特表 2024-512585 リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子、その製造方法、およびその治療のための使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-19

(54)【発明の名称】リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子、その製造方法、およびその治療のための使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/14 20060101AFI20240312BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 33/30 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 31/401 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 31/198 20060101ALI20240312BHJP

   B82Y 40/00 20110101ALI20240312BHJP

   B82Y 5/00 20110101ALI20240312BHJP

【ＦＩ】

A61K9/14

A61P25/28

A61P9/10

A61P27/06

A61P21/00

A61P43/00 111

A61K33/30

A61K45/00

A61K31/401

A61K31/198

B82Y40/00

B82Y5/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023558657

(86)(22)【出願日】2021-03-23

(85)【翻訳文提出日】2023-11-22

(86)【国際出願番号】 CN2021082357

(87)【国際公開番号】W WO2022198438

(87)【国際公開日】2022-09-29

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521313935

【氏名又は名称】武漢広行科学研究有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＷＵＨＡＮ ＶＡＳＴ ＣＯＮＤＵＣＴ ＳＣＩＥＮＣＥ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ５０６， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １， Ｏｐｔｉｃｓ Ｖａｌｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ， Ｎｏ． ３８８ Ｇａｏｘｉｎ ２ｎｄ Ｒｏａｄ， Ｄｏｎｇｈｕ Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ Ｗｕｈａｎ， Ｈｕｂｅｉ ４３００７０ （ＣＮ）

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】スゥン、タオレイ

(72)【発明者】

【氏名】ガオ、グァンビン

(72)【発明者】

【氏名】ウィ、マァン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C076AA29

4C076CC01

4C076CC10

4C076CC11

4C076CC41

4C076DD21A

4C076FF36

4C084AA17

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA15

4C084ZA36

4C084ZA94

4C084ZC41

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC07

4C086GA16

4C086HA03

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA05

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA15

4C086ZA36

4C086ZA94

4C086ZC41

4C206AA01

4C206AA02

4C206FA53

4C206MA01

4C206MA02

4C206MA04

4C206MA05

4C206NA05

4C206NA14

4C206ZA15

4C206ZA36

4C206ZA94

4C206ZC41

(57)【要約】

リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の製造方法、リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子を含む組成物、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子および前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子を含む組成物のアミロイドβ（Ａβ）の線維化を抑制すること、炎症因子の発現を低下させること、Ａβ線維化が原因／関連するアルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、緑内障における網膜神経節細胞変性（ＲＧＣＤ）または筋炎・ミオパチー（ＭＭ）の治療を含む使用、ＡＤ、ＣＡＡ、ＲＧＣＤまたはＭＭの治療のための医薬の製造における使用、および上記の疾患の治療方法に関する。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

硫化亜鉛コアと、前記硫化亜鉛コアに結合したリガンドとを含む、リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子。

【請求項2】

前記硫化亜鉛コアの直径が、０．５～４．０ｎｍである、請求項１記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子。

【請求項3】

前記硫化亜鉛コアの直径が、１．０～３．５ｎｍである、請求項１記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子。

【請求項4】

前記リガンドは、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる一つである、請求項１記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子。

【請求項5】

前記リガンドは、カプトプリルである、請求項１記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子。

【請求項6】

リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子（Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓ）の製造方法であって、
リガンド水溶液におけるリガンドの濃度が０．０２～２．０ｍｏｌ／Ｌとなるように、リガンドを脱イオン水に溶解し、リガンド水溶液を得るステップと、
酢酸亜鉛溶液を前記リガンド水溶液に添加し、酢酸亜鉛／リガンド反応混合物を得るステップであって、酢酸亜鉛水溶液の濃度が０．０１～１．０ｍｏｌ／Ｌであり、リガンドと酢酸亜鉛とのモル比が１：１～１０：１の範囲内にあるステップと、
前記酢酸亜鉛／リガンド反応混合物のｐＨを７～１０の範囲に調整するステップと、
添加された硫化ナトリウムと前記酢酸亜鉛／リガンド反応混合物における酢酸亜鉛とのモル比が０．１：１～５：１の範囲にあるように、硫化ナトリウム水溶液を前記ｐＨ調整済の酢酸亜鉛／リガンド反応混合物に滴下し、硫化ナトリウム／酢酸亜鉛／リガンド反応混合物を得るステップと、
前記硫化ナトリウム／酢酸亜鉛／リガンド反応混合物を所定の温度までに加熱し、そして、前記反応を所定の時間維持し、Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓを形成するステップであって、前記所定の温度は、５０～１００℃であり、前記所定の時間は、１～５時間であるステップと、
を含む、方法。

【請求項7】

前記方法は、さらに、
限外濾過チューブを用いた遠心分離により、前記Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓを精製するステップであって、前記限外濾過チューブの分子量カットオフが５ｋダルトンであるステップを含み、請求項６記載の方法。

【請求項8】

アルツハイマー病（ＡＤ）および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、緑内障における網膜神経節細胞変性（ＲＧＣＤ）または筋炎・ミオパチー（ＭＭ）を有する対象の治療において使用されるための、請求項１～５のいずれか１項に記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子。

【請求項9】

請求項１～５のいずれか１項に記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子を含み、アルツハイマー病（ＡＤ）および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、緑内障における網膜神経節細胞変性（ＲＧＣＤ）または筋炎・ミオパチー（ＭＭ）を有する対象の治療のために使用される、組成物。

【請求項10】

インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、過敏性Ｃ反応性タンパク質（Ｈｓ ＣＲＰ）、または腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）の過剰発現の状態を有する対象の治療において使用されるための、請求項１～５のいずれか１項に記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子。

【請求項11】

請求項１～５のいずれか１項に記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子を含み、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、過敏性Ｃ反応性タンパク質（Ｈｓ ＣＲＰ）、または腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）の過剰発現の状態を有する対象の治療のために使用される、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ナノ技術およびその応用の技術分野に関し、特にリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子を含む組成物、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の治療用の医薬の製造における使用、並びに、治療のために前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子および前記組成物を利用する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

アミロイドβ（Ａβ）の線維化は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、緑内障における網膜神経節細胞変性（ＲＧＣＤ）、筋炎・ミオパチー（ＭＭ）などの疾患の原因または関連因子である。

【0003】

アルツハイマー病（ＡＤ）は、慢性的な神経変性疾患である。その病理学的特徴としては、細胞外の老人斑の沈着、細胞内の神経原線維のもつれ、神経細胞とシナプスの異常な消失などが挙げられる。細胞外の老人斑の沈着と細胞内の神経原線維のもつれの初期蓄積は、ヒトのアストロサイト（ＨＡ）の増殖性炎症と酸化ストレスを含む一連の深刻な病理過程を引き起こすことが、より多くの証拠によって示唆されている。ＨＡの増殖性炎症と酸化ストレスは、老人斑と神経原線維もつれの蓄積を加速させる。この悪循環は、神経細胞やシナプスの異常な消失につながる。老人斑の沈着は、Ａβのミスフォールディングや異常凝集、線維化によって引き起こされる。したがって、Ａβプラークと神経炎症を同時に抑制することができる潜在的な薬剤を開発することは、大きな意義がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子（Ｒ－ＺｎＳ ＮＰ）を提供する。特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子が、硫化亜鉛コアと、前記硫化亜鉛コアに結合したリガンド（Ｒ）とを含む。特定の実施形態では、前記リガンド（Ｒ）が、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる一つである。特定の実施形態では、前記リガンド（Ｒ）が、カプトプリルである。前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の特定の実施形態では、前記硫化亜鉛コアの直径が、０．５～４．０ｎｍである。前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の特定の実施形態では、前記硫化亜鉛コアの直径が、１．０～３．５ｎｍである。

【0005】

本発明は、リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子（Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓ）の製造方法を提供する。特定の実施形態では、前記方法が、

【0006】

リガンド水溶液におけるリガンドの濃度が０．０２～２．０ｍｏｌ／Ｌとなるように、リガンド（Ｒ）を脱イオン水に溶解し、リガンド水溶液を得るステップと、

【0007】

酢酸亜鉛溶液をリガンド水溶液に添加し、酢酸亜鉛／リガンド反応混合物を得るステップであって、酢酸亜鉛水溶液の濃度が０．０１～１．０ｍｏｌ／Ｌであり、リガンドと酢酸亜鉛とのモル比が１：１～１０：１の範囲内にあるステップと、

【0008】

前記酢酸亜鉛／リガンド反応混合物のｐＨを７～１０の範囲に調整するステップと、

【0009】

添加された硫化ナトリウムと前記酢酸亜鉛／リガンド反応混合物における酢酸亜鉛とのモル比が０．１：１～５：１の範囲にあるように、硫化ナトリウム水溶液を前記ｐＨ調整済の酢酸亜鉛／リガンド反応混合物に滴下し、硫化ナトリウム／酢酸亜鉛／リガンド反応混合物を得るステップと、

【0010】

前記硫化ナトリウム／酢酸亜鉛／リガンド反応混合物を所定の温度までに加熱し、そして、前記反応を所定の時間維持し、Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓを形成するステップであって、前記所定の温度は、５０～１００℃であり、前記所定の時間は、１～５時間であるステップと、
を含む。

【0011】

特定の実施形態では、前記方法が、さらに、限外濾過チューブを用いた遠心分離により、前記Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓを精製するステップであって、前記限外濾過チューブの分子量カットオフが５ｋダルトンであるステップを含む。

【0012】

本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、緑内障における網膜神経節細胞変性（ＲＧＣＤ）または筋炎・ミオパチー（ＭＭ）を有する対象の治療において使用されるためのリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子を提供する。特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の前記リガンドが、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる一つである。特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の前記リガンドが、カプトプリルである。

【0013】

本発明は、リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子を含む組成物であって、アルツハイマー病（ＡＤ）および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、緑内障における網膜神経節細胞変性（ＲＧＣＤ）または筋炎・ミオパチー（ＭＭ）を有する対象の治療のために使用される、組成物を提供する。特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の前記リガンドが、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる一つである。特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の前記リガンドが、カプトプリルである。

【0014】

本発明は、インターロイキン－６（interleukin-6、ＩＬ－６）、インターロイキン－８（interleukin-8、ＩＬ－８）、インターロイキン－１β（interleukin-1β、ＩＬ－１β）、過敏性Ｃ反応性タンパク質（hypersensitive-c-reactive-protein、Ｈｓ ＣＲＰ）、または腫瘍壊死因子－α（tumor necrosis factor-alpha、ＴＮＦα）の過剰発現の状態を有する対象の治療において使用されるためのリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子を提供する。特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の前記リガンドが、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる一つである。特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の前記リガンドが、カプトプリルである。

【0015】

本発明は、リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子を含む組成物であって、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、過敏性Ｃ反応性タンパク質（Ｈｓ ＣＲＰ）、または腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）の過剰発現の状態を有する対象の治療のために使用される、組成物を提供する。特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の前記リガンドが、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる一つである。特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の前記リガンドが、カプトプリルである。

【0016】

本発明の目的および利点は、添付の図面に関連して、その好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるである。

【図面の簡単な説明】

【0017】

本発明による好ましい実施形態は、次に、同様の参照数字が同様の要素を示す、図を参照して説明される。

【0018】

【図1】Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓのＴＥＭ画像および物理的特性群の曲線を示す：（Ａ）Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓのＴＥＭ画像；（Ｂ）Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの粒子サイズおよびサイズ分布の統計図；（Ｃ）Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの赤外スペクトル；（Ｄ）Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓのＸ線光電子スペクトル；（Ｅ）Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓのＺｎスペクトル、および（Ｆ）Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓのＳスペクトル。

【0019】

【図2】Ａβ４０と６０時間インキュベートしたＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ、ＭＡ－ＺｎＳ ＮＰｓおよびＤＨＬＡ－ＺｎＳ ＮＰｓのＴｈＴ動態曲線をそれぞれ示し、２０μＭでのＡβ４０の線維化動態に対する異なる濃度の（Ａ）Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ、（Ｂ）ＭＡ－ＺｎＳ ＮＰｓおよび（Ｃ）ＤＨＬＡ－ＺｎＳ ＮＰｓの影響を説明する。

【0020】

【図3】Ａβ４０と６０時間インキュベートしたＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰのＡＦＭおよびＴＥＭ画像を示す：（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの最終濃度がそれぞれ０、１および５ｐｐｍのときのＡＦＭ画像；（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）は、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの最終濃度がそれぞれ０、１および５ｐｐｍのときのＴＥＭ画像。

【0021】

【図4】ＰＣ１２細胞の生存率のヒストグラムであり、（Ａ）ＰＣ１２細胞の生存率に対する、異なる濃度のＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの効果；（Ｂ）Ａβ４０（最終濃度２５μＭ）の細胞毒性に対する、異なる濃度のＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの阻害効果を示す。

【0022】

【図5】ＥＬＩＳＡによって検出されたＬＰＳモデルにおける５つの炎症因子の発現に対するＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓおよびＣａｐの効果の棒グラフである：（Ａ）ＩＬ－６、（Ｂ）ＩＬ－８、（Ｃ）ＩＬ－１β、（Ｄ）ｈｓ ＣＲＰおよび（Ｅ）ＴＮＦ－α。

【0023】

【図6】１００ｍｇ／ｋｇのＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓを腹腔内注射した後のマウスの心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓および脳の組織切片のＨＥ染色画像を示す。

【0024】

【図7】２０ｍｇ／ｋｇのＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ（ｎ＝５）の腹腔内注射後、２、６、１２および２４時間における心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓および脳におけるＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの分布を示す図である。

【0025】

【図8】Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ、ＭＡ－ＺｎＳ ＮＰｓまたはＤＨＬＡ－ＺｎＳ ＮＰｓを毎日４週間投与した後の雄マウスのモリス水迷路の結果：（Ａ）潜伏期間；（Ｂ）プラットフォーム横断回数；（Ｃ）目標象限の遊泳時間；（Ｄ）目標象限の滞在時間。

【0026】

【図9】海馬におけるＡβ４０、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－αおよびＧＦＡＰの免疫組織化学的画像を示す。正常マウスは、２０ｍｇ／ｋｇのＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓを腹腔内注射した対照群であり、６０番目のＡＤマウスは、６０週目のモデル対照群であり、６４番目のＡＤマウスは、６０週から６４週まで２０ｍｇ／ｋｇのＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓを毎日注射されたマウスである。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本発明は、以下の本発明の特定の実施形態に対する詳細な説明を参照することによって、より容易に理解することができる。

【0028】

本出願にわたって、刊行物が参照される場合、これらの刊行物の開示は、本発明が関係する技術状態をより完全に説明するために、その全体が参照により本出願に組み込まれる。

【0029】

本明細書で使用される「投与」とは、対象への経口（「ｐｏ」）投与、座薬としての投与、局所接触、静脈内（「ｉｖ」）、腹腔内（「ｉｐ」）、筋肉内（「ｉｍ」）、病変内、海馬内、脳室内、鼻腔内または皮下（「ｓｃ」）投与、または徐放デバイス（例えば、ミニ浸透圧ポンプもしくは侵食性インプラント）の埋め込みを意味する。投与は、非経口および経粘膜（例えば、経口、鼻腔、膣、直腸、または経皮）を含む任意の経路によるものである。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内など投与が含まれる。他の送達形態としては、リポソーム製剤の使用、静脈内注入、経皮パッチなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0030】

「全身的投与」及び「全身投与」という用語は、化合物又は組成物が循環系を介して、医薬作用の標的部位を含む体内の部位に送達されるように、哺乳動物に化合物又は組成物を投与する方法を意味する。全身投与には、経口、鼻腔内、直腸および非経口の（すなわち、筋肉内、静脈内、動脈内、経皮および皮下などの消化管経由以外の）投与が含まれるが、これらに限定されない。ただし、本明細書で使用される場合、全身投与は、髄腔内注射および頭蓋内投与などの循環系経由以外の手段による脳領域への直接投与を含まない。

【0031】

本明細書で使用される「治療する」及び「治療」という用語は、その用語が適用される疾患もしくは状態、又はこのような疾患もしくは状態の１つ以上の症状のいずれかの発症を遅らせること、その進行を遅らせること又は逆転させること、又は緩和もしくは予防することを指す。

【0032】

「患者」、「対象」または「個体」という用語は、互換的に、哺乳類、例えば、ヒト、または霊長類（例えば、マカク、パントログロディート、ポンゴ）、家畜哺乳類（例えば、ネコ科動物、イヌ科動物）、農業用哺乳動物（例えば、ウシ科動物、ヒツジ科動物、ブタ、ウマ科動物）、および実験用哺乳動物またはげっ歯類（例えば、ラット、ネズミ、ラゴムノキ、ハムスター、モルモット）を含む非ヒト哺乳類を指す。

【0033】

本明細書で使用される場合、「室温」という用語は、約２２～２５℃を意味する。

【0034】

本発明は、リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子（Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓ）を提供する。

【0035】

特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子（Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓ）が、リガンド（Ｒ）と、硫化亜鉛コアとを含み、前記リガンドが、前記硫化亜鉛コアに結合している。前記リガンドが前記硫化亜鉛コアに結合していることとは、前記リガンドが共有結合、水素結合、静電気力、疎水性力（hydrophobic force）、ファンデルワールス力等によって前記硫化亜鉛コアと溶液中で安定しているナノ粒子を形成することを意味する。特定の実施形態では、前記硫化亜鉛コアの直径が、０．５～４．０ナノメートル（ｎｍ）である。特定の実施形態では、前記硫化亜鉛コアの直径が、１．０～３．５ｎｍの範囲にある。

【0036】

特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の前記リガンドが、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる一つである。

【0037】

特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の前記リガンドが、式（Ｉ）で示されるカプトプリルである（すなわち、１－［（Ｓ）－３－メルカプト－２－メチルプロピオニル］－Ｌ－プロリン）。

【0038】

本発明は、リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子（Ｒ－ＺｎＳ ＮＰ）の製造方法を提供する。

【0039】

特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子（Ｒ－ＺｎＳ ＮＰ）の製造方法が、

【0040】

リガンドを脱イオン水に溶解し、リガンド水溶液を得ること（特定の実施形態では、前記リガンド水溶液におけるリガンドの濃度が０．０２～２．０ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０２～０．２ｍｏｌ／Ｌである。）と、

【0041】

酢酸亜鉛溶液を前記リガンド水溶液に添加し、酢酸亜鉛／リガンド反応混合物を得ること（特定の実施形態では、前記酢酸亜鉛／リガンド反応混合物を室温で０．１～３時間、好ましくは０．３～１．５時間撹拌する。特定の実施形態では、酢酸亜鉛水溶液の濃度が０．０１～１．０ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０２～０．２ｍｏｌ／Ｌである。特定の実施形態では、リガンドと酢酸亜鉛とのモル比が１：１～１０：１の範囲内にあり、好ましくは１：１～５：１である。）と、

【0042】

前記酢酸亜鉛／リガンド反応混合物のｐＨを７～１０、好ましくは８～９の範囲に調整すること（特定の実施形態では、前記ｐＨ調整済の酢酸亜鉛／リガンド反応混合物を室温で０．３～５時間、好ましくは０．５～２時間撹拌する。特定の実施形態では、前記ｐＨ調整用の試薬が、水酸化ナトリウム溶液である。）と、

【0043】

硫化ナトリウム水溶液を前記ｐＨ調整済の酢酸亜鉛／リガンド反応混合物に滴下し、硫化ナトリウム／酢酸亜鉛／リガンド反応混合物を得ること（特定の実施形態では、前記硫化ナトリウム／酢酸亜鉛／リガンド反応混合物を室温で１～５時間、好ましくは１～３時間撹拌する。特定の実施形態では、添加された硫化ナトリウムと前記酢酸亜鉛／リガンド反応混合物における酢酸亜鉛とのモル比が０．１：１～５：１の範囲にあり、好ましくは０．２：１～２：１である。）と、

【0044】

前記硫化ナトリウム／酢酸亜鉛／リガンド反応混合物を所定の温度までに加熱し、そして、前記反応を所定の時間維持し、Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓを形成すること（特定の実施形態では、前記所定の温度が５０～１００℃、好ましくは５０～７０℃である。特定の実施形態では、前記所定の時間が１～５時間、好ましくは１～２時間である。）と、
を含む。

【0045】

特定の実施形態では、前記方法が、さらに、

【0046】

限外濾過チューブを用いた遠心分離により、前記Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓを精製すること（特定の実施形態では、前記遠心分離の条件が５０００～６０００ｒ／ｍｉｎ、５分間である。特定の実施形態では、前記限外濾過チューブの分子量カットオフが５ｋダルトンである。）と、

【0047】

前記限外濾過チューブの上部の液体を回収し、精製されたＲ－ＺｎＳ ＮＰｓを得ること（特定の実施形態では、前記分離されたＲ－ＺｎＳ ＮＰｓを超純水で、例えば、３回洗浄する。）と、

【0048】

前記精製されたＬ－ＺｎＳ ＮＰｓを凍結乾燥し、安定的なＬ－ＺｎＳ ＮＰｓの粉末を得ることと、
を含む。

【0049】

本発明は、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、過敏性Ｃ反応性タンパク質（Ｈｓ ＣＲＰ）、または腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）の過剰発現の状態を有する対象の治療のために使用される、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子（Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓ）を提供する。ここで、「過剰発現」とは、タンパク質レベルが生理的発現レベルよりも２０％以上高いことを意味する。前記治療は、Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓまたはＲ－ＺｎＳ ＮＰｓを含む組成物の投与である。前記治療は、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１β、Ｈｓ ＣＲＰ、またはＴＮＦαの過剰発現を少なくとも５０％、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％または１００％減少させることができ、ここで、「過剰発現」は、生理学的条件での発現レベルと過剰発現の条件での発現レベルの間の差として定義される。特定の実施形態では、過剰発現の状態は、真菌、細菌およびウイルスなどの微生物による感染によって誘導される。対象に病原微生物が感染すると、病原微生物はリポ多糖（ＬＰＳ）などの特定の物質を分泌し、サイトカインの過剰発現を誘発することになる。ＬＰＳは、内毒素とも呼ばれ、グラム陰性菌の外膜に存在する脂質と多糖類からなる大きな分子である。グラム陰性菌は、細菌の鑑別法であるグラム染色法に用いられるクリスタルバイオレット染色を保持しない細菌である。グラム陰性菌には、大腸菌（Escherichia coli、Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ステノトロホモナス属菌（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ブデロビブリオ属菌（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）、酢酸菌（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）、レジオネラ属菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、シアノバクテリア（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、スピロヘータ（ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）、緑色硫黄細菌（ｇｒｅｅｎ ｓｕｌｆｕｒ）、緑色非硫黄細菌（ｇｒｅｅｎ ｎｏｎ－ｓｕｌｆｕｒ ｂａｃｔｅｒｉａ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）が含まれる。特定の実施形態において、過剰発現の状態は、自己免疫疾患または癌を含む慢性炎症疾患によって誘導される。特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の前記リガンドが、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる一つである。特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の前記リガンドが、カプトプリルである。

【0050】

本発明は、リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子を含む組成物であって、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、過敏性Ｃ反応性タンパク質（Ｈｓ ＣＲＰ）、または腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）の過剰発現の状態を有する対象の治療のために使用される組成物を提供する。特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の前記リガンドが、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる一つである。特定の実施形態では、前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子の前記リガンドが、カプトプリルである。

【0051】

本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、緑内障における網膜神経節細胞変性（ＲＧＣＤ）、または筋炎・ミオパチー（ＭＭ）を有する対象の治療のための医薬組成物を提供する。

【0052】

特定の実施形態では、前記組成物が、上述した前記リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子（Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓ）と、薬理学的に許容される賦形剤とを含む。特定の実施形態では、前記賦形剤が、リン酸緩衝液、または生理食塩水である。

【0053】

本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、緑内障における網膜神経節細胞変性（ＲＧＣＤ）または筋炎・ミオパチー（ＭＭ）を有する対象の治療のために使用されるリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子（Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓ）を提供する。

【0054】

本発明は、上述したＲ－ＺｎＳ ＮＰｓのアルツハイマー病（ＡＤ）および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、緑内障における網膜神経節細胞変性（ＲＧＣＤ）または筋炎・ミオパチー（ＭＭ）を有する対象を治療するための使用、または上述したＲ－ＺｎＳ ＮＰｓを用いた、アルツハイマー病（ＡＤ）および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、緑内障における網膜神経節細胞変性（ＲＧＣＤ）または筋炎・ミオパチー（ＭＭ）を有する対象の治療方法を提供する。特定の実施形態では、前記治療方法は、対象に薬理学的に有効な量のＲ－ＺｎＳ ＮＰｓを投与することを含む。前記薬理学的に有効な量は、体内研究で通常の方法により決定されてもよい。特定の実施形態では、前記Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓの薬理学的に有効な量は、少なくとも０．００１ｍｇ／ｋｇ／日、０．００５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、０．１ｍｇ／ｋｇ／日、０．５ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日、２ｍｇ／ｋｇ／日、３ｍｇ／ｋｇ／日、４ｍｇ／ｋｇ／日、５ｍｇ／ｋｇ／日、６ｍｇ／ｋｇ／日、７ｍｇ／ｋｇ／日、８ｍｇ／ｋｇ／日、９ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日、５０ｍｇ／ｋｇ／日、６０ｍｇ／ｋｇ／日、７０ｍｇ／ｋｇ／日、８０ｍｇ／ｋｇ／日、１００ｍｇ／ｋｇ／日、２００ｍｇ／ｋｇ／日、３００ｍｇ／ｋｇ／日、４００ｍｇ／ｋｇ／日、５００ｍｇ／ｋｇ／日、６００ｍｇ／ｋｇ／日、７００ｍｇ／ｋｇ／日、８００ｍｇ／ｋｇ／日、９００ｍｇ／ｋｇ／日、または１０００ｍｇ／ｋｇ／日の用量である。

【0055】

特定の実施形態では、前記対象が、ヒトである。特定の実施形態では、前記対象が、犬などのペット動物である。

【0056】

以下の実施例は、本発明の原理を説明することのみを目的として提供され、それらは決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【0057】

実施例

【0058】

現在、Ａβ誘発細胞性ＡＤモデル及びＬＰＳ誘発細胞性炎症モデル、並びにＡＰＰ／ＰＳ１ダブルトランスジェニックＡＤマウスモデルが、実験モデルとして広く使用されている。

【0059】

実施例１．カプトプリル結合硫化亜鉛ナノ粒子（Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ）の製造

【0060】

（１）リガンドであるカプトプリル（４３．４６ ｍｇ）を脱イオン水（１０ ｍｌ）に溶解し、カプトプリル水溶液を得て、前記カプトプリル水溶液を反応フラスコに入れて、その後、前記カプトプリル水溶液に酢酸亜鉛溶液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ、１０ ｍＬ）をゆっくり添加し、カプトプリル／酢酸亜鉛反応混合物を得て、前記カプトプリル／酢酸亜鉛反応混合物を室温で０．５時間撹拌し、前記カプトプリル／酢酸亜鉛反応混合物におけるカプトプリルと酢酸亜鉛とのモル比が２：１であった。

【0061】

（２）新たに調製された水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ）を前記カプトプリル／酢酸亜鉛反応混合物に添加し、前記カプトプリル／酢酸亜鉛反応混合物のｐＨを９に調整し、ｐＨ調整済のカプトプリル／酢酸亜鉛反応混合物を得て、そして室温で１時間撹拌した。

【0062】

（３）ゆっくり硫化ナトリウム水溶液（０．００４ｍｏｌ／Ｌ、約１０ｍｌ）をｐＨ調整済のカプトプリル／酢酸亜鉛反応混合物に滴下し、硫化ナトリウム／カプトプリル／酢酸亜鉛反応混合物を得て、前記硫化ナトリウム／カプトプリル／酢酸亜鉛反応混合物を室温で１時間撹拌し、前記硫化ナトリウム／カプトプリル／酢酸亜鉛反応混合物における硫化ナトリウムと酢酸亜鉛とのモル比が０．４：１であった。

【0063】

（４）前記硫化ナトリウム／カプトプリル／酢酸亜鉛反応混合物を含む反応フラスコを６０℃オイルバスに移動し、そして２時間撹拌し、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓを形成した。

【0064】

（５）形成したＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓを分子量カットオフ５ｋの限外濾過チューブを用いた遠心分離により５０００～６０００ｒ／ｍｉｎで５分間分離し、その後分離したＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓを超純水で３回限外濾過洗浄し、精製されたＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓを得た。

【0065】

（６）前記精製されたＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓを凍結乾燥し、白色の安定しているＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰ粉末を得た。

【0066】

実施例２． Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの同定

【0067】

２．１．Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの粒子サイズ

【0068】

室温で、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓをエタノールと水との体積比１：１の混合物に懸濁させ、ＪＥＭ－２１００Ｆ透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ、日本）によりＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰsの粒子径を測定した。１００個のＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰsをＩｍａｇｅ Ｊでランダムにカウントして粒子サイズを算出した。

【0069】

図１Ａは、代表的な透過型電子顕微鏡写真であり、製造されたＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰsが良好な分散性を有したことを示す。図１Ｂは、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰsのサイズ分布を示し、それは主に０．５～４．０ナノメートル（ｎｍ）に分布した。

【0070】

２．２． Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰsの赤外スペクトル

【0071】

室温で、４０００～５００ｃｍ^－１の範囲におけるＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓおよびＣａｐの赤外スペクトルを、ドイツＢｒｕｋｅｒ ｖｅｒｔｅｘ ８０ｖ ＦＴＩＲを使用して測定した。凍結乾燥したサンプルは、ＭＩＲ－ＡＴＲモードで測定し、その結果を図１Ｃに示す。

【0072】

その結果によれば、リガンドＣａｐがＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの形成に関与した後、赤外線スペクトルにおける－ＳＨ伸縮振動特性ピーク（２５６６ｃｍ^－１）が消失し、ＣａｐがＺｎ－Ｓ結合を介してＺｎＳコアにグラフトすることに成功したことを明らかにした。

【0073】

２．３． Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓのＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）

【0074】

ＥＳＣＡＬＡＢ ２５０Ｘｉ ＸＰＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ， ＵＳＡ）を用いて、全ＸＰＳスペクトルおよびＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｚｎの単一元素スペクトルの元素組成、含有量および結合エネルギーを測定した。単一元素スペクトルのデータはＸＰＳ ＰＥＡＫで解析し、その結果を図１Ｄ、１Ｅ、および１Ｆに示す。

【0075】

図１ＤのＣ１ｓ、Ｏ１ｓ、Ｎ１ｓ、Ｓ２ｓ、Ｓ２ｐ、Ｚｎ２ｐの特性ピーク、および図１ＥのＺｎ２ｐ、図１ＦのＳ２ｐの高解像度ＸＰＳスペクトルは、Ｚｎ２ｐ_１／２、Ｚｎ２ｐ_３／２、Ｓ２ｐ_１／２及びＳ２ｐ_３／２の理論予測と非常に一致しており、ＺｎＳコアの存在とＺｎＳコアの表面にＣａｐがグラフト（結合）したことに成功したことを明らかにした。

【0076】

実施例３．Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓと他の２つのリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子との抗Ａβタンパク質線維化能の比較

【0077】

他の２つのリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子は、４－メルカプト酪酸（ＭＡ）結合硫化亜鉛ナノ粒子（ＭＡ－ＺｎＳ ＮＰｓ）およびジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）結合硫化亜鉛ナノ粒子（ＤＨＬＡ－ＺｎＳ ＮＰｓ）であった。これらの製造方法は、リガンドをそれぞれＭＡとＤＨＬＡに置き換えた以外は、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの製造方法と同様であった。それらのサイズの範囲もＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓのそれと一致した。

【0078】

３．１．ＴｈＴ蛍光分光法によるＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ、ＭＡ－ＺｎＳ ＮＰｓ及びＤＨＬＡ－ＺｎＳ ＮＰｓの抗タンパク質線維化能の比較

【0079】

米国Ｂｉｏ Ｔｅｋ社のＧｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｎｅｒｇｙ^ＴＭ ＭＸマイクロプレートリーダーを用いて、Ａβ４０の線維化の動態学的プロセスを研究した。４０μＭ Ａβ４０および５０μＭ ＴｈＴを含むＰＢＳ緩衝液を、黒い管壁および透明なガラス底板を有する９６ウェルプレートに加えた（最終濃度はそれぞれ２０μＭおよび２５μＭであった）。濃度の異なるＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰ、ＭＡ－ＺｎＳ ＮＰまたはＤＨＬＡ－ＺｎＳ ＮＰサンプルをそれぞれ最終濃度が０、１、５、１０、２０、５０ｐｐｍになるように同量加え、膜でシールした後、プレートを多機能読み取り装置（Ｓｙｎｇｙ ＴＭ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ ＭＸ）に置き、プレート読み取りプログラムを設定した。試験条件：走査型終点蛍光（scanning end-point fluorescence）、励起光波長を４４５ｎｍ、検出蛍光発光波長を４８５ｎｍとした。温度を３７℃に維持し、１０分毎の最後の１０秒間プレートを適度な強さで振とうし、４８５ｎｍの蛍光発光強度を６０時間連続測定した。ＴｈＴの蛍光強度をモニターすることで、異なるリガンドが結合した３種類の硫化亜鉛ナノ粒子がＡβ４０線維化の動態（kinetics）に及ぼす影響を反映させた。その結果は図２に示す。

【0080】

図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃはそれぞれ、濃度２０μＭのＡβ４０の線維化の動態に対する、異なる濃度のＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ、ＭＡ－ＺｎＳ ＮＰｓおよびＤＨＬＡ－ＺｎＳ ＮＰｓの効果を示している。その結果から、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓは優れた抗Ａβタンパク質線維化能を有し、５ｐｐｍという低濃度でＡβの線維化を完全に抑制した（ＴｈＴ蛍光の速度論的曲線（kinetic curve）が完全にフラットになった）ことがわかった。ＭＡ－ＺｎＳ ＮＰｓとＤＨＬＡ－ＺｎＳ ＮＰｓも一定のＡβ線維化抑制能力を示したが、５０ｐｐｍという高濃度でもＡβ線維化を完全に抑制することができなかった。３つのＴｈＴ蛍光の速度論的曲線を比較すると、１ｐｐｍのＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓのＡβ線維化抑制効果は、最終濃度５０ｐｐｍの他の２種類の硫化亜鉛ナノ粒子のそれに達するかそれを上回っており、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの抗タンパク質線維化能は他の２種類の硫化亜鉛ナノ粒子をはるかに上回ることが分かった。

【0081】

３．２．原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によるＡβ４０線維化の微視的形態に対するＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの効果の研究

【0082】

室温で、ＦａｓｔＳｃａｎ原子間力顕微鏡（Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ）を使用して、異なる濃度のＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの存在下で６０時間インキュベートした後のＡβ４０繊維の微視的形態を研究した。ＳｃａｎＡｓｙｓｔ ａｉｒモード、ＳＮＬ－１０ピンスキャンを採用し、画像解像度は５１２×５１２であった。

【0083】

図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの最終濃度がそれぞれ０、１、および５ｐｐｍであるときのＡＦＭ試験の結果を示している。

【0084】

反応系にＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ（０ｐｐｍ）が存在しない場合、多数のＡβ繊維が出現し、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの最終濃度が１ｐｐｍになると、Ａβの繊維状構造は小さな棒状の原繊維（プロトフィブリル）からなる集合体に変化し、そして、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの最終濃度が５ｐｐｍに達すると、反応系にＡβ繊維やフィブリル構造がほとんど存在しないことが確認された。これらの結果は、ＴｈＴ蛍光法で測定した線維化動態の結果と一致した。さらに、１ｐｐｍのＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓは良好なＡβ線維化抑制効果を示し、５ｐｐｍのＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓは完全抑制の効果を達成できたことがわかった。

【0085】

３．３．透過型電子顕微鏡

【0086】

透過型電子顕微鏡ＪＥＭ－２１００Ｆ（日本電子、日本）を用いて、Ａβ４０の形態変化を測定した。その結果を図３Ｄ、３Ｅ、および３Ｆに示す。この結果は、ＡＦＭの試験結果と一致した。

【0087】

実施例４．Ａβ誘発ＰＣ－１２細胞損傷のＡＤモデル試験

【0088】

ＰＣ－１２細胞は、Ｗｕｈａｎ Ｐｒｏｃｅｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ & Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から入手した。ＰＣ－１２細胞の細胞生存率を検出するために、ＣＣＫ８法（CCK8 method）を使用した。これらの細胞は、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを含むＤＭＥＭ培地で、温度３７℃、ＣＯ_２濃度５％の条件下で培養された。細胞が適当な数まで増殖した後、状態の良い細胞１００μＬを９６ウェルプレートに５×１０^４細胞・ｍＬ^－１の密度で接種し、２４時間培養した（ｎ＝６）。次に、細胞と共培養していた培地を全て除去し、９６ウェルプレートに異なる用量のＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ａβ４０またはそれらの混合物を添加し（１ウェルあたり１００μＬ）、さらに２２時間インキュベートした。その後、１０％ＣＣＫ－８を含むＤＭＥＭ溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定し、その結果を図４に示す。

【0089】

図４Ａは、ＰＣ－１２細胞の生存率に対する、異なる濃度のＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの効果を示している。Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの最終濃度が１００ｐｐｍに達したとき、細胞生存率は依然として９２％以上を維持し、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓが細胞レベルで良好な安全性を有することを示す。図４Ｂは、Ａβ４０（最終濃度２５μＭ）存在下での、ＰＣ－１２細胞の細胞生存率に対する異なる濃度のＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの効果を示している。Ａβ４０はＰＣ－１２細胞の生存率を著しく低下させたが（１００％から６８．５±５．２％）、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの添加により細胞生存率は著しく回復し、この効果はＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの濃度の上昇とともに著しく増大した。Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの最終濃度が１００ｐｐｍに達すると、細胞生存率は９０％以上まで回復した。これらの結果は、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓがＡβ４０によって誘発されたＰＣ－１２細胞の損傷を有意に低減できることを示し、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの神経保護効果を実証した。

【0090】

実施例５．ＬＰＳ誘発細胞炎症実験

【0091】

試験薬：Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｌ－Ｃｙｓ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｄ－Ｃｙｓ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｄ－ＮＩＢＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｌ－ＮＡＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ、およびＤ－ＮＡＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ。

【0092】

ヒトアストログリア（ＨＡ）細胞は、Ｗｕｈａｎ Ｐｒｏｃｅｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ & Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から入手した。細胞培養液は、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを含むＤＭＥＭ培地であった。細胞培養器の培養温度は３７℃、ＣＯ_２濃度は５％であった。状態の良いＨＡ細胞を６ウェルプレートに２．４×１０^８細胞／ｍＬで接種し、培養した。ブランク対照群、ＬＰＳ傷害モデル対照群、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ（最終濃度１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ又は２０ｐｐｍ）の試験群の４つの群（ｎ=４）、Ｃａｐ対照群（Ｃａｐの最終濃度は２０ｐｐｍ）の１つの群（ｎ=４）、合計７つの群とした。２４時間培養後、前処理のために、ＤＭＥＭ最小培地とＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰまたはＣａｐを添加し、２時間後にＬＰＳ（最終濃度５ｐｐｍ）を添加した。さらに２４時間培養した後、培養液と細胞を回収し、ＥＬＩＳＡキットを用いて、細胞培養液中の炎症因子（ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１β、ｈｓ－ＣＲＰ、ＴＮＦ－α）のタンパク質発現量を検出した。具体的な方法は以下の通りである：特定の濃度に希釈した標準液およびサンプル希釈液を１００μＬとり、９６ウェルプレートに添加した。３７℃で９０分間インキュベートした後、ウェル内の液体を除去し、ビオチン化抗体ワーキングソリューション１００μＬを加えて１時間インキュベートした後、プレートを洗浄した。酵素結合体ワーキングソリューション１００μＬで０．５時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、発色試薬（ＴＭＢ）９０μＬを加えて暗所で１５分間インキュベートし、停止液５０μＬで反応を停止させた。マイクロプレートリーダーは、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。

【0093】

Ｌ－Ｃｙｓ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｄ－Ｃｙｓ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｄ－ＮＩＢＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｌ－ＮＡＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ、およびＤ－ＮＡＣ－ＺｎＳ ＮＰｓを用いて同様の実験を実施した。

【0094】

図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄおよび５Ｅはそれぞれ、５つの炎症性因子ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１β、ｈｓ－ＣＲＰおよびＴＮＦ－αのタンパク質発現量を示している。ＬＰＳによって５つの炎症因子が大幅に増加し（ブランク対照群と比較して、Ｐはすべて０．００１未満、＃＃）、モデルの確立に成功したことがわかった。Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの添加は、５つの炎症因子の増加を有意に抑制し（ＬＰＳモデル対照群と比較して、Ｐはすべて０．０５未満、＊、０．０１未満、＊＊、または０．００１未満、＊＊＊）、濃度の上昇とともに、この効果は明らかな増大傾向を示す。Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの濃度が１００ｐｐｍに達すると、５つの炎症因子のレベルはほぼ正常な対照群と同様のレベルまで低下した。しかし、Ｃａｐ対照群の炎症因子のレベルは、ＬＰＳモデル対照群に比べ、有意に低下することはなかった。以上の結果から、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓは、細胞実験において優れた抗炎症作用を示すことがわかった。

【0095】

Ｌ－Ｃｙｓ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｄ－Ｃｙｓ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｄ－ＮＩＢＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｌ－ＮＡＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ、およびＤ－ＮＡＣ－ＺｎＳ ＮＰｓもＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓと同様に優れた抗炎症作用を示したので、簡潔のために、詳細な説明は省略する。

【0096】

実施例６．マウスにおける急性毒性、組織分布及び代謝試験

【0097】

６．１．試験方法

【0098】

（１）マウスの維持管理

【0099】

６～８週齢、体重２５～３０ｋｇの清潔な昆明マウス４２匹（雄・雌各２１匹）を、毎日１２時間明:１２時間暗の明暗条件のある普通のケージに収容した。マウスは餌と水へ自由にアクセスできた。雄と雌のマウスを無作為に選択し、実験のために１～６群（７匹／群）に分けた。

【0100】

（２）組織処理

【0101】

マウスに対する急性毒性試験には、群１と群２を使用した。群１を薬物試験群とし、群２をブランク対照群とした。薬物試験群には、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ薬剤を１００ｍｇ／Ｋｇマウス体重で腹腔内注射し、ブランク対照群には、同量の通常の生理食塩水を注射した。マウスは２４時間後に犠牲死させた。通常の生理食塩水で灌流後、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳を解剖し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した動物組織を包埋箱に入れ、流水で３０分間洗浄し、組織中のパラホルムアルデヒドを除去した。組織をアルコール勾配で脱水し、キシレンで透明になるようにした。透明な組織をパラフィンワックスとキシレンの１：１の混合液に９０分間浸漬し、パラフィンワックスに２時間置き、すぐに冷却させた。パラフィンミクロトームを用いて組織の５μｍの連続スライスを作製し、スライスを６０℃で２時間ベークした。スライスをキシレンに５分間浸漬して脱パラフィンを行い、これを３回繰り返した。その後、スライスを勾配エタノール（１００％、９０％、８０％、７０％）に各５分間浸漬し、水道水の流水で５分間リンスした。ヘマトキシリン染色液で切片を５分間染色した後、スライド上の余分な染色液を水道水で洗浄し、０．７％塩酸とエタノールで１０秒間色分離し、顕微鏡で核と核クロマチンがはっきりするまで水道水でスライドをリンスした。７０％および９０％のエタノールで１０分間脱水後、０．５％エオシン溶液で５分間染色し、余分な染料溶液を流水でリンスした。染色した切片を７０％、８０％、９０％、及び１００％エタノールで１０秒間脱水し、キシレンに１分間浸漬して組織を透明化した後、換気した場所で自然乾燥させた。中性ガムを適量加え、スライドにマウントした。この病理スライスを光学顕微鏡で観察・撮影し、各スライスについてランダムに２視野を選択し、全組織を分析した。

【0102】

群３から群６は、薬物の組織分布を調べるために使用された。各群にＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓを２０ｍｇ／Ｋｇマウス体重の量で腹腔内注射し、２、６、１２、または２４時間後に犠牲死させた。解剖後、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳を直ちに液体窒素に入れ、凍結乾燥させた。５日後、取り出し、均一な粉末に粉砕した。組織粉末２ｍｇを秤量し、濃硝酸と過酸化水素の混合溶液（体積比５：１）で消化し、誘導結合プラズマ発光分光法で心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓および脳中のＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの含有量を測定した。

【0103】

６．２．試験結果

【0104】

急性毒性試験の結果、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓはマウスの目、皮膚、粘膜、および２４時間以内の呼吸、食物摂取、運動、排泄に影響を与えないことが判明した。さらに病理検査を行ったところ、図６に示すように、ブランク対照群（上）と比較して、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ試験群のマウスの心臓、肝臓、脾臓、肺、脳組織などの主要臓器は正常に配置されており、炎症細胞の浸潤は認められなかった。以上の研究から、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓは正常な組織や臓器に対して明らかな毒性や副作用を起こさず、生物学的安全性が良好であることがわかった。

【0105】

図７は、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓および脳の組織におけるＣａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの含有量を示している。その結果、各臓器における薬物の含有量は、約６時間で最大となり、その後、時間の経過とともに徐々に減少していることが確認された。また、脳内でもかなりの量の薬物が観察され、薬物が血液脳関門を通過して脳内に入ることが示された。

【0106】

実施例７．ＡＰＰ／ＰＳ１ダブルトランスジェニックのＡＤモデルマウスを用いた試験

【0107】

７．１．試験方法

【0108】

試験薬：Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｌ－Ｃｙｓ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｄ－Ｃｙｓ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｄ－ＮＩＢＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｌ－ＮＡＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ、Ｄ－ＮＡＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ、ＭＡ－ＺｎＳ ＮＰおよびＤＨＬＡ－ＺｎＳ ＮＰ。

【0109】

試験マウスとしては、６０週齢のＣ５７ＢＬ／６生殖細胞系ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックＡＤモデルマウスを用いた。このモデルマウスをモデル対照群、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群、Ｌ－Ｃｙｓ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群、Ｄ－Ｃｙｓ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群、Ｄ－ＮＩＢＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群、Ｌ－ＮＡＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群、Ｄ－ＮＡＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群、ＭＡ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群とＤＨＬＡ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群にランダムに分けた。同時に、同齢のＣ５７ＢＬ／６野生型マウス群を正常対照群として設定した。各群に１５匹のマウスがあった。各投与群には、対応する薬剤の生理食塩液を１日１回腹腔内注射し、投与量は２０ｍｇ／Ｋｇマウス体重とし、注射量は１００μＬとした。モデル対照群および正常対照群のマウスには、同量の生理的食塩水を腹腔内注射した。

【0110】

４週間の連続投与後、モリス水迷路試験により、全動物の認知・記憶機能を解析した。

【0111】

場所ナビゲーションテスト：モリス水迷路試験システムは、水迷路と自動映像記録・解析システムで構成されている。カメラは水迷路の上方に配置され、コンピュータに接続されている。水迷路は、直径１２０ｃｍ、高さ６０ｃｍの円形プールと、直径９ｃｍのプラットフォームで構成されている。液面はプラットフォームより０．５ｃｍ高く、水温は２２±０．５℃に保たれた。白色顔料を使い、水を乳白色に染めた。水迷路でのマウスの学習・記憶能力を測定するために、５日間にわたる場所ナビゲーションテストが行われた。水迷路はＮ、Ｓ、Ｗ、Ｅの４象限に分けられ、プラットフォームは固定の象限に配置された。プラットフォームの位置は、実験中に固定された。訓練では、毎日、頭をプールの壁に向けたマウスを、異なる象限の１／２弧から外壁に近い水中に静かに入れた。マウスが隠れたプラットフォームに登った時間を記録するか、６０秒に達した時点で試験を中止した。６０秒以内にプラットフォームが見つからない場合は、実験者がマウスを誘導し、３０秒間留まらせた。試験中、マウスがプラットフォームを探すまでの潜伏時間をカメラトラッキングシステムで記録した。試験終了後、各動物を取り出し、ヘアードライヤーで静かに乾燥させた。各動物は、１日に４回、トレーニングの間に２０分の間隔を空けて、５日間連続してトレーニングされた。

【0112】

空間探索テスト：５日目のトレーニング終了後、６日目にプラットフォームを取り外し、マウスをプールの壁に向けながらプラットフォームの最遠位点から水中に静かに入れた。各マウスの６０秒以内の移動軌跡をカメラで記録し、マウスがプラットフォームを横切った回数、目標象限での滞在時間、目標象限での遊泳時間をソフトウェアで解析した。

【0113】

【0114】

行動試験後、マウスに７％抱水クロラールを腹腔内注射して麻酔し、心臓灌流接続を確立した後、通常の生理食塩水を７分間急速に流し、４％抱水クロラールを使用して７分間組織を固定した。灌流終了後、脳組織を慎重に採取し、４％灌流液に入れ、後の使用のために室温で保存した。海馬と大脳皮質におけるＡβ４０と炎症因子の発現を検出するために、免疫組織化学的方法を用いた：灌流した組織を脱水して透明にし、ワックスで包埋し、パラフィンミクロトームを用いて切片化した。脱ワックスには、キシレンと無水エタノールの勾配を使用した。マイクロ波による抗原回収後、スライスを酸化水素でインキュベートし、血清で３０分間ブロッキングした。Ａβ４０、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＧＦＡＰ、ＩＬ－６、またはＣＯＸ－２に対する一次抗体（１：１００）を室温で添加し、４℃で一晩（１５時間）インキュベートした。一次抗体を捨て、スライスをＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ／マウス二次抗体とし、室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳでスライスを洗浄後、発色試薬ＤＡＢ発色液を加えて発色させ、ハリスヘマトキシリン対比染色、脱水、マウントした。撮影には蛍光顕微鏡を使用し、スライスの定量解析にはＩｍａｇｅ Ｊを使用した。

【0115】

２．試験結果

【0116】

図８は、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ、ＭＡ－ＺｎＳ ＮＰｓ及びＤＨＬＡ－ＺｎＳ ＮＰｓを４週間連続して毎日投与した後の、モリス水迷路における雄マウスの成績に及ぼす影響を示す。場所ナビゲーションテスト（図８Ａ）の訓練過程において、正常対照群（●）と比較して、訓練２日目から５日目まで、モデル対照群（■）のマウスの潜伏期間は、正常マウスよりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５、＃；Ｐ＜０．０１、＃）。モデル対照群に比べ、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群（△）はマウスの潜伏期間を大幅に短縮でき、３日目以降モデル対照群との有意差が認められた（３日目、４日目、５日目のＰ値はいずれも０．０５未満、＊）。しかし、ＭＡ－ＺｎＳ ＮＰｓ（□）投与群およびＤＨＬＡ－ＺｎＳ ＮＰｓ（○）投与群は潜伏期間の短縮に有意な効果は認められなかった。

【0117】

空間探索テストの結果（図８Ｂ～Ｄ）、正常対照群と比較して、モデル対照群では、プラットフォームの横断回数（図８Ｂ）（Ｐ＜０．０５、＃）、目標象限での遊泳時間（図８Ｃ）（＃）、目標象限での滞在時間（図８Ｄ）（Ｐ＜０．０５、＃）が有意に減少したことが確認された。モデル対照群と比較して、ＭＡ－ＺｎＳ ＮＰｓおよびＤＨＬＡ－ＺｎＳ ＮＰｓはマウスのプラットフォーム横断回数を増加させることができず（図８Ｂ）、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群ではプラットフォーム横断回数が明らかに増加したが、統計的差はなかった（Ｐ＞０．０５）。

【0118】

目標象限遊泳時間および目標象限滞在時間（図８Ｃおよび図８Ｄ）について、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ薬剤はこれら２つの値を有意に増加させたが（Ｐは０．０５未満、＊）、ＭＡ－ＺｎＳ ＮＰｓおよびＤＨＬＡ－ＺｎＳ ＮＰｓはいずれもこれら２つの値を増加させることができなかった。

【0119】

上記のデータは、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ薬剤がＡＤモデルマウスの認知能力および記憶能力を有意に改善し得るが、ＭＡ－ＺｎＳ ＮＰｓおよびＤＨＬＡ－ＺｎＳ ＮＰｓはそのような効果を有しないことを示している。

【0120】

Ｌ－Ｃｙｓ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群、Ｄ－Ｃｙｓ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群、Ｄ－ＮＩＢＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群、Ｌ－ＮＡＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群、Ｄ－ＮＡＣ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群の効果は、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群と同様である。簡潔にするために、本明細書では、これらの詳細な説明は省略する。

【0121】

図９は、免疫組織化学の結果の代表的な写真である。図９に示すように、野生型マウスの海馬には、Ａβ４０プラークが認められず、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α及びＧＦＡＰを含む顕著な炎症因子の発現も認められなかった。正常対照群の野生型マウスと比較すると、モデル対照群の海馬では、多数のＡβ４０プラークが認められ、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α及びＧＦＡＰの発現も認められた。また、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群の海馬では、Ａβ４０プラークが少量であり、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＧＦＡＰの発現は軽微であり、正常対照群に近い状態であった。また、統計解析の結果、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ投与群の海馬におけるＡβ４０プラーク数はモデル対照群に比べ７１．８％減少し、統計学的に有意差があり（Ｐ<０．０１）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＧＦＡＰの発現は７０％を超えて減少した（Ｐ<０．０１）。以上のことから、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓの投与により、ＡＤモデルマウスの脳内のＡβプラークを有意に減少させ、ＡＤモデルマウスの中枢性炎症を大幅に抑制することができ、これにより、神経細胞障害が軽減され、ＡＤが治癒されることを判明した。これらの試験に使用されたＡＤモデルマウスは６０週齢の老齢マウスであり、投与サイクルも４週間と短いため、このような良好な効果が得られることは、Ｃａｐ－ＺｎＳ ＮＰｓ医薬品がＡＤ治療において優れた応用性を有することを示している。

【0122】

本発明に記載のＲ－ＺｎＳ ＮＰｓは、簡便な製造方法と良好な生体適合性という特徴を有する。

【0123】

本発明によって提供されるＲ－ＺｎＳ ＮＰｓは、以下の利点を有する：

【0124】

第１に、Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓは、他のリガンド（４－メルカプト酪酸（ＭＡ）およびジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）など）結合ＺｎＳ ＮＰｓよりも、Ａβの線維化を阻害する効果が著しく高く、５ｐｐｍという超低用量のＲ－ＺｎＳ－ＮＰｓは、２０μＭの濃度でＡβの線維化を完全に阻害することができる。

【0125】

第２に、Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓは、ＬＰＳ処理したＨＡ細胞における炎症性因子（ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－８およびｈｓ－ＣＲＰ）の発現を大幅に低減することができる。

【0126】

第３に、Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓは、Ａβ誘発細胞損傷モデル実験において、Ａβ線維化による細胞毒性を有意に減少させた。

【0127】

第４に、Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓは、ＡＰＰ／ＰＳ１ダブルトランスジェニックＡＤモデルマウス試験において、ＡＤモデルマウスの海馬におけるＡβプラークを有意に減少させ、ＡＤモデルマウスの脳における神経炎症性因子のレベルを有意に減少させた。ＡＰＰ／ＰＳ１ダブルトランスジェニックＡＤモデルマウス試験において、Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓは、モデルマウスの認知および記憶行動障害を有意に改善した。

【0128】

第５に、Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓは、血液脳関門を通過し、マウスの脳に入ることができる。

【0129】

第６に、Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓは、動物レベルで生物学的安全性を有する。

【0130】

Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｌ－ＮＩＢＣ、Ｄ－ＮＩＢＣ、Ｌ－ＮＡＣまたはＤ－ＮＡＣをリガンドとするリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子は、上記と同様のプロトコルに従って合成、特性評価、および試験されており、炎症性サイトカインの発現を低減し、Ａβ線維化を阻害し、ＡＤなどのＡβ関連疾患を治療する上で同様の効果が示された。簡潔さのために、本明細書においてそれらの詳細な説明は省略する。

【0131】

本発明を特定の実施形態を参照して説明したが、実施形態は例示であり、本発明の範囲はそれほど限定されないことが理解される。本発明の代替的な実施形態は、本発明が関係する技術分野における通常の技術を有する者に明らかになる。そのような代替の実施形態は、本発明の範囲内に包含されると考えられる。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義され、前述の説明によって支持される。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【手続補正書】

【提出日】2023-11-22

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

硫化亜鉛コアと、前記硫化亜鉛コアに結合したリガンドとを含む、リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子。

【請求項2】

前記硫化亜鉛コアの直径が、０．５～４．０ｎｍである、請求項１記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子。

【請求項3】

前記硫化亜鉛コアの直径が、１．０～３．５ｎｍである、請求項１記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子。

【請求項4】

前記リガンドは、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる一つである、請求項１記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子。

【請求項5】

前記リガンドは、カプトプリルである、請求項１記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子。

【請求項6】

リガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子（Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓ）の製造方法であって、
リガンド水溶液におけるリガンドの濃度が０．０２～２．０ｍｏｌ／Ｌとなるように、リガンドを脱イオン水に溶解し、リガンド水溶液を得るステップと、
酢酸亜鉛溶液を前記リガンド水溶液に添加し、酢酸亜鉛／リガンド反応混合物を得るステップであって、酢酸亜鉛水溶液の濃度が０．０１～１．０ｍｏｌ／Ｌであり、リガンドと酢酸亜鉛とのモル比が１：１～１０：１の範囲内にあるステップと、
前記酢酸亜鉛／リガンド反応混合物のｐＨを７～１０の範囲に調整するステップと、
添加された硫化ナトリウムと前記酢酸亜鉛／リガンド反応混合物における酢酸亜鉛とのモル比が０．１：１～５：１の範囲にあるように、硫化ナトリウム水溶液を前記ｐＨ調整済の酢酸亜鉛／リガンド反応混合物に滴下し、硫化ナトリウム／酢酸亜鉛／リガンド反応混合物を得るステップと、
前記硫化ナトリウム／酢酸亜鉛／リガンド反応混合物を所定の温度までに加熱し、そして、前記反応を所定の時間維持し、Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓを形成するステップであって、前記所定の温度は、５０～１００℃であり、前記所定の時間は、１～５時間であるステップと、
を含む、方法。

【請求項7】

前記方法は、さらに、
限外濾過チューブを用いた遠心分離により、前記Ｒ－ＺｎＳ ＮＰｓを精製するステップであって、前記限外濾過チューブの分子量カットオフが５ｋダルトンであるステップを含み、請求項６記載の方法。

【請求項8】

アルツハイマー病（ＡＤ）および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、緑内障における網膜神経節細胞変性（ＲＧＣＤ）または筋炎・ミオパチー（ＭＭ）を有する対象の治療のための、請求項１～５のいずれか１項に記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子。

【請求項9】

請求項１～５のいずれか１項に記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子を含み、アルツハイマー病（ＡＤ）および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、緑内障における網膜神経節細胞変性（ＲＧＣＤ）または筋炎・ミオパチー（ＭＭ）を有する対象の治療のために使用される、組成物。

【請求項10】

インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、過敏性Ｃ反応性タンパク質（Ｈｓ ＣＲＰ）、または腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）の過剰発現の状態を有する対象の治療のための、請求項１～５のいずれか１項に記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子。

【請求項11】

請求項１～５のいずれか１項に記載のリガンド結合硫化亜鉛ナノ粒子を含み、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、過敏性Ｃ反応性タンパク質（Ｈｓ ＣＲＰ）、または腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）の過剰発現の状態を有する対象の治療のために使用される、組成物。

【国際調査報告】