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特表2024-512814臍帯血から得られた制御性Ｔ細胞を培養することによって制御性Ｔ細胞を製造する方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-19

(54)【発明の名称】臍帯血から得られた制御性Ｔ細胞を培養することによって制御性Ｔ細胞を製造する方法

(51)【国際特許分類】

C12N 5/10 20060101AFI20240312BHJP

A61K 35/17 20150101ALI20240312BHJP

A61P 37/02 20060101ALI20240312BHJP

A61P 3/10 20060101ALI20240312BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20240312BHJP

A61P 37/06 20060101ALI20240312BHJP

A61P 17/04 20060101ALI20240312BHJP

A61P 37/08 20060101ALI20240312BHJP

A61P 17/06 20060101ALI20240312BHJP

A61P 1/00 20060101ALI20240312BHJP

A61P 19/02 20060101ALI20240312BHJP

A61P 29/00 20060101ALI20240312BHJP

A61P 17/14 20060101ALI20240312BHJP

A61P 17/00 20060101ALI20240312BHJP

C12N 5/0783 20100101ALN20240312BHJP

C12N 15/113 20100101ALN20240312BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

A61K35/17

A61P37/02

A61P3/10

A61P25/00

A61P37/06

A61P17/04

A61P37/08

A61P17/06

A61P1/00

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P17/14

A61P17/00

C12N5/0783 ZNA

C12N15/113 120Z

C12N15/113 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023561149

(86)(22)【出願日】2022-03-31

(85)【翻訳文提出日】2023-12-04

(86)【国際出願番号】 US2022022823

(87)【国際公開番号】W WO2022212705

(87)【国際公開日】2022-10-06

(31)【優先権主張番号】63/170,214

(32)【優先日】2021-04-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523376578

【氏名又は名称】テライミューンインコーポレーティッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001896

【氏名又は名称】弁理士法人朝日奈特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キム、ヨンチャン

(72)【発明者】

【氏名】ビュン、ナリ

(72)【発明者】

【氏名】ユン、ジョンホン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065BB40

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB59

4C087BB64

4C087NA03

4C087NA05

4C087ZA08

4C087ZA66

4C087ZA89

4C087ZA92

4C087ZA96

4C087ZB07

4C087ZB08

4C087ZB13

4C087ZB15

4C087ZC35

(57)【要約】

本開示は、制御性Ｔ細胞の初期集団を増殖させるために、ＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＣＧＴＡＴＣＧＧＣＧＡＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む培地中で臍帯血から得られた制御性Ｔ細胞の初期集団を培養することを含む、制御性Ｔ細胞の集団を製造するための方法、上記方法によって調製される制御性Ｔ細胞を含む組成物の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む自己免疫疾患を処置する方法、および、自己免疫疾患を処置するための組成物、制御性Ｔ細胞を含む組成物を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

制御性Ｔ細胞の初期集団を増殖するために、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドを含む培地中で臍帯血から得られた制御性Ｔ細胞の初期集団を培養すること
を含む、制御性Ｔ細胞の集団を製造する方法。

【請求項2】

前記培地が、ＴＧＦβ１をさらに含む請求項１記載の方法。

【請求項3】

前記培地が、ラパマイシンをさらに含む請求項１記載の方法。

【請求項4】

前記培地が、ＴＧＦβ１およびラパマイシンをさらに含む請求項１記載の方法。

【請求項5】

前記制御性Ｔ細胞の初期集団が、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^+/hiＣＤ１２７^lo/-ＦｏｘＰ３⁺に対して濃縮されている請求項１記載の方法。

【請求項6】

請求項１記載の方法によって調製される制御性Ｔ細胞の集団。

【請求項7】

請求項６記載の制御性Ｔ細胞を含む組成物の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む自己免疫疾患を処置する方法。

【請求項8】

前記自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、同種移植片拒絶反応、アトピー性皮膚炎、乾癬、炎症性腸疾患視神経脊髄炎、関節リウマチ、円形脱毛症、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、自己免疫性血管炎、異種臓器移植、同種臓器移植、および抗薬物抗体媒介性合併症からなる群より選択される請求項７記載の方法。

【請求項9】

自己免疫疾患を処置するための組成物であって、前記組成物が請求項６記載の制御性Ｔ細胞を含む組成物。

【請求項10】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書には、臍帯血から得られた制御性Ｔ細胞を培養することによって制御性Ｔ細胞を製造する方法、および制御性Ｔ細胞を含む組成物をそれを必要とする被験体に投与することによって自己免疫疾患を処置する方法が記載されている。

【背景技術】

【0002】

制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は免疫細胞集団のほんの一部を構成し、および、２つの亜集団に分けられ得る。一つは胸腺で作られ、および感作されるもので、ナチュラルＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）と称される。もう一つは末梢部位で作られ、誘導型Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）と称される（Schmitt EG and Williams CB Front.Immunol.2013; 4(152):1-13）。これらは過剰な免疫反応を不活性化し、および免疫恒常性を維持することに特化している（Sharvan Sehrawat, Barry Ｔ. Rouse J Leukoc Biol：1079-1087）。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または自己免疫疾患に罹患している患者は、健康なドナーに比べてＴｒｅｇが少ないか、または、その機能に異常があることが知られている（Roncarolo M-G, Battaglia M., Nat Rev Immuno., 2007; 7(8):585-598; Riley J L, June C H, Blazar B R, Immunity, 2009; 30(5):656-665）。このような理由から、Ｔｒｅｇ輸血はこれらに対する可能性を秘めた治療であり得る。Ｔｒｅｇ養子免疫伝達の予防／治療効果は、マウス実験で証明されている（Hoffmann P, Ermann J, Edinger M, Fathman C G, Strober S, J Exp Med, 2002; 196(3):389-399）。Ｔｒｅｇを細胞治療または臨床試験に適用するためには、大量の末梢血または臍帯血（ＵＣＢ）由来のＴｒｅｇおよび末梢血または臍帯血（ＵＣＢ）由来のＴｒｅｇの安定的な機能性が必要である。

【0003】

Ｔｒｅｇを用いた個別化細胞治療の様態においては、克服すべき２つの大きなハードルがある。第一に、レシピエントは高度に精製された増殖されたＴｒｅｇを大量に必要とする。第二に、Ｔｒｅｇの機能にとって最も重要な特徴であるＦｏｘｐ３は、ヒトＴｒｅｇでは増殖プロセスのあいだに失われやすい。これらの問題を解決するために、多くのアプローチが用いられてきた。例えば、ＣＤ１２７^loおよびＣＤ２５^hiの併用は、ＣＤ２５^intＴ細胞の混入なしに、Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の富化された集団を単離するのに役立つことがわかった（Liu W, Putnam A L, Xu-Yu Z, et al., J Exp Med. 2006; 203(7):1701-1711）。さらに、例えばラパマイシンなどのｍＴＯＲ阻害剤を加えることで、増殖のあいだのＴ細胞の従来のコンタミネーションが阻害され、および、純度の高いＴｒｅｇの増殖が可能になることがわかった（Hippen K L, Merkel S C, Schirm D K, et al., American Journal of Transplantation, 2011; 11(6):1148-1157）。

【0004】

末梢血由来Ｔｒｅｇと比較して、臍帯血由来Ｔｒｅｇは、ナイーブＴ細胞のマーカーであるＣＤ４５ＲＡを高いレベルで発現していることから、よりナイーブな表現型を示した。ナイーブＴｒｅｇは活性化後、低レベルの例えばＩＦＮ－γなどの炎症性サイトカインを産生した。さらに、ナイーブＴｒｅｇは、メモリーＴｒｅｇと比較して、長期にわたる表現型安定性を維持し、および、これは、動物モデルによって、および、ヒト検体を用いたインビトロ試験によって証明された（Hoffmann, P, Eder, R, Boeld, ＴJ, Doser, K, Piseshka, B, Andreesen, R, et al.）。

【0005】

したがって、ヒトの臍帯血（cord blood）（臍帯血（umbilical cord blood））から安定した制御性Ｔ細胞を単離し、および増殖させるための効率的な方法が必要とされてきた。

【発明の概要】

【0006】

本開示は、制御性Ｔ細胞の初期集団を増殖させるために、ＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＣＧＴＡＴＣＧＧＣＧＡＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む培地中で臍帯血から得られた制御性Ｔ細胞の初期集団を培養することを含む、制御性Ｔ細胞の集団を製造するための方法を提供する。

【0007】

例示的な実施形態において、培地はＴＧＦβ１をさらに含んでいてもよい。さらに、例示的な実施形態において、培地は、ラパマイシンをさらに含んでいてもよい。別の例示的な実施形態において、培地は、臍帯血から得られた制御性Ｔ細胞の初期集団がＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチド、ＴＧＦβ１とラパマイシンとの存在下で培養されるように、ＴＧＦβ１およびラパマイシンの両方をさらに含んでいてもよい。

【0008】

一実施形態において、制御性Ｔ細胞の初期集団は、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^+/hiＣＤ１２７^lo/-ＦｏｘＰ３⁺に対して濃縮され得る。

【0009】

本開示はまた、制御性Ｔ細胞の初期集団を増殖させるために、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドを含む培地中で臍帯血から得られた制御性Ｔ細胞の初期集団を培養することによって調製される制御性Ｔ細胞の集団を提供する。

【0010】

加えて、本開示は、制御性Ｔ細胞の初期集団を増殖させるために、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドを含む培地中で臍帯血から得られた制御性Ｔ細胞の初期集団を培養することによって調製される制御性Ｔ細胞を含む組成物の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、自己免疫疾患を処置するための方法を提供する。

【0011】

一実施形態において、自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、同種移植片拒絶反応、アトピー性皮膚炎、乾癬、炎症性腸疾患、視神経脊髄炎、関節リウマチ、円形脱毛症、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、自己免疫性血管炎、異種臓器移植、同種臓器移植、および抗薬物抗体媒介性合併症からなる群より選択される。

【0012】

別の実施形態において、本開示は、自己免疫疾患を処置するための組成物を提供し、該組成物は、制御性Ｔ細胞の初期集団を増殖させるために臍帯血から得られた制御性Ｔ細胞の初期集団を、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドを含む培地中で培養することによって調製される制御性Ｔ細胞を含んでいる。

【0013】

いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、同種移植片拒絶反応、アトピー性皮膚炎、乾癬、炎症性腸疾患、視神経脊髄炎、関節リウマチ、円形脱毛症、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、自己免疫性血管炎、異種臓器移植、同種臓器移植、および抗薬物抗体媒介性合併症からなる群から選択される。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、Ｔｒｅｇ増殖のスキームを示す図である。特には、図１は、０日目に、選別されたＣＤ４⁺濃縮Ｔ細胞が播種され、ならびに、ＴＧＦβ１（２ｎｇ／ｍＬ）およびＢＨＫｐｓ２５（２μＭ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチド）を含むＴ細胞培養培地中でＴｒａｎｓＡｃＴを用いて５日目まで活性化されたことを示す。３日目～５日目まで、汚染された従来のＴ細胞集団を除去するためにラパマイシン（１００ｎＭ）が供給された。増殖されたＴｒｅｇは、６日目に、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体を添加した自己フィーダー細胞を加えることによって再刺激された。１０日目と１７日目に表現型分析が行われた。ＢＨＫｐｓ２５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチド）は、１３日目から増殖終了までのＴ細胞培地からは除去された。

【図2】図２は、フローサイトメトリーのソーティング戦略および純度を示す図である。図２では、臍帯血（ＵＣＢ）がヒトＣＤ４ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓで濃縮され、および、Ｍｅｌｏｄｙセルソーター上でＣｈｏｒｕｓソフトウェアを用いてソーティングされた。単離細胞群はリンパ球ゲートでゲートされた（データは示さず）。次に、ＣＤ４⁺集団がゲートされ、続いてナイーブＴ細胞（ＣＤ⁴⁺ＣＤ２５^-/loＣＤ１２７⁺ＣＤ４５ＲＡ⁺）およびＴｒｅｇ（ＣＤ４⁺ＣＤ２５^hiＣＤ１２７^lo）がゲートされた。ソートされたＴｒｅｇおよびナイーブＴ細胞集団はいずれも９７％より高い純度を示した。ナイーブＴ細胞はコントロールとして使用された。

【図3】図３は、０日目の全臍帯血（ＵＣＢ）および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるＴｒｅｇおよびナイーブＴ細胞集団の同定を示す図である。図３では、ＵＣＢ（Ａ－Ｂ）およびＰＢＭＣ（Ｃ－Ｄ）由来の単核球が０日目に分析された。Ｆｏｘｐ３およびＨｅｌｉｏｓの発現レベルが、生存ＣＤ４⁺集団中のＵＣＢ（Ａ）またはＰＢＭＣ（Ｃ）由来の単核細胞から測定された。ナイーブＴ細胞の割合は、生存ＣＤ４⁺集団中のＵＣＢ（Ｂ）またはＰＢＭＣ（Ｄ）由来のＣＤ２５^hiＣＤ１２７^loおよびＣＤ２５^-/loＣＤ１２７⁺細胞から測定された。

【図4】図４は、増殖されたｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇの増殖中期および終期における表現型分析を示す図である。細胞は、１０～１２日目に中間点分析としてＦｏｘｐ３およびＨｅｌｉｏｓ細胞内染色について分析された。さらに、エンドポイント分析が、１７～１９日目に行われた。ＵＣＢ（Ａ）およびＰＢＭＣ（Ｂ）からの増殖されたｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇにおける、Ｆｏｘｐ３とＨｅｌｉｏｓレベルの両方が示された。すべてのデータは生存ＣＤ４⁺集団中で解析された。

【図5】図５は、増殖のエンドポイントにおける臍帯血（ＵＣＢ）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇのサイトカイン分析を示す図である。安静ｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇが、ブレフェルジンＡの存在下で、ＰＭＡおよびイオノマイシンを用いて４時間再刺激されえた。細胞内ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１７Ａ、およびＩＦＮ－γのレベルが、ＵＣＢ（Ａ）およびＰＢＭＣ（Ｂ）由来の増殖されたｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇから分析された。

【図6】図６は、臍帯血（ＵＣＢ）由来のｎＴｒｅｇと末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のｎＴｒｅｇの、増殖の中間点およびエンドポイントにおける倍数変化の比較を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本開示は、制御性Ｔ細胞の初期集団を増殖させるために、ＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＣＧＴＡＴＣＧＧＣＧＡＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む培地中で臍帯血から得られた制御性Ｔ細胞の初期集団を培養することを含む、制御性Ｔ細胞の集団を製造するための方法に関する。

【0016】

用語「臍帯血（umbilical cord blood）」とは、臍帯血（cord blood）とも称され、出産後に胎盤中に、およびそれに付いている臍帯中に残る血液を指す。

【0017】

用語「制御性Ｔ細胞」とは、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容性を維持し、および、自己免疫疾患を予防するＴ細胞の亜集団を指す。

【0018】

用語「オリゴヌクレオチド」とは、より大きな核酸分子の分解によって合成または生成され得るヌクレオチド（または塩基）のポリマーを指す。例示的な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートをバックボーンとするオリゴデオキシヌクレオチドである。ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドは、０．０１～２０μＭの量で培地に添加され得る。別の実施形態において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドの量の下限は、０．２、０．３、０．４、０５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４または２．５μＭであり得る。ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドの量の上限は、１５、１０、９、８、７、６、５、４．２、２．１または２．０μＭであり得る．ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドの量の上限と下限は、異なる量の範囲を提供するために組み合わされてもよい。さらに、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドの量は、そのような組み合わせの範囲内の任意の量であってもよい。例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドの量は、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９または３．０μＭであり得る。別の実施形態において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドの代わりに、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドと共に、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドのアナログが使用されてもよい。

【0019】

一実施形態において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドの代わりに、それらがＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドと実質的に同じ機能を果たす場合、他のオリゴヌクレオチドが、臍帯血から得られた制御性Ｔ細胞の初期集団を培養する際に使用されてもよい。このようなオリゴヌクレオチドは、３００ヌクレオチド以下の長さ、２００ヌクレオチド以下の長さ、１００ヌクレオチド以下の長さ、９０ヌクレオチド以下の長さ、８０ヌクレオチド以下の長さ、７０ヌクレオチド以下の長さ、６０ヌクレオチド以下の長さ、５０ヌクレオチド以下の長さ、４０ヌクレオチド以下の長さ、３０ヌクレオチド以下の長さ、２９ヌクレオチド以下の長さ、２８ヌクレオチド以下の長さ、２７ヌクレオチド以下の長さ、２６ヌクレオチド以下の長さ、２５ヌクレオチド以下の長さ、２４ヌクレオチド以下の長さ、２３ヌクレオチド以下の長さ、２２ヌクレオチド以下の長さ、２１ヌクレオチド以下の長さ、２０ヌクレオチド以下の長さ、１９ヌクレオチド以下の長さ、１８ヌクレオチド以下の長さ、１７ヌクレオチド以下の長さ、１６ヌクレオチド以下の長さ、１５ヌクレオチド以下の長さ、１４ヌクレオチド以下の長さ、１３ヌクレオチド以下の長さ、１２ヌクレオチド以下の長さ、１１ヌクレオチド以下の長さ、１０ヌクレオチド以下の長さ、９ヌクレオチド以下の長さ、８ヌクレオチド以下の長さ、または７ヌクレオチド以下の長さであり得る。

【0020】

さらに、このようなオリゴヌクレオチドは、７ヌクレオチド以上の長さ、８ヌクレオチドの長さ、９ヌクレオチドの長さ、１０ヌクレオチドの長さ、１１ヌクレオチドの長さ、１２ヌクレオチドの長さ、１３ヌクレオチドの長さであってもよい、１４ヌクレオチドの長さ、１５ヌクレオチドの長さ、１６ヌクレオチドの長さ、１７ヌクレオチドの長さ、１８ヌクレオチドの長さ、１９ヌクレオチドの長さ、２０ヌクレオチドの長さ、２０ヌクレオチドの長さ、２１ヌクレオチドの長さ、２２ヌクレオチド以上の長さ、２３ヌクレオチド以上の長さ、２４ヌクレオチド以上の長さ、２５ヌクレオチド以上の長さ、２６ヌクレオチド以上の長さ、２７ヌクレオチド以上の長さ、２８ヌクレオチド以上の長さ、２９ヌクレオチド以上の長さ、３０ヌクレオチド以上の長さ、４０ヌクレオチド以上の長さ、５０ヌクレオチド以上の長さ、６０ヌクレオチド以上の長さ、７０ヌクレオチド以上の長さ、８０ヌクレオチド以上の長さ、９０ヌクレオチド以上の長さ、１００ヌクレオチド以上の長さ、または２００ヌクレオチド以上の長さであり得る。

【0021】

上記のヌクレオチド長の範囲の上限および下限は、異なるヌクレオチド長の範囲を提供するために、組み合わされてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、２０ヌクレオチド以上および３０ヌクレオチド以下の長さであってもよく、ここで、３０ヌクレオチド以上の長さと２０ヌクレオチド以上の長さとがヌクレオチド長の範囲を提供するために組み合わされる。さらに、オリゴヌクレオチドは、このような組み合わせの範囲内における任意のヌクレオチド長であってもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチドの長さ、１６ヌクレオチドの長さ、１７ヌクレオチドの長さ、１８ヌクレオチドの長さ、１９ヌクレオチドの長さ、２０ヌクレオチドの長さ、２１ヌクレオチドの長さ、２２ヌクレオチドの長さ、２３ヌクレオチドの長さ、２４ヌクレオチドの長さ、２５ヌクレオチドの長さ、２６ヌクレオチドの長さ、２７ヌクレオチドの長さ、２８ヌクレオチドの長さ、２９ヌクレオチドの長さ、または３０ヌクレオチドの長さであってもよい。

【0022】

例示的な実施形態において、培地はＴＧＦβ１をさらに含んでいてもよい。ＴＧＦβ１（トランスフォーミング成長因子β１）は、サイトカインのトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーのポリペプチドメンバーである。例示的な実施形態において、ＴＧＦβ１は、０．１～１０ｎｇ／ｍＬの量で培地に添加され得る。別の実施形態では、ＴＧＦβ１の量の下限は、０．２、０．３、０．４、０５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５ｎｇ／ｍＬであり、および、ＴＧＦβ１の量の上限は、９、８、７、６、５、４．５、４．０、３．５、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、または２．０ｎｇ／ｍＬであり得る。異なる量の範囲を提供するために、上記ＴＧＦβ１の量の上限と下限とが組み合わされてもよい。さらに、ＴＧＦβ１の量は、このような組み合わせの範囲内で任意の量であってもよい。例えば、ＴＧＦβ１の量は、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０ｎｇ／ｍＬであり得る。別の実施形態において、ＴＧＦβ１の代わりに、またはＴＧＦβ１と共に、ＴＧＦβ１のアナログが使用されてもよい。

【0023】

さらに、例示的な実施形態において、培地はラパマイシンをさらに含んでもよい。ラパマイシンはシロリムスとも称され、ｍＴＯＲ阻害剤である。別の実施形態において、ラパマイシンの代わりに、またはラパマイシンと共に、ラパマイシンのアナログが使用されてもよい。ラパマイシンは、０．１～１０００ｎＭの量で培地に添加され得る。別の実施形態において、ラパマイシンの量の下限は、１、１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｎＭであり得、および、ラパマイシン量の上限は、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、または１０１ｎＭであり得る。上記ラパマイシン量の上限および下限は、異なる量範囲を提供するために組み合わされてもよい。さらに、ラパマイシンの量は、このような組み合わせの範囲内で任意の量であってもよい。例えば、ラパマイシンの量は、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１１０、または１２０ｍＭであり得る。別の実施形態において、ラパマイシンの代わりに、またはラパマイシンと共に、ラパマイシンのアナログが使用されてもよい。

【0024】

別の例示的な実施形態において、培地は、臍帯血から得られる制御性Ｔ細胞の初期集団がＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチド、ＴＧＦβ１およびラパマイシンの存在下で培養されるように、ＴＧＦβ１およびラパマイシンの両方をさらに含んでもよい。ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチド、ＴＧＦβ１およびラパマイシンのそれぞれの量は、上述した任意の量または範囲で選択され得る。さらに、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチド、ＴＧＦβ１および／またはラパマイシンのアナログが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチド、ＴＧＦβ１およびラパマイシンの代わりに、またはそれらと共に使用されてもよい。一実施形態において、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチド、ＴＧＦβ１およびラパマイシンは、異なる期間で培地に添加されてもよい。例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドは、培養の０日目～１３日目の期間に培地に添加され得る。ＴＧＦβ１は、培養０日目～５日目の期間に培地に添加されてもよい。ラパマイシンは、培養３日目～５日目の期間に培地に添加されてもよい。

【0025】

一実施形態において、本開示は、ヒト血清ＡＢおよびＩＬ－２を含むＡＩＭ－Ｖ培地中でＢＨＫｐｓ２５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチド）、ＴＧＦβ１、およびラパマイシンと共にＣＤ４マイクロビーズを用いて臍帯血由来のＣＤ４富化Ｔ細胞からソートされるＣＤ４⁺ＣＤ２５^hiＣＤ１２７^loＴｒｅｇを処理することを含む、臍帯血からｎＴｒｅｇを単離および増殖する方法を提供する。

【0026】

一実施形態において、本開示は、臍帯血由来のｎＴｒｅｇにおいてＦｏｘｐ３およびＨｅｌｉｏｓレベルを高く維持する方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、臍帯血由来ｎＴｒｅｇにおいて、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１７Ａ、およびＩＦＮγなどの炎症性サイトカインの分泌を減少、阻害、および／または低下させる方法に関する。

【0027】

一実施形態において、制御性Ｔ細胞の初期集団は、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^+/hiＣＤ１２７^lo/-ＦｏｘＰ３⁺に対して濃縮され得る。濃縮は、これらに限定される訳ではないが、分離培地の使用、濾過またはエルトリエーションによる細胞サイズ、形状または密度分離、免疫磁気分離、蛍光分離（例えば、蛍光活性化細胞ソーティングシステム、ＦＡＣＳ）、またはビーズベースのカラム分離を含む任意の適切な分離方法によって達成され得る。

【0028】

本開示はまた、臍帯血から得られる制御性Ｔ細胞の初期集団を、制御性Ｔ細胞の初期集団を増殖させるためにＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドを含む培地中で培養することによって調製された制御性Ｔ細胞の集団を提供する。

【0029】

加えて、本開示は、制御性Ｔ細胞の初期集団を増殖させるために、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドを含む培地中で臍帯血から得られる制御性Ｔ細胞の初期集団を培養することによって調製された制御性Ｔ細胞を含む組成物の有効量（例えば、治療上有効な投与量）を、それを必要とする被験体に投与することを含む、自己免疫疾患を処置する方法を提供する。

【0030】

用語「投与する（administering）」は、当業者によって周知である様々な方法および送達システムのいずれかを用いた、対象への薬剤（組成物）の物理的な導入を意味する。本明細書中に開示される方法により調製される制御性Ｔ細胞のための例示的な投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄、または他の非経口投与経路、例えば注射または注入による投与が挙げられる。本明細書中で使用される「非経口投与」との語句は、経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射によるものであり、これらに限定される訳ではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ管内静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内注射および注入、ならびにインビボエレクトロポレーションが挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法によって調製される制御性Ｔ細胞は、非経口経路を介して、例えば経口などで投与される。他の非経口経路としては、局所、表皮または粘膜の投与経路、例えば、経鼻、経膣、直腸、舌下または局所などが挙げられる。投与はまた、例えば、１回、複数回、および／または１回以上の長期間にわたって行われ得る。

【0031】

用語「治療上有効な量」または「治療上有効な投与量」とは、本明細書中で使用される場合、方法によって製造される、および、単独でまたは別の治療剤と組み合わせて使用される場合に、被験体を疾患の発症から保護する、または、疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度および期間の増加、または疾患の苦痛による機能不全もしくは障害の予防によって明示される疾患の退縮を促進する制御性Ｔ細胞の量を指す。制御性Ｔ細胞の疾患の退縮を促進する能力は、例えば臨床試験のあいだのヒト被験体における、ヒトでの有効性を予測できる動物モデル系における、またはインビトロアッセイでの薬剤の活性を測定することによってなど、当業者にとって周知の様々な方法を用いて評価され得る。

【0032】

被験体の治療または処置との用語は、疾患に関連する症状、合併症もしくは状態、または生化学的徴候の発生、進行、発症、重症度もしくは再発を反転させる、緩和する、改善する、抑制する、遅らせる、または予防することを目的として、被験体に対して行われる任意の種類の介入またはプロセス、または被験体への本明細書中に開示される方法により調製される一またはそれ以上の制御性Ｔ細胞の投与を指す。一実施形態において、「治療」または「処置」は、部分寛解を含む。別の実施形態において、「治療」または「処置」には完全寛解を含む。

【0033】

【0034】

別の実施形態において、本開示は、自己免疫疾患を処置するための組成物を提供し、ここで、本組成物は、制御性Ｔ細胞の初期集団を増殖させるために臍帯血から得られる制御性Ｔ細胞の初期集団をＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドを含む培地中で培養することによって調製される制御性Ｔ細胞を含む。

【0035】

いくつかの実施形態において、組成物は、治療上有効な量の制御性Ｔ細胞を含む、自己免疫疾患を処置するための医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、自己免疫疾患を処置するための追加の治療剤を含んでいてもよい。別の実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでいてもよい。

【0036】

【実施例】

【0037】

材料および方法
組換えヒトインターロイキン（ＩＬ）－２（ＧＭＰグレード）は、Ｒ＆Ｄシステムから購入された。ＢＨＫｐｓ２５（Phosphorothioate-backboned oligodeoxynucleotides；ＳＥＱＩＤＮＯ：１）は、TriLink biotechnologiesにより合成された。ＭＡＣＳＧＭＰＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔは、Mitenyi Biotecから購入された。組換えヒトＴＧＦβ１（前臨床グレード）はCell Genix Inc.から購入された。ラパマイシンはSigma-Aldrich社から購入された。Ｔｒｅｇ培養用完全培地（ＴＣＭ）は、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２含有、５％ヒトＡＢ血清、５００ユニット／ｍＬペニシリン、５００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、１．４６ｍｇ／ｍＬグルタミンを含むＡＩＭ－Ｖ培地である。培養中、１００ｎＭのラパマイシンおよび２ｎｇ／ｍＬのｈＴＧＦβ１が培養スケジュールにしたがって添加された。

【0038】

ＵＣＢからの制御性Ｔ細胞の濃縮、ソーティング、および増殖
臍帯血（ＵＣＢ）はStem cell expressから購入された。細胞は、メーカーの指示にしたがってヒトＣＤ４ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Miltenyi Biotec Inc.）を用いて濃縮された。濃縮された細胞は、染色され、およびその後２つの集団にソートされた。染色のため、抗ヒトＣＤ４－ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ２５－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ１２７－ＡＰＣ、および抗ヒトＣＤ４５ＲＡ－ＡＰＣ－Ｃｙ７が、TonboおよびBiolegendから購入された。Ｔｒｅｇ（ＣＤ４⁺ＣＤ２５^hiＣＤ１２７^lo）およびナイーブＴ細胞（ＣＤ⁴⁺ＣＤ２５^-/loＣＤ１２７⁺ＣＤ４５ＲＡ⁺）は、いずれもMelody cell sorter（BD Bioscience）によってソートされた。

【0039】

ソートされ分離された細胞を培養するために、ＴｒａｎｓＡｃｔが０日目に培養液に直接的に添加され（図１）、および、細胞は、ＢＨＫｐｓ２５（２μＭ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１）の存在下、ＴＣＭ中で２週間培養された。ＴＧＦβ１（２ｎｇ／ｍＬ）およびラパマイシンが、それぞれ、図１に示されるように、異なる期間に提供された。２週間の培養後、細胞は、凍結されるまでＢＨＫｐｓ２５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を含まない培地中で維持された。

【0040】

培養されたＴｒｅｇの２回目の刺激のために、マイトマイシンＣ処理がされたＣＤ４^-細胞である自家フィーダー細胞が、５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３）に対して１:１０の割合で提供された。６～８日目でも細胞がよく増殖していれば、２回目の刺激は必要ない。

【0041】

Ｆｏｘｐ３、Ｈｅｌｉｏｓ、サイトカインに関する細胞内染色
スキーム（図１）に示されるように、増殖されたＴｒｅｇの表現型およびサイトカイン発現レベルが、培養のエンドポイントでのフローサイトメトリーにより分析された。表面染色には、ＣＤ３－ＢＶ５７０、ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ８－ＢＶ４２１、ＣＤ２５－ＢＶ７８５、ＣＤ１２７－ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＡ－ＡＰＣ－Ｃｙ７に対する抗ヒト抗体、および、生死細胞染色キットが用いられた。これらはTonbo、Biolegend、およびInvitrogenから購入された。染色された細胞は、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｆｉｘａｔｉｏｎ／ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎキットを用いて、メーカーの指示にしたがって固定および透過処理した。この工程の後、細胞内染色が、抗Ｆｏｘｐ３－ＰＥ－Ｃｙ７抗体および抗Ｈｅｌｉｏｓ－ＰＥ抗体を用いて行われた。Ｔｒｅｇの表現型は、０日目、１０日目、１７日目に確認された。サイトカイン解析のため、増殖期のＴｒｅｇが、ＩＬ－２フリー培地で２４時間培養され、および、ナイーブＴ細胞が、ＩＬ－２フリー培地で４８時間休ませられた。１７日目の再刺激は、ブレフェルジンＡの存在下、３７℃、４時間、ＰＭＡおよびイオノマイシンのカクテルによって行われた。細胞は、２％パラホルムアルデヒド溶液で固定された。これらの細胞は、ウシ血清アルブミンおよび０．１％ＴｒｉＴｏｎＸ－１００を含むＰＢＳを用いて透過処理された。ヒトＣＤ４－ＦＩＴＣ、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ－Ｃｙ７、Ｈｅｌｉｏｓ－ＰＥ、ＩＬ－２－ＢＶ５１０、ＩＦＮ－γ－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＩＬ－４－ＢＶ４２１、およびＩＬ－１７Ａ－ＡＦ６４７の抗体が同時に染色された。染色された細胞が、NovoCyte 3000（Agilent）に導入され、そしてFlowjoソフトウェアを用いて分析された。

【0042】

結果
ゲート戦略および臍帯血からのＴｒｅｇの単離
まず、ＣＤ４⁺Ｔ細胞が、ＣＤ４マイクロビーズを用いてヒト臍帯血から分離され（図２上段パネル、プレソート）、FACSMelody^TMソーター上でＣＤ２５、ＣＤ１２７、およびＣＤ４５ＲＡの発現レベルに応じてＴｒｅｇおよびナイーブＴ細胞にソートされた。非ＣＤ４発現細胞を除外するため、「リンパ球ゲート」がおこなわれ、続いてＣＤ４⁺集団が、ゲートされた。その後、図２に示されるように、ナイーブＴ細胞およびＴｒｅｇの細胞集団がそれぞれ、ＣＤ２５^hiＣＤ１２７^loおよびＣＤ２５^low/-ＣＤ１２７⁺ＣＤ４５ＲＡ⁺でゲートされた。これらのゲート戦略はＴｒｅｇをＰＢＭＣから分離するために適用された。ソートされ単離されたＴｒｅｇおよびナイーブＴ細胞集団は、いずれも、９７％より高い純度を示した（図２、ソート後ＴｒｅｇおよびナイーブＴ細胞）。これらのソートされた細胞は、２週間にわたって増殖されるために培養された。

【0043】

ＵＣＢおよびＰＢＭＣからのｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇの表現型分析
凍結された臍帯血（ＵＣＢ）および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の両方が解凍され、および、０日目にＣＤ４⁺Ｔ細胞の濃縮前に表現型の分析に付された（図３）。Ｆｏｘｐ３⁺Ｈｅｌｉｏｓ⁺集団は、ＵＣＢＣＤ４⁺集団中でＣＤ２５^hiＣＤ１２７^loを示した。一方、Ｆｏｘｐ３^-Ｈｅｌｉｏｓ^-集団は、ＣＤ２５^low/-ＣＤ１２７⁺ＣＤ４５ＲＡ⁺を示す（図３、Ａ）。ＵＣＢ中のＴｒｅｇおよびナイーブＴ細胞の両方を同定するために、それらは、図３、Ｂに示されるように、ＣＤ４⁺集団中のＣＤ２５およびＣＤ１２７の発現レベルによって分析された。その後、それらは、ＣＤ４５ＲＡ発現レベルでゲートされた。ＴｒｅｇおよびコンベンショナルＴ細胞から、両者は共に、９６％より高いＣＤ４５ＲＡ⁺ナイーブＴ細胞集団を示し、これはＵＣＢ中のナイーブＴ細胞の頻度が非常に高いことを示している。これはＰＢＭＣと区別されるＵＣＢ由来細胞のユニークな特徴であり得る。ＵＣＢは子供の出産まで女性の身体の外側からの抗原に暴露されることがないため、ＵＣＢ中の免疫細胞は、成熟する機会をもち得ない。同じゲート戦略を用いて、ＰＢＭＣ由来の細胞が、図３、ＣおよびＤに示されるように分析された。ＵＣＢとは対照的に、成人のＰＢＭＣ中の免疫細胞は多様な抗原に出会っているため、Ｔｒｅｇ細胞およびコンベンショナルＴ細胞の両方が、低い割合のＣＤ４５ＲＡ発現を示した。

【0044】

Ｆｏｘｐ３およびＨｅｌｉｏｓの発現レベルを含む表現型分析において、ＵＣＢ由来のｎＴｒｅｇのＦｏｘｐ３⁺Ｈｅｌｉｏｓ⁺集団は、中間点で８７．６％であり、および、エンドポイントにおいて６５．５％に減少した（図４、Ａ）。ＵＣＢ由来のｉＴｒｅｇの場合、Ｆｏｘｐ３とＨｅｌｉｏｓとの二重陽性集団は、６２．９％から１５．７％に減少した。両細胞は同じ条件で培養されたにも関わらず、ｎＴｒｅｇは、培養期間にわたってｉＴｒｅｇよりもＴｒｅｇの特徴をより良好に維持している。図４のＢにおいて、ＰＢＭＣ由来のｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇの両方における特徴が同じ戦略によって分析された。培養の中間点におけるｎＴｒｅｇは、ＵＣＢと同様に約９２％のＦｏｘｐ３⁺Ｈｅｌｉｏｓ⁺個体群を示したが、エンドポイントでは３３．２％に減少した。ＰＢＭＣからのｉＴｒｅｇ中のＦｏｘｐ３およびＨｅｌｉｏｓの二重陽性集団は、インビトロでの増殖のあいだに１５．８％から１％未満へと変化した。

【0045】

ＵＣＢおよびＰＢＭＣ由来のｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇのサイトカイン分析
臍帯血（ＵＣＢ）または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来のｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇの両者によるサイトカイン産生が、長期の増殖におけるＴ細胞の可塑性を検討するために測定された。ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１７Ａ、およびＩＦＮ－γの細胞内サイトカインレベルが、フローサイトメーターによって測定された。ＵＣＢおよびＰＢＭＣからのｎＴｒｅｇとｉＴｒｅｇはともに、ＩＬ－４およびＩＬ－１７Ａをほとんど分泌しなかった。しかしながら、ＵＣＢおよびＰＢＭＣ由来のｉＴｒｅｇは、ＩＬ－２を分泌した（～３５％、図５）。ＵＣＢ由来のｎＴｒｅｇは、ＩＬ－２を６．６３％分泌したが、ＰＢＭＣ由来のｎＴｒｅｇにおいては、ＩＬ－２が１９．７％分泌された。この結果は、増殖されたｎＴｒｅｇはいかなる系統にも分化せず、インビトロ培養期間のあいだもＴｒｅｇ安定性を保持していることを示した。加えて、本開示によるＴｒｅｇ増殖技術（制御性Ｔ細胞の初期集団を増殖するために、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチドを含む培地中で臍帯血から得られた制御性Ｔ細胞の初期集団を培養することにより、制御性Ｔ細胞の集団を製造する方法）が、免疫抑制機能を含むＴｒｅｇの表現型特性を維持するために信頼できることを示している。

【0046】

ＵＣＢおよびＰＢＭＣ由来のｎＴｒｅｇ数の、増殖の中間点およびエンドポイントにおける倍数変化
図６には、ＰＢＭＣ由来の増殖されたｎＴｒｅｇの数が、１１．３倍から２４．６倍までわずかに増加されたことが示されている。対照的に、増殖されたＵＣＢ由来のｎＴｒｅｇの数は、５２．６倍から培養のエンドポイントでの５００．８倍へと劇的に増加していた。したがって、制御性Ｔ細胞の初期集団を増殖するための本開示による方法（制御性Ｔ細胞の初期集団を増殖するために、臍帯血から得られた制御性Ｔ細胞の初期集団を、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のオリゴヌクレオチド（または、追加でＴＧＦβ１、およびラパマイシンを含む）を含む培地中で培養することにより、制御性Ｔ細胞の集団を製造する方法）は、ＰＢＭＣ由来のｎＴｒｅｇと比較して、ＵＣＢ由来のｎＴｒｅｇから高い収率をもたらすことが確認された。

【0047】