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特表2024-512691ＦＡＳ関連因子１（ＦＡＦ１）内包エクソソームおよび抗癌剤としてのその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-19
(54)【発明の名称】ＦＡＳ関連因子１（ＦＡＦ１）内包エクソソームおよび抗癌剤としてのその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 38/16 20060101AFI20240312BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240312BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20240312BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240312BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240312BHJP
A61K 35/22 20150101ALI20240312BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240312BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240312BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20240312BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240312BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240312BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20240312BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240312BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20240312BHJP
A61P 11/04 20060101ALI20240312BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20240312BHJP
A61P 13/10 20060101ALI20240312BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240312BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20240312BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240312BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20240312BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240312BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240312BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240312BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240312BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240312BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240312BHJP
【ＦＩ】
A61K38/16
A61K45/00
A61K35/15
A61K35/17
A61K35/12
A61K35/22
A61K48/00
A61P35/00
A61P1/02
A61P1/04
A61P1/16
A61P1/18
A61P11/00
A61P11/02
A61P11/04
A61P13/08
A61P13/10
A61P13/12
A61P15/00
A61P17/00
A61P19/08
A61P21/00
A61P25/00
A61P35/02
A61P43/00 105
C07K14/705 ZNA
C12N5/10
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023560455
(86)(22)【出願日】2022-03-30
(85)【翻訳文提出日】2023-11-20
(86)【国際出願番号】 KR2022004475
(87)【国際公開番号】W WO2022211473
(87)【国際公開日】2022-10-06
(31)【優先権主張番号】10-2021-0040990
(32)【優先日】2021-03-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516142104
【氏名又は名称】カイノス・メディスン・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＫＡＩＮＯＳ ＭＥＤＩＣＩＮＥ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】キム，ウンヒ
(72)【発明者】
【氏名】ハン，ジョンフン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA13
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA53
4C084DC50
4C084MA41
4C084MA52
4C084MA56
4C084MA60
4C084MA66
4C084NA05
4C084ZA011
4C084ZA021
4C084ZA341
4C084ZA591
4C084ZA661
4C084ZA671
4C084ZA751
4C084ZA811
4C084ZA891
4C084ZA941
4C084ZA961
4C084ZB211
4C084ZB261
4C084ZB271
4C084ZC412
4C087BB37
4C087BB40
4C087BB64
4C087CA04
4C087CA12
4C087MA41
4C087MA52
4C087MA56
4C087MA60
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZA02
4C087ZA34
4C087ZA59
4C087ZA66
4C087ZA67
4C087ZA75
4C087ZA81
4C087ZA89
4C087ZA94
4C087ZA96
4C087ZB21
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA15
(57)【要約】
本発明は、ｆａｓ関連因子１（ＦＡＦ１）タンパク質内包エクソソームおよびその癌治療用途に関する。本発明者らは、既知の癌抑制機能を有するＦＡＦ１が過剰発現されているＨＥＫ２９３細胞からＦＡＦ１タンパク質内包エクソソームを単離し、このＦＡＦ１タンパク質内包エクソソームを、膵臓癌細胞（ＭＩＡ ＰａＣａ－２）、肺癌細胞（Ａ５４９）、大腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ)、乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、腎臓癌細胞（Ｃａｋｉ－１）および子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ細胞）をヌードマウスに腫瘍内注射して移植した腫瘍モデルマウスに投与したところ、ＦＡＦ１で処置していない対照群よりも顕著な腫瘍増殖抑制効果が確認されたことから、本発明のＦＡＦ１内包エクソソームは、種々の癌の治療薬として用い得ることを見出した。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｆａｓ関連因子１（ＦＡＦ１）タンパク質を内包するエクソソームを有効成分として含む、癌を処置するための医薬組成物。
【請求項2】
ＦＡＦ１タンパク質が配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
エクソソームが５０～２００ｎｍの直径を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
エクソソームに内包されたＦＡＦ１タンパク質が、他の細胞の腫瘍形成を抑制する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項5】
癌が、子宮頸癌、膵臓癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、腎臓癌、大腸癌、頭頸部扁平上皮癌、膀胱癌、前立腺癌、胃癌、子宮内膜癌、脳腫瘍、卵巣癌、睾丸癌、頭部癌、頸部癌、皮膚癌、中皮内膜癌、食道癌、副腎癌、甲状腺癌、骨腫瘍、神経膠芽腫、中皮腫、肉腫、絨毛癌、皮膚基底細胞癌、精巣セミノーマ、白血病または悪性リンパ腫である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項6】
ＦＡＦ１の発現が癌において減少している、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項7】
組成物のエクソソームが、ＦＡＦ１を標的腫瘍細胞に送達する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項8】
組成物が、経口投与、気管支内吸入、あるいは腹腔内、直腸内、皮下、静脈内、筋肉内、胸腔内または腫瘍内注射により投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項9】
組成物が単独で、または他の治療剤と同時および逐次的に投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項10】
配列番号１のＦＡＦ１がエクソソームに内包されている、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項11】
ＦＡＦ１タンパク質を内包するエクソソームを製造する方法であって、１）ＦＡＦ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して形質転換細胞を得る工程；
２）前記形質転換細胞を培養する工程；および、
３）前記細胞からエクソソームを分離する工程
を含む、方法。
【請求項12】
工程１）における細胞が、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、樹状細胞、巨核球、マクロファージ、幹細胞および腫瘍細胞、ならびにヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞からなる群より選択されるいずれか１以上の細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
癌治療薬のスクリーニング方法であって、１）ＦＡＦ１の発現が低下した癌細胞を試験物質で処理する工程；
２）工程１）の細胞から単離したエクソソーム中のＦＡＦ１タンパク質のレベルを測定する工程；および、
３）試験物質で処理しない対照群と比較して、工程２）のＦＡＦ１タンパク質のレベルが増加する試験物質を選択する工程
を含む、方法。
【請求項14】
細胞が、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＨＣＴ １１６細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｃａｋｉ－１細胞、Ａ５４９細胞またはＨｅＬａ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
ＦＡＦ１の発現が低下した個体にＦＡＦ１タンパク質を内包したエクソソームを投与することを含む、癌を処置する方法。
【請求項16】
ＦＡＦ１タンパク質内包エクソソームの、癌治療薬の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本発明は、ＦＡＳ関連因子１（ＦＡＦ１）内包エクソソーム、および抗癌剤としてのその使用に関する。
本発明は、ＦＡＳ関連因子１（ＦＡＦ１）内包エクソソーム、および抗癌剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
背景技術
腫瘍とは、異常な細胞の無秩序な過剰増殖の産物であり、そのような腫瘍が破壊的な増殖性、浸潤性および転移性を有するとき、その腫瘍は悪性腫瘍、すなわち癌に分類される。癌関連死は韓国の死因の第１位であり、先進国では最も重要な死因の１つである。これまで、癌を処置するために、１９５０年代までは外科療法、１９６０年代は放射線療法、そして１９７０年代は抗癌剤治療が開発され、用いられてきた。１９８０年代に入り、免疫学および分子生物学を中心とした基礎科学の飛躍的な発展により、免疫療法および遺伝子治療が台頭し始め、現在も多くの研究が行われているが、既存の治療法として画期的な進歩を遂げるにはまだ不十分である。
腫瘍とは、異常な細胞の無秩序な過剰増殖の産物であり、そのような腫瘍が破壊的な増殖性、浸潤性および転移性を有するとき、その腫瘍は悪性腫瘍、すなわち癌に分類される。癌関連死は韓国の死因の第１位であり、先進国では最も重要な死因の１つである。これまで、癌を処置するために、１９５０年代までは外科療法、１９６０年代は放射線療法、そして１９７０年代は抗癌剤治療が開発され、用いられてきた。１９８０年代に入り、免疫学および分子生物学を中心とした基礎科学の飛躍的な発展により、免疫療法および遺伝子治療が台頭し始め、現在も多くの研究が行われているが、既存の治療法として画期的な進歩を遂げるにはまだ不十分である。
【0003】
Ｆａｓ（Ｆａｓ受容体、ＣＤ９５、Ａｐｏ１またはＴＮＦＲＳＦ６としても知られる）は、細胞死受容体（death receptor）の中で最も細胞を殺す能力の高い受容体であり、ＦａｓおよびＦａｓリガンド（Ｆａｓ Ｌ）はアポトーシスに重要な役割を果たしている。３つのＦａｓリガンドが３つのＦａｓ分子に結合すると、Ｆａｓ関連細胞死ドメイン（ＦＡＤＤ）と称されるアダプタータンパク質がＦａｓの細胞死ドメイン（ＤＤ）に結合する。次いで、ＦＡＤＤのデスエフェクタードメイン（ＤＥＤ）が不活性型カスパーゼ－８（ＦＬＩＣＥまたはＭＡＣＨとも呼ばれる）のデスエフェクタードメイン（ＤＥＤ）と結合すると、カスパーゼ－８が活性化され、これらのＦａｓ、ＦＡＤＤ、およびカスパーゼ－８が、Ｆａｓ細胞死誘導性シグナル伝達複合体（Ｆａｓ－ＤＩＳＣ）を形成し、最終的に細胞死を引き起こすエフェクターカスパーゼを活性化して細胞死を誘導する。
【0004】
Ｆａｓ関連因子１（ＦＡＦ１）はＦａｓ経路に関連するタンパク質であり、マウス（Chu et al., 1995；Becker et al., 1997）、ウズラ（Frohlich et al., 1998）およびヒト（Ryu et al., 1999）で見出だされた。これらは互いに高いアミノ酸相同性を有し、マウスのＦＡＦ１は６４９アミノ酸で構成され、ウズラのＦＡＦ１は６４８アミノ酸で構成され、ヒトのＦＡＦ１は６５０アミノ酸で構成されている。
【0005】
ＦＡＦ１に関するこれまでの研究では、ＦＡＦ１にはアポトーシスを誘導する能力があり、誘導の最小領域はＦＡＦ１の１８１－３８１アミノ酸領域であることが判明している。ＦＡＦ１はＦａｓ－ＤＩＳＣのメンバーであり、ＤＩＳＣはカスパーゼ－８およびＦＡＤＤのＤＥＤと、ＤＥＤと構造的に類似しているＦＡＦ１の１８１－３８１アミノ酸領域が相互作用することで形成されることが分かっている（Ryu and Kim, 2003）。
【0006】
肺癌、大腸癌、肝臓癌、前立腺癌、脳腫瘍、乳癌など種々の癌でＦＡＦ１の発現量が低下することが報告されており（Feng et al., 2017）、ＦＡＦ１タンパク質は腫瘍抑制因子として注目されており、ＦＡＦ１はＮＦ－ｋＢ阻害を介して腫瘍を抑制し、ＴＧＦ－βシグナルを介して腫瘍転移を抑制することが知られている（Park et al., 2004； Park et al., 2007）。さらに、ＦＡＦ１はオーロラＡ阻害を介して腫瘍の細胞周期をＧ２／Ｍ期に停止させることにより、腫瘍の増殖を阻害することが知られている（Jang et al., 2008）。韓国特許公開第１０－２００４－０１０１７０７号明細書には、ＦＡＦ１の特定領域のフラゲメントが血管新生および管形成、および細胞増殖を阻害する活性を有し、腫瘍抑制剤として使用できることが開示されている。
【0007】
細胞外小胞が最初に発見されたのは５０年前のことで、それ以来、試験されたすべての生体液中に小胞が存在することが判明し、試験管内で細胞株が様々な種類の小胞を放出することが知られている。細胞外小胞のうち、エクソソームはリン脂質二重層からなり、大きさが５０～２００ｎｍの小胞で、細胞内で産生されて細胞外に分泌され、恒常性維持に重要な核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、タンパク質および脂質などの特定のレパートリーを細胞内に送達することで、細胞間コミュニケーションに重要な役割を果たしていることがわかっている。例えば、エクソソームは、神経伝達、抗原提示、免疫反応、臓器発達、生殖能力などの基本的な生理学的プロセスに関与しており、また、癌の進行、心血管疾患、炎症およびプリオン感染を含むいくつかの病理学的疾患にも関与している。
【0008】
エクソソームが最初に発見されたのは、赤血球が成熟する最終段階で細胞内のタンパク質を放出および除去し、赤血球内にヘモグロビンだけを残す過程であった。これらのエクソソームは、細胞膜から直接分離されるのではなく、多胞体（ＭＶＢ）と呼ばれる細胞内の特定の構成要素（コンパートメント）に由来して細胞外空間に放出および分泌されることが、電子顕微鏡を用いた研究で観察された。すなわち、多胞体が細胞膜と融合すると、そのような小胞は細胞外環境に放出され、これをエクソソームと称する。
【0009】
エクソソームがどのような分子メカニズムで作製されるのかについて多くの研究が行われており、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、樹状細胞、巨核球、マクロファージなど種々の免疫細胞、および幹細胞、腫瘍細胞などがエクソソームを産生および分泌することが知られている。エクソソームの産生は、輸送に必要なエンドソーム選別複合体（ＥＳＣＲＴ）に依存する、あるいは依存しないことが報告されているが、正確なメカニズムを決定することは難しい。
【0010】
関連技術として、韓国特許公開第２００４－００１５５０８号明細書には、特定の抗原の遺伝子を細胞株に導入し、導入した遺伝子のタンパク質を細胞株内で安定に発現させ、エクソソームを通じて細胞外空間に放出させる方法、および該エクソソームをワクチンとして使用する方法が開示されている。さらに、韓国特許第１０－２０５３０６５号は、ヒアルロン酸およびドキソルビシンを用いたｐＨ感受性エクソソーム組成物に関し、ドキソルビシンならびにヒアルロン酸および３－ジエチルアミノプロピルアミンを化学的に結合させた高分子物質を用いたｐＨ感受性エクソソームの調製方法、および該エクソソームの癌細胞死滅効果を開示している。さらに、韓国特許公開第１０－２０１８－００７８１７３号は、新規のエクソソームを用いた抗癌剤に関し、その表面に貪食促進タンパク質である受容体チロシンキナーゼおよびＳＩＲＰが提示される組換えエクソソーム、および抗癌タンパク質である、アスパラギナーゼ、タンパク質毒素、癌抗原に特異的な抗体またはそのフラグメント、癌抑制遺伝子または抗血管新生因子などを含む組換えエクソソームが開示されている。また、韓国特許出願第１０－２０１９－００５９７２４号では、ＦＡＦ１がエクソソームに内包され、細胞外腔に分泌されることを確認した上で、神経変性疾患の治療薬候補をスクリーニングする方法が開示されているが、癌細胞に関する研究結果は報告されていない。
【0011】
エクソソームを用いることで、細胞外環境からカーゴ物質が保護され、半減期が長くなり、要すれば標的細胞内に入る。しかしながら、すべてのタンパク質がカーゴ物質としてエクソソームに内包されるわけではなく、エクソソームに内包されたとしても、内包されたカーゴ物質がすべての細胞に入るわけではない。また、大きなサイズの高分子タンパク質をエクソソーム内に内包することは技術的に困難であり、内包するためにタンパク質を操作したとき、内包したタンパク質の効果が著しく劣る可能性がある。ＦＡＦ１が神経細胞内で自発的にエクソソームに内包されることは報告されているが、エクソソームに内包されたＦＡＦ１が細胞内に入って正常に機能するかどうかは細胞の種類によって異なり、実験によって検証しなければならないという限界がある。したがって、エクソソームを用いたＦＡＦ１送達が癌細胞で適切に機能することが確認され、ＦＡＦ１内包エクソソームの大量生産が可能になれば、ＦＡＦ１内包エクソソームは種々の癌の腫瘍抑制剤として適用可能であり得る。
【0012】
従って、本発明者らは、腫瘍抑制機能として知られるＦＡＦ１をエクソソームに内包させて種々の腫瘍に送達し、エクソソームに内包されたＦＡＦ１が腫瘍を抑制できるかどうかを判定するために、ＦＡＦ１が過剰発現された細胞からエクソソームを単離し、単離されたエクソソーム中にＦＡＦ１が自発的に内包されているかどうかを確認し、単離されたＦＡＦ１が内包されたエクソソームで癌細胞を処置したところ、コロニー形成が抑制されたことを確認し、ＦＡＦ１タンパク質が内包されたエクソソームを癌細胞が移植された種々のマウス癌モデルに投与したとき、組換え型ＦＡＦ１タンパク質で処置した群を含む他の対照群と比較して有意に腫瘍増殖が阻害される効果を確認して、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
発明の開示
技術的課題
本発明の目的は、ＦＡＦ１タンパク質を内包したエクソソームを有効成分として含有する、癌を処置するための医薬組成物を提供することである。
技術的課題
本発明の目的は、ＦＡＦ１タンパク質を内包したエクソソームを有効成分として含有する、癌を処置するための医薬組成物を提供することである。
【0014】
本発明のもう一つの目的は、ＦＡＦ１タンパク質を内包したエクソソームを製造する方法を提供することである。
【0015】
本発明のさらに別の目的は、ＦＡＦ１の発現を低下させた癌治療薬をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0016】
課題解決
上記の目的を達成するために、本発明は、ＦＡＦ１タンパク質を内包するエクソソームを有効成分として含む癌の処置のための医薬組成物を提供する。
上記の目的を達成するために、本発明は、ＦＡＦ１タンパク質を内包するエクソソームを有効成分として含む癌の処置のための医薬組成物を提供する。
【0017】
さらに、本発明は、１）ＦＡＦ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して形質転換細胞を得る工程；２）形質転換細胞を培養する工程；および、３）培養細胞からエクソソームを単離する工程を含む、ＦＡＦ１タンパク質を内包したエクソソームを製造する方法を提供する。
【0018】
さらに、本発明は、１）ＦＡＦ１の発現が低下した癌細胞を試験物質で処理する工程；２）工程１）で細胞から単離したエクソソーム中のＦＡＦ１タンパク質のレベルを測定する工程；および、３）工程２）のＦＡＦ１タンパク質のレベルが、試験物質で処理しない対照群と比較して増加する試験物質を選択する工程を含む、癌治療薬をスクリーニングする方法を提供する。
【発明の効果】
【0019】
発明の有利な効果
本発明は、Ｆａｓ関連因子１（ＦＡＦ１）タンパク質内包エクソソームおよびその癌治療用途に関する。本発明者らは、腫瘍抑制機能を有することが知られているＦＡＦ１が過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞からＦＡＦ１タンパク質内包エクソソームを単離し、このＦＡＦ１タンパク質内包エクソソームを腫瘍モデルに投与し、膵臓癌細胞（ＭＩＡ ＰａＣａ－２）、肺癌細胞（Ａ５４９）、大腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ)、乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、腎臓癌細胞（Ｃａｋｉ－１）および子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ細胞）をヌードマウスに移植し、腫瘍内注射により投与したところ、ＦＡＦ１を投与していない対照群と比較して有意な腫瘍増殖抑制効果が確認されたことから、本発明のＦＡＦ１内包エクソソームは、種々の癌の治療薬として用いられ得る。
本発明は、Ｆａｓ関連因子１（ＦＡＦ１）タンパク質内包エクソソームおよびその癌治療用途に関する。本発明者らは、腫瘍抑制機能を有することが知られているＦＡＦ１が過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞からＦＡＦ１タンパク質内包エクソソームを単離し、このＦＡＦ１タンパク質内包エクソソームを腫瘍モデルに投与し、膵臓癌細胞（ＭＩＡ ＰａＣａ－２）、肺癌細胞（Ａ５４９）、大腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ)、乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、腎臓癌細胞（Ｃａｋｉ－１）および子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ細胞）をヌードマウスに移植し、腫瘍内注射により投与したところ、ＦＡＦ１を投与していない対照群と比較して有意な腫瘍増殖抑制効果が確認されたことから、本発明のＦＡＦ１内包エクソソームは、種々の癌の治療薬として用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図5】図５ａは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームでＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞を処理したときの、コロニー形成阻害効果を示す写真である。図５ｂは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離されたエクソソームでＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞を処理したときの、コロニー数を示すグラフである。
【図6】図６ａは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームでＡ５４９細胞を処理したときの、コロニー形成阻害効果を示す写真である。図６ｂは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームでＡ５４９細胞を処理したときの、コロニー数を示すグラフである。
【図7】図７ａは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームでＨＣＴ１１６細胞を処理したときの、コロニー形成阻害効果を示す写真である。図７ｂは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離されたエクソソームでＨＣＴ １１６細胞を処理したときの、コロニー数を示すグラフである。
【図8】図８ａは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームでＨｅｐ３Ｂ細胞を処理したときの、コロニー形成阻害効果を示す写真である。図８ｂは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離されたエクソソームでＨｅｐ３Ｂ細胞を処理したときの、コロニー数を示すグラフである。
【図9】図９ａは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームでＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を処理したときの、コロニー形成阻害効果を示す写真である。図９ｂは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームでＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を処理したときの、コロニー数を示すグラフである。
【図10】図１０ａは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームでＨｅＬａ細胞を処理したときの、コロニー形成阻害効果を示す写真である。図１０ｂは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離されたエクソソームでＨｅＬａ細胞を処理したときの、コロニー数を示すグラフである。
【図11】図１１ａは、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞を異種移植したヌードマウスに、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。図１１ｂは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍体積を示すグラフである。図１１ｃは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍の写真である。図１１ｄは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍重量を示すグラフである。図１１ｅは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍組織の細胞形態の変化を示す写真である。
【図12】図１２ａは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、Ａ５４９細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。図１２ｂは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、Ａ５４９細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍体積を示すグラフである。図１２ｃは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、Ａ５４９細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍の写真である。図１２ｄは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、Ａ５４９細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍重量を示すグラフである。図１２ｅは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、Ａ５４９細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍組織の細胞形態の変化を示す写真である。
【図13】図１３ａは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＨＣＴ１１６細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。図１３ｂは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＨＣＴ１１６細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍体積を示すグラフである。図１３ｃは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＨＣＴ１１６細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍の写真である。図１３ｄは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＨＣＴ１１６細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍重量を示すグラフである。図１３ｅは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＨＣＴ１１６細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍組織の細胞形態の変化を示す写真である。
【図14】図１４ａは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を異種移植したヌードマウスに、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。図１４ｂは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍体積を示すグラフである。図１４ｃは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を異種移植したヌードマウスに、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍の写真である。図１４ｄは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を異種移植したヌードマウスに、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍重量を示すグラフである。図１４ｅは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を異種移植したヌードマウスに、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍組織の細胞形態の変化を示す写真である。
【図15】図１５ａは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、組み換えＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。図１５ｂは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍体積を示すグラフである。図１５ｃは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍の写真である。図１５ｄは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍重量を示すグラフである。図１５ｅは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群における腫瘍組織の細胞形態の変化を示す写真である。
【図16】図１６ａは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、Ｃａｋｉ－１細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。図１６ｂは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、Ｃａｋｉ－１細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍体積を示すグラフである。図１６ｃは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、Ｃａｋｉ－１細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍の写真である。図１６ｄは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、Ｃａｋｉ－１細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍重量を示すグラフである。図１６ｅは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、Ｃａｋｉ－１細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍組織の細胞形態の変化を示す写真である。
【図17】図１７ａは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＨｅＬａ細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。図１７ｂは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＨｅＬａ細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、腫瘍徐核直前のＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍体積を示すグラフである。図１７ｃは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＨｅＬａ細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍の写真である。図１７ｄは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＨｅＬａ細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍重量を示すグラフである。図１７ｅは、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＨｅＬａ細胞を異種移植したヌードマウスに投与したときの、ＭＯＣＫ群、リコンビナントＦＡＦ１タンパク質群、ＥＸＯ－ＣＯＮ群およびＥＸＯ－ＦＡＦ１群の腫瘍組織の細胞形態の変化を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
発明を実施するための最良の方法
以下、本発明を詳細に説明する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【0022】
本発明は、ＦＡＦ１タンパク質を内包するエクソソームを有効成分として含有する、癌の処置のための医薬組成物を提供する。
【0023】
本発明のＦＡＦ１タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む。
【0024】
本発明のＦＡＦ１は、Ｆａｓ細胞死誘導シグナル複合体（Ｆａｓ－ＤＩＳＣ）を構成し、アポトーシスを誘導する。ＦＡＦ１は、いくつかの経路を活性化し、アポトーシスを促進するタンパク質として知られている。
【0025】
ＦＡＦ１は、ＪＮＫ依存性のミトコンドリア機能障害による細胞壊死を介し、オーロラＡを負に制御することで細胞周期のＧ２／Ｍ期を抑制することで細胞増殖に関与し、ユビキチン化タンパク質およびバロシン含有タンパク質（ＶＣＰ）と結合することでユビキチン－プロテアソーム経路に関与し、タンパク質の分解を制御し、不要なＦＡＦ１はパーキンを介してユビキチン化され、そしてプロテアソーム経路で分解される。
【0026】
さらにＦＡＦ１は、アポトーシス、炎症、細胞増殖およびタンパク質の恒常性維持など、種々の生化学的プロセスに関与している。ＦＡＦ１は腫瘍抑制因子であり、ＮＦ－κＢ阻害を介して腫瘍を抑制する役割を果たし、またＴＧＦ－βシグナルを介して腫瘍転移を抑制する。
【0027】
本発明のエクソソームは、細胞から分泌される２層のリン脂質膜からなる小胞であり、細胞間でシグナル伝達を行い、疾患特異的な核酸およびタンパク質を形成して体液中に放出することが知られており、恒常性維持に重要な核酸、タンパク質および脂質の特異的なレパートリーの細胞間伝達を通じて、細胞間コミュニケーションに重要な役割を果たしている。例えば、エクソソームは、神経伝達、抗原提示、免疫反応、臓器発達および生殖能力などの基本的な生理学的プロセスに関与しており、また、癌の進行、心血管系疾患、炎症およびプリオン感染などのいくつかの病理学的疾患にも関与している。
【0028】
エクソソームは、管腔内小胞（ＩＬＶ）を含む多胞体（ＭＶＢ）として知られる後期エンドソームが細胞膜と融合した後、細胞外環境に分泌される。多胞体は細胞膜と融合してＩＬＶを放出し、多胞体はリソソームと融合して内容物を分解する。エクソソーム中に存在する物質は、細胞質物質の組成とは類似しておらず、エクソソームは要すればＲＮＡおよびタンパク質を含んでいてもよい。
【0029】
エクソソームの産生は、輸送に必要なエンドソーム選別複合体（ＥＳＣＲＴ）に依存する、または依存しないことが報告されているが、正確なメカニズムを決定することは難しい。細胞はシグナルペプチドが存在するタンパク質を、小胞体－ゴルジ体複合体を介して分泌する。シグナルペプチドが存在するタンパク質を含む小胞は、細胞膜に向かって移動し、細胞膜と融合し、そしてタンパク質を細胞外に放出する。しかしながら、シグナルペプチドを有しないタンパク質は、非古典的な分泌経路を経由して分泌されることもある。シグナルペプチドを有しないタンパク質が分泌されるとき、タンパク質は小胞の不存在下または存在下で分泌され、小胞以外の分泌経路の正確なメカニズムは不明であるが、膜孔およびＡＴＰ結合カセットトランスポーターを介して分泌されるタンパク質もある。小胞分泌はエクソソームを含む細胞外小胞を介して行われ、種々の大きさの小胞を介して行われる。
【0030】
エクソソームの平均直径は５０ｎｍ～３００ｎｍであるが、本発明はこれに限定されない。
【0031】
エクソソームは、ほとんどの細胞タイプから放出されるナノサイズの細胞外小胞であり、低分子ＲＮＡ、脂質およびタンパク質を含む。これらの利点には、天然バリアを克服する能力、固有の細胞標的化特性、改善された透過性、維持効果および生体適合性などが含まれる。生物学的情報を伝達するという本来の機能に基づいて、治療薬としてのエクソソームの応用が注目されている。
【0032】
前記癌は、ＦＡＦ１の発現が低下している癌である。
【0033】
該癌としては、子宮頸癌、膵臓癌、肝臓癌、肺癌（小細胞肺癌および非小細胞癌を含む）、乳癌、腎臓癌、大腸癌、頭頸部扁平上皮癌、膀胱癌、前立腺癌、胃癌、子宮内膜癌、脳腫瘍、卵巣癌、精巣癌、頭部癌、頸部癌、皮膚癌（メラノーマおよび基底癌を含む）、中皮内膜癌、食道癌、副腎癌、甲状腺癌、骨腫瘍、神経膠芽腫、中皮腫、肉腫、絨毛癌、皮膚基底細胞癌、精巣セミノーマ、白血病および悪性リンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様では、癌は、膵臓癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、肝臓癌、トリプルネガティブ乳癌、腎臓癌または子宮頸癌である。
【0034】
本発明の医薬組成物は、医薬製剤に一般的に用いられる担体、希釈剤、賦形剤、またはそれらの混合物を含んでいてもよい。組成物を生体内に送達するのに適したものであれば、薬学的に許容される担体を使用してもよい。具体的には、担体は、Merck Index, 13th ed. Merck & Co. Inc.に記載されている化合物、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、ブドウ糖液、マルトデキストリン液、グリセロール、エタノール、またはこれらの混合物であり得る。さらに、要すれば、酸化防止剤、緩衝剤および静菌剤などの代表的な添加剤を加えてもよい。
【0035】
医薬組成物を製剤する際には、一般的に使用され得る充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤および界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を添加できる。
【0036】
本発明の医薬組成物は、経口剤または非経腸剤に製剤され得る。経口剤としては、固形剤および液剤が挙げられる。固形製剤は、錠剤、丸薬、粉末、顆粒、カプセルまたはトローチであってもよく、また固形製剤は、組成物に少なくとも１つの賦形剤を添加することによって調製されてもよい。賦形剤は、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンまたはそれらの混合物であってもよい。さらに、固形製剤は、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、およびタルクを含んでいてもよい。一方、液体製剤は、懸濁液、溶液、エマルジョン剤またはシロップのいずれでもよい。この場合、液体製剤は、湿潤剤、甘味料、香料および保存料などの賦形剤を含んでいてもよい。
【0037】
非経腸製剤としては、注射剤、坐剤、呼吸吸入用粉末、スプレーエアゾール、粉末、クリームなどを挙げることができる。注射剤には、滅菌水溶液、非水溶性溶媒、懸濁化剤、乳化剤などが含まれていてもよい。この場合、非水溶性溶媒または懸濁化剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、またはオレイン酸エチル等の注射用エステル等を用いることができる。
【0038】
本発明の医薬組成物は、所望の方法に従って経口的または非経腸的に投与できる。非経腸投与には、気管支内吸入、腹腔内、直腸内、皮下、静脈内、筋肉内、胸腔内または腫瘍内注射の方法が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、本発明の医薬組成物は、腫瘍内注射法によって投与できる。
【0039】
医薬組成物は、薬学的に有効な量で投与できる。これは、疾患の種類、重症度、薬剤の活性、患者の薬剤に対する感受性、投与時間、投与経路、処置期間、同時に使用する薬剤などによって異なっていてよい。しかしながら、所望の効果を得るためには、本発明の医薬組成物に含まれる有効成分の量は、０．０００１～１，０００ｍｇ／ｋｇ、特に、０．００１～５００ｍｇ／ｋｇであり得る。投与は１日１回から数回行うことができる。
【0040】
本発明の医薬組成物は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与できる。併用投与の場合、投与は逐次または同時に行うことができる。
【0041】
さらに、本発明は、ＦＡＦ１タンパク質を内包したエクソソームを製造する方法であって、
１）ＦＡＦ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して形質転換細胞を得る工程；
２）前記形質転換細胞を培養する工程；および、
３）前記細胞からエクソソームを分離する工程
を含む、方法を提供する。
１）ＦＡＦ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して形質転換細胞を得る工程；
２）前記形質転換細胞を培養する工程；および、
３）前記細胞からエクソソームを分離する工程
を含む、方法を提供する。
【0042】
工程１）における細胞は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、樹状細胞、巨核球、マクロファージ、幹細胞、腫瘍細胞、およびＨＥＫ２９３細胞からなる群より選択されるいずれか１以上の細胞であるが、これに限定されない。好ましい態様では、細胞はＨＥＫ２９３細胞またはＨｅＬａ細胞である。
【0043】
形質導入は、５×１０６～７×１０６個の細胞を５～１０μｇの３×Ｆｌａｇ－ＦＡＦ１プラスミドで処理し、細胞を培養することにより行うことができ、好ましくは、６．５ ×１０６個の細胞を８μｇの３×Ｆｌａｇ－ＦＡＦ１プラスミドで処理し、細胞を培養する。
【0044】
エクソソームは、エクソソームを単離するために当技術分野で一般的に用いられている方法によって単離できる。サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、示差遠心分離、限外濾過、タンジェンシャルフロー濾過、エクソソーム沈殿、全エクソソーム単離キット、免疫吸着剤捕捉、アフィニティー法、例えば、アフィニティー捕捉、アフィニティー精製、イムノアッセイ、マイクロ流体分離、またはこれらの組み合わせが、エクソソームを単離するために実施され得る。
【0045】
本発明の具体的な態様によれば、培養液を回収し、３００×ｇで１０分間、２，０００ｇで１０分間および１０，０００ｇで３０分間遠心分離して上清を分離し、上清を０．２μｍのフィルターで濾過し、超遠心機を用いて１５０，０００×ｇで７０分間遠心分離する。遠心した上清を除去し、ＰＢＳを加えてペレットを洗浄した後、再び１５０，０００×ｇで７０分間遠心して上清を除去し、下層に残ったエクソソームを単離する。
【0046】
単離されたエクソソームは－２０℃および－８０℃で保存できる。
【0047】
本明細書で用いる用語“形質転換”とは、元の細胞とは異なる外来遺伝子を有するＤＮＡ鎖フラグメントまたはプラスミドなどが細胞内に侵入し、元の細胞内に存在するＤＮＡと結合することにより、細胞の遺伝的性質を変化させる分子生物学的手法である。
【0048】
ＦＡＦ１内包エクソソームは、その中にＦＡＦ１タンパク質を含み、ＦＡＦ１タンパク質を癌細胞または組織に輸送する担体として機能する。
【0049】
ＦＡＦ１タンパク質はエクソソームを介して細胞外に分泌される。
【0050】
細胞外に分泌されたＦＡＦ１タンパク質は、他の細胞においてアポトーシスを誘導し得る。
【0051】
アポトーシスは、多細胞生物で起こり得る一種のプログラムされた細胞死である。アポトーシスは、細胞形態の変化および細胞内の生化学的変化によって細胞死を引き起こす。このプロセスは、細胞の膨潤および亀裂、細胞膜の変化、クロマチンの凝縮および染色体の切断、ならびに食細胞に貪食されることで終了する。
【0052】
急性の細胞傷害によって引き起こされる細胞死であるネクローシスとは対照的に、アポトーシスは生物に害を与えず、そのライフサイクルに利点をもたらす。ヒト胚の分化過程で手足の指が形成されるのは、アポトーシスの代表例である。さらにアポトーシスは、細胞の入れ替わり、組織のリモデリングおよび損傷細胞の除去において重要なメカニズムである。
【0053】
アポトーシスは２つの場合に生じ、１つは発生および分化の過程で不要な部分を除去するため、もう１つは細胞が深刻なダメージを受け、癌化する可能性がある場合に他の細胞を保護するためである。しかしながら、アポトーシスの過程で問題を有する細胞は癌細胞となり、癌細胞は死滅することなく、分裂を繰り返しながら徐々に増殖し成長していく。
【0054】
本明細書で用いる用語“培養”とは、適切に人工的に制御された環境条件下で細胞または微生物を増殖させる方法を意味する。本発明において、形質転換体を培養する方法は、当技術分野において広く知られている方法を用いて行うことができる。
【0055】
培地とは、動物細胞の培養に用いられる公知の培地を意味し、市販の無血清培地、無タンパク培地および化学的に定義された培地の群から選択できる。
【0056】
さらに、本発明は癌治療薬をスクリーニングする方法であって、
１）ＦＡＦ１の発現が低下した癌細胞を試験物質で処理する工程；
２）工程１）の細胞から単離したエクソソーム中のＦＡＦ１タンパク質のレベルを測定する工程；および、
３）試験物質で処理しない対照群と比較して、工程２）のＦＡＦ１タンパク質のレベルが増加する試験物質を選択する工程
を含む、方法を提供する。
１）ＦＡＦ１の発現が低下した癌細胞を試験物質で処理する工程；
２）工程１）の細胞から単離したエクソソーム中のＦＡＦ１タンパク質のレベルを測定する工程；および、
３）試験物質で処理しない対照群と比較して、工程２）のＦＡＦ１タンパク質のレベルが増加する試験物質を選択する工程
を含む、方法を提供する。
【0057】
本方法において、工程１）の細胞は特に限定されないが、好ましい局面では、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞、Ａ５４９細胞、ＨＣＴ １１６細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、Ｃａｋｉ－１細胞またはＨｅＬａ細胞である。
【0058】
本方法において、工程１）の試験物質とは、ＦＡＦ１の発現を増加させる物質を意味し、ペプチド、タンパク質、非ペプチド化合物、合成化合物、発酵産物、細胞抽出物、植物抽出物、および動物組織抽出物からなる群より選択されるいずれか１つであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0059】
本発明で用いる候補物質を選択するためのマーカーとして、ＦＡＦ１タンパク質のレベルは、当技術分野で公知の方法を用いて測定できる。例えば、タンパク質を特異的に検出する抗体は市販されており、ウエスタンブロット、共免疫沈降法、免疫蛍光法、酵素結合免疫吸着測定法等を用いてタンパク質を検出するために用いられ得る。かかる抗体を用いることにより、特定のタンパク質の発現レベルを特異的に確認できるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0060】
試験物質を投与していない対照群と比較して、特定のタンパク質の発現量が増加していれば、癌治療薬の候補物質として選択できる。
【0061】
まず、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ ２９３細胞およびＨｅＬａ細胞のエクソソーム中のＦＡＦ１量の増加を通じて、ＨＥＫ ２９３細胞およびＨｅＬａ細胞でＦＡＦ１を過剰発現させると、エクソソーム中に含まれるＦＡＦ１量が増加し、エクソソームを介してＦＡＦ１を分泌できることが確認された（図１～図４参照）。アポトーシス促進因子であるＦＡＦ１は、腫瘍形成を阻害するタンパク質である。従って、ＦＡＦ１を過剰発現するＨＥＫ ２９３細胞から単離したエクソソームに腫瘍形成抑制効果があるかどうかを確認するために、ＭＩＡ ＰａＣａ－２、Ａ５４９、ＨＣＴ １１６、Ｈｅｐ３Ｂ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１またはＨｅＬａ細胞を用いて腫瘍形成抑制試験を行ったところ、ＦＡＦ１を過剰発現しているＨＥＫ ２９３細胞から単離したエクソソームを処理したとき、ＦＡＦ１を過剰発現していないＨＥＫ ２９３細胞から単離したエクソソームを処理した場合に比べて、形成されるコロニー数が少ないことが確認された（図５ａ、５ｂ、６ａ、６ｂ、７ａ、７ｂ、８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、１０ａおよび１０ｂ参照)。また、ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ ２９３細胞から単離したエクソソームを、ＭＩＡ ＰａＣａ－２、Ａ５４９、ＨＣＴ １１６、Ｈｅｐ３Ｂ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｃａｋｉ－１またはＨｅＬａ細胞を異種移植したヌードマウスに腫瘍内注入することにより、ＦＡＦ１を内包したエクソソームの場合の腫瘍の体積および重量が減少することが確認され、ＦＡＦ１の処理により細胞のネクローシスが生じることが確認された（図１１ａ～１１ｅ、図１２ａ～１２ｅ、図１３ａ～１３ｅ、図１４ａ～１４ｅ、図１５ａ～１５ｅ、図１６ａ～１６ｅ、図１７ａ～１７ｅ参照)。上記の結果は、内包されたＦＡＦ１がエクソソームを介して細胞外空間に分泌され、ＦＡＦ１内包エクソソームが標的の癌細胞に適切に送達され、ＦＡＦ１が腫瘍を効果的に抑制できることを示し、ＦＡＦ１内包エクソソームは癌治療剤として使用可能である。
【0062】
以下、本発明を下記の実施例により詳細に説明する。
【0063】
ただし、以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【0064】
＜実施例１＞ ＦＡＦ１を過剰発現するＨＥＫ ２９３細胞からのエクソソームの単離
＜１－１＞細胞培養
ヒト胚性腎臓由来の細胞株であるＨＥＫ ２９３細胞は、抗生物質、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Atlas Biologicals, USA）および抗生物質－抗マイコプラズマ剤（ペニシリン／ストレプトマイシン、GIBCOBRL, USA）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、WelGENE, Korea）中で、５％ＣＯ２および３７℃の条件下で２日に１回継代培養しながら維持した。
＜１－１＞細胞培養
ヒト胚性腎臓由来の細胞株であるＨＥＫ ２９３細胞は、抗生物質、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Atlas Biologicals, USA）および抗生物質－抗マイコプラズマ剤（ペニシリン／ストレプトマイシン、GIBCOBRL, USA）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、WelGENE, Korea）中で、５％ＣＯ２および３７℃の条件下で２日に１回継代培養しながら維持した。
【0065】
＜１－２＞細胞内形質導入
ＦＡＦ１を細胞内で過剰発現させるために、３ｘ Ｆｌａｇタグ－ＦＡＦ１プラスミド（８μｇ）を６．５×１０６細胞に導入した。
具体的には、細胞を１５０ｍｍの培養皿に播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ２および３７℃の条件下で２４時間培養した。３ｘＦｌａｇタグ－ＦＡＦ１を、以前から知られている方法（Yu et al., 2016）で調製した。ＦＢＳおよび抗生物質を含まないＤＭＥＭを用いて、ＤＮＡ：ＢｉｏＴ（Bioland scientific, USA）＝１：１．５の割合で合計１８０μＬの混合液を調製し、室温で５分間反応させた。２４時間培養した細胞に該混合液を添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間反応させた。
ＦＡＦ１を細胞内で過剰発現させるために、３ｘ Ｆｌａｇタグ－ＦＡＦ１プラスミド（８μｇ）を６．５×１０６細胞に導入した。
具体的には、細胞を１５０ｍｍの培養皿に播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ２および３７℃の条件下で２４時間培養した。３ｘＦｌａｇタグ－ＦＡＦ１を、以前から知られている方法（Yu et al., 2016）で調製した。ＦＢＳおよび抗生物質を含まないＤＭＥＭを用いて、ＤＮＡ：ＢｉｏＴ（Bioland scientific, USA）＝１：１．５の割合で合計１８０μＬの混合液を調製し、室温で５分間反応させた。２４時間培養した細胞に該混合液を添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間反応させた。
【0066】
＜１－３＞エクソソームの単離
＜１－３－１＞Exo-quick-TC （商標）を用いたエクソソームの単離
Exo-quick-TC （商標） (System Biosciences, USA)を用いて、３ｘ Ｆｌａｇタグ－ＦＡＦ１プラスミドを導入した細胞からエクソソームを単離した。
具体的には、導入２４時間後、１０％エクソソーム除去ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（System Biosciences, USA）で処理し、４８時間培養した。培養細胞の培地を回収し、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心して上清を回収し、そこから細胞残屑を除去した。回収した培地（１０ｍＬ）をExo-quickバッファー２ｍＬで処理し、振盪し、培地：Exo-quickバッファー＝５：１になるようによく混合した。４℃で一晩培養した後、培地を１，５００ｇで３０分間遠心する操作を２回繰り返してエクソソームを得た。
＜１－３－１＞Exo-quick-TC （商標）を用いたエクソソームの単離
Exo-quick-TC （商標） (System Biosciences, USA)を用いて、３ｘ Ｆｌａｇタグ－ＦＡＦ１プラスミドを導入した細胞からエクソソームを単離した。
具体的には、導入２４時間後、１０％エクソソーム除去ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（System Biosciences, USA）で処理し、４８時間培養した。培養細胞の培地を回収し、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心して上清を回収し、そこから細胞残屑を除去した。回収した培地（１０ｍＬ）をExo-quickバッファー２ｍＬで処理し、振盪し、培地：Exo-quickバッファー＝５：１になるようによく混合した。４℃で一晩培養した後、培地を１，５００ｇで３０分間遠心する操作を２回繰り返してエクソソームを得た。
【0067】
＜１－３－２＞超遠心機を用いたエクソソームの単離
超遠心機（optima XE-100, BECKMAN Coulter, USA)を用いて、３ｘ Ｆｌａｇタグ－ＦＡＦ１プラスミドを導入した細胞からエクソソームを単離した。
具体的には、導入から２４時間後、ＦＢＳおよび抗生物質を含まないＤＭＥＭで細胞を処理し、再び２４時間培養した。培養細胞の培地を回収し、３００ｇで１０分間、２，０００ｇで１０分間および１０，０００ｇで３０分間遠心分離して上清を分離し、上清を０．２μｍのシリンジフィルター（BioFACT、Korea）でろ過した。
超遠心機（optima XE-100, BECKMAN Coulter, USA)を用いて、３ｘ Ｆｌａｇタグ－ＦＡＦ１プラスミドを導入した細胞からエクソソームを単離した。
具体的には、導入から２４時間後、ＦＢＳおよび抗生物質を含まないＤＭＥＭで細胞を処理し、再び２４時間培養した。培養細胞の培地を回収し、３００ｇで１０分間、２，０００ｇで１０分間および１０，０００ｇで３０分間遠心分離して上清を分離し、上清を０．２μｍのシリンジフィルター（BioFACT、Korea）でろ過した。
【0068】
インビトロおよびインビボ実験に用いるエクソソームを単離するために、BECKMAN Coulter optima XE-100超遠心機で４５Ｔｉローターを用いて１５０．０００ｇで７０分間遠心し、上清を捨て、ペレットをＰＢＳで洗浄した。洗浄したＰＢＳを再度１５０．０００ｇで７０分間遠心し、その後上清を捨て、残りをＰＢＳを用いてＥＰチューブに回収した。
【0069】
単離したエクソソームは－２０℃および－８０℃で保存し、使用前に４℃で融解した。
【0070】
＜実施例２＞ ＦＡＦ１を過剰発現するＨｅＬａ細胞からのエクソソームの単離
＜２－１＞細胞培養
子宮頸癌患者由来のＨｅＬａ細胞は、抗生物質、１０％ＦＢＳ（Atlas Biologicals、USA）、抗生物質－抗マイコプラズマ剤（ペニシリン／ストレプトマイシン、GIBCOBRL、USA）を含むＤＭＥＭ（WelGENE、Korea）中で、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２日に１回継代培養しながら維持した。
＜２－１＞細胞培養
子宮頸癌患者由来のＨｅＬａ細胞は、抗生物質、１０％ＦＢＳ（Atlas Biologicals、USA）、抗生物質－抗マイコプラズマ剤（ペニシリン／ストレプトマイシン、GIBCOBRL、USA）を含むＤＭＥＭ（WelGENE、Korea）中で、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２日に１回継代培養しながら維持した。
【0071】
＜２－２＞細胞内形質導入
ＨｅＬａ細胞でＦＡＦ１を過剰発現させるために、３ｘ Ｆｌａｇタグ－ＦＡＦ１プラスミド（８μｇ）を６．５×１０６細胞に導入した。
具体的な実験方法は、実施例１－２と同じである。
ＨｅＬａ細胞でＦＡＦ１を過剰発現させるために、３ｘ Ｆｌａｇタグ－ＦＡＦ１プラスミド（８μｇ）を６．５×１０６細胞に導入した。
具体的な実験方法は、実施例１－２と同じである。
【0072】
＜２－３＞エクソソームの単離
Exo-quick-TC（商標）または超遠心機を用いて、３ｘ Ｆｌａｇタグ－ＦＡＦ１プラスミドを導入したＨｅＬａ細胞からエクソソームを単離した。
具体的な実験方法は、実施例１－３と同じである。
Exo-quick-TC（商標）または超遠心機を用いて、３ｘ Ｆｌａｇタグ－ＦＡＦ１プラスミドを導入したＨｅＬａ細胞からエクソソームを単離した。
具体的な実験方法は、実施例１－３と同じである。
【0073】
＜実施例３＞癌細胞株の培養
ＭＩＡ ＰａＣａ－２（膵臓癌細胞）、Ｈｅｐ３Ｂ（肝臓癌細胞）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（トリプルネガティブ乳癌細胞）、Ｃａｋｉ－１（腎臓癌細胞)、ＨｅＬａ（子宮頸癌細胞）を、ＤＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ、１％ 抗生物質－抗マイコプラズマ剤（ペニシリン／ストレプトマイシン、GIBCO BRL、USA）、５％ ＣＯ２、３７℃の条件下でインキュベーター内で培養し、３日に１回継代培養した。Ａ５４９（非小細胞肺癌細胞）およびＨＣＴ１１６（大腸癌細胞）を、ＲＰＭＩ１６４０培地中、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質－抗マイコプラズマ剤、５％ＣＯ２、３7℃の条件下で培養し、３日に１回継代培養した。
ＭＩＡ ＰａＣａ－２（膵臓癌細胞）、Ｈｅｐ３Ｂ（肝臓癌細胞）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（トリプルネガティブ乳癌細胞）、Ｃａｋｉ－１（腎臓癌細胞)、ＨｅＬａ（子宮頸癌細胞）を、ＤＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ、１％ 抗生物質－抗マイコプラズマ剤（ペニシリン／ストレプトマイシン、GIBCO BRL、USA）、５％ ＣＯ２、３７℃の条件下でインキュベーター内で培養し、３日に１回継代培養した。Ａ５４９（非小細胞肺癌細胞）およびＨＣＴ１１６（大腸癌細胞）を、ＲＰＭＩ１６４０培地中、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質－抗マイコプラズマ剤、５％ＣＯ２、３7℃の条件下で培養し、３日に１回継代培養した。
【0074】
＜実験例１＞ＨＥＫ ２９３細胞およびＨｅＬａ細胞でＦＡＦ１を過剰発現させたときのエクソソーム中のＦＡＦ１の増加の確認
実施例１の３ｘ Ｆｌａｇタグ－ＦＡＦ１０プラスミド（８μｇ）を形質導入したＨＥＫ ２９３細胞およびＨｅＬａ細胞において、ＦＡＦ１を過剰発現させたときにエクソソームにＦＡＦ１が多く入るかどうかを調べるため、超遠心機およびExo-quick-TC（商標）を用いて単離したエクソソーム中のＦＡＦ１の発現量をウェスタンブロッティングにより確認した。
実施例１の３ｘ Ｆｌａｇタグ－ＦＡＦ１０プラスミド（８μｇ）を形質導入したＨＥＫ ２９３細胞およびＨｅＬａ細胞において、ＦＡＦ１を過剰発現させたときにエクソソームにＦＡＦ１が多く入るかどうかを調べるため、超遠心機およびExo-quick-TC（商標）を用いて単離したエクソソーム中のＦＡＦ１の発現量をウェスタンブロッティングにより確認した。
【0075】
具体的には、ウェスタンブロッティングを行うために、上清を除去したペレットに哺乳動物溶解バッファー５０μＬを添加し、氷上で３０分間溶解させた。ウエスタンブロットキット（Amersham Biosciences, UK）を用いて８－１０％アクリルアミドゲルを調製し、溶解したペレットを５μＬのＳＤＳサンプルバッファーと共に混合し、３分間煮沸した後、ゲル上に所定量をのせ、８０－１００Ｖの電圧をかけ、ペレット中のタンパク質をサイズ別に分離した。分離したタンパク質を含むアクリルアミドゲルをニトロセルロース膜に重なるように置き、２００ｍＡの電流を２時間流してタンパク質をニトロセルロース膜に移した。タンパク質を転写したニトロセルロース膜を脱脂粉乳でブロッキングし、そこにＦＡＦ１抗体を結合させ、さらに二次抗体を結合させ、ウエスタンブロット検出キット（AbFrontier、Korea）およびChemiDoc-It Imaging System（UVP、USA）によりＦＡＦ１タンパク質の量を確認した。
【0076】
超遠心機を用いてエクソソームを単離するとき、ＦＡＦ１が過剰発現しているＨＥＫ ２９３細胞から単離されたエクソソームでは、ＦＡＦ１が過剰発現していない細胞から単離されたエクソソームと比較して、ＦＡＦ１の発現がわずかに増加していた（図１）。ＨｅＬａ細胞の場合、ＦＡＦ１が過剰発現していない細胞から単離されたエクソソームおよびＦＡＦ１が過剰発現している細胞から単離されたエクソソームでは、ＦＡＦ１の発現がほとんど見られなかった（図２）。
【0077】
Exo-quick-TC（商標）を用いてエクソソームを単離したとき、ＨＥＫ ２９３細胞ではＦＡＦ１を過剰発現する細胞から単離されたエクソソーム中のＦＡＦ１の発現量が有意に増加し（図３）、ＨｅＬａ細胞ではＦＡＦ１過剰発現細胞から単離されたエクソソーム中にＦＡＦ１は認められなかったが、タグタンパク質であるＦｌａｇによりＦＡＦ１の量が増加していることが確認された（図４）。
【0078】
Exo-quick-TC（商標）を用いたエクソソームの単離方法は、超遠心機を用いる方法よりも簡便であり、時間を短縮できる利点があるが、単離過程でコンタミネーションが生じる欠点がある。また、超遠心機を用いる方法は、より純度の高いエクソソームを単離し得るため、本発明者らは、純度の高いエクソソームの効果を確認するために以下の実験例において超遠心機を用いてエクソソームを単離した。
【0079】
＜実験例２＞ＦＡＦ１過剰発現ＨＥＫ ２９３細胞から単離したエクソソームのインビトロ抗腫瘍効果の確認
ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ ２９３細胞から単離したエクソソームを用いて、膵臓癌、非小細胞肺癌、肝臓癌、子宮頸癌の細胞株におけるコロニー形成阻害能を評価した。
ＦＡＦ１を過剰発現させたＨＥＫ ２９３細胞から単離したエクソソームを用いて、膵臓癌、非小細胞肺癌、肝臓癌、子宮頸癌の細胞株におけるコロニー形成阻害能を評価した。
【0080】
具体的には、３ｘ Ｆｌａｇタグ－ＦＡＦ１（０μｇまたは８μｇ）を導入したＨＥＫ ２９３細胞を２４時間培養し、エクソソームの分泌を促進するためにＦＢＳおよび抗生物質を含まない培地で２４時間培養した後、培地を回収し、超遠心機（optima XE-100, BECKMAN Coulter）を用いてエクソソームを単離した。単離されたエクソソームを、分光光度計（MECASYS、Korea）を用いて定量した。ＭＩＡ ＰａＣａ－２、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、Ｈｅｐ３Ｂ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１またはＨｅＬａ細胞株におけるＦＡＦ１内包エクソソームの腫瘍コロニーを阻害するインビトロ効果を見るために、ＭＩＡ ＰａＣａ－２、Ｈｅｐ３ＢまたはＨｅＬａ細胞を、１００個細胞で６ウェルプレートに播種し、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は２００個細胞で播種した。２４時間後、ＦＡＦ１を内包しないエクソソーム（エクソソーム対照：ＥＸＯ－ＣＯＮ）およびＦＡＦ１を内包したエクソソーム（ＥＸＯ－ＦＡＦ１）で細胞を処理した。ＭＩＡ ＰａＣａ－２の場合、エクソソームを分光光度計（MECASYS、Korea）で測定し、細胞を６μｇのエクソソームで処理した後、１２日間培養した；Ａ５４９の場合、エクソソームをＮＴＡで測定し、細胞を３ｘ１０８のエクソソームで処理した後、１０日間培養した；ＨＣＴ１１６の場合、エクソソームをＮＴＡで測定し、細胞を３．１６ｘ１０９のエクソソームで細胞を処理し、１０日間培養した。Ｈｅｐ３Ｂの場合、分光光度計（MECASYS, Korea）でエクソソームを測定し、１２μｇのエクソソームで細胞を処理後、７日間培養した。８．４ｘ１０９のエクソソームで処理し、１２日間培養した。ＨｅＬａの場合、エクソソームをＮＴＡで測定し、細胞を１．６５ｘ１０１０のエクソソームで処理し、１０日間培養した。培地を３日に一度、新しい培地に交換し、培地交換したとき、細胞はそれぞれの濃度に従ってエクソソームで処理された。実験完了後、ＰＢＳで洗浄し、１ｍＬのメタノールで２０分間処理し、１ｍＬのクリスタルバイオレット溶液（SIGMA-ALDRICH、USA）で５分間処理することにより、染色されたコロニー数を測定した。
【0081】
＜２－１＞膵臓癌におけるコロニー形成抑制能の確認
膵臓癌におけるＦＡＦ１内包エクソソームの抗腫瘍効果のコロニー形成抑制能を確認するため、膵臓癌細胞株であるＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞をＦＡＦ１内包エクソソームで処理し、確認した。
膵臓癌におけるＦＡＦ１内包エクソソームの抗腫瘍効果のコロニー形成抑制能を確認するため、膵臓癌細胞株であるＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞をＦＡＦ１内包エクソソームで処理し、確認した。
【0082】
その結果、図５ａおよび図５ｂに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１で処理した群で最もコロニー数が少ないことが確認された。図面で確認すると、ＥＸＯ－ＦＡＦ１はＥＸＯ－ＣＯＮに比べて２４．２±７．２７％、ＭＯＣＫに比べて２６．２±７．０８％コロニー形成が減少していることが確認された。
【0083】
以上の結果は、ＦＡＦ１内包エクソソームが膵臓癌の腫瘍形成を抑制することを示唆している。
【0084】
＜２－２＞非小細胞肺癌におけるコロニー形成阻害能の確認
非小細胞肺癌におけるＦＡＦ１内包エクソソームの抗腫瘍効果を検証するため、非小細胞肺癌細胞株であるＡ５４９細胞をＦＡＦ１内包エクソソームで処理し、コロニー形成阻害能を確認した。
非小細胞肺癌におけるＦＡＦ１内包エクソソームの抗腫瘍効果を検証するため、非小細胞肺癌細胞株であるＡ５４９細胞をＦＡＦ１内包エクソソームで処理し、コロニー形成阻害能を確認した。
【0085】
その結果、図６ａおよび図６ｂに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１で処理した群で最もコロニー数が少ないことが確認された。その結果、ＥＸＯ－ＦＡＦ１はＥＸＯ－ＣＯＮと比較して４６．９±１２．８８％、ＭＯＣＫと比較して４２．７±１３．９１％コロニー形成を減少させることが確認された。
【0086】
以上の結果は、ＦＡＦ１内包エクソソームが非小細胞肺癌の腫瘍形成を抑制することを示唆している。
【0087】
＜２－３＞大腸癌におけるコロニー形成阻害能の確認
大腸癌におけるＦＡＦ１内包エクソソームの抗腫瘍効果を検証するため、大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞をＦＡＦ１内包エクソソームで処理し、コロニー形成阻害能を確認した。
大腸癌におけるＦＡＦ１内包エクソソームの抗腫瘍効果を検証するため、大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞をＦＡＦ１内包エクソソームで処理し、コロニー形成阻害能を確認した。
【0088】
その結果、図７ａおよび図７ｂに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１で処理した群で最もコロニー数が少ないことが確認された。ＥＸＯ－ＦＡＦ１はＥＸＯ－ＣＯＮと比較して２３．０±９．０７％、ＭＯＣＫと比較して３０．９±８．１４％コロニー形成が減少することが確認された。
【0089】
以上の結果は、ＦＡＦ１内包エクソソームが大腸癌の腫瘍形成を抑制することを示唆している。
【0090】
＜２－４＞肝臓癌におけるコロニー形成阻害能の確認
肝臓癌におけるＦＡＦ１内包エクソソームの抗腫瘍効果を検証するため、肝臓癌細胞株であるＨｅｐ３Ｂ細胞をＦＡＦ１内包エクソソームで処理し、コロニー形成阻害能を確認した。
肝臓癌におけるＦＡＦ１内包エクソソームの抗腫瘍効果を検証するため、肝臓癌細胞株であるＨｅｐ３Ｂ細胞をＦＡＦ１内包エクソソームで処理し、コロニー形成阻害能を確認した。
【0091】
その結果、図８ａおよび図８ｂに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１で処理した群ではコロニー数が最も少ないことが確認された。その結果、ＥＸＯ－ＦＡＦ１はＥＸＯ－ＣＯＮと比較して５０．６±１０．２１％、ＭＯＣＫと比較して４６．１±１１．１５％コロニー形成を減少させることが確認された。
【0092】
以上の結果から、ＦＡＦ１内包エクソソームが肝癌の腫瘍形成を抑制することが示唆された。
【0093】
＜２－５＞トリプルネガティブ乳癌におけるコロニー形成阻害能の確認
トリプルネガティブ乳癌におけるＦＡＦ１内包エクソソームの抗腫瘍効果のコロニー形成抑制能を検証するため、トリプルネガティブ乳癌細胞株であるＭＤＢ－ＭＢ－２３１細胞をＦＡＦ１内包エクソソームで処理し、その効果を確認した。
トリプルネガティブ乳癌におけるＦＡＦ１内包エクソソームの抗腫瘍効果のコロニー形成抑制能を検証するため、トリプルネガティブ乳癌細胞株であるＭＤＢ－ＭＢ－２３１細胞をＦＡＦ１内包エクソソームで処理し、その効果を確認した。
【0094】
その結果、図９ａおよび図９ｂに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１で処理した群ではコロニー数が最も少ないことが確認された。数値で確認したところ、ＥＸＯ－ＦＡＦ１はＥＸＯ－ＣＯＮに比べて４３．８±１０．４０％、ＭＯＣＫに比べて５９．３±７．５９％コロニー形成が減少していることが確認された。
【0095】
以上の結果から、ＦＡＦ１内包エクソソームはトリプルネガティブ乳癌の腫瘍形成を抑制することが示唆された。
【0096】
＜２－６＞子宮頸癌におけるコロニー形成阻害能の確認
子宮頸癌におけるＦＡＦ１内包エクソソームの抗腫瘍効果のコロニー形成抑制能を確認するため、子宮頸癌細胞株であるＨｅＬａ細胞をＦＡＦ１内包エクソソームで処理し、確認した。
子宮頸癌におけるＦＡＦ１内包エクソソームの抗腫瘍効果のコロニー形成抑制能を確認するため、子宮頸癌細胞株であるＨｅＬａ細胞をＦＡＦ１内包エクソソームで処理し、確認した。
【0097】
その結果、図１０ａおよび図１０ｂに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１で処理した群ではコロニー数が最も少ないことが確認された。数値で確認したところ、ＥＸＯ－ＦＡＦ１はＥＸＯ－ＣＯＮに比べて３８．４±６．４５％、ＭＯＣＫに比べて３８．０±６．４９％コロニー形成が減少していることが確認された。
【0098】
以上の結果から、ＦＡＦ１内包エクソソームは子宮頸癌の腫瘍形成を抑制することが示唆された。
【0099】
＜実験例３＞ＦＡＦ１過剰発現ＨＥＫ ２９３細胞から単離したエクソソームの腫瘍異種移植動物モデルにおけるインビボ抗腫瘍効果の確認
ＦＡＦ１を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームのインビボ腫瘍抑制効果を見るために、ＭＩＡ ＰａＣａ－２、Ａ５４９、ＨＣＴ １１６、Ｈｅｐ３Ｂ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｃａｋｉ－１およびＨｅＬａ細胞株を１００μＬのＰＢＳおよび１００μＬのマトリゲルと共に混合し（Corning Life Science, USA）、２６Ｇシリンジを通して８週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃＳＬＣ ｎｕ／ｎｕマウス（Central Lab. Animal Inc., Korea）の背部に異種移植した。腫瘍体積は、（長軸）×（短軸）２×０．５に基づいて計算された。腫瘍体積が８０－１４０ｍｍ３に達したとき、ＰＢＳ、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）、ＥＸＯ－ＣＯＮおよびＥＸＯ－ＦＡＦ１をそれぞれ２日に１回、計４回マウスに腫瘍内注射した。ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞株の腫瘍体積は４３日まで、Ａ５４９細胞株の腫瘍体積は４８日まで、ＨＣＴ１１６細胞株の腫瘍体積は３０日まで、Ｈｅｐ３Ｂ細胞株の腫瘍体積は３５日まで、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株の腫瘍体積は４０日まで、Ｃａｋｉ－１細胞株の腫瘍体積は４６日まで、そしてＨｅＬａ細胞株の腫瘍体積は４１日まで測定した。最終日、マウスを安楽死させた後、腫瘍を除核して重量を測定し、Ｈ＆Ｅ染色で腫瘍の内部を調べた。
ＦＡＦ１を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞から単離したエクソソームのインビボ腫瘍抑制効果を見るために、ＭＩＡ ＰａＣａ－２、Ａ５４９、ＨＣＴ １１６、Ｈｅｐ３Ｂ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｃａｋｉ－１およびＨｅＬａ細胞株を１００μＬのＰＢＳおよび１００μＬのマトリゲルと共に混合し（Corning Life Science, USA）、２６Ｇシリンジを通して８週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃＳＬＣ ｎｕ／ｎｕマウス（Central Lab. Animal Inc., Korea）の背部に異種移植した。腫瘍体積は、（長軸）×（短軸）２×０．５に基づいて計算された。腫瘍体積が８０－１４０ｍｍ３に達したとき、ＰＢＳ、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）、ＥＸＯ－ＣＯＮおよびＥＸＯ－ＦＡＦ１をそれぞれ２日に１回、計４回マウスに腫瘍内注射した。ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞株の腫瘍体積は４３日まで、Ａ５４９細胞株の腫瘍体積は４８日まで、ＨＣＴ１１６細胞株の腫瘍体積は３０日まで、Ｈｅｐ３Ｂ細胞株の腫瘍体積は３５日まで、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株の腫瘍体積は４０日まで、Ｃａｋｉ－１細胞株の腫瘍体積は４６日まで、そしてＨｅＬａ細胞株の腫瘍体積は４１日まで測定した。最終日、マウスを安楽死させた後、腫瘍を除核して重量を測定し、Ｈ＆Ｅ染色で腫瘍の内部を調べた。
【0100】
Ｈ＆Ｅ染色用に抽出した組織をホルマリン溶液で保存した。２４時間後、７０％エタノールで２０分間脱水し、９５％エタノールで２０分間脱水を２回行い、最後に１００％エタノールで２０分間脱水を２回行った。その後、組織プロセッサー（Leica, Germany）を用いて、キシレン反応およびパラフィン反応をそれぞれ３時間行った。組織切片の切り出しのため、組織をパラフィンで固め、ミクロトームを用いて厚さ５μｍに切り出し、切片をスライドグラス上に置いた。染色を開始する前に、スライドウォーマーを用いて６０℃で２０分間反応を行った。次に、キシレン中で３分３０秒の反応を３回行った。その後、１００％エタノールで２回、９５％、８０％および７０％エタノールで順に１回、それぞれ３分３０秒間反応させた。その後、流水で３分間洗浄した。次に、ヘマトキシリン中で５分間反応させ、その後１０分間洗浄し、塩酸で４秒間、１％アンモニアで１０秒間反応させ、５分間洗浄し、エオシンで１分１０秒間反応させる順で行った。その後、スライドを７０％エタノール、８５％エタノールの順に１分３０秒ずつ入れ、１００％エタノールで１分３０秒の反応を２回行った。エタノール反応後、１００％エタノールおよびキシレンを１：１の割合で混合した溶液を１分３０秒間反応させた。最後に、キシレンで３分間反応させ、さらに新しいキシレンで４分間反応させた。Shandon(商標） Synthetic Mountant（Thermo Scientific、USA）を用いてスライドをガラスカバーで覆った。染色終了後、顕微鏡で観察した。
【0101】
＜３－１＞膵臓癌異種移植モデル動物における有効性評価
膵臓癌細胞株であるＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞を免疫不全ヌードマウスに異種移植し、ＦＡＦ１内包エクソソームに腫瘍形成抑制作用があるかどうかを確認した。
その結果、図１１ａおよび図１１ｂに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて６０．４６±１３．３３％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて５５．４０±１５．０４％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて５９．７１±１３．５８％、腫瘍体積が減少することが確認された。また、図１１ｃおよび図１１ｄに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて腫瘍重量が５２．５５±１２．１３％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて腫瘍重量が４６．７４±１３．６１％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて腫瘍重量が４５．２８±１３．９８％減少することが確認された。
膵臓癌細胞株であるＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞を免疫不全ヌードマウスに異種移植し、ＦＡＦ１内包エクソソームに腫瘍形成抑制作用があるかどうかを確認した。
その結果、図１１ａおよび図１１ｂに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて６０．４６±１３．３３％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて５５．４０±１５．０４％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて５９．７１±１３．５８％、腫瘍体積が減少することが確認された。また、図１１ｃおよび図１１ｄに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて腫瘍重量が５２．５５±１２．１３％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて腫瘍重量が４６．７４±１３．６１％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて腫瘍重量が４５．２８±１３．９８％減少することが確認された。
【0102】
また、Ｈ＆Ｅ染色により腫瘍組織の細胞形態を観察した結果、図１１ｅに示すように、ＨＥＫ Ｅｘｏ－ＦＡＦ１投与群の腫瘍組織の細胞質サイズは、モック投与群、組換え型ＦＡＦ１投与群およびＨＥＫ Ｅｘｏ－ＣＯＮ投与群に比べて小さく、ＨＥＫ Ｅｘｏ－ＦＡＦ１投与により細胞ネクローシスが起こっていることが確認された。
【0103】
以上の結果は、エクソソームを介したＦＡＦ１がインビボでも腫瘍形成を抑制することを示している。
【0104】
＜３－２＞非小細胞肺癌異種移植モデル動物における有効性評価
非小細胞肺癌細胞株であるＡ５４９細胞を免疫不全ヌードマウスに異種移植し、ＦＡＦ１内包エクソソームに腫瘍形成抑制作用があるかどうかを確認した。
その結果、図１２ａおよび図１２ｂに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群ではＰＢＳ投与群に比べて７５．４５±９．８９％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて７２．７７±１０．９７％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて７５．１４±１０．０１％、腫瘍体積が減少することが確認された。また、図１２ｃおよび図１２ｄに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群ではＰＢＳ投与群に比べて５９．０７±１３．８８％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて６１．３１±１３．１２％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて６３．１９±１２．４８％腫瘍重量が減少したことが確認された。また、図１２ｅに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１投与群の腫瘍内部ではネクローシスが起こっていることが確認された。
非小細胞肺癌細胞株であるＡ５４９細胞を免疫不全ヌードマウスに異種移植し、ＦＡＦ１内包エクソソームに腫瘍形成抑制作用があるかどうかを確認した。
その結果、図１２ａおよび図１２ｂに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群ではＰＢＳ投与群に比べて７５．４５±９．８９％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて７２．７７±１０．９７％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて７５．１４±１０．０１％、腫瘍体積が減少することが確認された。また、図１２ｃおよび図１２ｄに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群ではＰＢＳ投与群に比べて５９．０７±１３．８８％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて６１．３１±１３．１２％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて６３．１９±１２．４８％腫瘍重量が減少したことが確認された。また、図１２ｅに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１投与群の腫瘍内部ではネクローシスが起こっていることが確認された。
【0105】
＜３－３＞大腸癌異種移植モデル動物における有効性評価
大腸癌細胞株であるＨＣＴ １１６細胞株を免疫不全ヌードマウスに異種移植し、ＦＡＦ１内包エクソソームに腫瘍形成抑制作用があるかどうかを確認した。
その結果、図１３ａおよび図１３ｂに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて６６．８７±７．６２％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて４７．８７±１２．００％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて５６．９３±９．９１％、腫瘍体積が減少することが確認された。また、図１３ｃおよび図１３ｄに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて腫瘍重量が７１．８８±５．６６％減少し、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて腫瘍重量が４０．１２±１２．０５％減少し、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて腫瘍重量が６０．０９±８．０３％減少することが確認された。また、図１３ｅに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１投与群では腫瘍内部にネクローシスが起こっていることが確認された。
大腸癌細胞株であるＨＣＴ １１６細胞株を免疫不全ヌードマウスに異種移植し、ＦＡＦ１内包エクソソームに腫瘍形成抑制作用があるかどうかを確認した。
その結果、図１３ａおよび図１３ｂに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて６６．８７±７．６２％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて４７．８７±１２．００％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて５６．９３±９．９１％、腫瘍体積が減少することが確認された。また、図１３ｃおよび図１３ｄに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて腫瘍重量が７１．８８±５．６６％減少し、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて腫瘍重量が４０．１２±１２．０５％減少し、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて腫瘍重量が６０．０９±８．０３％減少することが確認された。また、図１３ｅに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１投与群では腫瘍内部にネクローシスが起こっていることが確認された。
【0106】
＜３－４＞肝癌異種移植モデル動物における有効性評価
肝癌細胞株であるＨｅｐ３Ｂ細胞株を免疫不全ヌードマウスに異種移植し、ＦＡＦ１内包エクソソームに腫瘍形成抑制作用があるかどうかを確認した。
その結果、図１４ａおよび図１４ｂに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて７６．１６±１１．６１％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて７０．７４±１４．２５％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて６２．４４±１８．２９％、腫瘍体積が減少することが確認された。また、図１４ｃおよび図１４ｄに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて７３．４８±３３．２２％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて６６．６２±４２．１６％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて４４．４４±７０．８７％腫瘍重量が減少したことが確認された。また、図１４ｅに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１投与群では腫瘍内部にネクローシスが起こっていることが確認された。
肝癌細胞株であるＨｅｐ３Ｂ細胞株を免疫不全ヌードマウスに異種移植し、ＦＡＦ１内包エクソソームに腫瘍形成抑制作用があるかどうかを確認した。
その結果、図１４ａおよび図１４ｂに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて７６．１６±１１．６１％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて７０．７４±１４．２５％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて６２．４４±１８．２９％、腫瘍体積が減少することが確認された。また、図１４ｃおよび図１４ｄに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて７３．４８±３３．２２％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて６６．６２±４２．１６％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて４４．４４±７０．８７％腫瘍重量が減少したことが確認された。また、図１４ｅに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１投与群では腫瘍内部にネクローシスが起こっていることが確認された。
【0107】
＜３－５＞トリプルネガティブ乳癌異種移植モデル動物における有効性評価
トリプルネガティブ乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を免疫不全ヌードマウスに異種移植し、ＦＡＦ１内包エクソソームに腫瘍形成抑制作用があるかどうかを確認した。
その結果、図１５ａおよび図１５ｂに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて８０．３８±８．３４％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて６８．３２±１３．４６％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて６７．２２±１３．９３％、腫瘍体積が減少することが確認された。また、図１５ｃおよび図１５ｄに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて７７．０３±１１．８３％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて６９．６３±１５．６６％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて６２．５０±１９．３３％腫瘍重量が減少したことが確認された。また、図１５ｅに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１投与群の腫瘍内部ではネクローシスが起こっていることが確認された。
トリプルネガティブ乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を免疫不全ヌードマウスに異種移植し、ＦＡＦ１内包エクソソームに腫瘍形成抑制作用があるかどうかを確認した。
その結果、図１５ａおよび図１５ｂに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて８０．３８±８．３４％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて６８．３２±１３．４６％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて６７．２２±１３．９３％、腫瘍体積が減少することが確認された。また、図１５ｃおよび図１５ｄに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて７７．０３±１１．８３％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて６９．６３±１５．６６％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて６２．５０±１９．３３％腫瘍重量が減少したことが確認された。また、図１５ｅに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１投与群の腫瘍内部ではネクローシスが起こっていることが確認された。
【0108】
＜３－６＞腎臓癌異種移植モデル動物における有効性評価
腎臓癌細胞株であるＣａｋｉ－１細胞株を免疫不全ヌードマウスに異種移植し、ＦＡＦ１内包エクソソームに腫瘍形成抑制作用があるかどうかを確認した。
その結果、図１６ａおよび図１６ｂに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて５４．２３±１２．４０％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて４３．０５±１５．２１％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて５３．５６±１２．６０％、腫瘍体積が減少していることが確認された。また、図１６ｃおよび図１６ｄに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて腫瘍重量が４２．１１±１６．２２％減少し、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて腫瘍重量が３１．２５±１９．２６％減少したことが確認された。また、図１６ｅに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１投与群では腫瘍内部にネクローシスが起こっていることが確認された。
腎臓癌細胞株であるＣａｋｉ－１細胞株を免疫不全ヌードマウスに異種移植し、ＦＡＦ１内包エクソソームに腫瘍形成抑制作用があるかどうかを確認した。
その結果、図１６ａおよび図１６ｂに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて５４．２３±１２．４０％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて４３．０５±１５．２１％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて５３．５６±１２．６０％、腫瘍体積が減少していることが確認された。また、図１６ｃおよび図１６ｄに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて腫瘍重量が４２．１１±１６．２２％減少し、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて腫瘍重量が３１．２５±１９．２６％減少したことが確認された。また、図１６ｅに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１投与群では腫瘍内部にネクローシスが起こっていることが確認された。
【0109】
＜３－７＞子宮頸癌異種移植モデル動物における有効性評価
子宮頸癌細胞株であるＨｅＬａ細胞を免疫不全ヌードマウスに異種移植し、ＦＡＦ１内包エクソソームに腫瘍形成抑制作用があるかどうかを確認した。
その結果、図１７ａおよび図１７ｂに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群ではＰＢＳ投与群に比べて６６±１１．３３％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて５６．４±１４．５２％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて５７．１±１４．３０％、腫瘍体積が減少することが確認された。また、図１７ｃおよび図１７ｄに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて６０±１７．５９％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて４８．６±２１．３９％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて７０．７±１２．１７％腫瘍重量が減少したことが確認された。また、図１７ｅに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１投与群では腫瘍内部にネクローシスが起こっていることが確認された。
子宮頸癌細胞株であるＨｅＬａ細胞を免疫不全ヌードマウスに異種移植し、ＦＡＦ１内包エクソソームに腫瘍形成抑制作用があるかどうかを確認した。
その結果、図１７ａおよび図１７ｂに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群ではＰＢＳ投与群に比べて６６±１１．３３％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて５６．４±１４．５２％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて５７．１±１４．３０％、腫瘍体積が減少することが確認された。また、図１７ｃおよび図１７ｄに示すように、ＦＡＦ１内包エクソソーム投与群では、ＰＢＳ投与群に比べて６０±１７．５９％、ＥＸＯ－ＣＯＮ投与群に比べて４８．６±２１．３９％、リコンビナントＦＡＦ１（AngioLab, Korea）投与群に比べて７０．７±１２．１７％腫瘍重量が減少したことが確認された。また、図１７ｅに示すように、ＥＸＯ－ＦＡＦ１投与群では腫瘍内部にネクローシスが起こっていることが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図6a】
【図6b】
【図7a】
【図7b】
【図8a】
【図8b】
【図9a】
【図9b】
【図10a】
【図10b】
【図11a】
【図11b】
【図11c】
【図11d】
【図11e】
【図12a】
【図12b】
【図12c】
【図12d】
【図12e】
【図13a】
【図13b】
【図13c】
【図13d】
【図13e】
【図14a】
【図14b】
【図14c】
【図14d】
【図14e】
【図15a】
【図15b】
【図15c】
【図15d】
【図15e】
【図16a】
【図16b】
【図16c】
【図16d】
【図16e】
【図17a】
【図17b】
【図17c】
【図17d】
【図17e】
【配列表】
【国際調査報告】