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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-19
(54)【発明の名称】免疫原性融合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240312BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240312BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240312BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240312BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240312BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240312BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240312BHJP
C07K 14/315 20060101ALI20240312BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240312BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240312BHJP
A61K 39/09 20060101ALI20240312BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20240312BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240312BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240312BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240312BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/31
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K14/315
C07K19/00
C12N15/11 Z
A61K39/09
A61K39/39
A61K48/00
A61P31/04
A61P37/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023560549
(86)(22)【出願日】2022-03-29
(85)【翻訳文提出日】2023-11-15
(86)【国際出願番号】 EP2022058309
(87)【国際公開番号】W WO2022207657
(87)【国際公開日】2022-10-06
(31)【優先権主張番号】21165674.9
(32)【優先日】2021-03-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523371562
【氏名又は名称】ミネルバエクス・アンパルトセルスカブ
【氏名又は名称原語表記】ＭＩＮＥＲＶＡＸ ＡＰＳ
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ペダーセン・フィッシャー，ペル・ボー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA45
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZB35
4C085AA03
4C085AA38
4C085BA14
4C085CC05
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE06
4C085FF02
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA11
4H045EA31
4H045EA52
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA21
(57)【要約】
本発明は、ｉ．１７０～１７８個のアミノ酸、好ましくは１７４～１７５個のアミノ酸からなり、及び配列番号７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のアミノ酸配列部分と、ｉｉ．１６５～１７４個のアミノ酸、好ましくは１６９～１７０個のアミノ酸からなり、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のアミノ酸配列部分と、任意選択的に、ｉｉｉ．１～２０個のアミノ酸からなり、及び第１のアミノ酸配列部分を第２のアミノ酸部分から分離するリンカーアミノ酸配列部分とからなるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる免疫原性融合タンパク質に関する。免疫原性融合タンパク質は、好ましくは３３５～３７２個のアミノ酸、好ましくは３４３～３５３個のアミノ酸、より好ましくは３４３～３４７個のアミノ酸からなる。本発明は、免疫原性融合タンパク質をコードする核酸分子、ベクター、宿主細胞、ワクチン、及びＢ群連鎖球菌感染に対してワクチン接種するか又はＢ群連鎖球菌感染症を処置する方法に更に関係する。図３は要約とともに公開されることが提案される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉ．１７０～１７８個のアミノ酸、好ましくは１７４～１７５個のアミノ酸からなり、及び配列番号７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のアミノ酸配列部分と、ｉｉ．１６５～１７４個のアミノ酸、好ましくは１６９～１７０個のアミノ酸からなり、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のアミノ酸配列部分と、任意選択的に
ｉｉｉ．１～２０個のアミノ酸からなり、及び前記第１のアミノ酸配列部分を前記第２のアミノ酸部分から分離するリンカーアミノ酸配列部分と
からなるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる免疫原性融合タンパク質であって、
好ましくは３３５～３７２個のアミノ酸、好ましくは３４３～３５３個のアミノ酸、より好ましくは３４３～３４７個のアミノ酸からなる、免疫原性融合タンパク質。
【請求項2】
前記第１のアミノ酸配列部分が、配列番号７で表される配列のアミノ酸１～１７５又は２～１７５を含むか、又は好ましくはそれからなり、及び前記第２のアミノ酸配列部分が、配列番号１４で表される配列のアミノ酸１～１７０、又は２～１７０を含むか、又は好ましくはそれからなる、請求項１に記載の免疫原性融合タンパク質。
【請求項3】
前記アミノ酸配列がリンカーアミノ酸配列部分を含み、並びに前記リンカーアミノ酸配列部分が、１～１０個のアミノ酸、好ましくは２～５個のアミノ酸、より好ましくは２個のアミノ酸、及び最も好ましくはアミノ酸配列ＥＦからなる、いずれかの先行する請求項に記載の免疫原性融合タンパク質。
【請求項4】
配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、いずれかの先行する請求項に記載の免疫原性融合タンパク質。
【請求項5】
配列番号２１で表されるアミノ酸の配列からなり、或いは配列番号２１のアミノ酸２～３４７からなる、いずれかの先行する請求項に記載の免疫原性融合タンパク質。
【請求項6】
先行する請求項のいずれかに記載の免疫原性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子。
【請求項7】
配列番号１５～２０のうちの１つで表されるヌクレオチドの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項8】
請求項６～７のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項9】
請求項１～５のいずれかに記載の免疫原性融合タンパク質を発現するか、又は請求項６～７のいずれかに記載の核酸分子、又は請求項８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項10】
請求項１～５のいずれかに記載の免疫原性融合タンパク質、請求項６～７のいずれかに記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、又は請求項９に記載の宿主細胞のうちの１つ又は複数を含むワクチン。
【請求項11】
ａ）配列番号４２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる更なる免疫原性融合タンパク質、ｂ）前記更なる免疫原性融合タンパク質をコードする更なる核酸分子であって、好ましくは配列番号３６～４１の１つで表されるヌクレオチドの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する更なる核酸分子、
ｃ）前記更なる核酸分子を含む更なるベクター、或いは
ｄ）前記更なる免疫原性融合タンパク質を発現するか又は前記更なるベクターを含む更なる宿主細胞
のうちの１つ又は複数を更に含む、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項12】
ａ）請求項５に記載の免疫原性融合タンパク質と、ｂ）配列番号４２で表されるアミノ酸の配列を含み、好ましくはそれからなり、或いは配列番号４２のアミノ酸２～３４７を含むか、好ましくはそれからなる更なる免疫原性融合タンパク質と
を含む、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項13】
アジュバントとして水酸化アルミニウムを更に含む、請求項１０～１２のいずれかに記載のワクチン。
【請求項14】
ｉ）Ｂ群連鎖球菌感染症に対するワクチン接種、又はｉｉ）Ｂ群連鎖球菌感染症の処置における使用のための、請求項１～５のいずれかに記載の免疫原性融合タンパク質、請求項６～７のいずれかに記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、又は請求項１０～１３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項15】
請求項１４に記載の使用のための、請求項１～５のいずれかに記載の免疫原性融合タンパク質、請求項６～７のいずれかに記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、又は請求項１０～１３のいずれかに記載のワクチンであって、女性ヒト対象に投与される請求項１～５のいずれかに記載の免疫原性融合タンパク質、請求項６～７のいずれかに記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、又は請求項１０～１３のいずれかに記載のワクチン。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は微生物学及びワクチン技術の分野に関し、並びにＢ群連鎖球菌感染症に対する免疫性を付与する能力を有する免疫原性融合タンパク質の開発と関係する。より具体的には、本発明は、Ｂ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の侵襲的系統に対する免疫性を付与する免疫原性融合タンパク質に関する。本発明は、免疫原性融合タンパク質をコードする核酸分子、ベクター、宿主細胞、ワクチン、及びＢ群連鎖球菌感染に対してワクチン接種するか又はＢ群連鎖球菌感染症を処置する方法に更に関係する。
本発明は微生物学及びワクチン技術の分野に関し、並びにＢ群連鎖球菌感染症に対する免疫性を付与する能力を有する免疫原性融合タンパク質の開発と関係する。より具体的には、本発明は、Ｂ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の侵襲的系統に対する免疫性を付与する免疫原性融合タンパク質に関する。本発明は、免疫原性融合タンパク質をコードする核酸分子、ベクター、宿主細胞、ワクチン、及びＢ群連鎖球菌感染に対してワクチン接種するか又はＢ群連鎖球菌感染症を処置する方法に更に関係する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
Ｂ群連鎖球菌（ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ））（ＧＢＳ）は、新生児期の、髄膜炎を含む侵襲性細菌感染症の主原因である。米国単独で、今日、年間約５０００例の侵襲性疾患がこの細菌により引き起こされている。この感染症の全体的な死亡率は約１０％であり、また生存する小児の多くは永続的な神経学的後遺症を有する。この点に鑑み、予防及び処置する方法を見出し、またＧＢＳが引き起こす感染症の機構を解析するための多大な努力が払われてきた。
Ｂ群連鎖球菌（ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ））（ＧＢＳ）は、新生児期の、髄膜炎を含む侵襲性細菌感染症の主原因である。米国単独で、今日、年間約５０００例の侵襲性疾患がこの細菌により引き起こされている。この感染症の全体的な死亡率は約１０％であり、また生存する小児の多くは永続的な神経学的後遺症を有する。この点に鑑み、予防及び処置する方法を見出し、またＧＢＳが引き起こす感染症の機構を解析するための多大な努力が払われてきた。
【0003】
ＧＢＳは、ウシにおいて乳房炎、重大な経済的重要性を有するウシの疾患、を引き起こすおそれもある。従って、ＧＢＳ感染症に対するワクチンの開発は獣医学においても関心事である。
【0004】
全女性の約２０％がＧＢＳの膣内保菌者であり、また母体生殖器からの垂直感染が、おそらくはこの細菌により引き起こされる新生児疾患において最も一般的な感染源である。しかしながら、出生時にＧＢＳがコロニー形成した小児のうちの約１％が重篤な感染症に罹患するにすぎない。従って、出生時の当該細菌への曝露以外のその他の要因が、新生児疾患の発症に寄与しているはずである。
【0005】
Ｂ群連鎖球菌株は、多糖類カプセルの構造に基づき９つの血清型（Ｉａ、Ｉｂ、及びＩＩ～ＶＩＩＩ）に分割される。４つの「古典的な」血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、及びＩＩＩは、通常の細菌叢内の系統間でほぼ等しい割合で生ずるが、しかしＩＩＩ型は、特に髄膜炎のほとんどの症例の原因とされるので、臨床的に最も重要な血清型である。カプセルは公知の病原性因子であるので、特にＩＩＩ型系統においてかなり詳細に研究されてきた。ワクチンを開発するための努力がなされているが、そこではＩＩＩ型多糖類カプセルが必須のコンポーネントである。
【0006】
欧州特許第０ ８６６ １３３号は、Ｂ群連鎖球菌により引き起こされる感染症からレシピエントを防御する能力を有するワクチンについて開示する。該発明は、多糖類とイプシロンタンパク質の断片との併用と関連する。該発明は、型固有のカプセルがＢ群連鎖球菌感染症に対する免疫性において重要な役割を演ずることを示唆する疫学的データについて更に開示する（７頁の２～３行を参照されたい）。更に、該出願において記載される異なるタンパク質と多糖類との間にはいくつかの異なる組合せが存在するが、しかしすべての請求項は、その特別なコンポーネントの重要性を示す多糖類を含む。しかしながら、多糖類カプセルをワクチンとして使用すると、ヒト組織との交差反応に起因して問題が生ずるおそれがある（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、１９９２年、第６０巻：１５９８頁）。従って、多糖類よりはむしろタンパク質に基づくワクチンを開発することができれば非常に有用であろう。
【0007】
Ｇｒａｖｅｋａｍｐらの文献、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９７年１２月、５２１６～５２２１頁は、アルファ（α）Ｃタンパク質の反復数並びにＮ末端部分単独について、それらの免疫原性並びに保護の評価を開示する。反復数が増加すると共に免疫原性は低下することが判明した（図２Ｂを参照されたい）。しかしながら、Ｎ末端領域に対する抗体と比較して、Ｎ末端領域に対する抗体は保護に主として関与することがプロテクションアッセイにおいても判明した（５２１９頁、左側カラム、下から６行目、及び５２２０頁、右側カラム、２６～２９行を参照されたい）。
【0008】
国際公開第９４１０３１７号は、コンジュゲートワクチンの開発におけるアルファタンパク質（ＧＢＳ表面タンパク質）の使用について記載する。このタンパク質の欠点として、多くの重篤なＧＢＳ感染症の原因であるＩＩＩ型系統により通常発現されないことが挙げられる。従って、この系統に対する防御免疫はアルファタンパク質ワクチンによって誘起されない。
【0009】
国際公開第９４２１６８５号は、ワクチンの開発におけるＲｉｂタンパク質（ＧＢＳ表面タンパク質）の使用について記載する。このタンパク質は、ミョウバンと共に投与すると免疫性を誘発する。しかしながら、Ｒｉｂタンパク質は、ＧＢＳ系統のいずれに対しても防御免疫を惹起しないという欠点を有する。
【0010】
Ｌｉｎｄａｈｌらの文献、Ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ａｒｅ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ａｓ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ Ｉｎ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ、Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ、第２巻、４２７～４３４頁、２００７年１２月は、Ｂ群連鎖球菌表面タンパク質、Ｒｉｂ及びＡｌｐＣのＮ末端領域を含む融合タンパク質について開示する。
【0011】
同様に、国際公開第２００８１２７１７９号は、Ｂ群連鎖球菌表面タンパク質、又は類似体、相同体、誘導体、又は免疫学的に関連するアミノ酸配列、又はその断片の少なくとも１つの第２のＮ末端領域断片に融合している、Ｂ群連鎖球菌表面タンパク質、又は類似体、相同体、誘導体、又は免疫学的に関連するアミノ酸配列、又はその断片の少なくとも１つの第１のＮ末端領域断片を含む融合タンパク質であって、Ｂ群連鎖球菌表面タンパク質の第１及び第２の少なくとも１つのＮ末端領域断片が異なるＢ群連鎖球菌系統に由来し、並びに融合タンパク質はＢ群連鎖球菌に対して防御免疫を誘発する能力を有する融合タンパク質について記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
ＧＢＳ疾患の予防に適するワクチンに向けた進展に進歩がみられるにもかかわらず、ＧＢＳ感染症を予防及び処置するための更なる方法及びワクチンに対する必要性がなおも存在する。従って、広範囲のＧＢＳ系統に対して防御免疫を誘発する能力を有するワクチン戦略を探索する必要性が存続する。
【0013】
従って、本発明の第１の目的は、ＧＢＳ感染症に対して防御免疫を誘発する能力を有するワクチンにおいて使用可能である免疫原性融合タンパク質を提供することである。
【0014】
本発明の更なる目的は、多くの臨床的に重要なＧＢＳ系統に対して防御免疫を誘発するワクチンを提供することである。
【0015】
本発明の別の目的は、ＧＢＳ感染症に対して防御免疫を誘発する単一又はいくつかの免疫原性融合タンパク質を含むワクチンを提供することである。単一又はいくつかのタンパク質は、非常に多くのタンパク質から構成されるワクチンに対して、例えば製造コスト及び安全性といったいくつかの長所を有する。
【0016】
ＧＢＳに対して改善した防御を提供する能力を有する免疫原性融合タンパク質を提供することが本発明の更なる目的である。
【0017】
上記目的のそれぞれ並びにその他を実現する手段は、以下に続く本発明の説明から明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【0018】
発明の概要
本発明は、本発明者による、国際公開第２００８１２７１７９号で開示された融合タンパク質に関する更なる研究に基づく。特に、Ｒｉｂ及びＡｌｐＣのＮ末端領域のより短いアミノ酸配列を含む免疫原性融合タンパク質が好適であることが判明した。そのような免疫原性融合タンパク質は、ワクチン接種用として製造及び使用することがより容易であり得る。更に、実施例４及び５に示すように、そのようなより短尺の融合タンパク質は、特に内皮細胞との接着及び／又はそれへの浸潤に対して改善した防御を提供することにより、ＧＢＳに対して改善した防御を提供する。
本発明は、本発明者による、国際公開第２００８１２７１７９号で開示された融合タンパク質に関する更なる研究に基づく。特に、Ｒｉｂ及びＡｌｐＣのＮ末端領域のより短いアミノ酸配列を含む免疫原性融合タンパク質が好適であることが判明した。そのような免疫原性融合タンパク質は、ワクチン接種用として製造及び使用することがより容易であり得る。更に、実施例４及び５に示すように、そのようなより短尺の融合タンパク質は、特に内皮細胞との接着及び／又はそれへの浸潤に対して改善した防御を提供することにより、ＧＢＳに対して改善した防御を提供する。
【0019】
それに付加して、免疫原性融合タンパク質をコードするコドン最適化された対応する核酸分子が考案された。これはベクター内に提供され得る。宿主細胞が、ひいては免疫原性融合タンパク質を発現するか又はベクターを含み得る。免疫原性融合タンパク質、核酸分子、ベクター、及び宿主細胞のそれぞれは、ワクチンで使用され得る。免疫原性融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞、及び／又はワクチンは、Ｂ群連鎖球菌感染症に対してワクチン接種する方法、又はＢ群連鎖球菌感染症を処置する方法で更に使用され得る。
【0020】
従って、本発明の第１の態様は、
ｉ．１７０～１７８個のアミノ酸、好ましくは１７４～１７５個のアミノ酸からなり、及び配列番号７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のアミノ酸配列部分と、
ｉｉ．１６５～１７４個のアミノ酸、好ましくは１６９～１７０個のアミノ酸からなり、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のアミノ酸配列部分と、任意選択的に
ｉｉｉ．１～２０個のアミノ酸からなり、及び第１のアミノ酸配列部分を第２のアミノ酸部分から分離するリンカーアミノ酸配列部分と
からなるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる免疫原性融合タンパク質であって、
好ましくは３３５～３７２個のアミノ酸、好ましくは３４３～３５３個のアミノ酸、より好ましくは３４３～３４７個のアミノ酸からなる、免疫原性融合タンパク質に関する。
ｉ．１７０～１７８個のアミノ酸、好ましくは１７４～１７５個のアミノ酸からなり、及び配列番号７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のアミノ酸配列部分と、
ｉｉ．１６５～１７４個のアミノ酸、好ましくは１６９～１７０個のアミノ酸からなり、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のアミノ酸配列部分と、任意選択的に
ｉｉｉ．１～２０個のアミノ酸からなり、及び第１のアミノ酸配列部分を第２のアミノ酸部分から分離するリンカーアミノ酸配列部分と
からなるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる免疫原性融合タンパク質であって、
好ましくは３３５～３７２個のアミノ酸、好ましくは３４３～３５３個のアミノ酸、より好ましくは３４３～３４７個のアミノ酸からなる、免疫原性融合タンパク質に関する。
【0021】
上記で指摘したように、免疫原性融合タンパク質は、ワクチン接種用として製造及び使用することがより容易であり得る。免疫原性融合タンパク質は、アジュバントを用いなくても免疫原性であるという利点を有するが、しかしながら免疫原性を増加させるためのアジュバント、例えばミョウバン又は水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）等と共に使用することも可能である。
【0022】
免疫原性融合タンパク質に備わる別の長所は、Ａｌｐ１及びＡｌｐ２のＮ末端領域を含む更なる免疫原性融合タンパク質と組み合わせることができるという点にある。実施例において認められるように、２つのそのような免疫原性融合タンパク質を組み合わせることで、免疫化で併用される場合、取得される抗体の数（抗体価）に対して相乗的効果がもたらされる。
【0023】
本発明は下記でより詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質を単独で、又は本発明の第５の態様に基づくワクチンに包含される更なる免疫原性融合タンパク質と組み合わせてのいずれかの、アジュバントを含め／含めないで、異なる投薬量において、１回の投与を使用する免疫化から２９日後に得られたＩｇＧの倍率増加を示す図である。
【図2】本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質を単独で、又は本発明の第５の態様に基づくワクチンに包含される更なる免疫原性融合タンパク質と組み合わせてのいずれかの、アジュバントを含め／含めないで、異なる投薬量において、第１回投与及び第２回投与を使用する免疫化から５７日目に得られたＩｇＧの倍率増加を示す図である。
【図3】Ｂ群連鎖球菌系統ＢＭ１１０（８×１０３ｃｆｕ）を用いて新生児細菌性感染症を引き起こした後のマウス幼獣の生存率を示す図である。幼獣は、ａ）配列番号２１の免疫原性融合タンパク質＋アジュバント（水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３））、ｂ）又はコントロール（アジュバント（水酸化アルミニウム）のみ）のいずれかで免疫化したメスのマウスから生まれた。
【図4A】臨床分離株及び配列番号２１の免疫原性融合タンパク質を使用した免疫化から得られた抗血清を使用するヒト上皮細胞浸潤試験において得られた結果を示す図である。
【図4B】臨床分離株及び配列番号２１の免疫原性融合タンパク質を使用した免疫化から得られた抗血清を使用するヒト上皮細胞浸潤試験において得られた結果を示す図である。
【図4C】臨床分離株及び配列番号２１の免疫原性融合タンパク質を使用した免疫化から得られた抗血清を使用するヒト上皮細胞浸潤試験において得られた結果を示す図である。
【図4D】臨床分離株及び配列番号２１の免疫原性融合タンパク質を使用した免疫化から得られた抗血清を使用するヒト上皮細胞浸潤試験において得られた結果を示す図である。
【図4E】臨床分離株及び配列番号２１の免疫原性融合タンパク質を使用した免疫化から得られた抗血清を使用するヒト上皮細胞浸潤試験において得られた結果を示す図である。
【図5A】国際公開第２００８１２７１７９号に基づく融合タンパク質の描画を、配列番号４３に基づく先導配列及び配列番号２１に基づく融合タンパク質のより短尺のアミノ酸配列を含め示す図である。
【図5B】国際公開第２００８１２７１７９号に基づく融合タンパク質の描画を、配列番号４３に基づく先導配列及び配列番号２１に基づく融合タンパク質のより短尺のアミノ酸配列を含め示す図である。
【図5C】国際公開第２００８１２７１７９号に基づく融合タンパク質の描画を、配列番号４３に基づく先導配列及び配列番号２１に基づく融合タンパク質のより短尺のアミノ酸配列を含め示す図である。
【図6】配列番号２１のより短尺の融合タンパク質とα１β１インテグリンとの間の相互作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0025】
発明の詳細な説明
本明細書において、別途規定されない限り、「ａ」又は「ａｎ」は、「１つ又は複数」を意味する。本明細書全体を通じて、あらゆるすべての参考資料は、参照により本特許出願に特別に組み込まれる。
本明細書において、別途規定されない限り、「ａ」又は「ａｎ」は、「１つ又は複数」を意味する。本明細書全体を通じて、あらゆるすべての参考資料は、参照により本特許出願に特別に組み込まれる。
【0026】
上記の通り、本発明の第１の態様は、
ｉ．１７０～１７８個のアミノ酸、好ましくは１７４～１７５個のアミノ酸からなり、及び配列番号７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のアミノ酸配列部分と、
ｉｉ．１６５～１７４個のアミノ酸、好ましくは１６９～１７０個のアミノ酸からなり、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のアミノ酸配列部分と、任意選択的に
ｉｉｉ．１～２０個のアミノ酸からなり、及び第１のアミノ酸配列部分を第２のアミノ酸部分から分離するリンカーアミノ酸配列部分と
からなるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる免疫原性融合タンパク質であって、
好ましくは３３５～３７２個のアミノ酸、好ましくは３４３～３５３個のアミノ酸、より好ましくは３４３～３４７個のアミノ酸からなる、免疫原性融合タンパク質に関する。
ｉ．１７０～１７８個のアミノ酸、好ましくは１７４～１７５個のアミノ酸からなり、及び配列番号７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のアミノ酸配列部分と、
ｉｉ．１６５～１７４個のアミノ酸、好ましくは１６９～１７０個のアミノ酸からなり、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のアミノ酸配列部分と、任意選択的に
ｉｉｉ．１～２０個のアミノ酸からなり、及び第１のアミノ酸配列部分を第２のアミノ酸部分から分離するリンカーアミノ酸配列部分と
からなるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる免疫原性融合タンパク質であって、
好ましくは３３５～３７２個のアミノ酸、好ましくは３４３～３５３個のアミノ酸、より好ましくは３４３～３４７個のアミノ酸からなる、免疫原性融合タンパク質に関する。
【0027】
用語「免疫原性」は、免疫応答を誘発する能力を有することを意味するように意図される。本発明の免疫原性融合タンパク質は免疫原性であり、また少なくとも表面タンパク質（そのＮ末端領域が免疫原性融合タンパク質に含まれる）を含有するＧＢＳに対する防御免疫応答を誘発するその能力により特徴付けられる。Ｂ群連鎖球菌に対して防御免疫を誘発するということは、表面タンパク質Ｒｉｂ及びＡｌｐＣの少なくとも１つを担持するＢ群連鎖球菌に対して防御免疫を誘発するということを包含するものと理解される。「～の能力を有する」とは、免疫原性融合タンパク質が、免疫系を有する個体に対して適する用量で投与された場合、当該個体において防御免疫を誘発することを意味する。免疫原性融合タンパク質は、好ましくはＢ群連鎖球菌に対して防御免疫を誘発する能力を有する。
【0028】
用語「防御免疫」とは、本発明に関連する場合、感染性病原体、例えばＢ群連鎖球菌等により引き起こされた疾患から防御する（部分的又は全面的に）ための免疫化の期間中に誘発された血清抗体の能力及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞応答を指す。すなわち、本発明のワクチンにより免疫化された脊椎動物は、Ｂ群連鎖球菌の限定的増殖及び拡散を経験する。防御免疫が融合タンパク質又はワクチンにより誘発されるかどうか判定するために、当業者にとって周知の技術が使用可能である。例えば、本発明の融合タンパク質又はワクチンを用いた免疫化がＢ群連鎖球菌感染症に対して防御免疫を誘発するかどうか判定するためには、Ｂ群連鎖球菌を免疫化されたテスト動物に負荷することが可能であり、そしてＢ群連鎖球菌の増殖及び拡散が測定される。例えば、防御免疫が誘発されるかどうか判定するために、下記の実施例に記載する方法に基づく方法が使用可能である。
【0029】
本発明の目的に照らして、用語「融合タンパク質」とは、２つ以上のタンパク質領域又はその断片のアセンブリを指す。上記のように、免疫原性融合タンパク質は、少なくとも第１及び第２のアミノ酸配列部分からなるアミノ酸配列を含む（又は好ましくはそれからなる）。これらの部分は、Ｂ群連鎖球菌表面タンパク質Ｒｉｂ及びＡｌｐＣそれぞれのＮ末端領域と関連する。
【0030】
融合タンパク質を取得するためのアミノ酸配列部分の組合せは、アミノ酸配列部分をその一方若しくは両方の端部において共に融合させ、すなわち結びつけること（共有結合性のカップリング、結合、又はリンキング、又はコンジュゲーション）により、又は結びついた核酸分子が翻訳されるときに、単一の連続した発現産物が生成されるように、各アミノ酸配列部分をコードする別個の核酸分子を共に結びつけることにより実現可能である。
【0031】
融合タンパク質において、第１及び第２のアミノ酸配列部分はリンカーアミノ酸配列部分により分離され得る。
【0032】
融合タンパク質は、アミノ酸配列部分を架橋すること又は高分子構造上でそれを捕捉することにより取得可能であることが、本発明の文脈において更に想定される。
【0033】
本発明の目的に照らして、用語「タンパク質」とは、アミノ酸の分子鎖を指す。タンパク質は特定の長さを有するものではなく、また必要であれば、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化、又はリン酸化により、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで改変可能である。特に、ペプチド、オリゴペプチド、及びポリペプチドが、当該定義に含まれる。
【0034】
用語「Ｎ末端領域」とは、本発明に関連する場合、タンパク質のＮ末端領域（Ｎ）を指す。
【0035】
本明細書においてＧＢＳとも呼ばれるＢ群連鎖球菌系統は公知であり、感染したヒトの血液から単離され得る。ＧＢＳは、米国内の新生児敗血症の最も一般的な原因であり、また年間約５０００例に関与する。
【0036】
「Ｂ群連鎖球菌」という表示は、連鎖球菌は、その細胞表面上の特定の炭水化物抗原の存在に基づき免疫学的群に分割されるという事実に由来する。現時点では、Ａ群からＯ群が認識されている。
【0037】
Ｂ群連鎖球菌のＲｉｂタンパク質は、本明細書においてＲｉｂ及びＲｉｂタンパク質とも呼ばれ、当技術分野において公知の表面タンパク質であり、また例えば国際公開第９４２１６８５号に記載されている。「Ｒｉｂ」という表示は、プロテアーゼ耐性、免疫性、及びＢ群を表す。Ｒｉｂタンパク質は、特徴的な９５ｋＤａタンパク質として血清型ＩＩＩのＢ群連鎖球菌株から最初に単離された。タンパク質Ｒｉｂは、髄膜炎のほとんどの症例の原因をなす臨床的に重要な血清型ＩＩＩに該当するほぼすべてのＢ群連鎖球菌株により、及びその他の血清型、例えばＩＩ等のいくつかの系統により発現されている。それに加えて、Ｒｉｂは、ＩＩＩ型の超強毒性クローンのすべての系統により発現される。タンパク質Ｒｉｂを精製する方法が考案されており、またこのタンパク質に対する抗体は、タンパク質Ｒｉｂを発現する系統による致死性感染症から保護することが実証されている（更なる詳細については、例えばＤＮＡ及びタンパク質配列等については、国際公開第９４２１６８５号を参照されたい）。
【0038】
配列番号７はＲｉｂのより短いＮ末端領域を示す：
MAEVISGSAVTLNTNMTKNVQNGRAYIDLYDVKNGKIDPLQLITLNSPDLKAQYVIRQGGNYFTQPSELTTVGAASINYTVLKTDGSPHTKPDGQVDIINVSLTIYNSSALRDKIDEVKKKAEDPKWDEGSRDKVLISLDDIKTDIDNNPKTQSDIANKITEVTNLEKILVPRIP
配列番号７のアミノ酸配列をコードする核酸ＤＮＡ分子は配列番号１、３、５で表され、配列番号３は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させるためにコドン最適化されており、及び配列番号５は、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞内で発現させるためにコドン最適化されている。
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配列番号７のアミノ酸配列をコードする核酸ＤＮＡ分子は配列番号１、３、５で表され、配列番号３は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させるためにコドン最適化されており、及び配列番号５は、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞内で発現させるためにコドン最適化されている。
【0039】
配列番号７のアミノ酸配列をコードする対応する核酸ＲＮＡ分子は配列番号２、４、６で表され、配列番号４は大腸菌内で発現させるためにコドン最適化されており、及び配列番号６は、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞内で発現させるためにコドン最適化されている。
【0040】
Ｒｉｂのより短いＮ末端領域、すなわち配列番号７と、国際公開第２００８１２７１７９号においてＲｉｂのＮ末端に関して提示される配列との間の差異は、アミノ酸５個分の長さの先導配列ＧＰＬＧＳ、配列番号４４に該当する。
【0041】
Ｂ群連鎖球菌のＡｌｐＣタンパク質はアルファタンパク質としても知られており、当技術分野において公知のＢ群連鎖球菌表面タンパク質である。国際公開第９４１０３１７号は、アルファタンパク質を含むコンジュゲートワクチン組成物について記載する。国際公開第９４１０３１７号に記載されるような天然のＢ群連鎖球菌ＡｌｐＣ前駆体タンパク質は、分子量１０８ｋＤａを有する。４１個のアミノ酸からなる推定シグナル配列を切断すると、１０４ｋＤａの成熟したタンパク質が得られる。（注記：しかしながら、シグナル配列は長さ５６個のアミノ酸残基を有することが、その後明らかとなった：Ｓｔａｌｈａｍｍａｒ－Ｃａｒｌｅｍａｌｍら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、第１７７巻、１５９３頁；１９９３年）。ＡｌｐＣ抗原の２０ｋＤａ Ｎ末端領域は、これまでに記載されたタンパク質配列に対して相同性を示さず、また成熟したタンパク質の７４％を占める一連の９個の直列反復単位がそれに後続する。各反復単位（本明細書において「Ｒ」として表される）は同一であり、また約８５００ダルトンの分子質量を有する８２個のアミノ酸からなり、２４６個のヌクレオチドによりコードされる。ＡｌｐＣ抗原のＣ末端領域は、いくつかのグラム陽性表面タンパク質中に存在する細胞壁アンカードメインモチーフを含有する。
【0042】
配列番号１４はＡｌｐＣのより短いＮ末端領域を示す：
STIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKLGKIDPLQLIVLEQGFTAKYVFRQGTKYYGDVSQLQSTGRASLTYNIFGEDGLPHVKTDGQIDIVSVALTIYDSTTLRDKIEEVRTNANDPKWTEESRTEVLTGLDTIKTDIDNNPKTQTDIDSKIVEVNELEKLLVLS
ＡｌｐＣのより短いＮ末端領域、すなわち配列番号１４と、国際公開第２００８１２７１７９号においてＡｌｐＣのＮ末端に関して提示される配列との間の差異は、アミノ酸５個分の長さの先導配列ＧＰＬＧＳ、配列番号４４に該当する。
STIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKLGKIDPLQLIVLEQGFTAKYVFRQGTKYYGDVSQLQSTGRASLTYNIFGEDGLPHVKTDGQIDIVSVALTIYDSTTLRDKIEEVRTNANDPKWTEESRTEVLTGLDTIKTDIDNNPKTQTDIDSKIVEVNELEKLLVLS
ＡｌｐＣのより短いＮ末端領域、すなわち配列番号１４と、国際公開第２００８１２７１７９号においてＡｌｐＣのＮ末端に関して提示される配列との間の差異は、アミノ酸５個分の長さの先導配列ＧＰＬＧＳ、配列番号４４に該当する。
【0043】
配列番号１４のアミノ酸配列をコードする核酸ＤＮＡ分子は配列番号８、１０、１２で表され、配列番号１０は大腸菌内で発現させるためにコドン最適化されており、及び配列番号１２はＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞内で発現させるためにコドン最適化されている。
【0044】
配列番号１４のアミノ酸配列をコードする対応する核酸ＲＮＡ分子は配列番号９、１１、１３で表され、配列番号１１は大腸菌内で発現させるためにコドン最適化されており、及び配列番号１３はＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞内で発現させるためにコドン最適化されている。
【0045】
用語「配列同一性」は、等しい長さの２つのアミノ酸配列間、又は等しい長さの２つのヌクレオチド配列間の相同性について、その程度の定量的指標を表す。比較される２つの配列の長さが等しくない場合には、該２つの配列は、考え得る最良の当て嵌めとなるようにアライメントされなければならない。配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴプログラム、例えばＢＬＡＳＴＰプログラム又はＢＬＡＳＴＮプログラムにより計算可能である（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ．Ｒ 及び Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ、第８５巻：２４４４～２４４８頁）（ｗｗｗ．ｎｃｂｌ．ｎｌｍ．ｎｌｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）。
【0046】
好ましくは、免疫原性融合タンパク質はアミノ酸配列からなる。１７０～１７８個のアミノ酸、好ましくは１７４～１７５個のアミノ酸からなる第１のアミノ酸配列部分は、配列番号７で表される完全長アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【0047】
１６５～１７４個のアミノ酸、好ましくは１６９～１７０個のアミノ酸からなる第２のアミノ酸配列部分は、配列番号１４で表される完全長アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【0048】
第１のアミノ酸配列部分は、最大１７８個のアミノ酸、例えば１７０～１７８個のアミノ酸、好ましくは１７４～１７５個のアミノ酸からなるべきである。記載の通り、配列番号７は１７５個のアミノ酸を含有する。該配列内の最初のＭは任意選択的であり、従ってこの場合１７４個のアミノ酸となる。
【0049】
第１のアミノ酸配列部分は、配列番号７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【0050】
第２のアミノ酸配列部分は、最大１７４個のアミノ酸、例えば１６５～１７４個のアミノ酸、好ましくは１６９～１７０個のアミノ酸からなるべきである。記載の通り、配列番号１４は１７０個のアミノ酸を含有する。配列内の最初のＡは任意選択的であり得、従ってこの場合１６９個のアミノ酸となる。
【0051】
第２のアミノ酸配列部分は、配列番号１４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【0052】
リンカーアミノ酸配列部分は任意選択的である。換言すれば、リンカーアミノ酸配列部分は、含まれる場合、０～２０個のアミノ酸からなり得る。リンカーアミノ酸配列部分内のアミノ酸は、ランダムに、すなわちランダムコイル形成が得られるように選択され得る。リンカーアミノ酸配列部分は、存在する場合には、第１のアミノ酸配列部分を第２のアミノ酸部分から分離する。換言すれば、リンカーアミノ酸配列部分は、第１のアミノ酸配列部分と第２のアミノ酸部分との間に設けられる。
【0053】
第１及び第２のアミノ酸配列部分の一方は、第１及び第２のアミノ酸配列部分の他方から最も遠ざかった端部に位置する先導／後続アミノ酸配列部分と共に提供され得る。先導／後続アミノ酸配列部分は１つ又は複数のアミノ酸を含み得る。
【0054】
免疫原性融合タンパク質は、３３５～３７２個のアミノ酸、好ましくは３４３～３５３個のアミノ酸、より好ましくは３４３～３４７個のアミノ酸からなるのが好ましい。
【0055】
本発明の第１の態様による免疫原性融合タンパク質の好ましい実施形態では、
－第１のアミノ酸配列部分は、配列番号７で表される配列のアミノ酸１～１７５又は２～１７５を含むか又は好ましくはそれからなり、及び
－第２のアミノ酸配列部分は、配列番号１４で表される配列のアミノ酸１～１７０又は２～１７０を含むか又は好ましくはそれからなる。
－第１のアミノ酸配列部分は、配列番号７で表される配列のアミノ酸１～１７５又は２～１７５を含むか又は好ましくはそれからなり、及び
－第２のアミノ酸配列部分は、配列番号１４で表される配列のアミノ酸１～１７０又は２～１７０を含むか又は好ましくはそれからなる。
【0056】
配列番号７は１７５個のアミノ酸を含有する。アミノ酸２～１７５は、最初のメチオニン（Ｍ）を除き、配列番号７内のアミノ酸の配列に対応する。
【0057】
本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質の好ましい実施形態では、アミノ酸配列はリンカーアミノ酸配列部分を含み、並びにリンカーアミノ酸配列部分は、１～１０個のアミノ酸、好ましくは２～５個のアミノ酸、より好ましくは２個のアミノ酸、及び最も好ましくはアミノ酸配列ＥＦからなる。
【0058】
リンカーアミノ酸配列部分がアミノ酸ＥＦ（グルタミン酸－フェニルアラニン）からなる場合、第２のアミノ酸配列部分は、配列番号１４で表される配列のアミノ酸２～１７０を含むか又は好ましくはそれからなるのが好ましい。
【0059】
好ましくは、免疫原性融合タンパク質は、好ましくは配列番号２１で表されるアミノ酸配列のすべてと、少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【0060】
好ましい実施形態では、免疫原性融合タンパク質は、配列番号２１で表されるアミノ酸の配列からなり、或いは免疫原性融合タンパク質は配列番号２１のアミノ酸２～３４７からからなる。
【0061】
図と関連して示すように、そのような免疫原性融合タンパク質は、国際公開第２００８１２７１７９号で開示される免疫原性融合タンパク質よりも短いが、なおも良好な効果を有し、またＧＢＳに対するワクチンで使用するのに適する。
【0062】
更に、実施例４及び５に示すように、先導配列（配列番号４３）を除去することによるそのようなより短尺のアミノ酸配列は、特に内皮細胞との接着及び／又はそれへの浸潤に対してより有効であり及び／又は改善した防御を提供することにより、ＧＢＳに対する防御を提供する際により有効であり且つ改善している。
【0063】
配列番号２１は、アミノ酸配列：
MAEVISGSAVTLNTNMTKNVQNGRAYIDLYDVKNGKIDPLQLITLNSPDLKAQYVIRQGGNYFTQPSELTTVGAASINYTVLKTDGSPHTKPDGQVDIINVSLTIYNSSALRDKIDEVKKKAEDPKWDEGSRDKVLISLDDIKTDIDNNPKTQSDIANKITEVTNLEKILVPRIPEFSTIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKLGKIDPLQLIVLEQGFTAKYVFRQGTKYYGDVSQLQSTGRASLTYNIFGEDGLPHVKTDGQIDIVSVALTIYDSTTLRDKIEEVRTNANDPKWTEESRTEVLTGLDTIKTDIDNNPKTQTDIDSKIVEVNELEKLLVLS
に対応する。
MAEVISGSAVTLNTNMTKNVQNGRAYIDLYDVKNGKIDPLQLITLNSPDLKAQYVIRQGGNYFTQPSELTTVGAASINYTVLKTDGSPHTKPDGQVDIINVSLTIYNSSALRDKIDEVKKKAEDPKWDEGSRDKVLISLDDIKTDIDNNPKTQSDIANKITEVTNLEKILVPRIPEFSTIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKLGKIDPLQLIVLEQGFTAKYVFRQGTKYYGDVSQLQSTGRASLTYNIFGEDGLPHVKTDGQIDIVSVALTIYDSTTLRDKIEEVRTNANDPKWTEESRTEVLTGLDTIKTDIDNNPKTQTDIDSKIVEVNELEKLLVLS
に対応する。
【0064】
配列番号２１に基づくより短尺の融合タンパク質と、国際公開第２００８１２７１７９号の融合タンパク質について提示される配列との間の差異は、アミノ酸３２個分の長さの先導配列：ＧＰＬＧＳＡＳＶＬＩＧＩＳＦＬＧＧＦＴＱＧＱＦＮＩＳＴＤＴＶＦＡ－配列番号４３であり、配列番号２１には見出されない配列である。
【0065】
本発明の第１の態様による免疫原性融合タンパク質の更なる実施形態では、免疫原性融合タンパク質はグリコシル化、アミド化、カルボキシル化、若しくはリン酸化により、又は更に下記する本発明の第３の態様に関して記載される莢膜多糖類若しくはＲＳＶ抗原にコンジュゲートすることにより改変される。
【0066】
そのような融合タンパク質は強化された免疫原性を有し得るので、これは有利である。融合タンパク質の免疫原性を実質的に増加させるために、過度の実験を行わなくても使用され得る非常に多くの技術が利用可能であり、また当業者に周知されている。例えば、融合タンパク質は、ジニトロフェノール基又はアルサニル酸とカップリングさせることにより、或いは熱及び／又はＳＤＳを用いた変性により改変され得る。或いは、融合タンパク質は免疫原性担体とカップリングし得る。カップリング戦略におけるいくつかの一般的検討事項のレビューについては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｅｄ．Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（１９８８年）を参照されたい。有用な免疫原性担体は当技術分野において周知されている。そのような担体の例は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）；アルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やオバルブミン等、ＰＰＤ（ツベルクリンの精製済みタンパク質誘導体）；赤血球；破傷風トキソイド；コレラトキソイド；アガロースビーズ；活性炭；又はベントナイトである。
【0067】
更なる実施形態では、免疫原性融合タンパク質は、莢膜多糖類、好ましくは細菌多糖類、より好ましくはＢ群連鎖球菌多糖類にコンジュゲートしている。
【0068】
多糖類とは、通常グリコシド結合によりリンクした単糖残基からなる任意の直鎖状又は分岐状ポリマーを意味し、従ってオリゴ糖を含む。好ましくは、多糖類は、２～５０個の単糖ユニット、より好ましくは６～３０個の単糖ユニットを含有する。
【0069】
多糖類コンポーネントは、多くのグラム陽性及びグラム陰性菌病原体、例えばインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、及びストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等から得られた多糖類カプセルの多糖類コンポーネントに基づくか又はそれに由来し得る。本発明の融合タンパク質にコンジュゲートし得る多糖類コンポーネントの起源となるその他の細菌として、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びシゲラ・ディセンテリアエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）が挙げられる。本発明のこの態様に基づく使用に適する多糖類コンポーネントとして、Ｈｉｂオリゴ糖、緑膿菌由来のリポ多糖類、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）由来のリポ多糖類、及びシゲラ・ディセンテリアエ由来のＯ－特異的多糖類が挙げられる。
【0070】
本発明に基づく使用に適するその他の多糖類コンポーネントは当業者において周知される。
【0071】
細菌莢膜多糖類の断片は、任意の適する方法により、例えば酸加水分解又は超音波照射等により生成され得る。多糖類コンポーネントを調製するその他の方法は当業者において周知される。
【0072】
多糖類は、好ましくはＢ群連鎖球菌に由来する莢膜多糖類又はその等価物である。
多糖類は、好ましくは共有結合により融合タンパク質とカップリングすべきである。多糖類とタンパク質をカップリングする特に好ましい方法は還元的アミノ化である。その他の方法として、臭化シアンを用いた多糖類の活性化とそれに後続するアジピン酸ジヒドラジド（スペーサー）を用いた反応及び可溶性カルボジイミドを使用するキャリアタンパク質のカルボキシド基へのコンジュゲーション；アジピン酸ジヒドラジドを用いたキャリアタンパク質の機能化とそれに後続する臭化シアン活性化多糖類とのカップリング、キャリアタンパク質及び多糖類の両方の化学修飾とそれに後続するそのカップリングが挙げられる。
多糖類は、好ましくは共有結合により融合タンパク質とカップリングすべきである。多糖類とタンパク質をカップリングする特に好ましい方法は還元的アミノ化である。その他の方法として、臭化シアンを用いた多糖類の活性化とそれに後続するアジピン酸ジヒドラジド（スペーサー）を用いた反応及び可溶性カルボジイミドを使用するキャリアタンパク質のカルボキシド基へのコンジュゲーション；アジピン酸ジヒドラジドを用いたキャリアタンパク質の機能化とそれに後続する臭化シアン活性化多糖類とのカップリング、キャリアタンパク質及び多糖類の両方の化学修飾とそれに後続するそのカップリングが挙げられる。
【0073】
多糖類分子は、スペーサー分子、例えばアジピン酸等により融合タンパク質とカップリングし得る。このスペーサー分子は、多糖類に対する融合タンパク質のカップリングを促進するのに使用可能である。カップリング反応を実施した後に、コンジュゲートは、未反応のタンパク質又は多糖類コンポーネントを取り除くために、透析濾過又はその他の公知の方法により精製され得る。
【0074】
多糖類がＧＢＳとは異なる細菌性病原体に由来する場合には、コンジュゲートは、２つ以上の病原体、例えば、複数種類の細菌に対して免疫性を誘発し得る。これは、免疫原性融合タンパク質の潜在的に重要な応用である。
【0075】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子と関係する。
【0076】
そのような核酸分子は、例えば分離及び取得される免疫原性融合タンパク質の起源となる細胞培養物において直接的に、又は例えば、免疫化するために免疫原性融合タンパク質が発現される対象内で間接的に、免疫原性融合タンパク質を製造する際に使用可能である。
【0077】
核酸分子は、例えばＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である可能性がある。ＲＮＡ分子はｍＲＮＡ分子であり得る。
【0078】
核酸分子は、配列番号８～１３のうちの１つと少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する第２のポリヌクレオチドに、直接又はリンカーポリヌクレオチド配列を介して融合した、配列番号１～６のうちの１つに対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する第１のポリヌクレオチドを含み得るか又は好ましくはそれからなり得る。
【0079】
リンカーポリヌクレオチド配列は任意選択的であるが、核酸分子によりコードされる免疫原性融合タンパク質が、第１のアミノ酸配列部分と第２のアミノ酸配列部分との間に提供されるリンカーを有することとする場合に含まれる。第１のポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドに直接融合する場合には、核酸分子中に存在するはずのリンカーポリヌクレオチド配列は存在しない。
【0080】
上記で引用した配列番号１～６及び配列番号８～１３のそれぞれは、核酸分子によりコードされる免疫原性融合タンパク質の第１のアミノ酸配列部分内のイニシャルメチオニン（Ｍ）、及び第２のアミノ酸配列部分内のイニシャルアラニン（Ａ）をコードする最初の３つの塩基を取り除くことにより任意選択的にトランケートされ得る。
【0081】
核酸分子は、１つ又は複数の終止コドンを任意選択的に含み得る。
核酸分子は、１つ又は複数の開始コドンを任意選択的に含み得る。
核酸分子は、１つ又は複数の開始コドンを任意選択的に含み得る。
【0082】
核酸分子は、特定の生物、例えば大腸菌又はＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞等において発現させるためにコドン最適化され得る。
【0083】
本発明の第２の態様に基づく核酸分子の好ましい実施形態では、核酸分子は、配列番号１５～２０のうちの１つで表されるヌクレオチドの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。好ましくは、核酸分子は、配列番号１５～２０のうちの１つで表されるヌクレオチドの配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。これらの好ましい実施形態において引用された配列番号１５～２０のそれぞれは、核酸分子によりコードされる免疫原性融合タンパク質の第１のアミノ酸配列部分内のイニシャルメチオニン（Ｍ）をコードする最初の３つの塩基を取り除くことにより、任意選択的にトランケートされ得る。更に、これらの好ましい実施形態において引用された配列番号１５～２０のそれぞれは、２つの終止コドンの最後１～６の塩基を取り除くことにより、任意選択的にトランケートされ得る。これは、例えば、核酸分子がＤＮＡ又はＲＮＡワクチンとして使用されるときに使用され得る－転写及び／又は翻訳が核酸分子の末端において停止する。
【0084】
核酸分子は、好ましくは、１０４４個（イニシャルＭを含まない）～１０４７個（イニシャルＭを含む）の塩基からなり得る。
【0085】
本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様に基づく核酸分子を含むベクターと関係する。
【0086】
多種多様な発現宿主／ベクターの組合せが、核酸分子を発現させる際に採用され得る。真核生物宿主に対する有用発現ベクターとして、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、サイトメガロウイルス、及びレトロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に対する有用発現ベクターとして、細菌プラスミド、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、及びその誘導体を含む、大腸菌に由来するもの等、より広範囲の宿主プラスミド、例えばＲＰ４、ファージＤＮＡ等、例えば非常に多くのファージラムダの誘導体、例えばラムダＧＴ１０及びラムダＧＴ１１、ＮＭ９８９、及びその他のＤＮＡファージ、例えばＭ１３及び線維状一本鎖ＤＮＡファージ等が挙げられる。酵母菌細胞に対する有用発現ベクターとして、２．ｍｕ．プラスミド及びその誘導体が挙げられる。昆虫細胞に対する有用ベクターとしてｐＶＬ９４１が挙げられる。
【0087】
それに加えて、多種多様な発現制御配列のいずれも、これらのベクターにおいて核酸分子を発現させるために使用され得る。有用な発現制御配列として、上記発現ベクターの構造遺伝子と関連する発現制御配列が挙げられる。有用な発現制御配列の例として、例えばＳＶ４０又はアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ファージラムダの主要なオペレーター及びプロモーター領域、ｆｄ外被タンパク質の制御領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ又はその他の糖分解酵素に対するプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母菌アルファ交配系のプロモーター、並びに原核若しくは真核細胞、又はそのウイルス及びその様々な組合せにおいて、それらの遺伝子の発現をコントロールすることが公知のその他の構成的及び誘導的プロモーター配列が挙げられる。
【0088】
本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質を発現するか、又は本発明の第２の態様に基づく核酸分子、又は本発明の第３の態様に基づくベクターを含む宿主細胞と関係する。
【0089】
宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞、グラム陽性細菌細胞、酵母菌細胞、昆虫細胞、動物細胞、アフリカミドリザル細胞、ヒト細胞、又は植物細胞であり得る。宿主細胞は、大腸菌、シュードモナス属、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シゲラ属（ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ属、リステリア属（ｌｉｓｔｅｒｉａ）、連鎖球菌属、スタフィロコッカス属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、及び菌類からなる群から選択され得る。しかしながら、大腸菌が好ましい。
【0090】
更に、昆虫細胞、例えばヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ＳＦ９）等、動物細胞、例えばＣＨＯ及びマウス細胞等、アフリカミドリザル細胞、例えばＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、及びＢＭＴ１０等、ヒト細胞、並びに組織培養における植物細胞が使用され得る。好ましい宿主生物として、細菌、例えば大腸菌やＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等、及び組織培養における哺乳動物細胞が挙げられる。
【0091】
宿主細胞が、免疫原性融合タンパク質を生成するのに使用されるか、又はその第１及び第２のアミノ酸配列部分を生成するのに使用されるか、又はリンカーアミノ酸配列部分を生成するのに使用されるとき、生成したアミノ酸配列部分は微生物培養物又は細胞培養物から単離され、及び様々な従来法のいずれか（ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等を使用する液体クロマトグラフィー（例えば、順相又は逆相等）；アフィニティークロマトグラフィー（例えば、無機リガンド又はモノクローナル抗体等を用いた）；イオン交換クロマトグラフィー、粒径排除クロマトグラフィー；固定化金属キレートクロマトグラフィー；ゲル電気泳動；タンジェンシャルフロー濾過等を含む）を使用して精製され得る。当業者は、本発明の範囲から逸脱せずに最も適する単離及び精製技術を選択し得る。
【0092】
それに加えて、免疫原性融合タンパク質、その第１及び第２のアミノ酸配列部分、又はリンカーアミノ酸配列部分は、いくつかの化学的技法のいずれかにより生成され得る。例えば、それらは固相合成技術を使用して調製され得るか、又は溶液状態での合成により調製され得る。
【0093】
本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質、本発明の第２の態様に基づく核酸分子、本発明の第３の態様に基づくベクター、又は本発明の第４の態様に基づく宿主細胞のうちの１つ又は複数を含むワクチンと関係する。
【0094】
免疫原性融合体、核酸分子、ベクター、及び／又は宿主細胞のそれぞれの量は、好ましくは薬学的に有効な量、又はＢ群連鎖球菌に対して防御免疫を誘発する能力を有する量、又は免疫応答を誘発するのに十分な量である。更に、量は、例えばワクチン投与を受ける対象の活動及び応答における臨床的に重要な欠陥を低減し、及び最も好ましくは防止するのに十分な量等であり得る。或いは、量は、宿主又は対象における臨床的に重要な状態の改善を引き起こすのに十分な量である。
【0095】
当業者により認識されるように、化合物の量はその比活性に応じて変化し得る。適する投与量は、望ましい治療効果を生成するように、必要とされる稀釈剤；すなわち担体又は添加剤と関連して計算された事前決定量の活性組成物を含有し得る。更に、投与される投薬量は、使用される有効成分（１つ又は複数）、処置される個体の年齢、体重等に応じて変化する。ワクチンは、好ましくはＢ群連鎖球菌に対して防御免疫を誘発する能力を有する。
【0096】
図で指摘する通り、免疫原性融合タンパク質は、対象に投与されるとき、免疫応答を誘発する。そのような免疫応答は、核酸分子を、免疫原性融合タンパク質を発現させるために後に転写及び翻訳されるＤＮＡ核酸分子として、又は免疫原性融合タンパク質に翻訳され、それを発現するためのＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ核酸分子として、そのいずれかによって間接的に投与することにより取得することも可能である。核酸分子は、転写及び／又は翻訳のコントロールを高めるためにベクター内に提供され得るが、またベクターは、ひいては、免疫原性融合タンパク質の発現を更にコントロールし、及び／又は増加させるために宿主細胞内に提供可能である。
【0097】
ワクチンは、薬学的に許容される媒体、及び任意選択的にアジュバントを更に含み得る。用語「薬学的に許容される媒体」は、医薬製剤で一般的に使用される任意の適する許容される賦形剤、アジュバント、担体、稀釈剤を意味するように意図される。
【0098】
ワクチンは、ワクチン組成物を包含し得る。
ワクチンは、その他の薬理学的に許容される成分、例えば塩、バッファー、免疫活性コンポーネント、アジュバント（ＡｌＯＨ）、湿潤剤、乳化及び懸濁剤、又は甘味料、香味料、芳香剤、又は組成物の有効性を改善するのに望ましいその他の物質等を更に含み得る。組成物は、その投与がレシピエント個体により許容され得る場合に「薬理学的に許容される」と言われる。
ワクチンは、その他の薬理学的に許容される成分、例えば塩、バッファー、免疫活性コンポーネント、アジュバント（ＡｌＯＨ）、湿潤剤、乳化及び懸濁剤、又は甘味料、香味料、芳香剤、又は組成物の有効性を改善するのに望ましいその他の物質等を更に含み得る。組成物は、その投与がレシピエント個体により許容され得る場合に「薬理学的に許容される」と言われる。
【0099】
アジュバントは、特定の免疫応答を特別に増強するのに使用可能である物質である。通常、アジュバント及び組成物は免疫系に提示される前に混合されるか、又は個別に、但し免疫化される動物又はヒトの同一部位内に提供される。アジュバントは、その組成に基づき、いくつかの群におおまかに分割され得る。このような群には、オイルアジュバント（例えば、フロイント完全及び不完全アジュバント）、無機塩、例えばＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、ＡｌＯＨ、シリカ、カオリン、及びカーボン)、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣ及びポリＡＵ酸）、及びある特定の天然物質（例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のワックスＤ）、並びにコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）又は百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、及びブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属のメンバーに見出される物質が含まれる。
【0100】
アルハイドロゲル（例えば、水酸化アルミニウム、Ａｌ（ＯＨ）３）は、本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質にとって特に有効なアジュバントであり、従って本発明の第５の態様に基づくワクチンにおいて特に有用である。
【0101】
ワクチン及びワクチン組成物を調製及び製剤化するための方法は、当業者に周知されている。成分の選択は、例えば組成物の投与経路に応じて変化する。例えば、非経口投与用の組成物として、滅菌水性又は非水性の溶液、懸濁物質、及びエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油等、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチル等である。担体又は閉鎖性包帯が、皮膚透過性を増加させ、そして抗原吸収を強化するのに使用可能である。経口投与用の液体投与剤形は、液体投与剤形を含有するリポソーム溶液を一般的に含み得る。リポソームを懸濁するための適する形態として、当技術分野で一般的に使用される不活性稀釈剤、例えば精製水等を含有するエマルジョン、懸濁物質、溶液、シロップ、及びエリキシル剤が挙げられる。
【0102】
ワクチンは、哺乳動物及び鳥類を含むヒト又は動物、例えば齧歯類（マウス、ラット、モルモット、又はウサギ）；鳥類（シチメンチョウ、メンドリ又はニワトリ）；その他の家畜（ウシ、ウマ、ブタ、又は子ブタ）；ペット（イヌ、ネコ、及びその他のペット）；及びヒト等に投与され得る。多くの動物が本発明のワクチンで処置され得るものの、処置の対象となる好ましい個体は、ヒト又は商業的に有用な動物及び家畜、例えば魚、例えばティラピアやラクダ等である。
【0103】
ワクチンは、当技術分野において公知の方法に基づき、個体に対して投与可能である。そのような方法は、例えば、非経口的、例えば皮膚内に又はそれを通じて注射するすべての経路：例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜、粘膜下、又は皮下等の経路を通じた適用を含む。また、そのような方法は、眼、鼻、口、肛門、若しくは膣の粘膜上皮に対する又は身体の任意の部分に位置する外部皮膚の表皮上へのドロップ剤、スプレー剤、ゲル剤、又は軟膏剤として、局所投与により適用される場合もある。その他の考え得る適用経路は、呼吸気管を経由する吸入を通じたスプレー剤、エアゾール剤、又は散剤の適用による。この最後のケースでは、使用される粒子サイズが、呼吸気管内に粒子がどの程度進入するかその深さを決定する。或いは、適用は、例えば、散剤、液剤、若しくは錠剤として食物、飼料、又は飲料水と組み合わせることにより、或いは液剤、ゲル剤、錠剤、若しくはカプセル剤として口内に、又は坐剤として肛門に直接投与することにより消化経路を経由し得る。
【0104】
多くの異なる技術が、免疫化の時期を調節するために存在する。免疫化される動物によって発現される免疫グロブリンレパートリーの発現において、そのレベル及び多様性を増加させるために、ワクチン又はコンポーネントａ～ｄを２回以上投与することが可能である。一般的に、複数の免疫化が実施される場合、免疫化は１週間～３ヶ月の間隔を置いて、例えば２週間～２ヶ月の間隔、例えば１～２ヶ月の間隔、又は４週間の間隔を置いて実施され得る。
【0105】
更に、ワクチン又はコンポーネントａ～ｄの１回又はおそらくはそれより多数回のブースター注射が投与される場合がある。好ましくは、ブースター注射は、初回注射（単回又は複数回）から約１～６ヶ月後に投与され得る。
【0106】
本発明の第５の態様に基づくワクチンは、好ましくは、１つ又は複数の追加の免疫活性成分を含み得る。追加の免疫活性コンポーネントは、抗原、免疫増強物質、及び／又はワクチンであり得るが、これらのいずれもアジュバントを含み得る。
【0107】
従って、本発明の第５の態様に基づくワクチンの好ましい実施形態では、ワクチンは、
ａ）配列番号４２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる更なる免疫原性融合タンパク質、
ｂ）更なる免疫原性融合タンパク質をコードする更なる核酸分子であって、好ましくは配列番号３６～４１の１つで表されるヌクレオチドの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する更なる核酸分子、
ｃ）更なる核酸分子を含む更なるベクター、或いは
ｄ）更なる免疫原性融合タンパク質を発現するか又は更なるベクターを含む更なる宿主細胞
のうちの１つ又は複数を更に含む。
ａ）配列番号４２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる更なる免疫原性融合タンパク質、
ｂ）更なる免疫原性融合タンパク質をコードする更なる核酸分子であって、好ましくは配列番号３６～４１の１つで表されるヌクレオチドの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する更なる核酸分子、
ｃ）更なる核酸分子を含む更なるベクター、或いは
ｄ）更なる免疫原性融合タンパク質を発現するか又は更なるベクターを含む更なる宿主細胞
のうちの１つ又は複数を更に含む。
【0108】
下記で更に議論されるように、更なる免疫原性融合タンパク質は、国際公開第２０１７／０６８１１２号でもやはり開示されるようなＧＢＳ表面タンパク質Ａｌｐ１及びＡｌｐ２／３のＮ末端領域に由来する。図に示し、また以下で議論されるように、免疫原性融合タンパク質及び更なる免疫原性融合タンパク質の両方を含むワクチンを使用するとき、相乗的効果が認められる。
【0109】
更に、１つ又は複数の追加のコンポーネントａ～ｄを含めることにより、ワクチンは、すべてのＢ群連鎖球菌系統に対してより広い防御範囲を提供し得る。免疫原性融合タンパク質について上記したことと類似して、更なる免疫原性融合タンパク質は、更なる核酸分子、更なるベクター、及び更なる宿主細胞により間接的に発現され得る。
【0110】
ａ～ｄのそれぞれの量は、好ましくは薬学的に有効な量、又はＢ群連鎖球菌に対して防御免疫を誘発する能力を有する量、又は免疫応答を誘発するのに十分な量、又は少なくともワクチンに対する一般的な免疫応答を増加させるのに十分な量であるべきである。
【0111】
上記のように、更なる免疫原性融合タンパク質は、配列番号４２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有し、配列番号４２は下記のアミノ酸配列：
MAEVISGSAATLNSALVKNVSGGKAYIDIYDVKNGKIDPLNLIVLTPSNYSANYYIKQGGRIFTSVNQLQTPGTATITYNILDENGNPYTKSDGQIDIVSLVTTVYDTTELRNNINKVIENANDPKWSDDSRKDVLSKIEVIKNDIDNNPKTQSDIDNKIVEVNELEKLLVLPEFSTIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKNGLIDPQNLIVLNPSSYSANYYIKQGAKYYSNPSEITTTGSATITFNILDETGNPHKKADGQIDIVSVNLTIYDSTALRNRIDEVINNANDPKWSDGSRDEVLTGLEKIKKDIDNNPKTQIDIDNKINEVNEIEKLLVVSL
を表す。
MAEVISGSAATLNSALVKNVSGGKAYIDIYDVKNGKIDPLNLIVLTPSNYSANYYIKQGGRIFTSVNQLQTPGTATITYNILDENGNPYTKSDGQIDIVSLVTTVYDTTELRNNINKVIENANDPKWSDDSRKDVLSKIEVIKNDIDNNPKTQSDIDNKIVEVNELEKLLVLPEFSTIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKNGLIDPQNLIVLNPSSYSANYYIKQGAKYYSNPSEITTTGSATITFNILDETGNPHKKADGQIDIVSVNLTIYDSTALRNRIDEVINNANDPKWSDGSRDEVLTGLEKIKKDIDNNPKTQIDIDNKINEVNEIEKLLVVSL
を表す。
【0112】
配列番号４２のアミノ酸配列をコードする核酸ＤＮＡ分子、すなわち（ｂ）に包含される核酸ＤＮＡ分子は配列番号３６、３８、及び４０で表され、配列番号３８は大腸菌内で発現させるためにコドン最適化されており、また配列番号４０は、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞内で発現させるためにコドン最適化されている。
【0113】
配列番号４２のアミノ酸配列をコードする対応する核酸ＲＮＡ分子は、配列番号３７、３９、及び４１で表され、配列番号３９は大腸菌内で発現させるためにコドン最適化されており、また配列番号４１は、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞内で発現させるためにコドン最適化されている。
【0114】
上記のように、更なる免疫原性融合タンパク質は、ＧＢＳ表面タンパク質Ａｌｐ１及びＡｌｐ２／３のＮ末端領域に由来する。
【0115】
Ａｌｐ１タンパク質はイプシロンタンパク質としても知られており、またＢ群連鎖球菌アルファタンパク質様タンパク質である。
【0116】
Ａｌｐ１のＮ末端領域のアミノ酸配列は、配列番号２８：
MAEVISGSAATLNSALVKNVSGGKAYIDIYDVKNGKIDPLNLIVLTPSNYSANYYIKQGGRIFTSVNQLQTPGTATITYNILDENGNPYTKSDGQIDIVSLVTTVYDTTELRNNINKVIENANDPKWSDDSRKDVLSKIEVIKNDIDNNPKTQSDIDNKIVEVNELEKLLVLP
により提示される。
MAEVISGSAATLNSALVKNVSGGKAYIDIYDVKNGKIDPLNLIVLTPSNYSANYYIKQGGRIFTSVNQLQTPGTATITYNILDENGNPYTKSDGQIDIVSLVTTVYDTTELRNNINKVIENANDPKWSDDSRKDVLSKIEVIKNDIDNNPKTQSDIDNKIVEVNELEKLLVLP
により提示される。
【0117】
配列番号２８のアミノ酸配列をコードする核酸ＤＮＡ分子は、配列番号２２、２４、及び２６で表され、配列番号２４は大腸菌内で発現させるためにコドン最適化されており、また配列番号２６は、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞内で発現させるためにコドン最適化されている。
【0118】
配列番号２８のアミノ酸配列をコードする対応する核酸ＲＮＡ分子は、配列番号２３、２５、及び２７で表され、配列番号２５は大腸菌内で発現させるためにコドン最適化されており、また配列番号２７は、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞内で発現させるためにコドン最適化されている。
【0119】
Ａｌｐ２タンパク質は、別のアルファタンパク質様タンパク質である。その他のファミリーメンバーと同様に、Ａｌｐ２タンパク質は、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端に向かっていくつかの反復したドメインを有する。Ａｌｐ２及びＡｌｐ３のＮ末端領域は同一である。Ａｌｐ３は、Ｒ２８としても知られている別のアルファタンパク質様タンパク質である。Ａｌｐ３は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）においても見出されるＲ２８タンパク質と非常に類似している。
【0120】
Ａｌｐ２のＮ末端領域のアミノ酸配列は、配列番号３５：
STIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKNGLIDPQNLIVLNPSSYSANYYIKQGAKYYSNPSEITTTGSATITFNILDETGNPHKKADGQIDIVSVNLTIYDSTALRNRIDEVINNANDPKWSDGSRDEVLTGLEKIKKDIDNNPKTQIDIDNKINEVNEIEKLLVVSL
により提示される。
STIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKNGLIDPQNLIVLNPSSYSANYYIKQGAKYYSNPSEITTTGSATITFNILDETGNPHKKADGQIDIVSVNLTIYDSTALRNRIDEVINNANDPKWSDGSRDEVLTGLEKIKKDIDNNPKTQIDIDNKINEVNEIEKLLVVSL
により提示される。
【0121】
配列番号３５のアミノ酸配列をコードする核酸ＤＮＡ分子は、配列番号２９、３１、及び３３で表され、配列番号３１は大腸菌内で発現させるためにコドン最適化されており、また配列番号３３は、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞内で発現させるためにコドン最適化されている。
【0122】
配列番号３５のアミノ酸配列をコードする対応する核酸ＲＮＡ分子は、配列番号３０、３２、及び３４で表され、配列番号３２は大腸菌内で発現させるためにコドン最適化されており、また配列番号３４は、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞内で発現させるためにコドン最適化されている。
【0123】
配列番号４２は、従って、アミノ酸ＥＦからなるリンカーアミノ酸配列部分を介して配列番号３５（Ａｌｐ２／３のＮ末端）に融合した配列番号２８（Ａｌｐ１のＮ末端）に対応する。
【0124】
第２の免疫原性融合タンパク質は、
ｉ．配列番号２８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する更なる第１のアミノ酸配列部分と、
ｉｉ．配列番号３５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する更なる第２のアミノ酸配列部分と、任意選択的に
ｉｉｉ．１～２０個のアミノ酸からなり、及び更なる第１のアミノ酸配列部分を更なる第２のアミノ酸部分から分離する更なるリンカーアミノ酸配列部分と
からなるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり得る。
ｉ．配列番号２８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する更なる第１のアミノ酸配列部分と、
ｉｉ．配列番号３５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する更なる第２のアミノ酸配列部分と、任意選択的に
ｉｉｉ．１～２０個のアミノ酸からなり、及び更なる第１のアミノ酸配列部分を更なる第２のアミノ酸部分から分離する更なるリンカーアミノ酸配列部分と
からなるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり得る。
【0125】
配列番号２８及び４２のそれぞれにおいて、イニシャルＭは任意選択的であり得る。従って、本発明の第５の態様に基づくワクチンの好ましい実施形態では、ワクチンは、
ａ）本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質であって、配列番号２１で表されるアミノ酸の配列からなり、或いは配列番号２１のアミノ酸２～３４７からなる免疫原性融合タンパク質と、
ｂ）配列番号４２で表されるアミノ酸の配列を含み、好ましくはそれからなり、或いは配列番号４２のアミノ酸２～３４７を含み、好ましくはそれからなる更なる免疫原性融合タンパク質と
を含む。
ａ）本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質であって、配列番号２１で表されるアミノ酸の配列からなり、或いは配列番号２１のアミノ酸２～３４７からなる免疫原性融合タンパク質と、
ｂ）配列番号４２で表されるアミノ酸の配列を含み、好ましくはそれからなり、或いは配列番号４２のアミノ酸２～３４７を含み、好ましくはそれからなる更なる免疫原性融合タンパク質と
を含む。
【0126】
このような実施形態では、好ましくは、規定された免疫原性融合タンパク質及び規定された更なる免疫原性融合タンパク質とは異なるその他のタンパク質又はアミノ酸配列はワクチン内に存在しない。
【0127】
本発明の第５の態様に基づくワクチンの好ましい実施形態では、ワクチンはアジュバントとして水酸化アルミニウムを更に含む。このような実施形態では、ワクチンは、好ましくは医薬組成物であり、また薬学的に許容される賦形剤、稀釈剤、又は担体を更に含む。
【0128】
本発明の第６の態様は、ｉ）Ｂ群連鎖球菌感染症に対するワクチン接種、又はｉｉ）Ｂ群連鎖球菌感染症の処置における使用のための、本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質、本発明の第２の態様に基づく核酸分子、本発明の第３の態様に基づくベクター、本発明の第４の態様に基づく宿主細胞、又は本発明の第５の態様に基づくワクチンと関係する。
【0129】
免疫原性融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞、又はワクチンは、免疫原性融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞、又はワクチンを、それを必要としている対象に投与することにより、そのようなワクチン接種又は処置を行うのに使用され得る。
【0130】
対応する本発明の第７の態様は、本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質、本発明の第２の態様に基づく核酸分子、本発明の第３の態様に基づくベクター、本発明の第４の態様に基づく宿主細胞、又は本発明の第５の態様に基づくワクチンを、それを必要としている対象に投与することにより、ｉ）Ｂ群連鎖球菌感染症に対するワクチン接種、又はｉｉ）Ｂ群連鎖球菌感染症の処置を行う方法と関係する。
【0131】
対応する本発明の第８の態様は、ｉ）Ｂ群連鎖球菌感染症に対するワクチン接種、又はｉｉ）Ｂ群連鎖球菌感染症の処置用の医薬組成物又は医薬、例えばワクチン等を製造するための本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質、本発明の第２の態様に基づく核酸分子、本発明の第３の態様に基づくベクター、本発明の第４の態様に基づく宿主細胞の使用と関係する。
【0132】
本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質、本発明の第２の態様に基づく核酸分子、本発明の第３の態様に基づくベクター、本発明の第４の態様に基づく宿主細胞、又は本発明の第５の態様に基づくワクチンは、従ってＢ群連鎖球菌により引き起こされる感染症を予防又は処置する方法で使用され得る。
【0133】
母親及び若年小児の両方を対象としてＢ群連鎖球菌の感染症から保護する場合、ワクチンを用いた母体の免疫学的予防が潜在的経路として長く提案されてきた。
【0134】
従って、本発明の第６、第７、及び第８の態様の好ましい実施形態では、本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質、本発明の第２の態様に基づく核酸分子、本発明の第３の態様に基づくベクター、本発明の第４の態様に基づく宿主細胞、又は本発明の第５の態様に基づくワクチンが、女性ヒト対象に投与される。
【0135】
投与は、従ってＧＢＳ感染症に対する免疫性をヒト女性の未生の子供に付与する能力を有する。更に、投与は、男性が老齢の場合には、男性に対しても実施され得る。
【0136】
この実施形態によれば、女性及び胎児又は新生児の両方を保護する役目を果たす抗体の生成（胎盤を横断する抗体の受身移入を介して）を引き起こすのに十分な時間と量という条件下で、免疫原性融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞、又はワクチンが、非妊娠女性又は妊娠女性に投与される。
【0137】
用語「～を予防すること又は処置すること」とは、本発明に関連するその様々な文法的形態において、（１）Ｂ群連鎖球菌感染症と関連する障害の有害効果、（２）障害の進行、又は（３）障害病原体（Ｂ群連鎖球菌）を予防、治癒、逆転、減弱、緩和、良化、阻害し、最低限に抑え、抑制するか、又は停止させることを指す。更に、用語「～を予防すること又は処置すること」は、Ｂ群連鎖球菌感染症に対して個体がその全体的又は部分的な免疫性を構築することを含むように想定される。
【0138】
本発明の第９の態様は、Ｂ群連鎖球菌により引き起こされた感染症を予防又は処置するための方法であって、第２の個体を、本発明の第１～第５の態様に基づく免疫原性融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞、又はワクチンに曝露することから誘発される有効量の抗体を、それを必要としている個体に投与することを含む方法と関係する。
【0139】
この態様によれば、Ｂ群連鎖球菌に対する抵抗性又は免疫性が、受動免疫化により個体に付与され、すなわち、誘発された抗血清が回収され、そしてＢ群連鎖球菌により引き起こされた感染症を有するものと疑われるレシピエントに直接提供される。そのような抗血清は、抗血清が胎児又は新生児いずれかを保護する（胎盤を横断する抗体の受身移入を介して）役目を果たすのに十分な時間と量という条件下で、妊娠女性（出産時又はその前に）に投与され得るものと想定される。
【0140】
本発明のワクチン又は抗血清は、従って感染症が発現する前（予期される感染症を予防又は減弱するために）、又は実際の感染症が開始した後のいずれかにおいて提供され得る。
【0141】
本発明の第１０の態様は、免疫原性融合タンパク質を製造する方法であって、
－本発明の第４の態様に基づく宿主細胞を提供するステップと、
－宿主細胞を増倍させるステップと、
－本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質を精製するステップと、
－免疫原性融合タンパク質を取得するステップと
を含む方法と関係する。
－本発明の第４の態様に基づく宿主細胞を提供するステップと、
－宿主細胞を増倍させるステップと、
－本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質を精製するステップと、
－免疫原性融合タンパク質を取得するステップと
を含む方法と関係する。
【0142】
或いは、免疫原性融合タンパク質は、無細胞発現系内で製造可能である。そのような系は、該当する組換え核酸から発現させるためのすべての必須因子（その特別な系において機能するプロモーターに作動可能にリンクしている）を含む。
【実施例】
【0143】
実施例１－健康女性の免疫化
アジュバント（水酸化アルミニウム）を含め／含めないで、配列番号２１からなる免疫原性融合タンパク質を単独で、又は配列番号４２に基づく更なる免疫原性融合タンパク質と共に用いながら、成人健康女性を免疫化した。
アジュバント（水酸化アルミニウム）を含め／含めないで、配列番号２１からなる免疫原性融合タンパク質を単独で、又は配列番号４２に基づく更なる免疫原性融合タンパク質と共に用いながら、成人健康女性を免疫化した。
【0144】
図１は、アジュバント（水酸化アルミニウム）を含め／含めないで、異なる投薬量において、本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質を単独で、又は本発明の第５の態様に基づくワクチンに包含される更なる免疫原性融合タンパク質と組み合わせてのいずれかの、その１回投与を使用しながら免疫化した後２９日目に取得されたＩｇＧの増加倍率を示す。
【0145】
図１では、最初の７つの結果は、配列番号２１からなる免疫原性融合タンパク質を単独で、又はアジュバント（水酸化アルミニウム）（０．５ｍｇ）と共に投与することにより取得された。
【0146】
図１から了解されるように、水酸化アルミニウムの使用は、１０μｇの用量でのＩｇＧ増加倍率を５０μｇの用量でのＩｇＧ増加倍率に匹敵する数値まで押し上げるので有益である。同様に、５０μｇの用量を水酸化アルミニウムと併用することで、２５０μｇの用量に匹敵する増加倍率を実現する。
【0147】
図１は、水酸化アルミニウム、並びに配列番号２１に基づく免疫原性融合タンパク質及び配列番号４２に基づく更なる免疫原性融合タンパク質の両方を含むワクチンが使用されるとき、２５μｇの用量の免疫原性融合タンパク質それぞれは、配列番号２１に基づく免疫原性融合タンパク質２５０μｇの投薬量と比較して、同等か又はそれ以上の増加倍率を実現することを更に示す。水酸化アルミニウム及び５０μｇの各免疫原性融合タンパク質を使用することで、２９日目に最高の増加倍率を実現した。各実験の対象の数（ｎ）を図内に提示する。
【0148】
図２は、アジュバントを含め／含めないで、異なる投薬量において、本発明の第１の態様に基づく免疫原性融合タンパク質を単独で、又は本発明の第５の態様に基づくワクチンに包含される更なる免疫原性融合タンパク質と組み合わせてのいずれかの、その第１回投与及び第２回投与を使用しながら免疫化してから５７日目に取得されたＩｇＧ増加倍率を示す。
【0149】
図２では、最初の７つの実験は、配列番号２１からなる免疫原性融合タンパク質を単独で、又はアジュバント（水酸化アルミニウム）、０．５ｍｇと共に投与することにより取得される。
【0150】
図２から了解されるように、水酸化アルミニウムと共に、配列番号２１からなる免疫原性融合タンパク質を、５０μｇ及び１００μｇの２用量で投与すると約１００倍の増加倍率を実現する。しかしながら、水酸化アルミニウム、並びに配列番号２１に基づく免疫原性融合タンパク質及び配列番号４２に基づく更なる免疫原性融合タンパク質の両方を含むワクチンを使用したとき、より高い増加倍率が認められるといえども、免疫原性融合タンパク質それぞれの投薬量は２５μｇ又は５０μｇにすぎない。
【0151】
各実験の対象の数（ｎ）を図内に提示する。
実施例２－幼獣を保護するためのメスマウスの免疫化
図３は、Ｂ群連鎖球菌系統ＢＭ１１０（８×１０３ｃｆｕ）により新生児細菌性感染症に罹患させた後のマウス幼獣の生存率を示す。幼獣は、ａ）アジュバント（水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３））と併用される配列番号２１の免疫原性融合タンパク質、ｂ）、又はコントロール（アジュバント（水酸化アルミニウム）のみ）のいずれかで免疫化したメスのマウスから生まれた。図３に認められるように、配列番号２１に基づく免疫原性融合タンパク質で免疫化された母親から生まれたマウス幼獣（破線）は、実験全体を通じて（感染後０～４８時間）、コントロールの投与を受けた母親から生まれたマウス幼獣（実線）よりも有意に高い生存率を有した。従って、配列番号２１の免疫原性融合タンパク質は、メスマウスに投与したとき、そのようなメスマウスから生まれたマウス幼獣を、ＧＢＳ感染及び死亡から有意に防御した。免疫原性融合タンパク質は、Ｌｉｎｄａｈｌら、Ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ａｒｅ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ａｓ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ Ｉｎ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ、第２巻、４２７～４３４頁、２００７年１２月の図２のパネルＣ及びパネルＥにおいてマウスについて報告するものと類似する防御効果をＧＢＳ感染及び死亡に対して実現した。
実施例２－幼獣を保護するためのメスマウスの免疫化
図３は、Ｂ群連鎖球菌系統ＢＭ１１０（８×１０３ｃｆｕ）により新生児細菌性感染症に罹患させた後のマウス幼獣の生存率を示す。幼獣は、ａ）アジュバント（水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３））と併用される配列番号２１の免疫原性融合タンパク質、ｂ）、又はコントロール（アジュバント（水酸化アルミニウム）のみ）のいずれかで免疫化したメスのマウスから生まれた。図３に認められるように、配列番号２１に基づく免疫原性融合タンパク質で免疫化された母親から生まれたマウス幼獣（破線）は、実験全体を通じて（感染後０～４８時間）、コントロールの投与を受けた母親から生まれたマウス幼獣（実線）よりも有意に高い生存率を有した。従って、配列番号２１の免疫原性融合タンパク質は、メスマウスに投与したとき、そのようなメスマウスから生まれたマウス幼獣を、ＧＢＳ感染及び死亡から有意に防御した。免疫原性融合タンパク質は、Ｌｉｎｄａｈｌら、Ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ａｒｅ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ａｓ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ Ｉｎ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ、第２巻、４２７～４３４頁、２００７年１２月の図２のパネルＣ及びパネルＥにおいてマウスについて報告するものと類似する防御効果をＧＢＳ感染及び死亡に対して実現した。
【0152】
実施例３－上皮細胞浸潤試験
図４Ａ～図４Ｅは、臨床分離株及び配列番号２１の免疫原性融合体を使用する免疫化から得られた抗血清を使用するヒト上皮細胞浸潤試験において得られた結果を示す。それぞれのバーは、コントロール（無血清）、０日目の免疫前の段階（Ｄ０）、及び５７日目の免疫後の段階（Ｄ５７）について相対的上皮細胞浸潤率（％）を示す。内皮細胞の浸潤阻害に対する良好な効果が認められる。従って、免疫原性融合タンパク質は、Ｌｉｎｄａｈｌら、Ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ａｒｅ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ａｓ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ Ｉｎ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ、Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ、第２巻、４２７～４３４頁、２００７年１２月の図３のパネルＢにおいて報告するものと類似する阻害効果を上皮細胞の浸潤に対して実現した。
図４Ａ～図４Ｅは、臨床分離株及び配列番号２１の免疫原性融合体を使用する免疫化から得られた抗血清を使用するヒト上皮細胞浸潤試験において得られた結果を示す。それぞれのバーは、コントロール（無血清）、０日目の免疫前の段階（Ｄ０）、及び５７日目の免疫後の段階（Ｄ５７）について相対的上皮細胞浸潤率（％）を示す。内皮細胞の浸潤阻害に対する良好な効果が認められる。従って、免疫原性融合タンパク質は、Ｌｉｎｄａｈｌら、Ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ａｒｅ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ａｓ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ Ｉｎ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ、Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ、第２巻、４２７～４３４頁、２００７年１２月の図３のパネルＢにおいて報告するものと類似する阻害効果を上皮細胞の浸潤に対して実現した。
【0153】
従って、図１及び図２は、更なる融合タンパク質と共に免疫原性融合タンパク質を投与することが有利であること、及びアジュバント、例えば水酸化アルミニウムを使用することもやはり有利であることを示す。とはいえ、免疫原性融合タンパク質は、低投薬量（１０μｇ）であっても、またアジュバントを含めなくても、免疫応答、例えばＩｇＧ倍率増加を誘発した。
【0154】
更に、図３及び図４Ａ～図４Ｅは、免疫原性融合タンパク質がＬｉｎｄａｈｌら、Ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ａｒｅ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ａｓ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ Ｉｎ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ、Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ、第２巻、４２７～４３４頁、２００７年１２月、及び国際公開第２００８１２７１７９号で開示される免疫原性融合タンパク質について認められたものと類似した効果を実現することを示す。
【0155】
免疫原性融合タンパク質及び更なる免疫原性融合タンパク質（投与される場合）それぞれのヒトに対する投薬量は、１０μｇ～２５０μｇの範囲、例えば１０μｇ～１００μｇ、例えば１５μｇ～７５μｇ、好ましくは２５μｇ～７５μｇ、例えば２５μｇ～５０μｇであり得る。
【0156】
免疫原性融合タンパク質及び更なる免疫原性融合タンパク質（投与される場合）それぞれのヒトに対する好ましい投薬量は、アジュバント、例えば水酸化アルミニウム等の存在下では、従って１０～２５０μｇ、好ましくは１０～１５０μｇ、好ましくは２５～１００μｇ、又は２５～７５μｇの範囲内である。
【0157】
免疫原性融合タンパク質が、更なる免疫原性融合タンパク質と共に、及びアジュバント、例えば水酸化アルミニウム等の存在下で投与される場合には、各融合タンパク質の投薬量は、好ましくは１５μｇ～７５μｇ、好ましくは２５μｇ～７５μｇ、例えば２５μｇ～５０μｇの範囲である。
【0158】
アジュバント、例えば水酸化アルミニウム等の非存在下では、免疫原性融合タンパク質、及び更なる免疫原性融合タンパク質（投与される場合）それぞれのヒトに対する投薬量は、１０～１０００μｇ、好ましくは５０～５００μｇ、又は好ましくは１００～２５０μｇである。
【0159】
免疫原性融合タンパク質及び更なる免疫原性融合タンパク質（投与される場合）が、対応する核酸分子、ベクター、又は宿主細胞の投与として間接的に投与される場合には、対応する核酸分子、ベクター、又は宿主細胞の投薬量は、好ましくは、免疫原性融合タンパク質及び更なる免疫原性融合タンパク質（投与される場合）が対象に対して直接投与された場合に取得されるはずの免疫応答に類似した免疫応答が取得されるように選択される。
【0160】
好ましくは、免疫原性融合タンパク質及び更なる免疫原性融合タンパク質（投与される場合）それぞれの投薬は繰り返される。従って、免疫原性融合タンパク質及び更なる免疫原性融合タンパク質（投与される場合）は、第１回投与において投与され、そして第１回投与後のある時間に第２回投与として繰り返される。第１回投与及び第２回投与は、１週間～３ヶ月の間隔、例えば２週間～２ヶ月の間隔、例えば１～２ヶ月の間隔、又は４週間の間隔が置かれる場合がある。
【0161】
実施例４－配列番号２１に基づく融合タンパク質は、ＲｉｂのＮ末端の保存された領域の遮蔽性が低下している
最初に記載した通り、本発明は、国際公開第２００８１２７１７９号で開示される融合タンパク質に関する更なる研究に基づく。この研究では、免疫原性融合タンパク質配列（配列番号２１）を同定したが、それは国際公開第２００８１２７１７９号で開示された免疫原性融合タンパク質よりも短尺であるもののなおも良好な効果を有し、そして上記で議論された図に示すように、ＧＢＳに対するワクチンで使用するのに適する。
最初に記載した通り、本発明は、国際公開第２００８１２７１７９号で開示される融合タンパク質に関する更なる研究に基づく。この研究では、免疫原性融合タンパク質配列（配列番号２１）を同定したが、それは国際公開第２００８１２７１７９号で開示された免疫原性融合タンパク質よりも短尺であるもののなおも良好な効果を有し、そして上記で議論された図に示すように、ＧＢＳに対するワクチンで使用するのに適する。
【0162】
本実施例は、より短尺の免疫原性融合タンパク質と国際公開第２００８１２７１７９号の融合タンパク質との間の差異について更なる見識をもたらす。
【0163】
特に、配列間の差異は、アミノ酸３２個分の長さの先導配列：ＧＰＬＧＳＡＳＶＬＩＧＩＳＦＬＧＧＦＴＱＧＱＦＮＩＳＴＤＴＶＦＡ－配列番号４３であり、この配列は配列番号２１には見出されない。
【0164】
コンピューターシミュレーションを、配列番号４３に基づく先導配列を含む国際公開第２００８１２７１７９号の免疫原性融合タンパク質に関する配列上で実施した。シミュレーションは、システム内の各原子が明示的にモデル化される分子動力学に基づいた。隣接する原子が各原子に作用する力も計算し、そして短い時間間隔（一般的にフェムト秒）で各原子の相対的位置を更新するのに使用される。シミュレーションは分子軌道を生成し、全コンフォメーションが規定された時間間隔で書き出される。
【0165】
特に、国際公開第２００８１２７１７９号の完全長融合タンパク質の高品質モデルを、Ａｌｐｈａｆｏｌｄ２、バージョンｖ２．１．０、Ｊｕｍｐｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、第５９６巻、５８３～５８９頁（２０２１年）を使用して調製した。Ｃ末端ドメイン、すなわちＡｌｐＣのＮ末端は先導配列からはるか遠方に位置するので、それを除去し、アミノ酸３２個の先導配列（配列番号４３）及び合計２０４個のアミノ酸を含むＮ末端ｒｉｂドメインを残した。Ｇｒｏｍａｃｓ ２０２１．５を、以下のようにシステムを調製するのに使用した；Ａｌｐｈａｆｏｌｄ２モデルを、水（ｇｍｘ ｓｏｌｖａｔｅ）を使用しながら立方体単位胞内で溶媒和させ、そしてイオンを添加してシステムを中性にした（ｇｍｘ ｇｅｎｉｏｎ）。重原子の封じ込め及びそれに後続する平衡化ステップ（圧力及び温度（３００Ｋ））を保つことによって、エネルギーを最低限に抑えた。システムが定常状態下にあることを検証した後に、以下のようなメインシミュレーションに進んだ。グローバルシステムの分子運動を、デルタタイムを２ｆｓとして１００ｎｓ間、合計５０百万ステップについてシミュレーションを実施し、そしてシステムコンフォメーションを５０００ステップ毎に保管し、１００００モデルに及ぶ軌道を得た。
【0166】
グローバル軌道を分析し、ｒｉｂドメインが基底状態の周辺で振動することを検証し、分子は現行条件下で安定であることを示すのに、ＭＤａｎａｌｙｓｉｓ ｖ２．０．０を使用した。分析を３回反復した（Ｓｉｍ１～３）。
【0167】
部分的な結果として、先導配列（アミノ酸１～３２）は、大規模なコンフォメーション変化を経た後、約６０ｎｓ後に安定なコンフォメーションを見出すことが判明した。Ｇｒｏｍａｃｓ ｍｉｎｄｉｓｔ（ｇｍｘ ｍｉｎｄｉｓｔ）を使用して、先導配列との間の相互作用を計算した。先導配列とｒｉｂドメインとの間の緊密且つ安定な相互作用を見出すために、シミュレーションの最後の３０ｎｓ（３０００モデル）について検討を行い、そして３回のシミュレーションの平均に基づき、時間の少なくとも３０％（９００以上のモデルにおける相互作用）において、発生した相互作用を計算した。このポイントでの相互作用を、アミノ酸の任意の原子間の最低距離（０．３ｎｍ以下）として定義した。結果を下記の表１に提示及び図５Ａに示すが、同図は、表面描画（ボール及びスティック描画で表わされた先導配列を含む）においてＲｉｂＮ末端を表す。ＲｉｂＮ末端の表面描画は、高頻度接触（高い割合）に対応する白色から無接触又は稀な接触に対応する黒色で影付きにした。
【0168】
図５Ｂは、ＲｉｂＮ末端（カートゥーン描画で示す）及び先導配列（ボール及びスティック描画で示す）の代替的描画を示す。ＲｉｂＮ末端のカートゥーン描画は、高頻度接触（高い割合）に対応する白色から無接触又は稀な接触に対応する黒色で影付きにした。
【0169】
更に、ｒｉｂドメインのアミノ酸保存を以下のように計算した；１４４個の完全ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ゲノムをＰａｔｒｉｃＢＲＣからダウンロードし、その中から９５個のｒｉｂドメインをｂｌａｓｔｐ ２．９．０＋を使用して見出した。９５個の配列を、Ｍｕｓｃｌｅ ｖ３．８．１５５１を使用してアライメントし、そしてアミノ酸１個当たりの標準化後の情報量を、ｌｏｇｏｍａｋｅｒ０．８を使用してコンピューター計算した。保存スコアを下記表１の保存（Ｃｏｎｓ．）カラムにおいて報告し、また図５Ｃに示すが、同図は、表面描画（ボール及びスティック描画で表わされた先導配列を含む）においてＲｉｂＮ末端を表す。ＲｉｂＮ末端の表面描画は、高保存スコアに対応する白色から無保存又は低保存スコアに対応する黒色で影付きにした。
【0170】
【表1-1】
【0171】
【表1-2】
【0172】
表１は、先導配列（アミノ酸１～３２）とｒｉｂドメイン（アミノ酸３３～２０４）との間の安定な相互作用を示す。シミュレーションの最後３０ｎｓにおいてその少なくとも３０％の時間相互作用する、先導配列とｒｉｂドメインとの間の各アミノ酸の対をリスト化する。先導配列アミノ酸毎に最高割合を太字で示す。アミノ酸の保存性を見積もり、Ｃｏｎｓ．の行に示す。
【0173】
表１に認められるように、４つの構造要素の対が相互作用を支配する；１番目は、Ｒｉｂドメインの主要なベータ－シート（１２９～１３３）の１つに納まるドメインに最も近い先導配列（２９～３２）のストレッチである。第２の要素は、２つのベータ－シートを結びつけるＲｉｂドメインのループ領域（１２６～１２７）と相互作用する先導配列アミノ酸２３～２６である。第３の相互作用は、いくつかのベータ－シート（８４、１１３、１２７）と相互作用する先導配列アミノ酸１２～１６である。最終的に、先導配列の第１の部分（１～５）は、Ｒｉｂドメインのループ（９０～９３）と相互作用する。
【0174】
これら相互作用する対は、保存されたアミノ酸の割合が高いＲｉｂのＮ末端部分と関係するが、このように割合が高いということは、これらの部分がＲｉｂタンパク質の意図する目的（ＧＢＳ細菌による細胞の感染を促進する）にとって重要であることを示唆する。
【0175】
従って、表１の結果より、国際公開第２００８１２７１７９号のＲｉｂＮ－ＡｌｐＣＮ融合タンパク質の３２個のアミノ酸からなる先導配列は、少なからず、融合タンパク質のＲｉｂ部分のこれら重要な部分に納まり、それらと相互作用することが明らかである。このように、先導配列は時間的に、すなわち少なくとも３０％の時間、これらの部分と相互作用し、それへのアクセスを減少させる。従って、免疫応答を誘発するために使用されるとき、先導配列が存在することでＲｉｂタンパク質のこのような重要部分に対する免疫系のアクセスが減少する。
【0176】
反対に、配列番号２１に基づくより短尺の免疫原性融合タンパク質は先導配列を含まない。従って、免疫系のこれら重要な部分に対するアクセスを減少させる相互作用は一切存在しないと考えられ、その結果としてより良好な免疫応答が取得される。
【0177】
特に、先導配列とＲｉｂのドメインとの間の相互作用が、先導配列の異なるアミノ酸において生ずる。従って、国際公開第２００８１２７１７９号の免疫原性融合タンパク質を短縮させることで、いずれの場合にも相互作用の低下をもたらし、そして免疫系が免疫原性融合タンパク質のＲｉｂＮドメインのあらゆる部分に対してより良好にアクセスするようにする。従って、軽微な短縮化、例えば先導配列について、そのより少ない数のアミノ酸の除去等を行っても、やはり免疫系は免疫原性融合タンパク質のＲｉｂＮドメインに対してより良好にアクセスするようにする。
【0178】
【0179】
実施例５－Ｒｉｂタンパク質がα１β１インテグリンと相互作用するとき、先導配列により遮蔽されたＲｉｂのＮ末端の保存された領域が上皮細胞との接着及びそれへの浸潤に関与する
実施例４で見出されたＲｉｂのＮ末端の保存された領域の意義について研究した。ＲｉｂはＧＢＳ表面タンパク質であること、及びＲｉｂＮに対する抗体は、上皮細胞への浸潤を含む、ＧＢＳ感染に対する防御を提供することに留意しつつ、保存された領域は上皮細胞との接着及びそれへの浸潤促進に関与できるものと仮定した。
実施例４で見出されたＲｉｂのＮ末端の保存された領域の意義について研究した。ＲｉｂはＧＢＳ表面タンパク質であること、及びＲｉｂＮに対する抗体は、上皮細胞への浸潤を含む、ＧＢＳ感染に対する防御を提供することに留意しつつ、保存された領域は上皮細胞との接着及びそれへの浸潤促進に関与できるものと仮定した。
【0180】
α１β１インテグリンに関するアルファフォールド構造を、Ｂｏｌｄｕｃら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００７年）、第１５３巻、４０３９～４０４９頁で引用された配列から取得し、そして配列番号２１に基づく融合部分に含まれるＲｉｂのＮ末端とα１β１インテグリンとの間の相互作用シミュレーションを実施した。図６は結果を表し、α１β１インテグリンを黒色の表面描画で示し、及びＲｉｂのＮ末端を薄い灰色の表面描画で示す。図６Ａにおいて、ＲｉｂのＮ末端を図５Ａ～図５Ｃと類似した方向で示す。従って、図６では図示しないものの、先導配列がＲｉｂのＮ末端の右側のエンドキャップに提供される。図５Ａ～図５Ｃと比較することにより、実施例４において特定された保存された領域がα１β１インテグリンとの結合に関与することが更に明らかとなった。その結果より、Ｎ末端は、ドメイン２（フォン・ヴィルブランド因子、タイプＡ）及びα１β１インテグリンのドメイン３と結合することが更に明らかとなった。
【0181】
従って、実施例４及び５は、先導配列はＲｉｂのＮ末端の保存された領域と相互作用し、それを遮蔽し、そのような保存された領域は、α１β１インテグリンとの結合、これによる上皮細胞との接着及びそれへの浸潤に関与していることを示す。
【0182】
従って、先導配列と共に提供されるＲｉｂのＮ末端領域を用いて免疫化する場合、先導配列の遮蔽効果に起因して、これらの保存された領域の露出が低下することとなる。これは、保存された領域に対するより非効率的な免疫系応答及び／又は抗体応答を引き起こす。
【0183】
対照的に、免疫化が、先導配列（配列番号４３）が除去されるか又は少なくとも短縮したＲｉｂのＮ末端を使用して、そのようなＮ末端を単独で、又は本発明の第１の態様若しくは配列番号２１の融合タンパク質の一部として使用しながら実施される場合、これらの保存された領域は免疫系に対してよりアクセスしやすくなる。従って、免疫化された宿主にとって、保存された領域に対する抗体形成がより容易になる。保存された領域をより効率的且つ完全に中和することで、α１β１インテグリンを介する上皮細胞との接着及びそれへの浸潤に対する防御が増加する。
【0184】
まとめとして、配列番号２１により例示されるような、Ｒｉｂ構成要素の先導配列（配列番号４３）が除去されるか又は少なくとも短縮した、本発明の第１の態様に基づく融合タンパク質を使用すれば、特に内皮細胞との接着及び／又はそれへの浸潤に対する防御を改善させることができ、それによってＧＢＳに対する防御が改善する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】