特表 2024-512762 炎症性疾患の治療のための造血増殖因子枯渇ワクチン組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-19

(54)【発明の名称】炎症性疾患の治療のための造血増殖因子枯渇ワクチン組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20240312BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20240312BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 H

A61P35/00

A61P11/00

A61P27/02

A61P29/00 101

A61P19/02

A61P25/00

A61P17/00

A61P1/00

A61P11/06

A61P29/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023560805

(86)(22)【出願日】2022-03-16

(85)【翻訳文提出日】2023-11-28

(86)【国際出願番号】 CU2022050002

(87)【国際公開番号】W WO2022207016

(87)【国際公開日】2022-10-06

(31)【優先権主張番号】CU-2021-0021

(32)【優先日】2021-03-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CU

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】509352381

【氏名又は名称】セントロ デ インミュノロヒア モレキュラル

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ラーゲ ダビラ、アグスティン ビエンベニード

(72)【発明者】

【氏名】レドン ナランホ、ヌリス

(72)【発明者】

【氏名】ペレイラ ジャニェス、カーラ

(72)【発明者】

【氏名】シルバ ソーサ、アレクサ

(72)【発明者】

【氏名】フエンテス モラレス、ダシャ

(72)【発明者】

【氏名】サアベドラ エルナンデス、ダナイ

(72)【発明者】

【氏名】オテロ アルフォロ、オスカー

(72)【発明者】

【氏名】スアレス フォルミーゴ、ヒセラ マリア

(72)【発明者】

【氏名】ロハス ドランテス、ゲルトルーディス

(72)【発明者】

【氏名】ペレス マルティネス、ダヤナ

(72)【発明者】

【氏名】ガルベス バルカルセル、ヘスス ラモン

(72)【発明者】

【氏名】ロペス メディナニージャ、アルマンド

【テーマコード（参考）】

4C085

【Ｆターム（参考）】

4C085AA03

4C085BB11

4C085EE06

4C085FF11

4C085FF13

4C085FF20

4C085GG01

4C085GG03

4C085GG04

(57)【要約】

本発明は、バイオテクノロジー及び医薬品の分野に関する。特に、化学的コンジュゲーションまたは融合によって他の分子またはその断片へ結合された、造血増殖因子（Ｇ－ＳＣＦ及び／またはＧＭ－ＣＳＦ等）に対する自己免疫反応を産生することが可能な治療用ワクチン組成物を記載する。かかるワクチン組成物は、特に循環好中球の病理学的な増加が起こる炎症性疾患の治療のために有用である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

担体タンパク質と、
アジュバントと、
組み換え顆粒球コロニー刺激因子（ｒＧ－ＣＳＦ）、及び組み換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒＧＭ－ＣＳＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの抗原と
を含む、造血増殖因子に対する免疫応答を誘導する治療用ワクチン組成物。

【請求項2】

前記担体タンパク質が、
コレラトキシンＢサブユニット、
破傷風トキソイド、
ＫＬＨ、
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＰ６４ｋ、
ジフテリアトキソイド、
Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦに対するエピトープを提示することが可能なペプチド、
免疫グロブリンＧ、
免疫グロブリンＭ、
抗体Ｆｃ領域、
抗体可変領域、
細菌タンパク質、
酵母タンパク質、及び
哺乳動物タンパク質
を含む群から選択される、請求項１に記載のワクチン組成物。

【請求項3】

前記担体タンパク質が、
化学的コンジュゲーション、及び
融合
のうちの任意のものによって、抗原へ結合される、請求項１～２のいずれか１項に記載のワクチン組成物。

【請求項4】

前記抗原が、ｒＧ－ＣＳＦである、請求項１～３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。

【請求項5】

前記抗原が、ｒＧＭ－ＣＳＦである、請求項１～３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。

【請求項6】

前記アジュバントが、
不完全フロイントアジュバント、
完全フロイントアジュバント、
スクアレンベースのアジュバント、
合成起源アジュバント、
ミネラル起源アジュバント、
植物起源アジュバント、
動物起源アジュバント、
微粒子タンパク質性アジュバント、
プロテオリポソーム型アジュバント、
リポソーム、及び
上記のアジュバントの混合物
からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。

【請求項7】

癌、
慢性閉塞性肺疾患、
ぶどう膜炎、
関節リウマチ、
強直性脊椎炎、
紅斑性狼瘡、
クローン病、
喘息、
皮膚炎、
サイトカイン放出症候群、
細胞脱顆粒が関連する疾患
からなる群から選択される炎症性疾患の治療における、請求項１～６のいずれか１項に記載ワクチン組成物の使用。

【請求項8】

０．０１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲の治療用有効量の請求項１～６のいずれか１項に記載の治療用ワクチン組成物の投与を含む、必要性のある対象の治療の方法。

【請求項9】

免疫応答誘導ステージが、前記ワクチン組成物を１～６用量少なくとも毎週投与して達成され、維持ステージとして、少なくとも１用量で毒性が起こる使用制限まで毎週投与される、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ワクチン組成物の投与経路が、筋肉内、皮下、及び腫瘍内を含む群から選択される、請求項９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオテクノロジー及び医薬品の分野に関する。特に、抗原が顆粒球コロニー刺激因子及び／または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子であり得る、造血増殖因子であるワクチン組成物を記載する。

【背景技術】

【0002】

炎症は複雑なプロセスであり、白血球及び血漿に由来するエフェクタータンパク質は、特異的な組織部位へ動員されて、局所的免疫応答を駆動する（Ｎｅｗｔｏｎ Ｋ，Ｄｉｘｉｔ ＶＭ．（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．４（３）：ａ００６０４９）。これは、感染を限定し、組織リモデリングを開始するための有効な手法であるが、付随する組織損傷を回避するために制御されなくてはならない。短期間の急性炎症は、感染または傷害を阻止し、創傷治癒を可能にするが、長期の慢性炎症（サイトカイン産生細胞及び顆粒球を活性化して、サイトカインの産生を増加させ、正のフィードバックループを生成することに起因する）は、局所的な組織損傷の増加及び全身的に規制された免疫（特にＴ細胞応答）を引き起こし得る。

【0003】

慢性炎症は、様々な理由で、完全な治癒フェーズを欠き、それは決して終わらない。これについては、感染または刺激物との長時間の接触、及び継続的に炎症性メディエーターを分泌する細胞の存在等の異なる理由がある。炎症性刺激が永続的になる場合に、免疫抑制及び免疫寛容が始まる。この事例において、臨床的なレベル以下であるが上昇したレベルの顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）及び顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）等のサイトカインは、免疫寛容に関連する一方で、有意に上昇するレベルは、炎症性増悪に関連する（Ｒｏｇｏｖｓｋｉｉ Ｖ．（２０２０）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：２０６１）。実際に、炎症性サイトカイン（Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦ等）は、免疫寛容の増加を媒介し得る。免疫寛容の増加の代償は、腫瘍への罹病性の増加である（Ｓｔａｐｅ Ｔ（２０１８）Ａｓｉａ Ｐａｃ Ｊ Ｏｎｃｏｌ Ｎｕｒｓ ５：４０－２）。

【0004】

Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦは、骨髄中での正常な顆粒球前駆体の顆粒球形成及び分化における主要サイトカインである。その生理的効果は、特異的な細胞表面受容体への結合によって媒介される。Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦならびにそれらの受容体の血漿濃度は、好中球増加症、発熱、炎症、組織破壊を示す炎症性疾患において、ならびに、いくつかの症例では、ショック及び死亡において、変化することが公知である（Ｗａｔａｒｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｌｏｏｄ．７３（１）：１１７－２２；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＪＡ（２０２０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２１７（１）：ｅ２０１９０９４５）。

【0005】

感染が起こる場合に、Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦの放出は、感染性病原体のいくつかの構成要素がそれらの産生を刺激するので、自然に増加する。生じた反応の連鎖を起源とする好中球は、今度は、感染性病原体を攻撃し、それらの破壊を支援する（Ｅｙｌｅｓ ＪＬ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２（９）：５００－５１０；Ａｈａｎｄｉｄｅｈ Ｂ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１（５）：２０６－２１７）。Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦは、癌の開始、進行、及び転移における重要な役割も有する（Ｄｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｃａｎｃｅｒｓ．１２（２）：２８７）。新生物性細胞によって産生されたサイトカインの組み合わせられた作用は、宿主の免疫系の細胞応答を調節する。高レベルの炎症性サイトカインは、複数の型の癌についての進行ステージ及び予後不良と相関している（Ｓｉｌｖａ ＥＭ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＰＬｏＳ ＯＮＥ １２（７）：ｅ０１８１１２５．；Ｌｉｐｐｉｔｚ，ＢＥ（２０１３）．；Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１４（６），ｅ２１８－ｅ２２８）。

【0006】

好中球は、とりわけ腫瘍の発生、慢性閉塞性肺疾患、ぶどう膜炎、関節炎、強直性脊椎炎、紅斑性狼瘡、喘息、サイトカイン放出症候群等の慢性炎症によって特徴付けられる異なる病理において、重要な役割を果たすことが公知である。好中球／リンパ球の比は、それらのうちのいくつかにおける予後指標である（Ｌｅｅ ＨＮ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｉｎｔ．３９（５）：８５９－８６８）。

【0007】

臨床において、Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦは、化学療法に付随する好中球減少症を治療し、移植のための造血幹細胞を動員するために広範囲に使用されてきた（Ｒｏｂｅｒｔｓ，ＡＷ（２００５）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ２３（１）：３３－４；Ｍｅｈｔａ ＨＭ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９５（４）：１３４１－１３４９）が、これに反する先行例は見出されていない。

【0008】

診断的役割を果たし得るか、またはＧ－ＣＳＦ受容体（Ｇ－ＣＳＦＲ）を高発現する腫瘍と闘う受動的療法としてのモノクローナル抗体（Ａｂ）が記載されている。Ｇ－ＣＳＦＲに対する指向性のヒト化中和モノクローナル抗体は、霊長動物において良好な忍容性を示し、好中球減少症をもたらさなかったことが報告されている。加えて、マウス抗Ｇ－ＣＳＦＲモノクローナル抗体は、関節炎を抑制し、関節中の好中球蓄積を有意に阻害し、これらは好中球減少症を伴わずに生じたことから、Ｇ－ＣＳＦＲ遮断が、炎症部位への好中球局在化に影響することを示唆した（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＩＫ（２０１６）．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７：４３９２－４４０２）。しかしながら、抗増殖性及び抗腫瘍性の治療についての証拠は、見出されていない。Ｇ－ＣＳＦは、好中球の制御及び機能における重要なリガンドであるので、このタイプの疾患の患者における治療適応症としてこのサイトカインの活性化を阻害する製剤の使用は有用且つ重要である。

【0009】

化膿性汗腺炎及び掌蹠膿疱症の治療のためのモノクローナル抗Ｇ－ＣＳＦＲ抗体による健康なボランティアにおける第Ｉ相試験があり（ＷＯ２０１９／１７８６４５及びＷＯ２０２０／１１３２７０）、その場合には、循環好中球数はより低い危険なレベルまで低下しない。

【0010】

サイトカインまたはその受容体自身に対する指向性のモノクローナル抗体によるＧＭ－ＣＳＦ経路の遮断は、ＷＯ２０１０／１２４１６３中で記載され、難治性関節リウマチの患者ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０４３３３１４７（２０２０年１１月２３日にアクセス）；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ．ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０４１３４７２８（２０２０年１１月２３日にアクセス）及びＣＯＶＩＤ患者ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０４３７６６８４（２０２０年１１月２３日にアクセス）において継続している臨床試験がある。ＡＣＴ型免疫療法によって誘導された毒性の治療における、ＧＭ－ＣＳＦに対する抗体の使用も記載されている（ＷＯ２０１９／０７０６８０）。

【0011】

患者において検出されるＧ－ＣＳＦサイトカイン及びＧＭ－ＣＳＦサイトカインの濃度は高く、そのため、高用量の抗体でさえ完全にそれらの活性を中和することは不可能である。これらの分子が正常条件下の身体において見出されるので、寛容の破壊及び免疫原性の生成はこれらの分子について容易なプロセスではない。これまでのところ、Ｇ－ＣＳＦ依存性腫瘍またはＧＭ－ＣＳＦ依存性腫瘍に対して、それらの増殖を阻害できる積極的な免疫療法は提案されていない。

【0012】

初めて、本発明において、これらの造血増殖因子を枯渇させる免疫応答が示され、この応答の治療効果の証拠が炎症及び癌の実験モデルにおいて示される。前記組成物は、抗ＧＣＳＦ抗体及び抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体の力価の増加、循環好中球数の減少、抗増殖性抗炎症効果、ならびに高い抗腫瘍効果を生じる。加えて、低用量の活性成分が要求されることによって、毒性が低減されるので、それらは慢性状況において使用され得る。

【0013】

本明細書において記載されるワクチン組成物によって示される効果は、意外且つ予想外である。サイトカインネットワークの複雑な特性とその多面的効果、ならびに炎症を生成するメカニズムの冗長性から、これらのワクチン組成物によって生成された抗体が、好中球の集団を選択的に抑制できること、ましてや、この枯渇が抗炎症性効果及び抗腫瘍性効果へと変換されることは明らかではない。

【発明の概要】

【0014】

１つの手順行為において、本発明の対象は、担体タンパク質、アジュバント、及びｒＧ－ＣＳＦまたはｒＧＭ－ＣＳＦであり得る少なくとも１つの抗原を含む、造血増殖因子に対する免疫応答を誘導する治療用ワクチン組成物である。

【0015】

これらのワクチン組成物によって使用される担体タンパク質の中には、コレラトキシンＢ、破傷風トキソイド、ＫＬＨ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｐ６４ｋ、ジフテリアトキソイド、Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦに対するＴエピトープを提示し得るペプチド、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、抗体のＦｃ領域、抗体の可変断片、ならびに細菌、酵母、または哺乳動物からのタンパク質がある。これらの担体タンパク質は、化学的コンジュゲーションまたは融合方法によって抗原へ付着され得る。

【0016】

本発明のワクチン組成物中で使用され得るアジュバントは、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、スクアレンに基づくアジュバント、合成起源のアジュバント、ミネラル起源のアジュバント、植物起源のアジュバント、動物性タンパク質のアジュバント、微粒子タンパク質アジュバント、プロテオリポソーム型アジュバント、リポソーム、及び上記のうちの任意のものの混合物である。

【0017】

特定の手順行為において、本発明は、癌、慢性閉塞性肺疾患、ぶどう膜炎、関節リウマチ、強直性脊椎炎、紅斑性狼瘡、クローン病、喘息、皮膚炎、サイトカイン放出症候群、及び細胞脱顆粒が重要な役割を果たす疾患を含む群から選択される炎症性疾患の治療における、本明細書において記載されるワクチン組成物の使用に関する。

【0018】

別の手順行為において、０．０１～１０ｍｇ／体重ｋｇの範囲の治療有効量の本発明のワクチン組成物を投与することを含む、必要性のある対象を治療する方法が記載される。特に、１から６用量の間で少なくとも週に１回投与して生成される免疫応答誘導ステージ、及び１用量から毒性が起こる使用限度までの間で少なくとも週に１回投与する前記免疫応答を維持するための別のステージが実行される。この方法は、筋肉内経路、皮下経路、または腫瘍内経路のいずれかによるワクチン組成物の投与を含む。

【発明を実施するための形態】

【0019】

ワクチン組成物
本発明は、造血増殖因子Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦに対する免疫応答を誘導し、インビボで、循環好中球数の減少、抗増殖性効果、及び高い抗腫瘍効果を生じるワクチン調製物を得ることを含む。

【0020】

本発明のワクチン組成物の活性成分は、抗原（Ｇ－ＣＳＦ及び／またはＧＭ－ＣＳＦ）を担体タンパク質へ結合したタンパク質コンジュゲートである。前記担体タンパク質は、コレラトキシンＢ、破傷風トキソイド、ＫＬＨ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからのＰ６４ｋ；ジフテリアトキソイド、ならびにＧ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦに対するＴエピトープを提示できるペプチドから選択されるがこれらに限定されない。上記のコンジュゲートにおいて、当該タンパク質は、ヒトまたは別の動物種からであるかにかかわらず、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、抗体のＦｃ領域へ融合され得る。前記Ｆｃ領域は、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａにより領域Ｃγ２中で突然変異したＩｇＧ１からなり、Ｆｃ受容体へ限定的に結合するバリアントであり得る。加えて、コンジュゲートは、抗体の可変断片、細菌タンパク質、酵母タンパク質、または哺乳動物タンパク質へ融合され得る。

【0021】

また、上で記載されるタンパク質コンジュゲートは、抗Ｇ－ＣＳＦ及び／または抗ＧＭ－ＣＳＦ Ａｂ応答を促進または補完するアジュバントを含む。これらのアジュバントは、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、スクアレンベースのアジュバント、合成起源のアジュバント、ミネラル起源のアジュバント、植物起源のアジュバント、動物起源のアジュバント、微粒子タンパク質アジュバント、プロテオリポソーム型アジュバント、リポソーム、または上記のもののうちの任意のものの混合物であり得る。

【0022】

抗Ｇ－ＣＳＦ及び／または抗ＧＭ－ＣＳＦ系は、好適な本発明使用において、薬学的賦形剤を含んでいた。これらのもとしては、注射用水、塩化ナトリウム、リン系塩（ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ ｓａｌｔ）及びカリウム塩、塩化カルシウム、水酸化ナトリウム及びクエン酸ナトリウム、ならびにＥＤＴＡが挙げられるがこれらに限定されない。患者は、０．０１～１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、且つ１０～１００μＬ／ｋｇ、または１キログラムあたり総タンパク質１０～１００μｇ、または総タンパク質の最大５ｍｇ（１０～６０μｇ／ｋｇがより推奨される）の用量で、非経口製剤において接種され得る。

【0023】

治療用組成物は、液体形態を使用して－８０℃～８℃の温度で、またはで凍結乾燥プロセス後に２～８℃の温度で保存され得る。

【0024】

担体タンパク質と組み換えＧ－ＣＳＦ（ｒＧ－ＣＳＦ）及び／または組み換え体Ｇ－ＣＳＦ（ｒＧＭ－ＣＳＦ）との間の化学的コンジュゲートの取得
ｒＧＣＳＦタンパク質及び／またはｒＧＭ－ＣＳＦタンパク質と上で言及される担体タンパク質のうちのいくつかとの間の化学的抱合反応のための条件の評価及び最適化から、コンジュゲーションの最中の両者の間の高いコンジュゲーション効率を保証するために、高いモル比の自己タンパク質を要求する化学的コンジュゲーション法が開発されている。次いで、コンジュゲーションの最中で必要な過剰量の自己タンパク質は、限外濾過膜精製方法を通じて除去され、それにより、高い均一性を備えたワクチン調製物を取得することが可能にされる。

【0025】

本発明において記載される手順は、両方のタンパク質間の適切な化学的コンジュゲーションを保証し、単一のステップからなるものである。当該手順は、０．１～１ｍｇ／ｍＬの範囲に事前に濃縮されたｒＧＣＳＦタンパク質及び／またはｒＧＭ－ＣＳＦタンパク質ならびにそれがコンジュゲートされるであろう分子を、０．６～２０ｍｇ／ｍＬの範囲でコンジュゲーション反応器中で混合することによって開始する。後続して、ＰＢＳ／ＭｇＣｌ２の溶液（ｐＨ６．０～７．２）及び０．１～０．８％の範囲のグルタルアルデヒドコンジュゲーション溶液は、このタンパク質混合物へ添加される。混合物は、２０～２４℃±２℃の温度で１５分間～４時間で持続的な撹拌下で維持される。コンジュゲーション反応の最中の総タンパク質濃度は１～２０ｍｇ／ｍＬである。

【0026】

後続して、５０～１００ｋＤａの範囲の限外濾過膜を使用して、２つのステージからなる精製が実行される。初期ステージにおいて、バッファー溶液の連続交換（ダイアフィルトレーション）を遂行して、グルタルアルデヒドを除去し、過剰な自己タンパク質を除去し、遊離しているか、または異なるサイズの、ｒＧＣＳＦタンパク質のみもしくはｒＧＭ－ＣＳＦタンパク質のみのコンジュゲートを形成するもの、のいずれかとする。このステージの間に、バッファー溶液の３～１５回の交換が遂行される。第２のステージは、精製された化学的コンジュゲートの濃縮である。

【0027】

膜精製によって取得された治療用調製物は、ｒＧＣＳＦタンパク質とそれがコンジュゲートされる分子との間の化学的コンジュゲーション比が５：１～２０：１の範囲であること、及びグルタルアルデヒドが無いことによって特徴付けられる。

【0028】

融合タンパク質発現方法による治療用組成物の取得
本発明のワクチン組成物は、発現ベクター（これに限定されないが、好ましくはＰＣＭＸ）中にクローニングされ、前述の担体タンパク質のうちの任意のものの遺伝子へ融合された、ｒＧ－ＣＳＦ遺伝子及びｒＧＭ－ＣＳＦ遺伝子に基づく遺伝的構造物をデザインすることによっても取得され得る、トランスフェクションにおいて使用される細胞は、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨＥＫ－２９３－ＧＥ、Ｅｘｐｉ ２９３、ＨＥＫ－２９３、またはＣＨＯｋ１であり得る。トランスフェクションされた細胞の上清は、６～１０日間の培養後に収集される。次いで、前記組み換えタンパク質は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーまたは金属イオン親和性クロマトグラフィーによって精製される。

【0029】

治療方法
上で記載される系は、本発明において記載される系によって生成された抗体の事前の誘導により、抗Ｇ－ＣＳＦ免疫応答及び／または抗ＧＭ－ＣＳＦ免疫応答の維持において有効である。Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦが関連する役割を果たす場合に、当該系は、炎症性疾患の治療において有用である。これらの疾患としては、癌（特にＧ－ＣＳＦまたはＧＭ－ＣＳＦに依存性の腫瘍）、慢性閉塞性肺疾患、ぶどう膜炎、関節炎、強直性脊椎炎、紅斑性狼瘡、クローン病、喘息、皮膚炎、サイトカイン放出症候群、及び細胞脱顆粒が重要な役割を果たす疾患が挙げられるがこれらに限定されない。

【0030】

ヒトまたは動物における使用のために承認される用量は、少なくとも毎週投与される１から６の誘導用量で投与され、次いで免疫応答の維持のステージにおいて、１用量から使用を限定する毒性が起こるまでの間で投与され、少なくとも毎週だけではなく、隔週、毎月、四半期、または毎年、筋肉内、皮下、または腫瘍内に投与される。

【0031】

本発明は、以下の実施例及び図面によりさらに詳述される。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】ＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動によるｒＧ－ＣＳＦ－Ｐ６４ｋ系の特性評価。

【図2】ＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動によるｒＧ－ＣＳＦ－Ｆｃ系及びｒＧＭ－ＣＳＦ－Ｆｃ系の特性評価。

【図3】治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｐ６４ｋ単独で、またはＧ－ＣＳＦと併用して投与した後の、抗Ｇ－ＣＳＦ抗体力価の生成の動態研究。

【図4】Ａ）異なる用量での治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｐ６４ｋの投与後の抗Ｇ－ＣＳＦ抗体力価の生成。Ｂ）異なる用量での治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｐ６４ｋの投与後の抗Ｇ－ＣＳＦ抗体力価の生成の動態。

【図5】治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｐ６４ｋ単独で、またはＧ－ＣＳＦと組み合わせて投与した後の循環好中球カウントの評価。

【図6】治療用組成物ｒＧＣＳＦ－Ｐ６４ｋにより免疫されたマウスから得た血清によって誘導される細胞増殖の阻害。

【図7】クロトン油の適用によって引き起こされた炎症モデルにおける治療用組成物ｒＧＣＳＦ－Ｐ６４ｋの投与後の抗炎症効果の評価。Ａ）循環好中球カウントの減少。Ｂ）心房浮腫の減少。

【図8】治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｆｃ単独で、またはＧ－ＣＳＦと組み合わせて投与した後の、Ａｂ抗Ｇ－ＣＳＦ力価の生成の動態研究。

【図9】Ａ）異なる用量での治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｆｃの投与後の抗Ｇ－ＣＳＦ抗体力価の生成の研究。Ｂ）異なる用量での治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｆｃの投与後の抗Ｇ－ＣＳＦ抗体力価の生成の動態。

【図10】Ｂａｌｂ／ｃ系統における治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｆｃの投与後の抗Ｇ－ＣＳＦ抗体力価の生成の動態研究。

【図11】治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｆｃ単独で、またはＧ－ＣＳＦと組み合わせて投与した後の循環好中球カウントの評価。

【図12】治療用組成物ｒＧＣＳＦ－Ｆｃにより免疫されたマウスから得た血清によって誘導された細胞増殖の阻害。

【図13】治療用組成物ｒＧＭ－ＣＳＦ－Ｆｃの投与後の抗ＧＭ－ＣＳＦ Ａｂ力価の生成の動態研究。

【図14】Ａ）異なる用量での治療用組成物ｒＧＭ－ＣＳＦ－Ｆｃの投与後の抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体力価の生成の研究。Ｂ）異なる用量での治療用組成物ｒＧＭ－ＣＳＦ－Ｆｃの投与後の抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体力価の生成の動態研究。

【図15】治療用組成物ｒＧＭＣＳＦ－Ｆｃにより免疫されたマウスから得た血清によって誘導された細胞増殖の阻害。

【実施例】

【0033】

実施例１．組み換えタンパク質ｒＰ６４ｋとｒＧ－ＣＳＦとの間の化学的コンジュゲートの取得
２０：１の比でｒＧＣＳＦとＰ６４ｋのタンパク質との間の化学的コンジュゲートを取得するために、１７．６ｍｇのＧＣＳＦタンパク質から開始し、３ｍｇのＰ６４ｋ担体タンパク質を、１時間撹拌しながら反応器中で、ＮａＨＣＯ３Ｎａ２ＣＯ３バッファー溶液（０．０１Ｍ）及び０．５％のグルタルアルデヒドコンジュゲーション溶液中に添加する。後続して、細かい不純物（ｄｅｔａｉｌｓ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ）及びコンジュゲートされないタンパク質を限外濾過系を通じて除去する。このプロセスを、ポリソルベート８０、ソルビトール、酢酸ナトリウム、酢酸、及び注射用水を含有するバッファーを使用して実行する。この操作の中に、７回のバッファー交換を遂行する。残存する限外濾過溶液を濃縮して、１ｍｇ／ｍｌの投薬量へ濃縮を調整する。その後、２～８℃で保存する。

【0034】

精製タンパク質の純度を、１０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル及び１つのμｇタンパク質質量で査定した。図１は、取得されたワクチン組成物がおよそ２００ｋＤの分子量に対応することを示す。

【0035】

実施例２．融合タンパク質発現方法を介する治療用組成物の取得。
ヒト免疫グロブリンＧ１のＦｃ領域へ融合されＰＣＭＸ発現ベクターの中へクローニングされた、Ｇ－ＣＳＦ遺伝子に基づく遺伝子コンストラクト及びＧＭ－ＣＳＦ遺伝子による別の遺伝子コンストラクトをデザインした。Ｅｘｐｉ ２９３細胞に、評価される遺伝子コンストラクトをポリエチレンイミンと混合して、トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞からの上清を、６日間の培養後に収集した。前記組み換えタンパク質を、プロテインＡマトリックスへの親和性によって精製した。精製タンパク質の純度を７．５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおいて評価し、使用されるＧ－ＣＳＦ－Ｆｃの質量は２μｇであり、ＧＭ－ＣＳＦ－Ｆｃの事例において９μｇであった。

【0036】

図２は、評価した組成物の両方の分子量がおよそ３５ｋＤに対応することを示す。

【0037】

実施例３．治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｐ６４ｋは、抗Ｇ－ＣＳＦ抗体を誘導する。
Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス（ｎ＝５）を、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅをアジュバントとした（Ｖ／Ｖ １：１）、５０μｇ／体重ｋｇの実施例１の製剤により、０日目、７日目、２１日目、３５日目、及び４２日目に筋肉内で免疫した。１４日目に開始して、Ｇ－ＣＳＦまたはＰＢＳも週に３回皮下投与した。

【0038】

０日目（免疫前）、１４日目、３５日目、及び５６日目に採血して、血清へとプロセシングした。Ｇ－ＣＳＦに対する特異的な抗体の力価を、ＥＬＩＳＡによって決定した。このために、プレートを５μｇ／ｍＬのＧ－ＣＳＦによりカバーし、３７℃で１時間インキュベーションした。対応するブロッキング後に、血清希釈物（１／１０、１／１００、１／５００、１／１０００、１／５０００、１／１００００、１／２００００）を添加した。抗マウスＩｇＧ抗体／アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）及び対応する酵素基質を使用して、反応を可視化した。吸光度を４０５ｎｍで読み取った。免疫前血清を陰性対照として使用した。抗体力価は、ＥＬＩＳＡ光学的密度（ＯＤ）読み取りを示し、加えて免疫前血清を含有するウェルにおいて得られた平均ＯＤを５標準偏差超えるものを最大血清希釈として定義された。

【0039】

各々の実験群のＥＬＩＳＡによって評価された抗Ｇ－ＣＳＦ抗体力価の幾何平均を使用して、免疫応答の条件を規定した。免疫されたマウスは特異的な抗体を生じ、それは、１／１０，０００を超える力価に達し、ワクチン組成物がＧ－ＣＳＦ自体に対する免疫応答を誘導することを示す（図３）。

【0040】

実施例４．異なる濃度での治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｐ６４ｋは抗Ｇ－ＣＳＦ抗体を誘導する。
Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス（ｎ＝５）を、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅをアジュバントとした（Ｖ／Ｖｅｒ １：１）、５０、２５、１２．５、６．２５、及び３．１２５μｇの異なる濃度の実施例１の製剤により、１４日間の間隔の６用量で筋肉内で免疫した。２回目の免疫から、Ｇ－ＣＳＦまたはＰＢＳも週に２回皮下投与した。

【0041】

０日目（免疫前）及び各々の免疫の１５日後に採血して、血清へとプロセシングした。Ｇ－ＣＳＦに対する特異的な抗体の力価を、ＥＬＩＳＡによって決定した。このために、プレートを５ｕｇ／ｍＬのＧ－ＣＳＦによりカバーし、３７℃で１時間インキュベーションした。対応するブロッキング後に、血清希釈物（１／１００、１／１０００、１／１００００、１／１０００００、１／１００００００）を添加した。次いで実施例３において記載される手順に従った。

【0042】

免疫されたマウスは特異的な抗体を生じ、それは、ワクチン組成物の異なる濃度で１／１０００を超える力価に達し、Ｇ－ＣＳＦに対する免疫応答を誘導することを実証した。抗原の複数の用量により免疫されたマウスにおいて得た力価間で有意な差がある（図４Ａ）。これは、抗体力価として測定して取得される応答に関して、免疫群間の用量依存性を実証する。

【0043】

液性免疫応答も、ワクチン組成物の３用量、４用量、５用量、及び６用量に対応する異なる時間的間隔で評価した。異なる濃度のワクチン調製物で免疫されたすべての動物の抗体力価は、用量依存的様式で増加し、５回目の免疫からの抗体力価はプラトーに到達する（図４Ｂ）。

【0044】

実施例５．治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｐ６４ｋは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて循環好中球のカウントを減少させる。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）を、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅをアジュバントとした（Ｖ／Ｖ １：１）実施例１のワクチン製剤により、実施例３の免疫スケジュールに従って免疫した。１４日目に開始して、Ｇ－ＣＳＦまたはＰＢＳも週に３回皮下投与した。０日目（免疫前）及び第１の免疫の５６日後に、末梢血を動物の上顎洞から採血し、ＥＤＴＡ（血液１ｍＬあたり４０μｌ）含有バイアル中に収集した。Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ顕微鏡。

【0045】

正規性はコルモゴロフ・スミルノフ検定によって、等分散性はルビーン検定によって検証され、対応のあるスチューデントのｔ検定は、免疫前の各々の動物の値と３５日目及び５６日目の各々の動物の値との間で遂行された。有意水準は、ｐ＜０．０５である。Ｇ－ＣＳＦ－Ｐ６４ｋコンジュゲートにより処理された動物において、好中球の統計的に有意な低減は５６日目に観察され、この医薬組成物が、生成する抗Ｇ－ＣＳＦ抗体を通じて好中球減少症を引き起こすことが可能であることを示唆する（図５）。好中球減少症がマウスの生存の減少を意味するものでないことにも留意されたい。

【0046】

実施例６．治療用組成物ｒＧＣＳＦ－Ｐ６４ｋは、マウス骨髄芽球株ＮＦＳ６０の細胞増殖を阻害する。
実施例１の治療用組成物、及び実施例３において記載される免疫スキームを使用して、１４日目及び２８日目で取得された血清の効果を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの免疫後のマウス骨髄芽球株ＮＦＳ６０（Ｇ－ＣＳＦ依存性）における細胞増殖アッセイを通じて評価した。

【0047】

細胞を事前に融解し、指数関数的増殖を達成するために培養において４８時間維持した。試験の中のインキュベーション条件は、温度３７℃及び５％のＣＯ２雰囲気であった。活性成分が１／２５０；１／５００、及び１／１０００の希釈のｒＰ６４ｋ－ｒＧ－ＣＳＦタンパク質コンジュゲートであるワクチン製剤の存在下において、細胞を１ウェルあたり１０，０００細胞の濃度で９６ウェル培養プレート中に播種した。ｈＧ－ＣＳＦ参照物質（ＭＲＴ（ＱＦＢ）Ｇ－ＣＳＦ／１９０５）を、陽性対照として同じ濃度でこれらのアッセイのために使用し、Ｇ－ＣＳＦ無しの培地による細胞を陰性対照として含めた。４８時間のインキュベーション後に、１ウェルあたり２０μＬのＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを添加し、６時間インキュベーションした。プレートを５４０ｎｍ及び６２０ｎｍで読み取った。すべてのサンプルを二重で試験した。

【0048】

図６は、ワクチン組成物の投与により、希釈（希釈が低いほど効果が大きい）及び処理の開始からの時間に依存して分裂増殖の阻害があることを示すが、これは１４日目よりも２８日目により高い阻害効果が観察されたからであり、ワクチン製剤が、Ｇ－ＣＳＦ（評価される腫瘍株における顆粒球形成に重要である）の増殖性効果を阻害することを示す。

【0049】

実施例７．治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｐ６４ｋは、抗炎症効果を有する。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、完全フロイントアジュバント中の５０μｇ／体重ｋｇの実施例１のワクチン製剤（Ｖ：Ｖ １：１）により、０日目、７日目、及び２１日目に皮下で免疫した。残りの免疫は、フロイントの不完全アジュバント中で遂行した。対照群として、マウスに、同じ経路及び頻度によって食塩水を投与した。

【0050】

０日目、７日目、及び２１日目に、動物の右側耳介の各々の面上に、１０μＬの０．４％のクロトン油を局所的に適用した。等体積の食塩水を左側耳介へ適用した。０日目及びクロトン油投与開始の２０日前に、好中球のカウントのために、すべての動物から血液サンプルを採取した。３５日目に、刺激物質の適用の４時間後に、動物を屠殺し、耳介浮腫への応答を決定した。それらのために、６ｍｍの直径の組織片を耳介から採取し、分析天秤で秤量した。各々の動物の両方の耳介のディスクから得られた重量により、生じた浮腫及び炎症の阻害パーセンテージを、以下を考慮して計算した。
浮腫＝腫れた耳介（右側耳介）の重量－腫れていない耳介（左側耳介）の重量
炎症の％阻害＝［（Ｐｃ－Ｐｔ）／Ｐｃ］×１００式中：
Ｐｃ：対照群における重量の変化の算術平均、
Ｐｔ：処理群における重量変動の算術平均。

【0051】

統計パッケージＭＩＮＩＴＡＢ（Ｍｉｎｉｔａｂ Ｉｎｃ．バージョン１６．１．０．ＭＩＮＩＴＡＢ、２０１０）を、データプロセッシングのために使用し、結果の解釈において９０％の信頼水準を確立した。データを群間で比較し、コルモゴロフ・スミルノフ（ＫＳ）検定及びルビーン検定を使用して、それぞれ正規性及び等分散性を分析した。実験群間で有意差があるかどうかを決定するために、パラメトリックスチューデントのｔ検定（好中球カウント）及び浮腫のためにマン・ホイットニーＵ検定を遂行した。

【0052】

前の手順の結果として、２０日目に対照群に比較して、ＧＣＳＦ－Ｐ６４Ｋコンジュゲートにより処理された群の好中球カウントの統計的に有意な低減（ｐ＜０．１）が検出された（図７Ａ）一方で、３５日目に、対照群に比較して、ＧＣＳＦ－Ｐ６４Ｋコンジュゲートにより処理された群の急性炎症の阻害が検出され、これは、クロトン油によって引き起こされた耳介浮腫の統計的に有意な５３．８５％の低減（ｐ＜０．１）によって特徴付けられ（図７Ｂ）、ワクチン調製物が、急性炎症のモデルにおいて抗炎症効果を有することを示す。

【0053】

実施例８．治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｆｃは、抗体応答を誘導する。
５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を、抗原としてＧ－ＣＳＦをＦｃへカップリングし、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅをアジュバントとした、２０μｇ／ｋｇの実施例２において記載されるワクチン組成物により、０日目、１４日目、２８日目、及び４２日目に筋肉内で免疫した。１４日目及び５６日目に採血して、血清をプロセシングし、Ｇ－ＣＳＦに対する特異的な抗体力価を、ＥＬＩＳＡによって決定した。このために、プレートを、５μｇ／ｍＬの、６つのヒスチジン分子の尾部を備えたＧ－ＣＳＦｈにより、４℃で１６～２０時間コーティングした。プレートを、リン酸緩衝食塩水中で希釈した４％の脱脂粉乳により、２５℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液中の免疫されたマウスからの血清及び免疫前血清の連続希釈物（１／１０～１／１０^７）を添加し、２５℃で１時間インキュベーションした。０．１％（Ｖ：Ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０溶液による６回の洗浄を遂行した。ブロッキング溶液中で１：３５０００に希釈した抗マウスＩｇＧ免疫グロブリン－ホースラディシュペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ、Ａ２５５４－１ｍＬ）を添加し、２５℃で１時間インキュベーションした。オルトフェニレンジアミン（０．５ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を、０．０１５％の過酸化水素と共に、基質バッファー溶液（２００ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、１００ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸、ｐＨ＝５）中で、顕色のために２５℃で３０分間使用した。反応を１０％のＨ２ＳＯ４により停止させた。吸光度を、Ｄｉａｌａｂ ＧｍｂＨ ＥＬＩＳＡリーダー、ＥＬｘ８０８で４９０ｎｍで決定した。

【0054】

力価は、同じ動物からの免疫前血清の吸光度の少なくとも２倍の吸光度が観察されたものが最高希釈として決定された。図８中で示される結果は、１４日目及び５６日目に得られた血清の力価測定に対応する。グラフから、前記サイトカインに対してマウスにおいてＧ－ＣＳＦｈに対する免疫が液性型応答及び高力価を生成することが可能であることが示される。

【0055】

実施例９．異なる濃度での治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｆｃは、抗Ｇ－ＣＳＦ抗体を誘導する。
Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス（ｎ＝７）を、ＦｃへカップリングしたＧＣＳＦを抗原として有し、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅをアジュバントとした（Ｖ／Ｖ １：１）、８０、４０、２０、１０、及び５μｇの異なる濃度の実施例２の製剤により、１４日間の間隔の６用量で筋肉内で免疫した。血清のプロセシングのために０日目（免疫前）及び各々の免疫の１４日後に採血した。Ｇ－ＣＳＦに対する特異的な抗体の力価を、ＥＬＩＳＡによって決定し、次いで実施例３の手順に従った。

【0056】

免疫されたマウスは特異的な抗体が生じ、それは、ワクチン組成物の異なる濃度で免疫された群間の統計的な差異無しで、１／１０００を超える力価に達し、評価された間隔の用量に依存しないＧ－ＣＳＦに対する免疫応答を誘導することを実証する（図９Ａ）。

【0057】

液性免疫応答を、４０及び５ｕｇのワクチン組成物により免疫された動物について、実施例４の手順に従って、異なる時間的間隔で評価した。抗体力価の動態は、３回目の免疫からプラトー相に留まり、４回目の用量後に小さな変動があった。経時的な液性応答の発生において、濃度に対する非依存性は維持される（図９Ｂ）。

【0058】

実施例１０．治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｆｃは、Ｂａｌｂ／ｃ系統において抗Ｇ－ＣＳＦ抗体を誘導する。
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、抗原としてＦｃへ融合したＧ－ＣＳＦを有し、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅをアジュバントとした、５ｕｇの実施例２の治療用組成物により、１４日間の間隔で分離して５用量で皮下で免疫した。０日目（免疫前）、４２日目、７０日目、及び７７日目に採血した。

【0059】

Ｇ－ＣＳＦに対する特異的な抗体力価を、異なる血清抽出物についてＥＬＩＳＡによって決定した。このために、プレートを５ｕｇ／ｍＬのＧ－ＣＳＦによりカバーし、３７℃で１時間インキュベーションした。対応するブロッキング後に、血清希釈物（１／１００、１／１０００、１／１０，０００、１／１００，０００、１／１，０００，０００）を添加し、次いで実施例３中で記載されるように進めた。

【0060】

免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスは特異的な抗体を生じ、それは、１／１０，０００の平均力価に達し、ワクチン組成物がＧ－ＣＳＦに対する強い免疫応答を誘導することを実証する（図１０）。

【0061】

実施例１１．治療用組成物ｒＧ－ＣＳＦ－Ｆｃは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて循環好中球のカウントを減少させる。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）に、抗原としてＦｃへカップリングしたＧ－ＣＳＦを有し、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅをアジュバントとした、２０μｇ／ｋｇの実施例２中で記載されるワクチン組成物の重量を、実施例３中で記載される免疫スケジュールに従って投与した。好中球カウントを、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ顕微鏡を使用して査定した。０日目（免疫前）及び第１の免疫の５６日目に、末梢血を動物の上顎洞から抽出し、ＥＤＴＡ（血液１ｍＬあたり４０μｌ）含有バイアル中に収集した。好中球カウントを、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓの顕微鏡を使用して遂行した。

【0062】

正規性はコルモゴロフ・スミルノフ検定によって及び等分散性はルビーン検定によって検証され、対応のあるスチューデントのｔ検定は、免疫前の各々の動物の値と３５日目及び５６日目の各々の動物の値との間で遂行された。有意水準は、ｐ＜０．０５である。

【0063】

好中球の統計的に有意な低減は、ＧＣＳＦ－Ｐ６４ｋコンジュゲートにより処理した動物において５６日目に観察され、この医薬組成物が、生成する抗Ｇ－ＣＳＦ抗体を通じて好中球減少症を引き起こすことが可能であることを示唆する（図１１）。好中球減少症がマウスの生存の減少を意味するものでないことにも留意されたい。

【0064】

実施例１２．治療用組成物ｒＧＣＳＦ－Ｆｃは、マウス骨髄芽球株ＮＦＳ６０の細胞増殖を阻害する。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、抗原としてＦｃへ融合したＧＣＳＦを有し、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅをアジュバントとした、４０及び５ｕｇの実施例２の治療用組成物により、１４日間の間隔で分離して５用量で筋肉内で免疫した。

【0065】

マウス骨髄芽球株ＮＦＳ６０（Ｇ－ＣＳＦ依存性）において細胞増殖アッセイを使用して、０日目（免疫前）に及び免疫スキームの終了時に得た血清の効果を評価し、手順は実施例５中で記載されるものである。

【0066】

図１２から、ワクチン組成物の投与により分裂増殖阻害が起こり、免疫されていない動物（免疫前）の血清では阻害が起こらないことが示され、このことは、ワクチン製剤が、ＮＦＳ６０株における顆粒球形成に重要なＧ－ＣＳＦの増殖分裂効果を阻害することを示す。評価された血清の分裂増殖の阻害は、ワクチン組成物の濃度に対する依存性を示さない。

【0067】

実施例１３．治療用組成物ｒＧＭ－ＣＳＦ－Ｆｃは、抗体応答を誘導する。
４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、ＩｇＧ１ Ｆｃ鎖へ融合した、２０μｇのヒトＧＭ－ＣＳＦにより、皮下で免疫した。第１の免疫の２日前に、マウスから血清をして、免疫前血清対照として使用した６回の免疫を１４日間の間隔で遂行し、第６の用量の７日後に採血した。０日目に、免疫を、フロイントの完全アジュバント中で乳化させた２０μｇのタンパク質（Ｖ：Ｖ １：１）により実行した。残りの免疫は、フロイントの不完全アジュバント中で遂行した。

【0068】

０日目日、３５日目、４９日目、及び７７日目に、採血し、ＧＭ－ＣＳＦに対する抗体力価をＥＬＩＳＡによって血清で決定した。このために、９６ウェルプレートを、リン酸緩衝食塩水中で溶解した５μｇ／ｍＬのヒトＧＭ－ＣＳＦにより、４℃で１６～２０時間コーティングした。プレートを、リン酸緩衝食塩水中で希釈した４％の脱脂粉乳により、２５℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液中の免疫されたマウスからの血清及び免疫前血清の連続希釈物（１／１０～１／１０７）を添加し、２５℃で１時間インキュベーションした。０．１％（Ｖ：Ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０溶液による６回の洗浄を遂行した。ブロッキング溶液中で１／３５，０００に希釈した抗マウスＩｇＧ－ホースラディシュペルオキシダーゼコンジュゲートを添加し、２５℃で１時間インキュベーションした。顕色のために、オルトフェニレンジアミン（０．５ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を、０．０１５％の過酸化水素と共に、基質バッファー溶液（２００ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、１００ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸、ｐＨ＝５）中で２５℃で３０分間使用した。反応を１０％のＨ２ＳＯ４により停止させた。すべてのサンプルを二重で適用し、免疫されたマウスの結成中に存在する抗体力価は、同じ動物の免疫前血清の吸光度の少なくとも２倍の吸光度が観察されたものが最高希釈としてみなされた。

【0069】

図１３中で、グラフから、ヒトＧＭ－ＣＳＦに対する免疫が、最大で１×１０７の力価による高い応答を生成したことが示される。結果から、免疫が、かかるサイトカインに対してマウスにおいて高力価の液性応答を生成することが可能であることが示される。

【0070】

実施例１４．異なる濃度での治療用組成物ｒＧＭ－ＣＳＦ－Ｆｃは、抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体を誘導する。
Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス（ｎ＝７）を、ＦｃへカップリングしたＧＭＣＳＦを抗原として有し、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅをアジュバントとした（Ｖ／Ｖ １：１）、４０、２０、１０、５、及び２．５μｇの異なる濃度の実施例２の製剤により、１４日間の間隔の６用量で筋肉内で免疫した。

【0071】

血清のプロセシングのために０日目（免疫前）及び各々の免疫の１４日後に採血した。ＧＭ－ＣＳＦに対する特異的な抗体の力価を、ＥＬＩＳＡによって決定した。このために、実施例４の手順に従って、プレートを５μｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦによりカバーし、３７℃で１時間インキュベーションした。

【0072】

各々の実験群のＥＬＩＳＡによって評価された抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体価の幾何平均を使用して、免疫応答の条件を規定した。免疫されたマウスは特異的な抗体が生じ、それは、ワクチン組成物の異なる濃度で免疫した群間の統計的な差異無しで、１／１０００を超える力価に達し、試験された用量範囲において濃度に依存しないＧＭ－ＣＳＦに対する免疫応答を誘導することを実証する（図１４Ａ）。

【0073】

液性免疫応答を、２０及び５ｕｇのワクチン組成物により免疫された動物について、実施例４の手順に従って、異なる時間的間隔で評価した。抗体力価の動態は、用量の数と対応して増加する。５回目の用量から、応答における変動がないプラトー相が観察される。経時的な液性応答の発生において、濃度に対する非依存性は維持される（図１４Ｂ）。

【0074】

実施例１５．治療用組成物ｒＧＭＣＳＦ－Ｆｃは、マウス骨髄芽球株ＮＦＳ６０の細胞増殖を阻害する。
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、抗原としてＦｃへ融合したＧＭＣＳＦを有し、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅをアジュバントとした、５ｕｇの実施例２の治療用組成物により、１４日間の間隔で分離して５用量で皮下で免疫した。０日目（免疫前）及び最終免疫の１４日後に採血した。

【0075】

免疫から取得された血清の効果を、マウス骨髄芽球株ＮＦＳ６０（Ｇ－ＣＳＦ依存性）における細胞増殖アッセイによって評価し、実施例６において記載される同じ手順に従った。

【0076】

図１５から、ｒＧＭＣＳＦ－Ｆｃワクチン組成物の投与により、免疫された動物において分裂増殖の阻害が起こり、免疫されていない動物（免疫前）の血清では阻害が起こらないことが示され、このことは、ワクチン製剤が、ＮＦＳ６０株における顆粒球形成に重要なＧ－ＣＳＦの増殖効果を阻害することを示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【国際調査報告】