特表2024-512957ＣＤ３に結合する多重特異性抗原結合タンパク質とその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-21
(54)【発明の名称】ＣＤ３に結合する多重特異性抗原結合タンパク質とその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240313BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240313BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240313BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240313BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240313BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240313BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240313BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240313BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240313BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240313BHJP
A61K 47/46 20060101ALI20240313BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240313BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20240313BHJP
C12N 1/19 20060101ALN20240313BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240313BHJP
C12N 7/01 20060101ALN20240313BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240313BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K16/46 ZNA
C12N1/21
C12N15/63 Z
C12N1/15
A61P43/00 107
A61P35/00
A61K47/68
A61K39/395 U
A61K39/395 G
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K48/00
A61K47/46
C07K16/28
C12P21/08
C12N1/19
C12N5/10
C12N7/01
C12N15/13
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023558720
(86)(22)【出願日】2022-03-22
(85)【翻訳文提出日】2023-09-22
(86)【国際出願番号】 CN2022082129
(87)【国際公開番号】W WO2022199555
(87)【国際公開日】2022-09-29
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/082341
(32)【優先日】2021-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/089112
(32)【優先日】2021-04-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/127043
(32)【優先日】2021-10-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523363464
【氏名又は名称】広州凌騰生物医薬有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＧＵＡＮＧＺＨＯＵ ＬＩＮＴＯＮＰＨＡＲＭ ＣＯ．，ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(74)【代理人】
【識別番号】100179648
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 咲江
(74)【代理人】
【識別番号】100222885
【弁理士】
【氏名又は名称】早川 康
(74)【代理人】
【識別番号】100140338
【弁理士】
【氏名又は名称】竹内 直樹
(74)【代理人】
【識別番号】100227695
【弁理士】
【氏名又は名称】有川 智章
(74)【代理人】
【識別番号】100170896
【弁理士】
【氏名又は名称】寺薗 健一
(74)【代理人】
【識別番号】100219313
【弁理士】
【氏名又は名称】米口 麻子
(74)【代理人】
【識別番号】100161610
【弁理士】
【氏名又は名称】藤野 香子
(72)【発明者】
【氏名】シン ショウ
(72)【発明者】
【氏名】ソン ジェ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA20
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA92X
4B065AB02
4B065AC14
4B065BA08
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE57
4C076EE59
4C084AA13
4C084NA05
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB221
4C084ZB261
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB01
4C085BB11
4C085BB22
4C085BB31
4C085BB33
4C085BB34
4C085BB35
4C085BB36
4C085BB37
4C085BB41
4C085BB43
4C085CC02
4C085CC03
4C085CC05
4C085CC07
4C085CC31
4C085DD62
4C085DD63
4C085DD88
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本出願は、ＣＤ３に対する結合部分を含む多重特異性抗原結合タンパク質を提供する。本出願はまた、Ｔ細胞活性化および／または腫瘍治療薬剤の製造における多重特異性抗原結合タンパク質の使用方法を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＤ３結合部分を含む多重特異性抗原結合タンパク質であって、前記ＣＤ３結合部分は、重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＨＣＤＲ１は、配列番号４、３７、４５および５３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、
前記ＨＣＤＲ２は、配列番号５、３８、４６および５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、
前記ＨＣＤＲ３は、配列番号６、３９、４７および５５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、および／または、
前記ＣＤ３結合部分は、軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＬＣＤＲ１は、配列番号１、４０、４８および５６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣＤＲ２は、配列番号２、４１、４９および５７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣＤＲ３は、配列番号３、４２、５０および５８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、
前記ＣＤ３結合部分は、Ｔ細胞の活性化を誘導する、多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項2】
前記ＣＤ３結合部分は、重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号４、３７、４５および５３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、
前記ＨＣＤＲ２は、配列番号５、３８、４６および５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、
前記ＨＣＤＲ３は、配列番号６、３９、４７および５５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、および／または、
前記ＣＤ３結合部分は、軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、
前記ＬＣＤＲ１は、配列番号１、４０、４８および５６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣＤＲ２は、配列番号２、４１、４９および５７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣＤＲ３は、配列番号３、４２、５０および５８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項3】
前記重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４、５および６に記載の配列を有する、および／または前記軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１、２および３に記載の配列を有する、前記重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３７、３８および３９に記載の配列を有する、および／または前記軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４０、４１および４２に記載の配列を有する、
前記重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４５、４６および４７に記載の配列を有する、および／または前記軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４８、４９および５０に記載の配列を有する、または、
前記重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号５３、５４および５５に記載の配列を有する、および／または前記軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号５６、５７および５８に記載の配列を有する、請求項１または２に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項4】
前記ＣＤ３結合部分は、重鎖可変領域と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号８、３５、４３および５１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、および／または、
前記ＣＤ３結合部分は、軽鎖可変領域と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号７、３６、４４および５２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項5】
前記ＣＤ３結合部分は、重鎖可変領域のアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号８、３５、４３および５１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、および／または、
前記ＣＤ３結合部分は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号７、３６、４４および５２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項6】
前記ＣＤ３結合部分は、配列番号８の重鎖可変領域、および／または配列番号７の軽鎖可変領域を含む；前記ＣＤ３結合部分は、配列番号３５の重鎖可変領域、および／または配列番号３６の軽鎖可変領域を含む；
前記ＣＤ３結合部分は、配列番号４３の重鎖可変領域、および／または配列番号４４の軽鎖可変領域を含む；または、
前記ＣＤ３結合部分は、配列番号５１の重鎖可変領域、および／または配列番号５２の軽鎖可変領域を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項7】
前記ＣＤ３結合部分は、ヒト化されている、請求項１～６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項8】
前記ヒト化ＣＤ３結合部分は、（ｉ）配列番号２７の重鎖可変領域、および／または配列番号３１の軽鎖可変領域、
（ｉｉ）または配列番号２８の重鎖可変領域、および／または配列番号３１の軽鎖可変領域から選択される重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項9】
前記ヒト化ＣＤ３結合部分は、前記重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、（ｉ）配列番号２７の重鎖可変領域、および／または配列番号３１の軽鎖可変領域、
（ｉｉ）または配列番号２８の重鎖可変領域、および／または配列番号３１の軽鎖可変領域から選択される、請求項８に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項10】
宿主細胞からの組換え発現により産生される、請求項１～９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項11】
前記宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、哺乳動物細胞またはウイルスから選択される、請求項１０に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項12】
前記細菌細胞は、大腸菌である、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項13】
前記真菌細胞は、酵母細胞である、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項14】
前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＢＨＫ、またはＨＥＫ２９３細胞から選択される、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項15】
ハイブリドーマ細胞によって産生される、請求項１～９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項16】
前記ハイブリドーマ細胞は、マウス、ラット、ウサギから選択される、請求項１５に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項17】
前記多重特異性抗原結合タンパク質の形式は、二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、二重特異性ｓｃＦｖ、ＴａｎｄＡｂ、三価結合分子、または四価結合分子から選択される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項18】
ヒト化抗体である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項19】
完全ヒト抗体である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項20】
キメラ抗体である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項21】
モノクローナル抗体である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項22】
ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体由来の定常領域を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項23】
前記抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂを含む、請求項１～２２の１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項24】
少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）結合部分を含む、請求項１～２３の１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項25】
前記ＴＡＡは、ＥＰＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ７、ｂｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅＧＤ３、９－Ｏ－Ａｃｅｔｙｌ－ＧＤ３、ＧＭ２、ｇｌｏｂｏＨ、ｆｕｃｏｓｙｌＧＭ１、ＰｏｌｙＳＡ、ＧＤ２、ＲＯＮ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＥＡＣＡＭ－６、ＰＣＴＡ－１、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＡＬＣＡＭ（ＣＤ１６６）、ＰＥＣＡＭ－１、ＣＤ１５１、ＭＡＧＥ－１、ＴＲＯＰ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＴＧＦＢＲ２、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＩＬ－６Ｒ、ｇｐｌ３０、ＴＮＦＲ２、ＯＳＭＲｐ、Ｐａｔｃｈｅｄ－１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｒｏｂｏｌ、ＬＴｐＲ、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１００、ＣＸＣＲ４、ＳＡＳ、ＢＣＭＡ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎｌ４、ＦＧＦＲ４、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＳＳＸ１、およびＳＳＸ２、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ－１、形質細胞抗原、（膜結合型）ＩｇＥ、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ－α前駆体、ＳＴＲＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ－６；デスモグレイン４、Ｅ－カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９－９マーカー、ＣＡ－１２５マーカーおよびミュラー阻害物質（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアル化Ｔｎ抗原、ＴＡＧ７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原））、エンドシアリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｌ６、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＦ抗原、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２２、Ｉｇα、Ｉｇβ、ｇｐ１００、ＭＴ－ＭＭＰｓ、Ｆ１９－ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＯ－２９およびＥｐｈＡ２を含む群から選択される、請求項２４に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項26】
前記ＴＡＡは、ＨＥＲ２またはＣＤ２０である、請求項２４に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項27】
前記ＨＥＲ２結合部分は、それぞれ配列番号１２、１３および１４に記載の配列を有する重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および／またはそれぞれ配列番号９、１０および１１に記載の配列を有する軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項28】
前記ＨＥＲ２結合部分は、それぞれ配列番号１２、１３および１４に記載の配列を有する重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および／またはそれぞれ配列番号９、１０および１１に記載の配列を有する軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３からなり、前記ＣＤ３結合部分は、Ｔ細胞活性化を誘導する、請求項２７に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項29】
前記ＨＥＲ２結合部分は、配列番号１６の重鎖可変領域、および／または配列番号１５の軽鎖可変領域と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項30】
前記ＨＥＲ２結合部分は、配列番号１６の重鎖可変領域、および／または配列番号１５の軽鎖可変領域を含む、請求項２９に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項31】
請求項１～３０のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項32】
請求項３１に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項33】
請求項３２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項34】
請求項１～３０のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質を製造する方法であって、前記多重特異性抗原結合タンパク質を発現可能な条件下で、請求項３３に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項35】
請求項１～３０のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質、請求項３１に記載の単離された核酸分子、請求項３２に記載のベクター、および／または請求項３３に記載の宿主細胞、および場合により薬学的に許容されるアジュバントを含む医薬組成物。
【請求項36】
請求項１～３０のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質、請求項３１に記載の単離された核酸分子、請求項３２に記載のベクター、請求項３３に記載の宿主細胞の使用、及び／または、Ｔ細胞を活性化する、Ｔ細胞上に発現するＣＤ３を標的とする、および／またはＴ細胞と腫瘍細胞との間の相互作用を促進するための薬物の製造における、および／または請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項37】
請求項１～３０のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質、請求項３１に記載の単離された核酸分子、請求項３２に記載のベクター、請求項３３に記載の細胞の使用、および／または腫瘍を予防、軽減および／または治療するための薬剤の製造における、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項38】
がんを有する被験体を予防、緩和および／または治療する方法であって、請求項１～３０のいずれかに記載の多重特異性抗原結合タンパク質、請求項３１に記載の単離された核酸分子、請求項３２に記載のベクター、請求項３３に記載の細胞、および／または請求項３５に記載の医薬組成物を、必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【請求項39】
請求項３８に記載のがんを有する被験体を予防、緩和および／または治療する方法であって、前記がんは、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺腺がん、肺扁平上皮がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん、消化器がん、食道がん、膵チックがん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がんを含む、膀胱がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、子宮体がん、唾液腺がん、腎がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、泌尿器がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、肛門がん、陰茎がん、頭頸部がんを含む群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
二重特異性抗体は２つの異なる標的を同時に認識でき、より多くの細胞の制御機構を活性化できるため、腫瘍やその他の疾患の治療に大きな可能性を秘めている。Ｔセルエンゲージャー二重特異性抗体は、典型的な二重特異性抗体である。Ｔ細胞表面抗原（ＣＤ３など）と腫瘍細胞表面抗原（ＣＤ１９など）に同時に結合して免疫シナプスを形成することにより、免疫シナプスを形成する可能性がある。腫瘍細胞とＴ細胞の間の距離は二重特異性抗体によって短縮され、その後Ｔ細胞が直接活性化および増殖し、活性化されたＴ細胞は腫瘍細胞を直接殺傷したり、細胞毒素を放出して腫瘍細胞を殺傷したりする能性がある。したがって、二重特異性抗体によるＴ細胞の活性化プロセスには、特異的なＴリンパ球クローンを生成するためのＴ細胞への腫瘍抗原の提示は含まれない。したがって、このプロセスはＭＨＣやＨＬＡによって制限されず、臨床応用が可能である。
【0002】
ＣＤ３（分化クラスター３）は、ほとんどのＴ細胞の表面に発現するタンパク質複合体である。ＭＨＣ－ＴＣＲ結合シグナルを伝達し、Ｔ細胞を活性化できるため、Ｔ細胞エンゲージャー二重特異性抗体にとって理想的な結合部位となる。初代目抗ＣＤ３薬は大きな成功を収めた。ただし、安全性を向上させるために（たとえば、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を回避するために）、Ｔ細胞の活性化および／またはサイトカインの放出の合理制御には改善が必要である。ＣＲＳの発生率の低下は、血液がんにおけるＴ細胞エンゲージャー二重特異性抗体の臨床応用を促進するだけでなく、固形腫瘍への応用でも画期的な進歩をもたらすであろう。
【0003】
したがって、ＣＤ３に対するより有効かつ安全な多重特異性抗体および対応ヒト化抗ＣＤ３抗体の提供が急務となる。
【発明の概要】
【0004】
本出願は、ＣＤ３に対する結合部分を含む多特異的抗原結合タンパク質を提供し、ＣＤ３に対する結合部分は、配列番号８の重鎖可変領域ＶＨからのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域及び／または配列番号７の軽鎖可変領域ＶＨからのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域を含む。ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域を含む。多特異的抗原結合タンパク質は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する結合部分をさらに含み得る。本出願の多特異的抗原結合タンパク質は、腫瘍の予防、緩和及び／又は治療薬剤の製造に使用できる。本出願の多特異的抗原結合蛋白質は、腫瘍細胞に対してより効果的な殺傷効果を示すことができる。本出願の多特異的抗原結合タンパク質は、投与された被験体に対する安全性プロファイルの改善を示し、例えば、Ｔ細胞媒介性サイトカインの放出をより少なく誘導し得る。本出願の多特異的抗原結合タンパク質および／またはＣＤ３に対する結合部分は、ＣＤ３に対して著しく増強された結合親和性を示す。
【0005】
一つの態様では、本出願は、ＣＤ３結合部分を含む多特異的抗原結合タンパク質を提供し、ここで、ＣＤ３結合部分は、重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＨＣＤＲ１は、配列番号４、３７、４５および５３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号５、３８、４６および５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号および６、３９、４７および５５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。および／または、ＣＤ３結合部分は、軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＬＣＤＲ１は、配列番号１、４０、４８および５６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。ＬＣＤＲ２は、配列番号２、４１、４９および５７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する；ＬＣＤＲ３は、配列番号３、４２、５０および５８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤ３結合部分は、Ｔ細胞の活性化を誘導する。
【0006】
いくつかの実施形態において、ＣＤ３結合部分は、重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。ＨＣＤＲ１は、配列番号４、３７、４５および５３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号５、３８、４６および５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号６、３９、４７および５５のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を有する。および／または、ＣＤ３結合部分は、軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。ＬＣＤＲ１は、配列番号１、４０、４８および５６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号２、４１、４９および５７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号３、４２、５０および５８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。
【0007】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４、５および６に示される配列を有し、および／または軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は配列番号１、２および３に示される配列を有する。重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は配列番号３７、３８および３９に示される配列を有し、および／または軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は配列番号４０、４１および４２に示される配列を有する。重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、配列番号４５、４６および４７に示される配列を有し、および／または軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は配列番号４８、４９および５０に示される配列を有する。または、重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、配列番号５３、５４および５５に示される配列を有し、および／または軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は配列番号５６、５７および５８に示される配列を有する。
【0008】
いくつかの実施形態において、ＣＤ３結合部分は、重鎖可変領域と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、配列番号８、３５、４３および５１のいずれかの一つに記載のアミノ酸配列を有する。および／または、ＣＤ３結合部分は、軽鎖可変領域と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号７、３６、４４および５２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。
【0009】
いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号８、３５、４３および５１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。および／または、軽鎖可変領域は、配列番号７、３６、４４、５２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。
【0010】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合部分は、配列番号８の重鎖可変領域、および／または配列番号７の軽鎖可変領域に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＣＤ３結合部分は、配列番号３５の重鎖可変領域および／または配列番号３６の軽鎖可変領域に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＣＤ３結合部分は、配列番号４３の重鎖可変領域および／または配列番号４４の軽鎖可変領域に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。または、ＣＤ３結合部分は、配列番号５１の重鎖可変領域および／または配列番号５２の軽鎖可変領域に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合部分は、配列番号８の重鎖可変領域、および／または配列番号７の軽鎖可変領域を含む。ＣＤ３結合部分は、配列番号３５の重鎖可変領域、および／または配列番号３６の軽鎖可変領域を含む。ＣＤ３結合部分は、配列番号４３の重鎖可変領域、および／または配列番号４４の軽鎖可変領域を含む。または、ＣＤ３結合部分は配列番号５１の重鎖可変領域および／または配列番号５２の軽鎖可変領域を含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、フレームワーク領域Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３、およびＨ－ＦＲ４を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３に対する結合部分は、抗体重鎖定常領域を含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３に対する結合部分は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体に由来する抗体重鎖定常領域を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域は、ＩｇＧ定常領域を含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域は、配列番号１８または配列番号２６を含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、ＶＬは、フレームワーク領域Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３、およびＬ－ＦＲ４を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３に対する結合部分は、抗体軽鎖定常領域を含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３に対する結合部分は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体に由来する抗体軽鎖定常領域を含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、抗体軽鎖定常領域は、Ｉｇк定常領域を含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、抗体軽鎖定常領域は、配列番号１７または配列番号２５を含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３に対する結合部分は、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【0023】
一つの態様では、多重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合部分はヒト化されている。
【0024】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３に対するヒト化結合部分は、配列番号２７の重鎖可変領域及び／または配列番号３１の軽鎖可変領域に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸を含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３に対するヒト化結合部分は、配列番号２８の重鎖可変領域及び／または配列番号３１の軽鎖可変領域に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸を含む。
【0026】
いくつかの実施形態において、ＣＤ３に対するヒト化結合部分は、配列番号２７の重鎖可変領域、および／または配列番号３１の軽鎖可変領域を含む。
【0027】
いくつかの実施形態において、ＣＤ３に対するヒト化結合部分は、配列番号２８の重鎖可変領域、および／または配列番号３１の軽鎖可変領域を含む。
【0028】
いくつかの実施形態において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂを含む。
【0029】
いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体から選択される。
【0030】
いくつかの実施形態において、多特異的抗原結合タンパク質は、宿主細胞の組換え発現によって産生される。
【0031】
いくつかの実施形態において、多特異的抗原結合タンパク質を発現する宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、哺乳動物細胞またはウイルスから選択される。
【0032】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は大腸菌である。
【0033】
いくつかの実施形態において、真菌細胞は酵母細胞である。
【0034】
いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＢＨＫ、またはＨＥＫ２９３細胞から選択される。
【0035】
いくつかの実施形態において、多特異的抗原結合タンパク質は、ハイブリドーマ細胞によって産生される。
【0036】
いくつかの実施形態において、ハイブリドーマ細胞は、マウス、ラット、またはウサギから選択される。
【0037】
いくつかの実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質の形式は、二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、二重特異性ｓｃＦｖ、ＴａｎｄＡｂ、三価結合分子、または四価結合分子から選択される。
【0038】
いくつかの実施形態において、多特異的抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する結合部分を含む。
【0039】
いくつかの実施形態において、多特異的抗原結合タンパク質のＴＡＡは、下記の群から選択される：ＥＰＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ７、βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅＧＤ３、９－０－Ａｃｅｔｙｌ－ＧＤ３、ＧＭ２、ｇｌｏｂｏＨ、ｆｕｃｏｓｙｌＧＭ１、ＰｏｌｙＳＡ、ＧＤ２、ＲＯＮ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＥＡＣＡＭ－６、ＰＣＴＡ－１、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＡＬＣＡＭ（ＣＤ１６６）、ＰＥＣＡＭ－１、ＣＤ１５１、ＭＡＧＥ－１、ＴＲＯＰ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＴＧＦＢＲ２、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＩＬ－６Ｒ、ｇｐｌ３０、ＴＮＦＲ２、ＯＳＭＲｐ、Ｐａｔｃｈｅｄ－１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ．Ｒｏｂｏｌ、ＬＴｐＲ、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１００、ＣＸＣＲ４、ＳＡＳ、ＢＣＭＡ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎｌ４、ＦＧＦＲ４、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＳＳＸ１、およびＳＳＸ２、ＣａｒｂｏａｎｈｙｄｒａｓｅＩＸ（ＭＮ／ＣＡＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ＳｏｎｉｃＨｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ－１、形質細胞抗原、（膜結合型）ＩｇＥ、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ－α前駆体、ＳＴＲＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ－６；デスモグレイン４、Ｅ－カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９－９マーカー、ＣＡ－１２５マーカーおよびミュラー阻害物質（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアル化Ｔｎ抗原、ＴＡＧ７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｌ６、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＦ抗原、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２２、Ｉｇα、Ｉｇβ、ｇｐ１００、ＭＴ－ＭＭＰｓ、Ｆ１９－ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＯ－２９およびＥｐｈＡ２。
【0040】
いくつかの実施形態において、多特異的抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ２に対する結合部分を含む。
【0041】
いくつかの実施形態において、多特異的抗原結合タンパク質のＨＥＲ２に対する結合部分は、それぞれ配列番号１２、１３および１４に記載の配列を有する重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号９、１０および１１に記載の配列を有する軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0042】
いくつかの実施形態において、多特異的抗原結合タンパク質のＨＥＲ２に対する結合部分は、それぞれ配列番号１２、１３および１４に記載の配列を有する重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号９、１０および１１に記載の配列を有する軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。ＣＤ３結合部分は、Ｔ細胞の活性化を誘導する。
【0043】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合タンパク質のＨＥＲ２に対する結合部分は、配列番号１６の重鎖可変領域および／または配列番号１５の軽鎖可変領域に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0044】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合タンパク質のＨＥＲ２に対する結合部分は、配列番号１６の重鎖可変領域、および／または配列番号１５の軽鎖可変領域を含む。
【0045】
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２に対する結合部分は、抗体重鎖定常領域を含む。
【0046】
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２に対する結合部分は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体に由来する抗体重鎖定常領域を含む。
【0047】
いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域は、ＩｇＧ定常領域を含む。
【0048】
いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域は、配列番号１８または配列番号２６を含む。
【0049】
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２に対する結合部分は、抗体軽鎖定常領域を含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２に対する結合部分は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体に由来する抗体軽鎖定常領域を含む。
【0051】
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２抗体軽鎖定常領域は、ＩｇＫ定常領域を含む。
【0052】
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２抗体軽鎖定常領域は、配列番号１７または配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。
【0053】
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２に対する結合部分は、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【0054】
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２に対する抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂを含む。
【0055】
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２に対する抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体から選択される。
【0056】
いくつかの実施形態において、多特異的抗原結合タンパク質は、ＣＤ２０に対する結合部分を含む。
【0057】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２０に対する結合部分の重鎖可変領域ＶＨは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む。
【0058】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２０に対する結合部分の軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む。
【0059】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３に対する結合部分は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含む。第１のポリペプチド鎖は、ＣＤ３に結合する抗体の重鎖可変領域ＶＨを含み、第２のポリペプチド鎖は、ＣＤ３に結合する抗体の軽鎖可変領域ＶＬを含む。
【0060】
いくつかの実施形態では、ＴＡＡに対する結合部分は、第３のポリペプチド鎖および第４のポリペプチド鎖を含む。第３のポリペプチド鎖は、ＴＡＡに結合する抗体の重鎖可変領域ＶＨを含み、第４のポリペプチド鎖は、ＴＡＡに結合する抗体の軽鎖可変領域ＶＬを含む。
【0061】
いくつかの実施形態では、第３のポリペプチド鎖は、ＨＥＲ２に結合する抗体の重鎖可変領域ＶＨを含み、第４のポリペプチド鎖は、ＨＥＲ２に結合する抗体の軽鎖可変領域ＶＬを含む。
【0062】
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２に結合する抗体の重鎖可変領域ＶＨは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＥＲ２に結合する抗体の軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む。または、ＨＥＲ２に結合する抗体の重鎖可変領域ＶＨは、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＥＲ２に結合する抗体の軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む。
【0063】
いくつかの実施形態では、第３のポリペプチド鎖は、ＣＤ２０に結合する抗体の重鎖可変領域ＶＨを含み、第４のポリペプチド鎖は、ＣＤ２０に結合する抗体の軽鎖可変領域ＶＬを含む。
【0064】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２０に結合する抗体の重鎖可変領域ＶＨは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含み、ＣＤ２０に結合する抗体の軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む。
【0065】
別の態様では、本出願は、本出願の多重特異性抗原結合タンパク質をコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を提供する。
【0066】
別の態様では、本出願は、本出願の単離された核酸分子を含むベクターを提供する。
【0067】
別の態様では、本出願は、本出願の単離された核酸分子および／または本出願のベクターを含む細胞を提供する。
【0068】
別の態様では、本出願は、本出願の多重特異性抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下で本出願の細胞を培養することを含む、本出願の多重特異性抗原結合タンパク質を調製する方法を提供する。
【0069】
別の態様では、本出願は、本出願の多特異的抗原結合タンパク質、本出願の単離された核酸分子、本出願のベクター、および／または本出願の細胞、および任意に薬学的に許容されるアジュバントを含む、医薬組成物を提供する。
【0070】
別の態様では、本出願は、腫瘍を予防、緩和および／または治療薬剤の製造における、本出願の多特異的抗原結合タンパク質、本出願の単離された核酸分子、本出願のベクター、本出願の細胞、および／または本出願の医薬組成物の使用方法を提供する。
【0071】
別の態様では、本出願は、腫瘍の予防、緩和および／または治療に使用するための、本出願の多特異性抗原結合タンパク質、本出願の単離された核酸分子、本出願のベクター、本出願の細胞、および／または本出願の医薬組成物を提供する。
【0072】
別の態様では、本出願は、本出願の多特異的抗原結合タンパク質、本出願の単離された核酸分子、本出願のベクター、本出願の細胞、および／または本出願の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、腫瘍を予防、緩和および／または治療する方法を提供する。
【0073】
別の態様において、本出願は、被験体における腫瘍を予防、緩和および／または治療する方法を提供する。ここで、腫瘍は、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺腺がん、扁平上皮肺がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん、胃腸がん、食道がん、膵チックがんを含む、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、子宮体がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、泌尿器がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、肛門がん、陰茎がん、頭頸部がん、またはその他のがんを指す。
【0074】
別の態様では、本出願は、本出願の多特異的抗原結合タンパク質、本出願の単離された核酸分子、本出願のベクター、本出願の細胞、および／または本出願の医薬組成物を投与することを含む、Ｔ細胞を活性化する方法、Ｔ細胞上に発現されるＣＤ３を標的とする方法、および／またはＴ細胞と腫瘍細胞との間の相互作用を促進する方法を提供する。
【0075】
本出願の追加の態様および利点は、本出願の例示的な実施形態のみが示され、説明される以下の詳細な説明から、当業者に容易に明らかになる。理解されるように、本出願は、他の異なる実施形態が可能であり、その幾つかの細部は、全て本開示から逸脱することなく、様々な明白な点で修正が可能である。従って、図面および説明は、本質的に例示的なものとみなされ、制限的なものとはみなされない。
【0076】
関連出願の相互参照
本明細書で言及されているすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ範囲で、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及されているすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ範囲で、参照により本明細書に組み込まれる。
【0077】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求範囲に詳細に記載される。本発明の特徴および利点は、本発明の原理が使用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、および添付の図面（「図」および「図面」と言う）を参照することによって理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0078】
【発明を実施するための形態】
【0079】
本発明の様々な実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、そのような実施形態が例示のためにのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、および置換が当業者に生じ得る。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替が採用され得ることが理解されるべきである。
【0080】
本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないことが指示されない限り、一般に複数形の参照を含む。
【0081】
本出願において、「抗原結合タンパク質」という用語は、一般に、抗原に結合する部分と、任意に、抗原結合タンパク質と抗原との結合を促進するコンフォメーションを抗原結合部分にとらせる足場または骨格部分とを含むタンパク質を指す。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗体断片（例えば、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体、および抗体アナログを挙げることができる。抗原結合タンパク質は、例えば、天然に存在する免疫グロブリンの構造を持ち得る。免疫グロブリン」は四量体分子である。天然に存在する免疫グロブリンでは、各四量体は２対の同一のポリペプチド鎖から構成され、各対は１本の軽鎖（ＬＣ）と１本の重鎖（ＨＣ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００から１１０以上のアミノ酸を含む可変領域を含み得る。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、 または軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、εまたはκλに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義する。天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域で結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と同じ一般構造を示し得る。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖と重鎖の両方がドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含み得る。
【0082】
本出願に使用される「ＣＤＲ」という用語は、一般に、抗原結合タンパク質の相補性決定領域のアミノ酸配列を指す。これらは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分には、３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）がある。ＣＤＲ配列には様々な番号付けシステムがあることは当業者には明らかであろう。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３）、Ｒａｂａｔ（Ｒａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９８７年と１９９１年））。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムは、本開示の抗体中の残基に番号を付けるために使用される。
【0083】
本出願において、本明細書で使用される「抗原結合断片」という用語は、一般に免疫グロブリン分子の一部を指す。抗原結合断片は、１つの軽鎖と、単一の抗原結合部位を有する重鎖の一部を含み得る。抗原結合断片は、免疫グロブリン分子の酵素消化によって得ることができる。例えば、抗原結合断片は、重鎖および軽鎖のそれぞれの１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインを含み得る。可変ドメインは、免疫グロブリン分子のアミノ末端に、相補性決定領域のセットを含むパラトープ（抗原結合部位）を含む場合がある。
【0084】
本出願において、本明細書で使用される「Ｆｖ断片」という用語は、一般に、重鎖および軽鎖の可変領域の全部または一部を指し、重鎖および軽鎖の定常領域は含まれない。例えば、重鎖および軽鎖の可変領域はＣＤＲを含み得る。
【0085】
本出願に使用される「ＳｃＦｖ」という用語は、一般に、単鎖抗体断片を指す。ＳｃＦｖは、抗体の軽鎖および重鎖可変領域が直接またはペプチドリンカーを介して接続された組換え単鎖ポリペプチド分子であり得る。
【0086】
本出願において、用語「Ｆａｂ」は、一般に、ヒンジ領域において少なくとも１つのジスルフィド橋によって結合された重鎖ポリペプチドの２つのＮ末端部分と、２つの完全な軽鎖ポリペプチドとを含む断片を含む抗体断片を指す。例えば、各軽鎖は重鎖の１つのＮ末端部分と複合体化され得る。Ｆａｂはまた、重鎖ポリペプチド（例えば、ＶＨＣＨ１）のＮ末端部分と複合体化した軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬＣＬ）の全部または大部分を含むＦａｂ断片を含み得る。
【0087】
本出願において、用語「Ｆａｂ」は、本明細書で使用される場合、一般にＦ（ａｂ）２断片の還元産物の抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含むＣＨＩドメインのカルボキシ末端にいくつかの付加的な残基を有することにより、Ｆａｂ断片と異なる場合がある。Ｆａｂ’－ＳＨは、本明細書において、一定ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の呼称であり得る。
【0088】
本出願において、用語「Ｆ（ａｂ）２」は、本明細書で使用される場合、一般に、抗原に結合可能であるが、Ｆｃ部分を有しない一価の抗体構造を指す。Ｆ（ａｂ）２は、酵素パパインによって消化され、それぞれ約５０ｋＤａの２つのＦ（ａｂ）断片とＦｃ断片を生じる抗体であり得る。
【0089】
本出願において、用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、本明細書で使用される場合、一般に、２つのＦａｂ断片と、ジスルフィド結合によって結合されたヒンジ領域の一部とを含む抗体断片を指す。Ｆ（ａｂ’）２は、インタクトな抗体のペプシン消化によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は二価の抗原結合活性を有し、抗原を架橋できる可能性がある。
【0090】
本出願明細書において、「完全ヒト抗体」という用語は、一般に、遺伝子改変マウスの使用によるｉｎｖｉｖｏか、スクリーニングと組み合わせた抗体工学的プロセスによって抗原特異性が選択された、完全ヒトアミノ酸配列由来の抗体を指す。
【0091】
本出願において、「モノクローナル抗体」という用語は、一般に、実質的に相同体のある抗体群を指す。すなわち、その抗体群に含まれる各抗体は、微量の天然由来の変異の可能性を除いて同一である。モノクローナル抗体は、複数の異なる免疫細胞から作られるポリクローナル抗体とは対照的に、すべてユニークな親細胞のクローンである同一の細胞によって作られる抗体と理解される。例えば、モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術によって調製することもできるし、組換えＤＮＡ法によって細菌、真核動物、植物細胞で産生することもできる。または、モノクローナル抗体は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４－６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されている技術を用いる。
【0092】
本出願において、「キメラ抗体」という用語は、一般に、各重鎖または軽鎖のアミノ酸配列の一部が、特定の動物種由来の抗体の対応するアミノ酸配列と相同であるか、特定のクラスに属し、鎖の残りの部分が他の動物種の対応する配列と相同である抗体を指す。例えば、軽鎖と重鎖の両方の可変領域は、ある動物種（例えば、マウス、ラットなど）の抗体の可変領域に由来し、定数部分は別の動物種（例えば、ヒト）の抗体配列に相同である。例えば、キメラ抗体を得るために、非ヒトＢ細胞またはハイブリドーマ細胞を用いて可変領域を作製し、これに結合する定常領域はヒト由来とできる。可変領域は調製しやすいという利点があり、その特異性は結合する定数領域の由来に影響されない。同時に、キメラ抗体の定数領域はヒト由来である可能性があるため、定数領域が非ヒト由来である抗体と比較して、キメラ抗体を注射した際に免疫反応が誘導される可能性は低くなると考えられる。
【0093】
本出願において、「ヒト化抗体」とは、一般に、非ヒト種（例えば、マウスやラット）由来の抗体、免疫グロブリン結合タンパク質およびポリペプチドのヒトに対する免疫原性を低下させることにより得られる、元の抗体の抗原結合特性を保持したまま操作された抗体を指す。例えば、ＣＤＲグラフト化（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６））、および「再形成」（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３３７；Ｔｅｍｐｅｓｔら、１９９１ ９：２６６－２７１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ １９９１ ９：２６６－２７１）、「ハイパーキメライゼーション」（Ｑｕｅｅｎら、１９８９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８６：１００２９－１００３３；Ｃｏら、１９９１ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８８：２８６９－２８７３；Ｃｏら、１９９２ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：１１４９－１１５４）、「ベニアリング」（Ｍａｒｋら、「Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｄ ｖｅｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ １８ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」を含むその変形を含む技術的手段を使用できる。上記資料は、Ｍｅｔｃａｌｆ ＢＷ，Ｄａｌｔｏｎ ＢＪ，ｅｄｓ．細細胞接着：分子的定義から治療の可能性まで。ニューヨーク：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９４：２９１－３１２）を参照する。または、非ヒト結合ドメインをヒト化する。ヒンジ領域や定常領域ドメインなどの他の領域も非ヒト由来であれば、これらの領域もヒト化できる。
【0094】
本出願明において、「ＣＤ３」という用語は、一般にＣＤ３を含むＴＣＲ複合体を指す。ＣＤ３は、哺乳類では４本の鎖（すなわちＣＤ３γ、ＣＤ３５および２本のＣＤ３ε鎖）を含むタンパク質複合体で、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子や（ ζ－鎖および η鎖と（ホモまたはヘテロダイマーとして））会合して、Ｔリンパ球の活性化シグナルを生成する。これらのＣＤ３分子の細胞内尾部には、「免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ」、略してＩＴＡＭとして知られる一つの保存されたモチーフを含み、ＴＣＲのシグナル伝達能力に不可欠である。ＣＤ３γ鎖、δ鎖、ε鎖とζ－η鎖は、ＣＤ３－鎖（ζとＣＤ３η鎖はＴＣＲとともにＴ細胞受容体複合体として知られている）とも呼ばれる。
【0095】
本出願において、用語「ＨＥＲ２」は、一般に、ＥｒｂＢ－２、ＮＥＵ、ＨＥＲ－２またはＣＤ３４０を指し、上皮成長因子受容体２（例えば、ヒトＨＥＲ２、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰ０４６２６）、およびその任意の変異体、アイソフォームおよび種の相同体を指す場合がある。ＨＥＲ２は、腫瘍細胞を含む細胞においてネイティブに発現され得る。細胞におけるＨＥＲ２遺伝子またはｃＤＮＡのトランスフェクションによって発現され得る。
【0096】
本出願において、「ＣＤ２０」という用語は、一般に、骨髄由来リンパ球抗原ＣＤ２０を指し、骨髄由来リンパ球表面抗原Ｂ１または白血球表面は抗ＦｏｒｍｅｒＬｅｕ－１６とも呼ばれ、霊長類などの哺乳動物、動体（人など）、非ヒト霊長類およびげっ歯類（マウスおよびラットなど）を含む、任意の脊椎動物由来の天然のＣＤ２０を含み得る。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列のＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号ＰＩ１８３６に表示されている。ＣＤ２０は一種の疎水性膜貫通タンパク質であり、分子量は約３５ｋＤで、先行するＢリンパ球や成熟骨髄由来リンパ球に発現し得る。
【0097】
本出願において、「腫瘍関連抗原」という用語は、一般に、同じ組織型の非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞によって高い頻度または密度で発現され得る分子または複合体を指す。腫瘍関連抗原は、宿主によって通常発現されない抗原であり得、宿主によって通常発現される分子の変異、切断、ミスフォールディング、またはその他の異常な発現であり得、通常発現される分子と同一であっても異常に高いレベルで発現されるものであり得、または異常な状況または環境において発現されるものであり得る。腫瘍関連抗原は、例えば、タンパク質またはタンパク質断片、複合糖質、ガングリオシド、ハプテン、核酸、またはこれらの組み合わせ、または他の生物学的分子である。例えば、腫瘍関連抗原はＨＥＲ２および／またはＣＤ２０を含み得る。
【0098】
本出願において、「活性化」という用語は、一般に、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドとの結合によって誘導される一次応答を意味し、それによってシグナル伝達事象が媒介される。例えば、活性化はＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達を含み得る。
【0099】
本出願において、「Ｔ細胞と腫瘍細胞との相互作用」という用語は、一般に、免疫系（例えば、Ｔ細胞）によって認識される腫瘍細胞に対する負の選択圧をもたらすＴ細胞と腫瘍細胞との反応を意味する。そのため、腫瘍細胞では、抗原プロセシングと提示に重要な分子のダウンレギュレーションやコスティミュレーションによって、Ｔ細胞の認識が低下する可能性がある。
【0100】
本出願において、本明細書で使用する「治療する」という用語は、一般的に、治療される個体または細胞の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指す。治療は、予防のために、または臨床病理学の経過中に実行され得る。望ましい効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の軽減、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、寛解または予後の改善などが含まれ得る。
【0101】
本出願において、本明細書で使用される「対象」という用語は、一般に哺乳動物を指す。例えば、対象は人間であり得る。例えば、対象はヒト以外の哺乳動物であり得る。非ヒト哺乳動物には、家畜、スポーツ動物、およびペットが含まれ得る。
【0102】
本出願において、「多重特異性」という用語は一般に、二重特異性、三重特異性、または多重特異性の抗原結合の特徴を指す。多重特異性抗原結合タンパク質は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または２つ以上の標的ポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合ドメインを含み得る。多重特異性抗原結合タンパク質は、単一の多機能ポリペプチドであり得、または互いに共有結合または非共有結合した２つ以上のポリペプチドの多量体複合体であり得る。「多重特異性抗原結合タンパク質」という用語は、本出願の抗体および／または本出願の抗原結合断片を含み得る。例えば、本出願の抗体および／または抗原結合断片は、タンパク質またはその断片などの１つまたは複数の他の分子実体に機能的に（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合またはその他によって）連結され得る。第２の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性の抗原結合タンパク質を生成する。本出願によれば、「多特異的抗原結合タンパク質」という用語は、二重特異性、三重特異性または多特異性抗体またはその抗原結合断片を含むこともある。
【0103】
本出願において、用語「単離された核酸分子または分子」は、一般に、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログの重合体であって、本来の環境から単離されたもの、または人工的に合成されたものを指す。
【0104】
本出願において、「ベクターまたはベクター」という用語は、一般に、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挿入および発現され得る核酸ビヒクルを指す。ベクターに担持された遺伝物質エレメントは、宿主細胞をベクターで形質転換、形質導入、またはトランスフェクトすることにより、宿主細胞中で発現させることができる。ベクターの具体例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ＰＩ由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体；λファージやＭ１３ファージなどのファージ、動物ウイルスなどが挙げられる。ベクターには、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、レポーター遺伝子など、発現を制御するさまざまなエレメントが含まれる場合がある。さらに、ベクターには複製起点も含まれる場合がある。また、ベクターには、これらの物質だけではなく、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質シェルなど、細胞への侵入を助ける成分が含まれる可能性もある。
【0105】
本出願において、本明細書で使用される「細胞」という用語は、一般に、本開示のベクターまたはベクターを担持するために使用され得るか、または本開示の抗体、抗原結合断片もしくは変異体を発現もしくは産生するために使用され得る細胞を指す。本開示の細胞は宿主細胞であり得る。細胞は、大腸菌や枯草菌などの原核細胞、酵母細胞やアスペルギルス細胞などの真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ細胞やＳｆ９などの昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など、抗体発現に適した他の細胞であり得る。
【0106】
本出願において、本明細書で使用される「発現を可能にする条件」という用語は、一般に、本開示の多特異的抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件を指す。例えば、条件は、インキュベーション時間、温度、培養培地を含み得、細胞型に依存し得、当業者によって容易に決定される。
【0107】
本出願において、「Ｔ細胞エンゲージャー」という用語は、一般に、Ｔ細胞／ＣＤ３複合体の定数成分および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する二特異性抗体または多重特異性抗体を指す。Ｔ細胞活性化の引き金となる通常のＴＣＲ－ＭＨＣ相互作用をバイパスすることで、Ｔ細胞エンゲージャーは２つの利点を示す：１）ポリクローナルＴ細胞応答を誘発できる可能性がある。２）抗原提示のダウンレギュレーションを伴うエスケープ機構の影響を受けない可能性がある。Ｔ細胞エンゲージャーは、Ｍｅｔｈｏｄｓ１５４（２０１９）１０２－１１７を参照する場合がある。
【0108】
本出願において、「約」という用語は、一般に、所定の値±０．５％～±１０％の範囲の変動を指す。例えば、所定の値±０．５％、±１％、±１．５％、±２％、±２．５％、±３％、±３．５％、±４％、±４．５％、±５％、±５．５％、±６％、±６．５％、±７％、±７．５％、±８％、±８．５％、±９％、±９．５％、または±１０％である。
【0109】
ＣＤ３に対する結合部分
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、抗体またはその抗原結合断片を含み得る。本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、ＣＤ３に対して特異的であり得る。例えば、ＣＤ３に対する結合部分は、抗ＣＤ３抗体またはＣＤ３に対する抗原結合断片であり得る。「ＣＤ３に対する結合部分」および「ＣＤ３結合部分」という用語は、本出願において互換的に使用される。
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、抗体またはその抗原結合断片を含み得る。本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、ＣＤ３に対して特異的であり得る。例えば、ＣＤ３に対する結合部分は、抗ＣＤ３抗体またはＣＤ３に対する抗原結合断片であり得る。「ＣＤ３に対する結合部分」および「ＣＤ３結合部分」という用語は、本出願において互換的に使用される。
【0110】
本出願において、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体から選択され得る。
【0111】
本出願において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂを含み得る。
【0112】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、配列番号８の重鎖可変領域ＶＨからのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３領域のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。
【0113】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分はＨＣＤＲ１～３を含み得る。ＨＣＤＲ１は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ２は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ３は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0114】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、配列番号３５の重鎖可変領域ＶＨからのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３領域のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。
【0115】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分はＨＣＤＲ１～３を含み得る。ＨＣＤＲ１は、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ２は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ３は、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0116】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、配列番号４３の重鎖可変領域ＶＨからのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３領域のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。
【0117】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分はＨＣＤＲ１～３を含み得る。ＨＣＤＲ１は、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ２は、配列番号４６に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ３は、配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0118】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、配列番号５１の重鎖可変領域ＶＨからのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３領域のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。
【0119】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分はＨＣＤＲ１～３を含み得る。ＨＣＤＲ１は、配列番号５３に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ２は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ３は、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0120】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、ＶＨを含み得る。例えば、ＣＤ３に対する結合部分のＶＨは、フレームワーク領域Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４を含み得る。
【0121】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分のＶＨは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。本出願において、ＣＤ３に対する結合部分のＶＨは、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含む。本出願において、ＣＤ３に対する結合部分のＶＨは、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含む。本出願において、ＣＤ３に対する結合部分のＶＨは、配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含む。
【0122】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分がヒト化されている。本出願において、ＣＤ３に対する結合部分のＶＨは、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む。本出願において、ＣＤ３に対する結合部分のＶＨは、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む。
【0123】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、抗体重鎖定常領域を含み得る。
【0124】
本出願において、抗体重鎖定常領域は、ＩｇＧ定常領域を含む。
【0125】
本出願において、抗体重鎖定常領域は、配列番号１８または配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0126】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、配列番号７の軽鎖可変領域ＶＬからのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３領域のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。
【0127】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分はＬＣＤＲ１～３を含み得る。ＬＣＤＲ１は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ２は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ３は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0128】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、配列番号３６の軽鎖可変領域ＶＬからのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３領域のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。
【0129】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分はＬＣＤＲ１～３を含み得る。ＬＣＤＲ１は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ２は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ３は、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0130】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、配列番号４４の軽鎖可変領域ＶＬからのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３領域のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。
【0131】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分はＬＣＤＲ１～３を含み得る。ＬＣＤＲ１は、配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ２は、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ３は、配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0132】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、配列番号５２の軽鎖可変領域ＶＬからのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３領域のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。
【0133】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分はＬＣＤＲ１～３を含み得る。ＬＣＤＲ１は、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ２は、配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ３は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0134】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、ＶＬを含み得る。例えば、ＣＤ３に対する結合部分のＶＬは、フレームワーク領域Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３およびＬ－ＦＲ４を含み得る。
【0135】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分のＶＬは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む。本出願において、ＣＤ３に対する結合部分のＶＬは、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む。本出願において、ＣＤ３に対する結合部分のＶＬは、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含む。本出願において、ＣＤ３に対する結合部分のＶＬは、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含む。
【0136】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分がヒト化されている。本出願において、ＣＤ３に対する結合部分のＶＬは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含む。
【0137】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、抗体軽鎖定常領域を含み得る。
【0138】
本出願において、抗体軽鎖定常領域は、ＩｇＫ定常領域を含み得る。
【0139】
本出願において、抗体軽鎖定常領域は、配列番号１７または配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。
【0140】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、ＨＣＤＲ１－３およびＬＣＤＲ１－３を含み得る。ＨＣＤＲ１は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ２は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ３は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ１は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ２は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、ＬＣＤＲ３は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み得る。
【0141】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、ＨＣＤＲ１－３およびＬＣＤＲ１－３を含み得る。ＨＣＤＲ１は、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ２は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ３は、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ１は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ２は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ３は、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0142】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、ＨＣＤＲ１－３およびＬＣＤＲ１－３を含み得る。ＨＣＤＲ１は、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ２は、配列番号４６に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ３は、配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ１は、配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ２は、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ３は、配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0143】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、ＨＣＤＲ１－３およびＬＣＤＲ１－３を含み得る。ＨＣＤＲ１は、配列番号５３に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ２は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ３は、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ１は、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ２は、配列番号５７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、ＬＣＤＲ３は、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を含み得る。
【0144】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、ＶＨおよびＶＬを含み得る。ＶＨは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み得る。そして、ＶＬは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＶＨは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、ＶＬは、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含み得る。ＶＨは、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、ＶＬは、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含み得る。ＶＨは、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、ＶＬは、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含み得る。
【0145】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、ヒト化ＶＨおよびヒト化ＶＬを含み得る。ＶＨは、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、ＶＬは、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含み得る。ＶＨは、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、ＶＬは、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含み得る。
【0146】
本出願において、多重特異性抗原結合タンパク質は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体に由来する定常領域を含み得る。
【0147】
参照抗体
本開示において、ＣＤ３に対する結合部分は、ＣＤ３への結合に関して参照抗体と競合し得る。
本開示において、ＣＤ３に対する結合部分は、ＣＤ３への結合に関して参照抗体と競合し得る。
【0148】
場合によっては、参照抗体は、配列番号８の重鎖可変領域ＶＨからの少なくとも１つのＨＣＤＲ領域、配列番号７の軽鎖可変領域ＶＬからの少なくとも１つのＬＣＤＲ領域を含み得る。場合によっては、参照抗体は、配列番号３５の重鎖可変領域ＶＨからの少なくとも１つのＨＣＤＲ領域、および配列番号３６の軽鎖可変領域ＶＬからの少なくとも１つのＬＣＤＲ領域を含み得る。場合によっては、参照抗体は、配列番号４３の重鎖可変領域ＶＨからの少なくとも１つのＨＣＤＲ領域、および配列番号４４の軽鎖可変領域ＶＬからの少なくとも１つのＬＣＤＲ領域を含み得る。場合によっては、参照抗体は、配列番号５１の重鎖可変領域ＶＨからの少なくとも１つのＨＣＤＲ領域、および配列番号５２の軽鎖可変領域ＶＬからの少なくとも１つのＬＣＤＲ領域を含み得る。
【0149】
本開示において、参照抗体はＨＣＤＲ１～３を含み得る。ＨＣＤＲ１は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ２は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ３は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含み得る。場合によっては、参照抗体はＬＣＤＲ１～３を含み得る。ＬＣＤＲ１は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ２は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ３は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0150】
本開示において、参照抗体はＨＣＤＲ１～３を含み得る。ＨＣＤＲ１は、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ２は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ３は、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含み得る。場合によっては、参照抗体はＬＣＤＲ１～３を含み得る。ＬＣＤＲ１は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ２は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ３は、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0151】
本開示において、参照抗体はＨＣＤＲ１～３を含み得る。ＨＣＤＲ１は、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ２は、配列番号４６に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ３は、配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含み得る。場合によっては、参照抗体はＬＣＤＲ１～３を含み得る。ＬＣＤＲ１は、配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ２は、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ３は、配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0152】
本開示において、参照抗体はＨＣＤＲ１～３を含み得る。ＨＣＤＲ１は、配列番号５３に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ２は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ３は、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含み得る。場合によっては、参照抗体はＬＣＤＲ１～３を含み得る。ＬＣＤＲ１は、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ２は、配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ３は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0153】
本開示において、参照抗体は、ＶＨおよびＶＬを含み得る。ＶＨは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み得る。そして、ＶＬは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＶＨは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含み得る。ＶＬは、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含み得る。ＶＨは、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含み得る。Ｌは、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含み得る。ＶＨは、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含み得る。ＶＬは、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含み得る。
【0154】
本開示において、参照抗体は、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含み得る。重鎖定常領域は、配列番号１８または配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含み得、軽鎖定常領域は、配列番号１７または配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0155】
ＣＤ３に対する結合部分には、それと実質的に同じ機能／特性を有する相同体またはその変異体も含まれ得る。場合によっては、相同体または変異体は、抗原結合タンパク質とは少なくとも１つのアミノ酸が異なるポリペプチドであり得る。例えば、相同体または変異体は、抗原結合タンパク質とは異なるポリペプチドで、１－５０、１－４０、１－３０、１－２０、１－１５、１－１４、１－１３、１－１２、１－１１、１－１０、１－９、１－８、１－７、１－６、１－５、１－４、１－３、または１－２のアミノ酸など、１個以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換によって異なる場合がある。
【0156】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する結合部分
本出願において、多重特異性抗原結合タンパク質は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する結合部分を含み得る。
本出願において、多重特異性抗原結合タンパク質は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する結合部分を含み得る。
【0157】
本出願において、ＴＡＡは下記の対象群から選択される：ＥＰＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ７、βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅＧＤ３、９－Ｏ－Ａｃｅｔｙｌ－ＧＤ３、ＧＭ２、ｇｌｏｂｏＨ、ｆｕｃｏｓｙｌＧＭ１、ＰｏｌｙＳＡ、ＧＤ２、ＲＯＮ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＥＡＣＡＭ－６、ＰＣＴＡ－１、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＡＬＣＡＭ（ＣＤ１６６）、ＰＥＣＡＭ－１、ＣＤ１５１、ＭＡＧＥ－１、ＴＲＯＰ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＴＧＦＢＲ２、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＩＬ－６Ｒ、ｇｐ１３０、ＴＮＦＲ２、ＯＳＭＲｐ、Ｐａｔｃｈｅｄ－１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ．Ｒｏｂｏｌ、ＬＴｐＲ、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１００、ＣＸＣＲ４、ＳＡＳ、ＢＣＭＡ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎｌ４、ＦＧＦＲ４、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＳＳＸ１、およびＳＳＸ２、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ－１、形質細胞抗原、（膜結合型）ＩｇＥ、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦα前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソセリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ－６；デスモグレイン４、Ｅ－カドヘリン新エピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９－９マーカー、ＣＡ－１２５マーカー、ミュラー抑制物質（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアリル化Ｔｎ抗原、ＴＡＧ７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｌ６、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＦ抗原、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２２、Ｉｇα、Ｉｇβ、ｇｐ１００、ＭＴ－ＭＭＰｓ、ＦＩ９抗原、ＣＯ－２９、ＥｐｈＡ２。
【0158】
本出願において、多特異的抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ２に対する結合部分を含み得る。
【0159】
例えば、ＨＥＲ２に対する結合部分は、抗ＨＥＲ２抗体またはＨＥＲ２に対する抗原結合断片であり得る。
【0160】
本出願において、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体から選択され得る。
【0161】
本出願において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂを含み得る。
【0162】
本出願において、ＨＥＲ２に対する結合部分は、配列番号１６または配列番号２０の重鎖可変領域ＶＨからのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３領域のいずれかに記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0163】
本出願において、ＨＥＲ２に対する結合部分は、ＨＣＤＲ１－３を含み得る。ＨＣＤＲ１は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ２は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ３は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0164】
本出願において、ＨＥＲ２に対する結合部分は、ＶＨを含み得る。例えば、ＨＥＲ２に対する結合部分のＶＨは、フレームワーク領域Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３およびＨ－ＦＲ４を含み得る。
【0165】
本出願において、ＨＥＲ２に対する結合部分のＶＨは、配列番号１６または配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0166】
本出願において、ＨＥＲ２に対する結合部分は、抗体重鎖定数領域を含み得る。
【0167】
本出願において、抗体重鎖定常領域は、ＩｇＧ定常領域を含む。
【0168】
本出願において、抗体重鎖定常領域は、配列番号１８または配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0169】
本出願において、ＨＥＲ２に対する結合部分は、配列番号１５または配列番号１９の軽鎖可変領域ＶＬからのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３領域のいずれかに記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0170】
本出願において、ＨＥＲ２に対する結合部分は、ＬＣＤＲ１－３を含み得る。ＬＣＤＲ１は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ２は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ３は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0171】
本出願において、ＨＥＲ２に対する結合部分は、ＶＬを含み得る。例えば、ＨＥＲ２に対する結合部分のＶＬは、フレームワーク領域Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３およびＬ－ＦＲ４を含み得る。
【0172】
本出願において、ＨＥＲ２に対する結合部分は、抗体軽鎖定数領域を含み得る。
【0173】
本出願において、抗体軽鎖定数領域は、ｌｇｋ定数領域を含み得る。
【0174】
本出願において、抗体軽鎖定常領域は、配列番号１７または配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。
【0175】
本出願において、ＨＥＲ２に対する結合部分は、ＨＣＤＲ１－３およびＬＣＤＲ１－３を含み得る。ＨＣＤＲ１は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ２は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＤＲ３は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ１は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ２は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＬＣＤＲ３は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0176】
本出願において、ＨＥＲ２に対する結合部分は、ＶＨとＶＬを含み得る。ＶＨは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含み得、ＶＬは配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0177】
本出願において、ＨＥＲ２に対する結合部分は、ＶＨとＶＬを含み得る。ＶＨは、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含み得、ＶＬは配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0178】
本出願において、多特異的抗原結合タンパク質は、ＣＤ２０に対する結合部分を含み得る。
【0179】
例えば、ＣＤ２０に対する結合部分は、抗ＣＤ２０抗体またはＣＤ２０に対する抗原結合断片であり得る。
【0180】
本出願において、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体から選択され得る。
【0181】
本出願において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂを含み得る。
【0182】
本出願において、ＣＤ２０に対する結合部分は、配列番号２４の重鎖可変領域ＶＨからのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３領域のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。
【0183】
本出願において、ＣＤ２０に対する結合部分のＶＨは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む。
【0184】
本出願において、ＣＤ２０に対する結合部分は、抗体重鎖定数領域を含み得る。
【0185】
本出願において、抗体重鎖定常領域は、ＩｇＧ定常領域を含む。
【0186】
本出願において、抗体重鎖定常領域は、配列番号１８または配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0187】
本出願において、ＣＤ２０に対する結合部分は、配列番号２３の軽鎖可変領域ＶＬからのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３領域のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。
【0188】
本出願において、ＣＤ２０に対する結合部分は、抗体軽鎖定数領域を含み得る。
【0189】
本出願において、抗体軽鎖定数領域は、ｌｇＫ定数領域を含み得る。
【0190】
本出願において、抗体軽鎖定常領域は、配列番号１７または配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。
【0191】
本出願において、ＣＤ２０に対する結合部分は、ＶＨとＶＬを含み得る。ＶＨは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含み得、ＶＬは、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含み得る。
【0192】
多特異的抗原結合タンパク質
本出願において、多特異的抗原結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり得る。例えば、多特異的抗原結合タンパク質は、インタクトな抗体（例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および／または完全ヒト抗体）であり得る。例えば、多特異的抗原結合タンパク質はＩｇＧ抗体であり得る。例えば、多特異的抗原結合タンパク質は、その抗原結合断片であり得、例えば、多特異的抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂを含み得る。例えば、多特異的抗原結合タンパク質はＦ（ａｂ’）２であり得る。
本出願において、多特異的抗原結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり得る。例えば、多特異的抗原結合タンパク質は、インタクトな抗体（例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および／または完全ヒト抗体）であり得る。例えば、多特異的抗原結合タンパク質はＩｇＧ抗体であり得る。例えば、多特異的抗原結合タンパク質は、その抗原結合断片であり得、例えば、多特異的抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖおよび／またはｄＡｂを含み得る。例えば、多特異的抗原結合タンパク質はＦ（ａｂ’）２であり得る。
【0193】
本出願において、ＣＤ３に対する結合部分は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含み得る。第１のポリペプチド鎖は、ＣＤ３に結合する抗体の重鎖可変領域ＶＨを含み得、第２のポリペプチド鎖は、ＣＤ３に結合する抗体の軽鎖可変領域ＶＬを含み得る。
【0194】
本出願において、ＣＤ３に結合する抗体の重鎖可変領域ＶＨは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＣＤ３に結合する抗体の軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【0195】
本出願において、第１のポリペプチド鎖は、ＣＤ３に結合する抗体の軽鎖を含み得る。また、本出願において、第２のポリペプチド鎖は、ＣＤ３に結合する抗体の重鎖を含み得る。
【0196】
本出願において、第１のポリペプチド鎖は、ＣＤ３に結合する抗体のＶＬおよび軽鎖定常領域を含み得る。また、本出願において、第２のポリペプチド鎖は、ＣＤ３に結合する抗体のＶＨ、重鎖定常領域のＣＨＩ、およびヒンジを含み得る。
【0197】
例えば、ＣＤ３に結合する抗体は、本出願のＣＤ３抗体を含み得る。
【0198】
本出願において、軽鎖定数領域はＩｇＧ由来であり得る。例えば、ＩｇＧ２由来、またはマウスＩｇＧ２由来であり得る（例えば、ＩｇＧ２ａ由来であり得る）。
【0199】
本出願において、重鎖定常領域（例えば、ＣＨＩ）は、ＩｇＧに由来であり得る。例えば、ＩｇＧ２由来、またはラットＩｇＧ２由来であり得る（例えば、ＩｇＧ２ｂ由来であり得る）。本出願において、ヒンジはＩｇＧ由来であり得る。例えば、ＩｇＧ２由来、またはラットＩｇＧ２由来であり得る（例えば、ＩｇＧ２ｂ由来であり得る）。
【0200】
本出願において、第２のポリペプチド鎖は、ヒンジのＣ末端にリンカーを含み得る。例えば、リンカーは可撓性リンカーであり得る。例えば、リンカーはＧＧＧＧＳである。
【0201】
本出願において、第２のポリペプチド鎖は、そのＣ末端にタグを含み得る。例えば、タグは、タンパク質（例えば、第２のポリペプチド鎖、および／またはＣＤ３に対する結合部分）の単離および／または精製に利用可能な任意のタグであり得る。例えば、タグはＨｉｓタグであり得る。
【0202】
本出願において、ＴＡＡに対する結合部分は、第３のポリペプチド鎖および第４のポリペプチド鎖を含み得、第３のポリペプチド鎖は、ＴＡＡに結合する抗体の重鎖可変領域ＶＨを構成する場合があり、第４のポリペプチド鎖は、ＴＡＡに結合する抗体の軽鎖可変領域ＶＬを構成する場合がある。
【0203】
本出願において、第３のポリペプチド鎖は、ＨＥＲ２に結合する抗体の重鎖可変領域ＶＨを構成し、第４のポリペプチド鎖は、ＨＥＲ２に結合する抗体の軽鎖可変領域ＶＬを含み得る。
【0204】
本出願において、ＨＥＲ２に結合する抗体の重鎖可変領域ＶＨは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含み得、ＨＥＲ２に結合する抗体の軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む場合がある。または、ＨＥＲ２に結合する抗体の重鎖可変領域ＶＨは、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含み得、ＨＥＲ２に結合する抗体の軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む場合がある。
【0205】
本出願において、第３のポリペプチド鎖は、ＣＤ２０に結合する抗体の重鎖可変領域ＶＨを構成し、第４のポリペプチド鎖は、ＣＤ２０に結合する抗体の軽鎖可変領域ＶＬを含み得る。
【0206】
本出願において、ＣＤ２０に結合する抗体の重鎖可変領域ＶＨは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含み得、ＣＤ２０に結合する抗体の軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む場合がある。
【0207】
本出願において、第３のポリペプチド鎖は、ＨＥＲ２に結合する抗体の軽鎖を含み得る。また、本出願において、第４のポリペプチド鎖は、ＨＥＲ２に結合する抗体の重鎖を含み得る。
【0208】
または、本出願において、第３のポリペプチド鎖は、ＨＥＲ２に結合する抗体のＶＬおよび軽鎖定常領域を含み得る。そして、本出願において、第４のポリペプチド鎖は、ＨＥＲ２に結合する抗体のＶＨ、重鎖定常領域のＣＨＩ、及びヒンジを含み得る。
【0209】
例えば、ＨＥＲ２に結合する抗体は、本出願のＨＥＲ２抗体を含み得る。
【0210】
本出願において、第３のポリペプチド鎖は、ＣＤ２０に結合する抗体の軽鎖を含み得る。また、本出願において、第４のポリペプチド鎖は、ＣＤ２０に結合する抗体の重鎖を含み得る。
【0211】
または、本出願において、第３のポリペプチド鎖は、ＣＤ２０に結合する抗体のＶＬおよび軽鎖定常領域を含み得る。そして、本出願において、第４のポリペプチド鎖は、ＣＤ２０に結合する抗体のＶＨ、重鎖定常領域のＣＨＩ、及びヒンジを含み得る。
【0212】
例えば、ＣＤ２０に結合する抗体は、本出願のＣＤ２０抗体を含み得る。
【0213】
本出願において、軽鎖定数領域はＩｇＧ由来であり得る。例えば、ＩｇＧ２由来、またはマウスＩｇＧ２由来であり得る（例えば、ＩｇＧ２ａ由来であり得る）。
【0214】
本出願において、重鎖定常領域（例えば、ＣＨＩ）は、ＩｇＧに由来であり得る。例えば、ＩｇＧ２由来、またはマウスＩｇＧ２由来であり得る（例えば、ＩｇＧ２ａ由来であり得る）。本出願において、ヒンジはＩｇＧ由来であり得る。例えば、ＩｇＧ２由来、またはマウスＩｇＧ２由来であり得る（例えば、ＩｇＧ２ａ由来であり得る）。
【0215】
本出願において、第４のポリペプチド鎖は、ヒンジのＣ末端にリンカーを含み得る。例えば、リンカーは可撓性リンカーであり得る。例えば、リンカーはＧＧＧＧＳである。
【0216】
本出願において、第４のポリペプチド鎖は、そのＣ末端にタグを含み得る。例えば、タグは、タンパク質（例えば、第４ポリペプチド鎖、および／またはＨＥＲ２もしくはＣＤ２０に対する結合部分）の単離および／または精製に利用可能な任意のタグであり得る。例えば、タグはｓｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩであり得る。
【0217】
本出願において、多特異的抗原結合タンパク質は、１つの第１のポリペプチド鎖、１つの第２のポリペプチド鎖、１つの第３のポリペプチド鎖および１つの第４のポリペプチド鎖を含み得る。多特異的抗原結合タンパク質において、第４のポリペプチド鎖は、第３のポリペプチド鎖に対応するものであり得、第３のポリペプチド鎖および第４のポリペプチド鎖は、同一のＴＡＡに結合可能であり得る。
【0218】
本出願において、多特異的抗原結合タンパク質は、宿主細胞の組換え発現により産生され得る。
【0219】
本出願において、多特異的抗原結合タンパク質を産生する宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、哺乳動物細胞またはウイルスであり得る。
【0220】
本出願において、細菌細胞は大腸菌であり得る。
【0221】
本出願において、真菌細胞は酵母細胞であり得る。
【0222】
本出願において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＢＨＫ、またはＨＥＫ２９３細胞であり得る。
【0223】
本出願において、多特異的抗原結合タンパク質はハイブリドーマ細胞により産生され得る。
【0224】
本出願において、ハイブリドーマ細胞は、マウス、ラットまたはウサギ由来であり得る。
【0225】
本出願において、多特異性抗原結合タンパク質の形式は、二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、二重特異性ｓｃＦｖ、ＴａｎｄＡｂ、三価結合分子、または四価結合分子であり得る。
【0226】
本出願において、多重特異性抗原結合タンパク質は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体に由来する定常領域を含み得る。
【0227】
本出願において、タンパク質はまた、タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。例えば、相同体または変異体は、タンパク質と８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上）の配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【0228】
本出願で同定されるポリペプチド配列の文脈で使用される「パーセント（％）配列同一性」という用語は、一般に、「配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後、第２の参照ポリペプチド配列またはその一部のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である、クエリ配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージ」を指し得る。必要に応じて、配列同一性の最大パーセントを達成し、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない。パーセントアミノ酸／ヌクレオチド配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＮＥＥＤＬＥまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の技術の範囲内である様々な方法で達成できる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定できる。同一性パーセントは、定義されたポリペプチド／ポリヌクレオチド配列全体の長さにわたって測定され得、またはより短い長さにわたって、例えば、より大きな定義されたポリペプチド／ポリヌクレオチド配列から取られた断片の長さにわたって測定され得る。本明細書、表、図または配列表に示される配列によってサポートされる任意の断片長は、同一性パーセントが測定され得る長さを記述するために使用され得ることが理解される。
【0229】
１～１６のアミノ酸配列（および／またはその任意の１つ以上の断片および／または誘導体）のいずれも、当業者の所望に応じて他のアミノ酸で置換することもできる。例えば、当業者は、以下の表１に示すように、特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置き換えることによって保存的置換を行うことができる。選択される特定のアミノ酸置換は、選択された部位の位置に依存する可能性がある。このような保存的アミノ酸置換は、その位置のアミノ酸残基のサイズ、極性、電荷、疎水性または親水性にほとんどまたは全く影響がないように、天然アミノ酸残基を非天然残基で置換することを伴う場合がある。
【0230】
【表1】
【0231】
核酸、ベクター、細胞
別の態様では、本出願は、本出願の多重特異性抗原結合タンパク質をコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を提供する。
別の態様では、本出願は、本出願の多重特異性抗原結合タンパク質をコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を提供する。
【0232】
別の態様では、本出願は、本出願の単離された核酸分子を含み得るベクターを提供する。
【0233】
別の態様では、本出願は、本出願の単離された核酸分子および／または本出願のベクターを含み得る細胞を提供する。
【0234】
別の態様では、本出願は、本出願の多重特異性抗原結合タンパク質を調製する方法を提供し、この方法は、本出願の多重特異性抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下で本出願の細胞を培養することを含み得る。
【0235】
単離された核酸は、それぞれが抗原結合タンパク質（例えば、ＣＤ３に対する結合部分、および／またはＴＡＡに対する結合部分）をコードする１つまたは複数の核酸分子を含み得る。例えば、単離された核酸は、少なくとも２つの核酸分子を含み得る。一方は抗体重鎖またはその断片をコードし、もう一方は抗体軽鎖またはその断片をコードする。
【0236】
単離された核酸または複数の単離された核酸は、当技術分野で周知の組換え技術を使用して合成され得る。例えば、単離された核酸または複数の単離された核酸は、自動ＤＮＡ合成装置を用いて合成され得る。標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇによって記載されている技術が含まれる。研究室マニュアル；コールドスプリングハーバー研究所出版局：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、（１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ．Ｊ．Ｓｉ１ｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、およびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ著、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ」、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（１９８４）、およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ分子生物学のプロトコル、出版物。Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ、およびＷｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）による。簡単に言うと、対象の核酸は、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡから調製することができ、これらはすべて細胞から直接抽出することもできるし、ＰＣＲおよびＲＴ－ＰＣＲを含むがこれらに限定されない様々な増幅プロセスによって組換え生成することもできる。
【0237】
核酸の直接化学合成では、通常、成長するヌクレオチドポリマー鎖の末端５’ヒドロキシル基への３’ブロックおよび５’ブロックのヌクレオチドモノマーの連続的な付加が含まれ、各付加は末端５の求核攻撃によって影響を受ける可能性がある。追加されたモノマーの３’位にある成長鎖のヒドロキシル基。典型的には、ホスホトリエステル、ホスホラミダイトなどのリン誘導体である。例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｉら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．５２１：７１９（１９８０）；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓらの米国特許第４，５００，７０７号明細書；そしてＳｏｕｔｈｅｒｎらの米国特許第５，４３６，３２７号明細書および第５，７００，６３７号明細書である。
【0238】
ベクターは、任意の直鎖状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター等であり得る。ウイルスベクターの非限定的な例には、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスが含まれ得る。本出願において、ベクターは発現ベクター、例えばプラスミドであり得る。
【0239】
発現ベクターは、特定の種類の宿主細胞での使用には適しているが、他の種類の宿主細胞での使用には適さない場合がある。例えば、発現ベクターを宿主生物に導入し、その後、ベクターに含まれる任意の遺伝子／ポリヌクレオチドの生存率および発現をモニタリングできる。
【0240】
発現ベクターはまた、発現時に、発現ベクターを保有する宿主細胞を選択または識別するのに有用な１つまたは複数の表現型形質を与える１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子を含み得る。真核細胞に適した選択マーカーの非限定的な例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素およびネオマイシン耐性が挙げられる。
【0241】
主題のベクターは、様々な確立された技術によって宿主細胞に安定的にまたは一過的に導入され得る。例えば、１つの方法は、発現ベクターがカルシウム沈殿物を介して導入される塩化カルシウム処理を含み得る。他の塩、例えばリン酸カルシウムも同様の手順に従って使用できる。さらに、エレクトロポレーション（つまり、核酸に対する細胞の透過性を高めるための電流の印加）も使用できる。形質転換法の他の例としては、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介形質転換、酢酸リチウム存在下での熱ショックなどが挙げられます。脂質複合体、リポソーム、デンドリマーも宿主細胞をトランスフェクトするために使用できる。
【0242】
本出願において、細胞は、本開示の多重特異性抗原結合タンパク質を発現し得る。細胞は真核細胞であっても原核細胞であり得る。適切な細胞を本出願の核酸またはベクターで形質転換またはトランスフェクトし、本出願の多重特異性抗原結合タンパク質の発現および／または分泌に利用できる。例えば、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、他の細菌宿主細胞、酵母細胞、または様々な高等真核細胞であり得る。
【0243】
本出願において、方法は、場合により、本出願の多重特異性抗原結合タンパク質を採取することをさらに含み得る。
【0244】
医薬組成物、使用および方法
別の態様では、本出願は、本出願の多特異的抗原結合タンパク質、本出願の単離された核酸分子、本出願のベクター、および／または本出願の細胞、および任意に薬学的に許容されるアジュバントを含む、医薬組成物を提供する。
別の態様では、本出願は、本出願の多特異的抗原結合タンパク質、本出願の単離された核酸分子、本出願のベクター、および／または本出願の細胞、および任意に薬学的に許容されるアジュバントを含む、医薬組成物を提供する。
【0245】
別の態様では、本出願は、本出願の多特異的抗原結合タンパク質、本出願の単離された核酸分子、本出願のベクター、本出願の細胞、本出願のベクターの使用方法を提供する；本出願のベクター、本出願の細胞、および／または腫瘍を予防、緩和および／または治療するための薬剤の製造における本出願の医薬組成物の使用方法を提供する。
【0246】
別の態様では、本出願は、腫瘍の予防、緩和および／または治療に使用するための、本出願の多特異性抗原結合タンパク質、本出願の単離された核酸分子、本出願のベクター、本出願の細胞、および／または本出願の医薬組成物を提供する。
【0247】
別の態様では、本出願は、本出願の多特異的抗原結合タンパク質、本出願の単離された核酸分子、本出願のベクター、本出願の細胞、および／または本出願の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、腫瘍を予防、緩和および／または治療する方法を提供する。
【0248】
本出願において、「薬学的に許容されるアジュバント」は、あらゆる防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤を含み得る。微生物の存在防止は、上述した滅菌手順と、様々な抗菌剤および抗真菌剤の含有との両方によって確保され得る。また、組成物に等張化剤を含めることが望ましい場合もある。さらに、吸収を遅延させる薬剤を含有させることにより、注射可能な医薬形態の吸収を延長させることができる。
【0249】
医薬組成物は、典型的には、無菌であり、製造および保存の条件下で安定であり得る。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の秩序構造として製剤化できる。担体は、例えば、水、エタノールおよびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばコーティングの使用によって維持できる。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる薬剤を組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【0250】
本出願の医薬組成物は、腫瘍の治療に使用される他の化合物、薬物、および／または薬剤を含み得る。
【0251】
本出願において、腫瘍は、固形腫瘍および／またはｂ１００ｄ腫瘍を含み得る。例えば、ｂ１００ｄ腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫および／または白血病、例えば、急性Ｔ細胞白血病、またはヒトＢ細胞リンパ腫を含み得る。例えば、固形腫瘍は乳がんを含む。
【0252】
本出願において、腫瘍を予防、緩和および／または治療することは、腫瘍の成長を阻害および／または低減すること、腫瘍の進行を阻害することを含み得る。例えば、腫瘍を予防、緩和および／または治療することは、別の薬剤、例えば、腫瘍を治療するための当該技術分野で公知の任意の薬剤を投与することも含み得る。
【0253】
本出願の医薬組成物および／または本出願の多特異的抗原結合タンパク質は、任意の合理的な投与量、レジメンおよび／または様式で必要な被験体に投与することができ、これら全ての投与条件は、腫瘍の種類、被験体の状況等に応じて調整できる。
【0254】
別の態様において、本出願は、Ｔ細胞エンゲージャーの製造における、本出願のＣＤ３に対する結合部分、および／または本出願の多特異的抗原結合タンパク質の使用を提供する。
【0255】
本出願において、Ｔ細胞エンゲージャーは、Ｂｉ特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥｓ）を含んでなり得る。Ｔ細胞エンゲージャーは宿主の免疫系を誘導し、腫瘍細胞に対してより特異的なＴ細胞の細胞傷害活性を示す可能性がある。Ｔ細胞エンゲージャーは、腫瘍を治療するための医薬品としてより安全である可能性がある。そして、Ｔ細胞エンゲージャーは、腫瘍細胞に対してより効果的な殺傷を示す可能性がある。
【0256】
別の態様において、本出願は、本出願の多特異的抗原結合タンパク質、本出願の単離された核酸分子、本出願のベクター、本出願の細胞、および／または本出願の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、Ｔ細胞を活性化する方法を提供する。
【0257】
別の態様において、本出願は、本出願の多特異的抗原結合タンパク質、本出願の単離された核酸分子、本出願のベクター、本出願の細胞、および／または本出願の医薬組成物を投与することを含む、Ｔ細胞上で発現するＣＤ３を標的とする方法を提供する。
【0258】
別の態様において、本出願は、本出願の多特異的抗原結合タンパク質、本出願の単離された核酸分子、本出願のベクター、本出願の細胞、および／または本出願の医薬組成物を投与することを含む、Ｔ細胞と腫瘍細胞との間の相互作用を促進する方法を提供する。
【0259】
別の態様において、本出願は、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺腺がん、扁平上皮肺がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん、消化管がん、食道がん、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸部がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、尿路がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、肛門がん、陰茎がん、頭頸部がんなどの治療方法を提供する。
【実施例】
【0260】
以下の実施例は、当業者に本発明の製造方法および使用方法の完全な開示および説明を提供するために記載されており、発明者が彼らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。それらは、以下の実験が実行されたすべての実験であるか、または唯一の実験であることを表すことを目的とする。使用される数値（量、温度など）の正確性を確保するために努力が払われていますが、一部の実験誤差や偏差は考慮する必要がある。特に断りのない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏温度、圧力は大気圧または大気圧付近を示す。標準的な略語が使用され得る。例えば、ｂｐ、塩基対（複数可）。ｋｂ、キロ塩基（複数可）。π、ピコリットル（複数可）。ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）。ｍｉｎ、分（複数可）。ｈまたはｈｒ、時間（複数可）。ａａ、アミノ酸（複数可）。ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）。ｉ．ｍ．、筋肉内（複数可）。ｉ．ｐ．、腹腔内（複数可）。ｓ．ｃ．、皮下（複数可）などが挙げられる。
【0261】
実施例１ ハイブリドーマＨＥＲ２－ＣＤ３二特異性抗体の作製とスクリーニング
ＨＥＲ２抗原およびＣＤ３抗原を含む組成物をマウスおよびラットにそれぞれ注射し、脾臓におけるＢリンパ球の増殖を刺激し、ＨＥＲ２およびＣＤ３に対する抗体を特異的に分泌させた。マウスおよびラットの脾臓は複数回の免疫後に外科的に摘出し、骨髄腫細胞との細胞融合にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた。次いで、融合細胞をＨＡＴ選択培地を通してスクリーニングした。ＨＡＴ選択培地は、ヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、チミン（Ｔ）の３つの成分で構成される。ＨＡＴ選択培地中のアミノプテリンはジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤であり、ＤＮＡ合成の内因性経路を効果的にブロックできる。融合前の骨髄腫細胞は抗体を産生できず、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）遺伝子を欠いているため、ＨＡＴ選択培地に対して感受性が高く、したがって生存できない。しかし、融合細胞はＨＧＰＲＴ酵素を合成でき、Ｂリンパ球と骨髄腫細胞の二重の特徴を継承できるため、ＨＡＴ選択培地中で無限に増殖できる。
ＨＥＲ２抗原およびＣＤ３抗原を含む組成物をマウスおよびラットにそれぞれ注射し、脾臓におけるＢリンパ球の増殖を刺激し、ＨＥＲ２およびＣＤ３に対する抗体を特異的に分泌させた。マウスおよびラットの脾臓は複数回の免疫後に外科的に摘出し、骨髄腫細胞との細胞融合にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた。次いで、融合細胞をＨＡＴ選択培地を通してスクリーニングした。ＨＡＴ選択培地は、ヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、チミン（Ｔ）の３つの成分で構成される。ＨＡＴ選択培地中のアミノプテリンはジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤であり、ＤＮＡ合成の内因性経路を効果的にブロックできる。融合前の骨髄腫細胞は抗体を産生できず、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）遺伝子を欠いているため、ＨＡＴ選択培地に対して感受性が高く、したがって生存できない。しかし、融合細胞はＨＧＰＲＴ酵素を合成でき、Ｂリンパ球と骨髄腫細胞の二重の特徴を継承できるため、ＨＡＴ選択培地中で無限に増殖できる。
【0262】
融合細胞をＨＡＴ選択培地中で約１０～１４日間インキュベートし、その後、各ウェルが１つのハイブリドーマ細胞のみを含むように培地をマルチウェルプレート内で希釈した。これらの単一細胞クローンから、所定の特異的抗体を分泌するハイブリッド細胞株をＥＬＩＳＡにより選択した。
【0263】
選択されたハイブリドーマの１つは、マウス由来の抗ＨＥＲ２抗体（略してＨＥＲ２抗体）を発現するハイブリドーマであった。
【0264】
他の４つは、ラット由来の抗ＣＤ３抗体（略してＣＤ３Ａ抗体、ＣＤ３Ｂ抗体、ＣＤ３Ｃ抗体、およびＣＤ３Ｄ抗体）を発現するハイブリドーマであった。
【0265】
ＨＥＲ２抗体を発現するハイブリドーマ細胞とＣＤ３Ｄ抗体を発現するハイブリドーマ細胞を融合させ、抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３二重特異性抗体を発現する二重特異性ハイブリドーマ、すなわちハイブリドーマＨＥＲ２－ＣＤ３Ｄ二重特異性抗体（以下、ｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄという）を得た。
【0266】
実施例２ ヒトＴ細胞株に対する各種ＣＤ３抗体の結合活性
ａ）試薬と消耗品：
１．ヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ（クローンＥ６－１、ＡＴＣＣ♯ＴＩＢ－１５２）
２．抗ＣＤ３抗体：
（ｉ）抗ＣＤ３Ａ抗体（配列番号３５に記載のアミノ酸を含むＶＨと配列番号３６に記載のアミノ酸を含むＶＬを有する）
（ｉｉ）抗ＣＤ３Ｂ抗体（配列番号４３に記載のアミノ酸を含むＶＨと配列番号４４に記載のアミノ酸を含むＶＬを有する）
（ｉｉｉ）抗ＣＤ３Ｃ抗体（配列番号５１に記載のアミノ酸を含むＶＨと配列番号５２に記載のアミノ酸を含むＶＬを有する）
（ｉｖ）抗ＣＤ３Ｄ抗体（配列番号８に記載のアミノ酸を含むＶＨと配列番号７に記載のアミノ酸を含むＶＬを有する）
（ｖ）ＵＣＨＴ－ｌ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２１００２９３）
３．二次抗体：ＦＩＴＣ標識ＡｆｆｍｉＰｕｒｅＲａｔＡｎｔｉ－ＭｏｕｓｅＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍ．Ｒｅｓ．、４１５－０９５－１６６）、ＦＩＴＣ標識ＡｆｆｍｉＰｕｒｅＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－ＲａｔＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍ．Ｒｅｓ．、２１２－０９５－１６８）
４．ＰＢＳ（センルイ、ＣＲ２００１２）
５．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
６．フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍｅｎ、Ａ００－１－１１０２）
ａ）試薬と消耗品：
１．ヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ（クローンＥ６－１、ＡＴＣＣ♯ＴＩＢ－１５２）
２．抗ＣＤ３抗体：
（ｉ）抗ＣＤ３Ａ抗体（配列番号３５に記載のアミノ酸を含むＶＨと配列番号３６に記載のアミノ酸を含むＶＬを有する）
（ｉｉ）抗ＣＤ３Ｂ抗体（配列番号４３に記載のアミノ酸を含むＶＨと配列番号４４に記載のアミノ酸を含むＶＬを有する）
（ｉｉｉ）抗ＣＤ３Ｃ抗体（配列番号５１に記載のアミノ酸を含むＶＨと配列番号５２に記載のアミノ酸を含むＶＬを有する）
（ｉｖ）抗ＣＤ３Ｄ抗体（配列番号８に記載のアミノ酸を含むＶＨと配列番号７に記載のアミノ酸を含むＶＬを有する）
（ｖ）ＵＣＨＴ－ｌ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２１００２９３）
３．二次抗体：ＦＩＴＣ標識ＡｆｆｍｉＰｕｒｅＲａｔＡｎｔｉ－ＭｏｕｓｅＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍ．Ｒｅｓ．、４１５－０９５－１６６）、ＦＩＴＣ標識ＡｆｆｍｉＰｕｒｅＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－ＲａｔＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍ．Ｒｅｓ．、２１２－０９５－１６８）
４．ＰＢＳ（センルイ、ＣＲ２００１２）
５．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
６．フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍｅｎ、Ａ００－１－１１０２）
【0267】
ｂ）方法：
本出願のＣＤ３抗体と市販のＵＣＨＴ－１のヒトＣＤ３抗原に対する結合活性を比較するために、ｉｎｖｉｔｒｏ細胞実験を用いて抗体の結合活性を検出した。
本出願のＣＤ３抗体と市販のＵＣＨＴ－１のヒトＣＤ３抗原に対する結合活性を比較するために、ｉｎｖｉｔｒｏ細胞実験を用いて抗体の結合活性を検出した。
【0268】
まず、Ｊｕｒｋａｔ細胞の濃度をＰＢＳで１×１０７細胞／ｍｌに調整した。これら２つの抗体の濃度は８０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６２５μｇ／ｍｌ、０．３１２５μｇ／ｍｌ、０．１５６２５μｇ／ｍｌ、７８．１２５ｎｇ／ｍｌ、３９．０６２５ｎｇ／ｍｌ、１９．５３１２５ｎｇ／ｍｌ及び０ｎｇ／ｍｌに調整された。次に、Ｊｕｒｋａｔ細胞の懸濁液（５０μｌ／ウェル）を加え、続いてこれら５種類のＣＤ３抗体（５０μｌ／ウェル）を異なる濃度でＵ字底プレートを備えた９６ウェルプレートに加えた。最後、混合物中のこれら５つのＣＤ３抗体の最終濃度は、それぞれ４０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６２５μｇ／ｍｌ、０．３１２５μｇ／ｍｌ、０．１５６２５μｇ／ｍｌ、７８．１２５ｎｇ／ｍｌ、３９．０６２５ｎｇ／ｍｌ、１９．５３１２５ｎｇ／ｍｌ、９．７６５６２５ｎｇ／ｍｌ及び０ｎｇ／ｍｌであり、混合物を４℃の冷蔵庫で１時間インキュベートした。
【0269】
インキュベーション後、混合物を３００ｇで５分間遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳ（２００μｌ／ウェル）で２回洗浄した。最後に、二次抗体ＦＩＴＣ標識ＡｆｆｍｉＰｕｒｅＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－ＲａｔＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）またはＦＩＴＣ標識ＡｆｆｍｉＰｕｒｅＲａｔＡｎｔｉ－ＭｏｕｓｅＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をそれぞれ用いて、抗ＣＤ３抗体－Ｊｕｒｋａｔ細胞複合体またはＵＣＨＴ－ｌ－Ｊｕｒｋａｔ細胞複合体に結合させ、フローサイトメトリーを行った。ジャーカット細胞に対する抗体の結合活性を評価するために、ＦＩＴＣ陽性ジャーカット細胞を計算した（図８）。
【0270】
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７ソフトウェアを用いてグラフを可視化し、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する抗体の結合活性の半値最大効果濃度（ＥＣ５０）を算出した。ＣＤ３Ａ、ＣＤ３Ｂ、ＣＤ３Ｃ、ＣＤ３ＤおよびＵＣＨＴ－１抗体のＥＣ５０値は、それぞれ２５．８７ｐＭ、９．５６ｐＭ、１５．２３ｐＭ、１０．７１ｐＭ、２２．７９ｐＭであった。
【0271】
実施例３ ＣＨＯにおける組換えＨＥＲ２－ＣＤ３二重特異性抗体の発現
本実施例では、ＣＨＯ細胞を遺伝子改変し、組換えＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄ二特異性抗体（以下、ｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄと略す）を発現および産生させた。
本実施例では、ＣＨＯ細胞を遺伝子改変し、組換えＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄ二特異性抗体（以下、ｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄと略す）を発現および産生させた。
【0272】
１．タンパク質配列の合成
ｒＨＥＲ２－ＣＤ３Ｄ二重特異性抗体の構造を図１に示す。抗体は２つの異なる抗原結合部分、すなわちＨＥＲ２結合部分とＣＤ３結合部分を含む。ＨＥＲ２結合部分は実施例１のマウス抗ＨＥＲ２抗体に由来し、ＣＤ３結合部分は実施例１のラット抗ＣＤ３Ｄ抗体に由来する。
ｒＨＥＲ２－ＣＤ３Ｄ二重特異性抗体の構造を図１に示す。抗体は２つの異なる抗原結合部分、すなわちＨＥＲ２結合部分とＣＤ３結合部分を含む。ＨＥＲ２結合部分は実施例１のマウス抗ＨＥＲ２抗体に由来し、ＣＤ３結合部分は実施例１のラット抗ＣＤ３Ｄ抗体に由来する。
【0273】
実施例１の抗ＨＥＲ２抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸配列をそれぞれｐ２ＭＰＴ（ピューロマイシン耐性遺伝子を含む）の２つの異なる発現カセットに挿入し、組換えプラスミドｐ２ＭＰＴ－ＥＨＥＬを得た。実施例１の抗ＣＤ３Ｄ抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸配列をそれぞれｐ２ＭＰＴ（ピューロマイシン耐性遺伝子を含む）の２つの異なる発現カセットに挿入し、組換えプラスミドｐ２ＭＰＴ－ＤＨＤＬを得た。
【0274】
【表2】
【0275】
ｒＨＥＲ２－ＣＤ３Ｄ二重特異性抗体を発現させるために、２種類の組換えプラスミドをＣＨＯ細胞に１：１の割合で安定的に共導入した。トランスポザーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＨＴ－ＰＢａｓｅ－ｏｒｉを安定トランスフェクションの試薬として用いた。トランスフェクションの間、細胞密度を４．０×１０６細胞／ｍｌに調整し、培地を新鮮なｐｒｏＣＨ０５培地に交換した。トランスフェクション試薬はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で、全ＤＮＡとＰＥＩの比率は１：５であった。
【0276】
表３に従って、新鮮な培地に懸濁したＣＨＯ細胞にＤＮＡとＰＥＩを順次添加し、素早く混合した後、混合物を３７℃のシェーカーに入れてトランスフェクションを行った。
【0277】
【表3】
【0278】
２．ｒＨＥＲ２－ＣＤ３Ｄ二重特異性抗体の細胞プールスクリーニング
トランスフェクションの７２時間後、１０ｍｌ容量の５×１０６個の細胞に１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンを加え、３７℃のシェーカーで培養した。培地は２－３日ごとにリフレッシュし、細胞は０．５×１０６細胞／ｍｌの密度で継代し、１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン中で維持した。１０日間のスクリーニングの後、生存率９７％以上の陽性細胞プールが得られた。
トランスフェクションの７２時間後、１０ｍｌ容量の５×１０６個の細胞に１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンを加え、３７℃のシェーカーで培養した。培地は２－３日ごとにリフレッシュし、細胞は０．５×１０６細胞／ｍｌの密度で継代し、１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン中で維持した。１０日間のスクリーニングの後、生存率９７％以上の陽性細胞プールが得られた。
【0279】
３．ｒＨＥＲ２－ＣＤ３Ｄ二重特異性抗体の発現
５．０×１０６細胞／ｍｌの陽性細胞を、２ｍＭ酪酸ナトリウム添加培地で３１℃、４日間培養した。１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離により上清を回収した。
５．０×１０６細胞／ｍｌの陽性細胞を、２ｍＭ酪酸ナトリウム添加培地で３１℃、４日間培養した。１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離により上清を回収した。
【0280】
４．ｒＨＥＲ２－ＣＤ３Ｄ二重特異性抗体の精製
ステップ３で得られた上清を２０００ｒｐｍで遠心分離し、細胞破片を除去した後、０．４５μｍの微多孔膜で傾けた。ＭａｂｓｅｌｅｃｔＳｕｒｅアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて上清からＦｃ部分を持つ抗体を濃縮し、ｐＨ５．８のクエン酸ナトリウム緩衝液を用いて抗ＣＤ３Ｄモノクローナル抗体を溶出した。その後、ｐＨ５．８からｐＨ３．０まで２０ＣＶのグラジエント直線溶出を行った。
ステップ３で得られた上清を２０００ｒｐｍで遠心分離し、細胞破片を除去した後、０．４５μｍの微多孔膜で傾けた。ＭａｂｓｅｌｅｃｔＳｕｒｅアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて上清からＦｃ部分を持つ抗体を濃縮し、ｐＨ５．８のクエン酸ナトリウム緩衝液を用いて抗ＣＤ３Ｄモノクローナル抗体を溶出した。その後、ｐＨ５．８からｐＨ３．０まで２０ＣＶのグラジエント直線溶出を行った。
【0281】
採取したサンプルはＴｒｉｓ－ＨＣｌでｐＨ５．４に調整した後、ＣａｐｔｏＳ衝撃イオン交換クロマトグラフィーカラムでｒＦＩＥＲ２－ＣＤ３Ｄ二重特異性抗体と抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を分離した。精製されたｒＨＥＲ２－ＣＤ３Ｄ二重特異性抗体は、組換えＨＥＲ２－ＣＤ３Ｄ二重特異性抗体であり、以下ｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄと称する。
【0282】
３０Ｋｄカットオフ限外濾過を行い、溶出バッファーをＰＢＳ溶液に置換した。ｒＨＥＲ２×ＣＤ３ＤはウェスタンブロットとＳＤＳ－ＰＡＧＥで純度を確認した。図２はウェスタンブロットの結果を表す。図２中、Ｍはマーカー、１－２行目はｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄ、３行目は抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、４行目は抗ＣＤ３Ｄモノクローナル抗体を表す。図３は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。ライン１はマーカーを表し、ライン２はｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄを表す。
【0283】
実施例４ 組換え抗ＣＤ３二重特異性抗体のＦ（ａｂ）’２断片の作製
ＨＥＲ２とＣＤ２０をそれぞれ標的とする重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬは、市販のハーセプチンとリツキシマブから得られた。重鎖定常領域ＣＨＩ、ＣＬの軽鎖定常領域およびそのヒンジ領域はマウスＩｇＧ２ａに由来した。精製のために、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩをＣＨＩのＣ末端に連結した。
ＨＥＲ２とＣＤ２０をそれぞれ標的とする重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬは、市販のハーセプチンとリツキシマブから得られた。重鎖定常領域ＣＨＩ、ＣＬの軽鎖定常領域およびそのヒンジ領域はマウスＩｇＧ２ａに由来した。精製のために、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩをＣＨＩのＣ末端に連結した。
【0284】
ＣＤ３を標的とする重鎖可変領域ＶＨおよび軽鎖可変領域ＶＬは、実施例１の抗ＣＤ３Ｄ抗体または市販のＵＣＨＴ１に由来した。重鎖定常領域ＣＨＩ、ＣＬの軽鎖定常領域およびそのヒンジ領域はラットＩｇＧ２ｂに由来した。Ｈｉｓタグを精製のためにＣＨＩのＣ末端に連結した。
【0285】
ラット由来Ｆａｂおよびマウス由来Ｆａｂの２つの部分は、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合され、組換え抗ＣＤ３二重特異性抗体のＦ（ａｂ）’２構造を形成した。
【0286】
組換え抗ＣＤ３二重特異性抗体のＦ（ａｂ）’２断片は、宿主細胞内で２つの異なるＦａｂ抗体断片を共発現させることにより得られた。組換え抗ＣＤ３二重特異性抗体のＦ（ａｂ）’２断片を含む細胞プールを安定遺伝子発現（ＳＧＥ）により得た。高分子ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が宿主細胞へのＤＮＡ導入を仲介し、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムを用いて安定な細胞プールを得た。ＣＨＯ細胞に２つの異なるプラスミドを共導入することにより、組換え抗ＣＤ３二重特異性抗体の完全なＦ（ａｂ）’２断片が得られた。
【0287】
１．タンパク質の配列解析と合成
８つの遺伝子は以下のように合成された：
１）遺伝子１、エンコーディング：ハーセプチンＶＨ（配列番号２０に記載のアミノ酸を有する）－マウスＩｇＧ２ａのＣＨ１－マウスＩｇＧ２ａのヒンジ－フレキシブルリンカーＧ４Ｓ－ｓｔｒｅｐ－タグＩＩ
２）遺伝子２、エンコーディング：ハーセプチンＶＬ（配列番号１９に記載のアミノ酸を有する）－マウスＩｇＧ２ａのＣＬ
３）遺伝子３、エンコーディング：リツキシマブＶＨ（配列番号２４に記載のアミノ酸を有する）－マウスＩｇＧ２ａのＣＨ１－マウスＩｇＧ２ａのヒンジ－フレキシブルリンカーＧ４Ｓ－ｓｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩ
４）遺伝子４、エンコーディング：リツキシマブＶＬ（配列番号２３に記載のアミノ酸を有する）－マウスＩｇＧ２ａのＣＬ
５）遺伝子５、エンコーディング：抗ＣＤ３ＤＶＨ（配列番号８に記載のアミノ酸を有する）－ラットＩｇＧ２ｂのＣＨＩ－ラットＩｇＧ２ｂのヒンジ－フレキシブルリンカーＧ４Ｓ－Ｈｉｓ－タグ
６）遺伝子６、エンコーディング：抗ＣＤ３ＤＶＬ（配列番号７に記載のアミノ酸を有する）－マウスＩｇＧ２ａのＣＬ
７）遺伝子７、エンコーディング：ＵＣＨＴ１ＶＨ（配列番号２２に記載のアミノ酸を有する）－ラットＩｇＧ２ｂのＣＨＩ－ラットＩｇＧ２ｂのヒンジ－フレキシブルリンカーＧ４Ｓ－Ｈｉｓ－タグ、および、
８）遺伝子８、エンコーディング：ＵＣＨＴ１ＶＬ（配列番号２１に記載のアミノ酸を有する）－マウスＩｇＧ２ａのＣＬ
８つの遺伝子は以下のように合成された：
１）遺伝子１、エンコーディング：ハーセプチンＶＨ（配列番号２０に記載のアミノ酸を有する）－マウスＩｇＧ２ａのＣＨ１－マウスＩｇＧ２ａのヒンジ－フレキシブルリンカーＧ４Ｓ－ｓｔｒｅｐ－タグＩＩ
２）遺伝子２、エンコーディング：ハーセプチンＶＬ（配列番号１９に記載のアミノ酸を有する）－マウスＩｇＧ２ａのＣＬ
３）遺伝子３、エンコーディング：リツキシマブＶＨ（配列番号２４に記載のアミノ酸を有する）－マウスＩｇＧ２ａのＣＨ１－マウスＩｇＧ２ａのヒンジ－フレキシブルリンカーＧ４Ｓ－ｓｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩ
４）遺伝子４、エンコーディング：リツキシマブＶＬ（配列番号２３に記載のアミノ酸を有する）－マウスＩｇＧ２ａのＣＬ
５）遺伝子５、エンコーディング：抗ＣＤ３ＤＶＨ（配列番号８に記載のアミノ酸を有する）－ラットＩｇＧ２ｂのＣＨＩ－ラットＩｇＧ２ｂのヒンジ－フレキシブルリンカーＧ４Ｓ－Ｈｉｓ－タグ
６）遺伝子６、エンコーディング：抗ＣＤ３ＤＶＬ（配列番号７に記載のアミノ酸を有する）－マウスＩｇＧ２ａのＣＬ
７）遺伝子７、エンコーディング：ＵＣＨＴ１ＶＨ（配列番号２２に記載のアミノ酸を有する）－ラットＩｇＧ２ｂのＣＨＩ－ラットＩｇＧ２ｂのヒンジ－フレキシブルリンカーＧ４Ｓ－Ｈｉｓ－タグ、および、
８）遺伝子８、エンコーディング：ＵＣＨＴ１ＶＬ（配列番号２１に記載のアミノ酸を有する）－マウスＩｇＧ２ａのＣＬ
【0288】
遺伝子１－８を発現ベクターにライゲーションし、宿主細胞株にトランスフェクトして、２つの異なるＦ（ａｂ）’２断片の組換え抗ＣＤ３二重特異性抗体を作製し、その構造を図４－５に示した。抗体の構造にはＦｃ領域が含まれない。抗体は２つの異なる抗原結合部分、すなわちＨＥＲ２結合部分とＣＤ３結合部分、またはＣＤ２０結合部分とＣＤ３結合部分を含む。この構造により、抗体は腫瘍細胞上に発現する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）とＴ細胞上のＣＤ３分子に同時に結合できる。そして、リコンビナント抗ＣＤ３二重特異性抗体のＦ（ａｂ）’２断片は、精製のためにＳｔｒｅｐ－ＩＩとＨｉｓペプチドの両方を持っている。
【0289】
２．プラスミド構築
遺伝子１－２または遺伝子３－４をｐ２ＭＰＴ（ピューロマイシン耐性遺伝子を含む）の２つの異なる発現カセットに別々に挿入し、ｐ２ＭＰＴ－ＨＨ－ＨＬおよびｐ２ＭＰＴ－ＲＨ－ＲＬと命名した組換えプラスミドを得た。遺伝子５－６または遺伝子７－８をｐ２ＭＰＴ（ピューロマイシン耐性遺伝子を含む）の２つの異なる発現カセットに別々に挿入し、ｐ２ＭＰＴ－ＣＨ－ＣＬおよびｐ２ＭＰＴ－ＵＨ－ＵＬと命名された組換えプラスミドを得た。
遺伝子１－２または遺伝子３－４をｐ２ＭＰＴ（ピューロマイシン耐性遺伝子を含む）の２つの異なる発現カセットに別々に挿入し、ｐ２ＭＰＴ－ＨＨ－ＨＬおよびｐ２ＭＰＴ－ＲＨ－ＲＬと命名した組換えプラスミドを得た。遺伝子５－６または遺伝子７－８をｐ２ＭＰＴ（ピューロマイシン耐性遺伝子を含む）の２つの異なる発現カセットに別々に挿入し、ｐ２ＭＰＴ－ＣＨ－ＣＬおよびｐ２ＭＰＴ－ＵＨ－ＵＬと命名された組換えプラスミドを得た。
【0290】
【表4】
【0291】
表４の組換えプラスミドを用いて、合計４つの組換え抗ＣＤ３二重特異性抗体のＦ（ａｂ）’２断片を構築した：（１）Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２；（２）Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２；（３）Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２；および（４）Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２。
【0292】
３．細胞トランスフェクション
ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞を安定にトランスフェクトして、組換え抗ＣＤ３二重特異性抗体の上記４つのＦ（ａｂ）’２断片を発現させた。
ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞を安定にトランスフェクトして、組換え抗ＣＤ３二重特異性抗体の上記４つのＦ（ａｂ）’２断片を発現させた。
【0293】
トランスフェクション中、細胞密度を３．０×１０６細胞／ｍｌに調整し、培地を新鮮なｐｒｏＣＨ０５培地と交換した。トランスフェクション試薬はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で、全ＤＮＡとＰＥＩの比率は１：３であった。
【0294】
プラスミドｐ２ＭＰＴ－ＨＨ－ＨＬとｐ２ＭＰＴ－ＣＨ－ＣＬ、ｐ２ＭＰＴ－ＲＨ－ＲＬとｐ２ＭＰＴ－ＣＨ－ＣＬ、ｐ２ＭＰＴ－ＨＨ－ＨＬとｐ２ＭＰＴ－ＵＨ－ＵＬ、ｐ２ＭＰＴ－ＲＨ－ＲＬとｐ２ＭＰＴ－ＵＨ－ＵＬを添加し、その質量比は１：１とした。同時に、トランスポザーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＨＴ－ＰＢａｓｅ－ｏｒｉを添加し、添加量はＤＮＡ総量の１／１０とした。表５に従って、新鮮な培地に懸濁したＣＨＯ－ＤＧ４４細胞にＤＮＡとＰＥＩを順次添加し、素早く混合した後、混合物を３７℃のシェーカーに入れてトランスフェクションを行った。
【0295】
【表5】
【0296】
４．組換え抗ＣＤ３二重特異性抗体のＦ（ａｂ）’２断片の細胞プールスクリーニング
トランスフェクション９６時間後、１０ｍｌ容量の１．０×１０７個の細胞に１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンを加え、３７℃のシェーカーで培養した。培地は２日ごとにリフレッシュし、細胞は１．０×１０６細胞／ｍｌの密度で継代し、１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン中で維持した。１２日間のスクリーニングの後、生存率９５％以上の陽性細胞プールが得られた。
トランスフェクション９６時間後、１０ｍｌ容量の１．０×１０７個の細胞に１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンを加え、３７℃のシェーカーで培養した。培地は２日ごとにリフレッシュし、細胞は１．０×１０６細胞／ｍｌの密度で継代し、１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン中で維持した。１２日間のスクリーニングの後、生存率９５％以上の陽性細胞プールが得られた。
【0297】
５．組換え抗ＣＤ３二重特異性抗体のＦ（ａｂ）’２断片の発現
４．０×１０６細胞／ｍｌの陽性細胞を、２ｍＭ酪酸ナトリウムを添加した培地中で３１℃で７日間培養した。１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により上清を回収した。
４．０×１０６細胞／ｍｌの陽性細胞を、２ｍＭ酪酸ナトリウムを添加した培地中で３１℃で７日間培養した。１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により上清を回収した。
【0298】
６．組換えＣＤ３二重特異性抗体のＦ（ａｂ）’２断片の精製
ステップ５で得られた上清を２０００ｒｐｍで遠心分離して細胞破片を除去し、０．４５μｍの微多孔性膜で濾過した。Ｈｉｓタグ付きＦ（ａｂ’）２は、Ｈｉｓｔｒａｐｅｘｃｅｌアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いてＣＨＯ発現上清から濃縮され、続いてＨｉｓｔｒａｐアフィニティーカラムから濃縮された組換え抗ＣＤ３ｂｉ特異的抗体のＦ（ａｂ’）２断片は３００ｍＭイミダゾール溶液で溶出された。溶出したサンプルをＳｔｒｅｐＴｒａｐＨＰアフィニティークロマトグラフィーカラムで濃縮した。濃縮後、５ｍＭの脱硫ビオチン（Ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ）を用いて溶出し、Ｈｉｓ－ｔａｇとＳｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩの両方を持つ目的物を得た。３０Ｋｄカットオフ限外濾過を行い、溶出バッファーをＰＢＳ溶液に置換した。精製した抗ＣＤ３二重抗体のＦ（ａｂ’）２断片をＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出した結果を図６－７に示す。図６において、線１はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２を表し、線２はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２を表し、線３はマーカーを表す。７において、１行目はマーカー、２行目はＲｉｔｕｘｉｍａｂ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２、３行目はＲｉｔｕｘｉｍａｂ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２を表す。
ステップ５で得られた上清を２０００ｒｐｍで遠心分離して細胞破片を除去し、０．４５μｍの微多孔性膜で濾過した。Ｈｉｓタグ付きＦ（ａｂ’）２は、Ｈｉｓｔｒａｐｅｘｃｅｌアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いてＣＨＯ発現上清から濃縮され、続いてＨｉｓｔｒａｐアフィニティーカラムから濃縮された組換え抗ＣＤ３ｂｉ特異的抗体のＦ（ａｂ’）２断片は３００ｍＭイミダゾール溶液で溶出された。溶出したサンプルをＳｔｒｅｐＴｒａｐＨＰアフィニティークロマトグラフィーカラムで濃縮した。濃縮後、５ｍＭの脱硫ビオチン（Ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ）を用いて溶出し、Ｈｉｓ－ｔａｇとＳｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩの両方を持つ目的物を得た。３０Ｋｄカットオフ限外濾過を行い、溶出バッファーをＰＢＳ溶液に置換した。精製した抗ＣＤ３二重抗体のＦ（ａｂ’）２断片をＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出した結果を図６－７に示す。図６において、線１はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２を表し、線２はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２を表し、線３はマーカーを表す。７において、１行目はマーカー、２行目はＲｉｔｕｘｉｍａｂ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２、３行目はＲｉｔｕｘｉｍａｂ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２を表す。
【0299】
【0300】
実施例５ ｒＨＥＲ２×ＣＤ３ＤおよびｈＨＥＲ２×ＣＤ３ＤによるＩｎｖｉｔｒｏＳＫ－ＢＲ３細胞死滅アッセイ
ａ）試薬と消耗品：
１．細胞株：ＳＫ－ＢＲ－３（ＡＴＣＣ♯ＨＴＢ－３０）
２．末梢ｂ１００ｄ単核細胞（ＰＢＭＣ）（リード、ＰＢＭＣ－２０２０１１０４０３）
３．ＨＥＲ２×ＣＤ３二重特異性抗体：
（ｉ）ｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄ（実施例３で生成）
（ｉｉ）ｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄ（実施例１で作製）
４．ＰＢＳ（センルイ、ＣＲ２００１２）
５．ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、２２４０００８９）
６．ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０４０６．０５）
７．ＣｅｌｌＴｒａｃｅ遠赤細胞増殖キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５７２）
８．ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（シグマ、Ｐ４１７０）
９．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
１０．フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍｅｎ、Ａ００－１－１１０２）
ａ）試薬と消耗品：
１．細胞株：ＳＫ－ＢＲ－３（ＡＴＣＣ♯ＨＴＢ－３０）
２．末梢ｂ１００ｄ単核細胞（ＰＢＭＣ）（リード、ＰＢＭＣ－２０２０１１０４０３）
３．ＨＥＲ２×ＣＤ３二重特異性抗体：
（ｉ）ｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄ（実施例３で生成）
（ｉｉ）ｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄ（実施例１で作製）
４．ＰＢＳ（センルイ、ＣＲ２００１２）
５．ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、２２４０００８９）
６．ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０４０６．０５）
７．ＣｅｌｌＴｒａｃｅ遠赤細胞増殖キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５７２）
８．ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（シグマ、Ｐ４１７０）
９．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
１０．フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍｅｎ、Ａ００－１－１１０２）
【0301】
ｂ）方法：
異なる抗体作製法によって作製された二重特異性抗体の薬力学的活性を比較するために、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するｒＨＥＲ２×ＣＤ３ＤおよびｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの殺傷効果を検出するｉｎｖｉｔｒｏ実験を行った。
異なる抗体作製法によって作製された二重特異性抗体の薬力学的活性を比較するために、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するｒＨＥＲ２×ＣＤ３ＤおよびｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの殺傷効果を検出するｉｎｖｉｔｒｏ実験を行った。
【0302】
まず、表面にＨＥＲ２を高発現しているＳＫ－ＢＲ－３を細胞染色（ＦａｒＲｅｄ）で染色した。次いで、細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁した。続いて、細胞濃度を８×１０５細胞／ｍｌに調整した。健康なドナーからのＰＢＭＣを１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁し、細胞濃度を８×１０６細胞／ｍｌに調整した。最後に、ＰＢＭＣとＳＫ－ＢＲ－３を体積比１：１でよく混合した。
【0303】
ｒＨＥＲ２×ＣＤ３ＤまたはｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの濃度を０、２×１０－４、２×１０－３、２×１０－２、２×１０－１、２×１００、２×１０１、２×１０２、２×１０３及び２×１０４に連続希釈した。ＰＢＭＣとＳＫ－ＢＲ－３の細胞混合物（５０μｌ／ウェル）を９６ウェルプレートに添加し、続いて連続希釈したｒＨＥＲ２×ＣＤ３ＤまたはｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄ（５０μｌ／ウェル）を細胞混合物に添加した。ｒＨＥＲ２×ＣＤ３ＤまたはｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの最終濃度は、０、１０－４、１０－３、１０－２、１０－１、１００、１０１、１０２、１０３及び１０４ｐＭに調整した。
【0304】
二特異性抗体と細胞の混合物を３７℃のインキュベーターで２４時間インキュベートした後、４００ｇで５分間遠心して上清を除去した。細胞をパンクレアチンで１０分間消化し、ＰＢＳ（２００μｌ／ウェル）で２回洗浄した。
【0305】
最後に、死細胞をＰＩで染色し、残存するＳＫ－ＢＲ－３細胞の量をフローサイトメトリーで解析して、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対する抗体媒介細胞傷害の殺傷効果を決定した。
【0306】
フローサイトメトリーを行う際、細胞懸濁液中のＳＫ－ＢＲ－３細胞を標識するためにＡＰＣチャンネルを用い（ファーレッド染色）、生細胞と死細胞を区別するためにＰＥチャンネルを用いた（ＰＩ染色）。ＰＩは死細胞を染色することができるため、フローサイトメトリーで分析したＡＰＣ陽性細胞数とＰｉ陰性細胞数（ＡＰＣ＋ＰＴ）を最終的に用いて残存ＳＫ－ＢＲ－３細胞を定量し、殺傷率を算出した。
【0307】
ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するＰＢＭＣの殺傷活性を媒介するｒＨＥＲ２×ＣＤ３ＤとｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの効果を比較するために、グラフの可視化にはＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７ソフトウェアを用い、半減最大効果濃度（ＥＣ５０）の算出には４パラメータフィッティング曲線の非線形回帰を用いた。ｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの場合、ＥＣ５０値は約３．３３ｐＭである。ｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの場合、ＥＣ５０値は約２２．５２ｐＭである。したがって、ＣＨＯ細胞から産生されたｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄは、ハイブリドーマから産生されたｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄよりも腫瘍細胞に対する殺傷活性が有意に優れているという驚くべき結果が得られた。図９は、ｈＨＥＲ２×ＣＤ３ＤおよびｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄを介するＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するＰＢＭＣの殺傷効果を示す。
【0308】
実施例６ ＣＤ３結合部分は、ＳＫ－ＢＲ３細胞死滅に対するｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの細胞毒性効果に寄与
ａ）試薬と消耗品：
１．細胞株：ＳＫ－ＢＲ－３（ＡＴＣＣ♯ＨＴＢ－３０）
２．ＰＢＭＣから精製されたＴ細胞（健常人ドナー♯１：Ｒｅｉｄ、ＰＢＭＣ－２０２１１１０９０２；健常人ドナー♯２：Ｏｒｉｃｅｌｌｓ、ＬＰ２１０８１８０１３、Ｚ０２３１）
３．ＨＥＲ２×ＣＤ３二重特異性抗体：
（ｉ）ｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄ（実施例３で生成）；
（ｉｉ）ｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄ（実施例１で作製）
４．ＰＢＳ（センルイ、ＣＲ２００１２）
５．ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、２２４０００８９）
６．ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０４０６．０５）
７．ＣｅｌｌＴｒａｃｅ遠赤細胞増殖キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５７２）
８．ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（シグマ、Ｐ４１７０）
９．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
１０．フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍｅｎ、Ａ００－１－１１０２）
ａ）試薬と消耗品：
１．細胞株：ＳＫ－ＢＲ－３（ＡＴＣＣ♯ＨＴＢ－３０）
２．ＰＢＭＣから精製されたＴ細胞（健常人ドナー♯１：Ｒｅｉｄ、ＰＢＭＣ－２０２１１１０９０２；健常人ドナー♯２：Ｏｒｉｃｅｌｌｓ、ＬＰ２１０８１８０１３、Ｚ０２３１）
３．ＨＥＲ２×ＣＤ３二重特異性抗体：
（ｉ）ｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄ（実施例３で生成）；
（ｉｉ）ｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄ（実施例１で作製）
４．ＰＢＳ（センルイ、ＣＲ２００１２）
５．ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、２２４０００８９）
６．ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０４０６．０５）
７．ＣｅｌｌＴｒａｃｅ遠赤細胞増殖キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５７２）
８．ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（シグマ、Ｐ４１７０）
９．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
１０．フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍｅｎ、Ａ００－１－１１０２）
【0309】
ｂ）方法：
実施例６に基づき、ＣＤ３結合部分がＳＫ－ＢＲ３細胞の殺傷に対するｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの細胞毒性効果の改善に寄与するかどうかを決定するために、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するｒＨＥＲ２×ＣＤ３ＤおよびｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの殺傷効果を検出するｉｎｖｉｔｒｏ実験を行った。実験のために健康なドナーのＰＢＭＣからＴ細胞を精製した。
実施例６に基づき、ＣＤ３結合部分がＳＫ－ＢＲ３細胞の殺傷に対するｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの細胞毒性効果の改善に寄与するかどうかを決定するために、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するｒＨＥＲ２×ＣＤ３ＤおよびｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの殺傷効果を検出するｉｎｖｉｔｒｏ実験を行った。実験のために健康なドナーのＰＢＭＣからＴ細胞を精製した。
【0310】
表面にＨＥＲ２を高発現しているＳＫ－ＢＲ－３を細胞染色（ＦａｒＲｅｄ）で染色した。次いで、細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁した。続いて、細胞濃度を２×１０４細胞／ｍｌに調整した。健康なドナーのＰＢＭＣから精製したＴ細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁し、Ｔ細胞濃度を２×１０５細胞／ｍｌに調整した。最後に、ＰＢＭＣから精製したＴ細胞とＳＫ－ＢＲ－３を体積比１：１でよく混合した。
【0311】
ｒＨＥＲ２×ＣＤ３ＤまたはｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの濃度を０、２×１０－４、２×１０－３、２×１０－２、２×１０－１、２×１００、２×１０１、２×１０２、２×１０３および２×１０４ｐＭに連続希釈した。ＰＢＭＣから精製したＴ細胞とＳＫ－ＢＲ－３の細胞混合物（５０μｌ／ウェル）を９６ウェルプレートに加え、続いて段階希釈したｒＨＥＲ２×ＣＤ３ＤまたはｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄ（５０μｌ／ウェル）を細胞混合物に加えた。ｒＨＥＲ２×ＣＤ３ＤまたはｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの最終濃度は、０、１０－４、１０－３、１０－２、１０－１、１００、１０１、１０２、１０３及び１０４ｐＭに調整した。
【0312】
二特異性抗体と細胞の混合物を３７℃のインキュベーターで２４時間インキュベートした後、４００ｇで５分間遠心して上清を除去した。細胞をパンクレアチンで１０分間消化し、ＰＢＳ（２００μｌ／ウェル）で２回洗浄した。
【0313】
最後に、死細胞をＰＩで染色し、残存するＳＫ－ＢＲ－３細胞の量をフローサイトメトリーで解析して、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対する抗体媒介細胞傷害の殺傷効果を決定した。
【0314】
フローサイトメトリーを行う際、細胞懸濁液中のＳＫ－ＢＲ－３細胞を標識するためにＡＰＣチャンネルを用い（ファーレッド染色）、生細胞と死細胞を区別するためにＰＥチャンネルを用いた（ＰＩ染色）。ＰＩは死細胞を染色することができるので、フローサイトメトリーで分析したＡＰＣ陽性細胞とＰｉ陰性細胞（ＡＰＣ＋ＰＩ－）の数を用いて、残存するＳＫ－ＢＲ－３細胞を定量し、殺傷率を算出した。
【0315】
ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するＰＢＭＣから精製したＴ細胞の殺傷活性を媒介するｒＨＥＲ２×ＣＤ３ＤとｈＨＥＲ２Ｃ’Ｄ３Ｄの効果を比較するために、グラフの可視化にＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７ソフトウェアを使用し、半値最大効果濃度（ＥＣ５０）の算出に４パラメータフィッティング曲線の非線形回帰を使用した。ｒＨＥＲ２ＣＤ３Ｄの場合、ドナー１のＥＣ５０値は約７．６５ｐＭであり、ｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの場合、ドナー１のＥＣ５０値は約１２．７５ｐＭであった。ｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの場合、ドナー２のＥＣ５０値は約３．７３ｐＭであり、ｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの場合、ドナー２のＥＣ５０値は約７．２８ｐＭであった。したがって、ＣＤ３結合部分はｈＨＥＲ２×ＣＤ３ＤよりもｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄの方がＳＫ－ＢＲ３細胞の殺傷において有意に優れた細胞毒性効果に寄与している。図１５は、ｈＨＥＲ２×ＣＤ３ＤおよびｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄを介するＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するＴ細胞の殺傷効果を示す。
【0316】
実施例７ ｈＨＥＲ２×ＣＤ３ＤおよびｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄによって誘導されるＩＬ－６の放出
ａ）試薬と消耗品：
１．キット：ＬＥＧＥＮＤＭＡＸＴＭヒトＩＬ－６ＥＬＩＳＡ（バイオレジェンド、Ｂ３２９６７６）
２．テストサンプル：
（ｉ）実施例５のｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄからの上清；（ｉｉ）実施例５のｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄからの上清；
３．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
４．フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍｅｎ、Ａ００－１－１１０２）
ａ）試薬と消耗品：
１．キット：ＬＥＧＥＮＤＭＡＸＴＭヒトＩＬ－６ＥＬＩＳＡ（バイオレジェンド、Ｂ３２９６７６）
２．テストサンプル：
（ｉ）実施例５のｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄからの上清；（ｉｉ）実施例５のｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄからの上清；
３．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
４．フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍｅｎ、Ａ００－１－１１０２）
【0317】
ｂ）方法：
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、臨床で使用されるＴ細胞関与二特異性抗体の主な安全性の問題であるため、上清中のサイトカインの放出は、本出願の抗ＣＤ３二特異性抗体を投与する際の安全性に関係する。ＣＲＳを誘発するサイトカインには、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０などが含まれ、その中でＩＬ－６はＣＲＳの誘発において最も重要なサイトカインである。
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、臨床で使用されるＴ細胞関与二特異性抗体の主な安全性の問題であるため、上清中のサイトカインの放出は、本出願の抗ＣＤ３二特異性抗体を投与する際の安全性に関係する。ＣＲＳを誘発するサイトカインには、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０などが含まれ、その中でＩＬ－６はＣＲＳの誘発において最も重要なサイトカインである。
【0318】
ｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄは１０２ｐＭの濃度で最大の細胞毒性効果を示し、ｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄは１０４ｐＭの濃度でｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄと同等の細胞毒性効果を示した（図９）。そこで、抗体濃度１０２ｐＭと１０４ｐＭにおけるアンディボディ誘発細胞毒性とサイトカインＩＬ－６の放出の相関を解析した。表６に示すように、ｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄと比較して、ｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄが１０２ｐＭの濃度でＰＢＭＣによる腫瘍細胞死滅を有意に増加させた場合（５４．０５％ｖｓ１６．１８％）、ＩＬ－６放出レベルは有意に低かった（１７９５．５ｐｇ／ｍｌｖｓ２９２８．７９ｐｇ／ｍｌ）；ｈＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄと比較して、ｒＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄは１０４ｐＭの濃度で腫瘍細胞死滅をわずかに増加させたが（６１．９％ｖｓ５８．３５％）、ＩＬ－６放出レベルは有意に増加しなかった（３８３７ｐｇ／ｍｌｖｓ３２９５．８２ｐｇ／ｍｌ）。結論として、ハイブリドーマＨＥＲ２×ＣＤ３Ｄと比較して、組換えＨＥＲ２×ＣＤ３ＤはＰＢＭＣを介した抗腫瘍効果を増強するが、サイトカイン放出は少なく、臨床使用においてより安全な選択肢となる。
【0319】
【表6】
【0320】
実施例８ ハーセプチン×ＣＤ３二重特異性抗体によるＩｎｖｉｔｒｏＳＫ－ＢＲ３細胞死滅アッセイ
ａ）試薬と消耗品：
１．細胞株：ＳＫ－ＢＲ－３（ＡＴＣＣ♯ＨＴＢ－３０）
２．ＰＢＭＣ：健康なドナー♯１（リード、ＰＢＭＣ－２０２１０１０６０２）；健康なドナー♯２（リード、ＰＢＭＣ－２０２１０１１８０２）
３．ハーセプチン×ＣＤ３二重特異性抗体：
（ｉ）ハーセプチン×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２、実施例４で生成；
（ｉｉ）ハーセプチン×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２、実施例４で生成；
４．ＰＢＳ（センルイ、ＣＲ２００１２）
５．ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、２２４０００８９）
６．ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０４０６．０５）
７．ＣｅｌｌＴｒａｃｅ遠赤細胞増殖キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５７２）
８．ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（シグマ、Ｐ４１７０）
９．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
１０．フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍｅｎ、Ａ００－１－１１０２）
ｂ）方法：
異なるＣＤ３抗体によって産生された二重特異性抗体の薬力学的活性を比較するために、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するハーセプチン×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２およびハーセプチン×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２の殺傷効果を検出するｉｎｖｉｔｒｏ細胞実験を行った。
ａ）試薬と消耗品：
１．細胞株：ＳＫ－ＢＲ－３（ＡＴＣＣ♯ＨＴＢ－３０）
２．ＰＢＭＣ：健康なドナー♯１（リード、ＰＢＭＣ－２０２１０１０６０２）；健康なドナー♯２（リード、ＰＢＭＣ－２０２１０１１８０２）
３．ハーセプチン×ＣＤ３二重特異性抗体：
（ｉ）ハーセプチン×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２、実施例４で生成；
（ｉｉ）ハーセプチン×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２、実施例４で生成；
４．ＰＢＳ（センルイ、ＣＲ２００１２）
５．ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、２２４０００８９）
６．ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０４０６．０５）
７．ＣｅｌｌＴｒａｃｅ遠赤細胞増殖キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５７２）
８．ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（シグマ、Ｐ４１７０）
９．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
１０．フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍｅｎ、Ａ００－１－１１０２）
ｂ）方法：
異なるＣＤ３抗体によって産生された二重特異性抗体の薬力学的活性を比較するために、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するハーセプチン×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２およびハーセプチン×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２の殺傷効果を検出するｉｎｖｉｔｒｏ細胞実験を行った。
【0321】
まず、表面にＨＥＲ２を高発現しているＳＫ－ＢＲ－３を細胞染色（ＦａｒＲｅｄ）で染色した。次いで、細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁した。続いて、細胞濃度を８×１０５細胞／ｍｌに調整した。健康なドナーからのＰＢＭＣを１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁し、細胞濃度を８×１０６細胞／ｍｌに調整した。最後に、ＰＢＭＣとＳＫ－ＢＲ－３を体積比１：１でよく混合した。ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２またはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２の濃度を０、２×１００、２×１０１、２×１０２、２×１０３、２×１０４、１０５および２×１０５ｐＭに連続希釈した。ＰＢＭＣとＳＫ－ＢＲ－３の細胞混合物（５０μｌ／ウェル）を９６ウェルプレートに添加し、続いて段階希釈したハーセプチン×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２またはハーセプチン×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２（５０μｌ／ウェル）を添加した。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２またはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２の最終濃度は、０、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、５×１０４、１０５ｐＭに調整した。
【0322】
二特異性抗体と細胞の混合物を３７℃のインキュベーターで２４時間インキュベートした後、４００ｇで５分間遠心して上清を除去した。細胞をパンクレアチンで１０分間消化し、ＰＢＳ（２００μｌ／ウェル）で２回洗浄した。最後に、死細胞をＰＩで染色し、残存するＳＫ－ＢＲ－３細胞の量をフローサイトメトリーで解析して、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対する抗体媒介細胞傷害の殺傷効果を決定した。
【0323】
フローサイトメトリーを行う際、細胞懸濁液中のＳＫ－ＢＲ－３細胞を標識するためにＡＰＣチャンネルを用い（ファーレッド染色）、生細胞と死細胞を区別するためにＰＥチャンネルを用いた（ＰＩ染色）。ＰＩは死細胞を染色できるため、フローサイトメトリーで分析されたＡＰＣ陽性およびＰｉ陰性（ＡＰＣ＋ＰＴ－）細胞の数を最終的に使用して、残存ＳＫ－ＢＲ－３細胞を定量し、死滅率を計算した。
【0324】
ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するＰＢＭＣの殺傷活性媒介に対するハーセプチン×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２とハーセプチン×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２の効果を比較するために、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７ソフトウェアを使用してグラフを視覚化し、非線形回帰を行いました。４パラメータフィッティング曲線を使用して、最大効果濃度の半値（ＥＣ５０）を計算した。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２の場合、最初のドナーのＥＣ５０値は約６８０．７ｐＭ、２番目のドナーのＥＣ５０値は約８２．５８ｐＭである。ハーセプチン×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２の場合、最初のドナーのＥＣ５０値は約１００３ｐＭ、２番目のドナーのＥＣ５０値は約９４１．２ｐＭである。これらの結果は、ハーセプチン×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２と比較して、ハーセプチン×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２が腫瘍細胞に対して有意に優れた殺傷効果を有することを示した。図１０は、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するハーセプチン×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２およびハーセプチン×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２の殺傷効果を示す。
【0325】
実施例９ リツキシマブ×ＣＤ３二重特異性抗体によるＩｎｖｉｔｒｏＳＵ－ＤＨＬ－８細胞死滅アッセイ
ａ）試薬と消耗品：
１．細胞株：ＳＵ－ＤＨＬ－８（ＡＴＣＣ♯ＣＲＬ－２９６１）
２．ＰＢＭＣ：健康なドナー♯１（リード、ＰＢＭＣ－２０２０１２２１０１）；健康なドナー♯２（リード、ＰＢＭＣ－２０２１０１０６０２）
３．リツキシマブ×ＣＤ３二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２：
（ｉ）リツキシマブ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２、実施例４で生成。
（ｉｉ）リツキシマブ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２、実施例４で生成。
４．ＰＢＳ（センルイ、ＣＲ２００１２）
５．ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、２２４０００８９）
６．ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０４０６．０５）
７．ＣｅｌｌＴｒａｃｅ遠赤細胞増殖キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５７２）
８．ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（シグマ、Ｐ４１７０）
９．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
１０．フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍｅｎ、Ａ００－１－１１０２）
ａ）試薬と消耗品：
１．細胞株：ＳＵ－ＤＨＬ－８（ＡＴＣＣ♯ＣＲＬ－２９６１）
２．ＰＢＭＣ：健康なドナー♯１（リード、ＰＢＭＣ－２０２０１２２１０１）；健康なドナー♯２（リード、ＰＢＭＣ－２０２１０１０６０２）
３．リツキシマブ×ＣＤ３二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２：
（ｉ）リツキシマブ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２、実施例４で生成。
（ｉｉ）リツキシマブ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２、実施例４で生成。
４．ＰＢＳ（センルイ、ＣＲ２００１２）
５．ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、２２４０００８９）
６．ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０４０６．０５）
７．ＣｅｌｌＴｒａｃｅ遠赤細胞増殖キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５７２）
８．ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（シグマ、Ｐ４１７０）
９．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
１０．フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍｅｎ、Ａ００－１－１１０２）
【0326】
ｂ）方法：
異なるＣＤ３抗体によって産生された二重特異性抗体の薬力学的活性を比較するために、ＳＵ－ＤＨＬ－８細胞に対するリツキシマブ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２およびリツキシマブ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２の殺傷効果を検出するｉｎｖｉｔｒｏ細胞実験を行った。まず、表面にＣＤ２０を発現させたＳＵ－ＤＨＬ－８を細胞染色（ＦａｒＲｅｄ）で染色した。次いで、細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁した。続いて、細胞濃度を８×１０５細胞／ｍｌに調整した。健康なドナーのＰＢＭＣを１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁し、細胞濃度を８×１０６細胞／ｍｌに調整した。最後に、ＰＢＭＣとＳＵ－ＤＨＬ－８を体積比１：１でよく混合した。
異なるＣＤ３抗体によって産生された二重特異性抗体の薬力学的活性を比較するために、ＳＵ－ＤＨＬ－８細胞に対するリツキシマブ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２およびリツキシマブ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２の殺傷効果を検出するｉｎｖｉｔｒｏ細胞実験を行った。まず、表面にＣＤ２０を発現させたＳＵ－ＤＨＬ－８を細胞染色（ＦａｒＲｅｄ）で染色した。次いで、細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁した。続いて、細胞濃度を８×１０５細胞／ｍｌに調整した。健康なドナーのＰＢＭＣを１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁し、細胞濃度を８×１０６細胞／ｍｌに調整した。最後に、ＰＢＭＣとＳＵ－ＤＨＬ－８を体積比１：１でよく混合した。
【0327】
Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２またはＲｉｔｕｘｉｍａｂ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２の濃度を連続希釈した。ＰＢＭＣとＳＵ－ＤＨＬ－８の細胞混合物（５０μｌ／ウェル）を９６ウェルプレートに添加し、続いて連続希釈したリツキシマブ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２またはリツキシマブ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２（５０μｌ／ウェル）を細胞混合物に添加した。二特異性抗体と細胞の混合物を３７℃のインキュベーターで２４時間インキュベートした後、４００ｇで５分間遠心して上清を除去した。細胞をパンクレアチンで１０分間消化し、ＰＢＳ（２００μｌ／ウェル）で２回洗浄した。Ｕ－ＤＨＬ－８細胞をフローサイトメトリーで分析し、ＳＵ－ＤＨＬ－８細胞に対する抗体媒介細胞毒性の殺傷効果を測定した。フローサイトメトリーを実行する場合、ＡＰＣチャネルを使用して細胞懸濁液中のＳＵ－ＤＨＬ－８細胞を標識し（遠赤染色）、ＰＥチャネルを使用して生細胞と死細胞を区別した（ＰＩ染色）。ＰＩは死細胞を染色できるため、フローサイトメトリーで分析されたＡＰＣ陽性およびＰｉ陰性（ＡＰＣ＋ＰＴ－）細胞の数を最終的に使用して、残存ＳＵ－ＤＨＬ－８細胞を定量し、死滅率を計算した。リツキシマブ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２とリツキシマブ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２のＳＵ－ＤＨＬ－８細胞に対するＰＢＭＣの殺傷活性の仲介効果を比較するために、グラフの可視化にはＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７ソフトウェアを使用し、半値最大効果濃度（ＥＣ５０）の算出には４パラメータフィッティング曲線の非線形回帰を使用した。リツキシマブ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２の場合、最初のドナーのＥＣ５０値は約７２．８３ｐＭ、２番目のドナーのＥＣ５０値は約５９．９８ｐＭである。リツキシマブ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２の場合、最初のドナーのＥＣ５０値は約６０５．５ｐＭ、２番目のドナーのＥＣ５０値は約２７４．４ｐＭである。これらの結果から、リツキシマブ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２と比較して、リツキシマブ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２は腫瘍細胞に対する殺傷効果が有意に優れていることが示された。図１１はＳＵ－ＤＨＬ－８細胞に対するリツキシマブ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２およびリツキシマブ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２の殺傷効果を示す。
【0328】
実施例１０ グランザイムＢおよびパーフォリンの放出
ａ）試薬と消耗品：
１．検出キット：
（ｉ）グランザイムＢ ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｙｏｕ、ロット：２００７－１）；
（ｉｉ）パーフォリンＥＬＩＳＡキット（ダユー、ロット：２００８－１）
２．テストサンプル：
（ｉ）実施例８からの上清（健康なドナー♯１からのもの）。
（ｉｉ）実施例９からの上清（健康なドナー♯２からのもの）。
３．ＰＢＳ（センルイ、ＣＲ２００１２）
４．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
５．マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ）
ａ）試薬と消耗品：
１．検出キット：
（ｉ）グランザイムＢ ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｙｏｕ、ロット：２００７－１）；
（ｉｉ）パーフォリンＥＬＩＳＡキット（ダユー、ロット：２００８－１）
２．テストサンプル：
（ｉ）実施例８からの上清（健康なドナー♯１からのもの）。
（ｉｉ）実施例９からの上清（健康なドナー♯２からのもの）。
３．ＰＢＳ（センルイ、ＣＲ２００１２）
４．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
５．マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ）
【0329】
ｂ）方法：
グランザイムＢ／パーフォリン経路は、細胞傷害性リンパ球が腫瘍細胞を殺す主な機構と考えられた。組換えＣＤ３二重特異性抗体のＦ（ａｂ）’２断片がＰＢＭＣを媒介して標的細胞を殺すことができること、および細胞傷害効果がＣＤ３とＴ細胞間の相互作用に起因することを確認するために、グランザイムＢとパーフォリンの放出を定量した。
グランザイムＢ／パーフォリン経路は、細胞傷害性リンパ球が腫瘍細胞を殺す主な機構と考えられた。組換えＣＤ３二重特異性抗体のＦ（ａｂ）’２断片がＰＢＭＣを媒介して標的細胞を殺すことができること、および細胞傷害効果がＣＤ３とＴ細胞間の相互作用に起因することを確認するために、グランザイムＢとパーフォリンの放出を定量した。
【0330】
実施例８または９で収集した上清をサンプルとして使用し、グランザイムＢおよびパーフォリンの放出をグランザイムＢ／パーフォリンＥＬＩＳＡキットにより定量した。
【0331】
結果は、実施例８のハーセプチン×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２の上清について、グランザイムＢおよびパーフォリンの含有量がそれぞれ２１２３３．５７ｐｇ／ｍｌおよび１５９７．４５ｐｇ／ｍｌであることを示した。実施例９におけるリツキシマブ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２の上清については、グランザイムＢおよびパーフォリンの含有量はそれぞれ２４４１０．０４ｐｇ／ｍｌおよび１６７５．９７ｐｇ／ｍｌであった。リツキシマブ×ＵＣＨＴ１ Ｆ（ａｂ）’２の上清では、グランザイムＢとパーフォリンの含有量はそれぞれ４８８６３．１２ｐｇ／ｍｌと２１８３．４６ｐｇ／ｍｌであった。
【0332】
上記の結果は、本出願における組換えＣＤ３二重特異性抗体のＦ（ａｂ）’２断片が、グランザイムＢおよびパーフォリンの放出経路を介して腫瘍細胞の死滅を媒介することを示した。
【0333】
実施例１１ ハーセプチン×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２およびハーセプチン×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２によって誘導されるサイトカインＩＬ－６の放出
ａ）試薬と消耗品：
１．キット：ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘＴＭヒトＣＤ８／ＮＫペインパネル（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、７４０２６７）
２．テストサンプル：
（ｉ）実施例８の上清（健常ドナー♯１由来）；（ｉｉ）実施例９の上清（健常ドナー♯２由来）；
３．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
４．フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍｅｎ、Ａ００－１－１１０２）
ａ）試薬と消耗品：
１．キット：ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘＴＭヒトＣＤ８／ＮＫペインパネル（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、７４０２６７）
２．テストサンプル：
（ｉ）実施例８の上清（健常ドナー♯１由来）；（ｉｉ）実施例９の上清（健常ドナー♯２由来）；
３．Ｕ字型底プレート付き９６ウェルプレート（Ｊｅｔｂｉｏ、ＴＣＰ００２０９６）
４．フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍｅｎ、Ａ００－１－１１０２）
【0334】
ｂ）方法：
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、臨床で使用されるＴ細胞関与二特異性抗体の主な安全性の問題であるため、上清中のサイトカインの放出は、本出願の抗ＣＤ３二特異性抗体を投与する際の安全性に関係する。ＣＲＳを誘発するサイトカインには、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０などが含まれ、その中でＩＬ－６はＣＲＳの誘発において最も重要なサイトカインである。
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、臨床で使用されるＴ細胞関与二特異性抗体の主な安全性の問題であるため、上清中のサイトカインの放出は、本出願の抗ＣＤ３二特異性抗体を投与する際の安全性に関係する。ＣＲＳを誘発するサイトカインには、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０などが含まれ、その中でＩＬ－６はＣＲＳの誘発において最も重要なサイトカインである。
【0335】
実施例８および実施例９から採取した上清中のＩＬ－６レベルを、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘＴＭＨｕｍａｎＣＤ８／ＮＫＰａｎｅＰａｎｅｌキットにより測定した。上清中のＩＬ－６含量は、抗ＣＤ３抗体濃度１０５ｐＭで測定した。結果を表７に示す。
【0336】
その結果、実施例８の上清において、ハーセプチン×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２がハーセプチン×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２よりも有意に優れた殺腫瘍効果を示した場合、上清中のＩＬ－６の含量はほぼ同じであった。一方、リツキシマブ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２がリツキシマブ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２と比較的同様の殺腫瘍効果を示した実施例９の上清において、リツキシマブ×ＵＣＨＴ１Ｆ（ａｂ）’２の上清中のＩＬ－６の含量は、リツキシマブ×ＣＤ３ＤＦ（ａｂ）’２の上清中のＩＬ－６の含量よりも有意に高く、キットの検出上限値をさらに上回った。
【0337】
結論として、ＵＣＨＴ－１と比較して、抗ＣＤ３Ｄ二重特異性抗体はサイトカイン放出が低く、腫瘍細胞の死滅を媒介する際により安全であった。
【0338】
【表7】
【0339】
実施例１２ ヒト化抗ＣＤ３モノクローナル抗体
１２．１抗ＣＤ３モノクローナル抗体をコードするプラスミド構築物の調製
重鎖ベクターインサートまたは軽鎖ベクターインサートを、図１２に描かれているようにｐＴＴ５ベクター中の発現カセットにライゲーションした（ｐＴＴ５－ＨＣまたはｐＴＴ５－ＬＣと命名）。得られたシグナルペプチドを含むベクター＋インサートの塩基配列も決定し、コーディングＤＮＡの正しい読み枠と塩基配列を確認した。各プラスミドに挿入されるアミノ酸配列を表８に示す。
１２．１抗ＣＤ３モノクローナル抗体をコードするプラスミド構築物の調製
重鎖ベクターインサートまたは軽鎖ベクターインサートを、図１２に描かれているようにｐＴＴ５ベクター中の発現カセットにライゲーションした（ｐＴＴ５－ＨＣまたはｐＴＴ５－ＬＣと命名）。得られたシグナルペプチドを含むベクター＋インサートの塩基配列も決定し、コーディングＤＮＡの正しい読み枠と塩基配列を確認した。各プラスミドに挿入されるアミノ酸配列を表８に示す。
【0340】
【表8】
【0341】
表８によれば、Ｃ３０００はラット由来の抗ＣＤ３抗体であるのに対し、Ｃ３００２－１およびＣ３００２－２はヒト化抗ＣＤ３抗体である。
【0342】
１２．２トランスフェクション法
プラスミド ｐＴＴ５－ＨＣおよびｐＴＴ５－ＬＣをＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）－Ｓ細胞に一時的にトランスフェクトし、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を取得した。ＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）－Ｓ細胞を６．０×１０６細胞／ｍｌの密度で、ＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ中で３７℃で培養した。２つの溶液を次のように調製：１）解決策１：６４μｌのエクスピフェクタミンＣＨＯ試薬を８００μｌのＯｐｔｉＰＲＯ（登録商標）培地と混合した。２）解決策２：８μｇのｐＴＴ５－ＨＣおよび８μｇのｐＴＴ５－ＬＣの混合物を、８００μｌのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＣＨＯ試薬で希釈した。溶液１と溶液２を混合して、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ混合物を形成した。５分間のインキュベーション後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ混合物をＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）－Ｓ細胞培養物に添加して、２０ｍｌの培養系を形成した。細胞培養混合物は３７℃、８％ＣＯ２で培養された。
プラスミド ｐＴＴ５－ＨＣおよびｐＴＴ５－ＬＣをＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）－Ｓ細胞に一時的にトランスフェクトし、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を取得した。ＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）－Ｓ細胞を６．０×１０６細胞／ｍｌの密度で、ＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ中で３７℃で培養した。２つの溶液を次のように調製：１）解決策１：６４μｌのエクスピフェクタミンＣＨＯ試薬を８００μｌのＯｐｔｉＰＲＯ（登録商標）培地と混合した。２）解決策２：８μｇのｐＴＴ５－ＨＣおよび８μｇのｐＴＴ５－ＬＣの混合物を、８００μｌのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＣＨＯ試薬で希釈した。溶液１と溶液２を混合して、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ混合物を形成した。５分間のインキュベーション後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ混合物をＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）－Ｓ細胞培養物に添加して、２０ｍｌの培養系を形成した。細胞培養混合物は３７℃、８％ＣＯ２で培養された。
【0343】
１２．３タンパク質の発現
トランスフェクション２４時間後、１２０μＬのＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒと４．８ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）Ｆｅｅｄ溶液を１１．２から細胞培養に添加した。この培養液をさらに３１℃で７日間培養した。上清を遠心分離により回収した。
トランスフェクション２４時間後、１２０μＬのＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒと４．８ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）Ｆｅｅｄ溶液を１１．２から細胞培養に添加した。この培養液をさらに３１℃で７日間培養した。上清を遠心分離により回収した。
【0344】
１２．４精製
ステップ１１．３で得られた上清をＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅＬＸカラムで精製した。上清をｐＨ７．４ ＰＢＳで洗浄し、ｐＨ３．０ ０．１Ｍグリシンで溶出した。採取したサンプルはｐＨ８．０の１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液で中和した後、限外ろ過して溶出緩衝液をＰＢＳ溶液に置換した。精製サンプルは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによってさらに同定された。図１３Ａ～１３Ｆは、抗ＣＤ３ｍＡｂのウェスタンブロットおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。図１３Ａ、図１３Ｃと図１３Ｅは、それぞれＣ３０００、Ｃ３００２－１Ｃおよび３００２－２のウェスタンブロットの結果を示す。図１３Ｂの１行目１３Ｄと図１３Ｆは、それぞれＣ３０００、Ｃ３００２－１Ｃ、３００２－２の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。図１３Ｂの２行目、図１３Ｄおよび図１３Ｆは、それぞれＣ３０００、Ｃ３００２－１Ｃおよび３００２－２の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。
ステップ１１．３で得られた上清をＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅＬＸカラムで精製した。上清をｐＨ７．４ ＰＢＳで洗浄し、ｐＨ３．０ ０．１Ｍグリシンで溶出した。採取したサンプルはｐＨ８．０の１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液で中和した後、限外ろ過して溶出緩衝液をＰＢＳ溶液に置換した。精製サンプルは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによってさらに同定された。図１３Ａ～１３Ｆは、抗ＣＤ３ｍＡｂのウェスタンブロットおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。図１３Ａ、図１３Ｃと図１３Ｅは、それぞれＣ３０００、Ｃ３００２－１Ｃおよび３００２－２のウェスタンブロットの結果を示す。図１３Ｂの１行目１３Ｄと図１３Ｆは、それぞれＣ３０００、Ｃ３００２－１Ｃ、３００２－２の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。図１３Ｂの２行目、図１３Ｄおよび図１３Ｆは、それぞれＣ３０００、Ｃ３００２－１Ｃおよび３００２－２の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。
【0345】
１２．５抗ＣＤ３ｍＡｂＣ３０００Ｃ３００２－１Ｃおよび３００２－２からＣＤ３ｅおよびＣＤ３ｙヘテロ二量体タンパク質の結合親和性
ＥＬＩＳＡプレートに１００ｎｇ／ウェルのＣＤ３ε＆ＣＤ３γＨｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒＰｒｏｔｅｉｎを４℃で一晩コートし、さらにＰＢＳ中３％ ＢＳＡで２時間ブロッキングした後、連続希釈した抗ＣＤ３ｍＡｂＣ３０００、Ｃ３００２－１Ｃおよび３００２－２をプレートに添加し、３７℃で以下の時間インキュベートした。プレートを洗浄し乾燥させた後、検出抗体ＴＨＥＨｉｓＴａｇＡｎｔｉｂｏｄｙ［ＨＲＰ］を１００μＬ／ウェル添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し乾燥させた後、ＴＭＢ発色液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。発色後、５０μＬ／ｗｅｌｌの停止液を加え、発色反応を停止した。サンプルの最適密度は４５０ｎｍ（ＯＤ４５０）で測定された。図１４に示すように、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８ソフトウェアを使用して、ＣＤ３εおよびＣＤ３γヘテロ二量体タンパク質に対する抗ＣＤ３ｍＡｂＣ３０００、Ｃ３００２－１Ｃおよび３００２－２の結合親和性のグラフを視覚化した。図１４によると、ラット由来のＣ３０００と比較して、ヒト化抗ＣＤ３抗体Ｃ３００２－１Ｃおよび３００２－２は、ＣＤ３εおよびＣＤ３γヘテロ二量体タンパク質に対して同等の結合親和性を示す。
ＥＬＩＳＡプレートに１００ｎｇ／ウェルのＣＤ３ε＆ＣＤ３γＨｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒＰｒｏｔｅｉｎを４℃で一晩コートし、さらにＰＢＳ中３％ ＢＳＡで２時間ブロッキングした後、連続希釈した抗ＣＤ３ｍＡｂＣ３０００、Ｃ３００２－１Ｃおよび３００２－２をプレートに添加し、３７℃で以下の時間インキュベートした。プレートを洗浄し乾燥させた後、検出抗体ＴＨＥＨｉｓＴａｇＡｎｔｉｂｏｄｙ［ＨＲＰ］を１００μＬ／ウェル添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し乾燥させた後、ＴＭＢ発色液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。発色後、５０μＬ／ｗｅｌｌの停止液を加え、発色反応を停止した。サンプルの最適密度は４５０ｎｍ（ＯＤ４５０）で測定された。図１４に示すように、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８ソフトウェアを使用して、ＣＤ３εおよびＣＤ３γヘテロ二量体タンパク質に対する抗ＣＤ３ｍＡｂＣ３０００、Ｃ３００２－１Ｃおよび３００２－２の結合親和性のグラフを視覚化した。図１４によると、ラット由来のＣ３０００と比較して、ヒト化抗ＣＤ３抗体Ｃ３００２－１Ｃおよび３００２－２は、ＣＤ３εおよびＣＤ３γヘテロ二量体タンパク質に対して同等の結合親和性を示す。
【0346】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、そのような実施形態が例示としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本発明は、本明細書内で提供される特定の例によって限定されることを意図するものではない。本発明を前述の明細書を参照して説明してきたが、本明細書における実施形態の説明および図示は、限定的な意味で解釈されることを意図するものではない。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更、および置換を思いつくであろう。さらに、本発明のすべての態様は、様々な条件および変数に依存する、本明細書に記載の特定の描写、構成または相対的比率に限定されないことを理解されたい。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替案が、本発明を実施する際に使用され得ることを理解されたい。したがって、本発明は、そのような代替物、修正物、変形物、または均等物も網羅するものと考えられる。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、およびそれらの均等物がそれによってカバーされることが意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A-F】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】