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特表2024-512895グルカゴン誘導体を含む慢性腎臓疾患予防又は治療用薬学組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-21
(54)【発明の名称】グルカゴン誘導体を含む慢性腎臓疾患予防又は治療用薬学組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/26 20060101AFI20240313BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240313BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240313BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20240313BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240313BHJP
C07K 14/605 20060101ALI20240313BHJP
【ＦＩ】
A61K38/26
A61K47/68
A61P13/12
A61P9/12
C07K16/00 ZNA
C07K14/605
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023553081
(86)(22)【出願日】2022-04-11
(85)【翻訳文提出日】2023-08-31
(86)【国際出願番号】 KR2022005188
(87)【国際公開番号】W WO2022216129
(87)【国際公開日】2022-10-13
(31)【優先権主張番号】10-2021-0046648
(32)【優先日】2021-04-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515022445
【氏名又は名称】ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】リ ソン ミョン
(72)【発明者】
【氏名】リ ジョン スク
(72)【発明者】
【氏名】キム ジュン クク
(72)【発明者】
【氏名】パク ウン ジン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC11
4C076CC17
4C076EE59
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA19
4C084BA23
4C084BA25
4C084BA41
4C084CA18
4C084CA59
4C084DB35
4C084NA14
4C084ZA421
4C084ZA422
4C084ZA811
4C084ZA812
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA18
4H045BA50
4H045BA57
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA10
4H045GA21
(57)【要約】
本発明は、グルカゴン誘導体及びその用途に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グルカゴン誘導体及び薬学的に許容される賦形剤を含む慢性腎臓疾患（chronic kidney disease）予防又は治療用薬学組成物であって、前記グルカゴン誘導体は、下記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドである、組成物。
Ｘ１－Ｘ２－ＱＧＴＦ－Ｘ７－ＳＤ－Ｘ１０－Ｓ－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｘ１８－Ｘ１９－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｆ－Ｘ２３－Ｘ２４－Ｗ－Ｌ－Ｘ２７－Ｘ２８－Ｘ２９－Ｘ３０（一般式１，配列番号４６）
上記式において、
Ｘ１はチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ２はα－メチルグルタミン酸（α-methyl-glutamic acid）、Ａｉｂ（aminoisobutyric acid）、Ｄ－アラニン、グリシン（Ｇ）、Ｓａｒ（N-methylglycine）、セリン（Ｓ）又はＤ－セリンであり、
Ｘ７はトレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）又はシステイン（Ｃ）であり、
Ｘ１０はチロシン（Ｙ）又はシステイン（Ｃ）であり、
Ｘ１２はリシン（Ｋ）又はシステイン（Ｃ）であり、
Ｘ１３はチロシン（Ｙ）又はシステイン（Ｃ）であり、
Ｘ１４はロイシン（Ｌ）又はシステイン（Ｃ）であり、
Ｘ１５はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）又はシステイン（Ｃ）であり、
Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、α－メチルグルタミン酸もしくはシステイン（Ｃ）であるか、又は存在せず、
Ｘ１７はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）もしくはバリン（Ｖ）であるか、又は存在せず、
Ｘ１８はアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）もしくはシステイン（Ｃ）であるか、又は存在せず、
Ｘ１９はアラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）もしくはシステイン（Ｃ）であるか、又は存在せず、
Ｘ２０はリシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アルギニン（Ｒ）、α－メチルグルタミン酸もしくはシステイン（Ｃ）であるか、又は存在せず、
Ｘ２１はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）もしくはシステイン（Ｃ）であるか、又は存在せず、
Ｘ２３はイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）もしくはアルギニン（Ｒ）であるか、又は存在せず、
Ｘ２４はバリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、α－メチルグルタミン酸もしくはロイシン（Ｌ）であるか、又は存在せず、
Ｘ２７はイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）もしくはアルギニン（Ｒ）であるか、又は存在せず、
Ｘ２８はグルタミン（Ｑ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）もしくはアルギニン（Ｒ）であるか、又は存在せず、
Ｘ２９はトレオニン（Ｔ）であり、
Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であるか、又は存在しない
（ただし、前記一般式１のアミノ酸配列が配列番号１又は配列番号１２と同じ場合は除く）。
【請求項2】
前記ペプチドは、持続型結合体の形態であり、前記持続型結合体は、下記化学式（１）で表されるものである、請求項１に記載の組成物。【化1】
Ｌはエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであり、
Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域であり、
－はＸとＬ間、ＬとＦ間の共有結合連結を示すものである。
【請求項3】
前記一般式１において、Ｘ２はＡｉｂ（aminoisobutyric acid）であり、
Ｘ７はトレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）又はシステイン（Ｃ）であり、
Ｘ１０はチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ１２はリシン（Ｋ）であり、
Ｘ１３はチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ１４はロイシン（Ｌ）又はシステイン（Ｃ）であり、
Ｘ１５はアスパラギン酸（Ｄ）であり、
Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）又はセリン（Ｓ）であり、
Ｘ１７はリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はシステイン（Ｃ）であり、
Ｘ１８はアルギニン（Ｒ）であり、
Ｘ１９はアラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）であり、
Ｘ２０はグルタミン（Ｑ）又はリシン（Ｋ）であり、
Ｘ２１はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、
Ｘ２３はバリン（Ｖ）であり、
Ｘ２４はグルタミン（Ｑ）であり、
Ｘ２７はメチオニン（Ｍ）であり、
Ｘ２８はアスパラギン（Ｎ）であり、
Ｘ２９はトレオニン（Ｔ）であり、
Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であるか、又は存在しない、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
前記ペプチドは、配列番号７～１１、１３～２５、２７、２９、３１、３３及び３５～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記ペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである、請求項３に記載の組成物。
【請求項6】
前記組成物は、次の特性の少なくとも１つを有するものである、請求項１又は２に記載の組成物。（ａ）血圧降下
（ｂ）アルブミン排泄量減少
（ｃ）タンパク尿減少
（ｄ）腎臓機能回復
【請求項7】
前記組成物は、個体に投与されると、個体の血圧降下効果及び腎臓機能回復効果を発揮するものである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項8】
前記ペプチドは、Ｃ末端がアミド化されているものである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項9】
前記ペプチドは、アミノ酸残基間に環が形成されたものである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項10】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、非グリコシル化されたものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項11】
前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項２に記載の組成物。
【請求項12】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、２本のポリペプチド鎖からなる二量体であり、Ｌの一末端が前記２本のポリペプチド鎖のいずれかのポリペプチド鎖にのみ連結されたものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項13】
前記持続型結合体は、Ｌの一末端がＦのアミノ基又はチオール基、Ｌの他の末端がＸのアミノ基又はチオール基にそれぞれ反応して形成された共有結合により、Ｆ及びＸにそれぞれ連結されたものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項14】
前記Ｌはポリエチレングリコールである、請求項２に記載の組成物。
【請求項15】
前記Ｌ中のエチレングリコール繰り返し単位部分の化学式量は、１～１００ｋＤａの範囲にある、請求項２に記載の組成物。
【請求項16】
前記組成物は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（glucagon like peptide 1 receptor agonist）をさらに含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項17】
前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、ＧＬＰ－１、エキセンジン－３、エキセンジン－４、それらのアゴニスト（agonist）、誘導体（derivative）、フラグメント（fragment）、変異体（variant）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、Ｎ末端のヒスチジン残基がデス－アミノ－ヒスチジル、ジメチル－ヒスチジル、β－ヒドロキシイミダゾプロピオニル、４－イミダゾアセチル及びβ－カルボキシイミダゾプロピオニルからなる群から選択される物質に置換されたＧＬＰ－１受容体アゴニスト誘導体である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項19】
前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、天然エキセンジン－４、エキセンジン－４のＮ末端のアミノ基が除去されたエキセンジン－４誘導体、エキセンジン－４のＮ末端のアミノ基がヒドロキシ基に置換されたエキセンジン－４誘導体、エキセンジン－４のＮ末端のアミノ基がジメチル基で修飾されたエキセンジン－４誘導体、エキセンジン－４の１番目のアミノ酸（ヒスチジン）のα炭素を欠失（deletion）させたエキセンジン－４誘導体からなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項20】
前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、ＧＬＰ－１受容体アゴニストが免疫グロブリンＦｃ領域に連結された持続型結合体の形態である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項21】
前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、イミダゾ－アセチルエキセンジン－４（ＣＡエキセンジン－４）がエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結されたものである、請求項２０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、グルカゴン誘導体を含む組成物及びその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
グルカゴンは、薬物治療、疾病、ホルモン、酵素の欠乏などの様々な原因で血糖値が低下すると膵臓で産生されて分泌される。分泌されたグルカゴンは、肝臓にグリコーゲンを分解してグルコースを放出するように働きかけ、結果として血糖レベルを正常レベルまで引き上げる役割を果たすことが知られている。また、肝臓において脂肪の合成を抑制するだけでなく、脂肪酸の燃焼を促進することにより血中脂質の数値を降下させることが知られている。さらに、グルカゴンは、白色脂肪にも直接、間接的に作用して脂肪の燃焼及び脂肪褐色化を促進し、効果的な体重減量効果を発揮することが知られている（非特許文献１）。このようなグルカゴンは、グルカゴン受容体に作用することにより活性を示す。
【0003】
近年、効能向上、副作用改善などのために、グルカゴン受容体に作用すると共に、物性が改善されたグルカゴン誘導体の必要性が高まっていることから、本発明者らは、グルカゴン受容体に作用するグルカゴン誘導体及びその結合体を開発した（特許文献１）。
【0004】
腎臓（キドニー，kidney）は、横隔膜の下方、肺の後方に位置し、体内の老廃物を除去すると共に、水分及び塩分の量、電解質並びに酸塩基平衡を調節する臓器である。このような腎臓の損傷又は機能異常による疾患の一つとして、慢性腎臓疾患が挙げられる。
【0005】
慢性腎臓病ともいう慢性腎臓疾患は、継続して尿にタンパク質が排出される状態（タンパク尿）や、腎臓の機能が低下した状態を呈する疾患であり、特に糖尿病、高血圧の患者に慢性腎臓疾患の発症リスクが高いことが知られている。慢性腎臓疾患の患者においては、腎臓機能の低下により、老廃物が体に溜まり、血圧が上昇し、貧血が生じ、骨が弱くなり、神経損傷などが発生し、心血管疾患の発症リスクが高まる。
【0006】
このような慢性腎臓疾患は、進行性疾患であり、初期段階では自覚が困難であるので、検査による早期診断が重要であり、治療時期が遅れると慢性腎不全に進行し、透析や腎臓移植が必要となる。
【0007】
慢性腎臓疾患の治療は、リスクを減少させ、腎臓機能の維持又は回復により行われる。特に、慢性腎臓疾患の患者の６０％が高血圧を伴うことが知られており、それほど高血圧は慢性腎臓疾患に密接な関連があるため、抗高血圧剤を用いた慢性腎臓疾患の治療が研究されており、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（angiotensin converting enzyme inhibitor）、アンジオテンシン受容体拮抗薬（angiotensin receptor blocker）などを用いた治療方法が研究されている。しかし、従来の抗高血圧剤を投与すると、腎機能異常、高カリウム血症、虚血性腎損傷などの副作用が生じることも報告されている。
【0008】
よって、血圧降下及び腎臓機能回復による新たな慢性腎臓疾患治療剤及び治療法を開発する努力が続けられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】国際公開第２０１８／００４２８３号
【特許文献2】国際公開第２０１６／１０８５８６号
【特許文献3】国際公開第２０１７／００３１９１号
【特許文献4】国際公開第９７／０３４６３１号
【特許文献5】国際公開第９６／０３２４７８号
【特許文献6】国際公開第２０１５／００５７４８号
【特許文献7】国際公開第２００７／０２１１２９号
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Nat Rev Endocrinol. 11, 329－38 (2015); Physiol Rev. 97, 721－66 (2017)
【非特許文献2】Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献3】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276－277
【非特許文献4】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443－453
【非特許文献5】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)
【非特許文献6】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)
【非特許文献7】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994
【非特許文献8】[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073
【非特許文献9】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482
【非特許文献10】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353－358 (1979)
【非特許文献11】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745
【非特許文献12】H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
血圧降下及び腎臓機能回復による新たな慢性腎臓疾患治療剤及び治療法の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は、グルカゴン誘導体又はその結合体を含む慢性腎臓疾患（chronic kidney disease）予防又は治療用薬学組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、グルカゴン誘導体もしくはその結合体、又はそれを含む組成物を投与するステップを含む慢性腎臓疾患予防又は治療方法を提供することを目的とする。
【0013】
さらに、本発明は、グルカゴン誘導体もしくはその結合体、又はそれを含む組成物の慢性腎臓疾患予防又は治療用途を提供することを目的とする。
【0014】
さらに、本発明は、グルカゴン誘導体もしくはその結合体、又はそれを含む組成物の慢性腎臓疾患予防又は治療用途を有する薬剤の製造のための用途を提供することを目的とする。
【0015】
さらに、本発明は、グルカゴン誘導体又はその結合体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト又はその結合体とを含む慢性腎臓疾患（chronic kidney disease）予防又は治療用薬学組成物を提供することを目的とする。
【0016】
さらに、本発明は、グルカゴン誘導体又はその結合体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト又はその結合体を併用する治療学的用途を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【0017】
本発明のグルカゴン誘導体は、血圧降下及び腎臓機能回復効果を有するので、慢性腎臓疾患の患者の治療薬物として用いることができ、ＧＬＰ－１受容体アゴニストと併用することにより、さらなる効果を期待することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】本態性高血圧（ＳＨＲ）モデルにおいて、本発明の配列番号３７のグルカゴン誘導体の持続型結合体による尿中アルブミン排泄量減少効果を確認した図である。
【図2】本態性高血圧（ＳＨＲ）モデルにおいて、本発明の配列番号３７のグルカゴン誘導体の持続型結合体による収縮期（左）及び拡張期（右）の血圧降下効果を確認した図である。
【図3】本態性高血圧（ＳＨＲ）モデルにおいて、本発明の配列番号３７のグルカゴン誘導体の持続型結合体とＣＡエキセンジン－４の持続型結合体の併用投与による尿中ＡＣＲ（albumin to creatinine ratio）の変化を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明を実現する一態様は、グルカゴン誘導体又はその結合体を含む組成物である。前記結合体とは、グルカゴン誘導体に対して活性を有するペプチドが免疫グロブリンＦｃ領域にリンカーにより共有結合された物質を意味する。
【0020】
一具体例による組成物は、グルカゴン誘導体又はその結合体を含む慢性腎臓疾患（chronic kidney disease）予防又は治療用薬学組成物である。
【0021】
他の具体例による組成物において、前記グルカゴン誘導体は、一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする。
【0022】
Ｘ１－Ｘ２－ＱＧＴＦ－Ｘ７－ＳＤ－Ｘ１０－Ｓ－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｘ１８－Ｘ１９－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｆ－Ｘ２３－Ｘ２４－Ｗ－Ｌ－Ｘ２７－Ｘ２８－Ｘ２９－Ｘ３０（一般式１，配列番号４６）
【0023】
上記式において、Ｘ１はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ２はα－メチルグルタミン酸（α－methyl-glutamic acid）、Ａｉｂ（aminoisobutyric acid）、Ｄ－アラニン、グリシン（Ｇ）、Ｓａｒ（N-methylglycine）、セリン（Ｓ）又はＤ－セリンであり、Ｘ７はトレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）又はシステイン（Ｃ）であり、Ｘ１０はチロシン（Ｙ）又はシステイン（Ｃ）であり、Ｘ１２はリシン（Ｋ）又はシステイン（Ｃ）であり、Ｘ１３はチロシン（Ｙ）又はシステイン（Ｃ）であり、Ｘ１４はロイシン（Ｌ）又はシステイン（Ｃ）であり、Ｘ１５はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）又はシステイン（Ｃ）であり、Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、α－メチルグルタミン酸もしくはシステイン（Ｃ）であるか、又は存在せず、Ｘ１７はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）もしくはバリン（Ｖ）であるか、又は存在せず、Ｘ１８はアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）もしくはシステイン（Ｃ）であるか、又は存在せず、Ｘ１９はアラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）もしくはシステイン（Ｃ）であるか、又は存在せず、Ｘ２０はリシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アルギニン（Ｒ）、α－メチルグルタミン酸もしくはシステイン（Ｃ）であるか、又は存在せず、Ｘ２１はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）もしくはシステイン（Ｃ）であるか、又は存在せず、Ｘ２３はイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）もしくはアルギニン（Ｒ）であるか、又は存在せず、Ｘ２４はバリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、α－メチルグルタミン酸もしくはロイシン（Ｌ）であるか、又は存在せず、Ｘ２７はイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）もしくはアルギニン（Ｒ）であるか、又は存在せず、Ｘ２８はグルタミン（Ｑ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）もしくはアルギニン（Ｒ）であるか、又は存在せず、Ｘ２９はトレオニン（Ｔ）であり、Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であるか、又は存在しない（ただし、一般式１のアミノ酸配列が配列番号１又は配列番号１２と同じ場合は除く）。
【0024】
他の具体例による組成物において、前記グルカゴン誘導体は、配列番号２～１１、及び１３～４５からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする。
【0025】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記ペプチドは、持続型結合体の形態であり、前記持続型結合体は、化学式（１）で表されるものであることを特徴とする。
【0026】
Ｘ－Ｌ－Ｆ・・・（１）
【0027】
ここで、Ｘは一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｌはエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであり、Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域であり、－はＸとＬ間、ＬとＦ間の共有結合連結を示すものである。
【0028】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、一般式１にて、Ｘ２はＡｉｂ（aminoisobutyric acid）であり、Ｘ７はトレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）又はシステイン（Ｃ）であり、Ｘ１０はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ１２はリシン（Ｋ）であり、Ｘ１３はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ１４はロイシン（Ｌ）又はシステイン（Ｃ）であり、Ｘ１５はアスパラギン酸（Ｄ）であり、Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｘ１７はリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はシステイン（Ｃ）であり、Ｘ１８はアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ１９はアラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）であり、Ｘ２０はグルタミン（Ｑ）又はリシン（Ｋ）であり、Ｘ２１はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、Ｘ２３はバリン（Ｖ）であり、Ｘ２４はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘ２７はメチオニン（Ｍ）であり、Ｘ２８はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２９はトレオニン（Ｔ）であり、Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であるか、又は存在しないことを特徴とする。
【0029】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記ペプチドは、配列番号７～１１、１３～２５、２７、２９、３１、３３及び３５～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする。
【0030】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記ペプチドは、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする。
【0031】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記組成物は、次の特性の少なくとも１つを有するものであることを特徴とする。
（ａ）賦形剤投与対照群に比べて血圧が降下する
（ｂ）賦形剤投与対照群に比べてアルブミン排泄量が減少する
（ｃ）賦形剤投与対照群に比べてタンパク尿が減少する
（ｄ）賦形剤投与対照群に比べて腎臓機能が回復する
（ａ）賦形剤投与対照群に比べて血圧が降下する
（ｂ）賦形剤投与対照群に比べてアルブミン排泄量が減少する
（ｃ）賦形剤投与対照群に比べてタンパク尿が減少する
（ｄ）賦形剤投与対照群に比べて腎臓機能が回復する
【0032】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記組成物は、個体に投与されると、個体の血圧降下及び／又は腎臓機能回復効果を発揮するものであることを特徴とする。
【0033】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記グルカゴン誘導体は、Ｃ末端が修飾されていないか、アミド化されているものであることを特徴とする。
【0034】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記グルカゴン誘導体は、アミノ酸残基間に環が形成されたものであることを特徴とする。
【0035】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、非グリコシル化されたものであることを特徴とする。
【0036】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、（ａ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、（ｂ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、（ｃ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（ｄ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（ｅ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインの少なくとも１つのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域又はヒンジ領域の一部との組み合わせ、並びに（ｆ）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体からなる群から選択されることを特徴とする。
【0037】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ジスルフィド結合を形成する部位が除去されたか、天然ＦｃからＮ末端の一部のアミノ酸が欠失したか、天然ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されたか、補体結合部位が除去されたか、又はＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されたものであることを特徴とする。
【0038】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するものであることを特徴とする。
【0039】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドであることを特徴とする。
【0040】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、二量体形態（dimeric form）であることを特徴とする。
【0041】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、２本のポリペプチド鎖からなる二量体であり、Ｌの一末端が前記２本のポリペプチド鎖のいずれかのポリペプチド鎖にのみ連結されたものであることを特徴とする。
【0042】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であることを特徴とする。
【0043】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域であることを特徴とする。
【0044】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、２本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合で連結された構造であり、前記２本の鎖のうち１本の鎖の窒素原子を介してのみ連結されたものであることを特徴とする。
【0045】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号６７のアミノ酸配列を有する単量体を含むものであることを特徴とする。
【0046】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号６７のアミノ酸配列の単量体からなるホモ二量体であることを特徴とする。
【0047】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、そのＮ末端プロリンの窒素原子により連結されたものであることを特徴とする。
【0048】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記結合体は、Ｌの一末端がＦのアミノ基又はチオール基、Ｌの他の末端がＸのアミノ基又はチオール基にそれぞれ反応して形成された共有結合により、Ｆ及びＸにそれぞれ連結されたものであることを特徴とする。
【0049】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記Ｌはポリエチレングリコールであることを特徴とする。
【0050】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記Ｌ中のエチレングリコール繰り返し単位部分の化学式量は、１～１００ｋＤａの範囲にあることを特徴とする。
【0051】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記エチレングリコール繰り返し単位は［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎであり、ｎは、自然数であって、前記結合体中の［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎ部分の平均分子量、例えば数平均分子量が１～１００ｋＤａになるように決定されるものであることを特徴とする。
【0052】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域のいずれかのＦｃ領域鎖にＸ１分子が前記エチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーを介して共有結合的に連結されたものであることを特徴とする。
【0053】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記リンカーの一末端が前記二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域の２本のＦｃ領域鎖のいずれかのＦｃ領域鎖にのみ連結されたものであることを特徴とする。
【0054】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記組成物は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（glucagon like peptide 1 receptor agonist）をさらに含むものであることを特徴とする。
【0055】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、ＧＬＰ－１、エキセンジン－３、エキセンジン－４、それらのアゴニスト（agonist）、誘導体（derivative）、フラグメント（fragment）、変異体（variant）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
【0056】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、Ｎ末端のヒスチジン残基がデス－アミノ－ヒスチジル、ジメチル－ヒスチジル、β－ヒドロキシイミダゾプロピオニル、４－イミダゾアセチル及びβ－カルボキシイミダゾプロピオニルからなる群から選択される物質に置換されたＧＬＰ－１受容体アゴニスト誘導体であることを特徴とする。
【0057】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、天然エキセンジン－４、エキセンジン－４のＮ末端のアミノ基が除去されたエキセンジン－４誘導体、エキセンジン－４のＮ末端のアミノ基がヒドロキシ基に置換されたエキセンジン－４誘導体、エキセンジン－４のＮ末端のアミノ基がジメチル基で修飾されたエキセンジン－４誘導体、エキセンジン－４の１番目のアミノ酸（ヒスチジン）のα炭素を欠失（deletion）させたエキセンジン－４誘導体からなる群から選択されることを特徴とする。
【0058】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストはイミダゾ－アセチルエキセンジン－４（ＣＡエキセンジン－４）であることを特徴とする。
【0059】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、ＧＬＰ－１受容体アゴニストが免疫グロブリンＦｃ領域に連結された持続型結合体の形態であることを特徴とする。
【0060】
前述した具体例のいずれかによる組成物において、前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、イミダゾ－アセチルエキセンジン－４（ＣＡエキセンジン－４）がエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結されたものであることを特徴とする。
【0061】
本発明を実現する他の態様は、グルカゴン誘導体、その結合体、又はそれを含む組成物を個体に投与するステップを含む慢性腎臓疾患予防又は治療方法である。
【0062】
本発明を実現するさらに他の態様は、グルカゴン誘導体もしくはその結合体、及びＧＬＰ－１受容体アゴニストもしくはその結合体、又はそれを含む組成物を個体に投与するステップを含む慢性腎臓疾患予防又は治療方法である。
【0063】
本発明を実現するさらに他の態様は、グルカゴン誘導体もしくはその結合体、又はそれを含む組成物の慢性腎臓疾患予防又は治療用途である。
【0064】
本発明を実現するさらに他の態様は、グルカゴン誘導体もしくはその結合体、及びＧＬＰ－１受容体アゴニストもしくはその結合体、又はそれを含む組成物の慢性腎臓疾患予防又は治療用途である。
【0065】
本発明を実現するさらに他の態様は、グルカゴン誘導体もしくはその結合体、又はそれを含む組成物の慢性腎臓疾患予防又は治療用途を有する薬剤の製造のための用途である。
【0066】
本発明を実現するさらに他の態様は、グルカゴン誘導体もしくはその結合体、及びＧＬＰ－１受容体アゴニストもしくはその結合体、又はそれを含む組成物の慢性腎臓疾患予防又は治療用途を有する薬剤の製造のための用途である。
【0067】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0068】
なお、本発明で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。さらに、本明細書全体にわたって多くの論文及び特許文献が参照されており、その引用が示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体が本明細書に参照として組み込まれており、それにより本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【0069】
本明細書全体を通して、天然に存在するアミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが用いられるだけでなく、Ａｉｂ（α－アミノイソブチル酸）、Ｓａｒ（N-methylglycine）、α－メチルグルタミン酸（α-methyl-glutamic acid）などの他のアミノ酸に対して一般に許容される３文字コードが用いられる。また、本明細書において略語で言及したアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法に従って記載したものである。
アラニン Ａｌａ，Ａ
アルギニン Ａｒｇ，Ｒ
アスパラギン Ａｓｎ，Ｎ
アスパラギン酸 Ａｓｐ，Ｄ
システイン Ｃｙｓ，Ｃ
グルタミン酸 Ｇｌｕ，Ｅ
グルタミン Ｇｌｎ，Ｑ
グリシン Ｇｌｙ，Ｇ
ヒスチジン Ｈｉｓ，Ｈ
イソロイシン Ｉｌｅ，Ｉ
ロイシン Ｌｅｕ，Ｌ
リシン Ｌｙｓ，Ｋ
メチオニン Ｍｅｔ，Ｍ
フェニルアラニン Ｐｈｅ，Ｆ
プロリン Ｐｒｏ，Ｐ
セリン Ｓｅｒ，Ｓ
トレオニン Ｔｈｒ，Ｔ
トリプトファン Ｔｒｐ，Ｗ
チロシン Ｔｙｒ，Ｙ
バリン Ｖａｌ，Ｖ
アラニン Ａｌａ，Ａ
アルギニン Ａｒｇ，Ｒ
アスパラギン Ａｓｎ，Ｎ
アスパラギン酸 Ａｓｐ，Ｄ
システイン Ｃｙｓ，Ｃ
グルタミン酸 Ｇｌｕ，Ｅ
グルタミン Ｇｌｎ，Ｑ
グリシン Ｇｌｙ，Ｇ
ヒスチジン Ｈｉｓ，Ｈ
イソロイシン Ｉｌｅ，Ｉ
ロイシン Ｌｅｕ，Ｌ
リシン Ｌｙｓ，Ｋ
メチオニン Ｍｅｔ，Ｍ
フェニルアラニン Ｐｈｅ，Ｆ
プロリン Ｐｒｏ，Ｐ
セリン Ｓｅｒ，Ｓ
トレオニン Ｔｈｒ，Ｔ
トリプトファン Ｔｒｐ，Ｗ
チロシン Ｔｙｒ，Ｙ
バリン Ｖａｌ，Ｖ
【0070】
本明細書における「Ａｉｂ」は「２－アミノイソブチル酸（2-aminoisobutyric acid）」又は「アミノイソブチル酸（aminoisobutyric acid）」と混用され、２－アミノイソブチル酸（2-aminoisobutyric acid）とアミノイソブチル酸（aminoisobutyric acid）は混用される。
【0071】
本発明を実現する一態様は、グルカゴン誘導体又はその結合体を含む組成物である。具体的には、前記組成物は、グルカゴン誘導体又はその結合体を含む慢性腎臓疾患（chronic kidney disease）予防又は治療用薬学組成物である。
【0072】
一具体例において、前記慢性腎臓疾患予防又は治療用薬学組成物は、薬学的に許容される賦形剤と、グルカゴン誘導体又はその結合体とを薬学的有効量で含む薬学組成物であってもよい。
【0073】
本発明によるグルカゴン誘導体又はその結合体を有効成分として含む組成物は、グルカゴン受容体に対する作用により、血圧を低くし、腎臓機能を回復させ、慢性腎臓疾患予防又は治療効果を奏する。
【0074】
本発明の組成物は、慢性腎臓疾患予防又は治療効果を発揮する。
【0075】
本発明における「慢性腎臓疾患（chronic kidney disease, CKD）」とは、慢性腎臓病と混用され、腎臓の構造的又は機能的異常が３カ月以上存在するか、腎臓の損傷有無とは関係なく、糸球体濾過量が６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２以下に減少して３カ月以上経過した状態と定義される独立した疾患名である。慢性腎臓疾患は、進行によって５段階に分けられて臨床に適用される。高い血糖により腎臓に損傷がある場合や、血圧が高い状態が長く続く場合に慢性腎臓疾患の発症リスクが高くなり、それ以外にも、糸球体腎炎、多嚢胞性腎疾患、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス）なども慢性腎臓疾患の原因として知られている。
【0076】
前記慢性腎臓疾患の患者は、糸球体濾過量が減少して尿にタンパク質が排出される状態（タンパク尿）や、腎臓の機能が低下した状態を呈し、特に高血圧は、慢性腎臓疾患の原因でもあるが、慢性腎臓疾患の合併症としても知られている。慢性腎臓疾患の患者は糸球体高血圧及びタンパク尿を伴うことが多いので、血圧を低くし、タンパク尿を減少させることが慢性腎臓疾患の治療に必要かつ重要であることが知られている。
【0077】
前記慢性腎臓疾患には、ネフローゼ症候群（nephrotic syndrome）、尿細管機能障害（renal tubular dysfunction）、腎性高血圧（renal hypertension）、尿毒症（uremia）、腎不全（renal failure）及び慢性腎不全（chronic renal failure）からなる群から選択される少なくとも１つの疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0078】
本発明によるグルカゴン誘導体もしくはその結合体、又はそれを含む組成物は、血圧を低くし、かつ／又は腎臓機能の回復効果を奏する。
【0079】
前記血圧降下とは、収縮期血圧（systolic blood pressure, SBP）と拡張期血圧（diastolic blood pressure, DBP）の減少を意味するが、これに限定されるものではない。
【0080】
前記腎臓機能回復とは、血液中の老廃物を濾過する腎臓固有の機能を回復することを意味し、様々な方法で測定することができる。測定方法の例として、アルブミン排泄量、糸球体濾過量、タンパク尿、クレアチン濃度などを測定することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0081】
本発明におけるタンパク尿（proteinuria）とは、糸球体濾過量が低くなった慢性腎臓疾患の患者の尿に正常値より高いタンパク質（例えば、アルブミン、グロブリンなど）が含まれる症状を意味する。アルブミンは尿タンパクの約４０％を占めるタンパク質であり、尿中のアルブミンレベルを測定することにより、タンパク尿レベルを確認することができる。本発明によるグルカゴン誘導体もしくはその結合体、又はそれを含む組成物は、腎臓機能を回復させ、体外に排出されるタンパク質（例えば、アルブミン）の量を減少させるものであってもよい。よって、本発明において、タンパク尿減少は、腎臓機能回復と同じ意味で用いられる。
【0082】
本発明によるグルカゴン誘導体もしくはその結合体、又はそれを含む組成物は、個体に投与されると、個体の血圧降下効果を発揮するものであってもよい。また、グルカゴン誘導体もしくはその結合体、又はそれを含む組成物は、個体に投与されると、個体の腎臓機能を回復させるものであってもよい。前記血圧降下及び腎臓機能回復は、本発明によるグルカゴン誘導体もしくはその結合体、又はそれを含む組成物により、互いに独立して行われてもよく、共に行われてもよい。
【0083】
本発明における「個体」とは、腎臓損傷、腎臓機能異常及び／又は慢性腎臓疾患を有する、ヒトをはじめとして、マウス、家畜などが含まれる哺乳動物を意味し、血圧降下及び／又は腎臓機能回復により有利な効果が得られるものであれば特に限定されるものではない。
【0084】
本発明の実施例に用いた本態性高血圧モデル（spontaneously hypertensive rat, SHR）は、先天性高血圧による腎臓損傷などを誘導した慢性腎臓疾患関連モデルとして知られており、血圧降下治療剤の効能評価に用いられるものである。本発明の実施例において、本発明によるペプチドグルカゴン誘導体又はその持続型結合体の血圧降下及び腎臓機能回復効果が前記モデルで確認された。これは、慢性腎臓疾患予防又は治療に有用であることを示唆するものである。
【0085】
本発明によるグルカゴン誘導体もしくはその結合体、又はそれを含む組成物は、投与された個体において次の特性の少なくとも１つを有するものであるが、これらに限定されるものではない。
（ａ）賦形剤投与対照群に比べて血圧が降下する
（ｂ）賦形剤投与対照群に比べてアルブミン排泄量が減少する
（ｃ）賦形剤投与対照群に比べてタンパク尿が減少する
（ｄ）賦形剤投与対照群に比べて腎臓機能が回復する
（ａ）賦形剤投与対照群に比べて血圧が降下する
（ｂ）賦形剤投与対照群に比べてアルブミン排泄量が減少する
（ｃ）賦形剤投与対照群に比べてタンパク尿が減少する
（ｄ）賦形剤投与対照群に比べて腎臓機能が回復する
【0086】
本発明によるグルカゴン誘導体もしくはその結合体、又はそれを含む組成物は、前記特性を有することにより、慢性腎臓疾患に対する予防又は治療効果を奏する。
【0087】
本発明における「グルカゴン」とは、膵臓のα細胞から分泌されるホルモンの一種であり、グリコーゲンの分解を促進することにより、グルコースの濃度を上昇させて体内の血糖値を上げる役割を果たす。天然グルカゴンは、次のアミノ酸配列を有する。
Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ（配列番号１）
Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ（配列番号１）
【0088】
本発明のグルカゴン誘導体には、天然グルカゴンと比較してアミノ酸配列に少なくとも１つの差異のあるペプチド、天然グルカゴン配列を修飾（modification）することにより改変されたペプチド、天然グルカゴンのようにグルカゴン受容体を活性化させることのできる天然グルカゴンの模倣体が含まれる。このような天然グルカゴンの誘導体は、生体内での血圧降下及び／又は腎臓機能回復効果を有するものであってもよい。
【0089】
また、前記グルカゴン誘導体は、天然に存在しない（non-naturally occurring）ものであってもよい。
【0090】
本発明における前記グルカゴン誘導体とは、天然グルカゴンに比べて有意なレベルでグルカゴン受容体に作用するペプチドを意味する。本発明において、前記グルカゴン誘導体は、「グルカゴン受容体に活性を有するペプチド」、「グルカゴンアナログ」又は「ペプチド」と混用される。
【0091】
本発明のグルカゴン誘導体は、グルカゴン受容体に対する活性を有するペプチドであり、ここで、受容体に対する活性は、天然のものに比べて、受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が０．１％以上、０．２％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上又は２００％以上である例が挙げられる。しかし、これらに限定されるものではない。
【0092】
具体的には、本発明のグルカゴン誘導体は、グルカゴン受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が、当該受容体の天然リガンド（天然グルカゴン）に比べて、約０．００１％以上、約０．０１％以上、約０．１％以上、０．２％以上、約１％以上、約２％以上、約３％以上、約４％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上、約８％以上、約９％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％、約２００％以上であるが、有意に増加する範囲であればいかなるものでもよい。具体的には、本発明のグルカゴン受容体に活性を有するペプチドは、天然グルカゴンに比べて、グルカゴン受容体に対する相対的活性が５％以上、１０％以上、２０％以上又は３０％以上のものであるが、これらに限定されるものではない。
【0093】
本発明における「約」とは、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などが全て含まれる範囲であり、約という用語の後に続く数値と同等又は同程度の範囲の数値であればいかなるものでもよい。
【0094】
このようなペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を測定する方法としては、当該技術分野で公知の様々な方法（例えば、特許文献１、２、３）を用いることができるが、特にこれらに限定されるものではない。
【0095】
本発明の目的上、前記グルカゴン誘導体には、グルカゴン受容体のアゴニスト（agonist）、又は天然グルカゴンの少なくとも１つのアミノ酸に置換、付加、欠失、修飾及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異が生じたアナログもしくはフラグメントが含まれる。
【0096】
本発明における「グルカゴン受容体のアゴニスト」とは、「作用薬」又は「作動薬」と同じ意味であり、グルカゴン受容体に結合して実際の生体内でグルカゴンと同様の機能を果たす物質を意味する。
【0097】
本発明における「グルカゴンアナログ（glucagon analog）」とは、天然グルカゴンとは異なる非天然グルカゴンを意味する。このようなグルカゴンアナログには、天然グルカゴンの一部のアミノ酸が付加、欠失又は置換の形態で改変されたアナログが含まれる。
【0098】
本発明における「フラグメント」とは、体内で慢性腎臓疾患予防又は治療効果を発揮するものであって、天然グルカゴン又はグルカゴン誘導体のＮ末端又はＣ末端の少なくとも１つのアミノ酸が欠失した形態を意味する。
【0099】
本発明のグルカゴン誘導体は、天然グルカゴンの一部のアミノ酸が置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）及び修飾（modification）のいずれかの方法又はそれらの組み合わせにより改変されたものであってもよい。前記アミノ酸の置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。このような類似した性質を有するアミノ酸への保存的置換は、同一又は類似の活性を示すものと期待される。
【0100】
上記方法の組み合わせにより作製されるグルカゴン誘導体の例として、天然グルカゴンとアミノ酸配列が少なくとも１つ異なり、Ｎ末端のアミノ酸残基が脱アミノ化（deamination）された、グルカゴン受容体に対する活性化機能を有するペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、誘導体作製のための様々な方法の組み合わせにより、本発明に用いられる天然グルカゴンの誘導体を作製することができる。
【0101】
また、本発明においては、ペプチドの作製のためのＬ型もしくはＤ型アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸を用いた改変、並びに／あるいは天然配列の修飾、例えば側鎖官能基の改変、分子内の共有結合、一例として側鎖間の環形成、メチル化、アシル化、ユビキチン化、リン酸化、アミノヘキサン化、ビオチン化などの修飾による改変が全て含まれる。さらに、前記改変には、非天然化合物への置換が全て含まれる。
【0102】
さらに、Ｎ及び／又はＣ末端に少なくとも１つのアミノ酸が付加されたものが全て含まれる。
【0103】
前述したように置換されるか、付加されるアミノ酸としては、ヒトタンパク質において通常観察される２０種のアミノ酸だけでなく、異常又は非天然アミノ酸を用いることができる。異常アミノ酸の市販元には、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐ、Ｇｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。これらのアミノ酸が含まれるペプチドと定型的なペプチド配列は、民間のペプチド合成会社、例えば米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、又は韓国のＡｎｙｇｅｎにおいて合成及び購入することができる。
【0104】
アミノ酸誘導体も同様に入手することができ、一例として４－イミダゾ酢酸（4-imidazoacetic acid）などが挙げられる。
【0105】
また、本発明のグルカゴン誘導体は、上記作製方法を単独で用いるか、組み合わせて用いて作製したものであってもよい。
【0106】
具体的な一態様として、前記グルカゴン誘導体は、一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい。
【0107】
Ｘ１－Ｘ２－ＱＧＴＦ－Ｘ７－ＳＤ－Ｘ１０－Ｓ－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｘ１８－Ｘ１９－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｆ－Ｘ２３－Ｘ２４－Ｗ－Ｌ－Ｘ２７－Ｘ２８－Ｘ２９－Ｘ３０（一般式１，配列番号４６）
【0108】
上記式において、Ｘ１はチロシンであり、Ｘ２はα－メチルグルタミン酸（α-methyl-glutamic acid）、Ａｉｂ（aminoisobutyric acid）、Ｄ－アラニン、グリシン、Ｓａｒ（N-methylglycine）、セリン又はＤ－セリンであり、Ｘ７はトレオニン、バリン又はシステインであり、Ｘ１０はチロシン又はシステインであり、Ｘ１２はリシン又はシステインであり、Ｘ１３はチロシン又はシステインであり、Ｘ１４はロイシン又はシステインであり、Ｘ１５はアスパラギン酸、グルタミン酸又はシステインであり、Ｘ１６はグルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、α－メチルグルタミン酸もしくはシステインであるか、又は存在せず、Ｘ１７はアスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、システインもしくはバリンであるか、又は存在せず、Ｘ１８はアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、バリンもしくはシステインであるか、又は存在せず、Ｘ１９はアラニン、アルギニン、セリン、バリンもしくはシステインであるか、又は存在せず、Ｘ２０はリシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン酸、アルギニン、α－メチルグルタミン酸もしくはシステインであるか、又は存在せず、Ｘ２１はアスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、バリンもしくはシステインであるか、又は存在せず、Ｘ２３はイソロイシン、バリンもしくはアルギニンであるか、又は存在せず、Ｘ２４はバリン、アルギニン、アラニン、システイン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、α－メチルグルタミン酸もしくはロイシンであるか、又は存在せず、Ｘ２７はイソロイシン、バリン、アラニン、リシン、メチオニン、グルタミンもしくはアルギニンであるか、又は存在せず、Ｘ２８はグルタミン、リシン、アスパラギンもしくはアルギニンであるか、又は存在せず、Ｘ２９はトレオニン（Ｔ）であり、Ｘ３０はシステインであるか、又は存在しない（ただし、一般式１のアミノ酸配列が配列番号１又は配列番号１２と同じ場合は除く）。
【0109】
より具体的には、一般式１において、Ｘ２はＡｉｂ（aminoisobutyric acid）であり、Ｘ７はトレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）又はシステイン（Ｃ）であり、Ｘ１０はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ１２はリシン（Ｋ）であり、Ｘ１３はチロシン（Ｙ）であり、Ｘ１４はロイシン（Ｌ）又はシステイン（Ｃ）であり、Ｘ１５はアスパラギン酸（Ｄ）であり、Ｘ１６はグルタミン酸（Ｅ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｘ１７はリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はシステイン（Ｃ）であり、Ｘ１８はアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ１９はアラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）であり、Ｘ２０はグルタミン（Ｑ）又はリシン（Ｋ）であり、Ｘ２１はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であり、Ｘ２３はバリン（Ｖ）であり、Ｘ２４はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘ２７はメチオニン（Ｍ）であり、Ｘ２８はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ２９はトレオニン（Ｔ）であり、Ｘ３０はシステイン（Ｃ）であるか、又は存在しない。
【0110】
本発明の他の具体例として、前記グルカゴン誘導体は、配列番号２～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、具体的には配列番号２～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列で（必須に）構成されるものであるが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記グルカゴン誘導体は、配列番号２～１１、１３～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、より具体的には配列番号２～１１、１３～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列で（必須に）構成されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0111】
他の具体例として、前記グルカゴン誘導体は、配列番号７～１１、１３～２５、２７、２９、３１、３３及び３５～４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであるか、前記アミノ酸配列で（必須に）構成されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0112】
あるいは、前記グルカゴン誘導体は、配列番号２０、２２、２３、２７、３３、３５、３７、３８、４０、４１、４２及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであるか、前記アミノ酸配列で（必須に）構成されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0113】
本発明に「特定配列番号で構成される」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、当該配列番号のアミノ酸配列の前後の無意味な配列付加や、自然発生する突然変異や、その非表現突然変異（silent mutation）を除外するものではなく、このような配列付加又は突然変異を有するものも本発明に含まれることは言うまでもない。すなわち、一部の配列に差異があっても、所定レベル以上の相同性を示し、グルカゴン受容体に対する活性を示すものであれば、本発明に含まれる。
【0114】
例えば、本発明のグルカゴン誘導体は、天然グルカゴンと配列同一性を比較した場合に、少なくとも６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上又は９５％以上の配列同一性を有するものであるが、慢性腎臓疾患予防又は治療効果を有するものであれば、特定配列に限定されるものではない。本発明のグルカゴン誘導体については、特許文献１、２、３に開示されている。
【0115】
また、本発明のグルカゴン誘導体は、配列番号２～４５のいずれかのアミノ酸配列を含むものであるか、配列番号２～４５のいずれかのアミノ酸配列で（必須に）構成されるものであるか、又は配列番号２～４５のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上又は９５％以上の配列同一性を有するペプチドを含むものであるが、慢性腎臓疾患予防又は治療効果を有するものであれば、特定配列に限定されるものではない。
【0116】
本発明における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が互いに関連する程度を意味し、百分率で表される。
【0117】
相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。
【0118】
任意の２つのペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献２のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献３）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献４）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献５）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献６、７及び８）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
【0119】
ペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献９に開示されているように、非特許文献４などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、アミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献１０に開示されているように、非特許文献１１の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。よって、本発明における「相同性」又は「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示すものである。
【0120】
前述した本発明のグルカゴン誘導体は、分子内架橋（intramolecular bridge）を含んでもよく（例えば、共有結合的架橋又は非共有結合的架橋）、具体的にはアミノ酸残基間に環を含む形態であってもよい。例えば、ペプチドの１２番目のアミノ酸と１６番目のアミノ酸間、又は１６番目のアミノ酸と２０番目のアミノ酸間に環が形成される形態であってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
【0121】
前記環の例として、ラクタム架橋（又はラクタム環）が挙げられるが、特にこれに限定されるものではない。
【0122】
また、前記グルカゴン誘導体には、目的とする位置に環を形成するアミノ酸を含むことにより環を含むように改変されたものが全て含まれる。
【0123】
このような環は、前記グルカゴン誘導体中のアミノ酸側鎖間に形成される形態、例えばリシンの側鎖とグルタミン酸の側鎖間にラクタム環が形成される形態であるが、特にこれらに限定されるものではない。
【0124】
例えば、一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドは、一般式１のＸ１０とＸ１４、Ｘ１２とＸ１６、Ｘ１６とＸ２０、Ｘ１７とＸ２１、Ｘ２０とＸ２４、及びＸ２４とＸ２８のアミノ酸対において、各アミノ酸対のアミノ酸がそれぞれグルタミン酸又はリシンに置換されたものであってもよいが、これらに限定されるものではない。上記において、Ｘｎ（ｎは自然数）のｎは、提示されたアミノ酸配列のＮ末端からのアミノ酸位置を示すものである。
【0125】
また、一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドは、Ｘ１２とＸ１６のアミノ酸対、Ｘ１６とＸ２０のアミノ酸対、又はＸ１７とＸ２１のアミノ酸対の各アミノ酸が環を形成するグルタミン酸又はリシンに置換されたものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0126】
さらに、一般式１のＸ１０とＸ１４、Ｘ１２とＸ１６、Ｘ１６とＸ２０、Ｘ１７とＸ２１、Ｘ２０とＸ２４、及びＸ２４とＸ２８のアミノ酸対の少なくとも１つのアミノ酸対において、各アミノ酸対の各アミノ酸間に環（例えば、ラクタム環）を形成するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0127】
さらに、一般式１において、Ｘ１６はグルタミン酸であり、Ｘ２０はリシンであり、Ｘ１６とＸ２０の側鎖はラクタム環を形成するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0128】
また、本発明のグルカゴン誘導体は、Ｎ末端及び／又はＣ末端が改変されていないものであってもよいが、生体内のタンパク質切断酵素から保護して安定性を向上させるために、そのＮ末端及び／又はＣ末端などが化学的に修飾された形態、有機基により保護された形態、又はグルカゴン誘導体の末端などにアミノ酸が付加されて改変された形態も本発明によるグルカゴン誘導体に含まれる。Ｃ末端が改変されていない場合、本発明によるグルカゴン誘導体の末端はカルボキシ基を有するが、特にこれに限定されるものではない。
【0129】
特に、化学的に合成したグルカゴン誘導体の場合、Ｎ及びＣ末端が電荷を帯びているので、その電荷を除去するために、Ｎ末端のアセチル化（acetylation）及び／又はＣ末端のアミド化（amidation）を行うが、特にこれらに限定されるものではない。
【0130】
具体的には、本発明のグルカゴン誘導体のＮ末端又はＣ末端は、アミノ基（－ＮＨ２）又はカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）を有するが、これらに限定されるものではない。
【0131】
本発明において、前記グルカゴン誘導体は、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質部が結合されている結合体の形態であるが、これに限定されるものではない。
【0132】
本発明における「持続型結合体」又は「結合体」とは、前記グルカゴン誘導体と生体適合性物質が結合された構造を有し、前記生体適合性物質が結合されていないグルカゴン誘導体より効力の持続性が向上したものを意味する。前記持続型結合体における生体適合性物質は、グルカゴン誘導体に共有結合で連結されたものであるが、特にこれに限定されるものではない。本発明において、前記結合体の一構成要素であるグルカゴン誘導体は、天然グルカゴン配列の少なくとも１つのアミノ酸に置換、付加、欠失、修飾又はそれらの組み合わせの変異が生じたペプチド又はフラグメントであり、生体適合性物質の結合により活性を失わないものであるが、慢性腎臓疾患予防又は治療効果を有するものであれば、いかなるものでも本発明の結合体の一構成要素として用いられる。
【0133】
例えば、前記結合体に含まれるグルカゴン誘導体は、前述した一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドである。あるいは、前記結合体に含まれるグルカゴン誘導体は、配列番号２～４５のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである。あるいは、前記結合体に含まれるグルカゴン誘導体は、配列番号２～１１、及び１３～４５のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであるが、これらに限定されるものではない。
【0134】
本発明における「生体適合性物質」とは、生理活性物質である本発明のグルカゴン誘導体に結合され、生体適合性物質部又はキャリアに結合されていない生理活性物質より生理活性物質の効力の持続性を向上させることのできる物質を意味する。前記生体適合性物質は、生理活性物質に共有結合で連結されたものであるが、特にこれに限定されるものではない。
【0135】
前記生体適合性物質は、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体フラグメント、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカライド（saccharide）、ヘパリン及びエラスチンからなる群から選択されるものであるが、特にこれらに限定されるものではない。
【0136】
例えば、前記ＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ領域であり、より具体的にはＩｇＧ Ｆｃ領域であるが、特にこれらに限定されるものではない。
【0137】
本発明のペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸側鎖は、生体内で可溶性及び／又は半減期を向上させ、かつ／又はバイオアベイラビリティを増加させるために、このような生体適合性物質に接合される。また、このような改変は、治療学的タンパク質及びペプチドのクリアランス（clearance）を減少させる。
【0138】
前述した生体適合性物質は、水溶性（両親媒性又は親水性）のもの、無毒性のもの、及び／又は薬学的に許容されるものであってもよい。
【0139】
以下、本発明の組成物に含まれる有効成分であるグルカゴン誘導体の持続型結合体についてより具体的に説明する。
【0140】
本発明のグルカゴン誘導体の持続型結合体は、グルカゴン誘導体と免疫グロブリンＦｃ領域が互いに連結された形態である。具体的には、前記結合体は、グルカゴン誘導体に免疫グロブリンＦｃ領域がリンカーを介して共有結合的に連結されたものであるが、特にこれに限定されるものではない。
【0141】
前記グルカゴン誘導体の持続型結合体とは、免疫グロブリンＦｃ領域が結合されていないグルカゴン誘導体より効力の持続性が向上したものを意味し、本発明においては、一般式１のペプチドの化学式（１）で表される結合体を「持続型結合体」といい、「グルカゴン誘導体の持続型結合体」と混用される。
【0142】
具体的には、前記グルカゴン誘導体又はペプチドは、持続型結合体の形態であり、前記持続型結合体は、化学式（１）で表される結合体である。
【0143】
Ｘ－Ｌ－Ｆ・・・（１）
【0144】
ここで、Ｘは一般式１のアミノ酸配列を含むペプチド（グルカゴン誘導体）であり、Ｌはエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであり、Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域であり、－はＸとＬ間、ＬとＦ間の共有結合連結を示すものである。
【0145】
本発明の持続型結合体は、一般式１のアミノ酸配列を含むペプチド（グルカゴン誘導体）を結合体の一部として含むものであることを特徴とする。
【0146】
本発明の結合体は、結合体の形態においても、グルカゴン誘導体と同様に、グルカゴン受容体に対して有意な活性を示すので、血圧降下及び腎臓機能回復による慢性腎臓疾患予防又は治療効能を発揮する。
【0147】
具体的には、本発明の結合体は、天然グルカゴンに比べて、グルカゴン受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が約０．０１％以上、０．１％以上、０．２％以上、０．５％以上、０．７％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上であるが、これらに限定されるものではない。
【0148】
本発明の目的上、前記ペプチド（グルカゴン誘導体）又はその結合体は、天然グルカゴンに比べて、グルカゴン受容体に対する活性が約０．０１％以上、約０．１％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、２００％以上であるが、これらに限定されるものではない。
【0149】
本発明の組成物は、（ｉ）グルカゴン受容体に対して活性を有するグルカゴン誘導体であってもよく、（ｉｉ）前記グルカゴン誘導体の持続型結合体を含むものであってもよく、前記持続型結合体は、向上した体内持続性に基づいて、優れた慢性腎臓疾患予防又は治療効果を発揮する。
【0150】
前記結合体において、Ｆは、半減期を延長させる生体適合性物質、具体的にはＸ、すなわち本発明のグルカゴン誘導体の半減期を延長させる物質であって、本発明の前記結合体の一構成要素である。
【0151】
前記Ｆは、Ｘに共有化学結合又は非共有化学結合により互いに結合されたものであってもよく、Ｌを介して、Ｘに共有化学結合、非共有化学結合又はそれらの組み合わせにより互いに結合されたものであってもよい。
【0152】
より具体的には、ＸとＬ、及びＬとＦは、共有結合により互いに連結されたものであってもよく、ここで、前記結合体は、化学式（１）の順に、Ｘ、Ｌ及びＦが共有結合によりそれぞれ連結された結合体である。
【0153】
本発明において、前記Ｆは、免疫グロブリンＦｃ領域であってもよい。
【0154】
前記「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除いたものであり、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び／又は重鎖定常領域３（ＣＨ３）部分を含む部位を意味する。前記免疫グロブリンＦｃ領域は、本発明の結合体の一部をなす一構成であってもよい。具体的には、化学式（１）のＦに該当する。
【0155】
本明細書において、Ｆｃ領域には、免疫グロブリンのパパイン消化により得られる天然配列だけでなく、その誘導体、例えば天然配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより置換されて天然のものとは異なる配列などの改変体も含まれる。前記誘導体、置換体、改変体は、ＦｃＲｎに結合する能力を保有することを前提とする。本発明において、Ｆはヒト免疫グロブリン領域であるが、これに限定されるものではない。前記Ｆは、２本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合で連結された構造であり、前記２本の鎖のうち１本の鎖の窒素原子を介してのみ連結された構造であるが、これに限定されるものではない。前記窒素原子を介した連結は、リシンのεアミノ原子やＮ末端のアミノ基に還元的アミノ化により連結されるものであってもよい。
【0156】
還元的アミノ化反応とは、反応物のアミン基又はアミノ基が他の反応物のアルデヒド（すなわち、還元的アミノ化が可能な官能基）と反応してアミンを生成し、次いで還元反応によりアミン結合を形成する反応を意味し、当該技術分野で周知の有機合成反応である。
【0157】
一具体例として、前記Ｆは、そのＮ末端のプロリンの窒素原子を介して連結されたものであるが、これに限定されるものではない。
【0158】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、本発明の化学式（１）の結合体の一部をなす一構成であり、具体的には、化学式（１）のＦに該当する。
【0159】
このような免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖定常領域にヒンジ（hinge）部分を含むが、これに限定されるものではない。
【0160】
本発明における「ヒンジ配列」とは、重鎖に位置してジスルフィド結合（inter disulfide bond）により免疫グロブリンＦｃ領域の二量体を形成する部位を意味する。
【0161】
本発明における前記ヒンジ配列は、次のアミノ酸配列を有するヒンジ配列中の一部が欠失して１つのシステイン残基のみ有するように変異したものであるが、これに限定されるものではない。
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４７）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４７）
【0162】
前記ヒンジ配列は、配列番号４７のヒンジ配列中の８番目又は１１番目のシステイン残基が欠失して１つのシステイン残基のみ含むものであってもよい。本発明のヒンジ配列は、１つのシステイン残基のみ含む、３～１２個のアミノ酸からなるものであるが、これに限定されるものではない。より具体的には、本発明のヒンジ配列は、次の配列を有するものであってもよい。
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４８）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ（配列番号４９）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５０）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（配列番号５１）
Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５２）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号５３）
Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号５４）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５５）
Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５６）
Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５７）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５８）
Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５９）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６０）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号６１）
Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６２）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６３）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６４）
Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ（配列番号６５）
Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６６）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号４８）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ（配列番号４９）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５０）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（配列番号５１）
Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号５２）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号５３）
Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号５４）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５５）
Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５６）
Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５７）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５８）
Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号５９）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６０）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号６１）
Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６２）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６３）
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６４）
Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ（配列番号６５）
Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号６６）
【0163】
より具体的には、前記ヒンジ配列は、配列番号５７（Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ）又は配列番号６６（Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ）のアミノ酸配列を含むものであるが、これらに限定されるものではない。
【0164】
本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ配列の存在により免疫グロブリンＦｃ鎖の２つの分子が二量体を形成した形態であり、また、本発明の化学式（１）の結合体は、リンカーの一末端が二量体の免疫グロブリンＦｃ領域の１本の鎖に連結された形態であるが、これらに限定されるものではない。
【0165】
本発明における「Ｎ末端」とは、タンパク質又はポリペプチドのアミノ末端を意味し、アミノ末端の最末端、又は最末端から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個以上のアミノ酸が含まれる。本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ配列をＮ末端に含むが、これに限定されるものではない。
【0166】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然のものと実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。さらに、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に相当する非常に長い一部のアミノ酸配列が欠失した領域であってもよい。
【0167】
例えば、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインの少なくとも１つのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体である。しかし、これらに限定されるものではない。
【0168】
本発明における前記免疫グロブリンＦｃ領域は、同一起源のドメインからなる一本鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体の形態であるが、これらに限定されるものではない。
【0169】
また、前記免疫グロブリンＦｃ領域Ｆは、２本のポリペプチド鎖からなる二量体（dimer）であり、ここで、前記Ｆｃ領域二量体ＦとＸは、エチレングリコール繰り返し単位を含む１つの同じリンカーＬを介して共有結合的に連結されている。本実施形態の具体的な例において、Ｘは、このようなＦｃ領域二量体Ｆの２本のポリペプチド鎖のいずれかのポリペプチド鎖にのみリンカーＬを介して共有結合により連結されている。本実施形態のさらに具体的な例において、このようなＦｃ領域二量体Ｆの２本のポリペプチド鎖のうちＸが連結された１本のポリペプチド鎖には、１分子のＸのみＬを介して共有結合的に連結されている。本実施形態の最も具体的な例において、前記Ｆはホモ二量体（homodimer）である。
【0170】
他の具体形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域Ｆは、２本のポリペプチド鎖からなる二量体であり、Ｌの一末端が前記２本のポリペプチド鎖のいずれかのポリペプチド鎖にのみ連結されているものであるが、これに限定されるものではない。
【0171】
本発明の持続型結合体の他の実施形態においては、二量体の形態の１つのＦｃ領域に２分子のＸが対称に結合されてもよい。ここで、前記免疫グロブリンＦｃ領域とＸは、非ペプチド性リンカーにより互いに連結されてもよい。しかし、上記例に限定されるものではない。
【0172】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域には、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体も含まれる。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。
【0173】
例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４～２３８、２９７～２９９、３１８～３２２、又は３２７～３３１番目のアミノ酸残基が修飾に適した部位として用いられる。
【0174】
また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去された誘導体、天然ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が欠失した誘導体、天然ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加された誘導体など、様々な誘導体が用いられる。さらに、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を作製する技術は、特許文献４、５などに開示されている。
【0175】
分子の活性を全体的に変化させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野で公知である（非特許文献１２）。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫酸化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、グリコシル化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）、アミド化（amidation）などにより修飾（modification）されてもよい。
【0176】
前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同等の生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を向上させたものであってもよい。
【0177】
また、このようなＦｃ領域は、ヒトや、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離した天然のものから得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換えたもの又はその誘導体であってもよい。ここで、天然のものから得る方法は、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素で処理することにより得る方法であってもよい。パパインで処理するとＦａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンで処理するとｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）2に切断される。これらは、サイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。より具体的な実施形態において、ヒト由来のＦｃ領域は、微生物から得られた組換え免疫グロブリンＦｃ領域である。
【0178】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然糖鎖であってもよく、天然のものに比べて増加した糖鎖であってもよく、天然のものに比べて減少した糖鎖であってもよく、糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法、微生物を用いた遺伝工学的手法などの通常の方法が用いられる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が低減又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことから、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域は、薬物のキャリアとしての本来の目的に適する形態である。
【0179】
本発明における「糖鎖の除去（Deglycosylation）」とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域を意味し、非グリコシル化（Aglycosylation）とは、原核生物、より具体的な実施形態においては大腸菌で産生されてグリコシル化されていないＦｃ領域を意味する。
【0180】
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト起源、又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であり、より具体的な実施形態においてはヒト起源である。
【0181】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来のＦｃ領域であってもよく、それらの組み合わせ（combination）又はそれらのハイブリッド（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。より具体的な実施形態においては、ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来のものであり、さらに具体的な実施形態においては、リガンド結合タンパク質の半減期を延長させることが知られているＩｇＧ由来のものである。一層具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、最も具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域であるが、これらに限定されるものではない。
【0182】
また、具体的な一実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃの領域であり、各単量体（monomer）の３番目のアミノ酸であるシステイン間のジスルフィド結合（inter-chain形態）により２つの単量体が連結されたホモ二量体（homodimer）の形態であってもよく、ここで、ホモ二量体の各単量体は、独立して３５番目と９５番目のシステイン間の内部のジスルフィド結合、及び１４１番目と１９９番目のシステイン間の内部のジスルフィド結合、すなわち２つの内部のジスルフィド結合（intra-chain形態）を有するものである／有するものであってもよい。
【0183】
各単量体のアミノ酸は、２２１個のアミノ酸からなり、ホモ二量体を形成するアミノ酸は、全体で４４２個のアミノ酸からなるが、これらに限定されるものではない。具体的には、免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号６７のアミノ酸配列（２２１個のアミノ酸からなる）を有する２つの単量体が各単量体の３番目のアミノ酸であるシステイン間のジスルフィド結合によりホモ二量体を形成し、前記ホモ二量体の単量体は、それぞれ独立して３５番目と９５番目のシステイン間の内部のジスルフィド結合、及び１４１番目と１９９番目のシステイン間の内部のジスルフィド結合を形成するものであるが、これに限定されるものではない。
【0184】
化学式（１）のＦは、配列番号６７のアミノ酸配列を有する単量体を含むものであり、前記Ｆは、配列番号６７のアミノ酸配列の単量体のホモ二量体であるが、これらに限定されるものではない。
【0185】
一例として、免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号６８のアミノ酸配列（４４２個のアミノ酸からなる）を含むホモ二量体であるが、これに限定されるものではない。
【0186】
一具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域とＸはグリコシル化されていないが、これに限定されるものではない。
【0187】
一方、本発明における「組み合わせ（combination）」とは、二量体又は多量体を形成する際に、同一起源の一本鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが異なる起源の一本鎖ポリペプチドに結合することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ領域からなる群から選択される少なくとも２つの領域から二量体又は多量体を作製することができる。
【0188】
本発明における「ハイブリッド（hybrid）」とは、一本鎖免疫グロブリン定常領域内に、少なくとも２つの異なる起源の免疫グロブリンＦｃ領域に相当する配列が存在することを意味する。本発明においては、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群から１つ～４つのドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含んでもよい。
【0189】
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けられ、本発明においては、それらの組み合わせ又はそれらのハイブリダイゼーションも可能である。具体的には、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであり、より具体的には、補体依存的細胞傷害（CDC, Complement dependent cytotoxicity）などのエフェクター機能（effector function）のほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域である。
【0190】
また、前述した結合体は、天然グルカゴンより、又はＦが修飾されていないＸより効力の持続性が向上したものであり、このような結合体には、前述した形態だけでなく、生分解性ナノ粒子に封入された形態などが全て含まれる。
【0191】
一方、化学式（１）において、前記Ｌは、非ペプチド性リンカー、例えばエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであってもよい。
【0192】
本発明における「非ペプチド性リンカー」には、繰り返し単位が少なくとも２つ結合された生体適合性重合体が含まれる。前記繰り返し単位は、ペプチド結合を除く任意の共有結合により互いに連結される。前記非ペプチド性リンカーは、本発明の結合体の一部をなす一構成であり、化学式（１）のＬに該当する。
【0193】
本発明に用いられる非ペプチド性リンカーは、生体内タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体であればいかなるものでもよい。本発明における前記非ペプチド性リンカーは、非ペプチド性重合体と混用される。
【0194】
本発明における非ペプチド性リンカーは、末端に反応基を含み、結合体を構成する他の構成要素との反応により結合体を形成することができる。両末端に反応性官能基を有する非ペプチド性リンカーが各反応基を介して化学式（１）のＸ及びＦに結合することにより結合体を形成する場合、前記非ペプチド性リンカー又は非ペプチド性重合体を非ペプチド性重合体連結部（linker moiety）又は非ペプチド性リンカー連結部ともいう。
【0195】
前記非ペプチド性リンカーは、エチレングリコール繰り返し単位を含むリンカー、例えばポリエチレングリコールであるが、特にこれらに限定されるものではない。また、当該分野で公知のそれらの誘導体や当該分野の技術水準で容易に作製できる誘導体も本発明に含まれる。
【0196】
前記非ペプチド性リンカーの繰り返し単位は、エチレングリコール繰り返し単位であってもよく、具体的には、前記非ペプチド性リンカーは、エチレングリコール繰り返し単位を含むと共に、結合体として構成されるまでは、結合体の作製に用いられる官能基を末端に含むものであってもよい。本発明による持続型結合体は、前記官能基を介してＸとＦが連結された形態であるが、これに限定されるものではない。本発明における前記非ペプチド性リンカーは、２つ又は３つ以上の官能基を含み、各官能基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0197】
具体的には、前記リンカーは、化学式（２）で表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるが、これに限定されるものではない。
【0198】
【0199】
ここで、ｎ＝１０～２４００、n＝１０～４８０、又はｎ＝５０～２５０であるが、これらに限定されるものではない。
【0200】
前記持続型結合体でＰＥＧ部分は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－構造だけでなく、連結要素とその－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－間に介在する酸素原子も含むが、これに限定されるものではない。
【0201】
一具体例として、前記エチレングリコール繰り返し単位は［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎで表され、ｎ値は、自然数であって、前記持続型結合体中の［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎ部分の平均分子量、例えば数平均分子量が０超～約１００ｋＤａになるように決定されるが、これらに限定されるものではない。他の具体例として、前記ｎ値は、自然数であって、前記持続型結合体中の［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎ部分の平均分子量、例えば数平均分子量が約１～約１００ｋＤａ、約１～約８０ｋＤａ、約１～約５０ｋＤａ、約１～約３０ｋＤａ、約１～約２５ｋＤａ、約１～約２０ｋＤａ、約１～約１５ｋＤａ、約１～約１３ｋＤａ、約１～約１１ｋＤａ、約１～約１０ｋＤａ、約１～約８ｋＤａ、約１～約５ｋＤａ、約１～約３．４ｋＤａ、約３～約３０ｋＤａ、約３～約２７ｋＤａ、約３～約２５ｋＤａ、約３～約２２ｋＤａ、約３～約２０ｋＤａ、約３～約１８ｋＤａ、約３～約１６ｋＤａ、約３～約１５ｋＤａ、約３～約１３ｋＤａ、約３～約１１ｋＤａ、約３～約１０ｋＤａ、約３～約８ｋＤａ、約３～約５ｋＤａ、約３～約３．４ｋＤａ、約８～約３０ｋＤａ、約８～約２７ｋＤａ、約８～約２５ｋＤａ、約８～約２２ｋＤａ、約８～約２０ｋＤａ、約８～約１８ｋＤａ、約８～約１６ｋＤａ、約８～約１５ｋＤａ、約８～約１３ｋＤａ、約８～約１１ｋＤａ、約８～約１０ｋＤａ、約９～約１５ｋＤａ、約９～約１４ｋＤａ、約９～約１３ｋＤａ、約９～約１２ｋＤａ、約９～約１１ｋＤａ、約９．５～約１０．５ｋＤａ、又は約１０ｋＤａであるが、これらに限定されるものではない。
【0202】
また、具体的な一実施形態における前記結合体は、グルカゴン誘導体（Ｘ）と免疫グロブリンＦｃ領域（Ｆ）がエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーを介して共有結合により連結された構造であるが、これに限定されるものではない。
【0203】
具体的な他の実施形態における前記持続型結合体において、前記Ｌは、エチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーであり、Ｆは、二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域であってもよい。より具体的には、二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域のいずれかのＦｃ領域にＸ１分子が前記エチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーを介して共有結合的に連結されたものであるが、これに限定されるものではない。また、具体的なさらに他の実施形態においては、前記エチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーの一末端が前記二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域の２本のＦｃ領域鎖のいずれかのＦｃ領域鎖にのみ連結されたものであるが、これに限定されるものではない。
【0204】
前記ポリエチレングリコールは、エチレングリコールホモポリマー、ＰＥＧコポリマー又はモノメチル置換ＰＥＧポリマー（ｍＰＥＧ）の形態を包括するものであるが、特にこれらに限定されるものではない。
【0205】
前記Ｌ中のエチレングリコール繰り返し単位部分の化学式量は、１～１００ｋＤａの範囲にあるが、これに限定されるものではない。また、具体的な一実施形態において、前記結合体は、両末端にＦ、具体的には免疫グロブリンＦｃ領域、及びＸ、具体的にはグルカゴン誘導体に結合される反応基を有する非ペプチド性リンカーを介して、ＦとＸが互いに共有結合的に連結されたものであってもよい。
【0206】
本発明に用いられる非ペプチド性リンカーは、生体内タンパク質分解酵素に抵抗性を有し、エチレングリコール繰り返し単位を含む重合体であればいかなるものでもよい。前記非ペプチド性重合体の分子量は、０超～約１００ｋＤａの範囲、約１～約１００ｋＤａの範囲、具体的には約１～約２０ｋＤａの範囲、又は約１～約１０ｋＤａの範囲であるが、これらに限定されるものではない。また、前記Ｆに該当するポリペプチドに結合される本発明の非ペプチド性リンカーは、１種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが用いられてもよい。
【0207】
本発明における「約」とは、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などが全て含まれる範囲であり、約という用語の後に続く数値と同等又は同程度の範囲の数値であればいかなるものでもよいが、これらに限定されるものではない。
【0208】
具体的には、前記非ペプチド性リンカーは、Ｆ及びＸに結合されていない状態で両末端に反応基を有し、前記反応基を介してＦ及びＸに結合されるものであってもよい。
【0209】
一具体例として、前記リンカーの両末端は、免疫グロブリンＦｃ領域のチオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、及びグルカゴン誘導体（Ｘ）のチオール基、アミノ基、アジド基、ヒドロキシ基に結合されるが、これらに限定されるものではない。
【0210】
具体的には、前記リンカーは、両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びグルカゴン誘導体（Ｘ）に結合される反応基、より具体的には、免疫グロブリンＦｃ領域のシステインのチオール基と、Ｎ末端、リシン、アルギニン、グルタミン及び／又はヒスチジンに位置するアミノ基と、Ｃ末端に位置するヒドロキシ基とからなる群から選択される少なくとも１つに結合され、グルカゴン誘導体（Ｘ）のシステインのチオール基と、リシン、アルギニン、グルタミン及び／又はヒスチジンのアミノ基と、アジドリシンのアジド基と、ヒドロキシ基とからなる群から選択される少なくとも１つに結合される反応基であるが、これらに限定されるものではない。
【0211】
さらに具体的には、前記リンカーの反応基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。
【0212】
上記において、アルデヒド基の例として、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0213】
上記において、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル又はスクシンイミジルカーボネートが用いられるが、これらに限定されるものではない。
【0214】
前記リンカーは、上記反応基を介して、免疫グロブリンＦｃ領域であるＦ、及びグルカゴン誘導体であるＸに連結され、リンカー連結部に変換されてもよい。
【0215】
また、アルデヒド結合による還元性アミノ化で生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものよりはるかに安定している。アルデヒド反応基は、低いｐＨではＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリシン残基と共有結合を形成することができる。
【0216】
また、前記非ペプチド性リンカーの両末端の反応基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。例えば、両末端にアルデヒド基を有するものであってもよく、一末端にはマレイミド基、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を有するものであってもよい。しかし、非ペプチド性リンカーの各末端にＦ、具体的には免疫グロブリンＦｃ領域とＸが結合されるものであれば、特にこれに限定されるものではない。
【0217】
例えば、前記非ペプチド性リンカーの一末端には反応基としてマレイミド基を含み、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基などを含んでもよい。
【0218】
両末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前述した様々な反応基として活性化するか、市販されている修飾された反応基を有するポリエチレングリコールを用いることにより、本発明の持続型タンパク質結合体を作製することができる。
【0219】
具体的な一実施形態におおて。前記非ペプチド性重合体は、Ｘのシステイン残基、より具体的にはシステインの－ＳＨ基に連結されたものであるが、これらに限定されるものではない。
【0220】
例えば、前記Ｘに該当するペプチドにおいて、７番目のシステイン残基、１０番目のシステイン残基、１２番目のシステイン残基、１３番目のシステイン残基、１４番目のシステイン残基、１５番目のシステイン残基、１６番目のシステイン残基、１７番目のシステイン残基、１８番目のシステイン残基、１９番目のシステイン残基、２０番目のシステイン残基、２１番目のシステイン残基、又は３０番目のシステイン残基に前記非ペプチド性重合体が連結されたものが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【0221】
具体的には、前記システイン残基の－ＳＨ基に非ペプチド性重合体の反応基が連結されてもよい。反応基については前述した通りである。マレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドを用いる場合、マレイミド基はＸの－ＳＨ基にチオエーテル（thioether）結合で連結することができ、アルデヒド基はＦ、具体的には免疫グロブリンＦｃの－ＮＨ2基に還元的アミノ化反応により連結することができるが、これらに限定されるものではなく、これらは一例にすぎない。
【0222】
このような還元的アルキル化により、ＰＥＧの一末端に位置する酸素原子に免疫グロブリンＦｃフラグメントのＮ末端アミノ基が－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－の構造を有するリンカー官能基を介して互いに連結され、－ＰＥＧ－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ－免疫グロブリンＦｃのような構造を形成することができ、チオエーテル結合により、ＰＥＧの一末端が一般式１のペプチドのシステインに位置する硫黄原子に連結された構造を形成することができる。前述したチオエーテル結合は、
の構造を有するものであってもよい。
【0223】
しかし、上記例に特に限定されるものではなく、これは一例にすぎない。
【0224】
具体的な他の実施形態において、前記非ペプチド性重合体は、Ｘのリシン残基、より具体的にはリシンのアミノ基に連結されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0225】
また、前記結合体において、非ペプチド性重合体の反応基が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に位置する－ＮＨ2に連結されたものであってもよいが、これは一例にすぎない。
【0226】
さらに、前記結合体において、本発明によるグルカゴン誘導体は、反応基を有するリンカーにＣ末端を介して連結されてもよいが、これは一例にすぎない。
【0227】
本発明における「Ｃ末端」とは、ペプチドのカルボキシ末端を意味し、本発明の目的上、リンカーに結合する位置を意味する。例えば、これらに限定されるものではないが、Ｃ末端の最末端のアミノ酸残基だけでなく、Ｃ末端周辺のアミノ酸残基が全て含まれ、具体的には最末端から１～２０番目のアミノ酸残基が含まれる。
【0228】
一具体例として、化学式（１）の結合体は、化学式（３）の構造を有するものであってもよい。
【0229】
【0230】
化学式（３）において、Ｘは前述した一般式１のペプチドであり、Ｆはヒト免疫グロブリンＦｃ領域であり、ｎは自然数である。ここで、ｎについては前述した通りである。
【0231】
一具体例として、化学式（３）の持続型結合体は、配列番号４６の一般式１のペプチドのＸとヒト免疫グロブリンＦｃ領域のＦがエチレングリコール繰り返し単位を介して共有結合により連結された構造であってもよく、また、Ｘは化学式（３）のスクシンイミド環、Ｆは化学式（３）のオキシプロピレン基にそれぞれ連結された形態であってもよい。
【0232】
化学式（３）において、前記ｎの値は、前記ペプチド結合体中の［ＯＣＨ2ＣＨ2］ｎ部分の平均分子量、例えば数平均分子量が１～１００ｋＤａ、１～２０ｋＤａ、又は１０ｋＤａになるように決定されるが、これらに限定されるものではない。
【0233】
前記結合体のＸは、グルカゴン受容体に対して活性を有するペプチドであってもよい。
【0234】
一実施形態において、化学式（３）のスクシンイミド環にＸが連結される部位は、ＸのＣ末端システインの硫黄原子であってもよい。
【0235】
化学式（３）のＦは、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域であり、Ｆにおいて、前記オキシプロピレン基に連結される部位は、特に限定されるものではない。本発明の一実施形態において、前記オキシプロピレン基に連結されるＦの部位は、Ｎ末端窒素又はＦの内部残基の窒素原子（例えば、リシンのε窒素）であってもよい。本発明の具体的な一実施形態において、Ｆが化学式（３）のオキシプロピレン基に連結される部位は、ＦのＮ末端プロリンであるが、これに限定されるものではない。
【0236】
一具体例として、前記Ｆは、そのＮ末端のプロリンの窒素原子を介して連結されたものであるが、これに限定されるものではない。
【0237】
前記グルカゴン誘導体の種類として、特許文献２及び特許文献３に記載された種類が挙げられ、前記特許文献の明細書の全文が参考資料として本発明に援用される。また、前記グルカゴン誘導体の持続型結合体の作製方法は、特許文献３に記載されており、前記特許文献の明細書の全文が参考資料として本発明に援用されることは言うまでもない。
【0238】
また、前述した結合体は、Ｆが修飾されていないＸより効力の持続性が向上したものであり、このような結合体には、前述した形態だけでなく、生分解性ナノ粒子に封入された形態などが全て含まれる。
【0239】
本明細書において特に断らない限り、本発明による「ペプチド」又はそのペプチドが生体適合性物質に共有結合で連結された「結合体」についての明細書の詳細な説明や請求の範囲の記述は、当該ペプチド又は結合体は言うまでもなく、当該ペプチド又は結合体の塩（例えば、前記ペプチドの薬学的に許容される塩）又はその溶媒和物の形態が全て含まれるカテゴリーにも適用される。よって、明細書に「ペプチド」又は「結合体」とのみ記載されていたとしても、当該記載内容はその特定の塩、その特定の溶媒和物、その特定の塩の特定の溶媒和物にも同様に適用される。これらの塩の形態は、例えば薬学的に許容される任意の塩を用いた形態であってもよい。前記塩の種類は、特に限定されるものではない。もっとも、個体、例えば哺乳類に安全かつ効果的な形態であることが好ましいが、特にこれに限定されるものではない。
【0240】
前記「薬学的に許容される」とは、医薬学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応などを誘発することなく所望の用途に効果的に使用できる物質を意味する。
【0241】
本発明における「薬学的に許容される塩」には、薬学的に許容される無機酸、有機酸又は塩基から誘導された塩が含まれる。好適な酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。好適な塩基から誘導された塩には、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、アンモニウムなどが含まれる。
【0242】
また、本発明における「溶媒和物」とは、本発明によるペプチド、結合体又はその塩が溶媒分子と複合体を形成したものを意味する。
【0243】
また、本発明のペプチドは、その長さに応じてこの分野で周知の方法、例えば自動ペプチド合成機により合成することができ、遺伝子操作技術により産生することができる。
【0244】
具体的には、本発明のペプチドは、標準合成方法、組換え発現システム又は任意の他の当該分野の方法により製造することができる。よって、本発明によるグルカゴン誘導体は、例えば（ａ）ペプチドを固相もしくは液相法で段階的に又はフラグメント組立により合成し、最終ペプチド生成物を分離及び精製する方法、（ｂ）ペプチドをコードする核酸作製物を宿主細胞内で発現させ、発現生成物を宿主細胞培養物から回収する方法、（ｃ）ペプチドをコードする核酸作製物を無細胞試験管内で発現させ、発現生成物を回収する方法、又は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の任意の組み合わせによりペプチドのフラグメントを得て、次にフラグメントを連結してペプチドを得ることにより当該ペプチドを回収する方法をはじめとする多くの方法で合成することができる。
【0245】
本発明による組成物は、グルカゴン誘導体又はその結合体を含むものであってもよく、具体的には、薬理学的有効量のグルカゴン誘導体又はその結合体を含むものであってもよい。また、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。本発明の組成物は、慢性腎臓疾患予防又は治療用途を有するものであり、血圧降下及び／又は腎臓機能回復効果を有するものであるが、これらに限定されるものではない。
【0246】
本発明における「薬学的に許容される」とは、治療効果を発揮する程度の十分な量と副作用を起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康状態、性別、薬物に対する感受性、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合、同時に用いられる薬物などの医学分野における公知の要素により当業者が容易に決定することができる。
【0247】
薬学的に許容される担体は、経口投与の場合は、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いることができ、注射剤の場合は、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与用の場合は、基剤、賦形剤、滑沢剤、保存剤などを用いることができる。本発明の薬学的組成物の剤形は、前述したような薬学的に許容される担体と混合して様々な形態に製造することができる。例えば、経口投与の場合は、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形態に製造することができ、注射剤の場合は、使い捨てアンプル又は複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放性製剤などに剤形化することができる。
【0248】
なお、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシア、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油などが挙げられる。また、充填剤、抗凝集剤、滑沢剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでもよい。
【0249】
また、本発明の組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれかの剤形を有してもよい。
【0250】
さらに、前記結合体は、生理食塩水や有機溶媒のように薬剤に許容される様々な担体（carrier）と混合して用いることができ、安定性や吸収性を向上させるために、グルコース、スクロース、デキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸（ascorbic acid）、グルタチオンなどの抗酸化剤（antioxidants）、キレート剤、低分子タンパク質、他の安定化剤（stabilizers）などを薬剤として用いることができる。
【0251】
本発明の組成物の投与量と回数は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類により決定される。具体的には、本発明の組成物は、前記グルカゴン誘導体又はその結合体を薬学的有効量で含むものであるが、これらに限定されるものではない。
【0252】
前記グルカゴン誘導体又はその結合体を薬学的有効量で含むとは、グルカゴン誘導体又はその結合体により目的とする薬理活性（例えば、慢性腎臓疾患予防又は治療）が得られる程度に含むことを意味し、また、投与される個体に毒性や副作用がないか、僅かなレベルであって、薬学的に許容されるレベルで含むことを意味するが、これらに限定されるものではない。このような薬学的有効量は、投与回数、患者、剤形などを総合的に考慮して決定される。
【0253】
本発明の前記薬学的組成物は、上記成分（有効成分）を０．０１～９９重量対体積％で含有するが、特にこれに限定されるものではない。
【0254】
本発明の組成物の総有効量は、単回投与量（single dose）で患者に投与してもよく、複数回投与量（multiple dose）で長期間投与する分割治療方法（fractionated treatment protocol）により投与してもよい。本発明の組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含有量を変えてもよい。具体的には、本発明の結合体の総用量は、１日体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ～５００ｍｇであることが好ましい。しかし、前記結合体の用量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌、排泄率など様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるので、これらを考慮すると、当該分野における通常の知識を有する者であれば、前記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定することができるであろう。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を奏するものであれば、その剤形、投与経路及び投与方法が特に限定されるものではない。
【0255】
例えば、本発明の組成物は、１週間に１回、２週間に１回、４週間に１回、又は１カ月に１回投与するものであるが、これらに限定されるものではない。
【0256】
本発明による組成物の具体的な他の態様は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（glucagon like peptide 1 receptor agonist）をさらに含むものであるが、これに限定されるものではない。
【0257】
具体的には、本発明の組成物は、グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体アゴニストを含む慢性腎臓疾患予防又は治療用薬学組成物であり、より具体的には、グルカゴン誘導体、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト及び薬学的に許容される賦形剤を含む慢性腎臓疾患予防又は治療用薬学組成物であるが、これらに限定されるものではない。
【0258】
本発明の（ｉ）グルカゴン誘導体及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、ａ）（ｉ）グルカゴン誘導体と、（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体アゴニストが混合された１つの混合物（mixture）で投与されるものであるか、又はｂ）（ｉ）グルカゴン誘導体と、（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体アゴニストが分離された形態で投与されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0259】
例えば、グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体アゴニストが１つの製剤に製剤化されたものであってもよく、個別に製剤化されたものであってもよい。グルカゴン誘導体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニストが分離された形態の場合、グルカゴン誘導体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニストが別個の製剤に製剤化され、同時、個別、順次又は逆順に投与されてもよい。
【0260】
本発明における併用投与とは、単に同時の投与を意味するだけでなく、グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体アゴニストが個体に共に作用し、各物質が本然の機能と同等又はそれ以上のレベルの機能を果たす投与形態を意味するものと理解されるべきである。よって、本発明における「併用」とは、グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体アゴニストの同時、個別、順次又は逆順の投与を意味するものと理解されるべきである。前記投与が順次、逆順又は個別の場合、投与の順序は、特に限定されるものではないが、２次成分投与の間隔は、前記併用の有利な効果を失わないものでなければならない。
【0261】
本発明のグルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体アゴニスト、又はそれを含む組成物は、キットの形態で提供されるものであるが、これに限定されるものではない。本発明における「キット」は、グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体アゴニストを併用投与するために、本発明による組成物を含むものであってもよい。具体的には、本発明によるキットは、１つの製剤に製剤化されたグルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体アゴニストを含むものであってもよく、グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体アゴニストの個別製剤を含むものであってもよく、２つの物質の併用投与に必要な物質をさらに含むものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0262】
なお、前記グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体アゴニストは、免疫グロブリンＦｃ領域が連結された持続型結合体の形態であるが、これに限定されるものではない。
【0263】
ＧＬＰ－１（glucagon-like peptide-1）は、小腸から分泌されるホルモンであり、細胞内へのグルコース取り込みを促進することが知られている。小腸において、グルカゴン前駆体は、グルカゴン、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－２の３つのペプチドに分解される。ここで、ＧＬＰ－１とは、ＧＬＰ－１（１－３７）を意味し、インスリン分泌機能のない形態であるが、ＧＬＰ－１（７－３７）の形態にプロセシングされて活性型ＧＬＰ－１（７－３７）となる。ＧＬＰ－１（７－３７）アミノ酸配列は次の通りである。
ＧＬＰ－１（７－３７）：ＨＡＥＧＴ ＦＴＳＤＶ ＳＳＹＬＥ ＧＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧＲ Ｇ（配列番号６９）
ＧＬＰ－１（７－３７）：ＨＡＥＧＴ ＦＴＳＤＶ ＳＳＹＬＥ ＧＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧＲ Ｇ（配列番号６９）
【0264】
ＧＬＰ－１受容体アゴニストとは、前記ＧＬＰ－１の受容体に作用するアゴニストを意味し、様々な物質、例えば化合物又はペプチドの形態の物質が含まれるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0265】
前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、天然ＧＬＰ－１だけでなく、ＧＬＰ－１受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が当該受容体の天然リガンド（天然ＧＬＰ－１）に比べて０．１％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上である、ＧＬＰ－１受容体に対して有意なレベルの活性を有する物質（例えば、ペプチド）であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0266】
このようなＧＬＰ－１受容体アゴニストのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を測定する方法は、当該技術分野で公知の様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ活性測定により行うことができる。
【0267】
本発明によるＧＬＰ－１受容体アゴニストには、ＧＬＰ－１受容体に対して有意なレベルの活性を有し、かつ天然ＧＬＰ－１と比較してアミノ酸配列に少なくとも１つ差異のあるペプチド、天然ＧＬＰ－１配列を修飾（modification）により改変したペプチド、天然ＧＬＰ－１の模倣体などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0268】
具体的には、本発明において、ＧＬＰ－１受容体アゴニストには、ＧＬＰ－１、エキセンジン－３、エキセンジン－４、それらのアゴニスト（agonist）、誘導体（derivative）、フラグメント（fragment）、変異体（variant）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0269】
本発明における「アゴニスト」とは、「作用薬」又は「作動薬」と同じ意味であり、受容体に結合して実際の生体内で天然リガンドと同様の機能を果たす物質を意味する。
【0270】
本発明における「誘導体」とは、ＧＬＰ－１受容体に対して有意なレベルの活性を有し、かつ天然ＧＬＰ－１の一部の配列が改変されてアミノ酸残基の一部の基が化学的に置換（例えば、alpha-methylation、alpha-hydroxylation）、除去（例えば、deamination）又は修飾（例えば、N-methylation）された形態を意味するが、これらに限定されるものではない。
【0271】
本発明のＧＬＰ－１受容体アゴニストには、Ｎ末端のアミノ基を除去した誘導体（Desamino-histidyl誘導体）、アミノ基をヒドロキシ基に置換した誘導体（beta-hydroxy imidazopropionyl誘導体）、アミノ基を２つのメチル（methyl）残基で修飾した誘導体（Dimethyl-histidyl誘導体）、Ｎ末端のアミノ基をカルボキシ基に置換した誘導体（beta-carboxyimidazopropionyl誘導体）、Ｎ末端のヒスチジン残基のα炭素を除去してイミダゾアセチル（imidazoacetyl）基のみ残し、アミノ基の正電荷（positive charge）を除去した誘導体（Imidazoacetyl誘導体）などが含まれ、他の形態にＮ末端のアミノ基が変異した誘導体も本発明に含まれる。
【0272】
具体例として、本発明において、ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、エキセンジン－４のＮ末端のアミノ基又はアミノ酸残基を化学的に変異させた誘導体であり、より具体的には、エキセンジン－４のＮ末端の１番目のアミノ酸であるヒスチジン残基のα炭素に存在するαアミノ基又はα炭素を置換又は除去したエキセンジン－４誘導体であり、さらに具体的には、Ｎ末端のアミノ基を除去したデスアミノ－ヒスチジル－エキセンジン－４（Desamino-histidylexendin-4, ＤＡ－エキセンジン－４）、ヒドロキシ基又はカルボキシ基に置換したβ－ヒドロキシイミダゾプロピオニル－エキセンジン－４（beta-hydroxy imidazopropionyl-exendin-4, ＨＹ－エキセンジン－４）、β－カルボキシイミダゾプロピオニル－エキセンジン－４（beta-carboxyimidazopropionyl-exendin-4, ＣＸ－エキセンジン－４）、２つのメチル残基で修飾したジメチル－ヒスチジル－エキセンジン－４（Dimethyl-histidyl-exendin-4, ＤＭ－エキセンジン－４）、又はＮ末端のヒスチジン残基のα炭素を除去したイミダゾアセチル－エキセンジン－４（Imidazoacetyl-exendin-4, ＣＡ－エキセンジン－４）であるが、これらに限定されるものではない。
【0273】
本発明のＧＬＰ－１受容体アゴニストの例としては、Ｎ末端のヒスチジン残基がデス－アミノ－ヒスチジル、ジメチル－ヒスチジル、β－ヒドロキシイミダゾプロピオニル、４－イミダゾアセチル及びβ－カルボキシイミダゾプロピオニルからなる群から選択される物質に置換されたＧＬＰ－１受容体アゴニスト誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものでない。
【0274】
本発明における「ＧＬＰ－１フラグメント」とは、ＧＬＰ－１受容体に対して有意なレベルの活性を有し、かつ天然ＧＬＰ－１のＮ末端又はＣ末端に少なくとも１つのアミノ酸が付加又は欠失された形態を意味し、付加されるアミノ酸は天然に存在しないアミノ酸（例えば、Ｄ型アミノ酸）であってもよい。
【0275】
本発明における「ＧＬＰ－１変異体」とは、ＧＬＰ－１受容体に対して有意なレベルの活性を有し、かつ天然ＧＬＰ－１とアミノ酸配列が少なくとも１つ異なるペプチドを意味し、「アナログ」と混用される。
【0276】
具体的には、ＧＬＰ－１変異体は、天然ＧＬＰ－１から一部のアミノ酸が置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）及び修飾（modification）のいずれかの方法又はそれらの組み合わせにより改変されたものであってもよい。
【0277】
上記方法の組み合わせにより作製されるＧＬＰ－１変異体の例として、天然ＧＬＰ－１とアミノ酸配列が少なくとも１つ異なり、Ｎ末端のアミノ酸残基が脱アミノ化（deamination）された、ＧＬＰ－１受容体に対する活性化機能を有するペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0278】
また、天然ＧＬＰ－１のＮ及び／又はＣ末端に少なくとも１つのアミノ酸が付加されたものが全て含まれる。前述したように置換されるか、付加されるアミノ酸としては、ヒトタンパク質において通常観察される２０種のアミノ酸だけでなく、異常又は非天然アミノ酸を用いることができる。異常アミノ酸の市販元には、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐ、Ｇｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。これらのアミノ酸が含まれるペプチドと定型的なペプチド配列は、民間のペプチド合成会社、例えば米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、又は韓国のＡｎｙｇｅｎにおいて合成及び購入することができる。アミノ酸誘導体も同様に入手することができ、一例として４－イミダゾ酢酸（4-imidazoacetic acid）などが挙げられる。
【0279】
また、誘導体又は変異体の作製のためのこのような改変には、Ｌ型もしくはＤ型アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸を用いた改変、並びに／あるいは天然配列の修飾、例えば側鎖官能基の改変、分子内の共有結合、一例として側鎖間の環形成、メチル化、アシル化、ユビキチン化、リン酸化、アミノヘキサン化、ビオチン化などの修飾による改変が全て含まれる。さらに、前記改変には、非天然化合物への置換が全て含まれる。
【0280】
本発明のエキセンジン－３とエキセンジン－４は、ＧＬＰ－１と５３％のアミノ酸配列類似性を示す３９個のアミノ酸からなるＧＬＰ－１受容体アゴニストであり、エキセンジン－３とエキセンジン－４のアミノ酸配列は次の通りである。
【0281】
エキセンジン－３：ＨＳＤＧＴ ＦＴＳＤＬ ＳＫＱＭＥ ＥＥＡＶＲ ＬＦＩＥＷ ＬＫＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳ（配列番号７０）
エキセンジン－４：ＨＧＥＧＴ ＦＴＳＤＬ ＳＫＱＭＥ ＥＥＡＶＲ ＬＦＩＥＷ ＬＫＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳ（配列番号７１）
エキセンジン－４：ＨＧＥＧＴ ＦＴＳＤＬ ＳＫＱＭＥ ＥＥＡＶＲ ＬＦＩＥＷ ＬＫＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳ（配列番号７１）
【0282】
エキセンジンアゴニストとは、エキセンジンの構造に関係なく、エキセンジンの生体内受容体に結合してエキセンジンと同一の生物学的活性を示す物質を意味し、エキセンジン誘導体は、天然エキセンジンと比較して、少なくとも８０％のアミノ酸配列相同性を有し、アミノ酸残基の一部の基が化学的に置換（例えば、alpha-methylation、alpha-hydroxylation）、除去（例えば、deamination）又は修飾（例えば、N-methylation）された形態であるが、これらに限定されるものではない。
【0283】
エキセンジン誘導体には、Ｎ末端のアミノ基を除去した誘導体（Desamino-histidyl誘導体）、アミノ基をヒドロキシ基に置換した誘導体（beta-hydroxy imidazopropionyl誘導体）、アミノ基を２つのメチル（methyl）残基で修飾した誘導体（Dimethyl-histidyl誘導体）、Ｎ末端のアミノ基をカルボキシ基に置換した誘導体（beta-carboxyimidazopropionyl誘導体）、Ｎ末端のヒスチジン残基のα炭素を除去してイミダゾアセチル（imidazoacetyl）基のみ残し、アミノ基の正電荷（positive charge）を除去した誘導体（Imidazoacetyl誘導体）などが含まれ、他の形態にＮ末端のアミノ基が変異した誘導体も本発明に含まれる。
【0284】
具体例として、本発明において、エキセンジン誘導体は、エキセンジン－４のＮ末端のアミノ基又はアミノ酸残基を化学的に変異させた誘導体であり、より具体的には、エキセンジン－４のＮ末端の１番目のアミノ酸であるヒスチジン残基のα炭素に存在するαアミノ基又はα炭素を置換又は除去したエキセンジン－４誘導体であり、さらに具体的には、Ｎ末端のアミノ基を除去したデスアミノ－ヒスチジル－エキセンジン－４（Desamino-histidylexendin-4, ＤＡ－エキセンジン－４）、ヒドロキシ基又はカルボキシ基に置換したβ－ヒドロキシイミダゾプロピオニル－エキセンジン－４（beta-hydroxy imidazopropionyl-exendin-4, ＨＹ－エキセンジン－４）、β－カルボキシイミダゾプロピオニル－エキセンジン－４（beta-carboxyimidazopropionyl-exendin-4, ＣＸ－エキセンジン－４）、２つのメチル残基で修飾したジメチル－ヒスチジル－エキセンジン－４（Dimethyl-histidyl-exendin-4, ＤＭ－エキセンジン－４）、又はＮ末端のヒスチジン残基のα炭素を除去したイミダゾアセチル－エキセンジン－４（Imidazoacetyl-exendin-4, ＣＡ－エキセンジン－４）であるが、これらに限定されるものではない。
【0285】
本発明のエキセンジン誘導体の例としては、エキセンジン－４のＮ末端のアミノ基を除去したエキセンジン－４誘導体、エキセンジン－４のＮ末端のアミノ基をヒドロキシ基に置換したエキセンジン－４誘導体、エキセンジン－４のＮ末端のアミノ基をジメチル基で修飾したエキセンジン－４誘導体、エキセンジン－４の１番目のアミノ酸（ヒスチジン）のα炭素を除去（deletion）したエキセンジン－４誘導体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0286】
エキセンジンフラグメントとは、天然エキセンジンのＮ末端又はＣ末端に少なくとも１つのアミノ酸が付加又は欠失された形態を意味し、付加されるアミノ酸は天然に存在しないアミノ酸（例えば、Ｄ型アミノ酸）であってもよい。
【0287】
エキセンジン変異体とは、天然エキセンジンとアミノ酸配列が少なくとも１つ異なるペプチドを意味し、具体的には、天然エキセンジンの一部のアミノ酸が置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）及び修飾（modification）のいずれかの方法又はそれらの組み合わせにより改変されたものを意味する。
【0288】
前述したアゴニスト、誘導体、フラグメント及び変異体において用いる各作製方法は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。例えば、アミノ酸配列が少なくとも１つ異なり、Ｎ末端のアミノ酸残基が脱アミノ化（deamination）されたインスリン分泌ペプチドが挙げられる。
【0289】
本発明の具体的なＧＬＰ－１受容体アゴニストの例として、［（１Ｈ－Ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｙｌ）－ａｃｅｔｙｌ１］ＧＥＧＴＦＴＳＤＬ ＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲ ＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号７２）（Bachem社）、又はＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶ ＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷＬＶＫＧ（配列番号７３）（Bachem社）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向に記載したものである。本発明のＧＬＰ－１受容体アゴニストについては、特許文献６の明細書に開示されている。
【0290】
本発明において、前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、ＧＬＰ－１受容体アゴニストが免疫グロブリンＦｃ領域に連結された持続型結合体の形態であるが、これに限定されるものではない。具体的には、前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、イミダゾ－アセチルエキセンジン－４（ＣＡエキセンジン－４）がエチレングリコール繰り返し単位を含むリンカーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結されたものであり、より具体的には、配列番号７２のＧＬＰ－１受容体アゴニストのリシン（lysine, Lys）にポリエチレングリコールリンカーの一末端を連結し、前記ポリエチレングリコールリンカーの他の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を連結したＧＬＰ－１受容体アゴニストの持続型結合体であるが、これらに限定されるものではない。
【0291】
本発明において、前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト「エフペグレナチド（efpeglenatide）」であるが、これに限定されるものではない。
【0292】
ここで、「持続型結合体」及びそれに関する「免疫グロブリンＦｃ領域」、「エチレングリコール繰り返し単位を含むリンカー」などについては前述した通りである。
【0293】
本発明の組成物は、次の（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかを含むものであってもよい。
（ｉ）グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体アゴニスト
（ｉｉ）グルカゴン誘導体の持続型結合体及びＧＬＰ－１受容体アゴニスト
（ｉｉｉ）グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体アゴニストの持続型結合体
（ｉｖ）グルカゴン誘導体の持続型結合体及びＧＬＰ－１受容体アゴニストの持続型結合体
（ｉ）グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体アゴニスト
（ｉｉ）グルカゴン誘導体の持続型結合体及びＧＬＰ－１受容体アゴニスト
（ｉｉｉ）グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体アゴニストの持続型結合体
（ｉｖ）グルカゴン誘導体の持続型結合体及びＧＬＰ－１受容体アゴニストの持続型結合体
【0294】
本発明によるグルカゴン誘導体もしくはその結合体、及びＧＬＰ－１受容体アゴニストもしくはその結合体、又はそれを含む組成物は、個体に投与されると、個体の血圧降下効果を発揮するもの、及び／又は腎臓機能を回復させるものであるが、これらに限定されるものではない。具体的には、本発明によるグルカゴン誘導体又はその結合体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト又はその結合体の併用投与により、賦形剤対照群に比べて、血圧降下、アルブミン排泄量減少、タンパク尿減少及び／又は腎臓機能回復の効果を発揮するものである。
【0295】
本発明の前記薬学的組成物は、前記グルカゴン誘導体又はその結合体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト又はその結合体とを０．０１～９９重量対体積％で含有するが、特にこれに限定されるものではない。
【0296】
具体的には、本発明の組成物は、グルカゴン誘導体を０．０１～５ｎｍｏｌ／ｋｇ、０．０５～４ｎｍｏｌ／ｋｇ、０．０５～３．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、又は０．０９～２．９９ｎｍｏｌ／ｋｇ含み、ＧＬＰ－１受容体アゴニストを０．０１～５ｎｍｏｌ／ｋｇ、０．０５～４ｎｍｏｌ／ｋｇ、０．０５～３．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、又は０．０９～２．９９ｎｍｏｌ／ｋｇ含むものであるが、これらに限定されるものではない。また、本発明の組成物は、グルカゴン誘導体とＧＬＰ－１受容体アゴニストを０．０１～５０、０．０２～４０、又は０．０３～３３．２２のモル比で含むものであるが、これらに限定されるものではない。
【0297】
本発明の薬学的組成物は、個体にグルカゴン誘導体又はその結合体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト又はその結合体をそれぞれ０．１～２０ｍｇ、又は０．５～１６ｍｇ投与するものであるが、これらに限定されるものではない。
【0298】
以上の内容は、本発明の他の具体例又は他の態様にも適用されるが、これらに限定されるものではない。
【0299】
本発明を実現する他の態様は、グルカゴン誘導体、その結合体、又はそれを含む組成物を個体に投与するステップを含む慢性腎臓疾患予防又は治療方法である。
【0300】
本発明による慢性腎臓疾患予防又は治療方法は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、その結合体、又はそれを含む組成物を個体に投与するステップをさらに含んでもよい。
【0301】
本発明を実現するさらに他の態様は、グルカゴン誘導体又はその結合体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト又はその結合体を個体に併用投与するステップを含む慢性腎臓疾患予防又は治療方法である。
【0302】
前記方法は、グルカゴン誘導体もしくはその結合体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニストもしくはその結合体とを含む組成物を個体に投与するものであるか、又はグルカゴン誘導体もしくはその結合体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニストもしくはその結合体を別個の製剤で併用投与するものであるが、これらに限定されるものではない。
【0303】
本発明の方法は、（ｉ）グルカゴン誘導体及び（ｉｉ）ＧＬＰ－１受容体アゴニストを１つの製剤として投与するものであるか、又は個別製剤を同時、個別、順次もしくは逆順に投与するものであるが、これらに限定されるものではない。
【0304】
前記グルカゴン誘導体、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、その結合体、組成物、血圧降下、腎臓機能回復、慢性腎臓疾患、予防及び治療については前述した通りである。
【0305】
本発明における前記個体とは、ヒトをはじめとしてマウス、家畜などが含まれる哺乳動物を意味し、慢性腎臓疾患を発症したか、発症するリスクのある個体であるが、これらに限定されるものではない。
【0306】
本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で患者（個体）に所定の物質を導入することを意味し、前記グルカゴン誘導体、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、その結合体、又は組成物の投与経路は、特にこれらに限定されるものではないが、前記グルカゴン誘導体、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、その結合体又は組成物を生体内の標的に送達できるものであれば、一般的なあらゆる経路で投与することができ、例えば腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などが挙げられる。
【0307】
また、前記グルカゴン誘導体、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、その結合体又は組成物は、薬学的分野における通常の方法による患者の体内投与に適した単位投与型の製剤、具体的にはタンパク質医薬品の投与に有用な製剤形態に剤形化し、当該技術分野で通常用いる投与方法を用いて経口、又は皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内もしくは直腸経路が含まれる非経口投与経路で投与することができるが、これらに限定されるものではない。
【0308】
本発明の方法は、前記グルカゴン誘導体、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト又はその結合体を含む組成物を薬学的有効量で投与するステップを含んでもよい。好適な総１日使用量は正しい医学的判断の範囲内で担当医により決定され、１回又は数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては他の製剤が用いられるか否か、具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と共に又は同時に投与される薬物をはじめとする様々な因子や、医薬分野で周知の類似の因子に応じて異なる量であることが好ましい。
【0309】
本発明のグルカゴン誘導体、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、その結合体、又はそれを含む組成物は、１週間に１回、２週間に１回、４週間に１回、又は１カ月に１回投与するものであるが、これらに限定されるものではない。
【0310】
具体的には、グルカゴン誘導体及びＧＬＰ－１受容体アゴニストを投与する場合は、患者の体重１ｋｇ当たり約１～２００μｇ、３～１８０μｇ、又は５～１６０μｇとなるように投与し、２つの物質を併用する場合は、総量が患者の体重１ｋｇ当たり約２～４００μｇ、約６～３６０μｇ、又は１０～３２０μｇとなるように投与するが、これらに限定されるものではない。また、グルカゴン誘導体とＧＬＰ－１受容体アゴニストを併用投与する場合は、０．０１～５０、０．０２～４０、又は０．０３～３３．２２のモル比で投与するが、これらに限定されるものではない。
【0311】
具体的には、グルカゴン誘導体を０．０９～２．９９ｎｍｏｌ／ｋｇ、ＧＬＰ－１受容体アゴニストを０．０９～２．９９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与するか、又はグルカゴン誘導体とＧＬＰ－１受容体アゴニストを０．０１～５０、０．０２～４０、もしくは０．０３～３３．２２のモル比で投与するが、これらに限定されるものではない。
【0312】
本発明を実現するさらに他の態様は、グルカゴン誘導体もしくはその結合体、又はそれを含む組成物の慢性腎臓疾患予防又は治療用途である。
【0313】
本発明を実現するさらに他の態様は、グルカゴン誘導体又はその結合体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト又はその結合体とを含む組成物の慢性腎臓疾患予防又は治療用途である。
【0314】
本発明を実現するさらに他の態様は、グルカゴン誘導体又はその結合体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト又はその結合体の慢性腎臓疾患予防又は治療のための併用用途である。
【0315】
前記グルカゴン誘導体、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、その結合体、組成物、血圧降下、腎臓機能回復、慢性腎臓疾患、予防及び治療については前述した通りである。
【0316】
本発明を実現するさらに他の態様は、グルカゴン誘導体又はその結合体、それを含む組成物の慢性腎臓疾患予防又は治療用途を有する薬剤の製造のための用途である。
【0317】
本発明を実現するさらに他の態様は、グルカゴン誘導体又はその結合体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト又はその結合体とを含む組成物の慢性腎臓疾患予防又は治療用途を有する薬剤の製造のための用途である。
【0318】
前記グルカゴン誘導体、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、その結合体、組成物、血圧降下、腎臓機能回復、慢性腎臓疾患、予防及び治療については前述した通りである。
【0319】
また、本発明のさらに他の態様は、グルカゴン誘導体又はその結合体、それを含む組成物の血圧降下及び／又は腎臓機能回復用途である。
【0320】
本発明を実現するさらに他の態様は、グルカゴン誘導体又はその結合体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト又はその結合体とを含む組成物の血圧降下及び／又は腎臓機能回復用途である。
【0321】
本発明を実現するさらに他の態様は、グルカゴン誘導体又はその結合体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト又はその結合体の血圧降下及び／又は腎臓機能回復のための併用用途である。
【0322】
前記グルカゴン誘導体、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、その結合体、組成物、血圧降下、腎臓機能回復、慢性腎臓疾患、予防及び治療については前述した通りである。
【0323】
本発明を実現するさらに他の態様は、グルカゴン誘導体又はその結合体、それを含む組成物の血圧降下及び／又は腎臓機能回復用途を有する薬剤の製造のための用途である。
【0324】
本発明を実現するさらに他の態様は、グルカゴン誘導体又はその結合体と、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト又はその結合体とを含む組成物の血圧降下及び／又は腎臓機能回復用途を有する薬剤の製造のための用途である。
【0325】
前記グルカゴン誘導体、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、その結合体、組成物、血圧降下、腎臓機能回復、慢性腎臓疾患、予防及び治療については前述した通りである。
【0326】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。
【実施例1】
【0327】
グルカゴン誘導体の作製及び活性測定
本発明者らは、グルカゴン受容体に対する活性により、血圧降下及び腎臓機能回復による慢性腎臓疾患予防又は治療効果が得られるか否かを確認した。
本発明者らは、グルカゴン受容体に対する活性により、血圧降下及び腎臓機能回復による慢性腎臓疾患予防又は治療効果が得られるか否かを確認した。
【0328】
まず、次の表１に示すように、天然グルカゴン及びそれと同等の活性を有するグルカゴン誘導体を作製した。特許文献１、２、３を参照してグルカゴン誘導体を合成し、そのｐＩ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を測定した。
【0329】
【表1】
【0330】
表１の配列において、Ｘで表記したアミノ酸は非天然アミノ酸であるアミノイソブチル酸（Ａｉｂ）を示すものであり、アミノ酸記号の下線は下線及び太字で示す当該アミノ酸対の側鎖間におけるラクタム環の形成を示すものであり、「－」は当該位置にアミノ酸残基がないことを示すものである。また、環形成の有無の列において、「－」は当該配列に環が形成されていないことを示すものである。
【実施例2】
【0331】
グルカゴン誘導体持続型結合体の作製
リンカーとしてポリエチレングリコールを用いて、前記実施例で作製した配列番号３７のグルカゴン誘導体と、免疫グロブリンＦｃ領域を結合させ、グルカゴン誘導体持続型結合体を作製した。
リンカーとしてポリエチレングリコールを用いて、前記実施例で作製した配列番号３７のグルカゴン誘導体と、免疫グロブリンＦｃ領域を結合させ、グルカゴン誘導体持続型結合体を作製した。
【0332】
両末端の水素がそれぞれ３－（３－マレイミドプロピオンアミド）プロピル基及び３－オキソプロピル基（プロピオンアルデヒド基）に置換された分子量１０ｋＤａの線形修飾ポリエチレングリコールであるマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒド（NOF社，日本）を配列番号３７のグルカゴン誘導体に反応させ、そのグルカゴン誘導体ペプチドのシステイン残基をマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドのマレイミド側の末端にペグ化させた。具体的には、配列番号３７のグルカゴン誘導体ペプチドとマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドのモル比を１：１～５とし、タンパク質の濃度を３～１０ｍｇ／ｍｌとして、低温で１～３時間反応させた。ここで、反応は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に２０～６０％イソプロパノールを添加した環境下で行った。反応終了後に、上記反応液をＳＰ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（GE healthcare, 米国）に適用し、システインにモノペグ化されたグルカゴン誘導体を精製した。
【0333】
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、Ｎ末端にＰｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ配列（配列番号５７）のヒンジ領域を有する免疫グロブリンＦｃ領域（４９．８ｋＤａ，配列番号６７の２本の鎖がジスルフィド結合で連結されたホモ二量体）を用いて、特許文献７に記載されている方法で作製した。
【0334】
次に、前述したように精製したモノペグ化グルカゴン誘導体と免疫グロブリンＦｃ領域のモル比を１：２～１０とし、タンパク質の濃度を１０～５０ｍｇ／ｍｌとして、４～８℃で１２～１８時間反応させた。反応は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤として１０～５０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムと１０～２０％イソプロパノールを添加した環境下で行った。反応終了後に、上記反応液をＢｕｔｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ精製カラム（GE healthcare, 米国）とＳｏｕｒｃｅ ＩＳＯ精製カラム（GE healthcare, 米国）に適用し、前記モノペグ化グルカゴン誘導体ペプチドのアルデヒド側のポリエチレングリコール末端が免疫グロブリンＦｃホモ二量体の２本の鎖のうち１本の鎖のＮ末端プロリン窒素に連結されたグルカゴン誘導体ペプチドの持続型結合体を精製した。精製した前記結合体は、分子内においてグルカゴン誘導体、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、二量体の免疫グロブリンＦｃ領域が１：１：１のモル比で共有結合により連結された構造であり、ＰＥＧリンカーは、免疫グロブリンＦｃ領域の２本のポリペプチド鎖のうち１本の鎖のＮ末端プロリン窒素に連結されている。
【0335】
作製後に逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーで分析した純度は９５％以上であった。
【0336】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号６７のアミノ酸配列（２２１個のアミノ酸からなる）を有する２つの単量体が各単量体の３番目のアミノ酸であるシステイン間にジスルフィド結合によりホモ二量体を形成し、前記ホモ二量体の単量体は、それぞれ独立して３５番目と９５番目のシステイン間の内部のジスルフィド結合、及び１４１番目と１９９番目のシステイン間の内部のジスルフィド結合が形成されたものである。
【0337】
ここで、グルカゴン誘導体ペプチドと免疫グロブリンＦｃ領域がＰＥＧを介して連結された結合体を「グルカゴン誘導体の持続型結合体」と命名した。
【実施例3】
【0338】
慢性腎臓疾患ラットモデルにおける腎臓機能改善効果
前記実施例で作製したグルカゴン誘導体の持続型結合体の慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）改善効果を確認するために、高血圧及びＣＫＤ疾患モデルとして知られるｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔ（ＳＨＲ）モデルを用いた。ＳＨＲは、高血圧により腎臓機能異常が発生したモデルであり、ＣＫＤの病因学（etiology）面でヒトのものと極めて類似することが知られている。
前記実施例で作製したグルカゴン誘導体の持続型結合体の慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）改善効果を確認するために、高血圧及びＣＫＤ疾患モデルとして知られるｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔ（ＳＨＲ）モデルを用いた。ＳＨＲは、高血圧により腎臓機能異常が発生したモデルであり、ＣＫＤの病因学（etiology）面でヒトのものと極めて類似することが知られている。
【0339】
まず、血圧上昇により腎臓機能異常が発生することが知られている１６週齢のＳＨＲを賦形剤対照群、配列番号３７のグルカゴン誘導体の持続型結合体（３．９ｎｍｏｌ／ｋｇ，Ｑ３Ｄ，皮下）投与群に分け、６週間の反復投与を行った。陰性対照群としては、正常ラット、賦形剤対照群を用いた。６週間の反復投与中の腎臓機能を評価するために、ｄａｙ ０、ｄａｙ １３、ｄａｙ ２８、及びｄａｙ ４６時点で尿中アルブミン排泄量を測定した。統計処理には１元ＡＮＯＶＡを用いた（＊～＊＊＊ｐ＜０．０５～０．００１ ｖｓ．ＳＨＲ賦形剤対照群）。
【0340】
その結果、グルカゴン誘導体の持続型結合体投与１３日後から尿中アルブミン排泄量がＳＨＲ賦形剤対照群に比べて減少し始め、投薬２８日以降は有意差が生じることが確認された（図１）。
【実施例4】
【0341】
慢性腎臓疾患ラットモデルにおける血圧降下効果
実施例２で作製した配列番号３７のグルカゴン誘導体の持続型結合体の慢性腎臓疾患における血圧降下効果を確認するために、ＣＫＤ疾患モデルとして知られるｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔ（ＳＨＲ）モデルを用いた。ＳＨＲは、週齢に応じて次第に血圧が上昇することが知られているモデルであり、様々な血圧降下治療剤の効能評価に用いられている。
実施例２で作製した配列番号３７のグルカゴン誘導体の持続型結合体の慢性腎臓疾患における血圧降下効果を確認するために、ＣＫＤ疾患モデルとして知られるｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔ（ＳＨＲ）モデルを用いた。ＳＨＲは、週齢に応じて次第に血圧が上昇することが知られているモデルであり、様々な血圧降下治療剤の効能評価に用いられている。
【0342】
まず、高血圧レベルに血圧が上昇した１５週齢のＳＨＲに手術により遠隔測定装置（telemetry）を大動脈に挿入し、その後賦形剤対照群、グルカゴン誘導体の持続型結合体（２ｎｍｏｌ／ｋｇ，Ｑ３Ｄ，皮下）投与群に分け、１週間の反復投与を行った。１週間の反復投与中の収縮期（ＳＢＰ）及び拡張期（ＤＢＰ）血圧の変化は、大動脈に挿入した遠隔測定装置により２時間間隔でモニタリングした。投与した配列番号３７のグルカゴン誘導体の持続型結合体の血圧降下効果を評価するために、投与前２日間の平均血圧に対する投与期間１週間の平均血圧の変化量を算出した。統計処理にはｔ－ｔｅｓｔを用いた（＊ｐ＜０．０５ ｖｓ．ＳＨＲ賦形剤対照群）。
【0343】
その結果、賦形剤対照群においては、投与前に比べて血圧が上昇したのに対して、配列番号３７のグルカゴン誘導体の持続型結合体投与群においては、収縮期、拡張期血圧がどちらも減少することが確認された。特に、収縮期血圧においては、賦形剤対照群に比べて有意差が生じることが確認された（図２）。
【0344】
よって、本発明のグルカゴン誘導体の持続型結合体は、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）における血圧降下にも治療効果を有することが確認された。
【実施例5】
【0345】
ＧＬＰ－１受容体アゴニストとの併用投与による腎臓機能改善効果の確認
本発明のグルカゴン誘導体の慢性腎臓疾患に対する治療効果に基づいて、ＧＬＰ－１受容体アゴニストを本発明のグルカゴン誘導体と併用した際の慢性腎臓疾患の治療効果をさらに確認した。
本発明のグルカゴン誘導体の慢性腎臓疾患に対する治療効果に基づいて、ＧＬＰ－１受容体アゴニストを本発明のグルカゴン誘導体と併用した際の慢性腎臓疾患の治療効果をさらに確認した。
【0346】
実施例５－１：ＧＬＰ－１受容体アゴニストの持続型結合体の作製
両末端にプロピオンアルデヒド基を有する３．４ｋＤａのプロピオン（propion）－ＡＬＤ２ ＰＥＧ（IDB, 韓国）を配列番号７２のＧＬＰ－１受容体アゴニスト（イミダゾ－アセチルエキセンジン－４（ＣＡエキセンジン－４））のリシン（Lysine）と位置特異的に反応させ、その後ＰＥＧとイミダゾ－アセチルエキセンジン－４（ＣＡエキセンジン－４）が１：１で結合された連結体を得るために、前記反応混合物から陽イオン交換カラムを用いてモノペグ化（mono-PEGylated）イミダゾ－アセチルエキセンジン－４（ＣＡエキセンジン－４）を精製した。免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端と特異的にモノペグ化されたイミダゾ－アセチルエキセンジン－４（ＣＡエキセンジン－４）が連結されたイミダゾ－アセチルエキセンジン－４（ＣＡエキセンジン－４）－免疫グロブリンＦｃ領域結合体を作製するために、ｐＨ５．０～８．２の条件で反応させた。カップリング反応後に疎水性カラムと陰イオン交換カラムを用いた２段階の精製方法を行うことにより、最終的に位置特異的に結合されたＧＬＰ－１受容体アゴニスト－免疫グロブリンＦｃ領域結合体を精製した。
両末端にプロピオンアルデヒド基を有する３．４ｋＤａのプロピオン（propion）－ＡＬＤ２ ＰＥＧ（IDB, 韓国）を配列番号７２のＧＬＰ－１受容体アゴニスト（イミダゾ－アセチルエキセンジン－４（ＣＡエキセンジン－４））のリシン（Lysine）と位置特異的に反応させ、その後ＰＥＧとイミダゾ－アセチルエキセンジン－４（ＣＡエキセンジン－４）が１：１で結合された連結体を得るために、前記反応混合物から陽イオン交換カラムを用いてモノペグ化（mono-PEGylated）イミダゾ－アセチルエキセンジン－４（ＣＡエキセンジン－４）を精製した。免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端と特異的にモノペグ化されたイミダゾ－アセチルエキセンジン－４（ＣＡエキセンジン－４）が連結されたイミダゾ－アセチルエキセンジン－４（ＣＡエキセンジン－４）－免疫グロブリンＦｃ領域結合体を作製するために、ｐＨ５．０～８．２の条件で反応させた。カップリング反応後に疎水性カラムと陰イオン交換カラムを用いた２段階の精製方法を行うことにより、最終的に位置特異的に結合されたＧＬＰ－１受容体アゴニスト－免疫グロブリンＦｃ領域結合体を精製した。
【0347】
ここで、配列番号７２のＧＬＰ－１受容体アゴニスト（イミダゾ－アセチルエキセンジン－４（ＣＡエキセンジン－４））と免疫グロブリンＦｃ領域がＰＥＧを介して連結された結合体を「ＧＬＰ－１受容体アゴニストの持続型結合体」又は「ＣＡ－Ｅｘｄ４誘導体の持続型結合体」と命名した。
【0348】
なお、前記ＧＬＰ－１受容体アゴニストの持続型結合体の作製に用いた免疫グロブリンＦｃ領域は、実施例２で用いたＦｃ領域と同一である。
【0349】
実施例５－２：ＧＬＰ－１受容体アゴニストとの併用投与効果の確認
実施例２で作製した配列番号３７のグルカゴン誘導体の持続型結合体と、実施例５－１で作製したＧＬＰ－１受容体アゴニスト（ＣＡ－Ｅｘｄ４誘導体の持続型結合体）の持続型結合体の併用投与による慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）改善効果を確認するために、ＣＫＤ疾患モデルであるｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔ（ＳＨＲ）モデルを用いた。
実施例２で作製した配列番号３７のグルカゴン誘導体の持続型結合体と、実施例５－１で作製したＧＬＰ－１受容体アゴニスト（ＣＡ－Ｅｘｄ４誘導体の持続型結合体）の持続型結合体の併用投与による慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）改善効果を確認するために、ＣＫＤ疾患モデルであるｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔ（ＳＨＲ）モデルを用いた。
【0350】
まず、血圧上昇により腎臓機能異常が発生することが知られている１６週齢のＳＨＲを賦形剤対照群、グルカゴン誘導体の持続型結合体（３．０ｎｍｏｌ／ｋｇ，Ｑ３Ｄ，皮下）投与群、グルカゴン誘導体の持続型結合体（３．０ｎｍｏｌ／ｋｇ，Ｑ３Ｄ，皮下）とＧＬＰ－１受容体アゴニストの持続型結合体（６．９ｎｍｏｌ／ｋｇ，Ｑ３Ｄ，皮下）の併用投与群に分け、１０週間の反復投与を行った。陰性対照群としては、正常ラット、賦形剤対照群を用いた。１０週間の反復投与中の腎臓機能及びＣＫＤの進行程度を評価するために、ｄａｙ ０、ｄａｙ １４、ｄａｙ ２８、ｄａｙ ４２、ｄａｙ ５６、及びｄａｙ ７０時点で尿中ＡＣＲ（albumin to creatinine ratio）を測定した。統計処理には１元ＡＮＯＶＡを用いた（＊～＊＊＊ｐ＜０．０５～０．００１ ｖｓ．ＳＨＲ賦形剤対照群）。
【0351】
その結果、賦形剤対照群においては、ＡＣＲが継続して上昇するのに対して、グルカゴン誘導体の持続型結合体投与群においては、ＡＣＲの上昇が遅延する効果が確認された。また、グルカゴン誘導体の持続型結合体とＧＬＰ－１受容体アゴニストの持続型結合体の併用投与群においては、賦形剤対照群に比べて、有意にＡＣＲが減少することが確認された（図３）。
【0352】
よって、グルカゴン誘導体の持続型結合体による慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）治療効果は、ＧＬＰ－１受容体アゴニストの持続型結合体との併用投与により、さらに改善されることが確認された。
【0353】
これらの実験結果は、全て本発明のグルカゴン誘導体が血圧降下及び腎臓機能回復効果を有し、慢性腎臓疾患の治療に有効な効果を有すると共に、ＧＬＰ－１受容体アゴニストと併用投与することにより、さらなる治療効果を期待できることを示唆するものである。
【0354】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】
【国際調査報告】