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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-19
(54)【発明の名称】Ｔ細胞リンパ腫の診断および治療方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20240312BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240312BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240312BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240312BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240312BHJP
C07K 16/30 20060101ALN20240312BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 T
A61K45/00
A61P35/02
A61K39/395 E
G01N33/53 Y
C12N15/13 ZNA
C07K16/30
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023558457
(86)(22)【出願日】2022-03-22
(85)【翻訳文提出日】2023-09-22
(86)【国際出願番号】 EP2022057408
(87)【国際公開番号】W WO2022200303
(87)【国際公開日】2022-09-29
(31)【優先権主張番号】21305356.4
(32)【優先日】2021-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21306740.8
(32)【優先日】2021-12-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＳＰＡＮ
(71)【出願人】
【識別番号】513246469
【氏名又は名称】インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル）
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＲＭ（ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬＥ）
(71)【出願人】
【識別番号】507240336
【氏名又は名称】アシスターンス・ピュブリック－オピトー・ドゥ・パリ
(71)【出願人】
【識別番号】520053762
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ・シテ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＣＩＴＥ
(71)【出願人】
【識別番号】509319214
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ－エスト・クレテイユ・ヴァル・ドゥ・マルヌ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ－ＥＳＴ ＣＲＥＴＥＩＬ ＶＡＬ ＤＥ ＭＡＲＮＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(74)【代理人】
【識別番号】100179648
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 咲江
(74)【代理人】
【識別番号】100222885
【弁理士】
【氏名又は名称】早川 康
(74)【代理人】
【識別番号】100140338
【弁理士】
【氏名又は名称】竹内 直樹
(74)【代理人】
【識別番号】100227695
【弁理士】
【氏名又は名称】有川 智章
(74)【代理人】
【識別番号】100170896
【弁理士】
【氏名又は名称】寺薗 健一
(74)【代理人】
【識別番号】100219313
【弁理士】
【氏名又は名称】米口 麻子
(74)【代理人】
【識別番号】100161610
【弁理士】
【氏名又は名称】藤野 香子
(72)【発明者】
【氏名】ベンスサン，アルマン
(72)【発明者】
【氏名】ガスチニアニ，ジェローム
(72)【発明者】
【氏名】バゴット，マルティン
(72)【発明者】
【氏名】ドゥ マッソン ドートム，アデル
(72)【発明者】
【氏名】オルトンヌ，ニコラ
(72)【発明者】
【氏名】バティステラ，マキシム
(72)【発明者】
【氏名】マリ－カーディーヌ，アンヌ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZB272
4C085AA13
4C085BB01
4C085CC02
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
Ｔ細胞リンパ腫は、Ｔリンパ球が関与する不均一な悪性腫瘍のグループであり、一般に予後不良であることを特徴とする。このうち、皮膚Ｔ細胞リンパ腫は主に皮膚に発生する。菌状息肉症およびセザリー症候群は、最も頻度の高い皮膚Ｔ細胞リンパ腫である。本発明者らは、セザリー細胞の制御性Ｔ表現型を研究し、セザリー細胞および他のＴ細胞リンパ腫細胞株によるＣＣＲ８（ＣＤ１９８）の発現を示した。すなわち、ＣＣＲ８は、Ｔ細胞リンパ腫の有用な診断、予後、追跡マーカーとして、また潜在的な治療標的となると考えられる。ＣＣＲ８を発現するがん細胞を治療的に枯渇させると、腫瘍細胞が除去され、Ｔ細胞リンパ腫における抗腫瘍免疫も活性化される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
治療を必要とする患者においてＴ細胞リンパ腫を治療する方法であって、ＣＣＲ８発現がん細胞の細胞死を誘導することができる治療有効量の薬剤を患者に投与することを含む方法。
【請求項2】
前記Ｔ細胞リンパ腫が、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫、または皮膚Ｔ細胞リンパ腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記Ｔ細胞リンパ腫が皮膚Ｔ細胞リンパ腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記Ｔ細胞リンパ腫がセザリー症候群である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記薬剤がＣＣＲ８阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記薬剤が、ＣＣＲ８に対する結合親和性を有する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記薬剤が、ＣＣＲ８の少なくとも１つの細胞外ドメインに対する抗体であり、ＣＣＲ８を発現するがん細胞の枯渇をもたらす、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
ＣＣＲ８がん細胞の枯渇に適した前記抗体が、抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記抗体が、ＣＣＲ８に対する第１の抗原結合部位およびエフェクター細胞に対する少なくとも１つの第２の抗原結合部位を含む多重特異性抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記抗体が細胞傷害性部分に接合している、請求項７に記載の方法。
【請求項11】
前記薬剤がＣＡＲ－Ｔ細胞であり、前記ＣＡＲがＣＣＲ８に特異的な細胞外抗原結合ドメインを少なくとも含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
患者から得られたサンプル中のＣＣＲ８の発現レベルを検出することを含む、患者におけるＴ細胞リンパ腫を診断する方法。
【請求項13】
血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫、または皮膚Ｔ細胞リンパ腫を診断するための、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
皮膚Ｔ細胞リンパ腫を診断するための、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
セザリー症候群を診断するための、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
ＫＩＲ３ＤＬ２、ＰＬＳ３、ＴｗｉｓｔおよびＮＫｐ４６からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるマーカーの発現レベルを検出することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医学、特に腫瘍学に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｔ細胞リンパ腫は、Ｔリンパ球が関係する悪性腫瘍の不均一なグループであり、通常は予後が悪いという特徴を持つ。これらの中でも、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）は主に皮膚に発生する。菌状息肉症およびセザリー症候群（ＳＳ）は、最もよく見られるＣＴＣＬである。循環クローン腫瘍性Ｔ細胞（セザリー細胞）は、ほとんどの場合ＣＤ１５８ｋ（ＫＩＲ３ＤＬ２）の異常な発現を示す一方で、ＣＤ４を発現し、ＣＤ７およびＣＤ２６の発現を失うことがある（文献１，２）。進行したＣＴＣＬにおいては長期奏効が見られることは珍しく、新たな治療が必要となる。近年では、抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体（モガムリズマブ）を用いる治療が、ＣＴＣＬにおける無増悪生存期間を改善している（文献３）。ＣＣＲ４はセザリー細胞だけでなく、末梢血活性化制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）でも発現し（文献４）、モガムリズマブ治療によるＣＣＲ４＋循環Ｔｒｅｇの枯渇は、自己免疫関連有害事象の発生に関連する（文献５，６）。ＣＣＲ４に加えて、セザリー細胞は、ＰＤ１（文献７）、ＣＤ３９（文献８）およびＴＩＧＩＴ（文献９）などの数種のＴｒｅｇマーカーかつ免疫チェックポイント阻害物質を発現する。セザリー細胞によるこれらのマーカーの発現を踏まえて、我々は、リンパ球の皮膚へのホーミングに関与するケモカイン受動体であるＣＣＲ８（ＣＤ１９８）の発現の研究することとした（文献１０）。
【発明の概要】
【0003】
本発明は、特許請求の範囲によって決定される。特に、本発明は、Ｔ細胞リンパ腫の診断および治療方法に関連する。
【図面の簡単な説明】
【0004】
【図1】セザリー症候群患者の新鮮末梢血腫瘍細胞におけるＣＣＲ８の発現。
【図2】Ｔ細胞リンパ腫細胞株（ＳＮＫ６、ＤＥＲＬ－２、およびＨｕＴ７８細胞株）のＣＣＲ８の発現。
【図3】ＣＣＲ８はＣＴＣＬ末梢血腫瘍細胞の細胞表面で過剰発現され、セザリー細胞の活性化と増殖に関与する。末梢血セザリー細胞、健常な対照であるＴ細胞、およびＴ細胞リンパ腫細胞株によるＣＣＲ８発現のフローサイトメトリー分析。（Ａ）末梢血セザリー細胞のゲーティングストラテジー（左パネル）および２人のセザリー患者のセザリー細胞におけるＣＣＲ８発現の平均蛍光強度（対コントロールアイソタイプ）（右パネル）。（Ｂ）セザリー患者から採取した新鮮なセザリー細胞におけるＣＣＲ８デルタ平均蛍光強度（ＣＣＲ８ｍＡｂ－コントロールアイソタイプ）と健康な対照Ｔ細胞との比較。（Ｃ）ＣＣＬ１リガンドによるＣＣＲ８の刺激は、セザリー細胞の増殖を誘導する。新鮮なＰＢＭＣをＣＦＳＥ中でインキュベートし、ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）、ＣＣＬ－１（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ－２／ＣＣＬ１中で９６時間培養し、ＫＩＲ３ＤＬ２＋セザリー生細胞のうちＣＦＳＥｌｏ細胞の割合を計算した。（Ｄ）３日間のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＤ３／２８活性化の前後の、新たに単離された健康な対照末梢血単核細胞におけるＣＣＲ８発現。
【図4】（Ａ）ＡＩＴＬ由来のＰＤＸ細胞におけるＣＣＲ８発現。ＡＩＴＬ患者由来の脾細胞を、コントロールアイソタイプまたは抗ヒトＣＤ４抗体および抗ＣＣＲ８抗体（クローンＬ２６３．Ｇ８）のいずれかと４℃で１５分間インキュベートし、その後ＰＢＳで洗浄し、ＬＳＲＸ２０フローサイトメーターで分析した。ヒストグラムは、ＣＤ４＋細胞上のＣＣＲ８発現を表す。（Ｂ）ＨＳＴＬ細胞上のＣＣＲ８発現。脾細胞を、コントロールアイソタイプまたは抗ＣＤ３、ＣＤ５、ＴＣＲγδおよび抗ＣＣＲ８抗体のいずれかで染色した。ヒストグラムは、ＣＤ３＋ＣＤ５－ＴＣＲγδ＋細胞上のＣＣＲ８の発現を表す。
【発明を実施するための形態】
【0005】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、セザリー細胞の制御性Ｔ表現型を研究し、セザリー細胞および他のＴ細胞リンパ腫細胞株によるＣＣＲ８（ＣＤ１９８）の発現を示した。ＣＣＲ８は、リンパ球の皮膚へのホーミングに関与するケモカイン受容体である（文献１０）。ＣＣＲ８は皮膚常在性記憶Ｔ細胞（ＴＲＭ）（文献１１）によって発現され、菌状息肉症の起源となる腫瘍細胞であると考えられている（文献１２）。ＣＣＲ８は免疫逃避に関与する腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞によっても強く発現されるが、末梢血Ｔｒｅｇでの発現は低かった（文献１３）。ＣＣＲ８＋Ｔｒｅｇの枯渇は、ＬＬＣ－ＯＶＡおよびＭＣ３８腫瘍マウスモデルにおいて、独立して、またはＰＤ－１阻害剤との組み合わせで、強力な抗腫瘍効果を発揮した（文献１３）。したがって、ＣＣＲ８は、Ｔ細胞リンパ腫の有用な診断、予後、追跡マーカーであり、潜在的な治療標的であると考えられる。ＣＣＲ８を発現するがん細胞を治療的に枯渇させると、腫瘍細胞が除去され、Ｔ細胞リンパ腫における抗腫瘍免疫も活性化される。
本発明者らは、セザリー細胞の制御性Ｔ表現型を研究し、セザリー細胞および他のＴ細胞リンパ腫細胞株によるＣＣＲ８（ＣＤ１９８）の発現を示した。ＣＣＲ８は、リンパ球の皮膚へのホーミングに関与するケモカイン受容体である（文献１０）。ＣＣＲ８は皮膚常在性記憶Ｔ細胞（ＴＲＭ）（文献１１）によって発現され、菌状息肉症の起源となる腫瘍細胞であると考えられている（文献１２）。ＣＣＲ８は免疫逃避に関与する腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞によっても強く発現されるが、末梢血Ｔｒｅｇでの発現は低かった（文献１３）。ＣＣＲ８＋Ｔｒｅｇの枯渇は、ＬＬＣ－ＯＶＡおよびＭＣ３８腫瘍マウスモデルにおいて、独立して、またはＰＤ－１阻害剤との組み合わせで、強力な抗腫瘍効果を発揮した（文献１３）。したがって、ＣＣＲ８は、Ｔ細胞リンパ腫の有用な診断、予後、追跡マーカーであり、潜在的な治療標的であると考えられる。ＣＣＲ８を発現するがん細胞を治療的に枯渇させると、腫瘍細胞が除去され、Ｔ細胞リンパ腫における抗腫瘍免疫も活性化される。
【0006】
主な定義：
本明細書で使用される「Ｔ細胞」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、細胞性免疫において中心的な役割を果たす免疫系の重要な構成要素を表す。Ｔ細胞は、主要組織適合性複合体の分子による提示または制限を受けながらＴＣＲ（抗原に対するＴ細胞受容体）で抗原を認識することから、従来型のリンパ球として知られる。Ｔ細胞には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞など、それぞれ異なる機能を持つ数種のサブセットが存在する。本明細書で使用される場合、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、表面にＣＤ８を発現するＴ細胞のサブセットを指す。これらはＭＨＣクラスＩに制限されており、細胞傷害性Ｔ細胞として機能する。「ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、Ｔ－キラー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、キラーＴ細胞とも呼ばれる。ＣＤ８抗原は免疫グロブリン スーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合性複合体のクラスＩ限定相互作用における結合認識要素である。本明細書で使用される場合、用語「腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、血流を離れて腫瘍内に移動した患者のＣＤ８＋Ｔ細胞のプールを指す。本明細書で使用される場合、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」（Ｔヘルパー細胞またはＴＨ細胞とも呼ばれる）という用語は、その表面にＣＤ４糖タンパク質を発現し、形質細胞およびメモリーＢ細胞へのＢ細胞の成熟、並びにＴ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて、他の白血球を助けるＴ細胞を指す。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現するＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されると活性化される。一旦活性化されると、それらは急速に分裂し、活発な免疫応答を調節または支援するサイトカインを分泌する。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、ＴＦＨ、またはＴｒｅｇを含むいくつかのサブタイプのうちの１つに分化することができ、これらは異なる種類の免疫応答を促進するために、異なるサイトカインを分泌する。ＡＰＣからのシグナルは、Ｔ細胞を特定のサブタイプに導く。ＣＤ４に加えて、当技術分野で知られているＴＨ細胞表面バイオマーカーには、ＣＸＣＲ３（Ｔｈ１）、ＣＣＲ４、Ｃｒｔｈ２（Ｔｈ２）、ＣＣＲ６（Ｔｈ１７）、ＣＸＣＲ５（Ｔｆｈ）、およびサイトカインが含まれると共に、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＥＯＭＥＳ、ＲＯＲγＴ、ＢＣＬ６およびＦｏｘＰ３を含むサイトカイン並びに転写因子のサブタイプ特異的発現が含まれる。本明細書で使用される場合、「ガンマ－デルタＴ細胞」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有する。ガンマ－デルタＴ細胞は、通常、健康な個体（ヒト、サル）の末梢血リンパ球の１～５％を占める。 それらは防御免疫応答の開始に関与しており、抗原提示細胞のＭＨＣ分子による提示なしに、抗原との直接相互作用によって抗原性リガンドを認識することが示されている。ガンマ９デルタ２Ｔ細胞（ガンマ２デルタ２Ｔ細胞とも呼ばれる）は、可変ドメインＶγ９およびＶδ２を持つＴＣＲ受容体を有するガンマ－デルタＴ細胞である。これらは、人間の血液中のガンマ－デルタＴ細胞の大部分を形成する。ガンマデルタＴ細胞は、活性化されると、ＭＨＣに制限されない強力な細胞傷害活性を発揮し、さまざまな種類の細胞、特に病原性細胞を殺すのに効果的である。これらは、ウイルス（Poccia et al., J. Leukocyte Biology, 1997, 62: 1-5）またはマイコバクテリアなどの他の細胞内寄生物（Constant et al., Infection and Immunity, December 1995, vol. 63, no. 12: 4628-4633）または原生動物 (Behr et al., Infection and Immunity, 1996, vol. 64, no. 8: 2892-2896) に感染した細胞であることがある。また、それらはがん細胞であることもある（Poccia et al., J. Immunol., 159: 6009-6015; Fournie and Bonneville, Res. Immunol., 66th Forum in Immunology, 147: 338-347）。従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの上述の細胞の活性を調節する可能性は、感染症（特にウイルスまたは寄生虫）、がん、アレルギー、さらには自己免疫疾患および／または炎症性疾患などの様々な病状の治療において、新しく効果的な治療アプローチを提供するであろう。
本明細書で使用される「Ｔ細胞」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、細胞性免疫において中心的な役割を果たす免疫系の重要な構成要素を表す。Ｔ細胞は、主要組織適合性複合体の分子による提示または制限を受けながらＴＣＲ（抗原に対するＴ細胞受容体）で抗原を認識することから、従来型のリンパ球として知られる。Ｔ細胞には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞など、それぞれ異なる機能を持つ数種のサブセットが存在する。本明細書で使用される場合、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、表面にＣＤ８を発現するＴ細胞のサブセットを指す。これらはＭＨＣクラスＩに制限されており、細胞傷害性Ｔ細胞として機能する。「ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、Ｔ－キラー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、キラーＴ細胞とも呼ばれる。ＣＤ８抗原は免疫グロブリン スーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合性複合体のクラスＩ限定相互作用における結合認識要素である。本明細書で使用される場合、用語「腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、血流を離れて腫瘍内に移動した患者のＣＤ８＋Ｔ細胞のプールを指す。本明細書で使用される場合、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」（Ｔヘルパー細胞またはＴＨ細胞とも呼ばれる）という用語は、その表面にＣＤ４糖タンパク質を発現し、形質細胞およびメモリーＢ細胞へのＢ細胞の成熟、並びにＴ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて、他の白血球を助けるＴ細胞を指す。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現するＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されると活性化される。一旦活性化されると、それらは急速に分裂し、活発な免疫応答を調節または支援するサイトカインを分泌する。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、ＴＦＨ、またはＴｒｅｇを含むいくつかのサブタイプのうちの１つに分化することができ、これらは異なる種類の免疫応答を促進するために、異なるサイトカインを分泌する。ＡＰＣからのシグナルは、Ｔ細胞を特定のサブタイプに導く。ＣＤ４に加えて、当技術分野で知られているＴＨ細胞表面バイオマーカーには、ＣＸＣＲ３（Ｔｈ１）、ＣＣＲ４、Ｃｒｔｈ２（Ｔｈ２）、ＣＣＲ６（Ｔｈ１７）、ＣＸＣＲ５（Ｔｆｈ）、およびサイトカインが含まれると共に、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＥＯＭＥＳ、ＲＯＲγＴ、ＢＣＬ６およびＦｏｘＰ３を含むサイトカイン並びに転写因子のサブタイプ特異的発現が含まれる。本明細書で使用される場合、「ガンマ－デルタＴ細胞」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有する。ガンマ－デルタＴ細胞は、通常、健康な個体（ヒト、サル）の末梢血リンパ球の１～５％を占める。 それらは防御免疫応答の開始に関与しており、抗原提示細胞のＭＨＣ分子による提示なしに、抗原との直接相互作用によって抗原性リガンドを認識することが示されている。ガンマ９デルタ２Ｔ細胞（ガンマ２デルタ２Ｔ細胞とも呼ばれる）は、可変ドメインＶγ９およびＶδ２を持つＴＣＲ受容体を有するガンマ－デルタＴ細胞である。これらは、人間の血液中のガンマ－デルタＴ細胞の大部分を形成する。ガンマデルタＴ細胞は、活性化されると、ＭＨＣに制限されない強力な細胞傷害活性を発揮し、さまざまな種類の細胞、特に病原性細胞を殺すのに効果的である。これらは、ウイルス（Poccia et al., J. Leukocyte Biology, 1997, 62: 1-5）またはマイコバクテリアなどの他の細胞内寄生物（Constant et al., Infection and Immunity, December 1995, vol. 63, no. 12: 4628-4633）または原生動物 (Behr et al., Infection and Immunity, 1996, vol. 64, no. 8: 2892-2896) に感染した細胞であることがある。また、それらはがん細胞であることもある（Poccia et al., J. Immunol., 159: 6009-6015; Fournie and Bonneville, Res. Immunol., 66th Forum in Immunology, 147: 338-347）。従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの上述の細胞の活性を調節する可能性は、感染症（特にウイルスまたは寄生虫）、がん、アレルギー、さらには自己免疫疾患および／または炎症性疾患などの様々な病状の治療において、新しく効果的な治療アプローチを提供するであろう。
【0007】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞リンパ腫」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｔ細胞に影響を与えるがん性リンパ腫の稀な形態を指す。リンパ腫は主にＴ細胞の制御されない増殖によって発生し、がん化することがある。Ｔ細胞リンパ腫は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に分類され、このカテゴリー内のすべての非ホジキン病の１５％未満に相当する。Ｔ細胞リンパ腫は、多くの場合、その増殖パターンに基づいて、悪性（成長が早い）または低悪性（成長が遅い）のいずれかに分類される。特に、Ｔ細胞リンパ腫には、末梢Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）、および皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）が含まれる。
【0008】
本明細書で使用される場合、「皮膚Ｔ細胞リンパ腫」または「ＣＴＣＬ」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、皮膚ホーミング成熟Ｔ細胞に由来する非ホジキンリンパ腫の稀かつ不均一なグループを指す。菌状息肉症（ＭＦ）およびセザリー症候群（ＳＳ）は、原発性ＣＴＣＬの最も一般的なサブタイプであり、発生率は4.1／1,000,000人‐年で、主に男性で発生する。
【0009】
本明細書で使用される場合、「セザリー症候群」または「ＳＳ」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、紅皮症、リンパ節腫脹および循環異型リンパ球（セザリー細胞）の３つを特徴とする悪性の皮膚Ｔ細胞リンパ腫を指す。ＳＳは男性で最も頻繁に発症し、高齢者でより頻繁に発生し、急速に進行する。ＳＳは、Ｔ細胞皮膚リンパ腫（この用語を参照）のＩＶＡ２期およびＩＶＢ期に相当する。患者は鱗屑性紅皮症と浸潤を呈し、しばしばレオニン様顔貌と重度のそう痒症を呈する。脱毛症、外反症、軽度の掌蹠角皮症および爪ジストロフィーが存在する場合もある。リンパ節腫大および肝脾腫が観察される。 患者はしばしば震え、悪寒や全身倦怠感を訴える。
【0010】
本明細書で使用する場合、「ＣＣＲ８」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、Ｃ－Ｃケモカイン受容体８型を指す。この用語は、ＣＤ１９８、ＣＫＲＬ１、ＣＭＫＢＲ８、またはＣＭＫＢＲＬ２とも呼ばれる。ＣＣＲ８の例示的なアミノ酸配列は、配列番号１として示される。この受容体は、配列番号１の次の位置１～３５、９４～１０７、１７２～２０２、および２６４～２８０によって定義されるいくつかの細胞外ドメインを特徴とする。
【0011】
【表1】
【0012】
本明細書で使用される場合、「ＣＣＲ８阻害剤」という用語は、ＣＣＲ８の生物学的活性または発現を部分的または完全に遮断、阻害、または中和する分子を指す。ＣＣＲ８阻害剤は、例えば、ＣＣＲ８をコードする核酸の転写もしくは翻訳を低下させることによって、またはＣＣＲ８ポリペプチド活性を阻害もしくは遮断することによって、あるいはその両方によって、細胞内のＣＣＲ８に関連するシグナル伝達を干渉する任意のタイプの分子であり得る。ＣＣＲ８阻害剤の例は、ＣＣＲ８阻害剤とＣＣＲ８との間の相互作用により、ＣＣＲ８の活性または発現が低下または停止するものであれば、アンチセンスポリヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡキメラ、ＣＣＲ８特異的アプタマー、抗ＣＣＲ８抗体、抗ＣＣＲ８抗体のＣＣＲ８結合断片、ＣＣＲ８結合低分子化合物、ＣＣＲ８結合ペプチド、およびＣＣＲ８に特異的に結合する他のポリペプチド（１または複数の他のドメインと融合していてもよい、１つまたは複数のＣＣＲ８リガンドのＣＣＲ８結合断片を含むが、これに限定されない。）を含むがこれらに限定されない。
【0013】
したがって、本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために使用され、この用語には、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などの抗原結合ドメイン、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、ＴａｎｄＡｂｓダイマー、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、Ｆｄ、直鎖状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメント、バイボディ、トリボディ（それぞれｓｃＦｖ－Ｆａｂ融合体、二重特異性または三重特異性である）；ｓｃ－ダイアボディ；カッパ（ラムダ）体（ｓｃＦｖ－ＣＬ融合体）；ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞誘導体、Ｔ細胞を誘引するｓｃＦｖ－ｓｃＦｖタンデム）；ＤＶＤ－Ｉｇ（二重可変領域抗体、二重特異性型）；ＳＩＰ（低分子免疫タンパク質、ミニボディの一種）；ＳＭＩＰ（スモールモジュラー免疫医薬品）ｓｃＦｖ－Ｆｃ二量体；ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化ダイアボディ「Dual Affinity ReTargeting」）；１つまたは複数のＣＤＲなどを含む小型抗体代替物を含む、抗体フラグメントが含まれる。さまざまな抗体を基とする構築物およびフラグメントを調製および使用するための技術は、よく知られている（Kabat et al., 1991を参照。これは特に参照により本明細書に組み入れられる。）。特にダイアボディはEP404097およびWO93/11161にさらに記載されており、線状抗体はさらにZapata et al. (1995)に記載されている。抗体は従来の技術を使用して断片化できる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は抗体をペプシンで処理することによって生成できる。得られたＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を切断することで、Ｆ（ａｂ’）断片を得ることができる。パパイン消化によりＦａｂフラグメントを形成することができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂｓ、ＴａｎｄＡｂｓ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメントおよび他のフラグメントも、組換え技術によって合成することもできるし、化学的に合成することもできる。抗体フラグメントを生成する技術は当技術分野で周知であり、説明されている。たとえば、Beckman et al., 2006；Holliger & Hudson, 2005； Le Gall et al., 2004; Reff & Heard, 2001; Reiter et al., 1996；および Young et al., 1995はそれぞれ、有効な抗体フラグメントの生成について記載し、それを可能とする。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は単鎖抗体である。本明細書で使用される「単一ドメイン抗体」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、天然に軽鎖を欠いている、ラクダ科哺乳動物に見出され得るタイプの抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このような単一ドメイン抗体も「ナノボディ（登録商標）」である。（単一）ドメイン抗体の一般的な説明については、上で引用した従来技術、およびEP0368684、Ward et al.(Nature 1989 Oct 12；341(6242):544-6)、Holt et al., Trends Biotechnol., 2003,21(11):484-490；およびWO06/030220、WO06/003388も参照されたい。天然の抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合によって互いに結合されており、各重鎖がジスルフィド結合によって軽鎖に結合されている。軽鎖にはラムダ（１）とカッパ（ｋ）の２種類がある。抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥがある。各鎖には異なる配列ドメインが含まれる。 軽鎖には、可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）の２つのドメインが含まれる。重鎖には、可変ドメイン（ＶＨ）と３つの定常ドメイン（ＣＨＩ、ＣＨ２、およびＣＨ３、総称してＣＨ）の４つのドメインが含まれる。軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域によって、抗原に対する結合認識と特異性が決まる。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物学的特性を与える。Ｆｖフラグメントは免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１つの軽鎖と１つの重鎖の可変部分で構成される。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基の間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基で構成されている。場合によっては、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が抗体結合部位に関与したり、ドメイン全体の構造、ひいては結合部位に影響を与えたりすることがある。相補性決定領域またはＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を共に定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、およびＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲを持つ。したがって、抗原結合部位には、典型的には、重鎖および軽鎖のＶ領域のそれぞれからのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲが含まれる。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に挟まれたアミノ酸配列を指す。抗体可変ドメインの残基は、Kabatらが考案したシステムに従って慣習的に番号付けされる。このシステムは、Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA（以下「Ｋａｂａｔら」）に記載されている。このシステムは、本明細書で使用される。Ｋａｂａｔ残基指定は、配列番号における配列内のアミノ酸残基の直線的な番号付けと常に直接対応するとは限らない。実際の直鎖アミノ酸配列は、基本可変ドメイン構造の構成成分（フレームワークまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）のどちらでもよい）の短縮または構造成分への挿入に対応する厳密なＫａｂａｔ番号付けよりも少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含む場合がある。残基の正確なＫａｂａｔ番号付けは、所定の抗体について、その抗体の配列における相同性の残基と「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付けされた配列とのアラインメントによって決定され得る。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、残基３１～３５Ｂ（Ｈ－ＣＤＲ１）、残基５０～６５（Ｈ－ＣＤＲ２）、および残基９５～１０２（Ｈ－ＣＤＲ３）に位置する。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、残基２４～３４（Ｌ－ＣＤＲ１）、残基５０～５６（Ｌ－ＣＤＲ２）、および残基８９～９７（Ｌ－ＣＤＲ３）に位置する。
【0014】
本明細書で使用される「結合」という用語は、抗体が表面分子に対して親和性を有することを示す。本明細書で使用される「親和性」という用語は、エピトープに対する抗体の結合の強さを意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］ｘ［Ａｇ］／［Ａｂ－Ａｇ］として定義される解離定数Ｋｄによって与えられ、［Ａｂ－Ａｇ］は抗体－抗原複合体のモル濃度、［Ａｂ］は非結合抗体のモル濃度、［Ａｇ］は非結合抗原のモル濃度である。アフィニティ定数Ｋａは１／Ｋｄで定義される。ｍＡｂの親和性を決定するための好ましい方法は、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)、 Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. およびWiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)、並びに Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)に開示され、これらの参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知の１つの好ましい標準的な方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ機器の使用である。
【0015】
本明細書で使用される場合、「完全ヒト型」という用語は、分子全体がヒト起源であるか、またはヒト型の抗体または免疫グロブリンと同一のアミノ酸配列からなる、抗体または抗体フラグメントなどの免疫グロブリンを指す。
【0016】
本明細書において使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、非ヒト抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインと、ヒト抗体のＣＨドメインおよびＣＬドメインとを含む抗体を指す。いくつかの実施形態では、「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域（すなわち、重鎖および／または軽鎖）またはその一部が改変、置換、または交換されていることで、抗原結合部位（可変領域）が、異なる若しくは変化したクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、またはキメラ抗体に新しい特性を与える全く異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物など）に連結する抗体分子；または、（ｂ）可変領域またはその一部が、異なる若しくは改変された抗原特異性を有する可変領域に改変、置換または交換された抗体を指す。キメラ抗体には、霊長類化抗体、特にヒト化抗体も含まれる。さらに、キメラ抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良するために行われる。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。(U.S. Pat. No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)を参照のこと）。
【0017】
本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体の可変領域フレームワークおよび定常領域を有するが、元の非ヒト抗体のＣＤＲを保持している抗体を指す。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む。ほとんどの場合、ヒト化抗体およびその抗体フラグメントは、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、結合能を有するマウス、ラット、ウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体または抗体フラグメント）であり得る。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも、インポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含むことができる。このような抗体は、結合領域の由来元である非ヒト抗体の結合特異性を維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するように設計される。これらの修飾により、抗体または抗体フラグメントの性能をさらに改良し、最適化できる。一般に、ヒト化抗体またはその抗体フラグメントは、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、その中で、全てのまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全てのまたは重要な部分は、ヒト免疫グロブリン配列である。ヒト化抗体または抗体フラグメントはまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含んでもよい。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照されたい。
【0018】
本明細書で使用する「二重特異性抗体」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、２つの異なる重鎖および軽鎖の対、および２つの異なる抗原結合部位を有する人工ハイブリッド抗体を指す。
【0019】
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに連結された抗体（例えば、ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインを含む人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドを指す。
【0020】
ＣＡＲの特徴には、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、ＭＨＣに制限されない方法で、選択された標的に対するＴ細胞の特異性と反応性をリダイレクトする能力が含まれる。さらに、Ｔ細胞内で発現される場合、ＣＡＲは、有利なことに、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖およびβ鎖と二量体化しない。本発明のキメラ抗原受容体は、典型的には、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。
【0021】
本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ－Ｔ細胞」という用語は、ＣＡＲを発現するように遺伝子操作されたＴリンパ球を指す。ＣＡＲ－Ｔ細胞の定義には、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、さらにエフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞などを含むＴリンパ球のすべてのクラスおよびサブクラスが含まれる。遺伝子組み換えされたＴリンパ球は、遺伝子組み換えＴ細胞を使用する治療を受ける患者から「由来」または患者から「取得」され得るか、または別の患者から「由来」または「取得」され得る。
【0022】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」という用語は、病気にかかっているか、または病気や病状に苦しんでいると診断された人だけでなく、疾患に罹患するリスクがあるか、または疾患に罹患している疑いのある患者の治療を含む、防御的若しくは予防的治療、さらには治癒的または疾患を修飾する治療の両方を指し、臨床的再発の抑制も含む。治療は、障害または再発性障害の１つ以上の症状を予防、治癒、発症の遅延、重症度の軽減、若しくは改善するために、またはそのような治療がない場合に予想される以上に患者の生存を延長するために、医学的障害を有するか、または最終的にその障害を獲得する可能性がある患者に施されてもよい。「治療レジメン」とは、病気の治療パターン、例えば、治療中に使用される投薬パターンを意味する。治療計画には、導入計画および維持計画が含まれ得る。「導入レジメン」または「導入期間」という語句は、疾患の初期治療に使用される治療レジメン（または治療レジメンの一部）を指す。導入計画の一般的な目標は、治療計画の初期期間に患者に高レベルの薬剤を提供することである。導入レジメンでは、部分的または全体的に「負荷レジメン」が採用される場合があり、これには、医師が維持レジメン中に採用するよりも多量の薬剤を投与すること、医師が維持レジメン中に投与するよりも頻繁に薬剤を投与すること、またはその両方が含まれ得る。「維持レジメン」または「維持期間」という語句は、病気の治療中に患者を維持するため、例えば患者を長期間（数か月または数年）寛解状態に保つために、使用される治療レジメン（または治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンは、持続的療法（一定の間隔（例えば毎週、毎月、毎年など）で、例えば薬物を投与すること）または断続的療法（例えば、中断された治療、断続的な治療、再発時の治療、または特定の所定の基準での目標達成時の治療（例えば疾患の症状など））を採用し得る。
【0023】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、必要な用量および期間で所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。活性薬剤の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、体重、個体において所望の反応を誘発する活性薬剤の能力などの要因に応じて変わり得る。治療有効量はまた、治療上有益な効果が薬物のあらゆる毒性または有害な効果を上回る量である。活性薬剤の効率的な用量および投薬計画は、治療される疾患または状態に依存し、当業者によって決定され得る。当業者であれば、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師は、医薬組成物に使用される活性剤の用量を、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増やすことができる。一般に、本発明の組成物の適切な用量は、特定の投与計画に従って治療効果を生み出すのに有効な最低用量である化合物の量である。このような有効量は、一般に、上記の要因に依存する。例えば、治療目的での治療有効量は、疾患の進行を安定化させるその能力によって測定され得る。典型的には、がんを阻害する化合物の能力は、例えば、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系で評価され得る。治療有効量の治療化合物は、腫瘍サイズを減少させるか、あるいは患者の症状を改善することができる。当業者であれば、患者の体格、患者の症状の重症度、および選択された特定の組成物または投与経路などの要因に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。本発明の阻害剤の治療有効量の例示的で非限定的な範囲は、約0.1～100mg/kg、例えば約0.1～50mg/kg、例えば約0.1～20mg/kg、約0.1～10mg/kg、例えば約0.5、例えば約0.3、約1、約3mg/kg、約5mg/kgまたは約8mg/kgである。本発明の阻害剤の治療有効量の例示的で非限定的な範囲は、0.02～100mg/kg、例えば約0.02～30mg/kg、例えば約0.05～10mg/kgまたは0.1～3mg/kg、例えば約0.5～2mg/kgである。投与は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下で行われ、例えば標的部位の近位に対して行われる。上記の治療方法および使用における投与計画は、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するように調整される。例えば、治療状況の緊急性に応じて、単回急速静注により投与されてもよいし時間をかけて数回に分けて投与してもよいし、用量を比例的に減少または増加させてもよい。いくつかの実施形態では、治療の有効性は、例えば事前に決定されたタイミングで、治療中に監視される。いくつかの実施形態では、有効性は、疾患領域の視覚化によって、または本明細書でさらに説明される他の診断方法、例えば、本発明の標識された阻害剤、本発明の阻害剤に由来するフラグメントまたはミニ抗体を使用して、１回または複数回のＰＥＴ－ＣＴスキャンを実施することによって監視される。必要に応じて、１日の有効量に当たる医薬組成物は、場合により単位剤形で、１日を通して適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６またはそれ以上の分割用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、望ましくない副作用を最小限に抑えるために、２４時間以上などの長期間にわたるゆっくりとした連続注入によって投与される。本発明の阻害剤の有効量は、毎週、隔週、または三週ごとの投与期間を使用して投与することもできる。投与期間は、例えば、8週間、12週間、または臨床的進行が確立されるまでに限定され得る。本発明を制限しない例示として、本発明による治療は、約0.1～100mg/kg、より具体的には0.2、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90または100mg/kgを本発明の阻害剤の毎日の投与量として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40日の少なくともいずれか、または治療開始後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20週間の少なくともいずれかの期間、またはそれらの任意の組み合わせで、24、12、8、6、4もしくは2時間ごとの単回または分割用量またはそれらの任意の組み合わせで、使用され得る。
【0024】
治療方法：
以上のとおり、本発明の第１の目的は、ＣＣＲ８発現がん細胞の細胞死を誘導することができる治療有効量の薬剤を患者に投与することを含む、それを必要とする患者におけるＴ細胞リンパ腫の治療方法に関する。
以上のとおり、本発明の第１の目的は、ＣＣＲ８発現がん細胞の細胞死を誘導することができる治療有効量の薬剤を患者に投与することを含む、それを必要とする患者におけるＴ細胞リンパ腫の治療方法に関する。
【0025】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞リンパ腫は、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫、または皮膚Ｔ細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞リンパ腫は皮膚Ｔ細胞リンパ腫である。より具体的には、Ｔ細胞リンパ腫はセザリー症候群である。
【0026】
いくつかの実施形態では、患者はヒトの乳児である。いくつかの実施形態では、患者は人間の子供である。いくつかの実施形態では、患者は成人である。いくつかの実施形態では、患者は高齢者である。いくつかの実施形態では、患者はヒトの未熟児である。
【0027】
いくつかの実施形態では、ＣＣＲ８を発現するがん細胞の細胞死を誘導することができる薬剤は、ＣＣＲ８阻害剤である。
【0028】
ＣＣＲ８阻害剤は当技術分野でよく知られている。例として、ＣＣＲ８阻害剤は、AZ084 (Cas No. 929300-19-6)、ML604086 (Cas No. 850330-18-6)、R243 (Cas No. 688352-84-3)、LMD-A (Cas No. 850330-77-7)、MC148、CDBP0728、またはCDBP5280であってもよい。ＣＣＲ８阻害剤はWO/2004/058736などの特許文献にも記載されている。
【0029】
ＣＣＲ８抗体：
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＣＲ８に対する結合親和性を有する抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＣＲ８の少なくとも１つの細胞外ドメインに結合する抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＣＣＲ８中和抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＣＬ１、ＣＣＬ８、またはＣＣＬ１８を介したＣＣＲ８の活性化を阻害する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＣＲ８発現がん細胞の枯渇をもたらす。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＣＲ８に対する結合親和性を有する抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＣＲ８の少なくとも１つの細胞外ドメインに結合する抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＣＣＲ８中和抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＣＬ１、ＣＣＬ８、またはＣＣＬ１８を介したＣＣＲ８の活性化を阻害する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＣＲ８発現がん細胞の枯渇をもたらす。
【0030】
いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体またはキメラ抗体である。
【0031】
完全ヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックのマウスを免疫することによっても、調製可能である。例えば、米国特許第5,591,669号、第5,598,369号、第5,545,806号、第5,545,807号、第6,150,584号、およびそこで引用された参考文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0032】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－６９４０を有するハイブリドーマから得ることができる。
【0033】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－６９３８を有するハイブリドーマから入手可能である。
【0034】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－６９３９を有するハイブリドーマから得ることができる。
【0035】
いくつかの実施形態では、抗体は、Lu S, Hu S, Gan X, et al “711 HBM1022, a novel anti-CCR8 antibody depletes tumor-infiltrating regulatory T cells via enhanced ADCC activity, mediates potent anti-tumor activity with Keytruda.” Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2020; 8: doi: 10.1136/jitc-2020-SITC2020.0711に記載されるHBM1022抗体である。
【0036】
いくつかの実施形態では、抗体は、Rankin A, Naik E, “861Development of FPA157, an anti-CCR8 depleting antibody engineered to preferentially eliminate tumor-infiltrating T regulatory cells.” Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2020;8:doi: 10.1136/jitc-2020-SITC2020.0861に記載されるFPA157抗体である。
【0037】
いくつかの実施形態では、抗体は、Lake A, Warren M, Das S, et al “726 SRF114 is a fully human, CCR8 selective IgG1 antibody that induces destruction of tumor Tregs through ADCC.” Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2020;8:doi: 10.1136/jitc-2020-SITC2020.0726に記載されるSRF114抗体である。
【0038】
いくつかの実施形態では、抗体は、Lan, Ruth, et al. “Highly selective anti-CCR8 antibody-mediated depletion of regulatory T cells leads to potent antitumor activity alone and in combination with anti-PD-1 in preclinical models.” (2020): 6694-6694 および Bayati F, Mohammadi M, Valadi M, Jamshidi S, Foma AM, Sharif-Paghaleh E “The Therapeutic Potential of Regulatory T Cells: Challenges and Opportunities.” Front Immunol. 2021;11:585819. Published 2021 Jan 15. doi:10.3389/fimmu.2020.585819に記載されるCCR8 hIgG1-nonfucosylated BMS-986340抗体である。
【0039】
いくつかの実施形態では、抗体は、Van Damme H, Dombrecht B, Kiss M, Roose H, Allen E, Van Overmeire E, Kancheva D, Martens L, Murgaski A, Bardet PMR, Blancke G, Jans M, Bolli E, Martins MS, Elkrim Y, Dooley J, Boon L, Schwarze JK, Tacke F, Movahedi K, Vandamme N, Neyns B, Ocak S, Scheyltjens I, Vereecke L, Nana FA, Merchiers P, Laoui D, Van Ginderachter JA. “Therapeutic depletion of CCR8+ tumor-infiltrating regulatory T cells elicits antitumor immunity and synergizes with anti-PD-1 therapy” J Immunother Cancer. 2021 Feb;9(2):e001749. doi: 10.1136/jitc-2020-001749. PMID: 33589525; PMCID: PMC7887378に記載されるナノボディである。
【0040】
いくつかの実施形態では、抗体は、Depis, Fabien, et al. “Preclinical evaluation of JTX-1811, an anti-CCR8 antibody with enhanced ADCC activity, for preferential depletion of tumor-infiltrating regulatory T cells.” (2020): 4532-4532に開示されるJTX-1811である。
【0041】
ＣＣＲ８枯渇抗体：
いくつかの実施形態では、ＣＣＲ８がん細胞の枯渇に適した抗体は、抗体依存性細胞傷害性を媒介する。
いくつかの実施形態では、ＣＣＲ８がん細胞の枯渇に適した抗体は、抗体依存性細胞傷害性を媒介する。
【0042】
本明細書で使用される「抗体依存性細胞傷害性」または「ADCC」という用語は、非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（NK）細胞、好中球、およびマクロファージ）が結合した抗体を認識する細胞媒介反応を指す。標的細胞に作用し、その後標的細胞の溶解を引き起こす。いかなる特定の作用機序にも限定されることを望まないが、ADCCを媒介するこれらの細胞傷害性細胞は、一般にFc受容体（ＦｃＲ）を発現する。
【0043】
本明細書で使用される場合、用語「Ｆｃ領域」には、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドが含まれる。たがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにこれらのドメインの柔軟なヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変動する可能性があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、残基Ｃ２２６またはＰ２３０からそのカルボキシル末端までを含むと定義され、番号付けはKabat（1991、NIH Publication 91-3242、National Technical Information Service、バージニア州スプリングフィールド）に記載のＥＵインデックスに従う。「Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックス」とは、上記Ｋａｂａｔらに記載されているヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。Ｆｃは、この領域を単独で指す場合もあれば、抗体、抗体フラグメント、またはＦｃ融合タンパク質との関連でこの領域を指す場合もある。Ｆｃ変異体タンパク質は、抗体、Ｆｃ融合体、またはＦｃ領域を含む任意のタンパク質もしくはタンパク質ドメインであり得る。特に好ましいのは、Ｆｃ領域の非天然変異体である変異Ｆｃ領域を含むタンパク質である。非天然Ｆｃ領域（本明細書では「変異Ｆｃ領域」とも呼ばれる）のアミノ酸配列は、野生型アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入、および／または欠失を含む。挿入または置換の結果として変異Ｆｃ領域の配列に現れる任意の新しいアミノ酸残基は、非天然アミノ酸残基と呼ばれる場合がある。注：多型は、Ｋａｂａｔ ２７０、２７２、３１２、３１５、３５６、および３５８を含むがこれらに限定されない多くのＦｃ位置で見られ、したがって、提示される配列と先行技術の配列との間にはわずかな違いが存在する可能性がある。
【0044】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するために使用される。ＡＤＣＣを媒介する主要細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよび／またはＦｃγＲＩＶを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 （1991）にまとめられている。分子のＡＤＣＣ活性を評価するには、米国特許第5,500,362号または第5,821,337号に記載されているようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイが実行されてもよい。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998) で開示されるような、動物モデルのｉｎ ｖｉｖｏで評価されてもよい。
【0045】
本明細書で使用される場合、「エフェクター細胞」という用語は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。これらの細胞は少なくともＦｃγＲＩ、ＦＣγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよび／またはＦｃγＲＩＶを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が含まれる。
【0046】
いくつかの実施形態では、がん細胞の枯渇に適した抗体は完全長抗体である。いくつかの実施形態では、全長抗体はＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、全長抗体はＩｇＧ３抗体である。
【0047】
いくつかの実施形態では、がん細胞の枯渇に適した抗体は、ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＶに対して増加した親和性を有する変異Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を含む変異Ｆｃ領域を含み、前記少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入または欠失により、ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が増加する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入または欠失を含む変異Ｆｃ領域を含み、前記少なくとも１つのアミノ酸残基は残基239、330、および332からなる群より選択され、これらのアミノ酸残基はＥＵインデックスに従って番号が付けられる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異Ｆｃ領域を含み、前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、および１３３２Ｅからなる群から選択され、これらのアミノ酸置換はＥＵインデックスに従って番号が付けられる。
【0048】
いくつかの実施形態では、がん細胞の枯渇に適した抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体は作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を高めるように変更されてもよい。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を変更することによって達成することができる。例えば、１以上のアミノ酸置換がなされてもよく、それによって１またはそれ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位が除去され、その部位でのグリコシル化が除去され得る。このような非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が高まることがある。このようなアプローチは、Coらによる米国特許第5,714,350号および第6,350,861号にさらに詳細に記載されている。さらに、または代わりに、フコシル残基の量が減少したかまたは全くない低フコシル化抗体または非フコシル化抗体、または増大した二分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体などの、変化したタイプのグリコシル化を有する抗体を作製することができる。このような変化したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば、変化したグリコシル化機構を持つ宿主細胞内で抗体を発現させることによって達成することができる。グリコシル化機構が変化した細胞は当該技術分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現する宿主細胞として使用して、それによってグリコシル化が変化した抗体を産生することができる。例えば、HangらによるEP1176195は、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株について記載し、そのような細胞株で発現される抗体が低フコシル化を示すか、またはフコシル残基を欠くことを記載している。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、低フコシル化パターンまたは非フコシル化パターンを示す細胞株、例えば、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子の発現が欠損している哺乳動物細胞株における組換え発現によって産生され得る。Prestaによる国際公開WO 03/035835には、Ａｓｎ（２９７）結合炭水化物にフコースを結合させる能力が低下し、その宿主細胞内で発現される抗体の低フコシル化も生じる、変異型ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞が記載されている（Shields, R.L. et al, 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740）。Umanaらによる国際公開WO 99/54342には、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えばベータ（１，４）‐ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株について開示されており、これらの操作された細胞株で発現される抗体は、増大した二分ＧｌｃＮａｃ構造を持ち、その結果、抗体のＡＤＣＣ活性が増大することが記載されている（Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180も参照）。Eureka Therapeutics はさらに、フコシル残基を欠く哺乳動物のグリコシル化パターンが変化した抗体を産生できる遺伝子操作されたＣＨＯ哺乳動物細胞について記載している(http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html)。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗体は、哺乳動物様のグリコシル化パターンを持ち、グリコシル化パターンとしてフコースを欠く抗体を産生することができるように操作された酵母または糸状菌において産生することができる（例えばEP1297172B1を参照）。
【0049】
いくつかの実施形態では、がん細胞の枯渇に適した抗体は、補体依存性細胞傷害を媒介する。
【0050】
本明細書で使用される場合、「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」という用語は、補体の存在下で補体の活性化を開始し、標的を溶解する分子の能力を指す。補体活性化経路は、同種抗原と複合体を形成した分子（例えば抗体）に、補体系の最初の成分（Ｃ１ｑ）が結合することによって開始される。補体活性化を評価するには、例えばGazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)に記載されるようなＣＤＣアッセイを実施してもよい。
【0051】
いくつかの実施形態では、がん細胞の枯渇に適した抗体は、抗体依存性の食作用を媒介する。
【0052】
本明細書で使用される場合、「抗体依存性貪食」または「オプソニン化」という用語は、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介反応を指す。
【0053】
ＣＣＲ８多重特異性抗体：
いくつかの実施形態では、ＣＣＲ８がん細胞の枯渇に適した抗体は、上述したように、ＣＣＲ８に対する第１の抗原結合部位と、エフェクター細胞に対する少なくとも１つの第２の抗原結合部位とを含む多重特異性抗体である。上述の実施形態では、第２の抗原結合部位は、例えば、ヒトエフェクター細胞上の抗原に結合することによって、殺傷メカニズムを動員するために使用される。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、ナチュラルキラー細胞などのＡＤＣＣを誘導することができる。例えば、ＦｃＲを発現する単球およびマクロファージは、標的細胞の特異的な死滅に関与し、免疫系の他の構成要素に抗原を提示する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食し得る。エフェクター細胞上の特定のＦｃＲの発現は、サイトカインなどの体液性因子によって制御され得る。エフェクター細胞は、標的抗原を貪食したり、標的細胞を貪食したり溶解したりすることができる。適切な細胞傷害剤および第２の治療剤は以下に例示されており、これには毒素（放射性標識ペプチドなど）、化学療法剤およびプロドラッグが含まれる。いくつかの実施形態では、第２の結合部位は、上で定義したようにＦｃ受容体に結合する。いくつかの実施形態では、第２の結合部位は、ＮＫ細胞の表面分子に結合し、その結果、前記細胞が活性化され得る。いくつかの実施形態では、第２の結合部位はＮＫｐ４６に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＣＲ８がん細胞の枯渇に適した抗体は、上述したように、ＣＣＲ８に対する第１の抗原結合部位と、エフェクター細胞に対する少なくとも１つの第２の抗原結合部位とを含む多重特異性抗体である。上述の実施形態では、第２の抗原結合部位は、例えば、ヒトエフェクター細胞上の抗原に結合することによって、殺傷メカニズムを動員するために使用される。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、ナチュラルキラー細胞などのＡＤＣＣを誘導することができる。例えば、ＦｃＲを発現する単球およびマクロファージは、標的細胞の特異的な死滅に関与し、免疫系の他の構成要素に抗原を提示する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食し得る。エフェクター細胞上の特定のＦｃＲの発現は、サイトカインなどの体液性因子によって制御され得る。エフェクター細胞は、標的抗原を貪食したり、標的細胞を貪食したり溶解したりすることができる。適切な細胞傷害剤および第２の治療剤は以下に例示されており、これには毒素（放射性標識ペプチドなど）、化学療法剤およびプロドラッグが含まれる。いくつかの実施形態では、第２の結合部位は、上で定義したようにＦｃ受容体に結合する。いくつかの実施形態では、第２の結合部位は、ＮＫ細胞の表面分子に結合し、その結果、前記細胞が活性化され得る。いくつかの実施形態では、第２の結合部位はＮＫｐ４６に結合する。
【0054】
本発明の多重特異性抗体分子の例示的な形式には、（ｉ）１つはＩＬＣの特定の表面分子に対する特異性を有し、もう１つは第２の抗原に対する特異性を有する、化学的ヘテロ接合によって架橋された２つの抗体；（ｉｉ）２つの異なる抗原結合領域を含む単一の抗体；（ｉｉｉ）追加のペプチドリンカーによってタンデムに連結された２つのｓｃＦｖ等の、２つの異なる抗原結合領域を含む単鎖抗体；（ｉｖ）それぞれの軽鎖および重鎖が、短いペプチド結合を介してタンデムに結合される２つの可変ドメインを含む、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）（Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-IgTM) Molecule, In : Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)）；（ｖ）化学的に結合した二重特異性（Ｆａｂ’）２フラグメント：（ｖｉ）標的抗原のそれぞれに対して２つの結合部位を有する４価の二重特異性抗体をもたらす２つの単鎖ダイアボディの融合体であるＴａｎｄａｂ；（ｖｉｉ）多価分子をもたらすダイアボディとｓｃＦｖとの組み合わせである、フレキシボディ（flexibody）；（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼＡにおける「二量体化およびドッキングドメイン」に基づく、いわゆる「ドックアンドロック（dock and lock）」分子。これをＦａｂに適用すると、異なるＦａｂ断片に連結された２つの同一のＦａｂ断片からなる三価の二重特異性結合タンパク質を得ることができる；（ｉｘ）例えばヒトＦａｂアームの両末端に融合された２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるスコーピオン分子；および（ｘ）ダイアボディ、が含まれるが、これらに限定されない。二重特異性抗体の別の例示的なフォーマットは、ヘテロ二量体化を強制する相補的なＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子である。
【0055】
このような分子は、例えば、Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech)、Knob-into-Hole (Genentech)、CrossMAb (Roche)、および静電整合(Amgen)、LUZ-Y (Genentech)、Strand Exchange Engineered Domain body (SEEDbody) (EMD Serono)、Biclonic (Merus)、およびDuoBody (Genmab A/S) などとして知られる既知の技術を使用して調製することができる。
【0056】
したがって、いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は二重特異性抗体である。
【0057】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体はＢｉＴＥである。本明細書で使用される場合、「二重特異性Ｔ細胞誘導体」または「ＢｉＴＥ」という用語は、柔軟に接続された２つの単鎖抗体（ｓｃＦｖ）から構成される組換えタンパク質構築物である二重特異性抗体を指す。前記ｓｃＦｖ抗体の１つは、選択された標的細胞発現腫瘍抗原（すなわち、ＣＣＲ８）に特異的に結合し、もう１つは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体複合体のサブユニットであるＣＤ３などの別の分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＢｉＴＥ抗体は、Ｔ細胞を標的細胞に一時的に結合することができ、同時に、Ｔ細胞の細胞溶解活性を活性化することができる。ＢｉＴＥを介したＴ細胞の活性化には、Ｔ細胞上の特異的Ｔ細胞受容体も、標的細胞上のＭＨＣ Ｉ分子、ペプチド抗原、または共刺激分子も必要ない。
【0058】
ＣＣＲ８抗体薬物接合体：
いくつかの実施形態では、がん細胞の枯渇に適した抗体は、治療部分、すなわち薬物に接合される。
いくつかの実施形態では、がん細胞の枯渇に適した抗体は、治療部分、すなわち薬物に接合される。
【0059】
いくつかの実施形態では、治療部分は、例えば、細胞毒素、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、免疫刺激剤、溶解ペプチド、または放射性同位体であり得る。このような接合体は、本明細書では「抗体薬物接合体」または「ＡＤＣ」と呼ばれる。
【0060】
いくつかの実施形態では、がん細胞の枯渇に適した抗体は、細胞傷害性部分に接合される。細胞傷害性部分は、例えば、タキソール；サイトカラシンＢ；グラミシジンＤ；エチジウムブロミド；エメチン；マイトマイシン；エトポシド；テノポシド；ビンクリスチン；ビンブラスチン；コルヒシン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；ジヒドロキシアントラシンジオン；メイタンシンまたはその類似物もしくは誘導体などのチューブリン阻害剤；モノメチルアウリスタチンＥもしくはＦまたはその類似物もしくは誘導体などの有糸分裂阻害剤；ドラスタチン１０もしくは１５またはその類似物；イリノテカンまたはその類似物；ミトキサントロン；ミトラマイシン；アクチノマイシンＤ；１－デヒドロテストステロン；グルココルチコイド；プロカイン；テトラカイン；リドカイン；プロプラノロール；ピューロマイシン；カリケアマイシンまたはその類似物もしくは誘導体；メトトレキサート、６メルカプトプリン、６チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、またはクラドリビンなどの代謝拮抗剤；メクロレタミン、チオエパ、クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣなどのアルキル化剤；シスプラチンまたはカルボプラチンなどの白金誘導体；デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、ラケルマイシン（ＣＣ－１０６５）、またはその類似物もしくは誘導体；ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）などの抗生物質；ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］－ベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）；ジフテリア毒素、およびジフテリアＡ鎖およびその活性断片およびハイブリッド分子などの関連分子、リシンＡまたは脱グリコシル化リシンＡ鎖毒素などのリシン毒素、コレラ毒素、ＳＬＴ Ｉ、ＳＬＴ ＩＩ、ＳＬＴ ＩＩＶなどの志賀様毒素、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆ボーマンバークプロテアーゼ阻害剤、シュードモナス外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ゼラニン、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α－サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓなどのヨウシュヤマゴボウ（Phytolacca americana）タンパク質、ツルレイシ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン（mitogellin）、リストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシン毒素；リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）；ＤＮａｓｅ Ｉ ブドウ球菌エンテロトキシンＡ；アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質；ジフテリン毒素；ならびにシュードモナスエンドトキシンからなる群から選択される。
【0061】
いくつかの実施形態では、がん細胞の枯渇に適した抗体は、アウリスタチンまたはそのペプチド類似物、その誘導体もしくはプロドラッグに接合される。アウリスタチンについては、微小管の動態、ＧＴＰ加水分解、並びに核および細胞分裂に干渉し（Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584）、抗がん活性（US5663149）および抗真菌活性（Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42: 2961-2965）を有することが示されている。例えば、アウリスタチンＥは、パラ－アセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応して、それぞれＡＥＢおよびＡＥＶＢを生成する。他の典型的なアウリスタチン誘導体は、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）およびＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）を含む。適切なアウリスタチンおよびアウリスタチンの類似物、誘導体およびプロドラッグ、並びにアウリスタチンのAbsへの接合に適切なリンカーは、例えば、米国特許第5,635,483号、第5,780,588号、および第6,214,345号、ならびに国際公開WO02088172、WO2004010957、WO2005081711、WO2005084390、WO2006132670、WO03026577、WO200700860、WO207011968およびWO205082023に開示されている。
【0062】
いくつかの実施形態では、がん細胞の枯渇に適した抗体は、ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］－ベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）またはその類似物、誘導体もしくはプロドラッグに接合される。適切なＰＤＢおよびＰＤＢ誘導体、並びに関連技術は、例えば、Hartley J. A. et al., Cancer Res 2010; 70(17): 6849-6858；Antonow D. et al., Cancer J 2008; 14(3): 154-169；Howard P.W. et al., Bioorg Med Chem Lett 2009; 19: 6463-6466；およびSagnou et al., Bioorg Med Chem Lett 2000; 10(18): 2083-2086に記載されている。
【0063】
いくつかの実施形態では、がん細胞の枯渇に適した抗体は、アントラサイクリン、メイタンシン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ラケルマイシン（ＣＣ－１０６５）、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、イリノテカン、モノメチルアウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＦ、ＰＤＢ、またはそれらのいずれかの類似物、誘導体、もしくはプロドラッグからなる群から選択される細胞傷害性部分に接合される。
【0064】
いくつかの実施形態では、がん細胞の枯渇に適した抗体は、アントラサイクリンまたはその類似物、誘導体もしくはプロドラッグに接合される。いくつかの実施形態では、抗体はメイタンシンまたはその類似物、誘導体もしくはプロドラッグに接合される。いくつかの実施形態では、抗体はカリケアマイシンまたはその類似物、誘導体もしくはプロドラッグに接合される。いくつかの実施形態では、抗体はデュオカルマイシンまたはその類似物、誘導体もしくはプロドラッグに接合される。いくつかの実施形態では、抗体はラケルマイシン（ＣＣ－１０６５）またはその類似物、誘導体もしくはプロドラッグに接合される。いくつかの実施形態では、抗体はドラスタチン１０またはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに接合される。いくつかの実施形態では、抗体は、ドラスタチン１５またはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに接合される。いくつかの実施形態では、抗体はモノメチルアウリスタチンＥまたはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに接合される。いくつかの実施形態では、抗体はモノメチルアウリスタチンＦまたはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに接合される。いくつかの実施形態では、抗体は、ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］－ベンゾジアゼピン、またはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに接合される。いくつかの実施形態では、抗体はイリノテカンまたはその類似体、誘導体もしくはプロドラッグに接合される。
【0065】
いくつかの実施形態では、がん細胞の枯渇に適した抗体は、核酸または核酸関連分子に接合される。そのような実施形態の１つでは、接合される核酸は、細胞傷害性リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）またはデオキシリボヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ）、アンチセンス核酸、阻害性ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）、または免疫刺激性核酸（例えば、免疫刺激性ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡ分子）である。いくつかの実施形態では、抗体はアプタマーまたはリボザイムに接合される。
【0066】
分子を抗体に接合させる技術は当技術分野で周知である（例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985)； Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987)；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985)；“Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985)；およびThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58. を参照のこと。同様に、例えば国際公開WO 89/12624を参照のこと。)。典型的には、核酸分子は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはマレイミド官能基を介して、抗体上のリジンまたはシステインにそれぞれ共有結合している。操作されたシステインまたは非天然アミノ酸の組み込みを使用した接合方法は、接合体の均質性を改善することが報告されている（Axup, J.Y.、Bajjuri, K.M.、Ritland, M.、Hutchins, B.M.、Kim, C.H.、Kazane, S.A.、Halder, R., Forsyth, J.S., Santidrian, A.F., Stafin, K., et al. (2012). Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 16101-16106.；Junutula, J.R., Flagella, K.M., Graham, R.A., Parsons, K.L., Ha, E., Raab, H., Bhakta, S., Nguyen, T., Dugger, D.L., Li, G., et al. (2010). Engineered thio-trastuzumab-DM1 conjugate with an improved therapeutic index to target humanepidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. Clin. Cancer Res.16, 4769-4778）。Junutulaら（2008）は、システインベースの部位特異的接合体（ＴＤＣ）である「ＴＨＩＯＭＡＢ」を開発し、従来の接合法と比較して治療指数が向上したと主張する。抗体に組み込まれた非天然アミノ酸への接合も、ＡＤＣについて研究されている。ただし、このアプローチの一般性はまだ確立されていない（Axup et al., 2012）。特に、当業者はまた、アシル供与体グルタミン含有タグ（例えば、Ｇｉｎ含有ペプチドタグまたはＱタグ）、またはポリペプチド操作によって（例えば、ポリペプチドにおけるアミノ酸の欠失、挿入、置換、または突然変異を介して）反応性を持つようにされた内因性グルタミンによって操作されたＦｃ含有ポリペプチドを構想することもできる。次いで、トランスグルタミナーゼは、アミン供与体物質（例えば、反応性アミンを含む、または反応性アミンに結合した小分子）と共有結合で架橋することで、アシル供与体グルタミン含有タグまたは接近可能／露出／反応性内因性グルタミンを介して、Ｆｃ含有ポリペプチドに部位特異的に接合するアミン供与体物質と接合する、操作されたＦｃ含有ポリペプチドの安定かつ均質な集団を形成することができる（WO2012059882）。
【0067】
ＣＣＲ８ ＣＡＲ－Ｔ細胞：
いくつかの実施形態では、薬剤はＣＡＲ－Ｔ細胞であり、ＣＡＲはＣＣＲ８に特異的な細胞外抗原結合ドメインを少なくとも含む。
いくつかの実施形態では、薬剤はＣＡＲ－Ｔ細胞であり、ＣＡＲはＣＣＲ８に特異的な細胞外抗原結合ドメインを少なくとも含む。
【0068】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および以下に定義される刺激分子および／または共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドのセットは互いに隣接している。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在により、ポリペプチドを互いに結合させることができる二量体化スイッチを含む。二量体化スイッチは、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合させることができる。いくつかの実施形態では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するゼータ鎖である。いくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義する少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激分子は、本明細書に記載の共刺激分子、例えば、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８から選択される。
【0069】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＣＲ８に特異的な細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを有するキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＣＲ８に特異的な細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを有する細胞内シグナル伝達ドメインを有する、キメラ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＣＲ８に特異的な細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに、１つまたは複数の共刺激分子に由来する２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを有する、キメラ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＣＲ８に特異的な細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに、１つまたは複数の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを有するキメラ融合タンパク質を含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に任意のリーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列をさらに含み、リーダー配列は、細胞プロセシングおよび細胞膜へのＣＡＲの局在化中に抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から任意に乖離する。
【0071】
特定の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインおよびエンドドメインに融合された、ＣＣＲ８に特異的なモノクローナル抗体に由来する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、および／またはＯＸ４０などのさらなる共刺激シグナル伝達のためのドメインを含む。 いくつかの実施形態では、分子は、共刺激分子、画像診断用（例えば、陽電子放出断層撮影用）のレポーター遺伝子、プロドラッグの添加時にＴ細胞を条件付きで切除する遺伝子産物、ホーミングレセプター、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカインおよびサイトカイン受容体を含み、ＣＡＲと共発現させることができる。
【0072】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラ抗原受容体は、ＣＣＲ８に特異的な抗体の少なくとも１つのＶＨ配列および／またはＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ８に特異的な抗体またはその抗体断片を含む本発明のＣＡＲの部分は、抗原結合ドメインは、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体または二重特異性抗体等の様々な態様で存在しうる（Harlow et al.、1999、In:Using Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY；Harlow et al.、1999、In:Using Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY；Harlow et al., 1989, In:Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.；Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Bird et al., 1988, Science 242 :423-426)。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、ＣＣＲ８に特異的な抗体断片を含む。さらなる態様では、ＣＡＲは、ＣＣＲ８に特異的なｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。
【0073】
ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法は当技術分野でよく知られている。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、細胞はＣＡＲを安定して発現し得る。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、哺乳類細胞における発現のためにその配列がコドン最適化された核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲ構築物全体は、その全配列が哺乳類細胞における発現のためにコドン最適化されている核酸分子によってコードされる。コドンの最適化とは、コーディングＤＮＡにおける同義コドン (つまり、同じアミノ酸をコードするコドン) の出現頻度が異なる種で偏っているという発見を指す。このようなコドン縮重により、同一のポリペプチドがさまざまなヌクレオチド配列によってコードされることが可能になる。様々なコドン最適化方法が当技術分野で知られており、例えば、少なくとも米国特許第5,786,464号および第6,114,148号に開示される方法が含まれる。
【0074】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラ抗原受容体は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ－アシル化、例えばジスルフィド架橋を介した環化されてもよく、または酸付加塩に変換されてもよく、および／または場合により二量体化または重合されてもよい。
【0075】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ治療の安全性および有効性を最適化するために、所望であれば、ＣＡＲ活性を制御することができる。ＣＡＲ活動を調節する方法は数多く存在する。例えば二量体化ドメインに融合したカスパーゼを使用する、誘導性アポトーシス（例えば、Di et al., N Egnl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683を参照）は、本発明のＣＡＲ療法における安全スイッチとして使用される一例である。
【0076】
医薬組成物：
典型的には、本発明の薬剤は、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物の形態で患者に投与される。これらの組成物に使用され得る薬学的に許容される担体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝剤、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂肪が挙げられるが、これらに限定されない。患者への投与に使用するために、組成物は患者への投与用に製剤化される。本発明の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸内に、鼻腔内に、口腔内に、膣内に、または埋め込みリザーバーを介して投与することができる。本明細書で使用されるものとしては、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、肝臓内、病変内および頭蓋内注射または注入技術が含まれる。本発明の組成物の滅菌注射可能な形態は、水性懸濁液または油性懸濁液であってもよい。これらの懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、当技術分野で知られている技術に従って配合することができる。滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液であってもよい。使用できる許容可能な賦形剤および溶媒の中には、水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌した不揮発性油が溶媒または懸濁媒体として従来使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む、任意の低刺激な固定油を使用することができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、特にポリオキシエチル化された状態のオリーブ油およびヒマシ油などの薬学的に許容される天然油と同様に、注射剤の調製に有用である。これらの油溶液または懸濁液は、エマルジョンおよび懸濁液を含む薬学的に許容される剤形の製剤化に一般的に使用されるカルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤などの長鎖アルコール希釈剤または分散剤も含有し得る。薬学的に許容される固体、液体、または他の剤形の製造に一般的に使用される、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎおよび他の乳化剤またはバイオアベイラビリティ増強剤などの他の一般的に使用される界面活性剤もまた、製剤化の目的で使用され得る。本発明の組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を含むがこれらに限定されない、経口的に許容される任意の剤形で経口投与することができる。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体には乳糖およびコーンスターチが含まれる。通常、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も添加される。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤としては、例えば乳糖が挙げられる。経口使用に水性懸濁液が必要な場合、有効成分を乳化剤および懸濁剤と組み合わせる。必要に応じて、特定の甘味料、香味料、または着色料を添加することもできる。あるいは、本発明の組成物は、直腸投与用の坐剤の形態で投与することもできる。これらは、室温では固体であるが直腸温度では液体であることで、直腸内で溶けて薬剤を放出する適切な非刺激性賦形剤を、薬剤と混合することによって調製できる。このような材料には、ココアバター、ミツロウ、ポリエチレングリコールなどがある。本発明の組成物は、特に治療の標的が、眼、皮膚または下部腸管の疾患を含む、局所適用によって容易に届く領域または器官を含む場合、局所的に投与することもできる。適切な局所製剤は、これらの領域または器官のそれぞれに対して容易に調製される。局所適用の場合、組成物は、１つ以上の担体中に懸濁または溶解された活性成分を含む適切な軟膏として製剤化され得る。本発明の化合物の局所投与のための担体としては、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する適切なローションまたはクリームに製剤化することができる。適切な担体としては、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。下部腸管への局所適用は、直腸坐薬製剤（上記参照）または適切な浣腸製剤で行うことができる。パッチも使用できる。本発明の組成物は、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することもできる。このような組成物は、医薬製剤の分野で周知の技術に従って調製され、また、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、生物学的利用能を高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の従来の可溶化剤または分散剤を使用して、生理食塩水溶液として調製され得る。例えば、本発明の医薬組成物中に存在する抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）または５００ｍｇ（５０ｍＬ）の使い捨てバイアル中で１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給され得る。この製品は、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、および注射用滅菌水でＩＶ投与用に製剤化される。ｐＨは６．５に調整される。本発明の医薬組成物中の抗体の例示的な適切な用量範囲は、約１ｍｇ／ｍ２から５００ｍｇ／ｍ２の間であり得る。しかしながら、これらのスケジュールは例示であり、臨床試験で決定しなければならない医薬組成物中の特定の抗体の親和性および忍容性を考慮して最適なスケジュールおよびレジメンを適合させることができることが理解されるであろう。注射（例えば、筋肉内、静脈内）用の本発明の医薬組成物は、滅菌緩衝水（例えば、筋肉内では１ｍｌ）、および約1ng～約100mg、例えば約50ng～約30mg、より好ましくは約5mg～約25mgの本発明の阻害剤を含むように調整され得る。
典型的には、本発明の薬剤は、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物の形態で患者に投与される。これらの組成物に使用され得る薬学的に許容される担体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝剤、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂肪が挙げられるが、これらに限定されない。患者への投与に使用するために、組成物は患者への投与用に製剤化される。本発明の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸内に、鼻腔内に、口腔内に、膣内に、または埋め込みリザーバーを介して投与することができる。本明細書で使用されるものとしては、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、肝臓内、病変内および頭蓋内注射または注入技術が含まれる。本発明の組成物の滅菌注射可能な形態は、水性懸濁液または油性懸濁液であってもよい。これらの懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、当技術分野で知られている技術に従って配合することができる。滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液であってもよい。使用できる許容可能な賦形剤および溶媒の中には、水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌した不揮発性油が溶媒または懸濁媒体として従来使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む、任意の低刺激な固定油を使用することができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、特にポリオキシエチル化された状態のオリーブ油およびヒマシ油などの薬学的に許容される天然油と同様に、注射剤の調製に有用である。これらの油溶液または懸濁液は、エマルジョンおよび懸濁液を含む薬学的に許容される剤形の製剤化に一般的に使用されるカルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤などの長鎖アルコール希釈剤または分散剤も含有し得る。薬学的に許容される固体、液体、または他の剤形の製造に一般的に使用される、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎおよび他の乳化剤またはバイオアベイラビリティ増強剤などの他の一般的に使用される界面活性剤もまた、製剤化の目的で使用され得る。本発明の組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を含むがこれらに限定されない、経口的に許容される任意の剤形で経口投与することができる。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体には乳糖およびコーンスターチが含まれる。通常、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も添加される。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤としては、例えば乳糖が挙げられる。経口使用に水性懸濁液が必要な場合、有効成分を乳化剤および懸濁剤と組み合わせる。必要に応じて、特定の甘味料、香味料、または着色料を添加することもできる。あるいは、本発明の組成物は、直腸投与用の坐剤の形態で投与することもできる。これらは、室温では固体であるが直腸温度では液体であることで、直腸内で溶けて薬剤を放出する適切な非刺激性賦形剤を、薬剤と混合することによって調製できる。このような材料には、ココアバター、ミツロウ、ポリエチレングリコールなどがある。本発明の組成物は、特に治療の標的が、眼、皮膚または下部腸管の疾患を含む、局所適用によって容易に届く領域または器官を含む場合、局所的に投与することもできる。適切な局所製剤は、これらの領域または器官のそれぞれに対して容易に調製される。局所適用の場合、組成物は、１つ以上の担体中に懸濁または溶解された活性成分を含む適切な軟膏として製剤化され得る。本発明の化合物の局所投与のための担体としては、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する適切なローションまたはクリームに製剤化することができる。適切な担体としては、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。下部腸管への局所適用は、直腸坐薬製剤（上記参照）または適切な浣腸製剤で行うことができる。パッチも使用できる。本発明の組成物は、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することもできる。このような組成物は、医薬製剤の分野で周知の技術に従って調製され、また、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、生物学的利用能を高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の従来の可溶化剤または分散剤を使用して、生理食塩水溶液として調製され得る。例えば、本発明の医薬組成物中に存在する抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）または５００ｍｇ（５０ｍＬ）の使い捨てバイアル中で１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給され得る。この製品は、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、および注射用滅菌水でＩＶ投与用に製剤化される。ｐＨは６．５に調整される。本発明の医薬組成物中の抗体の例示的な適切な用量範囲は、約１ｍｇ／ｍ２から５００ｍｇ／ｍ２の間であり得る。しかしながら、これらのスケジュールは例示であり、臨床試験で決定しなければならない医薬組成物中の特定の抗体の親和性および忍容性を考慮して最適なスケジュールおよびレジメンを適合させることができることが理解されるであろう。注射（例えば、筋肉内、静脈内）用の本発明の医薬組成物は、滅菌緩衝水（例えば、筋肉内では１ｍｌ）、および約1ng～約100mg、例えば約50ng～約30mg、より好ましくは約5mg～約25mgの本発明の阻害剤を含むように調整され得る。
【0077】
診断方法：
本発明のさらなる目的は、患者から得られたサンプル中のＣＣＲ８の発現レベルを検出することを含む、患者におけるＴ細胞リンパ腫を診断する方法に関する。
本発明のさらなる目的は、患者から得られたサンプル中のＣＣＲ８の発現レベルを検出することを含む、患者におけるＴ細胞リンパ腫を診断する方法に関する。
【0078】
いくつかの実施形態において、本発明は、患者から得られたサンプル中のＣＣＲ８の発現レベルを検出することを含む、Ｔ細胞リンパ腫を診断する方法に関する。この方法においては、所定の基準値と比較した場合のＣＣＲ８の過剰発現は、上記患者が上記Ｔ細胞リンパ腫を患っていることを示す。
【0079】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫、または皮膚Ｔ細胞リンパ腫を診断するのに特に適している。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫を診断するのに特に適している。より詳細には、本発明の方法は、セザリー症候群を診断するのに特に適している。
【0080】
本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価の目的で得られる任意の生物学的サンプルを指す。いくつかの実施形態では、サンプルは血液サンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルはＰＢＭＣサンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは、（ｉ）精製血液白血球、（ｉｉ）末梢血単核球またはＰＢＭＣ、（ｉｉｉ）精製リンパ球、（ｉｖ）精製Ｔ細胞、（ｖ）精製ＣＤ４＋Ｔ細胞、または（ｖｉ）精製されたＣＤ３＋Ｔ細胞のサンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは、精製されたＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２６－および／またはＣＤ７－ＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ球のサンプルである。いくつかの実施形態では、生体サンプルは組織サンプルである。「組織サンプル」という用語には、生検または解剖サンプルなどの組織の切片、および組織学的目的で採取された凍結切片が含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、組織サンプルは、対象の皮膚で行われた生検から生じ得る。
【0081】
いくつかの実施形態では、マーカーのレベルは免疫組織化学染色（ＩＨＣ）によって決定される。免疫組織化学染色は通常、ｉ）前記組織サンプルをホルマリンで固定するステップ、ｉｉ）前記組織サンプルをパラフィンに包埋するステップ、ｉｉｉ）前記組織サンプルを染色のために切片に切断するステップ、ｉｖ）前記切片をマーカーに特異的な結合パートナーとインキュベートするステップ、ｖ）前記切片をすすぐステップ、ｖｉ）前記切片をビオチン化二次抗体とともにインキュベートするステップ、およびｖｉｉ）アビジン－ビオチン－ペルオキシダーゼ複合体を有する抗原－抗体複合体を明らかにするステップを含む。したがって、組織サンプルは最初に結合パートナーとともにインキュベートされる。洗浄後、目的のマーカーに結合する標識抗体は、放射性、蛍光、または酵素ラベル等の標識抗体が担持する標識の種類に応じて、適切な手法で認識される。多重染色は同時に実行できる。あるいは、本発明の方法は、増幅システム（染色シグナルを強化するため）および酵素分子に結合した二次抗体を使用してもよい。このような結合二次抗体はDako、EnVision等によって市販されている。H&E、DAPI、Hoechstなどの対比染色を使用することもできる。他の染色方法は、自動、半自動、または手動システムを含む、当業者には明らかな任意の適切な方法またはシステムを使用して達成することができる。例えば、１つ以上の標識を抗体に結合させることができ、それによって標的タンパク質（すなわち、マーカー）の検出が可能になる。例示的な標識には、放射性同位体、蛍光色素、リガンド、化学発光剤、酵素、およびそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、標識は量子ドットである。一次および／または二次親和性リガンドに接合させることができる標識の非限定的な例としては、蛍光色素または金属（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレスカミン）、発色団色素（例えば、ロドプシン）、化学発光化合物（例えば、ルミナール、イミダゾール）および生物発光タンパク質（例：ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例：ビオチン）が挙げられる。他の様々な有用な蛍光体および発色団は、Stryer L (1968) Science 162:526-533およびBrand L and Gohlke J R (1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868に記載されている。親和性リガンドは、酵素（西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼなど）、放射性同位元素（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉなど）、粒子（金など）で標識することもできる。さまざまな種類の標識が、さまざまな化学反応（アミン反応またはチオール反応など）を使用して親和性リガンドに接合できる。しかしながら、アミンおよびチオール以外の他の反応性基（アルデヒド、カルボン酸、グルタミン等）も使用することができる。対象タンパク質を検出するための様々な酵素染色法は、当技術分野で知られている。例えば、酵素相互作用は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどのさまざまな酵素、またはＤＡＢ、ＡＥＣ若しくはＦａｓｔ Ｒｅｄなどのさまざまなクロモゲンを使用して視覚化できる。他の例では、抗体は、標識された結合パートナーまたは抗体を介して検出できるペプチドまたはタンパク質に接合させることができる。間接ＩＨＣアッセイでは、最初の結合パートナーは標識されていないため、その結合を検出するために二次抗体または二次結合パートナーが必要である。得られた染色標本はそれぞれ、検出可能な信号を観察し、染色のデジタル画像などの画像を取得するシステムを使用して画像化される。画像取得の方法は当業者にはよく知られている。例えば、サンプルが染色されると、例えば、正立または倒立光学顕微鏡、走査型共焦点顕微鏡、カメラ、走査型またはトンネル型電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡および画像化赤外線検出器などの、任意の光学または非光学式イメージングデバイスを、染色またはバイオマーカーラベルの検出に使用できる。いくつかの例では、画像はデジタル的に取り込むことができる。得られた画像は、サンプル中のマーカーの量を定量的または半定量的に決定するために使用できる。免疫組織化学染色での使用に適した様々な自動サンプル処理、走査および分析システムが当技術分野で利用可能である。このようなシステムは、自動染色と顕微鏡走査、コンピュータによる画像解析、連続切片比較（サンプルの向きとサイズの変動を制御するため）、デジタルレポートの生成、並びにサンプルのアーカイブおよび追跡（どの組織切片が載っているかなどを含む）。従来の光学顕微鏡とデジタル画像処理システムを組み合わせて、免疫染色サンプルを含む細胞および組織の定量分析を実行する細胞イメージングシステムが市販されている。例えば、CAS-200システム(Becton, Dickinson & Co.)を参照されたい。特に、検出は手動で、またはコンピュータプロセッサおよびソフトウェアを含む画像処理技術によって行うことができる。このようなソフトウェアを使用すると、当業者に知られている手順を使用して、例えば染色の品質または染色の強度を含む要因に基づいて、例えば、画像を構成、校正、標準化、および／または検証することができる（例えば、米国特許公開第20100136549号)。画像は定量的または半定量的に分析され、サンプルの染色強度に基づいてスコア付けされる。定量的または半定量的組織化学は、特定のバイオマーカー（つまり、マーカー）の存在を同定および定量するために、組織化学を経たサンプルをスキャンおよびスコアリングする方法を指す。定量的または半定量的方法では、染色濃度若しくは染色量を検出するイメージングソフトウェア、または訓練を受けたオペレーターが結果を数値的にランク付けする、人間の目による染色検出方法を採用することができる。）。例えば、画像は、ピクセルカウントアルゴリズムを使用して定量的に分析できる（例えば、Aperio Spectrum Software、Automated QUantitatative Analysisプラットフォーム（AQUA（登録商標）プラットフォーム）、および染色の程度を測定または定量または半定量するその他の標準的な方法)；米国特許第8,023,714号、米国特許第7,257,268号、米国特許第7,219,016号、米国特許第7,646,905号、米国特許公開第20100136549号および第20110111435 号、Camp et al. (2002) Nature Medicine, 8:1323-1327；Bacus et al. (1997) Analyt Quant Cytol Histol, 19:316-328を参照されたい）。染色面積の合計に対する強い陽性染色 （茶色の染色など）の比率は算出され、スコアリングされる。検出されたバイオマーカー（つまり、マーカー）の量は定量化され、陽性ピクセルのパーセンテージおよび／またはスコアとして与えられる。たとえば、その量は、陽性ピクセルのパーセンテージとして定量化できる。いくつかの例では、その量は、染色された領域の割合、例えば陽性ピクセルの割合として定量化される。例えば、サンプルは、総染色面積に対して、少なくともまたは約0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上の陽性ピクセルを有する。いくつかの実施形態では、サンプルの組織化学的染色の強度または量の数値表現であり、サンプル中に存在する標的バイオマーカー（例えば、マーカー）の量を表すスコアがサンプルに与えられる。光学濃度または面積割合の値には、たとえば整数スケールなどのスケールされたスコアを与えることができる。 したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ｉ）マーカーと選択的に相互作用することができる結合パートナー（例えば上述の抗体）を使用することによって、自動スライド染色システムで得られた組織切片の１つまたは複数の免疫染色されたスライドを提供するステップ、ｉｉ）高解像度スキャンキャプチャによるステップａのスライドのデジタル化に進むステップ、ｉｉｉ）デジタル画像上で組織切片のスライスを検出するステップ、ｉｖ）同じ表面を有する均一に分布したユニットを有する参照サイズ格子を準備するステップであって、前記格子は、分析する組織切片のサイズに適合しているステップ、およびｖ）各ユニットにおける染色された細胞の強度を検出、定量化および測定するステップであり、それによって各ユニットの染色された細胞の数または密度が評価されるステップを含む。
【0082】
いくつかの実施形態では、マーカーのレベルはフローサイトメトリー法によって決定される。本明細書で使用する「フローサイトメトリー法」という用語は、対象の細胞を流体の流れに懸濁し、電子検出装置に通過させることによって細胞を計数する技術を指す。フローサイトメトリー法は、蛍光パラメーターなど、１秒あたり最大数千のイベントの物理パラメーターおよび／または化学パラメーターの同時マルチパラメーター分析を可能とする。最新のフローサイトメトリー機器は通常、複数のレーザーと蛍光検出器を搭載する。フローサイトメトリー技術の一般的なバリエーションは、「蛍光活性化細胞選別」を使用して、目的の集団を精製または検出するために、粒子の特性に基づいて粒子を物理的に選別することである。本明細書で使用される「蛍光活性化細胞選別」（ＦＡＣＳ）とは、生物学的試料から細胞の不均一な混合物を、各細胞の特異的な光散乱および蛍光特性に基づいて、一度に１細胞ずつ２つ以上の容器に選別するフローサイトメトリー法を指し、個々の細胞からの蛍光シグナルの高速で客観的かつ定量的な記録と、特に関心のある細胞の物理的な分離を提供する。したがって、ＦＡＣＳを本明細書に記載の方法とともに、本発明の細胞集団の単離および検出に使用することができる。従って、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用することができる。これには、実質的に製造業者の指示に従って使用される、BD Biosciences FACSCanto（商標）フローサイトメーターなどの、複数の発蛍光団の同時励起および検出が可能なフローサイトメーターの使用が含まれる。サイトメトリーシステムは、以下に説明するように、サイトメトリーサンプル流体サブシステムを含むことができる。さらに、サイトメトリーシステムは、サイトメトリーサンプル流体サブシステムに流体的に結合されたサイトメーターを含む。本開示のシステムは、データ出力デバイス（例えば、モニタ、プリンタ、及び／又はスピーカ）、ソフトウェア（例えば、Flowjo、Laluza・・・）、データ入力デバイス（例えば、インターフェースポート、マウス、キーボード等）、流体処理部、電源等の多くの追加部品を含んでもよい。より具体的には、サンプルは、対象となる細胞集団の特定の市場に特異的な抗体のパネルと接触される。このような抗体または抗原結合フラグメントは、R&D Systems、BD Biosciences、e-Biosciences、Biolegend、ProimmuneおよびMiltenyiなどの販売業者から商業的に入手可能であるか、または当業者に知られている方法によってこれらの細胞表面マーカーに対して生じさせることができる。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントなどの細胞表面マーカーに特異的に結合する薬剤は、目的の細胞集団の単離および検出を容易にするためにタグで標識される。本明細書で使用する「標識」または「タグ」という用語は、生体サンプル中の特定の細胞表面マーカーの存在など、標的の存在を示す検出可能なシグナルを生成することができる組成物を指す。substrates, 適切な標識には、蛍光分子、放射性同位体、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、化学発光部分、磁性粒子、生物発光部分などが含まれる。したがって、標識は、がん細胞を単離および検出する方法に必要な、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明の方法で使用する抗体などの薬剤を標識するための蛍光標識またはタグの非限定的な例としては、ヒドロキシクマリン、スクシンイミジルエステル、アミノクマリン、スクシンイミジルエステル、メトキシクマリン、スクシンイミジルエステル、カスケードブルー、ヒドラジド、パシフィックブルー、マレイミド、パシフィックオレンジ、ルシファーイエロー、NBD、NBD-X、R-フィコエリトリン（PE）、PE-Cy5接合体（Cychrome、R670、Tri-Color、Quantum Red）、PE-Cy7接合体、Red 613、PE-Texas Red、PerCP、PerCPeFluor 710、PE-CF594、ペリジニンクロロフィルタンパク質、TruRed（PerCP-Cy5.5接合体）、FluorX、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、BODIPY-FL、TRITC、X-Rhodamine（XRITC）、Lissamine Rhodamine B、Texas Red、Allophycocyanin（APC）、APC-Cy7接合体、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5 .5、Cy7、BV 785、BV711、BV421、BV605、BV510、またはBV650を含む。前述のアッセイは、固体支持体への抗体の結合が含んでもよい。固体表面は、抗体でコーティングされた微量滴定プレートであってもよい。あるいは、固体表面は、活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなどのビーズであってもよい。ビーズは、ガラス、プラスチック、ポリスチレン、アクリルなどのさまざまな材料で作ることができるが、これらに限定されない。さらに、ビーズは蛍光標識されていることが好ましい。好ましい実施形態では、蛍光ビーズは、Becton Dickinson Biosciences（カリフォルニア州サンノゼ）から入手可能なTruCount（商標）チューブに含まれるビーズである。
【0083】
いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも１つのさらなるマーカーの発現レベルを検出することをさらに含む。典型的には、マーカーは、KIR3DL2、PLS3、TwistおよびNKp46からなる群から選択される。
【0084】
本明細書において、対象となる様々なマーカーのそれぞれの名前は、HUGO Gene Nomenclature Committeeが提供し、特にインターネットアドレス http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/index.htmlで入手できるデータベースを含む、国際的に認められた遺伝子配列およびタンパク質配列のデータベースに見られるような、対応遺伝子の国際的に認められた名前を指す。本明細書において、対象となる様々なマーカーのそれぞれの名前は、国際的に認められた遺伝子配列およびタンパク質配列データベースGenbankに見られるような、対応遺伝子の国際的に認められた名前を指す場合もある。
当業者は、これらの国際的に認められた配列データベースを通じて、本明細書に記載の目的のマーカーのそれぞれに対応する核酸配列およびアミノ酸配列を検索することができる。
当業者は、これらの国際的に認められた配列データベースを通じて、本明細書に記載の目的のマーカーのそれぞれに対応する核酸配列およびアミノ酸配列を検索することができる。
【0085】
多重組織分析技術は、組織サンプル内のいくつかのマーカーを定量するのに特に役立つ。このような技術により、単一の組織サンプルから少なくとも５つ、または少なくとも１０以上のバイオマーカーを測定できるはずである。さらに、この技術がバイオマーカーの局在を保存し、がん性細胞と非がん性細胞におけるバイオマーカーの存在を区別できるという利点がある。このような方法には、例えば、米国特許第6,602,661号、第6,969,615号、第7,214,477号および第7,838,222号、米国特許公開第2011/0306514号（参照により本明細書に組み込まれる）；Chung & Hewitt、Meth Mol Biol、Prot Blotting Detect、Kurlen & Scofield編、536: 139-148, 2009に教示される、層状免疫組織化学染色（Ｌ－ＩＨＣ）、層状発現スキャニング（ＬＥＳ）、または多重組織免疫ブロット法（ＭＴＩ）が含まれ、各参考文献は、層状かつブロットされた膜、紙、フィルターなどの上に組織切片の最大８、最大９、最大１０、最大１１またはそれ以上の画像を作成することを教示する。Ｌ－ＩＨＣ／ＭＴＩプロセスを実施するのに有用なコーティングされた膜は、20/20 GeneSystems, Inc.（メリーランド州ロックビル）から入手可能である。
【0086】
いくつかの実施形態では、Ｌ－ＩＨＣ法は、新鮮であるか保存されていたかにかかわらず、様々な組織サンプルのいずれに対しても実行することができる。サンプルは、これらは日常的に10%の標準緩衝ホルマリンで固定され、病理学部門で処理されたコア針生検が含んだ。標準的な５μｍの厚さの組織切片を組織塊から切り出し、Ｌ－ＩＨＣに使用する荷電スライド上に置いた。したがって、Ｌ－ＩＨＣは、組織切片から複数の生体親和性コーティング膜に転写された分子のコピーを得ることにより、組織切片中の複数のマーカーの検査を可能にし、実質的に組織の「画像」のコピーを作成する。パラフィン切片の場合、組織切片は、当技術分野で知られているように、例えば切片をキシレンまたはＮＥＯ－ＣＬＥＡＲ（登録商標）などのキシレン代替物および段階的エタノール溶液に曝露することによって脱パラフィンされる。切片は、パパイン、トリプシン、プロテイナーゼＫなどのプロテイナーゼで処理することができる。次いで、例えば、スタックを通してタンパク質などの組織分子を導くための、直径０．４μｍの細孔を有する厚さ１０μｍのコーティングされたポリマー主鎖の複数のシートを含む膜基材のスタックが、組織切片上に配置される。流体および組織分子の動きは、膜表面に対して実質的に垂直になるように構成されている。切片、膜、スペーサー紙、吸収紙、おもりなどのサンドイッチを熱にさらして、組織から膜束への分子の移動を促進することができる。組織のタンパク質の一部は、生体親和性コートされ束ねられた膜のそれぞれに捕捉される（20/20 GeneSystems, Inc. メリーランド州ロックビルから入手可能）したがって、各膜は組織のコピーを構成し、標準的な免疫ブロッティング技術を使用して異なるバイオマーカーをプローブでき、これにより、単一の組織切片に対して実行されるようにマーカープロファイルの自在な拡張が可能になる。束の中で組織から遠位にある膜ではタンパク質の量が少なくなる可能性があり、たとえば、組織サンプル中の分子の量の違い、組織サンプルから放出される分子の移動度の違い、膜への分子の結合親和性、移動距離等の違いが発生し得るので、膜内および膜間で生じる変化を修正し、膜内および膜間での情報の直接比較を可能にするように、手順は、値の正規化、実行制御、組織分子の移動レベルの評価などを含んでもよい。したがって、例えば、当該技術分野において知られているように、標準的な試薬および方法を用いたタンパク質等の利用可能な分子をビオチン化し、次いで標識されたアビジンまたはストレプトアビジン；Blot fastStain、Ponceau Red、ブリリアントブルー染色などのタンパク質染色剤に膜を暴露することによる結合ビオチンを検出する等のタンパク質の任意の定量方法によって、タンパク質の総量は膜毎に決定され得る。
【0087】
いくつかの実施形態では、本方法は、バイオマーカーを測定するために多重組織インプリンティング（Multiplex Tissue Imprinting：ＭＴＩ）技術を利用し、この方法は、複数のバイオマーカー、場合によっては少なくとも６つのバイオマーカーを可能にすることによって貴重な生検組織を保存する。
【0088】
いくつかの実施形態では、本発明の一部として使用することもできる代替の多重組織分析システムが存在する。そのような技術の１つは、質量分析に基づく選択反応モニタリング（ＳＲＭ）アッセイシステム（OncoPlexDx（メリーランド州ロックビル）から入手可能な「Liquid Tissue」）である。その技術は、米国特許第7,473,532号に記載されている。
【0089】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、GE Global Research（ニューヨーク州ニスカユナ）によって開発された多重ＩＨＣ技術を利用した。この技術は、米国特許公開第2008/0118916号および第2008/0118934号に記載されている。そこでは、蛍光プローブをサンプルに結合させ、その後シグナルを検出し、次にプローブを不活化し、続いてプローブを別のターゲットに結合させ、検出および不活化を行い、そしてこのプロセスを継続するというステップを含む、複数の標的を含有する生体サンプルに対する連続分析が実行される。
【0090】
いくつかの実施形態では、多重組織イメージングは蛍光（例えば、蛍光団または量子ドット）を使用するときに実行されてもよく、信号はマルチスペクトルイメージングシステムを用いて測定されてもよい。マルチスペクトルイメージングは、画像の各ピクセルの分光情報を収集し、得られたデータをスペクトル画像処理ソフトウェアで分析する技術である。たとえば、このシステムは、電子的かつ連続的に選択可能な異なる波長で一連の画像を取得でき、そのようなデータを処理するために設計された分析プログラムで利用できる。したがって、このシステムは、スペクトル曲線が異なる場合、色素のスペクトルが高度に重複している場合や、それらが共局在している場合、またはサンプル内の同じ点で発生している場合でも、複数の色素から定量的な情報を同時に取得できる。多くの生体物質は、高エネルギー光によって励起されると自家蛍光を発するか、低エネルギー光を放出する。この信号により、画像やデータのコントラストが低下する可能性がある。マルチスペクトルイメージング機能のない高感度カメラでは、蛍光信号とともに自家蛍光信号も増加するだけである。マルチスペクトルイメージングは、組織からの自己蛍光を分離または除去することができるため、達成可能な信号対雑音比を高めることができる。 簡単に言うと、定量化は次のステップ：ｉ）対象から得た腫瘍組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を提供すること、ｉｉ）次に、ＴＭＡサンプルを目的のタンパク質の特異性を有する抗抗体で染色すること、ｉｉｉ）ＴＭＡスライドを、腫瘍と間質の自動セグメンテーションを支援するために上皮細胞マーカーでさらに染色すること、ｉｖ）次に、マルチスペクトルイメージングシステムを使用してＴＭＡスライドをスキャンすること、ｖ）スキャンされた画像を、自動画像解析ソフトウェア（例：Perkin Elmer Technology）を使用して処理すること（これによって強力なパターン認識アルゴリズムを通じて特定の組織の検出、定量化、セグメンテーションが可能となる）、を含み得る。機械学習アルゴリズムは通常、間質から腫瘍をセグメント化し、標識された細胞を識別するように事前にトレーニングされている。
【0091】
いくつかの実施形態では、マーカーのレベルは核酸レベルで決定される。典型的には、遺伝子のレベルは、ｍＲＮＡの量を決定することによって決定され得る。ｍＲＮＡの量を決定する方法は当技術分野でよく知られている。例えば、サンプル（例えば、対象から調製された細胞または組織）に含まれる核酸は、最初に標準的な方法に従って、例えば溶解酵素または化学溶液を使用して抽出されるか、または製造業者の指示に従って核酸結合樹脂によって抽出される。次いで、抽出されたｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット分析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）および／または増幅（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）によって検出される。他の増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（ligase chain reaction：ＬＣＲ）、転写媒介増幅（transcription-mediated amplification：ＴＭＡ）、鎖置換増幅（strand displacement amplification：ＳＤＡ）、および核酸配列に基づく増幅（nucleic acid sequence based amplification：ＮＡＳＢＡ）が含まれる。
【0092】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、マーカーの発現レベルを所定の基準値と比較することをさらに含み、マーカーの発現レベルと所定の基準値との間の差の検出は、対象がＴ細胞リンパ腫を有するかどうかを示す。
【0093】
いくつかの実施形態において、所定の基準値は、同一又は類似の年齢範囲の被験者、同一又は類似の民族グループの被験者、及び同一の重症度の病変を有する被験者を含むがこれに限定されない集団研究から得られた、数値又は値に対する相対値である。このような所定の基準値は、集団の統計分析および／または数学的アルゴリズムおよび計算された指数から得られるリスク予測データから導き出すことができる。いくつかの実施形態では、適切に保管された過去の対象サンプルにおけるマーカーのレベルの遡及的測定を、これらの所定の基準値を確立する際に使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、所定の基準値は閾値またはカットオフ値である。閾値は、検査の機能および利益／リスクバランス（偽陽性および偽陰性の臨床結果）に従って、最適な感度および特異度を得るように決定する必要がある。通常、最適な感度と特異度（および閾値）は、実験データに基づく受信者動作特性 (ROC) 曲線を使用して決定できる。たとえば、参照グループ内のマーカーのレベルを決定した後、アルゴリズム分析を使用して、検査対象のサンプル中のマーカーの測定レベルの統計処理を行うことができ、これにより、サンプルの分類に重要な分類基準を取得できる。ＲＯＣ曲線の正式名称は受信者操作特性曲線であり、受信者動作特性曲線とも呼ばれる。これは主に臨床生化学診断検査に使用される。ＲＯＣ曲線は、真陽性率（感度）および偽陽性率（１特異度）の連続変数を反映する包括的な指標である。これは画像合成法による感度と特異度との関係を明らかにする。一連の異なるカットオフ値（閾値または臨界値、診断検査の正常結果と異常結果の間の境界値）が連続変数として設定され、一連の感度および特異度の値が計算される次に、感度を垂直座標として使用し、特異度を水平座標として使用して曲線を描く。曲線下面積（ＡＵＣ）が高いほど、診断の精度が高くなる。ＲＯＣ曲線上では、座標図の左上端に最も近い点が、高い感度値および高い特異性値の両方を持つ臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は1.0～0.5である。ＡＵＣ＞0.5の場合、ＡＵＣが1に近づくにつれて診断結果はより良くなる。ＡＵＣが0.5～0.7の場合、精度は低くなる。ＡＵＣが0.7～0.9の場合、精度は中程度である。When AUC is higher than 0.9, the accuracy is quite high.ＡＵＣが0.9より高い場合、精度は非常に高くなる。このアルゴリズムによる方法は、コンピュータを使用して実行されることが好ましい。ROC曲線の描画には、MedCalc 9.2.0.1医療統計ソフトウェア、SPSS 9.0、ROCPOWER.SAS、DESIGNROC.FOR、MULTIREADER POWER.SAS、CREATE-ROC.SAS、GB STAT VI0.0（Dynamic Microsystems, Inc. 米国メリーランド州シルバースプリング）などの既存のソフトウェアまたはシステムを使用することができる。
【0094】
典型的には、実施例で実証されるように、ＣＣＲ８の発現レベルは、健康な個体からのサンプルにおいて測定される発現レベルよりも高い。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ８発現レベルは、蛍光強度によって決定される。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ８発現レベルは、ＣＣＲ８平均蛍光強度によって決定される。いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＣＲ８平均蛍光強度を決定することと、ＣＣＲ８平均蛍光強度が100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490または500より大きいときに、患者がＴ細胞リンパ腫に罹患していると結論付けることからなるさらなるステップを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＣＲ８平均蛍光強度を決定することと、ＣＣＲ８平均蛍光強度が400より大きいときに、患者がＴ細胞リンパ腫に罹患していると結論付けることからなるさらなるステップを含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ８発現レベルは、ＣＣＲ８デルタ平均蛍光強度で決定される。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ８デルタ平均蛍光強度は、ＩｇＧ２ａコントロールアイソタイプ発現レベルと比較して計算される。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ８デルタ平均蛍光強度は、ＩｇＧ２ａコントロールアイソタイプ平均蛍光強度と比較して計算される。いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＣＲ８デルタ平均蛍光強度を決定することと、ＣＣＲ８デルタ平均蛍光強度が100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490または500より大きいときに、患者がＴ細胞リンパ腫に罹患していると結論付けることからなるさらなるステップを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＣＲ８デルタ平均蛍光強度を決定することと、ＣＣＲ８デルタ平均蛍光強度が160より大きいときに、患者がＴ細胞リンパ腫に罹患していると結論付けることからなるさらなるステップを含む。
【0095】
ＣＣＲ８の発現レベルに対する薬剤（薬物化合物など）の影響のモニタリングは、患者のＴ細胞リンパ腫の状態を経時的にモニタリングするために応用できる。例えば、マーカー発現に影響を及ぼす薬剤の有効性は、抗Ｔ細胞リンパ腫治療を受けている対象の治療中にモニタリングすることができる。
【0096】
したがって、本発明は、以下のステップを含む、Ｔ細胞リンパ腫に罹患している患者への治療の有効性をモニタリングする方法も提供する：
（ｉ）薬剤の投与前に患者から投与前サンプルを入手するステップ；
（ｉｉ）投与前のサンプルにおけるＣＣＲ８の発現レベルを検出するステップ；
（ｉｉｉ）患者から１つ以上の投与後のサンプルを採取するステップ；
（ｉｖ）投与後のサンプルにおける同じマーカーの発現レベルを検出するステップ；
（ｖ）投与前のサンプルにおけるＣＣＲ８の発現レベルを、投与後のサンプルにおけるＣＣＲ８の発現レベルと比較するステップ；および
（ｖｉ）それに応じて患者への薬剤の投与を変更するステップ。
（ｉ）薬剤の投与前に患者から投与前サンプルを入手するステップ；
（ｉｉ）投与前のサンプルにおけるＣＣＲ８の発現レベルを検出するステップ；
（ｉｉｉ）患者から１つ以上の投与後のサンプルを採取するステップ；
（ｉｖ）投与後のサンプルにおける同じマーカーの発現レベルを検出するステップ；
（ｖ）投与前のサンプルにおけるＣＣＲ８の発現レベルを、投与後のサンプルにおけるＣＣＲ８の発現レベルと比較するステップ；および
（ｖｉ）それに応じて患者への薬剤の投与を変更するステップ。
【0097】
例えば、治療中にＣＣＲ８の発現レベルを評価することによって病状が悪化したと診断された場合、投与量が無効であり、投与量を増やすことが望ましいことを示している可能性がある。逆に、ＣＣＲ８の発現レベルを評価することによって病状が改善したと診断された場合は、有効な治療法であり、投与量を変更する必要がないことを示している可能性がある。
【0098】
したがって、本発明はまた、Ｔ細胞リンパ腫に罹患している患者に治療を適応させる方法にも関し、前記方法は以下のステップを含む：
ａ）前記患者から収集された少なくとも１つのサンプルに対して、本明細書に開示されるｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法を実行すること；
ｂ）前記患者に投与することによって、前記患者の治療法を適応させること。
ａ）前記患者から収集された少なくとも１つのサンプルに対して、本明細書に開示されるｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法を実行すること；
ｂ）前記患者に投与することによって、前記患者の治療法を適応させること。
【0099】
本発明はまた、上述の診断方法を実施するためのキットにも関する。キットは、複数の試薬、特にＣＣＲ８マーカーに特異的に結合できる少なくとも１つの試薬を含む。マーカータンパク質と結合するための適切な試薬には、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメントなどが含まれる。マーカー核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライシングされたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）と結合するための適切な試薬には、相補的核酸が含まれる。例えば、核酸試薬には、基板に固定されたオリゴヌクレオチド（標識または非標識）、基板に結合していない標識オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー対、分子ビーコンプローブなどが含まれ得る。本発明のキットは、本発明の方法を実施するために有用な追加の成分を任意に含んでもよい。例として、キットは、相補的核酸をアニーリングするために、または抗体とそれが特異的に結合するタンパク質とを結合するのに適した流体（例えば、ＳＳＣ緩衝液）、１つまたは複数のサンプルコンパートメント、本発明の体外診断方法の実行について説明する説明書等を含んでもよい。
【0100】
本発明は、以下の図および実施例によってさらに説明される。しかしながら、これらの例および図は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【0101】
実施例１：
＜方法＞
〔セザリー症候群患者の新鮮末梢血腫瘍細胞におけるＣＣＲ８発現〕
患者への説明とインフォームドコンセントへの署名後の、抗ＣＤ４、ＣＤ１５８ｋ（＝ＫＩＲ３ＤＬ２、セザリー細胞の表面マーカー）、およびＣＣＲ８（ＣＤ１９８）抗体（クローンＬ２６３．Ｇ８）またはコントロールアイソタイプを使用した、セザリー症候群患者４人の末梢血単核細胞におけるフローサイトメトリーによるＣＣＲ８発現の研究。
＜方法＞
〔セザリー症候群患者の新鮮末梢血腫瘍細胞におけるＣＣＲ８発現〕
患者への説明とインフォームドコンセントへの署名後の、抗ＣＤ４、ＣＤ１５８ｋ（＝ＫＩＲ３ＤＬ２、セザリー細胞の表面マーカー）、およびＣＣＲ８（ＣＤ１９８）抗体（クローンＬ２６３．Ｇ８）またはコントロールアイソタイプを使用した、セザリー症候群患者４人の末梢血単核細胞におけるフローサイトメトリーによるＣＣＲ８発現の研究。
【0102】
〔Ｔ細胞リンパ腫細胞株のＣＣＲ８発現〕
細胞をコントロールアイソタイプまたは抗ＣＣＲ８（ＣＤ１９８）抗体（クローンＬ２６３．Ｇ８）とともに４℃で１５分間インキュベートし、その後ＰＢＳで洗浄し、ＬＳＲＸ２０フローサイトメーターで分析した。
細胞をコントロールアイソタイプまたは抗ＣＣＲ８（ＣＤ１９８）抗体（クローンＬ２６３．Ｇ８）とともに４℃で１５分間インキュベートし、その後ＰＢＳで洗浄し、ＬＳＲＸ２０フローサイトメーターで分析した。
【0103】
＜結果＞
〔セザリー症候群患者の新鮮末梢血腫瘍細胞におけるＣＣＲ８発現〕
反応性ＫＩＲ３ＤＬ２－ＣＤ４ Ｔ細胞と比較した、セザリー症候群患者の循環ＣＤ４＋ＫＩＲ３ＤＬ２＋腫瘍細胞によるＣＣＲ８（ＣＤ１９８）の過剰発現（図１）。４つの異なるセザリー患者の細胞を抗ＣＤ４、抗ＫＩＲ３ＤＬ２、および抗ＣＤ１９８抗体で染色した。ＣＤ１９８発現は、ＣＤ４＋ＫＩＲ３ＤＬ２＋腫瘍細胞集団で分析された。
〔セザリー症候群患者の新鮮末梢血腫瘍細胞におけるＣＣＲ８発現〕
反応性ＫＩＲ３ＤＬ２－ＣＤ４ Ｔ細胞と比較した、セザリー症候群患者の循環ＣＤ４＋ＫＩＲ３ＤＬ２＋腫瘍細胞によるＣＣＲ８（ＣＤ１９８）の過剰発現（図１）。４つの異なるセザリー患者の細胞を抗ＣＤ４、抗ＫＩＲ３ＤＬ２、および抗ＣＤ１９８抗体で染色した。ＣＤ１９８発現は、ＣＤ４＋ＫＩＲ３ＤＬ２＋腫瘍細胞集団で分析された。
【0104】
〔Ｔ細胞リンパ腫細胞株のＣＣＲ８発現〕
ＳＮＫ（ＥＢＶ陽性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫）、ＤＥＲＬ－２（肝脾ガンマデルタＴ細胞リンパ腫）、およびＨｕＴ７８（セザリー症候群）細胞株を抗ＣＣＲ８抗体またはコントロールアイソタイプで染色し、ＣＣＲ８発現をフローサイトメトリーで分析した（図２）。
ＳＮＫ（ＥＢＶ陽性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫）、ＤＥＲＬ－２（肝脾ガンマデルタＴ細胞リンパ腫）、およびＨｕＴ７８（セザリー症候群）細胞株を抗ＣＣＲ８抗体またはコントロールアイソタイプで染色し、ＣＣＲ８発現をフローサイトメトリーで分析した（図２）。
【0105】
実施例２：
我々は、ＳＳおよび持続的血液関与を有する１３人の患者の末梢血白血球のフローサイトメトリー分析を行った。セザリー細胞は、上述したように、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２６－および／またはＣＤ７－ＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ球として同定された（１４、１５）（図３Ａ）。Ｌ２６３Ｇ８モノクローナル抗体およびコントロールＩｇＧ２ａアイソタイプを使用してＣＣＲ８発現を測定し、健康なドナーのＴ細胞の発現と比較した。ＣＣＲ８＋腫瘍Ｔ細胞は全例でＣＣＲ４を共発現した（データは示さず）。セザリー患者の末梢血ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＴｒｅｇは高レベルのＣＣＲ８を発現しなかった（データは示さず）。ＣＣＲ８デルタ中央平均蛍光強度（ＣＣＲ８ ｍＡｂ－コントロールアイソタイプ）は、セザリー細胞では５８０（範囲、１５０～１４２０）であったのに対し、健康なコントロールでは１１０（範囲、８０～１６０）であった（ｐ＜０．００１、図３Ｂ）。興味深いことに、ＣＴＣＬ ＨｕＴ７８（ＳＳ）細胞株だけでなく、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫ＳＮＫ６、肝脾ガンマデルタＴ細胞リンパ腫ＤＥＲＬ－２細胞株およびＡＩＴＬ細胞株もＣＣＲ８を発現しており（図２および図４）、このことはＣＣＲ８がさまざまなＴ細胞リンパ腫サブタイプにおける潜在的な治療標的であることを示唆する。リガンドＣＣＬ１８およびＣＣＬ１によるＣＣＲ８結合は、３０分で顕著なＥｒｋ１／２リン酸化を誘導し、セザリー患者の腫瘍細胞ではＩＬ－２に依存しなかった（データは示さず）。さらに、一部の患者では、ＣＣＬ１とＩＬ－２を併用すると、ＩＬ－２単独と比較してより高いセザリー細胞増殖が誘導されるようである（ＣＦＳＥｌｏセザリー細胞では４２％対１２％）（図３Ｃ）。健康な対照の新たに単離した末梢血リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ３／２８活性化した前（０日目）または後（３日目）のＣＣＲ８発現も分析した。Ｔ細胞によるＣＣＲ８発現は、３日間のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化後に大幅に増加し、ＣＤ２５ｉｎｔＴ細胞と比較してＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ活性化Ｔ細胞でより高かった（図３Ｄ）。
我々は、ＳＳおよび持続的血液関与を有する１３人の患者の末梢血白血球のフローサイトメトリー分析を行った。セザリー細胞は、上述したように、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２６－および／またはＣＤ７－ＫＩＲ３ＤＬ２＋リンパ球として同定された（１４、１５）（図３Ａ）。Ｌ２６３Ｇ８モノクローナル抗体およびコントロールＩｇＧ２ａアイソタイプを使用してＣＣＲ８発現を測定し、健康なドナーのＴ細胞の発現と比較した。ＣＣＲ８＋腫瘍Ｔ細胞は全例でＣＣＲ４を共発現した（データは示さず）。セザリー患者の末梢血ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＴｒｅｇは高レベルのＣＣＲ８を発現しなかった（データは示さず）。ＣＣＲ８デルタ中央平均蛍光強度（ＣＣＲ８ ｍＡｂ－コントロールアイソタイプ）は、セザリー細胞では５８０（範囲、１５０～１４２０）であったのに対し、健康なコントロールでは１１０（範囲、８０～１６０）であった（ｐ＜０．００１、図３Ｂ）。興味深いことに、ＣＴＣＬ ＨｕＴ７８（ＳＳ）細胞株だけでなく、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫ＳＮＫ６、肝脾ガンマデルタＴ細胞リンパ腫ＤＥＲＬ－２細胞株およびＡＩＴＬ細胞株もＣＣＲ８を発現しており（図２および図４）、このことはＣＣＲ８がさまざまなＴ細胞リンパ腫サブタイプにおける潜在的な治療標的であることを示唆する。リガンドＣＣＬ１８およびＣＣＬ１によるＣＣＲ８結合は、３０分で顕著なＥｒｋ１／２リン酸化を誘導し、セザリー患者の腫瘍細胞ではＩＬ－２に依存しなかった（データは示さず）。さらに、一部の患者では、ＣＣＬ１とＩＬ－２を併用すると、ＩＬ－２単独と比較してより高いセザリー細胞増殖が誘導されるようである（ＣＦＳＥｌｏセザリー細胞では４２％対１２％）（図３Ｃ）。健康な対照の新たに単離した末梢血リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ３／２８活性化した前（０日目）または後（３日目）のＣＣＲ８発現も分析した。Ｔ細胞によるＣＣＲ８発現は、３日間のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化後に大幅に増加し、ＣＤ２５ｉｎｔＴ細胞と比較してＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ活性化Ｔ細胞でより高かった（図３Ｄ）。
【0106】
＜結論＞
結論として、この研究は、健康な対照Ｔ細胞と比較して、末梢血セザリー細胞によるホーミングマーカーＣＣＲ８の過剰発現を裏付ける。この分子は他のＴ細胞リンパ腫細胞株の細胞表面でも発現しているため、我々が得た結果は、ＣＣＲ８が別個の進行性Ｔ細胞リンパ腫サブタイプの治療標的である可能性を示唆する。
結論として、この研究は、健康な対照Ｔ細胞と比較して、末梢血セザリー細胞によるホーミングマーカーＣＣＲ８の過剰発現を裏付ける。この分子は他のＴ細胞リンパ腫細胞株の細胞表面でも発現しているため、我々が得た結果は、ＣＣＲ８が別個の進行性Ｔ細胞リンパ腫サブタイプの治療標的である可能性を示唆する。
【0107】
我々の研究は、ＣＴＣＬの潜在的な治療標的としてのＣＣＲ８の分析としては初である。ＰＤ－１阻害（文献７）または同種異系幹細胞移植（文献１７）などの免疫調節治療（文献１６）は、ＣＴＣＬにおいて長期応答を引き起こすことができることが示されており、抗腫瘍免疫応答の活性化が長期にわたる疾患制御を提供する可能性があることを示唆する。モガムリズマブ治療を受けた患者では、ＣＣＲ４を発現する末梢活性化Ｔｒｅｇの枯渇は免疫副作用と関連したが、これらの免疫反応は疾患反応と長期的な疾患制御と関連した（文献５、６、１８）。ＣＣＲ８は最近、最適な腫瘍Ｔｒｅｇ標的として提案されている（文献１９）。ＣＣＲ４とは異なり、ＣＣＲ８はヒト腫瘍Ｔｒｅｇ上で選択的に発現され、炎症誘発性エフェクターＴ細胞上では最小限に発現された。前臨床マウス腫瘍モデルでは、ＦｃγＲ結合抗ＣＣＲ８抗体によるＣＣＲ８＋Ｔｒｅｇの枯渇により、用量依存的で効果的かつ長期持続する抗腫瘍免疫が可能となり、ＰＤ－１遮断と相乗効果を発揮することが示された（文献１９）。Ｆｃ最適化された非フコシル化抗ヒトＣＣＲ８抗体は、ヒト一次検体からのｅｘ ｖｉｖｏ腫瘍培養物においてＴｒｅｇを特異的に枯渇させ、エフェクターＴ細胞を枯渇させなかった（文献１９）。
【0108】
参考文献：
本出願全体を通じて、さまざまな参考文献が本発明に関係する最先端技術を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み込まれる。
1. Bagot M, Moretta A, Sivori S, Biassoni R, Cantoni C, Bottino C, et al. CD4(+) cutaneous T-cell lymphoma cells express the p140-killer cell immunoglobulin-like receptor. Blood. 2001;97(5):1388-91.
2. Battistella M, Leboeuf C, Ram-Wolff C, Hurabielle C, Bonnafous C, Sicard H, et al. KIR3DL2 expression in cutaneous T-cell lymphomas: expanding the spectrum for KIR3DL2 targeting. Blood. 2017;130(26):2900-2.
3. Kim YH, Bagot M, Pinter-Brown L, Rook AH, Porcu P, Horwitz SM, et al. Mogamulizumab versus vorinostat in previously treated cutaneous T-cell lymphoma (MAVORIC): an international, open-label, randomised, controlled phase 3 trial. Lancet Oncol. 2018;19(9):1192-204.
4. Sugiyama D, Nishikawa H, Maeda Y, Nishioka M, Tanemura A, Katayama I, et al. Anti-CCR4 mAb selectively depletes effector-type FoxP3+CD4+ regulatory T cells, evoking antitumor immune responses in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(44):17945-50.
5. Bonnet P, Battistella M, Roelens M, Ram-Wolff C, Herms F, Frumholtz L, et al. Association of autoimmunity and long-term complete remission in patients with Sezary syndrome treated with mogamulizumab. Br J Dermatol. 2019;180(2):419-20.
6. Algarni AS, Ram-Wolff C, Bagot M, De Masson A. Mogamulizumab-induced vitiligo in patients with Sezary syndrome: three cases. Eur J Dermatol. 2021;31(2):213-6.
7. Khodadoust MS, Rook AH, Porcu P, Foss F, Moskowitz AJ, Shustov A, et al. Pembrolizumab in Relapsed and Refractory Mycosis Fungoides and Sezary Syndrome: A Multicenter Phase II Study. J Clin Oncol. 2020;38(1):20-8.
8. Bensussan A, Janela B, Thonnart N, Bagot M, Musette P, Ginhoux F, et al. Identification of CD39 as a Marker for the Circulating Malignant T-Cell Clone of Sezary Syndrome Patients. J Invest Dermatol. 2019;139(3):725-8.
9. Jariwala N, Benoit B, Kossenkov AV, Oetjen LK, Whelan TM, Cornejo CM, et al. TIGIT and Helios Are Highly Expressed on CD4+ T Cells in Sezary Syndrome Patients. J Invest Dermatol. 2017;137(1):257-60.
10. McCully ML, Ladell K, Hakobyan S, Mansel RE, Price DA, Moser B. Epidermis instructs skin homing receptor expression in human T cells. Blood. 2012;120(23):4591-8.
11. McCully ML, Ladell K, Andrews R, Jones RE, Miners KL, Roger L, et al. CCR8 Expression Defines Tissue-Resident Memory T Cells in Human Skin. J Immunol Baltim. 2018;200(5):1639-50.
12. Clark RA, Watanabe R, Teague JE, Schlapbach C, Tawa MC, Adams N, et al. Skin effector memory T cells do not recirculate and provide immune protection in alemtuzumab-treated CTCL patients. Sci Transl Med. 2012;4(117):117ra7.
13. Van Damme H, Dombrecht B, Kiss M, Roose H, Allen E, Van Overmeire E, et al. Therapeutic depletion of CCR8+ tumor-infiltrating regulatory T cells elicits antitumor immunity and synergizes with anti-PD-1 therapy. J Immunother Cancer. 2021;9(2).
14. Moins-Teisserenc H, Daubord M, Clave E, Douay C, Felix J, Marie-Cardine A, et al. CD158k is a reliable marker for diagnosis of Sezary syndrome and reveals an unprecedented heterogeneity of circulating malignant cells. J Invest Dermatol. 2015;135(1):247-57.
15. Roelens M, de Masson A, Ram-Wolff C, Maki G, Cayuela J-M, Marie-Cardine A, et al. Revisiting the initial diagnosis and blood staging of mycosis fungoides and Sezary syndrome with the KIR3DL2 marker. Br J Dermatol. 2020;182(6):1415-22.
16. Roccuzzo G, Giordano S, Fava P, Pileri A, Guglielmo A, Tonella L, et al. Immune Check Point Inhibitors in Primary Cutaneous T-Cell Lymphomas: Biologic Rationale, Clinical Results and Future Perspectives. Front Oncol. 2021;11:733770.
17. de Masson A, Beylot-Barry M, Bouaziz J-D, Peffault de Latour R, Aubin F, Garciaz S, et al. Allogeneic stem cell transplantation for advanced cutaneous T-cell lymphomas: a study from the French Society of Bone Marrow Transplantation and French Study Group on Cutaneous Lymphomas. Haematologica. 2014;99(3):527-34.
18. Trum NA, Zain J, Martinez XU, Parekh V, Afkhami M, Abdulla F, et al. Mogamulizumab Efficacy is Underscored by its Associated Rash that Mimics Cutaneous T-cell Lymphoma: A Retrospective Single-Centre Case Series. Br J Dermatol. 2021 (Epub ahead of print)
19. Campbell JR, McDonald BR, Mesko PB, Siemers NO, Singh PB, Selby M, et al. Fc-Optimized Anti-CCR8 Antibody Depletes Regulatory T Cells in Human Tumor Models. Cancer Res. 2021;81(11):2983-94.
本出願全体を通じて、さまざまな参考文献が本発明に関係する最先端技術を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み込まれる。
1. Bagot M, Moretta A, Sivori S, Biassoni R, Cantoni C, Bottino C, et al. CD4(+) cutaneous T-cell lymphoma cells express the p140-killer cell immunoglobulin-like receptor. Blood. 2001;97(5):1388-91.
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19. Campbell JR, McDonald BR, Mesko PB, Siemers NO, Singh PB, Selby M, et al. Fc-Optimized Anti-CCR8 Antibody Depletes Regulatory T Cells in Human Tumor Models. Cancer Res. 2021;81(11):2983-94.
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【配列表】
【国際調査報告】