（野生型及びＫ４０９Ｒバリアント）又は２つ（Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒバリアント）の独立したドナーから得られた平均値（±ＳＥＭ）である。

【0219】

第２の組の実験を本質的に上記のように行い、分析した。しかし、濃度範囲の代わりに、定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体及びそのバリアントによってＡＤＣＣを誘導する能力を、１０ｕｇ／ｍＬの最終抗体濃度で評価した。データを実験複製物ごとに非結合陰性対照ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型ＩｇＧ１抗体バリアント（抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１、１００％）に対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）で可視化した。データは、２つの独立した実験からの６人のドナーから得られた平均値（±ＳＥＭ）である。

【0220】

Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ＥｕＴＤＡ ＴＲＦ細胞毒性キットを用いたＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣの評価により、野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１又はＫ４０９Ｒ変異を有するバリアントがＣＤ２０発現Ｒａｊｉ細胞のＡＤＣＣを効率的に誘導することが明らかになった（図８）。対照的に、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合及びそれを介した活性化及びシグナル伝達の非存在（実施例６及び７）と一致して、抗ヒトＣＤ２０野生型ＩｇＧ４抗体、又はＳ２２８Ｐヒンジ安定化変異を有するバリアントは、ＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣを誘導しない（図８Ｂ）。非活性化抗体バリアントによるＡＤＣＣ誘導能の評価により、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１の重鎖定常領域にＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ及びＫ４０９Ｒ変異を導入すると、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１非活性化バリアントＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ（図８Ａ、図８Ｂ）、及び抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１非活性化バリアントＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ－Ｋ４０９Ｒ、Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ－Ｓ２６７Ｋ－Ｋ４０９Ｒ、Ｎ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ－Ｋ４０９Ｒと同様に、ＣＤ２０発現Ｒａｊｉ細胞のＡＤＣＣが約６９～９８％減少することが明らかになった（図８Ｂ）。更に、野生型ＩｇＧ４と同様に、ＩｇＧ４非活性化抗体バリアントＳ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ又はＳ２２８Ｐ－Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌもＡＤＣＣを誘導することができなかった（図８Ｂ）。

【0221】

結論として、ＡＤＣＣを誘導する能力は、重鎖定常領域に新規Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を有する抗体バリアントによって効率的に無効にされた。

【0222】

［実施例１０］
抗ヒトＣＤ３抗体及びその非活性化バリアントによるＰＢＭＣ培養におけるＴ細胞活性化
Ｔ細胞上のＣＤ６９のアップレギュレーションを、抗ヒトＣＤ３ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体、並びにＦＡＣＳ分析による定常重鎖領域に非活性化変異を有するそのバリアントによるＴ細胞の早期活性化の測定として評価した。

【0223】

ＰＢＭＣを、実施例９に記載の密度勾配分離によってバフィーコートから単離し、ＰＢＳで洗浄し、培養培地（２ｍＭのＬ－グルタミン及び２５ｍＭのＨｅｐｅｓを含むＲＰＭＩ－１６４０、カタログ番号ＢＥ１２－１１５Ｆ、Ｌｏｎｚａ；鉄、ＤＢＳＩを有する１０％ドナーウシ血清を補足、カタログ番号２０３７１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁した。抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１－Ｆ４０５Ｌ及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ、Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ－Ｓ２６７Ｋ、又はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓ変異を有するその非活性化バリアントの用量応答シリーズ、Ｆ４０５Ｌに加えて並びにヒンジ安定化突然変異Ｓ２２８Ｐを有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ４、又はＦ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋに加えてＳ２２８Ｐ－Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ若しくはＳ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ突然変異を有する非活性化バリアントを、培地（０．００１～１０００ｎｇ／ｍｌの最終濃度、１０倍希釈）中で調製し、培地中にＰＢＭＣ（１．５×１０^５細胞／ウェル）を含む９６ウェル丸底プレートのウェルに添加した。１６～２４時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離によってペレット化した。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、カタログ番号ＢＥ１７－５１７Ｑ、Ｌｏｎｚａ；０．１％ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ；０．０２％ＮａＮ_３、カタログ番号４１９２００４４－３、Ｂｉｏ－ｗｏｒｌｄ）で洗浄し、マウス抗ヒトＣＤ２８－ＰＥ（カタログ番号１３０－０９２－９２１；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；Ｔ細胞マーカー）及びマウス抗ヒトＣＤ６９－ＡＰＣ抗体（カタログ番号３４０５６０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で４℃で３０分間染色した。未結合抗体をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄することによって除去し、続いて細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１５０μＬ／ウェル）に再懸濁し、ＰＢＭＣ混合物中のＣＤ２８陽性細胞のＣＤ６９陽性細胞の割合をＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ）で測定した。データをＣＤ２８^＋細胞のＣＤ６９^＋に対する用量応答として可視化し、各実験複製物のＰＢＭＣドナー当たりの用量応答曲線下面積（ＡＵＣ）を、ベースラインとしてバックグラウンド染色（抗体対照なし）を用いたＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度を使用して計算し、その後、実験複製物当たりの各ドナーについて、野生型ＩｇＧ１抗体バリアントについて測定されたＡＵＣ値（ＩｇＧ１－Ｆ４０５Ｌ、１００％）に対して正規化した。データは、３つの独立したレプリケートから６人のドナーから得られた平均値±ＳＥＭである。

【0224】

初期Ｔ細胞活性化の尺度としてのＴ細胞上のＣＤ６９アップレギュレーションの評価は、Ｆ４０５Ｌ変異に加えてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ３抗体ＩｇＧ１が、試験した他のバリアント、すなわち非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ、Ｇ２３６Ｒ－Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ－Ｓ２６７Ｋ、又はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３７Ａ－Ａ３３０Ｓ－Ｐ３３１Ｓを含む抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１－Ｆ４０５Ｌバリアント、並びに非活性化変異Ｓ２２８Ｐ－Ｅ２３３Ｐ－Ｆ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌを含む抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ４－Ｆ４０５Ｌ－Ｒ４０９Ｋバリアントと同様に、ＰＢＭＣ共培養物中のＴ細胞上のＣＤ６９のアップレギュレーションを防止したことを示す（図９Ａ、図９Ｂ）。対照的に、Ｆ４０５Ｌ変異を有するＮ２９７Ｇを有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアント及びＦ４０５Ｌ－Ｒ４０９Ｋ変異を有するＳ２２８Ｐ－Ｆ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａを有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ４抗体バリアントは、ＰＢＭＣ共培養物中のＴ細胞上のＣＤ６９上方制御を防ぐことができなかった。

【0225】

要約すると、ＰＢＭＣ共培養物におけるＣＤ６９アップレギュレーションによって測定されるＴ細胞の活性化は、抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１型抗体における新規Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異の導入によって防止することができる。

【0226】

［実施例１１］
非活性化抗体バリアントによって誘導されるインビトロＴ細胞媒介性細胞傷害
実施例１０では、ＣＤ３標的化抗体のＩｇＧ１バリアントの定常重鎖領域に非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒを導入すると、Ｔ細胞活性化を効率的に防止できることが示された。ここで、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を、ＣＤ３ｘＨＥＲ２、ＣＤ３ｘｂ１２及びｂ１２ｘＨＥＲ２二重特異性野生型ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体並びに定常重鎖領域に非活性化変異を有するそれらのバリアントについて評価した。

【0227】

実施例１に記載されているように、制御されたＦａｂアーム交換（ｃＦＡＥ）によって二重特異性分子を作製した。野生型二重特異性抗体ＣＤ３ｘＨＥＲ２（抗ヒトＣＤ３（ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４）ＩｇＧ１又はＩｇＧ４及び抗ヒトＨＥＲ２ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）、ＣＤ３ｘｂ１２（抗ヒトＣＤ３（ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４）ＩｇＧ１又はＩｇＧ４及び非結合コントロール抗体抗ＨＩＶ１ｇｐ１２０（ｂ１２）ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）、又はｂ１２ｘＨＥＲ２（非結合コントロール抗体抗ＨＩＶ１ｇｐ１２０（ｂ１２）ＩｇＧ１又はＩｇＧ４及び抗ヒトＨＥＲ２ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）及び定常重鎖領域に非活性化変異を有するそのバリアントによるＴ細胞媒介性細胞傷害性を評価した。ＰＢＭＣを、実施例９に記載の密度勾配分離によって健康なドナーに由来するバフィーコートから単離し、ＰＢＳで洗浄し、培養培地（２ｍＭのＬ－グルタミン及び２５ｍＭのＨｅｐｅｓを含むＲＰＭＩ－１６４０；鉄（ＤＢＳＩ）を含む１０％ドナーウシ血清を補充した）に再懸濁した。ＨＥＲ２発現ＳＫ－ＯＶ－３細胞（カタログ番号ＨＴＢ－７７、ＡＴＣＣ）を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）熱不活性化ＤＢＳＩ及びペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、最終濃度５０単位／ｍＬペニシリンカリウム及び５０μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン（ロンザ、カタログ番号ＤＥ１７－６０３Ｅ）を補充したＭｃＣｏｙの５Ａ培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＢＥ１２－１６８Ｆ）で培養し、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＣＯ_２加湿インキュベータ内で３７℃で維持した。ＳＫ－ＯＶ－３細胞をコンフルエント付近まで培養した。細胞をトリプシン処理し、培養培地に再懸濁し、続いてセルストレーナーに通して、単一細胞懸濁液を得た。２．５×１０^４個のＳＫ－ＯＶ－３細胞を９６ウェル培養プレートの各ウェルに播種し、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートしてプレートに接着させた。続いて、ＳＫ－ＯＶ－３標的細胞を含む９６ウェルプレートの各ウェルに１×１０^５個のＰＢＭＣを添加して、４：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比を得た。続いて、上記のような二重特異性ＣＤ３ｘＨＥＲ２、ＣＤ３ｘｂ１２及びｂ１２ｘＨＥＲ２野生型及びその非活性化バリアントの用量応答シリーズを培養培地（０．００１～１０００ｎｇ／ｍＬの最終濃度、１０倍希釈）中で調製し、ＳＫ－ＯＶ－３細胞及びＰＢＭＣを含有する９６ウェル培養プレートのウェルに添加した。ＳＫ－ＯＶ－３標的細胞と２μＭスタウロスポリン（カタログ番号Ｓ６９４２－２００、Ｓｉｇｍａ）とのインキュベーションを、１００％腫瘍細胞殺傷のための参照として使用した。培地対照（ＳＫ－ＯＶ－３細胞、抗体なし、ＰＢＭＣなし）を０％腫瘍細胞殺傷の基準として使用した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で３日間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳで２回洗浄し、１０％のアラマーブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＤＡＬ１１００）を含有する１５０μＬの培養培地を各ウェルに添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした。５９０ｎｍの吸光度を測定した（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。データを、実験複製ごとに各ドナーについて計算した、生存ＳＫ－ＯＶ－３細胞のパーセンテージに対する用量応答として、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）で可視化した。データは、３つの独立したレプリケートから６人のドナーから得られた平均値±ＳＥＭである。

【0228】

定常重鎖領域に非活性化変異を有する全ての二重特異性ＣＤ３ｘＨＥＲ２抗体バリアントは、野生型様機能を有するＦｃ領域を有する、したがって非活性化変異を有さない二重特異性ＣＤ３ｘＨＥＲ２抗体バリアントに匹敵する効率で、ＳＫ－ＯＶ－３細胞の用量依存性細胞傷害を誘導した（図１０Ａ）。野生型様二重特異性ＣＤ３ｘｂ１２抗体は、野生型様二重特異性ＣＤ３ｘＨＥＲ２抗体バリアントよりも程度は低いが、ＳＫ－ＯＶ－３細胞の非特異的殺滅を誘導した。対照的に、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を有する二重特異性ＣＤ３ｘｂ１２抗体バリアントは、試験した最高濃度でＳＫ－ＯＶ－３細胞の部分的な非特異的細胞傷害性を依然として示したＮ２９７Ｇ変異を有するＣＤ３ｘｂ１２二重特異性抗体を除いて、試験した他の非活性化二重特異性ＣＤ３ｘｂ１２バリアントと同様に、ＳＫ－ＯＶ－３細胞の細胞傷害性を示さなかった（図１０Ｂ）。これは、このバリアントについて実施例１０で観察されたＰＢＭＣ培養物中のＴ細胞の観察された活性化（ＣＤ６９の上方制御）と一致している。野生型様二重特異性ｂ１２ｘＨＥＲ２抗体バリアントでは、ＳＫ－ＯＶ－３細胞の非特異的細胞傷害性がわずかに観察された。Ｅ２３３Ｐ－Ｌ２３４Ｖ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６ｄｅｌ－Ｓ２６７Ｋ変異を有する二重特異性ｂ１２ｘＨＥＲ２バリアントによる残留非特異的細胞傷害性を除いて、試験した他の二重特異性ｂ１２ｘＨＥＲ２抗体バリアントでは非特異的細胞傷害性は観察されなかった（図１０Ｃ）。

【0229】

全体として、癌抗原及びＴ細胞を標的とする二重特異性抗体バリアントの定常重鎖領域における新規Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異の導入は、非特異的細胞傷害性を効率的に回避し、特異的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を誘導する能力を保持することを可能にする。

【0230】

［実施例１２］
非活性化抗体バリアントの薬物動態（ＰＫ）分析
定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ３（ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４）及び抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントの薬物動態特性をマウス研究で分析した。

【0231】

この試験におけるマウスは、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｕｔｒｅｃｈｔ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に収容した。全てのマウスを個別に換気ケージで飼育し、食物及び水を自由に与えた。全ての実験は、指令（２０１０／６３／ＥＵ）から翻訳されたオランダ動物保護法（ＷｏＤ）に準拠しており、動物実験に関するオランダ中央委員会及び現地の倫理委員会によって承認された。ＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ－１７／ＩｃｒＨａｎ＠Ｈｓｄ－Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ，Ｅｎｖｉｇｏ）に、群当たり３匹のマウスを用いて５００μｇの抗体（野生型抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１、Ｆ４０５Ｌ変異を単独で、又は非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ若しくはＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒと組み合わせて有するそのバリアント、野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１、及びＫ４０９Ｒ変異を単独で、又は非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ若しくはＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒと組み合わせて有するバリアント）を静脈内注射した。血液試料（５０μＬ）を、抗体投与の１０分後、４時間後、１日後、２日後、８日後、１４日後及び２１日後に顔面静脈から採取した。血液をヘパリンを含むバイアルに収集し、続いて１０，０００ｇで５分間遠心分離した。血漿を、抗体濃度の決定まで－２０℃で保存した。

【0232】

総ｈＩｇＧ ＥＬＩＳＡにより、特異的ヒトＩｇＧ濃度を決定した。９６ウェルＭｉｃｒｏｌｏｎ ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に２μｇ／ｍＬの濃度でコーティングされた抗ヒトＩｇＧ（カタログ番号Ｍ９１０５、ロット番号８０００２６０３９５ Ｓａｎｑｕｉｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を捕捉抗体として使用した。その後、プレートを０．２％ＢＳＡを補充したＰＢＳでブロックした後、試料を添加し、ＥＬＩＳＡ緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．２％ウシ血清アルブミンを補充したＰＢＳ）で段階希釈し、プレートシェーカー上で室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。その後、プレートをヤギ抗ヒトＩｇＧ免疫グロブリン（カタログ番号１０９－０３５－０９８，Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートし、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンズチアゾリン－６－スルホン酸；ＡＢＴＳ；ロッシュ）で発色させた。２％シュウ酸（Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎ、カタログ番号３３５０６）を添加することによって反応を停止させた。注入に用いた各材料を基準曲線とした。吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で４０５ｎｍで測定した。

【0233】

抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びＫ４０９Ｒ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ、又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異を保有するそのバリアントの血清ＩｇＧ濃度（図１１Ａ）、並びに抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体及びＦ４０５Ｌ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ、又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異を保有するそのバリアントの血清ＩｇＧ濃度（図１１Ｂ）は同等であった。マウスに注射した全ての抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及び抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントについて測定した血漿中ＩｇＧ濃度は、ＳＣＩＤマウスにおける野生型ヒトＩｇＧ１の２コンパートメントモデル薬物動態によって予測される濃度と一致していた。全ての抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及び抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントについて計算されたクリアランス値は、それらの野生型対応物と同様であった（図１１Ｃ；注射後２１日目）。群間の変動は、主に、バッチ間のグリコシル化の違いによって引き起こされる可能性があり、フォーマットに関連しない可能性がある分布相の違いを反映する。ｔ１／２ベータは、全ての突然変異について同等であると思われた。

【0234】

要約すると、新規Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異を含む非活性化変異の導入は、マウスにおけるＩｇＧ１抗体バリアントの薬物動態に影響を及ぼさない。

【0235】

［実施例１３］
Ｆｃ領域におけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を保有する抗体バリアントの免疫原性評価
Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異を有するＩｇＧ１抗体バリアント（ＩｇＧ１－ＦＥＲ）の定常ドメインの臨床的免疫原性のリスクを、ＡｂｚｅｎａのｉＴｏｐｅ（商標）及びＴＣＥＤ（商標）インシリコ技術を使用して評価した。

【0236】

ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウェアは、試験タンパク質配列中の全ての可能な９量体ペプチドのアミノ酸側鎖と３４個のヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のオープンエンド結合溝との間の好ましい相互作用を予測する（Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｄｒｕｇｓ ＲＤ ９（６），ｐｐ．３８５－９６）。選択された対立遺伝子は、世界中で見られる最も一般的なＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子を表し、いかなる特定の民族集団において最も一般的に見られるものに起因する重み付けはない。これらの予測を野生型ヒトＩｇＧ１（ｍ）ｆ参照に存在するＭＨＣクラスＩＩ結合配列と比較することによって、新規結合配列を同定することが可能である。５０％以上のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に中程度及び高親和性で結合すると予測されるペプチドは、Ｔ細胞エピトープの存在と相関すると考えられる（Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ ５（１），ｐｐ．Ｒ４０－８）。ＴＣＥＤ（商標）は、様々なタンパク質、主に抗体を使用したエクスビボ免疫原性試験によって同定された既知のＴ細胞エピトープのデータベースである（Ｂｒｙｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２４（１），ｐｐ．１－８）。データベースは、予測された乱雑な中程度又は高い親和性を有するペプチドもデータベースに存在するかどうかを確認するためにＢＬＡＳＴ検索によって調査される。

【0237】

各９ｍｅｒを、潜在的な「適合」及びＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用に基づいてスコア化した。ソフトウェアによって計算されたペプチドスコアは、０～１の間にある。高い平均結合スコア（ｉＴｏｐｅ（商標）スコアリング関数で＞０．５５）を生じたペプチドを強調し、５０％以上のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド（すなわち、３４の対立遺伝子のうち１７）が高い結合親和性（スコア＞０．６）を有する場合、そのようなペプチドを、ＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含有する高いリスクと考えられる「無差別高親和性」ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドと定義した。有望な中程度の親和性ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは、＞０．５５の結合スコアで≧５０％の対立遺伝子に結合する（＞０．６の大多数なし）。ＴＣＥＤ（商標）を使用して配列の更なる分析を行った。これらの基準は、３４個の対立遺伝子のうちの２０個の開いたｐ１ポケットが大きな芳香族残基の結合を可能にするｐ１アンカー位置に存在する大きな芳香族アミノ酸（すなわち、Ｆ、Ｗ、Ｙ）の場合に変更された。これが起こる場合、無差別ペプチドは、２０個の対立遺伝子のサブセットの１０個以上に結合すると定義される。配列は、以前のエクスビボ研究においてＴ細胞応答を刺激した無関係なタンパク質／抗体由来のペプチド（Ｔ細胞エピトープ）間の高い配列相同性を同定するために、ＢＬＡＳＴ検索によってＴＣＥＤ（商標）を調べるために使用した。

【0238】

ｉＴｏｐｅ（商標）分析では、ＩｇＧ１－ＦＥＲに存在し、野生型ＩｇＧ１（ｍ）ｆには存在しない無差別の中程度又は高親和性ＭＨＣクラスＩＩ結合配列は同定されなかった。したがって、この分析に基づいて、ＩｇＧ１－ＦＥＲに基づく抗体について臨床的免疫原性のリスクの明らかな増加はない。

【0239】

［実施例１４］
非活性化抗体バリアントの糖分析
ＩｇＧ分子は、ＣＨ２領域に（ＩｇＧ１については位置Ｎ２９７に）単一の保存されたＡｓｎ（Ｎ）結合グリコシル化部位を有する。このＡｓｎ結合型グリカンのコア構造は、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びマンノース残基から構成される。ガラクトース、シアル酸、コアフコシル化及び二切断性ＧｌｃＮＡｃ（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｏｃｔ ２０；５：５２０）を用いて更なる伸長を行うことができ、Ｎ２９７において不均一にグリコシル化されたＩｇＧ１分子をもたらす。グリカンは、タンパク質の立体配座、安定性及び生物学的機能において重要な役割を果たす（Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４（４）：２８１－９９（２０１４））．したがって、有効性及び薬物動態特性が影響を受ける可能性があるため、ＩｇＧ１分子のグリコシル化変化は望ましくない。更に、グリカンの不均一性は、製造中に分析及び制御される必要があり、荷電グリカンは、放出試験又は特性評価に使用される画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）等の電荷に基づく分析アッセイの複雑さを更に増加させ得る。

【0240】

この実施例において、Ｎ結合型グリカンプロファイリングを、野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びＫ４０９Ｒ変異に加えてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ変異又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異を有するその非活性化バリアントに対して行った。更に、グリカンプロファイリングを、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｆ４０５Ｌ変異を有する抗ヒトＣＤ３（ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４）ＩｇＧ１抗体、又はＤ２６５Ａ若しくはＧ２３６Ｒ変異を更に有するそのバリアントに対して行った。

【0241】

ＩｇＧ１Ｎ結合型グリコシル化の評価を、示されるような２つの異なる方法によって行った（表２）。抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１野生型、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１、及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｆ４０５Ｌ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ変異のいずれかを有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントを、２－アミノベンズアミド（２－ＡＢ）標識によって分析した。Ｎ結合型グリカンプロファイリングを、２－ＡＢ標識グリカンのＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いた順相ＨＰＬＣ分析によって行った。ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（カタログ番号ＧＫＥ－５００６Ｄ、ＰＲＯｚｙｍｅ）とのインキュベーションによって、抗体からＮ結合グリカンを放出させた。その後、抗体をエタノール沈殿させ（氷冷）、除去した。放出されたグリカンを含む上清を真空乾燥した。得られたグリカンを可溶化し、続いて、ＨＰＬＣ分析のための還元的アミノ化によって還元末端のフルオロフォア２－ＡＢ（ＬｕｄｇｅｒＴａｇ ２－ＡＢ Ｇｌｙｃａｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔから、カタログ番号ＬＴ－ＫＡＢ－Ａ２、Ｌｕｄｇｅｒ）標識で標識した。次いで、蛍光検出と併せて勾配溶出を用いてＨＰＬＣプロファイルを得た。ＨＰＬＣピーク強度の積分は、オリゴ糖の全集団に対する個々のＮ結合型グリカン（例えば、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ等）のモル存在量のパーセンテージの尺度であった。ピークを、外部グリカン標準混合物（Ｌｕｄｇｅｒ由来の別個のグリカンを混合することによって調製した：ＮＧＡ２（＝Ｇ０、＃ＣＮ－ＮＧＡ２－２０Ｕ）、ＮＧＡ２Ｆ（＝Ｇ０Ｆ、＃ＣＮ－ＮＧＡ２Ｆ－２０Ｕ）、ＮＡ２（＝Ｇ２、＃ＣＮ－ＮＡ２－２０Ｕ）、ＮＡ２Ｆ（＝Ｇ２Ｆ、＃ＣＮ－ＮＡ２Ｆ－２０Ｕ）、ＭＡＮ５（＃ＣＮ－ＭＡＮ５－２０Ｕ）、ＭＡＮ６（＃ＣＮ－ＭＡＮ６－２０Ｕ）、ＭＡＮ８（＃ＣＮ－ＭＡＮ８－２０Ｕ）、ＭＡＮ９（＃ＣＮ－ＭＡＮ９－２０Ｕ）、Ａ１（＃ＣＮ－Ａ１－２０Ｕ）、Ａ１Ｆ（＃ＣＮ－Ａ１Ｆ－２０Ｕ）、Ａ２（＃ＣＮ－Ａ２－２０Ｕ）、Ａ２Ｆ（＃ＣＮ－Ａ２Ｆ－２０Ｕ））に基づいて割り当てた。

【0242】

Ｋ４０９Ｒに加えてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアント及びＦ４０５Ｌに加えてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用する液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）分析によって分析した。Ｎ結合型グリコシル化の同定及び相対定量を、還元型グリコシル化抗体重鎖に対して行った。重鎖の既知の一次アミノ酸配列を考慮すると、結合したＮ結合グリカンの質量同一性を同定することができた。簡潔には、抗体試料をＰＢＳ ｐＨ７．４（カタログ番号３６２３１４０、Ｂ．Ｂｒａｕｎ）中２００μｇ／ｍＬに希釈して総体積を５０μＬにした。次に、１μＬの１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ；カタログ番号Ｄ９１６３、Ｓｉｇｍａ）を５０μＬの試料に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、試料をガラスＱｓｅｒｔバイアル（カタログ番号１８６００１１２８ｃ、Ｗａｔｅｒｓ）に移し、ＬＣ－ＭＳに入れた。１μＬをＬＣカラムに注入し、移動相Ａ（０．１％ギ酸を含むＭｉｌｌｉ－Ｑ水、カタログ番号５６３０２－５０ｍｌ－Ｆ、Ｆｌｕｋａ）－移動相Ｂ（アセトニトリル中０．１％ギ酸、カタログ番号０００１９３４１０１ＢＳ、Ｂｉｏ Ｓｏｌｖｅ）勾配を用いて０．２ｍＬ／分の流速で２分で、２３％（Ｂ）から９５％（Ｂ）で抗体を溶出した。得られた生のｍ／ｚスペクトルを、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ４．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）ソフトウェアを用いてデコンボリューションした。結果として、デコンボリューションされたスペクトルは、グリコシル化重鎖質量の減少をもたらした。得られたピーク強度（スペクトルデコンボリューション後）は、オリゴ糖の全集団に対する個々のＮ結合型グリカン（例えば、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ等）のモル存在量の計算されたパーセンテージの尺度であった。図１２は、検出されたグリカン種の概略図を示す。

【0243】

異なるオリゴ糖の相対的存在量を知ることは、その構造の知識と相まって（図１２参照）、Ａ２Ｆ構造中の量に対するガラクトシル化及び荷電グリカンの総量の計算を可能にする。ここで百分率として計算される量はモル量、すなわち質量ではなく分子の数を表す。表２から、野生型ＩｇＧ１配列は、それぞれ０～１％及び１５～２５％の荷電グリカンの存在率及びガラクトシル化率を有すると計算される。非活性化Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ変異の荷電グリカン及びガラクトシル化のパーセンテージは、約１０％及び約６０％であった。

【0244】

抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントのグリコシル化の評価（表２）は、Ｋ４０９Ｒ変異と組み合わせた非活性化Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ変異の導入が、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１野生型抗体と比較して、Ｇ１又はＧ２及びそのバリアントとして示されるガラクトシル化を増加させ（Ｇ：ガラクトース）、Ａ１又はＡ２及びそのバリアントとして示される荷電グリカンの存在を増加させる（Ａ：シアル酸）ことを明らかにした。Ｆ４０５Ｌ変異に加えて非活性化Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ変異を有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントについても同様のパターンが観察された。Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｆ４０５Ｌ変異を有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントは、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１野生型抗体と同様のグリコシル化パターンを示したので、増加したガラクトシル化及び荷電グリカンの存在をＤ２６５Ａ変異の存在に割り当てることができる。これと一致して、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒ又は抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１－Ｆ４０５Ｌのいずれかに非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒを導入しても、ガラクトシル化の増加及び荷電グリカンの存在の増加はもたらされなかった。

【0245】

要約すると、ＩｇＧ１抗体の定常重鎖領域に非活性化Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ変異を導入すると抗体グリコシル化不均一性が増加し、ガラクトシル化が増加し、荷電グリカンの存在が増加するが、ＩｇＧ１抗体に非活性化Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異を導入すると、ＩｇＧ１の野生型定常領域に匹敵するグリカンプロフィールを保持することが可能になる。

【表4】

表２は、定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及び抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントのグリコシル化の分析を示す。抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１野生型（ｗｔ）又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するバリアント、並びにＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｆ４０５Ｌ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ変異を有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１を、２－ＡＢ標識法によって分析した。Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異をそれぞれ有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及び抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントのグリカンプロフィールを、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって評価した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＬＣ－ＭＳ法とは対照的に、２－ＡＢ標識法は、Ｇ２及びマンノース６並びにＡ２Ｆ及びマンノース９（該当なし；ｎａ）を別々に割り当てることができないため、両方の合計が示されている。Ｇ０Ｆ－ＧＮ、Ｇ１Ｆ－ＧＮ、及びＭａｎ７は、２－ＡＢ法で評価されず、適用できない（ｎａ）と述べられている。試験したバリアントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ、ＩｇＧ１－ＦＥ－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１－ＦＥＲ－Ｆ４０５Ｌ、ＩｇＧ１－ＦＥＡ－Ｆ４０５Ｌであり、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ａ－Ｇ２３６Ｒ、ＦＥ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ、及びＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａである。検出されたグリカン種の概略図を図１２に示す。

【0246】

［実施例１５］
非活性化抗体バリアントによる制御されたＦａｂアーム交換の効率
実施例１１に示されるような標的細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性等の特定の用途は、一方のＦ（ａｂ）アームが標的Ａと係合し得、他方のＦ（ａｂ）アームが標的Ｂと係合する二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）バリアントの生成及び使用を必要とする。

【0247】

ここで、本発明者らは、効率的なヘテロ二量体形成に必要とされる単一特異性抗体の１つにそれぞれ存在するＦ４０５Ｌ変異又はＫ４０９Ｒ変異のいずれかに加えて、親単一特異性抗体の定常重鎖領域に非活性化変異を導入すると、実施例１に記載されるように、制御されたＦａｂアーム交換（ｃＦＡＥ）によってｂｓＡｂバリアントが生成される効率を評価した。簡潔には、抗体を等モル濃度で混合し、７５ｍＭ２－メルカプトエチルアミン－ＨＣｌ（２－ＭＥＡ；カタログ番号３００７８、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に３１℃で５時間インキュベートした。その後、ＰＢＳに対する緩衝液交換を実施例１に記載されるように達成し、濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－２０００－ＥＵ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して２８０ｎｍでの吸光度によって測定した。質量分析を行い、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用して二重特異性及び残留ホモ二量体含有量を決定した。

【0248】

ｃＦＡＥの効率の評価により、各々が単一特異性抗体の１つに存在するＦ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒ変異に加えて非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒを導入すると効率的なｃＦＡＥがもたらされ、集団の少なくとも９５％がＩｇＧ１ｂｓＡｂ（ＢｉｓＧ１）であり、残りの集団は単一特異性抗体の一方又は両方であることが明らかになった（図ではＩｇＧ１－Ａ及びＩｇＧ１－Ｂとして示されている）；図１３Ａ）。更に、非活性化変異、すなわちＦ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒ変異に加えて１つの単一特異性抗体バリアントに存在するＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、及びＦ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒ変異に加えて他の単一特異性抗体バリアントに存在するＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａの非対称分布を有するｂｓＡｂバリアントを作製した場合に、ｃＦＡＥの効率を評価した。分析により、各々が単一特異性抗体の１つに存在するＦ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒ変異に加えて、ｂｓＡｂの両アームにＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を有するバリアントについて示されるように、ｂｓＡｂバリアント（図１３Ｂ、図１３Ｃ）の作製における同様の効率が明らかにされた（図１３Ａ）。

【0249】

要約すると、ＩｇＧ１定常重鎖領域に新規Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を有する抗体バリアントは、単一特異性抗体の１つにそれぞれ存在するＦ４０５Ｌ及びＫ４０９Ｒ変異を使用した制御されたＦａｂアーム交換によってｂｓＡｂバリアントを効率的に形成する能力を保持し、ヘテロ二量体化を可能にし、単一特異性ホモ二量体の形成を防止する。

【0250】

［実施例１６］
非活性化抗体バリアントの産生レベル
この実施例では、Ｆ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒ変異のいずれかに加えて、定常重鎖領域にＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異のいずれかを有する抗体バリアントの産生レベルを評価した。

【0251】

実施例１に記載したように、全ての抗体バリアントをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で産生した。一方の非活性化抗体バリアントについては特定のクローンを使用するが他方については使用しないことによる産生力価の差を回避するため、及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒのいずれかの非活性化変異を定常重鎖領域に有する抗体バリアントの産生力価の直接比較を可能にするために、同じ抗体クローンを各群、すなわちＦ４０５Ｌ抗体バリアント又はＫ４０９Ｒ抗体バリアント内に表す。

【0252】

産生レベルの分析により、Ｆ４０５Ｌ変異に加えてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異を有する非活性化抗体バリアント（黒い丸）が、Ｆ４０５Ｌ変異に加えて非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａを有する抗体バリアント（白い丸；図１４）と同様のレベルで産生されることが明らかになった。Ｋ４０９Ｒ変異に加えてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を有する抗体バリアントの産生レベル（黒い四角）は、非活性化変異に加えてＦ４０５Ｌ変異を含む抗体バリアントと類似していたが、Ｋ４０９Ｒ変異に加えてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異を有する抗体バリアントでは、平均産生レベルのわずかな増加が観察された（白い四角；図１４）。

【0253】

要約すると、Ｆ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒ突然変異に加えてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化突然変異を有するバリアントと比較して、Ｆ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒ突然変異のいずれかに加えてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ突然変異を有する非活性化抗体バリアントの産生レベルに大きな差は観察されなかった。

【0254】

［実施例１７］
ＰＥＧ中点、ＤＬＳ及びＤＳＦ分析によるＩｇＧ１非活性化抗体バリアントの安定性及び溶解性の評価
定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントのタンパク質安定性及び溶解特性を、ＰＥＧ誘導沈殿アッセイ、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）アッセイを使用して評価した。

【0255】

抗ヒトＣＤ２０及び抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１（ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４）抗体バリアントの試料を、およそ２０ｍｇ／ｍＬ（濃度範囲１８．７～２１．６ｍｇ／ｍＬ；抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントに適用される濾過）の濃度でＰＢＳ ｐＨ７．４に製剤化した。ＰＢＳを非最適な製剤として使用して、タンパク質安定性のより良好な比較を可能にした。

【0256】

コンフォメーションタンパク質の安定性を評価するために、外因性色素Ｓｙｐｒｏ－Ｏｒａｎｇｅ（ＤＭＳＯ中５０００倍濃縮物、カタログ番号Ｓ５６９２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が変性ＩｇＧによって露出された疎水性領域に結合することによって引き起こされる蛍光強度の変化を検出することができるｉＱ５ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）においてＤＳＦを行った。Ｓｙｐｒｏ－ＯｒａｎｇｅをＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＳＨ３Ａ３８３．０３）ｐＨ７．４又は３０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４（カタログ番号２５０２２－１ＫＧ－Ｒ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で３２０倍希釈して７５ｍＭの濃度にした。熱融解曲線は、分析されたＩｇＧの制御された段階的な熱変性中に増加する蛍光を測定することから導き出すことができる。したがって、２０μＬの７５ｍＭのＳｙｐｒｏ－Ｏｒａｎｇｅ（ＰＢＳ ｐＨ７．４又は３０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４のいずれかで）と混合した、Ｋ４０９Ｒ変異、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異のいずれかを有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアント、又はＦ４０５Ｌ変異、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異を有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントの５μＬ試料（ＰＢＳで希釈；濃度範囲１ｍｇ／ｍＬ＋／－１０％）を、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ９６ウェルＰＣＲプレートで二連で調製した。蛍光（励起４８５ｎｍ、発光５７５ｎｍ）を、２５℃～９５℃の範囲の上昇する温度で、０．５℃／増分及び１５秒の持続時間＋全ウェルの蛍光を記録するのに必要な時間の段階的な増分で記録した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．０を使用してデータを分析し、ソフトウェアによって蛍光対温度のグラフから融点を決定した。

【0257】

コロイド安定性の尺度として、上述の抗体バリアントが溶液中で凝集する傾向を評価するためにＤＬＳ分析を行った。ＰＢＳ ｐＨ７．４中の２０μＬの上記抗体バリアント（濃度範囲１ｍｇ／ｍＬ＋／－１０％）を、ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、Ｄｙｎａｍｉｃｓ ７ソフトウェアを用いて分析した。試料を円形３８４ウェルＩＱ－ＬＶプレート（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０１１－００１１０）に三連で適用し、２，１１１ｘｇで３分間遠心分離し、パラフィン油で覆った。測定の前に、プレートを再び２，１１１ｘｇで３分間遠心分離した。熱スキャン測定は、実験を通して連続的に上昇する温度（１℃の上昇／各特定の試料のデータ点）で実施した。キュムラント適合手順を使用してデータを分析し、見かけの半径を決定した。ソフトウェアアーチファクトによってしばしば引き起こされ、各取得で一貫して観察されないより低い半径を有するピークを除いて、２．１ｎｍのカットオフ値を使用した。屈折率１．３３３及び粘度１．０１９ｃＰを２５℃のＰＢＳ緩衝液に使用した（ダイナミクスソフトウェアで提供される標準値）。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌでデータを処理して、凝集の開始（Ｔ_ａｇｇ）を決定した。全てのウェルについて半径の平均及び標準偏差（ｎ＝１０、最初の１０回の測定）を計算することによって、Ｔ_ａｇｇを決定した。各測定の９９．９９％信頼区間を個別に設定することにより、信頼区間外となる最初の連続値（２５℃から８０℃まで）をＴ_ａｇｇとしてタグ付けした。５つの連続測定を実験ごとに３回実施した。

【0258】

ＰＥＧ誘導沈殿アッセイを実施して、相対タンパク質溶解度を評価した。２つの緩衝液を調製した。緩衝液Ａ：５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０（リン酸ナトリウム一塩基性；Ｆｌｕｋａ、カタログ番号１７８４４＋リン酸ナトリウム二水和物、Ｆｌｕｋａカタログ番号７１６３３）；緩衝液Ｂ：５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０＋４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ５４１３）。異なる量の緩衝液Ｂを緩衝液Ａと混合して、０％～４０％ＰＥＧの範囲の一連の１１の異なるＰＥＧ濃度を生成した。各ＰＥＧ濃度緩衝液の一定分量（８０μＬ）を９６ウェルプレート（ＵＶ Ｓｔａｒ（登録商標）９６ウェルプレート、半分の面積、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、カタログ番号６７５８０１）の異なるウェルに添加した。各抗体試料（ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍＬに希釈）のうち、２０μＬを、一連のＰＥＧ含有緩衝液を含むウェルに添加する。プレートをシールで覆い、７５０ｒｐｍで５分間振盪した。プレートを室温で一晩放置し、続いて５分間振盪した。次いで、プレートを４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、沈殿した抗体を除去した。各ウェルから、遠心分離した沈殿物を乱すことなく、８０μＬを新しいＵＶ Ｓｔａｒ ９６ウェルプレートに慎重に移した。Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）２マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＢｉｏＳＰＸ）で２８０ｎｍでの吸光度（可溶化タンパク質の量と相関するＡ２８０）を測定し、１００μＬの体積に再計算し（経路長補正）、ブランク値（抗体なしのＰＥＧ）を差し引いた。補正されたＡ２８０値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８におけるＰＥＧ濃度に対してプロットした。データを非線形回帰を用いて分析し、ＰＥＧ中点（％）は、抗体の５０％が沈殿した試験試料の濃度（すなわち、０％ＰＥＧと比較してＡ２８０で５０％の損失）を反映する。ＰＥＧ中間点は溶解度の尺度として使用され、より高いＰＥＧ中間点はより良好な溶解度に対応する。

【0259】

上記のアッセイの結果を表３、４に要約する。ＤＳＦ分析により、ｐＨ７．４で６８．０℃の融解温度（Ｔ_ｍ）が明らかになり、これはｐＨ４．０で５６．０℃のＴ_ｍ１及び６２．０℃のＴ_ｍ２に低下した。ｐＨ７．４での抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒについて記録されたＴ_ｍは、Ｋ４０９Ｒ含有バリアントに匹敵した（それぞれ６７．８℃対６８．０℃）。ｐＨ４．０では、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するバリアントは、５８．０℃で１つのＴ_ｍを示した。対照的に、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントは、ｐＨ７．４で６３．３℃のＴ_ｍ１及び６８．５℃のＴ_ｍ２の減少を有し、一方、ｐＨ４．０では３つのＴ_ｍ、すなわち４８．５℃、５７．０℃及び６１．０℃が記録された。抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体について、Ｆ４０５Ｌ変異のみ、又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異のいずれかを有するバリアントは、ｐＨ７．４（６８．０℃）で同じＴ_ｍを有し、ｐＨ４．０（Ｆ４０５Ｌ：５３．５及び７０．５℃；Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ：５４．５及び７０．８℃）で非常に類似したＴ_ｍ１及びＴ_ｍ２を有していた。ｐＨ７．４では、ＩｇＧ１－ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ抗体バリアントのＴ_ｍは、Ｆ４０５Ｌ及び２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ含有バリアントと比較して減少した（６３．０℃）。また、ｐＨ４．０において、バリアントＩｇＧ１－ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌについて記録された第１のＴ_ｍは、他のＩｇＧ１－ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４バリアントと比較して減少し（４８．５℃）、一方、７１．０℃の第２のＴ_ｍが、他のＩｇＧ１－ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４バリアントと一致するＩｇＧ１－ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌについて観察された。

【0260】

抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒ及び抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ抗体バリアントは、最も低い凝集温度（Ｔ_ａｇｇ；それぞれ５７．９℃及び５８．５℃）を示し、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ含有バリアント（５９．９℃）が続く。ＩｇＧ１－ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４バリアントでは、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ変異を有するバリアント（５８．７℃）で最も低いＴ_ａｇｇが観察され、続いてＦ４０５Ｌ含有バリアント及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ含有バリアントが続く（それぞれ６１．７℃及び６２．０℃）。

【0261】

Ｋ４０９Ｒ変異、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異のいずれかを有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントは、ＰＥＧ誘導沈殿アッセイによって決定されるように、同等の相対溶解度プロファイルを示した。全体として、抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントは、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントと比較して低い相対溶解度を示した。Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ又はＬ２３４５Ｆ－Ｌ２３Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異を有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントは、溶解度に関して同等であった。これらのバリアントは両方とも、抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１－Ｆ４０５Ｌバリアントよりも比較的わずかに可溶性が低かった。

【0262】

まとめると、非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントは、Ｋ４０９Ｒ含有対照バリアントと比較して、溶解性及び凝集傾向に関して同等のプロファイルを示した。しかしながら、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するバリアントは、Ｋ４０９Ｒ含有対照バリアントと同等のタンパク質安定性プロファイルを示したが、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒバリアントは、より低いタンパク質安定性プロファイルを示した。抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントについては、Ｆ４０５Ｌ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異を有するバリアントは、同等の凝集傾向及びタンパク質安定性プロファイルを示した。両方の非活性化バリアントの溶解度は、Ｆ４０５Ｌ含有対照バリアントと比較して低下した。Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ変異を有するバリアントは、Ｆ４０５Ｌ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異を有するバリアントと比較して、タンパク質安定性の低下及び凝集する傾向がわずかに高いことを示した。Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ含有バリアントの溶解度は、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ含有バリアントに匹敵した。

【0263】

結論として、ＰＢＳ中に高濃度で製剤化した場合、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ２０及びＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントは、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ含有バリアントよりもロバストなタンパク質安定性プロファイルを示した。更に、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントは、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ含有バリアントよりもわずかに低い凝集傾向を示した。

【0264】

表３は、定常重鎖領域に非活性化突然変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及び抗ＣＤ３ ＩｇＧ１（ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４）抗体バリアントについて、ＤＳＦ分析によって決定されたタンパク質立体配座安定性を示す。ＤＳＦ：示差走査蛍光測定；Ｔ_ｍ：融解温度。

【0265】

表４は、定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及び抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントについて、ＰＥＧ中点決定アッセイによって決定されるタンパク質溶解度、及びＤＬＳ分析によって決定される凝集傾向を示す。Ｔ_ａｇｇ：凝集温度；ＰＥＧ：ポリエチレングリコール；ＤＬＳ：動的光散乱。

【表5】

【表6】

［実施例１８］
１又は４ヶ月間の異なる温度での貯蔵後のＩｇＧ１非活性化抗体バリアントのタンパク質安定性に対する影響
実施例１７では、定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントのタンパク質安定性及び溶解度プロファイルを評価した。ここでは、このような抗体バリアントのタンパク質安定性を、異なるアッセイを使用して２～８℃又は４０℃で１ヶ月又は４ヶ月間保存した後に評価した。

【0266】

抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及び抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１（ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４）抗体バリアントの試料を、およそ２０ｍｇ／ｍＬ（濃度範囲１８．７～２１．６ｍｇ／ｍＬ；抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントに適用される濾過）の濃度でＰＢＳ ｐＨ７．４に製剤化した。ＰＢＳを非最適な製剤として使用して、タンパク質安定性のより良好な比較を可能にした。抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントは、Ｋ４０９Ｒ変異、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異のいずれかを有していたが、抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントは、Ｆ４０５Ｌ変異、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異のいずれかを有していた。試料を２～８℃で１ヶ月間、４０℃で１ヶ月間、２～８℃で４ヶ月間、４０℃で４ヶ月間インキュベートした。その後、全ての試料を高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ－ＳＥＣ）、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した。

【0267】

ＨＰ－ＳＥＣ分析は、ＴＳＫカラム（Ｇ３０００ＳＷｘｌ；Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号６０９５００６）及びＴＳＫ－ゲルＳＷｘｌガードカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号６０９５００７）を使用して、Ｗａｔｅｒｓ ２４８７二重λ吸光度検出器（Ｗａｔｅｒｓ）を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ２７９５分離モジュール（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して行った。試料（ＰＢＳ ｐＨ７．４で５ｍｇ／ｍＬに希釈）を、移動相０．１Ｍ硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号３１４８１）／０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６．８（ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号１７８４４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４．２Ｈ_２Ｏ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号７１６３３）を使用して１ｍＬ／分で運転した。結果をＥｍｐｏｗｅｒ ３ソフトウェアを使用して処理し、ピークごとに総ピーク高さのパーセンテージとして表した。

【0268】

ｃＩＥＦ分析は、ＩＣＥ３ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を用いて行った。各抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントを、最終的に０．３ｍｇ／ｍＬの抗体、０．３５％メチルセルロース（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、カタログ番号１０１８７６）；２％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ３－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－０４５６－０１）；６％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ８－１０．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，、カタログ番号１７－０４５５－０１）；０．５％ｐＩマーカー７．６５及び０．５％ｐＩマーカー１０．１０（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、カタログ番号１０２４０７及びカタログ番号１０２２３２）を含有するアッセイミックスと混合した。フォーカシングは、１５００Ｖ（プレフォーカシング）で１分間、３０００Ｖで７分間行った。抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントを、最終的に０．３ｍｇ／ｍＬの抗体；３．２Ｍの尿素（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号３３２４７－１ｋｇ）；０．３５％メチルセルロース；２％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ３～１０；６％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ８～１０．５；０．５％ｐＩマーカー７．６５及び０．５％ｐＩマーカー１０．１０を含有するアッセイミックスと混合した。フォーカシングは、１５００Ｖ（プレフォーカシング）で２分間、３０００Ｖで９分間行った。全キャピラリー吸収画像を電荷結合素子カメラによって撮影した。ピークプロファイルの較正後、Ｅｍｐｏｗｅｒ ３ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）によってデータをｐＩ及び面積（％）について分析した。

【0269】

ＣＥ－ＳＤＳは、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ試薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＣＬＳ９６０００８）をほとんど修飾することなく使用して、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＬａｂＣｈｉｐ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号７６０４９９）上でＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＣＬＳ１３８１６０）を使用して行った。試料をＰＢＳ ｐＨ７．４で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、２μＬの希釈試料＋７μＬの変性溶液＋３５μＬのＭｉｌｌｉＱ水によって試料を調製した。試料を９６ウェルＢｉｏ－Ｒａｄ ＨＳＰ９６０１プレート（カタログ番号４ＴＩ－０９６０）中で調製した。分析は、非還元条件及び還元条件（ＤＴＴの添加）の両方で行った。試料を７０℃で３分間インキュベートすることによって変性させた。チップを製造者の説明書に従って調製し、試料をＨＴ抗体分析２００高感度設定で実行した。タンパク質サイズ（ｋＤａ）及び純度（％）を、Ｌａｂｃｈｉｐ ＧＸＩＩソフトウェアＶ５．３．２１１５．０を使用して分析した。

【0270】

動的光散乱（ＤＬＳ）は、本質的に実施例１７に記載されるように行ったが、ここでは、ＤＬＳを２５℃の一定の温度で行って平均粒径を決定した。

【0271】

全ての結果を表５～７に要約する。ＨＰ－ＳＥＣによって検出されたように、２～８℃で４ヶ月間の抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ１－ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４抗体バリアントの保存は、１ヶ月の曝露と比較して、試料中に検出された多量体の割合に大きな影響を及ぼさなかった。存在する多量体のパーセンテージは、４０℃に４ヶ月間さらされた抗ヒトＣＤ２０及びＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントを含有する試料において最も高く、４０℃に１ヶ月間さらされたものはより低い程度であった。４０℃の抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１試料のうち、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するバリアントの試料は、Ｋ４０９Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異のいずれかを有するバリアントの試料よりも高い割合の多量体を含んでいた。更に、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントを含有する試料間で分解の割合の差は観察されなかった。抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントの場合、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ含有バリアントの試料を４０℃に４ヶ月間、及びより少ない程度で４０℃に１ヶ月間供した後、試料中に多量体の増強された割合が検出されたが、多量体の割合は、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ又はＦ４０５Ｌ変異を有するバリアントの試料について同等であった。抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌバリアントを４０℃に１ヶ月間曝露すると、比較的高い割合のタンパク質が分解され、４ヶ月の曝露後に次第に分解された。

【0272】

ｃＩＥＦ分析を使用して、異なるストレス条件に応答した抗体バリアントの酸性、中性及び塩基性ピークの割合の変化を研究した。試料中に存在する酸性タンパク質のパーセンテージの変化は、脱アミドの代用尺度として使用される。注目すべきことに、中性ピークは、いずれかの温度で１ヶ月間保存した試料について２つのピークに分割され、これを中性タンパク質のパーセンテージとして合計した。酸性タンパク質のパーセンテージの増加は、４０℃で１から４ヶ月間の貯蔵の間に全ての試料で観察されたが、２～８℃で貯蔵した試料については、貯蔵の１から４ヶ月間の酸性タンパク質のパーセンテージのこのような増加は観察されなかった。酸性タンパク質のパーセンテージは、試験した全ての抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントについて同等であった。Ｆ４０５Ｌ変異のみ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異のいずれかを有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントはまた、４０℃で４ヶ月の貯蔵後に最大７９％の酸性タンパク質に達したＦ４０５Ｌ含有バリアントを除いて、全ての試験条件で同等の割合の酸性タンパク質を示したが、非活性化変異を有するバリアントはこの条件でそれぞれ９８％及び９６％に達した。

【0273】

ＣＥ－ＳＤＳによって検出されたインタクトなタンパク質のパーセンテージは、試験したストレス条件に応答したタンパク質の完全性及び分解の尺度として役立った。抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントは、試料を２～８℃で１又は４ヶ月間保存した後、又は４０℃で１ヶ月間保存した後、それらのインタクトな構造をほとんど保持した。しかしながら、検出されたインタクトＩｇＧの割合は、全ての抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントについて試料を４０℃に４ヶ月間曝露した後に減少し、Ｋ４０９Ｒ含有バリアントについて最も強い分解が観察された。同様のパターンが、ＨＣ及びＬＣの割合を研究したときに観察されたが、Ｋ４０９Ｒ変異又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するバリアントが同様の割合のＨＣ及びＬＣを示したことを除いて、程度はより低かった。抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントは同様の分解パターンを示し、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ含有バリアントは、４０℃への曝露後にインタクトＩｇＧタンパク質の最低パーセンテージを示した。抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントのＨＣ及びＬＣの割合は全体的に同様のパターンを示したが、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ変異を有するバリアントでは、ＨＣ及びＬＣの最も低い割合が検出された。

【0274】

ＤＬＳ分析を行って、抗体バリアント試料を、凝集レベルの代用尺度である示されたストレス条件に供した後の平均粒径（半径）を決定した。全ての抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントについて、試料を４０℃に４ヶ月間曝露すると、試験した他の条件と比較して平均粒子半径が実質的に増加した。全ての試験条件において、Ｋ４０９Ｒ及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒバリアントと比較して、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒバリアントを有するバリアントで最も高い平均粒子半径が検出された。粒子は、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ含有バリアントを含有する試料の出発材料中に既に存在していた。抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントについては、全ての試験条件において、抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１－Ｆ４０５Ｌバリアントについて比較的大きな平均粒径が検出された。これらのより大きな半径の原因は、粒子が出発材料中に既に存在していたので、印加された応力条件とはおそらく無関係である。ストレス後に平均粒径の増加は観察されない。非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌを有するバリアントについて、実質的により低い平均粒径が検出された。

【0275】

要約すると、定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０及びＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントの１～４ヶ月間の４０℃でのインキュベーションは、２～８℃で保存したバリアントと比較して多量体化の増加をもたらした。Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒを有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントでは、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するバリアントよりも多くの多量体化が観察されたが、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異を有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１のバリアントは、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ変異を有するバリアントよりも多くの多量体化を示した。一般に、脱アミド化タンパク質の代用尺度として使用される酸性タンパク質の割合の増加は、２～８℃で１又は４ヶ月間保存した場合、試験した抗体バリアントのいずれについても観察されなかった。４０℃で１ヶ月間保存した試料は、２～８℃での保存と比較して比較的多くの酸性タンパク質を含有していたが、４０℃で４ヶ月間保存した後、試験した全てのバリアントについて酸性タンパク質の割合の更なる増加が観察された。４０℃で貯蔵した後、全ての抗体バリアントでインタクトなタンパク質がより少なく検出され、これは４ヶ月の貯蔵後に最も顕著であった。抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌバリアントは、４０℃で４ヶ月間保存した後に検出されたインタクトタンパク質の割合のわずかにより強い減少を示した。最後に、４０℃で４ヶ月間保存した場合、全ての抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントについて、より多くの凝集が観察された。抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントのうち、非活性化変異を有する両バリアントは、Ｆ４０５Ｌ含有バリアントよりも実質的に少ない凝集体を含有した。

【0276】

Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異のいずれかを有する抗ヒトＣＤ２０及びＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントの両方について、許容可能な安定性プロファイルが観察された。４０℃で４ヶ月間保存すると、試験した全ての抗体バリアントの安定性プロファイルが低下した。

【0277】

表５は、２～８℃又は４０℃で１ヶ月間又は４ヶ月間保存された定常重鎖領域に非活性化変異又は単一ヘテロ二量体化促進変異を有する抗ヒトＣＤ２０及びＣＤ３ ＩｇＧ１（ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４）抗体バリアントを含む試料における、ＨＰ－ＳＥＣ分析によって検出される多量体、単量体及び分解されたタンパク質の割合を示す。ＨＰ－ＳＥＣ：高性能サイズ排除クロマトグラフィー。

【0278】

表６は、ｃＩＥＦ分析によって決定された、２～８℃又は４０℃で１又は４ヶ月間保存された、定常重鎖領域における非活性化変異又は単一ヘテロ二量体化促進変異を有する抗ヒトＣＤ２０及びＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントを含有する試料中に存在する酸性、中性及び塩基性アイソフォームのパーセンテージを示す。試料中に存在する酸性アイソフォームのパーセンテージの変化は、試料脱アミドのレベルの代用である。ＣＩＥＦ：キャピラリー等電点電気泳動。

【0279】

表７は、２～８℃又は４０℃で１ヶ月間又は４ヶ月間保存した定常重鎖領域に非活性化変異又は単一ヘテロ二量体化促進変異を有する抗ヒトＣＤ２０及びＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントを含有する試料において検出された、非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳ分析によって決定されるインタクトなタンパク質並びにＨＣ及びＬＣの合計のパーセンテージ、並びにＤＬＳ分析によって決定される粒子の平均半径（ｎｍ）を示す。ＣＥ－ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウムのキャピラリー電気泳動；ＤＬＳ：動的光散乱。

【表7】

【表8】

【表9】

［実施例１９］
ＩｇＧ１非活性化抗体バリアントの安定性に対する凍結／融解の影響
定常重鎖領域に非活性化変異を有するＩｇＧ１抗体バリアントの安定性に対する凍結／解凍サイクルの影響を、実施例１８に記載のアッセイを使用して評価した。

【0280】

抗ヒトＣＤ２０及びＣＤ３ ＩｇＧ１（ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４）抗体バリアントの試料を、およそ２０ｍｇ／ｍＬ（濃度範囲１８．７～２１．６ｍｇ／ｍＬ；抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントに適用される濾過）の濃度でＰＢＳ ｐＨ７．４に製剤化した。ＰＢＳを非最適な製剤として使用して、タンパク質安定性のより良好な比較を可能にした。抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントは、Ｋ４０９Ｒ変異、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異のいずれかを有していたが、抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントは、Ｆ４０５Ｌ変異、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異のいずれかを有していた。２つの独立した同一の試料を＜－６５℃で凍結し、３サイクルで室温（ＲＴ）に解凍した。続いて、実施例１８に記載されているように、ＨＰ－ＳＥＣ、ｃＩＥＦ、ＣＥ－ＳＤＳ及びＤＬＳを使用してタンパク質安定性を試験した。

【0281】

凍結及び解凍の３サイクル後、ＨＰ－ＳＥＣによって決定されるように、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントを含有する試料において多量体の割合の増加が観察されるが、試料中に存在する多量体の割合は低い（参照試料では０．７％～１．２％、凍結融解試料では１．８％～２．８％の範囲）。抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントについては、０．２％～０．７％の範囲の検出された多量体のパーセンテージは、信頼できる結論を可能にするには低すぎると考えられた。

【0282】

ｃＩＥＦ分析によって決定した場合、抗ヒトＣＤ２０及びＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントの凍結及び融解時に、酸性タンパク質のパーセンテージに実質的な差は検出されなかった。全体として、Ｋ４０９Ｒ又はＦ４０５Ｌのいずれかと組み合わせてＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ変異を有するバリアントは、おそらくＤ２６５Ａのシアリル化に起因して、参照試料においても酸性タンパク質の最も高いパーセンテージを示した。

【0283】

抗体バリアント試料の凍結及び解凍はまた、ＩｇＧ１バリアントのいずれについてもインタクトタンパク質の割合に影響せず、インタクトタンパク質の割合は９９％～１００％の範囲であった。同様に、ＨＣ及びＬＣの割合も、試料の凍結及び解凍によって影響を受けなかった。

【0284】

ＤＬＳ分析によって評価した平均粒径（半径）は、試料の凍結及び解凍による影響を受けなかった。Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するバリアントについては、比較的より多くの抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントの凝集体が検出されたが、抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントについては、Ｆ４０５Ｌ含有バリアントについて比較的多くの凝集体が検出された。

【0285】

要約すると、Ｋ４０９Ｒ又はＦ４０５Ｌのいずれかと組み合わせた非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒを有する抗ヒトＣＤ２０及びＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントを含有する試料の凍結及び解凍は、参照試料と比較して、多量体化、脱アミド化、又はタンパク質分解の関連する増強をもたらさなかった。したがって、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ変異のいずれかを有する抗体バリアントは、反復凍結／解凍サイクル時にタンパク質安定性を同様に保持することができると結論付けられた。

【0286】

表８は、３回の凍結／解凍サイクルに供した定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及び抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントを含有する試料における、ＨＰ－ＳＥＣ分析によって検出される多量体及び単量体の割合を示す。示されている値は、３回の凍結／解凍サイクルに供された２つの個々の試料の平均である。ＨＰ－ＳＥＣ：高性能サイズ排除クロマトグラフィー。

【0287】

表９は、ｃＩＥＦ分析によって決定した、１回又は２回の凍結／解凍サイクルに供した定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０及びＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントを含有する試料中に存在する酸性、中性及び塩基性アイソフォームのパーセンテージを示す。試料中に存在する酸性タンパク質のパーセンテージの変化は、脱アミドの代用尺度として使用される。示されている値は、３回の凍結／解凍サイクルに供された２つの個々の試料の平均である。ＣＩＥＦ：キャピラリー等電点電気泳動。

【0288】

表１０は、ＣＥ－ＳＤＳ分析によって決定されるインタクトなタンパク質及び総ＨＣ＋ＬＣのパーセンテージ、並びに３回の凍結／解凍サイクルに供された定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０及びＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントを含有する試料において検出されたＤＬＳ分析によって決定される平均半径（ｎｍ）を示す。示されている値は、３回の凍結／解凍サイクルに供された２つの個々の試料の平均である。ＣＥ－ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウムのキャピラリー電気泳動；ＤＬＳ：動的光散乱。

【表10】

【表11】

【表12】

［実施例２０］
ＩｇＧ１非活性化抗体バリアントの安定性に対する低ｐＨ誘導ストレスの影響
実施例１８では、定常重鎖領域に非活性化変異を有するＩｇＧ１抗体バリアントの低温又は高温保存の影響を、一連のタンパク質安定性アッセイを使用して評価した。同じアッセイを実施例１９に適用して、そのようなＩｇＧ１抗体バリアントの安定性に対する凍結／解凍サイクルの影響を評価した。ここで、抗体治療薬開発中のウイルス不活化は低ｐＨ条件下で行われることが多いので、低ｐＨ誘導ストレスの影響を実施例１８に記載のアッセイを使用して評価する。

【0289】

抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及び抗ヒトＣＤ３（ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４）ＩｇＧ１抗体バリアントの試料を、およそ２０ｍｇ／ｍＬ（濃度範囲１８．７～２１．６ｍｇ／ｍＬ；抗ヒトＣＤ３抗体バリアントに適用される濾過）の濃度でＰＢＳ ｐＨ７．４に製剤化した。抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントは、Ｋ４０９Ｒ変異、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異のいずれかを有していたが、抗ヒトＩｇＧ１抗体バリアントは、Ｆ４０５Ｌ変異、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異のいずれかを有していた。示された抗体バリアントをＰＢＳ（参照）中で製剤化し、１時間（室温で）又は２４時間（２～８℃で）０．０２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｃ１９０９－５００Ｇ）に緩衝液交換し、続いて別の緩衝液交換をしてＰＢＳに戻した。続いて、実施例１８に記載されているように、ＨＰ－ＳＥＣ、ｃＩＥＦ、ＣＥ－ＳＤＳ及びＤＬＳを使用してタンパク質安定性を試験した。

【0290】

ＨＰ－ＳＥＣ分析によって決定されるように、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１試料中に存在する多量体の割合は、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するバリアントについてｐＨ３．０で実質的に増加したが、Ｋ４０９Ｒ及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ含有バリアントは両方とも、多量体の割合のより低い増加を示した。ｐＨ３．０条件下に１時間又は２４時間維持した試料で観察された多量体の割合は同様であった。抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントについては、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異を有するバリアントを含む試料は両方とも、ｐＨ３．０（１時間及び２４時間）で多量体の存在の増加を示した。これらの割合は、Ｆ４０５Ｌ含有バリアントを含有する試料で検出されたものよりも高かった。

【0291】

ｃＩＥＦ分析によって生成されたデータは、ｐＨ３．０で１又は２４時間インキュベートした全ての抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントについて、中性ピークの塩基性側でのテーリングを示した。非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌを有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントは、ｐＨ３．０で酸性タンパク質のパーセンテージの増加を示したが、これはＦ４０５Ｌ含有バリアントでは観察されなかった。参照試料（ｐＨ７．４）と比較して、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ－及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ含有バリアントの両方についてｐＨ３．０で酸性タンパク質の増加が観察されたが、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ含有バリアントは、おそらくＤ２６５Ａのシアリル化に起因して、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ含有バリアントよりも高い割合の酸性タンパク質をｐＨ７．４で既に含有していた。注目すべきことに、非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントを含有する試料中の酸性タンパク質のパーセンテージの増加は、試料中に形成された凝集体の増加に起因し得る、ｐＨ３．０でこれらの試料中に観察されるスパイクの増加を反映し得る。

【0292】

ＣＥ－ＳＤＳ分析は、インタクトなＩｇＧ１又は総ＨＣ＋ＬＣの割合において、ＰＢＳ又はｐＨ３．０の緩衝液のいずれかで製剤化された試料間の差を明らかにしなかった。更に、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９ＲをｐＨ３．０で１時間又は２４時間維持すると、ＤＬＳ分析を使用して検出される平均粒径の増加が観察された。抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒバリアントを含有するＰＢＳ参照試料及び抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１－Ｆ４０５Ｌバリアントを含有する試料におけるより大きい平均粒径は、緩衝液交換中の凝集体の除去によって説明され得る。これらの観察結果とは別に、ＰＢＳ単独又はｐＨ３．０でのインキュベーション後にＰＢＳ中に製剤化された試料間で粒径の実質的な差は観察されなかった。

【0293】

要約すると、生理学的ｐＨのＰＢＳ中に製剤化された試料と比較して、試料をｐＨ３．０でインキュベートした場合、定常重鎖領域にＦ４０５Ｌ若しくはＫ４０９Ｒ変異及び／又は非活性化変異のいずれかを有する抗ヒトＣＤ２０又はＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントを含む試料において、多量体の存在の増加が検出された。Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントは、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するバリアントよりも多量体化のより大きな増加を示した。塩基性側の中性ピークのテーリングは、ｐＨ３．０で試験した全ての抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントについて観察されたが、非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体バリアントについての結果は、ｐＨ３．０に保たれた試料で検出されたスパイクのために決定的ではなかった。酸性条件（ｐＨ３．０）はタンパク質の完全性に影響を及ぼさなかったが、ｐＨ３．０でのインキュベーション後に抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒについて平均粒径の相対的増加が検出された。

【0294】

したがって、低ｐＨでインキュベートした場合、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントは、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ変異を有するバリアントよりも低い凝集を示した。これは、低ｐＨでのウイルス不活化手順中に、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ含有抗体バリアントがＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ含有バリアントよりも好ましい可能性があることを示す。

【0295】

表１１は、ＰＢＳ中に製剤化された定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０及びＣＤ３ ＩｇＧ１（ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４）抗体バリアントを含有する試料、又は０．０２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）中で１時間若しくは２４時間インキュベートしたときのＨＰ－ＳＥＣ分析によって検出される多量体及び単量体の割合を示す。

【0296】

表１２は、ｃＩＥＦ分析によって決定した、ＰＢＳ、又は０．０２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）中で１又は２４時間製剤化された、定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及び抗ＣＤ３ ＩｇＧ１（－ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４）抗体バリアントを含有する試料中に存在する酸性、中性及び塩基性アイソフォームのパーセンテージを示す。

【0297】

表１３は、ＣＥ－ＳＤＳ分析によって決定されるインタクトＩｇＧ及び総ＨＣ＋ＬＣのパーセンテージ、並びにＰＢＳ又は０．０２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）中で１時間又は２４時間製剤化された定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及び抗ＣＤ３ ＩｇＧ１－ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４抗体バリアントを含有する試料中で検出されたＤＬＳ分析によって決定される平均粒子半径（ｎｍ）を示す。

【表13】

【表14】

【表15】

［実施例２１］
低ｐＨでのＩｇＧ１非活性化抗体バリアントの安定性の評価
実施例２０では、定常重鎖領域に非活性化変異を有するＩｇＧ１抗体バリアントの安定性に対する低ｐＨの影響を、一連のタンパク質安定性アッセイを使用して評価した。ここで、低ｐＨ誘導ストレス（ｐＨ３．５）の影響を、実施例１８に記載のアッセイを使用して、ＲＴで０．５、１及び４時間後に評価する。

【0298】

抗ヒトＣＤ２０及びヒトＣＤ３（ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４）抗体バリアントの試料を、およそ５ｍｇ／ｍＬ（濃度範囲４．９８～５．３ｍｇ／ｍＬ）の濃度でＰＢＳ ｐＨ７．４に製剤化した。ＩｇＧ１－ＣＤ２０バリアントは、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異のいずれかを保有していたが、ＩｇＧ１－ＣＤ３抗体バリアントは、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異のいずれかを保有していた。低ｐＨ（３．５）条件への曝露の影響を評価するために、抗体バリアントを含有する試料を、室温で０．５時間、１時間及び４時間、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）で緩衝液交換し、続いて別の緩衝液交換をしてＰＢＳに戻した。実施例１９に記載されているように、ＨＰ－ＳＥＣ、ＣＥ－ＳＤＳ及びＤＬＳを使用してタンパク質安定性を試験した。

【0299】

ＨＰ－ＳＥＣ分析によって決定した場合、試料をｐＨ３．５でインキュベートした０．５時間、１時間及び４時間の時点で、非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントを含有する試料中の多量体の割合の増加は観察されなかった。Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異を有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントの多量体の割合は、時間とともにわずかに増加した。検出された多量体の割合は、ｐＨ３．５でＩｇＧ１－ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌバリアントを含有する試料において経時的に強く増加した。

【0300】

ＣＥ－ＳＤＳ分析は、試料をｐＨ７．４（ＰＢＳ）又はｐＨ３．５のいずれかでインキュベートした場合、試験した試料のいずれにおいてもインタクトＩｇＧ又は総ＨＣ＋ＬＣの割合の変化を明らかにしなかった。また、ＤＬＳによって分析されるように、ｐＨ７．４又はｐＨ３．５のいずれかに維持された試料のいずれかの間で平均粒径の実質的な差は検出されなかった。ＩｇＧ１－ＣＤ２０－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒの参照試料について測定された増強された粒径は、緩衝液交換プロセス中に除去され、したがってｐＨストレスを受けた試料では検出されなかった、適用された参照バッチ中の凝集粒子の存在によって説明することができた。

【0301】

要約すると、０．５時間、１時間又は４時間ｐＨ３．５に曝露した後、定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントでは、多量体化の増加は観察されなかった。Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｆ４０５Ｌ変異を有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１バリアントは、ｐＨ３．５で多量体化のわずかな増加を示したが、この増加は、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｆ４０５Ｌ変異を有するバリアントでより顕著であった。したがって、実施例２０に示されるデータと一致して、また、アッセイ結果におけるクローン依存的差異にもかかわらず、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ含有抗体バリアントは、低ｐＨでのウイルス不活化手順に関して、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ含有バリアントを上回る利点を有し得ることが確認された。

【0302】

表１４は、ＰＢＳ又は０．０２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）に０．５時間、１時間又は４時間溶解した定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０及び抗ヒトＣＤ３抗体バリアントを含む試料における、ＨＰ－ＳＥＣ分析によって検出される多量体及び単量体の割合（全ての試料における分解＜０．２％）、並びにＣＥ－ＳＤＳ分析によって決定されるインタクトＩｇＧ及び総ＨＣ＋ＬＣの割合を示す。

【0303】

表１４はまた、ＰＢＳ又は０．０２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）に０．５時間、１時間又は４時間溶解した定常重鎖領域に非活性化変異を有するＩｇＧ１－ＣＤ２０及びＩｇＧ１－ＣＤ３抗体バリアントを含む試料で検出された、ＤＬＳ分析によって決定された平均粒子半径（ｎｍ）を示す。

【表16】

［実施例２２］
非活性化変異を有する二重特異性ＩｇＧ１抗体バリアントの低ｐＨでの安定性の評価
実施例２１では、定常重鎖領域に非活性化変異を有するＩｇＧ１抗体バリアントの安定性に対する低ｐＨ誘導ストレス（ｐＨ３．５）の影響を０．５、１時間及び４時間後に評価した。ここで、非活性化変異を有する抗ＣＤ３／ＣＤ２０二重特異性抗体の安定性に対する低ｐＨ誘導ストレス（ｐＨ３．５）の影響を、実施例１８に記載されるアッセイを使用して０．５、１及び４時間後に評価する。

【0304】

二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）を、実施例１に記載される制御されたＦａｂアーム交換手順を使用して、制御された還元条件下でのみ相補的半分子との半分子ヘテロ二量体化を促進するＫ４０９Ｒ又はＦ４０５Ｌ変異のいずれかに加えて、非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒを有する抗ヒトＣＤ３及び抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体から作製した。これにより、両方のアームにＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、又は両方のアームにＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒのいずれかを有するｂｓＩｇＧ１－ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体（以下、対称骨格として示される）、又は一方のアームにＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ変異と他方のアームにＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異との組み合わせを有する二重特異性抗体（以下、非対称骨格として示される）が得られた。ｂｓＩｇＧ１－ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体バリアントの試料を、およそ５ｍｇ／ｍＬの濃度（濃度範囲３．２０９～５．３０４ｍｇ／ｍＬ）でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に製剤化した。低ｐＨ（３．５）条件への曝露の影響を評価するために、ｂｓＩｇＧ１－ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体を含有する試料を、室温で０．５時間、１時間及び４時間、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）で緩衝液交換し、続いて別の緩衝液交換をしてＰＢＳに戻した。続いて、実施例１８に記載されているように、ＨＰ－ＳＥＣ、ＣＥ－ＳＤＳ及びＤＬＳを使用してタンパク質安定性を試験した。

【0305】

ＨＰ－ＳＥＣ分析は、非活性化変異を有するｂｓＩｇＧ１－ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体バリアントのいずれかを試験した時点のいずれかでｐＨ３．５に曝露すると、それぞれの参照試料と比較して、多量体化に対する顕著な効果を示さなかった。ＣＥ－ＳＤＳを使用すると、試験したｂｓＡｂバリアントのいずれについてもｐＨ３．５曝露の影響は観察されず、全てのｂｓＡｂがｐＨ３．５への曝露時に無傷のままであったことを示した。ＤＬＳによる平均サイズの分析は、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ変異を有する対称ｂｓＡｂ、並びにＦ４０５Ｌ含有アームにおけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異を有する非対称ｂｓＡｂのｐＨ３．５への曝露が、変化したレベルの凝集を誘導しなかったことを示した。Ｋ４０９Ｒ含有アームにおけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ突然変異を有する対称ｂｓＡｂ及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ突然変異を有する非対称ｂｓＡｂについて解析した時点のいずれかでｐＨ３．５で観察された平均サイズの小さな減少は、緩衝液交換プロセス中の凝集体の除去によるものであり得る。

【0306】

要約すると、定常重鎖領域に非活性化突然変異を有するＩｇＧ１ｂｓＡｂバリアントは、それらのインタクトな構造を保持し、約５ｍｇ／ｍＬの濃度で最大４時間低ｐＨ条件に曝露した後、多量体化に対してますます感受性ではない。これらの結果は、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異のいずれかを有する二重特異性抗体バリアントが、低ｐＨ条件への曝露時に単量体性を等しく保持することができ、これは、低ｐＨで行われるウイルス不活性化手順における治療的開発中に好ましい特性であることを示す。

【0307】

表１５は、ＨＰ－ＳＥＣ分析によって検出される多量体及び単量体の割合、並びに定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及び抗ヒトＣＤ３抗体から生成された二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）を含有する試料において検出された、ＣＥ－ＳＤＳ分析によって決定されるインタクトＩｇＧ及び総ＨＣ＋ＬＣの割合を示す。両方のアームにおけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異、又は両方のアームにおけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異のいずれか、又は一方のアームにおけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ変異と他方のアームにおけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異との組み合わせを有するＢｓＡｂを作製した。抗体バリアントをＰＢＳ又は０．０２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）に０．５時間、１時間又は４時間溶解した後、分析した。

【0308】

表１６は、定常重鎖領域に非活性化変異を有するｂｓＩｇＧ１－ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体バリアントを含む試料で検出された、ＤＬＳ分析によって決定された平均半径（ｎｍ）及びモノマー質量の割合を示す。両方のアームにおけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異、又は両方のアームにおけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異のいずれか、又は一方のアームにおけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ変異と他方のアームにおけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異との組み合わせを有するＢｓＡｂを作製した。抗体バリアントをＰＢＳ又は０．０２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）に０．５時間、１時間又は４時間溶解した後、分析した。

【表17】

【表18】

［実施例２３］
非活性化変異を有する抗ＣＤ２０及び抗ｇｐ１２０ ＩｇＧ１抗体バリアントの低ｐＨでの安定性の評価
実施例２１では、定常重鎖領域に非活性化変異を有するＩｇＧ１抗体バリアントの安定性に対する低ｐＨ誘導ストレス（ｐＨ３．５）の影響を０．５時間、１時間及び４時間後に評価した。ここで、Ｋ４０９Ｒ変異と組み合わせた、定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及び抗ｇｐ１２０（ＨＩＶ１）ＩｇＧ１－ｂ１２抗体の安定性に対する低ｐＨ誘導ストレス（ｐＨ３．５）の影響を、実施例１８に記載のＨＰ－ＳＥＣアッセイを使用して０．５、１時間、２時間、４時間及び２４時間後に評価する。低ｐＨ条件下での多量体化の程度を、抗体治療開発中のウイルス不活化手順に関連して重要であるタンパク質不安定性の尺度としてこれらの抗体バリアントについて分析した。

【0309】

抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ１－ｂ１２抗体バリアントの試料を、およそ０．５ｍｇ／ｍＬ（濃度範囲０．４３５～０．５ｍｇ／ｍＬ）の濃度でＰＢＳに製剤化した。抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及びＩｇＧ１－ｂ１２バリアントは、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異のいずれかを保有していた。低ｐＨ（３．５）条件への曝露の影響を評価するために、ＰＢＳ中に抗体バリアントを含有する試料を、２Ｍ酢酸（Ｆｌｕｋａ、カタログ番号３３２０９）をｐＨ３．５に滴加し、引き続いてプレートシェーカーを使用して室温で０．５時間、１時間、２時間、４時間又は２４時間インキュベートすることによって酸性化した。インキュベーション後、各試料チューブからの試料を、２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ６０６６）を含有するチューブに移して、ｐＨを７．４に回復させた。続いて、実施例１８に記載されているように、ＨＰ－ＳＥＣを使用してタンパク質安定性を試験した。

【0310】

ＨＰ－ＳＥＣ分析により、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントを含有する試料において生じる多量体化の急速な増加が、ｐＨ３．５でのインキュベーションに応答して明らかにされ、これは、試料において検出された多量体の３５．２％とのインキュベーションの２時間後にトップに達した。対照的に、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１バリアントをｐＨ３．５に曝露すると、多量体化が経時的に安定して比較的ゆっくりと増加し、２４時間のインキュベーション後に分析した試料では多量体の最大１０．８％が検出された。

【0311】

非活性化変異を有するＩｇＧ１－ｂ１２バリアントについて、非常に類似したパターンが観察された。Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するバリアントは、多量体化の急速な増加を示し、ｐＨ３．５での２時間のインキュベーション後に最大２７．６％の多量体が検出されたが、ｐＨ３．５でのＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するバリアントでは、より遅くより低い多量体化の増加が観察され、ｐＨ３．５での２４時間のインキュベーション後に最大１８％の多量体が検出された。

【0312】

要約すると、ＨＰ－ＳＥＣ分析により、多量体化のプロセスが、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ－Ｋ４０９Ｒ変異を有する抗体バリアントにおいて、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ－Ｋ４０９Ｒ変異を有するバリアントよりも迅速かつ広範囲に起こることが明らかになった。したがって、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を有する他の抗体クローンバリアントも、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ含有バリアントよりも低ｐＨ条件で単量体性を保持する能力が高いと結論付けられた。低ｐＨでの単量体性の保持は、低ｐＨで行われるウイルス不活化手順中の好ましい特徴である。

【0313】

表１７は、ＰＢＳ又は酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）に０．５時間、１時間、２時間、４時間又は２４時間溶解した定常重鎖領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１及び抗ｇｐ１２０（ＨＩＶ１）ＩｇＧ１－ｂ１２抗体バリアントを含有する試料における、ＨＰ－ＳＥＣ分析によって検出される多量体、単量体及び分解の割合を示す。

【表19】

ＦＥＲの抗体治療現像性の態様
実施例１５～２３では、抗体治療開発性に関連する様々な態様を評価した。第１に、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（ＦＥＡ）変異又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）変異のいずれかを有する抗体バリアントを使用して二重特異性抗体を形成する能力に明らかな差は観察されなかった。また、ＦＥＡ変異又はＦＥＲ変異のいずれかを有する抗体バリアントの産生レベルは類似していた。ＦＥＲ変異を有する抗体バリアントの高度に濃縮された試料は、ＦＥＡ変異を有する抗体バリアントと比較して、タンパク質安定性の改善及び凝集する傾向の減少を示した。抗体バリアントを４０℃に４ヶ月間曝露すると、試験した全てのバリアントの多量体化が増加し、その程度は抗体クローン依存性であった。更に、凍結融解サイクルは、ＦＥＡ変異又はＦＥＲ変異のいずれかを有する抗体バリアントのタンパク質安定性に影響を及ぼさなかった。重要なことに、ＦＥＲ変異を有する抗体バリアントは、ＦＥＡ変異を有するバリアントと比較して、低ｐＨ誘導ストレス条件に対するより高い耐性を示した。

【0314】

ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域におけるＦＥＡ変異の導入は、容易に開発され得る抗体バリアントをもたらし、そのような抗体バリアントは、現在、臨床製品開発及び臨床使用のために広く受け入れられている。上記を考慮して、不活性フォーマットを望む場合の抗体バリアントのタンパク質安定性プロファイル及び発達性は、代わりにＦＥＲ変異を導入することによって更に改善することができた。したがって、ＦＥＲ含有バリアントは、臨床使用のための単一特異性抗体又は多重特異性抗体の開発に好ましい可能性がある。特に、ＦＥＲ変異を有する抗体バリアントは、低ｐＨ条件への曝露に対する感受性が低いことが示されたが、これは、ヒト使用のための治療抗体の開発中にしばしば適用され、必要とされるウイルス不活化のための手順における有益な特性である。

【0315】

［実施例２４］
各重鎖に異なるセットの非活性化変異を含む抗ヒトＣＤ２０抗体及びそのバリアントによるＣ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害
実施例３及び５では、野生型様ＩｇＧ１抗ヒトＣＤ２０及びＨＬＡ－ＤＲ抗体の重鎖（ＨＣ）定常領域にＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）変異を導入すると、ＣＤＣを誘導する能力がほぼ完全に消失することが示された。これは、実施例４に示されるように、ＦＥＲ変異を有する抗体バリアントによるＣ１ｑ結合の減少と一致していた。ここでは、補体因子Ｃ１ｑに結合する能力を、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（ＦＥＡ）又は両方のＨＣにおけるＦＥＲ変異のいずれかを有する２つのＨＣを含有する抗ヒトＣＤ２０抗体について、及び一方のＨＣにおけるＦＥＡ変異及び他方のＨＣにおけるＦＥＲ変異を含有するバリアントについて評価した。また、ＣＤＣを誘導する上記抗体バリアントの能力を評価した。

【0316】

Ｋ４０９Ｒ又はＦ４０５Ｌ変異に加えて、両方のＨＣにおいてＦＥＡ又はＦＥＲ非活性化変異を有する野生型抗ヒトＣＤ２０抗体ＩｇＧ１－ＣＤ２０及びそのバリアント、又は一方のＨＣにおいてＦＥＡ変異を含み、他方のＨＣにおいてＦＥＲ変異を含むバリアント（以下、「非対称バリアント」と呼ぶ）を、実施例４に記載される手順に従って、Ｃ１ｑの供給源として２０％正常ヒト血清（ＮＨＳ、Ｍ０００８、Ｓａｎｑｕｉｎ）を用いたＲａｊｉ細胞に対するＣ１ｑ結合アッセイにおいて試験した。抗ヒトＣＤ２０抗体の非対称バリアントを、本質的に実施例１に記載されるように、制御されたＦａｂアーム交換によって作製した。抗体バリアントへのＣ１ｑ結合を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅスクリーナー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でのフローサイトメトリーによって、蛍光強度中央値－ＦＩＴＣを測定することによって検出した。非線形アゴニスト用量－反応モデルを用いてデータを分析し、抗体コントロールをベースラインとして用いないＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度を用いて、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、続いて、非結合コントロール抗体ＩｇＧ１－ｂ１２について測定したＡＵＣ値（０％）及び野生型ＩｇＧ１抗体バリアントについて測定したＡＵＣ値（ＩｇＧ１－ＣＤ２０、１００％）に対する実験反復１回当たりの正規化を行った。データは、３つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。

【0317】

Ｃ１ｑ結合アッセイで試験したのと同じ抗体バリアントをインビトロＣＤＣアッセイで試験した。本質的には更に実施例３に記載されるように、１ウェル当たり５×１０^４個のＲａｊｉ細胞を使用して、抗体バリアントをある範囲の濃度（０．０１４～１０μｇ／ｍＬの最終濃度；３倍希釈）で試験した。ＰＩ陽性細胞の数をＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅスクリーナー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でフローサイトメトリーによって決定した。細胞溶解のパーセンテージに対応するＰＩ陽性細胞のパーセンテージを、（ＰＩ陽性細胞の数／細胞の総数）×１００％として計算した。非線形アゴニスト用量－反応モデルを用いてデータを分析し、抗体コントロールをベースラインとして用いないＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度を用いて、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、続いて、非結合コントロール抗体ＩｇＧ１－ｂ１２について測定したＡＵＣ値（０％）及び野生型ＩｇＧ１抗体バリアントについて測定したＡＵＣ値（ＩｇＧ１－ＣＤ２０、１００％）に対する実験反復１回当たりの正規化を行った。データは、３つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。

【0318】

ＩｇＧ１－ＣＤ２０バリアントへのＣ１ｑの結合の評価により、野生型ＩｇＧ１－ＣＤ２０抗体は、標的Ｒａｊｉ細胞上のＣＤ２０に結合すると補体タンパク質Ｃ１ｑと効率的に係合することが明らかになった。ＦＥＡ又はＦＥＲ非活性化突然変異のいずれかの導入は、Ｆ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒ突然変異のいずれかと組み合わせて、Ｃ１ｑ結合を劇的に減少させた（図１６）。Ｃ１ｑの結合は、両方のＨＣがＫ４０９Ｒ変異又はＦ４０５Ｌ変異のいずれかを含有するかどうか、又は一方のＨＣがＫ４０９Ｒ変異を含有し、他方のＨＣがＦ４０５Ｌ変異を含有するかどうかにかかわらず、ＦＥＡ変異を含有するＩｇＧ１－ＣＤ２０バリアントよりも、ＦＥＲ変異を含有するＩｇＧ１－ＣＤ２０バリアントに対してより強く減少した。非対称バリアントＢｉｓＧ１－ＣＤ２０ＦＥＡ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＲ－Ｋ４０９ＲについてＣ１ｑ結合の完全な消失が観察されたが、他方の非対称バリアントＢｉｓＧ１－ＣＤ２０ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＡ－Ｋ４０９ＲについてＣ１ｑ結合の強い減少が観察された（図１６）。

【0319】

同じＩｇＧ１－ＣＤ２０バリアントのＣＤＣ誘導能の評価は、両方のＨＣがＫ４０９Ｒ又はＦ４０５Ｌ変異のいずれかを含有するかどうか、又は一方のＨＣがＫ４０９Ｒ変異を含有し、他方のＨＣがＦ４０５Ｌ変異を含有するかどうかにかかわらず、ＣＤＣを排除する能力がＦＥＲ変異を導入することによって最も強く抑制されることを明らかにした（図１７）。野生型ＩｇＧ１－ＣＤ２０と比較して、変異ＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒを含有するＩｇＧ１－ＣＤ２０バリアントについて、及びＩｇＧ１－ＣＤ２０－ＦＥＡ－Ｆ４０５Ｌについてより少ない程度で、残留ＣＤＣが観察された。非対称バリアントＢｉｓＧ１－ＣＤ２０ＦＥＡ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＲ－Ｋ４０９Ｒについて、低い残留ＣＤＣが観察された。ＢｉｓＧ１－ＣＤ２０ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＡ－Ｋ４０９ＲのＣＤＣ誘導能の低下は、ＢｉｓＧ１－ＣＤ２０ＦＥＡ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒについて観察されたものと同等であった。

【0320】

結論として、Ｃ１ｑへの抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体の結合は、両方のＨＣにＦＥＲ変異を導入することによって、又はＫ４０９Ｒ変異を更に含む１つのＨＣにこれらの変異を導入し、他のＨＣにＦＥＡ－Ｆ４０５Ｌ変異を導入することによって最も強く抑制された。ＣＤＣを誘導する能力は、ＦＥＡ変異よりもＦＥＲ変異を導入することによってより強く抑制された。１つのＨＣにおけるＦＥＲ変異及び他のＨＣにおけるＦＥＡ変異を含む非対称バリアントもまた、両方のＨＣにおけるＦＥＲ変異又はＦＥＡ変異のいずれかを有するバリアントに対する中間レベルまでのＣＤＣ誘導能の強い低下を示した。

【0321】

［実施例２５］
各重鎖に異なるセットの非活性化変異を含む抗体バリアントによって誘導されるインビトロＴ細胞媒介性細胞傷害
実施例１１は、癌抗原及びＴ細胞を標的とする二重特異性抗体バリアントの重鎖（ＨＣ）定常領域におけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）変異の導入が、非特異的細胞傷害を効率的に回避したが、特異的Ｔ細胞媒介性細胞傷害を誘導する能力を保持したことを示した。これらの実験では、非活性化突然変異は対称的に存在し、すなわち、両方のＨＣは、Ｆ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒ突然変異のいずれかに加えてＦＥＲ非活性化突然変異を保有していた。ここで、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を、Ｆｃ領域に非対称の非活性化変異を有するＣＤ３ｘＨＥＲ２及びＣＤ３ｘｂ１２二重特異性ＩｇＧ１抗体について評価し、すなわち、一方のＨＣはＦＥＲ変異を有し、他方のＨＣは代替の非活性化変異を有していた（例えば、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ［ＦＥＡ］、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ［ＡＡＧ］、又はＮ２９７Ｇ）。

【0322】

非対称の非活性化変異を有するものを含む二重特異性抗体バリアントを、実施例１に記載されているように、制御されたＦａｂアーム交換（ｃＦＡＥ）によって作製した。野生型二重特異性抗体ＣＤ３ｘＨＥＲ２（抗ヒトＣＤ３［ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４］ＩｇＧ１－Ｆ４０５Ｌ及び抗ヒトＨＥＲ２ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒ）又はＣＤ３ｘｂ１２（抗ヒトＣＤ３［ｈｕＣＬＢ－Ｔ３／４］ＩｇＧ１－Ｆ４０５Ｌ及び非結合コントロール抗体抗ＨＩＶ１ｇｐ１２０［ｂ１２］ＩｇＧ１－Ｋ４０９Ｒ）及びＦｃ領域に非対称非活性化変異を有するそのバリアントによるＴ細胞媒介性細胞傷害性を評価した。試験した二重特異性バリアントは、１つのＨＣ中のＦ４０５Ｌ変異に加えて、第２のＨＣ中のＫ４０９Ｒ変異に加えて、ＦＥＡ、ＡＡＧ、又はＮ２７９Ｇ非活性化変異のいずれかと組み合わせて、ＦＥＲ非活性化変異を有していた。更に、１つのＨＣにおけるＦ４０５Ｌ変異に加えて、ＦＥＲ非活性化変異を有する二重特異性抗体バリアントを、非活性化変異を有さないがＫ４０９Ｒ変異（二重特異性抗体バリアントの効率的な生成に必要）のみを有する第２のＨＣと組み合わせて試験した。コントロールとして、ＨＣにおける非活性化変異を有さない二重特異性抗体バリアント、並びに非結合コントロール抗体ＩｇＧ１－ｂ１２を試験した。ＰＢＭＣを、実施例９に記載の密度勾配分離によって健康なドナーに由来するバフィーコートから単離し、ＰＢＳで洗浄し、培養培地（２ｍＭのＬ－グルタミン及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ－１６４０；鉄（ＤＢＳＩ）を含む１０％ドナーウシ血清を補充した）に再懸濁した。続いて、ＰＢＭＣを、１部の培養培地（２ｍＭのＬ－グルタミン及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ－１６４０；鉄（ＤＢＳＩ）を含む１０％ドナーウシ血清を補充した）並びに８０％ＤＢＳＩ及び２０％ジメチルスルホキシドの混合物の１部（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号４１６４４）からなる凍結保護培地にＰＢＭＣを再懸濁することによって、３０～５０×１０^６細胞／ｍｌの濃度で－１５０℃で凍結し、凍結保護培地中のＤＭＳＯの最終濃度は１０％であった）。ＨＥＲ２発現ＳＫ－ＯＶ－３細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ－７７）を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）熱不活性化ＤＢＳＩ及びペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、最終濃度５０単位／ｍＬペニシリンカリウム及び５０μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン［ロンザ、カタログ番号ＤＥ１７－６０３Ｅ］）を補充したＭｃＣｏｙの５Ａ培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＢＥ１２－１６８Ｆ）で培養し、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＣＯ_２加湿インキュベータ内で３７℃で維持した。ＳＫ－ＯＶ－３細胞をコンフルエント付近まで培養した。細胞をトリプシン処理し、培養培地に再懸濁し、続いてセルストレーナーに通して、単一細胞懸濁液を得た。２．５×１０^４個のＳＫ－ＯＶ－３細胞を９６ウェル培養プレートの各ウェルに播種し、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートしてプレートに接着させた。上記のように単離後に凍結したＰＢＭＣを解凍した。次いで、ＰＢＭＣをＰＢＳで２回洗浄し、続いて培養培地に再懸濁した。続いて、ＳＫ－ＯＶ－３標的細胞を含む９６ウェルプレートの各ウェルに１×１０^５個のＰＢＭＣを添加して、４：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比を得た。続いて、上記のような二重特異性ＣＤ３ｘＨＥＲ２、及びＣＤ３ｘｂ１２野生型及びその非活性化バリアントの用量応答シリーズを培養培地（０．００１～１０００ｎｇ／ｍＬの最終濃度、１０倍希釈）中で調製し、ＳＫ－ＯＶ－３細胞及びＰＢＭＣを含有する９６ウェル培養プレートのウェルに添加した。ＳＫ－ＯＶ－３標的細胞と２μＭスタウロスポリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ６９４２－２００、Ｓｉｇｍａ）とのインキュベーションを、１００％腫瘍細胞殺傷のための参照として使用した。培地対照（ＳＫ－ＯＶ－３細胞、抗体なし、ＰＢＭＣなし）を０％腫瘍細胞殺傷の基準として使用した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で３日間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳで２回洗浄し、１０％のアラマーブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＤＡＬ１１００）を含有する１５０μＬの培養培地を各ウェルに添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした。５９０ｎｍの吸光度を測定した（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。データを、実験複製ごとに各ドナーについて計算した、生存ＳＫ－ＯＶ－３細胞のパーセンテージに対する用量応答として、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）で可視化した。データは、２つの独立した実験からの４人のドナーから得られた平均値±ＳＥＭである。

【0323】

Ｆｃ領域に非対称の非活性化変異を有するものを含む全ての二重特異性ＣＤ３ｘＨＥＲ２抗体バリアントは、野生型様機能を有するＦｃ領域を有する、したがって非活性化変異を有さない二重特異性ＣＤ３ｘＨＥＲ２抗体バリアントに匹敵する効率でＳＫ－ＯＶ－３細胞の用量依存性細胞傷害を誘導した（図１８Ａ）。実施例１１に示されるデータと同様に、野生型様二重特異性ＣＤ３ｘｂ１２抗体（ＢｉｓＧ１Ｆ４０５ＬｘＫ４０９Ｒ）は、野生型様二重特異性ＣＤ３ｘＨＥＲ２抗体バリアントよりも程度は低いが、ＳＫ－ＯＶ－３細胞の非特異的殺傷を誘導した（図１８Ｂ）。対称的に分布したＦＥＲ、ＦＥＡ又はＡＡＧ変異を有する二重特異性ＣＤ３ｘｂ１２バリアント（図１０Ｂ）と同様に、ＦＥＡ（ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ）又は他のＨＣのＡＡＧ（ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＡＡＧ－Ｋ４０９Ｒ）変異と組み合わせた１つのＨＣにおけるＦＥＲ非活性化変異を有する二重特異性ＣＤ３ｘｂ１２抗体バリアントは、ＳＫ－ＯＶ－３細胞の細胞傷害性を示さなかった（図１８Ｂ）。対照的に、野生型様二重特異性ＣＤ３ｘｂ１２抗体バリアントよりも程度は低いが、Ｎ２９７Ｇ非活性化変異を有する他のＨＣと組み合わせた１つのＨＣにＦＥＲ非活性化変異を有する二重特異性ＣＤ３ｘｂ１２抗体バリアント（ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＮ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒ）は、ＳＫ－ＯＶ－３細胞の非特異的殺傷を誘導した（図１８Ｂ）。この結果は、対称的なＮ２９７Ｇ非活性化変異を有する二重特異性ＣＤ３×ｂ１２抗体バリアントもＳＫ－ＯＶ－３細胞の部分的な非特異的殺滅を誘導したという観察結果と一致している（図１０Ｂ）。更に、野生型様機能を有する他のＨＣ領域と組み合わされた１つのＨＣにおけるＦＥＲ非活性化変異を有する二重特異性ＣＤ３ｘｂ１２抗体バリアント（ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＫ４０９Ｒ）もまた、ＣＤ３ｘｂ１２バリアントＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＮ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒと同様のレベルで非特異的殺傷を誘導した（図１８Ｂ）。

【0324】

全体として、癌抗原及びＴ細胞を標的とし、Ｆｃ領域に非対称の非活性化変異を有する二重特異性抗体バリアント、すなわち、１つのＨＣにおけるＦＥＲ非活性化変異及びＦＥＡ又はＡＡＧ非活性化変異のいずれかを有する他のＨＣは、特異的Ｔ細胞媒介性細胞傷害を誘導する能力を保持したが、非特異的細胞傷害を効率的に回避した。

【0325】

［実施例２６］
各重鎖に異なるセットの非活性化変異を含む抗体バリアントによって誘導されるＰＢＭＣ培養物中のＴ細胞活性化
実施例１０は、抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体の重鎖（ＨＣ）定常領域におけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）変異の導入が、ヒトＰＢＭＣ共培養物において、ＣＤ６９のアップレギュレーションによって測定されるように、Ｔ細胞の活性化を妨げたことを示した。これらの実験では、非活性化突然変異は対称的に存在し、すなわち、両方のＨＣは、Ｆ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒ突然変異のいずれかに加えてＦＥＲ非活性化突然変異を保有していた。ここでは、Ｆｃ領域に非対称の非活性化変異を有するＣＤ３ｘＨＥＲ２二重特異性ＩｇＧ１抗体、すなわち、ＦＥＲ変異を有する一方のＨＣ及び異なる非活性化変異を有する他方のＨＣについて、Ｔ細胞活性化を評価した。

【0326】

Ｆｃ領域に非対称の非活性化変異を有する、実施例２５に示すような、野生型二重特異性ＩｇＧ１抗体ＣＤ３ｘＨＥＲ２及びそのバリアントによるＰＢＭＣ共培養物中のＴ細胞の活性化を評価した。コントロールとして、ＨＣにおける対称的な非活性化ＦＥＲ変異を有する二重特異性抗体バリアント、ＨＣにおける非活性化変異を有しない二重特異性抗体バリアント、並びに非結合コントロール抗体ＩｇＧ１－ｂ１２を試験した。Ｔ細胞活性化の尺度として、これらの抗体バリアントによるＴ細胞上のＣＤ６９の上方制御を本質的に実施例１０に記載の手順に従って評価した。手短に言えば、上記の二重特異性ＣＤ３ｘＨＥＲ２及びそのＣＤ３ｘｂ１２野生型及び非活性化バリアントの用量応答シリーズを培養培地（０．００１～１０００ｎｇ／ｍＬの最終濃度、１０倍希釈）中で調製し、培養培地中にＰＢＭＣ（１．５×１０^５細胞／ウェル）を含む９６ウェル丸底プレートのウェルに添加した。１６～２４時間のインキュベーション後、ＰＢＭＣ混合物中のＣＤ２８陽性細胞のうちのＣＤ６９陽性細胞の割合を、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ）で測定した。データを、ＣＤ２８陽性細胞の用量応答対ＣＤ６９陽性率として分析した。各実験複製物のＰＢＭＣドナー当たりの用量応答曲線下面積（ＡＵＣ）を、ベースラインとしてバックグラウンド染色（抗体対照なし）を用いてＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度を使用して計算し、その後、実験複製物当たりの各ドナーについて、非結合陰性対照ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型様ＩｇＧ１二重特異性抗体バリアント（ＢｉｓＧ１Ｆ４０５ＬｘＫ４０９Ｒ、１００％）について測定されたＡＵＣ値に正規化した。データは、２回の独立した反復実験において４人のドナーから得られた平均値±ＳＥＭである。

【0327】

早期Ｔ細胞活性化の尺度としてのＴ細胞上のＣＤ６９アップレギュレーションの評価は、野生型様ＣＤ３ｘＨＥＲ２二重特異性抗体バリアント（ＢｉｓＧ１Ｆ４０５ＬｘＫ４０９Ｒ）と比較して、ＨＣにおける対称性非活性化ＦＥＲ変異を有する二重特異性抗体バリアントがＰＢＭＣ共培養物中のＴ細胞上のＣＤ６９のアップレギュレーションを防止したことを示す（図１９）。これは、Ｆ４０５Ｌ変異に加えてＦＥＲ非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ１抗体について実施例１０に記載されるデータと一致する。ＦＥＡ（ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＦＥＡ－Ｋ４０９Ｒ）又はＡＡＧ（ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＡＡＧ－Ｋ４０９Ｒ）変異と組み合わされた一方のＨＣにおけるＦＥＲ非活性化変異を有する二重特異性ＣＤ３ｘＨＥＲ２抗体バリアントもまた、ＰＢＭＣ共培養物におけるＴ細胞上のＣＤ６９アップレギュレーションのほぼ完全な抑止を示した（図１９）。対照的に、一方のＨＣにＦＥＲ非活性化変異を有する二重特異性ＣＤ３ｘＨＥＲ２抗体バリアントは、Ｎ２９７Ｇ非活性化変異を有する他方のＨＣと組み合わせて（ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＮ２９７Ｇ－Ｋ４０９Ｒ）、又は野生型様機能を有する別のＨＣ領域と組み合わせて（ＢｉｓＧ１ＦＥＲ－Ｆ４０５ＬｘＫ４０９Ｒ）、野生型様二重特異性ＣＤ３ｘＨＥＲ２抗体バリアントよりも程度は低いが、Ｔ細胞の残存活性化を誘導した（図１９）。

【0328】

要約すると、Ｆｃ領域に非対称の非活性化変異、すなわち、１つのＨＣにおけるＦＥＲ非活性化変異と、ＦＥＡ又はＡＡＧ非活性化変異のいずれかを有する他のＨＣとを有する、癌抗原及びＴ細胞を標的とする二重特異性抗体バリアントは、ヒトＰＢＭＣ共培養物中のＣＤ６９上方制御によって測定されるＴ細胞の活性化を効率的に防止した。

【0329】

［実施例２７］
バイオレイヤー干渉法によって測定されたヒトＦｃγ受容体に対する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びその非活性化バリアントの結合親和性
実施例６のデータは、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した場合、重鎖（ＨＣ）定常領域に非活性化Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）変異を導入すると、ＦｃγＲＩａの単量体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、又はヒトＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ヒトＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｒ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｆ及びヒトＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖの二量体ＥＣＤへの結合が妨げられることを示した。

【0330】

ここで、本発明者らは、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）でバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖの単量体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びその非活性化バリアントの結合親和性を定量した。試験した非活性化バリアントは、突然変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、又はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇを有していた。全ての工程を３０℃で行った。ヒトＦｃγＲＩａについては、Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８－５１０１）並びにＳａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８－１１０４）で希釈したタンパク質の順化（３０℃で６００秒）後、Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ中でＮｉＮＴＡバイオセンサを１００秒間インキュベートすることによって最初のベースライン測定を行った。続いて、Ｈｉｓタグ付きヒトＦｃγＲＩａ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０２５６－Ｈ０８Ｓ－Ｂ、１μｇ／ｍｌ）をＮｉ－ＮＴＡバイオセンサ上に６００秒間固定化した。Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔにおけるベースライン測定（１００秒）の後、野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びその非活性化バリアントの会合（３００秒）及び解離（１０００秒）を決定した。ヒトＦｃγＲＩａに対する抗体の結合を、１．５６－１００ｎＭ（ＩｇＧ１野生型用；２倍希釈）又は１５．６－１０００ｎＭ（ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、及びＩｇＧ１－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇについて；２倍希釈）の濃度範囲を使用して試験した。データ解析ソフトウェアｖ１１．１（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いてデータを解析した。要するに、データトレースを基準曲線（センサ上のＦｃγＲ、試料希釈液のみによる測定）の減算によって補正し、Ｙ軸を測定されたベースラインの最後の１０秒に位置合わせし、工程間補正並びにＳａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを適用した。Ｋ_Ｄ（Ｍ）並びにｋ_ｏｎ（１／Ｍｓ）及びｋ_ｏｆｆ（１／ｓ）を決定するために、グローバル（完全）フィットを使用して１：１モデルを選択した。応答値＜０．０５を分析から除外した。４００秒の解離を、全ての抗体バリアントの分析のための目的のウインドウとして使用した。最適な適合は、＞０．９９の完全なＲ^２値によって決定され、適合と実験データとが有意に相関したことを示している。更に、グローバル（完全）フィットは、＞３の曲線フィット（信頼できる分析）に基づく。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＤである。

【0331】

ヒトＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖについては、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８－５０１９）並びにＳａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔで希釈したタンパク質の順化（３０℃で６００秒）後、Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ中でＳＡバイオセンサを１００秒間インキュベートすることによって初期ベースライン測定を行った。続いて、Ｈｉｓタグ化ビオチン化ヒトＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０３７４－Ｈ２７Ｈ１－Ｂ、１μｇ／ｍｌ）、ＦｃγＲＩＩｂ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０２５９－Ｈ２７Ｈ－Ｂ、１μｇ／ｍｌ）又はＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０３８９－Ｈ２７Ｈ１－Ｂ、３μｇ／ｍｌ）を、ＳＡバイオセンサ上に６５秒間（ＦｃγＲＩＩａ又はＦｃγＲＩＩｂ）又は６００秒間（ＦｃγＲＩＩＩａ）固定化した。Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔにおけるベースライン測定（１００秒）の後、野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びその非活性化バリアントの会合（５０ｓ、ＦｃγＲＩＩａ又はＦｃγＲＩＩｂ；３００秒、ＦｃγＲＩＩＩａ）及び解離（１０００秒）を決定した。ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖに対する抗体の結合を、ある濃度範囲（ＦｃγＲＩＩａ、１５６．２５－１００００ｎＭ、２倍希釈；ＦｃγＲＩＩｂ、２５０～１６０００ｎＭ、２倍希釈；ＦｃγＲＩＩＩａ、１２５～８０００ｎＭ、２倍希釈）を使用して試験した。データ解析ソフトウェアｖ１１．１（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いてデータを解析した。要するに、データトレースを基準曲線（センサ上のＦｃγＲ、試料希釈液のみによる測定）の減算によって補正し、Ｙ軸を測定されたベースラインの最後の１０秒に位置合わせし、工程間補正を適用した。ヒトＩｇＧ１と低親和性Ｆｃγ受容体ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖとの間の低親和性のために、定常状態分析（ＳＳＡ）を選択してＫ_Ｄ（Ｍ）を決定した。要するに、０．０５未満の応答値を分析から除外した。様々な抗体濃度についての定常状態応答（センサグラムが会合相でプラトーに達した場合）を、データ解析ソフトウェアのＲ平衡（Ｒ_ｅｑ）関数を使用して計算し、続いて定常状態応答を抗体濃度に対してプロットし、最後にラングミュアモデルを使用してＫ_Ｄ（Ｍ）を計算した。最適な適合は、＞０．９９の完全なＲ^２値によって決定され、適合と実験データとが有意に相関したことを示している。更に、ＳＳＡは、＞３の会合曲線フィッティングに基づいており、各抗体濃度についてプロットされた定常状態応答はプラトーに達し、最大結合応答の適切な計算を可能にした（信頼できる分析）。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＤである。

【0332】

バイオレイヤー干渉法を用いたヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖに対する抗ヒトＣＤ２０ヒトＩｇＧ１抗体バリアントの結合の評価により、野生型ＩｇＧ１が、試験した全てのＦｃγ受容体に対して、ＦｃγＲＩａについては１．８ｎＭ、ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈについては１．９μＭ、ＦｃγＲＩＩｂについては７．３μＭ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖについては０．６μＭの結合親和性で結合を示すことが明らかになった（表１８）。対照的に、重鎖定常領域にＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ又はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ非活性化変異を有するヒトＩｇＧ１抗体バリアントは、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖに対する結合を示さなかった（表１８）。

【0333】

表１８：バイオレイヤー干渉法によって測定した、重鎖定常領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントによるヒトＦｃγＲ結合親和性。高親和性受容体ＦｃγＲＩａについて、Ｋ_Ｄ（Ｍ）、ｋ_ｏｎ（１／Ｍｓ）及びｋ_ｏｆｆ（１／ｓ）を、グローバル（完全）フィットを使用した１：１モデルに基づいて示す。低親和性受容体ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖについて、定常状態分析に基づいてＫ_Ｄ（Ｍ）を示す。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＤである。試験したバリアントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－ＦＥＲ、ＩｇＧ１－ＦＥＡ、及びＩｇＧ１－ＬＡＬＡＰＧであり、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、及びＬＡＬＡＰＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇである。ＳＳＡ：定常状態分析、ＢＬＩ：バイオレイヤー干渉法、ｎｂ：結合なし、ｎ／ａ：該当なし。

【表20】

［実施例２８］
バイオレイヤー干渉法によって測定されたマウスＦｃγ受容体に対する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びその非活性化バリアントの結合親和性
実施例２７のデータは、バイオレイヤー干渉法によって測定した場合に、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖに対する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びその非活性化バリアントの結合親和性又は結合欠損を示した。しかしながら、マウスモデルにおけるヒト抗体のインビボ治療効果を評価する場合、選択されたマウスモデルに応じて、ヒトＦｃγ受容体は存在し得ない。代わりに、ヒト抗体の治療効果の評価は、内因的に発現されるマウスＦｃγ受容体の存在に依存し得る。そのような場合、治療用抗体が非活性化Ｆｃドメインから利益を得るならば、非活性化抗体バリアントによるマウスＦｃγ受容体への結合の非存在を確実にすることが重要である。

【0334】

ここで、本発明者らは、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）においてバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して、マウスＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＶの単量体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する、野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ変異を内包するその非活性化バリアントの結合親和性を評価した。全ての工程を３０℃で行った。マウスＦｃγＲＩについては、Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８－５１０１）並びにＳａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８－１１０４）で希釈したタンパク質の順化（３０℃で６００秒）後、Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ中でＮｉ－ＮＴＡバイオセンサを１００秒間インキュベートすることによって最初のベースライン測定を行った。続いて、Ｈｉｓタグ付きマウスＦｃγＲＩ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号５００８６－Ｍ２７Ｈ－Ｂ、２μｇ／ｍｌ）をＮｉ－ＮＴＡバイオセンサ上に６００秒間固定化した。Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔにおけるベースライン測定（１００秒）の後、野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びその非活性化バリアントの会合（３００秒）及び解離（１０００秒）を決定した。マウスＦｃγＲＩに対する抗体の結合を、濃度範囲（１５．６－１０００ｎＭ；２倍希釈）を使用して試験した。データ解析ソフトウェアｖ１１．１（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いてデータを解析した。要するに、基準曲線（センサ上のＦｃγＲ、試料希釈液のみによる測定）を減算し、続いてベースラインの最後の１０秒にＹ軸を位置合わせすることによって、データトレースを補正した。最後に、工程間補正及びＳａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを適用した。Ｋ_Ｄ（Ｍ）並びにｋ_ｏｎ（１／Ｍｓ）及びｋ_ｏｆｆ（１／ｓ）を決定するために、グローバル（完全）フィットを使用して１：１モデルを選択した。応答値＜０．０５を分析から除外した。１００秒の解離を、全ての抗体バリアントの分析のための目的のウインドウとして使用した。最適な適合は、＞０．９８の完全なＲ^２値によって決定され、適合と実験データとが有意に相関したことを示している。更に、グローバル（完全）フィットは、＞３の曲線フィット（信頼できる分析）に基づく。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＤである。

【0335】

マウスＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＶについては、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８－５０１９）並びにＳａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔで希釈したタンパク質の順化（３０℃で６００秒）後、Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ中でＳＡバイオセンサを１００秒間インキュベートすることによって初期ベースライン測定を行った。続いて、Ｈｉｓタグ化ビオチン化マウスＦｃγＲＩＩｂ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号５００３０－Ｍ２７Ｈ－Ｂ、１μｇ／ｍｌ）、ＦｃγＲＩＩＩ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号５０３２６－Ｍ２７Ｈ－Ｂ、１μｇ／ｍｌ）又はＦｃγＲＩＶ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号５００３６－Ｍ２７Ｈ－Ｂ、１μｇ／ｍｌ）をＳＡバイオセンサに９０秒間（ＦｃγＲＩＩｂ）又は２５０秒間（ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＶ）固定化した。Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔにおけるベースライン測定（１００秒）の後、野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びその非活性化バリアントの会合（５０ｓ、ＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩＩ、３００秒、ＦｃγＲＩＶ）及び解離（１０００秒）を決定した。マウスＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＶに対する抗体の結合を、ある濃度範囲（ＦｃγＲＩＩｂ、１８７．５～１２０００ｎＭ、２倍希釈；ＦｃγＲＩＩＩ、１５６．２５～１００００ｎＭ、２倍希釈；ＦｃγＲＩＶ、７８．１３～５０００ｎＭ、２倍希釈）を使用して試験した。データ解析ソフトウェアｖ１１．１（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いてデータを解析した。要するに、データトレースを基準曲線（センサ上のＦｃγＲ、試料希釈液のみによる測定）の減算によって補正し、Ｙ軸をベースライン測定の最後の１０秒に位置合わせし、工程間補正を適用した。ヒトＩｇＧ１と低親和性マウスＦｃγ受容体ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃγＲＩＶとの間の低親和性のために、定常状態分析（ＳＳＡ）を選択してＫ_Ｄ（Ｍ）を決定した。要するに、０．０５未満の応答値を分析から除外した。様々な抗体濃度についての定常状態応答（センサグラムが会合相でプラトーに達した場合）を、データ解析ソフトウェアのＲ平衡（Ｒ_ｅｑ）関数を使用して計算し、続いて定常状態応答を抗体濃度に対してプロットし、最後にラングミュアモデルを使用してＫ_Ｄ（Ｍ）を計算した。最適な適合は、＞０．９８の完全なＲ^２値によって決定され、適合と実験データとが有意に相関したことを示している。更に、ＳＳＡは、＞３の会合曲線フィッティングに基づいており、各抗体濃度についてプロットされた定常状態応答はプラトーに達し、最大結合応答の適切な計算を可能にした（信頼できる分析）。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＤである。

【0336】

バイオレイヤー干渉法を用いたマウスＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＶに対する抗ヒトＣＤ２０ヒトＩｇＧ１抗体バリアントの結合の評価により、野生型ヒトＩｇＧ１が、試験した全てのマウスＦｃγ受容体に対して、ＦｃγＲＩａに対して０．１２μＭ、ＦｃγＲＩＩｂに対して２．８μＭ、ＦｃγＲＩＩＩに対して７．５μＭ及びＦｃγＲＩＶに対して１μＭの結合親和性で結合を示すことが明らかになった（表１９）。対照的に、重鎖定常領域にＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、又はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ非活性化変異を有するヒトＩｇＧ１抗体バリアントは、マウスＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＶに対する結合を示さなかった（表１９）。

【0337】

表１９：バイオレイヤー干渉法によって測定した、重鎖定常領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ヒトＩｇＧ１抗体バリアントによるマウスＦｃγＲ結合親和性。高親和性受容体ＦｃγＲＩについて、Ｋ_Ｄ（Ｍ）、ｋ_ｏｎ（１／Ｍｓ）及びｋ_ｏｆｆ（１／ｓ）を、グローバル（完全）フィットを使用した１：１モデルに基づいて示す。低親和性受容体ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＶについて、定常状態分析に基づいてＫ_Ｄ（Ｍ）を示す。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＤである。試験したバリアントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－ＦＥＲ、ＩｇＧ１－ＦＥＡ、及びＩｇＧ１－ＬＡＬＡＰＧであり、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、及びＬＡＬＡＰＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇである。ＳＳＡ：定常状態分析、ＢＬＩ：バイオレイヤー干渉法、ｎｂ：結合なし、ｎ／ａ：該当なし。

【表21】

［実施例２９］
バイオレイヤー干渉法によって測定されたカニクイザルＦｃγ受容体に対する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びその非活性化バリアントの結合親和性
前臨床開発中に、非ヒト霊長類（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））を含む研究、又は非ヒト霊長類に由来する生物学的試料を含む実験を開始して、抗体治療候補の治療効果、並びに安全性及び薬物動態を調べることができる。実施例２７のデータは、バイオレイヤー干渉法によって測定した場合に、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖに対する、非活性化Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体の結合親和性又はその欠如を示した。ヒトＦｃγ受容体とカニクイザルＦｃγ受容体との間の強い配列類似性にもかかわらず、ヒトＦｃγ受容体への結合を示さなかった特定の非活性化バリアントは、依然としてカニクイザルＦｃγ受容体への結合を示し得る。したがって、望ましくない有害事象及び用量制限毒性のリスクを最小限に抑えるために、本発明者らは、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）においてバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて、カニクイザルＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩの単量体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する、野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ変異を内包するその非活性化バリアントの結合親和性を評価した。

【0338】

全ての工程を３０℃で行った。カニクイザルＦｃγＲＩについては、Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８－５１０１）並びにＳａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８－１１０４）で希釈したタンパク質の順化（３０℃で６００秒）後、Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ中でＮｉ－ＮＴＡバイオセンサを１００秒間インキュベートすることによって最初のベースライン測定を行った。続いて、Ｈｉｓタグ化カニクイザルＦｃγＲＩ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＣＦ９２３９－Ｆｃ、１μｇ／ｍｌ）をＮｉ－ＮＴＡバイオセンサ上に６００秒間固定化した。Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔにおけるベースライン測定（１００秒）の後、野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びその非活性化バリアントの会合（３００秒）及び解離（１０００秒）を決定した。カニクイザルＦｃγＲＩに対する抗体の結合を、１．５６－１００ｎＭ（ＩｇＧ１野生型用；２倍希釈）又は１５．６－１０００ｎＭ（ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、及びＩｇＧ１－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇについて；２倍希釈）の濃度範囲を使用して試験した。データ解析ソフトウェアｖ１１．１（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いてデータを解析した。要するに、基準曲線（センサ上のＦｃγＲ、試料希釈液のみによる測定）を減算し、続いてベースラインの最後の１０秒にｙ軸を位置合わせすることによって、データトレースを補正した。最後に、工程間補正及びＳａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを適用した。Ｋ_Ｄ（Ｍ）並びにｋ_ｏｎ（１／Ｍｓ）及びｋ_ｏｆｆ（１／ｓ）を決定するために、グローバル（完全）フィットを使用して１：１モデルを選択した。応答値＜０．０５を分析から除外した。４００秒の解離を、全ての抗体バリアントの分析のための目的のウインドウとして使用した。最適な適合は、＞０．９８の完全なＲ^２値によって決定され、適合と実験データとが有意に相関したことを示している。更に、グローバル（完全）フィットは、特に指示しない限り、＞３の濃度曲線適合（信頼できる分析）に基づく。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＤである。

【0339】

カニクイザルＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩについては、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８－５０１９）並びにＳａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔで希釈したタンパク質の順化（３０℃で６００秒）後、Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ中でＳＡバイオセンサを１００秒間インキュベートすることによって初期ベースライン測定を行った。続いて、Ｈｉｓタグ付きビオチン化カニクイザルＦｃγＲＩＩａ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号９００１５－Ｃ２７Ｈ－Ｂ、１μｇ／ｍｌ）、ＦｃγＲＩＩｂ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号９００１４－Ｃ２７Ｈ－Ｂ、１μｇ／ｍｌ）又はＦｃγＲＩＩＩ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＦＣ６－Ｃ８２Ｅ０、１μｇ／ｍｌ）をＳＡバイオセンサに８０秒間（ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂ）又は１００秒間（ＦｃγＲＩＩＩ）固定化した。Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔにおけるベースライン測定（１００秒）の後、野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びその非活性化バリアントの会合（５０ｓ、ＦｃγＲＩＩａ又はＦｃγＲＩＩｂ；３００秒、ＦｃγＲＩＩＩ）及び解離（１０００秒）を決定した。カニクイザルＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩに対する抗体の結合を、ある濃度範囲（ＦｃγＲＩＩａ、１５６．２５～１００００ｎＭ、２倍希釈；ＦｃγＲＩＩｂ、１８７．５～１２０００ｎＭ、２倍希釈；ＦｃγＲＩＩＩ、３１．２５～２０００ｎＭ、２倍希釈）を使用して試験した。データ解析ソフトウェアｖ１１．１（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いてデータを解析した。要するに、データトレースを基準曲線（センサ上のＦｃγＲ、試料希釈液のみによる測定）の減算によって補正し、ｙ軸をベースライン測定の最後の１０秒に位置合わせし、工程間補正を適用した。ヒトＩｇＧ１と低親和性カニクイザルＦｃγ受容体ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩとの間の低親和性のために、定常状態分析（ＳＳＡ）を選択してＫ_Ｄ（Ｍ）を決定した。要するに、０．０５未満の応答値を分析から除外した。様々な抗体濃度についての定常状態応答（センサグラムが会合相でプラトーに達した場合）を、データ解析ソフトウェアのＲ平衡（Ｒ_ｅｑ）関数を使用して計算し、続いて定常状態応答を抗体濃度に対してプロットし、最後にラングミュアモデルを使用してＫ_Ｄ（Ｍ）を計算した。最適な適合は、＞０．９８の完全なＲ^２値によって決定され、適合と実験データとが有意に相関したことを示している。更に、ＳＳＡは、＞３の会合曲線フィッティングに基づいており、各抗体濃度についてプロットされた定常状態応答はプラトーに達し、最大結合応答の適切な計算を可能にした（信頼できる分析）。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＤである。

【0340】

バイオレイヤー干渉法を用いたカニクイザルＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩに対する抗ヒトＣＤ２０ヒトＩｇＧ１抗体バリアントの結合の評価により、野生型ヒトＩｇＧ１が、試験した全てのカニクイザルＦｃγ受容体に対して、ＦｃγＲＩａに対して０．６ｎＭ、ＦｃγＲＩＩａに対して４．３μＭ、ＦｃγＲＩＩｂに対して３．９μＭ及びＦｃγＲＩＩＩに対して０．４μＭの結合親和性で結合を示すことが明らかになった（表２０）。対照的に、重鎖定常領域にＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異を有するヒトＩｇＧ１抗体バリアントは、カニクイザルＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩへの結合を示さなかった（表２０）。非活性化バリアントＩｇＧ１－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇは、低親和性受容体ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩへの結合を示さなかった。対照的に、グローバル（完全）フィット分析は最適ではなかったが（３つの濃度曲線フィットのみ）、分析は、約２．２μＭの結合親和性で、高親和性受容体ＦｃγＲＩへのＩｇＧ１－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇの結合が残留しているが大幅に減少した（約３５００倍）ことを示す（表２０）。

【0341】

要約すると、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を有するヒトＩｇＧ１抗体バリアントは、以前に記載された非活性化ＦｃバリアントＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａと同様に、カニクイザルＦｃγＲ結合を示さなかった。対照的に、ヒト又はマウスＦｃγＲ結合を全く示さなかったＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇは、カニクイザルＦｃγＲＩに対する残留結合を示したが、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩＩに対する残留結合は示さなかった。

【0342】

表２０：バイオレイヤー干渉法によって測定した、重鎖定常領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ヒトＩｇＧ１抗体バリアントによるカニクイザルＦｃγＲ結合親和性。高親和性受容体ＦｃγＲＩについて、Ｋ_Ｄ（Ｍ）、ｋ_ｏｎ（１／Ｍｓ）及びｋ_ｏｆｆ（１／ｓ）を、グローバル（完全）フィットを使用した１：１モデルに基づいて示す。低親和性受容体ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩについて、定常状態分析に基づいてＫ_Ｄ（Ｍ）を示す。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＤである。試験したバリアントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１－ＦＥＲ、ＩｇＧ１－ＦＥＡ、及びＩｇＧ１－ＬＡＬＡＰＧであり、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＦＥＡ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ、及びＬＡＬＡＰＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇである。ＳＳＡ：定常状態分析、ＢＬＩ：バイオレイヤー干渉法、ｎｂ：結合なし、ｎ／ａ：該当なし。

【表22】

［実施例３０］
重鎖領域に非活性化変異を含む抗ヒトＣＤ２０抗体及びそのバリアントによる補体依存性細胞傷害を誘導する能力に対するＣ末端リジンのコード配列を含むか又は除く遺伝子配列の影響
ＩｇＧ抗体の遺伝子配列は、重鎖のＣ末端にリジンをコードし、これは培養培地又は循環中でカルボキシペプチダーゼによって産生されたＩｇＧ抗体から（部分的に）切断され（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ；２０１５；７（４）：６７２－８０）、最終生成物の治療における潜在的な不均一性をもたらす。更に、ＨＣ Ｃ末端リジンの存在は、ＣＤＣを誘導する能力に悪影響を及ぼすことが示されている。ここでは、重鎖定常領域中の非活性化Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（ＦＥＡ）又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）変異を含む抗ヒトＣＤ２０抗体によるＣＤＣ誘導能を評価し、ＨＣ Ｃ末端リジンをコードする遺伝子配列に基づく抗体バリアントとＨＣ Ｃ末端リジンが組換え的に欠失した遺伝子配列に基づくバリアントとを比較した。理論的には、Ｃ末端リジンは、産生中又は産生後に前者のバリアントから切断され得る。

【0343】

インビトロＣＤＣアッセイを、本質的には実施例３に記載のように、補体源として２０％ＮＨＳを含むＲａｊｉ細胞に対して行った。簡潔には、重鎖定常領域に非活性化変異ＦＥＡ又はＦＥＲを有する抗ヒトＣＤ２０抗体ＩｇＧ１－ＣＤ２０又はそのバリアントを、５０，０００個／ウェルのＲａｊｉ細胞を用いて、ある範囲の濃度（０．０１４～１０μｇ／ｍＬの最終濃度；３倍希釈）で試験した。細胞溶解の尺度としてのＰＩ陽性細胞の数を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅスクリーナー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でフローサイトメトリーによって決定した。非線形アゴニスト用量－反応モデルを使用してデータを分析し、抗体対照をベースラインとして用いないＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭにおける対数変換濃度を使用して、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、続いて実験反復１回当たりを野生型ＩｇＧ１－ＣＤ２０抗体バリアントについて測定されたＡＵＣ値（１００％）に正規化した。データは、３つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。

【0344】

図２０に示すように、ＨＣ Ｃ末端リジンをコードするヌクレオチド配列を含有するか又は欠くかのいずれかの遺伝子配列に基づいて産生された抗体バリアント間で、Ｒａｊｉ細胞上のＣＤＣを誘導する能力の差は観察されなかった。これは、野生型ＩｇＧ１－ＣＤ２０抗体及びＦＥＡ又はＦＥＲ非活性化変異を含むバリアントの両方について示された。

【0345】

［実施例３１］
ＨＣ Ｃ末端リジンの組換え欠失を伴う抗ヒトＣＤ２０抗体及びその非活性化バリアントによるＦｃγ受容体を介した活性化及びシグナル伝達
実施例３０では、野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びその非活性化バリアントの重鎖（ＨＣ）Ｃ末端リジン（ｄｅｌＫ）の組換え欠失がＣＤＣの誘導を誘導又は阻害する能力に及ぼす影響を評価した。ここで、本発明者らは、標的発現Ｒａｊｉ細胞及び示されたＦｃγＲを発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞株を使用して、実施例３０に記載されるように、これらの抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びそのバリアントによって、ＰｒｏｍｅｇａレポーターアッセイにおいてヒトＦｃγＲ活性化及びシグナル伝達を評価した。

【0346】

実施例３０に示す抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントによるヒトＦｃγＲ媒介シグナル伝達の活性化を、実施例７に記載の手順に従ってＣＤ２０発現Ｒａｊｉ細胞を標的細胞として用いてレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＦｃγＲＩａ：カタログ番号ＣＳ１７８１Ｃ０１；ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ：カタログ番号Ｇ９８８Ａ；ＦｃγＲＩＩｂ：カタログ番号ＣＳ１７８１Ｅ０１；ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖ：カタログ番号Ｇ７０１Ａ）を使用して定量した。更なる分析の前に、培地のみの対照試料（Ｒａｊｉ細胞なし、抗体なし、エフェクター細胞なし）によって決定されたバックグラウンド発光シグナルを全ての試料から差し引いた。非線形アゴニスト用量－反応モデルを使用してデータを分析し、抗体対照なし（Ｒａｊｉ細胞及びエフェクター細胞のみ）のＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度をベースラインとして使用して、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。実験ごとに、ＡＵＣ値を、非結合対照ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型ＩｇＧ１（１００％）とインキュベートした細胞について観察されたレポーター活性に対して正規化した。データは、２回の独立した反復からの平均値±ＳＥＭである。

【0347】

Ｐｒｏｍｅｇａレポーターアッセイを使用したヒトＦｃγＲ活性化の評価では、ＨＣ Ｃ末端リジンが組換え的に欠失したバリアント（ＩｇＧ１－ｄｅｌＫ）と、このＣ末端リジンが産生中又は産生後に切断されたバリアント（ＩｇＧ１；図２１）との間で、ＦｃγＲＩａ－、ＦｃγＲＩＩａ－、ＦｃγＲＩＩｂ－及びＦｃγＲＩＩＩａ媒介活性化を誘導する効率に差はないことが明らかになった。更に、非活性化バリアントＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（ＦＥＡ）がＦｃγＲＩａ－、ＦｃγＲＩＩａ－、ＦｃγＲＩＩｂ－及びＦｃγＲＩＩＩａ媒介活性化を消失させる能力も影響を受けなかった（図２１）。

【0348】

要約すると、抗ヒトＩｇＧ１－ＣＤ２０抗体及びその非活性化バリアントのＨＣ Ｃ末端リジンの組換え欠失は、Ｃ末端リジンが産生中又は産生後に切断されたバリアントと比較した場合、ＣＤＣを誘導するこれらの抗体の能力又はその欠如に影響を及ぼさない。

【0349】

［実施例３２］
抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体のアロタイプバリアント及びその非活性化バリアントによる補体依存性細胞傷害
以前の実施例では、ＣＤＣを誘導する能力を、アロタイプＩｇＧ１（ｆ）に属する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントについて評価した。ここで、本発明者らは、重鎖（ＨＣ）定常領域におけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異を有する様々なアロタイプの抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体及びそのバリアントの能力を評価した。

【0350】

インビトロＣＤＣアッセイを、本質的には実施例３に記載のように、補体源として２０％ＮＨＳを含むＲａｊｉ細胞に対して行った。ＩｇＧ１（ｆａ）、ＩｇＧ１（ｚａｘ）、ＩｇＧ１（ｚａｖ）、ＩｇＧ１（ｚａ）及びＩｇＧ１（ｆ）を含む様々なアロタイプの抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体バリアントを試験した。手短に言えば、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体のアロタイプバリアント又は非活性化変異を有するそのバリアントを、５０，０００個／ウェルのＲａｊｉ細胞を用いて、ある範囲の濃度（０．０１４～１０μｇ／ｍＬの最終濃度；３倍希釈）で試験した。細胞溶解の尺度としてのＰＩ陽性細胞の数を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅスクリーナー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でフローサイトメトリーによって決定した。非線形アゴニスト用量－反応モデルを使用してデータを分析し、抗体対照をベースラインとして用いないＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭにおける対数変換濃度を使用して、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、続いて実験反復１回当たりを野生型ＩｇＧ１（ｆ）－ＣＤ２０抗体バリアントについて測定されたＡＵＣ値（１００％）に正規化した。データは、３つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。

【0351】

図２２に示すように、野生型アロタイプＩｇＧ１バリアント間で、Ｒａｊｉ細胞上のＣＤＣを誘導する能力の差は観察されなかった。ＣＤＣを誘導する能力は、ＦＥＲ又はＦＥＡ非活性化変異の導入時に全ての試験アロタイプで大幅に低下し、ＦＥＲ変異は、全ての試験アロタイプにおけるＦＥＡ変異よりも強いＣＤＣ抑制をもたらす。

【0352】

［実施例３３］
異なるＩｇＧ１アロタイプ定常領域を有する抗ヒトＣＤ２０抗体及びその非活性化バリアントによるＦｃγ受容体を介した活性化及びシグナル伝達
実施例３２では、ＣＤＣを誘導する能力に対する異なるＩｇＧ１アロタイプ定常領域を有する抗ヒトＣＤ２０抗体の重鎖（ＨＣ）におけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異の導入の影響を評価した。ここで、本発明者らは、標的発現Ｒａｊｉ細胞及び示されたＦｃγＲを発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞株を使用して、重鎖定常領域にＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異を有するこれらの異なるＩｇＧ１アロタイプ抗ヒトＣＤ２０抗体及びそのバリアントによって、ＰｒｏｍｅｇａレポーターアッセイにおいてヒトＦｃγＲ活性化及びシグナル伝達を評価した。

【0353】

実施例３２に示す抗ヒトＣＤ２０抗体バリアントによるヒトＦｃγＲ媒介シグナル伝達の活性化を、実施例７に記載の手順に従ってＣＤ２０発現Ｒａｊｉ細胞を標的細胞として用いてレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＦｃγＲＩａ：カタログ番号ＣＳ１７８１Ｃ０１；ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ：カタログ番号Ｇ９８８Ａ；ＦｃγＲＩＩｂ：カタログ番号ＣＳ１７８１Ｅ０１；ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖ：カタログ番号Ｇ７０１Ａ）を使用して定量した。更なる分析の前に、培地のみの対照試料（Ｒａｊｉ細胞なし、抗体なし、エフェクター細胞なし）によって決定されたバックグラウンド発光シグナルを全ての試料から差し引いた。非線形アゴニスト用量－反応モデルを使用してデータを分析し、抗体対照なし（Ｒａｊｉ細胞及びエフェクター細胞のみ）のＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度をベースラインとして使用して、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。実験ごとに、ＡＵＣ値を、非結合対照ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型ＩｇＧ１（ｆ）（１００％）とインキュベートした細胞について観察されたレポーター活性に対して正規化した。データは、２回の独立した反復からの平均値±ＳＥＭである。

【0354】

Ｐｒｏｍｅｇａレポーターアッセイを用いたヒトＦｃγＲＩａ－、ＦｃγＲＩＩａ－、ＦｃγＲＩＩｂ－及びＦｃγＲＩＩＩａ媒介活性化の評価により、いくらかの変動が観察されたが、試験した全ての野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１アロタイプ抗体バリアントが効率的なヒトＦｃγＲ活性化を示したことが明らかになった（図２３）。更に、異なるＩｇＧ１アロタイプバリアントの重鎖定常領域におけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異のいずれかの導入は、ＦｃγＲＩａ－、ＦｃγＲＩＩａ－、ＦｃγＲＩＩｂ－及びＦｃγＲＩＩＩａ媒介活性化を効率的に抑止した（図２３）。

【0355】

要約すると、非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒは、異なるＩｇＧ１アロタイプ定常領域を有する抗ヒトＣＤ２０抗体バリアントによるＦｃγＲ媒介活性化を効率的に無効化した。

【0356】

［実施例３４］
ＩｇＧ１、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４抗ヒトＣＤ２０抗体及びその非活性化バリアントによる補体依存性細胞傷害
ここで、本発明者らは、抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ３抗体のＨＣにおけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異の導入時、及び位置２３４にフェニルアラニン（Ｆ）を天然に有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ４抗体のＨＣにおけるＬ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異の導入時に、ＣＤＣを誘導する能力を評価した。

【0357】

Ｒａｊｉ細胞に対するインビトロＣＤＣアッセイを、本質的には実施例３に記載のように、補体源として２０％ＮＨＳを用いて行った。野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１、ＩｇＧ３（アロタイプＩＧＨＧ３＊０１及びＩＧＨＧ３＊０４［ＩｇＧ３ｒｃｈ２］）及びＩｇＧ４抗体を、上記の非活性化変異を有するそのバリアントと比較した。手短に言えば、抗体バリアントを、５０，０００個のＲａｊｉ細胞／ウェルを使用して、ある範囲の濃度（０．０１４～１０μｇ／ｍＬの最終濃度；３倍希釈）で試験した。細胞溶解の尺度としてのＰＩ陽性細胞の数を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅスクリーナー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でフローサイトメトリーによって決定した。非線形アゴニスト用量－反応モデルを使用してデータを分析し、抗体対照をベースラインとして用いないＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭにおける対数変換濃度を使用して、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、続いて実験反復１回当たりを野生型ＩｇＧ１－ＣＤ２０抗体バリアントについて測定されたＡＵＣ値（１００％）に正規化した。データは、３つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。

【0358】

図２４Ａに示されるように、野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体は、両方の野生型アロタイプのＩｇＧ３よりも強いＣＤＣを誘導した。非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ及びＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒの導入は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３バリアントの両方においてＣＤＣを誘導する能力を強く抑制し、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ変異を有するバリアントで最も強いＣＤＣ活性の抑制が観察された。野生型ＩｇＧ４はＣＤＣを誘導する非常に低い固有の能力を示し、これはＬ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異の導入によって更に抑制されなかった（図２４Ｂ）。

【0359】

要約すると、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３サブクラスの抗ヒトＣＤ２０抗体におけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異の導入は、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異よりも強くＲａｊｉ細胞のＣＤＣを誘導する能力を低下させた。

【0360】

［実施例３５］
ＩｇＧ１、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４抗ヒトＣＤ２０抗体及びその非活性化バリアントによるＦｃγ受容体を介した活性化及びシグナル伝達
実施例３４では、抗ヒトＣＤ２０抗体によるＣＤＣ誘導能を、ＩｇＧ３の重鎖（ＨＣ）定常領域におけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ若しくはＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異の導入時、又は位置２３４にフェニルアラニン（Ｆ）を天然に有するＩｇＧ４のＨＣ定常領域におけるＬ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ若しくはＬ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ非活性化変異の導入時に評価した。ここで、本発明者らは、ＨＣ定常領域に非活性化変異を有する抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４抗体並びにそれらのバリアントによる、標的発現Ｒａｊｉ細胞及び示されたＦｃγＲを発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞株を使用するＰｒｏｍｅｇａレポーターアッセイにおけるヒトＦｃγＲ活性化及びシグナル伝達を評価した。

【0361】

実施例３４に示すように、抗ヒトＣＤ２０抗体バリアントによるヒトＦｃγＲの活性化及びシグナル伝達を、実施例７に記載の手順に従ってＣＤ２０発現Ｒａｊｉ細胞を標的細胞として用いてレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＦｃγＲＩａ：カタログ番号ＣＳ１７８１Ｃ０１；ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ：カタログ番号Ｇ９８８Ａ；ＦｃγＲＩＩｂ：カタログ番号ＣＳ１７８１Ｅ０１；ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖ：カタログ番号Ｇ７０１Ａ）を使用して定量した。更なる分析の前に、培地のみの対照試料（Ｒａｊｉ細胞なし、抗体なし、エフェクター細胞なし）によって決定されたバックグラウンド発光シグナルを全ての試料から差し引いた。非線形アゴニスト用量－反応モデルを使用してデータを分析し、抗体対照なし（Ｒａｊｉ細胞及びエフェクター細胞のみ）のＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度をベースラインとして使用して、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。実験ごとに、ＡＵＣ値を、非結合対照ＩｇＧ１－ｂ１２（０％）及び野生型ＩｇＧ１（１００％）とインキュベートした細胞について観察されたレポーター活性に対して正規化した。データは、２回の独立した反復からの平均値±ＳＥＭである。

【0362】

Ｐｒｏｍｅｇａレポーターアッセイを使用したヒトＦｃγＲ媒介性活性化の評価により、野生型ヒトＩｇＧ１がＦｃγＲＩａ－、ＦｃγＲＩＩａ－、ＦｃγＲＩＩｂ－、及びＦｃγＲＩＩＩａ媒介性活性化を効率的に誘導することが明らかになった（図２５）。ＩｇＧ１と比較した場合、野生型ヒトＩｇＧ４によるＦｃγＲ媒介活性化の評価により、ＦｃγＲＩａ及びＦｃγＲＩＩｂ媒介活性化の増加（図２５Ａ、図２５Ｃ）、ＦｃγＲＩＩａ媒介活性化の減少（図２５Ｂ）、及びＦｃγＲＩＩＩａ媒介活性化の欠如（図２５Ｄ）が明らかになった。ヒトＩｇＧ３アロタイプＩＧＨＧ３＊０１（ＩｇＧ３）野生型抗体バリアントによるＦｃγＲ媒介活性化の評価により、ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂ媒介活性化の欠如（図２５Ｂ、図２５Ｃ）並びにＦｃγＲＩａ及びＦｃγＲＩＩＩａ媒介活性化のわずかな誘導（図２５Ａ、図２５Ｄ）が明らかになった。対照的に、ヒトＩｇＧ３アロタイプＩＧＨＧ３＊０４（ＩｇＧ３ｒｃｈ２）野生型抗体バリアントは、ヒトＩｇＧ３アロタイプＩＧＨＧ３＊０１によるＦｃγＲＩａ－、ＦｃγＲＩＩａ－、ＦｃγＲＩＩｂ－及びＦｃγＲＩＩＩａ媒介活性化と比較した場合、ＦｃγＲＩａ－、ＦｃγＲＩＩａ－、ＦｃγＲＩＩｂ－及びＦｃγＲＩＩＩａ媒介活性化の増加を示したが、ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａに対するＦｃγＲ媒介活性化のレベルは、野生型ヒトＩｇＧ１と比較して依然として低下していた（図２５）。抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体バリアントによるＦｃγＲＩａ－、ＦｃγＲＩＩａ－、ＦｃγＲＩＩｂ－、及びＦｃγＲＩＩＩａ媒介活性化の評価により、重鎖定常領域におけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ若しくはＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ３ｒｃｈ２）の導入又はＬ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ若しくはＬ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａ（ＩｇＧ４）の非活性化変異の導入が、試験した全てのＦｃγＲの活性化を効率的に抑止したことが明らかになった（図２５）。

【0363】

要約すると、非活性化突然変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（又はＩｇＧ４についてはＬ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ）は、これらの非活性化突然変異がＩｇＧ１、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４重鎖定常領域に導入されたかどうかにかかわらず、抗ヒトＣＤ２０抗体バリアントによるＦｃγＲ媒介活性化を効率的に無効化した。

【0364】

［実施例３６］
バイオレイヤー干渉法によって測定したヒトＦｃγ受容体に対する抗ヒトＣＤ２０マウスＩｇＧ２ａ抗体及びその非活性化バリアントの結合親和性
免疫不全マウスを使用する前臨床異種移植片モデルは、腫瘍特異的抗体を使用する治療概念を確立するために使用されることが多い。しかしながら、より複雑な治療上の問題は、治療用抗体の生物学及び有効性を正確に捕捉する免疫担当マウスの使用を必要とする。そのような場合、代用マウス抗体は、抗体とマウスエフェクター分子との自然な相互作用を可能にするために必要である。実施例２７～２９では、ヒト、マウス及びカニクイザルＦｃγ受容体に対するヒトＩｇＧ１抗体及びその非活性化バリアントの結合親和性を評価したが、ここでは、マウスＩｇＧ２ａ抗体の重鎖（ＨＣ）定常領域に非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒを導入するとヒトＦｃγＲへの結合が妨げられるかどうかを調べた。マウスＦｃγＲに対するこれらのバリアントの結合親和性を実施例３７で評価する。

【0365】

ここで、本発明者らは、本質的に実施例２７に記載されるように、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）でのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖの単量体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する、野生型マウス抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ抗体及びＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、又はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ変異を内包するその非活性化バリアントの結合親和性を評価した。手短に言えば、ヒトＦｃγＲＩａについて、Ｎｉ－ＮＴＡセンサにヒトＦｃγＲＩａをロードした後、Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔにおけるベースライン測定（１００秒）を行った。続いて、その野生型マウス抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ抗体非活性化バリアントの会合（３００秒）及び解離（１０００秒）を決定した。ヒトＦｃγＲＩａに対する抗体の結合を、１．５６～１００ｎＭ（野生型ＩｇＧ２ａの場合；２倍希釈）又は１５．６～１０００ｎＭ（ＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ及びＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇについて；２倍希釈）の濃度範囲を使用して試験した。実施例２７に記載されるようにデータを分析し、応答値＜０．０５を分析から除外した。４００秒の解離を、ＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａを除く全ての抗体バリアントの分析のための目的のウインドウとして使用し、５０秒の解離を目的のウインドウとして使用した。最適な適合は、＞０．９８の完全なＲ^２値によって決定され、適合と実験データとが有意に相関したことを示している。更に、グローバル（完全）フィットは、特に指示しない限り、＞３の曲線適合（信頼できる分析）に基づく。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＤである。

【0366】

ヒトＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖへの結合の評価を、本質的に実施例２７に記載のように行った。手短に言えば、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサにヒトＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖをロードした後、Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔにおけるベースライン測定（１００秒）を行った。続いて、マウス抗ヒトＣＤ２０抗体ＩｇＧ２ａ野生型及びその非活性化バリアントの会合（５０ｓ、ＦｃγＲＩＩａ又はＦｃγＲＩＩｂ；３００秒、ＦｃγＲＩＩＩａ）及び解離（１０００秒）を決定した。ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖに対する抗体の結合を、ある濃度範囲（ＦｃγＲＩＩａ、１５６．２５－１００００ｎＭ、２倍希釈；ＦｃγＲＩＩｂ、２５０～１６０００ｎＭ、２倍希釈；ＦｃγＲＩＩＩａ、１２５～８０００ｎＭ、２倍希釈）を使用して試験した。実施例２７に記載されるようにデータを分析した。マウスＩｇＧ２ａと低親和性Ｆｃγ受容体ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖとの間の低親和性のために、定常状態分析（ＳＳＡ）を選択してＫ_Ｄ（Ｍ）を決定した。要するに、０．０５未満の応答値を分析から除外した。様々な抗体濃度についての定常状態応答（センサグラムが会合相でプラトーに達した場合）を、データ解析ソフトウェアのＲ平衡（Ｒ_ｅｑ）関数を使用して計算し、続いて定常状態応答を抗体濃度に対してプロットし、最後にラングミュアモデルを使用してＫ_Ｄ（Ｍ）を計算した。最適な適合は、＞０．９８の完全なＲ^２値によって決定され、適合と実験データとが有意に相関したことを示している。更に、ＳＳＡは、＞３の会合曲線フィッティングに基づいており、各抗体濃度についてプロットされた定常状態応答はプラトーに達し、特に異なって示されない限り、最大結合応答の適切な計算を可能にした（信頼できる分析）。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＤである。

【0367】

バイオレイヤー干渉法を用いたヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖに対するマウス抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ抗体バリアントの結合の評価により、野生型マウスＩｇＧ２ａが、試験した全てのヒトＦｃγ受容体に対して、ＦｃγＲＩａに対して１．２７ｎＭ、ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈに対して１．８５μＭ、ＦｃγＲＩＩｂに対して１７μＭ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖに対して１．９５μＭの結合親和性で結合を示すことが明らかになった（表２１）。対照的に、重鎖定常領域にＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ非活性化変異を有するマウスＩｇＧ２ａ抗体バリアントは、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖに対する結合を示さなかった（表２１）。重鎖定常領域にＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ非活性化変異を有するマウスＩｇＧ２ａは、ヒトＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ及びＦｃγＲＩＩｂに対する結合を示さなかった。分析は、ヒトＦｃγＲＩａ（Ｋ_Ｄ＝３．６μＭ；３つの濃度曲線適合のみに基づくグローバル（完全）フィット分析）及びヒトＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖ（Ｋ_Ｄ＝１３．８μＭ；定常状態応答はプラトーに達しなかった）に対するＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａの低い残留結合を示した（表２１）。

【0368】

要約すると、マウスＩｇＧ２ａ抗体の重鎖定常領域にＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を導入すると、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ非活性化変異を有するマウスＩｇＧ２ａ抗体と同様に、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖへの結合が妨げられた。

【0369】

表２１：バイオレイヤー干渉法によって測定した、重鎖定常領域に非活性化変異を有するマウス抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ抗体バリアントによるヒトＦｃγＲ結合親和性。高親和性受容体ＦｃγＲＩａについて、Ｋ_Ｄ（Ｍ）、ｋ_ｏｎ（１／Ｍｓ）及びｋ_ｏｆｆ（１／ｓ）を、グローバル（完全）フィットを使用した１：１モデルに基づいて示す。低親和性受容体ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖについて、定常状態分析に基づいてＫ_Ｄ（Ｍ）を示す。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＤである。試験したバリアントは、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ａ－ＦＥＲ、ＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡ、及びＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡＰＧであり、式中、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＬＡＬＡ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ、及びＬＡＬＡＰＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇである。ＳＳＡ：定常状態分析、ＢＬＩ：バイオレイヤー干渉法、ｎｂ：結合なし、ｎ／ａ：該当なし。

【表23】

［実施例３７］
バイオレイヤー干渉法によって測定したマウスＦｃγ受容体に対する抗ヒトＣＤ２０マウスＩｇＧ２ａ抗体及びその非活性化バリアントの結合親和性
実施例３６では、ヒトＦｃγＲに対する抗ヒトＣＤ２０マウスＩｇＧ２ａ非活性化抗体の親和性の結合を評価した。ここで、マウスＩｇＧ２ａ抗体の重鎖（ＨＣ）定常領域に非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒを導入すると、マウスＦｃγＲへの結合が妨げられるかどうかを調べた。

【0370】

マウスＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＶのモノマー細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する実施例３６に記載されるマウス抗ヒトＣＤ２０抗体の結合親和性を、本質的に実施例２８に記載されるように、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）においてバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて評価した。手短に言えば、マウスＦｃγＲＩについて、Ｎｉ－ＮＴＡセンサにマウスＦｃγＲＩを負荷した後、Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔにおけるベースライン測定（１００秒）を行った。続いて、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ変異を有する野生型マウス抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ抗体及びその非活性化バリアントの会合（３００秒）及び解離（１０００秒）を決定した。マウスＦｃγＲＩに対する抗体の結合を、１．５６～１００ｎＭ（野生型ＩｇＧ２ａの場合；２倍希釈）又は１５．６～１０００ｎＭ（ＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ及びＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇについて；２倍希釈）の濃度範囲を使用して試験した。実施例２８に記載されるようにデータを分析し、応答値＜０．０５を分析から除外した。４００秒の解離を、全ての抗体バリアントの分析のための目的のウインドウとして使用した。最適な適合は、＞０．９８の完全なＲ^２値によって決定され、適合と実験データとが有意に相関したことを示している。更に、グローバル（完全）フィットは、特に指示しない限り、＞３の曲線適合（信頼できる分析）に基づく。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＤである。

【0371】

マウスＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＶに対する結合親和性の評価は、本質的に実施例２８に記載のように行った。手短に言えば、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサにマウスＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ又はＦｃγＲＩＶをロードした後、Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔにおけるベースライン測定（１００秒）を行った。続いて、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ変異を有する野生型マウス抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ抗体及びその非活性化バリアントの会合（５０ｓ、ＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩＩ；３００秒、ＦｃγＲＩＶ）及び解離（１０００秒）を決定した。マウスＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＶに対する抗体の結合を、ある濃度範囲（ＦｃγＲＩＩｂ、１８７．５～１２，０００ｎＭ、２倍希釈；ＦｃγＲＩＩＩ、１５６．２５～１０，０００ｎＭ、２倍希釈；ＦｃγＲＩＶ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ及びＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇについては１５．６３～１，０００ｎＭ、又はＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａについては１５６．３～１０，０００ｎＭ、２倍希釈）を使用して試験した。実施例２８に記載されるようにデータを分析した。マウスＩｇＧ２ａと低親和性Ｆｃγ受容体ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＶとの間の低親和性のために、定常状態分析（ＳＳＡ）を選択してＫ_Ｄ（Ｍ）を決定した。要するに、０．０５未満の応答値を分析から除外した。様々な抗体濃度についての定常状態応答（センサグラムが会合相でプラトーに達した場合）を、データ解析ソフトウェアのＲ平衡（Ｒ_ｅｑ）関数を使用して計算し、続いて定常状態応答を抗体濃度に対してプロットし、最後にラングミュアモデルを使用してＫ_Ｄ（Ｍ）を計算した。最適な適合は、＞０．９８の完全なＲ^２値によって決定され、適合と実験データとが有意に相関したことを示している。更に、ＳＳＡは、＞３の会合曲線フィッティングに基づいており、各抗体濃度についてプロットされた定常状態応答はプラトーに達し、特に異なって示されない限り、最大結合応答の適切な計算を可能にした（信頼できる分析）。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＤである。

【0372】

バイオレイヤー干渉法を用いたマウスＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＶに対するマウス抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ抗体バリアントの結合の評価により、野生型マウスＩｇＧ２ａが、試験した全てのマウスＦｃγ受容体に対して、ＦｃγＲＩに対して約３．８ｎＭ、ＦｃγＲＩＩｂに対して６．４μＭ、ＦｃγＲＩＩＩに対して６．９μＭ及びＦｃγＲＩＶに対して０．１５μＭの結合親和性で結合を示すことが明らかになった（表２２）。対照的に、重鎖定常領域にＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ非活性化変異を有するマウスＩｇＧ２ａ抗体バリアントは、マウスＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＶへの結合を示さなかった（表２２）。更に、マウスＦｃγＲＩに対するＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇの結合親和性は、野生型ＩｇＧ２ａと比較して大幅に低下した（１００倍）が、分析は最適ではなかった（グローバル（完全）フィット分析について４フィット未満）（表２２）。マウスＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａは、マウスＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩに対する結合を示さなかったが、マウスＦｃγＲＩ（ｗｔ ＩｇＧ２ａと比較して１００～１５０倍の減少）及びＦｃγＲＩＶ（ｗｔ ＩｇＧ２ａと比較して１００倍の減少）に対する低い残留結合を示した（表２２）。

【0373】

要約すると、Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を有するマウスＩｇＧ２ａ抗体バリアントは、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ非活性化変異を有するマウスＩｇＧ２ａ抗体と同様に、マウスＦｃγＲ結合を示さなかった（ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃγＲＩＶ）か、又は大きく減少した（ＦｃγＲＩ）ことを示した。

【0374】

表２２：バイオレイヤー干渉法によって測定した、重鎖定常領域に非活性化変異を有するマウス抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ抗体バリアントによるマウスＦｃγＲ結合親和性。高親和性受容体ＦｃγＲＩについて、Ｋ_Ｄ（Ｍ）、ｋ_ｏｎ（１／Ｍｓ）及びｋ_ｏｆｆ（１／ｓ）を、グローバル（完全）フィットを使用した１：１モデルに基づいて示す。低親和性受容体ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＶについて、定常状態分析に基づいてＫ_Ｄ（Ｍ）を示す。示されるデータは、２回の独立した反復の平均値±ＳＤである。試験したバリアントは、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ａ－ＦＥＲ、ＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡ、及びＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡＰＧであり、式中、ＦＥＲ：Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、ＬＡＬＡ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ、及びＬＡＬＡＰＧ：Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇである。ＳＳＡ：定常状態分析、ＢＬＩ：バイオレイヤー干渉法、ｎｂ：結合なし、ｎ／ａ：該当なし。

【表24】

［実施例３８］
抗ヒトＣＤ２０マウスＩｇＧ２ａ抗体及びその非活性化バリアントによるヒトＦｃγ受容体を介した活性化及びシグナル伝達
実施例３６は、マウスＩｇＧ２ａ抗体の重鎖（ＨＣ）定常領域にＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異を導入すると、バイオレイヤー干渉法によって測定した場合、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖへの結合が効率的に妨げられることを示した。しかしながら、そのようなアッセイでは、エフェクター細胞上のＦｃ受容体の抗原結合、標的媒介性抗体クラスター化及びその後の標的媒介性クラスター化の効果はなかった。ここで、本発明者らは、野生型抗ヒトＣＤ２０マウスＩｇＧ２ａ抗体、及び重鎖定常領域にＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ、又はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ非活性化変異を有するそのバリアントによる、標的発現Ｒａｊｉ細胞及び示されたＦｃγＲを発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞株を使用するＰｒｏｍｅｇａレポーターアッセイにおけるヒトＦｃγＲ活性化及びシグナル伝達を評価した。

【0375】

上記のマウスＩｇＧ２ａ抗ヒトＣＤ２０抗体バリアントによるヒトＦｃγＲ媒介シグナル伝達の活性化を、レポーターＢｉｏＡｓｓａｙｓ Ｐｒｏｍｅｇａ、ＦｃγＲＩａ：カタログ番号ＣＳ１７８１Ｃ０１；ＦｃγＲＩＩａアロタイプ１３１Ｈ：カタログ番号Ｇ９８８Ａ；ＦｃγＲＩＩｂ：カタログ番号ＣＳ１７８１Ｅ０１；ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプ１５８Ｖ：カタログ番号Ｇ７０１Ａ）を、実施例７に記載の手順に従って標的細胞としてＣＤ２０発現Ｒａｊｉ細胞と共に使用して定量した。更なる分析の前に、培地のみの対照試料（Ｒａｊｉ細胞なし、抗体なし、エフェクター細胞なし）によって決定されたバックグラウンド発光シグナルを全ての試料から差し引いた。非線形アゴニスト用量－反応モデルを使用してデータを分析し、抗体対照なし（Ｒａｊｉ細胞及びエフェクター細胞のみ）のＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度をベースラインとして使用して、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。実験ごとに、ＡＵＣ値を、非結合対照ＩｇＧ２ａ－ｂ１２とインキュベートした細胞（０％）及び野生型ＩｇＧ２ａ－ＣＤ２０の活性（１００％）について観察されたレポーター活性に対して正規化した。データは、２回の独立した反復からの平均値±ＳＥＭである。

【0376】

Ｐｒｏｍｅｇａレポーターアッセイを用いたヒトＦｃγＲＩａ－、ＦｃγＲＩＩａ－、ＦｃγＲＩＩｂ－及びＦｃγＲＩＩＩａ媒介活性化の評価により、マウスＩｇＧ２ａ抗体の重鎖定常領域におけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異の導入が、ＩｇＧ２ａ非活性化バリアントＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇに匹敵するＦｃγＲ媒介活性化を効率的に阻害することが明らかになった（図２６）。ＦｃγＲＩａを介して媒介される部分的活性化（図２６Ａ）を除いて、ＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５ＡについてもＦｃγＲ媒介性活性化の欠如が観察され（図２６Ｂ～Ｄ）、これは、バイオレイヤー干渉法によって測定した場合のヒトＦｃγＲＩａに対するＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａについて観察された低い残留結合と一致している（実施例３６）。

【0377】

要約すると、抗ヒトＣＤ２０マウスＩｇＧ２ａ抗体の重鎖定常領域におけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ非活性化変異の導入は、非活性化抗体バリアントＩｇＧ２ａ－Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇに匹敵するヒトＦｃγＲ媒介活性化を効率的に抑止した。

【0378】

［実施例３９］
抗ヒトＣＤ２０マウスＩｇＧ２ａ抗体及びその非活性化バリアントによるＣ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害
以前の実施例において、抗ヒトＣＤ２０ヒトＩｇＧ１抗体の重鎖（ＨＣ）定常領域におけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）非活性化変異の導入は、補体因子Ｃ１ｑと会合する能力、並びにＣＤＣを誘導する能力のほぼ完全な消失をもたらすことが示された。ここでは、野生型抗ヒトＣＤ２０マウスＩｇＧ２ａ抗体及びＨＣ中にＦＥＲ、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ変異を有するその非活性化バリアントがヒト補体因子Ｃ１ｑに結合する能力、並びにＣＤＣを誘導する能力を評価した。

【0379】

野生型抗ヒトＣＤ２０マウスＩｇＧ２ａ抗体及びＨＣに非活性化変異を有するそのバリアントを、上述のように、本質的に実施例４に記載の手順に従って、Ｃ１ｑの供給源として２０％正常ヒト血清（ＮＨＳ、カタログ番号Ｍ０００８、Ｓａｎｑｕｉｎ）を用いたある範囲の濃度（０．００２４μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの最終濃度；４倍希釈）を用いて、Ｒａｊｉ細胞（３×１０^４細胞／ウェル）に対するＣ１ｑ結合アッセイで試験した。抗体バリアントへのＣ１ｑ結合を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅスクリーナー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でのフローサイトメトリーによって、蛍光強度中央値－ＦＩＴＣを測定することによって検出した。非線形アゴニスト用量－反応モデルを使用してデータを分析し、抗体コントロールなしのＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度をベースラインとして使用して、実験反復１回当たりの用量－反応曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、続いて、非結合コントロール抗体ＩｇＧ２ａ－ｂ１２について測定したＡＵＣ値（０％）及び野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ抗体バリアントについて測定したＡＵＣ値（１００％）に対する実験反復１回当たりの正規化を行った。データは、３つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。

【0380】

Ｃ１ｑ結合アッセイで試験したのと同じ抗体バリアントをインビトロＣＤＣアッセイで試験した。本質的には更に実施例３に記載されるように、１ウェル当たり３×１０^４個のＲａｊｉ細胞を使用して、抗体バリアントをある範囲の濃度（０．００２４～１０μｇ／ｍＬの最終濃度；４倍希釈）で試験した。ＰＩ陽性細胞の数をＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅスクリーナー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でフローサイトメトリーによって決定した。細胞溶解のパーセンテージに対応するＰＩ陽性細胞のパーセンテージを、（ＰＩ陽性細胞の数／細胞の総数）×１００％として計算した。非線形アゴニスト用量－反応モデルを使用してデータを分析し、抗体コントロールなしのＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（バージョン８．４．１、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）における対数変換濃度をベースラインとして使用して、実験反復１回当たりのＡＵＣを計算し、続いて、非結合コントロール抗体ＩｇＧ２ａ－ｂ１２について測定したＡＵＣ値（０％）及び野生型抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ抗体バリアントについて測定したＡＵＣ値（１００％）に対する実験反復１回当たりの正規化を行った。データは、３つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭである。

【0381】

マウスＩｇＧ２ａ－ＣＤ２０バリアントへのＣ１ｑの結合の評価により、野生型ＩｇＧ２ａ－ＣＤ２０は、標的Ｒａｊｉ細胞上のＣＤ２０に結合すると補体タンパク質Ｃ１ｑと効率的に係合することが明らかになった（図２７）。ＨＣにおけるＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ変異を有する非活性化バリアントは、補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合を効率的に無効にした（図２７）。しかし、マウスＩｇＧ２ａ抗体のＨＣにＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ非活性化変異を導入すると、Ｃ１ｑへの結合は減少したが残留した（図２７）。

【0382】

同じＩｇＧ２ａ－ＣＤ２０バリアントのＣＤＣ誘導能の評価により、Ｃ１ｑ結合の結果と一致する結果が明らかになった。マウスＩｇＧ２ａ抗体のＨＣに非活性化Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ変異を導入すると、ＣＤＣを誘導する能力がほぼ完全に消失した（図２８）。更に、マウスＩｇＧ２ａ抗体のＨＣにおけるＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒ又はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ非活性化変異の導入はＣＤＣの減少をもたらしたが、残留ＣＤＣは依然として観察された（図２８）。

【0383】

要約すると、マウスＩｇＧ２ａ抗体に非活性化変異Ｌ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｇ２３６Ｒを導入すると、補体因子Ｃ１ｑと係合する能力及びＣＤＣを誘導する能力の完全阻害はもたらされなかったが、低下した。したがって、ＦＥＲ非活性化変異の導入は、ヒトＣ１ｑと係合し、ヒトＩｇＧ抗体及びマウスＩｇＧ抗体の両方のＣＤＣを誘導する能力を低下させると結論付けられた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21-1】

【図21-2】

【図22】

【図23-1】

【図23-2】

【図24-1】

【図24-2】

【図25-1】

【図25-2】

【図26-1】

【図26-2】

【図27】

【図28】

【配列表】

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【国際調査報告】