特表 2024-512418 新規な免疫活性インターロイキン２アナログ結合体及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-19

(54)【発明の名称】新規な免疫活性インターロイキン２アナログ結合体及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/55 20060101AFI20240312BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240312BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 15/26 20060101ALN20240312BHJP

   C12P 21/02 20060101ALN20240312BHJP

【ＦＩ】

C07K14/55

A61K38/20 ZNA

A61K47/68

A61P35/00

A61P35/04

C12N15/26

C12P21/02 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023555563

(86)(22)【出願日】2022-03-31

(85)【翻訳文提出日】2023-09-11

(86)【国際出願番号】 KR2022004620

(87)【国際公開番号】W WO2022211537

(87)【国際公開日】2022-10-06

(31)【優先権主張番号】10-2021-0042305

(32)【優先日】2021-03-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】515022445

【氏名又は名称】ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(72)【発明者】

【氏名】ホ ヨンホ

(72)【発明者】

【氏名】オ ウリム

(72)【発明者】

【氏名】パク ダヒョン

(72)【発明者】

【氏名】キム ジンヨン

(72)【発明者】

【氏名】パク ジュンソプ

(72)【発明者】

【氏名】キム ユヨン

(72)【発明者】

【氏名】リ アラム

(72)【発明者】

【氏名】キム サンユン

【テーマコード（参考）】

4B064

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG05

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4C076AA11

4C076AA22

4C076AA36

4C076AA53

4C076BB01

4C076BB11

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF31

4C076FF34

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA21

4C084BA41

4C084DA14

4C084MA16

4C084MA17

4C084MA23

4C084MA35

4C084MA37

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA11

4C084NA12

4C084NA14

4C084ZB26

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045DA04

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、インターロイキン２受容体に対する結合力が変化したインターロイキン２アナログの持続型結合体に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

インターロイキン２アナログ（analog）を含む持続型結合体であって、下記化学式（１）で表される持続型結合体。

【化1】

ここで、Ｘはアルデスロイキン（aldesleukin）に比べてインターロイキン２β受容体結合力が増大したインターロイキン２アナログ（analog）であり、
Ｌはポリエチレングリコールリンカーであり、
ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、
Ｆは二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であり、
－はＸとＬ間、ＬとＦ間の共有結合連結を示すものであり、
前記インターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２において、１番目、１２番目、１８番目、１９番目、２０番目、２２番目、３２番目、３５番目、３８番目、４２番目、４３番目、４５番目、４８番目、４９番目、６１番目、６８番目、６９番目、７４番目、７６番目、８０番目、８１番目、８２番目、８４番目、８５番目、８６番目、８７番目、８８番目、８９番目、９１番目、９２番目、９４番目、９５番目、９６番目、１２５番目、１２６番目及び１３３番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つが変異した配列を含むものである。

【請求項2】

前記インターロイキン２アナログは、インターロイキン２α受容体に対する結合力がアルデスロイキンとは異なることを特徴とする、請求項１に記載の持続型結合体。

【請求項3】

前記１３３番目の位置に相当するアミノ酸に少なくとも１つのアミノ酸が付加されたものである、請求項１に記載の持続型結合体。

【請求項4】

前記インターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものである、請求項１に記載の持続型結合体。

【請求項5】

前記インターロイキン２アナログは、１個～１０個のアミノ酸置換をさらに含むものである、請求項４に記載の持続型結合体。

【請求項6】

前記インターロイキン２アナログは、１８番目、１９番目、２０番目、２２番目、３８番目、４２番目、４３番目、４５番目、６１番目、６８番目、６９番目、７４番目、８０番目、８１番目、８４番目、８５番目、８６番目、８８番目、８９番目、９１番目、９２番目、９４番目及び９６番目の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸にさらに置換されたものである、請求項５に記載の持続型結合体。

【請求項7】

前記インターロイキン２アナログは、１８番目、２２番目、３８番目、４２番目、６１番目、６８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸にさらに置換されたものである、請求項５に記載の持続型結合体。

【請求項8】

前記インターロイキン２アナログは、次のアナログのいずれかである、請求項１に記載の持続型結合体。
（ａ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び３２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び３５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｃ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び３８番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｄ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び４２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｅ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び４３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｆ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び４８番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｇ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び４９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｈ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び７６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｉ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８１番目、９２番目、９４番目及び９６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｊ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び８７番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｋ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目及び４２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｌ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目及び８０番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｍ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目及び８４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｎ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１９番目、３８番目及び４２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｏ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が除去され、１２５番目、１２番目、３８番目及び４２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｐ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び６１番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｑ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び８４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｒ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び８８番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｓ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び８９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｔ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び９１番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｕ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び９４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｖ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び１２６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｗ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８０番目及び８４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｘ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、９４番目及び９６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｙ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｚ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、６１番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａａ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｂ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８０番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｃ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８１番目、８４番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｄ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、２０番目、３８番目、４２番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｅ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｆ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、７４番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｇ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８１番目、８４番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｈ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８１番目、８８番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｉ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｊ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８０番目、８１番目、８５番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｋ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８０番目、８１番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｌ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｍ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、４５番目、７４番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｎ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、７４番目、８０番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｏ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８４番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｐ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、４５番目、８０番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｑ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｒ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｓ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、６１番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｔ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、６９番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｕ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目、９１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｖ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｗ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｘ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、４５番目、７４番目、８０番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｙ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、６８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｚ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、６９番目、７４番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂａ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８４番目、８５番目、８６番目、９１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｂ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目、９２番目、９４番目及び９６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｃ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、１９番目、２２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｄ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、３８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｅ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、６１番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｆ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、６８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｇ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｈ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、４５番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｉ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目、９１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｊ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目、９２番目及び９５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｋ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３５番目、３８番目、４２番目、７４番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｌ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、４３番目、６１番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｍ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目、９１番目、９２番目及び９５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｎ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３５番目、３８番目、４２番目、７４番目、８０番目、８１番目、８２番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｏ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｐ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８５番目及び８６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ

【請求項9】

前記アミノ酸置換は、次のアミノ酸置換からなる群から選択されるいずれかである、請求項８に記載の持続型結合体。
（ａ）１２番目のアミノ酸のバリン又はフェニルアラニンへの置換
（ｂ）１８番目のアミノ酸のアルギニンへの置換
（ｃ）１９番目のアミノ酸のチロシン、バリン、フェニルアラニン、アルギニンへの置換
（ｄ）２０番目のアミノ酸のバリン又はフェニルアラニンへの置換
（ｅ）２２番目のアミノ酸のグルタミン酸への置換
（ｆ）３２番目のアミノ酸のシステインへの置換
（ｇ）３５番目のアミノ酸のシステイン又はグルタミン酸への置換
（ｈ）３８番目のアミノ酸のアラニン又はアスパラギン酸への置換
（ｉ）４２番目のアミノ酸のリシン、アラニン又はトリプトファンへの置換
（ｊ）４３番目のアミノ酸のシステイン、グルタミン酸又はグルタミンへの置換
（ｋ）４５番目のアミノ酸のアラニンへの置換
（ｌ）４８番目のアミノ酸のシステインへの置換
（ｍ）４９番目のアミノ酸のシステインへの置換
（ｎ）６１番目のアミノ酸のグルタミン、アルギニン又はアスパラギン酸への置換
（ｏ）６８番目のアミノ酸のアスパラギン酸又はグルタミンへの置換
（ｐ）６９番目のアミノ酸のグリシンへの置換
（ｑ）７４番目のアミノ酸のヒスチジン又はアラニンへの置換
（ｒ）７６番目のアミノ酸のシステインへの置換
（ｓ）８０番目のアミノ酸のフェニルアラニン、チロシン、バリン、アスパラギン酸又はトリプトファンへの置換
（ｔ）８１番目のアミノ酸のアスパラギン酸、グルタミン酸又はアスパラギンへの置換
（ｕ）８２番目のアミノ酸のグリシン又はバリンへの置換
（ｖ）８４番目のアミノ酸のグルタミン酸、バリン又はフェニルアラニンへの置換
（ｗ）８５番目のアミノ酸のバリン、アラニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、トレオニン、イソロイシン、グルタミン酸又はフェニルアラニンへの置換
（ｘ）８６番目のアミノ酸のバリン、アラニン、グリシン又はロイシンへの置換
（ｙ）８７番目のアミノ酸のシステインへの置換
（ｚ）８８番目のアミノ酸のグルタミン、バリン又はフェニルアラニンへの置換
（ａａ）８９番目のアミノ酸のフェニルアラニンへの置換
（ａｂ）９１番目のアミノ酸のトレオニン、フェニルアラニン又はグルタミン酸への置換
（ａｃ）９２番目のアミノ酸のフェニルアラニン、ロイシン、チロシン又はトリプトファンへの置換
（ａｄ）９４番目のアミノ酸のフェニルアラニン又はバリンへの置換
（ａｅ）９５番目のアミノ酸のアスパラギン酸への置換
（ａｆ）９６番目のアミノ酸のフェニルアラニン、バリン又はイソロイシンへの置換
（ａｇ）１２５番目のアミノ酸のセリンへの置換
（ａｈ）１２６番目のアミノ酸のトレオニンへの置換

【請求項10】

前記インターロイキン２アナログは、次のアナログのいずれかである、請求項８に記載の持続型結合体。
（ａ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｃ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｄ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｅ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、６１番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｆ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、６８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ

【請求項11】

前記アミノ酸置換は、次のアミノ酸置換からなる群から選択されるいずれかである、請求項１０に記載の持続型結合体。
（ａ）１８番目のアミノ酸のアルギニンへの置換
（ｂ）２２番目のアミノ酸のグルタミン酸への置換
（ｃ）３８番目のアミノ酸のアラニンへの置換
（ｄ）４２番目のアミノ酸のリシンへの置換
（ｅ）６１番目のアミノ酸のアスパラギン酸への置換
（ｆ）６８番目のアミノ酸のアスパラギン酸への置換
（ｇ）８０番目のアミノ酸のフェニルアラニンへの置換
（ｈ）８１番目のアミノ酸のグルタミン酸への置換
（ｉ）８５番目のアミノ酸のバリンへの置換
（ｊ）８６番目のアミノ酸のバリンへの置換
（ｋ）９２番目のアミノ酸のフェニルアラニンへの置換
（ｌ）１２５番目のアミノ酸のセリンへの置換

【請求項12】

前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来のもの、又はそれらの組み合わせ（combination）もしくはそれらのハイブリッド（hybrid）である、請求項１に記載の持続型結合体。

【請求項13】

前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項１に記載の持続型結合体。

【請求項14】

前記免疫グロブリンＦｃ領域は、非グリコシル化されたものである、請求項１に記載の持続型結合体。

【請求項15】

前記Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含み、前記エチレングリコール繰り返し単位部分（moiety）の化学式量は、１～１００ｋＤａの範囲にある、請求項１に記載の持続型結合体。

【請求項16】

前記持続型結合体は、前記二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域のいずれかのＦｃ領域に１分子のＸが前記ポリエチレングリコールリンカーを介して共有結合的に連結されたものである、請求項１に記載の持続型結合体。

【請求項17】

下記化学式（２）で表されるインターロイキン２アナログの持続型結合体。

【化2】

ここで、Ｘは配列番号３～１０６のアミノ酸配列から選択されるいずれかのポリペプチド配列を含むインターロイキン２アナログであり、
Ｚはポリエチレングリコールリンカーであって、分子量２ｋＤａ～３０ｋＤａのリンカーであり、
Ｆｃは二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であり、
－はＸとＺ間、ＺとＦｃ間の共有結合連結を示すものであり、
前記持続型結合体は、前記二量体形態のＦｃ領域のうち１本のポリペプチド鎖にのみＺの一末端が共有結合により連結され、そのＺの反対側の末端に１分子のＸが共有結合により連結されたものである。

【請求項18】

前記インターロイキン２アナログは、配列番号１０、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２１、２２、３２、３５、３６、４２、５３、５４、５６、５８、５９、６０、６２、７１、７２、７４、７５、７６、７７、７８、８５、８７、８９、９１、９２、９３、９４、９５、９８、９９、１００、１０１、１０３、１０４、１０５及び１０６のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかの配列を含むものである、請求項１７に記載の持続型結合体。

【請求項19】

前記インターロイキン２アナログは、配列番号１０、１３、１４、１６、１７、２０、２１、２２、３２、３５、３６、４２、５３、５４、８７、８９、９１、９２、９３、９４、９８、９９、１００、１０１、１０３、１０４及び１０５のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかの配列を含むものである、請求項１７に記載の持続型結合体。

【請求項20】

前記インターロイキン２アナログは、配列番号２２、４２、５３、８７、１０５及び１０６のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかの配列を含むものである、請求項１７に記載のインターロイキン２アナログ。

【請求項21】

前記インターロイキン２アナログは、Ｃ末端に少なくとも１つのアミノ酸をさらに含むものである、請求項１７に記載の持続型結合体。

【請求項22】

下記化学式（３）で表されるインターロイキン２アナログの持続型結合体。

【化3】

ここで、Ｘ’は下記一般式１で表されるアミノ酸配列を含むインターロイキン２アナログであり、
Ｚはポリエチレングリコールリンカーであって、分子量２ｋＤａ～３０ｋＤａのリンカーであり、
Ｆｃは二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であり、
－はＸ’とＺ間、ＺとＦｃ間の共有結合連結を示すものであり、
前記持続型結合体は、前記二量体形態のＦｃ領域のうち１本のポリペプチド鎖にのみＺの一末端が共有結合により連結され、そのＺの反対側の末端に１分子のＸ’が共有結合により連結されたものである。
［一般式１］
Ｘ１－Ｐ－Ｔ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｔ－Ｋ－Ｋ－Ｔ－Ｑ－Ｌ－Ｑ－Ｌ－Ｅ－Ｈ－Ｌ－Ｘ１８－Ｘ１９－Ｄ－Ｌ－Ｘ２２－Ｍ－Ｉ－Ｌ－Ｎ－Ｇ－Ｉ－Ｎ－Ｎ－Ｙ－Ｋ－Ｎ－Ｐ－Ｋ－Ｌ－Ｔ－Ｘ３８－Ｍ－Ｌ－Ｔ－Ｘ４２－Ｘ４３－Ｆ－Ｘ４５－Ｍ－Ｐ－Ｋ－Ｋ－Ａ－Ｔ－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｈ－Ｌ－Ｑ－Ｃ－Ｌ－Ｅ－Ｘ６１－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｐ－Ｌ－Ｅ－Ｘ６８－Ｖ－Ｌ－Ｎ－Ｌ－Ａ－Ｘ７４－Ｓ－Ｋ－Ｎ－Ｆ－Ｈ－Ｘ８０－Ｘ８１－Ｐ－Ｒ－Ｘ８４－Ｘ８５－Ｘ８６－Ｓ－Ｎ－Ｉ－Ｎ－Ｘ９１－Ｘ９２－Ｖ－Ｘ９４－Ｅ－Ｘ９６－Ｋ－Ｇ－Ｓ－Ｅ－Ｔ－Ｔ－Ｆ－Ｍ－Ｃ－Ｅ－Ｙ－Ａ－Ｄ－Ｅ－Ｔ－Ａ－Ｔ－Ｉ－Ｖ－Ｅ－Ｆ－Ｌ－Ｎ－Ｒ－Ｗ－Ｉ－Ｔ－Ｆ－Ｓ－Ｑ－Ｓ－Ｉ－Ｉ－Ｓ－Ｔ－Ｌ－Ｔ（一般式１，配列番号２１２）
前記一般式１において、
Ｘ１は欠失しており、
Ｘ１８はロイシン（Ｌ）又はアルギニン（Ｒ）であり、
Ｘ１９はロイシン（Ｌ）又はチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ２２はグルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）であり、
Ｘ３８はアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はアルギニン（Ｒ）であり、
Ｘ４２はアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）又はトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ４３はグルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）又はグルタミン（Ｑ）であり、
Ｘ４５はアラニン（Ａ）又はチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ６１はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）であり、
Ｘ６８はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ７４はヒスチジン（Ｈ）又はグルタミン（Ｑ）であり、
Ｘ８０はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又はチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ８１はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）又はアルギニン（Ｒ）であり、
Ｘ８４はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ８５はアラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）又はチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ８６はアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）又はバリン（Ｖ）であり、
Ｘ９１はトレオニン（Ｔ）又はバリン（Ｖ）であり、
Ｘ９２はフェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）又はチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ９４はフェニルアラニン（Ｆ）又はロイシン（Ｌ）であり、
Ｘ９６はフェニルアラニン（Ｆ）又はロイシン（Ｌ）である。

【請求項23】

前記一般式１において、
Ｘ４３はリシン（Ｋ）であり、
Ｘ４５はチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ６１はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）であり、
Ｘ６８はグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ７４はグルタミン（Ｑ）であり、
Ｘ８０はフェニルアラニン（Ｆ）又はロイシン（Ｌ）であり、
Ｘ８５はロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又はチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ８６はイソロイシン（Ｉ）又はバリン（Ｖ）であり、
Ｘ９２はフェニルアラニン（Ｆ）又はイソロイシン（Ｉ）である、請求項２２に記載のもの。

【請求項24】

前記インターロイキン２アナログは、Ｃ末端に少なくとも１つのアミノ酸をさらに含むものである、請求項２２に記載のインターロイキン２アナログ。

【請求項25】

下記化学式（４）で表されるインターロイキン２アナログの持続型結合体。

【化4】

ここで、Ｘ’’は下記一般式２で表されるアミノ酸配列を含むインターロイキン２アナログであり、
Ｚはポリエチレングリコールリンカーであって、分子量２ｋＤａ～３０ｋＤａのリンカーであり、
Ｆｃは二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であり、
－はＸ’’とＺ間、ＺとＦｃ間の共有結合連結を示すものであり、
前記持続型結合体は、前記二量体形態のＦｃ領域のうち１本のポリペプチド鎖にのみＺの一末端が共有結合により連結され、そのＺの反対側の末端に１分子のＸ’’が共有結合により連結されたものである。
［一般式２］
Ｘ１－Ｐ－Ｔ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｔ－Ｋ－Ｋ－Ｔ－Ｑ－Ｌ－Ｑ－Ｌ－Ｅ－Ｈ－Ｌ－Ｘ１８－Ｌ－Ｄ－Ｌ－Ｘ２２－Ｍ－Ｉ－Ｌ－Ｎ－Ｇ－Ｉ－Ｎ－Ｎ－Ｙ－Ｋ－Ｎ－Ｐ－Ｋ－Ｌ－Ｔ－Ｘ３８－Ｍ－Ｌ－Ｔ－Ｘ４２－Ｋ－Ｆ－Ｙ－Ｍ－Ｐ－Ｋ－Ｋ－Ａ－Ｔ－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｈ－Ｌ－Ｑ－Ｃ－Ｌ－Ｅ－Ｘ６１－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｐ－Ｌ－Ｅ－Ｘ６８－Ｖ－Ｌ－Ｎ－Ｌ－Ａ－Ｑ－Ｓ－Ｋ－Ｎ－Ｆ－Ｈ－Ｆ－Ｘ８１－Ｐ－Ｒ－Ｄ－Ｘ８５－Ｘ８６－Ｓ－Ｎ－Ｉ－Ｎ－Ｖ－Ｆ－Ｖ－Ｌ－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｇ－Ｓ－Ｅ－Ｔ－Ｔ－Ｆ－Ｍ－Ｃ－Ｅ－Ｙ－Ａ－Ｄ－Ｅ－Ｔ－Ａ－Ｔ－Ｉ－Ｖ－Ｅ－Ｆ－Ｌ－Ｎ－Ｒ－Ｗ－Ｉ－Ｔ－Ｆ－Ｓ－Ｑ－Ｓ－Ｉ－Ｉ－Ｓ－Ｔ－Ｌ－Ｔ（一般式２，配列番号２１３）
Ｘ１は欠失しており、
Ｘ１８はロイシン（Ｌ）又はアルギニン（Ｒ）であり、
Ｘ２２はグルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）であり、
Ｘ３８はアラニン（Ａ）又はアルギニン（Ｒ）であり、
Ｘ４２はフェニルアラニン（Ｆ）又はリシン（Ｋ）であり、
Ｘ６１はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ６８はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ８１はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ８５はロイシン（Ｌ）又はバリン（Ｖ）であり、
Ｘ８６はイソロイシン（Ｉ）又はバリン（Ｖ）である。

【請求項26】

前記インターロイキン２アナログは、配列番号２２、４２、５３、８７、１０５及び１０６のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかの配列を含むものである、請求項２５に記載のインターロイキン２アナログ。

【請求項27】

薬学的有効量の請求項１又は１７に記載の持続型結合体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、癌の予防又は治療用薬学組成物。

【請求項28】

前記インターロイキン２アナログは、配列番号２２、４２、５３、８７、１０５及び１０６からなる群から選択されるものである、請求項２７に記載の薬学組成物。

【請求項29】

前記癌は、転移性腎細胞癌、転移性黒色腫、大腸癌、肝癌、卵巣癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、肺癌、皮膚癌、黒色腫、乳癌、膀胱癌及び胃癌からなる群から選択されるいずれかである、請求項２７に記載の薬学組成物。

【請求項30】

前記薬学組成物は、次の特性の少なくとも１つの特性を示すものである、請求項２７に記載の薬学組成物。
（ｉ）アルデスロイキンと比較した高い血中曝露量
（ｉｉ）アルデスロイキンと比較した高い腫瘍成長抑制活性
（ｉｉｉ）アルデスロイキンと比較した高い記憶Ｔ細胞生成反応

【請求項31】

前記薬学組成物は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与又は直腸内投与経路で投与されるものである、請求項２７に記載の薬学組成物。

【請求項32】

前記薬学組成物は、１週間～１カ月の範囲の時間間隔で投与されるものである、請求項２７に記載の薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規なインターロイキン２アナログ結合体、その製造方法、及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

インターロイキン２（Interleukin 2）は、計１３３個のアミノ酸残基から構成される分子量約１５ｋＤａの重要な免疫刺激剤であり、Ｔ細胞、Ｂ細胞をはじめとする免疫系の様々な細胞を活性化する。インターロイキン２の免疫刺激剤としての高い効能は、癌、エイズをはじめとする様々な免疫関連疾患の治療に有用である（特許文献１）。現在、インターロイキン２（Proleukin（登録商標））は、転移性腎細胞癌及び転移性黒色腫の治療用としてＦＤＡから承認された医薬である。しかし、高服用量のインターロイキン２療法には深刻な毒性が関連するので、適用できる患者が制限され、実際に適当な少数の患者に対してのみこの治療療法が行われている。インターロイキン２に関連する毒性には、高熱、吐気、嘔吐、血管漏出（vascular leak）、重い低血圧、肺浮腫及び肝損傷を引き起こす血管漏出症候群（Vascular leak syndrome）が含まれる。

【0003】

インターロイキン２受容体には、３種のサブユニット受容体がある。そのサブユニットは、α鎖（ＩＬ－２Ｒα，ＣＤ２５）、β鎖（ＩＬ－２Ｒβ又はＣＤ１２２）及びγ鎖（ＩＬ－２Ｒγ又はＣＤ１３２）で形成されており、インターロイキン２が受容体サブユニットの様々な組み合わせに結合することにより、様々な機能を発揮することができる。単一のインターロイキン２α受容体は、低親和性インターロイキン２受容体であり、シグナル伝達には関与しない。インターロイキン２β及びγ受容体の複合体は、中程度の親和性でインターロイキン２に結合する。インターロイキン２α、β及びγ受容体の複合体は、高い親和性でインターロイキン２に結合する。インターロイキン２β及びγ受容体の複合体は、多重シグナル伝達経路のキナーゼ活性化による効果的なシグナル変換に必要である。特に、インターロイキン２β及びγ受容体の複合体は、ＣＤ８＋細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞において著しく見られる。また、高い親和性を有するインターロイキン２α、β及びγ受容体の複合体は、通常見られるＣＤ４⁺Ｔ調節細胞（Treg）のみならず、最近では、活性化したＴ細胞においても見られる。インターロイキン２β受容体は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞（NK cell）に分布して体内の免疫反応に関与するので、免疫活性化のためにβ受容体に対する活性向上により治療剤を開発する研究が行われている。

【0004】

一方、インターロイキン２には様々な免疫関連疾患の治療剤としての可能性があるにもかかわらず、毒性及び副作用を減少させると共に服用量を減少させることのできる薬剤が十分に存在しない状態であるので、新規かつ向上した薬剤に関する研究がさらに求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】韓国公開特許第１０－２０１７－００７００９１号公報

【特許文献2】国際公開第９７／０３４６３１号

【特許文献3】国際公開第９６／０３２４７８号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453

【非特許文献2】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277

【非特許文献3】Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444

【非特許文献4】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)

【非特許文献5】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)

【非特許文献6】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994

【非特許文献7】[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073

【非特許文献8】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482

【非特許文献9】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)

【非特許文献10】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745

【非特許文献11】J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989

【非特許文献12】F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York,9.50-9.51, 11.7-11.8

【非特許文献13】H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

免疫関連疾患の治療剤開発の一環として、インターロイキン２アナログを含むと共に、持続性に優れ、かつ薬理効果に優れた薬剤の開発が求められている。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、インターロイキン２アナログを含む持続型結合体を提供することを目的とする。

【0009】

また、本発明は、前記持続型結合体を製造する方法を提供することを目的とする。

【0010】

さらに、本発明は、前記インターロイキン２アナログ又はその持続型結合体を含む、癌の予防又は治療用薬学組成物を提供することを目的とする。

【0011】

さらに、本発明は、前記インターロイキン２アナログ、その持続型結合体、又はそれを含む組成物を必要とする個体に、前記インターロイキン２アナログ、その持続型結合体、又はそれを含む組成物を投与するステップを含む、癌の予防又は治療方法を提供することを目的とする。

【0012】

さらに、本発明は、前記インターロイキン２アナログ、その持続型結合体、又はそれを含む組成物の癌の予防又は治療用途を提供することを目的とする。

【0013】

さらに、本発明は、前記インターロイキン２アナログ、その持続型結合体、又はそれを含む組成物を含む、癌の予防又は治療のための薬剤を提供する用途を提供することを目的とする。

【発明の効果】

【0014】

本発明によるインターロイキン２アナログ又はそれを含む持続型結合体は、生体インターロイキン２β受容体結合力が増大したアナログであり、抗癌治療目的の投与利便性及び副作用を改善することができるという効果がある。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】インターロイキン２アナログ持続型結合体（アナログ２１、４１及び５２番）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す図である。

【図2】インターロイキン２アナログ持続型結合体（アナログ２１、４１及び５２番）の純度分析結果を示す図である。

【図3】インターロイキン２アナログ持続型結合体のＩＣＲ及びＣ５７ＢＬ／６マウスにおける薬物動態を分析した結果を示す図である。ＡはＩＣＲマウスにおけるインターロイキン２アナログ４１番結合体及びインターロイキン２アナログ５２番結合体の薬物動態を分析した結果を示す図であり、ＢはＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるインターロイキン２アナログ２１番結合体、インターロイキン２アナログ８６番結合体、インターロイキン２アナログ１０４番結合体及びインターロイキン２アナログ１０５番結合体の薬物動態を分析した結果を示す図である。図３において、持続型結合体の投与量と血清中濃度の数値は、当該結合体全体においてインターロイキン２アナログ部位が占める重量のみを基準として示す値である。

【図4】マウスにおいてインターロイキン２アナログ２１番結合体、インターロイキン２アナログ４１番結合体、インターロイキン２アナログ５２番結合体の動物モデルにおける抗癌効力を確認した結果を示す図である。図４において、持続型結合体の投与量は、当該結合体全体においてインターロイキン２アナログ部位が占める重量のみを基準として示す値である。

【図5】インターロイキン２アナログ持続型結合体の動物モデルにおける記憶Ｔ細胞変化を確認した結果を示す図である。Ａはインターロイキン２アナログ２１番結合体、インターロイキン２アナログ４１番結合体、インターロイキン２アナログ５２番結合体の腫瘍成長抑制効果を分析した結果を示す図であり、Ｂはインターロイキン２アナログ２１番結合体、インターロイキン２アナログ４１番結合体、インターロイキン２アナログ５２番結合体の記憶Ｔ細胞数を分析した結果を示す図である。図５において、持続型結合体の投与量は、当該結合体全体においてインターロイキン２アナログ部位が占める重量のみを基準として示す値である。

【図6】インターロイキン２アナログ持続型結合体の悪性黒色腫動物モデルにおける抗腫瘍効力を評価した結果を示す図である。Ａはアルデスロイキンとインターロイキン２アナログ８６番結合体の腫瘍サイズを確認した結果を示す図であり、Ｂはアルデスロイキンとインターロイキン２アナログ８６番結合体の生存率を確認した結果を示す図である。図６において、持続型結合体の投与量は、当該結合体全体におけるインターロイキン２アナログ部位が占める重量のみを基準として示す値である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明の一態様は、新規なインターロイキン２アナログ（interleukin 2 analog又はIL-2 analog）を含む持続型結合体である。前記インターロイキン２（interleukin 2, IL-2）アナログは、天然インターロイキン２又はインターロイキン２アナログであるアルデスロイキン（aldesleukin）に比べてインターロイキン２β受容体結合力が増大したインターロイキン２アナログであってもよく、前記インターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２において少なくとも１つのアミノ酸が変異した配列を含むものであってもよい。

【0017】

一具体例として、前記持続型結合体は、化学式（１）で表される持続型結合体であることを特徴とする。

【0018】

Ｘ－Ｌａ－Ｆ・・・（１）

【0019】

ここで、Ｘはインターロイキン２アナログ（analog）であり、このアナログは持続型結合体の一部をなさず、Ｘ単独ではアルデスロイキンに比べてインターロイキン２β受容体結合力が増大したインターロイキン２アナログであり、Ｌはポリエチレングリコールリンカーであり、ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、Ｆは二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であり、－はＸとＬ間、ＬとＦ間の共有結合連結を示すものであり、前記インターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２において、１番目、１２番目、１８番目、１９番目、２０番目、２２番目、３２番目、３５番目、３８番目、４２番目、４３番目、４５番目、４８番目、４９番目、６１番目、６８番目、６９番目、７４番目、７６番目、８０番目、８１番目、８２番目、８４番目、８５番目、８６番目、８７番目、８８番目、８９番目、９１番目、９２番目、９４番目、９５番目、９６番目、１２５番目、１２６番目及び１３３番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つが変異した配列を含むものである。

【0020】

他の具体例として、前記持続型結合体は、天然インターロイキン２の少なくとも１つのアミノ酸に置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）、修飾（modification）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異が起こったインターロイキン２アナログを含むことを特徴とする。

【0021】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、天然インターロイキン２又はアルデスロイキンに比べて、インターロイキン２α受容体結合力が変化し、インターロイキン２β受容体結合力が増大したインターロイキン２アナログを結合体の一部として含むことを特徴とする。

【0022】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、前記１３３番目の位置に相当するアミノ酸に少なくとも１つのアミノ酸が付加されたインターロイキン２アナログを結合体の一部として含むことを特徴とする。

【0023】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された配列を有するインターロイキン２アナログを結合体の一部として含むことを特徴とする。

【0024】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、１個～１０個のアミノ酸置換をさらに有するインターロイキン２アナログを結合体の一部として含むことを特徴とする。

【0025】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、インターロイキン２アナログ部位の１８番目、１９番目、２０番目、２２番目、３８番目、４２番目、４３番目、４５番目、６１番目、６８番目、６９番目、７４番目、８０番目、８１番目、８４番目、８５番目、８６番目、８８番目、８９番目、９１番目、９２番目、９４番目及び９６番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸にさらに置換されたインターロイキン２アナログを含むことを特徴とする。

【0026】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、１８番目、２２番目、３８番目、４２番目、６１番目、６８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸にさらに置換されたインターロイキン２アナログを結合体の一部として含むことを特徴とする。

【0027】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、次のアナログのいずれかのインターロイキン２アナログを結合体の一部として含むことを特徴とする。
（ａ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び３２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び３５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｃ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び３８番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｄ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び４２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｅ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び４３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｆ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び４８番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｇ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び４９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｈ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び７６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｉ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８１番目、９２番目、９４番目及び９６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｊ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び８７番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｋ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目及び４２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｌ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目及び８０番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｍ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目及び８４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｎ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１９番目、３８番目及び４２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｏ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１２番目、３８番目及び４２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｐ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び６１番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｑ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び８４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｒ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び８８番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｓ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び８９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｔ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び９１番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｕ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び９４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｖ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び１２６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｗ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８０番目及び８４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｘ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、９４番目及び９６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｙ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｚ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、６１番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａａ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｂ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８０番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｃ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８１番目、８４番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｄ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、２０番目、３８番目、４２番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｅ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｆ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、７４番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｇ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８１番目、８４番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｈ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８１番目、８８番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｉ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｊ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８０番目、８１番目、８５番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｋ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８０番目、８１番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｌ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｍ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、４５番目、７４番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｎ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、７４番目、８０番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｏ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８４番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｐ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、４５番目、８０番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｑ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｒ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｓ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、６１番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｔ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、６９番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｕ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目、９１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｖ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｗ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｘ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、４５番目、７４番目、８０番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｙ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、６８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｚ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、６９番目、７４番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂａ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８４番目、８５番目、８６番目、９１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｂ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目、９２番目、９４番目及び９６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｃ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、１９番目、２２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｄ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、３８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｅ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、６１番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｆ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、６８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｇ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｈ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、４５番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｉ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目、９１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｊ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目、９２番目及び９５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｋ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３５番目、３８番目、４２番目、７４番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｌ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、４３番目、６１番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｍ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目、９１番目、９２番目及び９５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｎ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３５番目、３８番目、４２番目、７４番目、８０番目、８１番目、８２番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｏ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｐ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８５番目及び８６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ

【0028】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、次のアミノ酸置換からなる群から選択される少なくとも１つの置換を有するインターロイキン２アナログを含むことを特徴とする。
（ａ）１２番目のアミノ酸のバリン又はフェニルアラニンへの置換
（ｂ）１８番目のアミノ酸のアルギニンへの置換
（ｃ）１９番目のアミノ酸のチロシン、バリン、フェニルアラニン、アルギニンへの置換
（ｄ）２０番目のアミノ酸のバリン又はフェニルアラニンへの置換
（ｅ）２２番目のアミノ酸のグルタミン酸への置換
（ｆ）３２番目のアミノ酸のシステインへの置換
（ｇ）３５番目のアミノ酸のシステイン又はグルタミン酸への置換
（ｈ）３８番目のアミノ酸のアラニン又はアスパラギン酸への置換
（ｉ）４２番目のアミノ酸のリシン、アラニン又はトリプトファンへの置換
（ｊ）４３番目のアミノ酸のシステイン、グルタミン酸又はグルタミンへの置換
（ｋ）４５番目のアミノ酸のアラニンへの置換
（ｌ）４８番目のアミノ酸のシステインへの置換
（ｍ）４９番目のアミノ酸のシステインへの置換
（ｎ）６１番目のアミノ酸のグルタミン、アルギニン又はアスパラギン酸への置換
（ｏ）６８番目のアミノ酸のアスパラギン酸又はグルタミンへの置換
（ｐ）６９番目のアミノ酸のグリシンへの置換
（ｑ）７４番目のアミノ酸のヒスチジン又はアラニンへの置換
（ｒ）７６番目のアミノ酸のシステインへの置換
（ｓ）８０番目のアミノ酸のフェニルアラニン、チロシン、バリン、アスパラギン酸又はトリプトファンへの置換
（ｔ）８１番目のアミノ酸のアスパラギン酸、グルタミン酸又はアスパラギンへの置換
（ｕ）８２番目のアミノ酸のグリシン又はバリンへの置換
（ｖ）８４番目のアミノ酸のグルタミン酸、バリン又はフェニルアラニンへの置換
（ｗ）８５番目のアミノ酸のバリン、アラニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、トレオニン、イソロイシン、グルタミン酸又はフェニルアラニンへの置換
（ｘ）８６番目のアミノ酸のバリン、アラニン、グリシン又はロイシンへの置換
（ｙ）８７番目のアミノ酸のシステインへの置換
（ｚ）８８番目のアミノ酸のグルタミン、バリン又はフェニルアラニンへの置換
（ａａ）８９番目のアミノ酸のフェニルアラニンへの置換
（ａｂ）９１番目のアミノ酸のトレオニン、フェニルアラニン又はグルタミン酸への置換
（ａｃ）９２番目のアミノ酸のフェニルアラニン、ロイシン、チロシン又はトリプトファンへの置換
（ａｄ）９４番目のアミノ酸のフェニルアラニン又はバリンへの置換
（ａｅ）９５番目のアミノ酸のアスパラギン酸への置換
（ａｆ）９６番目のアミノ酸のフェニルアラニン、バリン又はイソロイシンへの置換
（ａｇ）１２５番目のアミノ酸のセリンへの置換
（ａｈ）１２６番目のアミノ酸のトレオニンへの置換

【0029】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、配列番号３～１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するインターロイキン２アナログを含むことを特徴とする。

【0030】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、次のアナログのいずれかのインターロイキン２アナログを含むことを特徴とする。
（ａ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｃ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｄ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｅ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、６１番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｆ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、６８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ

【0031】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、次のアミノ酸置換からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するインターロイキン２アナログを含むことを特徴とする。
（ａ）１８番目のアミノ酸のアルギニンへの置換
（ｂ）２２番目のアミノ酸のグルタミン酸への置換
（ｃ）３８番目のアミノ酸のアラニンへの置換
（ｄ）４２番目のアミノ酸のリシンへの置換
（ｅ）６１番目のアミノ酸のアスパラギン酸への置換
（ｆ）６８番目のアミノ酸のアスパラギン酸への置換
（ｇ）８０番目のアミノ酸のフェニルアラニンへの置換
（ｈ）８１番目のアミノ酸のグルタミン酸への置換
（ｉ）８５番目のアミノ酸のバリンへの置換
（ｊ）８６番目のアミノ酸のバリンへの置換
（ｋ）９２番目のアミノ酸のフェニルアラニンへの置換
（ｌ）１２５番目のアミノ酸のセリンへの置換

【0032】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来のもの、又はそれらの組み合わせ（combination）もしくはそれらのハイブリッド（hybrid）である免疫グロブリンＦｃ領域を含むことを特徴とする。

【0033】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含むことを特徴とする。

【0034】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域を含むことを特徴とする。

【0035】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域であることを特徴とする。

【0036】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、２本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合で連結された構造であり、前記２本のうち１本の鎖の窒素原子を介してのみ連結されたものであることを特徴とする。

【0037】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号４３８のアミノ酸配列を有する単量体を含むことを特徴とする。

【0038】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号４３８のアミノ酸配列の単量体からなるホモ二量体であることを特徴とする。

【0039】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、そのＮ末端プロリンの窒素原子を介して連結されたものであることを特徴とする。

【0040】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体において、前記Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含み、前記エチレングリコール繰り返し単位部分（moiety）の化学式量は、１～１００ｋＤａ範囲にあることを特徴とする。

【0041】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、前記二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域のいずれかのＦｃ領域に１分子のＸが前記ポリエチレングリコールリンカーを介して共有結合的に連結されたものであることを特徴とする。

【0042】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体において、前記エチレングリコール繰り返し単位は、［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎであり、ｎは、自然数であって、前記インターロイキン２アナログ結合体中の［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎ部分の平均分子量、例えば数平均分子量が１～１００ｋＤａになるように決定されることを特徴とする。

【0043】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体において、前記ｎの値は、前記インターロイキン２アナログ結合体中の［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎ部分の平均分子量、例えば数平均分子量が３．４ｋＤａになるように決定されることを特徴とする。

【0044】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体において、前記ａは、１であり、前記二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域のいずれかのＦｃ領域鎖に１分子のＸが前記エチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーを介して共有結合的に連結されたものであることを特徴とする。

【0045】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体において、前記リンカーの一末端が前記二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域の２本のＦｃ領域鎖のいずれかのＦｃ領域鎖にのみ連結されたものであることを特徴とする。

【0046】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体において、前記結合体は、Ｌの一末端がＦのアミノ基又はチオール基、Ｌの他の末端がＸのアミノ基又はチオール基にそれぞれ反応して形成された共有結合により、Ｆ及びＸにそれぞれ連結されたものであることを特徴とする。

【0047】

本発明の他の態様は、化学式（２）で表されるインターロイキン２アナログの持続型結合体である。

【0048】

Ｘ－Ｚ－Ｆｃ・・・（２）

【0049】

ここで、Ｘは配列番号３～１０６のアミノ酸配列から選択されるいずれかのポリペプチド配列を含むインターロイキン２アナログであり、Ｚはポリエチレングリコールリンカーであって、分子量２ｋＤａ～３０ｋＤａのリンカーであり、Ｆｃは二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であり、－はＸとＺ間、ＺとＦｃ間の共有結合連結を示すものであり、前記持続型結合体は、前記二量体形態のＦｃ領域のうち１本のポリペプチド鎖にのみＺの一末端が共有結合により連結され、そのＺの反対側の末端に１分子のＸが共有結合により連結されたものである。

【0050】

一具体例として、前記インターロイキン２アナログは、配列番号１０、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２１、２２、３２、３５、３６、４２、５３、５４、５６、５８、５９、６０、６２、７１、７２、７４、７５、７６、７７、７８、８５、８７、８９、９１、９２、９３、９４、９５、９８、９９、１００、１０１、１０３、１０４、１０５及び１０６のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかの配列を含むことを特徴とする。

【0051】

他の具体例として、前記インターロイキン２アナログは、配列番号１０、１３、１４、１６、１７、２０、２１、２２、３２、３５、３６、４２、５３、５４、８７、８９、９１、９２、９３、９４、９８、９９、１００、１０１、１０３、１０４及び１０５のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかの配列を含むことを特徴とする。

【0052】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体は、配列番号２２、４２、５３、８７、１０５及び１０６のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかの配列を有するインターロイキン２アナログを含むことを特徴とする。

【0053】

前述した具体例のいずれかによる持続型結合体のインターロイキン２アナログは、Ｃ末端に少なくとも１つのアミノ酸をさらに含むことを特徴とする。

【0054】

本発明のさらに他の態様は、化学式（３）で表されるインターロイキン２アナログの持続型結合体である。

【0055】

Ｘ’－Ｚ－Ｆｃ・・・（３）

【0056】

ここで、Ｘ’は一般式１で表されるアミノ酸配列を含むインターロイキン２アナログであり、Ｚはポリエチレングリコールリンカーであって、分子量２ｋＤａ～３０ｋＤａのリンカーであり、Ｆｃは二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であり、－はＸ’とＺ間、ＺとＦｃ間の共有結合連結を示すものであり、前記持続型結合体は、前記二量体形態のＦｃ領域のうち１本のポリペプチド鎖にのみＺの一末端が共有結合により連結され、そのＺの反対側の末端に１分子のＸ’が共有結合により連結されたものである。

【0057】

［一般式１］
Ｘ１－Ｐ－Ｔ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｔ－Ｋ－Ｋ－Ｔ－Ｑ－Ｌ－Ｑ－Ｌ－Ｅ－Ｈ－Ｌ－Ｘ１８－Ｘ１９－Ｄ－Ｌ－Ｘ２２－Ｍ－Ｉ－Ｌ－Ｎ－Ｇ－Ｉ－Ｎ－Ｎ－Ｙ－Ｋ－Ｎ－Ｐ－Ｋ－Ｌ－Ｔ－Ｘ３８－Ｍ－Ｌ－Ｔ－Ｘ４２－Ｘ４３－Ｆ－Ｘ４５－Ｍ－Ｐ－Ｋ－Ｋ－Ａ－Ｔ－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｈ－Ｌ－Ｑ－Ｃ－Ｌ－Ｅ－Ｘ６１－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｐ－Ｌ－Ｅ－Ｘ６８－Ｖ－Ｌ－Ｎ－Ｌ－Ａ－Ｘ７４－Ｓ－Ｋ－Ｎ－Ｆ－Ｈ－Ｘ８０－Ｘ８１－Ｐ－Ｒ－Ｘ８４－Ｘ８５－Ｘ８６－Ｓ－Ｎ－Ｉ－Ｎ－Ｘ９１－Ｘ９２－Ｖ－Ｘ９４－Ｅ－Ｘ９６－Ｋ－Ｇ－Ｓ－Ｅ－Ｔ－Ｔ－Ｆ－Ｍ－Ｃ－Ｅ－Ｙ－Ａ－Ｄ－Ｅ－Ｔ－Ａ－Ｔ－Ｉ－Ｖ－Ｅ－Ｆ－Ｌ－Ｎ－Ｒ－Ｗ－Ｉ－Ｔ－Ｆ－Ｓ－Ｑ－Ｓ－Ｉ－Ｉ－Ｓ－Ｔ－Ｌ－Ｔ（一般式１，配列番号２１２）

【0058】

一般式１において、Ｘ１は欠失しており、Ｘ１８はロイシン（Ｌ）又はアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ１９はロイシン（Ｌ）又はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ２２はグルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘ３８はアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ４２はアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）又はトリプトファン（Ｗ）であり、Ｘ４３はグルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）又はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘ４５はアラニン（Ａ）又はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ６１はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ６８はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、Ｘ７４はヒスチジン（Ｈ）又はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘ８０はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ８１はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）又はアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ８４はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、Ｘ８５はアラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）又はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ８６はアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）又はバリン（Ｖ）であり、Ｘ９１はトレオニン（Ｔ）又はバリン（Ｖ）であり、Ｘ９２はフェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）又はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ９４はフェニルアラニン（Ｆ）又はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ９６はフェニルアラニン（Ｆ）又はロイシン（Ｌ）である。

【0059】

一具体例として、一般式１において、Ｘ４３はリシン（Ｋ）であり、Ｘ４５はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ６１はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘ６８はグルタミン酸（Ｅ）であり、Ｘ７４はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘ８０はフェニルアラニン（Ｆ）又はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ８５はロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ８６はイソロイシン（Ｉ）又はバリン（Ｖ）であり、Ｘ９２はフェニルアラニン（Ｆ）又はイソロイシン（Ｉ）であることを特徴とする。

【0060】

他の具体例として、前記インターロイキン２アナログは、Ｃ末端に少なくとも１つのアミノ酸をさらに含むことを特徴とする。

【0061】

本発明のさらに他の態様は、化学式（４）で表されるインターロイキン２アナログの持続型結合体である。

【0062】

Ｘ’’－Ｚ－Ｆｃ・・・（４）

【0063】

ここで、Ｘ’’は一般式２で表されるアミノ酸配列を含むインターロイキン２アナログであり、Ｚはポリエチレングリコールリンカーであって、分子量２ｋＤａ～３０ｋＤａのリンカーであり、Ｆｃは二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であり、－はＸ’’とＺ間、ＺとＦｃ間の共有結合連結を示すものであり、前記持続型結合体は、前記二量体形態のＦｃ領域のうち１本のポリペプチド鎖にのみＺの一末端が共有結合により連結され、そのＺの反対側の末端に１分子のＸ’’が共有結合により連結されたものである。

【0064】

［一般式２］
Ｘ１－Ｐ－Ｔ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｔ－Ｋ－Ｋ－Ｔ－Ｑ－Ｌ－Ｑ－Ｌ－Ｅ－Ｈ－Ｌ－Ｘ１８－Ｌ－Ｄ－Ｌ－Ｘ２２－Ｍ－Ｉ－Ｌ－Ｎ－Ｇ－Ｉ－Ｎ－Ｎ－Ｙ－Ｋ－Ｎ－Ｐ－Ｋ－Ｌ－Ｔ－Ｘ３８－Ｍ－Ｌ－Ｔ－Ｘ４２－Ｋ－Ｆ－Ｙ－Ｍ－Ｐ－Ｋ－Ｋ－Ａ－Ｔ－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｈ－Ｌ－Ｑ－Ｃ－Ｌ－Ｅ－Ｘ６１－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｐ－Ｌ－Ｅ－Ｘ６８－Ｖ－Ｌ－Ｎ－Ｌ－Ａ－Ｑ－Ｓ－Ｋ－Ｎ－Ｆ－Ｈ－Ｆ－Ｘ８１－Ｐ－Ｒ－Ｄ－Ｘ８５－Ｘ８６－Ｓ－Ｎ－Ｉ－Ｎ－Ｖ－Ｆ－Ｖ－Ｌ－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｇ－Ｓ－Ｅ－Ｔ－Ｔ－Ｆ－Ｍ－Ｃ－Ｅ－Ｙ－Ａ－Ｄ－Ｅ－Ｔ－Ａ－Ｔ－Ｉ－Ｖ－Ｅ－Ｆ－Ｌ－Ｎ－Ｒ－Ｗ－Ｉ－Ｔ－Ｆ－Ｓ－Ｑ－Ｓ－Ｉ－Ｉ－Ｓ－Ｔ－Ｌ－Ｔ（一般式２，配列番号２１３）

【0065】

Ｘ１は欠失しており、Ｘ１８はロイシン（Ｌ）又はアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ２２はグルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘ３８はアラニン（Ａ）又はアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ４２はフェニルアラニン（Ｆ）又はリシン（Ｋ）であり、Ｘ６１はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、Ｘ６８はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、Ｘ８１はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、Ｘ８５はロイシン（Ｌ）又はバリン（Ｖ）であり、Ｘ８６はイソロイシン（Ｉ）又はバリン（Ｖ）である。

【0066】

一具体例として、前記インターロイキン２アナログは、配列番号２２、４２、５３、８７、１０５及び１０６のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかの配列を含むことを特徴とする。

【0067】

本発明のさらに他の態様は、非ペプチド性重合体を介してインターロイキン２アナログを免疫グロブリンＦｃ領域に連結するステップを含む、インターロイキン２アナログを有する持続型結合体を製造する方法である。

【0068】

一具体例として、前記インターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２において、１番目、１２番目、１８番目、１９番目、２０番目、２２番目、３２番目、３５番目、３８番目、４２番目、４３番目、４５番目、４８番目、４９番目、６１番目、６８番目、６９番目、７４番目、７６番目、８０番目、８１番目、８２番目、８４番目、８５番目、８６番目、８７番目、８８番目、８９番目、９１番目、９２番目、９４番目、９５番目、９６番目、１２５番目、１２６番目及び１３３番目の位置に相当するアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸が変異したことを特徴とする。

【0069】

本発明のさらに他の態様は、インターロイキン２アナログ（analog）又はその持続型結合体を含む、癌の予防又は治療用薬学組成物である。

【0070】

一具体例として、前記薬学組成物は、薬学的有効量のインターロイキン２アナログの持続型結合体と、薬学的に許容される賦形剤とを含むことを特徴とする。

【0071】

他の具体例として、前記薬学組成物であるインターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２において、１番目、１２番目、１８番目、１９番目、２０番目、２２番目、３２番目、３５番目、３８番目、４２番目、４３番目、４５番目、４８番目、４９番目、６１番目、６８番目、６９番目、７４番目、７６番目、８０番目、８１番目、８２番目、８４番目、８５番目、８６番目、８７番目、８８番目、８９番目、９１番目、９２番目、９４番目、９５番目、９６番目、１２５番目、１２６番目及び１３３番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つが変異した配列を含むことを特徴とする。

【0072】

前述した具体例のいずれかによる薬学組成物は、アルデスロイキンに比べてインターロイキン２β受容体結合力が増大したインターロイキン２アナログを含むことを特徴とする。

【0073】

前述した具体例のいずれかによる薬学組成物において、前記インターロイキン２アナログは、配列番号３～１０６からなる群から選択されることを特徴とする。

【0074】

前述した具体例のいずれかによる薬学組成物において、前記インターロイキン２アナログは、配列番号２２、４２、５３、８７、１０５及び１０６からなる群から選択されることを特徴とする。

【0075】

前述した具体例のいずれかによる薬学組成物において、前記持続型結合体は、化学式（１）で表されることを特徴とする。

【0076】

Ｘ－Ｌａ－Ｆ・・・（１）

【0077】

ここで、Ｘはアルデスロイキンに比べてインターロイキン２β受容体結合力が増大したインターロイキン２アナログであり、Ｌはポリエチレングリコールリンカーであり、ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、Ｆは二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であり、－はＸとＬ間、ＬとＦ間の共有結合連結を示すものである。

【0078】

前述した具体例のいずれかによる薬学組成物において、前記癌は、転移性腎細胞癌、転移性黒色腫、大腸癌、肝癌、卵巣癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、肺癌、皮膚癌、黒色腫、乳癌、膀胱癌及び胃癌からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする。

【0079】

前述した具体例のいずれかによる薬学組成物において、組成物は、アルデスロイキンと比較した高い血中曝露量、腫瘍成長抑制及び／又は記憶Ｔ細胞反応を示すことを特徴とする。

【0080】

前述した具体例のいずれかによる薬学組成物において、前記薬学組成物は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与又は直腸内投与経路で投与されることを特徴とする。

【0081】

前述した具体例のいずれかによる薬学組成物において、前記薬学組成物は、１週間～１カ月の範囲の時間間隔で投与されることを特徴とする。

【0082】

本発明のさらに他の態様は、前記インターロイキン２アナログ、その持続型結合体、又はそれを含む組成物を個体に投与するステップを含む、癌の予防又は治療方法である。

【0083】

本発明のさらに他の態様は、前記インターロイキン２アナログ、その持続型結合体、又はそれを含む組成物の癌の予防又は治療用途である。

【0084】

本発明のさらに他の態様は、前記インターロイキン２アナログ又はその持続型結合体を含む、癌の予防又は治療のための薬剤を提供する用途である。

【0085】

以下、本発明を実施するための形態について説明する。なお、本発明で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。さらに、本明細書全体にわたって多くの論文及び特許文献が参照されており、その引用が示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体が本明細書に参照として組み込まれており、それにより本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

【0086】

本明細書全体を通して、アミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが用いられる。また、本明細書において略語で言及したアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法に従って記載したものである。
アラニン Ａ
アルギニン Ｒ
アスパラギン Ｎ
アスパラギン酸 Ｄ
システイン Ｃ
グルタミン酸 Ｅ
グルタミン Ｑ
グリシン Ｇ
ヒスチジン Ｈ
イソロイシン Ｉ
ロイシン Ｌ
リシン Ｋ
メチオニン Ｍ
フェニルアラニン Ｆ
プロリン Ｐ
セリン Ｓ
トレオニン Ｔ
トリプトファン Ｗ
チロシン Ｙ
バリン Ｖ

【0087】

本明細書における「Ａｉｂ」は「２－アミノイソブチル酸（2-aminoisobutyric acid）」又は「アミノイソブチル酸（aminoisobutyric acid）」と混用され、２－アミノイソブチル酸（2-aminoisobutyric acid）とアミノイソブチル酸（aminoisobutyric acid）は混用される。

【0088】

本発明の一態様は、インターロイキン２アナログを含む持続型結合体を提供する。

【0089】

具体的には、前記持続型結合体は、化学式（１）で表されるものであってもよい。

【0090】

Ｘ－Ｌａ－Ｆ・・・（１）

【0091】

ここで、Ｘはアルデスロイキンに比べてインターロイキン２β受容体結合力が増大したインターロイキン２アナログ（analog）であり、Ｌはポリエチレングリコールリンカーであり、ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、Ｆは二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であり、－はＸとＬ間、ＬとＦ間の共有結合連結を示すものである。

【0092】

本発明の持続型結合体のインターロイキン２アナログは、結合体の一部をなさず、単独で存在する場合に、インターロイキン２受容体に対する結合力が変化したこと、特にインターロイキン２β受容体結合力が増大したことを特徴とする。具体的には、本発明のインターロイキン２アナログは、結合体の一部をなさず、単独で存在する場合に、天然インターロイキン２又は公知のアルデスロイキンに比べて、インターロイキン２β受容体に対する結合力が増大したものであってもよく、より具体的には、インターロイキン２α受容体に対する結合力も変化（増加又は減少）したものであって、天然インターロイキン２において少なくとも１つのアミノ酸が変異した配列を含むものであってもよい。

【0093】

本発明における「インターロイキン２（interleukin 2, IL-2）」とは、生体内免疫システムにおいてシグナルを伝達するサイトカインの一種である免疫調節剤を意味する。インターロイキン２は、一般に約１５ｋＤａの重要な免疫刺激剤として知られている。

【0094】

本発明における「インターロイキン２アナログ」とは、天然配列において少なくとも１つのアミノ酸が変異したものを意味し、特に本発明においては、天然のものに比べてインターロイキン２受容体に対する結合力が減少又は増加した、天然インターロイキン２のアミノ酸が変異したインターロイキン２アナログであってもよい。具体的には、本発明のインターロイキン２アナログは、非自然発生（non-naturally occurring）のものであってもよい。

【0095】

前記天然インターロイキン２は、ヒトインターロイキン２であってもよく、その配列は公知のデータベースなどから得られる。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列であるが、これに限定されるものではない。

【0096】

本発明における、天然インターロイキン２が配列番号１のアミノ酸配列であるとは、配列番号１と同じ配列だけでなく、配列番号１と相同性８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列も本発明の天然インターロイキン２の範疇に含まれることを意味し、アミノ酸の変異位置は、配列番号１を基準に、相同性８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列をアラインメント（align）したときに、配列番号１のアミノ酸配列に相当する位置が変異したことを意味する。

【0097】

本発明における、天然配列において少なくとも１つのアミノ酸が変異したものとは、天然インターロイキン２において少なくとも１つのアミノ酸に置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）、修飾（modification）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変が行われたものを意味する。

【0098】

具体的には、本発明のインターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２において、１番目、１２番目、１８番目、１９番目、２０番目、２２番目、３２番目、３５番目、３８番目、４２番目、４３番目、４５番目、４８番目、４９番目、６１番目、６８番目、６９番目、７４番目、７６番目、８０番目、８１番目、８２番目、８４番目、８５番目、８６番目、８７番目、８８番目、８９番目、９１番目、９２番目、９４番目、９５番目、９６番目、１２５番目、１２６番目及び１３３番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つが変異した配列を含むものであってもよい。具体的には、本発明のインターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、さらに１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のアミノ酸置換を含むものであってもよい。１２５番目のアミノ酸であるシステインがセリンに置換されるが、これに限定されるものではなく、さらなる置換が起こるアミノ酸は、１２番目、１８番目、１９番目、２０番目、２２番目、３２番目、３５番目、３８番目、４２番目、４３番目、４５番目、４８番目、４９番目、６１番目、６８番目、６９番目、７４番目、７６番目、８０番目、８１番目、８２番目、８４番目、８５番目、８６番目、８７番目、８８番目、８９番目、９１番目、９２番目、９４番目、９５番目、９６番目、１２６番目及び１３３番目の位置に相当するアミノ酸であるが、これらに限定されるものではない。

【0099】

また、前記変異位置以外に、当該技術分野で公知のペプチドの安定性及び半減期延長のために行う程度のアミノ酸残基の置換、付加、欠失、修飾などを含むインターロイキン２アナログも本発明に含まれる。

【0100】

本発明における「アルデスロイキン（aldesleukin）」又は「インターロイキン２アナログ（aldesleukin）」とは、市販されているインターロイキン２アナログであるａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ（商標名：Proleukin（登録商標））を意味し、具体的には、配列番号２のアミノ酸配列を有するものを意味する。本発明においては、「インターロイキン２アナログ１」と混用される。本発明によるインターロイキン２アナログは、前記インターロイキン２アナログ１に比べて、変化したインターロイキン２α受容体結合力及び／又は増大したインターロイキン２β受容体結合力を有するものであってもよい。

【0101】

インターロイキン２α受容体は、インターロイキン２のシグナル伝達システムには関与しないことが知られているが、他のインターロイキン２受容体（β又はγ）とインターロイキン２の結合力を１０倍～１００倍増加させ、ＣＤ４⁺調節Ｔ細胞などに発現する。

【0102】

インターロイキン２β受容体は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞（NK cell）に主に分布しており、免疫反応とマクロファージ作用を活性化することを主な機能とするので、インターロイキン２β受容体の活性化により腫瘍アポトーシス及び身体の免疫反応の活性化が期待される。

【0103】

よって、本発明のインターロイキン２β受容体に対する結合力が増加したインターロイキン２アナログは、腫瘍抑制及び死滅などの治療効果を増大させ、副作用は減少させる効果を奏する。

【0104】

本発明における前記インターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された配列を含むものであってもよく、１～１０個のアミノ酸変異をさらに含むものであってもよい。例えば、１２５番目のアミノ酸がセリンに置換され、１２番目、１８番目、１９番目、２０番目、２２番目、３２番目、３５番目、３８番目、４２番目、４３番目、４５番目、４８番目、４９番目、６１番目、６８番目、６９番目、７４番目、７６番目、８０番目、８１番目、８２番目、８４番目、８５番目、８６番目、８７番目、８８番目、８９番目、９１番目、９２番目、９４番目、９５番目、９６番目及び１２６番目の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸にさらに置換され、かつ／又は１３３番目のアミノ酸に少なくとも１つのアミノ酸が付加された配列を含むが、これらに限定されるものではなく、天然インターロイキン２及び／又はアルデスロイキンに比べて、インターロイキン２α受容体結合力が変化し、インターロイキン２β受容体結合力が増加したインターロイキン２アナログであればいかなるものでもよい。

【0105】

本発明のインターロイキン２アナログの一例として、前記インターロイキン２アナログは、前記１３３番目の位置に相当するアミノ酸に少なくとも１つのアミノ酸が付加されたものであるが、これに限定されるものではない。本発明の目的上、前述したように付加されるアミノ酸は、天然インターロイキン２又はアルデスロイキンに比べて、インターロイキン２α受容体結合力が変化し、インターロイキン２β受容体結合力が増大するものであれば、その種類や長さが制限されるものではなく、天然アミノ酸以外にも、非天然アミノ酸、化学的改変を含むアミノ酸が付加されてもよい。

【0106】

他の例として、前記インターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、１８番目、１９番目、２０番目、２２番目、３８番目、４２番目、４３番目、４５番目、６１番目、６８番目、６９番目、７４番目、８０番目、８１番目、８４番目、８５番目、８６番目、８８番目、８９番目、９１番目、９２番目、９４番目及び９６番目のアミノ酸のうち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであるが、これらに限定されるものではない。

【0107】

さらに他の例として、前記インターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、１８番目、１９番目、２２番目、３８番目、４２番目、４３番目、４５番目、６１番目、６８番目、７４番目、８０番目、８１番目、８４番目、８５番目、８６番目、８８番目、９１番目、９２番目、９４番目及び９６番目のアミノ酸のうち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸にさらに置換されたものであるが、これらに限定されるものではない。

【0108】

さらに他の例として、前記インターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、１８番目、２２番目、３８番目、４２番目、６１番目、６８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸にさらに置換されたものであるが、これらに限定されるものではない。

【0109】

さらに他の例として、前記インターロイキン２アナログは、次のアナログからなる群から選択されるいずれかであってもよい。
（ａ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び３２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び３５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｃ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び３８番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｄ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び４２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｅ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び４３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｆ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び４８番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｇ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び４９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｈ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び７６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｉ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８１番目、９２番目、９４番目及び９６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｊ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目及び８７番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｋ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目及び４２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｌ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目及び８０番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｍ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目及び８４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｎ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１９番目、３８番目及び４２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｏ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１２番目、３８番目及び４２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｐ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び６１番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｑ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び８４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｒ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び８８番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｓ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び８９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｔ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び９１番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｕ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び９４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｖ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目及び１２６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｗ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８０番目及び８４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｘ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、９４番目及び９６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｙ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｚ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、６１番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａａ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｂ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８０番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｃ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８１番目、８４番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｄ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、２０番目、３８番目、４２番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｅ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｆ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、７４番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｇ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８１番目、８４番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｈ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８１番目、８８番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｉ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｊ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８０番目、８１番目、８５番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｋ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８０番目、８１番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｌ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｍ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、４５番目、７４番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｎ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、７４番目、８０番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｏ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８４番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｐ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、４５番目、８０番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｑ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｒ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｓ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、６１番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｔ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、６９番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｕ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目、９１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｖ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｗ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｘ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、４５番目、７４番目、８０番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｙ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、６８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ａｚ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、６９番目、７４番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂａ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８４番目、８５番目、８６番目、９１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｂ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目、９２番目、９４番目及び９６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｃ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、１９番目、２２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｄ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、３８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｅ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、６１番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｆ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、６８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｇ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｈ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、４５番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｉ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目、９１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｊ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目、９２番目及び９５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｋ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３５番目、３８番目、４２番目、７４番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｌ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、４３番目、６１番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｍ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目、９１番目、９２番目及び９５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｎ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３５番目、３８番目、４２番目、７４番目、８０番目、８１番目、８２番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｏ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂｐ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８５番目及び８６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ

【0110】

ここで、前記インターロイキン２アナログが含むアミノ酸置換は、次のアミノ酸置換からなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。
（ａ）１２番目のアミノ酸のバリン又はフェニルアラニンへの置換
（ｂ）１８番目のアミノ酸のアルギニンへの置換
（ｃ）１９番目のアミノ酸のチロシン、バリン、フェニルアラニン、アルギニンへの置換
（ｄ）２０番目のアミノ酸のバリン又はフェニルアラニンへの置換
（ｅ）２２番目のアミノ酸のグルタミン酸への置換
（ｆ）３２番目のアミノ酸のシステインへの置換
（ｇ）３５番目のアミノ酸のシステイン又はグルタミン酸への置換
（ｈ）３８番目のアミノ酸のアラニン又はアスパラギン酸への置換
（ｉ）４２番目のアミノ酸のリシン、アラニン又はトリプトファンへの置換
（ｊ）４３番目のアミノ酸のシステイン、グルタミン酸又はグルタミンへの置換
（ｋ）４５番目のアミノ酸のアラニンへの置換
（ｌ）４８番目のアミノ酸のシステインへの置換
（ｍ）４９番目のアミノ酸のシステインへの置換
（ｎ）６１番目のアミノ酸のグルタミン、アルギニン又はアスパラギン酸への置換
（ｏ）６８番目のアミノ酸のアスパラギン酸又はグルタミンへの置換
（ｐ）６９番目のアミノ酸のグリシンへの置換
（ｑ）７４番目のアミノ酸のヒスチジン又はアラニンへの置換
（ｒ）７６番目のアミノ酸のシステインへの置換
（ｓ）８０番目のアミノ酸のフェニルアラニン、チロシン、バリン、アスパラギン酸又はトリプトファンへの置換
（ｔ）８１番目のアミノ酸のアスパラギン酸、グルタミン酸又はアスパラギンへの置換
（ｕ）８２番目のアミノ酸のグリシン又はバリンへの置換
（ｖ）８４番目のアミノ酸のグルタミン酸、バリン又はフェニルアラニンへの置換
（ｗ）８５番目のアミノ酸のバリン、アラニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、トレオニン、イソロイシン、グルタミン酸又はフェニルアラニンへの置換
（ｘ）８６番目のアミノ酸のバリン、アラニン、グリシン又はロイシンへの置換
（ｙ）８７番目のアミノ酸のシステインへの置換
（ｚ）８８番目のアミノ酸のグルタミン、バリン又はフェニルアラニンへの置換
（ａａ）８９番目のアミノ酸のフェニルアラニンへの置換
（ａｂ）９１番目のアミノ酸のトレオニン、フェニルアラニン又はグルタミン酸への置換
（ａｃ）９２番目のアミノ酸のフェニルアラニン、ロイシン、チロシン又はトリプトファンへの置換
（ａｄ）９４番目のアミノ酸のフェニルアラニン又はバリンへの置換
（ａｅ）９５番目のアミノ酸のアスパラギン酸への置換
（ａｆ）９６番目のアミノ酸のフェニルアラニン、バリン又はイソロイシンへの置換
（ａｇ）１２５番目のアミノ酸のセリンへの置換
（ａｈ）１２６番目のアミノ酸のトレオニンへの置換

【0111】

さらに他の例として、前記インターロイキン２アナログは、次のインターロイキン２アナログから選択されるいずれかであってもよい。
（ａ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｂ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｃ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｄ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、３８番目、４２番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｅ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、６１番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ
（ｆ）天然インターロイキン２において、１番目のアミノ酸が欠失され、１２５番目、１８番目、２２番目、６８番目、８０番目、８１番目、８５番目、８６番目及び９２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたインターロイキン２アナログ

【0112】

ここで、前記インターロイキン２アナログが含むアミノ酸置換は、次のアミノ酸置換からなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。
（ａ）１８番目のアミノ酸のアルギニンへの置換
（ｂ）２２番目のアミノ酸のグルタミン酸への置換
（ｃ）３８番目のアミノ酸のアラニンへの置換
（ｄ）４２番目のアミノ酸のリシンへの置換
（ｅ）６１番目のアミノ酸のアスパラギン酸への置換
（ｆ）６８番目のアミノ酸のアスパラギン酸への置換
（ｇ）８０番目のアミノ酸のフェニルアラニンへの置換
（ｈ）８１番目のアミノ酸のグルタミン酸への置換
（ｉ）８５番目のアミノ酸のバリンへの置換
（ｊ）８６番目のアミノ酸のバリンへの置換
（ｋ）９２番目のアミノ酸のフェニルアラニンへの置換
（ｌ）１２５番目のアミノ酸のセリンへの置換

【0113】

本明細書における「相当する（corresponding to）」とは、ペプチドにおいて列挙される位置のアミノ酸残基であるか、又はペプチドにおいて列挙される残基に類似、同一もしくは相当するアミノ酸残基であることを意味する。相当する位置のアミノ酸を確認することは、特定配列を参照する配列の特定アミノ酸を決定することになる。

【0114】

例えば、任意のアミノ酸配列を配列番号１とアラインメント（align）すると、それに基づいて、前記アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の数、位置を参照してナンバリングすることができる。

【0115】

このようなアラインメントには、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（非特許文献１）、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）などを用いることができるが、これらに限定されるものではなく、当該技術分野で公知の配列アラインメントプログラム、ペアワイズ配列（pairwise sequence）比較アルゴリズムなどを適宜用いることができる。

【0116】

本発明において、ペプチド中のアミノ酸の特定位置で表現されていても、参照配列において相当する位置を意味することもある。

【0117】

さらに他の例として、前記インターロイキン２アナログは、配列番号３～１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであるか、前記アミノ酸配列から必須に構成されるものであるか、前記アミノ酸配列からなるものであるが、これらに限定されるものではない。

【0118】

また、本明細書において「特定配列番号からなるインターロイキン２アナログ」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるインターロイキン２アナログと同一又は相当する活性を有するものであれば、当該配列番号のアミノ酸配列の前後の無意味な配列付加や、自然発生する突然変異や、その非表現突然変異（silent mutation）を除外するものではなく、このような配列付加又は突然変異を有するものも本発明に含まれることは言うまでもない。

【0119】

本発明のインターロイキン２アナログは、配列番号３～１０６のアミノ酸配列と４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。

【0120】

具体例として、本発明のインターロイキン２アナログは、配列番号２１、４１、５２、８６、１０４及び１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであるか、前記アミノ酸配列から必須に構成されるものであるか、前記アミノ酸配列からなるものであるが、これらに限定されるものではない。

【0121】

本発明における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が互いに関連する程度を意味し、百分率で表される。

【0122】

保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は一部分とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドにおいて一般のコドン又はコドン縮退を考慮したコドンを有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることは言うまでもない。

【0123】

相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。

【0124】

任意の２つの塩基配列又はペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献３のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献１）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献５、６及び７）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。

【0125】

塩基配列又はペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献８に開示されているように、非特許文献１などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献９に開示されているように、非特許文献１０の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。よって、本発明における「相同性」又は「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示すものである。

【0126】

以上の内容は、本発明の他の具体例又は他の態様にも適用されるが、これらに限定されるものではない。

【0127】

本発明のインターロイキン２アナログは、インターロイキン２のα及び／又はβ受容体との結合力を低下又は増加させることによりｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を変化させる、新たなインターロイキン２の代替剤として用いられる。特に、β受容体に対する結合力を増加させるだけでなく、α受容体に対する結合力を変化（増加又は減少）させるので、両受容体に対する活性により、効果的な治療剤として用いられる。

【0128】

本発明における、インターロイキン２のアナログの製造のためのこのような改変には、Ｌ型もしくはＤ型アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸を用いた改変、並びに／あるいは天然配列の修飾、例えば側鎖官能基の改変、分子内の共有結合、一例として側鎖間の環形成、メチル化、アシル化、ユビキチン化、リン酸化、アミノヘキサン化、ビオチン化などの修飾による改変が全て含まれる。

【0129】

また、天然インターロイキン２のＮ及び／又はＣ末端に少なくとも１つのアミノ酸が付加されたものが全て含まれる。

【0130】

前述したように置換されるか、付加されるアミノ酸としては、ヒトタンパク質において通常観察される２０種のアミノ酸だけでなく、異常又は非天然アミノ酸を用いることができる。異常アミノ酸の市販元には、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐ、Ｇｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。これらのアミノ酸が含まれるペプチドと定型的なペプチド配列は、民間のペプチド合成会社、例えば米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、又は韓国のＡｎｙｇｅｎにおいて合成及び購入することができる。

【0131】

アミノ酸誘導体も同様に入手することができ、一例として４－イミダゾ酢酸（4-imidazoacetic acid）などが挙げられる。

【0132】

また、本発明によるインターロイキン２アナログは、生体内のタンパク質切断酵素から保護して安定性を向上させるために、そのＮ末端及び／又はＣ末端などが化学的に修飾された形態であってもよく、有機基により保護された形態であってもよく、ペプチド末端などにアミノ酸が付加されて改変された形態であってもよい。

【0133】

特に、化学的に合成したペプチドの場合、Ｎ及びＣ末端が電荷を帯びているので、その電荷を除去するために、Ｎ末端のアセチル化（acetylation）及び／又はＣ末端のアミド化（amidation）を行うが、特にこれらに限定されるものではない。

【0134】

本発明のインターロイキン２アナログは、Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ合成法により合成することもでき、組換え法により生産することもでき、商業的に依頼して作製することもできるが、これらに限定されるものではない。

【0135】

また、本発明のインターロイキン２アナログは、その長さに応じてこの分野で周知の方法、例えば自動ペプチド合成機により合成することができ、遺伝子操作技術により産生することができる。

【0136】

具体的には、本発明のインターロイキン２アナログは、標準合成方法、組換え発現システム又は任意の他の当該分野の方法により作製することができる。よって、本発明によるインターロイキン２アナログは、例えば（ａ）ペプチドを固相もしくは液相法で段階的に又はフラグメント組立により合成し、最終ペプチド生成物を分離及び精製する方法、（ｂ）ペプチドをコードする核酸作製物を宿主細胞内で発現させ、発現生成物を宿主細胞培養物から回収する方法、（ｃ）ペプチドをコードする核酸作製物を無細胞試験管内で発現させ、発現生成物を回収する方法、又は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の任意の組み合わせによりペプチドのフラグメントを得て、次にフラグメントを連結してペプチドを得ることにより当該ペプチドを回収する方法をはじめとする多くの方法で合成することができる。

【0137】

本発明において、天然インターロイキン２受容体に対するいずれかのインターロイキン２アナログ（又はそれを含む持続型結合体）の結合力は、受容体に対する親和性を測定する方法としてＳＰＲ（surface plasmon resonance）を用いて測定することができる。

【0138】

具体的には、ＳＰＲ分析としては、タンパク質－リガンド結合の原理を用いてセンサチップにインターロイキン２受容体を固定化し、連続希釈法により実験緩衝液に希釈したインターロイキン２アナログを注入して固定化した受容体との結合を誘導し、その後同じ流速で実験緩衝液のみ注入して受容体とインターロイキン２アナログの解離を誘導し、結合力を測定する方法や、まず、センサチップにヒト免疫グロブリンＦｃ領域に対する抗体を固定し、次いで、Ｆｃ領域が結合したインターロイキン２受容体を固定化してインターロイキン２アナログを注入し、結合力を測定する方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0139】

より具体的には、ビオチンで標識したヒトインターロイキン２受容体をストレプトアビジンバイオセンサチップに固定化し、２倍連続希釈法でＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液に希釈したインターロイキン２アナログ持続型結合体を１分当たり２０μＬの流速で３分間注入し、その後同じ流速でＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液のみ３分間注入してインターロイキン２受容体とインターロイキン２アナログ持続型結合体の解離を誘導し、次いで得られた結合定数及び解離定数からＢｉｏａｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムにより１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｉｔｔｉｎｇ ｍｏｄｅｌで結合力を測定することができるが、これに限定されるものではない。

【0140】

さらに具体的には、本発明のインターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２又はインターロイキン２アナログ（aldesleukin; 又はインターロイキン２アナログ１）に比べて、減少又は増加したインターロイキン２α受容体結合力を有してもよい。

【0141】

さらに具体的には、本発明のインターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２又はアルデスロイキンのインターロイキン２α受容体結合力と比較して、約０．００１倍以上、約０．００５倍以上、約０．０１倍以上、約０．０５倍以上、約０．１倍以上、約０．３倍以上、約０．５倍以上、約０．７倍以上、約０．９倍以上、約１．１倍以上、約１．３倍以上、約１．５倍以上、約１．７倍以上のインターロイキン２α受容体結合力を有するものであるが、その数値は限定されるものではなく、結合力が天然インターロイキン２又はアルデスロイキンに比べて変化したものであれば本発明に含まれる。

【0142】

あるいは、アルデスロイキンのインターロイキン２α受容体結合力（１００％）を基準に、本発明のインターロイキン２アナログは、完全に結合力を喪失したものであるか、約１％以上、約５％以上、約７％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約５０％以上、約７０％以上、約９０％以上、約１００％以上、約１５０％以上、約２００％以上の結合力を有するものであるが、その数値は限定されるものではなく、結合力が天然インターロイキン２又はアルデスロイキンに比べて変化したものであれば本発明に含まれる。

【0143】

また、具体的には、本発明のインターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２又はアルデスロイキンのインターロイキン２β受容体結合力と比較して、約０．１倍以上、約０．３倍以上、約０．５倍以上、約０．７倍以上、約１．０倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約６０倍以上、約７０倍以上、約８０倍以上、約９０倍以上、約１００倍以上のインターロイキン２β受容体結合力を有するものであるが、その数値は限定されるものではなく、結合力が天然インターロイキン２又はアルデスロイキンに比べて変化したか、増加したものであれば本発明に含まれる。

【0144】

あるいは、アルデスロイキンのインターロイキン２β受容体結合力（１００％）を基準に、本発明のインターロイキン２アナログは、約５％以上、約９％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約５０％以上、約１００％以上、約２００％以上、約５００％以上、約７００％以上、約１０００％以上、約１５００％以上、約３０００％以上、約５０００％以上、約７０００％以上、約１００００％以上、約１２０００％以上、約１５０００％以上、約２００００％以上、約２５０００％以上の結合力を有するものであるが、その数値は限定されるものではなく、結合力が天然インターロイキン２又はアルデスロイキンに比べて増加したものであれば本発明に含まれる。

【0145】

本発明における「約」とは、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などが全て含まれる範囲であり、約という用語の後に続く数値と同等又は同程度の範囲の数値であればいかなるものでもよい。

【0146】

本発明のインターロイキン２アナログは、天然インターロイキン２又はアルデスロイキンに比べて、インターロイキン２α受容体に対する結合力が変化し、インターロイキン２β受容体に対する結合力が増加したことを特徴とする。

【0147】

本発明の具体的な実施形態においては、本発明のインターロイキン２アナログを作製するために、天然インターロイキン２（配列番号１）に基づいて、変異を導入したインターロイキン２アナログを作製した。本発明で作製したインターロイキン２アナログは、配列番号３～１０６のいずれかのアミノ酸配列を含むものであってもよく、配列番号１０８～２１１のいずれかの塩基配列でコードされるものであってもよい。

【0148】

本発明のインターロイキン２アナログをコードする核酸は、配列番号１の天然インターロイキン２をコードする塩基配列において、特定位置のアミノ酸に変異（アミノ酸の欠失、置換及び／又は付加）を導入できるように改変されたものであってもよく、具体的には、配列番号３～１０６のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであってもよい。例えば、本発明の核酸は、配列番号１０８～２１１のいずれかの塩基配列を有するものであってもよく、含むものであってもよい。

【0149】

本発明の塩基配列は、コドンの縮退（degeneracy）により、又は本発明の核酸を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、本発明のインターロイキン２アナログのアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。具体的には、本発明の核酸は、配列番号１０８～２１１のいずれかの配列と相同性もしくは同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上及び１００％未満の塩基配列を有するものであるか、含むものであるか、又は配列番号１０８～２１１の配列のいずれかの配列と相同性もしくは同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上及び１００％未満の塩基配列からなるものであるか、必須に構成されるものであるが、これらに限定されるものではない。

【0150】

また、本発明の核酸は、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば本発明の核酸配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（非特許文献１１、１２参照）に具体的に記載されている。

【0151】

ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本発明の核酸には、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸断片が含まれてもよい。

【0152】

前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（例えば、非特許文献１１）。

【0153】

相同性又は同一性については前述した通りである。

【0154】

また、本発明のインターロイキン２アナログは、天然インターロイキン又はアルデスロイキンに比べて体内半減期が延長されたものであるが、特にこれらに限定されるものではない。例えば、半減期延長のための生体適合性物質（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域）がインターロイキン２アナログに直接又はリンカーを介して結合され、半減期が延長された持続型結合体の形態が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0155】

本発明による持続型結合体は、インターロイキン２β受容体に対する結合力を向上させたインターロイキン２アナログを含むだけでなく、その半減期を延長させるための代表的なキャリアとして免疫グロブリンＦｃ領域に結合させることにより、インターロイキン２アナログの半減期が延長され、血中曝露量が高まり、生体内免疫反応が増加するので、癌細胞の成長抑制及び減少を効果的に達成することができる。

【0156】

本発明を実現するための本発明の他の態様は、インターロイキン２アナログの持続型結合体を提供する。

【0157】

本発明において、前記インターロイキン２アナログ持続型結合体は、インターロイキン２アナログに、その生体内半減期を延長させるための生体適合性物質が結合された形態であってもよい。本明細書における前記生体適合性物質は、キャリアと混用される。

【0158】

本発明における前記持続型結合体は、キャリアが結合されていないインターロイキン２アナログより効力の持続性が向上したものであり、本発明においては、このような結合体を「持続型結合体」又は「結合体」という。

【0159】

なお、このような結合体は、天然に存在しない（non-naturally occurring）ものであってもよい。

【0160】

本発明の一具体例において、前記持続型結合体は、化学式（１）で表される持続型結合体である。

【0161】

Ｘ－Ｌａ－Ｆ・・・（１）

【0162】

ここで、Ｘはアルデスロイキンに比べてインターロイキン２β受容体結合力が増大したインターロイキン２アナログ（analog）であり、Ｌはポリエチレングリコールリンカーであり、ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、Ｆは二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であり、前記「－」は共有結合を示すものである。

【0163】

より具体的には、ＸとＬ、及びＬとＦは共有結合により互いに連結されたものであってもよく、ここで、前記結合体は、化学式（１）の順に、Ｘ、Ｌ及びＦが共有結合によりそれぞれ連結された結合体である。

【0164】

また、前記Ｆは、Ｘに直接連結された（すなわち、化学式（１）においてａが０である）ものであってもよく、リンカー（Ｌ）を介して連結されたものであってもよい。

【0165】

本発明における前記インターロイキン２アナログは、前記結合体の一部をなす一構成である。具体的には、化学式（１）におけるＸに該当する。インターロイキン２アナログについては前述した通りである。

【0166】

前記結合体におけるＦは、Ｘ、すなわちインターロイキン２アナログの半減期を延長させる物質であり、本発明の結合体の一部をなす一構成である。

【0167】

前記Ｆは、Ｘに共有化学結合により互いに結合されたものであってもよく、Ｌを介して、Ｘに共有化学結合により互いに結合されたものであってもよい。

【0168】

具体的には、前記Ｆは、免疫グロブリンＦｃ領域であり、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ Ｆｃ領域又は非グリコシル化されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域であるが、特にこれらに限定されるものではない。

【0169】

本発明の具体的な一例として、前記Ｆ（免疫グロブリンＦｃ領域）は、２本のポリペプチド鎖からなる二量体であり、Ｌの一末端が前記２本のポリペプチド鎖のいずれかのポリペプチド鎖にのみ連結されている構造を有するが、これに限定されるものではない。

【0170】

本発明のペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸側鎖は、生体内で可溶性及び／又は半減期を向上させ、かつ／又はバイオアベイラビリティを増加させるために、このような生体適合性物質に接合される。また、このような改変は、治療学的タンパク質及びペプチドのクリアランス（clearance）を減少させる。

【0171】

前述した生体適合性物質は、水溶性（両親媒性又は親水性）のもの、無毒性のもの、及び／又は薬学的に許容されるものであってもよい。

【0172】

前記Ｆは、Ｘに直接連結された（すなわち、化学式（１）においてａが０である）ものであってもよく、ポリエチレングリコールリンカー（Ｌ）を介して連結されたものであってもよい。

【0173】

具体的な一実施形態において、本発明の持続型結合体は、インターロイキン２アナログと免疫グロブリンＦｃ領域が連結されたものであるが、これに限定されるものではない。

【0174】

本発明における「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除いたものであり、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び／又は重鎖定常領域３（ＣＨ３）部分を含む部位を意味する。前記免疫グロブリンＦｃ領域は、本発明の結合体の一部をなす一構成であってもよい。具体的には、化学式（１）におけるＦに該当する。

【0175】

本明細書において、Ｆｃ領域には、免疫グロブリンのパパイン消化により得られる天然配列だけでなく、その誘導体、例えば天然配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより置換されて天然のものとは異なる配列などの改変体も含まれる。前記誘導体、置換体、改変体は、ＦｃＲｎに結合する能力を有することを前提とする。本発明において、Ｆはヒト免疫グロブリン領域であるが、これに限定されるものではない。本明細書における「生体適合性物質」又は「キャリア」とは、前記Ｆｃ領域を意味する。

【0176】

前記Ｆ（免疫グロブリンＦｃ領域）は、２本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合で連結された構造であり、前記２本の鎖のうち１本の鎖の窒素原子を介してのみ連結された構造であるが、これに限定されるものではない。前記窒素原子を介した連結は、リシンのεアミノ原子やＮ末端のアミノ基に還元的アミノ化により連結されるものであってもよい。

【0177】

還元的アミノ化反応とは、反応物のアミン基又はアミノ基が他の反応物のアルデヒド（すなわち、還元的アミノ化が可能な官能基）と反応してアミンを生成し、次いで還元反応によりアミン結合を形成する反応を意味し、当該技術分野で周知の有機合成反応である。

【0178】

本発明の持続型結合体の一具体例として、前記持続型結合体は、前記免疫グロブリンＦｃ領域がそのＮ末端窒素原子を介してリンカーに連結されたものであってもよい。

【0179】

このような免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖定常領域にヒンジ（hinge）部分を含むが、これに限定されるものではない。

【0180】

本発明における免疫グロブリンＦｃ領域は、Ｎ末端に特定ヒンジ配列を含んでもよい。

【0181】

本発明における「ヒンジ配列」とは、重鎖に位置してジスルフィド結合（inter disulfide bond）により免疫グロブリンＦｃ領域の二量体を形成する部位を意味する。

【0182】

本発明において、前記ヒンジ配列は、次のアミノ酸配列を有するヒンジ配列中の一部が欠失して１つのシステイン残基のみ有するように変異したものであるが、これに限定されるものではない。
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４１８）。

【0183】

前記ヒンジ配列は、配列番号４１８のヒンジ配列中の８番目又は１１番目のシステイン残基が欠失して１つのシステイン残基のみ含むものであってもよい。本発明のヒンジ配列は、１つのシステイン残基のみ含む、３～１２個のアミノ酸からなるものであるが、これに限定されるものではない。より具体的には、本発明のヒンジ配列は、次の配列を有するものであってもよい。
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４１９）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ（配列番号４２０）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号４２１）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（配列番号４２２）
Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号４２３）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号４２４）
Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号４２５）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４２６）
Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４２７）
Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４２８）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４２９）
Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４３０）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４３１）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号４３２）
Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４３３）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４３４）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４３５）
Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ（配列番号４３６）
Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４３７）

【0184】

より具体的には、前記ヒンジ配列は、配列番号４２８（Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ）又は配列番号４３７（Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ）のアミノ酸配列を含むものであるが、これらに限定されるものではない。

【0185】

本発明の持続型結合体のより具体的な形態において、前記結合体中の前記免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端はプロリンであり、その結合体は前記プロリンの窒素原子を介してＦｃ領域がリンカーに連結されたものである。

【0186】

本発明の持続型結合体の一実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ配列が存在することにより免疫グロブリンＦｃ領域の２本の鎖がホモ二量体（homodimer）やヘテロ二量体（heterodimer）を形成する二量体の形態であってもよい。本発明の化学式（１）の結合体は、リンカーの一末端が二量体の免疫グロブリンＦｃ領域の１本の鎖に連結された形態であるが、これに限定されるものではない。

【0187】

本発明における「Ｎ末端」とは、タンパク質又はポリペプチドのアミノ末端を意味し、アミノ末端の最末端、又は最末端から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個以上のアミノ酸が含まれる。本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ配列をＮ末端に含むが、これに限定されるものではない。

【0188】

また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然のものと実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。さらに、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に相当する非常に長い一部のアミノ酸配列が欠失した領域であってもよい。

【0189】

例えば、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインの少なくとも１つのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、又は６）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体であるが、これらに限定されるものではない。

【0190】

本発明における前記免疫グロブリンＦｃ領域は、同一起源のドメインからなる一本鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体の形態であるが、これらに限定されるものではない。

【0191】

また、本発明の持続型結合体の一実施形態として、前記免疫グロブリンＦｃ領域Ｆは、２本のポリペプチド鎖からなる二量体（dimer）であり、ここで、前記Ｆｃ領域二量体ＦとＸは、エチレングリコール繰り返し単位を含む１つの同じリンカーＬを介して共有結合的に連結されている。本実施形態の具体的な例において、Ｘは、このようなＦｃ領域二量体Ｆの２本のポリペプチド鎖のいずれかのポリペプチド鎖にのみリンカーＬを介して共有結合により連結されている。本実施形態のさらに具体的な例において、このようなＦｃ領域二量体Ｆの２本のポリペプチド鎖のうちＸが連結された１本のポリペプチド鎖には、１分子のＸのみＬを介して共有結合的に連結されている。本実施形態の最も具体的な例において、前記Ｆはホモ二量体である。

【0192】

他の具体例において、前記免疫グロブリンＦｃ領域Ｆは、２本のポリペプチド鎖からなる二量体であり、Ｌの一末端が前記２本のポリペプチド鎖のいずれかのポリペプチド鎖にのみ連結されたものであるが、これに限定されるものではない。

【0193】

本発明の持続型結合体の他の実施形態においては、二量体形態の１つのＦｃ領域に２分子のＸが対称に結合されてもよい。ここで、前記免疫グロブリンＦｃ領域とＸは、Ｌにより互いに連結されてもよい。しかし、上記例に限定されるものではない。

【0194】

また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域には、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体も含まれる。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。

【0195】

例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４～２３８、２９７～２９９、３１８～３２２、又は３２７～３３１番目のアミノ酸残基が修飾に適した部位として用いられる。

【0196】

また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去された誘導体、天然ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が欠失した誘導体、天然ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加された誘導体など、様々な誘導体が用いられる。さらに、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を作製する技術は、特許文献２、３などに開示されている。

【0197】

分子の活性を全体的に変化させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野で公知である（非特許文献１３）。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫酸化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、グリコシル化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）、アミド化（amidation）などにより修飾（modification）されてもよい。

【0198】

記述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同等の生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を向上させたものであってもよい。

【0199】

また、このようなＦｃ領域は、ヒトや、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離した天然のものから得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換えたもの又はその誘導体であってもよい。ここで、天然のものから得る方法は、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素で処理することにより得る方法であってもよい。パパインで処理するとＦａｂ及びＦｃで切断され、ペプシンで処理するとｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）₂に切断される。これらは、サイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。より具体的な実施形態において、ヒト由来のＦｃ領域は、微生物から得られた組換え免疫グロブリンＦｃ領域である。

【0200】

また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然糖鎖であってもよく、天然のものに比べて増加した糖鎖であってもよく、天然のものに比べて減少した糖鎖であってもよく、糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法、微生物を用いた遺伝工学的手法などの通常の方法が用いられる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が低減又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことから、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域は、薬物のキャリアとしての本来の目的に適する形態である。

【0201】

本発明における「糖鎖の除去（Deglycosylation）」とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域を意味し、非グリコシル化（Aglycosylation）とは、原核生物、より具体的な実施形態においては大腸菌で産生されてグリコシル化されていないＦｃ領域を意味する。

【0202】

一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト起源、又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であり、より具体的な実施形態においてはヒト起源である。

【0203】

また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来のＦｃ領域であってもよく、それらの組み合わせ（combination）又はそれらのハイブリッド（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。より具体的な実施形態においては、ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来のものであり、さらに具体的な実施形態においては、リガンド結合タンパク質の半減期を延長させることが知られているＩｇＧ由来のものである。一層具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、最も具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域であるが、これらに限定されるものではない。

【0204】

また、一具体例として、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃのフラグメントであり、各単量体の３番目のアミノ酸であるシステイン間のジスルフィド結合（inter-chain形態）により２つの単量体が連結されたホモ二量体であってもよく、ここで、ホモ二量体は、各単量体において３５番目と９５番目のシステイン間、及び１４１番目と１９９番目のシステイン間にジスルフィド結合、すなわち２つのジスルフィド結合（intra-chain形態）を有するものである／有するものであってもよい。

【0205】

各単量体のアミノ酸は、２２１個のアミノ酸からなり、ホモ二量体を形成するアミノ酸は、全体で４４２個のアミノ酸からなるが、これらに限定されるものではない。具体的には、免疫グロブリンＦｃフラグメントは、配列番号４３８のアミノ酸配列（２２１個のアミノ酸からなる）を有する２つの単量体が各単量体の３番目のアミノ酸であるシステイン間のジスルフィド結合によりホモ二量体を形成し、前記ホモ二量体の単量体は、それぞれ独立して３５番目と９５番目のシステイン間の内部のジスルフィド結合、及び１４１番目と１９９番目のシステイン間の内部のジスルフィド結合を形成するものであるが、これに限定されるものではない。

【0206】

化学式（１）のＦは、配列番号４３８のアミノ酸配列を有する単量体を含むものであり、前記Ｆは、配列番号４３８のアミノ酸配列の単量体のホモ二量体であるが、これらに限定されるものではない。

【0207】

一例として、免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号４３９のアミノ酸配列（４４２個のアミノ酸からなる）を含むホモ二量体であるが、これに限定されるものではない。

【0208】

一具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域とＸはグリコシル化されていないが、これに限定されるものではない。

【0209】

一方、本発明における「組み合わせ（combination）」とは、二量体又は多量体を形成する際に、同一起源の一本鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが異なる起源の一本鎖ポリペプチドに結合することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ Ｆｃフラグメントからなる群から選択される少なくとも２つのフラグメントから二量体又は多量体を作製することができる。

【0210】

本発明における「ハイブリッド（hybrid）」とは、一本鎖免疫グロブリン定常領域内に、少なくとも２つの異なる起源の免疫グロブリンＦｃフラグメントに相当する配列が存在することを意味する。本発明においては、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群から選択される１つ～４つのドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含んでもよい。

【0211】

一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けられ、本発明においては、それらの組み合わせ又はそれらのハイブリダイゼーションも可能である。具体的には、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであり、より具体的には、補体依存性細胞傷害（CDC, Complement dependent cytotoxicity）などのエフェクター機能（effector function）のほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域である。

【0212】

また、前述した結合体は、天然インターロイキン２もしくはアルデスロイキンより、又はＦが修飾されていないＸより効力の持続性が向上したものであり、このような結合体には、前述した形態だけでなく、生分解性ナノ粒子に封入された形態などが全て含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0213】

化学式（１）において、前記Ｌはポリエチレングリコールリンカーであってもよい。

【0214】

本発明における「ポリエチレングリコールリンカー」には、エチレングリコール繰り返し単位が少なくとも２つ結合された生体適合性重合体が含まれる。前記繰り返し単位は、ペプチド結合を除く任意の共有結合により互いに連結される。前記ポリエチレングリコールリンカーは、本発明の結合体の一部をなす一構成であり、化学式（１）におけるＬに該当する。本明細書において、前記リンカーは、「非ペプチド性リンカー」又は「非ペプチド性重合体」と混用される。

【0215】

前記Ｌａにおいて、ａは１以上であってもよく、ａが２以上であればそれぞれのＬは独立したものであってもよい。

【0216】

具体的な一実施形態における前記結合体は、両末端にＦ（具体的には、免疫グロブリンＦｃ領域）、及びＸ（具体的には、インターロイキン２アナログ）に結合される反応基を含む非ペプチド性リンカーを介して、ＦとＸが互いに共有結合的に連結されたものであってもよい。

【0217】

具体的には、本発明における非ペプチド性リンカーは、末端に反応基を含み、結合体を構成する他の構成要素との反応により結合体を形成することができる。両末端に反応性官能基を有する非ペプチド性リンカーが各反応基を介して化学式（１）のＸ及びＦに結合することにより結合体を形成する場合、前記非ペプチド性リンカー又は非ペプチド性重合体を非ペプチド性重合体連結部（linker moiety）又は非ペプチド性リンカー連結部ともいう。

【0218】

具体的な一実施形態において、前記Ｌ（ポリエチレングリコールリンカー）は、エチレングリコール繰り返し単位を含むリンカー、例えばポリエチレングリコールであるが、これに限定されるものではない。本明細書における前記ポリエチレングリコールは、エチレングリコールホモポリマー、ＰＥＧコポリマー又はモノメチル置換ＰＥＧポリマー（ｍＰＥＧ）の形態を包括するものでるが、特にこれらに限定されるものではない。また、当該分野で公知のそれらの誘導体や当該分野の技術水準で容易に作製できる誘導体も本発明に含まれる。

【0219】

前記ポリエチレングリコールリンカーは、エチレングリコール繰り返し単位を含むと共に、結合体として構成されるまでは、結合体の作製に用いられる官能基を末端に含むものであってもよい。本発明による持続型結合体は、前記官能基を介してＸとＦが連結された形態であるが、これに限定されるものではない。本発明における前記非ペプチド性リンカーは、２つ又は３つ以上の官能基を含み、各官能基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0220】

具体的には、前記リンカーは、化学式（５）で表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるが、これに限定されるものではない。

【0221】

・・・（５）

【0222】

ここで、ｎ＝１０～２４００、ｎ＝１０～４８０、又はｎ＝５０～２５０であるが、これらに限定されるものではない。

【0223】

前記持続型結合体のＰＥＧ部分は、－（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n－構造だけでなく、連結要素とその－（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n－間に介在する酸素原子も含むが、これに限定されるものではない。

【0224】

一具体例として、前記エチレングリコール繰り返し単位は［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎで表され、ｎ値は、自然数であって、前記インターロイキン２アナログ結合体中の［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎ部分の平均分子量、例えば数平均分子量が０超～約１００ｋＤａになるように決定されるが、これらに限定されるものではない。他の具体例として、前記ｎ値は、自然数であって、前記インターロイキン２アナログ結合体中の［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］ｎ部分の平均分子量、例えば数平均分子量が約１～約１００ｋＤａ、約１～約８０ｋＤａ、約１～約５０ｋＤａ、約１～約３０ｋＤａ、約１～約２５ｋＤａ、約１～約２０ｋＤａ、約１～約１５ｋＤａ、約１～約１３ｋＤａ、約１～約１１ｋＤａ、約１～約１０ｋＤａ、約１～約８ｋＤａ、約１～約５ｋＤａ、約１～約３．４ｋＤａ、約３～約３０ｋＤａ、約３～約２７ｋＤａ、約３～約２５ｋＤａ、約３～約２２ｋＤａ、約３～約２０ｋＤａ、約３～約１８ｋＤａ、約３～約１６ｋＤａ、約３～約１５ｋＤａ、約３～約１３ｋＤａ、約３～約１１ｋＤａ、約３～約１０ｋＤａ、約３～約８ｋＤａ、約３～約５ｋＤａ、約３～約３．４ｋＤａ、約８～約３０ｋＤａ、約８～約２７ｋＤａ、約８～約２５ｋＤａ、約８～約２２ｋＤａ、約８～約２０ｋＤａ、約８～約１８ｋＤａ、約８～約１６ｋＤａ、約８～約１５ｋＤａ、約８～約１３ｋＤａ、約８～約１１ｋＤａ、約８～約１０ｋＤａ、約９～約１５ｋＤａ、約９～約１４ｋＤａ、約９～約１３ｋＤａ、約９～約１２ｋＤａ、約９～約１１ｋＤａ、約９．５～約１０．５ｋＤａ、又は約１０ｋＤａであるが、これらに限定されるものではない。

【0225】

また、具体的な一実施形態における前記結合体は、インターロイキン２アナログと免疫グロブリンＦｃ領域（Ｆ）がエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカー（Ｌ）を介して共有結合により連結された構造であるが、これに限定されるものではない。

【0226】

具体的な他の実施形態における前記持続型結合体において、前記Ｌはエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであり、ａは１であり、Ｆは二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であってもよい。より具体的には、二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域のいずれかのＦｃ領域に１分子のＸが前記エチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーを介して共有結合的に連結されたものであるが、これに限定されるものではない。また、具体的なさらに他の実施形態においては、前記エチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーの一末端が前記二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域の２本のＦｃ領域鎖のいずれかのＦｃ領域鎖にのみ連結されたものであるが、これに限定されるものではない。

【0227】

本発明に用いられるポリエチレングリコールリンカーの分子量は、０超～２００ｋＤａの範囲、具体的には約１～１００ｋＤａの範囲、約１～５０ｋＤａの範囲、約１～３０ｋＤａの範囲、約２～３０ｋＤａの範囲、約１～２０ｋＤａの範囲、より具体的には約３．４ｋＤａ～１０ｋＤａの範囲、さらに具体的には約３．４ｋＤａであるが、これらに限定されるものではない。また、前記Ｆに該当するポリペプチドに結合される本発明の非ペプチド性リンカーは、１種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが用いられてもよい。

【0228】

本発明における「約」とは、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などが全て含まれる範囲であり、約という用語の後に続く数値と同等又は同程度の範囲の数値であればいかなるものでもよいが、これらに限定されるものではない。

【0229】

具体的には、前記非ペプチド性リンカーは、Ｆ及びＸに結合されていない状態で両末端に反応基を有し、前記反応基を介してＦ及びＸに結合されるものであってもよい。

【0230】

一具体例として、前記リンカーの両末端は、免疫グロブリンＦｃ領域のチオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、及びインターロイキン２アナログ（Ｘ）のチオール基、アミノ基、アジド基、ヒドロキシ基に結合されるが、これらに限定されるものではない。

【0231】

具体的には、前記リンカーは、両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びインターロイキン２アナログ（Ｘ）に結合される反応基、より具体的には、免疫グロブリンＦｃ領域のシステインのチオール基と、Ｎ末端、リシン、アルギニン、グルタミン及び／又はヒスチジンに位置するアミノ基と、Ｃ末端に位置するヒドロキシ基とからなる群から選択される少なくとも１つに結合され、インターロイキン２アナログ（Ｘ）のシステインのチオール基と、リシン、アルギニン、グルタミン及び／又はヒスチジンのアミノ基と、アジドリシンのアジド基と、ヒドロキシ基とからなる群から選択される少なくとも１つに結合される反応基であるが、これらに限定されるものではない。

【0232】

さらに具体的には、前記リンカーの反応基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。

【0233】

上記において、アルデヒド基の例として、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0234】

上記において、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル又はスクシンイミジルカーボネートが用いられるが、これらに限定されるものではない。

【0235】

前記リンカーは、上記反応基を介して、免疫グロブリンＦｃ領域であるＦ、及びインターロイキン２アナログであるＸに連結され、リンカー連結部に変換されてもよい。

【0236】

また、アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものよりはるかに安定している。アルデヒド反応基は、低いｐＨではＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリシン残基と共有結合を形成することができる。

【0237】

また、前記リンカーの両末端の反応基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。例えば、両末端にアルデヒド基を有するものであってもよく、一末端にはマレイミド基、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を有するものであってもよい。しかし、リンカーの各末端にＦ、具体的には免疫グロブリンＦｃ領域とＸが結合されるものであれば、特にこれに限定されるものではない。

【0238】

例えば、前記リンカーの一末端には反応基としてマレイミド基を含み、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基などを含んでもよい。

【0239】

両末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールをリンカーとして用いる場合、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前述した様々な反応基として活性化するか、市販されている修飾された反応基を有するポリエチレングリコールを用いることにより、本発明のインターロイキン２アナログ持続型結合体を作製することができる。

【0240】

具体的な一実施形態において、前記リンカーは、Ｘのシステイン残基、より具体的にはシステインの－ＳＨ基に連結されたものであるが、これらに限定されるものではない。

【0241】

具体的には、前記システイン残基の－ＳＨ基にリンカーの反応基が連結されてもよい。反応基については前述した通りである。マレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドを用いる場合、マレイミド基はＸの－ＳＨ基にチオエーテル（thioether）結合で連結することができ、アルデヒド基はＦ、具体的には免疫グロブリンＦｃの－ＮＨ２基に還元的アミノ化反応により連結することができるが、これに限定されるものではない。

【0242】

具体的な他の実施形態において、前記リンカーは、Ｘのリシン残基、より具体的にはリシンのアミノ基に連結されるものであるが、これらに限定されるものではない。

【0243】

また、前記結合体において、リンカーの反応基が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に位置する－ＮＨ２に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0244】

さらに、前記結合体において、本発明によるインターロイキン２アナログは、反応基を有するリンカーにＣ末端を介して連結されてもよいが、これは一例にすぎない。

【0245】

本発明における「Ｃ末端」とは、ペプチドのカルボキシ末端を意味し、本発明の目的上、リンカーに結合する位置を意味する。例えば、これらに限定されるものではないが、Ｃ末端の最末端のアミノ酸残基だけでなく、Ｃ末端周辺のアミノ酸残基が全て含まれ、具体的には最末端から１～２０番目のアミノ酸残基が含まれる。

【0246】

また、前述した結合体は、Ｆが修飾されていないＸより効力の持続性が向上したものであり、このような結合体には、前述した形態だけでなく、生分解性ナノ粒子に封入された形態などが全て含まれる。

【0247】

本発明を実現するための本発明のさらに他の態様は、配列番号３～１０６のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むインターロイキン２アナログと免疫グロブリンＦｃ領域がリンカーを介して連結された持続型結合体を提供する。

【0248】

前記インターロイキン２アナログ、リンカー及びそれを含む持続型結合体については前述した通りである。

【0249】

本発明を実現するための本発明のさらに他の態様は、化学式（２）で表されるインターロイキン２アナログの持続型結合体を提供する。

【0250】

Ｘ－Ｚ－Ｆｃ・・・（２）

【0251】

ここで、Ｘは配列番号３～１０６のアミノ酸配列から選択されるいずれかのポリペプチド配列を含むインターロイキン２アナログであり、Ｚはポリエチレングリコールリンカーであって、分子量２ｋＤａ～３０ｋＤａのリンカーであり、Ｆｃは二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であり、－はＸとＺ間、ＺとＦｃ間の共有結合連結を示すものであり、前記持続型結合体は、前記二量体形態のＦｃ領域のうち１本のポリペプチド鎖にのみＺの一末端が共有結合により連結され、そのＺの反対側の末端に１分子のＸが共有結合により連結されたものである。

【0252】

前記インターロイキン２アナログ、リンカー、Ｆｃ領域及びそれを含む持続型結合体については前述した通りである。

【0253】

具体的な一実施形態において、前記インターロイキン２アナログは、配列番号１０、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２１、２２、３２、３５、３６、４２、５３、５４、５６、５８、５９、６０、６２、７１、７２、７４、７５、７６、７７、７８、８５、８７、８９、９１、９２、９３、９４、９５、９８、９９、１００、１０１、１０３、１０４、１０５及び１０６のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかの配列を含むものであるか、前記配列から必須に構成されるものであるか、前記配列からなるものであるが、これらに限定されるものではない。

【0254】

具体的な他の実施形態において、前記インターロイキン２アナログは、配列番号１０、１３、１４、１６、１７、２０、２１、２２、３２、３５、３６、４２、５３、５４、８７、８９、９１、９２、９３、９４、９８、９９、１００、１０１、１０３、１０４及び１０５のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかの配列を含むものであるか、前記配列から必須に構成されるものであるか、前記配列からなるものであるが、これらに限定されるものではない。

【0255】

具体的なさらに他の実施形態において、前記インターロイキン２アナログは、配列番号２２、４２、５３、８７、１０５及び１０６のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかの配列を含むものであるか、前記配列から必須に構成されるものであるか、前記配列からなるものであるが、これらに限定されるものではない。

【0256】

また、前記インターロイキン２アナログは、Ｃ末端に少なくとも１つのアミノ酸をさらに含むものであるが、これに限定されるものではない。

【0257】

本発明を実現するための本発明のさらに他の態様は、化学式（３）で表されるインターロイキン２アナログの持続型結合体を提供する。

【0258】

Ｘ’－Ｚ－Ｆｃ・・・（３）

【0259】

ここで、Ｘ’は一般式１で表されるアミノ酸配列を含むインターロイキン２アナログであり、Ｚはポリエチレングリコールリンカーであって、分子量２ｋＤａ～３０ｋＤａのリンカーであり、Ｆｃは二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であり、－はＸ’とＺ間、ＺとＦｃ間の共有結合連結を示すものであり、前記持続型結合体は、前記二量体形態のＦｃ領域のうち１本のポリペプチド鎖にのみＺの一末端が共有結合により連結され、そのＺの反対側の末端に１分子のＸ’が共有結合により連結されたものである。

【0260】

［一般式１］
Ｘ１－Ｐ－Ｔ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｔ－Ｋ－Ｋ－Ｔ－Ｑ－Ｌ－Ｑ－Ｌ－Ｅ－Ｈ－Ｌ－Ｘ１８－Ｘ１９－Ｄ－Ｌ－Ｘ２２－Ｍ－Ｉ－Ｌ－Ｎ－Ｇ－Ｉ－Ｎ－Ｎ－Ｙ－Ｋ－Ｎ－Ｐ－Ｋ－Ｌ－Ｔ－Ｘ３８－Ｍ－Ｌ－Ｔ－Ｘ４２－Ｘ４３－Ｆ－Ｘ４５－Ｍ－Ｐ－Ｋ－Ｋ－Ａ－Ｔ－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｈ－Ｌ－Ｑ－Ｃ－Ｌ－Ｅ－Ｘ６１－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｐ－Ｌ－Ｅ－Ｘ６８－Ｖ－Ｌ－Ｎ－Ｌ－Ａ－Ｘ７４－Ｓ－Ｋ－Ｎ－Ｆ－Ｈ－Ｘ８０－Ｘ８１－Ｐ－Ｒ－Ｘ８４－Ｘ８５－Ｘ８６－Ｓ－Ｎ－Ｉ－Ｎ－Ｘ９１－Ｘ９２－Ｖ－Ｘ９４－Ｅ－Ｘ９６－Ｋ－Ｇ－Ｓ－Ｅ－Ｔ－Ｔ－Ｆ－Ｍ－Ｃ－Ｅ－Ｙ－Ａ－Ｄ－Ｅ－Ｔ－Ａ－Ｔ－Ｉ－Ｖ－Ｅ－Ｆ－Ｌ－Ｎ－Ｒ－Ｗ－Ｉ－Ｔ－Ｆ－Ｓ－Ｑ－Ｓ－Ｉ－Ｉ－Ｓ－Ｔ－Ｌ－Ｔ（一般式１，配列番号２１２）

【0261】

一般式１において、Ｘ１は欠失しており、Ｘ１８はロイシン（Ｌ）又はアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ１９はロイシン（Ｌ）又はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ２２はグルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘ３８はアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ４２はアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）又はトリプトファン（Ｗ）であり、Ｘ４３はグルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）又はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘ４５はアラニン（Ａ）又はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ６１はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ６８はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、Ｘ７４はヒスチジン（Ｈ）又はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘ８０はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ８１はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）又はアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ８４はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、Ｘ８５はアラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）又はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ８６はアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）又はバリン（Ｖ）であり、Ｘ９１はトレオニン（Ｔ）又はバリン（Ｖ）であり、Ｘ９２はフェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）又はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ９４はフェニルアラニン（Ｆ）又はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ９６はフェニルアラニン（Ｆ）又はロイシン（Ｌ）である。

【0262】

前記インターロイキン２アナログ、リンカー、Ｆｃ領域及びそれを含む持続型結合体については前述した通りである。

【0263】

一般式１においてＸ１３３に相当するトレオニン（Ｔ）に少なくとも１つのアミノ酸が付加されるが、これに限定されるものではない。

【0264】

具体的には、前記インターロイキン２アナログは、配列番号１０、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２１、２２、３２、３５、３６、４２、５３、５４、５６、５８、５９、６０、６２、７１、７２、７４、７５、７６、７７、７８、８５、８７、８９、９１、９２、９３、９４、９５、９８、９９、１００、１０１、１０３、１０４、１０５及び１０６のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかの配列を含むものであるか、前記配列から必須に構成されるものであるか、前記配列からなるものであるが、これらに限定されるものではない。

【0265】

このようなインターロイキン２アナログは、アルデスロイキン又は天然インターロイキン２より増加したβ受容体結合力を有するが、これらに限定されるものではない。

【0266】

具体的な一実施形態において、一般式１にて、Ｘ４３はリシン（Ｋ）であり、Ｘ４５はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ６１はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘ６８はグルタミン酸（Ｅ）であり、Ｘ７４はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘ８０はフェニルアラニン（Ｆ）又はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ８５はロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ８６はイソロイシン（Ｉ）又はバリン（Ｖ）であり、Ｘ９２はフェニルアラニン（Ｆ）又はイソロイシン（Ｉ）であるが、これらに限定されるものではない。

【0267】

具体的には、前記インターロイキン２アナログは、配列番号１０、１３、１４、１６、１７、２０、２１、２２、３２、３５、３６、４２、５３、５４、８７、８９、９１、９２、９３、９４、９８、９９、１００、１０１、１０３、１０４及び１０５のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかの配列を含むことを特徴とする。

【0268】

本発明のインターロイキン２アナログは、Ｃ末端に少なくとも１つのアミノ酸をさらに含むが、これに限定されるものではない。

【0269】

本発明を実現するための本発明のさらに他の態様は、化学式（４）で表されるインターロイキン２アナログの持続型結合体を提供する。

【0270】

Ｘ’’－Ｚ－Ｆｃ・・・（４）

【0271】

ここで、Ｘ’’は一般式２で表されるアミノ酸配列を含むインターロイキン２アナログであり、Ｚはポリエチレングリコールリンカーであって、分子量２ｋＤａ～３０ｋＤａのリンカーであり、Ｆｃは二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であり、－はＸ’’とＺ間、ＺとＦｃ間の共有結合連結を示すものであり、前記持続型結合体は、前記二量体形態のＦｃ領域のうち１本のポリペプチド鎖にのみＺの一末端が共有結合により連結され、そのＺの反対側の末端に１分子のＸ’’が共有結合により連結されたものである。

【0272】

［一般式２］
Ｘ１－Ｐ－Ｔ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｔ－Ｋ－Ｋ－Ｔ－Ｑ－Ｌ－Ｑ－Ｌ－Ｅ－Ｈ－Ｌ－Ｘ１８－Ｌ－Ｄ－Ｌ－Ｘ２２－Ｍ－Ｉ－Ｌ－Ｎ－Ｇ－Ｉ－Ｎ－Ｎ－Ｙ－Ｋ－Ｎ－Ｐ－Ｋ－Ｌ－Ｔ－Ｘ３８－Ｍ－Ｌ－Ｔ－Ｘ４２－Ｋ－Ｆ－Ｙ－Ｍ－Ｐ－Ｋ－Ｋ－Ａ－Ｔ－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｈ－Ｌ－Ｑ－Ｃ－Ｌ－Ｅ－Ｘ６１－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｐ－Ｌ－Ｅ－Ｘ６８－Ｖ－Ｌ－Ｎ－Ｌ－Ａ－Ｑ－Ｓ－Ｋ－Ｎ－Ｆ－Ｈ－Ｆ－Ｘ８１－Ｐ－Ｒ－Ｄ－Ｘ８５－Ｘ８６－Ｓ－Ｎ－Ｉ－Ｎ－Ｖ－Ｆ－Ｖ－Ｌ－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｇ－Ｓ－Ｅ－Ｔ－Ｔ－Ｆ－Ｍ－Ｃ－Ｅ－Ｙ－Ａ－Ｄ－Ｅ－Ｔ－Ａ－Ｔ－Ｉ－Ｖ－Ｅ－Ｆ－Ｌ－Ｎ－Ｒ－Ｗ－Ｉ－Ｔ－Ｆ－Ｓ－Ｑ－Ｓ－Ｉ－Ｉ－Ｓ－Ｔ－Ｌ－Ｔ（一般式２，配列番号２１３）

【0273】

Ｘ１は欠失しており、Ｘ１８はロイシン（Ｌ）又はアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ２２はグルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘ３８はアラニン（Ａ）又はアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ４２はフェニルアラニン（Ｆ）又はリシン（Ｋ）であり、Ｘ６１はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、Ｘ６８はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、Ｘ８１はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、Ｘ８５はロイシン（Ｌ）又はバリン（Ｖ）であり、Ｘ８６はイソロイシン（Ｉ）又はバリン（Ｖ）である。

【0274】

前記インターロイキン２アナログ、リンカー、Ｆｃ領域及びそれを含む持続型結合体については前述した通りである。

【0275】

具体的には、前記インターロイキン２アナログは、配列番号２２、４２、５３、８７、１０５及び１０６のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれかの配列を含むものであるが、これらに限定されるものではない。

【0276】

また、一般式２においてＸ１３３に相当するトレオニン（Ｔ）に少なくとも１つのアミノ酸が付加されるか、インターロイキン２アナログのＣ末端に少なくとも１つのアミノ酸をさらに含むが、これらに限定されるものではない。

【0277】

本発明を実現するための本発明のさらに他の態様は、インターロイキン２アナログを含む持続型結合体を製造する方法を提供する。

【0278】

前記インターロイキン２アナログ、及びそれを含む持続型結合体については前述した通りである。

【0279】

具体的には、前記方法は、天然インターロイキン２において、１番目、１２番目、１８番目、１９番目、２０番目、２２番目、３２番目、３５番目、３８番目、４２番目、４３番目、４５番目、４８番目、４９番目、６１番目、６８番目、６９番目、７４番目、７６番目、８０番目、８１番目、８２番目、８４番目、８５番目、８６番目、８７番目、８８番目、８９番目、９１番目、９２番目、９４番目、９５番目、９６番目、１２５番目、１２６番目及び１３３番目の位置に相当するアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸に変異が導入されたインターロイキン２アナログを生体適合性物質（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域）にリンカー（例えば、非ペプチド性重合体）を介して連結するステップを含むものであってもよい。

【0280】

本発明の持続型結合体製造方法は、天然インターロイキン２において、１番目、１２番目、１８番目、１９番目、２０番目、２２番目、３２番目、３５番目、３８番目、４２番目、４３番目、４５番目、４８番目、４９番目、６１番目、６８番目、６９番目、７４番目、７６番目、８０番目、８１番目、８２番目、８４番目、８５番目、８６番目、８７番目、８８番目、８９番目、９１番目、９２番目、９４番目、９５番目、９６番目、１２５番目、１２６番目及び１３３番目の位置に相当するアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸に変異を導入するステップをさらに含んでもよいが、前述した本発明によるインターロイキン２アナログが生体適合性物質（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域）に連結された持続型結合体が製造されるものであれば、特定のステップやその順序に限定されるものではない。

【0281】

また、本発明の持続型結合体製造方法は、ａ）前記インターロイキン２アナログをコードする核酸を含む形質転換体を培養してインターロイキン２アナログを発現させるステップと、ｂ）発現したインターロイキン２アナログを分離及び精製するステップとをさらに含むが、これに限定されるものではない。

【0282】

前記インターロイキン２アナログをコードする核酸は、配列番号１０９～２１２のいずれかの塩基配列を含むものであるか、前記塩基配列から（必須に）構成されるものであるが、これらに限定されるものではない。

【0283】

本発明において、形質転換体の培養に用いられる培地は、好適な方法で宿主細胞培養の要件を満たさなければならない。宿主細胞の成長のために培地中に含まれる炭素源は、作製される形質転換体の種類に応じて当業者の判断により適宜選択され、培養の時期及び量を調節するために好適な培養条件が採用される。

【0284】

用いることのできる糖源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フラクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油脂、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセリン、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が挙げられる。これらの物質は、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。

【0285】

用いることのできる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、黄粉及び尿素、又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源も、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。

【0286】

用いることのできるリン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、又はそれらに相当するナトリウム含有塩が挙げられる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウム、硫酸鉄などの金属塩を含有してもよい。

【0287】

最後に、上記物質以外に、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に好適な前駆体が用いられてもよい。前述した原料は、培養過程において培養物に好適な方法でバッチ毎に又は連続して添加されてもよい。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの塩基性化合物、又はリン酸、硫酸などの酸性化合物を好適な方法で用いて培養物のｐＨを調整してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために、培養物中に酸素又は酸素含有気体（例えば、空気）を注入してもよい。

【0288】

本発明による形質転換体の培養は、通常２０℃～４５℃、具体的には２５℃～４０℃の温度で行われる。また、培養は、所望のインターロイキン２アナログの最大の生成量が得られるまで続けるが、これらの目的上、通常１０～１６０時間続ける。

【0289】

前述したように、宿主細胞に応じて適切な培養条件を整えると、本発明による形質転換体によりインターロイキン２アナログが生産され、ベクターの構成及び宿主細胞の特徴に応じて、生産されるインターロイキン２アナログは宿主細胞の細胞質内、細胞周辺腔（periplasmic space）又は細胞外に分泌される。

【0290】

宿主細胞の内外で発現したタンパク質は、通常の方法で精製することができる。精製方法の例としては、塩析（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（例えば、アセトン、エタノールなどを用いたタンパク質分画沈殿など）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、限外濾過などの技法を単独で又は組み合わせて用いることができる。

【0291】

あるいは、ペプチド合成法により作製したインターロイキン２アナログを生体適合性物質（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域）に非ペプチド性重合体を介して連結してもよい。このようなペプチド合成は、本発明のインターロイキン２アナログ配列が提供されているので、公知のペプチド合成法を用いることにより難なく行うことができる。

【0292】

インターロイキン２アナログについては前述した通りである。

【0293】

本発明を実現するための本発明のさらに他の態様は、前記方法で製造した持続型結合体を提供する。

【0294】

本明細書において特に断らない限り、本発明による「インターロイキン２アナログ」又はインターロイキン２アナログが生体適合性物質に共有結合で連結された「結合体」についての明細書の詳細な説明や請求の範囲の記述は、当該インターロイキン２アナログ又は結合体は言うまでもなく、当該インターロイキン２アナログ又は結合体の塩（例えば、前記インターロイキン２アナログの薬学的に許容される塩）又はその溶媒和物の形態が全て含まれるカテゴリーにも適用される。よって、明細書に「インターロイキン２アナログ」又は「結合体」とのみ記載されていたとしても、当該記載内容はその特定の塩、その特定の溶媒和物、その特定の塩の特定の溶媒和物にも同様に適用される。これらの塩の形態は、例えば薬学的に許容される任意の塩を用いた形態であってもよい。

【0295】

前記塩の種類は、特に限定されるものではない。もっとも、個体、例えば哺乳類に安全かつ効果的な形態であることが好ましいが、特にこれに限定されるものではない。

【0296】

前記「薬学的に許容される」とは、医薬学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応などを誘発することなく所望の用途に効果的に使用できる物質を意味する。

【0297】

本発明における「薬学的に許容される塩」には、薬学的に許容される無機酸、有機酸又は塩基から誘導された塩が含まれる。好適な酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。好適な塩基から誘導された塩には、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、アンモニウムなどが含まれる。

【0298】

また、本発明における「溶媒和物」とは、本発明によるインターロイキン２アナログ又はその塩が溶媒分子と複合体を形成したものを意味する。

【0299】

本発明を実現するための本発明のさらに他の態様は、インターロイキン２アナログ又はその持続型結合体を含む組成物を提供する。インターロイキン２アナログ、その持続型結合体については前述した通りである。本発明による組成物は、薬学組成物であってもよく、具体的な一形態としては、癌予防又は治療用途を有する薬学組成物であってもよい。

【0300】

本発明による組成物は、インターロイキン２アナログ又はその持続型結合体を含むものであってもよく、具体的には、薬理学的有効量のインターロイキン２アナログ又はその持続型結合体を含むものであってもよい。また、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。

【0301】

本発明による組成物の具体例として、配列番号３～１０６からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有するインターロイキン２アナログ又はそれを含む持続型結合体が挙げられ、より具体的には、配列番号２２、４２、５３、８７、１０５及び１０６からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有するインターロイキン２アナログ又は前記インターロイキン２アナログを含む持続型結合体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0302】

本発明における「薬理学的有効量」とは、前記インターロイキン２アナログ又はその持続型結合体が癌の予防又は治療効果を発揮すると共に、患者に毒性や副作用のない安全な投与用量を意味し、インターロイキン２受容体、具体的にはβ及び／又はα受容体に活性を示す投与用量を意味するが、これらに限定されるものではない。

【0303】

本発明による組成物は、次の特性の少なくとも１つの特性を示すものであってもよいが、増大したインターロイキン２β受容体に対する結合力に基づく免疫反応向上、抗癌効果などを示すものであればいかなるものでもよい。
（ｉ）アルデスロイキンと比較した高い血中曝露量
（ｉｉ）アルデスロイキンと比較した腫瘍成長抑制
（ｉｉｉ）アルデスロイキンと比較した記憶Ｔ細胞生成反応

【0304】

Ｔ細胞成長因子として知られるインターロイキン２は、免疫調節に関与するタンパク質であり、Ｔ細胞を増殖させ、Ｂ細胞を刺激し、Ｔ細胞に作用してγ－インターフェロンを分泌させる活性を有する。このようなインターロイキン２の免疫調節活性を基に、体内免疫システムを用いて癌細胞を除去することにより、癌の予防及び治療効果が得られる。

【0305】

特に、本発明のインターロイキン２アナログは、シグナル伝達において主な役割を果たすインターロイキン２β受容体に対する結合力が増大したものであるので、個体の免疫システムにおいてさらに効果的な抗癌効果をもたらす。また、前記インターロイキン２アナログを含む持続型結合体は、インターロイキン２β受容体に対する結合力が増大すると共に、持続性が高まるにつれて血中曝露量が高まり、優れたバイオアベイラビリティを示し、結局のところ、優れた腫瘍成長抑制及び記憶Ｔ細胞生成能を有するので、効果的な癌予防又は治療効果を発揮することができる。

【0306】

具体的には、本発明のインターロイキン２アナログ持続型結合体は、天然インターロイキン２、アルデスロイキン又はそれを含む持続型結合体のインターロイキン２α受容体結合力に比べて、完全に結合力を喪失したものであるか、約０．００１倍以上、約０．００５倍以上、約０．０１倍以上、約０．０５倍以上、約０．１倍以上、約０．３倍以上、約０．５倍以上、約０．６倍以上、約０．７倍以上、約０．８倍以上、約０．９倍以上、約１．１倍以上、約１．３倍以上、約１．５倍以上、約１．７倍以上のインターロイキン２α受容体結合力を有するものであるが、その数値は限定されるものではなく、結合力が天然インターロイキン２又はアルデスロイキンに比べて変化したものであれば本発明に含まれる。

【0307】

また、具体的には、本発明のインターロイキン２アナログ持続型結合体は、天然インターロイキン２、アルデスロイキン又はそれを含む持続型結合体のインターロイキン２β受容体結合力に比べて、約０．１倍以上、約０．３倍以上、約０．５倍以上、約０．７倍以上、約１．０倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約６０倍以上、約７０倍以上、約８０倍以上、約９０倍以上、約１００倍、約１３０倍、約１５０倍、約２００倍以上のインターロイキン２β受容体結合力を有するものであるが、その数値は限定されるものではなく、結合力が天然インターロイキン２又はアルデスロイキンに比べて変化したもの、又は増加したものであれば本発明に含まれる。

【0308】

本発明において、癌は、大腸癌、肝癌、卵巣癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、肺癌、皮膚癌、黒色腫、乳癌、膀胱癌及び胃癌からなる群から選択されるいずれかであるか、又は転移癌であるが、これらに限定されるものではない。また、転移性腎細胞癌又は転移性黒色腫が含まれてもよい。

【0309】

本発明における「予防」とは、前記インターロイキン２アナログ（例えば、前記インターロイキン２アナログ自体又はそれに生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態）又はそれを含む組成物の投与により癌又は腫瘍を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味する。

【0310】

本発明における「治療」とは、前記インターロイキン２アナログ（例えば、前記インターロイキン２アナログ自体又はそれに生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態）又はそれを含む組成物の投与により癌の症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。

【0311】

本発明のインターロイキン２アナログ又はその持続型結合体の使用は、血中曝露量、血中半減期及び生体内効力持続効果の画期的な向上により、毎日投与しなければならない慢性患者への投与回数を減少させることができるので、患者の生活の質を向上させることができるという大きな利点がある。

【0312】

本発明の薬学組成物は、薬学的に許容される担体又は希釈剤をさらに含んでもよい。このような薬学的に許容される担体又は希釈剤は、非自然発生のものであってもよい。

【0313】

本発明における「薬学的に許容される」とは、治療効果を発揮する程度の十分な量と副作用を起こさないことを意味し、癌の種類、患者の年齢、体重、健康状態、性別、患者の薬物に対する感受性、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合、同時に用いられる薬物などの医学分野における公知の要素により当業者が容易に決定することができる。

【0314】

本発明のインターロイキン２アナログ又はその持続型結合体を含む薬学組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。前記賦形剤は、経口投与の場合は、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いることができ、注射剤の場合は、緩衝剤、保存剤、鎮痛剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与用の場合は、基剤、賦形剤、滑沢剤、保存剤などを用いることができるが、特にこれらに限定されるものではない。

【0315】

本発明の組成物の剤形は、前述したような薬学的に許容される賦形剤と混合して様々の形態に製造することができる。例えば、経口投与の場合は、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形態に製造することができ、注射剤の場合は、使い捨てアンプル又は複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放性製剤などに剤形化することができる。

【0316】

なお、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシア、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油などが挙げられる。また、充填剤、抗凝集剤、滑沢剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含んでもよい。

【0317】

また、本発明の薬学組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれかの剤形を有してもよい。

【0318】

さらに、前記組成物は、薬学分野における通常の方法による患者の体内投与に適した単位投与型の製剤、具体的にはタンパク質医薬品の投与に有用な製剤形態に剤形化し、当該技術分野で通常用いる投与方法を用いて経口、又は皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内もしくは直腸経路が含まれる非経口投与経路で投与することができるが、これらに限定されるものではない。

【0319】

さらに、前記結合体は、生理食塩水や有機溶媒のように薬剤に許容される様々な担体（carrier）と混合して用いることができ、安定性や吸収性を向上させるために、グルコース、スクロース、デキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸（ascorbic acid）、グルタチオンなどの抗酸化剤（antioxidants）、キレート剤、低分子タンパク質、他の安定化剤（stabilizers）などを薬剤として用いることができる。

【0320】

本発明のさらに他の態様は、インターロイキン２アナログ、それを含む持続型結合体、又はそれを含む薬学組成物を必要とする個体に、インターロイキン２アナログ、それを含む持続型結合体、又はそれを含む薬学組成物を投与するステップを含む、癌の予防又は治療方法を提供する。

【0321】

前記インターロイキン２アナログ及び／又はインターロイキン２アナログの持続型結合体、それを含む組成物、癌、予防及び治療については前述した通りである。

【0322】

本発明における前記個体とは、癌を発症した個体、又は癌の疑いのある個体であって、ヒトをはじめとしてマウス、家畜などが含まれる哺乳動物を意味し、本発明のインターロイキン２アナログ及び／もしくは結合体、又はそれを含む前記組成物で治療可能な個体であればいかなるものでもよい。

【0323】

本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質（例えば、インターロイキン２アナログ又はその持続型結合体）を導入することを意味し、投与経路は、生体内の標的に送達できるものであれば、一般的なあらゆる経路で投与することができ、例えば腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。

【0324】

本発明の方法は、前記インターロイキン２アナログ又はその持続型結合体を含む薬学組成物を薬学的有効量で投与するステップを含んでもよい。好適な総１日用量は正しい医学的判断の範囲内で担当医により決定され、１回又は数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては他の製剤が用いられるか否か、具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と共に又は同時に投与される薬物をはじめとする様々な因子や、医薬分野で周知の類似の因子に応じて異なる量であることが好ましい。

【0325】

本発明の方法において、投与する際の投与量と回数は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類により決定される。具体的には、本発明の組成物は、前記インターロイキン２アナログ又はそれを含む持続型結合体を薬学的有効量で含むものであるが、これらに限定されるものではない。

【0326】

前記インターロイキン２アナログ又は持続型結合体を薬学的有効量で含むとは、インターロイキン２アナログ又は持続型結合体により目的とする薬理活性（例えば、癌の予防、改善又は治療）が得られる程度に含むことを意味し、また、投与される個体に毒性や副作用がないか、僅かなレベルであって、薬学的に許容されるレベルで含むことを意味するが、これらに限定されるものではない。このような薬学的有効量は、投与回数、患者、剤形などを総合的に考慮して決定される。

【0327】

本発明の前記薬学組成物は、上記成分（有効成分）を０．０１～９９重量対体積％で含有するが、特にこれに限定されるものではない。

【0328】

本発明の組成物の総有効量は、単回投与量（single dose）で患者に投与してもよく、複数回投与量（multiple dose）で長期間投与する分割治療方法（fractionated treatment protocol）により投与してもよい。本発明の薬学組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含有量を変えてもよい。具体的には、本発明のインターロイキン２アナログ又はその持続型結合体の総用量は、１日体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ～５００ｍｇであることが好ましい。しかし、前記インターロイキン２アナログ又はその結合体の用量は、薬学組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌、排泄率など様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるので、これらを考慮すると、当該分野における通常の知識を有する者であれば、前記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定することができるであろう。本発明による薬学組成物は、本発明の効果を奏するものであれば、その剤形、投与経路及び投与方法が特に限定されるものではない。

【0329】

本発明の薬学組成物は、生体内持続性及び力価に優れるので、本発明の薬学的製剤の投与回数及び頻度を大幅に減少させることができる。前記薬学組成物は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与又は直腸内投与経路で投与されるものであるが、目的とする薬理効果が得られるものであれば、特定の投与経路に限定されるものではない。

【0330】

例えば、本発明の薬学組成物は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、又は１カ月に１回投与するものであってもよく、１週間～１カ月の範囲の時間間隔で１回又は複数回投与するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0331】

本発明を実現するさらに他の態様は、癌の予防又は治療のための薬剤の製造における、前記インターロイキン２アナログ、その持続型結合体、それを含む組成物の用途である。

【0332】

前記インターロイキン２アナログ及び／もしくはその持続型結合体、又はそれを含む組成物、癌、予防、治療、投与経路及び投与回数については前述した通りである。

【0333】

本発明を実現するさらに他の態様は、インターロイキン２アナログ、その持続型結合体、又はそれを含む組成物の癌予防又は治療用途を提供する。

【0334】

前記インターロイキン２アナログ及び／もしくはその持続型結合体、又はそれを含む組成物、癌、予防、治療、投与経路及び投与回数については前述した通りである。

【0335】

なお、本明細書において、特に断らない限り、「含む」、「有する」、「含有する」などの表現は、明示した整数（integer）又は整数の集合を含むことを意味するが、他の整数又は整数の集合を排除するものではないと解されるべきである。

【0336】

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例はあくまで本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例1】

【0337】

天然インターロイキン２及びインターロイキン２アナログ発現ベクターの作製
１３３個のアミノ酸をコードする天然インターロイキン２発現ベクターを作製するために、報告されているインターロイキン２配列（ＮＭ＿０００５８６．３；配列番号１）に基づいて合成したインターロイキン２をｐＥＴ－２２ｂベクター（Novagen）にクローニングした。また、前記インターロイキン２を鋳型とし、インターロイキン２のアミノ酸を改変させた新規なインターロイキン２アナログを作製した。

【0338】

インターロイキン２アナログを増幅させるためのＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間、５５℃で６０秒間、６５℃で６．５分間とし、この過程を１６サイクル行った。所望の部位のアミノ酸が正常に改変されたかを判断するために、上記条件で得られた突然変異（mutagenesis）産物に対して配列分析を行い、各インターロイキン２アナログの目的とする変異位置に、天然のものを基準として次の表１に示す変異があることが確認された。このように得られた発現ベクターをｐＥＴ２２ｂ－インターロイキン２アナログ１～１０５と命名した。

【0339】

表１に各アミノ酸の改変配列及びアナログ名を示す。これらのインターロイキン２アナログを作製するために、順方向（Ｆ）及び逆方向（Ｒ）プライマーを合成し、その後ＰＣＲを行った各アナログ遺伝子を増幅した。

【0340】

表１において、アナログ１はアルデスロイキンであり、プライマー＃１～＃２０４は本明細書の配列番号２１４～４１７にそれぞれ相当する。

【0341】

【表1】

【0342】

ｄｅｓＡ１とは、インターロイキン２の１番目のアミノ酸であるアラニンを欠失させたことを意味する。表２にインターロイキン２アナログの全長タンパク質配列を示す。表２内の太字は変異位置を示す。

【0343】

【表2】

【実施例2】

【0344】

インターロイキン２アナログの発現
実施例１で作製した発現ベクターを用いて、Ｔ７プロモーター調節下で組換えインターロイキン２アナログを発現させた。各組換えインターロイキン２アナログ発現ベクターに発現大腸菌菌株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ＤＥ３（E. coli B F^-dcm ompT hsdS(r_B ^-m_B ^-) gal λ(DE3); ノバジェン社）を形質転換した。形質転換方法は、ノバジェン社が推薦する方法を用いた。各組換え発現ベクターが形質転換された各単一コロニーを得て、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含む２×ルリア培地（Luria Broth）に接種し、３７℃で１５時間培養した。組換え菌株の培養液と３０％グリセリンとを含む２×ＬＢ培地を１：１（ｖ／ｖ）の比で混合して各１ｍＬずつｃｒｙｏチューブに分注し、－１５０℃で保管した。これを組換えタンパク質の作製のための細胞ストック（cell stock）として用いた。

【0345】

組換えインターロイキン２アナログの発現のために、各細胞ストック１バイアル（vial）を溶解して５００ｍＬの２×ＬＢに接種し、３７℃で１４～１６時間振盪培養した。６００ｎｍでの吸光度値が４．０以上になったら培養を終了し、これを種培養液として用いた。５Ｌ発酵槽（Bioflo-320, NBS, 米国）を用いて、種培養液を１．６Ｌの発酵培地に接種して初期発酵を始めた。培養条件は、温度３７℃、空気量２．０Ｌ／ｍｉｎ（１ｖｖｍ）、攪拌速度６５０ｒｐｍとし、３０％アンモニア水を用いてｐＨ６．７０に維持した。発酵は、培養液中の栄養素が枯渇したら追加培地（feeding solution）を添加することにより、流加培養を行った。菌株の成長はＯＤ値によりモニタし、吸光度値が７０以上になったら最終濃度５００μＭのＩＰＴＧを導入した。培養はＩＰＴＧ導入後約２３～２５時間まで続け、培養終了後に、遠心分離器を用いて組換え菌株を得て、使用するまで－８０℃で保管した。

【実施例3】

【0346】

インターロイキン２アナログの抽出及びリフォールディング（refolding）
実施例２で得られたインターロイキン２アナログ発現大腸菌からインターロイキン２アナログを可溶性形態に変えるために、細胞を破砕してリフォールディングした。培養液１００ｍＬの分量に相当する細胞ペレットを１～２００ｍＬの破砕緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ９．０，０．２Ｍ ＮａＣｌ，０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）に浮遊させ、その後マイクロフルイダイザー（Microfluidizer）を用いて、１５，０００ｐｓｉで組換え大腸菌を破砕した。１３，９００ｇで３０分間遠心分離して上清を捨て、４００ｍＬの最初の洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０，５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ９．０）でペレットを洗浄した。前記と同一条件で遠心分離して上清を捨て、ペレットを４００ｍＬの２番目の洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０，５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ９．０，２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）でペレットを洗浄した。前記と同一条件で遠心分離して上清を捨て、ペレットを４００ｍＬの３番目の洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０，５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ９．０，１％ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｏｒａｔｅ）でペレットを洗浄した。前記と同一条件で遠心分離して上清を捨て、ペレットを４００ｍＬの４番目の洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０，５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ９．０，１Ｍ ＮａＣｌ）でペレットを洗浄した。前記と同一条件で遠心分離することにより、洗浄した大腸菌封入体（inclusion body）ペレットを得た。洗浄した封入体ペレットを４００ｍＬの可溶／還元化緩衝液（６Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ９．０，５０ｍＭ ＤＴＴ）に再浮遊させ、５０℃で３０分間攪拌した。可溶／還元したインターロイキン２アナログに蒸留水１００ｍＬを注入して６Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅを４．８Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅに希釈し、その後１３，９００ｇで３０分間遠心分離してペレットは捨て、溶液のみ得た。希釈した溶液に蒸留水１８５．７ｍＬをさらに注入して４．８Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅを３．５Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅに希釈し、その後１００％ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄを用いてｐＨを５．０に調整した。ｐＨを調整した溶液を常温で１時間攪拌した。不純物が沈殿した溶液は、１３，９００ｇで３０分間遠心分離して上清を捨て、最後の洗浄緩衝液（３．５Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ，２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ５．０，５ｍＭ ＤＴＴ）でペレットを洗浄した。前記と同一条件で遠心分離してペレットを得た。洗浄したインターロイキン２アナログを４００ｍＬのリフォールディング緩衝液（６ｍＭ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，０．１ｍＭ ＣｕＣｌ₂）に溶解させた。混合溶液を４℃で１５～２４時間攪拌することによりリフォールディング過程を行った。

【実施例4】

【0347】

サイズ排除カラムクロマトグラフィー
実施例３で得られたインターロイキン２アナログリフォールディング溶液をサイズ排除カラムに適用して精製するために、１ｍＬ以下に濃縮した。カラムはリフォールディング溶液導入前に緩衝液（２Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０）で平衡化し、リフォールディング溶液導入後に緩衝液を流して溶出した。溶出した試料はＧｕａｎｉｄｉｎｅを含んでいるので、安定化溶液（１０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ４．５，５％Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）に変更し、その後ＲＰ－ＨＰＬＣ、ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｐｐｉｎｇ分析により純度を測定した。測定した純度が８０％以上になったら実験に用いた。

【実施例5】

【0348】

インターロイキン２アナログの受容体結合力評価
実施例４で得られたインターロイキン２アナログのインターロイキン２α受容体及びβ受容体のそれぞれに対する受容体結合力を測定するために、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance, SPR, BIACORE T200, GE healthcare）を用いた。作製したアナログのα受容体及びβ受容体に対する結合力を測定し、インターロイキン２アナログ１（aldesleukin）と各結合力を比較した。

【0349】

まず、ＣＭ５チップ（GE healthcare社）にアミンカップリング法（amine coupling）により抗ヒト免疫グロブリン抗体（Abcam社，#ab97221）を約５，０００ＲＵ（resonance unit）だけ固定化し、その後抗原抗体結合反応によりヒト免疫グロブリンＦｃ部位が結合したインターロイキン２α受容体（SYMANSIS社，#4102H）又はインターロイキン２β受容体（SYMANSIS社，#4122H）をそれぞれ免疫グロブリン抗体に結合して最終的に固定化した。次に、前述したように作製した組換えインターロイキン２アナログを濃度別に２倍連続希釈法でＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液（Cytiva社，BR100671）に希釈し、インターロイキン２受容体が最終的に固定されたＣＭ５チップに流して各インターロイキン２受容体の結合力を測定した。結合力の測定は、結合速度（Ｋａ）と解離速度（Ｋｄ）を用いて行い、１０ｕＬ／分の流速でインターロイキン２アナログを３分間流して結合速度を測定し、同一時間及び同一流速でＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液のみ流して各インターロイキン２受容体からの解離速度を測定した。測定終了後に、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムにおいて１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｉｔｔｉｎｇ ｍｏｄｅｌにより受容体の結合力評価を行った。

【0350】

【数1】

【0351】

表３は、アナログ１（aldesleukin）と比較したインターロイキン２アナログのインターロイキン２α又はβ受容体に対する相対的結合力を整理した表であり、表３における「定義不可」とは、表面プラズモン共鳴測定において当該受容体に対する結合が観測されず、その受容体に限っては当該物理量が定義されないことを意味する。

【0352】

【表3】

【0353】

試験結果（図１、図２及び表３）から分かるように、本発明のインターロイキン２アナログは、インターロイキン２α受容体結合力を完全に喪失するか、インターロイキン２アナログ１に比べて減少又は増加するなど、天然インターロイキン２又はアルデスロイキンとは異なるインターロイキン２α受容体結合力を示すことが確認された。それに対して、インターロイキン２β受容体に対しては、天然インターロイキン２又はアルデスロイキンに比べて、最大で１００倍の相対的に強い結合力が確認された。よって、インターロイキン２アナログのアミノ酸配列がインターロイキン２α又はβ受容体との結合に影響を及ぼすことが確認された。これは、特定位置のアミノ酸を置換することによりインターロイキン２受容体の結合力を変化させることができることを示唆するものである。

【0354】

このような実験結果は、本発明によるインターロイキン２アナログが変化したインターロイキン２α受容体結合力及びインターロイキン２β受容体結合力を有し、それにより様々な薬物開発に用いられることを示唆するものである。

【実施例6】

【0355】

インターロイキン２アナログとポリエチレングリコール（３．４Ｋ ＰＥＧ）リンカーの連結反応及びインターロイキン２アナログ連結体の精製
実施例４で得られたインターロイキン２アナログを免疫グロブリンＦｃ領域に結合した持続型結合体を作製するために、まず、インターロイキン２アナログをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーの一末端に連結した連結体を作製した。連結体の作製には、２１番目、４１番目、５２番目、８６番目、１０４番目及び１０５番目のインターロイキン２アナログを用い、ＰＥＧリンカーとして、分子量が３．４ｋＤａであって、両末端のヒドロキシ水素がプロピルアルデヒド基で修飾されたポリエチレングリコール（日本NOF社のALD(2)3.4K PEG)を用いて、それを前記インターロイキン２アナログのＮ末端に連結反応させた。インターロイキン２アナログ：ＰＥＧリンカーのモル比を１：１５～１：２０とし、インターロイキン２アナログの濃度を１ｍｇ／ｍＬ以下として、２～１０℃で１時間反応させた。ここで、反応は、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ５．５）下で行い、還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Sodium cyanoborohydride, SCB）を添加した。反応液は、脱塩カラムを用いて、２０ｍＭトリエチルアミン（Triethylamine）（ｐＨ８．０）緩衝液に変更し、その後トリエチルアミン（ｐＨ８．０）と塩化ナトリウムの濃度勾配を用いたＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標） ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｓ）（Merck Millipore）又はＳｏｕｒｃｅ １５Ｑ（Cytiva）カラムを用いて精製することにより、インターロイキン２アナログ－３．４Ｋ ＰＥＧ連結体を得た。

【実施例7】

【0356】

インターロイキン２アナログ－３．４Ｋ ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ領域持続型結合体の作製
インターロイキン２アナログ－３．４Ｋ ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ領域持続型結合体を作製するために、実施例６の方法で得られたインターロイキン２アナログ－３．４Ｋ ＰＥＧ連結体と免疫グロブリンＦｃ領域（配列番号４３８）のモル比を１：１０とし、総タンパク質濃度を３０ｍｇ／ｍＬとして、２～１０℃で１５～１６時間反応させた。ここで、反応液は１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０）であり、還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。

【0357】

ここで、用いた免疫グロブリン領域は、配列番号４２３のアミノ酸配列（２２１個のアミノ酸からなる）を有する２つの単量体が各単量体の３番目のアミノ酸であるシステイン間のジスルフィド結合によりホモ二量体を形成し、前記ホモ二量体の単量体は、それぞれ独立して３５番目と９５番目のシステイン間の内部のジスルフィド結合、及び１４１番目と１９９番目のシステイン間の内部のジスルフィド結合を形成するものである。

【0358】

【表4】

【0359】

反応終了後に、上記反応液から、ビストリス（Bis-Tris）（ｐＨ６．５）と塩化ナトリウムを用いてＢｕｔｙｌ ＦＦ（Cytiva）で未反応免疫グロブリンＦｃ領域を除去し、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と硫酸アンモニウムを用いてＳｏｕｒｃｅ １５ＩＳＯ（Cytiva）で精製することにより、インターロイキン２アナログのＮ末端が３．４ｋＤａのＰＥＧリンカーの一末端に連結され、３．４ｋＤａのＰＥＧリンカーの反対側の末端がＦｃ領域のＮ末端プロリンの窒素に連結されたインターロイキン２アナログ－３．４Ｋ ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ領域結合体（持続型結合体）を得た。この持続型結合体をＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＳＥ－ＨＰＬＣにより分析した。（図１及び図２）

【実施例8】

【0360】

インターロイキン２アナログ結合体のインターロイキン２受容体結合力評価
実施例７で得られたインターロイキン２アナログ持続型結合体のインターロイキン２α、β受容体のそれぞれに対する受容体結合力を測定するために、表面プラズモン共鳴（SPR, BIACORE T200, GE healthcare）を用いた。

【0361】

具体的には、ビオチンで標識したヒトインターロイキン２受容体α及びβサブユニット（ACROBiosystems）のそれぞれをストレプトアビジンバイオセンサチップ（SA chip, Cytiva社）に約１００ＲＵ及び５００ＲＵずつ固定化し、２倍連続希釈法でＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（Cytiva社，BR100669）に希釈したインターロイキン２アナログ持続型結合体又はアルデスロイキンを１分当たり２０μＬの流速で注入した。３分間の結合過程後に、同じ流速でＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液のみ３分間注入し、インターロイキン２受容体におけるインターロイキン２アナログ持続型結合体又はアルデスロイキンの解離を誘導した。ここで、得られた結合定数及び解離定数から結合力を算出した。結合力評価は、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムにおいて１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｉｔｔｉｎｇ ｍｏｄｅｌにより行った。

【0362】

評価の結果、インターロイキン２アナログ結合体は、固有のインターロイキン２受容体結合力を有することが確認され、特にインターロイキン２受容体αサブユニットに対して、各候補物質間に明らかな結合力の差異が確認された。より詳細には、評価の結果、インターロイキン２アナログ２１番結合体及び５２番結合体は、インターロイキン２受容体αサブユニットに結合せず、インターロイキンアナログ４１番結合体、８６番結合体、１０４番結合体及び１０５番結合体は、アルデスロイキンと比較してそれぞれ５０．８％、６５．２％、８１．０％及び１１２．９％の相対的結合力が確認された。インターロイキン２受容体βサブユニットに対して、インターロイキン２アナログ２１番結合体及び５２番結合体をはじめとする全てのインターロイキン２アナログ結合体において、アルデスロイキンに比べて高い結合力が確認された。

【0363】

表５に、α受容体とβ受容体に分けて作製したインターロイキン２アナログ持続型結合体における、アルデスロイキンの結合力を基準に比較した相対的結合力（％）を整理した。表５において、当該持続型結合体は、それを構成するインターロイキン２アナログの番号で表示した（例えば、インターロイキン２アナログ２１番の持続型結合体は「インターロイキン２アナログ２１番結合体」と表示した）

【0364】

【表5】

【実施例9】

【0365】

インターロイキン２アナログ持続型結合体の薬物動態学評価
実施例５及び７で確認したインターロイキン２アナログ及びそれを含む持続型結合体のインターロイキン２受容体に対する結合力に基づいて、インターロイキン２アナログと持続型結合体を用いた薬剤が優れた血中曝露量及びバイオアベイラビリティを有するか否かを確認した。

【0366】

具体的には、本発明者らは、インターロイキン２アナログ持続型結合体とアルデスロイキンの薬物動態学をＩＣＲ及びＣ５７ＢＬ／６系統正常マウスモデルにおいて比較、分析した。

【0367】

より具体的には、アルデスロイキンを投与する対照群、並びにインターロイキン２アナログ結合体（インターロイキン２アナログ２１番結合体、インターロイキン２アナログ４１番結合体、インターロイキン２アナログ５２番結合体、インターロイキン２アナログ８６番結合体、インターロイキン２アナログ１０４番結合体及びインターロイキン２アナログ１０５番結合体）を投与する実験群において、正常マウスに皮下、静脈内又は腹腔内注射した。インターロイキン２アナログ結合体を皮下注射した群においては、１、４、８、２４、４８、７２及び９６時間後に、それぞれ３匹の動物の眼窩静脈から採血し、アルデスロイキンを静脈内又は腹腔内経路に投薬した群においては、０．０８、０．２５、０．５、１、１．５、２、３、４、６、８及び２４時間後に、それぞれ３匹ずつ同様に採血した。採血した各群の血液は、遠心分離して血清を分離し、ヒトインターロイキン２抗体を用いるＥＬＩＳＡ方法により血中のインターロイキン２アナログ結合体及びアルデスロイキンを定量した。その結果、インターロイキン２アナログ結合体は、ＩＣＲ及びＣ５７ＢＬ／６系統正常マウスにおいて、アルデスロイキンに比べて高い血中曝露量を示した（図３、表６及び７）。次の表における結合体の容量、ＡＵＣ、濃度の数値は、結合体全体においてインターロイキン２アナログ部位が占める重量のみを基準として結合体量数値（ｍｇ，ｎｇ）を示したものである。

【0368】

【表6】

【0369】

【表7】

【0370】

これらの表から分かるように、本発明によるインターロイキン２アナログ結合体は、皮下経路で投与したにもかかわらず、静脈内注射又は腹腔内注射によるアルデスロイキンに比べて高い血中分布率を示す。これらの結果は、薬物投与する際に、前記インターロイキン２アナログ結合体をヒト組換えインターロイキン２より少ない量で投薬しても、より多い量が血中に曝露され、さらには、投薬の利便性まで確保できることを示唆するものである。

【実施例10】

【0371】

インターロイキン２アナログ持続型結合体の抗癌効能評価
前記インターロイキン２アナログ結合体の治療的効能を調べるために、同種移植したＣＴ２６大腸癌腫マウスモデル（CT26 colon tumor syngeneic mouse mode）にインターロイキン２アナログ２１番結合体、インターロイキン２アナログ４１番結合体及びインターロイキン２アナログ５２番結合体、並びに対照物質としてのアルデスロイキンをそれぞれ投薬し、その後腫瘍の大きさと個体死亡率を評価した。

【0372】

具体的には、細胞培養用フラスコで培養したＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ）をＢＡＬＢ／ｃマウスの脚に皮下注射し、数日後に肉眼で腫瘍が観察されたら、腫瘍の大きさが同程度になるように各群に７匹ずつ配分した。各群には、０．５ｍｇ／ｋｇのインターロイキン２アナログ２１番結合体、インターロイキン２アナログ４１番結合体及びインターロイキン２アナログ５２番結合体をそれぞれ皮下経路で１週間に１回ずつ、計２回反復投薬した。ここで、持続型結合体の投与量は、当該結合体におけるインターロイキン２アナログ部位のみの重量で示すものである。アルデスロイキン投薬群には、３．０ｍｇ／ｋｇのプロロイキン注（Novartis）を腹腔内経路で１日に１回ずつ、５日間連続投薬し、２日間の休憩後に、同一日程で５日間さらに投薬した。

【0373】

最初の投薬日から３２日間にわたって体重及び個体死亡を観察した。その結果によれば、全てのインターロイキン２アナログ結合体投薬群において優れた抗癌効能が確認された。特に、インターロイキン２アナログ４１番結合体を投薬した群においては、全ての個体で完全寛解が観察された。それに対して、アルデスロイキンを投薬した群においては、７匹のうち２匹が死亡に至り、僅か２匹でのみ完全寛解が観察された。本発明によるインターロイキン２アナログ結合体は、アミノ酸配列の変更によりヒトインターロイキン２受容体βサブユニットに強力に結合し、それにより優れた抗癌効力が現れたものであると解される（図４）。それだけでなく、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域が連結された持続型結合体の構造により、高い血中曝露が可能になり、投薬間隔が大きくなり、従来の注射療法を皮下経路に変更することにより、患者及び医療提供者に投薬利便性をもたらすことを示唆するものである。

【実施例11】

【0374】

腫瘍の反復曝露による記憶Ｔ細胞反応評価
実施例１０の抗癌効能評価に続き、腫瘍の反復曝露による記憶Ｔ細胞の反応を評価した。具体的には、前記抗癌効能評価の終了後に、完全寛解が確認された個体に対して、最初の薬物投薬から４２日目及び７０日目にそれぞれＣＴ２６細胞を最初の曝露と同様に皮下経路で投与して再曝露し、次いで腫瘍が成長するか否かを観察し、２番目の再曝露の４日後及び７日後に、マウスの脾臓における記憶Ｔ細胞の数をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（Becton Dickinson）装置で分析した。

【0375】

その結果、陰性対照群を除く全ての薬物投薬群において、再曝露による腫瘍の成長が抑制されただけでなく、脾臓における記憶Ｔ細胞の有意な増加が観察された（図５）。結論として、本発明によるインターロイキン２アナログ結合体は、単一製剤で同種移植したＣＴ２６大腸癌腫マウスモデルにおける記憶免疫反応を誘導することができ、最初の腫瘍の曝露だけでなく、腫瘍の再曝露に対しても強力な抗癌効能を維持するものである。

【実施例12】

【0376】

悪性黒色腫におけるインターロイキン２アナログ持続型結合体の抗癌効能評価
本発明によるインターロイキン２アナログ結合体の抗癌効能を評価するために、黒色腫細胞であるＢ１６Ｆ１０細胞を同種移植した悪性黒色腫マウスモデル（B16F10 melanoma tumor syngeneic mouse model）にインターロイキン２アナログ８６番結合体、及び対照物質としてのアルデスロイキンをそれぞれ投薬し、その後腫瘍の大きさと個体生存率を評価した。

【0377】

具体的には、細胞培養用フラスコで培養したＢ１６Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ）をＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿に皮下注射し、数日後に肉眼で腫瘍が観察されたら、腫瘍の大きさが同程度になるように各群に９匹ずつ配分した。持続型結合体におけるインターロイキン２アナログ部位の重量を基準として、０．０８ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇのインターロイキン２アナログ８６番結合体をそれぞれ皮下経路で１週間に１回ずつ、計４回反復投薬した。また、対照群としてのアルデスロイキン投薬群には、３．０ｍｇ／ｋｇのプロロイキン注（Novartis）を腹腔内経路で１日に１回ずつ、５日間連続投薬し、２日間の休止期を設ける方法で計４回反復投薬した。

【0378】

最初の投薬日から１５日目における各群の腫瘍の大きさ（図６のＡ）と、６０日間の各個体の生存率（図６のＢ）を観察した。その結果、本発明のインターロイキン２アナログ８６番結合体投薬群は、アルデスロイキン投薬群に比べて、腫瘍の大きさが小さくなり、個体生存率にも優れることが確認され、本発明の持続型結合体の投薬用量依存的な抗癌効能が確認された。特に、１週間に４．０ｍｇ／ｋｇ以上のインターロイキン２アナログ８６番結合体を投薬した群においては、一部の個体で腫瘍が完全に除去された完全寛解が観察された。それに対して、アルデスロイキンを３．０ｍｇ／ｋｇで５日間継続して投薬した群においては、いかなる個体にも完全寛解が見られなかった。

【0379】

これは、本発明のインターロイキン２アナログ結合体が、アルデスロイキンに比べて相対的に強力なヒトインターロイキン２受容体βサブユニットに結合するという特徴を有するように設計されることにより、優れた抗癌効力を示すことを意味するものである。それだけでなく、望ましくない副作用をもたらさない最小限のヒトインターロイキン２受容体αサブユニットに対する結合力により過度な免疫反応が効果的に制御されるので、持続型結合体におけるインターロイキン２アナログ部位の重量を基準として１０ｍｇ／ｋｇ以上の高容量投薬群においても投薬を中断するほどの副作用は観察されなかった。

【0380】

これらの実験結果は、本発明による天然インターロイキン２にアミノ酸変異を導入したインターロイキン２アナログを含む持続型結合体が変化したインターロイキン２α受容体結合力及びインターロイキン２β受容体結合力を有するので、それを活用した様々な薬物開発、特に抗癌剤開発に有用であることを示唆するものである。

【0381】

以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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【国際調査報告】