特表 2024-512701 抗ＡＮＧ２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体を用いて脈絡膜新生血管形成を治療するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-19

(54)【発明の名称】抗ＡＮＧ２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体を用いて脈絡膜新生血管形成を治療するための方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20240312BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 27/10 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 31/56 20060101ALI20240312BHJP

   C07K 16/22 20060101ALN20240312BHJP

   C07K 16/46 20060101ALN20240312BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240312BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240312BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 N

A61K39/395 D

A61P9/00

A61P27/02

A61P27/10

A61P29/00

A61P9/10

A61K31/7088

A61K31/56

C07K16/22 ZNA

C07K16/46

C12N15/13

C12N15/62 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023560485

(86)(22)【出願日】2022-03-29

(85)【翻訳文提出日】2023-09-29

(86)【国際出願番号】 US2022022323

(87)【国際公開番号】W WO2022212360

(87)【国際公開日】2022-10-06

(31)【優先権主張番号】63/167,822

(32)【優先日】2021-03-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/182,623

(32)【優先日】2021-04-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523039477

【氏名又は名称】アブプロ コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ムダ， マルコ

(72)【発明者】

【氏名】ルロ， ジェイムズ

【テーマコード（参考）】

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085BB36

4C085BB42

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG01

4C085GG10

4C086AA01

4C086AA02

4C086DA08

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA58

4C086MA67

4C086NA05

4C086ZA33

4C086ZC75

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、概して、抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体を使用して、脈絡膜新生血管形成の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、前記対象に、有効量の抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体を投与することを含み、前記抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体が、配列番号１及び配列番号２、配列番号５及び配列番号６、並びに配列番号９及び配列番号１０からなる群から選択される、重鎖配列及び軽鎖配列を含む、方法。

【請求項2】

脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、前記対象に、有効量の抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体を投与することを含み、前記抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体が、ＶＥＧＦエピトープに結合する第１の抗原結合部分と、Ａｎｇ－２エピトープに結合する第２の抗原結合部分と、を含み、
前記第１の抗原結合部分が、第１の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び第１の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、前記第２の抗原結合部分が、第２のＶ_Ｈ及び第２のＶ_Ｌを含み、
前記第１のＶ_Ｈが、配列番号２５又は配列番号４４のアミノ酸配列を含み、前記第１のＶ_Ｌが、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、
前記第２のＶ_Ｈが、配列番号２６又は配列番号４５のアミノ酸配列を含み、前記第２のＶ_Ｌが、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、方法。

【請求項3】

前記抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体が、免疫グロブリン及びｓｃＦｖを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ｓｃＦｖが、前記第２の抗原結合部分を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記脈絡膜新生血管形成が、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、病的近視（ＰＭ）、炎症、ポリープ状脈絡膜症、又は中心性漿液性脈絡網膜症によって引き起こされる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記対象が、ＣＮＶを有するとして診断されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

ＣＮＶの徴候又は症状が、中心視のゆがみ若しくはうねり、又は中心視における灰色／黒色／空隙斑点、網膜における液体の水疱又は出血、色の輝度の喪失又は各眼で異なって現れる色、変視、痛みを伴わない視力低下、傍中心又は中心暗点、各眼について異なって現れる物体のサイズ、中心視における閃光又は明滅、網膜内若しくは網膜下液の滲出、出血、又は黄斑線維症による視力低下のうちの１つ以上を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記対象が、ＶＥＧＦ及び／又はＡｎｇ－２の上昇した発現レベル及び／又は増加した活性を示す、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

１つ以上の追加の療法を前記対象に、別々に、連続的に、又は同時に投与することを更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記１つ以上の追加の療法が、レーザー光凝固、光線力学療法（ＰＤＴ）、ペガプタニブナトリウム、ベバシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、及びコルチコステロイドからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体が、局所、硝子体内、眼内、網膜下、又は強膜下投与を介して投与される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

強膜下投与が、前記対象に徐放性強膜下インプラントを移植することによって達成される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体の投与が、前記対象における新生血管病変形成及び／又は血管漏出の低減をもたらす、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記対象が、ヒトである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記対象が、前記抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体の投与の１週間後に眼の炎症を示さない、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月３０日に出願された、米国仮特許出願第６３／１６７，８２２号、及び２０２１年４月３０日に出願された、米国仮特許出願第６３／１８２，６２３号の利益及び優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本技術は、概して、抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体を使用して、脈絡膜新生血管形成の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法に関する。

【背景技術】

【0003】

本技術の背景の以下の説明は、単に本技術を理解する際の補助として提供され、本技術の先行技術を説明又は構成するとは認められない。

【0004】

脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）は、網膜下色素上皮又は網膜下空間へのブルッフ膜における切断を通した脈絡膜に由来する新しい血管の成長を特徴とする。脈絡膜は、網膜と強膜との間にある眼の血管層であり、ブドウ膜の一部である。ブルッフ膜は、網膜色素上皮と隣接する脈絡膜の最内層である。網膜色素上皮は、眼の桿体及び錐体に隣接しており、これは視力への潜在的な干渉を説明する。ＣＮＶは、網膜内若しくは網膜下液の滲出、出血、又は黄斑部の線維症に起因する視力低下を引き起こし得る。ＣＮＶの最も重要な原因は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及び病的近視（ＰＭ）である。炎症、ポリープ状脈絡膜症、又は中心性漿液性脈絡網膜症などの他の原因が認識される。例えば、ＡＭＤは、高齢者に影響を与える全ての高所得国における失明及び重度視覚障害の主な原因である。疾患の有病率は、５０歳以降１０年毎に指数関数的に増加する。ＰＭは、一般人口の約２％に見られる。近視性ＣＮＶは、罹患した眼の４～１１％で発症する、ＰＭを有する眼における重度視力低下及び失明の主な原因である。それはアジア人では５０歳未満の人々の中で特に蔓延している。ＣＮＶは、最も重要な視力を脅かす因子であり、これは一般的にＡＭＤ及びＰＭに対して二次的に発生する。網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞への酸化ストレスは、その上に細胞外破片の蓄積を引き起こし、栄養素に対するブルッフ膜の透過性に影響を与えることによってＲＰＥ細胞の機能障害をもたらすと考えられる。

【0005】

ＶＥＧＦは、通常、ＲＰＥ及び網膜光受容体によって産生される重要な血管新生促進要素である。ＣＮＶでは、ＲＰＥは、非定型新生血管形成を強化し、ＶＥＧＦは、新しい血管の発生及び進化に関与する主な成長因子である。抗ＶＥＧＦ薬物でＶＥＧＦの活性を阻害するという考えは、眼の新生血管障害の管理において、特にその結果、すなわち、網膜下及び／又は網膜内流体の治療について、調査されている。しかしながら、現在の抗ＶＥＧＦ治療は、視力を維持するために繰り返し注射を必要とするＣＮＶの完全な退縮を誘導しない。また、抗ＶＥＧＦ療法耐性に関する証拠は、ＣＮＶの治療のための代替薬の必要性を示す。

【0006】

したがって、ＣＮＶの治療を必要とする患者においてそれを効果的に治療する治療剤の緊急の必要性が存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

一態様において、本開示は、脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、対象に、有効量の抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体を投与することを含み、抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体が、配列番号１及び配列番号２、配列番号５及び配列番号６、並びに配列番号９及び配列番号１０からなる群から選択される、重鎖配列及び軽鎖配列を含む、方法を提供する。

【0008】

一態様において、本開示は、脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、対象に、有効量の抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体を投与することを含み、抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体が、ＶＥＧＦエピトープに結合する第１の抗原結合部分と、Ａｎｇ－２エピトープに結合する第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分が、第１の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び第１の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、第２の抗原結合部分が、第２のＶ_Ｈ及び第２のＶ_Ｌを含み、第１のＶ_Ｈが、配列番号２５又は配列番号４４のアミノ酸配列を含み、第１のＶ_Ｌが、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、第２のＶ_Ｈが、配列番号２６又は配列番号４５のアミノ酸配列を含み、第２のＶ_Ｌが、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体は、免疫グロブリン及びｓｃＦｖを含む。追加的又は代替的に、いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、第２の抗原結合部分を含む。

【0009】

本明細書に開示される方法のいずれか及び全ての実施形態において、脈絡膜新生血管形成は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、病的近視（ＰＭ）、炎症、ポリープ状脈絡膜症、又は中心性漿液性脈絡網膜症によって引き起こされる。

【0010】

追加的又は代替的に、いくつかの実施形態において、対象は、ＣＮＶを有するとして診断されている。ＣＮＶの徴候又は症状の例としては、これらに限定されないが、中心視のゆがみ若しくはうねり、又は中心視における灰色／黒色／空隙斑点、網膜における液体の水疱又は出血、色の輝度の喪失又は各眼で異なって現れる色、変視、痛みを伴わない視力低下、傍中心又は中心暗点、各眼について異なって現れる物体のサイズ、中心視における閃光又は明滅、網膜内若しくは網膜下液の滲出、出血、又は黄斑線維症による視力低下が挙げられる。本明細書に開示される方法のいずれか及び全ての実施形態において、対象は、ＶＥＧＦ及び／又はＡｎｇ－２の上昇した発現レベル及び／又は増加した活性を示す。追加的又は代替的に、特定の実施形態において、対象は、ヒトである。

【0011】

追加的又は代替的に、いくつかの実施形態において、本技術の方法は、１つ以上の追加の療法を対象に別々に、連続的に、又は同時に投与することを更に含む。かかる追加の療法の例としては、レーザー光凝固、光線力学療法（ＰＤＴ）、ペガプタニブナトリウム、ベバシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、及びコルチコステロイドが挙げられる。

【0012】

本明細書に開示される方法のいずれか及び全ての実施形態において、抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体は、局所、硝子体内、眼内、網膜下、又は強膜下投与を介して投与される。特定の実施形態において、強膜下投与は、対象に徐放性強膜下インプラントを移植することによって達成される。

【0013】

追加的又は代替的に、本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体の投与は、対象の眼における新生血管病変形成及び／又は血管漏出の低減をもたらす。いくつかの実施形態において、対象は、抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体の投与の１週間後に眼の炎症を示さない。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本開示の抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体の概略図を示す。

【図2A】それぞれ、ｈｕＶＥＧＦ及びｈｕＡＮＧ２への、抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体ＡＢＰ２０１（配列番号１及び配列番号２によって表される）の結合親和性（ＫＤ）を示す。

【図2B】ＡＢＰ２０１が、ＡＮＧ２について選択的であり、サル、ラット、及びウサギと交差反応することを示す。

【図3】本開示の抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体の投与のための患者調製物を示す。

【図4】ウサギモデルにおける抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体ＡＢＰ２０１の毒性及び薬物動態（ＰＫ）を研究するための例示的な実験設計を示す。

【図5-1】注射の２４時間後の抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体ＡＢＰ２０１の忍容性結果を示す。ＡＢＰ２０１群における炎症のフレアが観察された。

【図5-2】注射の２４時間後の抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体ＡＢＰ２０１の忍容性結果を示す。ＡＢＰ２０１群における炎症のフレアが観察された。

【図6】注射の７日後の抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体ＡＢＰ２０１の忍容性結果を示す。ＡＢＰ２０１治療群における炎症が取り除かれた。

【図7】注射の１４日後の抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体ＡＢＰ２０１の忍容性結果を示す。組織病理データは、ＡＢＰ２０１治療群において大きな懸念を示さなかった。

【図8】注射の１４日後の試験されたウサギの組織病理を示す例示的な画像を示す。

【図9】インビボウサギモデルにおける抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体ＡＢＰ２０１のＰＫ結果を示す。

【図10】成体雄ダッチベルテッドウサギにおける抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体ＡＢＰ２０１のＰＫ平均パラメータを示す。

【図11】抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体ＡＢＰ２０１と、文献に報告されるＥｙｌｅａ及びＥｙｌｅａ様分子とのＰＫ比較を示す。

【図12A】ラットレーザー誘発性脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）疾患モデルを使用して、眼における抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体ＡＢＰ－２０１の活性を評価する研究の結果を示す。図１２Ａは、ＡＢＰ－２０１治療ＣＮＶラットにおける病変体積を示す。図１２Ｂは、ＡＢＰ２０１治療ＣＮＶラットにおける漏出を示す。

【図12B】ラットレーザー誘発性脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）疾患モデルを使用して、眼における抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体ＡＢＰ－２０１の活性を評価する研究の結果を示す。図１２Ａは、ＡＢＰ－２０１治療ＣＮＶラットにおける病変体積を示す。図１２Ｂは、ＡＢＰ２０１治療ＣＮＶラットにおける漏出を示す。

【図13A】ＡＢＰ２０１の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列（配列番号１及び配列番号２）を示す。Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１～３及びＶ_Ｌ ＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、下線が引かれ、抗Ａｎｇ２ ｓｃＦｖのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌアミノ酸配列は、斜体である。抗ＶＥＧＦ ＨＣ及び抗Ａｎｇ－２ ｓｃＦｖは、それぞれ、配列番号３及び配列番号４として表される。

【図13B】ＡＢＰ２０２の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列（配列番号５及び配列番号６）を示す。Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１～３及びＶ_Ｌ ＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、下線が引かれ、抗Ａｎｇ２ ｓｃＦｖのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌアミノ酸配列は、斜体である。抗ＶＥＧＦ ＨＣ及び抗Ａｎｇ－２ ｓｃＦｖは、それぞれ、配列番号７及び配列番号８として表される。

【図13C】ＡＢＰ２００の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列（それぞれ、配列番号９及び配列番号１０）を示す。Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１～３及びＶ_Ｌ ＣＤＲ１～３アミノ酸配列は、下線が引かれ、抗Ａｎｇ２ ｓｃＦｖのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌアミノ酸配列は、斜体である。抗ＶＥＧＦ ＨＣ及び抗Ａｎｇ－２ ｓｃＦｖは、それぞれ、配列番号１１及び配列番号１２として表される。

【図13D】本開示の抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体のＣＤＲ領域（配列番号１３～２４及び４２～４３によって表される）を示す。

【図13E】本開示の抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体の可変重（Ｖ_Ｈ）ドメイン及び可変軽（Ｖ_Ｌ）ドメイン（配列番号２５～２８及び４４～４５によって表される）を示す。

【図13F】それぞれ、配列番号３８～３９によって表される標的ＶＥＧＦ及びＡｎｇ－２のアミノ酸配列を示す。

【図14A】実験群及び対照群についての代表的な血管造影を示す。漏出は、実験方法に記載されるスコアリングシステムによって評価した。矢印は、病変を示す。

【図14B】実験群及び対照群の代表的なＯＣＴ画像を示す。体積を、方法に記載される計算によって決定した。赤矢印は、病変を示す。

【図15A】実験群及び対照群におけるフルオレセイン血管造影スコアを示す。

【図15B】実験群及び対照群における病変体積を示す。

【図16】経時的な抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体ＡＢＰ２０１（配列番号１及び配列番号２によって表される）でのインビボ累積関心領域（ＲＯＩ）蛍光の分析を示す。ビヒクル及びアフリベルセプトを、それぞれ、陰性及び陽性対照として使用した。

【図17】各時点での抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体ＡＢＰ２０１（配列番号１及び配列番号２によって表される）対ビヒクルのインビボ累積関心領域（ＲＯＩ）蛍光パーセント差を示す。

【図18A】経時的な図１６に記載される異なる治療群の例示的な蛍光画像を示す。

【図18B】経時的な図１６に記載される異なる治療群の例示的な蛍光画像を示す。

【図18C】経時的な図１６に記載される異なる治療群の例示的な蛍光画像を示す。

【図18D】経時的な図１６に記載される異なる治療群の例示的な蛍光画像を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本技術の実質的な理解を提供するために、本方法の特定の態様、モード、実施形態、変形、及び特徴が、様々なレベルの詳細で以下に記載されることを理解されたい。本開示は、勿論、変化し得る特定の使用、方法、試薬、化合物組成物、又は生物系に限定されるものではないことを理解されたい。本明細書に使用される用語が、単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、制限することが意図されないことも理解されたい。

【0016】

本方法を実施する際に、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学、及び組換えＤＮＡにおける多くの従来の技術が使用される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｄｓ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＰＣＲ １：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ｅｄｓ．（１９９９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇａｉｔ ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６））、Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｄ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、及びＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照されたい。ポリペプチド遺伝子発現産物のレベル（すなわち、遺伝子翻訳レベル）を検出及び測定する方法は、当該技術分野で周知であり、抗体検出及び定量技術などのポリペプチド検出方法の使用を含む。（また、Ｓｔｒａｃｈａｎ ＆ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９９９）を参照されたい）。

【0017】

ベバシズマブ（アバスチン）などの既存の抗ＶＥＧＦ治療剤は、全身心血管系に悪影響を及ぼし、血小板凝集、脱顆粒、及び血栓形成を誘発する。対照的に、本開示の抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体は、硝子体内送達後に迅速な全身クリアランスを示し、治療された眼において所望されない炎症性応答を引き起こさない。また、本開示の抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ多重特異性抗体は、治療後わずか１週間で低用量でインビボＣＮＶモデルにおける新生血管病変形成及び／又は血管漏出を有意に低減する。

【0018】

定義
別途定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、一般に、本技術が属する技術分野の当業者によって通例理解される意味と同じ意味を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が明示的に別様に示さない限り、複数の指示物を含む。例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」に対する言及は、２つ以上の細胞の組み合わせなどを含む。一般に、本明細書に使用される命名法、並びに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、分析化学、及び核酸化学における実験手順、並びに以下に記載されるハイブリダイゼーションは、当該技術分野で周知のものであり、通例用いられる。

【0019】

本明細書に使用される場合、数に関して「約」という用語は、別段の言明がない限り、又は文脈から明らかでない限り、数のいずれかの方向（より大きいか、又はより小さい）で１％、５％、又は１０％の範囲内に入る数を含むと一般に解釈される（かかる数が考えられる値の０％未満であるか、又は１００％を超える場合を除く）。

【0020】

本明細書に使用される場合、対象への薬剤又は薬物の「投与」は、その意図された機能を行うために、対象に化合物を導入又は送達する任意の経路を含む。投与は、経口、眼内、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下）、直腸、髄腔内、又は局所を含むが、これらに限定されない任意の好適な経路によって実行することができる。投与は、自己投与及び他者による投与を含む。

【0021】

本明細書に使用される場合、「抗体」という用語は、例として、限定されずに、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、それらの組み合わせ、並びに任意の脊椎動物、例えば、ヒト、ヤギ、ウサギ、及びマウスなどの哺乳動物、並びにサメ免疫グロブリンなどの非哺乳類種における免疫応答中に産生される同様の分子を含む、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様分子を総称して指す。本明細書で使用される場合、「抗体」（インタクトな免疫グロブリンを含む）及び「抗原結合断片」は、他の分子（例えば、生体試料中の他の分子の結合定数よりも少なくとも１０^３Ｍ^－１大きい、少なくとも１０^４Ｍ^－１大きい、又は少なくとも１０^５Ｍ^－１大きい、目的の分子の結合定数を有する抗体及び抗体断片）への結合の実質的な除外に対して目的の分子（又は高度に類似した目的の分子の群）に特異的に結合する。「抗体」という用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（二重特異性抗体など）などの遺伝子操作された形態を含む。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４－１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３^ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。

【0022】

より特定的には、抗体は、抗原のエピトープを特異的に認識して結合する、少なくとも軽鎖免疫グロブリン可変領域又は重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンドを指す。抗体は、重鎖及び軽鎖からなり、それらの各々は、可変重（Ｖ_Ｈ）領域及び可変軽（Ｖ_Ｌ）領域と称される可変領域を有する。一緒に、Ｖ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域が、抗体によって認識される抗原に対する結合に関与する。典型的には、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合により相互接続された重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖を有する。軽鎖には、ラムダ（λ）及びカッパ（κ）の２つのタイプがある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（又はアイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ。各重鎖及び軽鎖は、定常領域及び可変領域（領域は、「ドメイン」としても知られている）を含む。組み合わせで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、抗原に特異的に結合する。軽鎖及び重鎖可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断される「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲が定義されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照されたい）。Ｋａｂａｔデータベースは、現在、オンラインで維持されている。異なる軽鎖又は重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成する軽鎖及び重鎖の組み合わされたフレームワーク領域であり、主にβシート立体構造をとり、ＣＤＲが、β－シート構造に接続し、場合によってその一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合相互作用によって、ＣＤＲを正しい方向で配置することを提供する足場を形成するよう機能する。

【0023】

ＣＤＲは主に、抗原のエピトープとの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは通常、Ｎ末端から開始して順次付番されてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と称され、また通常は、特定のＣＤＲが配置される鎖によって特定される。よって、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、一方で、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインからのＣＤＲ１である。ＶＥＧＦ及び／又はＡｎｇ－２タンパク質に結合する抗体は、特異的なＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域配列、よって、特異的なＣＤＲ配列を有するであろう。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。抗体間で異なるのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限定された数のアミノ酸位置のみが、抗原結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。「免疫グロブリン関連組成物」は、本明細書に使用される場合、抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体などを含む）並びに抗体断片を指す。抗体又はその抗原結合断片は、抗原に特異的に結合する。

【0024】

本明細書に使用される場合、「抗体関連ポリペプチド」という用語は、単鎖抗体を含む抗原結合抗体断片を意味し、可変領域を単独で、又は抗体分子のポリペプチド要素：ヒンジ領域、ＣＨ_１、ＣＨ_２、及びＣＨ_３ドメインの全て又は一部と組み合わせて、含むことができる。技術には、可変領域及びヒンジ領域、ＣＨ_１、ＣＨ_２、及びＣＨ_３ドメインの任意の組み合わせも含まれる。本方法において有用な抗体関連分子、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、並びにＶ_Ｌ又はＶ_Ｈドメインのいずれかを含む断片に限定されない。例としては、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ、及びＣＨ_１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）_２断片、（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ及びＣＨ_１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_Ｌ及びＶ_ＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）Ｖ_Ｈドメインからなる、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９）、並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。かかる「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、全長抗体の一部、一般に、その抗原結合領域又は可変領域を含むことができる。抗体断片又は抗原結合断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、並びに抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。

【0025】

「二重特異性抗体」又は「ＢｓＡｂ」は、本明細書に使用される場合、異なる構造を有する２つの標的、例えば、２つの異なる標的抗原、同じ標的抗原上の２つの異なるエピトープ、又は標的抗原上のハプテン及び標的抗原若しくはエピトープに同時に結合することができる抗体を指す。様々な異なる二重特異性抗体構造が、当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体における各抗原結合部分は、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ領域を含み、いくつかのかかる実施形態において、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ領域は、特定のモノクローナル抗体に見出されるものである。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部分を含み、各々が、異なるモノクローナル抗体からのＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部分を含み、２つの抗原結合部分のうちの一方は、第１のモノクローナル抗体からのＣＤＲを含有するＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ領域を有する免疫グロブリン分子を含み、他方の抗原結合部分は、第２のモノクローナル抗体からのＣＤＲを含有するＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ領域を有する抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡＢ、ｓｃＦｖなど）を含む。

【0026】

本明細書に使用される場合、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」又は「ＡＤＣＣ」という用語は、その膜表面抗原が抗ＶＥＧＦ及び／又は抗Ａｎｇ－２抗体などの抗体によって結合されている、標的細胞を、免疫系のエフェクター細胞が活性的に溶解する細胞媒介性免疫防御のメカニズムを指す。

【0027】

本明細書に使用される場合、「抗原」は、抗体（又はその抗原結合断片）が選択的に結合することができる分子を指す。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、又は他の天然に存在するか若しくは合成による化合物であり得る。いくつかの実施形態において、標的抗原は、ポリペプチド（例えば、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２ポリペプチド）であり得る。また抗原を動物に投与して、動物における免疫応答を生じ得る。

【0028】

「抗原結合断片」という用語は、抗原との結合に関与するポリペプチドの一部を有する免疫グロブリン構造全体の断片を指す。本技術に有用な抗原結合断片の例には、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、ｓｃＦｖＦｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）_２が含まれるが、これらに限定されない。上記の抗体断片のうちのいずれかが、当業者に既知の従来の技術を使用して得られ、断片が、インタクト抗体と同様な手段で、結合特異性及び中和活性についてスクリーニングされる。

【0029】

本明細書に使用される場合、「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原又は抗原ペプチド）との間全非共有結合相互作用全体の強度を意味する。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋ_Ｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野で既知の標準的な方法によって測定することができる。低親和性複合体は、一般に、抗原から容易に解離する傾向がある抗体を含むが、高親和性複合体は、一般に、より長期間、抗原に結合し続ける傾向がある抗体を含む。

【0030】

本明細書に使用される場合、「生体試料」という用語は、生細胞に由来する試料材料を意味する。生体試料は、対象から単離された組織、細胞、細胞のタンパク質又は膜抽出物、及び生物学的液体（例えば、腹水又は脳脊髄液（ＣＳＦ））、並びに対象内に存在する組織、細胞、及び液体を含み得る。本技術の生体試料には、乳房組織、腎臓組織、子宮頸部、子宮内膜、頭部又は頸部、胆嚢、耳下腺組織、前立腺、脳、下垂体、腎臓組織、筋肉、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、脾臓、膵臓、甲状腺組織、心臓組織、肺組織、膀胱、脂肪組織、リンパ節組織、子宮、卵巣組織、副腎組織、精巣組織、扁桃腺、胸腺、血液、毛髪、頬、皮膚、血清、血漿、ＣＳＦ、精液、前立腺液、精漿、尿、糞便、汗、唾液、痰、粘膜、骨髄、リンパ、及び涙から採取される試料が含まれるが、これらに限定されない。生体試料は、内臓の生検から得ることもできる。生体試料は、診断又は研究のために対象から得ることができるか、又は対照として若しくは基礎研究のために、非疾患個体から得ることができる。試料は、例えば、静脈穿刺及び外科的生検を含む標準的な方法によって得ることができる。特定の実施形態において、生体試料は、針生検によって得られる組織試料である。

【0031】

本明細書に使用される場合、「ＣＤＲ移植」という用語は、「アクセプター」抗体の少なくとも１つのＣＤＲを、所望の抗原特異性を有する「ドナー」抗体からのＣＤＲ「移植片」で置き換えることを意味する。

【0032】

本明細書に使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、１つの種からのモノクローナル抗体のＦｃ定常領域（例えば、マウスＦｃ定常領域）が、組換えＤＮＡ技術を使用して、別の種の抗体からのＦｃ定常領域（例えば、ヒトＦｃ定常領域）で置き換えられている抗体を意味する。一般に、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９、Ａｋｉｒａ ｅｔ ａｌ．，欧州特許出願１８４，１８７、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，欧州特許出願１７１，４９６、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，欧州特許出願１７３，４９４、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ８６／０１５３３、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，欧州特許出願０１２５，０２３、Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３，１９８８、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９－３４４３，１９８７、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １３９：３５２１－３５２６，１９８７、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４－２１８，１９８７、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４７：９９９－１００５，１９８７、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６－４４９，１８８５、及びＳｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３－１５５９，１９８８を参照されたい。

【0033】

本明細書に使用される場合、「補体依存性細胞傷害性」又は「ＣＤＣ」という用語は、一般に、表面抗原に結合したときに古典的な補体経路を誘発し、膜攻撃複合体の形成及び標的細胞溶解を誘発する、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体のエフェクター機能を指す。

【0034】

本明細書で使用される場合、「コンジュゲートされた」という用語は、当業者に既知の任意の方法による２つの分子の会合を指す。好適なタイプの会合としては、化学結合及び物理結合が挙げられる。化学結合としては、例えば、共有結合及び配位結合が挙げられる。物理結合としては、例えば、水素結合、双極子相互作用、ファンデルワールス力、静電相互作用、疎水性相互作用、及び芳香族スタッキングが挙げられる。

【0035】

本明細書に使用される場合、「コンセンサスＦＲ」という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク（ＦＲ）抗体領域を意味する。抗体のＦＲ領域は、抗原に接触しない。

【0036】

本明細書に使用される場合、「対照」は、比較目的のために実験で使用される代替試料である。対照は、「陽性」又は「陰性」であることができる。例えば、実験の目的が特定のタイプの疾患に対する治療における治療剤の有効性の相関を決定することである場合、陽性対照（所望の治療効果を示すことが知られている化合物又は組成物）及び陰性対照（治療を受けないか、又はプラセボを受ける対象若しくは試料）が典型的に用いられる。

【0037】

本明細書に使用される場合、「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む（Ｖ_ＨＶ_Ｌ）。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作製させる。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）により十分に記載される。

【0038】

本明細書に使用される場合、「有効量」という用語は、所望の治療的及び／又は予防的効果を達成するのに十分な量、例えば、本明細書に記載される疾患若しくは状態、又は本明細書に記載される疾患若しくは状態に関連する１つ以上の徴候若しくは症状の予防又は減少をもたらす量を指す。治療的又は予防的適用の文脈において、対象に投与される組成物の量は、組成物、疾患の程度、タイプ、及び重症度、並びに全般的な健康、年齢、性別、体重、及び薬物に対する耐性などの個体の特性に応じて異なる。当業者は、これら及び他の要因に応じて適切な投与量を決定することができるであろう。組成物はまた、１つ以上の追加の治療用化合物と組み合わせて投与することができる。本明細書に記載の方法において、治療用組成物は、本明細書に記載される疾患又は状態の１つ以上の徴候又は症状を有する対象に投与され得る。本明細書に使用される場合、「治療有効量」の組成物は、疾患又は状態の生理学的影響が改善又は排除される組成物レベルを指す。治療有効量は、１回以上の投与で与えることができる。

【0039】

本明細書に使用される場合、「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識及び活性化段階とは対照的に、免疫応答のエフェクター段階に含まれる免疫細胞を意味する。例示的な免疫細胞には、骨髄又はリンパ起源の細胞、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞及び細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、肥満細胞、及び好塩基球が含まれる。エフェクター細胞は、特異的なＦｃ受容体を発現し、特異的免疫機能を実行する。エフェクター細胞は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、例えば、ＡＤＣＣを誘導することができる好中球を誘導することができる。例えば、ＦｃαＲを発現する単球、マクロファージ、好中球、好酸球、及びリンパ球は、標的細胞の特異的殺傷に関与し、免疫系の他の成分に抗原を提示するか、又は抗原を提示する細胞に結合する。

【0040】

本明細書に使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定因子を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなり、通常、特異的な三次元構造特徴、並びに特異的な電荷特徴を有する。立体構造エピトープ及び非立体構造エピトープは、変性化溶媒の存在下で前者との結合は失われるが、後者とは失われないことで、区別される。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質の「エピトープ」は、本技術の抗ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２多重特異性抗体が特異的に結合するタンパク質の領域である。いくつかの実施形態において、エピトープは、立体構造エピトープ又は非立体構造エピトープである。エピトープに結合する抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性抗体をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）などに記載される定型的な交差遮断アッセイを行うことができる。このアッセイは、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性抗体が、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性抗体と同じ部位又はエピトープに結合するかを決定するために使用することができる。代替的に、又は追加的に、エピトープマッピングは、当技術分野で既知の方法によって行うことができる。例えば、抗体配列は、アラニンスキャニングなどによって変異誘発して、接触残基を特定することができる。異なる方法において、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質の異なる領域に対応するペプチドは、試験抗体との競合アッセイ、又は試験抗体と、特徴付けられたか若しくは既知のエピトープを有する抗体との競合アッセイに使用することができる。

【0041】

本明細書に使用される場合、「発現」は、遺伝子の前駆体ｍＲＮＡへの転写と、成熟ｍＲＮＡを産生する前駆体ｍＲＮＡのスプライシング及び他のプロセシングと、ｍＲＮＡ安定性と、成熟ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳（コドンの使用及びｔＲＮＡの利用能を含む）と、適切な発現及び機能が必要とされる場合、翻訳産物のグリコシル化及び／又は他の修飾と、のうちの１つ以上を含む。

【0042】

本明細書に使用される場合、「遺伝子」という用語は、プロモーター、エクソン、イントロン、及び発現を制御する他の非翻訳領域を含む、ＲＮＡ産物の調節された生合成のための全ての情報を含む、ＤＮＡのセグメントを意味する。

【0043】

本明細書に使用される場合、「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的のためにアラインメントさせ得る、各配列の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列における位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められている場合、その分子はその位置において相同的である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される、一致するか又は相同な位置の数の関数である。ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域（又はポリペプチド又はポリペプチド領域）は、別の配列に対する特定のパーセンテージ（例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％）の「配列同一性」を有することは、アラインメントしたときに、塩基（又はアミノ酸）のそのパーセンテージが、２つの配列を比較する際に同じであることを意味する。このアラインメント及び相同性又は配列同一性パーセントは、当該技術分野で既知のソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。いくつかの実施形態において、デフォルトパラメータが、アラインメントのために使用される。１つのアラインメントプログラムはＢＬＡＳＴであり、デフォルトパラメータを使用する。特に、プログラムはＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＰであり、以下のデフォルトパラメータ：Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ、ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ、ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ、ｃｕｔｏｆｆ＝６０、ｅｘｐｅｃｔ＝１０、Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ、Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用する。これらのプログラムの詳細は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎで見出すことができる。生物学的に等価なポリヌクレオチドは、指定された相同性パーセントを有し、同じか又は類似の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするものである。２つの配列は、それらが互いに４０％未満の同一性、又は２５％未満の同一性を共有する場合、「無関連」又は「非相同的」とみなされる。

【0044】

本明細書に使用される場合、非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）からの超可変領域残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリンである。いくつかの実施形態において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に認められない残基を含み得る。これらの修飾は、結合親和性などの抗体性能を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメイン（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、又はＦｖ）の実質的に全てを含み、そこにおける超可変ループの全て又は実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサスＦＲ配列のものであるが、ＦＲ領域は、結合親和性を改善する１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、典型的には、Ｈ鎖では６個以下、Ｌ鎖では３個以下である。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含み得る。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。例えば、Ａｈｍｅｄ ＆ Ｃｈｅｕｎｇ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８８（２）：２８８－２９７（２０１４）を参照されたい。

【0045】

本明細書に使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」若しくは「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、Ｖ_Ｌにおける残基約２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、及び８９～９７（Ｌ３）の周囲、並びにＶ_Ｈにおける約３１～３５Ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）の周囲）（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））及び／又は「超可変ループ」からの残基（例えば、Ｖ_Ｌにおける残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、及び９１～９６（Ｌ３）、並びにＶ_Ｈにおける２６～３２（Ｈ１）、５２Ａ～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３））（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））を含む。

【0046】

本明細書に使用される場合、「同一の」又は「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈で使用される場合、以下に記載のデフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズム、又はマニュアルアラインメント及び目視検査（例えば、ＮＣＢＩウェブサイト）を使用して測定された、比較幅又は指定された領域にわたる最大の対応について比較及びアラインメントされる場合、同じであるか、又は同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの指定されたパーセント（すなわち、指定された領域（例えば、本明細書に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列又は本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列）にわたる約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより高い同一性）を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。次いで、かかる配列は、「実質的に同一」であると言われる。この用語はまた、試験配列の相補体を指すか、又はそれに適用することができる。この用語はまた、欠失及び／又は付加を有する配列、並びに置換を有する配列も含む。いくつかの実施形態において、同一性は、長さが少なくとも約２５個のアミノ酸若しくはヌクレオチド、又は長さが５０～１００個のアミノ酸若しくはヌクレオチドである領域にわたって存在する。

【0047】

本明細書に使用される場合、「インタクト抗体」又は「インタクト免疫グロブリン」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチド及び２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチドを有する抗体を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶ_Ｈと略される）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ_１、ＣＨ_２、及びＣＨ_３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶ_Ｌと略される）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、Ｃ_Ｌで構成される。Ｖ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分化することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシル末端に、以下の順序：ＦＲ_１、ＣＤＲ_１、ＦＲ_２、ＣＤＲ_２、ＦＲ_３、ＣＤＲ_３、ＦＲ_４で配置される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織又は因子との免疫グロブリンの結合を媒介することができる。

【0048】

本明細書に使用される場合、「リンカー」という用語は、２つ以上のポリペプチド又は核酸を、それらが互いに連結されるように共有結合する官能基（例えば、化学物質又はポリペプチド）を指す。本明細書に使用される場合、「ペプチドリンカー」は、２つのタンパク質を一緒に結合させるために（例えば、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを結合させるために）使用される１つ以上のアミノ酸を指す。特定の実施形態において、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_ｎのアミノ酸配列を含み、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上である。特定の実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４０）又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）の配列を有するアミノ酸を含む。

【0049】

本明細書に使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る自然に発生する可能性がある変異以外は同一である。例えば、モノクローナル抗体は、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む、それが産生される方法ではない、単一クローンに由来する抗体であることができる。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向される。更に、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。「モノクローナル」という修飾語句は、抗体の実質的に均一な集団から得られるときの抗体の特徴を示すが、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするとは解釈されない。モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術を含むがこれらに限定されない、当技術分野で既知の多種多様な技術を使用して調製することができる。例えば、本方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に報告されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、又は組換えＤＮＡ法によって作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１）で報告されている技術を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離され得る。

【0050】

本明細書に使用される場合、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、任意のＲＮＡ又はＤＮＡを意味し、非修飾又は修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。ポリヌクレオチドには、限定されないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、並びに一本鎖若しくはより典型的には二本鎖、又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。「ポリヌクレオチド」という用語はまた、１つ以上の修飾塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性又は他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡを含む。

【0051】

本明細書に使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与と適合性のある、任意及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌及び抗真菌化合物、等張性及び吸収遅延化化合物などを含むことが意図される。薬学的に許容される担体及びその製剤は、当業者に既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）に記載されている。

【0052】

本明細書に使用される場合、「ポリクローナル抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる抗体産生細胞株に由来する抗体の調製を意味する。本用語の使用は、抗原の異なるエピトープ又は領域に特異的に結合する抗体を含有する、少なくとも２つの抗体の調製物を含む。

【0053】

本明細書に使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸、すなわち、ペプチドアイソスター、を含むポリマーを意味する。ポリペプチドは、一般にペプチド、グリコペプチド、又はオリゴマーと称される短鎖、及び一般にタンパク質と称される長鎖の両方を指す。ポリペプチドは、２０個の遺伝子コードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。ポリペプチドには、翻訳後プロセシングなどの天然プロセス、又は当該技術分野において周知である化学修飾技術のいずれかによって修飾されたアミノ酸配列が含まれる。かかる修飾は、基本的なテキスト及びより詳細なモノグラフ、並びに膨大な研究文献に十分記載されている。

【0054】

本明細書に使用される場合、「組換え」という用語は、例えば、細胞、又は核酸、タンパク質、若しくはベクターに関連して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが、異種核酸若しくはタンパク質の導入、又は天然核酸若しくはタンパク質の変更によって修飾されているか、あるいは材料がそのように修飾された細胞に由来することを示す。よって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態には見られない遺伝子を発現するか、又はそうでなければ異常に発現されるか、過小発現されるか、若しくは全く発現されない天然遺伝子を発現する。

【0055】

本明細書に使用される場合、用語「別個の」治療的使用は、異なる経路による、同時又は実質的に同時の、少なくとも２つの活性成分の投与を指す。

【0056】

本明細書に使用される場合、用語「連続的な」治療的使用は、異なる時点での少なくとも２つの活性成分の投与を指し、投与経路は同一であるか、又は異なる。より特定的には、連続的使用は、一方の活性成分の後に他方の投与を開始する投与全体を指す。したがって、一方の活性成分を数分、数時間、又は数日にわたって投与して、その後に他の活性成分を投与することが可能である。この例では同時治療はない。

【0057】

本明細書に使用される場合、「同時の」治療的使用という用語は、同じ経路による、同時、又は実質的に同時の少なくとも２つの活性成分の投与を指す。

【0058】

本明細書に使用される場合、「単鎖抗体」又は「単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」という用語は、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶ_Ｌ及びＶ_Ｈの抗体融合分子を指す。単鎖抗体分子は、いくつかの個々の分子、例えば、二量体、三量体、又は他のポリマーを有するポリマーを含み得る。更に、Ｆ_ｖ断片の２つのドメインであるＶ_Ｌ及びＶ_Ｈは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって結合することができる（単鎖Ｆ_ｖ（ｓｃＦ_ｖ）として知られる）。Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８５：５８７９－５８８３。かかる単鎖抗体は、組換え技法又はインタクト抗体の酵素若しくは化学的切断によって調製することができる。

【0059】

本明細書に使用される場合、「特異的に結合する」とは、別の分子（例えば、抗原）を認識して結合するが、他の分子を実質的に認識及び結合しない分子（例えば、抗体又はその抗原結合断片）を指す。「特異的結合」、「に特異的に結合する」、又は特定の分子（例えば、ポリペプチド、又はポリペプチド上のエピトープ）に「対して特異的である」という用語は、本明細書に使用される場合、例えば、それが結合する分子に対して、約１０^－４Ｍ、１０^－５Ｍ、１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、又は１０^－１２ＭのＫ_Ｄを有する分子によって示すことができる。「特異的結合する」という用語は、分子（例えば、抗体又はその抗原結合断片）が特定のポリペプチド（例えば、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２ポリペプチド）、又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合し、いずれの他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープにも実質的に結合することがない結合を指し得る。

【0060】

本明細書に使用される場合、「対象」、「患者」、又は「個体」という用語は、個々の生物、脊椎動物、哺乳動物、又はヒトであることができる。いくつかの実施形態において、対象、患者、又は個体は、ヒトである。

【0061】

本明細書に使用される場合、「治療剤」という用語は、有効量で存在する場合、それを必要とする対象に対して所望の治療効果を生じる化合物を意味することが意図される。

【0062】

本明細書で使用される「治療すること」又は「治療」は、ヒトなどの対象における、本明細書に記載される疾患又は障害の治療を包含し、（ｉ）疾患若しくは障害を阻害すること、すなわち、その発症を阻害すること、（ｉｉ）疾患若しくは障害を緩和すること、すなわち、障害の退行を引き起こすこと、（ｉｉｉ）障害の進行を遅らせること、及び／又は（ｉｖ）疾患若しくは障害の１つ以上の症状の進行を阻害、緩和、若しくは遅延することを含む。いくつかの実施形態において、治療は、疾患に関連する症状が、例えば、緩和されるか、低減されるか、治癒されるか、又は寛解状態になることを意味する。

【0063】

本明細書に記載される障害の様々な治療モードは、全治療を含むが、全治療よりも少ない「実質的な」ことを意味することが意図され、いくつかの生物学的又は医学的に関連する結果が達成されることも理解されたい。治療は、慢性疾患のための継続的な長期治療、又は急性状態の治療のための単回、若しくは数回の投与であり得る。

【0064】

本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性抗体のアミノ酸配列修飾が企図される。かかる修飾は、抗体の結合親和性及び／若しくは他の生物学的特性を改善するために、例えば、コードされたアミノ酸をグリコシル化させるために、又はＣ１ｑ、Ｆｃ受容体に結合する抗体の能力を破壊するために、又は補体系を活性化するために、行われ得る。抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体核酸に適切なヌクレオチド変更を導入することによって、ペプチド合成によって、又は化学修飾によって調製される。かかる修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び／又はそれへの挿入及び／又はその置換が含まれる。得られた抗体が所望の特性を有する限り、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが目的の抗体を得るためになされる。修飾はまた、タンパク質のグリコシル化のパターンの変化を含む。置換変異誘発について最も関心が高い部位には、超可変領域が含まれるが、ＦＲ変更もまた企図される。

【0065】

保存的アミノ酸置換は、所与のアミノ酸を、類似する生化学的特性（例えば、電荷、疎水性、及びサイズ）を有する別のアミノ酸に変更するアミノ酸置換である。「保存的置換」を以下の表に示す。

【表1-1】

【表1-2】

【0066】

置換バリアントの一タイプは、親抗体の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。かかる置換バリアントを生成するために好都合な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟を含む。具体的には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６～７部位）を変異させて、全ての可能なアミノ酸置換を各部位で生じさせる。このように生成された抗体バリアントは、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物との融合として、繊維状ファージ粒子からの一価形式でディスプレイされる。次いで、ファージディスプレイされたバリアントを、本明細書に開示されるように、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾について超可変領域部位候補を特定するために、アラニンスキャニング変異誘発を行い、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を特定することができる。代替的に、又は追加的に、抗原－抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原との間の接触点を特定することが有益であり得る。かかる接触残基及び隣接する残基は、本明細書に詳述される技術による置換のための候補である。かかるバリアントが生成されると、バリアントのパネルは、本明細書に記載されるようにスクリーニングに供され、１つ以上の関連アッセイにおいて類似するか又は優れた特性を有する抗体が、更なる開発のために選択され得る。

【0067】

ＶＥＧＦ
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、一般に、脈管形成及び血管新生に関与するシグナル伝達タンパク質のサブファミリーである。ＶＥＧＦ－Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１５６９２．２、配列番号３８）は、タンパク質の最も一般的に研究され、関連する形態である。ベバシズマブ、ラニビズマブ、及びアフリベルセプトなどの薬物は全て、血管新生関連疾患状態を低減するために、このタンパク質を標的とする。内皮細胞のための分泌されたマイトジェンとしてのＶＥＧＦの役割の特定前に、それは血管透過性因子として特定され、増殖、移動、特殊化、及び生存を含む、内皮細胞挙動の多くの異なる態様を制御するＶＥＧＦの能力を強調した（Ｒｕｈｒｂｅｒｇ，２００３ ＢｉｏＥｓｓａｙｓ ２５：１０５２－１０６０）。ＶＥＧＦファミリーメンバーとしては、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、及び内分泌腺由来ＶＥＧＦ（ＥＧ－ＶＥＧＦ）が挙げられる。ＶＥＧＦの活性形態は、他のＶＥＧＦファミリーメンバーとともにホモ二量体又はヘテロ二量体のいずれかとして合成される。ＶＥＧＦ－Ａは、代替スプライシングによって生成される６つのアイソフォーム：ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９、及びＶＥＧＦ２０６に存在する。これらのアイソフォームは、主にそれらのバイオアベイラビリティにおいて異なり、ＶＥＧＦ１６５が優勢なアイソフォームである（Ｐｏｄａｒ，ｅｔ ａｌ．２００５ Ｂｌｏｏｄ １０５（４）：１３８３－１３９５）。様々なアイソフォームの段階特異的及び組織特異的比を生成する胚発生中のスプライシングの調節は、ＶＥＧＦに応答する内皮細胞の明確で文脈依存的な挙動のための豊富な可能性を生み出す。ＶＥＧＦは、正常及び疾患関連血管新生（Ｊａｋｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ：１３３，８４８－８５９、Ｋｏｌｃｈ，ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：３６，１３９－１５５）並びに血管透過性（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．１９８９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ：２６４，２００１７－２００２４）の両方の重要な刺激因子であると考えられている。

【0068】

Ａｎｇ－２
Ａｎｇ－２及びＶＥＧＦは、病理学的血管新生及び転移を促進するために協調して作用する。Ａｎｇ－２の上方調節は、ＶＥＧＦ経路阻害に対する回避メカニズムである。Ａｎｇ１ではなく、Ａｎｇ２レベルは、ヒト網膜血管疾患において上昇する。ＶＥＧＦファミリーに加えて、アンジオポエチンは、血管発生及び出生後血管新生に関与すると考えられている。ＡＮＧ－２（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＦ２１６２７．２、配列番号３９）発現は、主に、ＡＮＧ－１の構成的安定化又は成熟機能を遮断し、血管が発芽シグナルにより応答し得る可塑性状態に戻り、留まることを可能にすると考えられる血管リモデリングの部位に限定される（Ｈａｎａｈａｎ，１９９７、Ｈｏｌａｓｈ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：５３５６－６２（１９９９）、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，１９９７）。通常、Ａｎｇ－２は、血管形成事象を混乱させる。しかしながら、ＶＥＧＦの存在下では、新生血管形成がもたらされる。このタンパク質、及びその関連する経路、Ｔｉｅ２は、ＶＥＧＦとともにＣＮＶ進行に寄与することが示されている。ＬＣ－１０は、入手可能な主要な抗Ａｎｇ－２薬物である。

【0069】

本技術の免疫グロブリン関連組成物
本技術は、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性抗体又はその抗原結合断片）の生成及び使用のための方法及び組成物を記載する。本技術の抗体及び抗原結合断片は、ＶＥＧＦ及びＡｎｇ－２ポリペプチドに選択的に結合する。本開示の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性免疫グロブリン関連組成物は、ＣＮＶの診断、又は治療に有用であり得る。本技術の範囲内の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性免疫グロブリン関連組成物には、例えば、標的ポリペプチド、ホモログ、誘導体、又はその断片に特異的に結合するモノクローナル、キメラ、ヒト化、二重特異性抗体、及びダイアボディが含まれるが、これらに限定されない。本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性免疫グロブリン関連組成物のアミノ酸配列が、図１３Ａ～１３Ｅに記載される。

【0070】

一態様において、本開示は、ＶＥＧＦエピトープに結合する第１の抗原結合部分と、Ａｎｇ－２エピトープに結合する少なくとも第２の抗原結合部分と、を含む、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体又はその抗原結合断片を提供し、第１の抗原結合部分は、第１の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び第１の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、第２の抗原結合部分は、第２のＶ_Ｈ及び第２のＶ_Ｌを含み、（ａ）第１のＶ_Ｈは、配列番号１３のＶ_Ｈ－ＣＤＲ１配列、配列番号１４のＶ_Ｈ－ＣＤＲ２配列、及び配列番号１５若しくは配列番号４２からなる群から選択されるＶ_Ｈ－ＣＤＲ３配列を含み、かつ／又は第１のＶ_Ｌは、配列番号１６のＶ_Ｌ－ＣＤＲ１配列、配列番号１７のＶ_Ｌ－ＣＤＲ２配列、及び配列番号１８のＶ_Ｌ－ＣＤＲ３配列を含む。追加的又は代替的に、本明細書に開示される多重特異性（例えば、二重特異性）抗体又は抗原結合断片のいくつかの実施形態において、第２のＶ_Ｈは、配列番号１９のＶ_Ｈ－ＣＤＲ１配列、配列番号２０若しくは配列番号４３のＶ_Ｈ－ＣＤＲ２配列、及び配列番号２１のＶ_Ｈ－ＣＤＲ３配列を含み、かつ／又は第２のＶ_Ｌは、配列番号２２のＶ_Ｌ－ＣＤＲ１配列、配列番号２３のＶ_Ｌ－ＣＤＲ２配列、及び配列番号２４のＶ_Ｌ－ＣＤＲ３配列を含む。

【0071】

一態様において、本開示は、ＶＥＧＦエピトープに結合する第１の抗原結合部分と、Ａｎｇ－２エピトープに結合する少なくとも第２の抗原結合部分と、を含む、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体又はその抗原結合断片を提供し、第１の抗原結合部分は、第１の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び第１の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、第２の抗原結合部分は、第２のＶ_Ｈ及び第２のＶ_Ｌを含み、第１のＶ_Ｈは、配列番号２５若しくは配列番号４４のアミノ酸配列を含み、かつ／又は第１のＶ_Ｌは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。追加的又は代替的に、本明細書に開示される多重特異性（例えば、二重特異性）抗体又は抗原結合断片のいくつかの実施形態において、第２のＶ_Ｈは、配列番号２６若しくは配列番号４５のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／又は第２のＶ_Ｌは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。

【0072】

上記の実施形態のうちのいずれかにおいて、抗体は、任意のアイソタイプ、例えば、これらに限定されないが、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ、及びＩｇＹのＦｃドメインを更に含む。定常領域配列の非限定的な例には、以下が含まれる。

【0073】

ヒトＩｇＤ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８８０（配列番号２９）
ＡＰＴＫＡＰＤＶＦＰＩＩＳＧＣＲＨＰＫＤＮＳＰＶＶＬＡＣＬＩＴＧＹＨＰＴＳＶＴＶＴＷＹＭＧＴＱＳＱＰＱＲＴＦＰＥＩＱＲＲＤＳＹＹＭＴＳＳＱＬＳＴＰＬＱＱＷＲＱＧＥＹＫＣＶＶＱＨＴＡＳＫＳＫＫＥＩＦＲＷＰＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＧＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰＥＣＰＳＨＴＱＰＬＧＶＹＬＬＴＰＡＶＱＤＬＷＬＲＤＫＡＴＦＴＣＦＶＶＧＳＤＬＫＤＡＨＬＴＷＥＶＡＧＫＶＰＴＧＧＶＥＥＧＬＬＥＲＨＳＮＧＳＱＳＱＨＳＲＬＴＬＰＲＳＬＷＮＡＧＴＳＶＴＣＴＬＮＨＰＳＬＰＰＱＲＬＭＡＬＲＥＰＡＡＱＡＰＶＫＬＳＬＮＬＬＡＳＳＤＰＰＥＡＡＳＷＬＬＣＥＶＳＧＦＳＰＰＮＩＬＬＭＷＬＥＤＱＲＥＶＮＴＳＧＦＡＰＡＲＰＰＰＱＰＧＳＴＴＦＷＡＷＳＶＬＲＶＰＡＰＰＳＰＱＰＡＴＹＴＣＶＶＳＨＥＤＳＲＴＬＬＮＡＳＲＳＬＥＶＳＹＶＴＤＨＧＰＭＫ

【0074】

ヒトＩｇＧ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７（配列番号３０）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0075】

ヒトＩｇＧ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５９（配列番号３１）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0076】

ヒトＩｇＧ３定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６０（配列番号３２）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＴＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0077】

ヒトＩｇＭ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７１（配列番号３３）
ＧＳＡＳＡＰＴＬＦＰＬＶＳＣＥＮＳＰＳＤＴＳＳＶＡＶＧＣＬＡＱＤＦＬＰＤＳＩＴＬＳＷＫＹＫＮＮＳＤＩＳＳＴＲＧＦＰＳＶＬＲＧＧＫＹＡＡＴＳＱＶＬＬＰＳＫＤＶＭＱＧＴＤＥＨＶＶＣＫＶＱＨＰＮＧＮＫＥＫＮＶＰＬＰＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩＫＥＳＤＷＬＧＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ

【0078】

ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６１（配列番号３４）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

【0079】

ヒトＩｇＡ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６（配列番号３５）
ＡＳＰＴＳＰＫＶＦＰＬＳＬＣＳＴＱＰＤＧＮＶＶＩＡＣＬＶＱＧＦＦＰＱＥＰＬＳＶＴＷＳＥＳＧＱＧＶＴＡＲＮＦＰＰＳＱＤＡＳＧＤＬＹＴＴＳＳＱＬＴＬＰＡＴＱＣＬＡＧＫＳＶＴＣＨＶＫＨＹＴＮＰＳＱＤＶＴＶＰＣＰＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＶＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＥＰＷＮＨＧＫＴＦＴＣＴＡＡＹＰＥＳＫＴＰＬＴＡＴＬＳＫＳＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ

【0080】

ヒトＩｇＡ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７７（配列番号３６）
ＡＳＰＴＳＰＫＶＦＰＬＳＬＤＳＴＰＱＤＧＮＶＶＶＡＣＬＶＱＧＦＦＰＱＥＰＬＳＶＴＷＳＥＳＧＱＮＶＴＡＲＮＦＰＰＳＱＤＡＳＧＤＬＹＴＴＳＳＱＬＴＬＰＡＴＱＣＰＤＧＫＳＶＴＣＨＶＫＨＹＴＮＰＳＱＤＶＴＶＰＣＰＶＰＰＰＰＰＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＡＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＱＰＷＮＨＧＥＴＦＴＣＴＡＡＨＰＥＬＫＴＰＬＴＡＮＩＴＫＳＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＭＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ

【0081】

ヒトＩｇカッパ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８３４（配列番号３７）
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

【0082】

いくつかの実施形態において、本技術の免疫グロブリン関連組成物は、配列番号２９～３６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％同一であるか、又は１００％同一である重鎖定常領域を含む。追加的又は代替的に、いくつかの実施形態において、本技術の免疫グロブリン関連組成物は、配列番号３７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％同一であるか、又は１００％同一である軽鎖定常領域を含む。

【0083】

追加的又は代替的に、いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ＶＥＧＦ及び／又はＡｎｇ－２ポリペプチドの細胞外領域に結合する。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、Ａｎｇ－２ポリペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、エピトープは、立体構造エピトープ又は非立体構造エピトープである。

【0084】

いくつかの実施形態において、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列は、同じポリペプチド鎖の構成要素である。他の実施形態において、ＨＣ及びＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、異なるポリペプチド鎖の構成要素である。特定の実施形態において、抗体は、全長抗体である。

【0085】

いくつかの実施形態において、本技術の免疫グロブリン関連組成物は、少なくとも１つのＶＥＧＦポリペプチド及び／又は少なくとも１つのＡｎｇ－２ポリペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、本技術の免疫グロブリン関連組成物は、少なくとも１つのＶＥＧＦポリペプチドに約１０^－３Ｍ、１０^－４Ｍ、１０^－５Ｍ、１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、若しくは１０^－１２Ｍの解離定数（ＫＤ）で、及び／又は少なくとも１つのＡｎｇ－２ポリペプチドに約１０^－３Ｍ、１０^－４Ｍ、１０^－５Ｍ、１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、若しくは１０^－１２Ｍの解離定数（ＫＤ）で結合する。特定の実施形態において、免疫グロブリン関連組成物は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、又は多重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト抗体フレームワーク領域を含む。

【0086】

特定の実施形態において、免疫グロブリン関連組成物は、Ｎ２９７Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｈ４３５Ａ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含むＩｇＧ１定常領域を含有する。追加的、又は代替的に、いくつかの実施形態において、免疫グロブリン関連組成物は、Ｓ２２８Ｐ変異を含むＩｇＧ４定常領域を含有する。

【0087】

一態様において、本技術の免疫グロブリン関連組成物は、それぞれ、配列番号１及び２、配列番号５及び６、並びに配列番号９及び１０からなる群から選択される重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含む。

【0088】

一態様において、本開示は、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖、及び第４のポリペプチド鎖を含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を提供し、第１及び第２のポリペプチド鎖は、互いに共有結合し、第２及び第３のポリペプチド鎖は、互いに共有結合し、第３及び第４のポリペプチド鎖は、互いに共有結合し、（ａ）第１のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖の各々は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、（ｉ）第１のエピトープに特異的に結合することができる第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインと、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖定常ドメインと、を含み、（ｂ）第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖の各々は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、（ｉ）第１のエピトープに特異的に結合することができる第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインと、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖定常ドメインと、（ｉｉｉ）アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_２を含む可撓性ペプチドリンカーと、（ｉｖ）第２の免疫グロブリンの相補的重鎖可変ドメインに連結している第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン、又は第２の免疫グロブリンの相補的軽鎖可変ドメインに連結している第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインと、を含み、第２の免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖可変ドメインは、第２のエピトープに特異的に結合することができ、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_４を含む可撓性ペプチドリンカーを介して一緒に連結して、一本鎖可変断片を形成し、第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインは、配列番号２５若しくは４４のうちのいずれか１つを含み、かつ／又は第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインは、配列番号２７を含む。追加的又は代替的に、いくつかの実施形態において、第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインは、配列番号２６若しくは４５のいずれか１つを含み、かつ／又は第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインは、配列番号２８を含む。

【0089】

いくつかの態様において、本明細書に記載の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性免疫グロブリン関連組成物は、迅速な結合並びに細胞取り込み及び／又は緩やかな放出を促進するための構造的修飾を含有する。いくつかの態様において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗体）は、ＣＨ２定常重鎖領域に欠失を含有して、迅速な結合並びに細胞取り込み及び／又は緩やかな放出を促進し得る。いくつかの態様において、Ｆａｂ断片を使用して、迅速な結合並びに細胞取り込み及び／又は緩やかな放出を促進する。いくつかの態様において、Ｆ（ａｂ）’２断片を使用して、迅速な結合並びに細胞取り込み及び／又は緩やかな放出を促進する。

【0090】

一態様において、本技術は、本明細書に記載される免疫グロブリン関連組成物のうちのいずれか及び全てをコードする組換え核酸配列を提供する。本明細書に記載される免疫グロブリン関連組成物のうちのいずれかをコードする任意の核酸配列を発現する宿主細胞も本明細書に開示される。

【0091】

本技術の免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性抗体）は、二重特異性、三重特異性、又はより多い多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つ以上のＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２ポリペプチドの異なるエピトープについて、及び異種ポリペプチド又は固体支持材などの異種組成物について特異的であることができる。例えば、ＷＯ９３／１７７１５、ＷＯ９２／０８８０２、ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／０５７９３、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９（１９９１）、米国特許第５，５７３，９２０号、同第４，４７４，８９３号、同第５，６０１，８１９号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第６，１０６，８３５号、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７－１５５３（１９９２）を参照されたい。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン関連組成物は、キメラである。特定の実施形態において、免疫グロブリン関連組成物は、ヒト化されている。

【0092】

本技術の免疫グロブリン関連組成物は更に、異種ポリペプチドにＮ末端若しくはＣ末端で組換え的に融合することができるか、又はポリペプチド若しくは他の組成物に化学的にコンジュゲートすることができる（共有結合的及び非共有結合的コンジュゲーションを含む）。例えば、本技術の免疫グロブリン関連組成物は、検出アッセイの標識として有用な分子、及び異種ポリペプチド、薬物、又は毒素などのエフェクター分子に組換え的に融合又はコンジュゲートすることができる。例えば、ＷＯ９２／０８４９５、ＷＯ９１／１４４３８、ＷＯ８９／１２６２４、米国特許第５，３１４，９９５号、及びＥＰ０３９６３８７を参照されたい。

【0093】

本技術の免疫グロブリン関連組成物の上記実施形態のいずれかにおいて、抗体又は抗原結合断片は、任意選択的に、同位体、色素、クロマゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）、造影剤、薬物、毒素、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、成長因子、放射性核種、金属、リポソーム、ナノ粒子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される薬剤にコンジュゲートされ得る。化学結合又は物理結合について、免疫グロブリン関連組成物上の官能基は、典型的には、薬剤上の官能基と会合する。あるいは、薬剤上の官能基は、免疫グロブリン関連組成物上の官能基と会合する。

【0094】

薬剤及び免疫グロブリン関連組成物上の官能基は、直接会合することができる。例えば、薬剤上の官能基（例えば、スルフヒドリル基）は、免疫グロブリン関連組成物上の官能基（例えば、スルフヒドリル基）と会合して、ジスルフィドを形成することができる。あるいは、官能基は、架橋剤（すなわち、リンカー）を通して会合することができる。架橋剤のいくつかの例を以下に記載する。架橋剤は、薬剤又は免疫グロブリン関連組成物のいずれかに結合することができる。コンジュゲート中の薬剤又は免疫グロブリン関連組成物の数は、他方に存在する官能基の数によっても限定される。例えば、コンジュゲートに会合した薬剤の最大数は、免疫グロブリン関連組成物に存在する官能基の数に依存する。あるいは、薬剤と会合した免疫グロブリン関連組成物の最大数は、薬剤に存在する官能基の数に依存する。

【0095】

更に別の実施形態において、コンジュゲートは、１つの薬剤に会合した１つの免疫グロブリン関連組成物を含む。一実施形態において、コンジュゲートは、少なくとも１つの免疫グロブリン関連組成物に化学的に結合した（例えば、コンジュゲートした）少なくとも１つの薬剤を含む。薬剤は、当業者に既知の任意の方法によって免疫グロブリン関連組成物に化学的に結合することができる。例えば、薬剤上の官能基は、免疫グロブリン関連組成物上の官能基に直接結合し得る。好適な官能基のいくつかの例としては、例えば、アミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、マレイミド、イソシアネート、イソチオシアネート、及びヒドロキシルが挙げられる。

【0096】

薬剤はまた、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミドなどのような、架橋剤によって免疫グロブリン関連組成物に化学的に結合し得る。架橋剤は、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌから得ることができる。Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．ウェブサイトは、援助を提供することができる。追加の架橋剤としては、Ｋｒｅａｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｖ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓの米国特許第５，５８０，９９０号、同第５，９８５，５６６号、及び同第６，１３３，０３８号に記載される白金架橋剤が挙げられる。

【0097】

あるいは、薬剤上の官能基及び免疫グロブリン関連組成物は、同じであり得る。ホモ二官能性架橋剤は、典型的には、同一の官能基を架橋するために使用される。ホモ二官能性架橋剤の例としては、ＥＧＳ（すなわち、ビス［スクシンイミジルコハク酸］エチレングリコール）、ＤＳＳ（すなわち、スベリン酸ジスクシンイミジル）、ＤＭＡ（すなわち、アジプイミド酸ジメチル．２ＨＣｌ）、ＤＴＳＳＰ（すなわち、３，３’－ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオン酸塩］）、ＤＰＤＰＢ（すなわち、１，４－ジ－［３’－（２’－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ブタン）、及びＢＭＨ（すなわち、ビス－マレイミドヘキサン）が挙げられる。かかるホモ二官能性架橋剤はまた、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から入手可能である。

【0098】

他の場合において、薬剤を免疫グロブリン関連組成物から切断することが有益であり得る。上記のＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．のウェブサイトはまた、例えば、細胞における酵素によって切断することができる好適な架橋剤を選択することにおいて、当業者に援助を提供することができる。よって、薬剤は、免疫グロブリン関連組成物から分離することができる。切断可能なリンカーの例としては、ＳＭＰＴ（すなわち、４－スクシンイミジルオキシカルボニル－メチル－ａ－［２－ピリジルジチオ］トルエン）、スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（すなわち、スルホスクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＬＣ－ＳＰＤＰ（すなわち、スクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド）ヘキサノエート）、スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（すなわち、スルホスクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド） ヘキサノエート）、ＳＰＤＰ（すなわち、Ｎ－スクシンイミジル３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミドヘキサノエート）、及びＡＥＤＰ（すなわち、３－［（２－アミノエチル）ジチオ］プロピオン酸ＨＣｌ）が挙げられる。

【0099】

別の実施形態において、コンジュゲートは、少なくとも１つの免疫グロブリン関連組成物と物理的に結合した少なくとも１つの薬剤を含む。当業者に既知の任意の方法は、薬剤を免疫グロブリン関連組成物と物理的に結合させるために使用することができる。例えば、免疫グロブリン関連組成物及び薬剤は、当業者に既知の任意の方法によって一緒に混合することができる。混合の順序は、重要ではない。例えば、薬剤は、当業者に既知の任意の方法によって免疫グロブリン関連組成物と物理的に混合することができる。例えば、免疫グロブリン関連組成物及び薬剤は、容器に入れ、例えば、容器を振盪することによって撹拌して、免疫グロブリン関連組成物及び薬剤を混合することができる。

【0100】

免疫グロブリン関連組成物は、当業者に既知の任意の方法によって修飾することができる。例えば、免疫グロブリン関連組成物は、上記のように、架橋剤又は官能基によって修飾され得る。

【0101】

本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性抗体を調製する方法
一般的な概要。最初に、標的ポリペプチドが選択され、それに対して本技術の抗体を上昇させることができる。例えば、抗体は、全長ＶＥＧＦ若しくはＡｎｇ－２タンパク質、又はＶＥＧＦ若しくはＡｎｇ－２タンパク質の細胞外ドメインの一部分に対して上昇され得る。かかる標的ポリペプチドに向けられる抗体を生成するための技術は、当業者に周知である。かかる技術の例には、例えば、ディスプレイライブラリ、ｘｅｎｏ又はヒトマウス、ハイブリドーマなどを伴うものが含まれるが、これらに限定されない。本技術の範囲内の標的ポリペプチドには、免疫応答を誘発することができる細胞外ドメインを含有するＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質に由来する任意のポリペプチドが含まれる。

【0102】

ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質及びその断片に向けられる、組換え操作された抗体及び抗体断片、例えば、抗体関連ポリペプチドは、本開示による使用に好適であることを理解されたい。

【0103】

本明細書に示される技法に供することができる抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、抗体軽鎖、抗体重鎖、及び／又は抗体断片などの抗体断片が含まれる。抗体Ｆｖ含有ポリペプチド、例えば、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２抗体断片の高収率産生に有用な方法が記載されている。米国特許第５，６４８，２３７号を参照されたい。

【0104】

一般に、抗体は、発端となる種から得られる。より具体的には、標的ポリペプチド抗原に対して特異性を有する発端となる種の抗体の軽鎖、重鎖、又はその両方の可変部分の核酸又はアミノ酸配列が得られる。発端となる種は、本技術の抗体又は抗体のライブラリ（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、サル、ヒトなど）を生成するのに有用であった任意の種である。

【0105】

ファージ又はファージミドディスプレイ技術は、本技術の抗体を誘導するのに有用な技術である。モノクローナル抗体を生成及びクローニングする技術は、当業者に周知である。本技術の抗体をコードする配列の発現は、Ｅ．ｃｏｌｉで実行することができる。

【0106】

核酸コード配列の縮重性により、天然に存在するタンパク質のものと実質的に同じアミノ酸配列をコードする他の配列が、本技術の実施において使用され得る。これらには、限定されないが、上記のポリペプチドをコードする核酸配列の全部又は一部を含む核酸配列が含まれ、これらは、配列内の機能的に等価なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変更され、したがって、サイレント変化を生じる。本技術による免疫グロブリンのヌクレオチド配列は、標準的な方法（“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７－１４９，１９９８，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）によって計算される場合、かかるバリアントがＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質を認識する有効抗体を形成する限り、最大２５％の配列相同性変動を許容することが理解される。例えば、ポリペプチド配列内の１つ以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として作用する類似の極性の別のアミノ酸によって置換され得、サイレント改変をもたらす。配列内のアミノ酸における置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。また、本技術の範囲内には、例えば、グリコシル化、タンパク質分解切断、抗体分子又は他の細胞リガンドとの結合などによって、翻訳中又は翻訳後に差次的に修飾されるタンパク質、又はその断片若しくは誘導体が含まれる。追加的に、免疫グロブリンコード核酸配列を、インビトロ若しくはインビボで変異させて、翻訳、開始、及び／若しくは終結配列を作製及び／若しくは破壊するか、あるいはコード領域に変異を作製し、かつ／若しくは新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するか、又は既存のものを破壊して、インビトロ修飾を更に促進することができる。インビトロ部位特異的変異誘発、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１、Ｔａｂリンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用などを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の変異誘発のための任意の技法を使用することができる。

【0107】

ポリクローナル抗血清及び免疫原の調製。本技術の抗体又は抗体断片を生成する方法は、典型的には、対象（一般に、マウス又はウサギなどの非ヒト対象）を、精製されたＶＥＧＦ若しくはＡｎｇ－２タンパク質若しくはその断片で、又はＶＥＧＦ若しくはＡｎｇ－２タンパク質若しくはその断片で免疫化することを含む。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換え発現ＶＥＧＦ若しくはＡｎｇ－２タンパク質、又は化学合成ＶＥＧＦ若しくはＡｎｇ－２ペプチドを含有することができる。ＶＥＧＦ若しくはＡｎｇ－２タンパク質の細胞外ドメイン、又はその一部若しくは断片を免疫原として使用して、ＶＥＧＦ若しくはＡｎｇ－２タンパク質、又はその一部若しくは断片に結合する抗ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２抗体を、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体調製のための標準技法を使用して生成することができる。

【0108】

いくつかの実施形態において、抗原性ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２ペプチドは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００個のアミノ酸残基を含む。より長い抗原性ペプチドが、使用に応じ、当業者に周知の方法に従い、より短い抗原性ペプチドよりも時には望ましい。所与のエピトープの多量体が、時には単量体よりも効果的である。

【0109】

必要に応じて、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質（又はその断片）の免疫原性は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）又はオバルブミン（ＯＶＡ）などの担体タンパク質との融合又はコンジュゲーションによって増加させることができる。多くのかかる担体タンパク質が、当技術分野で知られている。また、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質をフロイント完全又は不完全アジュバントなどの従来のアジュバントと組み合わせて、ポリペプチドに対する対象の免疫反応を増加させることができる。免疫学的応答を増加させるために使用される様々なアジュバントには、フロイント（完全及び不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、ジニトロフェノールなど）、Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍなどのヒトアジュバント、又は同様の免疫刺激化合物が含まれるが、これらに限定されない。これらの技法は、当該技術分野において標準的である。

【0110】

あるいは、ナノ粒子、例えば、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を使用して、抗原、例えば、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２を宿主動物に提示することができる。ウイルス様粒子は、真正のネイティブウイルスの組織体及び立体構造を模倣する多タンパク質構造であり、いかなるウイルス遺伝物質も担持しないため、感染性であることない（Ｕｒａｋａｍｉ Ａ，ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４：ｅ０００９０－１７（２０１７））。宿主免疫系に導入されると、ＶＬＰは効果的な免疫応答を誘発し、それらを外来抗原の誘引的な担体にすることができる。ＶＬＰベースの抗原提示プラットフォームの重要な利点は、高密度で反復的な手段で抗原を提示できることである。したがって、抗原担持ＶＬＰは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の架橋結合を効果的に可能にすることによって、強いＢ細胞応答を誘導することができる。ＶＬＰは、それらの特性、例えば、免疫原性をより精確にするために、遺伝子操作され得る。これらの技法は、当該技術分野において標準的である。

【0111】

抗体が上昇するように十分に精製されたタンパク質又はポリペプチドの単離は、時間がかかり、時には技術的に困難であり得る。従来のタンパク質ベースの免疫に関連する追加の課題には、タンパク質抗原の安全性、安定性、スケーラビリティ、及び一貫性にわたる懸念が含まれる。核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）ベースの免疫が、有望な選択肢として出現している。ＤＮＡワクチンは、通常、候補抗原、例えば、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２のポリペプチド配列をコードする細菌プラスミドに基づいている。頑強な真核生物プロモーターを用いて、宿主がプラスミドを接種されると、コードされた抗原が発現させて、十分なレベルの導入遺伝子発現を得ることができる（Ｇａｌｖｉｎ Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２０００，１８：２５６６－２５８３）。現代のＤＮＡワクチンの生成は、ＤＮＡ合成、あるいはプラスミドベクターへのワンステップクローニング、及びプラスミドのその後の単離に依存しており、製造にかかる時間及びコストを大幅に削減させる。得られるプラスミドＤＮＡはまた、室温で非常に安定であり、冷蔵輸送を回避し、実質的に延長した有効期限をもたらす。これらの技法は、当該技術分野において標準的である。

【0112】

代替的に、目的の抗原、例えば、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２をコードする核酸配列は、ｍＲＮＡ分子に合成的に導入することができる。次いで、ｍＲＮＡを宿主動物に送達し、その細胞は、ｍＲＮＡ配列を認識して、候補抗原、例えば、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２のポリペプチド配列に翻訳し、したがって、外来抗原に対する免疫応答を誘発する。ｍＲＮＡ抗原又はｍＲＮＡワクチンの魅力的な特徴は、ｍＲＮＡが非感染性で、組み込みのないプラットフォームであることである。ＤＮＡワクチンに関連する感染又は挿入変異誘発の潜在的なリスクはない。加えて、ｍＲＮＡは、通常の細胞プロセスによって分解され、設計及び送達方法の修飾を通して制御可能なインビボ半減期を有する（Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６：１８３３－１８４０（２００８）、Ｋａｕｆｆｍａｎ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２４０，２２７－２３４（２０１６）、Ｇｕａｎ，Ｓ． ＆ Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２４，１３３－１４３（２０１７）、Ｔｈｅｓｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２３，１４５６－１４６４（２０１５））。これらの技法は、当該技術分野において標準的である。

【0113】

本技術を記載する際に、免疫応答は、「一次」又は「二次」免疫応答のいずれかとして記載され得る。「保護的」免疫応答としても記載される一次免疫応答は、特定の抗原、例えば、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質へのいくつかの初期曝露（例えば、初期「免疫化」又は「プライミング」）の結果として、個体で生じる免疫応答を指す。いくつかの実施形態において、免疫は、個体に抗原を含有するワクチンを接種する結果として生じることができる。例えば、ワクチンは、１つ以上のＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質由来抗原を含むＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２ワクチンであることができる。一次免疫応答は、時間の経過とともに弱化又は減少し、消失又は少なくともそれが検出できないほど減少さえし得る。したがって、本技術はまた、「二次」免疫応答に関するものであり、「記憶免疫応答」としても本明細書に記載される。二次免疫応答という用語は、一次免疫応答が既に生じている個体に誘発される免疫応答を指す。

【0114】

したがって、二次免疫応答を誘発して、例えば、弱化若しくは減少してきている既存の免疫応答を増強（例えば、ブースト）するか、又は消失しているか、若しくはもはや検出できない以前の免疫応答を再構築することができる。二次又は記憶免疫応答は、体液性（抗体）応答又は細胞性応答のいずれかであることができる。二次又は記憶体液性応答は、抗原の最初の提示時に生成された記憶Ｂ細胞の刺激で生じる。遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介される細胞二次又は記憶免疫応答のタイプである。抗原に対する最初の曝露は、免疫系をプライミングし、追加の曝露が、ＤＴＨをもたらす。

【0115】

適切な免疫後、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、対象の血清から調製することができる。所望の場合、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質に対して向けられた抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離することができ、ポリペプチドＡクロマトグラフィーなどの周知の技法によって更に精製して、ＩｇＧ画分を得ることができる。

【0116】

モノクローナル抗体。本技術の一実施形態において、抗体は、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又は抗Ａｎｇ－２モノクローナル抗体である。例えば、いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ又は抗Ａｎｇ－２モノクローナル抗体は、ヒト又はマウス抗ＶＥＧＦ又は抗Ａｎｇ－２モノクローナル抗体であり得る。ＶＥＧＦタンパク質若しくはＡｎｇ－２タンパク質、又はその誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログに対して向けられるモノクローナル抗体の調製のために、連続細胞株培養によって抗体分子の産生を提供する任意の技法を利用することができる。かかる技法としては、これらに限定されないが、ハイブリドーマ技法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５．Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７を参照されたい）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２を参照されたい）、及びヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶハイブリドーマ技法（例えば、Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６を参照されたい）が挙げられる。ヒトモノクローナル抗体は、本技術の実施において利用することができ、ヒトハイブリドーマを使用することによって（例えば、Ｃｏｔｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６－２０３０を参照されたい）又はヒトＢ細胞をエプスタインバールウイルスでインビトロで形質転換することによって（例えば、Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６を参照されたい）産生することができる。例えば、抗体の領域をコードする核酸の集団を単離することができる。抗体の保存された領域をコードする配列に由来するプライマーを利用したＰＣＲを使用して、抗体の部分をコードする配列を集団から増幅させ、次いで、抗体又は可変ドメインなどのその断片をコードするＤＮＡを、増幅させた配列から再構築する。かかる増幅させた配列はまた、ファージ又は細菌での融合ポリペプチドの発現及び提示のために、他のタンパク質－例えば、バクテリオファージコート、又は細菌細胞表面タンパク質－をコードするＤＮＡに融合することができる。増幅された配列を発現させ、更に、例えば、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質に存在する抗原又はエピトープに対して発現された抗体又はその断片の親和性に基づいて、選択又は単離することができる。代替的に、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又は抗Ａｎｇ－２モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、対象を免疫し、次いで、定型的方法を使用して、対象の脾臓からハイブリドーマを単離することによって調製することができる。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｇａｌｆｒｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８１）７３：３－４６）を参照されたい。標準的な方法を使用してハイブリドーマをスクリーニングすると、様々な特異性（すなわち、異なるエピトープに対する）及び親和性のモノクローナル抗体が生成される。所望の特性、例えば、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２結合を有する選択されたモノクローナル抗体は、ハイブリドーマによって発現されるように使用することができ、それは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの分子に結合させてその特性を変更することができるか、又はそれをコードするｃＤＮＡを、様々な方法で単離、配列決定、及び操作することができる。合成デンドロマーツリーを反応性アミノ酸側鎖、例えばリジンに付加して、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質の免疫原性特性を増強することができる。また、ＣＰＧ－ジヌクレオチド技法を使用して、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質の免疫原性特性を増強することができる。他の操作には、保存中又は対象への投与後の抗体の不安定性に関与する特定のアミノアシル残基の置換又は欠失、及びＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質を標的とする抗体の親和性を改善する親和性成熟技法が含まれる。

【0117】

ハイブリドーマ技法。いくつかの実施形態において、本技術の抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入非ヒト動物、例えば、遺伝子導入マウスから得られたＢ細胞を含む、ハイブリドーマによって産生された抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又は抗Ａｎｇ－２モノクローナル抗体である。ハイブリドーマ技法は、当該技術分野で既知であり、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，３４９（１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５６３－６８１（１９８１）に教示されている。ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体を生成するための他の方法は、当業者に周知である。

【0118】

ファージディスプレイ技法。上述したように、本技術の抗体は、組換えＤＮＡ及びファージディスプレイ技術の適用によって産生することができる。例えば、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗Ａｎｇ－２抗体は、当該技術分野で既知の様々なファージディスプレイ方法を使用して調製することができる。ファージディスプレイ方法では、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上に提示される。所望の結合特性を有するファージは、典型的には、固体表面又はビーズに結合又は捕捉された抗原を用いて直接的に選択することによって、レパートリー又は組み合わせ抗体ライブラリ（例えば、ヒト又はネズミ）から選択される。これらの方法に使用されるファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えによって融合されたＦａｂ、Ｆｖ、又はジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するｆｄ及びＭ１３を含む繊維状ファージである。加えて、方法は、Ｆａｂ発現ライブラリの構築のために適合させて（例えば、Ｈｕｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１，１９８９を参照されたい）、ＶＥＧＦポリペプチド又は抗Ａｎｇ－２ポリペプチド、例えば、ポリペプチド、又はその誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログに対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速で効果的な特定を可能にする。本技術の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ方法の他の例には、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９－５８８３，１９８８、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：１０６６－１０７０，１９９０、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１－５０，１９９５、Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７－１８６，１９９５、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２－９５８，１９９４、Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８７：９－１８，１９９７、Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１－２８０，１９９４、ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４、ＷＯ９０／０２８０９、ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９５／１５９８２、ＷＯ９５／２０４０１、ＷＯ９６／０６２１３、ＷＯ９２／０１０４７（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｅｔ ａｌ．）、ＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）、ＷＯ９２／０１０４７（ＣＡＴ／ＭＲＣ）、ＷＯ９１／１７２７１（Ａｆｆｙｍａｘ）、並びに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、及び同第５，７３３，７４３号に開示されるものが含まれる。ジスルフィド結合を介してポリペプチドを結合させることによってバクテリオファージ粒子の表面上にポリペプチドを表示するのに有用な方法は、Ｌｏｈｎｉｎｇ，米国特許第６，７５３，１３６号によって記載されている。上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域を単離し、使用してヒト抗体を含む全抗体、又は任意の他の所望の抗原結合断片を生成し、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主で発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２断片を組換えによって産生する技法はまた、ＷＯ９２／２２３２４、Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２：８６４－８６９，１９９２、及びＳａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，ＡＪＲＩ ３４：２６－３４，１９９５、及びＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３，１９８８に開示されるものなどの、当該技術分野で既知の方法を用いて使用することができる。

【0119】

一般に、抗体又は抗体断片は、ファージ又はファージミド粒子の表面上に存在するため、ディスプレイベクターにクローニングされるハイブリッド抗体又はハイブリッド抗体断片を適切な抗原に対して選択して、優れた結合活性を維持するバリアントを特定することができる。例えば、Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）を参照されたい。しかしながら、選択及び／又はスクリーニングのために、抗体断片ライブラリを溶解性ファージベクター（修飾Ｔ７又はラムダＺａｐ系）にクローニングするなどの、他のベクター方式をこのプロセスに使用することができる。

【0120】

組換え抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の発現。上述したように、本技術の抗体は、組換えＤＮＡ技術の適用によって産生することができる。本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体をコードする組換えポリヌクレオチド構築物は、典型的には、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体鎖のコード配列に操作可能に連結された発現制御配列を含み、天然に関連するか又は異種のプロモーター領域が含まれる。したがって、本技術の別の態様は、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体をコードする１つ以上の核酸配列を含有するベクターを含む。本技術のポリペプチドのうちの１つ以上の組換え発現のために、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体をコードするヌクレオチド配列の全て又は一部を含む核酸は、適切なクローニングベクター、又は発現ベクター（すなわち、挿入されたポリペプチドコード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含有するベクター）に、当技術分野で周知であり、以下に詳細される組換えＤＮＡ技法によって挿入される。ベクターの多様な集団を産生するための方法は、Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，２９１，１６０号及び第６，６８０，１９２号によって記載されている。

【0121】

一般に、組換えＤＮＡ技法で有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態にある。本開示において、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般に使用されている形態であるため、互換的に使用され得る。しかしながら、本技術は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）などの、技術的にプラスミドではない他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。かかるウイルスベクターは、対象の感染及びその対象における構築物の発現を可能にする。いくつかの実施形態において、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトすることができるベクターにおける真核生物プロモーター系である。ベクターが適切な宿主に組み込まれていると、宿主は、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体をコードするヌクレオチド配列の高レベル発現、並びに抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体、例えば、交差反応性抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の収集及び精製に好適な条件下で維持される。一般に、Ｕ．Ｓ．２００２／０１９９２１３を参照されたい。これらの発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの組み込み部分としてのいずれかで、宿主生物において複製可能である。一般に、発現ベクターは、選択マーカー、例えば、アンピシリン耐性又はヒグロマイシン耐性を含有し、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出を可能にする。ベクターはまた、細胞外抗体断片の分泌を指示するのに有用なシグナルペプチド、例えばペクチン酸リアーゼをコードすることができる。米国特許第５，５７６，１９５号を参照されたい。

【0122】

本技術の組換え発現ベクターは、ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２結合特性を有するタンパク質をコードする核酸を、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態で含み、これは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に操作可能に連結される、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内では、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（例えば、インビトロ転写／翻訳システムにおいて、又はベクターが宿主細胞に導入されるときに宿主細胞において）調節配列に連結されることを意味することが意図される。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。かかる調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）で更に考察されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、及び特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。当業者であれば、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるポリペプチドの発現レベルなどの因子に依存し得ることが理解されるであろう。組換えポリペプチド発現（例えば、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体）のプロモーターとして有用な典型的な調節配列には、例えば、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ及び他の糖解酵素のプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。誘導性酵母プロモーターには、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣ、並びにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素からのプロモーターが含まれる。一実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体をコードするポリヌクレオチドは、ａｒａ Ｂプロモーターに操作可能に結合され、宿主細胞において発現可能である。米国特許第５，０２８，５３０号を参照されたい。本技術の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって、本明細書に記載されるような核酸（例えば、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体など）によってコードされる融合ポリペプチドを含む、ポリペプチド又はペプチドを産生することができる。

【0123】

本技術の別の態様は、１つ以上の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体をコードする核酸を含有する、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体発現宿主細胞に関する。本技術の組換え発現ベクターは、原核生物細胞又は真核生物細胞における抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の発現のために設計することができる。例えば、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、真菌細胞、例えば、酵母、酵母細胞、又は哺乳動物細胞などで発現させることができる。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）で更に考察されている。代替的に、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写及び翻訳することができる。確率的に生成されたポリヌクレオチド配列の発現を介して、所定の特性を有するポリペプチド、例えば、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の調製及びスクリーニングに有用な方法が、既に報告されている。米国特許第５，７６３，１９２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，８１４，４７６号、同第５，８１７，４８３号、同第５，８２４，５１４号、同第５，９７６，８６２号、同第６，４９２，１０７号、同第６，５６９，６４１号を参照されたい。

【0124】

原核生物におけるポリペプチドの発現は、多くの場合、融合ポリペプチド又は非融合ポリペプチドのいずれかの発現を指示する構成的又は誘導性プロモーターを含むベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉで実行される。融合ベクターは、それにコードされるポリペプチドに、通常、組換えポリペプチドのアミノ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。かかる融合ベクターは、典型的には、３つの目的：（ｉ）組換えポリペプチドの発現を増加させること、（ｉｉ）組換えポリペプチドの溶解性を増加させること、及び（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えポリペプチドの精製を補助することを果たす。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位が融合部分と組換えポリペプチドとの接合部に導入され、融合ポリペプチドの精製に続いて、融合部分からの組換えポリペプチドの分離を可能にする。かかる酵素、及びそれらの同族認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合ポリペプチド、又はポリペプチドＡをそれぞれ標的組換えポリペプチドに融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が含まれる。

【0125】

好適な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０－８９）が含まれる。ポリペプチド融合を介して多官能性ポリペプチドを得る、異なる活性ペプチド又はタンパク質ドメインの標的化組み立てのための方法は、Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，２９４，３５３号、同第６，６９２，９３５号に記載されている。Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えポリペプチド発現、例えば、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体を最大化する１つの戦略は、組換えポリペプチドをタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌でポリペプチドを発現することである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９－１２８を参照されたい。別の戦略は、各アミノ酸における個々のコドンが発現宿主、例えばＥ．ｃｏｌｉで優先的に利用されるものであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａ，ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１－２１１８を参照されたい）。本技術の核酸配列のかかる変更は、標準的なＤＮＡ合成技法によって実行することができる。

【0126】

別の実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９－２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｃｅｌｌ ３０：９３３－９４３，１９８２）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ５４：１１３－１２３，１９８７）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。代替的に、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞で発現させることができる。培養した昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるポリペプチド、例えば、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．３：２１５６－２１６５，１９８３）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１－３９）が含まれる。

【0127】

更に別の実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体をコードする核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞で発現させる。哺乳動物発現ベクターの例には、例えば、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０，１９８７）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７－１９５，１９８７）が含まれる。哺乳類細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、多くの場合、ウイルス調節要素によって提供される。例えば、一般に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、及びシミアンウイルス４０に由来する。本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の発現に有用な原核生物細胞及び真核生物細胞の両方に好適な他の発現システムについて、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６ ａｎｄ １７ ｏｆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照されたい。

【0128】

別の実施形態において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞タイプで核酸の発現を指示することができる（例えば、組織特異的調節要素）。組織特異的調節要素は、当該技術分野で既知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的、Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７，１９８７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５，１９８８）、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３， １９８９）、及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７４０、Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７４８，１９８３．）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター、Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７，１９８９）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）、及び乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６４，１６６号）が含まれる。発生的に調節されたプロモーター、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４－３７９，１９９０）及びα－フェトタンパク質プロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７－５４６，１９８９）も包含される。

【0129】

本方法の別の態様は、本技術の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で互換的に使用される。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫又は潜在的子孫も指すことを理解されたい。変異又は環境影響のいずれかにより、特定の修飾が後世代で生じ得るため、かかる子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される本用語の範囲内に含まれる。

【0130】

宿主細胞は、任意の原核生物細胞又は真核生物細胞であることができる。例えば、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞、酵母、又は哺乳動物細胞で発現させることができる。哺乳類細胞は、免疫グロブリン又はその断片をコードするヌクレオチドセグメントを発現するのに好適な宿主である。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ Ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７）を参照されたい。インタクト異種タンパク質を分泌することができるいくつかの好適な宿主細胞株が当該技術分野で開発されてきており、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、及び骨髄腫細胞株が含まれる。いくつかの実施形態において、細胞は、非ヒトである。これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサーなどの発現制御配列、及びリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列などの必要なプロセシング情報部位を含むことができる。Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９，１９８６。例示的な発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９，１９９２。他の好適な宿主細胞が、当業者に既知である。

【0131】

ベクターＤＮＡは、従来の形質転換又はトランスフェクション技法によって原核生物細胞又は真核生物細胞に導入することができる。本明細書に使用される場合、「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な当該技術分野で認識されている技法を指すことが意図され、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、遺伝子銃、又はウイルスベースのトランスフェクションが含まれる。哺乳動物細胞を形質転換するために使用される他の方法には、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、及びマイクロインジェクションの使用が含まれる（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇを参照されたい）。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするための好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、及び他の検査室マニュアルに見出すことができる。対象のＤＮＡセグメントを含有するベクターは、細胞宿主のタイプに応じて、周知の方法によって宿主細胞に移入することができる。

【0132】

好適なベクターの非限定的な例には、増殖及び拡張のために、若しくは発現のために、又は両方のために設計されたものが含まれる。例えば、クローニングベクターは、ｐＵＣシリーズ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）からなる群から選択することができる。ラムダ－ＧＴ１０、ラムダ－ＧＴ１１、ラムダ－ＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラムダ－ＥＭＢＬ４、及びラムダ－ＮＭ１１４９などのバクテリオファージベクターも使用することができる。植物発現ベクターの非限定的な例には、ｐＢＩ１１０、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。動物発現ベクターの非限定的な例には、ｐＥＵＫ－Ｃ１、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。ＴＯＰＯクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）も、製造業者の推奨に従って使用することができる。

【0133】

特定の実施形態において、ベクターは、哺乳類ベクターである。特定の実施形態において、哺乳類ベクターは、ｍＲＮＡの転写と、抗体コード配列と、転写物の転写及びポリアデニル化の終結と、の開始に必要なシグナルを媒介する少なくとも１つのプロモーター要素を含有する。特定の実施形態において、哺乳類ベクターは、追加の要素、例えば、ＲＮＡスプライシングのためのドナー及びアクセプター部位に隣接するエンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、及び介入配列を含有する。特定の実施形態において、例えば、ＳＶ４０からの早期及び後期プロモーター、レトロウイルス、例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩからの長末端反復（ＬＴＲＳ）、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の早期プロモーターを用いて、非常に効率的な転写を達成することができる。細胞要素も使用することができる（例えば、ヒトアクチンプロモーター）。哺乳類発現ベクターの非限定的な例には、ｐＩＲＥＳｌｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ、又はｐＬＮＣＸ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／－）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／－）、又はｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／－）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＰＳＶＬ及びＰＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、並びにｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ６７１０９）などのベクターが含まれる。かかる哺乳動物ベクターと組み合わせて使用することができる哺乳動物宿主細胞の非限定的な例としては、ヒトＨｅｌａ ２９３、ＨＥＫ ２９３、Ｈ９、及びＪｕｒｋａｔ細胞、マウス３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３、及びＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １、Ｃｏｓ ７、及びＣＶ １、ウズラＱＣ１－３細胞、マウスＬ細胞、並びにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。

【0134】

特定の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、パルボウイルスベースのベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクター、ＡＡＶ－アデノウイルスキメラベクター、及びアデノウイルスベースのベクター、並びに単純ヘルペス（ＨＳＶ）ベースのベクターなどのレンチウイルスベクターである。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、ウイルス複製を欠損させるように操作される。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、宿主に対する毒性を排除するように操作される。これらのウイルスベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載される標準的な組換えＤＮＡ技法を使用して調製することができる。

【0135】

特定の実施形態において、本明細書に記載のベクター又はポリヌクレオチドは、従来の技術によって細胞（例えば、エクスビボ細胞）に移入することができ、得られる細胞は、従来の技術によって培養して、本明細書に記載の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体又は抗原結合断片を産生することができる。したがって、本明細書において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞におけるかかる配列の発現のための調節発現要素（例えば、プロモーター）に操作可能に連結されて含む細胞が提供される。特定の実施形態において、プロモーターに操作可能に連結された重鎖をコードするベクター及びプロモーターに操作可能に連結された軽鎖をコードするベクターは、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体全体又は抗原結合断片の発現のために、細胞で共発現させることができる。特定の実施形態において、細胞は、プロモーターに操作可能に連結される、本明細書に記載の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体又は抗原結合断片の重鎖及び軽鎖の両方をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。特定の実施形態において、細胞は、２つの異なるベクターを含み、第１のベクターは、プロモーターに操作可能に連結された重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、第２のベクターは、プロモーターに操作可能に連結された軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、第１の細胞は、本明細書に記載の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体又は抗原結合断片の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを含み、第２の細胞は、本明細書に記載の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体又は抗原結合断片の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含む。特定の実施形態において、本明細書では、当該第１の細胞及び当該第２の細胞を含む、細胞の混合物が提供される。細胞の例には、ヒト細胞、ヒト細胞株、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＢ－１、ＴＧ－２、ＤＨ５ａ、ＸＬ－Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＳＡ２８２１、及びＹ１０９０）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｅｎｏｓａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｎ．ｃｒａｓｓａ、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｅａ４）などが含まれるが、これらに限定されない。

【0136】

哺乳類細胞の安定的なトランスフェクションでは、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技法に応じて、わずかな割合の細胞のみが、外来ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込み得ることは既知である。これらの組み込み体を特定及び選択するために、一般に、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する抵抗性）をコードする遺伝子が、目的とする遺伝子とともに宿主細胞に導入される。様々な選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びメトトレキサートなどの薬物に対する抵抗性を付与するものが含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸は、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体をコードするものと同じベクターで宿主細胞に導入するか、又は別個のベクターで導入することができる。導入された核酸で安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって特定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。

【0137】

培養における原核生物又は真核生物の宿主細胞などの本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体を含む宿主細胞を使用して、組換え抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体を産生（すなわち、発現）することができる。一実施形態において、方法は、宿主細胞（抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体が産生されるような、好適な培地中で培養することを含む。別の実施形態において、方法は、培地又は宿主細胞から抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体を単離するステップを更に含む。発現されると、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体、例えば、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体又は抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体関連ポリペプチドの集合体を、培養培地及び宿主細胞から精製する。抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当該技術分野の標準的手順に従って精製することができる。一実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号の方法によって宿主生物で産生される。通常、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体鎖は、シグナル配列で発現され、したがって、培養培地に放出される。しかしながら、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体鎖が宿主細胞によって自然に分泌されない場合、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体鎖は、穏やかな界面活性剤を用いた処理によって放出させることができる。組換えポリペプチドの精製は、当該技術分野で周知であり、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティークロマトグラフィー精製技法、カラムクロマトグラフィー、イオン交換精製技法、ゲル電気泳動などが含まれる（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２を参照されたい）。

【0138】

抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体コードするポリヌクレオチド、例えば、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体コード配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入及びトランスジェニック動物の乳中におけるその後の発現のために導入遺伝子に組み込むことができる。例えば、米国特許第５，７４１，９５７号、同第５，３０４，４８９号、及び同第５，８４９，９９２号を参照されたい。好適な導入遺伝子には、カゼイン又はβ－ラクトグロブリンなどの乳腺特異的遺伝子からのプロモーター及びエンハンサーと操作可能な連結にある軽鎖及び／又は重鎖のコード配列が含まれる。トランスジェニック動物の生成のために、導入遺伝子は、受精した卵母細胞にマイクロインジェクションすることができるか、又は胚性幹細胞のゲノムに組み込み、かかる細胞の核を、除核された卵母細胞に移すことができる。

【0139】

単鎖抗体。一実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、単鎖抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体である。本発明の技術に従い、技法は、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生に適合させることができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）。本技術の単鎖Ｆｖ及び抗体を産生するために使用することができる技法の例には、米国特許第４，９４６，７７８号及び同第５，２５８，４９８号、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３：４６－８８，１９９１、Ｓｈｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７９９５－７９９９，１９９３、並びにＳｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８－１０４０，１９８８に記載されるものが含まれる。

【0140】

キメラ及びヒト化抗体。一実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、キメラ抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体である。一実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、ヒト化抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体である。本技術の一実施形態において、ドナー抗体及びアクセプター抗体は、異なる種からのモノクローナル抗体である。例えば、アクセプター抗体は、ヒト抗体（ヒトにおいてその抗原性を最小限に抑えるため）であり、その場合、得られるＣＤＲ移植抗体は、「ヒト化」抗体と称される。

【0141】

ヒト部分及び非ヒト部分の両方を含む、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、標準的な組換えＤＮＡ技法を使用して作製することができ、本技術の範囲内である。ヒトにおける本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体のインビボ使用、並びにインビトロ検出アッセイにおけるこれらの薬剤の使用を含むいくつかの使用では、キメラ又はヒト化抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体を使用することが可能である。かかるキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で知られている組換えＤＮＡ技法によって産生することができる。かかる有用な方法としては、例えば、これらに限定されないが、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号、米国特許第５，２２５，５３９号、欧州特許第１８４１８７号、欧州特許第１７１４９６号、欧州特許第１７３４９４号、ＰＣＴ国際公開第８６／０１５３３号、米国特許第４，８１６，５６７号、同第５，２２５，５３９号、欧州特許第１２５０２３号、Ｂｅｔｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３、Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９－３４４３、Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１－３５２６、Ｓｕｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４－２１８、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：９９９－１００５、Ｗｏｏｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６－４４９、Ｓｈａｗ，ｅｔ ａｌ．，１９８８．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３－１５５９、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－１２０７、Ｏｉ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，１９８６．Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２－５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２，１９８５、Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４，１９８６、Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２５：１９１－２０２，１９８９、米国特許第５，８０７，７１５号、及びＢｅｉｄｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８８．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３－４０６０に記載されるものが挙げられる。例えば、抗体は、ＣＤＲ移植（ＥＰ ０ ２３９ ４００、ＷＯ９１／０９９６７、米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，８５９，２０５号、同第６，２４８，５１６号、ＥＰ４６０１６７）、ベニヤリング又はリサーフェイシング（ＥＰ ０ ５９２ １０６、ＥＰ ０ ５１９ ５９６、Ｐａｄｌａｎ Ｅ．Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８：４８９－４９８，１９９１、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５－８１４，１９９４、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９１：９６９－９７３，１９９４）、及び鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む様々な技法を用いてヒト化することができる。一実施形態において、ネズミ抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２モノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡは、Ｆｃ定常領域をコードする配列を除去するために特異的に選択された制限酵素で消化され、ヒトＦｃ定常領域をコードするｃＤＮＡの等価部分は、置換される（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９、Ａｋｉｒａ ｅｔ ａｌ．，欧州特許出願１８４，１８７、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，欧州特許出願１７１，４９６、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，欧州特許出願１７３，４９４、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ８６／０１５３３、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，欧州特許出願１２５，０２３、Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９－３４４３、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３９：３５２１－３５２６、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４－２１８、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４７：９９９－１００５、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６－４４９、及びＳｈａｗ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３－１５５９、米国特許第６，１８０，３７０号、米国特許第６，３００，０６４号、同第６，６９６，２４８号、同第６，７０６，４８４号、同第６，８２８，４２２号を参照されたい）。

【0142】

一実施形態において、本技術は、ヒト抗マウス抗体（以下、「ＨＡＭＡ」と称される）応答を誘導する可能性が低いものの、依然として有効な抗体エフェクター機能を有する、ヒト化抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の構築を提供する。本明細書に使用される場合、抗体に関して、「ヒト」及び「ヒト化」という用語は、ヒト対象において治療的に耐えられる弱い免疫原性応答を誘発することが予想される任意の抗体に関する。一実施形態において、本技術は、ヒト化抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体、重鎖及び軽鎖免疫グロブリンを提供する。

【0143】

ＣＤＲ抗体。いくつかの実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２ ＣＤＲ抗体である。一般に、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２ ＣＤＲ抗体を生成するために使用されるドナー抗体及びアクセプター抗体は、異なる種からのモノクローナル抗体であり、典型的には、アクセプター抗体は、ヒト抗体であり（ヒトにおけるその抗原性を最小限に抑えるため）、この場合、得られるＣＤＲ移植抗体は、「ヒト化」抗体と称される。移植片は、アクセプター抗体の単一のＶ_Ｈ若しくはＶ_Ｌ内の単一のＣＤＲ（又は単一のＣＤＲの一部でさえ）のものであり得るか、又はＶ_Ｈ及びＶ_Ｌの一方若しくは両方内の複数のＣＤＲ（又はその一部）であることができる。多くの場合、アクセプター抗体の全ての可変ドメインにおける３つの全てのＣＤＲが、対応するドナーＣＤＲで置き換えられるが、ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２タンパク質に対する得られるＣＤＲ移植抗体の十分な結合を可能にするために必要な数のみ置き換える必要がある。ＣＤＲ移植及びヒト化抗体を生成するための方法は、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、及びＷｉｎｔｅｒ ＵＳ．５，２２５，５３９、並びにＥＰ０６８２０４０によって教示される。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌポリペプチドを調製するのに有用な方法は、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号、同第６，２９１，１５８号、同第６，２９１，１５９号、同第６，２９１，１６１号、同第６，５４５，１４２号、ＥＰ０３６８６８４、ＥＰ０４５１２１６、及びＥＰ０１２０６９４によって教示される。

【0144】

同じファミリー及び／又は同じファミリーメンバーから好適なフレームワーク領域候補を選択した後、発端となる種からのＣＤＲをハイブリッドフレームワーク領域に移植することによって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のいずれか又は両方が生成される。上記の態様のいずれかに関して、ハイブリッド可変鎖領域を有するハイブリッド抗体又はハイブリッド抗体断片の組み立ては、当業者に既知の従来の方法を使用して達成することができる。例えば、本明細書に記載のハイブリッド可変ドメインをコードするＤＮＡ配列（すなわち、標的種に基づくフレームワーク及び発端となる種からのＣＤＲ）は、オリゴヌクレオチド合成及び／又はＰＣＲによって生成することができる。ＣＤＲ領域をコードする核酸は、好適な制限酵素を使用して発端となる種の抗体から単離し、好適なライゲーション酵素で連結することによって標的種フレームワークに連結することもできる。代替的に、発端となる種の抗体の可変鎖のフレームワーク領域は、部位特異的変異誘発によって変更することができる。

【0145】

ハイブリッドは、各フレームワーク領域に対応する複数の候補の中の選択から構築されるため、本明細書に記載される原理に従う構築に適した、配列の多くの組み合わせが存在する。したがって、個々のフレームワーク領域の異なる組み合わせによるメンバーを有して、ハイブリッドのライブラリを組み立てることができる。かかるライブラリは、配列の電子データベースコレクション又はハイブリッドの物理的コレクションであることができる。

【0146】

このプロセスは、典型的には、移植されたＣＤＲに隣接するアクセプター抗体のＦＲを変更しない。しかしながら、当業者であれば、所与のＦＲの特定の残基を置き換えて、ＦＲをドナー抗体の対応するＦＲに、より類似させることによって、得られる抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２ ＣＤＲ移植抗体の抗原結合親和性を改善することができる。置換の好適な位置には、ＣＤＲに隣接するか、又はＣＤＲと相互作用することができるアミノ酸残基が含まれる（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９、特にカラム１２～１６を参照されたい）。又は、当業者であれば、ドナーＦＲから始めて、それを修飾して、アクセプターＦＲ又はヒトコンセンサスＦＲにより類似させることができる。これらの修飾を行うための技法は、当該技術分野で既知である。特に、得られるＦＲがその位置でヒトコンセンサスＦＲに適合する場合、又はかかるコンセンサスＦＲに少なくとも９０％以上同一である場合、それを行うことは、完全なヒトＦＲを有する同じ抗体と比較して、得られる修飾抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２ ＣＤＲ移植抗体の抗原性を有意に増加させ得ない。

【0147】

二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）。二重特異性抗体は、異なる構造を有する２つの標的、例えば、２つの異なる標的抗原、同じ標的抗原上の２つの異なるエピトープ、又は標的抗原上のハプテン及び標的抗原若しくはエピトープに同時に結合することができる抗体である。ＢｓＡｂは、例えば、同じか又は異なる抗原の異なるエピトープを認識する重鎖及び／又は軽鎖を組み合わせることによって作製することができる。いくつかの実施形態において、分子機能によって、二重特異性結合剤は、その２つの結合アームのうちの１つ（１つのＶＨ／ＶＬ対）で１つの抗原（又はエピトープ）に結合し、その第２のアーム（異なるＶＨ／ＶＬ対）で異なる抗原（又はエピトープ）に結合する。この定義によれば、二重特異性結合剤は、２つの異なる抗原結合アーム（特異性及びＣＤＲ配列の両方において）を有し、それが結合する各抗原に対して一価である。

【0148】

二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）及び二重特異性抗体断片（ＢｓＦａｂ）などの多重特異性抗体は、例えば、ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、第２の標的抗原に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームと、を有する。

【0149】

様々な二重特異性融合タンパク質は、分子工学を使用して産生することができる。例えば、ＢｓＡｂは、全免疫グロブリンフレームワーク（例えば、ＩｇＧ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又はそれらの組み合わせのいずれかを利用するように構築されている。いくつかの実施形態において、二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば、１つの抗原に対する単一結合部位を有するｓｃＦｖと、第２の抗原に対する単一結合部位を有するＦａｂ断片と、を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性融合タンパク質は、例えば、１つの抗原に対する単一結合部位を有するｓｃＦｖと、第２の抗原に対する単一結合部位を有する別のｓｃＦｖ断片と、を含む、二価である。他の実施形態において、二重特異性融合タンパク質は、例えば、１つの抗原に対する２つの結合部位と、第２の抗原に対する２つの同一のｓｃＦｖと、を有する免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）を含む、四価である。２つのｓｃＦｖユニットから構成されるＢｓＡｂは、臨床的に成功した二重特異性抗体形式であることが示されている。

【0150】

ＢｓＡｂを産生するための最近の方法には、より一般的な免疫グロブリンアイソタイプよりも強く架橋するように、追加のシステイン残基を有する操作された組換えモノクローナル抗体が含まれる。例えば、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０（１０）：１２２１－１２２５（１９９７）を参照されたい。別のアプローチは、組換え融合タンパク質を操作して、必要とされる二重特異性を有する２つ以上の異なる単鎖抗体又は抗体断片セグメントを連結することである。例えば、Ｃｏｌｏｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１５９－１６３（１９９７）を参照されたい。様々な二重特異性融合タンパク質は、分子工学を使用して産生することができる。

【0151】

２つ以上の異なる単鎖抗体又は抗体断片を連結する二重特異性融合タンパク質は、同様の方法で産生される。組換え方法を使用して、様々な融合タンパク質を産生することができる。いくつかの特定の実施形態において、本技術によるＢｓＡｂは、免疫グロブリンを含み、免疫グロブリンは、重鎖及び軽鎖、並びにｓｃＦｖを含む。いくつかの特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、本明細書に開示される任意のＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結される。いくつかの特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、本明細書に開示される任意のＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２免疫グロブリンの軽鎖のＣ末端に連結される。様々な実施形態において、ｓｃＦｖは、リンカー配列を介して重鎖又は軽鎖に連結される。重鎖ＦｄのｓｃＦｖとのフレーム内接続に必要な適切なリンカー配列は、ＰＣＲ反応によってＶ_Ｌ及びＶ_カッパドメインに導入される。次に、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ断片を、ＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を含有するステージングベクターに連結させる。得られたｓｃＦｖ－ＣＨ１構築物を切除し、ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体のＶ_Ｈ領域をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターに連結させる。得られたベクターを使用して、二重特異性融合タンパク質の発現のための哺乳類細胞などの適切な宿主細胞をトランスフェクトすることができる。

【0152】

いくつかの実施形態において、リンカーは、長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個、又はそれ以上のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、リンカーは、強固な三次元構造を採用しない傾向があり、むしろポリペプチド（例えば、第１及び／又は第２の抗原結合部位）に可撓性を提供することを特徴とする。いくつかの実施形態において、リンカーは、例えば、安定性の増加などのＢｓＡｂに付与される特定の特性に基づいて、本明細書に記載のＢｓＡｂに用いられる。いくつかの実施形態において、本技術のＢｓＡｂは、Ｇ_４Ｓリンカーを含む。いくつかの特定の実施形態において、本技術のＢｓＡｂは、（Ｇ_４Ｓ）_ｎリンカーを含み、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上である。

【0153】

Ｆｃ修飾。いくつかの実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、バリアントＦｃ領域を含み、当該バリアントＦｃ領域は、野生型Ｆｃ領域（又は親Ｆｃ領域）に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、それによって、当該分子は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ）に対する変化した親和性を有するが、ただし、当該バリアントＦｃ領域は、Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０６：２６７－２７３（２０００）によって開示されるものなどのＦｃ－Ｆｃ受容体相互作用の結晶学的及び構造的分析に基づいて、Ｆｃ受容体と直接的な接触をする位置で置換を有さない。ＦｃγＲなどのＦｃ受容体と直接接触するＦｃ領域内の位置の例としては、アミノ酸２３４～２３９（ヒンジ領域）、アミノ酸２６５～２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７～２９９（Ｃ７Ｅループ）、及びアミノ酸３２７～３３２（Ｆ／Ｇ）ループが挙げられる。

【0154】

いくつかの実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、活性化及び／又は阻害性受容体に対する変化した親和性を有し、１つ以上のアミノ酸修飾を有するバリアントＦｃ領域を有して、当該１つ以上のアミノ酸修飾は、アラニンによるＮ２９７置換、又はアラニンによるＫ３２２置換である。追加的又は代替的に、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体のＦｃ領域は、２つのアミノ酸置換であるＬｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ（ＬＡＬＡ変異と呼ばれる）を含み、ＦｃγＲＩＩａ結合を排除する。ＬＡＬＡ変異は、Ｔ細胞からのサイトカイン誘導を緩和するために一般的に使用され、したがって、抗体の毒性を減少させる（Ｗｉｎｅｓ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：５３１３－５３１８（２０００））。

【0155】

グリコシル化修飾。いくつかの実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、親Ｆｃ領域と比較して、バリアントグリコシル化を伴うＦｃ領域を有する。いくつかの実施形態において、バリアントグリコシル化は、フコースの不存在を含み、いくつかの実施形態において、バリアントグリコシル化は、ＧｎＴ１欠損ＣＨＯ細胞における発現から生じる。

【0156】

いくつかの実施形態において、本技術の抗体は、抗体の機能性、例えば、抗原との結合活性を変更することなく、目的の抗原（例えば、ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２）に結合する適切な参照抗体と比較して、修飾されたグリコシル化部位を有し得る。本明細書に使用される場合、「グリコシル化部位」は、オリゴ糖（すなわち、一緒に連結された２つ以上の単純な糖を含有する炭水化物）が特異的及び共有結合的に結合する抗体における任意の特定のアミノ酸配列を含む。

【0157】

オリゴ糖側鎖は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合のいずれかを介して抗体の骨格に連結されている。Ｎ結合型グリコシル化とは、オリゴ糖部分とアスパラギン残基の側鎖との結合を指す。Ｏ結合型グリコシル化とは、オリゴ糖部分とヒドロキシアミノ酸、例えば、セリン、スレオニンとの結合を指す。

【0158】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリン関連組成物の炭水化物含有量は、グリコシル化部位を付加又は欠失させることによって修飾される。抗体の炭水化物含有量を修飾する方法は、当該技術分野で周知であり、本技術内に含まれ、例えば、米国特許第６，２１８，１４９号、ＥＰ０３５９０９６Ｂ１、米国特許公開第２００２／００２８４８６号、国際特許出願公開第０３／０３５８３５号、米国特許公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許第６，２１８，１４９号、米国特許第６，４７２，５１１号を参照されたく、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、抗体（又はその関連部分若しくは成分）の炭水化物含有量は、抗体の１つ以上の内因性炭水化物部分を欠失させることによって修飾される。いくつかの特定の実施形態において、本技術は、２９７位をアスパラギンからアラニンに修飾することによって、抗体のＦｃ領域のグリコシル化部位を欠失させることを含む。

【0159】

操作されたグリコフォームは、エフェクター機能を増強させるか、又は低下させることを含むがこれらに限定されない、様々な目的のために有用であり得る。操作されたグリコフォームは、当業者に既知の任意の方法によって、例えば、操作されたか若しくはバリアント発現株を使用することによって、１つ以上の酵素、例えば、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）との共発現によって、様々な生物若しくは様々な生物からの細胞株にＦｃ領域を含む分子を発現させることによって、又はＦｃ領域を含む分子が発現された後に炭水化物を修飾することによって、生成され得る。操作されたグリコフォームを生成するための方法は、当該技術分野で知られ、これらに限定されないが、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６－１８０、Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７４：２８８－２９４、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６－３４７３、米国特許第６，６０２，６８４号、米国特許出願第１０／２７７，３７０号、米国特許出願第１０／１１３，９２９号、国際特許出願公開第００／６１７３９Ａ１号、同第０１／２９２２４６Ａ１号、同第０２／３１１１４０Ａ１号、同第０２／３０９５４Ａ１号に記載されるもの、ＰＯＴＩＬＬＥＧＥＮＴ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＧＬＹＣＯＭＡＢ（商標）グリコシル化操作技術（ＧＬＹＣＡＲＴ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含み、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、国際特許出願公開第００／０６１７３９号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＪＭＢ，３３６：１２３９－４９を参照されたい。

【0160】

融合タンパク質。一実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、融合タンパク質である。本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、第２のタンパク質に融合されたとき、抗原タグとして使用することができる。ポリペプチドに融合させることができるドメインの例には、異種シグナル配列だけでなく、他の異種機能性領域も含まれる。融合は必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して生じることができる。更に、本技術の融合タンパク質は、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の特徴を改善するように操作することもできる。例えば、追加のアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域は、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体のＮ末端に付加して、宿主細胞からの精製中又はその後の取り扱い及び保存の安定性及び持続性を向上させることができる。また、ペプチド部分は、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体に付加して精製を容易にすることができる。かかる領域は、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の最終調製前に除去することができる。ポリペプチドの取り扱いを容易にするペプチド部分の付加は、当技術分野ではよく知られており、定型的な技術である。本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、融合したポリペプチドの精製を容易にするペプチドなどのマーカー配列に融合することができる。選択された実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、その多くは、市販されており、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ）に提供されるタグなどのヘキサ－ヒスチジンペプチドである。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１－８２４，１９８９に記載されるように、例えば、ヘキサ－ヒスチジンは、融合タンパク質の都合のよい精製を提供する。精製に有用な別のペプチドタグである「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３７：７６７，１９８４。

【0161】

したがって、これら上記の融合タンパク質のうちのいずれかは、本技術のポリヌクレオチド又はポリペプチドを使用して操作することができる。また、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の融合タンパク質は、インビボで増加した半減期を示す。

【0162】

ジスルフィド結合二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する融合タンパク質は、単量体分泌タンパク質又はタンパク質断片単独と比較して、他の分子との結合及び中和において効率的であり得る。Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８－３９６４，１９９５。

【0163】

同様に、ＥＰ－Ａ－Ｏ４６４５３３（カナダの対応する２０４５８６９）は、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分を、別のヒトタンパク質又はその断片と一緒に含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質におけるＦｃ部分は、治療及び診断に有益であり、したがって、例えば、改善された薬物動態特性をもたらすことができる。ＥＰ－Ａ０２３２２６２を参照されたい。代替的に、融合タンパク質が発現、検出、及び精製された後に、Ｆｃ部分を欠失又は修飾することが望ましいことがある。例えば、Ｆｃ部分は、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用される場合、治療及び診断を妨げ得る。創薬において、例えば、ｈＩＬ－５などのヒトタンパク質は、ｈＩＬ－５のアンタゴニストを特定するハイスループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている。Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２－５８，１９９５、Ｊｏｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：９４５９－９４７１，１９９５。

【0164】

標識抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体。一実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、標識部分、すなわち、検出可能な基と結合される。抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体にコンジュゲートされた特定の標識又は検出可能な基は、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体とＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質との特異的結合を著しく干渉しない限り、本技術の重大な態様ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的又は化学的特性を有する任意の材料であることができる。かかる検出可能な標識は、イムノアッセイ及びイメージングの分野で十分に開発されてきている。一般に、かかる方法に有用なほとんどいずれの標識も、本技術に適用することができる。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、又は化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。本技術の実施において有用な標識には、磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ、^１２１Ｉ、^１３１Ｉ、^１１２Ｉｎ、^９９ｍＴｃ）、マイクロバブル（超音波イメージング用）などの他のイメージング剤、^１８Ｆ、^１１Ｃ、^１５Ｏ、^８９Ｚｒ（陽電子放射断層撮影用）、^９９ｍＴＣ、^１１１Ｉｎ（単一光子放射断層撮影用）、酵素（例えば、ラジッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びＥＬＩＳＡで一般的に使用される他のもの）、及び金コロイド又は着色ガラス若しくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどのカロリメトリック標識が含まれる。かかる標識の使用を記載する特許には、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号、及び同第４，３６６，２４１号が含まれ、各々は、参照によりそれらの全体が全ての目的で本明細書に組み込まれる。Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（６^ｔｈ Ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ．）も参照されたい。

【0165】

標識は、当技術分野で周知の方法に従って、アッセイの所望の成分に直接的又は間接的に結合させることができる。上述のように、必要とされる感度、化合物とのコンジュゲーションの容易さ、安定性要件、利用可能な装置、及び廃棄規定などの要因に応じた標識の選択によって、多種多様な標識を使用することができる。

【0166】

非放射性標識は、しばしば間接的な手段によって結合される。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合される。次に、リガンドは、検出可能な酵素、蛍光化合物、又は化学発光化合物などのシグナルシステムに固有に検出可能又は共有結合された抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合する。多くのリガンド及び抗リガンドを使用することができる。リガンドが天然の抗リガンド、例えば、ビオチン、チロキシン、及びコルチゾールを有する場合、それは、標識された、天然に存在する抗リガンドと併せて使用することができる。代替的に、任意のハプテン性又は抗原性化合物は、抗体、例えば、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体と組み合わせて使用することができる。

【0167】

分子はまた、例えば、酵素又はフルオロフォアとのコンジュゲーションによって、直接的にシグナル発生化合物にコンジュゲートすることもできる。標識としての目的の酵素は、主に、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼ、及びグリコシダーゼ、又はオキシドレダクターゼ、特にペルオキシダーゼである。標識部分として有用な蛍光化合物には、例えば、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれるが、これらに限定されない。標識部分として有用な化学発光化合物には、例えば、ルシフェリン、及び２，３－ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが含まれるが、これらに限定されない。使用することができる様々な標識又はシグナル発生システムのレビューについて、米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。

【0168】

標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、標識が放射性標識である場合、検出手段には、シンチレーションカウンター又はオートラジオグラフィーにおけるような写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合、適切な波長の光で蛍光色素を励起し、得られる蛍光を検出することによって検出することができる。蛍光は、写真フィルムによって、電荷結合素子（ＣＣＤ）又は光増倍管などの電子検出器の使用によって、視覚的に検出することができる。同様に、酵素に適切な基質を提供し、得られる反応生成物を検出することによって、酵素標識を検出することができる。最後に、単純な比色標識は、標識に関連付けられた色調を単に観察することによって検出することができる。したがって、様々なディップスティックアッセイでは、コンジュゲート化金は、しばしばピンク色を出現させるが、様々なコンジュゲート化ビーズは、ビーズの色調を出現させる。

【0169】

いくつかのアッセイ方式は、標識成分の使用を必要としない。例えば、凝集アッセイを使用して、標的抗体、例えば、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の存在を検出することができる。この場合、抗原コーティング粒子は、標的抗体を含む試料によって凝集される。この方式では、成分のいずれも標識する必要はなく、標的抗体の存在は、単純な目視検査によって検出される。

【0170】

本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の特定及び特性評価
本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体を特定及び／又はスクリーニングするための方法。ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質に対する所望の特異性を有するもの（例えば、配列番号３８及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドなどのＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質の細胞外ドメインに結合するもの）について、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２ポリペプチドに対する抗体を特定及びスクリーニングするのに有用な方法には、当該技術分野内で既知の任意の免疫学的に媒介される技法が含まれる。免疫応答の成分は、当業者に周知の様々な方法によって検出することができる。例えば、（１）細胞傷害性Ｔリンパ球を放射性標識標的細胞とともにインキュベートして、これらの標的細胞の溶解を放射能の放出によって検出することができ、（２）ヘルパーＴリンパ球を抗原及び抗原提示細胞とともにインキュベートして、サイトカインの合成及び分泌を標準的な方法によって測定することができ（Ｗｉｎｄｈａｇｅｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２：３７３－８０，１９９５）、（３）抗原提示細胞を総タンパク質抗原とともにインキュベートして、ＭＨＣ上でのその抗原の提示をＴリンパ球活性化アッセイ又は生物物理学的方法のいずれかによって検出することができ（Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：４２３０－４，１９８９）、（４）マスト細胞をそれらのＦｃ－イプシロン受容体を架橋する試薬とともにインキュベートして、ヒスタミン放出を酵素免疫測定法によって測定することができ（Ｓｉｒａｇａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＰＳ，４：４３２－４３７，１９８３）、並びに（５）酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）。

【0171】

同様に、モデル生物（例えば、マウス）又はヒト対象のいずれかにおける免疫応答の産物も、当業者に周知の様々な方法によって検出することができる。例えば、（１）ワクチン接種に応答する抗体の産生は、臨床検査室で現在使用されている標準的な方法、例えば、ＥＬＩＳＡによって容易に検出することができ、（２）炎症部位への免疫細胞の移動は、皮膚の表面をスクラッチし、無菌容器を配置して、移動細胞をスクラッチ部位にわたって捕捉することによって検出することができ（Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７２：１３１０－５，１９８８）、（３）マイトジェン又は混合リンパ球反応に応答する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖は、^３Ｈ－チミジンを用いて測定することができ、（４）ＰＢＭＣにおける顆粒球、マクロファージ、及び他の食細胞の貧食能は、ＰＢＭＣをウェルにおいて標識された粒子と一緒に配置することによって測定することができ（Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ， ７２：１３１０－５，１９８８）、（５）免疫系細胞の分化は、ＰＢＭＣをＣＤ４及びＣＤ８などのＣＤ分子に対する抗体で標識し、これらのマーカーを発現するＰＢＭＣの画分を測定することによって測定することができる。

【0172】

一実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、複製可能な遺伝子パッケージの表面上のＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２ペプチドのディスプレイを使用して選択される。例えば、米国特許第５，５１４，５４８号、同第５，８３７，５００号、同第５，８７１，９０７号、同第５，８８５，７９３号、同第５，９６９，１０８号、同第６，２２５，４４７号、同第６，２９１，６５０号、同第６，４９２，１６０号、ＥＰ５８５２８７、ＥＰ６０５５２２、ＥＰ６１６６４０、ＥＰ１０２４１９１、ＥＰ５８９８７７、ＥＰ７７４５１１、ＥＰ８４４３０６を参照されたい。所望の特異性を有する結合分子をコードするファージミドゲノムを含有する繊維状バクテリオファージ粒子の生成／選択するのに有用な方法が記載されている。例えば、ＥＰ７７４５１１、ＵＳ５８７１９０７、ＵＳ５９６９１０８、ＵＳ６２２５４４７、ＵＳ６２９１６５０、ＵＳ６４９２１６０を参照されたい。

【0173】

いくつかの実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、酵母宿主細胞の表面上のＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２ペプチドのディスプレイを使用して選択される。酵母表面ディスプレイによるｓｃＦｖポリペプチドの単離に有用な方法は、Ｋｉｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９７ Ｎｏｖ；１０（１１）：１３０３－１０によって記載されている。

【0174】

いくつかの実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、リボソームディスプレイを使用して選択される。リボソームディスプレイを使用してペプチドライブラリ中のリガンドを特定するのに有用な方法は、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９０２２－２６，１９９４、及びＨａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４９３７－４２，１９９７によって記載されている。

【0175】

特定の実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２ペプチドのｔＲＮＡディスプレイを使用して選択される。ｔＲＮＡディスプレイを使用したリガンドのインビトロ選択に有用な方法は、Ｍｅｒｒｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，９：７４１－４６，２００２によって記載されている。

【0176】

一実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、ＲＮＡディスプレイを使用して選択される。ＲＮＡディスプレイライブラリを使用してペプチド及びタンパク質を選択するのに有用な方法は、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１２２９７－３０２，１９９７、及びＮｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４１４：４０５－８，１９９７によって記載されている。非天然ＲＮＡディスプレイライブラリを使用してペプチド及びタンパク質を選択するのに有用な方法は、Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１３：５０６－１２，２００３によって記載されている。

【0177】

いくつかの実施形態において、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、グラム陰性細菌の周辺質中で発現され、標識されたＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質と混合される。ＷＯ０２／３４８８６を参照されたい。ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質に対する親和性を有する組換えポリペプチドを発現するクローンでは、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体に結合した標識ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２タンパク質の濃度が増加し、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２２：９１９３－９８ ２００４及び米国特許公開第２００４／００５８４０３号に記載されるように細胞がライブラリの残部から単離されることを可能にする。

【0178】

所望の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の選択後、当該抗体は、当業者に既知の任意の技術、例えば、原核生物細胞又は真核生物細胞の発現などによって、大量に産生できることが企図される。例えば、限定されないが、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２ハイブリッド抗体又は断片である、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、ＣＤＲと、必要に応じて、元の種の抗体結合特異性を保持するために必要とされる可変領域フレームワークの最小部分（本明細書に記載される技術に従って操作される）とが発端となる種の抗体に由来し、抗体の残分が本明細書に記載されるように操作することができる標的種免疫グロブリンに由来する、抗体重鎖をコードする発現ベクターを構築し、それによってハイブリッド抗体重鎖の発現のためのベクターを作製する、従来の技法を使用して産生することができる。

【0179】

ＶＥＧＦ又はＡｎｇ－２結合の測定。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２結合アッセイは、ＶＥＧＦ及び／又はＡｎｇ－２タンパク質並びに抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体を、ＶＥＧＦ及び／又はＡｎｇ－２タンパク質と抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体との間を結合し、ＶＥＧＦ及び／又はＡｎｇ－２タンパク質と抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体との間の結合量を評価するのに好適な条件下で混合するアッセイ方式を指す。結合の量は、ＶＥＧＦ及び／又はＡｎｇ－２タンパク質の不存在下での結合の量、非特異的免疫グロブリン組成物の存在下での結合の量、又はその両方であることができる好適な対照と比較される。結合の量は、任意の好適な方法によって評価することができる。結合アッセイ方法には、例えば、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ、シンチレーション近接アッセイ、蛍光エネルギー移動アッセイ、液体クロマトグラフィー、膜濾過アッセイなどが含まれる。抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体に結合するＶＥＧＦ及び／又はＡｎｇ－２タンパク質の直接的な測定のための生物物理学的アッセイは、例えば、核磁気共鳴、蛍光、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥチップ）などである。特異的結合は、当技術分野で知られている標準的なアッセイ、例えば、放射性リガンド結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＲＥＴ、免疫沈降、ＳＰＲ、ＮＭＲ（２Ｄ－ＮＭＲ）、質量分析法などによって決定される。候補抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の特異的結合が、候補抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の不存在下で観察される結合よりも少なくとも１パーセント大きい場合、候補抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、本技術の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体として有用である。

【0180】

治療方法
以下の考察は、例としてのみ提示され、限定することを意図するものではない。

【0181】

本技術の一態様は、新しい血管の網膜下色素上皮又は網膜下空間への成長を特徴とする疾患又は状態を治療する方法を含む。追加的又は代替的に、いくつかの実施形態において、本技術は、ＣＮＶを治療する方法を含む。一態様では、本開示は、眼におけるＶＥＧＦ－及び／又はＡｎｇ－２誘発性血管新生を阻害するための方法であって、対象に治療有効量の少なくとも１つの本技術のＶＥＧＦｘＡｎｇ－２抗体を投与することを含み、対象が、新たな血管の網膜下色素上皮又は網膜下空間への成長を特徴とする疾患又は状態に罹患している、方法を提供する。

【0182】

いくつかの実施形態において、対象は、ＶＥＧＦ及び／又はＡｎｇ－２の上昇した発現レベル及び／又は増加した活性を特徴とする疾患又は状態を有するか、有すると疑われるか、又は有するリスクがあると診断される。追加的又は代替的に、いくつかの実施形態において、対象は、ＣＮＶを有するとして診断される。

【0183】

治療用途において、本明細書に開示される抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体を含む組成物又は医薬品は、かかる疾患又は状態を疑われるか、又は既に罹患している対象（ＶＥＧＦ及び／若しくはＡｎｇ－２の上昇した発現レベル及び／若しくは増加した活性を特徴とする疾患若しくは状態と診断される対象、並びに／又はＣＮＶと診断される対象など）に、疾患の発症におけるその合併症及び中間病理学的表現型を含む、疾患の症状を治癒するか、又は少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与される。

【0184】

ＶＥＧＦ及び／若しくはＡｎｇ－２の上昇した発現レベル及び／若しくは増加した活性を特徴とする疾患若しくは状態に罹患している対象、又は代替的に、ＣＮＶと診断された対象は、当該技術分野で既知の診断アッセイ又は予後アッセイのいずれか又は組み合わせによって特定することができる。例えば、ＣＮＶの典型的な症状としては、これらに限定されないが、中心視のゆがみ若しくはうねり、又は中心視における灰色／黒色／空隙斑点、網膜における液体の水疱若しくは出血、色の輝度の喪失若しくは各眼で異なって現れる色、変視、すなわち、視覚のゆがみ、直線が曲がって、ゆがんで、若しくはでこぼこに見えること、痛みを伴わない視力低下、傍中心若しくは中心暗点、すなわち、視野の中心若しくは中心付近における相対的若しくは絶対的視力低下の島、各眼について異なって現れる物体のサイズ、又は中心視における閃光若しくは明滅が挙げられる。

【0185】

いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ及び／若しくはＡｎｇ－２の上昇した発現レベル及び／若しくは増加した活性を特徴とする疾患若しくは状態を有する対象、並びに／又は抗ＶＥＧＦ及び／若しくはＡｎｇ－２抗体で治療されるＣＮＶに罹患している対象は、以下の症状：中心視のゆがみ若しくはうねり、又は中心視における灰色／黒色／空隙斑点、網膜における液体の水疱若しくは出血、色の輝度の喪失若しくは各眼で異なって現れる色、変視、すなわち、視覚のゆがみ、直線が曲がって、ゆがんで、若しくはでこぼこに見えること、痛みを伴わない視力低下、傍中心若しくは中心暗点、すなわち、視野の中心若しくは中心付近における相対的若しくは絶対的視力低下の島、各眼について異なって現れる物体のサイズ、又は中心視における閃光若しくは明滅のうちの１つ以上の改善又は排除を示すであろう。

【0186】

治療用途のために、本明細書に開示される抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体を含む組成物は、対象に投与される。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、１日に１回、２回、３回、４回、又は５回投与される。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、１日に５回を超えて投与される。追加的又は代替的に、いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、毎日、１日おき、３日毎、４日毎、５日毎、又は６日毎に投与される。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、毎週、２週間毎、３週間毎、又は毎月投与される。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、１、２、３、４、又は５週間の期間にわたって投与される。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、６週間以上にわたって投与される。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、１２週間以上にわたって投与される。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、１年未満の期間にわたって投与される。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、１年を超える期間にわたって投与される。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、対象の生涯を通して投与される。

【0187】

本技術の方法のいくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、１週間以上毎日投与される。本技術の方法のいくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、２週間以上毎日投与される。本技術の方法のいくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、３週間以上毎日投与される。本技術の方法のいくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、４週間以上毎日投与される。本技術の方法のいくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、６週間以上毎日投与される。本技術の方法のいくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、１２週間以上毎日投与される。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、対象の生涯を通して毎日投与される。

【0188】

抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の生物学的効果の決定
様々な実施形態において、好適なインビトロ又はインビボアッセイは、特定の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の効果、及びその投与が治療に適しているかを決定するために実施される。様々な実施形態において、インビトロアッセイは、代表的な動物モデルで、所与の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体がＣＮＶの徴候及び／又は症状を低減又は排除することに対して所望の効果を発揮するかを決定するために実施することができる。療法における使用のための化合物は、ヒト対象における試験の前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどを含むがこれらに限定されない、好適な動物モデルシステムにおいて試験することができる。同様に、インビボ試験のために、当該技術分野で既知の動物モデルシステムのいずれも、ヒト対象への投与前に使用することができる。いくつかの実施形態において、インビトロ又はインビボ試験は、１つ以上の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の生物学的機能を対象とする。

【0189】

ＣＮＶの動物モデルは、当該技術分野で既知の技法を使用して生成され得る。かかるモデルは、特定の遺伝子の破壊から生じる状態の予防及び治療における抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の生物学的効果を実証するため、かつ所与の文脈において治療有効量の本明細書に開示される１つ以上の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体を含むものを決定するために使用され得る。

【0190】

投与様式及び有効投与量
細胞、臓器、又は組織を、本明細書に開示される１つ以上の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体と接触させるための当業者に既知の任意の方法が使用され得る。好適な方法としては、インビトロ、エクスビボ、又はインビボ方法が挙げられる。インビボ方法は、典型的には、１つ以上の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の哺乳動物、好適にはヒトへの投与を含む。療法のためにインビボで使用される場合、本明細書に記載される１つ以上の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、有効量（すなわち、所望の治療効果を有する量）で対象に投与される。用量及び投与量レジメンは、対象の疾患状態の程度、使用される特定の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の特徴、例えば、その治療指数、及び対象の病歴に依存するであろう。

【0191】

有効量は、前臨床試験及び臨床試験中に、医師及び臨床医によく知られている方法によって決定され得る。有効量の、方法において有用な本明細書に開示される１つ以上の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、医薬化合物を投与するためのいくつかの周知の方法のいずれかによって、それを必要とする哺乳動物に投与され得る。抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、全身又は局所投与され得る。

【0192】

本明細書に開示される１つ以上の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、ＲＰＥ細胞との接触を可能にする任意の経路によって投与することができる。投与は、例えば、眼、非経口（例えば、皮下、筋肉内、又は静脈内）、局所、経皮、硝子体内、後眼窩、網膜下、強膜下、経口、舌下、又は頬側投与様式であり得る。前述の例示的な投与様式のいくつかは、注射によって達成することができる。しかしながら、いくつかの実施形態において、注射は、網膜の近く（例えば、強膜下経路）での徐放性インプラントの使用によって、又は結膜に滴剤を投与することによって回避される。本技術の１つ以上の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、ＣＮＶに罹患している患者の眼に、局所投与され得る。局所投与には、硝子体内、局所眼、経皮パッチ、皮下、非経口、眼内、結膜下、又は後球若しくはテノン嚢下注射、経強膜（イオントフォレシスを含む）、後強膜近傍送達、又は徐放性生体分解性ポリマー若しくはリポソームが含まれる。１つ以上の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体はまた、眼内灌流溶液中に送達することができる。濃度は、約０．００１μＭ～約１００μＭ、好ましくは約０．０１μＭ～約５μＭの範囲であり得る。

【0193】

本技術の組成物は、ＣＮＶに罹患している患者の眼に、局所投与され得る。本技術の１つ以上の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、（例えば、局所的、腔内、強膜近傍、又はインプラントを介した）眼への送達のために様々なタイプの眼科用製剤に組み込むことができる。本技術の１つ以上の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、水性、無菌眼科用懸濁液若しくは溶液、又は予め形成されたゲル、又はインサイチュ形成されたゲルを形成するために、眼科的に許容される防腐剤、界面活性剤、粘度増強剤、ゲル化剤、浸透増強剤、緩衝剤、塩化ナトリウム、及び水と組み合わされ得る。

【0194】

本開示の方法のいくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体組成物は、網膜下経路によって投与される。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体組成物は、網膜下注射又は注入によって投与される。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体組成物は、網膜下注射によって投与され、注射は、５０μＬ～１０００μＬの体積を含む。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体組成物は、網膜下注射によって投与され、注射は、５０μＬ～３００μＬの体積を含む。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体組成物は、網膜下注射によって投与され、これは、１００μＬ又は最大１００μＬ（例えば、２５～１００μＬ、５０～１００μＬ、７５～１００μＬ）の体積を含む。いくつかの実施形態において、網膜下注射は、２段階注射を含む。

【0195】

本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体は、ＣＮＶの治療又は予防のために対象に、単独で又は組み合わせて、投与のための医薬組成物に組み込むことができる。かかる組成物は、典型的には、活性剤及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書に使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与と適合性のある、食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などを含む。補助的な活性化合物も、組成物中に組み込むことができる。

【0196】

医薬組成物は、典型的には、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、腹腔内、又は皮下）、経口、吸入、経皮（局所）、眼内、イオントフォレシス、及び経粘膜投与が挙げられる。非経口、皮内、又は皮下適用に使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、若しくは他の合成溶媒などの無菌希釈剤、ベンジルアルコール若しくはメチルパラベンなどの抗細菌剤、アスコルビン酸若しくは亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、若しくはリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム若しくはデキストロースなどの張度調整のための薬剤を含むことができる。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの、酸又は塩基で調整することができる。非経口調製物は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、又は複数用量バイアルに封入することができる。患者又は治療する医師の便宜のために、投与製剤は、治療経過（例えば、７日の治療）のために必要な全ての装置（例えば、薬物のバイアル、希釈剤のバイアル、シリンジ、及び針）を含有するキットで提供することができる。

【0197】

注射可能な使用に好適な医薬組成物は、無菌注射可能溶液又は分散液の即時調製のための無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び無菌粉末を含むことができる。好適な担体には、生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。いくつかの実施形態において、組成物は、無菌であり、容易なシリンジ通過性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。製造及び保存の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。

【0198】

本明細書に開示される抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体を有する医薬組成物は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であることができる、担体を含むことができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。グルタチオン及び他の抗酸化剤は、酸化を防止するために含めることができる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトールなどの多価アルコール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを含めることが有利であろう。注射可能組成物の長期吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを含むことによってもたらすことができる。

【0199】

無菌注射可能溶液は、必要な量の活性化合物を、上記に列挙される成分の１つ又は組み合わせを有する適切な溶媒に組み込むことによって調製することができ、必要に応じて、濾過滅菌が続く。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒及び上記に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する、無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の典型的な方法は、活性成分及びその既に無菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらすことができる、真空乾燥及び凍結乾燥を含む。

【0200】

治療剤は、担体システムに製剤化することができる。担体は、コロイドシステムであり得る。コロイドシステムは、リポソーム、リン脂質二重層ビヒクルであり得る。一実施形態において、治療剤は、薬剤の構造的完全性を維持しながら、リポソームに封入される。当業者であれば、リポソームを調製する様々な方法があることを理解するであろう。（Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．，３３：３３７－４６２（１９８８）、Ａｎｓｅｌｅｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）を参照されたい）。リポソーム製剤は、クリアランスを遅らせ、細胞取り込みを増加させることができる（Ｒｅｄｄｙ，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，３４（７－８）：９１５－９２３（２０００）を参照されたい）。活性剤はまた、これらに限定されないが、可溶性、不溶性、透過性、不透過性、生体分解性、又は胃保持性ポリマー又はリポソームを含む薬学的に許容される成分から調製される粒子に装填することができる。かかる粒子には、ナノ粒子、生体分解性ナノ粒子、マイクロ粒子、生体分解性マイクロ粒子、ナノスフェア、生体分解性ナノスフェア、マイクロスフェア、生体分解性マイクロスフェア、カプセル、エマルション、リポソーム、ミセル、及びウイルスベクターシステムが含まれるが、これらに限定されない。

【0201】

担体はまた、ポリマー、例えば、生体分解性、生体適合性ポリマーマトリックスであり得る。一実施形態において、治療剤は、薬剤の構造的完全性を維持しながら、ポリマーマトリックスに埋め込むことができる。ポリマーは、ポリペプチド、タンパク質、若しくは多糖などの天然であってもよく、又はポリα－ヒドロキシ酸などの合成であってもよい。例としては、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチン、及びそれらの組み合わせで作製された担体が挙げられる。一実施形態において、ポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）又はコポリ乳酸／グリコール酸（ＰＧＬＡ）である。ポリマーマトリックスは、ミクロスフェア及びナノスフェアを含む、様々な形態及びサイズで調製及び単離することができる。ポリマー製剤は、治療効果の持続時間の延長につながり得る。（Ｒｅｄｄｙ，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，３４（７－８）：９１５－９２３（２０００）を参照されたい）。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のためのポリマー製剤は、臨床試験において使用されている。（Ｋｏｚａｒｉｃｈ ａｎｄ Ｒｉｃｈ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：５４８－５５２（１９９８）を参照されたい）。

【0202】

ポリマーマイクロスフェア徐放製剤の例は、ＰＣＴ公開第９９／１５１５４号（Ｔｒａｃｙ，ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，６７４，５３４号及び第５，７１６，６４４号（ともにＺａｌｅ，ｅｔ ａｌ．）、ＰＣＴ公開第９６／４００７３号（Ｚａｌｅ，ｅｔ ａｌ．）、及びＰＣＴ公開第００／３８６５１号（Ｓｈａｈ，ｅｔ ａｌ．）に記載される。米国特許第５，６７４，５３４号及び第５，７１６，６４４号並びにＰＣＴ公開第９６／４００７３号は、塩との凝集に対して安定化されるエリスロポエチンの粒子を含有するポリマーマトリックスを記載する。

【0203】

いくつかの実施形態において、治療組成物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤などの、体からの迅速な排除に対して治療組成物を保護するであろう担体で調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生体分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤は、既知の技法を使用して調製することができる。材料はまた、例えば、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から、商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（細胞特異的抗原に対するモノクローナル抗体で特定の細胞に標的化されたリポソームを含む）はまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に既知の方法に従って調製することができる。

【0204】

治療化合物はまた、細胞内送達を増強するように製剤化することができる。例えば、リポソーム送達システムは、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｈｏｎｎ ａｎｄ Ｃｕｌｌｉｓ，“Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：６９８－７０８（１９９５）、Ｗｅｉｎｅｒ，“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，”Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４（３）：２０１－９（１９９４）、及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，”Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３（１２）：５２７－３７（１９９５）を参照されたい。Ｍｉｚｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，１００：６３－６９（１９９６）は、インビボ及びインビトロの両方で細胞にタンパク質を送達するための融合性リポソームの使用を記載する。

【0205】

任意の治療剤の投与量、毒性、及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）又はＥＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指標であり、それは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が有利である。毒性副作用を示す化合物が使用され得るが、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって副作用を低減するために、かかる化合物を罹患組織の部位に標的化する送達システムを設計するように注意するべきである。

【0206】

細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量の範囲を製剤化することにおいて使用することができる。かかる化合物の投与量は、ＥＤ５０を、ほとんど又は全く毒性を伴わずに含む、循環濃度の範囲内にあり得る。投与量は、用いられる投与形態、及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。方法で使用される任意の化合物について、治療有効量は、初期に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養で決定されるように、ＩＣ５０（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルで製剤化することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおける有用な用量を正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。

【0207】

典型的には、治療又は予防効果を達成するのに十分な、本明細書に開示される抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の有効量は、１日当たりキログラム体重当たり約０．０００００１ｍｇ～１日当たりキログラム体重当たり約１０，０００ｍｇの範囲である。好適には、投与量範囲は、１日当たりキログラム体重当たり約０．０００１ｍｇ～１日当たりキログラム体重当たり約１００ｍｇである。例えば、投与量は、毎日、２日毎、若しくは３日毎に１ｍｇ／ｋｇ体重、若しくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、毎週、又は２週毎、若しくは３週毎に１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であることができる。一実施形態において、治療化合物の単回投与量は、体重１ｋｇ当たり０．００１～１０，０００マイクログラムの範囲である。一実施形態において、担体中の１つ以上の抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体濃度は、送達されるミリリットル当たり０．２～２０００マイクログラムの範囲である。例示的な治療レジメンは、１日に１回又は１週間に１回の投与を伴う。治療的適用では、疾患の進行が減少若しくは終了するまで、又は対象が疾患の症状の部分的若しくは完全な改善を示すまで、比較的高い投与量が比較的短い間隔で、時に必要とされる。その後、患者に予防的レジームを投与することができる。

【0208】

いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２抗体の治療有効量は、１０^－３２～１０^－６モル、例えば、約１０^－７モルの標的組織での阻害剤の濃度として定義され得る。この濃度は、体表面積による０．００１～１００ｍｇ／ｋｇの全身用量又は等価用量によって送達され得る。用量のスケジュールは、単回の毎日又は毎週の投与などによって、標的組織での治療濃度を維持するように最適化されるであろう。

【0209】

当業者であれば、疾患又は障害の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患を含むが、これらに限定されない、特定の因子が、対象を効果的に治療するために必要な投与量及びタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。また、治療有効量の本明細書に記載される治療組成物での対象の治療は、単回の治療又は一連の治療を含むことができる。

【0210】

本方法に従って治療される哺乳動物は、例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、及びウマなどの家畜、イヌ及びネコなどのペット動物、ラット、マウス、及びウサギなどの実験動物を含む、任意の哺乳動物であり得る。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。

【0211】

併用療法
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性抗体のうちの１つ以上は、ＣＮＶの予防又は治療のための１つ以上の追加の療法と組み合わされ得る。追加の療法としては、レーザー光凝固、光線力学療法（ＰＤＴ）、ペガプタニブナトリウム、ベバシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、及びコルチコステロイドが挙げられる。

【0212】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性抗体は、レーザー光凝固、光線力学療法（ＰＤＴ）、ペガプタニブナトリウム、ベバシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、及びコルチコステロイドからなる群から選択される少なくとも１つの追加の療法と、別々に、連続的に、又は同時に投与され得る。

【0213】

いずれの場合も、複数の療法は、任意の順序で、又は更には同時に投与してもよい。同時の場合、複数の療法は、単一の、統一された形態で、又は複数の形態で（例としてのみ、単一の丸剤として、又は２つの別個の丸剤としてのいずれかで）提供され得る。療法のうちの１つが複数の用量で与えられてもよく、又は両方が複数の用量として与えられてもよい。同時でない場合、複数の用量間のタイミングは、０週間超から４週間未満まで変動し得る。加えて、併用方法、組成物、及び製剤は、２つの薬剤のみの使用に限定されるものではない。

【0214】

キット
本開示はまた、本明細書に開示される抗ＶＥＧＦ×Ａｎｇ－２多重特異性抗体のうちの１つ以上と、ＣＮＶを予防及び／又は治療するためにそれらを使用するための説明書と、を含む、キットを提供する。任意選択的に、本技術のキットの上述の構成要素は、好適な容器にパックされ、ＣＮＶの予防及び／又は治療について表示される。

【0215】

上記の構成要素は、水性の、好ましくは無菌の溶液として、又は再構成のための凍結乾燥された、好ましくは無菌の製剤として、単位又は複数用量の容器、例えば、密封したアンプル、バイアル、ボトル、シリンジ、及び試験管に保存され得る。キットは、医薬組成物をより大きい体積に希釈するのに好適な希釈剤を保持する第２の容器を更に含み得る。好適な希釈剤には、医薬組成物の薬学的に許容される賦形剤及び生理食塩水が含まれるが、これらに限定されない。更に、キットは、医薬組成物を希釈するための説明書、及び／又は希釈されるかどうかにかかわらず、医薬組成物を投与するための説明書を含み得る。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、又は皮下注射針によって穿刺され得るストッパーを有するバイアルであり得る）。キットは、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む、より多くの容器を更に含み得る。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、好適なホストのうちの１つ以上のための培地を含む、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含み得る。キットは、任意選択的に、例えば、かかる治療用製品又は診断用製品の適応症、使用法、投与量、製造、投与、禁忌、及び／又はその使用に関する警告についての情報を含む、治療用製品又は診断用製品の商用パッケージに通例含まれる説明書を含み得る。

【0216】

キットはまた、例えば、緩衝剤、保存剤、又は安定化剤を含むことができる。キットはまた、アッセイして、試験試料と比較することができる、対照試料又は一連の対照試料を含むことができる。キットの各構成要素は、個々の容器内に封入することができ、様々な容器の全ては、キットを使用して行われるアッセイの結果を解釈するための説明書とともに、単一のパッケージ内にあることができる。本技術のキットは、キット容器の上、又は中に記載物を含み得る。記載物は、キットに含まれる試薬を使用する方法を説明する。特定の実施形態において、試薬の使用は、本発明の技術の方法に従うことができる。

【実施例】

【0217】

本発明の技術は、以下の実施例によって更に例示されるが、これは、決して限定するものとして解釈されるべきではない。

【0218】

実施例１：硝子体内注射前のリスク管理についての指示
（１）．局所麻酔薬を塗布し、（２）．５パーセント又は１０パーセントのポビドン－ヨウ素滴剤及び／又は眼球周囲ポビドン－ヨウ素眼瞼製剤を塗布し、（３）．無菌検鏡を挿入して瞼を分離し、（４）．注射前に注射部位の直上にポビドン－ヨウ素を再塗布する。図３を参照されたい。

【0219】

実施例２：ウサギにおけるＡＢＰ２０１毒性及びＰＫ研究設計
治療。試験物品：試験物品は、すぐに使用できる様式で提供した。ビヒクルは、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．０２％のポリソルベート８０、及び５．８％のスクロース、ｐＨ７．２を含有する。投与：ウサギは、硝子体内経路を介して０日目に各眼において単回５０μＬ用量（４ｍｇ／ｍｌのＡＢＰ２０１）又はビヒクルを受けた。図４は、ウサギモデルにおける抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体ＡＢＰ２０１の毒性及び薬物動態（ＰＫ）を研究するための実験設計を示す。毒性及びＰＫ結果を図５～１１に示す。

【0220】

ＡＢＰ２０１治療群において炎症は検出されず、治療の７日後に取り除かれた。図６～７を図５に対して比較する。

【0221】

群１（ビヒクル）：４つの眼のうちの２つ、各ウサギにおける右眼は、主に網膜内面付近の、硝子体に５～１０個の単核細胞を有した。そうでなければ、ビヒクル治療されたウサギにおいて他の異常は観察されなかった。

【0222】

群２．（ＯＵ ＡＢＰ２０１）：この群における１匹のウサギは、いずれの眼においても硝子体に異常を認めなかった。群における他のウサギは、一方の眼、左が、中等度のびまん性硝子体単核細胞浸潤を有し、視神経は、中等度の限局性単核細胞浸潤を有した。反対の眼（右）は、硝子体にいくつか（５～１０個）の単核細胞を有した。

【0223】

全体的な組織病理は、ビヒクルとＡＢＰ２０１治療群との間で同等であった。図７～８。

【0224】

実施例３：ＣＮＶ疾患モデルを用いて、眼におけるＡＢＰ－２０１の活性を評価する
Ｂｒｏｗｎ－Ｎｏｒｗａｙラットは、３つの濃度（０．０３８５μｇ／μＬ－低、０．３８５μｇ／μＬ－中、及び３．８５μｇ／μＬ－高）のＡＢＰ－２０１の単回５μＬ硝子体内注射、ビヒクル（１０ｍＭのＮａ－クエン酸塩、０．０２％のポリソルベート８０、５．８％のスクロース）、又はアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標）、０．２μｇ／μＬ）を右眼において受けた。注射は、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＩＩカメラ（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｌａｂｓ）に取り付けられた５３２ｎｍレーザーで各ＯＤ眼における視神経頭からの２つの円板内で４～５つの２００μｍサイズの病変（１００ｍｓ、２００ｍＷ）を燃焼させた直後に行われた。眼底イメージング及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ、Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ）は、病変の存在、サイズ、及び適切な標的化を検証した。７及び１５日目に、フルオレセイン血管造影及びＯＣＴは、病変漏出及び体積を評価した。データは、平均±ＳＥＭとして表し、一元配置分散分析を使用して分析した。研究の１５日目に、動物を屠殺した。漏出データは、専門の読み手によって評価され、スコアは、カスタムＩｍａｇｅＪマクロを使用して確立された０（漏出なし）～４（非常に高い漏出）の経験的尺度に基づいた。各病変の中央ＯＣＴスキャンを手動で見つけ、Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔソフトウェアのキャリパーを使用して病変の底辺（ｂ）及び高さ（ｈ）サイズを測定することから、病変データを確立した。その後、半楕円体の式（Ｖ＝ｈｂ^２ π／１２）を用いて病変体積を概算した。データは、平均±ＳＥＭとして表し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて一元配置分散分析を使用して分析した。

【0225】

図１４Ａ～１４Ｂは、それぞれ、実験群及び対照群の代表的な血管造影及びＯＣＴ画像を示す。７日目に、ＡＢＰ－２０１の３つの用量全ては、ビヒクルと比較されるとき、病変体積（全てのｐ＜０．０１について、それぞれ、２７％、２７％、及び４０％）及び漏出（全てのｐ＜０．０００２について、それぞれ、３３％、３５％、及び３７％）の両方において高度に有意な低減を誘導した。１５日目に、ＡＢＰ－２０１の中及び高用量は、病変体積（両方のｐ＜０．０５について、それぞれ、２６％及び２７％）において有意な低減を誘導し、３つの用量全ては、漏出（全てのｐ＜０．０５について、それぞれ、２８％、３３％、及び３６％）において有意な低減を誘導した。病変体積及び漏出の両方について、ＡＢＰ－２０１の性能は、アフリベルセプトと同様又はそれよりも良好であった。図１２Ａ～１２Ｂ、図１５Ａ～１５Ｂを参照されたい。

【0226】

これらの結果は、本開示のＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体が、インビボでのレーザー誘導ＣＮＶにおける新生血管病変形成及び血管漏出を低減するのに有用であることを実証する。

【0227】

実施例４：ウサギにおける新規化合物の硝子体内（ＩＶＴ）送達後の忍容性及び薬物動態研究
動物の健康及び順応：動物を、麻酔前に最低限の１週間にわたって研究環境に順応させた。順応期間の完了時に、各動物は、研究参加についての適合性の決定のために、実験動物技術者によって身体検査された。検査には、皮膚及び外耳、眼、腹部、神経学的挙動、並びに全身的身体状態が含まれた。良好な健康状態であると決定された動物を研究に供した。

【0228】

無作為化及び研究特定：動物を、Ｐｏｗｅｒｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（ＳＯＰ）に従って研究群に割り当てた。

【0229】

試験製剤及び投与：試験物品を、すぐに使用できる方式で供給し、実験設計表に基づいて硝子体内投与した。

【表2】

【0230】

硝子体内注射：０日目に、動物を１．０％トロピカミドＨＣｌで拡張し、ブプレノルフィン０．０１～０．０５ｍｇ／ｋｇＳＱを投与した。次いで、ウサギを、注射のために鎮静し（ケタミン／キシラジン）、眼を、局所５％ベタジン溶液を使用し、続いて無菌洗眼液ですすぎ、無菌的に調製した。次いで、０．５％プロパラカインＨＣｌ及び１０％フェニレフリンＨＣｌの局所塗布を行った。結膜をコリブリ鉗子で優しくつかみ、（毛様体扁平部を通って）上縁よりも２～３ｍｍ後方の、３０Ｇ針を使用して、水晶体との接触を回避するために針をわずかに後方に向けて注射を行った。シリンジ内容物を分注した後、針をゆっくりと引き抜いた。両眼は、上記の実験設計表に示されるように注射を受けた。注射後、１滴のネオマイシンポリミキシンＢ硫酸塩グラミシジン眼科用溶液又はオフロキサシンを眼表面に局所適用し、動物を正常に麻酔から回復させる。

【0231】

眼検査：獣医眼科医は、ベースラインとして機能する投与前に、及び実験設計表によって示される追加の日に、スリットランプ生体顕微鏡及び間接検眼鏡を使用して完全な眼検査を実施して、全ての動物についての眼表面形態及び前部炎症を評価した。全ての動物は、この研究について検討されるために通常の眼検査を受けていなければならない。Ｈａｃｋｅｔｔ ａｎｄ ＭｃＤｏｎａｌｄ眼グレーディングシステムをスコアリングに使用した。動物は、検査のために鎮静化されなかった。Ｓｅｅ Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｒ．Ｂ．ａｎｄ ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｔ．Ｏ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ Ｏｃｕｌａｒ Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄ．Ｆ．Ｎ．Ｍａｒｚｕｌｌｉ ａｎｄ Ｈ．Ｉ．Ｍａｉｂａｃｈ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．１９９６；２９９－３０５ ａｎｄ ５５７－５６６を参照されたい。

【0232】

眼圧測定：眼内圧（ＩＯＰ）は、試験設計表によって示される時点で両眼において、全ての生存動物において測定した。ベースライン測定は、局所麻酔薬の使用なしに、Ｔｏｎｏｖｅｔプローブ（ｉＣａｒｅ Ｔｏｎｏｍｅｔｅｒ、Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して覚醒動物から取った。Ｔｏｎｏｖｅｔプローブの先端は、中心角膜に穏やかに接触するように指示された。ディスプレイ上に示される平均ＩＯＰを記録し、３回の測定を行った。

【0233】

血液収集：実験設計表によって示される時間に、約１ｍＬの全血を、心臓穿刺（又は他の好適な静脈／動脈）を介して、Ｐｌａｓｔｉｃ Ｒｅｄ Ｔｏｐ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（抗凝固剤又は血清分離剤ゲルなし）、１．３ｍＬ（Ｓａｒｓｒｅｄｔ Ｒｅｆ：４１．１３９２．１０５又は同等）に血清収集のために採取した。収集後、チューブを３～５回反転させることによって穏やかに混合した。血液試料を、処理前に少なくとも３０分、しかし６０分未満にわたって室温で保存した。試料を４℃で１０分間、１０，０００×ｇで冷蔵遠心分離機において遠心分離した。遠心分離直後、透明な血清を、予め標識された２ｍＬのクライオバイアルポリプロピレンチューブに移し、解析的分析のために搬出されるまで－８０℃で凍結保存した。赤血球が不注意に血清中に採取された場合、試料は直ちに再分離した。各アリコートは、以下の情報：試験番号、動物番号、群番号、マトリックス、時点、及び収集日で標識した。

【0234】

安楽死／組織収集：最終検査後、動物をケタミン／キシラジンの５０／１０ｍｇ／ｋｇ ＩＭで鎮静化し、血液を実験設計表に示される日に収集した。次いで、動物を、ＩＶ投与されたペントバルビタールナトリウムの過剰投与で安楽死させ、続いて死亡を確認する聴診を行った。

【0235】

ＰＫ分析のために指定された眼：安楽死直後に、両眼を摘出した。両眼からの房水を、２７ゲージ又は３０ゲージのシリンジを介して除去し、予め計量されたポリプロピレンチューブに移し、計量して組織重量を決定した。次いで、試料を液体窒素中に浸漬することによって瞬間凍結した。眼組織を、Ｐｏｗｅｒｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＳＯＰに従って凍結したまま解剖した。全ての試料を個々のバイアルに入れ、計量した。試料を均質化まで－８０℃で保存した。収集された組織のリスト：血清及び房水（２ｍＬポリプロピレンスクリューキャップチューブ）、硝子体液（７ｍＬ Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ）、網膜／脈絡膜／ＲＰＥ（２ｍＬ Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ）

【0236】

組織学：前述のように安楽死及び死亡の確認後、組織学について指定された動物の両眼を直ちに摘出し、ダビッドソン液中で２４時間、続いてアルコール中で固定した。視神経を含む、各眼球の中央セクションを、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、光学顕微鏡を用いて検査した。

【0237】

図１６～１８は、経時的な抗ＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体ＡＢＰ２０１（配列番号１及び配列番号２によって表される）でのインビボ累積関心領域（ＲＯＩ）蛍光の分析を示す。ビヒクル及びアフリベルセプトを、それぞれ、陰性及び陽性対照として使用した。

【0238】

ＡＢＰ－２０１二重特異性抗体の性能は、アフリベルセプトに相当した。これらの結果は、本開示のＡＮＧ－２×ＶＥＧＦ二重特異性抗体が、ＣＮＶを治療するために有用であることを実証する。

【0239】

等価物
本技術は、本出願に記載される特定の実施形態に関して限定されるべきではなく、本出願は、本技術の個々の態様の１つの例示として意図される。本技術の多くの修正及び変化は、当業者に明らかであるように、その趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に列挙されるものに加えて、本技術の範囲内の機能的に等価な方法及び装置は、前述の説明から当業者に明らかであろう。かかる修正及び変化は、本技術の範囲内であることが意図される。本発明の技術は、勿論、変化し得る特定の方法、試薬、化合物組成物、又は生物系に限定されるものではないことを理解されたい。本明細書に使用される用語が、単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、制限することが意図されないことも理解されたい。

【0240】

加えて、本開示の特徴又は態様がマーカッシュ群の観点から記載される場合、当業者であれば、本開示が、それによって、マーカッシュ群の任意の個々の構成要素又は構成要素のサブグループの観点からも記載されることを認識するであろう。

【0241】

当業者によって理解されるように、任意及び全ての目的のために、特に書面による説明を提供するという点で、本明細書に開示される全ての範囲はまた、任意及び全ての可能なサブ範囲及びそのサブ範囲の組み合わせも包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲が少なくとも等しい２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分類されることを十分に示し、可能にするものとして、容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で考察される各範囲は、容易に、下側の３分の１、中間の３分の１、及び上側の３分の１などに分類することができる。また、当業者によって理解されるように、「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「より少ない」などの全ての言語は、列挙される数を含み、続いて、上述のようにサブ範囲に分類され得る範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるであろうように、範囲は、各個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１～３個の細胞を有する群は、１、２、又は３個の細胞を有する群を指す。同様に、１～５個の細胞を有する群は、１個、２個、３個、４個、又は５個などの細胞を有する群を指す、などなど。

【0242】

本明細書に言及又は引用される全ての特許、特許出願、仮出願、及び刊行物は、本明細書の明示的な教示と矛盾しない限り、全ての図及び表を含む、それらの全体が参照により組み込まれる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図13F】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【配列表】

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【国際調査報告】