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特表2024-512842出血性脳卒中の予防又は治療のための薬物の製造におけるα－アサロンの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-21
(54)【発明の名称】出血性脳卒中の予防又は治療のための薬物の製造におけるα－アサロンの使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/09 20060101AFI20240313BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240313BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240313BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20240313BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240313BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20240313BHJP
【ＦＩ】
A61K31/09
A61P9/00
A61P25/00
A61P25/08
A61P25/28
A61K9/10
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023523130
(86)(22)【出願日】2021-07-22
(85)【翻訳文提出日】2023-04-10
(86)【国際出願番号】 CN2021107800
(87)【国際公開番号】W WO2023000247
(87)【国際公開日】2023-01-26
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507389842
【氏名又は名称】四川大学
(74)【代理人】
【識別番号】100169904
【弁理士】
【氏名又は名称】村井 康司
(74)【代理人】
【識別番号】100130443
【弁理士】
【氏名又は名称】遠藤 真治
(72)【発明者】
【氏名】毛声俊
(72)【発明者】
【氏名】高小▲鳳▼
(72)【発明者】
【氏名】▲羅▼▲麗▼君
(72)【発明者】
【氏名】李蕊
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼▲検▼
(72)【発明者】
【氏名】▲楊▼▲鵬▼
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼迪
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼▲チィー▼
(72)【発明者】
【氏名】▲楊▼惠媛
【テーマコード（参考）】
4C076
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C076AA16
4C076BB01
4C076BB11
4C076CC01
4C076CC11
4C076FF11
4C206AA01
4C206AA02
4C206CA34
4C206KA01
4C206MA01
4C206MA04
4C206MA42
4C206MA72
4C206MA86
4C206NA14
4C206ZA02
4C206ZA06
4C206ZA22
4C206ZA36
(57)【要約】
本発明は、出血性脳卒中を予防または治療するための薬物の製造におけるα－アサロンの使用を提供し、α－アサロンの構造は式Ｉに示され、モデルラットの短期神経機能欠損及び長期学習記憶機能を有意に改善し、脳浮腫を軽減し、血液脳関門透過性を改善し、回復期の脳組織萎縮を予防または緩和し、出血性脳卒中の動物モデルに対する明確な治療効果があり、明らかな毒性および副作用がなく、出血性脳卒中の予防／治療薬物として期待されている。
【化１】
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
出血性脳卒中を予防又は治療する薬物の製造における式Ｉで示される化合物の使用。【化1】
【請求項2】
前記薬物は、さらに、出血性脳卒中による二次性てんかんの予防又は治療に用いられることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記薬物は、出血性脳卒中の治療及び出血性脳卒中による二次てんかんの予防に用いられることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項4】
前記出血性脳卒中は、脳内出血及びくも膜下出血のうちの少なく一つに起因する脳卒中であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項5】
前記薬物は、ＩＣＨ又はＳＡＨによる神経機能又は運動機能の損傷の改善、ＩＣＨ又はＳＡＨによる急性脳組織水腫又は血液脳関門機能障害の改善、出血性脳卒中による急性死亡率の低下、生存期間の延長、出血性脳卒中による長期学習記憶機能障害の改善、及び出血性脳卒中回復期の脳組織の萎縮の防止又は緩和のうちの少なくとも一つに用いられることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項6】
前記式Ｉで示される化合物は、前記薬物の唯一の有効成分であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項7】
前記薬物は医薬補助剤を含有し、好ましくは、前記式Ｉで示される化合物と医薬補助剤との総重量比が１：２０～１０００であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項8】
前記薬物を出血性脳卒中に罹患した者の治療に用いられる場合、前記薬物の式Ｉで示される化合物の１日投与量範囲が０．１５ｍｇ～５．０ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは０．３ｍｇ～３．０ｍｇ／ｋｇ体重であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項9】
前記薬物の投与経路は、注射投与又は経口投与であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項10】
前記薬物は乳剤であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項11】
前記医薬組成物は式Ｉで示される化合物及び医薬補助剤を含有することを特徴とする、出血性脳卒中の予防又は治療に用いられる医薬組成物。【化2】
【請求項12】
前記医薬組成物は、さらに、出血性脳卒中による二次性てんかんの予防又は治療に用いられることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記医薬組成物は、出血性脳卒中の治療及び出血性脳卒中による二次てんかんの予防に用いられることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記式Ｉで示される化合物は、前記医薬組成物の唯一の有効成分であることを特徴とする、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記被験者に式Ｉで示される化合物の治療又は予防の有効量を投与することを含み、好ましくは、前記方法は被験者の出血性脳卒中の治療又は予防、出血性脳卒中による二次てんかんの治療又は予防に用いられ、より好ましくは、前記方法は被験者の出血性脳卒中の治療、出血性脳卒中による二次てんかんの予防に用いられる、被験者の出血性脳卒中の治療及び予防方法。【化3】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ医薬分野に属し、出血性脳卒中の治療又は予防のための薬物の製造におけるα－アサロンの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
脳卒中は現在、世界第２位の死因となっており、中国だけでも毎年４００万人近くの新規患者が発生し、世界で最も高い発症率となっている。脳卒中による死亡者数は毎年２００万人を超え、生き残った脳卒中患者の約２／３が永久に身体障害者になる。脳卒中は、臨床的には虚血性脳卒中と出血性脳卒中に分類される。出血性脳卒中とは、頭蓋骨内の血管が破裂して血液が脳に漏れ、それに伴う神経システム機能障害など様々な臨床症状が現れることである。出血性脳卒中は、発症率が比較的低いものの、死亡率と障害率が高い。脳組織内の出血部位により、出血性脳卒中は、脳内出血（Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ、ＩＣＨ）とくも膜下出血（Ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ、ＳＡＨ）の２種類に分けられる。ＩＣＨは脳内に、ＳＡＨは軟髄膜とくも膜の間に発生する。高血圧性脳出血は非外傷性ＩＣＨの最も一般的な原因であるのに対し、ＳＡＨの一般的な原因は頭蓋内動脈瘤である。
【0003】
出血性脳卒中による脳損傷は臨床治療の難点であり、障害の重要な原因である。脳損傷は一次脳損傷と二次脳損傷の２種類に分けられる。一次脳損傷は、初期出血による血腫及びその拡大による周辺脳組織の直接的な機械的圧迫損傷と虚血性変化を指し、グルタミン酸過負荷、カルシウム過負荷、ミトコンドリア機能障害などを含み、二次脳損傷のメカニズムはより複雑で、その病理学的経路には、血液脳関門破壊や脳浮腫形成、酸化ストレスや炎症反応、オートファジーやアポトーシス、ミクログリア活性化、脳内エネルギー代謝やプロテオーム変化、鉄の沈着などを含み、最終的には神経障害につながる。出血性脳卒中による脳損傷の病理学的メカニズムには、さまざまな要因とリンクが関与しており、多くの要因とリンクが相互作用し、相互に関連している。その中で、興奮性アミノ酸（例えばグルタミン酸）と抑制性アミノ酸（例えばγ－アミノ酪酸、ＧＡＢＡ）の不均衡な調節による神経細胞の興奮毒性が、出血性脳卒中の急性期神経細胞の損傷や死亡の主要因である。
【0004】
現在、出血性脳卒中患者の臨床治療は、主に薬物療法と手術療法を採用している。薬物療法は主に内科対症療法であり、頭蓋内圧の低下、血圧の調整、止血療法、低体温療法、脳代謝賦活剤、カルシウム拮抗剤などを含むが、効果は乏しい。手術療法は実際に患者の命を救う上で積極的な役割を果たしているが、患者の神経学的機能障害に対する有効性は理想的ではなく、より厳しい適用要件がある。現在までに、出血性脳卒中による神経損傷を治療し、それによって患者の生存率を高め、又は患者の予後を改善する薬物療法は承認されていない。したがって、出血性脳卒中を効果的に治療できる薬物を開発することは、臨床的に非常に重要である。
【0005】
α－アサロンは漢方薬石菖蒲（Ａｃｏｒｕｓ ｃａｌａｍｕｓ）の主な有効成分で、鎮静、鎮痙、抗けいれんなどの作用がある。研究によると、α－アサロンは、Ｎａ＋チャネルを遮断し、ＧＡＢＡＡ受容体を活性化することにより、抗てんかん作用を発揮できることが示されている（Ｗａｎｇ Ｚ Ｊ， Ｌｅｖｉｎｓｏｎ Ｓ Ｒ，Ｓｕｎ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ＧＡＢＡＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｖｏｌｔａｇｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｎａ＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ ａｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ ａｌｐｈａ－ａｓａｒｏｎｅ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１４，５（４０）：５－１１及びＨｕａｎｇ Ｃ， Ｌｉ Ｗ Ｇ，Ｚｈａｎｇ Ｘ Ｂ，ｅｔ ａｌ．ａｌｐｈａ－ａｓａｒｏｎｅ ｆｒｏｍ Ａｃｏｒｕｓ ｇｒａｍｉｎｅｕｓ ａｌｌｅｖｉａｔｅｓ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ａ－ｔｙｐｅ ＧＡＢＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１３，６５（２）：１－１１を参照されたい）。また、神経前駆細胞の増殖促進、抗酸化ストレス、ミクログリアの活性化抑制、神経炎症の抑制、神経細胞のアポトーシスの改善などの効果がある（Ｃｈｅｌｌｉａｎ Ｒ， Ｐａｎｄｙ Ｖ，Ｍｏｈａｍｅｄ Ｚ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｏｆ α－ ａｎｄ β－Ａｓａｒｏｎｅ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１７：４１－５８を参照されたい）。上記の研究は、α－アサロンが多種の神経薬理学的活性を有することを示唆しているにもかかわらず、これまで出血性脳卒中に対するα－アサロンの治療効果については報告されていない。
【0006】
一方、出血性脳卒中による二次性てんかんの臨床治療では、一般的に抗てんかん薬の予防投与は推奨されていない（中国医師会神経学会，中国医師会神経科脳血管疾患グループ，中国脳出血診断・治療ガイドライン２０１９［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２０１９，５２（１２）：９９４－１００５．）、その理由は、抗てんかん薬は副作用が高く、抗てんかん薬の予防投与は出血性脳卒中患者の神経機能を損なう恐れがあるからである。
【発明の概要】
【0007】
先行技術における出血性脳卒中の予防又は治療のための薬物の不足を克服するために、本発明はα－アサロンの新規な使用を提供する。
【0008】
このため、本発明は、下記の技術的解決策を提供する。
【0009】
本発明は、出血性脳卒中の予防又は治療のための薬物の製造における式Ｉで示される化合物（トランス－２，４，５－トリメトキシ－１－プロペニルベンゼン、別名α－アサロン）の使用を提供する。
本発明は、予想外に、式Ｉで示される化合物が、モデルラットの短期神経機能欠損及び長期学習記憶機能を有意に改善し、脳浮腫を軽減し、血液脳関門透過性を改善し、回復期の脳組織の萎縮を予防又は緩和し、出血性脳卒中の動物モデルに対して明確な治療効果を有し、明らかな毒性と副作用がないことを見出した。本発明は、血管内穿刺により構築されたクモ膜下出血モデルラット及びコラゲナーゼ注入により構築された脳実質出血モデルラットの治療に、α－アサロン、陽性薬物ビンポセチン注射液及びニモジピン注射液を用いることにより、α－アサロンがモデルラットの患側脳組織の浮腫を著しく軽減し、血液脳関門透過性を改善し、回復期のモデルラットの脳組織の萎縮を予防又は緩和し、短期神経機能スコア及び長期学習記憶機能を著しく改善することを明らかにした。また、α－アサロンはモデルラットの急性出血性脳卒中による二次性てんかんの発生率や死亡率を有意に低下させ、生存期間を延長させることができる。
【化1】
【0010】
いくつかの実施形態において、前記薬物はさらに、出血性脳卒中による二次てんかんを予防又は治療するために使用される。好ましくは、前記薬物は、出血性脳卒中の治療及び出血性脳卒中による二次性てんかんの予防のために使用される。
【0011】
いくつかの実施形態において、前記出血性脳卒中は、脳内出血（Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ、ＩＣＨ）及びくも膜下出血（Ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ，ＳＡＨ）の少なくとも一つによって引き起こされる脳卒中である。
【0012】
本発明において、前記式Ｉで示される化合物は下記の薬理作用を有する：（１）過剰なグルタミン酸による神経興奮毒性に拮抗する、（２）グルタミン酸及びＧＡＢＡの異常上昇を抑える、（３）神経細胞のカルシウムの流入を抑制し、細胞内カルシウム過剰を抑える、（４）神経細胞のミトコンドリア膜電位を安定化して神経細胞のアポトーシスを抑える、（５）損傷神経細胞の酸化的ストレス反応を軽減する。
【0013】
本発明において、前記薬物は下記の薬理作用を有する：（１）過剰なグルタミン酸による神経興奮毒性に拮抗する、（２）グルタミン酸及びＧＡＢＡレベルの異常上昇を抑える、（３）神経細胞のカルシウム流入を抑制し、細胞内カルシウム過剰を抑える、（４）神経細胞のミトコンドリア膜電位を安定化し、神経細胞のアポトーシスを抑える、（５）損傷神経細胞の酸化的ストレス反応を軽減する。
【0014】
本発明において、前記薬物は、（１）モデルラットの脳内グルタミン酸量を減少させることにより、脳出血によるグルタミン酸興奮毒性を拮抗する、（２）ＧＡＢＡレベルを回復させ、モデルラットの運動機能の回復を促進する、（３）Ｃａ２＋流入を抑制し、Ｃａ２＋過剰負荷による有害生化学反応及び興奮毒性を緩和する、（４）ミトコンドリア膜電位を安定化し、神経細胞のアポトーシスを抑制する、（５）神経細胞の酸化ストレス及び損傷を低減することにより、脳浮腫を軽減し、血液脳関門透過性を改善し、回復期の脳組織の萎縮を予防又は緩和し、モデルラットの短期神経機能欠損及び長期学習記憶機能障害を改善し、抗出血性脳卒中作用を発揮する。
【0015】
いくつかの実施形態において、前記薬物は、下記の少なくとも一つのために使用される：神経又は運動機能の損傷（例えば、ＩＣＨ又はＳＡＨによる神経又は運動機能の損傷）の改善、二次性早期脳損傷（例えば、急性期脳組織水腫又は血液脳関門機能障害、例えば、ＩＣＨ又はＳＡＨによる急性期脳組織水腫又は血液脳関門機能障害）の軽減、出血性脳卒中による急性期死亡率の低下、生存期間の延長、脳出血による長期学習記憶障害の改善、及び出血性脳卒中の回復期の脳組織の萎縮の予防又は緩和である。
【0016】
いくつかの実施形態において、前記式Ｉで示される前記化合物は前記薬物の唯一の有効成分である。
【0017】
いくつかの実施形態において、前記薬物は、医薬補助剤を含んでもよい。好ましくは、前記式Ｉで示される化合物は医薬補助剤との総重量比は１：２０～１０００であり、例えば１：２０～２００である。より好ましくは、前記式Ｉで示される化合物は前記薬物の唯一の有効成分であり、医薬補助剤との総重量比は１：２０～１０００であり、例えば１：２０～２００である。
【0018】
いくつかの実施形態において、前記薬物の投与対象は、ヒト又は動物であってよい。前記薬物を出血性脳卒中モデルラットの治療に用いる場合、前記薬物における式Ｉで示される化合物の１日の有効量は、５ｍｇ～４０ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。前記薬物を出血性脳卒中に罹患したヒトの治療に用いる場合、前記薬物における式Ｉで示される化合物の１日の投与量範囲は、０．１５ｍｇ～５．０ｍｇ／ｋｇ体重とすることができ、好ましくは０．３ｍｇ～３．０ｍｇ／ｋｇ体重であり、例えば、１日に２～３回投与し、１回の投与量範囲は０．１５ｍｇ～１．５ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは０．３ｍｇ～１．５ｍｇ／ｋｇ体重である。上記の投与量は、異なる動物種間の用量換算関係に従って求めることができる。
【0019】
いくつかの実施形態において、前記薬物の投与経路は、注射投与、経口投与、皮下埋め込み投与、吸入投与、経皮投与、経粘膜投与などである。好ましくは、前記薬物の投与経路は、注射投与（好ましくは静脈内注射投与）又は経口投与である。
【0020】
本発明において、式Ｉで示される化合物が脳に入り、治療有効濃度に達することができる剤形であれば、前記薬物は、ヒト及び／又は動物への使用に適した剤形、例えば、異なる投与経路に適合する任意の剤形とすることができる。いくつかの実施形態において、前記薬物は乳剤（例えば、乳状注射液、経口乳剤）である。乳剤は、現在市販されている注射剤（溶液型注射剤）に比べて安全性に優れ、錠剤に比べて生物学的利用能が高い。
【0021】
いくつかの実施形態において、前記乳剤は、式Ｉで示される化合物、薬学的に利用可能な油、薬学的に利用可能な乳化剤、及び水を含有してもよい。
【0022】
ここで、前記薬学的に利用可能な油は、大豆油、中鎖油、オリーブ油及び魚油のうちの少なくとも一つからなってもよい。
【0023】
ここで、前記薬学的に使用可能な乳化剤は、卵黄レシチン、大豆レシチン、プルロニック（登録商標）Ｆ－６８及びポリエチレングリコールステアリン酸－１５（Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ１５）のうちの少なくとも一つからなってもよい。
【0024】
ここで、前記水は、注射用水又は精製水であってもよい。
【0025】
ここで、乳化特性によっては、前記乳剤は、オレイン酸及びオレイン酸ナトリウムのうちの少なくとも一つを含有してもよい。製剤は、オレイン酸を油相に、オレイン酸ナトリウムを水相に溶解して実施されるが、両者の混合物を油相と水相にそれぞれ溶解してもよい。
【0026】
ここで、前記乳剤は、さらにグリセロールを含有してもよい。
【0027】
ここで、前記乳剤は、酸化防止剤をさらに含有してもよい。前記酸化防止剤は、重亜硫酸ナトリウム、ビタミンＥ、ピロガル酸エステル等であってもよい。
【0028】
ここで、経口投与する場合、前記乳剤は、防腐剤や矯味剤などの他の適切な添加物の少なくとも一つを含有してもよい。前記防腐剤は当技術分野で通常の防腐剤であってもよく、例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、エチルパラベン、プロピルエステル及びブチルエステルなどである。前記矯味剤は、当該技術分野で通常の矯味剤であってもよく、例えば、甘味料、芳香剤、ミューシレージ又は発泡剤である。前記甘味料は、シンプルシロップ、ステビオシド、アスパルテームなどであってもよく、前記芳香剤は、アップルフレーバー、ストロベリーフレーバーなどのフルーツフレーバーなどであってもよく、前記ミューシレージは、ゼラチン、メチルセルロースマスチックなどであってもよく、前記発泡剤は、クエン酸、酒石酸と炭酸水素ナトリウムの混合物であってもよい。
【0029】
いくつかの実施形態において、重量パーセントで前記乳剤は、０．５％～５％の式Ｉで示される化合物、５％～３０％の薬学的に利用可能な油、０．６％～１．８％の乳化剤、０％～２．５％のグリセロール、及び残部の水（例えば精製水又は注射用水）を含んでもよい。乳剤中の式Ｉで示される化合物の濃度は、ある範囲内で変化することができ、濃度変化の範囲は投与量、投与体積及び式Ｉで示される化合物の油相への溶解度に依存する。
【0030】
いくつかの実施形態において、前記乳剤は、乳剤注射液である。好ましくは、前記乳剤注射液において、式Ｉで示される化合物と医薬補助剤（注射用水を含む）との合計重量比が１：２０～１０００であり、例えば１：２０～２００である。
【0031】
ここで、前記乳剤の製造方法は、式Ｉで示される化合物、薬学的に利用可能な油、薬学的に利用可能な乳化剤及び水を高速せん断により混合して初乳を得るステップ、初乳を高圧で均質化して乳剤を得るステップを含んでもよい。
【0032】
いくつかの実施形態において、前記乳剤の製造方法は、下記のステップを含んでもよい：
ステップ１：窒素又は不活性ガスの保護下で、式Ｉで示される化合物を６０～８０℃の薬学的に利用可能な油に溶解して油相を得、次いで乳化剤及びグリセリンを６０～８０℃の水に溶解又は分散させて水相を得る。又は、窒素又は不活性ガスの保護下で、式Ｉで示される化合物と乳化剤を６０～８０℃の薬学的に利用可能な油に溶解又は分散させて油相を得、次いでグリセリンを６０～８０℃の水に溶解して水相を得る。
ステップ１：窒素又は不活性ガスの保護下で、式Ｉで示される化合物を６０～８０℃の薬学的に利用可能な油に溶解して油相を得、次いで乳化剤及びグリセリンを６０～８０℃の水に溶解又は分散させて水相を得る。又は、窒素又は不活性ガスの保護下で、式Ｉで示される化合物と乳化剤を６０～８０℃の薬学的に利用可能な油に溶解又は分散させて油相を得、次いでグリセリンを６０～８０℃の水に溶解して水相を得る。
【0033】
ステップ２：上記の油相と水相を高速せん断により混合し、油相を水相に分散させて初乳を得る。
【0034】
ステップ３：初乳を高圧で均質化し（均質化回数は例えば、高圧均質化１～３回）、乳滴の平均粒径が０．５μｍを超えないようにし、ろ過し、窒素又は不活性ガス保護下で、ガラスアンプル、輸液ボトル、バイアル、ソフトバッグなどの薬用容器に充填する。投与経路に応じて、ロータリーオートクレーブ滅菌や滅菌せずに防腐剤を添加することで乳剤を得る。
【0035】
前記高速せん断のせん断速度は、当該分野において乳剤の少量試験又は大規模生産の製造のために使用される従来のせん断速度であってよく、例えば、少量実験室試験用では１００００～２００００ ｒ・ｍｉｎ－１であってよく、また例えば大規模生産用では２０００～４０００ ｒ・ｍｉｎ－１であり、実際のせん断速度は、せん断半径により異なり、いずれもせん断力の大きさを決定する。
【0036】
前記高速せん断のせん断時間は、当該分野において乳剤の製造に使用される従来のせん断時間であってよく、例えば、３～１０分であってよく、また例えば、５～８分である。
【0037】
前記高圧均質化の均質化圧力は、当該分野において乳剤の製造に使用される従来の均質化圧力であってよく、例えば、５００～１５００ｂａｒであってよく、また例えば５００～１０００ｂａｒである。
【0038】
前記高圧均質化のサイクル回数は、当該分野において乳剤の製造に使用される従来のサイクル回数であってよく、例えば、１～３回であってよい。
【0039】
本発明はまた、出血性脳卒中の予防又は治療のための医薬組成物を提供し、ここで、前記医薬組成物は、式Ｉで示される化合物及び医薬補助剤を含有する。
【0040】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、出血性脳卒中に起因する二次性てんかんを予防又は治療するためにさらに使用される。
【0041】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、出血性脳卒中を治療するため、及び出血性脳卒中に起因する二次性てんかんを予防するために使用される。
【0042】
いくつかの実施形態において、前記式Ｉで示される化合物は、前記医薬組成物における唯一の有効成分である。
【0043】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は乳剤である。
【0044】
本発明はまた、前記被験者に、式Ｉで示される化合物の治療又は予防の有効量を投与することを含む、被験者の出血性脳卒中の治療又は予防方法を提供する。
【0045】
好ましくは、前記方法は、被験者の出血性脳卒中の治療又は予防に用いられ、出血性脳卒中に起因する二次性てんかんの治療又は予防に用いられる。
【0046】
より好ましくは、前記方法は、被験者の出血性脳卒中の治療に用いられ、出血性脳卒中による二次性てんかんの予防に用いられる。
【0047】
定義と説明
特に明記しない限り、本明細書で使用される下記の用語及び語句は、下記の意味を有している。特定の用語又は語句は、特定の定義なしに不確定又は不明確であると見なされるべきではなく、通常の意味で理解されるべきである。本明細書に商品名が現れる場合、それは対応する商品又はその有効成分を指すことを意図している。
特に明記しない限り、本明細書で使用される下記の用語及び語句は、下記の意味を有している。特定の用語又は語句は、特定の定義なしに不確定又は不明確であると見なされるべきではなく、通常の意味で理解されるべきである。本明細書に商品名が現れる場合、それは対応する商品又はその有効成分を指すことを意図している。
【0048】
特に明記しない限り、本発明において、用語「薬学的に使用可能な」とは、それらの化合物、材料、組成物及び／又は剤形について、それらは健全な医学的判断の範囲内で、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適し、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題や合併症なしに、合理的な利益／リスク比に見合うことを指す。
【0049】
特に明記しない限り、本発明において、用語「薬学的に許容される量の」とは、それらの化合物、材料、組成物及び／又は剤形の量について、それらは健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題や合併症なしに、合理的な利益／リスク比に見合うことを指す。
【0050】
特に明記しない限り、用語「医薬補助剤」とは、医薬品の製造や処方箋の作成に使用される賦形剤や添加剤を指し、活性成分以外の薬物製剤に含まれるすべての物質である。中華人民共和国薬局方（２０２０年版）第４部、又はＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ （Ｒａｙｍｏｎｄ Ｃ Ｒｏｗｅ、２００９ Ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照されたい。
【0051】
特に明記しない限り、用語「治療」とは治療療法を指す。特定の障害に関して、治療とは、（１）疾患又は病症の一つ又は複数の生物学的症状を軽減すること、（２）（ａ）病症になる、又は引き起こす生物学的カスケードの一つ又は複数のポイント、又は（ｂ）病症の一つ又は複数の生物学的症状を妨害すること、（３）病症に関連する一つ又は複数の症状、影響又は副作用、又は病症又はその治療に関連する一つ又は複数の症状、影響又は副作用を改善すること、又は（４）病症又は病症の一つ又は複数の生物学的症状の進行を遅らせることを指す。
【0052】
特に明記しない限り、用語「予防」とは、疾患、障害、又は病症を獲得又は発症するリスクの低下を指す。
【0053】
特に明記しない限り、用語「治療有効量」とは、被験者に投与される場合に、本明細書に記載の疾患又は病症を治療するのに十分な化合物の量を指す。「治療有効量」は、化合物、病症及びその重症度、ならびに治療される患者の年齢に応じて変化するが、当業者によって必要に応じて調整することができる。有効量は、投与対象（ヒト又は動物など）によっても異なる。
【0054】
特に明記しない限り、用語「予防有効量」とは、疾患、障害又は病症を予防するのに十分な量、又は疾患、障害又は病症に関連する一つ又は複数の症状を予防するのに十分な量、又は疾患、障害又は病症の再発を予防するのに十分な量を指す。
【0055】
特に明記しない限り、用語「被験者」とは、本発明の実施例に従って化合物が投与される、又は投与された任意の動物を指し、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。用語「哺乳動物」とは、任意の哺乳動物を含む。哺乳動物の例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなどが挙げられるが、これらに限定されず、ヒトが最も好ましい。
【0056】
本発明において反応温度を特定しない場合、反応温度は室温であり、室温は通常２０～３５℃である。
【0057】
特に明記しない限り、本発明における「出血性脳卒中に起因する二次性てんかん」とは、患者自身はてんかんの既往がなく、出血性脳卒中による二次性てんかん発作（出血性脳卒中とは関係のない病変を除く）を指す。
【0058】
当該技術分野における常識に反しないことに基づいて、上記の好ましい条件を任意に組み合わせて、本発明の好ましい例を得ることができる。
【0059】
本発明で使用する試薬及び原料はすべて市販されている。
【0060】
本発明の積極的な進歩的効果としては：
本発明は、α－アサロンが出血性脳卒中の治療／予防効果を有することを初めて開示し、薬力学的メカニズムの研究結果は、α－アサロンが（１）モデルラットの脳内のグルタミン酸の含有量を減少させることで、脳出血によって引き起こされるグルタミン酸興奮毒性に拮抗する、（２）ＧＡＢＡレベルを回復し、モデルラットの運動機能の回復を促進する、（３）Ｃａ２＋流入を減らし、Ｃａ２＋過負荷によって引き起こされる有害な生化学反応と興奮毒性を緩和する、（４）ミトコンドリア膜電位を安定化し、神経細胞アポトーシスを軽減する、（５）神経細胞の酸化ストレス及び損傷を軽減し、それによって脳浮腫を軽減し、脳損傷を軽減し、血液脳関門透過性を改善し、回復期の脳組織萎縮を予防又は緩和し、さらに、モデルラットの短期神経機能欠損及び長期学習記憶機能障害を改善し、モデルラットの急性期におけるてんかんの発生率及び死亡率を有意に低下させ、生存期間を延長し、生存率を改善し、予後を改善し、抗出血性脳卒中の効果を発揮することを示す。
本発明は、α－アサロンが出血性脳卒中の治療／予防効果を有することを初めて開示し、薬力学的メカニズムの研究結果は、α－アサロンが（１）モデルラットの脳内のグルタミン酸の含有量を減少させることで、脳出血によって引き起こされるグルタミン酸興奮毒性に拮抗する、（２）ＧＡＢＡレベルを回復し、モデルラットの運動機能の回復を促進する、（３）Ｃａ２＋流入を減らし、Ｃａ２＋過負荷によって引き起こされる有害な生化学反応と興奮毒性を緩和する、（４）ミトコンドリア膜電位を安定化し、神経細胞アポトーシスを軽減する、（５）神経細胞の酸化ストレス及び損傷を軽減し、それによって脳浮腫を軽減し、脳損傷を軽減し、血液脳関門透過性を改善し、回復期の脳組織萎縮を予防又は緩和し、さらに、モデルラットの短期神経機能欠損及び長期学習記憶機能障害を改善し、モデルラットの急性期におけるてんかんの発生率及び死亡率を有意に低下させ、生存期間を延長し、生存率を改善し、予後を改善し、抗出血性脳卒中の効果を発揮することを示す。
【0061】
本発明は予想外に、α－アサロンはＳＡＨの急性期にあるラットの神経機能欠損の改善において、効果がビンポセチン注射液よりも有意に優れていること、ＳＡＨ回復期にあるラットの学習記憶機能の改善及び脳組織萎縮の予防又は緩和において、効果がニモジピン注射液より有意に優れていること、ＩＣＨラットの神経機能欠損の改善において、効果がニモジピン注射液より有意に優れて、ビンポセチン注射液よりも有意に優れていることを発見した。したがって、α－アサロンは出血性脳卒中の予防／治療薬物として期待されている。
【0062】
α－アサロンは安全かつ効果的であり、本発明の全実験プロセスにおいて、α－アサロンの明らかな毒性及び副作用は見られなかった。
【図面の簡単な説明】
【0063】
【図1】図１：ＳＡＨラットの学習記憶機能及び回復期脳組織萎縮に対するα－アサロンの影響である。Ａ：各ラット群の獲得訓練時のプラットフォーム発見までの潜伏期であり、Ｂ：空間探査時の各ラット群の標的象限での滞留時間と遊泳速度であり、Ｃ：各ラット群の空間探査時の活動のヒートマップで、プラットフォームの位置は円で示し、その位置する象限は標的象限であり、Ｄ：水迷路実験終了後、心臓灌流によって脳が採取され、各群の脳組織萎縮状況である。Ｐ、Ｓ、Ｍ、Ｎはそれぞれ偽手術群、ＳＡＨモデル群、α－アサロン中用量群、ニモジピン注射群を示す。偽手術群と比較して、＃＃＃Ｐ＜０．００１、＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５であり、モデル群と比較して、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５であり、α－アサロン中用量群と比較して、＆＆＆Ｐ＜０．００１、＆＆Ｐ＜０．０１である。
【図2】図２：モデルラットにおける脳浮腫及び血液脳関門透過性に対するα－アサロンの影響である。Ａ：各群のＳＡＨラットの脳組織の異なる部位の水分量であり、Ｂ：各群のＳＡＨラットの脳組織からのエバンスブルーの滲出量であり、Ｃ：各群のＩＣＨラットの脳組織の異なる部位の水分量であり、Ｄ：各群のＩＣＨラットの脳組織からのエバンスブルーの滲出量である。Ｐ、Ｓ、Ｉ、Ｍはそれぞれ偽手術群、ＳＡＨモデル群、ＩＣＨモデル群、α－アサロン中用量群であり、偽手術群と比較して、＃＃＃Ｐ＜０．００１、＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５であり、モデル群と比較して、＊Ｐ＜０．０５である。
【図3】図３：モデルラットの脳組織におけるグルタミン酸とＧＡＢＡの含有量に対するα－アサロンの影響である。Ａ：各群のＳＡＨラットの脳組織中のグルタミン酸含有量であり、Ｂ：各群のＳＡＨラットの脳組織中のＧＡＢＡ含有量であり、Ｃ：各群のＩＣＨラットの血腫周囲の脳組織中のグルタミン酸含有量であり、Ｄ：各群のＩＣＨラットの血腫周囲の脳組織中のＧＡＢＡ含有量である。偽手術群と比較して、＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５であり、モデル群と比較して、＊Ｐ＜０．０５である。
【図4】図４：モデルラット脳組織におけるカルシウムイオンとミトコンドリア膜電位に対するα－アサロンの影響である。Ａ：各群のＳＡＨラットの脳組織中のカルシウムイオン量の測定結果であり、Ｂ：各群のＳＡＨラットの脳組織中のミトコンドリア膜電位の測定結果であり、Ｃ：各群のＳＡＨラットの脳組織中のカルシウムイオンとミトコンドリア膜電位の蛍光強度の統計図であり、Ｄ：各群のＩＣＨラットの脳組織中のカルシウムイオン量の測定結果であり、Ｅ：各群のＩＣＨラットの脳組織中のミトコンドリア膜電位の測定結果であり、Ｆ：各群のＩＣＨラットの脳組織中のカルシウムイオンとミトコンドリア膜電位の蛍光強度の統計図である。偽手術群と比較して、＃＃＃Ｐ＜０．００１、＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５であり、モデル群と比較して、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１である。
【発明を実施するための形態】
【0064】
下記、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明は記載される実施例の範囲に限定されるものではない。下記の実施例における特定の条件のない実験方法は、従来の方法及び条件に従って、又は製品の説明に従って選択される。
【0065】
製造実施例１α－アサロン注射乳剤の製造
α－アサロン０．５０～５０．０ｇ、注射用大豆油５０．０～３００．０ｇを秤量し、適当な容器に入れ、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させた。引き続き卵黄レシチン６．０ｇ～１８．０ｇを秤量し、それに添加し、撹拌して溶解させ（必要に応じて、オレイン酸、オレイン酸ナトリウム又は両者の混合物を０．１０～０．５０ｇ加える）、油相を製造して予備した。また、プルロニック（登録商標）（Ｆ６８）０～３．０ｇ、グリセロール０～２５．０ｇを秤量し、水約８００ｍＬを量り、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、攪拌して溶解させ、水相とした。上記油相を水相に加え、高速で５～１５分間せん断し、水を加えて１０００ｍＬとし、初乳を製造した。引き続き初乳を高圧ホモジナイザーで１～３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が０．５μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンで濾過し、濾液を窒素ガスの保護下で５ｍＬ～２０ｍＬのガラスアンプルに充填し、１２１℃×８～１２分間でロータリーホットプレス滅菌して、α－アサロンを０．５～５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含むα－アサロン注射乳剤が得られた。
α－アサロン０．５０～５０．０ｇ、注射用大豆油５０．０～３００．０ｇを秤量し、適当な容器に入れ、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させた。引き続き卵黄レシチン６．０ｇ～１８．０ｇを秤量し、それに添加し、撹拌して溶解させ（必要に応じて、オレイン酸、オレイン酸ナトリウム又は両者の混合物を０．１０～０．５０ｇ加える）、油相を製造して予備した。また、プルロニック（登録商標）（Ｆ６８）０～３．０ｇ、グリセロール０～２５．０ｇを秤量し、水約８００ｍＬを量り、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、攪拌して溶解させ、水相とした。上記油相を水相に加え、高速で５～１５分間せん断し、水を加えて１０００ｍＬとし、初乳を製造した。引き続き初乳を高圧ホモジナイザーで１～３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が０．５μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンで濾過し、濾液を窒素ガスの保護下で５ｍＬ～２０ｍＬのガラスアンプルに充填し、１２１℃×８～１２分間でロータリーホットプレス滅菌して、α－アサロンを０．５～５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含むα－アサロン注射乳剤が得られた。
【0066】
製造実施例２α－アサロン注射乳剤の製造
α－アサロン１０．０ｇ、注射用大豆油５０．０ｇ、注射用中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）５０．０ｇを秤量し、適当な容器に入れ、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させた。引き続き卵黄レシチン１２．０ｇ、オレイン酸ナトリウム０．３ｇを秤量し、それに加え、撹拌して溶解させ、油相を製造して予備した。グリセロール２２．０ｇを秤量し、水約８００ｍＬを量り、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させ、水相とした。上記油相を水相に加え、高速で５～１５分間せん断し、水を加えて１０００ｍＬとし、初乳を製造した。引き続き初乳を高圧ホモジナイザーで１～３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が０．５μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンで濾過し、濾液を窒素ガスの保護下で５ｍＬ又は１０ｍＬのガラスアンプルに充填し、１２１℃×８分間でロータリーホットプレス滅菌して、α－アサロンを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含むα－アサロン注射乳剤が得られた。
α－アサロン１０．０ｇ、注射用大豆油５０．０ｇ、注射用中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）５０．０ｇを秤量し、適当な容器に入れ、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させた。引き続き卵黄レシチン１２．０ｇ、オレイン酸ナトリウム０．３ｇを秤量し、それに加え、撹拌して溶解させ、油相を製造して予備した。グリセロール２２．０ｇを秤量し、水約８００ｍＬを量り、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させ、水相とした。上記油相を水相に加え、高速で５～１５分間せん断し、水を加えて１０００ｍＬとし、初乳を製造した。引き続き初乳を高圧ホモジナイザーで１～３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が０．５μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンで濾過し、濾液を窒素ガスの保護下で５ｍＬ又は１０ｍＬのガラスアンプルに充填し、１２１℃×８分間でロータリーホットプレス滅菌して、α－アサロンを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含むα－アサロン注射乳剤が得られた。
【0067】
製造実施例３α－アサロン注射乳剤の製造
α－アサロン２０．０ｇ、注射用大豆油１００．０ｇ、注射用中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）１００．０ｇを秤量し、適当な容器に入れ、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させた。引き続き卵黄レシチン１２．０ｇ、オレイン酸０．３ｇを秤量してそれに加え、撹拌して溶解させ、油相を製造して予備した。グリセロール２２．０ｇを秤量し、水約８００ｍＬを量り、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させ、水相とした。上記油相を水相に加え、高速で５～１５分間せん断し、水を加えて１０００ｍＬとし、初乳を製造した。初乳を高圧ホモジナイザーで１～３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が０．５μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンで濾過し、濾液を窒素ガスの保護下で５ｍＬ又は１０ｍＬのガラスアンプルに充填し、１２１℃×８分間でロータリーホットプレス滅菌し、α－アサロンを２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含むα－アサロン注射乳剤が得られた。
α－アサロン２０．０ｇ、注射用大豆油１００．０ｇ、注射用中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）１００．０ｇを秤量し、適当な容器に入れ、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させた。引き続き卵黄レシチン１２．０ｇ、オレイン酸０．３ｇを秤量してそれに加え、撹拌して溶解させ、油相を製造して予備した。グリセロール２２．０ｇを秤量し、水約８００ｍＬを量り、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させ、水相とした。上記油相を水相に加え、高速で５～１５分間せん断し、水を加えて１０００ｍＬとし、初乳を製造した。初乳を高圧ホモジナイザーで１～３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が０．５μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンで濾過し、濾液を窒素ガスの保護下で５ｍＬ又は１０ｍＬのガラスアンプルに充填し、１２１℃×８分間でロータリーホットプレス滅菌し、α－アサロンを２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含むα－アサロン注射乳剤が得られた。
【0068】
製造実施例４α－アサロン注射乳剤の製造
α－アサロン１．０ｇ、注射用大豆油１００．０ｇを秤量し、適当な容器に入れ、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させた。引き続き卵黄レシチン１２．０ｇ、オレイン酸０．３ｇを秤量し、それに加え、撹拌して溶解させ、油相を製造して予備した。グリセロール２２．０ｇを秤量し、水約８００ｍＬを量り、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させ、水相とした。上記油相を水相に加え、高速で５～１５分間せん断し、水を加えて１０００ｍＬとし、初乳を製造した。初乳を高圧ホモジナイザーで１～３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が０．５μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンでろ過し、ろ液を窒素ガスの保護下で５０ｍＬ輸液瓶に充填し、１２１℃×１２分間でロータリーホットプレス滅菌し、α－アサロンを１ｍｇ／ｍＬの濃度で含むα－アサロン注射乳剤が得られた。
α－アサロン１．０ｇ、注射用大豆油１００．０ｇを秤量し、適当な容器に入れ、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させた。引き続き卵黄レシチン１２．０ｇ、オレイン酸０．３ｇを秤量し、それに加え、撹拌して溶解させ、油相を製造して予備した。グリセロール２２．０ｇを秤量し、水約８００ｍＬを量り、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させ、水相とした。上記油相を水相に加え、高速で５～１５分間せん断し、水を加えて１０００ｍＬとし、初乳を製造した。初乳を高圧ホモジナイザーで１～３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が０．５μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンでろ過し、ろ液を窒素ガスの保護下で５０ｍＬ輸液瓶に充填し、１２１℃×１２分間でロータリーホットプレス滅菌し、α－アサロンを１ｍｇ／ｍＬの濃度で含むα－アサロン注射乳剤が得られた。
【0069】
製造実施例５α－アサロン経口乳剤の製造
製造方法は実施例１と同様であり、油相にはビタミンＥ、ピロガル酸エステルなどの薬学的に許容される量の抗酸化剤を加えることができ、油相にはエチルパラベンなどの薬学的に許容される量の防腐剤を加えることができる。水相には芳香のある果汁シロップなどの薬学的に許容される量の矯味剤を加えることができ、水相には安息香酸、安息香酸ナトリウムなどの薬学的に許容される量の防腐剤を加えることができる。初乳も同様の方法で製造し、引き続き初乳を高圧ホモジナイザーで１～３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が１０μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンでろ過し、ろ液を窒素ガスの保護下で適当な医薬包装に充填し、１００℃×３０分、又は１２１℃×８分で流動蒸気滅菌し、α－アサロン経口乳剤が得られた。
製造方法は実施例１と同様であり、油相にはビタミンＥ、ピロガル酸エステルなどの薬学的に許容される量の抗酸化剤を加えることができ、油相にはエチルパラベンなどの薬学的に許容される量の防腐剤を加えることができる。水相には芳香のある果汁シロップなどの薬学的に許容される量の矯味剤を加えることができ、水相には安息香酸、安息香酸ナトリウムなどの薬学的に許容される量の防腐剤を加えることができる。初乳も同様の方法で製造し、引き続き初乳を高圧ホモジナイザーで１～３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が１０μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンでろ過し、ろ液を窒素ガスの保護下で適当な医薬包装に充填し、１００℃×３０分、又は１２１℃×８分で流動蒸気滅菌し、α－アサロン経口乳剤が得られた。
【0070】
製造実施例６α－アサロン注射乳剤の製造
α－アサロン１．０ｇ～２０．０ｇ、注射用大豆油５０．０ｇ～２００．０ｇを秤量し、適当な容器に入れ、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させた。引き続き卵黄レシチン１２．０ｇ、オレイン酸０．３ｇを秤量してそれに加え、撹拌して溶解させ、油相を製造して予備した。グリセロール２２．０ｇを秤量し、水約８００ｍＬを量り、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱して撹拌して溶解させ、水相とした。上記油相を水相に加え、高速で５～１５分間せん断し、水を加えて１０００ｍＬとし、初乳を製造した。初乳を高圧ホモジナイザーで１～３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が０．５μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンでろ過し、ろ液を窒素ガスの保護下で２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬのガラスアンプルに充填し、１２１℃×８～１２分間でロータリーホットプレス滅菌し、α－アサロンの含有量が１ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬであるα－アサロン乳状注射液が得られた。
α－アサロン１．０ｇ～２０．０ｇ、注射用大豆油５０．０ｇ～２００．０ｇを秤量し、適当な容器に入れ、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱し、撹拌して溶解させた。引き続き卵黄レシチン１２．０ｇ、オレイン酸０．３ｇを秤量してそれに加え、撹拌して溶解させ、油相を製造して予備した。グリセロール２２．０ｇを秤量し、水約８００ｍＬを量り、窒素ガスの保護下で６０～８０℃に加熱して撹拌して溶解させ、水相とした。上記油相を水相に加え、高速で５～１５分間せん断し、水を加えて１０００ｍＬとし、初乳を製造した。初乳を高圧ホモジナイザーで１～３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が０．５μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンでろ過し、ろ液を窒素ガスの保護下で２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬのガラスアンプルに充填し、１２１℃×８～１２分間でロータリーホットプレス滅菌し、α－アサロンの含有量が１ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬであるα－アサロン乳状注射液が得られた。
【0071】
製造実施例７α－アサロン注射乳剤（別名：乳状注射液）の製造
実験材料：
α－アサロン（２８８３－９８－９、Ｗｕｈａｎ Ｌａｎａｂａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
注射用大豆油（ＤＤ２０２００６０３、Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｒｕｉｓｈｅｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
卵黄レシチン（２０２００８０１３、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｔａｉｗｅｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
オレイン酸（１６０９０７、Ｘｉ’ａｎ Ｌｉｂａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
グリセロール（２０１９１２１３、Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｓｕｉｃｈａｎｇ Ｈｕｉｋａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
実験ステップ：α－アサロン１０．０ｇ、注射用大豆油１００．０ｇを秤量し、適当な容器に入れ、窒素ガスの保護下で８０℃に加熱し、撹拌して溶解させた。引き続き卵黄レシチン１２．０ｇ、オレイン酸０．３ｇを秤量し、それに加えて撹拌して溶解させ、油相を製造して予備した。グリセロール２２．０ｇを秤量し、水約８００ｍＬを量り、窒素ガスの保護下で８０℃に加熱し、撹拌して溶解させ、水相とした。上記油相を水相に添加し、１９０００ｒ／ｍｉｎで１０分間高速でせん断して油相を水相に分散させ、水を加えて１０００ｍＬとし、初乳を製造した。引き続き初乳を高圧ホモジナイザーで１０００ｂａｒの圧力で３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が０．５μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンでろ過し、ろ液を窒素ガスの保護下で２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬのガラスアンプルに充填し、１２１℃×８分でロータリーホットプレス滅菌し、α－アサロン含有量が１０ｍｇ／ｍＬであるα－アサロン乳状注射液が得られ、バッチ番号は２０２０１２２８である。
実験材料：
α－アサロン（２８８３－９８－９、Ｗｕｈａｎ Ｌａｎａｂａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
注射用大豆油（ＤＤ２０２００６０３、Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｒｕｉｓｈｅｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
卵黄レシチン（２０２００８０１３、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｔａｉｗｅｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
オレイン酸（１６０９０７、Ｘｉ’ａｎ Ｌｉｂａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
グリセロール（２０１９１２１３、Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｓｕｉｃｈａｎｇ Ｈｕｉｋａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
実験ステップ：α－アサロン１０．０ｇ、注射用大豆油１００．０ｇを秤量し、適当な容器に入れ、窒素ガスの保護下で８０℃に加熱し、撹拌して溶解させた。引き続き卵黄レシチン１２．０ｇ、オレイン酸０．３ｇを秤量し、それに加えて撹拌して溶解させ、油相を製造して予備した。グリセロール２２．０ｇを秤量し、水約８００ｍＬを量り、窒素ガスの保護下で８０℃に加熱し、撹拌して溶解させ、水相とした。上記油相を水相に添加し、１９０００ｒ／ｍｉｎで１０分間高速でせん断して油相を水相に分散させ、水を加えて１０００ｍＬとし、初乳を製造した。引き続き初乳を高圧ホモジナイザーで１０００ｂａｒの圧力で３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が０．５μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンでろ過し、ろ液を窒素ガスの保護下で２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬのガラスアンプルに充填し、１２１℃×８分でロータリーホットプレス滅菌し、α－アサロン含有量が１０ｍｇ／ｍＬであるα－アサロン乳状注射液が得られ、バッチ番号は２０２０１２２８である。
【0072】
製造実施例８α－アサロン経口乳剤の製造
α－アサロン１０．０ｇ、薬用大豆油１００．０ｇを秤量し、適当な容器に入れ、窒素ガスの保護下で８０℃に加熱し、撹拌して溶解させた。引き続き卵黄レシチン１２．０ｇ、オレイン酸０．３ｇ、抗酸化ビタミンＥ１０．０ｇ、エチルパラベン２．０ｇを秤量してそれに加え、撹拌して溶解させ、油相を製造して予備した。グリセロール２２．０ｇを秤量し、水約８００ｍＬを量り、窒素ガスの保護下で８０℃に加熱し、撹拌して溶解させ、水相とした。上記油相を水相に添加し、１９０００ｒ／ｍｉｎで１０分間高速でせん断して油相を水相に分散させ、水を加えて１０００ｍＬとし、初乳を製造した。引き続き初乳を高圧ホモジナイザーで１０００ｂａｒの圧力で３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が０．５μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンでろ過し、ろ液を窒素ガスの保護下で１０ｍＬの経口バイアルに充填し、１００℃×３０分流動蒸気滅菌し、又は１２１℃×８分ロータリーホットプレス滅菌し、α－アサロンの含有量が１０ｍｇ／ｍＬであるα－アサロン経口乳剤が得られ、バッチ番号は２０２１０１０５である。
α－アサロン１０．０ｇ、薬用大豆油１００．０ｇを秤量し、適当な容器に入れ、窒素ガスの保護下で８０℃に加熱し、撹拌して溶解させた。引き続き卵黄レシチン１２．０ｇ、オレイン酸０．３ｇ、抗酸化ビタミンＥ１０．０ｇ、エチルパラベン２．０ｇを秤量してそれに加え、撹拌して溶解させ、油相を製造して予備した。グリセロール２２．０ｇを秤量し、水約８００ｍＬを量り、窒素ガスの保護下で８０℃に加熱し、撹拌して溶解させ、水相とした。上記油相を水相に添加し、１９０００ｒ／ｍｉｎで１０分間高速でせん断して油相を水相に分散させ、水を加えて１０００ｍＬとし、初乳を製造した。引き続き初乳を高圧ホモジナイザーで１０００ｂａｒの圧力で３回均質化し、均質化した乳滴の平均粒子径が０．５μｍ以下になるようにし、フィルターメンブレンでろ過し、ろ液を窒素ガスの保護下で１０ｍＬの経口バイアルに充填し、１００℃×３０分流動蒸気滅菌し、又は１２１℃×８分ロータリーホットプレス滅菌し、α－アサロンの含有量が１０ｍｇ／ｍＬであるα－アサロン経口乳剤が得られ、バッチ番号は２０２１０１０５である。
【0073】
効果実施例１：ＳＡＨ及びＩＣＨラットに対するα－アサロンの短期的な治療効果
実験材料：ＳＰＦグレードのＳＤラット、雌雄が半分ずつ、体重が２００～２４０ｇ、四川省のＣｈｅｎｇｄｕ Ｄａｓｈｕｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入した。証明書番号はＳＣＸＫ（川）２０２０－０３０である。
実験材料：ＳＰＦグレードのＳＤラット、雌雄が半分ずつ、体重が２００～２４０ｇ、四川省のＣｈｅｎｇｄｕ Ｄａｓｈｕｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入した。証明書番号はＳＣＸＫ（川）２０２０－０３０である。
【0074】
コラゲナーゼＶＩＩは、米国のＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙから購入した（仕様：１．５ＫＵ、バッチ番号：００００１１１５８６）。
【0075】
α－アサロン原料は、Ｗｕｈａｎ Ｌａｎａｂａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．（仕様：２ｋｇ、バッチ番号：２８８３－９８－９）から購入し、その乳状注射液は自作され、バッチ番号が２０２０１２２８、２０２１０１０５である。
【0076】
ビンポセチン注射液は、Ｈｅｎａｎ Ｒｕｎｈｏｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入した（仕様：１０ｍｇ：２ｍＬ、バッチ番号：１８１１２８３）。
【0077】
ニモジピン注射液は、Ｂａｙｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙから購入した（仕様：１０ｍｇ：５０ｍＬ、バッチ番号：ＢＸＪＣ７１）。
【0078】
実験群分け：血管内穿刺後又はコラゲナーゼＶＩＩ注射２時間後にＺｅａ Ｌｏｎｇａスコアでモデリングが成功したかどうかを判断し、モデリングが成功したラットをランダムにグループ分けて投与した。
【0079】
ラットをランダムに偽手術群（Ｐ群、乳状注射液高用量群と同体積の生理食塩水を投与）、モデル群（Ｓ又はＩ群、乳状注射液高用量群と同体積のブランク乳剤を投与）、α－アサロン乳状注射液低用量群（実施例７で製造、７．５ｍｇ／ｋｇ、Ｌ群）、α－アサロン乳状注射液中用量群（実施例７で製造、１５ｍｇ／ｋｇ、Ｍ群）、α－アサロン乳状注射液高用量群（実施例７で製造、３０ｍｇ／ｋｇ、Ｈ群）、α－アサロン乳剤経口投与群（実施例８で製造、４０ｍｇ／ｋｇ、Ｏ群）、β－アサロン乳状注射液群（製造実施例７の方法と同じ方法で実施、乳状注射液に製造、濃度１０ｍｇ／ｍＬ、投与量２０ｍｇ／ｋｇ、Ｂ群）、ビンポセチン注射液群（市販、２ｍｇ／ｋｇ、Ｖ群）、ニモジピン注射液群（市販、１ｍｇ／ｋｇ、Ｎ群）に分け、各群１２匹であり、Ｎ群は腹腔内注射投与された以外、他の各群は尾静脈から投与された。
【0080】
１．１血管内穿刺によるＳＡＨの構築
ラットは手術前１２時間絶食させ、４％のイソフルランで麻酔を導入し、２％のイソフルランで麻酔を維持した。仰臥位に固定し、動物の体温を約３７℃に維持した。頸部の皮膚を準備し、頸部の正中切開を行い、胸鎖乳突筋の内側の縁に沿って筋肉と筋膜を分離し、右側を露出し、総頸動脈（ＣＣＡ）、外頸動脈（ＥＣＡ）、及び内頸動脈（ＩＣＡ）を鈍的に分離し、ＣＣＡ近位端、ＩＣＡ、及びＥＣＡにラインを処理して予備した。ＣＣＡの近位端とＥＣＡを結紮し、動脈クリップでＩＣＡを一時的にクランプした後、ＣＣＡから分岐部まで約４ｍｍのところに針で小さな穴をあけ、穿刺線をＣＣＡ経由でＩＣＡを挿入し、ＩＣＡの動脈クリップを解放し、頭蓋内に穿刺線を挿入した。穿刺線の先端が総頸動脈の分岐点から１８～１９ｍｍ程度離れたところで抵抗感があり、穿刺線の先端が前大脳動脈と中大脳動脈の分岐点に到達したことを示す。その後、少し力を加えて２ｍｍ程度伸ばすと前大脳動脈と中大脳動脈の分岐点に刺さった。穿刺線を完全に除去し、ＩＣＡを結紮し、創部を生理食塩水で洗浄して縫合した。偽手術群は、穿刺線が挿入して抵抗を感じたときに引き抜くだけで、前大脳動脈と中大脳動脈の分岐点を穿刺せず、残りの手術手順は実験群と同じであった。麻酔から覚めた後、普通に餌を与えた。
ラットは手術前１２時間絶食させ、４％のイソフルランで麻酔を導入し、２％のイソフルランで麻酔を維持した。仰臥位に固定し、動物の体温を約３７℃に維持した。頸部の皮膚を準備し、頸部の正中切開を行い、胸鎖乳突筋の内側の縁に沿って筋肉と筋膜を分離し、右側を露出し、総頸動脈（ＣＣＡ）、外頸動脈（ＥＣＡ）、及び内頸動脈（ＩＣＡ）を鈍的に分離し、ＣＣＡ近位端、ＩＣＡ、及びＥＣＡにラインを処理して予備した。ＣＣＡの近位端とＥＣＡを結紮し、動脈クリップでＩＣＡを一時的にクランプした後、ＣＣＡから分岐部まで約４ｍｍのところに針で小さな穴をあけ、穿刺線をＣＣＡ経由でＩＣＡを挿入し、ＩＣＡの動脈クリップを解放し、頭蓋内に穿刺線を挿入した。穿刺線の先端が総頸動脈の分岐点から１８～１９ｍｍ程度離れたところで抵抗感があり、穿刺線の先端が前大脳動脈と中大脳動脈の分岐点に到達したことを示す。その後、少し力を加えて２ｍｍ程度伸ばすと前大脳動脈と中大脳動脈の分岐点に刺さった。穿刺線を完全に除去し、ＩＣＡを結紮し、創部を生理食塩水で洗浄して縫合した。偽手術群は、穿刺線が挿入して抵抗を感じたときに引き抜くだけで、前大脳動脈と中大脳動脈の分岐点を穿刺せず、残りの手術手順は実験群と同じであった。麻酔から覚めた後、普通に餌を与えた。
【0081】
ＳＡＨの重症度スコアは、短期神経機能スコアを完了し、ラットを安楽死させた後に行われ、基底槽と脳組織表面のくも膜下出血状況に基づいてスコア化した。基底槽は脳底動脈、前大脳動脈、内頚動脈、後大脳動脈、後交通動脈からなるウィリス輪によって六つの領域に分けられている。くも膜下血塊の数に応じて、各領域のスコアは０～３点に分けられる。０：くも膜下血なし、１：少量のくも膜下血、２：中等程度の血塊、頭蓋底動脈が識別可能、３：血塊は、その領域のすべての動脈を覆っている。六つのパートスコアをすべて合計すると、合計１８点である。最終スコアによると、ＳＡＨ出血の重症度は０～７点：軽度のくも膜下出血、８～１２点：中等程度のくも膜下出血、及び１３～１８点：重度のくも膜下出血に分類できる。中等程度から重度のＳＡＨモデルを統計対象として選定した（スコア≧８）。
【0082】
１．２コラゲナーゼインジェクションによるＩＣＨモデルの構築
ラットは手術前１２時間絶食させ、４％のイソフルランで麻酔を導入し、２％のイソフルランで麻酔を維持した。腹臥位に保たれ、動物の体温は約３７℃に保たれた。頭部の皮膚を準備し、頭部の正中切開を行い、諸葛▲啓▼釧によって主に翻訳されたラット脳の脳定位固定マッピング（ＧｅｏｒｇｅＰａｘｉｎｏｓ、ＣｈａｒｌｅｓＷａｔｓｏｎ、Ｐａｘｉｎｏｓ、Ｗａｔｓｏｎ、＆諸葛▲啓▼釧．ラット脳の脳定位固定マッピング［Ｍ］．人民衛生出版社、２００５）によると、定位固定装置を用いてラットの右尾状核の位置を確認し（前フォンタネルを原点、右３ｍｍ、深さ５．５ｍｍ）、マーキング後に頭蓋骨の貫通穴を使用してマイクロシリンジの針を脳組織の尾状核に挿入し、０．５Ｕ ＶＩＩタイプコラゲナーゼを１μＬ注入し、注射時間は５分であり、注射完了後針を抜けず８分維持し、針をゆっくり抜き、骨蝋で頭蓋穿孔を閉鎖し、皮膚を縫合しラットはケージに戻された。偽手術群のラットには薬物を注射せず、滅菌生理食塩水を注射したのみで、その他の操作に変更はない。
ラットは手術前１２時間絶食させ、４％のイソフルランで麻酔を導入し、２％のイソフルランで麻酔を維持した。腹臥位に保たれ、動物の体温は約３７℃に保たれた。頭部の皮膚を準備し、頭部の正中切開を行い、諸葛▲啓▼釧によって主に翻訳されたラット脳の脳定位固定マッピング（ＧｅｏｒｇｅＰａｘｉｎｏｓ、ＣｈａｒｌｅｓＷａｔｓｏｎ、Ｐａｘｉｎｏｓ、Ｗａｔｓｏｎ、＆諸葛▲啓▼釧．ラット脳の脳定位固定マッピング［Ｍ］．人民衛生出版社、２００５）によると、定位固定装置を用いてラットの右尾状核の位置を確認し（前フォンタネルを原点、右３ｍｍ、深さ５．５ｍｍ）、マーキング後に頭蓋骨の貫通穴を使用してマイクロシリンジの針を脳組織の尾状核に挿入し、０．５Ｕ ＶＩＩタイプコラゲナーゼを１μＬ注入し、注射時間は５分であり、注射完了後針を抜けず８分維持し、針をゆっくり抜き、骨蝋で頭蓋穿孔を閉鎖し、皮膚を縫合しラットはケージに戻された。偽手術群のラットには薬物を注射せず、滅菌生理食塩水を注射したのみで、その他の操作に変更はない。
【0083】
１．３脳内出血モデルの採用基準
Ｚｅａ Ｌｏｎｇａの神経機能スコアを参照して、手術の２時間後のラットが麻酔後に覚醒した後スコアリングされ、スコアが１～３点のラットがグループに含まれた。
Ｚｅａ Ｌｏｎｇａの神経機能スコアを参照して、手術の２時間後のラットが麻酔後に覚醒した後スコアリングされ、スコアが１～３点のラットがグループに含まれた。
【0084】
０点：神経学的欠損症状なし、通常の活動である。
【0085】
１点：反対側の前足を完全に伸ばすことができない。
【0086】
２点：動物は這うときに円を描くように回転する。
【0087】
３点：体が片麻痺側に倒れる。
【0088】
４点：自発歩行ができず、意識を失う。
【0089】
１．１短期神経機能欠損スコア
モデリングの２４時間後に、ラットの神経機能をＧａｒｃｉａスコアとビームバランステストによって総合的に評価し、Ｇａｒｃｉａのスコア基準は表１に示すように、ラットの動き、感覚、爬行、四肢の対称性を評価し、スコアの範囲は３～１８点であり、スコアが低いほど神経学的損傷が深刻である。ビームバランステストのスコア基準は表２に示すように、ラットの体の固有感覚と身体の協調性を評価し、スコアの範囲は０～６点であり、スコアが高いほど神経学的損傷が深刻である。採点は、モデリング及び薬物投与に関与しなくて知らない人によって独自に行われた。
モデリングの２４時間後に、ラットの神経機能をＧａｒｃｉａスコアとビームバランステストによって総合的に評価し、Ｇａｒｃｉａのスコア基準は表１に示すように、ラットの動き、感覚、爬行、四肢の対称性を評価し、スコアの範囲は３～１８点であり、スコアが低いほど神経学的損傷が深刻である。ビームバランステストのスコア基準は表２に示すように、ラットの体の固有感覚と身体の協調性を評価し、スコアの範囲は０～６点であり、スコアが高いほど神経学的損傷が深刻である。採点は、モデリング及び薬物投与に関与しなくて知らない人によって独自に行われた。
【0090】
【表1】
【0091】
【表2】
【0092】
表３より、偽手術群（Ｐ群）と比較して、手術後２４時間のモデル群（Ｓ又はＩ群）のＧａｒｃｉａのスコアが有意に減少し（Ｐ＜０．００１）、ビームバランスのスコアは有意に増加し（Ｐ＜０．００１）、ＳＡＨ又はＩＣＨの２４時間後のモデル群のラットは、明らかな神経機能欠損を持っている。異なる用量でのα－アサロンの静脈内投与（Ｌ、Ｍ、Ｈ群）及びα－アサロンの経口投与（Ｏ群）は、さまざまな程度にＧａｒｃｉａのスコアを改善し、ビームバランスのスコアを低下させ、ＳＡＨ又はＩＣＨによって引き起こされる神経機能欠損を改善することができ、その中でＭ群の投与が最も有意な改善効果を持っている（Ｐ＜０．０１）。ＳＡＨモデルの場合、Ｍ群の治療効果は、くも膜下出血後の血管痙攣を改善するために使用される薬物であるニモジピン（Ｎ群）、及び脳出血の後遺症を治療するために使用される薬物であるビンポセチン（Ｖ群）の治療効果より優れている。ＩＣＨモデルの場合、Ｌ、Ｍ群の治療効果はＶ群より優れており、どちらもＮ群より有意に優れている。逆に、β－アサロン投与群（Ｂ）はＳＡＨ及びＩＣＨモデルラットの神経学的機能に明らかな改善がない。さらに、ＳＡＨ各群のラットの心臓灌流経由の脳摘出後のモデル群と投与群との間の出血スコアに有意差はなく、モデリングの程度の違いによって引き起こされる行動機能の差を除外することができる。
【0093】
【表3】
注：偽手術群（Ｐ群）と比較して、＃＃＃Ｐ＜０．００１、＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５であり、モデル群（Ｓ又はＩ群）と比較して、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５であり、ニモジピン群（Ｎ群）と比較して、＆Ｐ＜０．０５である。比較データはｘ±ＳＤで示され、ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ－ｐｏｓｔ－ｈｏｃを使用して多群比較分析を行う。
【0094】
効果実施例２：α－アサロンはＳＡＨラットの二次性てんかんの発生率を低下させる
実験材料、群分け、モデリング方法及び投与方案は効果実施例１と同じであり、ラットのＳＡＨ後２４時間以内における各群のラットのてんかん発作状況を観察した。結果は表４に示すように、Ｐ群と比較して、Ｓ群のＲａｃｉｎｅスコアは有意に増加し（Ｐ＜０．００１）、Ｌ、Ｍ、Ｈ群及びＯ群は、Ｒａｃｉｎｅスコアをさまざまな程度に低下させることができ、その中でＭ群の投与減少効果が最も有意である（Ｐ＜０．０５）。したがって、α－アサロンは、ラットのＳＡＨによって引き起こされる二次性てんかんの発生率を大幅に低下させることができる。
実験材料、群分け、モデリング方法及び投与方案は効果実施例１と同じであり、ラットのＳＡＨ後２４時間以内における各群のラットのてんかん発作状況を観察した。結果は表４に示すように、Ｐ群と比較して、Ｓ群のＲａｃｉｎｅスコアは有意に増加し（Ｐ＜０．００１）、Ｌ、Ｍ、Ｈ群及びＯ群は、Ｒａｃｉｎｅスコアをさまざまな程度に低下させることができ、その中でＭ群の投与減少効果が最も有意である（Ｐ＜０．０５）。したがって、α－アサロンは、ラットのＳＡＨによって引き起こされる二次性てんかんの発生率を大幅に低下させることができる。
【0095】
【表4】
注：Ｐ群（生理食塩水を投与）と比較して、＃＃＃Ｐ＜０．００１、＃Ｐ＜０．０５であり、Ｓ群（ブランク乳剤を投与）と比較して、＊Ｐ＜０．０５である。発作グレードは、Ｒａｃｉｎｅ基準を参照して癲癇の発作程度に応じて発作行動を六つのグレードに分類する。グレード０は無反応又は攣縮停止、グレードＩはリズミカルな口又は顔の痙攣、グレードＩＩはうなずき又は尻尾のフリック、グレードＩＩＩは一つの手足痙攣、グレードＩＶは多肢の痙攣又は強直、グレードＶは全般性強直間代発作である。グレードＩ、ＩＩ、及びＩＩＩは間代性発作であり、グレードＩＶ及びＶは強直性発作である。
【0096】
効果実施例３：ＳＡＨラットに対するα－アサロンの長期保護効果
３．１ ラットの長期生存率
実験材料、群分け及びモデリング方法は、実施例１と同じである。ＳＡＨモデリングの２時間後、群分けの投与方案に従って直ちに投与され、その後１４日間投与され続け、１日１回投与され、ラットの１４日間の生存状況を観察して記録した。結果は表５に示すように、Ｓ群の死亡率は２４時間以内に５３．８％と高く、Ｍ、Ｈ、Ｏ群、及びＮ群の投与はＳＡＨラットの２４時間以内の死亡率を有意に低下させ、生存期間を延長することができ、すなわち、α－アサロンはＳＡＨラットの２４時間死亡率を大幅に低下させ、１４日間の生存期間を延長することができる。
３．１ ラットの長期生存率
実験材料、群分け及びモデリング方法は、実施例１と同じである。ＳＡＨモデリングの２時間後、群分けの投与方案に従って直ちに投与され、その後１４日間投与され続け、１日１回投与され、ラットの１４日間の生存状況を観察して記録した。結果は表５に示すように、Ｓ群の死亡率は２４時間以内に５３．８％と高く、Ｍ、Ｈ、Ｏ群、及びＮ群の投与はＳＡＨラットの２４時間以内の死亡率を有意に低下させ、生存期間を延長することができ、すなわち、α－アサロンはＳＡＨラットの２４時間死亡率を大幅に低下させ、１４日間の生存期間を延長することができる。
【0097】
【表5】
【0098】
３．２長期学習記憶機能評価
モリス水迷路を使用して、各群のラットの長期的な空間知覚及び記憶能力を評価し、これは、生存期間の観察記録終了後、すなわちＳＡＨ後１５～１９日目に実施された。水迷路は直径１５０ｃｍ、深さ６０ｃｍの円形のプールである。実験を始める前に、ぬるま湯（２４±２）℃を水深３０ｃｍまで入れ、顔料を使って水を黒く染めた。プールは四つの象限に分かれており、異なる象限のプールの壁には異なる標識が貼り付けられ、区別を示した。象限の一つの中央に、直径１０ｃｍ、高さ２８ｃｍの無色透明のプラットフォームが置かれ、プラットフォームは水中２ｃｍに沈んでいた。ラットは、実験開始後、実験ガイドラインに従って指定される象限に放された。１～４日目、１回の実験でラットを四つの異なる象限から水中に放し、各ラウンドの実験間の間隔は１０分である。ラットが６０秒以内にプラットフォームを見つけた場合は１０秒間プラットフォームに立たせ、そうでない場合は棒でプラットフォームに誘導して１０秒間立たせた。５日目に、プラットフォームを取り外し、ラットを６０秒間自由に泳がせ、コンピューター追跡システム（Ｎｏｌｄｕｓ Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ、Ｔａｃｏｍａ、ＷＡ、ＵＳＡ）で逃避潜時、遊泳速度、ターゲット象限探索時間などのデータを記録した。
モリス水迷路を使用して、各群のラットの長期的な空間知覚及び記憶能力を評価し、これは、生存期間の観察記録終了後、すなわちＳＡＨ後１５～１９日目に実施された。水迷路は直径１５０ｃｍ、深さ６０ｃｍの円形のプールである。実験を始める前に、ぬるま湯（２４±２）℃を水深３０ｃｍまで入れ、顔料を使って水を黒く染めた。プールは四つの象限に分かれており、異なる象限のプールの壁には異なる標識が貼り付けられ、区別を示した。象限の一つの中央に、直径１０ｃｍ、高さ２８ｃｍの無色透明のプラットフォームが置かれ、プラットフォームは水中２ｃｍに沈んでいた。ラットは、実験開始後、実験ガイドラインに従って指定される象限に放された。１～４日目、１回の実験でラットを四つの異なる象限から水中に放し、各ラウンドの実験間の間隔は１０分である。ラットが６０秒以内にプラットフォームを見つけた場合は１０秒間プラットフォームに立たせ、そうでない場合は棒でプラットフォームに誘導して１０秒間立たせた。５日目に、プラットフォームを取り外し、ラットを６０秒間自由に泳がせ、コンピューター追跡システム（Ｎｏｌｄｕｓ Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ、Ｔａｃｏｍａ、ＷＡ、ＵＳＡ）で逃避潜時、遊泳速度、ターゲット象限探索時間などのデータを記録した。
【0099】
実験結果は図１Ａに示すように、獲得訓練期間中に、Ｐ群と比較して、Ｓ群及びＮ群でプラットフォームを見つけるまでの潜伏期が有意に長くなった（Ｐ＜０．００１）。Ｍ群の逃避潜時間はＳ群及びＮ群より有意に短く、４日目でもＰ群との統計的差はなかった。図１Ｂ、１Ｃから、空間探査中に、Ｐ群と比較して、Ｓ群及びＮ群はターゲット象限に滞在する時間がより短く、Ｍ群はターゲット象限に滞在する時間が長くなり、Ｐ群に匹敵し、さらに、この群の泳ぐ速度はＳ群より有意に速かった（Ｐ＜０．０５）ことがわかった。図１Ｄに示すように、長期投薬後、Ｓ群とＮ群の両方で、ラットの脳組織の患側に白化と萎縮の現象が見られたが、Ｐ群とＭ群ではそうでは無かった。結論として、α－アサロンの長期投与は、ＳＡＨラットの回復期間の学習記憶機能を大幅に改善し、運動機能の回復を促進するだけでなく、ＳＡＨラットの回復期間の脳組織萎縮も緩和できる。
【0100】
効果実施例４：抗出血性脳卒中におけるα－アサロンの作用機序に関する研究
実験材料：
エバンスブルー（Ｃ１１８９１１５８、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍａｃｋｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
ホルムアミド（２０１９０７１６、Ｔｉａｎｊｉｎ ＢＯＤＩ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
グルタミン酸検出キット（２０２１０５２５、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
ＧＡＢＡ－Ｅｌｉｓａ キット（２０２１０１、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｎｇｌａｉ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
ＤＮａｓｅ Ｉ（２２６Ｆ０３１、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
パパイン（１１１Ｓ０２２、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
カルシウムイオン蛍光プローブ（２０２１０３１３、Ｊｉａｎｇｓｕ Ｋａｉｊｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
ローダミン１２３染料溶液（１１９Ｉ０３３、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
氷冷遠心緩衝液（２０２１０５２５、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）。
実験材料：
エバンスブルー（Ｃ１１８９１１５８、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍａｃｋｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
ホルムアミド（２０１９０７１６、Ｔｉａｎｊｉｎ ＢＯＤＩ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
グルタミン酸検出キット（２０２１０５２５、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
ＧＡＢＡ－Ｅｌｉｓａ キット（２０２１０１、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｎｇｌａｉ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
ＤＮａｓｅ Ｉ（２２６Ｆ０３１、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
パパイン（１１１Ｓ０２２、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
カルシウムイオン蛍光プローブ（２０２１０３１３、Ｊｉａｎｇｓｕ Ｋａｉｊｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
ローダミン１２３染料溶液（１１９Ｉ０３３、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
氷冷遠心緩衝液（２０２１０５２５、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）。
【0101】
実験ステップと結果：
４．１ 脳水分量と血液脳関門透過性の測定
２４時間の短期神経機能スコアが完了した後、ラットの右尾静脈に４％のエバンスブルー溶液（２．５ｍＬ／ｋｇ）を注射し、１時間後にラットを深く麻酔し、心臓経由で生理食塩水１００ｍＬを注入し、素早く斬首して脳を取り、すぐに左半球、右半球、小脳、脳幹に分けられた。左右半球の冠状を二つに分け、一部分では０．１ｍｇ単位の精度である天秤で別々に脳組織を秤量し（湿重量）、その後、サンプルを１０５℃のオーブンで２４時間乾燥させて再度別々に秤量した（乾重量）。脳水分量の算出：脳水分量＝［（湿重量－乾重量）／湿重量］×１００％である。脳組織の他の部分の湿重量を秤量した後、１０倍体積の純ホルムアミドに浸し、６０℃で４８時間インキュベートし、２５℃、１００００ｒｐｍ／ｍｉｎで３０分間遠心分離し、上清を吸引してＵＶ分光測光法で６２２ｎｍでエバンスブルー色素を検出し、定量用の標準曲線を描き、最終結果は脳組織１グラムあたりのエバンスブルー含有量（μｇ／ｇ）として表示される。
４．１ 脳水分量と血液脳関門透過性の測定
２４時間の短期神経機能スコアが完了した後、ラットの右尾静脈に４％のエバンスブルー溶液（２．５ｍＬ／ｋｇ）を注射し、１時間後にラットを深く麻酔し、心臓経由で生理食塩水１００ｍＬを注入し、素早く斬首して脳を取り、すぐに左半球、右半球、小脳、脳幹に分けられた。左右半球の冠状を二つに分け、一部分では０．１ｍｇ単位の精度である天秤で別々に脳組織を秤量し（湿重量）、その後、サンプルを１０５℃のオーブンで２４時間乾燥させて再度別々に秤量した（乾重量）。脳水分量の算出：脳水分量＝［（湿重量－乾重量）／湿重量］×１００％である。脳組織の他の部分の湿重量を秤量した後、１０倍体積の純ホルムアミドに浸し、６０℃で４８時間インキュベートし、２５℃、１００００ｒｐｍ／ｍｉｎで３０分間遠心分離し、上清を吸引してＵＶ分光測光法で６２２ｎｍでエバンスブルー色素を検出し、定量用の標準曲線を描き、最終結果は脳組織１グラムあたりのエバンスブルー含有量（μｇ／ｇ）として表示される。
【0102】
結果は、図２に示されるように。偽手術群（Ｐ群）と比較して、モデル群（Ｓ又はＩ群）の出血側の大脳半球は、手術後２４時間で有意に脳水分量を増加させ、エバンスブルーの滲出は有意に増加し、血液脳関門の透過性が増加し、α－アサロンの脳内への静脈内投与（Ｍ群）は、ラットの出血側の脳組織の水分含有量を有意に減少させ、脳浮腫を緩和し、エバンスブルーの滲出を減らし、血液脳関門の透過性を改善することができる。
【0103】
４．２ グルタミン酸及びＧＡＢＡ含有量の測定
モデリングの１２～２４時間後に、ラットを深く麻酔し、断頭して脳を取り、出血側の大脳半球皮質の約６０～１２０ｍｇを採取し、１０倍体積の生化学的検出に使用される氷冷遠心緩衝液を添加し、氷浴中で１０分間ホモジナイズし、４℃、１４０００ｒｐｍ／ｍｉｎで３０分間遠心分離し、グルタミン酸含量検出キット及びラットＧＡＢＡ Ｅｌｉｓａキットの説明書に従って上清液を取り、グルタミン酸及びＧＡＢＡ含量をそれぞれ検出した。
モデリングの１２～２４時間後に、ラットを深く麻酔し、断頭して脳を取り、出血側の大脳半球皮質の約６０～１２０ｍｇを採取し、１０倍体積の生化学的検出に使用される氷冷遠心緩衝液を添加し、氷浴中で１０分間ホモジナイズし、４℃、１４０００ｒｐｍ／ｍｉｎで３０分間遠心分離し、グルタミン酸含量検出キット及びラットＧＡＢＡ Ｅｌｉｓａキットの説明書に従って上清液を取り、グルタミン酸及びＧＡＢＡ含量をそれぞれ検出した。
【0104】
結果は、図３に示されるように、Ｐ群と比較して、Ｓ又はＩ群のラットの出血側の大脳半球は、手術後１２～２４時間でグルタミン酸とＧＡＢＡの含有量が有意に増加したが、Ｍ群の投与は脳出血ラットの脳組織のグルタミン酸とＧＡＢＡの含有量を有意に減少させることができ、グルタミン酸の興奮毒性に対抗し、脳内の興奮性アミノ酸／抑制性アミノ酸（ＥＡＡ／ＩＡＡ）のバランスを回復し、ラットの運動機能を改善するのに有益である。
【0105】
４．３ Ｃａ２＋含有量又はミトコンドリア膜電位の測定
モデリングの１２～２４時間後に、断頭して脳を取り、血腫の周囲の大脳半球の皮質を採取し、酵素消化（パパイン：２ｍｇ／ｍＬ、ＤＮａｓｅＩ：０．０５ｍｇ／ｍＬ）により単細胞懸濁液を直ちに製造し、細胞濃度を５×１０６個／ｍＬに調整し、１００μＬの細胞懸濁液を取り、最終濃度５μＭのＦｌｕｏ－３／ＡＭ染色液又は最終濃度１０μＭのローダミン１２３染色液に加え、３７℃で４５分間インキュベートし、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液、ｐＨ＝７．２～７．４）で細胞を２回洗浄し、０．５ｍＬ ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、励起波長５０６ｎｍ、発光波長５２６ｎｍの条件下でフローサイトメトリーを使用して１００００細胞を検出し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用してＦｌｕｏ－３及びＲｈ１２３平均蛍光強度を分析した。
モデリングの１２～２４時間後に、断頭して脳を取り、血腫の周囲の大脳半球の皮質を採取し、酵素消化（パパイン：２ｍｇ／ｍＬ、ＤＮａｓｅＩ：０．０５ｍｇ／ｍＬ）により単細胞懸濁液を直ちに製造し、細胞濃度を５×１０６個／ｍＬに調整し、１００μＬの細胞懸濁液を取り、最終濃度５μＭのＦｌｕｏ－３／ＡＭ染色液又は最終濃度１０μＭのローダミン１２３染色液に加え、３７℃で４５分間インキュベートし、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液、ｐＨ＝７．２～７．４）で細胞を２回洗浄し、０．５ｍＬ ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、励起波長５０６ｎｍ、発光波長５２６ｎｍの条件下でフローサイトメトリーを使用して１００００細胞を検出し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用してＦｌｕｏ－３及びＲｈ１２３平均蛍光強度を分析した。
【0106】
結果は、図４に示されるように、Ｐ群と比較して、Ｓ又はＩ群は手術後１２～２４時間でのカルシウムイオン量は有意に増加し、ミトコンドリア膜電位が上昇し、ミトコンドリアが損傷し、アポトーシスが増加したことが示されたが、Ｍ群の投与は、カルシウムイオン含有量を大幅に減少させ、ミトコンドリア膜電位を安定させ、それによって神経細胞のアポトーシスと壊死を減少させることができる。
【0107】
効果実施例５：オキシヘモグロビン損傷神経細胞に対するα－アサロンの保護効果
実験材料：
ＰＣ１２細胞系はＷｕｈａｎ Ｐｒｏｎｏｓａｉ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．から購入、
オキシヘモグロビン（２０２１０２０１、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
ＭＴＴ（Ｃ１２０２９６９０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）、
ＤＭＥＭ高グルコース培地（ＡＧ２９３０１８１０、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）、
ウシ胎児血清（２００１０４０１、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）、
ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（二重抗体）（２０２０１２２０、Ｈｙｃｌｏｎｅ社、ＵＳＡ）、
ＰＢＳ粉末（ＷＫ１７３６１８－１、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ Ｊｉｎｑｉａｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
ＤＭＳＯ（２０２０１２２０、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
実験ステップ：
完全培地：ＤＭＥＭ高グルコース培地、ウシ胎児血清、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（二重抗体）を９０：９：１の体積比で混合し、４℃の冷蔵庫に保存して得られる。
実験材料：
ＰＣ１２細胞系はＷｕｈａｎ Ｐｒｏｎｏｓａｉ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．から購入、
オキシヘモグロビン（２０２１０２０１、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
ＭＴＴ（Ｃ１２０２９６９０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）、
ＤＭＥＭ高グルコース培地（ＡＧ２９３０１８１０、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）、
ウシ胎児血清（２００１０４０１、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）、
ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（二重抗体）（２０２０１２２０、Ｈｙｃｌｏｎｅ社、ＵＳＡ）、
ＰＢＳ粉末（ＷＫ１７３６１８－１、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ Ｊｉｎｑｉａｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、
ＤＭＳＯ（２０２０１２２０、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
実験ステップ：
完全培地：ＤＭＥＭ高グルコース培地、ウシ胎児血清、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（二重抗体）を９０：９：１の体積比で混合し、４℃の冷蔵庫に保存して得られる。
【0108】
無血清培地：ＤＭＥＭ高グルコース培地とペニシリン－ストレプトマイシン溶液（二重抗体）を９９：１の体積比で均一に混合し、４℃の冷蔵庫に保存して得られる。
【0109】
完全培地で培養した対数増殖期のＰＣ１２細胞を取り、１×１０４個／１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、端のウェルを無菌ＰＢＳで満たし、３７℃、５％ＣＯ２で細胞が完全に壁に接着するまで２４時間インキュベートした。上清を捨て、最終濃度がそれぞれ０μＭ、４μＭ、６μＭ、８μＭ、１０μＭのオキシヘモグロビンを加え、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次に、１０μＬの５ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴを各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。上清を捨て、１００μＬ／ウェルのＤＭＳＯを加え、３７℃、５００ｒ／ｍｉｎで１５分間振ってホルマザンを完全に溶解し、マイクロプレートリーダーを使用して５７０ｎｍでのＯＤ値を検出し、ＰＣ１２細胞の活力を計算するには、式「異常細胞増殖倍数＝［（実験群の平均吸光度値－ゼロ調整穴の平均吸光度値）／（対照群の平均吸光度値）－ゼロ調整穴の平均吸光度値］に従って、本実験条件下で、異常細胞増殖倍数の最大値が１．５倍の場合、対応するオキシヘモグロビンの濃度は６μＭであることをスクリーニングした。したがって、この濃度は、予備試験におけるオキシヘモグロビン誘発酸化ストレス傷害モデルの好ましい濃度として採用され、下記の細胞薬力学実験で使用された。
【0110】
また、完全培地で培養した対数増殖期のＰＣ１２細胞を取り、１×１０４個／１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、端のウェルを無菌ＰＢＳで満たし、３７℃、５％ＣＯ２で細胞が完全に壁に接着するまで２４時間インキュベートした。上清を捨て、対照群とモデル群を除いた他の投与群には、無血清培地で希釈した１００μＬ異なる濃度のα－アサロン乳剤（製造実施例７で製造、α－アサロンの最終濃度をそれぞれ１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭとした）を添加した。２時間培養後、無血清培地で希釈した最終濃度６μＭのオキシヘモグロビン溶液を上記各投与群に添加し、２０μＬ／ウェル、３７℃、５％ＣＯ２で引き続き２４時間まで培養した。対照群は同体積の無血清培地のみを添加した。モデル群には、１００μＬの無血清培地で希釈したブランク乳剤（α－アサロンを含まない以外は製造実施例７と同じ）、及び２０μＬの最終濃度６μＭの無血清培地で希釈したオキシヘモグロビン溶液を順次に添加した。対照群とモデル群の残りの操作は、投与群と同じである。次に、１０μＬの５ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴを各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。上清を捨て、ＤＭＳＯ １００μＬ／ウェルを加え、３７℃、５００ｒ／ｍｉｎで１５分間振ってホルマザンを完全に溶解させ、５７０ｎｍにおけるＯＤ値をマイクロプレートリーダーで検出し、結果は図５に示す。
【0111】
実験結果：図５に示されるように、対照群と比較して、オキシヘモグロビンの添加により、モデル群でＰＣ１２細胞の異常増殖が引き起こされ、吸光度が大幅に増加し、細胞の活力が大幅に向上し、明らかな酸化ストレス反応が発生したことが示される。一方、異なる濃度のα－アサロンは、オキシヘモグロビンによって引き起こされる細胞活力の異常な増加を大幅に減少させ、オキシヘモグロビンによって誘発される酸化ストレス反応を大幅に減少させることができることを示している（図５）。
【0112】
効果実施例６：α－アサロン乳状注射液の安全性予備評価－マウス骨髄小核実験
実験材料：ＳＰＦグレードのオスの昆明マウス５０匹、体重１８～２２ｇ、Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｄａｓｈｕｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入され、許可番号はＳＣＸＫ（川）２０２０－０３０）である。注射用シクロホスファミドは、Ｊｉａｎｇｓｕ Ｓｈｅｎｇｄｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入した。１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸 （ＰＩＰＥＳ、７１５Ｈ０２１、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（８２９Ｉ０２１０、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、１０２４Ｓ０４３、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｃｏｍｐａｎｙ）。
実験材料：ＳＰＦグレードのオスの昆明マウス５０匹、体重１８～２２ｇ、Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｄａｓｈｕｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入され、許可番号はＳＣＸＫ（川）２０２０－０３０）である。注射用シクロホスファミドは、Ｊｉａｎｇｓｕ Ｓｈｅｎｇｄｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入した。１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸 （ＰＩＰＥＳ、７１５Ｈ０２１、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（８２９Ｉ０２１０、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、１０２４Ｓ０４３、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｃｏｍｐａｎｙ）。
【0113】
実験群分け及び投与：動物はランダムに１０匹ずつの五群に分けられ、ブランク対照群（ブランク群、α－アサロン高用量群と同等体積のブランク乳剤を投与）、シクロホスファミド群（ＣＴＸ群、４０ｍｇ／ｋｇ）、α－アサロン乳状注射液低用量群（製造実施例７より製造、１００ｍｇ／ｋｇ／日、ＡＳＡ－Ｌ群）、α－アサロン乳状注射液中用量群（製造実施例７より製造、１５０ｍｇ／ｋｇ／日、ＡＳＡ－Ｍ群）、α－アサロン乳状注射液高用量群（製造実施例７より製造、２００ｍｇ／ｋｇ／日、ＡＳＡ－Ｈ群）である。
【0114】
すべての薬物は尾静脈から注射され、陽性対照薬物であるシクロホスファミド（ＣＴＸ）はサンプリングの２４時間前に単回注射され、それ以外の群は尾静脈から４日間連続投与され、最後の投与から２４時間後にマウスを首切断で殺し、大腿骨を両側から分離した後、大腿骨骨髄細胞をＰＢＳで洗い流し、３００メッシュのナイロンメッシュに通して単一細胞懸濁液を作成し、１６５０ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁後、細胞濃度を５×１０６個／ｍＬに調整し、各サンプルから１００μＬの細胞懸濁液をＰＩＰＥＳ－ＰＩ溶液（１０ｍＬ ＰＩＰＥＳ溶液（濃度３．５ｍｇ／ｍＬ）＋０．５ｍｇＰＩ＋０．０１ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（濃度０．１％））に４００μＬ注意深く添加し、穏やかに吹き混ぜてから、４℃で３０分間遮光して染色し、フローサイトメトリーで検出し、結果は表６に示した。表６に示すように、ＰＣＥは多染赤血球であり、ＭＮＰＣＥは小核を有する多染赤血球であり、ｆＭＮＰＣＥは小核を含む多染赤血球の多染赤血球に占める割合であり、マウス骨髄細胞における小核の割合を反映し、値が高いほど遺伝毒性が大きいことを示している。
【0115】
結果は表６に示されるように、ブランク乳剤群と比較して、陽性対照薬物のシクロホスファミド群（ＣＴＸ）の小核率は有意に増加した（Ｐ＜０．０１）。ブランク乳剤群と比較して、α－アサロン乳状注射液の各用量群で小核率に有意差はなかった。ＣＴＸ群と比較して、小核率は有意に低く、統計的差異があった（ＡＳＡ－Ｌ：Ｐ＜０．０１、ＡＳＡ－Ｍ：Ｐ＜０．０５、ＡＳＡ－Ｈ：Ｐ＜０．０５）。
【0116】
マウス造血細胞の染色体損傷に関する上記の毒性学的研究は、α－アサロン乳状注射液の静脈内投与量が２００ｍｇ／ｋｇまででは、マウス骨髄細胞の小核率が有意に変化しないことを示した。前記の出血性脳卒中の治療に有効な用量を考慮すると、この薬物の安全性は良好であると予想される。
【0117】
【表6】
注：ブランク群（Ｂｌａｎｋ）と比較して、＃＃Ｐ＜０．０１であり、ＣＴＸ群と比較して、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５である。
【0118】
要約すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ薬力学研究の結果は、α－アサロンは、出血性脳卒中ラットの短期神経行動機能、長期学習記憶機能を大幅に改善し、ＳＡＨラットの二次てんかんの発生率と死亡率を低下させ、脳浮腫を緩和し、血液脳関門の透過性を改善し、回復期の脳組織萎縮を予防又は緩和し、グルタミン酸興奮毒性に拮抗し、ＧＡＢＡレベルを回復し、脳内の興奮性アミノ酸／抑制性アミノ酸（ＥＡＡ／ＩＡＡ）バランスを回復し、Ｃａ２＋の流入を減らし、ミトコンドリアの膜電位を安定させ、神経細胞のアポトーシスを減らし、酸化ストレスを軽減し、神経保護効果を発揮することを示した。したがって、α－アサロンは出血性脳卒中の治療薬物として有望であると期待されている。
【0119】
以上、本発明の具体的な実施形態について説明したが、当業者であれば、これらは単なる例に過ぎず、本発明の原理及び本質から逸脱することなく、これらの実施形態にさまざまな変更を加えることができることを理解すべきである。したがって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【国際調査報告】