(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-19
(54)【発明の名称】改変クロストリジウム神経毒
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20240312BHJP
C07K 14/33 20060101ALI20240312BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240312BHJP
A61K 38/48 20060101ALI20240312BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240312BHJP
A61P 21/02 20060101ALI20240312BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240312BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20240312BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31
C07K14/33 ZNA
C12P21/02 C
A61K38/48
A61P25/00
A61P21/02
A61P17/00
G01N33/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023555335
(86)(22)【出願日】2022-03-11
(85)【翻訳文提出日】2023-09-26
(86)【国際出願番号】 GB2022050641
(87)【国際公開番号】W WO2022189807
(87)【国際公開日】2022-09-15
(31)【優先権主張番号】2103372.5
(32)【優先日】2021-03-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517340507
【氏名又は名称】イプセン バイオファーム リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＩＰＳＥＮ ＢＩＯＰＨＡＲＭ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110000774
【氏名又は名称】弁理士法人 もえぎ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ムーア，ケビン
(72)【発明者】
【氏名】スプレビンス，アンドリュー
(72)【発明者】
【氏名】バラタ，テレサ シルバ
(72)【発明者】
【氏名】ヒジャズィ，ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】スペンサー，デイビッド
【テーマコード（参考）】
2G045
4B064
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045DA36
4B064AG30
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE10
4B064CE11
4B064DA01
4C084AA02
4C084AA06
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA04
4C084CA53
4C084DC09
4C084NA03
4C084NA14
4C084ZA031
4C084ZA032
4C084ZA231
4C084ZA232
4C084ZA941
4C084ZA942
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045CA11
4H045DA83
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA21
4H045GA23
(57)【要約】
本発明は、ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインを含む改変クロストリジウム神経毒を対象とし、ここで、HCCドメインは、メチオニン1144(M1144)の改変を含み、ここで、改変は、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大する。また、(とりわけ)それを生成する対応する方法、酸化耐性クロストリジウム神経毒を選択する方法、それをコードする核酸および前記改変クロストリジウム神経毒の治療的使用も提供される。
【選択図】図4
【選択図】図4
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインを含む改変クロストリジウム神経毒:ここで、当該HCCドメインは、メチオニン1144(M1144)の改変を含み、ここで、当該改変は、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に、改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大する。
【請求項2】
以下を含む、改変クロストリジウム神経毒を生成する方法:(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする第1の核酸を提供し、コードされるHCCドメインのメチオニン1144(M1144)で改変を導入するように第1の核酸を改変し、それによって、第2の核酸を生成すること、ここで、当該改変は、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大する;または
(b)請求項1に記載の改変クロストリジウム神経毒をコードする核酸を合成し、それによって、合成された核酸を提供すること;または
(c)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする核酸を合成し、ここで、当該HCCドメインは、メチオニン1144(M1144)の改変を含み、当該改変は、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大する、それによって、合成された核酸を提供すること;および
(d)第2の核酸または合成された核酸をそれぞれ発現させ、それによって、改変クロストリジウム神経毒を生成すること。
【請求項3】
アミノ酸位置番号付けが、配列番号2とのアライメントによって定義される、請求項1に記載の改変クロストリジウム神経毒または請求項2に記載の方法。
【請求項4】
改変が、M1144の、酸化に対して耐性であるアミノ酸との置換である、前記の請求項のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項5】
改変HCCドメインがRX1X2VX3TTNIYLNSX4LYX5GT(配列番号102)を含み、ここで、X1がDまたはGであり、X2がSまたはNであり、X3が酸化に対して耐性であるアミノ酸であり、X4がSまたはTであり、X5がMまたはRである、前記の請求項のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項6】
改変HCCドメインが、RX1X2VX3TTNIYLNSX4LYX5GT(配列番号102)を含み、ここで、X1がDまたはGであり、X2がSまたはNであり、X3が酸化に対して耐性であるアミノ酸であり、X4がSまたはTであり、X5がMまたはRであり、ここで、当該改変HCCドメインが、配列番号63～69、71～77、79～85、87～93または95～101のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項7】
改変がM1144V、M1144G、M1144L、M1144T、M1144AおよびM1144Iから選択される置換である、前記の請求項のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項8】
改変がM1144の欠失である、請求項1から3のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項9】
改変HCCドメインが、RX1X2VTTNIYLNSX3LYX4GT(配列番号111)を含み、ここで、X1がDまたはGであり、X2がSまたはNであり、X3がSまたはTであり、X4がMまたはRである、請求項1から3または7のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項10】
改変HCCドメインが、RX1X2VTTNIYLNSX3LYX4GT(配列番号111)を含み、ここで、X1がDまたはGであり、X2がSまたはNであり、X3がSまたはTであり、X4がMまたはRであり、ここで、当該改変HCCドメインが、配列番号63～69、71～77、79～85、87～93または95～101のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項1～3または8～9のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項11】
BoNT/A HCCドメインが、BoNT/A1 HCCドメイン、BoNT/A3 HCCドメインまたはBoNT/A4 HCCドメインである、前記の請求項のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項12】
(a)RX1X2VX3TTNIYLNSX4LYX5GT(配列番号102)、ここで、X1がDまたはGであり、X2がSまたはNであり、X3が酸化に対して耐性であるアミノ酸であり、X4がSまたはTであり、X5がMまたはRである;
または
(b)RX1X2VTTNIYLNSX3LYX4GT(配列番号111)、
ここで、X1がDまたはGであり、X2がSまたはNであり、X3がSまたはTであり、X4がMまたはRである;
を含む改変BoNT/A1 HCCドメイン、改変BoNT/A3 HCCドメイン、または改変BoNT/A4 HCCドメインを含む、
改変クロストリジウム神経毒。
【請求項13】
改変クロストリジウム神経毒が、配列番号63～69、71～77、79～85、87～93または95～101のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項1～5、7～9または11～12のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項14】
改変クロストリジウム神経毒が、配列番号63～69、71～77、79～85、87～93または95～101のいずれか1つに対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項15】
改変クロストリジウム神経毒が、改変BoNT/A1、改変BoNT/A3または改変BoNT/A4である、前記の請求項のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項16】
前記の請求項のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法:ここで、改変クロストリジウム神経毒は、ASN886、ASN905、GLN915、ASN918、GLU920、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、GLU992、GLN995、ASN1006、ASN1025、ASN1026、ASN1032、ASN1043、ASN1046、ASN1052、ASP1058、HIS1064、ASN1080、GLU1081、GLU1083、ASP1086、ASN1188、ASP1213、GLY1215、ASN1216、GLN1229、ASN1242、ASN1243、SER1274およびTHR1277のうち1つ以上の改変をさらに含む改変BoNT/A1であり、
好ましくは、改変が以下から選択される:
(a)酸性アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基との置換;
(b)酸性アミノ酸残基の無電荷アミノ酸残基との置換;
(c)無電荷アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基との置換;
(d)塩基性アミノ酸残基の挿入;および
(e)酸性アミノ酸残基の欠失。
【請求項17】
改変クロストリジウム神経毒が、配列番号3～9、12～18、21～27、30～36、39～45、47～53または55～61のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項18】
改変クロストリジウム神経毒が、配列番号3～9、12～18、21～27、30～36、39～45、47～53または55～61のいずれか1つに対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項19】
改変クロストリジウム神経毒が、単鎖改変クロストリジウム神経毒である、前記の請求項のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項20】
改変クロストリジウム神経毒が、ジスルフィド結合によって一緒に繋げられた軽鎖および重鎖を含む二本鎖改変クロストリジウム神経毒である、請求項1から18のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項21】
改変クロストリジウム神経毒が、軽鎖中に1つ以上のさらなる改変を含まない(例えば、未改変軽鎖と比較した場合に)、前記の請求項のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項22】
置換がM1144のみでの置換である、請求項1から7または11から21のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または方法。
【請求項23】
以下を含む、酸化耐性クロストリジウム神経毒を選択する方法:(a)クロストリジウム神経毒重鎖またはその部分の酸化可能アミノ酸残基を同定すること;
(b)前記酸化可能アミノ酸残基が改変されている改変クロストリジウム神経毒を生成すること;
(c)改変クロストリジウム神経毒を酸化条件に付すこと;
(d)改変クロストリジウム神経毒の活性レベルを決定すること;
(e)ステップ(d)において決定された活性レベルを、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒の活性レベルと比較すること、ここで、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒は酸化条件に付されている;および
(f)活性レベルが、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒の活性レベルよりもより高い場合に、当該改変クロストリジウム神経毒を選択すること;または
(g)活性レベルが、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒の活性レベルと同一またはそれより低い場合に、当該改変クロストリジウム神経毒を破棄すること。
【請求項24】
クロストリジウム神経毒重鎖の部分が、転位置ドメイン(HNドメイン)もしくはその一部分または受容体結合ドメイン(HCドメイン)もしくはその一部分を含む(好ましくは、それからなる)、請求項23に記載の方法。
【請求項25】
好ましくは、改変クロストリジウム神経毒が酸化耐性である、請求項23または24に記載の方法によって選択される改変クロストリジウム神経毒。
【請求項26】
請求項1、3～22または25のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒をコードする核酸配列を含む核酸。
【請求項27】
軽鎖および重鎖を有する単鎖改変クロストリジウム神経毒を生成する方法であって、請求項26に記載の核酸を適した宿主細胞において発現させること、宿主細胞を溶解して単鎖改変クロストリジウム神経毒を含有する宿主細胞ホモジネートを提供すること、および単鎖改変クロストリジウム神経毒を単離することを含む、方法。
【請求項28】
以下を含む、改変クロストリジウム神経毒を活性化する方法:請求項27に記載の方法によって得ることができる単鎖改変クロストリジウム神経毒を提供すること;
当該単鎖改変クロストリジウム神経毒を、軽鎖および重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で単鎖改変クロストリジウム神経毒を切断するプロテアーゼと接触させ、それによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換すること、
ここで、当該軽鎖および重鎖はジスルフィド結合によって一緒に繋げられる。
【請求項29】
請求項28に記載の方法によって得ることができる二本鎖改変クロストリジウム神経毒。
【請求項30】
請求項1、3から22または25のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒または請求項29に記載の二本鎖改変クロストリジウム神経毒ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤、アジュバント、噴射剤および/または塩を含む医薬組成物。
【請求項31】
医薬において使用するための、請求項1、3から22または25のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒、請求項29に記載の二本鎖改変クロストリジウム神経毒または請求項30に記載の医薬組成物。
【請求項32】
望まれない免疫分泌と関連する状態、斜視、眼瞼痙攣、内斜視、ジストニア、斜頸、眼性運動性の神経筋障害または状態、美容的障害、書痙、歯ぎしり、ウィルソン病、振戦、チック、分節性ミオクローヌス、攣縮、慢性多発性硬化症による痙縮、異常な膀胱制御をもたらす痙縮、アニムス、背部痙攣、こむら返り、緊張性頭痛、骨盤挙筋症候群、二分脊椎症、遅発性ジスキネジア、パーキンソン病、吃音、片側顔面痙攣、眼瞼障害、脳性麻痺、局所性痙縮、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、四肢痙縮、裂肛、アカラシア、嚥下障害、流涙、多汗症(hyperhydrosis)、過度の唾液分泌、過度の胃腸管分泌、筋肉痛、頭痛の疼痛、癌、子宮障害、泌尿生殖器障害、泌尿生殖器-神経疾患、慢性神経原性炎症および平滑筋障害から選択された障害の処置において使用するための、請求項1、3から22または25のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒、請求項29に記載の二本鎖改変クロストリジウム神経毒または請求項30に記載の医薬組成物。
【請求項33】
以下を対象に投与することを含む、障害を処置する方法: 請求項1、3から22または25のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒; 請求項29に記載の二本鎖改変クロストリジウム神経毒;または請求項30に記載の医薬組成物; ここで、障害は、望まれない免疫分泌と関連する状態、斜視、眼瞼痙攣、内斜視、ジストニア、斜頸、眼性運動性の神経筋障害または状態、美容的障害、書痙、歯ぎしり、ウィルソン病、振戦、チック、分節性ミオクローヌス、攣縮、慢性多発性硬化症による痙縮、異常な膀胱制御をもたらす痙縮、アニムス、背部痙攣、こむら返り、緊張性頭痛、骨盤挙筋症候群、二分脊椎症、遅発性ジスキネジア、パーキンソン病、吃音、片側顔面痙攣、眼瞼障害、脳性麻痺、局所性痙縮、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、四肢痙縮、裂肛、アカラシア、嚥下障害、流涙、多汗症(hyperhydrosis)、過度の唾液分泌、過度の胃腸管分泌、筋肉痛、頭痛の疼痛、癌、子宮障害、泌尿生殖器障害、泌尿生殖器-神経疾患、慢性神経原性炎症および平滑筋障害から選択される。
【請求項34】
望まれない免疫分泌と関連する状態、斜視、眼瞼痙攣、内斜視、ジストニア、斜頸、眼性運動性の神経筋障害または状態、美容的障害、書痙、歯ぎしり、ウィルソン病、振戦、チック、分節性ミオクローヌス、攣縮、慢性多発性硬化症による痙縮、異常な膀胱制御をもたらす痙縮、アニムス、背部痙攣、こむら返り、緊張性頭痛、骨盤挙筋症候群、二分脊椎症、遅発性ジスキネジア、パーキンソン病、吃音、片側顔面痙攣、眼瞼障害、脳性麻痺、局所性痙縮、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、四肢痙縮、裂肛、アカラシア、嚥下障害、流涙、多汗症(hyperhydrosis)、過度の唾液分泌、過度の胃腸管分泌、筋肉痛、頭痛の疼痛、癌、子宮障害、泌尿生殖器障害、泌尿生殖器-神経疾患、慢性神経原性炎症および平滑筋障害から選択される障害を処置するための医薬の製造における、請求項1、3から22または25のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒、請求項29に記載の二本鎖改変クロストリジウム神経毒または請求項30に記載の医薬組成物の使用。
【請求項35】
以下を対象に投与することを含む、美容的治療の方法: 請求項1、3から22または25のいずれか一項に記載の改変クロストリジウム神経毒; 請求項29に記載の二本鎖改変クロストリジウム神経毒; または請求項30に記載の医薬組成物。
【請求項36】
請求項32から35のいずれか一項に記載の用途の改変クロストリジウム神経毒、二本鎖改変クロストリジウム神経毒または医薬組成物、方法、または使用:ここで、美容的障害は、顔の線、眉間線、眉間のしわ、皮膚のしわ、くも膜下腔内線、額の線、バニーライン、笑顔の凸凹、顎の凸凹、広頸帯、マリオネットライン、唇の線、目尻のしわ、眉の凸凹、しかめっ面の線、心配の線、皮膚線条、創傷、アクシデント、咬傷、手術、眼、頬、鼻、唇、額および/もしくは首のような領域の輪郭の欠損および/または細胞/筋肉無能力化から恩恵を受ける美容療法から選択される障害である、
【請求項37】
以下を含む、クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大する方法:(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする第1の核酸を提供し、コードされるHCCドメインのメチオニン1144(M1144)で改変を導入するように第1の核酸を改変し、それによって、第2の核酸を生成すること、ここで、当該改変は、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大する;または
(b)請求項1に記載の改変クロストリジウム神経毒をコードする核酸を合成し、それによって、合成された核酸を提供すること;または
(c)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする核酸を合成し、ここで、当該HCCドメインは、メチオニン1144(M1144)の改変を含み、当該改変は、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大する、それによって、合成された核酸を提供すること;および
(d)第2の核酸または合成された核酸をそれぞれ発現させ、それによって、改変クロストリジウム神経毒を生成すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、改変クロストリジウム神経毒、特に、酸化耐性が増大した改変クロストリジウム神経毒に関する。
【背景技術】
【0002】
クロストリジウム属中の細菌は、高度に強力な、特異的なタンパク質毒素を産生し、それらが送達されるニューロンおよび他の細胞を毒することができる。このようなクリストリジウム神経毒の例として、C.テタニ(tetani)によって産生される神経毒(TeNT)およびC.ボツリヌム(botulinum)による血清型A～GおよびX(WO2018/009903A2を参照されたい)ならびにC.バラティ(baratii)およびC.ブチリカム(butyricum)によって産生されるものが挙げられる。
【0003】
クロストリジウム神経毒は、既知の最も強力な毒素の一つである。例えば、ボツリヌス神経毒は、血清型に応じて0.5～5ng/kgの範囲のマウスの半致死量(LD50)値を有する。テタヌスおよびボツリヌス神経毒の両方とも、冒されたニューロンの機能、具体的には、神経伝達物質の放出を阻害することによって作用する。ボツリヌス毒素は、神経筋接合部で作用し、末梢神経系においてコリン作動性伝達を阻害するが、破傷風菌毒素は、中枢神経系において作用する。
【0004】
天然では、クロストリジウム神経毒は、単鎖ポリペプチドとして合成され、これがタンパク質分解による切断事象によって翻訳後修飾されて、ジスルフィド結合によって一緒につなげられた2つのポリペプチド鎖を形成する。切断は、鎖間ジスルフィド結合を提供するシステイン残基間に位置する、活性化部位と呼ばれることが多い特定の切断部位で起こる。毒素の活性形態は、この二本鎖形態である。2つの鎖は、およそ100kDaの分子量を有する重鎖(H鎖)およびおよそ50kDaの分子量を有する軽鎖(L鎖)と呼ばれる。H鎖は、N末端転位置成分(HNドメイン)およびC末端標的化成分(HCドメイン)を含む。切断部位は、L鎖と転位置ドメイン成分の間に位置する。HCドメインのその標的ニューロンへの結合およびエンドソームによる結合された毒素の細胞への内部移行後、HNドメインは、L鎖をエンドソーム膜を越えてサイトゾル中に転位置し、L鎖は、プロテアーゼ機能を提供する(非細胞傷害性プロテアーゼとしても知られる)。
【0005】
非細胞傷害性プロテアーゼは、SNAREタンパク質(例えば、SNAP-25、VAMPまたはシンタキシン)として知られる細胞内輸送タンパク質をタンパク質分解性に切断することによって作用する-Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい。頭字語SNAREは、可溶性NSF付着受容体(Soluble NSF Attachment Receptor)という用語に由来し、ここで、NSFは、N-エチルマレイミド感受性因子を意味する。SNAREタンパク質は、細胞内小胞融合にとって、ひいては、細胞からの小胞輸送を介した分子の分泌にとって不可欠である。プロテアーゼ機能は、亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性であり、SNAREタンパク質に対して高い基質特異性を示す。したがって、ひとたび所望の標的細胞に送達されると、非細胞傷害性プロテアーゼは、標的細胞からの細胞性分泌を阻害可能である。クロストリジウム神経毒のL鎖プロテアーゼは、SNAREタンパク質を切断する非細胞傷害性プロテアーゼである。
【0006】
SNAREタンパク質の遍在性を考慮して、ボツリヌス神経毒などのクロストリジウム神経毒は、広範な療法において成功裏に使用されている。
【0007】
例えば、William J. Lipham、Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004)には、多種多様な治療的および美容的適用においてニューロンの信号伝達を阻害するための、クロストリジウム神経毒、例えば、ボツリヌス神経毒(BoNT)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/FおよびBoNT/Gならびにテタヌス神経毒(TeNT)の使用が記載されており、一例として、BOTOX(商標)が以下の適応症のための治療薬として現在承認されている:アカラシア、成人痙縮、裂肛、背痛、眼瞼痙攣、歯ぎしり、頸部ジストニア、本態性振戦、眉間の線または多動性の顔面の線、頭痛、片側顔面痙攣、膀胱の過活動、多汗症、若年性脳性麻痺、多発性硬化症、ミオクローヌス性障害、鼻唇線、痙攣性発声障害、斜視およびVII神経障害。さらに、神経筋疾患を処置するための(US6,872,397を参照されたい);子宮障害を処置するための(US2004/0175399を参照されたい);潰瘍および胃食道逆流疾患を処置するための(US2004/0086531を参照されたい);ジストニアを処置するための(US6,319,505を参照されたい);眼の障害を処置するための(US2004/0234532を参照されたい);眼瞼痙攣を処置するための(US2004/0151740を参照されたい);斜視を処置するための(US2004/0126396);疼痛を処置するための(US6,869,610、US6,641,820、US6,464,986およびUS6,113,915を参照されたい);線維筋痛症を処置するための(US6,623,742、US2004/0062776を参照されたい);腰痛を処置するための(US2004/0037852を参照されたい);筋損傷を処置するための(US6,423,319を参照されたい);副鼻腔炎性頭痛を処置するための(US6,838,434を参照されたい);緊張型頭痛を処置するための(US6,776,992を参照されたい);頭痛を処置するための(US6,458,365を参照されたい);片頭痛を低減するための(US5,714,469を参照されたい);心血管疾患を処置するための(US6,767,544を参照されたい);パーキンソン病などの神経疾患を処置するための(US6,620,415、US6,306,403を参照されたい);精神神経疾患を処置するための(US2004/0180061、US2003/0211121を参照されたい);内分泌障害を処置するための(US6,827,931を参照されたい);甲状腺障害を処置するための(US6,740,321を参照されたい);コリン作動性に影響を受ける汗腺障害を処置するための(US6,683,049を参照されたい);糖尿病を処置するための(US6,337,075、US6,416,765を参照されたい);膵臓障害を処置するための(US6,261,572、US6,143,306を参照されたい);骨腫瘍などのがんを処置するための(US6,565,870、US6,368,605、US6,139,845、US2005/0031648を参照されたい);耳の障害を処置するための(US6,358,926、US6,265,379を参照されたい);消化管筋障害および他の平滑筋機能障害などの自律神経障害を処置するための(US5,437,291を参照されたい);皮膚細胞増殖性障害と関連する皮膚病変の処置のための(US5,670,484を参照されたい);神経原性炎症性障害の管理のための(US6,063,768を参照されたい);脱毛を低減し、発毛を刺激するための(US6,299,893を参照されたい);下向きに下がった口を処置するための(US6,358,917を参照されたい);食欲を低減するための(US2004/40253274を参照されたい);歯科療法および処置のための(US2004/0115139を参照されたい);神経筋疾患および状態を処置するための(US2002/0010138を参照されたい);種々の障害および状態および関連する疼痛を処置するための(US2004/0013692を参照されたい);粘液分泌亢進に起因する状態、例えば、喘息およびCOPDを処置するための(WO00/10598を参照されたい);非神経性状態、例えば、炎症、内分泌状態、外分泌状態、免疫学的状態、心血管の状態、骨の状態を処置するための(WO01/21213を参照されたい)クロストリジウム神経毒療法が記載されている。上記の刊行物のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0008】
ヒトおよび他の哺乳動物の治療的および美容的処置におけるクロストリジウム神経毒(例えば、BoNTおよびTeNT)などの非細胞傷害性プロテアーゼの使用は、常に広がり続ける範囲の、これらの毒素の特性から恩恵を受けることができる疾患および病気に拡大されることが期待されている。これを考慮して、クロストリジウム神経毒の大規模製造に対する需用が増大している。
【0009】
生物治療薬、特に、クロストリジウム神経毒大規模製造は、困難なものであり、プロセスの複数の段階で望まれないポリペプチド改変および/または分解の可能性を有する。1つのこのような望まれない改変として酸化があり、これはクロストリジウム神経毒の細胞発現、精製、バイオ処理、製剤化および/または保存の際に生じ得る。実際、酸化は、生物治療薬の主な分解経路の1つである。過酸化物、溶存酸素、金属イオン、光およびフリーラジカルなどの酸化剤は、アミノ酸、例えば、メチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンの酸化を触媒できる(Torosantucci et al (2014), Pharm Res, 31、541-553)。バイオ処理および製剤化では、金属混入バッファーおよび/または金属接触表面から金属触媒がもたらされる場合があり、ヒスチジンおよびメチオニン残基の金属に触媒された酸化が、例えば、酸化されたポリペプチドの凝集および/または沈殿のために活性の喪失を引き起こすと実証されている。さらに、酸化剤は通常、大規模製造において汚染除去のために利用される。クロストリジウム神経毒は、酸化の候補である多数の表面に露出したアミノ酸残基(表面露出アミノ酸残基)を有する大きなポリペプチドである。
【0010】
少なくとも上記で提供された理由のために、酸化に耐性であり、それによって、大規模製造および/または保存の際の望まれない改変および/または分解を最小にする頑強なクロストリジウム神経毒が必要である。さらに、このようなクロストリジウム神経毒は、例えば、液体または凍結乾燥製剤の一部として室温で安定化の改善を示す可能性がある。有利なことに、これによって製造の際の低温の維持の必要性が除去されるであろう。
【0011】
本発明は、上記の問題のうち1つ以上を克服し、および/または上記で詳述された利点の1つ以上を提供する。
【発明の概要】
【0012】
本発明者らは、ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)のメチオニン1144(M1144)での酸化が酸化依存性活性喪失の主な原因であると見出した。有利なことに、M1144をその酸化を妨げるように改変すること(例えば、酸化耐性アミノ酸残基との置換および/またはM1144の欠失によって)によって、本発明者らは、酸化依存性活性喪失を最小にできる/避けることができることを見出した。驚くべきことに、M1144の改変は、酸化依存性活性喪失を最小にする/避けるだけでなく、実際、得られた改変神経毒の活性を増大する場合がある。
【0013】
M1144は、BoNT/A(HCCドメイン)のHCドメインのC末端部分に存在するアミノ酸であり、BoNT/Aの標的神経細胞上のシナプス小胞糖タンパク質(SV2)への結合に関与する。この残基がSV2結合に関与することを考慮して、M1144で適宜改変されたBoNT/A HCCドメインを含む任意のクロストリジウム神経毒は、本明細書において記載された改善された特性を示すことが考えられる。
【発明を実施するための形態】
【0014】
一態様では、本発明は、ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインを含む改変クロストリジウム神経毒を提供し、HCCドメインは、メチオニン1144(M1144)の改変を含み、改変は、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較して、改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大する。
【0015】
「改変クロストリジウム神経毒」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在しない、メチオニン1144(M1144)の改変を含むクロストリジウム神経毒を指し、改変は、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較して、改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大する。したがって、改変クロストリジウム神経毒」という用語は、HCCドメインが、アミノ酸1144に酸化に耐性であるアミノ酸を含むボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインを含む天然バリアントクロストリジウム神経毒を除外する。
【0016】
改変クロストリジウム神経毒は、単鎖改変クロストリジウム神経毒または二本鎖改変クロストリジウム毒素であり得る。好ましくは、改変クロストリジウム神経毒は、ジスルフィド結合によって一緒に繋げられた軽鎖および重鎖を含む二本鎖改変クロストリジウム毒素である。
【0017】
本発明の改変クロストリジウム神経毒は、クロストリジウム神経毒標的細胞、具体的に、少なくともBoNT/A標的細胞に結合する。前記改変クロストリジウム神経毒は、SV2(例えば、SV2c)に結合する。一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、特許請求される改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒よりも高い親和性でSV2に結合する。特に、本明細書において示されるように、M1144VまたはM1144L置換を含む改変クロストリジウム神経毒は、特許請求される改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒よりも高い親和性でSV2に結合する。より高い親和性は、特許請求される改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒のものと比較した場合に、より低いKD値(好ましくは、統計的に有意に低い値)として表される場合もある。KD値は、好ましくは、本明細書の実施例6に記載されるアッセイを使用して決定される。
【0018】
本発明の改変クロストリジウム神経毒は、好ましくは、特許請求される改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒のものと比較した場合に、改善された活性(例えば、統計的に有意に改善された活性)を示す。
【0019】
本明細書において言及されるアミノ酸位置番号付けは、配列番号2とのアライメントによって定義される。例えば、1144として示される位置は、所与のポリペプチドのアミノ酸番号1144ではない場合もあるが、前記ポリペプチドが配列番号2とアラインされる場合に配列番号2のM1144に対応するメチオニン残基の代わりである。配列番号2は、天然に存在する未改変BoNT/A1ポリペプチド配列である。例として、BoNT/A3のM1140は、BoNT/A1のM1144に対応する。したがって、BoNT/A3に関連して本明細書におけるM1144の改変とは、配列番号2とアラインされた場合の位置M1144の改変(すなわち、BoNT/A3残基M1140の改変)を意味する。アライメントは、配列相同性および/または配列同一性%を決定するための本明細書に記載される方法のいずれを使用しても実施できる。
【0020】
本発明の改変を欠く「その他の点においては同一のクロストリジウム神経毒」は、本明細書に記載される未改変クロストリジウム神経毒および/または本明細書に記載される未改変BoNT/A HCCドメインを含むクロストリジウム神経毒であり得る。前記の「そうでなければ同一のクロストリジウム神経毒」は、天然に存在するものである場合もある。
【0021】
改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大する任意の改変を、本発明において利用さできる。改変は、M1144の置換、M1144の欠失またはM1144を含む(好ましくは、それからなる)部位での挿入欠失であり得る。好ましくは、改変は、M1144の、酸化に対して耐性であるアミノ酸との置換である。
【0022】
「欠失」という用語は、本明細書で使用される場合、欠失の部位での1個以上のアミノ酸残基の置換を伴わない、ポリペプチドの1個以上のアミノ酸残基の除去を指す。したがって、x個のアミノ酸残基数を有する(例えば)ポリペプチド配列から1個のアミノ酸残基が欠失している場合は、得られたポリペプチドは、x-1個のアミノ酸残基を有する。
【0023】
「挿入欠失」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドの1個以上のアミノ酸残基の欠失および欠失されたアミノ酸残基の数と比較した場合に異なる数のアミノ酸残基(より多いまたはより少ないアミノ酸残基)の欠失部位での挿入を指す。したがって、x個の数のアミノ酸残基を有する(例えば)ポリペプチド配列から2個のアミノ酸残基が欠失されている挿入欠失について、得られたポリペプチドは、x-1個のアミノ酸残基またはx+≧1個のアミノ酸残基を有する。挿入および欠失は、任意の順序で、逐次または同時に行うことができる。
【0024】
「置換」という用語は、本明細書で使用される場合、同一部位で1個以上のアミノ酸残基の同数のアミノ酸残基との置き換えを指す。したがって、x個のアミノ酸残基数を有する(例えば)ポリペプチド配列の置換について、得られたポリペプチドはまた、x個のアミノ酸残基を有する。好ましくは、置換は、単一アミノ酸位置での置換である。
【0025】
「挿入」という用語は、本明細書で使用される場合、挿入の部位でのポリペプチドの1個以上のアミノ酸残基の欠失を伴わないポリペプチドの1個以上のアミノ酸残基の付加を指す。したがって、x個のアミノ酸残基数を有する(例えば)ポリペプチド配列中に1個のアミノ酸残基が挿入されている場合には、得られたポリペプチドは、x+1個のアミノ酸残基を有する。
【0026】
後により詳細に論じられるように、通常、改変は、核酸によってコードされる改変クロストリジウム神経毒が改変(複数可)を含むように天然クロストリジウム神経毒をコードする核酸を改変することのいずれかによって実施される。あるいは、改変(複数可)を含む改変クロストリジウム神経毒をコードする核酸を合成できる。
【0027】
「酸化に対して耐性であるアミノ酸」とは、本明細書で使用される場合、好ましくは、メチオニンよりも酸化に対してより耐性である任意のアミノ酸を意味する。酸化に対して耐性であるアミノ酸は、バリン、ロイシン、グリシン、スレオニン、アラニン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびプロリンから選択され得る。一実施形態では、酸化に対して耐性であるアミノ酸は、バリン、ロイシンおよびグリシンから選択され得る。好ましくは、酸化に対して耐性であるアミノ酸は、バリンおよびロイシンから選択される。一実施形態では、酸化に対して耐性であるアミノ酸は、グリシンではない。
【0028】
あるいは、酸化に対して耐性であるアミノ酸は、非天然または非標準アミノ酸、例えば、ノルロイシン、イソバリン、α-メチルバリン、シクロロイシンまたはアロスレオニンであり得る。
【0029】
本発明の改変クロストリジウム神経毒は、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒よりも、酸化に対して少なくとも1%、5%、10%、20%、50%、75%、90%または100%より耐性であり得る。
【0030】
クロストリジウム神経毒の酸化(酸化に対する耐性を含む)は、強制酸化アッセイを使用して評価できる。好ましくは、クロストリジウム神経毒の酸化(例えば、酸化に対する耐性)は、本実施例(「強制酸化研究」を参照されたい)において記載される強制酸化アッセイを使用して評価される。
【0031】
一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、強制酸化条件に曝露された場合に配列番号2のM1144に対応する位置で酸化に対して実質的に耐性であり得る。「酸化に対して実質的に耐性」という用語は、この文脈において使用される場合、強制酸化条件下で配列番号2のM1144に対応する位置で組成物中の改変クロストリジウム神経毒の10%、5%または1%未満(好ましくは、0.1%未満)が酸化されることを意味し得る。言い換えれば、好ましくは、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、強制酸化条件下で配列番号2のM1144に対応する位置で酸化されることができない。これに関連して、M1144に対応する位置は、改変される位置である。
【0032】
改変クロストリジウム神経毒は、1つ以上の表面露出アミノ酸残基、例えば、酸化に対して感受性である1つ以上の表面露出アミノ酸残基の1つ以上のさらなる改変を含み得る。したがって、改変クロストリジウム神経毒は、酸化に対して感受性である以下のアミノ酸のうち1つ以上のさらなる改変を含み得る:メチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン(好ましくは、メチオニン)。例えば、改変クロストリジウム神経毒は、例えば、未改変HCCドメイン(好ましくは、未改変SV2結合ドメイン)と比較した場合に、HCCドメイン中(好ましくは、SV2結合ドメイン中)に存在するアミノ酸に1つ以上のさらなる改変を含み得る。しかし、好ましくは、改変クロストリジウム神経毒は、例えば、未改変HCCドメインと比較した場合にHCCドメイン中に1つ以上のさらなる改変を含まず、より好ましくは、例えば、未改変SV2結合ドメインと比較した場合にSV2結合ドメイン中に1つ以上のさらなる改変を含まない。一部の実施形態では、改変クロストリジウム神経毒は、例えば、未改変HCドメインと比較した場合にHCドメイン中に1つ以上のさらなる改変を含まない。一実施形態では、改変クロストリジウム神経毒は、例えば、未改変重鎖と比較した場合に重鎖中に1つ以上のさらなる改変を含まない。一実施形態では、改変クロストリジウム神経毒は、例えば、未改変軽鎖と比較した場合に軽鎖中に1つ以上のさらなる改変を含まない。別の実施形態では、改変クロストリジウム神経毒は、例えば、未改変軽鎖と比較した場合に、軽鎖中に1つ以上のさらなる改変を含まず、例えば、未改変重鎖と比較した場合に重鎖中に1つ以上のさらなる改変を含まない。
【0033】
一態様では、本発明は、RX1X2VX3TTNIYLNSX4LYX5GT(配列番号102)を含む改変BoNT/A1 HCCドメイン、改変BoNT/A3 HCCドメインまたは改変BoNT/A4 HCCドメインを含む改変クロストリジウム神経毒を提供し、X1はDまたはGであり、X2はSまたはNであり、X3は酸化に対して耐性であるアミノ酸であり、X4はSまたはTであり、X5はMまたはRである。好ましくは、X4はSである。前記改変クロストリジウム神経毒M1144は、酸化に対して耐性であるアミノ酸と置換されている。
【0034】
配列番号102は、HCCドメインのBoNT/A1、BoNT/A3およびBoNT/A4 SV2c結合ドメインに含まれるコンセンサス配列であるが、X3は酸化に対して耐性であるアミノ酸である。天然配列では、X3は、以下の表に示されるようなメチオニンである:
【表A】
【0035】
本明細書に記載される任意の改変クロストリジウム神経毒は、RX1X2VX3TTNIYLNSX4LYX5GT(配列番号102)を含む(好ましくは、それからなる)改変HCCドメインを含む場合があり、X1はDまたはGであり、X2はSまたはNであり、X3は酸化に対して耐性であるアミノ酸であり、X4はSまたはTであり、X5はMまたはRである。好ましくは、X4はSである。
【0036】
本明細書に記載される改変クロストリジウム神経毒は、RGSVXTTNIYLNSSLYRGT(配列番号107)、RGNVXTTNIYLNSSLYMGT(配列番号108)、RGSVXTTNIYLNSTLYMGT(配列番号109)またはRDNVXTTNIYLNSSLYMGT(配列番号110)を含む(好ましくは、それからなる)改変HCCドメインを含む場合があり、Xは、酸化に対して耐性であるアミノ酸である。
【0037】
一態様では、本発明は、RX1X2VTTNIYLNSX3LYX4GT(配列番号111)を含む改変BoNT/A1 HCCドメイン、改変BoNT/A3 HCCドメインまたは改変BoNT/A4 HCCドメインを含む改変クロストリジウム神経毒を提供し、X1はDまたはGであり、X2はSまたはNであり、X3はSまたはTであり、X4はMまたはRである。好ましくは、X3はSである。前記改変クロストリジウム神経毒では、M1144は欠失されている。
【0038】
本明細書に記載される任意の改変クロストリジウム神経毒は、RX1X2VTTNIYLNSX3LYX4GT(配列番号111)を含む(好ましくは、それからなる)改変HCCドメインを含む場合があり、X1はDまたはGであり、X2はSまたはNであり、X3はSまたはTであり、X4はMまたはRである。好ましくは、X3はSである。
【0039】
本明細書に記載される改変クロストリジウム神経毒は、RGSVTTNIYLNSSLYRGT(配列番号112)、RGNVTTNIYLNSSLYMGT(配列番号113)、RGSVTTNIYLNSTLYMGT(配列番号114)またはRDNVTTNIYLNSSLYMGT(配列番号115)を含む(好ましくは、それからなる)改変HCCドメインを含み得る。
【0040】
一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、BoNT/A2 HCCドメインを含まない。一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、BoNT/A5 HCCドメインを含まない。一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、BoNT/A6 HCCドメインを含まない。一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、BoNT/A7 HCCドメインを含まない。一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、BoNT/A8 HCCドメインを含まない。一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、BoNT/A2 HCCドメイン、BoNT/A5 HCCドメイン、BoNT/A6 HCCドメイン、BoNT/A7 HCCドメインまたはBoNT/A8 HCCドメインを含まない。
【0041】
好ましくは、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、BoNT/A2、BoNT/A5、BoNT/A6、BoNT/A7またはBoNT/A8ではない。BoNT/A2は、配列番号139に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。例えば、BoNT/A2は、配列番号139に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、BoNT/A2は、配列番号139を含む(またはそれからなる)。BoNT/A5は、配列番号140または141に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。例えば、BoNT/A5は、配列番号140または141に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、BoNT/A5は、配列番号140または141を含む(またはそれからなる)。BoNT/A6は、配列番号142に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。例えば、BoNT/A6は、配列番号142に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、BoNT/A6は、配列番号142を含む(またはそれからなる)。BoNT/A7は、配列番号143に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。例えば、BoNT/A7は、配列番号143に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、BoNT/A7は、配列番号143を含む(またはそれからなる)。BoNT/A8は、配列番号144に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。例えば、BoNT/A8は、配列番号144に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、BoNT/A8は、配列番号144を含む(またはそれからなる)。
【0042】
好ましくは、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、以下に対応する(または以下の)HCCドメインを含まない:UniProtKB受託番号D3IV23(配列バージョン1)、UniProtKB受託番号C7BEA8(配列バージョン1)またはUniProtKB受託番号C1IPK2(配列バージョン1)。最も好ましくは、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、UniProtKB受託番号D3IV23(配列バージョン1)、UniProtKB受託番号C7BEA8(配列バージョン1)またはUniProtKB受託番号C1IPK2(配列バージョン1)に対応する(またはそれの)ポリペプチド配列を含まない。
【0043】
本発明の改変クロストリジウム神経毒は、改変BoNT/A1 HCCドメイン、改変BoNT/A3 HCCドメインまたは改変BoNT/A4 HCCドメイン、好ましくは、改変BoNT/A1 HCCドメインを含み得る。
【0044】
一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、未改変BoNT/A1 HCCドメインのM1144に改変を含み得る。未改変BoNT/A1 HCCドメインは、配列番号62、70または78のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態では、未改変BoNT/A1 HCCドメインは、配列番号62、70または78のいずれか1つに対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、未改変BoNT/A1 HCCドメインは、配列番号62、70または78のいずれか1つを含む(より好ましくは、それからなる)。示された配列のうち、配列番号70は最も好ましい。
【0045】
改変BoNT/A1 HCCドメインは、配列番号63～69、71～77または79～85のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態では、改変BoNT/A1 HCCドメインは、配列番号63～69、71～77または79～85のいずれか1つに対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、改変BoNT/A1 HCCドメインは、配列番号63～69、71～77または79～85のいずれか1つを含む(より好ましくは、それからなる)。示された配列のうち、配列番号71～77が最も好ましい。
【0046】
一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、未改変BoNT/A3 HCCドメインのM1144に改変を含み得る。未改変BoNT/A3 HCCドメインは、配列番号86に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態では、未改変BoNT/A3 HCCドメインは、配列番号86に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、未改変BoNT/A3 HCCドメインは、配列番号86を含む(より好ましくは、それからなる)。
【0047】
改変BoNT/A3 HCCドメインは、配列番号87～93のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態では、改変BoNT/A3 HCCドメインは、配列番号87～93のいずれか1つに対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、改変BoNT/A3 HCCドメインは、配列番号87～93のいずれか1つを含む(より好ましくは、それからなる)。
【0048】
一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、未改変BoNT/A4 HCCドメインのM1144に改変を含み得る。未改変BoNT/A4 HCCドメインは、配列番号94に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態では、未改変BoNT/A4 HCCドメインは、配列番号94に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、未改変BoNT/A4 HCCドメインは、配列番号94を含む(より好ましくは、それからなる)。
【0049】
改変BoNT/A4 HCCドメインは、配列番号95～101のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態では、改変BoNT/A4 HCCドメインは、配列番号95～101のいずれか1つに対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、改変BoNT/A4 HCCドメインは、配列番号95～101のいずれか1つを含む(より好ましくは、それからなる)。
【0050】
本発明の改変クロストリジウム神経毒は、改変BoNT/A1、改変BoNT/A3または改変BoNT/A4であり得る。好ましくは、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、改変BoNT/A1である。
【0051】
一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、未改変BoNT/A1のM1144に改変を含み得る。未改変BoNT/A1は、配列番号2、11、20、29または38のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態では、未改変BoNT/A1は、配列番号2、11、20、29または38のいずれか1つに対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、未改変BoNT/A1は、配列番号2、11、20、29または38のいずれか1つを含む(より好ましくは、それからなる)。示された配列のうち、配列番号11は最も好ましい。
【0052】
改変BoNT/A1は、配列番号3～9、12～18、21～27、30～36または39～45のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態では、改変BoNT/A1は、配列番号3～9、12～18、21～27、30～36または39～45のいずれか1つに対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、改変BoNT/A1は、配列番号3～9、12～18、21～27、30～36または39～45のいずれか1つを含む(より好ましくは、それからなる)。示された配列のうち、配列番号12～18が最も好ましい。
【0053】
一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、未改変BoNT/A3のM1144に改変を含み得る。未改変BoNT/A3は、配列番号46に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態では、未改変BoNT/A3は、配列番号46に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、未改変BoNT/A3は、配列番号46を含む(より好ましくは、それからなる)。
【0054】
改変BoNT/A3は、配列番号47～53のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態では、改変BoNT/A3は、配列番号47～53のいずれか1つに対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、改変BoNT/A3は、配列番号47～53のいずれか1つを含む(より好ましくは、それからなる)。
【0055】
一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、未改変BoNT/A4のM1144に改変を含み得る。未改変BoNT/A4は、配列番号54に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態では、未改変BoNT/A4は、配列番号54に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、未改変BoNT/A4は、配列番号54を含む(より好ましくは、それからなる)。
【0056】
改変BoNT/A4は、配列番号55～61のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態では、改変BoNT/A4は、配列番号55～61のいずれか1つに対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、改変BoNT/A4は、配列番号55～61のいずれか1つを含む(より好ましくは、それからなる)。
【0057】
配列番号70および78を有する未改変BoNT/A1 HCCドメインならびに配列番号11、20、29および38を有する対応するBoNT/A1ポリペプチドは、配列番号2および62(天然に存在する)に対してそれ自体改変されている。前記クロストリジウム神経毒は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2015/004461A1において教示されている。前記クロストリジウム神経毒中に存在する改変は、作用の効力および/または持続期間の増大を提供し、それによって、公知のクロストリジウム神経毒治療薬と比較して使用されるべき神経毒の投与量の低減(または任意の追加の有害作用を伴わない投与量の増大)が可能になり、さらなる利点をもたらす。実際、前記神経毒は、前記の1つ以上のアミノ酸改変を欠く同等のクロストリジウム神経毒の使用と比較して副作用の低減、またはそれが存在しないことを実証する。これは、改変神経毒の等電点を増大する表面露出アミノ酸残基の改変によって達成される。理論に捉われようとは思わないが、前記神経毒は、投与の部位での改変クロストリジウム神経毒とアニオン性細胞外構成成分(細胞膜およびヘパリン硫酸プロテオグリカンなど)の間の好都合な静電相互作用のために投与の部位でより長い組織保持時間を呈すると考えられる。
【0058】
本発明の目的のために、配列番号11、20、29、38、70および78は、1144位にメチオニンを含むので「未改変」とカテゴリー分けされる。
【0059】
WO2015/004461A1では、ASN886、ASN905、GLN915、ASN918、GLU920、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、GLU992、GLN995、ASN1006、ASN1025、ASN1026、ASN1032、ASN1043、ASN1046、ASN1052、ASP1058、HIS1064、ASN1080、GLU1081、GLU1083、ASP1086、ASN1188、ASP1213、GLY1215、ASN1216、GLN1229、ASN1242、ASN1243、SER1274およびTHR1277のうち1つ以上の適した改変が、改変クロストリジウム神経毒の等電点を増大して、上記の利点を提供することが教示されている。
【0060】
したがって、改変クロストリジウム神経毒は、ASN1188、ASP1213、GLY1215、ASN1216、GLN1229、ASN1242、ASN1243、SER1274およびTHR1277から選択される1つ以上のアミノ酸残基にさらなる改変を含む改変BoNT/A HCCドメイン(好ましくは、BoNT/A1 HCCドメイン)を含み得る。
【0061】
したがって、改変クロストリジウム神経毒(好ましくは、改変BoNT/A1)は、ASN886、ASN905、GLN915、ASN918、GLU920、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、GLU992、GLN995、ASN1006、ASN1025、ASN1026、ASN1032、ASN1043、ASN1046、ASN1052、ASP1058、HIS1064、ASN1080、GLU1081、GLU1083、ASP1086、ASN1188、ASP1213、GLY1215、ASN1216、GLN1229、ASN1242、ASN1243、SER1274およびTHR1277から選択される1つ以上のアミノ酸残基にさらなる改変を含み得る。
【0062】
改変は、配列番号2と比較され、アミノ酸残基番号付けが、配列番号2とのアライメントによって決定される場合に改変であり得る。
【0063】
改変のために示されるさらなるアミノ酸残基(複数可)は、表面露出アミノ酸残基(複数可)である。
【0064】
改変クロストリジウム神経毒が、ASN886、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、ASN1025、ASN1026、ASN1052、ASN1188、ASP1213、GLY1215、ASN1216、GLN1229、ASN1242、ASN1243、SER1274およびTHR1277から選択される1個以上のアミノ酸残基にさらなる改変を含むことが好ましい。
【0065】
特に好ましい実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、M1144のみに改変を含み、ならびにASN886、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、ASN1025、ASN1026、ASN1052、ASN1188、ASP1213、GLY1215、ASN1216、GLN1229、ASN1242、ASN1243、SER1274およびTHR1277のうち1つ以上にさらなる改変を含む。例えば、一実施形態では、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、M1144のみで改変された配列番号2ならびにASN886、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、ASN1025、ASN1026、ASN1052、ASN1188、ASP1213、GLY1215、ASN1216、GLN1229、ASN1242、ASN1243、SER1274およびTHR1277のうち1つ以上にさらなる改変を含む。言い換えれば、改変が、配列番号2と比較した場合に、M1144での改変ならびにASN886、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、ASN1025、ASN1026、ASN1052、ASN1188、ASP1213、GLY1215、ASN1216、GLN1229、ASN1242、ASN1243、SER1274およびTHR1277のうち1つ以上でのさらなる改変からなることが好ましい。
【0066】
改変クロストリジウム神経毒は、M1144での改変に加えて示されたアミノ酸残基で少なくとも2、3、4、5、6または7つ(好ましくは、7つ)のさらなる改変を含み得る。改変クロストリジウム神経毒は、1～30、3～20または5～10のさらなるアミノ酸改変を含み得る(好ましくは、からなり得る)。
【0067】
さらなる改変は、以下から選択され得る:
i.酸性の表面露出アミノ酸残基の、塩基性アミノ酸残基との置換、
ii.酸性の表面露出アミノ酸残基の、無電荷アミノ酸残基との置換、
iii.無電荷の表面露出アミノ酸残基の、塩基性アミノ酸残基との置換、
iv.塩基性アミノ酸残基の挿入、および
v.酸性の表面露出アミノ酸残基の欠失。
i.酸性の表面露出アミノ酸残基の、塩基性アミノ酸残基との置換、
ii.酸性の表面露出アミノ酸残基の、無電荷アミノ酸残基との置換、
iii.無電荷の表面露出アミノ酸残基の、塩基性アミノ酸残基との置換、
iv.塩基性アミノ酸残基の挿入、および
v.酸性の表面露出アミノ酸残基の欠失。
【0068】
上記で示されるようなさらなる改変は、対応する未改変クロストリジウム神経毒と比較した場合に正の表面電荷の増大および等電点の増大を有する改変クロストリジウム神経毒をもたらす。
【0069】
等電点(pI)は、所与のタンパク質の特定の特性である。当技術分野で周知のように、タンパク質は、アミノ酸の特定の配列(タンパク質中ではアミノ酸残基とも呼ばれる)から製造される。20種の標準セットの各アミノ酸は、異なる側鎖(またはR基)を有し、これは、タンパク質中の各アミノ酸残基が、異なる化学的特性、例えば、電荷および疎水性を呈することを意味する。これらの特性は、周囲の化学環境、例えば、温度およびpHによって影響を受ける場合がある。タンパク質の全体的な化学的な特徴は、これらの種々の因子の合計に応じて変わる。
【0070】
ある特定のアミノ酸残基(以下に詳述される)は、イオン化可能な側鎖を有し、周囲のpHに応じて電荷を呈する可能性がある。このような側鎖が所与のpHで電荷を有するか否かは、関連するイオン化可能な部分のpKaに応じて変わり、pKaは共役塩基からの特定のプロトンの酸解離定数(Ka)の負の対数である。
【0071】
例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性残基は、側鎖カルボン酸基を有し、および4.1のpKa値を有する(正確なpKa値は温度、イオン化可能な基のイオン強度および微小環境に応じて変わり得る)。したがって、これらの側鎖は、7.4のpHで負電荷を示す(「生理学的pH」と呼ばれることが多い)。これらの側鎖は、低pH値ではプロトン化されることとなり、その電荷を失う。
【0072】
逆に、リジンおよびアルギニンなどの塩基性残基は、窒素含有側鎖基を有し、およそ10～12のpKa値を有する。したがって、これらの側鎖は7.4のpHで正電荷を示す。これらの側鎖は、高pH値で脱プロトン化されることとなり、その電荷を失う。
【0073】
したがって、タンパク質分子の全体的な(正味の)電荷は、タンパク質中に存在する酸性および塩基性残基の数(およびその表面露出の程度)に、および周囲のpHに応じて変わる。周囲のpHを変えることは、タンパク質上の全体的な電荷を変える。したがって、どのタンパク質についても、正電荷および負電荷の数が等しく、タンパク質が全体的な正味電荷を呈さない所与のpHがある。この点は、等電点(pI)として知られている。等電点は、タンパク質生化学において標準的な概念であり、当業者は精通しているであろう。
【0074】
したがって、等電点(pI)は、タンパク質がゼロの正味電荷を呈するpH値と定義されるpIの増大は、ゼロの正味電荷を呈するためにタンパク質にとってより高いpH値が必要であることを意味する。したがって、pIの増大は、所与のpHでのタンパク質の正味の正電荷の増大を表す。逆に、pIの低下は、ゼロの正味電荷を呈するためにタンパク質にとってより低いpH値が必要であることを意味する。したがって、pIの低下は、所与のpHでのタンパク質の正味の正電荷の減少を表す。
【0075】
タンパク質のpIを決定する方法は、当技術分野で公知であり、当業者は精通しているであろう。例として、タンパク質のpIは、タンパク質中に存在する各アミノ酸の平均pKa値から算出できる(「算出pI」)。このような算出は、当技術分野で公知のコンピュータプログラム、例えば、ExPASy 製のCompute pI/MWツールを使用して実施でき(https://web.expasy.org/compute_pi/)、これは、本発明にしたがってpIを算出するための好ましい方法である。異なる分子間のpI値の比較は、同じ算出技術/プログラムを使用して行われなければならない。
【0076】
適切な場合には、タンパク質の算出されたpIを、等電点電気泳動の技術を使用して実験的に確認できる(「実測pI」)。この技術は、タンパク質をそのpIに従って分離する電気泳動を使用する。等電点電気泳動は通常、固定されたpH勾配を有するゲルを使用して実施される。電場が掛けられると、タンパク質は、ゼロの正味電荷を有するpHに到達するまでpH勾配によって移動し、この点がタンパク質のpIである。等電点電気泳動によって提供される結果は通常、天然には比較的低解像度であり、したがって、本発明者らは算出pI(上記のように)によって提供される結果が、使用するのにより適当であると考える。
【0077】
本明細書を通じて、「pI」は、特に断りのない限り「算出pI」を意味する。
【0078】
タンパク質のpIは、その表面に提示される塩基性および/または酸性基の数を変更することによって増大または低下させることができる。これは、タンパク質の1個以上のアミノ酸を改変することによって達成できる。例えば、pIの増大は、酸性残基の数を低減することによって、または塩基性残基の数を増大させることによって提供できる。
【0079】
さらなる改変を含む改変クロストリジウム神経毒は、未改変クロストリジウム神経毒(例えば、配列番号2)のものよりも少なくとも0.2、0.4、0.5または1のpI単位高いpI値を有する場合がある。好ましくは、改変クロストリジウム神経毒は、少なくとも6.6、例えば、少なくとも6.8のpIを有する場合がある。
【0080】
20種の標準アミノ酸の特性は、以下の表に示されている:
【表B】
【0081】
以下のアミノ酸は荷電アミノ酸と考えられる:アスパラギン酸(負)、グルタミン酸(負)、アルギニン(正)およびリジン(正)。
【0082】
7.4のpHで、アスパラギン酸(pKa3.1)およびグルタミン酸(pKa4.1)の側鎖は、負電荷を有し、アルギニン(pKa12.5)およびリジン(pKa10.8)の側鎖は、正電荷を有する。アスパラギン酸およびグルタミン酸は、酸性アミノ酸残基と呼ばれる。アルギニンおよびリジンは、塩基性アミノ酸残基と呼ばれる。
【0083】
以下のアミノ酸は、無電荷、極性(それらは水素結合に関与する可能性があることを意味する)アミノ酸と考えられる:アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニンおよびトリプトファン。
【0084】
以下のアミノ酸は、無電荷、疎水性アミノ酸と考えられる:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリンおよびグリシン。
【0085】
好ましくは、さらなる改変は置換である。置き換えアミノ酸残基は、上記のような20種の標準アミノ酸の1つであり得る。あるいは、アミノ酸置換中の置き換えアミノ酸は、非標準または非天然アミノ酸(上記の20種の標準セットの一部ではないアミノ酸)である場合もある。例として、置き換えアミノ酸は、塩基性非標準または非天然アミノ酸、例えば、L-オルニチン、L-2-アミノ-3-グアニジノプロピオン酸またはリジン、アルギニンおよびオルニチン)のD-イソマーであり得る。非標準または非天然アミノ酸をタンパク質中に導入する方法は、当技術分野で公知であり、大腸菌(E. coli)栄養要求性発現宿主を使用する組換えタンパク質合成が含まれる。一実施形態では、置換は、酸性アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基との置換、酸性アミノ酸残基の無電荷アミノ酸残基との置換および無電荷アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基との置換から選択される。置換が、酸性アミノ酸残基の無電荷アミノ酸残基との置換である一実施形態では、酸性アミノ酸残基がその対応する無電荷アミドアミノ酸残基と置き換えられる(すなわち、アスパラギン酸が、アスパラギンと置き換えられ、グルタミン酸がグルタミンと置き換えられる)。
【0086】
好ましくは、塩基性アミノ酸残基は、リジン残基またはアルギニン残基である。言い換えれば、置換は、好ましくは、リジンまたはアルギニンとの置換である。最も好ましくは、改変は、リジンとの置換である。
【0087】
好ましくは、1つ以上のさらなる改変を含む改変クロストリジウム神経毒は、クロストリジウム毒素HCNドメイン中に位置する4から40の間のアミノ酸改変を含む。前記改変クロストリジウム神経毒はまた、好ましくは、少なくとも6.6のpIを有する。前記改変クロストリジウム神経毒は好ましくは、M1144での改変に加えて、ASN886、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、ASN1025、ASN1026およびASN1052から選択される少なくとも4個のアミノ酸の改変を含み、前記改変は、アミノ酸のリジン残基またはアルギニン残基との置換を含む。例えば、前記改変クロストリジウム神経毒は、M1144での改変に加えて、ASN886、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、ASN1025、ASN1026、ASN1052およびGLN1229から選択される少なくとも5個のアミノ酸の改変を含む場合があり、前記改変は、アミノ酸のリジン残基またはアルギニン残基との置換を含む。
【0088】
さらなる改変後、さらなる改変クロストリジウム神経毒は、未改変BoNT/A(例えば、配列番号2)が結合する標的細胞受容体に結合可能である。
【0089】
1つ以上のさらなる改変を含む改変クロストリジウム神経毒について、これらの有利な特性(治療係数の増大を表す)を定義することができる1つの方法は、改変神経毒の安全率の観点においてである。この関連で、関連動物モデル(例えば、体重の減少が投与の7日以内に検出されるマウス)において体重減少パーセンテージを測定することによって、クロストリジウム神経毒の望まれない効果(投与の部位から離れた毒素の拡散によって引き起こされる)を実験的に評価できる。逆に、クロストリジウム神経毒の所望のオンターゲット効果は、筋肉麻痺の尺度である指外転スコア(Digital Abduction Score)(DAS)アッセイによって実験的に評価できる。DASアッセイは、マウス腓腹筋/ヒラメ筋複合体中への、ゼラチンリン酸バッファーで製剤化された20μlのクロストリジウム神経毒の注射と、それに続くAokiの方法(Aoki KR、Toxicon 39: 1815-1820; 2001)を使用する指外転スコアの評価によって実施できる。DASアッセイでは、後肢を伸ばし、後指を外転させる特徴的な驚愕反応を引き出すために、マウスを尾によって短時間吊り下げる。クロストリジウム神経毒注射後、様々な程度の指外転が5点スケール(指外転および脚伸長における、0=正常～4=最大の低減)でスコア化される。
【0090】
次いで、クロストリジウム神経毒の安全率を、体重の10%低下に必要な毒素の量(マウスにおいて投薬後最初の7日以内のピーク効果で測定される)と、2のDASスコアにとって必要な毒素の量の間の比として表すことができる。したがって、高い安全率スコアが望まれ、望まれないオフターゲット効果をほとんど伴わずに標的筋肉を効果的に麻痺させることが可能である毒素を示す。1つ以上のさらなる改変を含む改変クロストリジウム神経毒は、同等の未改変(天然)ボツリヌス毒素(例えば、配列番号2)の安全率よりも高い、または1つ以上のさらなる改変を含まない改変クロストリジウム神経毒と比較した場合により高い安全率を有し得る。
【0091】
したがって、一実施形態では、1つ以上のさらなる改変を含む改変クロストリジウム神経毒は、少なくとも8(例えば、少なくとも8、9、10、15、20、25、30、35、40、45または50)の安全率を有し、安全率は、DAS ED50(pg/マウス)によって除された-10%の体重変化(pg/マウス)に必要な毒素の用量[ED50=2のDASスコアをもたらすために必要な用量]として算出される。
【0092】
一実施形態では、1つ以上のさらなる改変を含む改変クロストリジウム神経毒は、少なくとも10の安全率を有する。一実施形態では、1つ以上のさらなる改変を含む改変クロストリジウム神経毒は、少なくとも15の安全率を有する。
【0093】
本発明の改変クロストリジウム神経毒は好ましくは、天然に存在するクロストリジウム神経毒複合体中に存在する複合体形成タンパク質を含まない。
【0094】
アミノ酸残基の置換、挿入または欠失によって、または挿入欠失を介してタンパク質を改変する方法は、当技術分野で公知である。例として、アミノ酸改変は、ポリペプチドをコードする(例えば、未改変BoNT/A HCCドメインをコードする)核酸配列(例えば、DNA配列)の改変によって導入できる。これは、標準的な分子クローニング技術を使用して、例えば、ポリメラーゼ酵素を使用して元のコード配列を置き換えるために所望のアミノ酸(複数可)をコードするDNAの短い鎖(オリゴヌクレオチド)が使用される位置指定突然変異誘発によって、または種々の酵素(例えば、リガーゼおよび制限エンドヌクレアーゼ)を用いて遺伝子の部分を挿入/欠失することによって達成できる。あるいは、改変遺伝子配列を化学的に合成できる。
【0095】
したがって、一態様では、本発明は、以下を含む、改変クロストリジウム神経毒を生成する方法を提供する:
(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする第1の核酸を提供することおよびコードされるHCCドメインのメチオニン1144(M1144)で改変を導入し、それによって、第2の核酸を生成するように第1の核酸を改変し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大すること、または
(b)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインを含む改変クロストリジウム神経毒をコードする核酸を合成し、HCCドメインがメチオニン1144(M1144)の改変を含み、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大し、それによって、合成された核酸を提供すること、ならびに
(c)第2の核酸または合成された核酸をそれぞれ発現させ、それによって、改変クロストリジウム神経毒を生成すること、ならびに
(d)任意選択で、改変クロストリジウム神経毒を単離すること、ならびに
(e)任意選択で、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を軽鎖と重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で切断するプロテアーゼと接触させ、それによって、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換し、軽鎖および重鎖がジスルフィド結合によって一緒に繋げられることによって、改変クロストリジウム神経毒を活性化すること。
(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする第1の核酸を提供することおよびコードされるHCCドメインのメチオニン1144(M1144)で改変を導入し、それによって、第2の核酸を生成するように第1の核酸を改変し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大すること、または
(b)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインを含む改変クロストリジウム神経毒をコードする核酸を合成し、HCCドメインがメチオニン1144(M1144)の改変を含み、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大し、それによって、合成された核酸を提供すること、ならびに
(c)第2の核酸または合成された核酸をそれぞれ発現させ、それによって、改変クロストリジウム神経毒を生成すること、ならびに
(d)任意選択で、改変クロストリジウム神経毒を単離すること、ならびに
(e)任意選択で、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を軽鎖と重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で切断するプロテアーゼと接触させ、それによって、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換し、軽鎖および重鎖がジスルフィド結合によって一緒に繋げられることによって、改変クロストリジウム神経毒を活性化すること。
【0096】
例えば、改変クロストリジウム神経毒を生成する方法は、以下を含み得る:
(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする第1の核酸を提供することおよびコードされるHCCドメインのメチオニン1144(M1144)で改変を導入し、それによって、第2の核酸を生成するように第1の核酸を改変し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大すること、
(b)第2の核酸を発現させ、それによって、改変クロストリジウム神経毒を生成すること、ならびに
(c)任意選択で、改変クロストリジウム神経毒を単離すること、ならびに
(d)任意選択で、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を軽鎖と重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で切断するプロテアーゼと接触させ、それによって、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換し、軽鎖および重鎖がジスルフィド結合によって一緒に繋げられることによって、改変クロストリジウム神経毒を活性化すること。
(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする第1の核酸を提供することおよびコードされるHCCドメインのメチオニン1144(M1144)で改変を導入し、それによって、第2の核酸を生成するように第1の核酸を改変し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大すること、
(b)第2の核酸を発現させ、それによって、改変クロストリジウム神経毒を生成すること、ならびに
(c)任意選択で、改変クロストリジウム神経毒を単離すること、ならびに
(d)任意選択で、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を軽鎖と重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で切断するプロテアーゼと接触させ、それによって、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換し、軽鎖および重鎖がジスルフィド結合によって一緒に繋げられることによって、改変クロストリジウム神経毒を活性化すること。
【0097】
例えば、改変クロストリジウム神経毒を生成する方法は、以下を含み得る:
(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする核酸を合成し、HCCドメインは、メチオニン1144(M1144)の改変を含み、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大し、それによって、合成された核酸を提供すること、
(b)合成された核酸を発現させ、それによって、改変クロストリジウム神経毒を生成すること、ならびに
(c)任意選択で、改変クロストリジウム神経毒を単離すること、ならびに
(d)任意選択で、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を軽鎖と重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で切断するプロテアーゼと接触させ、それによって、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換し、軽鎖および重鎖がジスルフィド結合によって一緒に繋げられることによって、改変クロストリジウム神経毒を活性化すること。
(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする核酸を合成し、HCCドメインは、メチオニン1144(M1144)の改変を含み、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大し、それによって、合成された核酸を提供すること、
(b)合成された核酸を発現させ、それによって、改変クロストリジウム神経毒を生成すること、ならびに
(c)任意選択で、改変クロストリジウム神経毒を単離すること、ならびに
(d)任意選択で、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を軽鎖と重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で切断するプロテアーゼと接触させ、それによって、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換し、軽鎖および重鎖がジスルフィド結合によって一緒に繋げられることによって、改変クロストリジウム神経毒を活性化すること。
【0098】
方法は、以下を含み得る:
(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする第1の核酸を提供することおよびコードされるHCCドメインのメチオニン1144(M1144)で改変を導入し、それによって、第2の核酸を生成するように第1の核酸を改変し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大すること、または
(b)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする核酸を合成し、HCCドメインがメチオニン1144(M1144)の改変を含み、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大し、それによって、合成された核酸を提供すること、ならびに
(c)第2の核酸または合成された核酸をそれぞれ発現させ、それによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を生成すること、ならびに
(d)単鎖改変クロストリジウム神経毒を単離すること。
(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする第1の核酸を提供することおよびコードされるHCCドメインのメチオニン1144(M1144)で改変を導入し、それによって、第2の核酸を生成するように第1の核酸を改変し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大すること、または
(b)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする核酸を合成し、HCCドメインがメチオニン1144(M1144)の改変を含み、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大し、それによって、合成された核酸を提供すること、ならびに
(c)第2の核酸または合成された核酸をそれぞれ発現させ、それによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を生成すること、ならびに
(d)単鎖改変クロストリジウム神経毒を単離すること。
【0099】
方法は、以下を含み得る:
(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする第1の核酸を提供することおよびコードされるHCCドメインのメチオニン1144(M1144)で改変を導入し、それによって、第2の核酸を生成するように第1の核酸を改変し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大すること、または
(b) (少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする核酸を合成し、HCCドメインがメチオニン1144(M1144)の改変を含み、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大し、それによって、合成された核酸を提供すること、ならびに
(c)第2の核酸または合成された核酸をそれぞれ発現させ、それによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を生成すること、ならびに
(d)単鎖改変クロストリジウム神経毒を、軽鎖と重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で単鎖改変クロストリジウム神経毒を切断するプロテアーゼと接触させ、それによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換し、軽鎖および重鎖がジスルフィド結合によって一緒に繋げられることによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を活性化すること。
(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする第1の核酸を提供することおよびコードされるHCCドメインのメチオニン1144(M1144)で改変を導入し、それによって、第2の核酸を生成するように第1の核酸を改変し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大すること、または
(b) (少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする核酸を合成し、HCCドメインがメチオニン1144(M1144)の改変を含み、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大し、それによって、合成された核酸を提供すること、ならびに
(c)第2の核酸または合成された核酸をそれぞれ発現させ、それによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を生成すること、ならびに
(d)単鎖改変クロストリジウム神経毒を、軽鎖と重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で単鎖改変クロストリジウム神経毒を切断するプロテアーゼと接触させ、それによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換し、軽鎖および重鎖がジスルフィド結合によって一緒に繋げられることによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を活性化すること。
【0100】
好ましくは、二本鎖改変クロストリジウム神経毒は次いで単離される。
【0101】
好ましくは、方法は、以下を含み得る:
(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする第1の核酸を提供することおよびコードされるHCCドメインのメチオニン1144(M1144)で改変を導入し、それによって、第2の核酸を生成するように第1の核酸を改変し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大すること、または
(b)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする核酸を合成し、HCCドメインがメチオニン1144(M1144)の改変を含み、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大し、それによって、合成された核酸を提供すること、ならびに
(c)第2の核酸または合成された核酸をそれぞれ発現させ、それによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を生成すること、ならびに
(d)単鎖改変クロストリジウム神経毒を単離すること、ならびに
(e)単鎖改変クロストリジウム神経毒を、単鎖改変クロストリジウム神経毒を軽鎖と重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で切断するプロテアーゼと接触させ、それによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換し、軽鎖および重鎖がジスルフィド結合によって一緒に繋げられることによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を活性化すること。
(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする第1の核酸を提供することおよびコードされるHCCドメインのメチオニン1144(M1144)で改変を導入し、それによって、第2の核酸を生成するように第1の核酸を改変し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大すること、または
(b)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする核酸を合成し、HCCドメインがメチオニン1144(M1144)の改変を含み、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大し、それによって、合成された核酸を提供すること、ならびに
(c)第2の核酸または合成された核酸をそれぞれ発現させ、それによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を生成すること、ならびに
(d)単鎖改変クロストリジウム神経毒を単離すること、ならびに
(e)単鎖改変クロストリジウム神経毒を、単鎖改変クロストリジウム神経毒を軽鎖と重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で切断するプロテアーゼと接触させ、それによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換し、軽鎖および重鎖がジスルフィド結合によって一緒に繋げられることによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を活性化すること。
【0102】
本発明はまた、クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大する対応する方法を提供する。したがって、一態様では、本発明は、以下を含む、クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大する方法を提供する:
(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする第1の核酸を提供することおよびコードされるHCCドメインのメチオニン1144(M1144)で改変を導入し、それによって、第2の核酸を生成するように第1の核酸を改変し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大すること、または
(b)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインを含む(少なくとも)改変クロストリジウム神経毒をコードする核酸を合成し、HCCドメインは、メチオニン1144(M1144)の改変を含み、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大し、それによって、合成された核酸を提供すること、ならびに
(c)第2の核酸または合成された核酸をそれぞれ発現させ、それによって、改変クロストリジウム神経毒を生成すること、ならびに
(d)任意選択で、改変クロストリジウム神経毒を単離すること、ならびに
(e)任意選択で、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を軽鎖と重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で切断するプロテアーゼと接触させ、それによって、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換し、軽鎖および重鎖がジスルフィド結合によって一緒に繋げられることによって、改変クロストリジウム神経毒を活性化すること。
(a)(少なくとも)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインをコードする第1の核酸を提供することおよびコードされるHCCドメインのメチオニン1144(M1144)で改変を導入し、それによって、第2の核酸を生成するように第1の核酸を改変し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大すること、または
(b)ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインを含む(少なくとも)改変クロストリジウム神経毒をコードする核酸を合成し、HCCドメインは、メチオニン1144(M1144)の改変を含み、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大し、それによって、合成された核酸を提供すること、ならびに
(c)第2の核酸または合成された核酸をそれぞれ発現させ、それによって、改変クロストリジウム神経毒を生成すること、ならびに
(d)任意選択で、改変クロストリジウム神経毒を単離すること、ならびに
(e)任意選択で、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を軽鎖と重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で切断するプロテアーゼと接触させ、それによって、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換し、軽鎖および重鎖がジスルフィド結合によって一緒に繋げられることによって、改変クロストリジウム神経毒を活性化すること。
【0103】
好ましくは、二本鎖改変クロストリジウム神経毒は単離される。
【0104】
第2の核酸または合成された核酸は、好ましくは、ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)HCCドメインを含む改変クロストリジウム神経毒をコードする。したがって、前記核酸は、クロストリジウム神経毒L鎖およびH鎖をコードする場合があり、前記H鎖は転位置ドメインおよびHCドメインを含み、HCドメインは、M1144で改変されたHCCドメインを含む。
【0105】
本発明はまた、本発明の方法によって得ることができる改変クロストリジウム神経毒も提供する。「得ることができる」という用語は、本明細書で使用される場合、「得られた」という用語を包含する。一実施形態では、「得ることができる」とは、「得られた」を意味する。
【0106】
本発明の方法において使用するための第1の核酸は、本明細書に記載される未改変BoNT/A HCCドメインをコードする核酸配列を含み得る。第1の核酸は、1144位にメチオニンを含むクロストリジウム神経毒(例えば、軽鎖および重鎖を含む)をコードする核酸を含み得る。好ましくは、第1の核酸は、本明細書に記載される未改変BoNT/Aをコードする核酸配列を含む。
【0107】
一実施形態では、第1の核酸は、配列番号1、10、19、28または37のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を含む。一実施形態では、第1の核酸は、配列番号1、10、19、28または37のいずれか1つに対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有する核酸を含む。好ましくは、第1の核酸は、配列番号1、10、19、28または37のいずれか1つを含む(より好ましくは、それからなる)。示された配列のうち、配列番号10が最も好ましい。
【0108】
一実施形態では、第2の核酸または合成された核酸は、配列番号136～138のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を含む。一実施形態では、第2の核酸または合成された核酸は、配列番号136～138のいずれか1つに対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有する核酸を含む。好ましくは、第2の核酸または合成された核酸は、配列番号136～138のいずれか1つを含む(より好ましくは、それからなる)。
【0109】
一実施形態では、改変は、M1144をコードするコドンを、バリン(例えば、GTG)、ロイシン(例えば、CTG)またはグリシン(例えば、GGT)をコードするコドンと置き換えることを含む。
【0110】
関連態様では、本発明は、本発明の改変クロストリジウム神経毒をコードする核酸(好ましくは、DNA)配列を提供する。一実施形態では、核酸配列は、プロモーターおよびターミネーターを含むDNAベクターの一部として調製される。
【0111】
一実施形態では、核酸は、配列番号136～138のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有する核酸を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号136～138のいずれか1つに対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有する核酸を含む。好ましくは、核酸は、配列番号136～138のいずれか1つを含む(より好ましくは、それからなる)。
【0112】
本発明の改変クロストリジウム神経毒は、組換え核酸技術を使用して生成できる。したがって、一実施形態では、改変クロストリジウム神経毒(上記のような)は、組換え改変クロストリジウム神経毒である。
【0113】
好ましい実施形態では、ベクターは、以下から選択されるプロモーターを有する:
プロモーター / 誘導剤 / 通常の誘導条件
Tac(ハイブリッド) / IPTG / 0.2mM(0.05～2.0mM)
AraBAD / L-アラビノース / 0.2%(0.002～0.4%)
T7-lacオペレーター / IPTG / 0.2mM(0.05～2.0mM)
プロモーター / 誘導剤 / 通常の誘導条件
Tac(ハイブリッド) / IPTG / 0.2mM(0.05～2.0mM)
AraBAD / L-アラビノース / 0.2%(0.002～0.4%)
T7-lacオペレーター / IPTG / 0.2mM(0.05～2.0mM)
【0114】
別の好ましい実施形態では、ベクターは、以下から選択されるプロモーターを有する:
プロモーター / 誘導剤 / 通常の誘導条件
Tac(ハイブリッド) / IPTG / 0.2mM(0.05～2.0mM)
AraBAD / L-アラビノース / 0.2%(0.002～0.4%)
T7-lacオペレーター / IPTG / 0.2mM(0.05～2.0mM)
T5-lacオペレーター / IPTG / 0.2mM(0.05～2.0mM)
プロモーター / 誘導剤 / 通常の誘導条件
Tac(ハイブリッド) / IPTG / 0.2mM(0.05～2.0mM)
AraBAD / L-アラビノース / 0.2%(0.002～0.4%)
T7-lacオペレーター / IPTG / 0.2mM(0.05～2.0mM)
T5-lacオペレーター / IPTG / 0.2mM(0.05～2.0mM)
【0115】
本発明の核酸分子は、当技術分野で公知の任意の適したプロセスを使用して作製できる。したがって、核酸分子は、化学合成技術を使用して作製できる。あるいは、本発明の核酸分子は分子生物学技術を使用して作製できる。
【0116】
例えば、本発明の核酸をコンピュータで設計し、次いで、従来の合成技術によって合成できる。
【0117】
上記の核酸配列情報は、任意選択で、利用される予定の最終宿主細胞(例えば、大腸菌)発現系に従うコドンバイアスのために改変される。
【0118】
「ヌクレオチド配列」および「核酸」という用語は、本明細書において同意語として使用される。好ましくは、ヌクレオチド配列は、DNA配列である。
【0119】
当技術分野で公知の任意の技術を使用して、本明細書に記載される核酸配列を発現させて改変クロストリジウム神経毒を生成することができる。例えば、核酸を、細胞を含まないin vitro系において発現させることができる。あるいは、核酸は、適した宿主細胞、例えば、大腸菌宿主細胞において発現されることが好ましい。
【0120】
したがって、一態様では、本発明は、軽鎖および重鎖を有する単鎖改変クロストリジウム神経毒を生成する方法であって、適した宿主細胞において本発明の核酸を発現させること、宿主細胞を溶解して単鎖改変クロストリジウム神経毒を含有する宿主細胞ホモジネートを提供することおよび単鎖改変クロストリジウム神経毒を単離することを含む、方法を提供する。
【0121】
発現の後で、改変クロストリジウム神経毒を単離できる。改変クロストリジウム神経毒を単離することは、当業者に公知の任意の精製法、例えば、クロマトグラフィー法または免疫親和性法によって達成できる。精製タグは、単離に役立ち得る。したがって、本明細書に記載される改変クロストリジウム神経毒は、1以上のタグ(例えば、精製タグ)、例えば、HisタグまたはStrepタグを含み得る。改変クロストリジウム神経毒がこのようなタグを含まないことまたは使用前にタグが除去されることが好ましい。改変クロストリジウム神経毒はまた、タグの除去を促進するために1以上の切断部位、例えば、TEV切断部位を含み得る。
【0122】
改変クロストリジウム神経毒は、生成の際の任意の点で単鎖ポリペプチドから対応する二本鎖ポリペプチドに変換され得る。しかし、これは改変クロストリジウム神経毒を単離した後に実施されることが好ましい。
【0123】
したがって、一態様では、本発明は、改変クロストリジウム神経毒を活性化する方法であって、本発明の方法によって得ることができる単鎖改変クロストリジウム神経毒を提供すること、単鎖改変クロストリジウム神経毒を、単鎖改変クロストリジウム神経毒を軽鎖および重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で切断するプロテアーゼと接触させ、それによって、単鎖改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換し、軽鎖および重鎖がジスルフィド結合によって一緒に繋げられることを含む、方法を提供する。
【0124】
本発明はしたがって、本発明の方法によって得ることができる二本鎖クロストリジウム神経毒を提供する。
【0125】
活性化は、好ましくは、WO2014/080206 A1に記載されるように、改変クロストリジウム神経毒をLys-Cと接触させることによって実施される。
【0126】
上記で論じられるように、クロストリジウム神経毒は、2つのポリペプチド鎖、およそ100kDaの分子量を有する重鎖(H鎖)、およびおよそ50kDaの分子量を有する軽鎖(L鎖)から形成される。H鎖はC末端標的化構成成分(受容体結合ドメインまたはHCドメイン)およびN末端転位置構成成分(HNドメイン)を含む。
【0127】
軽鎖参照配列の例として以下が挙げられる:
ボツリヌスA型神経毒:アミノ酸残基1～448
ボツリヌスB型神経毒:アミノ酸残基1～440
ボツリヌスC1型神経毒:アミノ酸残基1～441
ボツリヌスD型神経毒:アミノ酸残基1～445
ボツリヌスE型神経毒:アミノ酸残基1～422
ボツリヌスF型神経毒:アミノ酸残基1～439
ボツリヌスG型神経毒:アミノ酸残基1～441
テタヌス神経毒:アミノ酸残基1～457
ボツリヌスA型神経毒:アミノ酸残基1～448
ボツリヌスB型神経毒:アミノ酸残基1～440
ボツリヌスC1型神経毒:アミノ酸残基1～441
ボツリヌスD型神経毒:アミノ酸残基1～445
ボツリヌスE型神経毒:アミノ酸残基1～422
ボツリヌスF型神経毒:アミノ酸残基1～439
ボツリヌスG型神経毒:アミノ酸残基1～441
テタヌス神経毒:アミノ酸残基1～457
【0128】
最近同定されたBoNT/Xについて、L鎖は、そのアミノ酸1～439に対応し、L鎖境界は、およそ25個のアミノ酸だけ変わる可能性がある(例えば、1～414または1～464)と報告されている。
【0129】
亜血清型に従ってわずかな変動が生じ得るので、上記で同定された参照配列はガイドと考えられなければならない。例として、US2007/0166332(参照によりその全文で本明細書に組み込まれる)では、わずかに異なるクロストリジウム配列を引用している:
ボツリヌスA型神経毒:アミノ酸残基M1～K448
ボツリヌスB型神経毒:アミノ酸残基M1～K441
ボツリヌスC1型神経毒:アミノ酸残基M1～K449
ボツリヌスD型神経毒:アミノ酸残基M1～R445
ボツリヌスE型神経毒:アミノ酸残基M1～R422
ボツリヌスF型神経毒:アミノ酸残基M1～K439
ボツリヌスG型神経毒:アミノ酸残基M1～K446
テタヌス神経毒:アミノ酸残基M1～A457
ボツリヌスA型神経毒:アミノ酸残基M1～K448
ボツリヌスB型神経毒:アミノ酸残基M1～K441
ボツリヌスC1型神経毒:アミノ酸残基M1～K449
ボツリヌスD型神経毒:アミノ酸残基M1～R445
ボツリヌスE型神経毒:アミノ酸残基M1～R422
ボツリヌスF型神経毒:アミノ酸残基M1～K439
ボツリヌスG型神経毒:アミノ酸残基M1～K446
テタヌス神経毒:アミノ酸残基M1～A457
【0130】
転位置ドメインは、プロテアーゼ活性の機能的発現が標的細胞のサイトゾル内に生じるように、標的細胞中へのプロテアーゼの転位置を可能にする分子である。任意の分子(例えば、タンパク質またはペプチド)が、本発明の必要な転位置機能を有するか否かは、いくつかの従来アッセイのいずれか1つによって確認できる。
【0131】
例えば、Shone C. (1987)には、試験分子で検証される、リポソームを利用するin vitroアッセイが記載されている。必要な転位置機能の存在は、K+および/または標識されたNADのリポソームからの放出によって確認され、これは容易にモニタリングされ得る[Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp. 175-180を参照されたい]。
【0132】
さらなる例は、Blaustein R. (1987)によって提供されており、これは、平面リン脂質二重膜を利用する簡単なin vitroアッセイを記載する。膜が試験分子で検証され、必要な転位置機能は、前記膜全体のコンダクタンスの増大によって確認される[Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pp. 115-120を参照されたい]。
【0133】
膜融合の評価、ひいては本発明において使用するのに適した転位置ドメインの同定を可能にするさらなる方法論は、Methods in Enzymology Vol 220 and 221, Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993に提供されている。
【0134】
本発明はまた、バリアントドメインが必要な転位置活性を依然として実証する限り、バリアント転位置ドメインを包含する。例として、バリアントは、参照転位置ドメインと、少なくとも70%、好ましくは、少なくとも80%、より好ましくは、少なくとも90%、最も好ましくは、少なくとも95%または少なくとも98%のアミノ酸配列相同性を有し得る。断片という用語は、転位置ドメインと関連して使用される場合、参照転位置ドメインの少なくとも20個、好ましくは、少なくとも40個、より好ましくは、少なくとも80個、最も好ましくは、少なくとも100個のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。クロストリジウム転位置ドメインの場合には、断片は、好ましくは、参照転位置ドメイン(例えば、HNドメイン)の少なくとも100個、好ましくは、少なくとも150個、より好ましくは、少なくとも200個、最も好ましくは、少なくとも250個のアミノ酸残基を有する。本発明の転位置「断片」は、参照配列に基づいたバリアント転位置ドメインの断片を包含する。
【0135】
転位置ドメインは、好ましくは、低pHの条件下で脂質膜中にイオン透過性孔を形成可能である。好ましくは、エンドソーム膜内に孔形成可能なタンパク質分子のそれらの部分のみを使用することが見出された。
【0136】
転位置ドメインは、微生物タンパク質供給源から、特に、細菌またはウイルスタンパク質供給源から得ることができる。したがって、一実施形態では、転位置ドメインは、酵素、例えば、細菌毒素またはウイルスタンパク質の転位置ドメインである。
【0137】
細菌毒素分子のある特定のドメインがこのような孔を形成可能であることは十分に実証されている。ウイルスによって発現された膜融合タンパク質のある特定の転位置ドメインが、このような孔を形成可能であることも公知である。このようなドメインは、本発明において使用され得る。
【0138】
転位置ドメインは、クロストリジウム起源のもの、例えば、HNドメイン(またはその機能的構成成分)であり得る。HNとは、H鎖のアミノ末端の半分とほぼ同等のクロストリジウム神経毒のH鎖の部分もしくは断片または無処置のH鎖中のその断片に対応するドメインを意味する。
【0139】
適した(参照)転位置ドメインの例として、以下が挙げられる:
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(449～871)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(441～858)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(442～866)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(446～862)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(423～845)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(440～864)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(442～863)
テタヌス神経毒-アミノ酸残基(458～879)。
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(449～871)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(441～858)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(442～866)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(446～862)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(423～845)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(440～864)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(442～863)
テタヌス神経毒-アミノ酸残基(458～879)。
【0140】
亜血清型に従ってわずかな変動が生じ得るので、上記で同定された参照配列は、ガイドと考えられなければならない。例として、US2007/0166332(参照により本明細書に組み込まれる)は、わずかに異なるクロストリジウム配列を引用している:
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(A449～K871)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(A442～S858)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(T450～N866)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(D446～N862)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(K423～K845)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(A440～K864)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(S447～S863)
テタヌス神経毒-アミノ酸残基(S458～V879)
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(A449～K871)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(A442～S858)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(T450～N866)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(D446～N862)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(K423～K845)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(A440～K864)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(S447～S863)
テタヌス神経毒-アミノ酸残基(S458～V879)
【0141】
本発明に関連して、本発明の態様において転位置ドメインを含む種々のクロストリジウム神経毒HN領域は、これらの活性断片が、細胞内小胞から標的細胞の細胞質への非細胞傷害性プロテアーゼ(例えば、クロストリジウムのL鎖)の放出を促進し、ひいては、クロストリジウム神経毒が基質をタンパク質分解性に切断する全体的な細胞機序の実行に参加できる限り、有用であり得る。クロストリジウム神経毒の重鎖に由来するHN領域は、およそ410～430個のアミノ酸長であり、転位置ドメインを含む。研究によって、クロストリジウム神経毒重鎖由来のHN領域の全長が、転位置ドメインの転位置活性にとって必要であるわけではないということが示されている。したがって、この実施形態の態様は、例えば、少なくとも350個のアミノ酸、少なくとも375個のアミノ酸、少なくとも400個のアミノ酸および少なくとも425個のアミノ酸の長さを有する転位置ドメインを含むクロストリジウム神経毒HN領域を含み得る。この実施形態の他の態様は、例えば、多くとも350個のアミノ酸、多くとも375個のアミノ酸、多くとも400個のアミノ酸および多くとも425個のアミノ酸の長さを有する転位置ドメインを含むクロストリジウム神経毒HN領域を含み得る。
【0142】
クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium・botulinum)およびC.テタニ(tetani)における毒素生成の遺伝学的基礎に関するさらなる詳細については、本発明者らは、Henderson et al (1997) in The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic pressを参照している。
【0143】
HNという用語は、天然に生じる神経毒HN部分ならびに改変されたHN部分が上記の転位置機能を依然として実証する限り、天然では生じないアミノ酸配列および/または合成アミノ酸残基を有する改変されたHN部分を包含する。
【0144】
あるいは、転位置ドメインは、非クロストリジウム起源のものであり得る。非クロストリジウム(参照)転位置ドメイン起源の例として、ジフテリア毒素の転位置ドメイン[O’Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532;およびLondon, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51]、シュードモナス外毒素A型の転位置ドメイン[Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559]、炭疽病毒素の転位置ドメイン[Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442]、転位置機能の種々の膜融合性または疎水性ペプチド[Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924;およびWagner et al (1992) PNAS, 89, pp.7934-7938]および両親媒性ペプチド[Murata et al (1992) Biochem., 31, pp.1986-1992]が挙げられるが、それに制限されない。転位置ドメインは、天然に生じるタンパク質中に存在する転位置ドメインに酷似する場合がある、またはアミノ酸変動を、変動が転位置ドメインの転位置能を破壊しない限り含み得る。
【0145】
本発明において使用するのに適したウイルス(参照)転位置ドメインの特定の例として、ウイルスによって発現された膜融合タンパク質のある特定の転位置ドメインが挙げられる。例えば、Wagner et al. (1992)およびMurata et al. (1992)には、インフルエンザウイルス血球凝集素のN末端領域に由来するいくつかの膜融合性および両親媒性ペプチドの転位置(すなわち、膜融合および小胞化)機能が記載されている。所望の転位置活性を有すると知られている他のウイルスによって発現された膜融合タンパク質として、セムリキ森林ウイルス(SFV)の膜融合ペプチドの転位置ドメイン、水泡性口内炎ウイルス(VSV)糖タンパク質Gの転位置ドメイン、SERウイルスFタンパク質の転位置ドメインおよび泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質の転位置ドメインが挙げられる。ウイルスによってコードされるAスパイク(Aspike)タンパク質は、本発明に関連して特定の適用を有する、例えば、SFVのE1タンパク質およびVSVのGタンパク質のGタンパク質。
【0146】
表(以下)に列挙される(参照)転位置ドメインの使用は、その配列バリアントの使用を含む。バリアントは、バリアントが必要な転位置機能を有する限り、1以上の保存的核酸置換および/または核酸欠失もしくは挿入を含み得る。バリアントはまた、バリアントが必要な転位置機能を有する限り、1以上のアミノ酸置換および/またはアミノ酸欠失もしくは挿入も含み得る。
【表C】
【0147】
クロストリジウム神経毒HCドメイン参照配列の例として、以下が挙げられる:
BoNT/A-N872～L1296
BoNT/B-E859～E1291
BoNT/C1-N867～E1291
BoNT/D-S863～E1276
BoNT/E-R846～K1252
BoNT/F-K865～E1274
BoNT/G-N864～E1297
TeNT-I880～D1315。
BoNT/A-N872～L1296
BoNT/B-E859～E1291
BoNT/C1-N867～E1291
BoNT/D-S863～E1276
BoNT/E-R846～K1252
BoNT/F-K865～E1274
BoNT/G-N864～E1297
TeNT-I880～D1315。
【0148】
最近同定されたBoNT/Xについて、HCドメインは、そのアミノ酸893～1306に対応し、ドメイン境界は、およそ25個のアミノ酸だけ変わる可能性がある(例えば、868～1306または918～1306)と報告されている。
【0149】
本明細書において記載されるクロストリジウム神経毒は、転位置促進ドメインをさらに含み得る。前記ドメインは、非細胞傷害性プロテアーゼの標的細胞のサイトゾルへの送達を促進し、例えば、各々、参照により本明細書に組み込まれるWO08/008803およびWO08/008805に記載されている。
【0150】
例として、適した転位置促進ドメインは、エンベロープ型ウイルス膜融合ペプチドドメインを含み、例えば、適した膜融合ペプチドドメインとして、インフルエンザウイルス膜融合ペプチドドメイン(例えば、23個のアミノ酸のインフルエンザAウイルス膜融合ペプチドドメイン)、アルファウイルス膜融合ペプチドドメイン(例えば、26個のアミノ酸のセムリキ森林ウイルス膜融合ペプチドドメイン)、ベジクロウイルス膜融合ペプチドドメイン(例えば、21個のアミノ酸の水泡性口内炎ウイルス膜融合ペプチドドメイン)、レスピロウイルス膜融合ペプチドドメイン(例えば、25個のアミノ酸のセンダイウイルス膜融合ペプチドドメイン)、モルビリウイルス膜融合ペプチドドメイン(例えば、25個のアミノ酸のイヌジステンパーウイルス膜融合ペプチドドメイン)、アブラウイルス膜融合ペプチドドメイン(例えば、25個のアミノ酸のニューカッスル病ウイルス膜融合ペプチドドメイン)、ヘニパウイルス膜融合ペプチドドメイン(例えば、25個のアミノ酸のヘンドラウイルス膜融合ペプチドドメイン)、メタニューモウイルス膜融合ペプチドドメイン(例えば、25個のアミノ酸のヒトメタニューモウイルス膜融合ペプチドドメイン)またはスプーマウイルス膜融合ペプチドドメイン、例えば、サル泡沫状ウイルス膜融合ペプチドドメインまたはそれらの断片またはバリアントが挙げられる。
【0151】
さらなる例として、転位置促進ドメインは、クロストリジウム神経毒HCNドメインまたはその断片またはバリアントを含み得る。より詳細には、クロストリジウム毒素HCN転位置促進ドメインは、少なくとも200個のアミノ酸、少なくとも225個のアミノ酸、少なくとも250個のアミノ酸、少なくとも275個のアミノ酸の長さを有し得る。この関連で、クロストリジウム毒素HCN転位置促進ドメインは、好ましくは、多くとも200個のアミノ酸、多くとも225個のアミノ酸、多くとも250個のアミノ酸または多くとも275個のアミノ酸の長さを有する。具体的な(参照)例として、以下が挙げられる:
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(872～1110)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(859～1097)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(867～1111)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(863～1098)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(846～1085)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(865～1105)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(864～1105)
テタヌス神経毒-アミノ酸残基(880～1127)
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(872～1110)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(859～1097)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(867～1111)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(863～1098)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(846～1085)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(865～1105)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(864～1105)
テタヌス神経毒-アミノ酸残基(880～1127)
【0152】
上記の配列位置は、血清型/亜型に従ってわずかに変わる可能性があり、適した(参照)クロストリジウム神経毒HCNドメインのさらなる例として、以下が挙げられる:
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(874～1110)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(861～1097)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(869～1111)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(865～1098)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(848～1085)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(867～1105)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(866～1105)
テタヌス神経毒-アミノ酸残基(882～1127)。
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(874～1110)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(861～1097)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(869～1111)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(865～1098)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(848～1085)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(867～1105)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(866～1105)
テタヌス神経毒-アミノ酸残基(882～1127)。
【0153】
上記の促進ドメインのいずれも、本発明において使用するのに適しているこれまでに記載された転位置ドメインペプチドのいずれかと組み合わせることができる。したがって、例として、非クロストリジウム促進ドメインを、非クロストリジウム転位置ドメインペプチドと、またはクロストリジウム転位置ドメインペプチドと組み合わせることができる。あるいは、クロストリジウム神経毒HCN転位置促進ドメインを、非クロストリジウム転位置ドメインペプチドと組み合わせることができる。あるいは、クロストリジウム神経毒HCN促進ドメインを、クロストリジウム転位置ドメインペプチドと組み合わせることができ、その例として、以下が挙げられる:
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(449～1110)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(442～1097)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(450～1111)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(446～1098)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(423～1085)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(440～1105)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(447～1105)
テタヌス神経毒-アミノ酸残基(458～1127)。
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(449～1110)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(442～1097)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(450～1111)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(446～1098)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(423～1085)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(440～1105)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(447～1105)
テタヌス神経毒-アミノ酸残基(458～1127)。
【0154】
天然クロストリジウム神経毒のHCペプチドは、およそ400～440個のアミノ酸残基を含み、各々およそ25kDaの2つの機能的に別個のドメイン、すなわち、N末端領域(HCNペプチドまたはドメインと一般に呼ばれる)およびC末端領域(HCCペプチドまたはドメインと一般に呼ばれる)からなる。この事実は、各々、その全文で参照により本明細書に組み込まれる以下の刊行物によって確認されている:Umland TC (1997) Nat. Struct. Biol. 4: 788-792; Herreros J (2000) Biochem. J. 347: 199-204; Halpern J (1993) J. Biol. Chem. 268: 15, pp. 11188-11192; Rummel A (2007) PNAS 104: 359-364; Lacey DB (1998) Nat. Struct. Biol. 5: 898-902; Knapp (1998) Am. Cryst. Assoc. Abstract Papers 25: 90; Swaminathan and Eswaramoorthy (2000) Nat. Struct. Biol. 7: 1751-1759;およびRummel A (2004) Mol. Microbiol. 51(3), 631-643。さらに、C末端の160～200個のアミノ酸残基を構成するC末端領域(HCC)は、クロストリジウム神経毒のその天然細胞受容体、すなわち、神経筋接合部の神経終末への結合に関与しているということは十分に実証されており、この事実もまた、上記の刊行物によって確認されている。
【0155】
クロストリジウムHCC参照配列の例は、以下に提示される:
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(Y1111～L1296)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(Y1098～E1291)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(Y1112～E1291)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(Y1099～E1276)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(Y1086～K1252)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(Y1106～E1274)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(Y1106～E1297)
テタヌス神経毒-アミノ酸残基(Y1128～D1315)。
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(Y1111～L1296)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(Y1098～E1291)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(Y1112～E1291)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(Y1099～E1276)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(Y1086～K1252)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(Y1106～E1274)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(Y1106～E1297)
テタヌス神経毒-アミノ酸残基(Y1128～D1315)。
【0156】
亜血清型に従ってわずかな変動が生じ得るので、上記で同定された参照配列は、ガイドと考えられなければならない。
【0157】
改変クロストリジウム神経毒は、軽鎖のアミノ酸配列中に1つ以上の改変、例えば、改変されたL鎖のSNAREタンパク質特異性を変更または改変し得る、基質結合または触媒ドメイン中の改変を有し得る。このような改変クロストリジウム神経毒の例は、WO2010/120766およびUS2011/0318385に記載されており、その両方とも参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【0158】
改変クロストリジウム神経毒は、改変クロストリジウム神経毒の生物活性および/または生物学的残留性を増大/減少させる1つ以上の改変を含み得る。例えば、改変クロストリジウム神経毒は、ロイシン-またはチロシン-ベースのモチーフを含む場合があり、前記モチーフは、改変クロストリジウム神経毒の生物活性および/または生物学的残留性を増大または減少させる。適したロイシン-ベースのモチーフとして、xDxxxLL(配列番号117)、xExxxLL(配列番号118)、xExxxIL(配列番号119)およびxExxxLM(配列番号120)(式中、xは、任意のアミノ酸である)が挙げられる。適したチロシン-ベースのモチーフとして、Y-x-x-Hy(配列番号121)(式中、Hyは、疎水性アミノ酸である)が挙げられる。ロイシン-およびチロシン-ベースのモチーフを含む改変クロストリジウム神経毒の例は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるWO2002/08268に記載されている。
【0159】
本発明の改変クロストリジウム神経毒が改変BoNT/Aであることは好ましいが、本発明は、前記クロストリジウム神経毒が、本発明の改変BoNT/A HCCドメインを含むという条件で、クロストリジウム神経毒の多数の異なる変種への適用に適している(しかし、この条件は、以下に論じられるような酸化耐性クロストリジウム神経毒を選択する方法については必須ではない)。したがって、本発明に関連して、「クロストリジウム神経毒」という用語は、C.ボツリヌム(botulinum)によって(ボツリヌス神経毒血清型A、B、C1、D、E、F、G、HおよびX)、C.テタニ(tetani)によって(テタヌス神経毒)、C.ブチリカム(butyricum)によって(ボツリヌス神経毒血清型E)およびC.バラティー(baratii)によって(ボツリヌス神経毒血清型F)産生された毒素ならびに前記クロストリジウム神経毒が本発明の改変BoNT/A HCCドメインを含むという条件で(しかし、この条件は、以下に論じられるような酸化耐性クロストリジウム神経毒を選択する方法については必須ではない)、改変クロストリジウム神経毒または前記のいずれかに由来する誘導体を包含する。「クロストリジウム神経毒」という用語はまた、前記クロストリジウム神経毒が本発明の改変BoNT/A HCCドメインを含むという条件で(しかし、この条件は、以下に論じられるような酸化耐性クロストリジウム神経毒を選択する方法については必須ではない)、ボツリヌス神経毒血清型Hを包含する。
【0160】
したがって、「クロストリジウム神経毒」という用語は、ハイブリッドおよびキメラクロストリジウム神経毒を包含するものとする。一実施形態では、改変クロストリジウム神経毒は、前記クロストリジウム神経毒が本発明の改変BoNT/A HCCドメインを含むという条件で(しかし、やはりこの条件は、以下に論じられるような酸化耐性クロストリジウム神経毒を選択する方法については必須ではない)ハイブリッドまたはキメラクロストリジウム神経毒であり得る。ハイブリッドクロストリジウム神経毒は、あるクロストリジウム神経毒またはその亜型に由来する軽鎖の少なくとも一部分および別のクロストリジウム神経毒またはクロストリジウム神経毒亜型に由来する重鎖の少なくとも一部分を含む。一実施形態では、ハイブリッドクロストリジウム神経毒は、あるクロストリジウム神経毒亜型に由来する全軽鎖および別のクロストリジウム神経毒亜型に由来する重鎖を含有し得る。別の実施形態では、キメラクロストリジウム神経毒は、あるクロストリジウム神経毒亜型の重鎖の部分(例えば、結合ドメイン)を含有し、重鎖の別の部分は、別のクロストリジウム神経毒亜型に由来し得る。同様に、またはあるいは、治療要素は、異なるクロストリジウム神経毒に由来する軽鎖部分を含み得る。このようなハイブリッドまたはキメラクロストリジウム神経毒は、例えば、このようなクロストリジウム神経毒の治療的有用性を、所与のクロストリジウム神経毒亜型に対して免疫学的に耐性である患者に、所与のクロストリジウム神経毒重鎖結合ドメインに対する平均濃度よりも低い受容体を有し得る患者に、または膜もしくは小胞毒素基質(例えば、SNAP-25、VAMPおよびシンタキシン)のプロテアーゼ耐性バリアントを有し得る患者に送達する手段として有用である。ハイブリッドおよびキメラクロストリジウム神経毒は、US8,071,110に記載されており、この刊行物は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【0161】
ボツリヌス神経毒(BoNT)は、C.ボツリヌム(botulinum)によって、いくつかのアクセサリータンパク質と複合体形成されたBoNT自体からなる大きなタンパク質複合体の形態で産生される。現在9種の異なるクラスのボツリヌス神経毒、すなわち、ボツリヌス神経毒血清型A、B、C1、D、E、F、G、HおよびXがあり、そのすべてが、類似構造および作用様式を共有している。異なるBoNT血清型は、特異的中和抗血清による不活性化に基づいて区別することができ、このような血清型による分類は、アミノ酸レベルで配列同一性パーセンテージと相関する。所与の血清型のBoNTタンパク質は、アミノ酸配列同一性パーセンテージに基づいて異なる亜型にさらにわけられる。
【0162】
未改変BoNT/Aポリペプチド配列(未改変BoNT/A1、BoNT/A3およびBoNT/A4を含む)は、上記で記載されている。
【0163】
BoNT/Bは、配列番号128に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。例えば、BoNT/Bは、配列番号128に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、BoNT/Bは、配列番号128を含む(またはそれからなる)。
【0164】
BoNT/C1は、配列番号129に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。例えば、BoNT/C1は、配列番号129に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、BoNT/C1は、配列番号129を含む(またはそれからなる)。
【0165】
BoNT/Dは、配列番号130に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。例えば、BoNT/Dは、配列番号130に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、BoNT/Dは、配列番号130を含む(またはそれからなる)。
【0166】
BoNT/Eは、配列番号131に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。例えば、BoNT/Eは、配列番号131に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、BoNT/Eは、配列番号131を含む(またはそれからなる)。
【0167】
BoNT/Fは、配列番号132に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。例えば、BoNT/Fは、配列番号132に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、BoNT/Fは、配列番号132を含む(またはそれからなる)。
【0168】
BoNT/Gは、配列番号133に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。例えば、BoNT/Gは、配列番号133に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、BoNT/Gは、配列番号133を含む(またはそれからなる)。
【0169】
TeNTは、配列番号134に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。例えば、TeNTは、配列番号134に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、TeNTは、配列番号134を含む(またはそれからなる)。
【0170】
BoNT/Xは、配列番号135に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。例えば、BoNT/Xは、配列番号135に対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、BoNT/Xは、配列番号135を含む(またはそれからなる)。
【0171】
BoNTは、胃腸管において吸収され、全身循環に入ったのち、コリン作動性神経末端のシナプス前膜と結合し、その神経伝達物質アセチルコリンの放出を妨げる。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/FおよびBoNT/Gは、シナプトブレビン/小胞関連膜タンパク質(VAMP)を切断し、BoNT/C1、BoNT/AおよびBoNT/Eは、25kDaのシナプトソーム関連タンパク質(SNAP-25)を切断し、BoNT/C1は、シンタキシンを切断する。BoNT/Xは、SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP3、VAMP4、VAMP5、Ykt6およびシンタキシン1を切断するとわかっている。
【0172】
破傷風菌毒素は、C.テタニ(tetani)によって単一血清型で産生される。C.ブチリカム(butyricum)は、BoNT/Eを産生し、C.バラティー(baratii)は、BoNT/Fを産生する。
【0173】
「クロストリジウム神経毒」という用語はまた、前記クロストリジウム神経毒が本発明の改変BoNT/A HCCドメインを含むという条件で(しかし、やはりこの条件は、以下に論じられるような酸化耐性クロストリジウム神経毒を選択する方法については必須ではない)、非クロストリジウムの微生物によって発現された新たに発見されたボツリヌス神経毒タンパク質ファミリーメンバー、例えば、BoNT/Xに対して最も近い配列同一性を有するエンテロコッカス属(Enterococcus)によってコードされた毒素、BoNT/Wo(NCBI参照配列:WP_027699549.1)と呼ばれる、W89-W90でVAMP2を切断するワイセラ・オリゼ(Weissella oryzae)によってコードされる毒素、VAMP2およびSNAP25を切断するエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)によってコードされる毒素(GenBank:OTO22244.1)およびクリセオバクテリウム・ピペロ(Chryseobacterium pipero)によってコードされる毒素(NCBI参照配列:WP_034687872.1)も包含し得る。
【0174】
本発明の改変クロストリジウム神経毒は、本明細書に記載されるように改変されたBoNT/A HCCドメインならびに以下を含み得る:
(i)BoNT/A L鎖および/もしくはBoNT/A HNドメイン(好ましくは、BoNT/A L鎖およびBoNT/A HNドメイン)、
(ii)BoNT/B L鎖および/もしくはBoNT/B HNドメイン(好ましくは、BoNT/B L鎖および BoNT/B HNドメイン)、
(iii)BoNT/C1 L鎖および/もしくはBoNT/C1 HNドメイン(好ましくは、BoNT/C1 L鎖およびBoNT/C1 HNドメイン)、
(iv)BoNT/D L鎖および/もしくはBoNT/D HNドメイン(好ましくは、BoNT/D L鎖およびBoNT/D HNドメイン)、
(v)BoNT/E L鎖および/もしくはBoNT/E HNドメイン(好ましくは、BoNT/E L鎖およびBoNT/E HNドメイン)、
(vi)BoNT/F L鎖および/もしくはBoNT/F HNドメイン(好ましくは、BoNT/F L鎖およびBoNT/F HNドメイン)、
(iv)BoNT/G L鎖および/もしくはBoNT/G HNドメイン(好ましくは、BoNT/G L鎖および BoNT/G HNドメイン)、
(iv)BoNT/X L鎖および/もしくはBoNT/X HNドメイン(好ましくは、BoNT/X L鎖およびBoNT/X HNドメイン)、または
(iv)TeNT L鎖および/もしくはTeNT HNドメイン(好ましくは、TeNT L鎖およびTeNT HNドメイン)。
(i)BoNT/A L鎖および/もしくはBoNT/A HNドメイン(好ましくは、BoNT/A L鎖およびBoNT/A HNドメイン)、
(ii)BoNT/B L鎖および/もしくはBoNT/B HNドメイン(好ましくは、BoNT/B L鎖および BoNT/B HNドメイン)、
(iii)BoNT/C1 L鎖および/もしくはBoNT/C1 HNドメイン(好ましくは、BoNT/C1 L鎖およびBoNT/C1 HNドメイン)、
(iv)BoNT/D L鎖および/もしくはBoNT/D HNドメイン(好ましくは、BoNT/D L鎖およびBoNT/D HNドメイン)、
(v)BoNT/E L鎖および/もしくはBoNT/E HNドメイン(好ましくは、BoNT/E L鎖およびBoNT/E HNドメイン)、
(vi)BoNT/F L鎖および/もしくはBoNT/F HNドメイン(好ましくは、BoNT/F L鎖およびBoNT/F HNドメイン)、
(iv)BoNT/G L鎖および/もしくはBoNT/G HNドメイン(好ましくは、BoNT/G L鎖および BoNT/G HNドメイン)、
(iv)BoNT/X L鎖および/もしくはBoNT/X HNドメイン(好ましくは、BoNT/X L鎖およびBoNT/X HNドメイン)、または
(iv)TeNT L鎖および/もしくはTeNT HNドメイン(好ましくは、TeNT L鎖およびTeNT HNドメイン)。
【0175】
改変クロストリジウム神経毒は好ましくは、本明細書に記載されるように改変されたBoNT/A HCCドメインを含むBoNT/A HCドメインを含む。本明細書に記載されるように改変されたBoNT/A HCCドメインは、天然BoNT/A HCドメインと置き換わることができる。BoNT/A HCドメインは、HCCドメインと同一または異なる(好ましくは、同一の)BoNT/A亜血清型(例えば、BoNT/A1、BoNT/A3またはBoNT/A4)に由来する場合がある。これは、改変クロストリジウム神経毒が上記のようにBoNT/A L鎖および/またはHNドメインを含む場合に好ましい。
【0176】
あるいは、改変クロストリジウム神経毒は、そのHCCドメインが、本明細書に記載されるように改変されたBoNT/A HCCドメインと置き換えられている、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/XまたはTeNT HCドメインを含み得る。これは、改変クロストリジウム神経毒が、上記のようにBoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、or TeNT L鎖および/またはHNドメインを含む場合に好ましい。
【0177】
本発明はまた、非天然プロテアーゼ切断部位を有するクロストリジウム神経毒を包含する。このようなクロストリジウム神経毒では、天然プロテアーゼ切断部位(上記のように活性化部位としても同様に知られる)は、クロストリジウム神経毒にとって天然ではないプロテアーゼ切断部位(すなわち、外因性切断部位)を用いて改変されるか、または置き換えられる。このような部位は、切断のために外因性プロテアーゼを必要とし、これによって、切断事象のタイミングおよび位置を上回る改善された制御が可能となる。クロストリジウム神経毒において使用され得る非天然プロテアーゼ切断部位として、以下が挙げられる:
TEV(タバコエッチウイルス) (ENLYFQ↓G)(配列番号122)
トロンビン (LVPR↓GS)(配列番号123)
PreScission (LEVLFQ↓GP)(配列番号124)
エンテロキナーゼ (DDDDK↓、配列番号125)
第Xa因子 (IEGR↓/IDGR↓、配列番号126および127)
TEV(タバコエッチウイルス) (ENLYFQ↓G)(配列番号122)
トロンビン (LVPR↓GS)(配列番号123)
PreScission (LEVLFQ↓GP)(配列番号124)
エンテロキナーゼ (DDDDK↓、配列番号125)
第Xa因子 (IEGR↓/IDGR↓、配列番号126および127)
【0178】
さらなるプロテアーゼ切断部位として、非細胞傷害性プロテアーゼによって、例えば、クロストリジウム神経毒の軽鎖によって切断される認識配列が挙げられる。これらとして、非細胞傷害性プロテアーゼ、例えば、クロストリジウム神経毒の軽鎖によって切断されるSNARE(例えば、SNAP-25、シンタキシン、VAMP)タンパク質認識配列が挙げられる。非天然プロテアーゼ切断部位を含むクロストリジウム神経毒は、US7,132,259、EP1206554-B2およびUS2007/0166332に記載されており、そのすべては、その全文で参照により本明細書に組み込まれる。また、自己切断性配列であるインテインもプロテアーゼ切断部位という用語によって包含される。自己スプライシング反応は、例えば、存在する還元剤の濃度を変更することによって制御可能である。
【0179】
あるいは/さらに、改変クロストリジウム神経毒は、WO2020/065336 A1に記載されるような(外因性)活性化ループを含み得る。
【0180】
本発明はまた、「破壊性切断部位」を含むクロストリジウム神経毒も包含する。前記クロストリジウム神経毒では、非天然プロテアーゼ切断部位は、クロストリジウム神経毒中に、前記部位での切断が、クロストリジウム神経毒の活性を低下させる、または不活性化するように選択された位置で組み込まれる。破壊性プロテアーゼ切断部位は、クロストリジウム神経毒が、投与後に、非標的位置に移動する事象において局所プロテアーゼによる切断を受けやすい可能性がある。適した非天然プロテアーゼ切断部位として、上記のものが挙げられる。破壊性切断部位を含むクロストリジウム神経毒は、WO2010/094905およびWO2002/044199に記載されており、それらの両方とも、その全文で参照により本明細書に組み込まれる。
【0181】
本発明の改変クロストリジウム神経毒、特に、その軽鎖構成成分は、PEG化され得る-これは、軽鎖構成成分の安定性、例えば、作用の持続期間を増大するのに役立ち得る。ペグ化は、軽鎖がBoNT/A、BまたはC1プロテアーゼを含む場合に特に好ましい。ペグ化は、好ましくは、軽鎖構成成分のN末端へのPEGの付加を含む。例として、軽鎖のN末端が、同一である場合も、異なっている場合もある1個以上のアミノ酸(例えば、システイン)残基を用いて伸長され得る。前記アミノ酸残基のうち1個以上は、それに付着された(例えば、共有結合によって付着された)その自身のPEG分子を有し得る。この技術の例は、その全文で参照により本明細書に組み込まれるWO2007/104567に記載されている。
【0182】
本発明の改変クロストリジウム神経毒は、医薬または化粧品において有用性を適宜見出す。使用において、改変クロストリジウム神経毒は、好ましくは、二本鎖形態である。したがって、一態様では、本発明は、医薬における使用のために、本発明に従う改変クロストリジウム神経毒または本発明に従う二本鎖改変クロストリジウム神経毒を提供する。同様に、本発明は、本発明の改変クロストリジウム神経毒または二本鎖改変クロストリジウム神経毒をそれを必要とする対象に投与することを含む処置の方法に向けられる。
【0183】
「対象」とは、本明細書で使用される場合、哺乳動物、例えば、ヒトまたは他の哺乳動物であり得る。好ましくは、「対象」とは、ヒト対象を意味する。
【0184】
「障害」という用語はまた、本明細書で使用される場合、「疾患」包含する。一実施形態では、障害は疾患である。
【0185】
「処置する」または「処置」という用語は、本明細書で使用される場合、予防的処置(例えば、障害の発症を妨げるため)ならびに矯正処置(障害をすでに患っている対象の処置)を包含する。好ましくは、「処置する」または「処置」とは、本明細書で使用される場合、矯正処置を意味する。「処置する」または「処置」という用語は、本明細書で使用される場合、障害および/またはその症状を指す。
【0186】
したがって、本発明のポリペプチドは、治療上有効量または予防上有効量で対象に投与され得る。好ましくは、本発明の改変クロストリジウム神経毒は、治療上有効量で対象に投与される。
【0187】
「治療上有効量」とは、前記障害(またはその症状)を処置するために対象に単独または組み合わせて投与される場合に、障害またはその症状のこのような処置を達成するのに十分である改変クロストリジウム神経毒の任意の量である。
【0188】
「予防上有効量」とは、対象に単独または組み合わせて投与される場合に、障害(またはその症状)の発症または再発を阻害または遅延する改変クロストリジウム神経毒の任意の量である。一部の実施形態では、予防上有効量は、障害の発症または再発を完全に妨げる。発症を「阻害すること」とは、障害の発症(またはその症状)の可能性を減少させる、または発症を完全に妨げることのいずれかを意味する。
【0189】
本発明の改変クロストリジウム神経毒の投与のための投与量範囲は、所望の治療、美容または予防効果をもたらすものである。必要な投与量範囲は、改変クロストリジウム神経毒または組成物の正確な性質、投与経路、製剤の性質、患者の年齢、患者の状態の性質、程度または重症度、あるとすれば禁忌症、および主治医の判断に応じて変わるということは認められよう。これらの投与量レベルの変動は、最適化のための標準の経験的なルーチンを使用して調整され得る。
【0190】
適した1日投与量(患者の体重1kgあたり)は、範囲0.0001～1ng/kg、好ましくは、0.0001～0.5ng/kg、より好ましくは、0.002～0.5ng/kg、特に好ましくは、0.004～0.5ng/kgにある。単位投与量は、1ピコグラム未満～30ngで変わり得るが、通常、用量あたり0.01～1ngの領域中となり、これは、毎日、または好ましくは、より少ない頻度で、例えば、毎週または毎月投与され得る。
【0191】
特に好ましい投薬レジメンは、1×用量としての0.05ngの改変クロストリジウム神経毒に基づいている。これに関連して、好ましい投与量は、範囲1×～100×(すなわち、0.05～5ng)中にある。
【0192】
一態様では、本発明は、以下から選択された障害の処置において使用するための上記のような改変クロストリジウム神経毒または二本鎖改変クロストリジウム神経毒を提供する:望まれない免疫分泌と関連する状態、斜視、眼瞼痙攣、内斜視、ジストニア(例えば、痙攣性ジストニア、顎口腔ジストニア、局所性ジストニア、遅発性ジストニア、喉頭ジストニア、四肢ジストニア、頸部ジストニア)、斜頸(例えば、痙性斜頚)、細胞/筋肉無能力化(SNARE下方制御または不活性化による)から恩恵を受ける美容療法(美容)適用、眼性運動性の神経筋障害または状態(例えば、随伴性(concomitant)斜視、上下斜視、外直筋麻痺、眼振、甲状腺異常筋疾患)、書痙、歯ぎしり、ウィルソン病、振戦、チック、分節性ミオクローヌス、攣縮、慢性多発性硬化症による痙縮、異常な膀胱制御をもたらす痙縮、アニムス、背部痙攣、こむら返り、緊張性頭痛、骨盤挙筋症候群、二分脊椎症、遅発性ジスキネジア、パーキンソン病、吃音、片側顔面痙攣、眼瞼障害、脳性麻痺、局所性痙縮、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、四肢痙縮、裂肛、アカラシア、嚥下障害、流涙、多汗症(hyperhydrosis)、過度の唾液分泌、過度の胃腸管分泌、筋肉痛(例えば、筋肉攣縮からの疼痛)、頭痛の疼痛(例えば、緊張性頭痛)、しわのよった額、皮膚のしわ、癌、子宮障害、泌尿生殖器障害、泌尿生殖器-神経疾患、慢性神経原性炎症および平滑筋障害。
【0193】
関連態様では、本発明は、障害を処置する方法であって、上記のような改変クロストリジウム神経毒または二本鎖改変クロストリジウム神経毒を対象に投与することを含む、方法を提供し、障害は、以下から選択される:望まれない免疫分泌と関連する状態、斜視、眼瞼痙攣、内斜視、ジストニア(例えば、痙攣性ジストニア、顎口腔ジストニア、局所性ジストニア、遅発性ジストニア、喉頭ジストニア、四肢ジストニア、頸部ジストニア)、斜頸(例えば、痙性斜頚)、細胞/筋肉無能力化(SNARE下方制御または不活性化による)から恩恵を受ける美容療法(美容)適用、眼性運動性の神経筋障害または状態(例えば、随伴性(concomitant)斜視、上下斜視、外直筋麻痺、眼振、甲状腺異常筋疾患)、書痙、歯ぎしり、ウィルソン病、振戦、チック、分節性ミオクローヌス、攣縮、慢性多発性硬化症による痙縮、異常な膀胱制御をもたらす痙縮、アニムス、背部痙攣、こむら返り、緊張性頭痛、骨盤挙筋症候群、二分脊椎症、遅発性ジスキネジア、パーキンソン病、吃音、片側顔面痙攣、眼瞼障害、脳性麻痺、局所性痙縮、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、四肢痙縮、裂肛、アカラシア、嚥下障害、流涙、多汗症(hyperhydrosis)、過度の唾液分泌、過度の胃腸管分泌、筋肉痛(例えば、筋肉攣縮からの疼痛)、頭痛の疼痛(例えば、緊張性頭痛)、しわのよった額、皮膚のしわ、癌、子宮障害、泌尿生殖器障害、泌尿生殖器-神経疾患、慢性神経原性炎症および平滑筋障害。
【0194】
関連態様では、本発明は、以下から選択される障害を処置するための医薬の製造における上記のような改変クロストリジウム神経毒または二本鎖改変クロストリジウム神経毒の使用を提供する:望まれない免疫分泌と関連する状態、斜視、眼瞼痙攣、内斜視、ジストニア(例えば、痙攣性ジストニア、顎口腔ジストニア、局所性ジストニア、遅発性ジストニア、喉頭ジストニア、四肢ジストニア、頸部ジストニア)、斜頸(例えば、痙性斜頚)、細胞/筋肉無能力化(SNARE下方制御または不活性化による)から恩恵を受ける美容療法(美容)適用、眼性運動性の神経筋障害または状態(例えば、随伴性(concomitant)斜視、上下斜視、外直筋麻痺、眼振、甲状腺異常筋疾患)、書痙、歯ぎしり、ウィルソン病、振戦、チック、分節性ミオクローヌス、攣縮、慢性多発性硬化症による痙縮、異常な膀胱制御をもたらす痙縮、アニムス、背部痙攣、こむら返り、緊張性頭痛、骨盤挙筋症候群、二分脊椎症、遅発性ジスキネジア、パーキンソン病、吃音、片側顔面痙攣、眼瞼障害、脳性麻痺、局所性痙縮、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、四肢痙縮、裂肛、アカラシア、嚥下障害、流涙、多汗症(hyperhydrosis)、過度の唾液分泌、過度の胃腸管分泌、筋肉痛(例えば、筋肉攣縮からの疼痛)、頭痛の疼痛(例えば、緊張性頭痛)、しわのよった額、皮膚のしわ、癌、子宮障害、泌尿生殖器障害、泌尿生殖器-神経疾患、慢性神経原性炎症および平滑筋障害。
【0195】
一態様では、本発明は、美容的処置の方法であって、本発明に従う改変クロストリジウム神経毒または二本鎖改変クロストリジウム神経毒を対象に投与することを含む、方法を提供する。方法は、細胞/筋肉無能力化(SNARE下方制御または不活性化による)から恩恵を受ける美容療法適用に向けられ得る。前記美容的処置は、以下を処置できる:顔の線、眉間線、眉間のしわ、皮膚のしわ、くも膜下腔内線、額の線、「バニー」ライン、笑顔の凸凹、顎の凸凹、広頸帯、「マリオネット」ライン、唇の線、目尻のしわ、眉の凸凹、しかめっ面の線、心配の線、皮膚線条、創傷、アクシデント、咬傷、手術ならびに/または眼、頬、鼻、唇、額および/もしくは首のような領域の輪郭の欠損。
【0196】
一態様では、本発明は、本発明の改変クロストリジウム神経毒または二本鎖改変クロストリジウム神経毒並びに薬学的に許容される担体、賦形剤、アジュバント、噴射剤および/または塩を含む医薬組成物を提供する。改変クロストリジウム神経毒は、本明細書に記載される治療的または美容的適用において利用される場合に医薬組成物の一部であり得る。
【0197】
本発明の改変クロストリジウム神経毒は、経口、非経口、連続注入、吸入または局所適用のために製剤化され得る。注射に適した組成物は、溶液、懸濁液もしくはエマルジョンまたは使用前に適したビヒクル中に溶解または懸濁される乾燥粉末の形態であり得る。
【0198】
局所に送達されるべき改変クロストリジウム神経毒の場合には、改変クロストリジウム神経毒は、クリーム(例えば、局所適用用)として、または皮下注射のために製剤化され得る。
【0199】
局所送達手段として、エアロゾルまたは他のスプレー(例えば、ネブライザー)を挙げることができる。これに関連して、改変クロストリジウム神経毒のエアロゾル製剤は、肺および/または他の鼻腔および/または気管支もしくは気道への送達を可能にする。
【0200】
本発明の改変クロストリジウム神経毒は、影響を受けた臓器の神経支配に関与する脊髄分節のレベルで脊柱中に、くも膜下腔内または硬膜外注射によって患者に投与され得る。
【0201】
好ましい投与経路は、腹腔鏡下(laproscopic)および/または限局化、特に、筋肉内注射によってである。
【0202】
流体投与形は、通常、改変クロストリジウム神経毒および発熱物質不含滅菌ビヒクルを使用して調製される。改変クロストリジウム神経毒は、使用されるビヒクルおよび濃度に応じて、ビヒクルに溶解または懸濁され得る。溶液の調製では、改変クロストリジウム神経毒は、ビヒクルに溶解され、溶液は、必要な場合には、塩化ナトリウムの添加によって等張性にされ、無菌技術を使用して滅菌フィルターを通して濾過することによって滅菌され、その後、適した滅菌バイアルまたはアンプル中に充填され、密閉され得る。あるいは、溶液安定性が適切である場合には、その密閉容器中の溶液は、オートクレーブ処理によって滅菌され得る。有利なことに、添加物、例えば、緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、保存料または殺菌剤、懸濁剤または乳化剤およびまたは局所麻酔剤が、ビヒクル中に溶解され得る。
【0203】
使用前に適したビヒクル中に溶解または懸濁される乾燥粉末は、予め滅菌した成分を、滅菌区域において無菌技術を使用して滅菌容器中に充填することによって調製され得る。あるいは、成分が、滅菌区域において無菌技術を使用して適した容器中に溶解され得る。次いで、製品は凍結乾燥され、容器は無菌的に密閉される。
【0204】
筋肉内、皮下または皮内注射に適した非経口懸濁液は、滅菌構成成分が、溶解される代わりに滅菌ビヒクルに懸濁され、滅菌が濾過によって達成され得ない点を除いて実質的に同じ方法で調製される。構成成分は、滅菌状態で単離され得るか、あるいは、単離後に、例えば、ガンマ照射によって滅菌される場合もある。
【0205】
有利なことに、構成成分の均一分布を促進するために、組成物(複数可)中に懸濁剤、例えば、ポリビニルピロリドンが含まれる。
【0206】
本発明に従う投与は、微粒子カプセル封入、ウイルス送達系または高圧エアロゾル衝突を含む種々の送達技術を利用できる。
【0207】
本発明はまた、酸化に対して耐性を示すクロストリジウム神経毒を選択するためのスクリーニング法を提供する。したがって、一態様では、以下を含む、酸化耐性クロストリジウム神経毒を選択する方法が提供される:
(a)クロストリジウム神経毒重鎖またはその部分の酸化可能アミノ酸残基を同定すること、
(b)前記酸化可能アミノ酸残基が改変されている改変クロストリジウム神経毒を生成すること、
(c)改変クロストリジウム神経毒を酸化条件に付すこと、
(d)改変クロストリジウム神経毒の活性レベルを決定すること、
(e)ステップ(d)において決定された活性レベルを、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒の活性レベルと比較し、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒が酸化条件に付されていること、ならびに
(f)活性レベルが、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒の活性レベルよりもより高い場合に、改変クロストリジウム神経毒を選択すること、または
(g)活性レベルが、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒の活性レベルと同一またはそれより低い場合に、改変クロストリジウム神経毒を破棄/選択しないこと。
(a)クロストリジウム神経毒重鎖またはその部分の酸化可能アミノ酸残基を同定すること、
(b)前記酸化可能アミノ酸残基が改変されている改変クロストリジウム神経毒を生成すること、
(c)改変クロストリジウム神経毒を酸化条件に付すこと、
(d)改変クロストリジウム神経毒の活性レベルを決定すること、
(e)ステップ(d)において決定された活性レベルを、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒の活性レベルと比較し、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒が酸化条件に付されていること、ならびに
(f)活性レベルが、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒の活性レベルよりもより高い場合に、改変クロストリジウム神経毒を選択すること、または
(g)活性レベルが、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒の活性レベルと同一またはそれより低い場合に、改変クロストリジウム神経毒を破棄/選択しないこと。
【0208】
クロストリジウム神経毒重鎖の部分は、転位置ドメイン(HNドメイン)またはその一部分または受容体結合ドメイン(HCドメイン)またはその一部分を含み得る(好ましくは、それからなり得る)。受容体結合ドメインの一部分は、転位置促進ドメイン(HCNドメイン)またはHCドメイン(HCCドメイン)のC末端部分、好ましくは、HCCドメインを含み得る(好ましくは、それからなり得る)。
【0209】
方法のステップ(a)は、重鎖またはその部分中に存在する1つ以上のアミノ酸の性質および酸化に対するその感受性を分析することによってコンピュータで実施され得る。このような分析は、1個以上のアミノ酸の表面露出の程度を決定することを含み得る。酸化に対して感受性であるアミノ酸として、メチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンを挙げることができる。したがって、メチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンのうち1種以上が、酸化可能アミノ酸として方法のステップ(a)において同定され得る。
【0210】
改変は、適宜、本明細書に記載される任意の改変、例えば、置換、挿入、欠失または挿入欠失、好ましくは、置換である。好ましくは、改変は、同定されたアミノ酸よりも酸化に対してより耐性であるアミノ酸との置換である。改変は、バリン、ロイシン、グリシン、スレオニン、アラニン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリンまたはプロリンとの置換であり得る。一実施形態では、改変は、バリン、ロイシンまたはグリシンとの置換であり得る。好ましくは、バリンまたはロイシンとの置換。あるいは、改変は、非天然または非標準アミノ酸、例えば、ノルロイシン、イソバリン、α-メチルバリン、シクロロイシンまたはアロスレオニンとの置換であり得る。
【0211】
本発明はまた、本発明の方法によって選択される改変クロストリジウム神経毒を提供し、好ましくは、改変クロストリジウム神経毒が、酸化耐性である(例えば、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒よりも耐性である)。
【0212】
当業者ならば、酸化耐性クロストリジウム神経毒を選択する方法は、本明細書に記載される任意のクロストリジウム神経毒を利用できるということは理解するであろう。例えば、クロストリジウム神経毒は、BoNT/A(例えば、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4、BoNT/A5、BoNT/A6、BoNT/A7またはBoNT/A8)、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/XおよびTeNTから選択されるボツリヌス神経毒またはテタヌス神経毒であり得る。例えば、前記方法において利用されるクロストリジウム神経毒は、配列番号2、11、20、29、38、46、54または128～135のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。一実施形態では、前記方法において利用されるクロストリジウム神経毒は、配列番号2、11、20、29、38、46、54または128～135のいずれか1つに対して少なくとも80%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、前記方法において利用されるクロストリジウム神経毒は、配列番号2、11、20、29、38、46、54または128～135のいずれか1つを含む(より好ましくは、それからなる)。
【0213】
前記酸化可能アミノ酸残基が改変されている改変クロストリジウム神経毒は、当技術分野で公知の任意の技術を使用して生成できる。例えば、上記のように、(未改変)クロストリジウム神経毒をコードする核酸を、標準の分子クローニング技術を使用して、例えば、位置指定突然変異誘発によって改変することができる。あるいは、改変遺伝子配列を化学合成できる。一実施形態では、改変クロストリジウム神経毒は、以下を含む方法によって生成される:
(i)クロストリジウム神経毒をコードする第1の核酸を提供することおよび第1の核酸を改変して、ステップ(a)において同定された酸化可能アミノ酸に改変を導入し、それによって、第2の核酸を生成し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大すること、または
(ii)ステップ(a)において同定された酸化可能アミノ酸に改変を含む改変クロストリジウム神経毒をコードする核酸を合成し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大し、それによって、合成された核酸を提供すること、ならびに
(iii)それぞれ、第2の核酸または合成された核酸を発現させ、それによって、改変クロストリジウム神経毒を生成すること、
(iv)改変クロストリジウム神経毒を単離すること、ならびに
(v)(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を軽鎖および重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で切断するプロテアーゼと接触させることによって、改変クロストリジウム神経毒を活性化し、それによって、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換し、軽鎖および重鎖がジスルフィド結合によって一緒に繋げられること。
(i)クロストリジウム神経毒をコードする第1の核酸を提供することおよび第1の核酸を改変して、ステップ(a)において同定された酸化可能アミノ酸に改変を導入し、それによって、第2の核酸を生成し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大すること、または
(ii)ステップ(a)において同定された酸化可能アミノ酸に改変を含む改変クロストリジウム神経毒をコードする核酸を合成し、改変が、改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒と比較した場合に改変クロストリジウム神経毒の酸化耐性を増大し、それによって、合成された核酸を提供すること、ならびに
(iii)それぞれ、第2の核酸または合成された核酸を発現させ、それによって、改変クロストリジウム神経毒を生成すること、
(iv)改変クロストリジウム神経毒を単離すること、ならびに
(v)(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を軽鎖および重鎖の間に位置する認識部位(切断部位)で切断するプロテアーゼと接触させることによって、改変クロストリジウム神経毒を活性化し、それによって、(単鎖)改変クロストリジウム神経毒を二本鎖改変クロストリジウム神経毒に変換し、軽鎖および重鎖がジスルフィド結合によって一緒に繋げられること。
【0214】
スクリーニング法を実施する場合に、例えば、本実施例(「強制酸化研究」を参照されたい)に記載されるように、クロストリジウム神経毒が強制酸化条件に付されることが好ましい。それにもかかわらず、改変クロストリジウム神経毒および改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒が、比較性を確実にするために同一条件下で同一の酸化技術に付される限り、利用される特定の酸化技術は必須ではない。
【0215】
任意の適した活性アッセイ、例えば、本明細書に記載されるDASアッセイを使用して、クロストリジウム神経毒活性を定量化できる。しかし、本実施例に記載されるように細胞ベースの活性アッセイが実施されることが好ましい。それにもかかわらず、比較性を確実にするために同一条件下で同一アッセイを使用して改変クロストリジウム神経毒および改変を欠く点以外は同一のクロストリジウム神経毒の活性が決定される限り、利用される特定のアッセイは必須ではない。
【0216】
「活性レベルがより高い」という用語は、酸化耐性クロストリジウム神経毒を選択する方法の文脈において使用される場合、活性レベルが統計的に有意により高いことを意味する。
【0217】
「活性レベルが同じである」という用語は、酸化耐性クロストリジウム神経毒を選択する方法の文脈において使用される場合、活性レベルが統計的に有意に異ならないまたは同一であることを意味する。
【0218】
「活性レベルがより低い」という用語は、酸化耐性クロストリジウム神経毒を選択する方法の文脈において使用される場合、活性レベルが統計的に有意により低いことを意味する。
【0219】
統計的有意性は、一元ANOVAなどの任意の適した技術を使用して決定できる。
【0220】
一実施形態では、最初のメチオニンアミノ酸残基または対応する最初のコドンが、本明細書において以下の配列番号のいずれかに示される場合には、前記残基/コドンは任意選択である。
【0221】
本発明の種々の改変クロストリジウム神経毒と関連する実施形態は、本発明の核酸、方法、使用または医薬組成物に等しく適用されることが意図され、逆もまた同様である。
【0222】
配列相同性
【0223】
限定するものではないが、グローバル法、ローカル法およびハイブリッド法、例えば、セグメントアプローチ法などを含む種々の配列アライメント法のいずれも、同一性パーセントを決定するために使用され得る。同一性パーセントを決定するためのプロトコールは、当業者の範囲内の常法である。グローバル法は、分子の開始から最後まで配列をアラインし、個々の残基対のスコアを合計することによって、およびギャップペナルティーを課すことによって最良アライメントを決定する。限定されない方法として、例えば、CLUSTAL W、例えば、Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)を参照されたい、および反復改良、例えば、Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996)を参照されたい、が挙げられる。ローカル法は、インプット配列のすべてによって共有される1以上の保存されたモチーフを同定することによって配列をアラインする。限定されない方法として、例えば、Match-box、例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)を参照されたい、Gibbsサンプリング、例えば、C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131 ) Science 208-214 (1993)を参照されたい、Align-M、例えば、Ivo Van WaIIe et al., Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)を参照されたい、が挙げられる。
【0224】
したがって、配列同一性パーセントは、従来法によって決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992を参照されたい。手短には、2つのアミノ酸配列が、10のギャップ開始ペナルティー、1のギャップ伸長ペナルティーおよび以下に示されるようなHenikoff and Henikoff(同書)の「blosum 62」スコアリングマトリックス(アミノ酸は標準一文字コードによって示される)を使用してアライメントスコアを最適化するようにアラインされ、好ましくは、この方法を使用して、配列を配列番号2とアラインして、本明細書に記載されるようなアミノ酸位置番号付けを定義する。
【0225】
2つ以上の核酸またはアミノ酸配列間の「配列同一性パーセント」は、配列によって共有される同一位置数の関数である。したがって、同一性%は、ヌクレオチド/アミノ酸の総数によって除され、100が乗じられた同一ヌクレオチド/アミノ酸数として算出され得る。配列同一性%の算出はまた、2つ以上の配列のアライメントを最適化するために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さも考慮する場合がある。2つ以上の配列間の配列比較および同一性パーセントの決定は、当業者が精通するであろう特定の数学的アルゴリズム、例えば、BLASTを使用して実施され得る。
【0226】
【数1】
【0227】
次いで、同一性パーセントは、以下として算出される:
[同定されたマッチの総数×100] / [長い方の配列の長さおよび2つの配列をアラインするために長い方の配列中に導入されたギャップの数]
実質的に相同なポリペプチドは、1つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有すると特性決定される。これらの変化は、好ましくは、保存的アミノ酸置換(以下を参照されたい)およびポリペプチドのフォールディングもしくは活性に有意に影響を及ぼさない他の置換、通常1個～約30個のアミノ酸の小さい欠失、および小さいアミノ-もしくはカルボキシル-末端伸長、例えば、アミノ末端メチオニン残基、最大約20～25残基の小さいリンカーペプチドまたは親和性タグである小さい性質のものである。
[同定されたマッチの総数×100] / [長い方の配列の長さおよび2つの配列をアラインするために長い方の配列中に導入されたギャップの数]
実質的に相同なポリペプチドは、1つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有すると特性決定される。これらの変化は、好ましくは、保存的アミノ酸置換(以下を参照されたい)およびポリペプチドのフォールディングもしくは活性に有意に影響を及ぼさない他の置換、通常1個～約30個のアミノ酸の小さい欠失、および小さいアミノ-もしくはカルボキシル-末端伸長、例えば、アミノ末端メチオニン残基、最大約20～25残基の小さいリンカーペプチドまたは親和性タグである小さい性質のものである。
【0228】
保存的アミノ酸置換
塩基性:
アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性:
グルタミン酸
アスパラギン酸
極性:
グルタミン
アスパラギン
疎水性:
ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族:
フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小さい:
グリシン
アラニン
セリン
スレオニン
メチオニン
塩基性:
アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性:
グルタミン酸
アスパラギン酸
極性:
グルタミン
アスパラギン
疎水性:
ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族:
フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小さい:
グリシン
アラニン
セリン
スレオニン
メチオニン
【0229】
20個の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸(例えば、4-ヒドロキシプロリン、6-N-メチルリジン、2-アミノイソ酪酸、イソバリンおよびα-メチルセリン)が、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基と置換され得る。限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によってコードされないアミノ酸および非天然アミノ酸が、ポリペプチドアミノ酸残基と置換され得る。本発明のポリペプチドはまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含み得る。
【0230】
天然に存在しないアミノ酸として、限定するものではないが、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノ-プロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシ-プロリン、N-メチルグリシン、アロ-スレオニン、メチル-スレオニン、ヒドロキシ-エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ-システイン、ニトロ-グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、t-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニル-アラニン、4-アザフェニル-アラニンおよび4-フルオロフェニルアラニンが挙げられる。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に組み込むためのいくつかの方法が、当技術分野で公知である。例えば、ナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを使用して抑制されるin vitro系が、使用され得る。アミノ酸を合成し、tRNAをアミノアシル化する方法は、当技術分野で公知である。ナンセンス突然変異を含有するプラスミドの転写および翻訳は、大腸菌(E.coli)S30抽出物および市販の酵素および他の試薬を含む無細胞系において実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーによって精製される。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991、Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991、Chung et al., Science 259:806-9, 1993および Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993)を参照のこと。第2の方法では、翻訳は、突然変異されたmRNAおよび化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションによってアフリカツメガエル卵母細胞において実施される(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996)。第3の方法内で、大腸菌(E.coli)細胞は、置き換えられるべき天然アミノ酸(例えば、フェニルアラニン)の不在下および所望の天然に存在しないアミノ酸(複数可)(例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニンまたは4-フルオロフェニルアラニン)の存在下で培養される。天然に存在しないアミノ酸は、その天然の対応物の代わりにポリペプチド中に組み込まれる。Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994を参照されたい。天然に存在するアミノ酸残基は、in vitro化学修飾によって天然に存在しない種に変換され得る。置換の範囲をさらに拡大するために、化学修飾が部位特異的突然変異誘発と組み合わされることもある(Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993)。
【0231】
限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によってコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸および非天然アミノ酸が、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基と置換され得る。
【0232】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、当技術分野で公知の手順、例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発に従って同定され得る(Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989)。推定接触部位アミノ酸の突然変異とともに、生物学的相互作用の部位も、核磁気共鳴、結晶学、電子回折または光親和性標識のような技術によって決定されるような構造の物理的分析によって決定され得る。例えば、de Vos et al., Science 255:306-12, 1992、Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992、Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992を参照されたい。必須アミノ酸の同一性はまた、本発明のポリペプチドの関連構成成分(例えば、転位置またはプロテアーゼ構成成分)との相同性の分析から推論され得る。
【0233】
突然変異誘発およびスクリーニングの公知の方法、例えば、Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988)またはBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)によって開示されるものを使用して、複数のアミノ酸置換を行い、試験できる。手短には、これらの著者は、ポリペプチド中の2つ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドを選択し、次いで、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定して、各位置で許容可能な置換の範囲を決定する方法を開示している。使用できる他の方法として、ファージディスプレイ(例えば、Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991、Ladner et al., 米国特許第5,223,409号、Huse, WIPO公開WO 92/06204)および領域によって指示される突然変異誘発(Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986、Ner et al., DNA 7:127, 1988)が挙げられる。
【0234】
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)およびHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)は、当業者に、本開示において使用される用語の多くの一般的な辞書を提供する。
【0235】
本開示は、本明細書において開示される例示的方法および材料によって限定されず、本明細書において記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料が、本開示の実施形態の実施または試験において使用され得る。数値範囲には、範囲を定義する数値が含まれる。特に断りのない限り、それぞれ、任意の核酸配列が、5'から3'配向で左から右に書かれ、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ配向で左から右に書かれる。
【0236】
本明細書において提供された見出しは、本開示の種々の態様または実施形態の制限ではない。
【0237】
アミノ酸は、アミノ酸の名称、三文字略語または一文字略語を使用して本明細書において参照される。「タンパク質」という用語は、本明細書において使用される場合、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを含む。本明細書において使用される場合、「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語および/または「タンパク質」という用語と同義である。一部の例では、「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義である。一部の例では、「アミノ酸配列」という用語は、「酵素」という用語と同義である。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において同義的に使用される。本開示および特許請求の範囲では、従来のアミノ酸残基の一文字および三文字コードが使用され得る。生化学的命名法に関するIUPACIUB合同委員会(JCBN)に準拠して定義されたアミノ酸の3文字コード。また、ポリペプチドは、遺伝暗号の縮重のために1つより多いヌクレオチド配列によってコードされ得るということも理解される。
【0238】
用語の他の定義が、本明細書を通して現れる場合もある。例示的実施形態がより詳細に記載される前に、本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして変わり得るということは理解されるべきである。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ定義されるので、本明細書において使用される技術用語は、単に特定の実施形態を説明するためであって、限定であることを意図しないということも理解されるべきである。
【0239】
値の範囲が提供される場合には、その範囲の上限と下限との間の、文脈が明確に別段の指示をしない限り下限の単位の10分の1までの各介在値もまた、具体的に開示されることは理解される。任意の記載された値または記載された範囲内の介在値と、その記載された範囲内の他の記載された値または介在する値との間のそれぞれのより小さい範囲は、本開示内に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立に、範囲に含まれる場合も、除外される場合もあり、両限界の一方がより小さい範囲に含まれる、両方が含まれない、または両方が含まれる場合の各範囲も、本開示内に包含され、記載された範囲中の任意の具体的に除外された限界次第である。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合には、それらの含まれる限界の一方または両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
【0240】
本明細書において、および添付の特許請求の範囲においてで使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈が明確に別に示さない限り複数の言及を含むということは注記されなければならない。したがって、例えば、「クロストリジウム神経毒」への言及は、複数のこのような候補物質を含み、「クロストリジウム神経毒」への言及は、1つ以上のクロストリジウム神経毒および当業者に公知のその等価物などへの言及を含む。
【0241】
「含む(comprises)」または「含んでいる(comprising)」という用語が本明細書において使用される場合には、一実施形態では、前記用語を、「本質的にからなる(consists essentially of)」または「本質的にからなっている(consisting essentially of)」によって置き換えることができる。別の実施形態では、前記用語を、「からなる(consists of)」または「からなっている(consisting of)」によって置き換えることができる。
【0242】
本明細書において論じられた刊行物は、単に本出願の出願日より前のその開示のために提供されている。本明細書のいかなるものも、そのような刊行物が本明細書に添付された特許請求の範囲の先行技術を構成することを認めるものと解釈されるべきではない。
【0243】
本発明の実施形態を、以下の図および実施例を参照してここで単に例として記載する。
【図面の簡単な説明】
【0244】
【0245】
配列表
【0246】
配列番号1 - (BoNT/A1核酸配列)
配列番号2 - (BoNT/A1ポリペプチド配列)
配列番号3 - (改変BoNT/A1(M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号4 - (改変BoNT/A1(M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号5 - (改変BoNT/A1(M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号6 - (改変BoNT/A1(M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号7 - (改変BoNT/A1(M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号8 - (改変BoNT/A1(M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号9 - (改変BoNT/A1(M1144欠失)ポリペプチド配列)
配列番号10 - (BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K)核酸配列)
配列番号11 - (BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K)ポリペプチド配列)
配列番号12 - (改変BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号13 - (改変BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号14 - (改変BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号15 - (改変BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号16 - (改変BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号17 - (改変BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号18 - (改変BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号19 - (BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K)核酸配列)
配列番号20 - (BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K)ポリペプチド配列)
配列番号21 - (改変BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号22 - (改変BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号23 - (改変BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号24 - (改変BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号25 - (改変BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号26 - (改変BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号27 - (改変BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号28 - (BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K)核酸配列)
配列番号29 - (BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K)ポリペプチド配列)
配列番号30 - (改変BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号31 - (改変BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号32 - (改変BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号33 - (改変BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号34 - (改変BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号35 - (改変BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号36 - (改変BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号37 - (BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R)核酸配列)
配列番号38 - (BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R)ポリペプチド配列)
配列番号39 - (改変BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号40 - (改変BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号41 - (改変BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号42 - (改変BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号43 - (改変BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号44 - (改変BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号45 - (改変BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号46 - (BoNT/A3ポリペプチド配列)
配列番号47 - (改変BoNT/A3(M1140V)ポリペプチド配列)
配列番号48 - (改変BoNT/A3(M1140G)ポリペプチド配列)
配列番号49 - (改変BoNT/A3(M1140L)ポリペプチド配列)
配列番号50 - (改変BoNT/A3(M1140T)ポリペプチド配列)
配列番号51 - (改変BoNT/A3(M1140A)ポリペプチド配列)
配列番号52 - (改変BoNT/A3(M1140I)ポリペプチド配列)
配列番号53 - (改変BoNT/A3(M1140 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号54 - (BoNT/A4ポリペプチド配列)
配列番号55 - (改変BoNT/A4(M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号56 - (改変BoNT/A4(M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号57 - (改変BoNT/A4(M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号58 - (改変BoNT/A4(M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号59 - (改変BoNT/A4(M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号60 - (改変BoNT/A4(M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号61 - (改変BoNT/A4(M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号62 - (BoNT/A1 HCCドメインポリペプチド配列)
配列番号63 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号64 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号65 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号66 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号67 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号68 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号69 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号70 - (BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K)ポリペプチド配列)
配列番号71 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K、M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号72 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K、M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号73 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K、M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号74 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K、M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号75 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K、M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号76 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K、M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号77 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K、M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号78 - (BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R)ポリペプチド配列)
配列番号79 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144V)ポリペプチド
配列番号80 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号81 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号82 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号83 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号84 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号85 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号86 - (BoNT/A3 HCCドメインポリペプチド配列)
配列番号87 - (改変BoNT/A3 HCCドメイン(M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号88 - (改変BoNT/A3 HCCドメイン(M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号89 - (改変BoNT/A3 HCCドメイン(M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号90 - (改変BoNT/A3 HCCドメイン(M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号91 - (改変BoNT/A3 HCCドメイン(M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号92 - (改変BoNT/A3 HCCドメイン(M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号93 - (改変BoNT/A3 HCCドメイン(M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号94 - (BoNT/A4 HCCドメインポリペプチド配列)
配列番号95 - (改変BoNT/A4 HCCドメイン(M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号96 - (改変BoNT/A4 HCCドメイン(M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号97 - (改変BoNT/A4 HCCドメイン(M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号98 - (改変BoNT/A4 HCCドメイン(M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号99 - (改変BoNT/A4 HCCドメイン(M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号100 - (改変BoNT/A4 HCCドメイン(M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号101 - (改変BoNT/A4 HCCドメイン(M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号102 - (改変SV2結合ドメインコンセンサス配列1)
配列番号103 - (BoNT/A1Hall Str(参照)SV2結合ドメイン)
配列番号104 - (BoNT/A1CDC297 SV2結合ドメイン)
配列番号105 - (BoNT/A3 Loch Maree SV2結合ドメイン)
配列番号106 - (BoNT/A4 SV2結合ドメイン)
配列番号107 - (改変SV2結合ドメインコンセンサス配列2)
配列番号108 - (改変SV2結合ドメインコンセンサス配列3)
配列番号109 - (改変SV2結合ドメインコンセンサス配列4)
配列番号110 - (改変SV2結合ドメインコンセンサス配列5)
配列番号111 - (改変SV2結合ドメインコンセンサス配列6)
配列番号112 - (改変SV2結合ドメインA)
配列番号113 - (改変SV2結合ドメインB)
配列番号114 - (改変SV2結合ドメインC)
配列番号115 - (改変SV2結合ドメインD)
配列番号116 - (インフルエンザウイルス血球凝集素)
配列番号117 - (ロイシンベースのモチーフ1)
配列番号118 - (ロイシンベースのモチーフ2)
配列番号119 - (ロイシンベースのモチーフ3)
配列番号120 - (ロイシンベースのモチーフ4)
配列番号121 - (チロシンベースのモチーフ)
配列番号122 - (TEV切断部位)
配列番号123 - (トロンビン切断部位)
配列番号124 - (PreScission切断部位)
配列番号125 - (エンテロキナーゼ切断部位)
配列番号126 - (第Xa因子切断部位1)
配列番号127 - (第Xa因子切断部位2)
配列番号128 - (BoNT/B-UniProt P10844のポリペプチド配列)
配列番号129 - (BoNT/C-UniProt P18640のポリペプチド配列)
配列番号130 - (BoNT/D-UniProt P19321のポリペプチド配列)
配列番号131 - (BoNT/E-UniProt Q00496のポリペプチド配列)
配列番号132 - (BoNT/F-UniProt A7GBG3のポリペプチド配列)
配列番号133 - (BoNT/G-UniProt Q60393のポリペプチド配列)
配列番号134 - (TeNT-UniProt P04958のポリペプチド配列)
配列番号135 - (BoNT/Xのポリペプチド配列)
配列番号136 - (改変BoNT/A1(M1144V)核酸配列)
配列番号137 - (改変BoNT/A1(M1144G)核酸配列)
配列番号138 - (改変BoNT/A1(M1144L)核酸配列)
配列番号139 - (BoNT/A2-UniProt D3IV23のポリペプチド配列)
配列番号140 - (BoNT/A5 v.1-UniProt C7BEA8のポリペプチド配列)
配列番号141 - (BoNT/A5 v.2-UniProt C1IPK2のポリペプチド配列)
配列番号142 - (BoNT/A6-ACW83608.1、受託番号FJ981696のポリペプチド配列)
配列番号143 - (BoNT/A7-GenBank:AFV13854.1、受託番号JQ954969.1のポリペプチド配列)
配列番号144 - (BoNT/A8-GenBank:AJA05787.1、受託番号KM233166のポリペプチド配列)
配列番号2 - (BoNT/A1ポリペプチド配列)
配列番号3 - (改変BoNT/A1(M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号4 - (改変BoNT/A1(M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号5 - (改変BoNT/A1(M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号6 - (改変BoNT/A1(M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号7 - (改変BoNT/A1(M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号8 - (改変BoNT/A1(M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号9 - (改変BoNT/A1(M1144欠失)ポリペプチド配列)
配列番号10 - (BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K)核酸配列)
配列番号11 - (BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K)ポリペプチド配列)
配列番号12 - (改変BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号13 - (改変BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号14 - (改変BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号15 - (改変BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号16 - (改変BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号17 - (改変BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号18 - (改変BoNT/A1(N886K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号19 - (BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K)核酸配列)
配列番号20 - (BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K)ポリペプチド配列)
配列番号21 - (改変BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号22 - (改変BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号23 - (改変BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号24 - (改変BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号25 - (改変BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号26 - (改変BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号27 - (改変BoNT/A1(N954K、N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号28 - (BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K)核酸配列)
配列番号29 - (BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K)ポリペプチド配列)
配列番号30 - (改変BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号31 - (改変BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号32 - (改変BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号33 - (改変BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号34 - (改変BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号35 - (改変BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号36 - (改変BoNT/A1(N930K、S955K、Q991K、N1026K、N1052K、Q1229K、N1025K、M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号37 - (BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R)核酸配列)
配列番号38 - (BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R)ポリペプチド配列)
配列番号39 - (改変BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号40 - (改変BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号41 - (改変BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号42 - (改変BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号43 - (改変BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号44 - (改変BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号45 - (改変BoNT/A1(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号46 - (BoNT/A3ポリペプチド配列)
配列番号47 - (改変BoNT/A3(M1140V)ポリペプチド配列)
配列番号48 - (改変BoNT/A3(M1140G)ポリペプチド配列)
配列番号49 - (改変BoNT/A3(M1140L)ポリペプチド配列)
配列番号50 - (改変BoNT/A3(M1140T)ポリペプチド配列)
配列番号51 - (改変BoNT/A3(M1140A)ポリペプチド配列)
配列番号52 - (改変BoNT/A3(M1140I)ポリペプチド配列)
配列番号53 - (改変BoNT/A3(M1140 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号54 - (BoNT/A4ポリペプチド配列)
配列番号55 - (改変BoNT/A4(M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号56 - (改変BoNT/A4(M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号57 - (改変BoNT/A4(M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号58 - (改変BoNT/A4(M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号59 - (改変BoNT/A4(M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号60 - (改変BoNT/A4(M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号61 - (改変BoNT/A4(M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号62 - (BoNT/A1 HCCドメインポリペプチド配列)
配列番号63 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号64 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号65 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号66 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号67 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号68 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号69 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号70 - (BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K)ポリペプチド配列)
配列番号71 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K、M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号72 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K、M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号73 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K、M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号74 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K、M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号75 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K、M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号76 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K、M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号77 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(Q1229K、M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号78 - (BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R)ポリペプチド配列)
配列番号79 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144V)ポリペプチド
配列番号80 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号81 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号82 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号83 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号84 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号85 - (改変BoNT/A1 HCCドメイン(N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R、M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号86 - (BoNT/A3 HCCドメインポリペプチド配列)
配列番号87 - (改変BoNT/A3 HCCドメイン(M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号88 - (改変BoNT/A3 HCCドメイン(M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号89 - (改変BoNT/A3 HCCドメイン(M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号90 - (改変BoNT/A3 HCCドメイン(M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号91 - (改変BoNT/A3 HCCドメイン(M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号92 - (改変BoNT/A3 HCCドメイン(M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号93 - (改変BoNT/A3 HCCドメイン(M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号94 - (BoNT/A4 HCCドメインポリペプチド配列)
配列番号95 - (改変BoNT/A4 HCCドメイン(M1144V)ポリペプチド配列)
配列番号96 - (改変BoNT/A4 HCCドメイン(M1144G)ポリペプチド配列)
配列番号97 - (改変BoNT/A4 HCCドメイン(M1144L)ポリペプチド配列)
配列番号98 - (改変BoNT/A4 HCCドメイン(M1144T)ポリペプチド配列)
配列番号99 - (改変BoNT/A4 HCCドメイン(M1144A)ポリペプチド配列)
配列番号100 - (改変BoNT/A4 HCCドメイン(M1144I)ポリペプチド配列)
配列番号101 - (改変BoNT/A4 HCCドメイン(M1144 欠失)ポリペプチド配列)
配列番号102 - (改変SV2結合ドメインコンセンサス配列1)
配列番号103 - (BoNT/A1Hall Str(参照)SV2結合ドメイン)
配列番号104 - (BoNT/A1CDC297 SV2結合ドメイン)
配列番号105 - (BoNT/A3 Loch Maree SV2結合ドメイン)
配列番号106 - (BoNT/A4 SV2結合ドメイン)
配列番号107 - (改変SV2結合ドメインコンセンサス配列2)
配列番号108 - (改変SV2結合ドメインコンセンサス配列3)
配列番号109 - (改変SV2結合ドメインコンセンサス配列4)
配列番号110 - (改変SV2結合ドメインコンセンサス配列5)
配列番号111 - (改変SV2結合ドメインコンセンサス配列6)
配列番号112 - (改変SV2結合ドメインA)
配列番号113 - (改変SV2結合ドメインB)
配列番号114 - (改変SV2結合ドメインC)
配列番号115 - (改変SV2結合ドメインD)
配列番号116 - (インフルエンザウイルス血球凝集素)
配列番号117 - (ロイシンベースのモチーフ1)
配列番号118 - (ロイシンベースのモチーフ2)
配列番号119 - (ロイシンベースのモチーフ3)
配列番号120 - (ロイシンベースのモチーフ4)
配列番号121 - (チロシンベースのモチーフ)
配列番号122 - (TEV切断部位)
配列番号123 - (トロンビン切断部位)
配列番号124 - (PreScission切断部位)
配列番号125 - (エンテロキナーゼ切断部位)
配列番号126 - (第Xa因子切断部位1)
配列番号127 - (第Xa因子切断部位2)
配列番号128 - (BoNT/B-UniProt P10844のポリペプチド配列)
配列番号129 - (BoNT/C-UniProt P18640のポリペプチド配列)
配列番号130 - (BoNT/D-UniProt P19321のポリペプチド配列)
配列番号131 - (BoNT/E-UniProt Q00496のポリペプチド配列)
配列番号132 - (BoNT/F-UniProt A7GBG3のポリペプチド配列)
配列番号133 - (BoNT/G-UniProt Q60393のポリペプチド配列)
配列番号134 - (TeNT-UniProt P04958のポリペプチド配列)
配列番号135 - (BoNT/Xのポリペプチド配列)
配列番号136 - (改変BoNT/A1(M1144V)核酸配列)
配列番号137 - (改変BoNT/A1(M1144G)核酸配列)
配列番号138 - (改変BoNT/A1(M1144L)核酸配列)
配列番号139 - (BoNT/A2-UniProt D3IV23のポリペプチド配列)
配列番号140 - (BoNT/A5 v.1-UniProt C7BEA8のポリペプチド配列)
配列番号141 - (BoNT/A5 v.2-UniProt C1IPK2のポリペプチド配列)
配列番号142 - (BoNT/A6-ACW83608.1、受託番号FJ981696のポリペプチド配列)
配列番号143 - (BoNT/A7-GenBank:AFV13854.1、受託番号JQ954969.1のポリペプチド配列)
配列番号144 - (BoNT/A8-GenBank:AJA05787.1、受託番号KM233166のポリペプチド配列)
【0247】
配列番号1 (BoNT/A1 核酸配列)
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
【0248】
配列番号2 (BoNT/A1 ポリペプチド配列)
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【0249】
配列番号3 (改変 BoNT/A1 (M1144V) ポリペプチド配列)
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【0250】
配列番号4 (改変 BoNT/A1 (M1144G) ポリペプチド配列)
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【0251】
配列番号5 (改変 BoNT/A1 (M1144L) ポリペプチド配列)
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【0252】
配列番号6 (改変 BoNT/A1 (M1144T) ポリペプチド配列)
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【0253】
配列番号7 (改変 BoNT/A1 (M1144A) ポリペプチド配列)
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【0254】
配列番号8 (改変 BoNT/A1 (M1144I) ポリペプチド配列)
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【0255】
配列番号9 (改変 BoNT/A1 (M1144欠損) ポリペプチド配列)
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【0256】
配列番号10 (BoNT/A1 (N886K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K) 核酸配列)
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAAGCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCcGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAAGCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCcGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
【0257】
配列番号11 (BoNT/A1 (N886K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K) ポリペプチド配列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0258】
配列番号12 (改変 BoNT/A1 (N886K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, M1144V) ポリペプチド配列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVVTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVVTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0259】
配列番号13 (改変 BoNT/A1 (N886K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, M1144G) ポリペプチド配列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVGTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVGTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0260】
配列番号14 (改変 BoNT/A1 (N886K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, M1144L) ポリペプチド配列)
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【0261】
配列番号15 (改変 BoNT/A1 (N886K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, M1144T) ポリペプチド配列)
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【0262】
配列番号16 (改変 BoNT/A1 (N886K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, M1144A) ポリペプチド配列)
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【0263】
配列番号17 (改変 BoNT/A1 (N886K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, M1144I) ポリペプチド配列)
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【0264】
配列番号18 (改変 BoNT/A1 (N886K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, M1144欠損) ポリペプチド配列)
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【0265】
配列番号19 (BoNT/A1 (N954K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K) 核酸配列)
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACaAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAaTCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAAGAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACaAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAaTCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAAGAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
【0266】
配列番号20 (BoNT/A1 (N954K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K) ポリペプチド配列)
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【0267】
配列番号21 (改変 BoNT/A1 (N954K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, M1144V) ポリペプチド配列)
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【0268】
配列番号22 (改変 BoNT/A1 (N954K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, M1144G) ポリペプチド配列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFKKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVGTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
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【0269】
配列番号23 (改変 BoNT/A1 (N954K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, M1144L) ポリペプチド配列)
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【0270】
配列番号24 (改変 BoNT/A1 (N954K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, M1144T) ポリペプチド配列)
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【0271】
配列番号25 (改変 BoNT/A1 (N954K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, M1144A) ポリペプチド配列)
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【0272】
配列番号26 (改変 BoNT/A1 (N954K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, M1144I) ポリペプチド配列)
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【0273】
配列番号27 (改変 BoNT/A1 (N954K, N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, M1144欠損) ポリペプチド配列)
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【0274】
配列番号28 (BoNT/A1 (N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, N1025K) 核酸配列)
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAAGAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAAGAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
【0275】
配列番号29 (BoNT/A1 (N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, N1025K) ポリペプチド配列)
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【0276】
配列番号30 (改変 BoNT/A1 (N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, N1025K, M1144V) ポリペプチド配列)
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MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLKKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVVTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0277】
配列番号31 (改変 BoNT/A1 (N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, N1025K, M1144G) ポリペプチド配列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLKKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVGTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
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【0278】
配列番号32 (改変 BoNT/A1 (N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, N1025K, M1144L) ポリペプチド配列)
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【0279】
配列番号33 (改変 BoNT/A1 (N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, N1025K, M1144T) ポリペプチド配列)
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【0280】
配列番号34 (改変 BoNT/A1 (N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, N1025K, M1144A) ポリペプチド配列)
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【0281】
配列番号35 (改変 BoNT/A1 (N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, N1025K, M1144I) ポリペプチド配列)
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【0282】
配列番号36 (改変 BoNT/A1 (N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, N1025K, M1144欠損) ポリペプチド配列)
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【0283】
配列番号37 (BoNT/A1 (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R) 核酸配列)
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTgGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAaGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCaAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAaTTGCTGATaTTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCaATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATtGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGCGTAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTCGTGTCCGTCGTCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACCGTCGTGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCCGTAGCCGTCGTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTgGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAaGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCaAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAaTTGCTGATaTTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCaATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATtGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGCGTAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTCGTGTCCGTCGTCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACCGTCGTGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCCGTAGCCGTCGTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
【0284】
配列番号38 (BoNT/A1 (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R) ポリペプチド配列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0285】
配列番号39 (改変 BoNT/A1 (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R, M1144V) ポリペプチド配列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVVTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVVTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0286】
配列番号40 (改変 BoNT/A1 (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R, M1144G) ポリペプチド配列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVGTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVGTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0287】
配列番号41 (改変 BoNT/A1 (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R, M1144L) ポリペプチド配列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVLTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVLTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0288】
配列番号42 (改変 BoNT/A1 (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R, M1144T) ポリペプチド配列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVTTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVTTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0289】
配列番号43 (改変 BoNT/A1 (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R, M1144A) ポリペプチド配列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVATTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVATTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0290】
配列番号44 (改変 BoNT/A1 (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R, M1144I) ポリペプチド配列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVITTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVITTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0291】
配列番号45 (改変 BoNT/A1 (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R, M1144欠損) ポリペプチド配列)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0292】
配列番号46 (BoNT/A3 ポリペプチド配列)
MPFVNKPFNYRDPGNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHEGVWVIPERDTFTNPEEGDLN
PPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVIKLFDRIYSTGLGRMLLSFIVKGIPFWGG
STIDTELKVIDTNCINVIEPGGSYRSEELNLVITGPSADIIQFECKSFGHDVFNLTRNGY
GSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGTFATDPAVTLAHELIHAAHRLYGIAINPN
RVLKVKTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGNDTNFIDSLWQKKFSRDAYDNLQNIARILNEA
KTIVGTTTPLQYMKNIFIRKYFLSEDASGKISVNKAAFKEFYRVLTRGFTELEFVNPFKV
INRKTYLNFDKAVFRINIVPDENYTINEGFNLEGANSNGQNTEINSRNFTRLKNFTGLFE
FYKLLCVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNYLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLDKVEEITAD
TNIEAAEENISSDLIQQYYLTFDFDNEPENISIENLSSDIIGQLEPMPNIERFPNGKKYE
LDKYTMFHYLRAQEFEHGDSRIILTNSAEEALLKPNVAYTFFSSKYVKKINKAVEAVIFL
SWAEELVYDFTDETNEVTTMDKIADITIIVPYIGPALNIGNMVSKGEFVEAILFTGVVAL
LEFIPEYSLPVFGTFAIVSYIANKVLTVQTINNALSKRNEKWDEVYKYTVTNWLAKVNTQ
IDLIREKMKKALENQAEATRAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNRSINRAMINI
NKFLDQCSVSYLMNSMIPYAVKRLKDFDASVRDVLLKYIYDNRGTLILQVDRLKDEVNNT
LSADIPFQLSKYVNDKKLLSTFTEYIKNIVNTSILSIVYKKDDLIDLSRYGAKINIGDRV
YYDSIDKNQIKLINLESSTIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIKIPKYFSKINLNNEYTI
INCIENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDNKQNIQRVVFKYSQMVNISDYINRWMFVTITNNRL
TKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDPRRYIMIKYFNLFDKELNEKEI
KDLYDSQSNPGILKDFWGNYLQYDKPYYMLNLFDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGPRGSVM
TTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEK
ILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFVGFHLYDNIAKLVAS
NWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSL
MPFVNKPFNYRDPGNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHEGVWVIPERDTFTNPEEGDLN
PPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVIKLFDRIYSTGLGRMLLSFIVKGIPFWGG
STIDTELKVIDTNCINVIEPGGSYRSEELNLVITGPSADIIQFECKSFGHDVFNLTRNGY
GSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGTFATDPAVTLAHELIHAAHRLYGIAINPN
RVLKVKTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGNDTNFIDSLWQKKFSRDAYDNLQNIARILNEA
KTIVGTTTPLQYMKNIFIRKYFLSEDASGKISVNKAAFKEFYRVLTRGFTELEFVNPFKV
INRKTYLNFDKAVFRINIVPDENYTINEGFNLEGANSNGQNTEINSRNFTRLKNFTGLFE
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TNIEAAEENISSDLIQQYYLTFDFDNEPENISIENLSSDIIGQLEPMPNIERFPNGKKYE
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【0293】
配列番号47 (改変 BoNT/A3 (M1140V) ポリペプチド配列)
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【0294】
配列番号48 (改変 BoNT/A3 (M1140G) ポリペプチド配列)
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【0295】
配列番号49 (改変 BoNT/A3 (M1140L) ポリペプチド配列)
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【0296】
配列番号50 (改変 BoNT/A3 (M1140T) ポリペプチド配列)
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【0297】
配列番号51 (改変 BoNT/A3 (M1140A) ポリペプチド配列)
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【0298】
配列番号52 (改変 BoNT/A3 (M1140I) ポリペプチド配列)
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【0299】
配列番号53 (改変 BoNT/A3 (M1140欠損) ポリペプチド配列)
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【0300】
配列番号54 (BoNT/A4 ポリペプチド配列)
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AVILLEIVPEIALPVLGTFALVSYVSNKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAI
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【0301】
配列番号55 (改変 BoNT/A4 (M1144V) ポリペプチド配列)
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【0302】
配列番号56 (改変 BoNT/A4 (M1144G) ポリペプチド配列)
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EYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTFQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTIT
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RVFKVNTNAYYEMAGLEVSLEELITFGGNDAKFIDSLQKKEFSLYYYNKFKDIASTLNKA
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GLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDEGYNKALNELCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLDKVEE
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AVILLEIVPEIALPVLGTFALVSYVSNKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAI
VNTQINLIREKMKKALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINSA
MININKFLDQCSVSYLMNSMIPYAVKRLKDFDASVRDVLLKYIYDNRGTLIGQVNRLKDK
VNNTLSADIPFQLSKYVDNKKLLSTFTEYIKNITNASILSIVYKDDDLIDLSRYGAEIYN
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【0304】
配列番号58 (改変 BoNT/A4 (M1144T) ポリペプチド配列)
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【0305】
配列番号59 (改変 BoNT/A4 (M1144A) ポリペプチド配列)
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LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
【0306】
配列番号60 (改変 BoNT/A4 (M1144I) ポリペプチド配列)
MPLVNQQINYYDPVNGVDIAYIKIPNAGKMQPVKAFKIHNKVWVIPERDIFTNPEEVDLN
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AVILLEIVPEIALPVLGTFALVSYVSNKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAI
VNTQINLIREKMKKALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINSA
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VNNTLSADIPFQLSKYVDNKKLLSTFTEYIKNITNASILSIVYKDDDLIDLSRYGAEIYN
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EKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKSYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPR
DNVITTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQA
GVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
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GKIDTELKVIDTNCINIIQLDDSYRSEELNLAIIGPSANIIESQCSSFRDDVLNLTRNGY
GSTQYIRFSPDFTVGFEESLEVDTNPLLGAGKFAQDPAVALAHELIHAEHRLYGIAINTN
RVFKVNTNAYYEMAGLEVSLEELITFGGNDAKFIDSLQKKEFSLYYYNKFKDIASTLNKA
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LNRKTYLNFDKAVFKINIVPDVNYTIHDGFNLRNTNLAANFNGQNIEINNKNFDKLKNFT
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ITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLNFNFDNEPENTSIENLSSDIIGQLEPMPNIERFPNG
KKYELNKYTMFHYLRAQEFKHSNSRIILTNSAKEALLKPNIVYTFFSSKYIKAINKAVEA
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AVILLEIVPEIALPVLGTFALVSYVSNKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAI
VNTQINLIREKMKKALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINSA
MININKFLDQCSVSYLMNSMIPYAVKRLKDFDASVRDVLLKYIYDNRGTLIGQVNRLKDK
VNNTLSADIPFQLSKYVDNKKLLSTFTEYIKNITNASILSIVYKDDDLIDLSRYGAEIYN
GDKVYYNSIDKNQIRLINLESSTIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNN
EYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTFQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTIT
NNRITKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDPHRYIVIKYFNLFDKELS
EKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKSYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPR
DNVITTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQA
GVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
【0307】
配列番号61 (改変 BoNT/A4 (M1144欠損) ポリペプチド配列)
MPLVNQQINYYDPVNGVDIAYIKIPNAGKMQPVKAFKIHNKVWVIPERDIFTNPEEVDLN
PPPEAKQVPISYYDSAYLSTDNEKDNYLKGVIKLFERIYSTDLGRMLLISIVRGIPFWGG
GKIDTELKVIDTNCINIIQLDDSYRSEELNLAIIGPSANIIESQCSSFRDDVLNLTRNGY
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RVFKVNTNAYYEMAGLEVSLEELITFGGNDAKFIDSLQKKEFSLYYYNKFKDIASTLNKA
KSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDATGKFLVDRLKFDELYKLLTEIYTEDNFVKFFKV
LNRKTYLNFDKAVFKINIVPDVNYTIHDGFNLRNTNLAANFNGQNIEINNKNFDKLKNFT
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MININKFLDQCSVSYLMNSMIPYAVKRLKDFDASVRDVLLKYIYDNRGTLIGQVNRLKDK
VNNTLSADIPFQLSKYVDNKKLLSTFTEYIKNITNASILSIVYKDDDLIDLSRYGAEIYN
GDKVYYNSIDKNQIRLINLESSTIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNN
EYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTFQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTIT
NNRITKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDPHRYIVIKYFNLFDKELS
EKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKSYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPR
DNVTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQA
GVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
MPLVNQQINYYDPVNGVDIAYIKIPNAGKMQPVKAFKIHNKVWVIPERDIFTNPEEVDLN
PPPEAKQVPISYYDSAYLSTDNEKDNYLKGVIKLFERIYSTDLGRMLLISIVRGIPFWGG
GKIDTELKVIDTNCINIIQLDDSYRSEELNLAIIGPSANIIESQCSSFRDDVLNLTRNGY
GSTQYIRFSPDFTVGFEESLEVDTNPLLGAGKFAQDPAVALAHELIHAEHRLYGIAINTN
RVFKVNTNAYYEMAGLEVSLEELITFGGNDAKFIDSLQKKEFSLYYYNKFKDIASTLNKA
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LNRKTYLNFDKAVFKINIVPDVNYTIHDGFNLRNTNLAANFNGQNIEINNKNFDKLKNFT
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KKYELNKYTMFHYLRAQEFKHSNSRIILTNSAKEALLKPNIVYTFFSSKYIKAINKAVEA
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VNTQINLIREKMKKALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINSA
MININKFLDQCSVSYLMNSMIPYAVKRLKDFDASVRDVLLKYIYDNRGTLIGQVNRLKDK
VNNTLSADIPFQLSKYVDNKKLLSTFTEYIKNITNASILSIVYKDDDLIDLSRYGAEIYN
GDKVYYNSIDKNQIRLINLESSTIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNN
EYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTFQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTIT
NNRITKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDPHRYIVIKYFNLFDKELS
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LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
【0308】
配列番号62 (BoNT/A1 HCC ドメイン ポリペプチド配列)
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【0309】
配列番号63 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (M1144V) ポリペプチド配列)
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【0310】
配列番号64 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (M1144G) ポリペプチド配列)
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【0311】
配列番号65 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (M1144L) ポリペプチド配列)
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【0312】
配列番号66 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (M1144T) ポリペプチド配列)
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【0313】
配列番号67 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (M1144A) ポリペプチド配列)
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【0314】
配列番号68 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (M1144I) ポリペプチド配列)
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【0315】
配列番号69 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (M1144欠損) ポリペプチド配列)
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【0316】
配列番号70 (BoNT/A1 HCC ドメイン (Q1229K) ポリペプチド配列)
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【0317】
配列番号71 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (Q1229K, M1144V) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVVTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVVTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0318】
配列番号72 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (Q1229K, M1144G) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVGTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
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【0319】
配列番号73 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (Q1229K, M1144L) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVLTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
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【0320】
配列番号74 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (Q1229K, M1144T) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVTTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVTTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0321】
配列番号75 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (Q1229K, M1144A) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVATTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
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【0322】
配列番号76 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (Q1229K, M1144I) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVITTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
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【0323】
配列番号77 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (Q1229K, M1144欠損) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
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【0324】
配列番号78 (BoNT/A1 HCC ドメイン (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
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【0325】
配列番号79 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R, M1144V) Polypeptide
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVVTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVVTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0326】
配列番号80 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R, M1144G) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVGTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
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【0327】
配列番号81 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R, M1144L) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVLTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
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【0328】
配列番号82 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R, M1144T) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVTTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
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【0329】
配列番号83 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R, M1144A) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVATTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
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【0330】
配列番号84 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R, M1144I) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVITTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVITTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0331】
配列番号85 (改変 BoNT/A1 HCC ドメイン (N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R, M1144欠損) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
【0332】
配列番号86 (BoNT/A3 HCC ドメイン ポリペプチド配列)
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YYMLNLFDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFVGFHLYDNIAKLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSL
【0333】
配列番号87 (改変 BoNT/A3 HCC ドメイン (M1144V) ポリペプチド配列)
YYMLNLFDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGPRGSVVTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFVGFHLYDNIAKLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSL
YYMLNLFDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGPRGSVVTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFVGFHLYDNIAKLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSL
【0334】
配列番号88 (改変 BoNT/A3 HCC ドメイン (M1144G) ポリペプチド配列)
YYMLNLFDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGPRGSVGTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFVGFHLYDNIAKLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSL
YYMLNLFDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGPRGSVGTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFVGFHLYDNIAKLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSL
【0335】
配列番号89 (改変 BoNT/A3 HCC ドメイン (M1144L) ポリペプチド配列)
YYMLNLFDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGPRGSVLTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFVGFHLYDNIAKLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSL
YYMLNLFDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGPRGSVLTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFVGFHLYDNIAKLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSL
【0336】
配列番号90 (改変 BoNT/A3 HCC ドメイン (M1144T) ポリペプチド配列)
YYMLNLFDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGPRGSVTTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFVGFHLYDNIAKLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSL
YYMLNLFDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGPRGSVTTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFVGFHLYDNIAKLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSL
【0337】
配列番号91 (改変 BoNT/A3 HCC ドメイン (M1144A) ポリペプチド配列)
YYMLNLFDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGPRGSVATTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFVGFHLYDNIAKLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSL
YYMLNLFDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGPRGSVATTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFVGFHLYDNIAKLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSL
【0338】
配列番号92 (改変 BoNT/A3 HCC ドメイン (M1144I) ポリペプチド配列)
YYMLNLFDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGPRGSVITTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFVGFHLYDNIAKLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSL
YYMLNLFDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGPRGSVITTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFVGFHLYDNIAKLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSL
【0339】
配列番号93 (改変 BoNT/A3 HCC ドメイン (M1144欠損) ポリペプチド配列)
YYMLNLFDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGPRGSVTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFVGFHLYDNIAKLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSL
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【0340】
配列番号94 (BoNT/A4 HCC ドメイン ポリペプチド配列)
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LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
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LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
【0341】
配列番号95 (改変 BoNT/A4 HCC ドメイン (M1144V) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRDNVVTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRDNVVTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
【0342】
配列番号96 (改変 BoNT/A4 HCC ドメイン (M1144G) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRDNVGTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRDNVGTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
【0343】
配列番号97 (改変 BoNT/A4 HCC ドメイン (M1144L) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRDNVLTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRDNVLTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
【0344】
配列番号98 (改変 BoNT/A4 HCC ドメイン (M1144T) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRDNVTTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRDNVTTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
【0345】
配列番号99 (改変 BoNT/A4 HCC ドメイン (M1144A) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRDNVATTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRDNVATTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
【0346】
配列番号100 (改変 BoNT/A4 HCC ドメイン (M1144I) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRDNVITTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRDNVITTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
【0347】
配列番号101 (改変 BoNT/A4 HCC ドメイン (M1144欠損) ポリペプチド配列)
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRDNVTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
YYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRDNVTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWRERPL
【0348】
配列番号102 (改変 SV2 結合ドメイン コンセンサス配列 1)
RX1X2VX3TTNIYLNSX4LYX5GT, ここで、X1がDまたはGであり、X2がSまたはNであり、X3が酸化に対して耐性であるアミノ酸であり、X4がSまたはTであり、X5がMまたはRである.
RX1X2VX3TTNIYLNSX4LYX5GT, ここで、X1がDまたはGであり、X2がSまたはNであり、X3が酸化に対して耐性であるアミノ酸であり、X4がSまたはTであり、X5がMまたはRである.
【0349】
配列番号103 (BoNT/A1 Hall 株(参照) SV2 結合ドメイン)
RGSVMTTNIYLNSSLYRGT
RGSVMTTNIYLNSSLYRGT
【0350】
配列番号104 (BoNT/A1 CDC297 SV2 結合ドメイン)
RGNVMTTNIYLNSSLYMGT
RGNVMTTNIYLNSSLYMGT
【0351】
配列番号105 (BoNT/A3 Loch Maree SV2 結合ドメイン)
RGSVMTTNIYLNSTLYMGT
RGSVMTTNIYLNSTLYMGT
【0352】
配列番号106 (BoNT/A4 SV2 結合ドメイン)
RDNVMTTNIYLNSSLYMGT
RDNVMTTNIYLNSSLYMGT
【0353】
配列番号107 (改変 SV2 結合ドメイン コンセンサス配列 2)
RGSVXTTNIYLNSSLYRGT, ここで、Xは酸化耐性アミノ酸である.
RGSVXTTNIYLNSSLYRGT, ここで、Xは酸化耐性アミノ酸である.
【0354】
配列番号108 (改変 SV2 結合ドメイン コンセンサス配列 3)
RGNVXTTNIYLNSSLYMGT, ここで、Xは酸化耐性アミノ酸である.
RGNVXTTNIYLNSSLYMGT, ここで、Xは酸化耐性アミノ酸である.
【0355】
配列番号109 (改変 SV2 結合ドメイン コンセンサス配列 4)
RGSVXTTNIYLNSTLYMGT, ここで、Xは酸化耐性アミノ酸である.
RGSVXTTNIYLNSTLYMGT, ここで、Xは酸化耐性アミノ酸である.
【0356】
配列番号110 (改変 SV2 結合ドメイン コンセンサス配列 5)
RDNVXTTNIYLNSSLYMGT, ここで、Xは酸化耐性アミノ酸である.
RDNVXTTNIYLNSSLYMGT, ここで、Xは酸化耐性アミノ酸である.
【0357】
配列番号111 (改変 SV2 結合ドメイン コンセンサス配列 6)
RX1X2VTTNIYLNSX3LYX4GT, ここで、X1がDまたはGであり、X2がSまたはNであり、X3がSまたはTであり、X4がMまたはRである.
RX1X2VTTNIYLNSX3LYX4GT, ここで、X1がDまたはGであり、X2がSまたはNであり、X3がSまたはTであり、X4がMまたはRである.
【0358】
配列番号112 (改変 SV2 結合ドメイン A)
RGSVTTNIYLNSSLYRGT
RGSVTTNIYLNSSLYRGT
【0359】
配列番号113 (改変 SV2 結合ドメイン B)
RGNVTTNIYLNSSLYMGT
RGNVTTNIYLNSSLYMGT
【0360】
配列番号114 (改変 SV2 結合ドメイン C)
RGSVTTNIYLNSTLYMGT
RGSVTTNIYLNSTLYMGT
【0361】
配列番号115 (改変 SV2 結合ドメイン D)
RDNVTTNIYLNSSLYMGT
RDNVTTNIYLNSSLYMGT
【0362】
配列番号116 (インフルエンザウイルス ヘマグルチニン)
GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG
GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG
【0363】
配列番号117 (ロイシンベースモチーフ 1)
xDxxxLL, ここで、Xは任意のアミノ酸である.
xDxxxLL, ここで、Xは任意のアミノ酸である.
【0364】
配列番号118 (ロイシンベースモチーフ 2)
xExxxLL, ここで、Xは任意のアミノ酸である.
xExxxLL, ここで、Xは任意のアミノ酸である.
【0365】
配列番号119 (ロイシンベースモチーフ 3)
xExxxIL, ここで、Xは任意のアミノ酸である.
xExxxIL, ここで、Xは任意のアミノ酸である.
【0366】
配列番号120 (ロイシンベースモチーフ 4)
xExxxLM, ここで、Xは任意のアミノ酸である.
xExxxLM, ここで、Xは任意のアミノ酸である.
【0367】
配列番号121 (チロシンベースモチーフ)
Y-x-x-Hy, ここで、Hyは疎水性アミノ酸であり、ここで、Xは任意のアミノ酸である.
Y-x-x-Hy, ここで、Hyは疎水性アミノ酸であり、ここで、Xは任意のアミノ酸である.
【0368】
配列番号122 (TEV 切断部位)
ENLYFQG
ENLYFQG
【0369】
配列番号123 (Thrombin 切断部位)
LVPRGS
LVPRGS
【0370】
配列番号124 (PreScission 切断部位)
LEVLFQGP
LEVLFQGP
【0371】
配列番号125 (Enterokinase 切断部位)
DDDDK
DDDDK
【0372】
配列番号126 (Factor Xa 切断部位 1)
IEGR
IEGR
【0373】
配列番号127 (Factor Xa 切断部位 2)
IDGR
IDGR
【0374】
配列番号128 (ポリペプチド配列, BoNT/B - UniProt P10844)
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
【0375】
配列番号129 (ポリペプチド配列, BoNT/C - UniProt P18640)
MPITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDPFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLYLFTKFCHKAIDGRSLYNKTLDCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNNINDSKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE
MPITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDPFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLYLFTKFCHKAIDGRSLYNKTLDCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNNINDSKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE
【0376】
配列番号130 (ポリペプチド配列, BoNT/D - UniProt P19321)
MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTKNSRDDSTCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNSINDSKILSLQNKKNALVDTSGYNAEVRVGDNVQLNTIYTNDFKLSSSGDKIIVNLNNNILYSAIYENSSVSFWIKISKDLTNSHNEYTIINSIEQNSGWKLCIRNGNIEWILQDVNRKYKSLIFDYSESLSHTGYTNKWFFVTITNNIMGYMKLYINGELKQSQKIEDLDEVKLDKTIVFGIDENIDENQMLWIRDFNIFSKELSNEDINIVYEGQILRNVIKDYWGNPLKFDTEYYIINDNYIDRYIAPESNVLVLVQYPDRSKLYTGNPITIKSVSDKNPYSRILNGDNIILHMLYNSRKYMIIRDTDTIYATQGGECSQNCVYALKLQSNLGNYGIGIFSIKNIVSKNKYCSQIFSSFRENTMLLADIYKPWRFSFKNAYTPVAVTNYETKLLSTSSFWKFISRDPGWVE
MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTKNSRDDSTCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNSINDSKILSLQNKKNALVDTSGYNAEVRVGDNVQLNTIYTNDFKLSSSGDKIIVNLNNNILYSAIYENSSVSFWIKISKDLTNSHNEYTIINSIEQNSGWKLCIRNGNIEWILQDVNRKYKSLIFDYSESLSHTGYTNKWFFVTITNNIMGYMKLYINGELKQSQKIEDLDEVKLDKTIVFGIDENIDENQMLWIRDFNIFSKELSNEDINIVYEGQILRNVIKDYWGNPLKFDTEYYIINDNYIDRYIAPESNVLVLVQYPDRSKLYTGNPITIKSVSDKNPYSRILNGDNIILHMLYNSRKYMIIRDTDTIYATQGGECSQNCVYALKLQSNLGNYGIGIFSIKNIVSKNKYCSQIFSSFRENTMLLADIYKPWRFSFKNAYTPVAVTNYETKLLSTSSFWKFISRDPGWVE
【0377】
配列番号131 (ポリペプチド配列, BoNT/E - UniProt Q00496)
MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHRFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNCMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLRTKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKIINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTFEDNRGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHRFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNCMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLRTKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKIINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTFEDNRGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
【0378】
配列番号132 (ポリペプチド配列, BoNT/F - UniProt A7GBG3)
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN
【0379】
配列番号133 (ポリペプチド配列, BoNT/G - UniProt Q60393)
MPVNIKXFNYNDPINNDDIIMMEPFNDPGPGTYYKAFRIIDRIWIVPERFTYGFQPDQFNASTGVFSKDVYEYYDPTYLKTDAEKDKFLKTMIKLFNRINSKPSGQRLLDMIVDAIPYLGNASTPPDKFAANVANVSINKKIIQPGAEDQIKGLMTNLIIFGPGPVLSDNFTDSMIMNGHSPISEGFGARMMIRFCPSCLNVFNNVQENKDTSIFSRRAYFADPALTLMHELIHVLHGLYGIKISNLPITPNTKEFFMQHSDPVQAEELYTFGGHDPSVISPSTDMNIYNKALQNFQDIANRLNIVSSAQGSGIDISLYKQIYKNKYDFVEDPNGKYSVDKDKFDKLYKALMFGFTETNLAGEYGIKTRYSYFSEYLPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIASKNLKTEFNGQNKAVNKEAYEEISLEHLVIYRIAMCKPVMYKNTGKSEQCIIVNNEDLFFIANKDSFSKDLAKAETIAYNTQNNTIENNFSIDQLILDNDLSSGIDLPNENTEPFTNFDDIDIPVYIKQSALKKIFVDGDSLFEYLHAQTFPSNIENLQLTNSLNDALRNNNKVYTFFSTNLVEKANTVVGASLFVNWVKGVIDDFTSESTQKSTIDKVSDVSIIIPYIGPALNVGNETAKENFKNAFEIGGAAILMEFIPELIVPIVGFFTLESYVGNKGHIIMTISNALKKRDQKWTDMYGLIVSQWLSTVNTQFYTIKERMYNALNNQSQAIEKIIEDQYNRYSEEDKMNINIDFNDIDFKLNQSINLAINNIDDFINQCSISYLMNRMIPLAVKKLKDFDDNLKRDLLEYIDTNELYLLDEVNILKSKVNRHLKDSIPFDLSLYTKDTILIQVFNNYISNISSNAILSLSYRGGRLIDSSGYGATMNVGSDVIFNDIGNGQFKLNNSENSNITAHQSKFVVYDSMFDNFSINFWVRTPKYNNNDIQTYLQNEYTIISCIKNDSGWKVSIKGNRIIWTLIDVNAKSKSIFFEYSIKDNISDYINKWFSITITNDRLGNANIYINGSLKKSEKILNLDRINSSNDIDFKLINCTDTTKFVWIKDFNIFGRELNATEVSSLYWIQSSTNTLKDFWGNPLRYDTQYYLFNQGMQNIYIKYFSKASMGETAPRTNFNNAAINYQNLYLGLRFIIKKASNSRNINNDNIVREGDYIYLNIDNISDESYRVYVLVNSKEIQTQLFLAPINDDPTFYDVLQIKKYYEKTTYNCQILCEKDTKTFGLFGIGKFVKDYGYVWDTYDNYFCISQWYLRRISENINKLRLGCNWQFIPVDEGWTE
MPVNIKXFNYNDPINNDDIIMMEPFNDPGPGTYYKAFRIIDRIWIVPERFTYGFQPDQFNASTGVFSKDVYEYYDPTYLKTDAEKDKFLKTMIKLFNRINSKPSGQRLLDMIVDAIPYLGNASTPPDKFAANVANVSINKKIIQPGAEDQIKGLMTNLIIFGPGPVLSDNFTDSMIMNGHSPISEGFGARMMIRFCPSCLNVFNNVQENKDTSIFSRRAYFADPALTLMHELIHVLHGLYGIKISNLPITPNTKEFFMQHSDPVQAEELYTFGGHDPSVISPSTDMNIYNKALQNFQDIANRLNIVSSAQGSGIDISLYKQIYKNKYDFVEDPNGKYSVDKDKFDKLYKALMFGFTETNLAGEYGIKTRYSYFSEYLPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIASKNLKTEFNGQNKAVNKEAYEEISLEHLVIYRIAMCKPVMYKNTGKSEQCIIVNNEDLFFIANKDSFSKDLAKAETIAYNTQNNTIENNFSIDQLILDNDLSSGIDLPNENTEPFTNFDDIDIPVYIKQSALKKIFVDGDSLFEYLHAQTFPSNIENLQLTNSLNDALRNNNKVYTFFSTNLVEKANTVVGASLFVNWVKGVIDDFTSESTQKSTIDKVSDVSIIIPYIGPALNVGNETAKENFKNAFEIGGAAILMEFIPELIVPIVGFFTLESYVGNKGHIIMTISNALKKRDQKWTDMYGLIVSQWLSTVNTQFYTIKERMYNALNNQSQAIEKIIEDQYNRYSEEDKMNINIDFNDIDFKLNQSINLAINNIDDFINQCSISYLMNRMIPLAVKKLKDFDDNLKRDLLEYIDTNELYLLDEVNILKSKVNRHLKDSIPFDLSLYTKDTILIQVFNNYISNISSNAILSLSYRGGRLIDSSGYGATMNVGSDVIFNDIGNGQFKLNNSENSNITAHQSKFVVYDSMFDNFSINFWVRTPKYNNNDIQTYLQNEYTIISCIKNDSGWKVSIKGNRIIWTLIDVNAKSKSIFFEYSIKDNISDYINKWFSITITNDRLGNANIYINGSLKKSEKILNLDRINSSNDIDFKLINCTDTTKFVWIKDFNIFGRELNATEVSSLYWIQSSTNTLKDFWGNPLRYDTQYYLFNQGMQNIYIKYFSKASMGETAPRTNFNNAAINYQNLYLGLRFIIKKASNSRNINNDNIVREGDYIYLNIDNISDESYRVYVLVNSKEIQTQLFLAPINDDPTFYDVLQIKKYYEKTTYNCQILCEKDTKTFGLFGIGKFVKDYGYVWDTYDNYFCISQWYLRRISENINKLRLGCNWQFIPVDEGWTE
【0380】
配列番号134 (ポリペプチド配列, TeNT - UniProt P04958)
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTND
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTND
【0381】
配列番号135 (ポリペプチド配列, BoNT/X)
MKLEINKFNYNDPIDGINVITMRPPRHSDKINKGKGPFKAFQVIKNIWIVPERYNFTNNT
NDLNIPSEPIMEADAIYNPNYLNTPSEKDEFLQGVIKVLERIKSKPEGEKLLELISSSIP
LPLVSNGALTLSDNETIAYQENNNIVSNLQANLVIYGPGPDIANNATYGLYSTPISNGEG
TLSEVSFSPFYLKPFDESYGNYRSLVNIVNKFVKREFAPDPASTLMHELVHVTHNLYGIS
NRNFYYNFDTGKIETSRQQNSLIFEELLTFGGIDSKAISSLIIKKIIETAKNNYTTLISE
RLNTVTVENDLLKYIKNKIPVQGRLGNFKLDTAEFEKKLNTILFVLNESNLAQRFSILVR
KHYLKERPIDPIYVNILDDNSYSTLEGFNISSQGSNDFQGQLLESSYFEKIESNALRAFI
KICPRNGLLYNAIYRNSKNYLNNIDLEDKKTTSKTNVSYPCSLLNGCIEVENKDLFLISN
KDSLNDINLSEEKIKPETTVFFKDKLPPQDITLSNYDFTEANSIPSISQQNILERNEELY
EPIRNSLFEIKTIYVDKLTTFHFLEAQNIDESIDSSKIRVELTDSVDEALSNPNKVYSPF
KNMSNTINSIETGITSTYIFYQWLRSIVKDFSDETGKIDVIDKSSDTLAIVPYIGPLLNI
GNDIRHGDFVGAIELAGITALLEYVPEFTIPILVGLEVIGGELAREQVEAIVNNALDKRD
QKWAEVYNITKAQWWGTIHLQINTRLAHTYKALSRQANAIKMNMEFQLANYKGNIDDKAK
IKNAISETEILLNKSVEQAMKNTEKFMIKLSNSYLTKEMIPKVQDNLKNFDLETKKTLDK
FIKEKEDILGTNLSSSLRRKVSIRLNKNIAFDINDIPFSEFDDLINQYKNEIEDYEVLNL
GAEDGKIKDLSGTTSDINIGSDIELADGRENKAIKIKGSENSTIKIAMNKYLRFSATDNF
SISFWIKHPKPTNLLNNGIEYTLVENFNQRGWKISIQDSKLIWYLRDHNNSIKIVTPDYI
AFNGWNLITITNNRSKGSIVYVNGSKIEEKDISSIWNTEVDDPIIFRLKNNRDTQAFTLL
DQFSIYRKELNQNEVVKLYNYYFNSNYIRDIWGNPLQYNKKYYLQTQDKPGKGLIREYWS
SFGYDYVILSDSKTITFPNNIRYGALYNGSKVLIKNSKKLDGLVRNKDFIQLEIDGYNMG
ISADRFNEDTNYIGTTYGTTHDLTTDFEIIQRQEKYRNYCQLKTPYNIFHKSGLMSTETS
KPTFHDYRDWVYSSAWYFQNYENLNLRKHTKTNWYFIPKDEGWDED
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NDLNIPSEPIMEADAIYNPNYLNTPSEKDEFLQGVIKVLERIKSKPEGEKLLELISSSIP
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RLNTVTVENDLLKYIKNKIPVQGRLGNFKLDTAEFEKKLNTILFVLNESNLAQRFSILVR
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KNMSNTINSIETGITSTYIFYQWLRSIVKDFSDETGKIDVIDKSSDTLAIVPYIGPLLNI
GNDIRHGDFVGAIELAGITALLEYVPEFTIPILVGLEVIGGELAREQVEAIVNNALDKRD
QKWAEVYNITKAQWWGTIHLQINTRLAHTYKALSRQANAIKMNMEFQLANYKGNIDDKAK
IKNAISETEILLNKSVEQAMKNTEKFMIKLSNSYLTKEMIPKVQDNLKNFDLETKKTLDK
FIKEKEDILGTNLSSSLRRKVSIRLNKNIAFDINDIPFSEFDDLINQYKNEIEDYEVLNL
GAEDGKIKDLSGTTSDINIGSDIELADGRENKAIKIKGSENSTIKIAMNKYLRFSATDNF
SISFWIKHPKPTNLLNNGIEYTLVENFNQRGWKISIQDSKLIWYLRDHNNSIKIVTPDYI
AFNGWNLITITNNRSKGSIVYVNGSKIEEKDISSIWNTEVDDPIIFRLKNNRDTQAFTLL
DQFSIYRKELNQNEVVKLYNYYFNSNYIRDIWGNPLQYNKKYYLQTQDKPGKGLIREYWS
SFGYDYVILSDSKTITFPNNIRYGALYNGSKVLIKNSKKLDGLVRNKDFIQLEIDGYNMG
ISADRFNEDTNYIGTTYGTTHDLTTDFEIIQRQEKYRNYCQLKTPYNIFHKSGLMSTETS
KPTFHDYRDWVYSSAWYFQNYENLNLRKHTKTNWYFIPKDEGWDED
【0382】
配列番号136 (改変 BoNT/A1 (M1144V) 核酸配列)
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【0383】
配列番号137 (改変 BoNT/A1 (M1144G) 核酸配列)
ATGCCGTTTGTGAACAAACAGTTCAACTATAAAGATCCGGTGAACGGTGTTGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAATCCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACATGAACTGATTCATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCAATTAATCCGAACCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCATATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGTCATTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACCAGCGGTAAATTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGATAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTATACCGAAGATAACTTCGTGAAGTTTTTCAAAGTGCTGAACCGCAAAACCTACCTGAACTTTGATAAAGCCGTGTTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTGAACTATACCATCTATGATGGTTTTAACCTGCGCAATACCAATCTGGCAGCAAACTTTAATGGTCAGAACACCGAAATCAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAGAACTTCACCGGTCTGTTCGAATTTTACAAACTGCTGTGTGTTCGTGGCATTATTACCtcCAAAACCAAAAGCCTGGATAAAGGTTATAACAAAGCCCTGAATGACCTGTGCATTAAAGTGAATAATTGGGACCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAAGATAACTTTACCAACGATCTGAATAAAGGCGAAGAAATTACCAGCGATACCAATATTGAAGCAGCCGAAGAAAACATTAGCCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTCAACTTTGATAACGAGCCGGAAAATATCAGCATTGAAAATCTGAGCAGCGATATTATTGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATTGAACGTTTTCCGAACGGCAAAAAATACGAGCTGGATAAATACACCATGTTCCATTATCTGCGTGCCCAAGAATTTGAACATGGTAAAAGCCGTATTGCCCTGACCAATTCAGTTAATGAAGCACTGCTGAACCCGAGCCGTGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGATTACGTGAAAAAGGTGAACAAAGCAACCGAAGCAGCAATGTTTTTAGGTTGGGTTGAACAGCTGGTGTATGATTTCACCGATGAAACCAGCGAAGTTAGCACCACCGATAAAATTGCAGATATCACCATTATCATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAATATTGGCAATATGCTGTATAAAGATGATTTCGTGGGTGCCCTGATTTTTAGCGGTGCAGTTATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATTGCCATTCCGGTTCTGGGCACCTTTGCACTGGTTAGCTATATTGCAAATAAAGTTCTGACCGTGCAGACCATTGATAATGCACTGAGCAAACGTAACGAGAAATGGGATGAAGTGTACAAATATATCGTGACCAATTGGCTGGCCAAAGTTAATACCCAGATTGATCTGATCCGCAAAAAAATGAAAGAAGCCCTGGAAAATCAGGCAGAAGCAACCAAAGCCATTATCAACTATCAGTATAACCAGTACACCGAAGAAGAGAAAAACAACATCAACTTCAACATCGATGACCTGAGCAGCAAACTGAATGAAAGCATCAATAAGGCCATGATTAACATCAACAAATTTCTGAATCAGTGCAGCGTGAGCTATCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGTGTGAAACGCCTGGAAGATTTTGATGCAAGCCTGAAAGATGCGCTGCTGAAATATATCTATGATAATCGTGGCACCCTGATTGGCCAGGTTGATCGTCTGAAAGATAAAGTTAACAATACCCTGAGTACCGACATTCCGTTTCAGCTGAGCAAATATGTTGATAATCAGCGTCTGCTGAGCACCTTTACCGAATATATCAAGAACATCATCAACACCAGCATTCTGAATCTGCGCTATGAAAGCAATCATCTGATCGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAAATCAACATTGGTAGCAAAGTGAACTTCGACCCGATTGATAAAAACCAGATTCAGCTGTTTAATCTGGAAAGCAGCAAAATCGAAGTGATCCTGAAAAACGCCATTGTGTATAACAGCATGTATGAGAATTTCTCGACCAGCTTTTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTAATAGCATCAGCCTGAACAACGAGTACACCATTATTAACTGCATGGAAAACAATAGCGGTTGGAAAGTGAGCCTGAATTATGGTGAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCCAAGAAATCAAACAGCGTGTTGTGTTCAAATACAGCCAGATGATTAATATCAGCGACTATATCAACCGCTGGATCTTTGTTACCATTACCAATAATCGCCTGAATAACAGCAAGATCTATATTAACGGTCGCCTGATTGATCAGAAACCGATTAGCAATCTGGGCAATATTCATGCGAGCAACAACATTATGTTTAAACTGGATGGTTGCCGTGATACCCATCGTTATATTTGGATCAAATACTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAACGAAAAAGAAATTAAAGACCTGTACGACAACCAGAGCAATTCCGGTATTCTGAAAGACTTTTGGGGAGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTATATGCTGAACCTGTATGACCCGAACAAATATGTGGATGTGAACAATGTTGGTATCCGTGGCTATATGTATCTGAAAGGTCCGCGTGGTAGCGTTggtACCACCAACATTTATCTGAATAGCAGCCTGTATCGCGGTACGAAATTTATCATTAAAAAGTATGCCAGCGGCAACAAGGATAATATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTACATTAACGTTGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGCCTGGCAACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGCGCACTGGAAATTCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTTATGAAAAGCAAAAATGATCAGGGCATCACCAACAAGTGCAAAATGAATCTGCAGGACAATAACGGCAACGATATTGGTTTTATTGGCTTCCACCAGTTCAACAATATTGCGAAACTGGTTGCAAGCAATTGGTATAATCGTCAGATTGAACGTAGCAGTCGTACCCTGGGTTGTAGCTGGGAATTTATCCCTGTGGATGATGGTTGGGGTGAACGTCCGCTGTAA
ATGCCGTTTGTGAACAAACAGTTCAACTATAAAGATCCGGTGAACGGTGTTGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAATCCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACATGAACTGATTCATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCAATTAATCCGAACCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCATATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGTCATTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACCAGCGGTAAATTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGATAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTATACCGAAGATAACTTCGTGAAGTTTTTCAAAGTGCTGAACCGCAAAACCTACCTGAACTTTGATAAAGCCGTGTTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTGAACTATACCATCTATGATGGTTTTAACCTGCGCAATACCAATCTGGCAGCAAACTTTAATGGTCAGAACACCGAAATCAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAGAACTTCACCGGTCTGTTCGAATTTTACAAACTGCTGTGTGTTCGTGGCATTATTACCtcCAAAACCAAAAGCCTGGATAAAGGTTATAACAAAGCCCTGAATGACCTGTGCATTAAAGTGAATAATTGGGACCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAAGATAACTTTACCAACGATCTGAATAAAGGCGAAGAAATTACCAGCGATACCAATATTGAAGCAGCCGAAGAAAACATTAGCCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTCAACTTTGATAACGAGCCGGAAAATATCAGCATTGAAAATCTGAGCAGCGATATTATTGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATTGAACGTTTTCCGAACGGCAAAAAATACGAGCTGGATAAATACACCATGTTCCATTATCTGCGTGCCCAAGAATTTGAACATGGTAAAAGCCGTATTGCCCTGACCAATTCAGTTAATGAAGCACTGCTGAACCCGAGCCGTGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGATTACGTGAAAAAGGTGAACAAAGCAACCGAAGCAGCAATGTTTTTAGGTTGGGTTGAACAGCTGGTGTATGATTTCACCGATGAAACCAGCGAAGTTAGCACCACCGATAAAATTGCAGATATCACCATTATCATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAATATTGGCAATATGCTGTATAAAGATGATTTCGTGGGTGCCCTGATTTTTAGCGGTGCAGTTATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATTGCCATTCCGGTTCTGGGCACCTTTGCACTGGTTAGCTATATTGCAAATAAAGTTCTGACCGTGCAGACCATTGATAATGCACTGAGCAAACGTAACGAGAAATGGGATGAAGTGTACAAATATATCGTGACCAATTGGCTGGCCAAAGTTAATACCCAGATTGATCTGATCCGCAAAAAAATGAAAGAAGCCCTGGAAAATCAGGCAGAAGCAACCAAAGCCATTATCAACTATCAGTATAACCAGTACACCGAAGAAGAGAAAAACAACATCAACTTCAACATCGATGACCTGAGCAGCAAACTGAATGAAAGCATCAATAAGGCCATGATTAACATCAACAAATTTCTGAATCAGTGCAGCGTGAGCTATCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGTGTGAAACGCCTGGAAGATTTTGATGCAAGCCTGAAAGATGCGCTGCTGAAATATATCTATGATAATCGTGGCACCCTGATTGGCCAGGTTGATCGTCTGAAAGATAAAGTTAACAATACCCTGAGTACCGACATTCCGTTTCAGCTGAGCAAATATGTTGATAATCAGCGTCTGCTGAGCACCTTTACCGAATATATCAAGAACATCATCAACACCAGCATTCTGAATCTGCGCTATGAAAGCAATCATCTGATCGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAAATCAACATTGGTAGCAAAGTGAACTTCGACCCGATTGATAAAAACCAGATTCAGCTGTTTAATCTGGAAAGCAGCAAAATCGAAGTGATCCTGAAAAACGCCATTGTGTATAACAGCATGTATGAGAATTTCTCGACCAGCTTTTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTAATAGCATCAGCCTGAACAACGAGTACACCATTATTAACTGCATGGAAAACAATAGCGGTTGGAAAGTGAGCCTGAATTATGGTGAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCCAAGAAATCAAACAGCGTGTTGTGTTCAAATACAGCCAGATGATTAATATCAGCGACTATATCAACCGCTGGATCTTTGTTACCATTACCAATAATCGCCTGAATAACAGCAAGATCTATATTAACGGTCGCCTGATTGATCAGAAACCGATTAGCAATCTGGGCAATATTCATGCGAGCAACAACATTATGTTTAAACTGGATGGTTGCCGTGATACCCATCGTTATATTTGGATCAAATACTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAACGAAAAAGAAATTAAAGACCTGTACGACAACCAGAGCAATTCCGGTATTCTGAAAGACTTTTGGGGAGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTATATGCTGAACCTGTATGACCCGAACAAATATGTGGATGTGAACAATGTTGGTATCCGTGGCTATATGTATCTGAAAGGTCCGCGTGGTAGCGTTggtACCACCAACATTTATCTGAATAGCAGCCTGTATCGCGGTACGAAATTTATCATTAAAAAGTATGCCAGCGGCAACAAGGATAATATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTACATTAACGTTGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGCCTGGCAACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGCGCACTGGAAATTCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTTATGAAAAGCAAAAATGATCAGGGCATCACCAACAAGTGCAAAATGAATCTGCAGGACAATAACGGCAACGATATTGGTTTTATTGGCTTCCACCAGTTCAACAATATTGCGAAACTGGTTGCAAGCAATTGGTATAATCGTCAGATTGAACGTAGCAGTCGTACCCTGGGTTGTAGCTGGGAATTTATCCCTGTGGATGATGGTTGGGGTGAACGTCCGCTGTAA
【0384】
配列番号138 (改変 BoNT/A1 (M1144L) 核酸配列)
ATGCCGTTTGTGAACAAACAGTTCAACTATAAAGATCCGGTGAACGGTGTTGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAATCCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACATGAACTGATTCATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCAATTAATCCGAACCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCATATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGTCATTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACCAGCGGTAAATTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGATAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTATACCGAAGATAACTTCGTGAAGTTTTTCAAAGTGCTGAACCGCAAAACCTACCTGAACTTTGATAAAGCCGTGTTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTGAACTATACCATCTATGATGGTTTTAACCTGCGCAATACCAATCTGGCAGCAAACTTTAATGGTCAGAACACCGAAATCAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAGAACTTCACCGGTCTGTTCGAATTTTACAAACTGCTGTGTGTTCGTGGCATTATTACCtcCAAAACCAAAAGCCTGGATAAAGGTTATAACAAAGCCCTGAATGACCTGTGCATTAAAGTGAATAATTGGGACCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAAGATAACTTTACCAACGATCTGAATAAAGGCGAAGAAATTACCAGCGATACCAATATTGAAGCAGCCGAAGAAAACATTAGCCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTCAACTTTGATAACGAGCCGGAAAATATCAGCATTGAAAATCTGAGCAGCGATATTATTGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATTGAACGTTTTCCGAACGGCAAAAAATACGAGCTGGATAAATACACCATGTTCCATTATCTGCGTGCCCAAGAATTTGAACATGGTAAAAGCCGTATTGCCCTGACCAATTCAGTTAATGAAGCACTGCTGAACCCGAGCCGTGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGATTACGTGAAAAAGGTGAACAAAGCAACCGAAGCAGCAATGTTTTTAGGTTGGGTTGAACAGCTGGTGTATGATTTCACCGATGAAACCAGCGAAGTTAGCACCACCGATAAAATTGCAGATATCACCATTATCATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAATATTGGCAATATGCTGTATAAAGATGATTTCGTGGGTGCCCTGATTTTTAGCGGTGCAGTTATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATTGCCATTCCGGTTCTGGGCACCTTTGCACTGGTTAGCTATATTGCAAATAAAGTTCTGACCGTGCAGACCATTGATAATGCACTGAGCAAACGTAACGAGAAATGGGATGAAGTGTACAAATATATCGTGACCAATTGGCTGGCCAAAGTTAATACCCAGATTGATCTGATCCGCAAAAAAATGAAAGAAGCCCTGGAAAATCAGGCAGAAGCAACCAAAGCCATTATCAACTATCAGTATAACCAGTACACCGAAGAAGAGAAAAACAACATCAACTTCAACATCGATGACCTGAGCAGCAAACTGAATGAAAGCATCAATAAGGCCATGATTAACATCAACAAATTTCTGAATCAGTGCAGCGTGAGCTATCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGTGTGAAACGCCTGGAAGATTTTGATGCAAGCCTGAAAGATGCGCTGCTGAAATATATCTATGATAATCGTGGCACCCTGATTGGCCAGGTTGATCGTCTGAAAGATAAAGTTAACAATACCCTGAGTACCGACATTCCGTTTCAGCTGAGCAAATATGTTGATAATCAGCGTCTGCTGAGCACCTTTACCGAATATATCAAGAACATCATCAACACCAGCATTCTGAATCTGCGCTATGAAAGCAATCATCTGATCGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAAATCAACATTGGTAGCAAAGTGAACTTCGACCCGATTGATAAAAACCAGATTCAGCTGTTTAATCTGGAAAGCAGCAAAATCGAAGTGATCCTGAAAAACGCCATTGTGTATAACAGCATGTATGAGAATTTCTCGACCAGCTTTTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTAATAGCATCAGCCTGAACAACGAGTACACCATTATTAACTGCATGGAAAACAATAGCGGTTGGAAAGTGAGCCTGAATTATGGTGAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCCAAGAAATCAAACAGCGTGTTGTGTTCAAATACAGCCAGATGATTAATATCAGCGACTATATCAACCGCTGGATCTTTGTTACCATTACCAATAATCGCCTGAATAACAGCAAGATCTATATTAACGGTCGCCTGATTGATCAGAAACCGATTAGCAATCTGGGCAATATTCATGCGAGCAACAACATTATGTTTAAACTGGATGGTTGCCGTGATACCCATCGTTATATTTGGATCAAATACTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAACGAAAAAGAAATTAAAGACCTGTACGACAACCAGAGCAATTCCGGTATTCTGAAAGACTTTTGGGGAGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTATATGCTGAACCTGTATGACCCGAACAAATATGTGGATGTGAACAATGTTGGTATCCGTGGCTATATGTATCTGAAAGGTCCGCGTGGTAGCGTTcTGACCACCAACATTTATCTGAATAGCAGCCTGTATCGCGGTACGAAATTTATCATTAAAAAGTATGCCAGCGGCAACAAGGATAATATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTACATTAACGTTGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGCCTGGCAACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGCGCACTGGAAATTCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTTATGAAAAGCAAAAATGATCAGGGCATCACCAACAAGTGCAAAATGAATCTGCAGGACAATAACGGCAACGATATTGGTTTTATTGGCTTCCACCAGTTCAACAATATTGCGAAACTGGTTGCAAGCAATTGGTATAATCGTCAGATTGAACGTAGCAGTCGTACCCTGGGTTGTAGCTGGGAATTTATCCCTGTGGATGATGGTTGGGGTGAACGTCCGCTGTAA
ATGCCGTTTGTGAACAAACAGTTCAACTATAAAGATCCGGTGAACGGTGTTGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAATCCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACATGAACTGATTCATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCAATTAATCCGAACCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCATATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGTCATTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACCAGCGGTAAATTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGATAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTATACCGAAGATAACTTCGTGAAGTTTTTCAAAGTGCTGAACCGCAAAACCTACCTGAACTTTGATAAAGCCGTGTTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTGAACTATACCATCTATGATGGTTTTAACCTGCGCAATACCAATCTGGCAGCAAACTTTAATGGTCAGAACACCGAAATCAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAGAACTTCACCGGTCTGTTCGAATTTTACAAACTGCTGTGTGTTCGTGGCATTATTACCtcCAAAACCAAAAGCCTGGATAAAGGTTATAACAAAGCCCTGAATGACCTGTGCATTAAAGTGAATAATTGGGACCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAAGATAACTTTACCAACGATCTGAATAAAGGCGAAGAAATTACCAGCGATACCAATATTGAAGCAGCCGAAGAAAACATTAGCCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTCAACTTTGATAACGAGCCGGAAAATATCAGCATTGAAAATCTGAGCAGCGATATTATTGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATTGAACGTTTTCCGAACGGCAAAAAATACGAGCTGGATAAATACACCATGTTCCATTATCTGCGTGCCCAAGAATTTGAACATGGTAAAAGCCGTATTGCCCTGACCAATTCAGTTAATGAAGCACTGCTGAACCCGAGCCGTGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGATTACGTGAAAAAGGTGAACAAAGCAACCGAAGCAGCAATGTTTTTAGGTTGGGTTGAACAGCTGGTGTATGATTTCACCGATGAAACCAGCGAAGTTAGCACCACCGATAAAATTGCAGATATCACCATTATCATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAATATTGGCAATATGCTGTATAAAGATGATTTCGTGGGTGCCCTGATTTTTAGCGGTGCAGTTATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATTGCCATTCCGGTTCTGGGCACCTTTGCACTGGTTAGCTATATTGCAAATAAAGTTCTGACCGTGCAGACCATTGATAATGCACTGAGCAAACGTAACGAGAAATGGGATGAAGTGTACAAATATATCGTGACCAATTGGCTGGCCAAAGTTAATACCCAGATTGATCTGATCCGCAAAAAAATGAAAGAAGCCCTGGAAAATCAGGCAGAAGCAACCAAAGCCATTATCAACTATCAGTATAACCAGTACACCGAAGAAGAGAAAAACAACATCAACTTCAACATCGATGACCTGAGCAGCAAACTGAATGAAAGCATCAATAAGGCCATGATTAACATCAACAAATTTCTGAATCAGTGCAGCGTGAGCTATCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGTGTGAAACGCCTGGAAGATTTTGATGCAAGCCTGAAAGATGCGCTGCTGAAATATATCTATGATAATCGTGGCACCCTGATTGGCCAGGTTGATCGTCTGAAAGATAAAGTTAACAATACCCTGAGTACCGACATTCCGTTTCAGCTGAGCAAATATGTTGATAATCAGCGTCTGCTGAGCACCTTTACCGAATATATCAAGAACATCATCAACACCAGCATTCTGAATCTGCGCTATGAAAGCAATCATCTGATCGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAAATCAACATTGGTAGCAAAGTGAACTTCGACCCGATTGATAAAAACCAGATTCAGCTGTTTAATCTGGAAAGCAGCAAAATCGAAGTGATCCTGAAAAACGCCATTGTGTATAACAGCATGTATGAGAATTTCTCGACCAGCTTTTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTAATAGCATCAGCCTGAACAACGAGTACACCATTATTAACTGCATGGAAAACAATAGCGGTTGGAAAGTGAGCCTGAATTATGGTGAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCCAAGAAATCAAACAGCGTGTTGTGTTCAAATACAGCCAGATGATTAATATCAGCGACTATATCAACCGCTGGATCTTTGTTACCATTACCAATAATCGCCTGAATAACAGCAAGATCTATATTAACGGTCGCCTGATTGATCAGAAACCGATTAGCAATCTGGGCAATATTCATGCGAGCAACAACATTATGTTTAAACTGGATGGTTGCCGTGATACCCATCGTTATATTTGGATCAAATACTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAACGAAAAAGAAATTAAAGACCTGTACGACAACCAGAGCAATTCCGGTATTCTGAAAGACTTTTGGGGAGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTATATGCTGAACCTGTATGACCCGAACAAATATGTGGATGTGAACAATGTTGGTATCCGTGGCTATATGTATCTGAAAGGTCCGCGTGGTAGCGTTcTGACCACCAACATTTATCTGAATAGCAGCCTGTATCGCGGTACGAAATTTATCATTAAAAAGTATGCCAGCGGCAACAAGGATAATATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTACATTAACGTTGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGCCTGGCAACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGCGCACTGGAAATTCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTTATGAAAAGCAAAAATGATCAGGGCATCACCAACAAGTGCAAAATGAATCTGCAGGACAATAACGGCAACGATATTGGTTTTATTGGCTTCCACCAGTTCAACAATATTGCGAAACTGGTTGCAAGCAATTGGTATAATCGTCAGATTGAACGTAGCAGTCGTACCCTGGGTTGTAGCTGGGAATTTATCCCTGTGGATGATGGTTGGGGTGAACGTCCGCTGTAA
【0385】
配列番号139 (ポリペプチド配列, BoNT/A2 - UniProt D3IV23)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLN
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GSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAEHRLYGIAINPN
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KSIIGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVNFFKV
INRKTYLNFDKAVFRINIVPDENYTIKDGFNLKGANLSTNFNGQNTEINSRNFTRLKNFT
GLFEFYKLLCVRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLDKVEE
ITADTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFDFDNEPENISIENLSSDIIGQLEPMPNIERFPNG
KKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGDSRIILTNSAEEALLKPNVAYTFFSSKYVKKINKAVEA
FMFLNWAEELVYDFTDETNEVTTMDKIADITIIVPYIGPALNIGNMLSKGEFVEAIIFTG
VVAMLEFIPEYALPVFGTFAIVSYIANKVLTVQTINNALSKRNEKWDEVYKYTVTNWLAK
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MININKFLDQCSVSYLMNSMIPYAVKRLKDFDASVRDVLLKYIYDNRGTLILQVDRLKAE
VNNTLSTDIPFQLSKYVENKKLLSTFTEYIKNITNTSILSIVVDKDDELIDLSRYGAEIY
RGDKVFYNSIDKNQIKLINLESSTIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIKIPKYFSKINLN
NEYTIINCIENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDNKQNIQRVVFKYSQMVNISDYINRWIFVTI
TNNRLTKSKIYINGRLIDQKLISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDPGRYIVIKYFNLFDKEL
NEKEIKDLYDSQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGP
RGSVVTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQ
AGVEKILSALEIPDVGNLSQLVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGLIGFHQFNNIA
KLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSQ
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLN
PPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGG
STIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHDVLNLTRNGY
GSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAEHRLYGIAINPN
RVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDVASTLNKA
KSIIGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVNFFKV
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FMFLNWAEELVYDFTDETNEVTTMDKIADITIIVPYIGPALNIGNMLSKGEFVEAIIFTG
VVAMLEFIPEYALPVFGTFAIVSYIANKVLTVQTINNALSKRNEKWDEVYKYTVTNWLAK
VNTQIDLIREKMKKALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINSA
MININKFLDQCSVSYLMNSMIPYAVKRLKDFDASVRDVLLKYIYDNRGTLILQVDRLKAE
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NEYTIINCIENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDNKQNIQRVVFKYSQMVNISDYINRWIFVTI
TNNRLTKSKIYINGRLIDQKLISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDPGRYIVIKYFNLFDKEL
NEKEIKDLYDSQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNIGIRGYMYLKGP
RGSVVTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNEDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQ
AGVEKILSALEIPDVGNLSQLVVMKSKDDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGLIGFHQFNNIA
KLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSQ
【0386】
配列番号140 (ポリペプチド配列, BoNT/A5 v.1 - UniProt C7BEA8)
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KKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIVLTNSVNEALLNPSSVYTFFSSDYVRKVNKATEA
AMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSG
AVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWGEVYKYIVTNWLAK
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MININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDK
VNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASEINI
GSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEIILKNAIVYNSMYENFSTSFWIKIPKYFSKINLNN
EYTIINCIENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDNKQNIQRVVFKYSQMVAISDYINRWIFITIT
NNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDPQRYIWIKYFNLFDKELN
EKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGNYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPR
GSIVTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQA
GVEKILSVLEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIDK
LVASNWYNRQIERSSRTFGCSWEFIPVDDGWGESPL
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLN
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STIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHDVLNLTRNGY
GSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPN
RVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGEHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKA
KSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKV
LNRKTYLNFDKAVFKINIVPEVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFT
GLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEE
ITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNG
KKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIVLTNSVNEALLNPSSVYTFFSSDYVRKVNKATEA
AMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSG
AVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWGEVYKYIVTNWLAK
VNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIGDLSSKLNDSINKA
MININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDK
VNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASEINI
GSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEIILKNAIVYNSMYENFSTSFWIKIPKYFSKINLNN
EYTIINCIENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDNKQNIQRVVFKYSQMVAISDYINRWIFITIT
NNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDPQRYIWIKYFNLFDKELN
EKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGNYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPR
GSIVTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQA
GVEKILSVLEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIDK
LVASNWYNRQIERSSRTFGCSWEFIPVDDGWGESPL
【0387】
配列番号141 (ポリペプチド配列, BoNT/A5 v.2 - UniProt C1IPK2)
MLFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLN
PPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTELGRMLLTSIVRGIPFWGG
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GSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPN
RVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGEHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKA
KSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKV
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AVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWGEVYKYIVTNWLAK
VNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIGDLSSKLNDSINKA
MININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDK
VNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASEINI
GSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEIILKNAIVYNSMYENFSTSFWIKIPKYFSKINLNN
EYTIINCIENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDNKQNIQRVVFKYSQMVAISDYINRWIFITIT
NNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDPHRYIWIKYFNLFDKELN
EKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGNYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPR
GSIVTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQA
GVEKILSVLEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIDK
LVASNWYNRQIERSSRTFGCSWEFIPVDDGWGESPL
MLFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLN
PPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTELGRMLLTSIVRGIPFWGG
STIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHDVLNLTRNGY
GSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPN
RVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGEHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKA
KSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKV
LNRKTYLNFDKAVFKINIVPEVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFT
GLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDEGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEE
ITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNG
KKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIVLTNSVNEALLNPSSVYTFFSSDYVRKVNKATEA
AMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSG
AVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWGEVYKYIVTNWLAK
VNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIGDLSSKLNDSINKA
MININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDK
VNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASEINI
GSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEIILKNAIVYNSMYENFSTSFWIKIPKYFSKINLNN
EYTIINCIENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDNKQNIQRVVFKYSQMVAISDYINRWIFITIT
NNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDPHRYIWIKYFNLFDKELN
EKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGNYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPR
GSIVTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQA
GVEKILSVLEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIDK
LVASNWYNRQIERSSRTFGCSWEFIPVDDGWGESPL
【0388】
配列番号142 (ポリペプチド配列, BoNT/A6 - ACW83608.1, Accession # FJ981696)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPV
SYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQP
DGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGA
GKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQEN
EFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYT
EDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFAKLKNFT
GLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAA
EENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLSAQEFE
HGKSRIDLTNSVNEALLNPSHVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADI
TIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFAIVSYIANKVLTVQTINNALS
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【0389】
配列番号143 (ポリペプチド配列, BoNT/A7 - GenBank: AFV13854.1, Accession# JQ954969.1)
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【0390】
配列番号144 (ポリペプチド配列, BoNT/A8 - GenBank: AJA05787.1, Accession# KM233166)
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KLVASNWYNRQVGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSQ
【実施例】
【0391】
材料&方法
【0392】
強制酸化研究
【0393】
0.5mLのAmiconスピンカラムを使用して緩衝溶液を交換することによって、BoNT分子を強制酸化に付した。酸化するために使用されるバッファーは、20mMクエン酸バッファーpH5.0中の0.001%過酸化水素とした。バッファー交換後、サンプルを暗所で、最大72時間の所望の期間インキュベートし、その後、過剰のメチオニンの添加によって酸化反応をクエンチした。LC MSペプチドマッピングを使用して、試験された分子の酸化を算出した。100mM Tris pH7.6中の1M尿素の添加によってサンプルを変性し、その後、それぞれDTTおよびヨードアセトアミドの添加によって還元し、アルキル化し、次いで、それらを暗所で30分間インキュベートした。次いで、消化のために0.5mLのAmiconスピンカラムを使用してサンプルを100mMのTris pH7.6中の1M尿素にバッファー交換した。トリプシンを添加し、サンプルを37℃で4時間インキュベートして、タンパク質を消化した。LC MSを、acquity H-Class Bio UPLCに連結されたWaters SYNAPT G2-Si(Tof)質量分析計で実施した。10マイクロリットルのアリコートをAcquity BEH C18カラム130Å、1.7μm、2.1×150mm上に注入し、0.2ml/分の流速で93分のUPLC勾配によって分析した。UPLC勾配は、以下の表に示されており、移動相Aは、水中の0.02% TFAから構成され、移動相Bは、アセトニトリル中の0.02% TFAから構成された。
【表D】
【0394】
UNIFIソフトウェアでの低エネルギーおよび高衝突エネルギースキャン実行から構成されるMSE法を使用してデータを獲得した。
【0395】
細胞ベースの活性アッセイ
【0396】
細胞ベースの活性アッセイは、操作されたニューロンげっ歯類クローン細胞株を使用する。毒素の添加は、毒素標的の受容体結合、転位置およびタンパク質分解切断を介した内部移行につながる。細胞株は、全長SNAP-25(BoNT/Aの天然タンパク質分解標的)を発現し、アッセイにおいてその切断が測定される。平行曲線試験によって、および試験サンプルのEC50を参照標準のEC50と比較することによって、参照標準に対する毒素サンプルの効力を決定した。1日目に、細胞を3つの組織培養プレートの内側ウェル中に分注し、15～25分間沈降させ、次いで、5% CO2を用いて37℃で1～1.5時間インキュベートした。次いで、培地を成長培地からアッセイ培地に変更し、細胞を5% CO2を用いて37℃で一晩インキュベートした。2日目に、調査のためのサンプルをアッセイ培地で希釈し、所望の濃度でウェルに添加し、次いで、プレートを5% CO2を用いて37℃で72時間インキュベートした。5日目に、Tecan INFINITE M1000 PROプレートリーダーを使用して蛍光を測定した。
【0397】
コンピュータモデリング
【0398】
M1144置換を優先するコンピュータ解析を、Molecular Operating Environment視覚化ソフトウェア(MOE-Chemical Computing Group ULC)を使用してBoNT/A結晶構造(3BTA.pdb)で実施した。残基スキャンモジュールによって生成した集合から突然変異体の平均構造特性を評価した。野生型分子に対して比較された、表面積および親水性/疎水性パッチの変動ならびに3D確認および分子間相互作用に対する予測される影響を評価した。野生型M1144のタンパク質構造および相互作用ネットワークへの破壊を最小にした突然変異が優先された。
【0399】
BoNT/Aの突然変異
【0400】
NEB製のQ5キット(E0554S)を使用して、発現ベクターにおけるM1144コドンの部位特異的突然変異誘発によってBoNT/A遺伝子配列の突然変異(大腸菌における発現のために最適化されたコドン)を実施した。NEBase Changerソフトウェアを使用して、ATG(メチオニン)コドンをGTG(バリン)またはCTG(ロイシン)に変えるようにプライマーを設計した。得られたプライマーを使用してPCRによってプラスミドを増幅した。次いで、キナーゼ/リガーゼ/DpnI混合物を用いて得られたDNAを処置して、増幅されたDNAをライゲーションし、プラスミドDNA鋳型を消化した。次いで、反応混合物を化学的にコンピテントな大腸菌と混合し、42℃の熱ショックを使用して形質転換した。LB寒天プレートで抗生物質選択を使用して形質転換体を選択した。コロニーを選び、一晩培養物に播種した。培養物を遠心分離によって回収し、Wizard Plus SV Miniprepキット(Promega)を使用してシーケンシング分析のためにプラスミドDNAを調製した。Sanger Sequencingによって突然変異を確認した。使用したすべてのプラスミドは、lacオペレーターの制御下に目的の遺伝子のプロモーター領域を含有しており、そのようなものとして、IPTGの添加によって発現が誘導可能であった。
【0401】
改変BoNT/Aの発現、活性化および精製
【0402】
選択された細胞バンクから播種された100mLの培養物で発現を開始し、改変テリフィックブロスを使用して選択抗生物質の存在下で37℃で一晩増殖させた。次いで、一晩培養物を使用して、1Lの主培養物に播種し、次いで、これを0.5～1.0AUのOD600nmまで37℃でインキュベートした。所望のOD600nmが到達された時点で温度を16℃に1時間低下させた。温度低下後、1mM IPTGを使用して発現を誘導し、培養物を20時間増殖させ、その後、遠心分離によって回収した。
【0403】
細胞を50mMのTris pH8.0、200mM NaCl中に3mL/湿潤細胞重量1gで再懸濁し、氷上で超音波処理(Misonix 3000超音波処理器)によって溶解した。サンプルを、硫酸アンモニウム(NH4)2SO4の添加によって捕捉カラムにロードするために適当な状態にし、次いで、クロマトグラフィーステップの前に遠心分離によって清澄化した。疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を使用して標的タンパク質を捕捉し、硫酸アンモニウム勾配(1M～0M(NH4)2SO4)にわたって溶出した。SDS-PAGEによって画分を分析し、BoNTを含有するものをプールし、陰イオン交換クロマトグラフィー(AIEX)を使用する中間精製にとって適当な状態にした。適当な状態にしたサンプルをイオン交換カラムにロードし、25mMから1Mまで漸増する塩化ナトリウム(NaCl)勾配にわたって溶出した。SDS-PAGE分析後にBoNTを含有する画分をプールし、Lys-Cを使用して活性化した。総タンパク質1mgあたり0.5μgのLys-Cを添加し、2～8℃で18時間活性化を実施した。次いで、HICを使用する最終ポリッシングクロマトグラフィーステップの前に、サンプルをNaClの添加によって適当な状態にした。タンパク質を漸減NaCl勾配(3M～0M)にわたって溶出した。活性化BoNTを含有する画分をプールし、0.5～1.0mg/mLに濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィーによってPBS pH7.2にバッファー交換し、その後、-80℃で保存した。
【0404】
[実施例1]
【0405】
ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)の酸化
【0406】
ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)を、上記のように酸化剤過酸化水素に対する曝露によって強制酸化に付した。次いで、質量分析を利用して、BoNT/A分子内のペプチドの酸化のレベルを評価し、酸化の特異的部位を質量の変化によって同定/評価した。分析に基づいて、いくつかの酸化されたBoNT/Aペプチドが同定された。
【0407】
酸化されたBoNT/Aも、上記のように細胞ベースの活性アッセイにおいて試験した。BoNT/Aの1144位(M1144)に対応するメチオニン残基での酸化されたペプチドの数(図1および図2、「酸化」)と、活性(図1および図2、「活性」)の間に相関があることがわかった。言い換えれば、M1144での酸化は、BoNT/A活性の酸化依存性喪失の主な原因であるとわかった。
【0408】
M1144は、SV2c標的結合領域でBoNT/A(HCCドメイン)のHCドメインのC末端部分に存在するアミノ酸である。
【0409】
[実施例2]
【0410】
BoNT/Aのモデリング改変
【0411】
酸化感受性の候補としてM1144が同定され、この残基での酸化を妨げようとして、この部位に突然変異を導入した。既存のBoNT/A結晶構造を使用してコンピュータモデリングを実施して、種々の改変の構造的効果を予測し、スコア化した。
【0412】
モデリングに基づいて、以下の置換が検討された:M1144V(バリン)、M1114G(グリシン)、M1144L(ロイシン)、M1144T(スレオニン)、M1144A(アラニン)およびM1144I(イソロイシン)。M1144V、M1144GおよびM1144Lを、それぞれ、その低いエネルギー値ならびに疎水性および親水性面に対する低減された影響のために(M1144Tに対して)、大きな側鎖がなく、それによって、隣接する側鎖へのより少ない妨害を保証することによって(M1144Aに対して)、および側鎖位置があまり破壊的ではないことによって(M1144Iに対して)ショートリストに載せた。
【0413】
[実施例3]
【0414】
M1144のバリンとの置換
【0415】
上記のようにM1144のバリンへの突然変異を実施して、改変BoNT/Aを生成した。単鎖改変BoNT/Aを大腸菌において発現させ、カラムクロマトグラフィーを使用して精製し、その後、Lys-Cを使用するタンパク質分解活性化を行った。図3は、単鎖改変BoNT/Aが、高レベルの純度のものであった(約100%、図3「-」)ことおよびLys-CがBoNT/Aを対応する二本鎖形態に切断した(活性化は、約100%であった、図3「+」)ことを示す。
【0416】
改変二本鎖BoNT/Aを、強制酸化(上記のように)に付し、細胞ベースのアッセイを介して活性を評価した。図4は、M1144V置換によって、1144位での酸化が妨げられたことを示す(「酸化」を参照されたい)。しかし、驚くべきことに、改変は、BoNT/A活性の酸化依存性喪失を妨げるだけでなく、改変BoNT/Aの活性を有意に増大した(図4、「活性」を参照されたい)。
【0417】
[実施例4]
【0418】
M1144のロイシンとの置換
【0419】
上記のようにM1144のロイシンへの突然変異を実施して、改変BoNT/Aを生成した。記載されるように、単鎖改変BoNT/Aを発現させ、精製し、活性化した。
【0420】
[実施例5]
【0421】
BoNT/A M1144VおよびM1144Lの活性
【0422】
BoNT/A M1144LおよびM1144Vを、細胞ベースの活性アッセイにおいて未改変BoNT/Aと比較した。EC50(最大有効濃度の半分)値を決定し、相対活性を以下のように算出した:
(未改変BoNT/A EC50/改変BoNT/A EC50)×100=相対活性
未改変BoNT/Aの活性を100%に設定した。
(未改変BoNT/A EC50/改変BoNT/A EC50)×100=相対活性
未改変BoNT/Aの活性を100%に設定した。
【0423】
【表1】
【0424】
上記の表は、BoNT/A M1144VおよびM1144Lの両方が、非酸化(または低酸化)条件下でさえ未改変BoNT/Aよりも実質的により活性であることを示す。
【0425】
[実施例6]
【0426】
BoNT/A M1144LおよびBoNT/A M1144VのSV2cへの結合
【0427】
Biacore 8K(Cytiva)で25℃で結合実験を実施した。ランニングバッファーとしてHBS-EP+(10mM Hepes、150mM NaCl、3mM EDTAおよび0.05% v/v Tween 20、pH7.4)を使用して固定化を実施した。標準EDC/NHSアミンカップリングを使用して、GST-SV2cを約50共鳴単位(RU)の密度にシリーズS CM5センサーチップ(Cytiva)のFc2にカップリングした。Fc1はEDC/NHSによってブランク固定化し、その後、1Mエタノールアミン(Cytiva)を用いてブロッキングした。
【0428】
動態測定のために、0.1mg/mlのBSAを補給したHBS-EP+を、30μl/分の流速でランニングバッファーとして使用した。シングルサイクル法を使用し、500～7.8nMを含む1:1希釈系列でボツリヌス毒素を注射した。会合が7つの漸増濃度にわたって200秒間モニタリングされ、単一の600秒の解離が続いた。各サイクル後、10μl/分の10mMのグリシンpH1.5(Cytiva)の60秒の注射を用いて表面を再生した。
【0429】
結合親和性および動態学を、不均一結合モデル(Biacore Insight Evaluationソフトウェア)を使用して二重参照結合曲線をフィッティングすることによって決定した。
【0430】
BoNT/A M1144LおよびBoNT/A M1144Vの結合親和性および動態学を、CLD1040で表された野生型BoNT/A(「BoNT/A CLD1040」)と比較した。結果は、以下の表に、ならびに図5AおよびBにおいて図表で提示されている。
【0431】
【表2】
【0432】
【表3】
【0433】
野生型BoNT/Aと比較して、BoNT/A M1144Vは、KD1およびKD2の両方においてSV2cに対する親和性の統計的に有意な増大を示した。BoNT/A M1144Lは、KD1およびKD2の両方においてSV2cに対する親和性のさらに大きな(統計的に有意な)増大を示した。
【0434】
結論として、前記の親和性の増大が、BoNT/A M1144VおよびM1144Lの活性の改善の根底にある作用機序である可能性が高い。
【0435】
[実施例7]
【0436】
M1144のグリシンとの置換
【0437】
M1144のグリシンへの突然変異を、改変BoNT/Aを生成するためのM1144のバリンとの置換について上記で記載されたように実施した。単鎖改変BoNT/Aを、記載されたように発現させ、精製し、活性化した。
【0438】
[実施例8]
【0439】
酸化および非酸化条件におけるBoNT/A M1144LおよびBoNT/A M1144Gの活性
【0440】
BoNT/A M1144LおよびBoNT/A M1144Gの調製物を上記のように強制酸化に付し、その活性を細胞ベースのアッセイにおいて試験した。酸化条件に対する曝露の前のBoNT/A M1144LまたはBoNT/A M1144G(それぞれ)と比較して、酸化条件において72時間後にBoNT/A M1144LまたはBoNT/A M1144Gの活性に統計的に有意な差はなかった。
【0441】
上記の明細書に記載されているすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法およびシステムの様々な改変および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されるべきである。実際、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施するための記載された様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内にあると意図されている。
【符号の説明】
【0442】
[図1、2、及び4]
Activity: 活性
Oxidation: 酸化
% Relative to T=0: T=0に対する相対百分率
Time (Hours): 時間(h)
[図3]
Activation: 活性化
Single-chain: 単鎖
H-chain: H鎖
L-chain: L鎖
[図5A]
on rate (1/Ms)±SD: 結合(on)速度(1/Ms)±標準偏差
[図5B]
off rate (1/Ms)±SD: 解離(off)速度(1/Ms)±標準偏差
Activity: 活性
Oxidation: 酸化
% Relative to T=0: T=0に対する相対百分率
Time (Hours): 時間(h)
[図3]
Activation: 活性化
Single-chain: 単鎖
H-chain: H鎖
L-chain: L鎖
[図5A]
on rate (1/Ms)±SD: 結合(on)速度(1/Ms)±標準偏差
[図5B]
off rate (1/Ms)±SD: 解離(off)速度(1/Ms)±標準偏差
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【配列表】
【国際調査報告】