特表 2024-512769 抗原特異的Ｔ細胞を生成し、疾患を治療するための材料及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-19

(54)【発明の名称】抗原特異的Ｔ細胞を生成し、疾患を治療するための材料及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/15 20150101AFI20240312BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 9/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 15/88 20060101ALN20240312BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20240312BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240312BHJP

   C12N 15/24 20060101ALN20240312BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240312BHJP

   C12N 15/52 20060101ALN20240312BHJP

【ＦＩ】

A61K35/15

A61K48/00

A61K31/7105

A61P35/00

A61P37/02

A61P19/02

A61P37/04

A61K9/00

A61K39/00 H

A61P29/00

A61P35/02

C12N15/88 Z ZNA

C12N5/10

C12N15/13

C12N15/24

C12N15/12

C12N15/52 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023560854

(86)(22)【出願日】2022-04-01

(85)【翻訳文提出日】2023-11-08

(86)【国際出願番号】 US2022023125

(87)【国際公開番号】W WO2022212888

(87)【国際公開日】2022-10-06

(31)【優先権主張番号】63/170,221

(32)【優先日】2021-04-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521126302

【氏名又は名称】ナットクラッカー セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002848

【氏名又は名称】弁理士法人ＮＩＰ＆ＳＢＰＪ国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100107249

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 恭久

(72)【発明者】

【氏名】ドイチュ、サミュエル

(72)【発明者】

【氏名】ハーベス、オーレ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC04

4C076CC06

4C076CC07

4C076CC27

4C076FF68

4C084AA13

4C084MA11

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB07

4C084ZB09

4C084ZB11

4C084ZB26

4C084ZB27

4C085AA03

4C085BB01

4C085DD62

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA05

4C086MA11

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZB07

4C086ZB09

4C086ZB11

4C086ZB26

4C086ZB27

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA12

4C087MA11

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB07

4C087ZB09

4C087ZB11

4C087ZB26

4C087ZB27

(57)【要約】

本開示は、抗原ペプチドをコードするインビトロで転写されたｍＲＮＡを含有するナノ粒子の形態の材料、及びがん、自己免疫疾患、感染症、又は炎症などの疾患を治療又は予防するための個別化医療の方法を提供し、方法では、予防的又は治療的処置を受ける対象の細胞をエクスビボでナノ粒子と接触させ、対象の細胞にｍＲＮＡをプロセシングさせ、コードされた産物を発現させ、提示させて対象自身のＴ細胞を活性化し、それによってがん細胞などの罹患した細胞に対する免疫応答を高める。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

罹患した組織由来のポリヌクレオチドを対照と比較して特徴付ける工程と、
前記特徴付けられたポリヌクレオチドから、前記罹患した組織に関連するポリペプチドをコードする候補ｍＲＮＡを同定する工程と、
前記ｍＲＮＡを少なくとも１つの送達ビヒクル分子で封入して少なくとも１つのｍＲＮＡナノ粒子を形成する工程と、
前記少なくとも１つのｍＲＮＡナノ粒子を対象の末梢血白血球又はセンチネルリンパ節白血球に導入する工程であって、前記ｍＲＮＡが前記ポリペプチドをコードする、導入する工程と、
ｍＲＮＡを含む前記末梢血白血球又は前記センチネルリンパ節白血球を前記対象のＴ細胞と接触させる工程と、
少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を得る工程と、を含む、方法。

【請求項2】

前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記疾患が、がん、感染症、自己免疫疾患又は炎症である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記対象ががんを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記がんが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質がん、カポジ肉腫、リンパ腫、肛門がん、星細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、皮膚の基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳がん、腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、カルチノイド腫瘍、心（心臓）腫瘍、髄芽腫、胚細胞腫瘍、子宮頸がん、胆管がん、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、大腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管がん（ＤＣＩＳ）、胎児性腫瘍、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫（頭部及び頸部がん）、ユーイング肉腫（骨がん）、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼がん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管がん、骨線維性組織球腫、骨肉種、胆のうがん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（軟部組織肉腫）、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、精巣がん、妊娠性絨毛疾患、有毛細胞白血病、心臓腫瘍、組織球症、ランゲルハンス細胞ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、腎（腎細胞）がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、口唇及び口腔がん、肝がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、胸膜肺芽腫、気管気管支腫瘍、男性乳がん、骨悪性線維性組織球腫、悪性黒色腫、眼内（眼）、メルケル細胞がん、中皮腫、転移性頭頸部扁平上皮がん、正中線がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、鼻腔及び副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽種、非ホジキンリンパ腫、口腔がん、口唇及び口腔がん、中咽頭がん、骨肉種、骨未分化多形肉腫、卵巣がん、膵臓がん、膵神経内分泌腫瘍、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔及び鼻腔、上皮小体がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、中枢神経系原発悪性リンパ腫（ＣＮＳ）、原発性腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、ユーイング肉腫（骨がん）、カポジ肉腫、骨肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚がん、小腸がん、皮膚扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽喉がん、中咽頭がん、下咽頭がん、胸腺腫、胸腺がん、甲状腺がん、腎盂及び尿管の移行上皮がん、尿道がん、子宮がん、子宮内膜がん、膣がん、血管腫瘍、外陰がん、ウィルムス腫瘍、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項３又は４に記載の方法。

【請求項6】

前記がんが、膀胱がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、白血病、肝がん、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記対象が腫瘍を有する、請求項３又は４に記載の方法。

【請求項8】

前記腫瘍が、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、気管支腫瘍、カルチノイド腫瘍、心（心臓）腫瘍、胚細胞腫瘍、胎児性腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、心臓腫瘍、膵島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、気管気管支腫瘍、血管腫瘍、ウィルムス腫瘍、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記末梢血白血球又はセンチネルリンパ節白血球が樹状細胞を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、ＣＤ８ Ｔ細胞又はＣＤ４ Ｔ細胞である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記ＣＤ４ Ｔ細胞がＴ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２又はＴ_Ｈ１７のＴ細胞である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記対象の前記末梢血白血球又はセンチネルリンパ節白血球を、少なくとも１つのエフェクター分子、又はエフェクター分子をコードするｍＲＮＡを封入してそれによってｍＲＮＡナノ粒子を形成する第２の送達ビヒクル分子と接触させる工程を更に含み、前記エフェクター分子が、Ｔ細胞リプログラミング分子、共刺激分子、転写因子、抗体若しくはその抗原結合断片、又はＴ細胞の増殖を増強する分子である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

Ｔ細胞の増殖を増強する前記分子が、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１８、４－１ＢＢ、ＣＤ３ｚ、ＣＤ２８、抗ＰＤ１抗体、又は抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記Ｔ細胞リプログラミング分子が、ＩＬ１２、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ３、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、又はＴＮＦ－αである、請求項１２又は１３に記載の方法。

【請求項15】

前記共刺激分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＴＣＦ７、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＬＦＡ－２、ＬＦＡ－３、ＬＩＧＨＴ、又はＨＶＥＭである、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記転写因子が、ヒトテロメラーゼ、ＰＵ．１、ＣＥＰＢＡ、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ、β２マイクログロブリン、ＴＡＰ－１、ＴＡＰ－２、ＩＲＦ４、ＳＴＡＴ３、又はインバリアント鎖Ｌｉである、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記抗体又はその抗原結合断片が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＧＴＴＲ抗体、又はその抗原結合断片である、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の数を拡大させる工程を更に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の数を、前記Ｔ細胞を前記ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する前記送達ビヒクル分子、又は前記ｍＲＮＡナノ粒子に曝露された抗原提示細胞に曝露することによって、細胞の生存能力に適合する条件下であるが追加の入力又は操作を加えることなく、受動的に拡大させる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記受動的に拡大させたＴ細胞の数を、ｍＲＮＡを封入してＴ細胞リプログラミング分子、共刺激分子、又は転写因子をコードするｍＲＮＡを含むｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子への曝露によって更に拡大させ、特異化させる、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

ワークフローが自動化され、細胞が定期的にサンプリングされて、細胞数、生存率、特異性、表現型、又はそれらの任意の組み合わせが決定されて、Ｔ細胞療法産物が製造される、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記対照が、健康な同族組織、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、若しくはペプチドであるか、又はポリヌクレオチド、ポリペプチド若しくはペプチドの認められた野生型配列である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記ｍＲＮＡが、ｈＣＤ１ｄ選別ペプチドに融合したポリペプチドをコードし、それによって抗原提示を増加させる、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

治療有効量の抗原特異的Ｔ細胞を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、方法。

【請求項25】

前記抗原特異的Ｔ細胞の数を、何らの追加の入力又は操作を加えることなく、細胞の生存能力に適合する環境において受動的に拡大させる、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記抗原特異的Ｔ細胞が腫瘍細胞を標的とする、請求項２４又は２５に記載の方法。

【請求項27】

前記腫瘍細胞ががん性細胞である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記患者に投与される前記抗原特異的Ｔ細胞が同系Ｔ細胞である、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記患者に投与される前記抗原特異的Ｔ細胞が自家Ｔ細胞である、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

治療有効量の抗原特異的Ｔ細胞を、それを必要とする自己免疫患者に投与する工程を含む、方法。

【請求項31】

前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、アカラシア、アジソン病、成人スチル病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳障害（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、軸索型及びニューロン型神経障害（ＡＭＡＮ）、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）、又は好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性房室ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、肺線維症、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹又は妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、化膿性汗腺炎（ＨＳ）（反転型座瘡）、低ガンマグロブリン症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、若年性リウマチ、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症（ＬＡＤ）、全身性エリテマトーデス、ライム病、慢性メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッカ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児ループス、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリーロンバーグ病、扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、パーソネイジ・ターナー症候群、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、多腺性症候群１型、２型、３型、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発軟骨炎、レストレスレッグス症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、自己免疫性精子形成障害、スティッフパーソン症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感神経性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、甲状腺眼症（ＴＥＤ）、トロサ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、又はフォークト・小柳・原田病である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記患者に投与される前記抗原特異的Ｔ細胞が同系Ｔ細胞である、請求項３０又は３１に記載の方法。

【請求項33】

前記患者に投与される前記抗原特異的Ｔ細胞が自家Ｔ細胞である、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

治療有効量の抗原特異的Ｔ細胞を、それを必要とする感染症又は炎症性疾患を有する患者に投与する工程を含む、方法。

【請求項35】

前記患者に投与される前記抗原特異的Ｔ細胞が同系Ｔ細胞である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記患者に投与される前記抗原特異的Ｔ細胞が自家Ｔ細胞である、請求項３４又は３５に記載の方法。

【請求項37】

抗原ポリペプチドに曝露された対象由来の末梢血白血球又はセンチネルリンパ節白血球を、ｍＲＮＡを封入して前記抗原ポリペプチド又はその抗原性断片をコードするｍＲＮＡを含むｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクルと接触させる工程と、
前記末梢血白血球又はセンチネルリンパ節白血球由来の少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の数を拡大させる工程と、
有効量の前記抗原特異的Ｔ細胞を前記対象に投与し、それによって前記抗原ポリペプチドに対する免疫応答をブーストする工程と、を含む、方法。

【請求項38】

前記対象をワクチンの形態の前記抗原に曝露させる、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記抗原が前記対象に導入されたｍＲＮＡからインビボで発現される、請求項３７又は３８に記載の方法。

【請求項40】

ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子ワクチンを形成する送達ビヒクル分子を、疾患を有するリスクのある対象に投与する工程を含み、前記ｍＲＮＡが前記対象に由来する抗原ポリペプチドをコードし、それによって、前記対象において免疫応答を誘導することで前記対象にワクチン接種する、方法。

【請求項41】

ｍＲＮＡナノ粒子ワクチンの第２の送達を更に含み、それによって前記免疫応答をブーストする、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記投与されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンのｍＲＮＡと前記第２の送達されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンのｍＲＮＡとが同一のｍＲＮＡである、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記投与されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンと前記第２の送達されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンとが同一のｍＲＮＡナノ粒子ワクチンである、請求項４１に記載の方法。

【請求項44】

前記送達ビヒクルが前記ｍＲＮＡを封入して多成分リピトイドｍＲＮＡナノ粒子を形成する、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記投与されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンが第１の送達ビヒクル分子を含み、前記第２の送達されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンが第２の送達ビヒクル分子を含み、前記第１の送達ビヒクル分子と前記第２の送達ビヒクル分子とが同じである、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記投与されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンが第１の送達ビヒクル分子を含み、前記第２の送達されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンが第２の送達ビヒクル分子を含み、前記第１の送達ビヒクル分子と前記第２の送達ビヒクル分子とが異なる、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

ネオエピトープを含むペプチドをコードするｍＲＮＡを含むｍＲＮＡナノ粒子を含む、ワクチン。

【請求項48】

前記ｍＲＮＡナノ粒子が、多成分リピトイド系ナノ粒子である送達ビヒクル分子を含む、請求項４７に記載のワクチン。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年４月２日に出願された米国仮特許出願第６３／１７０，２２１号の優先権の利益を主張するものであり、この仮特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願は、参照によりその全体が組み込まれ次に特定される、コンピュータ可読形式の配列表を、本開示の別個の部分として含む；ファイル名：５６５７９＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ６，５４４バイト；作成日：２０２２年３月３１日。

【背景技術】

【0003】

近年、固形がんの治療のための免疫療法が有望な治療代替策として浮上してきている。がん免疫療法において、免疫系は、がん細胞を標的として死滅させるために受動的又は能動的のいずれかで利用される。免疫療法は、高度に強力な抗がん応答を誘導すると同時に、オフターゲット毒性を排除する標的特異性を提供する。腫瘍細胞又はそれらの微小環境を標的とすることによって、受動免疫療法は、抑制を克服することで内因性の抗腫瘍免疫応答を増強し、腫瘍細胞の成長を阻害することができる。能動免疫療法では、免疫細胞を刺激してがんと能動的に戦うように指示し、このアプローチは、より困難であるが、極めて有望である。能動免疫療法は、キラーＴ細胞及び抗体産生Ｂ細胞などの抗原特異的免疫細胞の効率的な刺激に強く依存する。養子Ｔ細胞の移入では、単離された自家の腫瘍特異的Ｔ細胞をエクスビボで増殖させて、十分に刺激した後にがん患者に再注入しており、これらの細胞が強力な抗腫瘍応答を誘発すると予想されている（１）。養子細胞療法（ＡＣＴ）、特にＴ細胞ベースの養子細胞療法は、治療に応答する患者のパーセンテージ（百分率）によって示されるように、腫瘍の退縮を引き起こすことにおける成功は限られている。また、チェックポイント阻害剤は、がんの治療におけるＴ細胞コンパートメントの可能性を更に強調している。しかしながら、全ての患者がこれらの治療に応答するわけではなく、多くの課題が残っている。

【0004】

いくつかの異なるレベルの障害が、固形腫瘍におけるＴ細胞ＡＣＴの成功を妨げる一因となっている。困難の１つはターゲットの選択である。Ｔ細胞免疫療法のために選択される標的抗原は、既知の腫瘍抗原であってもよく、又は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法の場合のように、１つの特定の腫瘍において見られる固有の変異によって形成されるネオアンチゲンか若しくは更に未知であってもよい。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、疾患の治療のための抗原特異的Ｔ細胞を生成するための材料及び方法を提供する。材料及び方法の様々な実装形態を以下に記載し、以下に列挙される更なる実装形態を含む、また除いた材料及び方法は、任意の組み合わせで（これらの組み合わせが矛盾しない限りで）、これらの欠点を克服し、本明細書に記載される利益を実現することができる。

【0006】

本開示は、ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクルの形態で抗原性材料を生成するための材料及び方法を提供する。封入されたｍＲＮＡは、少なくとも、がん（例えば、腫瘍）、炎症、感染症、及び自己免疫疾患などの疾患を治療するための治療的免疫応答の誘発に有用な抗原ペプチド又は抗原ポリペプチドをコードする。がんは、少なくとも１つの細胞型における細胞周期の制御の喪失による制御されない細胞増殖を特徴とする疾患である。いくつかのがん性細胞は腫瘍の形態で固形塊を形成し得る。腫瘍は、良性又は悪性であり得る。良性腫瘍はがんを生じない場合があるが、悪性腫瘍はがんの一形態であり、がん性細胞から構成されると考えることができる。炎症とは、傷害、疾患、刺激又は異物若しくは外来生物による侵入から保護するための生理学的プロセスからもたらされる発赤、腫脹、疼痛及び体温上昇を特徴とする症状である。感染性疾患とは、対象と接触するか、又は対象に侵入する外来生物によって引き起こされる疾患である。感染性病原体は、細菌、真菌、又はウイルスであり得る。自己免疫疾患とは、身体の免疫系が、身体を自己抗原に対して不適切に保護することを特徴とする疾患である。本方法は、免疫細胞には直接送達されないが、ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子（例えば、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子）を形成する送達ビヒクル中にパッケージされたｍＲＮＡによってコードされる抗原ペプチドの形態の自己抗原を利用する。ｍＲＮＡナノ粒子は、本開示の少なくとも１つのｍＲＮＡなどのナノ粒子のカーゴを部分的又は完全に封入することができる。処置される対象の抗原提示細胞は、エクスビボ、例えばインビトロで、少なくとも１つの抗原ペプチドをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされ、トランスフェクトされたＡＰＣは、その同じ対象のＴ細胞に抗原ペプチドを提示する。Ｔ細胞の活性化及び増殖は、提示増強配列及びエフェクター組成物によって促進され得る。その結果は、固形腫瘍がんなどのがんの治療によって例示される様々な疾患を治療するための免疫療法への個別化医療アプローチである。

【0007】

本開示の一態様は、罹患した組織由来のポリヌクレオチドを対照と比較して特徴付ける工程と、当該特徴付けられたポリヌクレオチドから、当該罹患した組織に関連するポリペプチドをコードする候補ｍＲＮＡを同定する工程と、当該ｍＲＮＡを少なくとも１つの送達ビヒクル分子に封入して、少なくとも１つのｍＲＮＡナノ粒子を形成する工程と、当該少なくとも１つのｍＲＮＡナノ粒子を当該対象の末梢血白血球又はセンチネルリンパ節白血球に導入する工程であって、当該ｍＲＮＡは当該ポリペプチドをコードする、導入する工程と、ｍＲＮＡを含む当該末梢血白血球又はセンチネルリンパ節白血球を当該対象のＴ細胞と接触させる工程と、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を得る工程と、を含む、方法に関する。ｍＲＮＡを封入する送達ビヒクル分子を含むｍＲＮＡナノ粒子を白血球に送達することによって、ｍＲＮＡナノ粒子のｍＲＮＡがプロセシング及び翻訳されて、コードされたペプチドを得ることができる。本明細書中で使用されるペプチドとは、ポリペプチド断片及び全長ポリペプチドの両方を指す。いくつかの実装形態において、対象はヒトである。いくつかの実装形態において、疾患は、がん、感染症、自己免疫疾患又は炎症である。

【0008】

いくつかの実装形態において、対象はがんを有する。いくつかの実装形態において、がんは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質がん、カポジ肉腫、リンパ腫、肛門がん、星細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、皮膚の基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳がん、腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、カルチノイド腫瘍、心（心臓）腫瘍、髄芽腫、胚細胞腫瘍、子宮頸がん、胆管がん、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、大腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管がん（ＤＣＩＳ）、胎児性腫瘍、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫（頭部及び頸部がん）、ユーイング肉腫（骨がん）、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼がん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管がん、骨線維性組織球腫、骨肉種、胆のうがん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（軟部組織肉腫）、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、精巣がん、妊娠性絨毛疾患、有毛細胞白血病、心臓腫瘍、組織球症、ランゲルハンス細胞ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、腎臓（腎細胞）がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、口唇及び口腔がん、肝がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、胸膜肺芽腫、気管気管支腫瘍、男性乳がん、骨悪性線維性組織球腫、悪性黒色腫、眼内（眼）、メルケル細胞がん、中皮腫、転移性頭頸部扁平上皮がん、正中線がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、鼻腔及び副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽種、非ホジキンリンパ腫、口腔がん、口唇及び口腔がん、中咽頭がん、骨肉種、骨未分化多形肉腫、卵巣がん、膵臓がん、膵神経内分泌腫瘍、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔及び鼻腔、上皮小体がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、中枢神経系原発悪性リンパ腫（ＣＮＳ）、原発性腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、ユーイング肉腫（骨がん）、カポジ肉腫、骨肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚がん、小腸がん、皮膚扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽喉がん、中咽頭がん、下咽頭がん、胸腺腫、胸腺がん、甲状腺がん、気管気管支腫瘍、腎盂及び尿管の移行上皮がん、尿道がん、子宮がん、子宮内膜がん、膣がん、血管腫瘍、外陰がん、ウィルムス腫瘍、又はそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実装形態において、がんは、膀胱がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、白血病、肝がん、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、又はそれらの任意の組み合わせである。

【0009】

いくつかの実装形態において、対象は腫瘍を有する。いくつかの実装形態において、腫瘍は、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、気管支腫瘍、カルチノイド腫瘍、心（心臓）腫瘍、胚細胞腫瘍、胎児性腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、心臓腫瘍、膵島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、気管気管支腫瘍、血管腫瘍、ウィルムス腫瘍、又はそれらの任意の組み合わせである。

【0010】

いくつかの実装形態において、末梢血白血球又はセンチネルリンパ節白血球は、樹状細胞を含む。いくつかの実装形態において、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞又はＣＤ４ Ｔ細胞である。いくつかの実装形態において、ＣＤ４ Ｔ細胞は、Ｔ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２又はＴ_Ｈ１７のＴ細胞である。いくつかの実装形態において、本方法は、対象の末梢血白血球又はセンチネルリンパ節白血球を、少なくとも１つのエフェクター分子、又はエフェクター分子をコードするｍＲＮＡを封入し、それによってｍＲＮＡナノ粒子を形成する第２の送達ビヒクル分子と接触させる工程を更に含み、エフェクター分子は、ＩＬ１２、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ３などのサイトカイン、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、若しくはＩＦＮγなどのインターフェロン（すなわち、ＩＦＮ）、又は腫瘍壊死因子α（すなわち、ＴＮＦ－α）を含むＴ細胞リプログラミング分子、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＴＣＦ７、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＬＦＡ－２、ＬＦＡ－３、ＬＩＧＨＴ、若しくはＨＶＥＭ、転写因子、ヒトテロメラーゼ、ＰＵ．１、ＣＥＰＢＡ、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ、β２マイクログロブリン、ＴＡＰ－１、ＴＡＰ－２、ＩＲＦ４、ＳＴＡＴ３、若しくはインバリアント鎖Ｌｉなどの共刺激分子、又は抗ＣＤ３抗体（すなわち、ａ－ＣＤ３）、ａ－ＣＤ２８、ａ－ＣＤ４０、ａ－ＯＸ４０、ａ－ＰＤ１、ａ－ＣＴＬＡ４、ａ－ＴＩＧＩＴ、ａ－ＬＡＧ３、若しくはａ－ＧＴＴＲを含む抗体あるいはその抗原結合断片、又は、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１８、４－１ＢＢ、ＣＤ３ｚ、ＣＤ２８、抗ＰＤ１抗体、若しくは抗ＣＴＬＡ４抗体などのＴ細胞の増殖を促進する分子である。いくつかの実装形態において、本方法は、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の数を拡大させる工程を更に含む。いくつかの実装形態において、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の数は、Ｔ細胞を、細胞の生存能力に適合する条件下ではあるが追加の入力又は操作を加えることなく、ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子、又はｍＲＮＡナノ粒子に曝露された抗原提示細胞に曝露することによって受動的に拡大される。いくつかの実装形態において、受動的に拡大されたＴ細胞の数を、ｍＲＮＡを封入してＴ細胞リプログラミング分子、共刺激分子、又は転写因子をコードするｍＲＮＡを含むｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子に曝露することによって更に拡大及び分化させる。いくつかの実装形態において、ワークフローは自動化され、細胞を定期的にサンプリングして、細胞数、生存率、特異性、表現型、又はそれらの任意の組み合わせを決定して、Ｔ細胞療法産物が製造される。いくつかの実装形態において、対照は、健康な同族組織、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、若しくはペプチドであるか、又はポリヌクレオチド、ポリペプチド、若しくはペプチドの認められた野生型配列である。認められた野生型配列とは、野生型配列であることが当技術分野で公知の野生型配列である。いくつかの実装形態において、ｍＲＮＡは、ヒトＣＤ１ｄ（すなわち、ｈＣＤ１ｄ）選別ペプチドに融合されたポリペプチドをコードし、それによって抗原の提示を増加させる。

【0011】

本開示の別の態様は、治療有効量の抗原特異的Ｔ細胞を、それを必要とする患者、例えば、がん患者、又は感染症、自己免疫疾患、若しくは炎症性疾患を有する患者に投与することを含む、方法に関する。いくつかの実装形態において、抗原特異的Ｔ細胞の数は、細胞の生存能力に適合する環境において何らの追加の入力又は操作を加えることなく、受動的に拡大される。いくつかの実装形態において、抗原特異的Ｔ細胞はがん性細胞などの腫瘍細胞を標的とする。いくつかの実装形態において、抗原特異的Ｔ細胞はがん細胞を標的とする。他の実装形態において、抗原特異的Ｔ細胞は非がん性の良性腫瘍細胞を標的とする。いくつかの実装形態において、患者に投与される抗原特異的Ｔ細胞は同系Ｔ細胞である。いくつかの実装形態において、患者に投与される抗原特異的Ｔ細胞は自家Ｔ細胞である。

【0012】

本開示の更に別の態様は、治療有効量の抗原特異的Ｔ細胞を、それを必要とする自己免疫患者に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実装形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、アカラシア、アジソン病、成人スチル病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳障害（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、軸索型及びニューロン型神経障害（ＡＭＡＮ）、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）、又は好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性房室ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、肺線維症、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹又は妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、化膿性汗腺炎（ＨＳ）（反転型座瘡）、低ガンマグロブリン症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、若年性リウマチ、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症（ＬＡＤ）、全身性エリテマトーデス、ライム病、慢性メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッカ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児ループス、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリーロンバーグ病、扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、パーソネイジ・ターナー症候群、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、多腺性症候群１型、２型、３型、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発軟骨炎、レストレスレッグス症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、自己免疫性精子形成障害、スティッフパーソン症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感神経性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、甲状腺眼症（ＴＥＤ）、トロサ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、又はフォークト・小柳・原田病である。いくつかの実装形態において、患者に投与される抗原特異的Ｔ細胞は同系Ｔ細胞である。いくつかの実装形態において、患者に投与される抗原特異的Ｔ細胞は自家Ｔ細胞である。

【0013】

本開示の更に別の態様では、治療有効量の抗原特異的Ｔ細胞を、それを必要とする感染症又は炎症性疾患を有する患者に投与することを含む、方法を示す。いくつかの実装形態において、患者に投与される抗原特異的Ｔ細胞は同系Ｔ細胞である。いくつかの実装形態において、患者に投与される抗原特異的Ｔ細胞は自家Ｔ細胞である。

【0014】

更に別の態様は、抗原ポリペプチド又は抗原ペプチドに曝露された対象由来の末梢血白血球又はセンチネルリンパ節白血球を、ｍＲＮＡを封入して抗原ポリペプチド又はその抗原性断片をコードするｍＲＮＡを含むｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子と接触させる工程と、当該末梢血白血球又はセンチネルリンパ節白血球由来の少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の数を拡大させる工程と、有効量の当該抗原特異的Ｔ細胞を当該対象に投与して、それによって、当該抗原ポリペプチドに対する免疫応答をブーストする工程と、を含む、方法に関する。いくつかの実装形態において、対象はワクチンの形態の抗原に曝露される。本開示のこの態様のいくつかの実装形態において、抗原は、例えば、本明細書に開示される送達ビヒクル分子を使用することによって対象に導入されたｍＲＮＡからインビボで発現される。

【0015】

本開示の別の態様は、ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子ワクチンを形成する送達ビヒクル分子を、疾患を有するリスクのある対象に投与することを含み、ｍＲＮＡは対象に由来する抗原ポリペプチド又は抗原ペプチドをコードし、それによって、対象において免疫応答を誘導することで対象にワクチン接種する、方法である。いくつかの実装形態において、本方法は、ｍＲＮＡナノ粒子ワクチンの第２の投与又は第２の送達を更に含み、それによって免疫反応をブーストする。いくつかの実装形態において、投与されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンのｍＲＮＡと第２の送達されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンのｍＲＮＡとは、同一のｍＲＮＡである。第１及び第２の送達されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンに関して述べると、これらのワクチンは同じ配列のｍＲＮＡを含む。いくつかの実装形態において、投与されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンと第２の送達されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンとは、同一のｍＲＮＡナノ粒子ワクチンである。再び、第１及び第２のｍＲＮＡナノ粒子ワクチンに関して述べると、ワクチンは同一であり、すなわち、投与されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンと第２の送達されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンとは同一の成分から構成される。上記と一致して、本開示の方法のいくつかの実装形態において、投与されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンは第１の送達ビヒクル分子を含み、第２の送達されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンは第２の送達ビヒクル分子を含み、第１の送達ビヒクル分子と第２の送達ビヒクル分子とは同じである。いくつかの実装形態において、投与されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンは第１の送達ビヒクル分子を含み、第２の送達されるｍＲＮＡナノ粒子ワクチンは第２の送達ビヒクル分子を含み、第１の送達ビヒクル分子と第２の送達ビヒクル分子とは異なる。

【0016】

本明細書に開示される方法の各々のいくつかの実装形態において、送達ビヒクル分子はｍＲＮＡを封入して多成分リピトイドｍＲＮＡナノ粒子を形成する。多成分リピトイドｍＲＮＡナノ粒子のｍＲＮＡは、Ｔ細胞リプログラミング分子、共刺激分子、転写因子、又は抗体若しくはその抗原結合断片、又はＴ細胞の増殖を増強する分子などのエフェクター分子をコードして、又はコードせずに、抗原ポリペプチド又は抗原ペプチドをコードする。本開示によるｍＲＮＡを封入して多成分脂質ｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクルは、更なる脂質成分、例えば構造脂質、リン脂質、及び遮蔽脂質と組み合わされた脂質化カチオン性ペプチド化合物の複合体を含み、それには、リピトイドとして知られるカチオン性ペプチド－リン脂質コンジュゲート、又は本明細書でより詳細に記載されるように、脂質部分、及び／又は（オリゴ及び／又はポリ）エチレングリコール部分でＮ置換されたＮ置換カチオン性ペプチド化合物（本明細書では、三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と称される）がカチオン性ペプチド化合物として含まれ得る。ｍＲＮＡを封入して多成分脂質ｍＲＮＡナノ粒子を形成するこれらの送達ビヒクル分子は、非常に効率的であり市販の脂質ナノ粒子製剤で観察される効率を超える細胞にｍＲＮＡを送達するためのビヒクルを提供する。

【0017】

本開示のもう１つの態様では、ネオエピトープを含むペプチドをコードするｍＲＮＡを含むｍＲＮＡナノ粒子を含む、ワクチンを提供する。いくつかの実装形態において、ｍＲＮＡナノ粒子は、多成分リピトイド系ナノ粒子である送達ビヒクル分子を含む。

【0018】

上記の概念及び以下でより詳細に論じられる追加の概念の全ての組み合わせ（そのような概念が相互に矛盾しない限り）は、本明細書で開示される本発明の主題の一部であるとして企図されることを理解されたい。特に、本開示の最後に示される特許請求される主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示される本発明の主題の一部であるとして企図される。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1-1】腫瘍特異的Ｔ細胞産物の同時生成による選択を伴うがんワクチンエピトープ発見のフローチャートである。（Ａ）及び（Ｂ）に、患者特異的、機能特異的Ｔ細胞産物を誘発し、誘導し、拡大するためのフローチャートを示す。

【図1-2】腫瘍特異的Ｔ細胞産物の同時生成による選択を伴うがんワクチンエピトープ発見のフローチャートである。（Ａ）及び（Ｂ）に、患者特異的、機能特異的Ｔ細胞産物を誘発し、誘導し、拡大するためのフローチャートを示す。

【図2-1】養子移入Ｔ細胞産物の製造である。（Ａ）同時の機能特異的ワクチン接種（例えば、がんワクチン接種）と養子Ｔ細胞産物を生成するための末梢血白血球（ＰＢＬ）の回収のフローチャート；（Ｂ）機能特異的（例えば，がん特異的）Ｔ細胞の初期のインビボでの増殖及び誘導、それに続く養子Ｔ細胞産物の生成のためのＰＢＬの回収を示すフローチャート。

【図2-2】養子移入Ｔ細胞産物の製造である。（Ａ）同時の機能特異的ワクチン接種（例えば、がんワクチン接種）と養子Ｔ細胞産物を生成するための末梢血白血球（ＰＢＬ）の回収のフローチャート；（Ｂ）機能特異的（例えば，がん特異的）Ｔ細胞の初期のインビボでの増殖及び誘導、それに続く養子Ｔ細胞産物の生成のためのＰＢＬの回収を示すフローチャート。

【図3】活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＦＡＣＳ選別である。（Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞をゲーティングした。左から：対照処理ＰＢＭＣｓ、Ｇｅｎ．１ ｍＲＮＡ活性化、Ｇｅｎ．２ ｍＲＮＡ活性化、ペプチド活性化のＦＡＣＳプロット。（Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞をゲーティングした。左から：対照処理ＰＢＭＣｓ、Ｇｅｎ．１ ｍＲＮＡ活性化、Ｇｅｎ．２ ｍＲＮＡ活性化、ペプチド活性化のＦＡＣＳプロット。

【図4】図に示した種々の末梢血単核細胞型の末梢血単核細胞のトランスフェクション効率である。細胞をＴｈｙ１ ｍＲＮＡナノ粒子に曝露して２４時間後に、トランスフェクション効率を測定した。ヒストグラムの高さはトランスフェクトされた親細胞のパーセンテージを反映している。

【図5】抗原をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた天然に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、従来のペプチド抗原刺激と比較して、優れた抗原提示及びＴ細胞活性化を与える。（Ａ）抗原チャレンジ後のＣＤ８ Ｔ細胞の活性化のフローサイトメトリー。（Ｂ）抗原処理又は対照処理したＰＢＭＣｓサンプルにおけるＩＦＮγの分泌。

【図6-1】（Ａ）及び（Ｂ）抗原提示並びにその後のＴ細胞の活性化は、ＭＨＣ提示増強配列を含めることで抗原ｍＲＮＡの設計を最適化することによって更に増強された。

【図6-2】（Ａ）及び（Ｂ）抗原提示並びにその後のＴ細胞の活性化は、ＭＨＣ提示増強配列を含めることで抗原ｍＲＮＡの設計を最適化することによって更に増強された。

【図7-1】天然に存在するＡＰＣによって活性化されたＴ細胞は、抗原を発現する標的細胞を死滅させることができ、また受動的に増殖して多数になることができる。（Ａ）ＭＨＣ提示増強配列を含むｐｐ６５をコードする１μｇのｍＲＮＡで処理した培養物において、頑健（ロバスト）なＣＤ８ Ｔ細胞の増殖が明らかである。生存率及び細胞数の両方で、ペプチドで処理した細胞よりも優れていた。（Ｂ）活性化され増殖したＣＤ８ Ｔ細胞は、Ｔ２標的細胞がＣＭＶ－ｐｐ６５抗原でパルスされた場合にのみ、Ｔ２標的細胞を認識して死滅させた。（Ｃ）ｍＲＮＡで処理した培養物から単離されたＣＤ８ Ｔ細胞において、ペプチドと比較して有意により良好な死滅の効果が見られる。

【図7-2】天然に存在するＡＰＣによって活性化されたＴ細胞は、抗原を発現する標的細胞を死滅させることができ、また受動的に増殖して多数になることができる。（Ａ）ＭＨＣ提示増強配列を含むｐｐ６５をコードする１μｇのｍＲＮＡで処理した培養物において、頑健（ロバスト）なＣＤ８ Ｔ細胞の増殖が明らかである。生存率及び細胞数の両方で、ペプチドで処理した細胞よりも優れていた。（Ｂ）活性化され増殖したＣＤ８ Ｔ細胞は、Ｔ２標的細胞がＣＭＶ－ｐｐ６５抗原でパルスされた場合にのみ、Ｔ２標的細胞を認識して死滅させた。（Ｃ）ｍＲＮＡで処理した培養物から単離されたＣＤ８ Ｔ細胞において、ペプチドと比較して有意により良好な死滅の効果が見られる。

【図7-3】天然に存在するＡＰＣによって活性化されたＴ細胞は、抗原を発現する標的細胞を死滅させることができ、また受動的に増殖して多数になることができる。（Ａ）ＭＨＣ提示増強配列を含むｐｐ６５をコードする１μｇのｍＲＮＡで処理した培養物において、頑健（ロバスト）なＣＤ８ Ｔ細胞の増殖が明らかである。生存率及び細胞数の両方で、ペプチドで処理した細胞よりも優れていた。（Ｂ）活性化され増殖したＣＤ８ Ｔ細胞は、Ｔ２標的細胞がＣＭＶ－ｐｐ６５抗原でパルスされた場合にのみ、Ｔ２標的細胞を認識して死滅させた。（Ｃ）ｍＲＮＡで処理した培養物から単離されたＣＤ８ Ｔ細胞において、ペプチドと比較して有意により良好な死滅の効果が見られる。

【図8】抗原をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた天然に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、子宮頚部異形成患者由来のＰＢＭＣにおいて、従来のペプチド抗原刺激と比較して、優れた抗原提示及びＴ細胞の活性化を与える。（Ａ）抗原チャレンジ後のＣＤ８ Ｔ細胞の活性化のフローサイトメトリー。（Ｂ）ＭＨＣ提示増強配列を含むＨＰＶ１６抗原のｍＲＮＡをコードする１μｇのｍＲＮＡで処理した培養物において、頑健なＣＤ８ Ｔ細胞の増殖が明らかである。生存率及び細胞数の両方で、ペプチドで処理した細胞よりも優れていた。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本開示は、疾患抗原ペプチド（例えば、腫瘍抗原ペプチドなどのがん抗原ペプチド）の同定とｍＲＮＡナノ粒子のロバスト性及び柔軟性とを組み合わせた免疫療法を提供する。一例において、ｍＲＮＡナノ粒子は、少なくとも１つの抗原ペプチドをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを封入する送達ビヒクル分子を含む。本明細書における「封入する」という用語は、ｍＲＮＡの周囲の送達ビヒクル分子の全ての適切な程度の被覆を意味する。例えば、封入は、送達ビヒクル分子によって完全に被覆され取り囲まれたｍＲＮＡ、又は送達ビヒクル分子によって部分的に被覆され取り囲まれた（例えば、実質的に被覆された）ｍＲＮＡを指すことができる。

【0021】

少なくとも１つの送達ビヒクル分子でｍＲＮＡを封入することによって少なくとも部分的に形成されたｍＲＮＡナノ粒子は、少なくとも１つの抗原ペプチドをコードする封入されたｍＲＮＡを、発現、プロセシング、及び対象のＴ細胞へのエクスビボでの提示のために、樹状細胞などの抗原提示細胞に輸送するために使用することができる。本方法は、腫瘍抗原ペプチドなどの疾患抗原ペプチドをコードする最適化されたｍＲＮＡの開発を容易にする。少なくとも抗原ポリペプチド又は抗原ペプチドをコードする本開示の治療用又は予防用ｍＲＮＡを、送達ビヒクル分子の中に封入して、ｍＲＮＡナノ粒子を生成することができる。本開示によるｍＲＮＡナノ粒子はまた、腫瘍浸潤Ｔリンパ球のリプログラミング及び拡大のために、送達ビヒクル中に封入されてｍＲＮＡナノ粒子を形成する１つ以上のｍＲＮＡによってコードされ得るエフェクター分子を提供することができる。更に、本開示は、抑制を克服し、活性化を増強し、増殖を確実にし、及び／又はＴ細胞のリプログラミングを誘導するための、エフェクターと腫瘍抗原ｍＲＮＡとの組み合わせを提供する。本明細書に開示される材料及び方法は、養子細胞療法（すなわち、ＡＣＴ）のための、がん抗原ペプチド特異的（例えば、腫瘍抗原ペプチド特異的）Ｔ細胞などの疾患を標的とする抗原ペプチド特異的Ｔ細胞の効果的かつ効率的な同定及び増殖を提供する。

【0022】

本開示の免疫療法は、がん、自己免疫疾患及び炎症などの疾患を治療するために対象自身の免疫応答の力を利用する。本方法は、抗原ポリペプチド又はペプチドの形態の自己抗原に焦点を当て、ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子を送達して、ｍＲＮＡはそのようなポリペプチド及びペプチドをコードして、細胞の生理学によって、驚くほど有効な免疫応答を生じる様式で、それらのコードされた産物がプロセシング及び発現されるようにする。本開示は更に、がん、自己免疫疾患又は炎症などの疾患を有する対象に、ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子を送達することによって、その免疫応答をブーストする方法であって、ｍＲＮＡは抗原ポリペプチド又はペプチドをコードする、方法を提供する。いくつかの実装形態において、免疫応答をブーストするために使用される封入されるｍＲＮＡは、最初の免疫応答を誘発するために使用された封入されたｍＲＮＡと同じである（すなわち、同じ配列を有する）。免疫応答をブーストするために使用されるｍＲＮＡナノ粒子を形成する際にｍＲＮＡを封入する送達ビヒクル分子は、最初の免疫応答を誘発するために使用されたｍＲＮＡナノ粒子を形成するためにｍＲＮＡを封入する送達ビヒクルと同じ（すなわち、同一の成分を有する）であってもよく、又は異なっていてもよい。

【0023】

更に、本明細書に開示される材料及び方法は、トランスジェニックＴ細胞療法産物の生成のための機能的Ｔ細胞受容体（すなわち、ＴＣＲ）配列の同定を提供する。本開示の方法における使用に適したエフェクター分子としては、表１に特定される例示的なエフェクター分子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0024】

【表1】

【0025】

本開示の方法における使用が企図される抗原ペプチド（例えば、腫瘍抗原ペプチド）としては、独立した抗原をコードする配列の間にプロテアーゼで切断可能なリンカーを含むように改変された抗原ペプチド、同じｍＲＮＡ分子における複数の抗原ペプチド（同じ又は異なる抗原ペプチド）の包含、安定化されたサイトカイン、安定化された受容体分子、増強された分泌される増殖因子、構成的に活性なシグナル伝達ドメイン、ＭＩＴＤ及びｈＣＤ１ｄなどの主要組織適合性複合体Ｉ（すなわち、ＭＨＣ Ｉ）及び／又はＭＨＣ ＩＩ選別配列の包含、ＫＤＥＬなどの小胞体保持配列、分泌シグナル／リーダーペプチド、ＰＡＤＲＥなどのＴヘルパーエピトープ、細胞特異的な非翻訳配列、及び／又は細胞特異的なコドン最適化が挙げられるが、これらに限定されない。これらの分子はいずれも、使用の前に適切な最適化プロセスを行なうことができる。これらの最適化のいずれか又は全ては、本開示の方法における使用のための抗原ペプチドを最適化するために、個別に、又は任意の組み合わせで適用することができる。

【0026】

対象に特異的な（例えば、患者に特異的な）生体材料は、対象の任意の臓器、組織又は細胞源から得ることができると企図される。そのような生体材料の供給源の例は、循環系、例えば全血又は分画血液、リンパ系（例えば、センチネルリンパ節などのリンパ節）、及び疾患組織（例えば腫瘍組織）である。

【0027】

個別化医療の適用において自己のｍＲＮＡにコードされた抗原ペプチドを使用して疾患に対する免疫応答を刺激又は活性化することによって、抗原提示細胞（すなわち、ＡＰＣ）集団のエクスビボでの生成のための面倒な要件を回避するという利益、外因的に導入される増殖因子及びサイトカインの必要性を低減するか、又は場合によっては更に排除する能力、ペプチドの合成及びコンジュゲーションを回避する能力、抗原ペプチドの最適でない提示、Ｔ細胞の最適でない共刺激、及び／又はエフェクター細胞サブタイプの最適でない産生に影響されない方法の実施、免疫抑制、及び／又は場合によっては他の形態の免疫療法に影響を及ぼすＴ細胞の枯渇の問題の低減、又は場合によっては排除という利益が得られる。

【0028】

ここで、本開示の方法に関係する例示的なワークフローの図としての図１（Ａ）を参照して、対象１０１（例えば、ヒト患者）を採取工程１０２に送り、これにより、末梢血白血球、及び対象が腫瘍について治療される場合には腫瘍細胞を採取する生体サンプルを得る。次いで、採取された細胞の部分ゲノム又は完全ゲノムを、配列及び同定工程１０３に送って、変異した、又は過剰発現されたポリヌクレオチド配列を同定する。対象は任意の哺乳動物であってよく、ヒトは一例にすぎないことに留意する。いくつかの例では、サンプルは事前に採取されて提供されてもよく、したがってワークフローは工程１０３から開始されてもよいことに留意する。変異した、及び／又は過剰発現された配列を同定した後、対象に特異的な（例えば、患者に特異的な）ｍＲＮＡライブラリの構築工程１０４が続き、ライブラリはＮＴＸのｍＲＮＡ設計スキャフォールド（足場）を使用して生成される。次いで、ｍＲＮＡライブラリを刺激工程１０５で使用して、本明細書に記載されるように製剤化される、ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクルを用いて対象に特異的な（例えば、患者に特異的な）ＰＢＬを刺激し、ｍＲＮＡを封入する送達ビヒクルを生成するプロセス中に、形成されたｍＲＮＡナノ粒子はまた、送達ビヒクル担持工程１０７のエフェクター分子をコードするｍＲＮＡを封入してもよく、これはまた、ｍＲＮＡナノ粒子担持工程１０７と見なすことができる。対象に特異的な（例えば、患者に特異的な）ＰＢＬを、ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクルで刺激した後、同定工程１０６を行ない、特定のＴ細胞が同定され、部分的又は完全に単離される。

【0029】

図１Ａに示したワークフローは図１Ｂに示すように続き、同定され単離されたＴ細胞は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に対する特異性及び活性を確認する確認工程１１０に送られる。エフェクター分子もまたコードするｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子に曝露されたＰＢＬも含んでもよい、同定され単離されたＴ細胞の収集物は、抗原特異的Ｔ細胞を増殖させる増殖工程１１１に送られる。次いで、増殖させたＴ細胞集団を抗原同定工程１１２に送って、Ｔ細胞の抗原特異性を同定する。抗原特異性が決定されたＴ細胞を、個別化抗原設計工程１１３に送って、特定の対象（例えば、患者）に合わせたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを調製する。増殖させたＴ細胞の集団はまた、Ｔ細胞生成工程１１４に送られ、Ｔ細胞産物を産生し、次いで、それを対象１０１（例えば、患者１０１）への送達に利用することができる。図１（Ａ）～図１（Ｂ）に記載された工程は、同じ人又は異なる人で実施されてもよいことに留意する。

【0030】

図２（Ａ）に、同時の機能特異的ワクチン接種（例えば、がんワクチン接種）及び養子Ｔ細胞産物を生成するための末梢血白血球（ＰＢＬ）採取の例示的ワークフローを示す。腫瘍抗原エピトープを同定し、同定に基づいてｍＲＮＡワクチンを生成する、エピトープ同定及びワクチン生成工程１２０を実施する。次いで、ｍＲＮＡワクチンを投与工程１２６に送り、例えば、がんｍＲＮＡワクチンが対象に投与される。本開示における対象とは、本明細書に記載される治療を必要とする任意の患者を指し得る。同時に、ＰＢＬ採取工程１２５を対象に対して行ない、採取したＰＢＬを、既知のがん抗原をコードするｍＲＮＡを使用して対象のＰＢＬを刺激する刺激工程１２４に送る。次いで、刺激したＰＢＬをＴ細胞同定工程１２３で分析して、Ｔ細胞の特異性及び機能を同定する。次いで、同定された目的のＴ細胞を増殖工程１２２に送って、がん特異的Ｔ細胞を得る。次いで、増殖させたがん特異的Ｔ細胞を養子移入工程１２１で使用して、対象の特異的ながんに対処するように合わせ調製されたがん特異的Ｔ細胞を対象に提供する。

【0031】

図２（Ｂ）では図２（Ａ）に示したフローチャートの代替例を提供する。図２（Ｂ）に、個別のプロトコールを使用して機能特異的（例えば、がん特異的）Ｔ細胞のインビボでの増殖及び誘導を行い、続いて養子Ｔ細胞産物を生成するためのＰＢＬの採取に関係するワークフローを示す。このアプローチを使用して、エピトープ同定及びワクチン生成工程１２０を最初に実施して、対象１０１（例えば、患者１０１）に投与されるがんｍＲＮＡワクチンを得る。次いで、対象１０１がワクチン特異的応答を生じ、ワクチン接種された対象１０１由来のＰＢＬをＰＢＬ採取工程１２５において得る。採取されたＰＢＬを刺激工程１２４に送り、ＰＢＬをｍＲＮＡにコードされたがん抗原によって刺激する。次に、同定及び検証工程１３０を行なって、標的特異的（例えば、がん特異的）Ｔ細胞を同定して特徴付ける。次いで、標的特異的Ｔ細胞を増殖工程１２２に送ってそのような細胞の数を増加させ、次に、増殖させた標的特異的Ｔ細胞を、増殖させた標的特異的（例えば、がん特異的）Ｔ細胞を対象に投与することによる養子移入工程１２１において使用する。本明細書で説明されるワークフローの、全てを含む、任意の部分が自動化され得ることに留意する。例えば、細胞を定期的にサンプリングして、細胞数、生存率、特異性、表現型、又はそれらの任意の組み合わせを決定して、Ｔ細胞療法産物を製造することができる。自動化は、例えば、少なくとも１つのプロセッサ及び必要なハードウェアとアルゴリズムとを伴い得る。

【0032】

以下の開示では、これらの工程が様々な状況において実装され得ることを更に説明する。

【0033】

本明細書では、送達ビヒクル分子（いくつかの例では、略して「送達ビヒクル」と称される）が、インビトロで、一次免疫細胞の混合集団中の生細胞にｍＲＮＡナノ粒子の形態でｍＲＮＡカーゴを効果的に送達することを立証する実験結果を開示する（図４）。データはまた、抗原ペプチドをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた天然に存在するＡＰＣが、従来のペプチド抗原刺激と比較して優れた抗原提示及びＴ細胞の活性化を与えるという驚くべき結果を示している（図５）。抗原ペプチドのｍＲＮＡに基づく提示によって、対象の細胞は発現産物をプロセシングして、個別化された免疫応答を誘発する抗原ペプチドを産生することができる。本開示の方法は抗原の提示を提供し、その後のＴ細胞の活性化を、ＭＨＣ選別配列を含めることによって抗原ペプチドをコードするｍＲＮＡの設計を最適化することによって更に増強できることにも留意する（図６）。これらの方法は、ｍＲＮＡをプロセシング及び翻訳し、発現された抗原ペプチドをプロセシング及び提示した天然に存在するＡＰＣによって活性化されたＴ細胞を利用して、Ｔ細胞を受動的に増殖させて多数にすることができる（図７Ａ）。更に、ｍＲＮＡをプロセシング及び翻訳して、コードされた抗原ペプチドを発現し、プロセシングして提示する天然に存在するＡＰＣによって活性化されたＴ細胞は、同じ抗原を発現する標的細胞をＭＨＣ拘束性の様式で死滅させることができる（図７Ｂ）。更に、ｍＲＮＡによってコードされる抗原ペプチドでは、抗原性物質としてのペプチドの外因性投与と比較して、よりポリクローナルな、したがってより頑健なＴ細胞の応答を生じる。図８（Ａ）～８（Ｂ）に示すように、子宮頚部異形成患者由来のＰＢＭＣにおいて、抗原をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた天然に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、従来のペプチド抗原刺激と比較して、優れた抗原提示及びＴ細胞の活性化を与えた。図８（Ａ）に、抗原チャレンジの後のＣＤ８ Ｔ細胞の活性化のフローサイトメトリーの結果を示し、図８（Ｂ）に、ＭＨＣ提示増強配列を含むＨＰＶ１６抗原のｍＲＮＡをコードする１μｇのｍＲＮＡで処理した培養物における明らかな頑健なＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を示す。結果は、生存率及び細胞数の両方で、ペプチドで処理した細胞よりも優れていることを示した。

【0034】

本開示の材料及び方法の状況におかれると、養子Ｔ細胞療法のための生産的Ｔ細胞産物の生成では、抗原発現のレベル、がん組織に対する特異性、及び特定のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子と関連した抗原の効率的な提示が可能であるかどうか、などの面に注意を払う必要があることに留意する。これらの考慮事項によって、標的の選択が複雑になり、不十分な標的化の効果又はオフターゲット効果などのリスクが生じ得る。Ｔ細胞産物のインビトロでの製造は別の面での困難を増やすことがある。異なるＴ細胞の表現型はインビボで異なる能力を有することが知られているため、Ｔ細胞培養中のサイトカインの選択などの因子が重要であることがある。Ｔ細胞療法の開発に関係する更なる考慮事項には、Ｔ細胞の供給源の選択、抗原提示細胞の供給源の選択、免疫抑制の現象を軽減するか、さもなければ対処するためのアプローチの設計、適切な抗原の選択のために取られるアプローチ、応答性Ｔ細胞を増殖させる際に採用されるプロトコール、Ｔ細胞の治療的に有用な活性化を確実にするためのＴ細胞の十分な共刺激を確保する方法、エフェクター表現型の選択、及びＴ細胞の枯渇の現実の脅威が含まれ得る。

【0035】

抗原の選択
Ｔ細胞養子細胞療法（すなわち、ＡＣＴ）のための標的の抗原ペプチドの選択は、治療の成功の確実な達成にとって重要である。本開示の方法は、少なくとも３つの主要な標的カテゴリー、すなわち、（１）未知の標的を用いた療法、（２）既知の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とする療法、及び（３）１つの個々の腫瘍に特異的なネオアンチゲンを標的とする療法のいずれでの使用にも適しているという点で柔軟である。

【0036】

未知の抗原
未知の抗原を標的とする本開示の方法は一般に、抗腫瘍特異性について富化されたＴ細胞の集団の調達に基づいている。よく知られて広範に研究されている１つは、腫瘍組織に浸潤するＴ細胞の単離を行なう、腫瘍浸潤リンパ球、又はＴＩＬの方法論である。この特異的Ｔ細胞の集団を採取するための基礎は、腫瘍組織における腫瘍特異的Ｔ細胞の富化である。多くの公表された研究において使用される培養プロセスは急速増殖プロトコール（ＲＥＰ）に従い、それには、ＴＩＬを消化された腫瘍組織から単離して増殖させ、インターロイキン２（ＩＬ－２）中で培養してＴＩＬの出発バッチを得る、プレＲＥＰと呼ばれることもある第１の工程が含まれる。続いて、ＲＥＰ培養工程において、ＴＩＬを、照射された同種異系のフィーダー細胞と共にＴＣＲ刺激（モノクローナル抗ＣＤ３）で再刺激する。

【0037】

治療に関して、患者などの対象は、多くの場合、本明細書に記載される抗原提示細胞、最終的には治療用Ｔ細胞産物の調製に使用されるリンパ球を取り出した後に、リンパ球を除去される。場合によっては、リンパ球を除去した患者は、Ｔ細胞産物の注入前に放射線療法を受ける。Ｔ細胞の注入は、多くの場合ＩＬ－２のインビボ投与を伴う。

【0038】

本開示の治療プロトコールはまた、Ｔ細胞の注入前の化学療法と、場合によっては放射線療法とによるリンパ球の除去、及び注入後のインビボＩＬ－２投与を含む。様々な用量レベルのＩＬ－２が企図されるが比較的低い投与量によって、望まない副作用を最小限にする。一例において、リンパ球の除去は、注入されたＴＩＬの恒常性サイトカインへの確実なアクセス、Ｔｒｅｇの減少、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する刺激効果によるＴＩＬなどのＴ細胞の生存及び局在化を改善するために行われる。

【0039】

未知の抗原を標的とする別のアプローチは、腫瘍排出センチネルリンパ節によって自家Ｔ細胞の供給源が提供されるＳｅｎｔｏｃｌｏｎｅ（登録商標）法である。センチネル節は、腫瘍組織と同様に、腫瘍特異的Ｔ細胞が富化されたＴ細胞の集団を有する。単離されたＴ細胞を自家腫瘍のホモジネートで刺激し、インビトロで増殖させ、事前のリンパ球の除去又はアジュバントのＩＬ－２なしで再注入する。

【0040】

腫瘍関連抗原
本開示の方法はまた、ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子と共に使用するために適しており、ｍＲＮＡは腫瘍関連抗原をコードする。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の同定及び標的化は、がん免疫療法のための別の戦略である。一例において、ＴＡＡは、均質であり、高度に安定であり、腫瘍細胞によって特異的に発現され（すなわち、健康な組織には見られない）、多くの患者に存在し、Ｔ細胞によって認識され、その後、Ｔ細胞の細胞傷害性を誘発できることが望ましい。天然に存在するＴＡＡ特異的Ｔ細胞は、患者の血液から供給され、開示される方法の様々な実装形態において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びサイトカインと組み合わせて、既知の腫瘍関連ペプチド抗原（例えば、ＰＲＡＭＥ、ＭＡＧＥＡ４、ＳＳＸ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、及びＮＹ－ＥＳ０－１）を使用して増殖させることができる。

【0041】

ネオアンチゲン
新たに形成された腫瘍特異的抗原はまた、本明細書においてネオアンチゲンとも呼ばれ、対象の身体における非同義変異及び他の異常な遺伝子改変から生じる。ＴＡＡよりもネオアンチゲンを標的とすることの１つの利点は、それらが１つの個々の腫瘍のがん細胞に対して高度に特異的であることである。変異は生殖系列ＤＮＡでは起こらないため、それらは正常組織では見られない。したがって、それらは正常な自己抗原から区別され、Ｔ細胞によって非自己として認識され得る。それらは単一の個々の腫瘍に特異的であり、治療に対する個別化アプローチに適合する。

【0042】

単一の変異に基づくネオアンチゲンによるワクチン接種が陽性の臨床応答の誘発に十分であることが分かっているため、変異の特徴は治療転帰に影響を及ぼす。また、皮膚悪性黒色腫又は非小細胞肺がんなどのネオアンチゲンの担持の高いがんは概して、チェックポイント阻害剤療法に良好に応答し、その療法はまた、がん（例えば、腫瘍）細胞を標的とする自家Ｔ細胞などの治療用Ｔ細胞産物の投与との組み合わせでも企図される。

【0043】

どのネオアンチゲンが陽性の免疫応答を誘発する可能性を有するか、の予測を容易にするためにいくつかの方法が開発されており、これらの方法は、がんのネオアンチゲンなどのネオアンチゲンを標的とする治療用Ｔ細胞産物の開発と組み合わせての使用が企図される。ＣＯＳＭＩＣ又はＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｒａｓなどの主要なデータベースを使用して発見された変異は、それらの多くががんドライバー変異であり、本開示の方法においてネオアンチゲンとしての使用が企図される。しかしながら、ネオアンチゲンに基づく免疫療法のために、ドライバー変異に焦点を当てる利点はよくわかっていない。ＨＬＡクラスＩ分子及びＨＬＡクラスＩＩ分子の両方への結合についての変異ランドスケープの最近のコンピュータ解析は、ドライバー変異がランダムな変異よりも全体的に低い親和性を有することを示している。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）もまた、個々の患者についてのネオアンチゲンの系統的かつ個別化された予測を通してネオアンチゲンを同定するためのツールとして企図される。ネオアンチゲンの予測のためのＮＧＳは、選択された組織のタンパク質をコードするゲノム中の全ての既知のＤＮＡ配列（全エクソーム配列決定、ＷＥＳ）又は現在利用可能なＲＮＡ転写物（トランスクリプトーム配列決定、ＲＮＡ－ｓｅｑ）のいずれかの大規模並列配列決定（大規模並列シーケンシング）に基づく。ネオアンチゲンを同定するためにＮＧＳを使用する取り組みでは、ｐＶＡＣ－Ｓｅｑ、ＭｕＰｅＸＩ、ＴＩＭｉｎｅｒ、及びＯｐｅｎＶａｘを含む利用可能なネオアンチゲン予測パイプラインが役立っている。ほとんどのネオアンチゲン予測パイプラインは、腫瘍ＲＮＡについてのＲＮＡ－ｓｅｑと組み合わされた正常及び腫瘍ＤＮＡについてのＷＥＳに依存しており、ＷＥＳは慣例的に、腫瘍ＤＮＡにおいてのみ見られる変異を同定するために使用され、ＲＮＡ－ｓｅｑは、対応するｍＲＮＡ転写物の発現を検証するために使用される。発現に加えて、ＲＮＡ－ｓｅｑはまた、選択的スプライシング変異体又は転写エラーなどの、ＷＥＳによって可視化されない更なる情報を明らかにする。

【0044】

ネオアンチゲンの同定における次の工程は、個々の患者由来の対応するＨＬＡ分子への推定されるエピトープ候補の結合を予測することを含んでもよい。ＮｅｔＭＨＣシリーズ（バージョン４．０）は、クラスＩ ＨＬＡ対立遺伝子にわたるペプチドの結合の予測に役立つ。しかしながら、いくつかの研究は、ＨＬＡ分子上に提示されると予測されるペプチドの実際の数が５％未満であり得ることを示している。ＨＬＡクラスＩＩ複合体上の抗原提示は、がんなどの疾患のネオアンチゲンに基づくＴ細胞療法に焦点を当てた本明細書に開示される方法が企図される。ＨＬＡクラスＩＩ複合体上に提示されたネオアンチゲンは、ＨＬＡクラスＩ複合体上の提示と同様に、腫瘍エピトープの認識及び抗腫瘍活性を促進する。したがって、クラスＩＩ分子及びクラスＩ分子は、本開示の方法において使用するためのネオアンチゲンの予測に含まれる。更に別のアプローチは、ペプチドのプロテアソームに誘導されるスプライス変異体を調べることである。これらのネオアンチゲンは、スプライシングが翻訳後に生じるため、元のペプチド鎖とはアラインしない。

【0045】

従来の予測パイプラインに関連する障害を克服するために、ネオアンチゲンペプチドの適合性といくつかのデータセットからの臨床応答に関する結果とを相関させる機械学習アルゴリズムを同時に使用して、ネオアンチゲン予測を改善することができる。Ｎｅｏｐｅｐｓｅｅ機械学習プラットフォームを使用して、感受性及び特異性を改善することができる。

【0046】

ネオアンチゲンは、自家腫瘍特異的クローンを刺激及び／若しくは選択するために、又は腫瘍特異的ＴＣＲの産生のための鋳型としてのいずれかで、Ｔ細胞ＡＣＴ戦略に使用することができる。ネオアンチゲンの概念は、センチネル節ベースのＴ細胞ＡＣＴに適用可能であるとして企図される。そのような実装形態において、ネオアンチゲンペプチドをリンパ節細胞の培養に添加される常磁性ビーズに結合させ、リンパ節由来のＡＰＣにネオアンチゲンをプロセシングさせ、それらをＴ細胞に提示させて、特異的な増殖を引き起こす。ネオアンチゲン反応性Ｔ細胞のクローンを同定し、それらのＴＣＲを配列決定して、本開示によるＴＣＲトランスジェニック療法に使用する。本開示の方法のいくつかの実装形態において、自家ＴＩＬは数が少ししかなく、機能的に抑制されている場合が多いことから、患者の腫瘍組織から同定されたネオアンチゲンを使用して、反応性クローンについて健常ドナーのＴ細胞をスクリーニングする。次いで、同定されたネオアンチゲン特異的ＴＣＲを、所望のＴ細胞の集団へのトランスジェニック移入のために使用する。本開示の方法の他の実装形態は、ＰＤ－１並びに／又は活性化マーカーＯＸ４０及び４－１ＢＢを発現する（したがって、腫瘍反応性である可能性が高い）ＴＩＬをフローサイトメトリーによって選別し、培養し、ネオアンチゲンペプチドでパルスされたＡＰＣと共培養する、ＴＩＬ療法を伴う。上記の方法と同様に、応答するクローンをＴＣＲ配列決定によって解析して、ＴＣＲ鋳型を得る。

【0047】

インビボでのＴ細胞の応答の誘導は、腫瘍特異的抗原を提示するプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特に樹状細胞（ＤＣ）との相互作用に高度に依存する。本開示の方法は、抗原ペプチドをコードするｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子を、治療を必要とする対象にバイアスなしで投与するため、そのようなインビボでの適用によく適している。したがって、プロフェッショナルＡＰＣは、免疫応答を刺激する適切な提示形態で抗原ペプチドを生じるｍＲＮＡナノ粒子を形成する際にｍＲＮＡを封入する送達ビヒクル分子の取り込みにおいて不利にはならない。実際、天然のＡＰＣ、特にＤＣは、腫瘍抗原特異的ナイーブＴ細胞の効率的な活性化及び増殖を誘導するよう十分に態勢が整い、それにより、特異的抗原を提示するがん細胞を死滅させることができるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含むＴ細胞の大集団を誘導することができる。いくつかの例において、がん治療における天然のＡＰＣの使用は、有害副作用が軽微である有益な臨床転帰と関連しており、能動免疫療法の有望性が強調される。

【0048】

ＤＣなどの天然のＡＰＣの従来の使用から、いくつかの制限が明らかにされている。腫瘍微小環境における免疫抑制因子の有害な効果と最適な抗原負荷ＤＣの知識の欠如とが合わさると、臨床試験において観察される様々な結果の原因となることがある。更に、いくつかの例において、自家ＤＣの単離及びエクスビボでの刺激は、時間がかかり、高価である場合があり、またエクスビボで生成されたＤＣの質は変動し得る。本開示の方法は、ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子の送達に依存し、ｍＲＮＡは、対象自身の天然に存在するＡＰＣがｍＲＮＡをプロセシングし、タンパク質を発現して対象自身のＴ細胞を活性化する抗原ペプチドを提示させる、抗原ペプチドをコードし、それによってがんなどの疾患を治療する。

【0049】

ｍＲＮＡの構造
本開示の抗原ペプチドは、少なくとも、対象の免疫系による認識のために抗原ペプチドを提示することができる白血球などの少なくとも１つの細胞型においてｍＲＮＡの発現を可能にするための十分な発現制御配列と共に、抗原の構造に関与するペプチドの部分のコード領域を含むｍＲＮＡにコードされる。したがって、本開示のｍＲＮＡは、少なくとも、抗原ペプチドのコード領域、リボソーム結合部位（例えば、コザック配列）、及び終止コドンを有してもよい。本開示のｍＲＮＡはまた、少なくとも１つの、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲなどの非翻訳領域（すなわち、ＵＴＲ）を含有してもよい。いくつかの実装形態において、ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを有する。更に、本開示のｍＲＮＡは、腫瘍浸潤Ｔリンパ球（すなわち、ＴＩＬ）などのＴ細胞のリプログラミング及び増殖のためのエフェクター分子をコードしていてもよい。また、本開示のｍＲＮＡは、ＭＨＣ提示増強配列を更にコードしていてもよい。より広くは、本明細書に記載されるエフェクターのコード領域の１つ以上が、本開示のｍＲＮＡに含まれていてもよい。また、本明細書の他の箇所に記載されるように、本開示のｍＲＮＡナノ粒子は、１つ以上の抗原ペプチドをコードするｍＲＮＡ及び１つ以上のエフェクター分子をコードする別のｍＲＮＡなどの、２つ以上のタイプのｍＲＮＡを、単独で、又は抗原ペプチドの少なくとも１つのコード領域と組み合わせて含有してもよい。いくつかの例では、本開示のｍＲＮＡは、発現可能な抗原ペプチドをコードする最小のサイズよりも大きくてもよく、追加のＲＮＡ配列は、抗原ペプチドを発現及び提示するプロセスにおいて対象の白血球によるｍＲＮＡの細胞内プロセシングを促進する。

【0050】

ｍＲＮＡナノ粒子
本明細書に開示される送達ビヒクル分子は、ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する。本開示のｍＲＮＡナノ粒子のナノ粒子成分は、例えば６０～１５０ナノメートルの範囲の概ね１～３００ナノメートルの大きさを有する物質の小粒子であり、それは１～１，０００μｍの大きさである微細粒子の典型的なサイズよりも小さい。ｍＲＮＡナノ粒子は、有機物（例えば、リポソーム）、無機物（例えば、金、銀、又は白金）、又は中空のいずれであってもよい。概して、企図されるｍＲＮＡナノ粒子は、エクスビボ（例えば、インビトロ）又はインビボのいずれかで、対象の細胞にｍＲＮＡを送達する能力を有する任意の化合物又は物質を含む。本開示のｍＲＮＡナノ粒子において見られる適切な化合物又は組成物としては、限定はされないが、リポソーム粒子、ポリマーベースの粒子（例えば、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）粒子）、インシュレーター粒子組成物、及びデンドリマー（有機対無機）が挙げられ、これらはいずれも、本開示に従って、その中にｍＲＮＡを含むことができる。

【0051】

ワクチンカセット
ワクチンは、抗体の産生を刺激し、１つ又はいくつかの疾患に対する免疫を提供するために使用される物質であり、疾患の原因因子、その産物、又は合成代替物から調製される。本明細書では、ワクチン組成物の生成のための新規な構築物及びスキャフォールドを開示する。これらのワクチン組成物は抗原ペイロードを担持又は運搬するスキャフォールドを含む。ワクチンスキャフォールドと抗原ペイロードとの組み合わせはワクチンカセットと呼ばれる。本明細書で使用される場合、「ワクチンカセット」とは、ワクチンとして集合的に機能するワクチンスキャフォールドと抗原ペイロードとをコードするポリヌクレオチド（又はそのコードされたポリペプチド）である。ワクチンカセットは、直接投与するように構成されてもよく、又は細胞における発現のために１つ以上のポリヌクレオチドにコードされるように構成されてもよく、投与のためにＤＮＡ、ＲＮＡ又はｍＲＮＡにコードされてもよい。

【0052】

ワクチンスキャフォールド
本開示のワクチンスキャフォールドは、１つ以上の親ポリペプチド（例えば、受容体分子）の１つ以上の領域に由来してもよい。このような親分子としては、限定されないが、受容体又はタンパク質の、ＣＤ１、ＬＤＬＲ、ＬＤＬＲＰ及び／又はＬＲＰ１ファミリーを挙げることができる。本開示は、ｍＲＮＡカーゴが送達ビヒクル分子で封入されてｍＲＮＡナノ粒子を形成する実装形態を企図する。送達ビヒクル分子は、ｍＲＮＡカーゴに広用途で有効な送達ビヒクルを提供するために、ペプトイド系脂質材料を含んでもよく、これについては以下で更に説明する。

【0053】

いくつかの実装形態において、親分子は受容体のＣＤ１糖タンパク質ファミリーから選択される。ＣＤ１タンパク質は、ヒト１番染色体上の遺伝子座にコードされている。この領域は、５つのＣＤ１アイソフォーム（ＣＤ１ａ～ｅ）をコードしている。これらのタンパク質は、ＣＤ１ｅを除いて、細胞表面で発現されて抗原提示分子として機能し、ＣＤ１ｅは細胞内でのみ発現され、他のヒトＣＤ１アイソフォームによる提示のための脂質のプロセシング及び編集に関与する。ＣＤ１アイソマーは、カルネキシン、カルレティキュリン、更にはＢ２Ｍなどの様々なシャペロンと会合することによって、細胞の周囲を移動する。新たに合成された結合していないＣＤ１のアイソマーは、ＥＲ及びゴルジから原形質膜に出て、続いて内在化して、アダプタータンパク質複合体２及び３とのそれらの結合を可能にするチロシンベースの選別モチーフを介して様々なコンパートメントに進入し、これにより、様々なエンドソームコンパートメント（初期エンドソーム、リサイクリングエンドソーム、後期エンドソーム）及びリソソームへの進入が促進され、最終的にＭＨＣ Ｉ分子の輸送経路と同様の輸送経路をたどる。更に、ＣＤ１アイソマーは、これらのエンドソームコンパートメントを介して移動して抗原を担持し、多くの場合、ＣＤ１並びにＭＨＣ Ｉ及びＭＨＣ ＩＩ分子は同じコンパートメント内で検出される。

【0054】

本開示によれば、ワクチンスキャフォールドは以下の式を有する：
５’ＵＴＲ－［［Ｓｉｇｎａｌ／Ｌｅａｄｅｒ］－［（Ａｎ１）ｎ－Ｘｏ－（Ａｎ２）ｐ］－［ＴＭＤ］－［ＣＹＤ］］－３’ＵＴＲ－ＰｏｌｙＡ
式中、「ＵＴＲ」は、標準的なｍＲＮＡ構築物の５’及び３’末端に位置する非翻訳領域であり、「ＰｏｌｙＡ」は、ｍＲＮＡのポリアデニル化部位を指し、［Ｓｉｇｎａｌ／Ｌｅａｄｅｒ］は、抗原ペイロード領域のフレーム内、及びその上流に位置する任意のシグナル又はリーダー又は選別配列を指し、
［（Ａｎ１）ｎ－Ｘｏ－（Ａｎ２）ｐ］は、「ｎ」回複製され得る第１の抗原ペイロード（Ａｎ１）と、任意で存在しなくてもよく、若しくは「ｏ」回繰り返されてもよいスペーサー又はリンカー領域（Ｘ）と、任意で、存在する場合に「ｐ」回繰り返されてもよい第２の抗原ペイロード（Ａｎ２）と、を含む任意の抗原ペイロード領域を指し、ＴＭＤは、１つ以上のＣＤＩ、ＬＤＬＲ、ＬＤＬＲＰ及び／又はＬＲＰ１タンパク質由来の膜貫通領域の全部又は一部分を指し、また
ＣＹＤは、１つ以上のＣＤＩ、ＬＤＬＲ、ＬＤＬＲＰ及び／又はＬＲＰ１タンパク質由来の細胞質領域の全部又は一部分を指す。

【0055】

いくつかの実装形態において、本開示のワクチンスキャフォールドは、エンドソーム及び／又はリソソームコンパートメントへの抗原のルーティングを促進するための、ＣＤ１、ＬＤＬＲ、ＬＤＬＲＰ及び／又はＬＲＰ１アイソマーのシグナル配列及び／又は細胞質選別シグナルの１つ以上を含み、最終的にＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子のプロセシング及び担持を可能にする。

【0056】

いくつかの実装形態において、シグナル配列は、ヒトＣＤ１ａ（ＭＬＦＬＬＬＰＬＬＡＶＬＰＧＤＧ；配列番号１）、ヒトＣＤ１ｂ（ＭＬＬＬＰＦＱＬＬＡＶＬＦＰＧＧＮ；配列番号２）、ヒトＣＤ１ｃ（ＭＬＦＬＱＦＬＬＬＡＬＬＬＰＧＧＤ；配列番号３）、ヒトＣＤ１ｄ（ＭＧＣＬＬＦＬＬＬＷＡＬＬＱＡＷＧＳＡ；配列番号４）、ヒトＣＤ１ｅ（ＭＬＬＬＦＬＬＦＥＧＬＣＣＰＧＥＮＴＡ；配列番号５）、ヒトＬＤＬＲ（ＭＧＰＷＧＷＫＬＲＷＴＶＡＬＬＬＡＡＡＧＴ；配列番号６）、又はヒトＬＲＰ１（ＭＬＴＰＰＬＬＬＬＬＰＬＬＳＡＬＶＡＡ；配列番号７）から選択される。本開示によれば、シグナル配列は任意のタンパク質に由来することができる。シグナル配列は、４～５０アミノ酸の範囲であってよく、キメラ、タンデム、繰り返し又は逆位であってもよい。シグナル配列は、シグナル伝達機能が実質的に保持される限り、本明細書に教示されるもの、又は本明細書に教示されるものと少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５若しくは９９％同一である任意のシグナル配列を含むことができる。

【0057】

いくつかの実装形態において、膜貫通ドメイン配列は、ヒトＣＤ１ａ（ＧＦＩＩＬＡＶＩＶＰＬＬＬＬＩＧＬＡＬＷ；配列番号８）、ヒトＣＤ１ｂ（ＩＶＬＡＩＩＶＰＳＬＬＬＬＬＣＬＡＬＷＹＭ；配列番号９）、ヒトＣＤ１ｃ（ＮＷＩＡＬＶＶＩＶＰＬＶＩＬＩＶＬＶＬＷＦ；配列番号１０）、ヒトＣＤ１ｄ（ＭＧＬＩＡＬＡＶＬＡＣＬＬＦＬＬＩＶＧＦＴ；配列番号１１）、ヒトＣＤ１ｅ（ＳＩＦＬＩＬＩＣＬＴＶＩＶＴＬＶＩＬＶＶＶ；配列番号１２）、ヒトＬＤＬＲ（ＡＬＳＩＶＬＰＩＶＬＬＶＦＬＣＬＧＶＦＬＬＷ；配列番号１３）、又はヒトＬＲＰ１（ＨＩＡＳＩＬＩＰＬＬＬＬＬＬＬＶＬＶＡＧＶＶＦＷＹ；配列番号１４）から選択される。本開示では、膜貫通ドメイン配列は、任意のタンパク質に由来することができる。膜貫通配列は、１０～１００アミノ酸の範囲であってよく、キメラ、タンデム、繰り返し又は逆位であってもよい。膜貫通配列は、機能が実質的に保持される限り、本明細書において教示されるもの、又は本明細書において教示されるものと少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５若しくは９９％同一である任意の膜貫通配列を含むことができる。

【0058】

いくつかの実装形態において、細胞質ドメイン配列は、ヒトＣＤ１ａ（ＲＫＲＣＦＣ；配列番号１５）、ヒトＣＤ１ｂ（ＲＲＲＳＹＱＮＩＰ；配列番号１６）、ヒトＣＤ１ｃ（ＫＫＨＣＳＹＱＤＩＬ；配列番号１７）、ヒトＣＤ１ｄ（ＳＲＦＫＲＱＴＳＹＱＧＶＬ；配列番号１８）、ヒトＣＤ１ｅ（ＤＳＲＬＫＫＱＳＳＮＫＮＩＬＳＰＨＴＰＳＰＶＦＬＭＧＡＮＴＱＤＴＫＮＳＲＨＱＦＣＬＡＱＶＳＷＩＫＮＲＶＬＫＫＷＫＴＲＬＮＱＬＷ；配列番号１９）、ヒトＬＤＬＲ（ＫＮＷＲＬＫＮＩＮＳＩＮＦＤＮＰＶＹＱＫＴＴＥＤＥＶＨＩＣＨＮＱＤＧＹＳＹＰＳＲＱＭＶＳＬＥＤＤＶＡ；配列番号２０）、及びヒトＬＲＰ１（ＫＲＲＶＱＧＡＫＧＦＱＨＱＲＭＴＮＧＡＭＮＶＥＩＧＮＰＴＹＫＭＹＥＧＧＥＰＤＤＶＧＧＬＬＤＡＤＦＡＬＤＰＤＫＰＴＮＦＴＮＰＶＹＡＴＬＹＭＧＧＨＧＳＲＨＳＬＡＳＴＤＥＫＲＥＬＬＧＲＧＰＥＤＥＩＧＤＰＬＡ；配列番号：２１）から選択される。本開示では、細胞質ドメイン配列は、任意のタンパク質に由来することができる。細胞質配列は、１０～１００アミノ酸の範囲であってよく、キメラ、タンデム、繰り返し又は逆位であってもよい。細胞質配列は、機能が実質的に保持される限り、本明細書で教示されるもの、又は本明細書で教示されるものと少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５若しくは９９％同一である任意の細胞質配列を含むことができる。

【0059】

ＣＤ１ｅの配列構造はまた、エンドソームコンパートメントにおいてプロセシングされて膜の結合に関与するＮ末端プロペプチド配列（ＡＰＱＡＬＱＳＹＨＬＡＡ；配列番号２２）を含有すること、他方、それがない場合に可溶性分子を生じることに留意する。

【0060】

上記で参照した親受容体分子の各々について、ＮＣＢＩの参照を表２に示す。

【0061】

【表2】

【0062】

抗原ペイロード
本開示のワクチンスキャフォールドは、抗原ポリペプチド又は抗原ペプチドをコードするｍＲＮＡなどの少なくとも１つの抗原ペイロードで担持され得るか、又はその中に組み込まれ得るように操作される。抗原ペイロードをワクチンスキャフォールドと組み合わせると、構築物をワクチンカセットと称することができる。

【0063】

抗原ポリペプチド又は抗原ペプチドをコードするｍＲＮＡを含む１つ以上の抗原ペイロードを含む医薬組成物、例えば本開示のワクチンを用いて、免疫応答が望まれる様々な疾患及び／又は症状を治療することができる。このような疾患としては、がん、自己免疫疾患及び炎症が挙げられる。

【0064】

ｍＲＮＡナノ粒子化合物及び組成物
本開示は、構造脂質、リン脂質、及び遮蔽脂質などの更なる脂質成分と組み合わせた脂質化カチオン性ペプチド化合物の複合体を含む多成分脂質組成物、例えば多成分脂質ナノ粒子を含む、ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子を提供する。多成分脂質組成物及び複合体は、リピトイドとして知られるカチオン性ペプチド－リン脂質コンジュゲート、又はカチオン性ペプチド化合物として脂質部分及び／又は（オリゴ及び／又はポリ）エチレングリコール部分でＮ置換されたＮ－置換カチオン性ペプチド化合物（本明細書において、三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と称される）を含んでもよい。

【0065】

送達ビヒクルのリピトイド並びに／又は三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む多成分脂質組成物は、他の市販の脂質ナノ粒子製剤（例えば、市販のキットに見られる製剤）又は単独の薬剤で観察される効率を超える、封入されたｍＲＮＡの細胞への高度に効率的な送達を示す。興味深いことに、本開示の脂質組成物を有する送達ビヒクルは、構造脂質を含めずに、ｍＲＮＡの十分な送達を実現した。

【0066】

本開示は複合体を含む組成物を提供し、複合体は１つ以上のポリアニオン性化合物及び３つ以上の脂質成分を含む。前述のいくつかの実装形態において、複合体は、１つ以上のポリアニオン性化合物、１つ以上の脂質化カチオン性ペプチド化合物、及び２つ以上の他の脂質成分を含む。

【0067】

１つ以上のポリアニオン性化合物及び／又は非アニオン性化合物とともに１つ以上の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む組成物及び複合体が更に、２つ以上の脂質成分（例えば、本明細書に記載されるリン脂質、構造脂質、及び／又は遮蔽脂質）を含むいくつかの実装形態において、組成物は脂質製剤として記載され得る。組成物が２つ以上の脂質成分を含む特定の実装形態において、脂質組成物は、多成分脂質製剤として記載され得る。複合体が脂質化カチオン性ペプチド化合物、ポリアニオン性化合物、リン脂質、構造脂質、及び遮蔽脂質を含む特定の実装形態において、組成物は、本開示による少なくとも１つのｍＲＮＡを封入する送達ビヒクルから形成された脂質ナノ粒子を含む。組成物が、本開示による少なくとも１つのｍＲＮＡを封入する送達ビヒクルから形成された脂質ナノ粒子複合体を含む更に別の実装形態において、組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物として特徴付けられる。

【0068】

いくつかの実装形態において、本開示の組成物は１つ以上のポリアニオン性化合物と脂質成分との複合体を含み、脂質成分は任意で１つ以上の構造脂質、１つ以上のリン脂質、１つ以上の遮蔽脂質、及び１つ以上の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む。いくつかの実装形態において、本開示の組成物は、１つ以上のポリアニオン性化合物と脂質成分との複合体を含み、脂質成分は１つ以上のリン脂質、１つ以上の遮蔽脂質、及び１つ以上の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む。他の実装形態において、組成物は１つ以上のポリアニオン性化合物と脂質成分との複合体を含み、脂質成分は１つ以上の構造脂質、１つ以上のリン脂質、１つ以上の遮蔽脂質、及び１つ以上の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む。

【0069】

本開示の組成物は複合体を含み、複合体は１つ以上のポリアニオン性化合物と脂質成分とを含み、脂質成分は任意で１つ以上の構造脂質と、１つ以上のリン脂質と、１つ以上の遮蔽脂質と、１つ以上の脂質化カチオン性ペプチド化合物とを含む。

【0070】

それらの正電荷によって、複合体及び組成物中の脂質化カチオン性ペプチド化合物は、ポリアニオン性カーゴ上の負電荷と釣り合った複合体を形成し、ひいては、標的細胞へのカーゴの取り込みを促進するすることができる。本明細書に記載の脂質化カチオン性ペプチド化合物は、正味でゼロの電荷又は正味の正電荷を有する。複合体又は組成物が１つ以上のカチオン性化合物を含むいくつかの実装形態において、１つ以上のカチオン性化合物は独立して、正味でゼロの電荷又は正味の正電荷を有する。特定の実装形態において、１つ以上の脂質化カチオン性ペプチド化合物は独立して、少なくとも＋１の正味の正電荷を有する。１つ以上のカチオン性化合物上に存在する正味の電荷は、環境条件に応じて変化し得ることを認識されたい。例えば、いくつかの実装形態において、１つ以上のカチオン性化合物は独立して、生理学的に適切なｐＨの範囲で安定な正味の正電荷を有する。例えば、生理学的ｐＨは少なくとも約５．５、典型的には少なくとも約６．０である。より典型的には、生理学的ｐＨは少なくとも約６．５である。通常、生理学的ｐＨは約８．５未満、典型的には約８．０未満である。より典型的には、生理学的ｐＨは約７．５未満である。

【0071】

本明細書において提供される組成物に利用される脂質化カチオン性ペプチド化合物は、リピトイドとしても知られるカチオン性ペプトイド－リン脂質コンジュゲート構築物、又は本明細書において三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と称される、ペプチド骨格全体にわたって脂質部分及び／若しくは（オリゴ及び／若しくはポリ）エチレングリコール部分を有するＮ－置換カチオン性ペプチド化合物を含むことができる。いくつかの実装形態において、本開示の組成物は、１つ以上の三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む複合体を含む。他の実装形態において、組成物は１つ以上のリピトイドを含む複合体を含む。更に別の実装形態において、組成物は１つ以上の三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物、１つ以上のリピトイド、又はそれらの任意の組み合わせを含む複合体を含む。

【0072】

いくつかの実装形態において、本開示の複合体及び組成物は、１つ以上の三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む。三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－置換アミノ酸残基を含むペプチド鎖である。本開示の三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物はオリゴペプチド骨格を含み、オリゴペプチド骨格はＮ置換された中性（「スペーサー」）及び／又は脂質アミノ酸残基が任意で挟まれた、Ｎ－置換カチオン性アミノ酸残基の繰り返しサブユニットを含む。オリゴペプチド骨格は更に、脂質部分でＮ－置換された（「Ｎ－脂質化」）、並びに／又はオリゴエチレングリコール及び／若しくはポリエチレングリコールでＮ－置換された（「Ｎ－ＰＥＧ化」）アミノ酸残基によって、Ｎ末端及び／又はＣ末端で更にキャッピングされる。

【0073】

いくつかの実装形態において、三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、ペプチド化合物中に存在するアミノ酸残基の総数によって特徴付けてもよく、各アミノ酸残基は一般構造－（ＮＲ－ＣＲａＲｂ－Ｃ（Ｏ））－によって表される。いくつかの実装形態において、アミノ酸残基の総数は、２～４０アミノ酸残基、２～３０アミノ酸残基、３～２５アミノ酸残基、５～２０アミノ酸残基、又は７～１５アミノ酸残基である。特定の実装形態において、三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は５～２０アミノ酸残基を含む。

【0074】

他の実装形態において、三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は正味でゼロの電荷又は正味の正電荷を有する。三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が三級アミノ脂質化カチオン性ペプチド化合物である特定の実装形態において、三級アミノ脂質化カチオン性ペプチド化合物は少なくとも＋１の正味の正電荷を有する。三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が、三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又は三級アミノ脂質化及びＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である他の実装形態において、カチオン性ペプチド化合物は、正味でゼロの電荷を有する（すなわち、電荷的に中性である）か、又は正味の正電荷を有する。三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又は三級アミノ脂質化及びＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であるいくつかの実装形態において、カチオン性ペプチド化合物は＋１の正味の正電荷を有する。特定の実装形態において、三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は（ｒｘｐ）＋の正味の正電荷を有する。

【0075】

三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、ｍＲＮＡなどのポリアニオン性化合物との複合体化、及びそのようなポリアニオン性化合物の細胞への送達に有用であり得る。本開示の三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－置換中性スペーサーアミノ酸残基及び／又はＮ－脂質化アミノ酸残基が任意で挟まれた、Ｎ－置換カチオン性アミノ酸残基の繰り返しサブユニットのオリゴペプチド骨格を含む。

【0076】

オリゴペプチド骨格の繰り返しサブユニット中のカチオン性アミノ酸残基は、本開示の化合物に正電荷を付与し、それにより、ｍＲＮＡのようなポリアニオン性種との好ましい静電相互作用及びその電荷の中和が可能になる。カチオン性残基中に、またその間に中性又は脂質化アミノ酸残基を挟み込むことによって、三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の全体にわたる正電荷の空間分布をより高度に制御することができ、それにより、カチオン性ペプチド化合物と、特定の長さ、電荷分布及び／又は立体構造を有するポリアニオン性種との複合体形成を改善することができる。

【0077】

本開示の三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の各繰り返しサブユニットは、少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基を含む。カチオン性アミノ酸残基は正電荷を提供し、それにより、核酸又はポリアニオン性化合物上の負電荷との相互作用によって、本明細書に記載されるペプチド化合物が核酸又は他のポリアニオン性化合物と静電複合体を形成できる。核酸の複合体形成は、核酸の負電荷を部分的又は完全に遮蔽し、細胞の脂質膜を通る細胞内部への輸送を容易にする。

【0078】

本明細書に記載される三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、オリゴペプチド骨格に沿って互いに近接した複数のカチオン性部分を含むことができる。複数のカチオン性部分がオリゴペプチド骨格に沿って存在する場合、特定のカチオン性部分のプロトン化又は脱プロトン化の状態は、近接した他のカチオン性部分のｐＫａ値に影響を及ぼし得る。

【0079】

カチオン性、又は正に荷電した部分としては、例えば、以下の官能基、すなわち、アミノ、グアニジノ、ヒドラジド、及びアミジノを含有するものなどの窒素系置換基を挙げることができる。これらの官能基は、芳香族、飽和環式、又は脂肪族のいずれであってもよい。

【0080】

三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のオリゴペプチド骨格内において、カチオン性アミノ酸残基は、Ｎ位に中性スペーサー部分を有する中性スペーサーアミノ酸残基で任意で挟まれていてもよい。中性アミノ酸残基は、カチオン性ペプチド化合物と複合体化されるポリヌクレオチドを含むポリアニオン性化合物との静電相互作用の改善のために、三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物における正電荷の空間分布を調節するために有用であり得る。中性スペーサー部分は、生理学的に適切なｐＨの範囲で中性である、又はゼロの正味電荷を有する任意の置換基を含むことができる。

【0081】

三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のオリゴペプチド骨格内のカチオン性アミノ酸残基で中性アミノ酸残基を任意で挟み込むことに加えて、Ｎ位に脂質部分を有するＮ－脂質化アミノ酸残基もまた、カチオン性（及び任意で中性スペーサー）アミノ酸残基に任意で挟み込むことができる。三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物がＮ－脂質化アミノ酸残基を含むいくつかの実装形態において、三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物はＮ－脂質化されている。中性アミノ酸残基と同様に、オリゴペプチド骨格内のＮ－脂質化アミノ酸残基は、三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物における正電荷の空間分布を調節するために、並びにポリアニオン性材料の封入及び細胞内送達の改善のためにそれらの親油性を増大させるために有用であり得る。ペプトイド骨格に沿った脂質の間隔はまた、細胞の取り込み及びエンドソーム放出に影響することが知られている脂質の流動性／結晶化度にも影響を及ぼし得る。好適な脂質部分としては、例えば、任意で置換された分岐鎖若しくは直鎖脂肪族部分、又は、脂肪酸、ステロール、及びイソプレノイドを含む天然の脂質化合物に由来する任意で置換された部分を挙げることができる。

【0082】

いくつかの実装形態において、脂質部分は、約６～約５０個の炭素原子又は約１０～約５０個の炭素原子を有し、任意で１つ以上のヘテロ原子を含み、また任意で１つ以上の二重又は三重結合を含む（すなわち、飽和又はモノ若しくはポリ不飽和の）分岐鎖又は直鎖脂肪族部分を含んでもよい。特定の実装形態において、脂質部分は、任意で置換された脂肪族の直鎖又は分岐鎖部分を含んでもよく、各疎水性の尾部は独立して、約８～約３０個の炭素原子又は約６～約３０個の炭素原子を有する。特定の実装形態において、脂質部分としては、例えば、脂肪酸、脂肪アルコール、リン脂質、グリセリド（ジ又はトリグリセリドなど）、グリコシルグリセリド、スフィンゴ脂質、セラミド、並びに飽和及び不飽和ステロール、またイソプレノイドに由来する脂肪族炭素鎖を挙げることができる。他の適切な脂質部分としては、任意で置換されたアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、又はアリールアルキル部分などの親油性炭素環式基又は芳香族基を挙げることができ、それらとしては例えば、ナフタレニル又はエチルベンジル、又はエステル官能基を含む脂質、例えばステロールエステル及びワックスエステルが挙げられる。

【0083】

本開示の三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、脂質部分でＮ－置換された（「Ｎ－脂質化」）、並びに／又はオリゴエチレングリコール及び／若しくはポリエチレングリコールでＮ－置換された（「Ｎ－ＰＥＧ化」）アミノ酸残基で、そのＮ末端及び／又はＣ末端がキャッピングされたオリゴペプチド骨格を含む。本明細書に記載されるカチオン性ペプチド化合物のＮ及び／又はＣ末端におけるＮ－脂質化アミノ酸残基の組み込みによって、化合物の親油性が増大する。カチオン性ペプチド化合物の親油性の増大によって、細胞膜の脂質二重層などの疎水性環境に対するそれらの親和性が高くなり、したがって、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物、並びにポリアニオン性化合物とのそれらの任意の複合体の、細胞内に輸送される傾向が増大する。

【0084】

本開示の三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－脂質化及び／又はＮ－ＰＥＧ化されたアミノ酸残基を含み得る。本明細書で提供されるカチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－脂質化又はＮ－ＰＥＧ化された少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。本開示の三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物はまた、Ｎ末端及びＣ末端がそれぞれ遊離アミンの形態及び遊離酸の形態で提供されてもよい。

【0085】

特定の実装形態において、複合体又は組成物は、カチオンリッチな１つ以上の三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、高度に脂質化された、及び／又は少なくとも１つのＰＥＧ部分を含有する１つ以上の三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物との組み合わせを含み得る。理論的には、このような組み合わせは、（脂質化ペプチド化合物による）より大きな親油性の遮蔽とともに、（カチオンリッチペプチド化合物を介した）より大きな電荷の安定化を提供することによって、ポリアニオン性化合物の送達の改善を与えることができる。更に、個々の三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の各々の個々の量は、所望の特性を得るために調整できることを認識されたい。

【0086】

三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチドは、固相合成法及び液相合成法のいずれか又は両方を用いて、ペプチド鎖中のＮ－置換残基を生成するための当分野で公知の方法によって完全に合成することができる。

【0087】

いくつかの実装形態において、本明細書に記載される複合体及び組成物の１つ以上の脂質化カチオン性ペプチド化合物は、１つ以上の、リピトイドとしても知られるカチオン性ペプトイド－リン脂質コンジュゲート構築物を含む。リピトイドは、ペプトイド骨格に沿ってグリシン残基のＮ位にカチオン性及び／又は中性の側鎖の組み合わせを有する、更にペプトイド鎖の単一の末端リン脂質基にコンジュゲート化された、Ｎ－置換ポリグリシン化合物（「ペプトイド」としても知られる）である。リピトイド及びそれらの合成方法は当分野で公知である。

【0088】

カチオン性、又は正に荷電した部分としては、例えば、以下の官能基、すなわち、アミノ、グアニジノ、ヒドラジド、及びアミジノを含有するものなどの窒素系置換基を挙げることができる。これらの官能基は、芳香族、飽和環式、又は脂肪族のいずれであってもよい。リピトイドのいくつかの実装形態において、各カチオン性部分は独立して、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アミノアルキルアミノアルキル、グアニジノアルキル、又はＮ－ヘテロシクリルアルキルである。

【0089】

中性部分としては、限定されないが、シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、又はヒドロキシアルキルで置換されたＣ_１～Ｃ_４－アルキルが挙げられ、各シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、又はヒドロキシアルキルは、１つ以上の置換基－ＯＨ、ハロ、又はアルコキシで、任意で置換される。

【0090】

三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と同様に、本明細書に記載されるリピトイドは、ランダムな配列で配置されたアミノ酸残基、又は交互配列若しくはブロック配列の繰り返しモチーフを含むことができる。

【0091】

カーゴとしてのｍＲＮＡなどの１つ以上のポリアニオン性化合物の電荷の中和のための主要脂質成分として使用される脂質化カチオン性ペプチド化合物に加えて、多成分脂質組成物及びその中の複合体は、構造脂質、リン脂質及び遮蔽脂質を含む他の脂質成分を含むことができる。本明細書に記載される追加の脂質成分は、カチオン性ペプチド化合物とポリアニオン性材料との複合体に物理的構造及び安定性を提供し、それによって、溶液中でのそれらの投与が容易になり、また細胞への複合体の取り込みが促進される。

【0092】

構造脂質は、本明細書に記載されるように、多成分組成物中のポリアニオン性化合物の複合体に物理的安定性を付与するために、また複合体の親油性を高めて標的細胞との結合及びエンドサイトーシスを促進するために使用され得る。いくつかの実装形態において、本開示の組成物は、脂質成分として１つ以上の構造脂質を任意で含む複合体を含む。いくつかの変形において、組成物は１つ以上の構造脂質を含む複合体を含む。

【0093】

存在する場合、本開示の組成物及び複合体に好適な構造脂質としては、限定されないが、ステロールが挙げられる。いくつかの実装形態において、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。特定の実装形態において、構造脂質はコレステロールである。本開示のいくつかの実装形態において、組成物及び複合体は、構造脂質を含有しないが、依然として非常に良好な送達効率を示す。

【0094】

構造脂質のようにリン脂質もまた、本開示の複合体及び組成物に組み込むことができる。リン脂質は、溶液中の複合体に更なる安定化を提供し、並びに、それらの両親媒性特性及び細胞膜を破壊する能力によって、細胞のエンドサイトーシスを促進する。いくつかの実装形態において、本明細書で提供される組成物は、脂質成分として１つ以上のリン脂質を含む複合体を含む。特定の実装形態において、１つ以上のリン脂質は１つ以上の双性イオン性リン脂質を含む。

【0095】

いくつかの実装形態において、１つ以上のリン脂質は、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミサクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ＬｙｓｏＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される。特定の実装形態において、リン脂質はＤＯＰＥである。

【0096】

エンドサイトーシスのための細胞膜の破壊を促進するためにリン脂質によって提供される両親媒性の属性は、リン脂質ではない双性イオン性脂質によって代替的に提供されてもよいことを認識されたい。いくつかの実装形態において、組成物は、リン脂質ではない１つ以上の双性イオン性脂質を含む複合体を含む。なお更なる実装形態において、それは、１つ以上のリン脂質、１つ以上の双性イオン性脂質、又はそれらの任意の組み合わせを含む複合体を含む。

【0097】

本開示の複合体及び組成物は、１つ以上の遮蔽脂質を更に含むことができる。ＰＥＧ化脂質などの遮蔽脂質は、１つ以上のポリアニオン性化合物に対する対電荷として１つ以上の脂質化カチオン性ペプチド化合物に追加の電荷中和の層を提供し、細胞の貪食プロセスによるクリアランスを防止することができる。いくつかの実装形態において、本明細書で提供される組成物は脂質成分として１つ以上の遮蔽脂質を含む複合体を含む。

【0098】

いくつかの実装形態において、遮蔽脂質はＰＥＧ脂質である。他の実装形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実装形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ＤＳＰＥ（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、ＰＥＧ修飾ＤＰＰＥ（ＤＰＰＥ－ＰＥＧ）、及びＰＥＧ修飾ＤＯＰＥ（ＤＯＰＥ－ＰＥＧ）からなる群から選択されるＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールである。特定の実装形態において、ＰＥＧ脂質は、ジミリストイルグリセロール－ポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、ジステアロイルグリセロール－ポリエチレングリコール（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、ジパルミトイルグリセロール－ポリエチレングリコール（ＤＰＧ－ＰＥＧ）、及びジオレオイルグリセロール－ポリエチレングリコール（ＤＯＧ－ＰＥＧ）からなる群から選択される。特定の実装形態において、ＰＥＧ脂質はＤＭＧ－ＰＥＧである。

【0099】

前述のＰＥＧ脂質におけるＰＥＧ鎖の分子量は、本開示の複合体への組み込みに特に有利である。例えば、いくつかの実装形態において、ＰＥＧ鎖は３５０～６，０００ｇ／ｍｏｌ、１，０００～５，０００ｇ／ｍｏｌ、又は２，０００～５，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。特定の実装形態において、ＰＥＧ脂質のＰＥＧ鎖は約３５０ｇ／ｍｏｌ、５００ｇ／ｍｏｌ、６００ｇ／ｍｏｌ、７５０ｇ／ｍｏｌ、１，０００ｇ／ｍｏｌ、２，０００ｇ／ｍｏｌ、３，０００ｇ／ｍｏｌ、５，０００ｇ／ｍｏｌ、又は１０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。特定の他の実装形態において、ＰＥＧ脂質のＰＥＧ鎖は約５００ｇ／ｍｏｌ、７５０ｇ／ｍｏｌ、１，０００ｇ／ｍｏｌ、２，０００ｇ／ｍｏｌ又は５，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。例えば、特定の実装形態において、ＰＥＧ化された脂質は、ジミリストイルグルセロール－ポリエチレングリコール２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）である。

【0100】

なお更なる実装形態において、１つ以上のＰＥＧ脂質は、少なくとも１つのオリゴ又はポリエチレングリコール部分を含む式（Ｉ）の三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む。式（Ｉ）の三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、より少ししかないより長いポリエチレングリコール部分の代わりにいくつかの短いオリゴエチレングリコール部分を含んでもよく、複合体に同様の粒子の安定化を提供できることを認識されたい。

【0101】

本開示の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む多成分脂質組成物は、ｍＲＮＡなどの１つ以上のポリアニオン性化合物との複合体形成に有用であり得る。１つの態様において、本開示は、１つ以上の脂質化カチオン性ペプチド化合物及び２つ以上の他の脂質成分と複合体化された１つ以上のｍＲＮＡを含む複合体を含む組成物を提供する。

【0102】

いくつかの実装形態において、１つ以上のｍＲＮＡは、天然に存在してもよく、又は、ホスホロチオエートなどの非天然の骨格及び修飾骨格結合、非天然及び修飾塩基、並びに非天然及び修飾末端を有する、天然に存在しない変異体であってもよい。ｍＲＮＡは、組換えで生成された分子又は化学的に合成された分子であってもよい。

【0103】

ｍＲＮＡは抗原ペプチド又は抗原ポリペプチドをコードし、抗原ポリペプチドは１つ以上の抗原ペプチドを含んでもよい。いくつかの実装形態において、２つ以上の特定のｍＲＮＡを一緒に組み合わせた送達は、本開示の免疫原性の方法に特に有用であり得る。

【0104】

本開示の組成物は、１つ以上のｍＲＮＡと脂質成分とを含む複合体を含み、脂質成分は１つ以上の脂質化カチオン性ペプチド化合物、１つ以上のリン脂質、１つ以上の遮蔽脂質、及び任意で１つ以上の構造脂質を含む。本明細書中に記載される複合体及び組成物の物理的特性は、所与のポリアニオン性化合物に対する脂質成分の特定の選択、並びに複合体及び組成物中の各成分の量によって影響され得る。いくつかの実装形態において、複合体及びその組成物内の脂質成分は、存在する総脂質成分の質量に対する脂質成分（単独又は組み合わせ）の質量百分率及び／又は互いに対する個々の脂質成分の質量比によって特徴付けられ得る。

【0105】

追加の成分を複合体に添加して、ｍＲＮＡポリアニオン性カーゴの高度な封入及び／又はその標的化された制御放出を容易にすることもまた可能である。このような追加の成分としては、例えば、ポリマー及び界面活性成分を挙げることができる。

【0106】

複合体は、ｍＲＮＡカーゴ及び他の化合物の細胞への送達に有用な更なる成分を含むことができる。このような成分としては、限定されないが、例えば、ｍＲＮＡを封入して脂質ｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクルに適合する超複合体又は他の送達系（すなわち、脂質－ポリマーのハイブリッドナノ粒子）を一緒に形成するものが挙げられる。

【0107】

本明細書に記載される複合体へのポリマーの組み込みによって、ｍＲＮＡを封入してポリマーｍＲＮＡナノ粒子の小胞を形成して、又は追加の脂質成分の存在下で、脂質－ポリマーのハイブリッドｍＲＮＡナノ粒子を形成することで送達ビヒクルを形成することによって、脂質化カチオン性ペプチド化合物とポリアニオン性化合物とを含む複合体を安定化させることができる。いくつかの実装形態において、本開示の複合体はポリマーを含む。適切なポリマーとしては、中性ポリマー（例えば、（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）又はポリグリコール酸（ＰＧＡ））、アニオン性ポリマー（ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、及びヘパリンを含む）、及び／又はカチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、プロタミン）を挙げることができる。

【0108】

ナノ粒子及びそれらのｍＲＮＡカーゴの組成物及び製剤の更なる説明は、そのような組成物を製造し、そのような製剤を調製する方法の説明と共に、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第１９／０５３６６１号、ＰＣＴ／ＵＳ第１９／０５３６５５号、及びＮＬ第２０２６８２５号に提供されており、これらの各々は、上記のように、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0109】

有機材料は、本開示のｍＲＮＡを封入してリピトイドｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子の調製の際の使用が企図される。ｍＲＮＡナノ粒子ポリマーとしては、ポリスチレン、シリコーンゴム、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリエチレン及びポリプロピレンを含むポリアルカン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、並びにポリエーテルが挙げられる。生分解性バイオポリマー（例えば、ＢＳＡなどのポリペプチド、多糖類など）、他の生物学的材料（例えば、炭水化物）、及び／又はポリマー化合物もまた、ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子の生成の際の使用が企図される。

【0110】

ｍＲＮＡを封入する送達ビヒクル分子から形成されるリポソームｍＲＮＡナノ粒子もまた、本開示の材料及び方法における使用が企図される。中空ナノ粒子もまた企図される。本開示のｍＲＮＡを封入する送達ビヒクル分子から形成されるリポソームｍＲＮＡナノ粒子は、少なくとも実質的に球状の幾何形状、内面及び外面を有して、脂質二重層を含む。脂質二重層は、様々な実装形態において、脂質のホスホコリンファミリー又は脂質のホスホエタノールアミンファミリー由来の脂質を含む。限定することを意図するものではないが、本開示のｍＲＮＡを封入してリポソームｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子中に見られる脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＳＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジヘキサデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、カルジオリピン、リピドＡ、又はそれらの組み合わせであってもよい。

【0111】

異なるサイズ、形状及び／又は化学組成を有する粒子の混合物の使用、並びにｍＲＮＡを封入して均一なサイズ、形状及び化学組成を有するｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子の使用が企図される。適切な粒子の例としては、限定されないが、ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子が挙げられ、ナノ粒子成分は、従来の構造のもの、凝集粒子、等方性粒子（例えば、球状粒子）及び異方性粒子（例えば、非球状ロッド、四面体、角柱）、並びにコア－シェル粒子である。

【0112】

ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子は本明細書に記載される材料を含み、その材料は、市販されているものでもよく、又は溶液中での漸進的核形成（例えば、コロイド反応）によって生成されてもよく、又はスパッタ蒸着などの様々な物理的及び化学的蒸着プロセスによって生成されてもよい。

【0113】

ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子は、平均直径が約１ｎｍ～約２５０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約２４０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約２３０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約２２０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約２１０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約２００ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約１９０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約１８０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約１７０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約１６０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約１５０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約１４０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約１３０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約１２０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約１１０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約１００ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約９０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約８０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約７０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約６０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約５０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約４０ｎｍ、平均直径が約１ｎｍ～約３０ｎｍ、又は平均直径が約１ｎｍ～約２０ｎｍ、又は平均直径が約１ｎｍ～約１０ｎｍのサイズの範囲であってもよい。他の態様では、ｍＲＮＡナノ粒子のサイズは、約５ｎｍ～約１５０ｎｍ（平均直径）、約５～約５０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～１５０ｎｍ、約１０～約１００ｎｍ、又は約１０～約５０ｎｍである。ｍＲＮＡナノ粒子のサイズは、約５ｎｍ～約１５０ｎｍ（平均直径）、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約８０ｎｍであってもよい。本開示の方法において使用されるｍＲＮＡナノ粒子のサイズは、それらの特定の使用又は用途による必要に応じ、変化させることができる。サイズの変化は、ｍＲＮＡナノ粒子の特定の物理的特性を最適化するために有益に使用される。

【0114】

ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子の前述の説明から明らかなことは、固形腫瘍の形態のがんを含むがん、自己免疫疾患、又は炎症などの疾患の予防又は治療を必要とする対象の細胞に１つ以上のｍＲＮＡを送達する際に使用するために、多種多様なｍＲＮＡナノ粒子が企図されることである。

【0115】

以下の実施例に、がん（例えば、腫瘍）などの疾患の治療に対する個別化医療アプローチを提供するために、罹患した対象の免疫系の動員に有用な少なくとも１つの抗原ペプチドをコードするｍＲＮＡを中に封入する送達ビヒクル分子を含むｍＲＮＡナノ粒子を調製する方法を立証するデータを示す。

【0116】

非限定的な実施例
実施例１
ＰＢＭＣのトランスフェクション効率
末梢血単核細胞のトランスフェクション効率を、凍結保存された健常ドナー（ＨＤ）の末梢血単核細胞を使用して、これを解凍し、１４ｍｌのＲＰＭＩ１６４０に再懸濁して、評価した。細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離することでペレット化した。上清を吸引し、細胞を再懸濁して、適切な体積の培養培地（１：１ＡＩＭ－Ｖ／ＲＰＭＩ１６４０＋１０％の濾過したヒトＡＢ血清＋５０μＭのβ－メルカプトエタノール（ＴＣグレード））中で計数した。細胞をＣＯ_２インキュベーター（５％ＣＯ_２）中に３７℃で一晩置いた。インキュベーション後、細胞を、送達ビヒクル中に封入されたラットＴｈｙ１．１をコードする１００ｎｇのｍＲＮＡで処理し、５０μｌの培養培地中でｍＲＮＡナノ粒子を形成した。細胞をＣＯ_２インキュベーター（５％ＣＯ_２）中、３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞を回収し、ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。次いで、洗浄した細胞を、室温（ＲＴ）で１５分間、ＰＢＳ中のＺｏｍｂｉｅ Ｎｅａｒ Ｉｎｆｒａｒｅｄ ｌｉｖｅ ｄｅａｄ ｓｔｒａｉｎ（ＮＩＲ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。次いで、細胞を洗浄し、蛍光色素とコンジュゲート化された抗ラットＴｈｙ１．１、抗ＣＤ８抗体（すなわち、ａ－ＣＤ８）、ａ－ＣＤ４、ａ－ＣＤ５６、ａ－ＣＤ１１ｃ、ａ－ＣＤ１９、ａ－ＭＨＣクラスＩＩ、及びａ－ＣＤ１４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含有する１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０２％アジ化ナトリウム）に再懸濁した。次いで、細胞を室温で２０分間インキュベートした。染色後、細胞を２００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、続いて１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。最終の洗浄後、上清を棄てて、細胞を２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。次いで、再懸濁した細胞をフローサイトメーター（Ｃｙｔｅｋ）で解析した。

【0117】

送達ビヒクルに封入されたｍＲＮＡは、健常ドナーのＰＢＭＣ由来の一次免疫細胞にカーゴを送達した。ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクルを使用して、本発明者らは、ＡＰＣ集団、すなわち、Ｂ細胞、ＤＣ、及び単球並びに初代Ｔ細胞及びＮＫ細胞において高いトランスフェクション効率を観察した。図４を参照されたい。

【0118】

この実験は、プロフェッショナル抗原提示細胞の集団におけるｍＲＮＡカーゴの効率的な送達及び翻訳が、ＡＰＣの単離及びインビトロでの分化の必要性を減らし、また、それによってそれらを効果的に排除することを立証している。これらの細胞型におけるタンパク質の発現は、抗原提示及びその後のＴ細胞の刺激を増強し、これらの細胞型が本開示の免疫療法において有益であることを立証している。

【0119】

実施例２
抗原ペプチドをコードするｍＲＮＡを含むＡＰＣ
ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクルによって送達される抗原ペプチドをコードするｍＲＮＡを有する抗原提示細胞を、それらの抗原提示及びＴ細胞活性化特性について分析した。凍結保存されたヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）血清反応陽性健常ドナー（ＣＭＶ＋）の末梢血単核細胞を解凍して、１４ｍｌのＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離することでペレット化した。上清を吸引し、細胞を再懸濁し、適切な体積の培養培地（１：１ＡＩＭ－Ｖ／ＲＰＭＩ１６４０＋１０％の濾過したヒトＡＢ血清＋５０μＭのβ－メルカプトエタノール（ＴＣグレード））中で計数した。細胞をＣＯ_２インキュベーター（５％ＣＯ_２）中に３７℃で一晩置いた。インキュベーション後、細胞を、天然のＣＭＶ ｐｐ６５タンパク質をコードする５０ｎｇのｍＲＮＡ、ｐｐ６５分子全体をカバーする２μｇ／ｍｌのＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドプール、又はノンコーディングｍＲＮＡで処理した。細胞をＣＯ_２インキュベーター（５％ＣＯ_２）中、３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞と細胞培養物の上清とを回収し、細胞をｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。次いで、洗浄した細胞を、室温（ＲＴ）で１５分間、ＰＢＳ中のＺｏｍｂｉｅ Ｎｅａｒ Ｉｎｆｒａｒｅｄ ｌｉｖｅ ｄｅａｄ ｓｔｒａｉｎ（ＮＩＲ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。次いで、細胞を洗浄し、蛍光色素とコンジュゲート化された抗ＣＤ８抗体（すなわち、ａ－ＣＤ８）、ａ－ＣＤ４、ａ－ＣＤ１３７、及びａ－ＣＤ６９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含有する１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０２％アジ化ナトリウム）に再懸濁した。次いで、細胞を室温で２０分間インキュベートした。染色後、細胞を２００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、続いて１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。最終の洗浄後、上清を棄てて、細胞を２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。次いで、再懸濁した細胞をフローサイトメーター（Ｃｙｔｅｋ）で解析した。上清を使用して、標準化された市販のヒトＩＦＮγＥＬＩＳＡキットとプロトコール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とを用いて、分泌されたインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を測定した。

【0120】

実験結果を図５に示す。図５Ａに、抗原チャレンジ後のＣＤ８ Ｔ細胞活性化のフローサイトメトリーの結果を示す。図５Ｂに、抗原処理又は対照処理したＰＢＭＣサンプルにおけるＩＦＮγ分泌を示す。それらの同族抗原を認識すると、ＣＤ８ Ｔ細胞は、多くの場合活性化マーカーと呼ばれるタンパク質の表面発現をアップレギュレートする。活性化されたＣＤ８ Ｔ細胞はまた、ＩＦＮγを産生して分泌する。このように、分泌されたＩＦＮγ及び活性化マーカーの発現は、抗原特異的なＣＤ８ Ｔ細胞の応答の識別子として役立つ。ＨＬＡ分子上に提示された抗原を認識したＣＤ８ Ｔ細胞に特異的な２つのそのような活性化マーカーは、ＣＤ６９とＣＤ１３７とである。本発明者らは、ペプチド抗原及びｍＲＮＡにコードされた抗原の両方を使用することで、頑健なＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を観察した。予想外に、したがって驚くべきことに、ｍＲＮＡの形態で送達された抗原は、ペプチドの形態で送達された抗原よりも、活性化マーカーを発現するＣＤ８ Ｔ細胞が多く、また上清中に分泌されるＩＦＮγが多いことにより、より強い応答を示した。

【0121】

ペプチド及びｍＲＮＡの処理の両方は理論的には同じ抗原をカバーするが、ペプチドがＰＢＭＣ集団中の全てのＡＰＣに利用可能である一方、ｍＲＮＡはＡＰＣのサブセットに入り込むだけであるにもかかわらず、本発明者らは、細胞がそれらの内因性の機構を用いて細胞に送達されたｍＲＮＡ由来の抗原を翻訳、輸送、プロセシング及び提示する場合に、より良好な応答を観察した。

【0122】

実施例３
ＭＨＣ提示増強配列を含むことによるｍＲＮＡの設計の最適化
抗原ペプチドをコードするｍＲＮＡの設計を、主要組織適合遺伝子複合体提示増強配列を組み込むことによって最適化した。凍結保存されたヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）血清反応陽性健常ドナー（ＣＭＶ＋）の末梢血単核細胞を解凍して、１４ｍｌのＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離することでペレット化した。上清を吸引し、細胞を再懸濁し、適切な体積の培養培地（１：１ＡＩＭ－Ｖ／ＲＰＭＩ１６４０＋１０％の濾過したヒトＡＢ血清＋５０μＭのβ－メルカプトエタノール（ＴＣグレード））中で計数した。細胞をＣＯ_２インキュベーター（５％ＣＯ_２）中に３７℃で一晩置いた。インキュベーション後、細胞を、天然のＣＭＶ ｐｐ６５タンパク質をコードする５０ｎｇのｍＲＮＡ、ＭＨＣ提示増強配列を含むｐｐ６５をコードする５０ｎｇのｍＲＮＡ、ｐｐ６５分子全体をカバーする２μｇ／ｍｌのＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドプール、又はノンコーディングｍＲＮＡで処理した。細胞をＣＯ_２インキュベーター（５％ＣＯ_２）中、３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞と細胞培養の上清とを回収し、細胞をｐＨ７．２のＰＢＳで２回洗浄した。次いで、洗浄した細胞を、室温（ＲＴ）で１５分間、ＰＢＳ中のＺｏｍｂｉｅ Ｎｅａｒ Ｉｎｆｒａｒｅｄ ｌｉｖｅ ｄｅａｄ ｓｔｒａｉｎ（ＮＩＲ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。次いで、細胞を洗浄し、蛍光色素とコンジュゲート化された抗ＣＤ８抗体（すなわち、ａ－ＣＤ８）、ａ－ＣＤ４、ａ－ＣＤ１３７、及びａ－ＣＤ６９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含有する１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０２％アジ化ナトリウム）に再懸濁した。次いで、細胞を室温で２０分間インキュベートした。染色後、細胞を２００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、続いて１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。最終の洗浄後、上清を棄てて、細胞を２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。次いで、再懸濁した細胞をフローサイトメーター（Ｃｙｔｅｋ）で解析した。上清を使用して、標準化された市販のヒトＩＦＮγＥＬＩＳＡキットとプロトコール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とを用いて、分泌されたインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を測定した。

【0123】

図７に示した結果は、図５に示した結果と同様であったが、より強い応答が、ＭＨＣ提示増強配列を含むｐｐ６５ ｍＲＮＡで処理したサンプルで観察された。ＭＨＣ提示増強配列の導入によって、抗原提示及びＣＤ８ Ｔ細胞の活性化が、これらのＰＢＭＣサンプルにおいて改善された。

【0124】

実施例４
活性化Ｔ細胞は、抗原を発現する標的細胞を死滅させ、受動的に増殖させることができる
天然に存在する抗原提示細胞（すなわち、ＡＰＣ）によって活性化されたＴ細胞は、抗原を提示する標的細胞を死滅させる。更に、実験結果は、これらのＴ細胞が、費用対効果が高くかつ簡単な様式で顕著な数に達するような受動的増殖に適していることを証明している。凍結保存されたヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）血清反応陽性健常ドナー（ＣＭＶ＋）の末梢血単核細胞を解凍して、１４ｍｌのＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離することでペレット化した。上清を吸引し、細胞を再懸濁し、適切な体積の培養培地（１：１ＡＩＭ－Ｖ／ＲＰＭＩ１６４０＋１０％の濾過したヒトＡＢ血清＋５０μＭのβ－メルカプトエタノール（ＴＣグレード））中で計数した。細胞をＣＯ_２インキュベーター（５％ＣＯ_２）中に３７℃で一晩置いた。インキュベーション後、８×１０^６個の細胞を、ＭＨＣ提示増強配列を含むｐｐ６５をコードする１μｇのｍＲＮＡ、ｐｐ６５分子全体をカバーする２μｇ／ｍｌのＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドプール、又はノンコーディングｍＲＮＡのいずれかで処理した。細胞をＣＯ_２インキュベーター（５％ＣＯ_２）中３７℃で、Ｔ細胞の増殖を支援するための追加のサイトカインを含まない培養培地中で６日間インキュベートした。６日後、細胞を回収し、ヒトＣＤ８単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）を用いてＣＤ８ Ｔ細胞を単離した。生存率を測定し、細胞を計数した。ペプチド処理サンプル又はｍＲＮＡ処理サンプルのいずれかから単離した５０，０００個のＣＤ８ Ｔ細胞を、９６ウェルＵ底プレート中の１００μｌの完全培地中に８連で播種した。次に、ＨＬＡ－Ａ２：０１、発現するＴ２細胞（ＡＴＣＣ）を、製造業者のプロトコール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って、細胞トレーサーのバイオレット色素で標識した。標識後、細胞を予熱した培地中で２回洗浄して、生存率及び細胞数を評価した。次に、Ｔ２細胞の半分にＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドを３７℃で１時間パルスした。Ｔ２細胞の他方の半分はパルスしないままにした。１時間後、細胞を予熱した完全培地中で２回洗浄した後、１０，０００個のパルスした、又はパルスしていないＴ２細胞を、単離したＣＤ８ Ｔ細胞を入れたウェルに加えた。単離したＣＤ８ Ｔ細胞と、パルスした、又はパルスしていないＴ２細胞とを３７℃で４時間共インキュベートした。４時間後、５μｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を各ウェルに添加し、ＣＤ ８媒介性のＴ２の死滅をフローサイトメトリー（Ｃｙｔｅｋ）によって分析した。

【0125】

図７に実験の結果を示す。図７Ａに、６日間の受動的な増殖の後に、ＭＨＣ提示増強配列を含むｐｐ６５をコードする１μｇのｍＲＮＡで処理した培養物において、頑健なＣＤ８ Ｔ細胞の増殖が観察されたことを示す。生存率及び細胞数の両方で、ペプチドで処理した細胞よりも優れていた。図７Ｂに、Ｔ２標的細胞をＣＭＶ－ｐｐ６５抗原でパルスした場合にのみ、活性化及び増殖させたＣＤ８ Ｔ細胞がＴ２標的細胞を認識して死滅させることができたことを立証するデータを示す。更に、抗原特異的Ｔ細胞を、細胞の生存能力に概ね適合するエクスビボ又はインビボの環境を提供することとは別に、他の何らの特別な処理を行なうことなく、抗原ペプチドへの曝露によって受動的に増殖させることができることは注目に値する。本明細書に開示されるように、本方法は、リンパ球の約２％から約８０％を超えるまでのＴ細胞の受動的な増殖を提供し、少なくとも約１６０万個の生存Ｔ細胞が産生された。したがって、本開示は、例えば個別化医療の用途においてＴ細胞の製造を一変させることができる簡単で、有効で、経済的に有利な方法を提供する。

【0126】

観察された結果は、抗原ペプチドに直接曝露した培養物と比較して、抗原ペプチドをコードするｍＲＮＡで処理した培養物から単離されたＣＤ８ Ｔ細胞における有意により良好な殺傷効果という非直感的な転帰を立証するということにおいて、驚くべきことでありかつ予想外であった。これらの結果は、遺伝子産物自体又はその遺伝子産物をコードする発現可能なｍＲＮＡのいずれを提供しても、機能的な遺伝子産物を提供するという点において結果は同様になるという当該分野における従来の理解に反していた。

【0127】

この実験では、多数の機能的な（すなわち、標的細胞を死滅させることができる）ＣＤ８ Ｔ細胞が、ｍＲＮＡが抗原ペプチドをコードする、ｍＲＮＡを封入してｍＲＮＡナノ粒子を形成する送達ビヒクル分子でＰＢＭＣ集団全体を処理することによって生成されることが示された。この受動的な増殖のプロトコールは、治療される対象の細胞によって行なわれる適切な抗原のプロセシング及び提示によってもたらされるＴ細胞の応答の頑健性を示している。

【0128】

本明細書で特定される各特許又は他の刊行物は、文脈から当業者に明らかであるように、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれ、この組み込みによって、例えば、本明細書に開示される情報に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を効果的に記載及び開示する。

【0129】

上記の説明は、当業者が本明細書に記載される様々な構成を実践することを可能にするために提供されたものである。主題の技術を、様々な図及び構成を参照して具体的に説明してきたが、これらは例示のみの目的であり、主題の技術の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。

【0130】

本明細書で使用される場合、単数形で記載され、単語「ａ」又は「ａｎ」が先行する要素又は工程は、そのような除外が明示的に述べられていない限り、複数の要素又は工程を除外しないものとして理解されるべきである。更に、「１つの実装形態」への言及は、記載された特徴も組み込む更なる実装形態の存在を除外するものとして解釈されることについて意図しているものではいない。更に、そうでないと明示的に述べられていない限り、特定の特性を有する１つの要素又は複数の要素を「備える」、「含む」、又は「有する」実装形態は、それらがその特性を有するか否かにかかわらず、追加の要素を含み得る。更に、「備える」、「含む」、「有する」などの用語は、本明細書において互換的に使用される。

【0131】

本明細書全体を通して使用される「実質的に」、「およそ」、及び「約」という用語は、プロセスにおける変化などによる小さな変動を記載し計算に入れるために使用される。例えば、それらは、±５％以下、例えば±２％以下、例えば±１％以下、例えば±０．５％以下、例えば±０．２％以下、例えば±０．１％以下、例えば±０．０５％以下を指すことができる。

【0132】

主題の技術を実装するために、他に多くの方法が存在し得る。本明細書で説明される様々な機能及び要素は、主題の技術の範囲から逸脱することなく、示されたものとは異なって分割されてもよい。これらの実装形態への様々な修正は当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義される一般原理は他の実装形態に適用することができる。したがって、主題の技術の範囲から逸脱することなく、当業者は多くの変更及び修正を主題の技術に対して行なうことができる。例えば、異なる数の所与のモジュール又はユニットを使用してもよく、１つ又は複数の異なるタイプの所与のモジュール又はユニットを使用してもよく、所与のモジュール又はユニットを追加してもよく、あるいは所与のモジュール又はユニットを省略してもよい。

【0133】

下線付き及び／又はイタリック体の見出し及び小見出しは便宜上の使用にすぎず、主題の技術を限定するものではなく、また主題の技術の説明の解釈に関連して言及されるものではない。当業者に知られている、又は後に知られるようになる、本開示全体にわたって説明される様々な実装形態の要素に対する全ての構造的及び機能的等価物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれ、主題の技術によって包含されると意図される。更に、本明細書で開示されるものはいずれも、そのような開示が上記の説明において明示的に記載されているかどうかに関係なく、公けに提供されることについて意図されているものではいない。

【0134】

上記の概念及び以下でより詳細に論じられる追加の概念の全ての組み合わせ（そのような概念が相互に矛盾しない限り）は、本明細書で開示される本発明の主題の一部であるとして企図されることを理解されたい。特に、本開示の最後に示される特許請求される主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示される本発明の主題の一部であるとして企図される。

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8】

【配列表】

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【国際調査報告】