▶ ユニバーシティ カレッジ カーディフ コンサルタンツ リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-21
(54)【発明の名称】改変アデノウイルス
(51)【国際特許分類】
C12N 7/01 20060101AFI20240313BHJP
C12N 15/42 20060101ALI20240313BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240313BHJP
C07K 14/09 20060101ALI20240313BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240313BHJP
C12N 15/34 20060101ALI20240313BHJP
C07K 14/075 20060101ALI20240313BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240313BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240313BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20240313BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240313BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240313BHJP
【ＦＩ】
C12N7/01
C12N15/42 ZNA
C12N15/12
C07K14/09
C07K14/705
C12N15/34
C07K14/075
A61P35/00
A61P35/02
A61K35/761
A61K48/00
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023559760
(86)(22)【出願日】2022-03-24
(85)【翻訳文提出日】2023-11-21
(86)【国際出願番号】 GB2022050745
(87)【国際公開番号】W WO2022208056
(87)【国際公開日】2022-10-06
(31)【優先権主張番号】2104409.4
(32)【優先日】2021-03-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2115496.8
(32)【優先日】2021-10-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2200186.1
(32)【優先日】2022-01-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501125275
【氏名又は名称】ユニバーシティ カレッジ カーディフ コンサルタンツ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100203208
【弁理士】
【氏名又は名称】小笠原 洋平
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】パーカー，アラン
(72)【発明者】
【氏名】デイヴィス，ジェイムズ
(72)【発明者】
【氏名】ベイツ，エミリー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AA97Y
4B065AB10
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA44
4C084AA13
4C084MA16
4C084MA17
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA56
4C084MA59
4C084MA63
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087MA16
4C087MA17
4C087MA52
4C087MA55
4C087MA56
4C087MA59
4C087MA63
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045AA10
4H045BA17
4H045BA41
4H045CA01
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、改変低血清有病率アデノウイルス；それを含む医薬組成物；およびそれを使用してがんを治療する方法に関する。
【選択図】図７Ａ
【選択図】図７Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血清型１０の改変Ｄ種ヒトアデノウイルスＨＡｄＶ－Ｄ１０であって、口蹄疫ウイルスに対して天然の、Ａ２０と呼ばれる２０アミノ酸ペプチド、ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ（配列番号１）を含むかまたはそれからなる（ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０と呼ばれる）、αｖβ６インテグリンに対して選択的親和性を有する結合エピトープと、以下の特徴：
ａ）０．００１μｇ／１０５細胞を超えるコクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）についてのＩＣ５０；および／または
ｂ）ヒト凝固第Ｘ因子（ＦＸ）に対する結合の欠如；および／または
ｃ）血清中和抗ＨＡｄＶ－Ｃ抗体の存在下での形質導入能力
のいずれか１つ以上とを含む、改変Ｄ種ヒトアデノウイルスＨＡｄＶ－Ｄ１０。
【請求項2】
前記Ａ２０ペプチドが、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブタンパク質のＤＧループに挿入されている、請求項１に記載の改変アデノウイルス。
【請求項3】
前記コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）についての前記ＩＣ５０が、０．００２μｇ／１０５細胞を超えるか、または約０．００３μｇ／１０５細胞である、請求項１または２に記載の改変アデノウイルス。
【請求項4】
ＨＡｄＶ－Ｄ１０が、ＨＡｄＶ－Ｃ５よりも明らかに１０倍低い親和性または１５倍低い親和性または１６．５倍低い親和性でＣＡＲに結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項5】
ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０がＦＸ相互作用のための重要な結合残基を欠き、したがってＦＸに係合することができない、請求項１～４のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項6】
前記ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０が、他のアデノウイルスに対する既存の免疫の存在によって影響されない、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項7】
少なくとも１つの導入遺伝子をコードする分子が前記アデノウイルスに挿入される、請求項１～６のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項8】
前記分子が、少なくとも１つの導入遺伝子または各導入遺伝子をコードするｃＤＮＡである、請求項７に記載の改変アデノウイルス。
【請求項9】
前記アデノウイルスが、ｐＲＢ欠損細胞へのウイルス複製を制限するために、Ｅ１Ａ遺伝子に２４塩基対の欠失ｄｌ９２２－９４７（Δ２４変異）を含むようにさらに改変される、請求項１～８のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項10】
前記アデノウイルスが、腫瘍溶解効力を高めるために、Ｅ３／１９Ｋ（Ｔ１変異）の小胞体（ＥＲ）保持ドメイン内の位置４４５に単一アデニン塩基付加を含むようにさらに改変される、請求項１～９のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項11】
前記アデノウイルスが、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）を含むようにさらに改変される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項12】
前記ＡＤＰが、Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６およびＡｄ５７を含む群から選択されるアデノウイルスに由来する、請求項１１に記載の改変アデノウイルス。
【請求項13】
前記アデノウイルスがさらに改変され、ウイルス増殖を改善するためにＥ４ｏｒｆ６領域がＨＡｄＶ－Ｃ５ Ｅ４ｏｒｆ６で置き換えられる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の改変アデノウイルスと、薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項15】
有効量の、請求項１～１３のいずれか一項に記載の改変アデノウイルスまたは請求項１４に記載の組成物を患者に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法。
【請求項16】
医薬品として使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の改変アデノウイルス。
【請求項17】
がんの治療に使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の改変アデノウイルスまたは請求項１４に記載の組成物。
【請求項18】
がんを治療するための医薬品の製造における、請求項１～１３のいずれか一項に記載の改変アデノウイルスまたは請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項19】
前記がんが、鼻咽頭がん、滑膜がん、肝細胞がん、腎臓がん、結合組織のがん、黒色腫、肺がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、脳がん、咽喉がん、口腔がん、肝臓がん、骨がん、膵臓がん、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、尿管がん、脳がん、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨がん、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明のがん、カルチノイド、消化管のカルチノイド、線維肉腫、乳がん、パジェット病、子宮頸がん、結腸直腸がん、直腸がん、食道がん、胆嚢がん、頭部がん、眼がん、頸部がん、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肝臓がん、カポジ肉腫、前立腺がん、肺がん、精巣がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔がん、皮膚がん、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、内分泌膵臓がん、グルカゴノーマ、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体がん、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸がん、胃がん、胸腺がん、甲状腺がん、トロホブラストがん、胞状奇胎、子宮がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、聴神経腫、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉がん、心臓がん、口唇がん、髄膜がん、口こうがん、神経がん、口蓋がん、耳下腺がん、腹膜がん、咽頭がん、胸膜がん、唾液腺がん、舌がんおよび扁桃腺がんを含む群から選択される、請求項１５に記載の方法、または請求項１６もしくは１７に記載の改変アデノウイルス、または請求項１８に記載の使用。
【請求項20】
前記がんが、卵巣がん、膵臓がん、食道がん、肺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、口腔がん、喉頭がん、皮膚がん、乳がん、腎臓がん、および結腸直腸がんを含む群から選択される、請求項１５に記載の方法、または請求項１６もしくは１７に記載の改変アデノウイルス、または請求項１８に記載の使用。
【請求項21】
アデノウイルスに対して既存の免疫を示す対象におけるがんの治療に使用するための請求項１～１３のいずれか一項に記載の改変アデノウイルスまたは請求項１４に記載の組成物。
【請求項22】
前記対象が、ＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－Ｅ４、ＨＡｄＶ－Ｂ１１、ＨＡｄＶ－Ｄ２６、ＨＡｄＶ－４８、キメラＨＡｄＶ－５／３およびＣｈｉｍｐアデノウイルスのうちのいずれか１つ以上に対する既存の免疫を示す、請求項２１に記載の改変アデノウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、改変低血清有病率アデノウイルス；それを含む医薬組成物；およびそれを使用してがんを治療する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ウイルス療法は、細胞に感染し、細胞内で複製し、細胞を溶解するウイルスの天然の能力を利用し、この能力を腫瘍細胞に対して特異的に誘導する。この細胞死の溶菌性は高度に免疫原性であり、対応するＣＤ８＋媒介活性化および免疫細胞媒介細胞殺傷を伴う腫瘍微小環境への免疫動員の増強をもたらす。エコーウイルスおよびレオウイルスなどの特定のウイルスは、他のウイルスが、腫瘍選択性を高め、細胞殺傷を高めるために遺伝子操作を必要とするのに対し、天然の腫瘍溶解能を有し得るため、より有効ながん治療の開発につながる。
【0003】
アデノウイルス感染症は、ヒトおよび動物集団に広く分布している。ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ）による感染は、広範囲の臨床病理をもたらし得るが、感染の大部分は無症候性または急性かつ自己限定性である。
【0004】
ＨＡｄＶは、９０～１００ｎｍの非エンベロープウイルスであり、突出したファイバータンパク質を有する正二十面体構造に配置されている。カプシドは、２４０個の三量体ヘキソンタンパク質で構成され、各頂点に五量体ペントンベース複合体が位置する。アデノウイルス構造は広く概説されている。血清学的試験に基づいて７つの種（Ａ～Ｇ）に分けられた５７個の標準的なＨＡｄＶ血清型がある。１００を超える新規アデノウイルス血清型が今日までに単離されている。一次受容体結合はアデノウイルス血清型に依存するが、一般にＡ、Ｃ、ＥおよびＦ種はコクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）と相互作用し、Ｂ種血清型はＣＤ４６および／またはデスモグレイン２（ＤＳＧ２）を使用する。Ｄ種はアデノウイルス種の中で最大であるが、多くの血清型はあまり理解されていない。ＨＡｄＶ－Ｄ２６およびＨＡｄＶ－Ｄ３７を含むいくつかのＤ種血清型は、細胞侵入のためにシアル酸に結合する。種内でのこの受容体使用の程度は完全には理解されていない。
【0005】
アデノウイルスベクターは、遺伝子治療のためのベクターおよび腫瘍溶解性ウイルスに対するワクチンに及ぶ重要な臨床用途を有する。いくつかの腫瘍溶解性ＨＡｄＶウイルス療法が臨床治験に入り、安全性および実現可能性が実証されているが、送達および有効性には、腫瘍溶解性アデノウイルスが有効ながん治療法として使用され得る前に、最適化が必要である。
【0006】
臨床的および実験的に最も広く評価されたＨＡｄＶは、Ｃ種５型、ＨＡｄＶ－Ｃ５に基づく。しかしながら、ＨＡｄＶ－Ｃ５ベースのベクターの使用に関連する制限がある。ＨＡｄＶ－Ｃ５は、細胞間のタイトジャンクションに局在し、身体全体にわたって遍在的に発現されるＣＡＲに結合する。さらに、ＣＡＲは、特定のがんにおいてダウンレギュレートされることが報告されており、したがって、活性ながん標的化のための受容体としてのＣＡＲの有用性を制限する。ＨＡｄＶ－Ｃ５は、肝臓への形質導入を媒介し、肝毒性をもたらし得るヘキソンタンパク質を介して、血清中のヒト凝固第Ｘ因子（ＦＸ）と相互作用することも知られている。集団のかなりの割合が急性アデノウイルス感染を経験しており、多くは一般的なＨＡｄＶ血清型に対する中和抗体を発達させており、したがって全身送達された治療用ベクターを迅速に不活性化するので、高レベルのＨＡｄＶ－Ｃ５既存免疫はまた、潜在的なＨＡｄＶ－Ｃ５ベースの腫瘍溶解性ウイルス療法の臨床的有効性を低下させる可能性がある。
【0007】
抗腫瘍免疫の活性化は、先天性宿主抗ウイルス免疫応答を弱める一方で、腫瘍溶解性アデノウイルス療法の成功に不可欠である。本発明者らの研究室における以前の研究は、ＨＡｄＶ－Ｃ５ＮＵＬＬ－Ａ２０ベクターの作製を通じて上記の制限に対処してきた（２７）。得られたＡｄ５ＮＵＬＬベクターを、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に対して天然のＡ２０と呼ばれる２０アミノ酸ペプチドであるＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴを挿入することによって、αｖβ６インテグリンに再標的化した。Ａ２０改変ウイルスは、乳がん、卵巣がん、膵臓がんおよび結腸直腸がんを含むいくつかのがん種においてアップレギュレートされる表面タンパク質であるαｖβ６インテグリンを発現する細胞に選択的に感染した。
【0008】
ここで、本発明者らは、Ｄ種アデノウイルス、ＨＡｄＶ－Ｄ１０を改変した。ＨＡｄＶ－Ｄ１０は、角結膜炎患者の眼から単離される稀な血清型である。その構造および宿主細胞受容体との相互作用はあまり理解されていない。本発明者らは、このウイルスを最適化して、腫瘍への最適な送達のための血清有病率の低い、高度に腫瘍選択的な薬剤を作製した。
【0009】
ＨＡｄＶ－Ｄ１０の結晶構造の作製に続いて、本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０が、ＣＡＲおよびシアル酸の両方と弱く相互作用し、したがってその形質導入有効性を高めるために改変を必要とするファイバーノブタンパク質を有することを発見した。これはまた、ＨＡｄＶ－Ｄ１０が典型的な宿主細胞結合受容体を介して機能しないことも伴い、これは、特定のがんがそのような典型的な結合タンパク質をダウンレギュレートすることを考えると有利であり得る。したがって、本発明者らは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に対して天然のＡ２０ペプチドを使用してαｖβ６インテグリンを組換え発現させることによって、ＨＡｄＶ－Ｄ１０をがん細胞に標的化した。次いで、本発明者らは、αｖβ６インテグリン陽性がん細胞株の感染性および選択的殺傷の改善を実証した。さらに、本発明者らはまた、驚くべきことに、ＨＡｄＶ－Ｄ１０がヒト凝固第Ｘ因子（ＦＸ）に結合せず、したがって、より典型的な感染性アデノウイルス血清型（例えばＨＡｄＶ－Ｃ５）に一般的な肝毒性およびオフサイト標的化を回避することを発見した。さらに、注目すべきことに、改変ウイルスはまた、ヒト血清中の中和を回避し、したがって臨床的有効性を維持する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の第１の態様によれば、血清型１０の改変Ｄ種ヒトアデノウイルスＨＡｄＶ－Ｄ１０であって、
口蹄疫ウイルスに対して天然のＡ２０と呼ばれる２０アミノ酸ペプチドであるＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ（配列番号１）を含むかまたはそれからなる（ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０と呼ばれる）、αｖβ６インテグリンに対して選択的親和性を有する結合エピトープと、以下の特徴：
ａ）０．００１μｇ／１０５細胞を超えるコクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）についてのＩＣ５０；および／または
ｂ）ヒト凝固第Ｘ因子（ＦＸ）に対する結合の欠如；および／または
ｃ）血清中和抗体の存在下での形質導入能力
のいずれか１つ以上とを含む、改変Ｄ種ヒトアデノウイルスＨＡｄＶ－Ｄ１０が提供される。
口蹄疫ウイルスに対して天然のＡ２０と呼ばれる２０アミノ酸ペプチドであるＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ（配列番号１）を含むかまたはそれからなる（ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０と呼ばれる）、αｖβ６インテグリンに対して選択的親和性を有する結合エピトープと、以下の特徴：
ａ）０．００１μｇ／１０５細胞を超えるコクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）についてのＩＣ５０；および／または
ｂ）ヒト凝固第Ｘ因子（ＦＸ）に対する結合の欠如；および／または
ｃ）血清中和抗体の存在下での形質導入能力
のいずれか１つ以上とを含む、改変Ｄ種ヒトアデノウイルスＨＡｄＶ－Ｄ１０が提供される。
【0011】
本発明の改変ＨＡｄＶ－Ｄ１０ウイルスは、他の血清型には典型的に必要とされる複数の改変を必要とせず、有害なオフサイト標的化を防止するので、また、顕著な臓器特異的標的化を示し、ＨＡｄＶ免疫反応性宿主血清において活性の喪失を経験しないので、有利である。
【0012】
当業者に知られているように、ヒトでは、以下の７つの種（ヒトアデノウイルスＡ～Ｇ）に分類される５７の認められたヒトアデノウイルス血清型（Ａｄ－１～５７）がある：Ａ－１２、１８、３１；Ｂ－３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、５０、５５；Ｃ－１、２、５、６、５７；Ｄ－８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３６、３７、３８、３９、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５１、５３、５４、５６；Ｅ－４；Ｆ－４０、４１；およびＧ－５２。したがって、本明細書におけるＨＡｄＶ－Ｄ１０への言及は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢ７２４３５１．１およびそこに記載されたタンパク質ドメイン配列によるものなどのアデノウイルスのＤサブクラスに属するアデノウイルス血清型１０を指す。
【0013】
本発明の好ましい実施形態では、上記Ａ２０ペプチドは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢ７２４３５１．１、具体的にはアクセッションＢＡＭ６６６９８に記載されるような、ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０ファイバーノブタンパク質のＤＧループに、好ましくはファイバーノブタンパク質のアミノ酸３０４～３０５の間の位置で、挿入される。予想外にも、Ａ２０結合エピトープまたは標的化ペプチドを、（アデノウイルス血清型５、Ａｄ５について典型的に行われるように）Ｈ１ループなどのファイバーノブタンパク質の他の位置に挿入しようとすると、ウイルス粒子形成が防止されることが分かった。したがって、これは、結合エピトープのための好ましい挿入ループを示す傾向がある。本発明の一実施形態では、位置３０４～３０５での上記ＤＧループへの挿入は、ＳＫＫＹなどの短いペプチド配列またはリンカーの使用を含む。しかしながら、当業者が理解するように、同等の効果を有する他のアミノ酸またはペプチドリンカーを使用してもよい。
【0014】
本発明者らは、本明細書において、ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０が腫瘍選択的細胞侵入受容体としてαｖβ６インテグリンに係合して利用することができ、この機能がＡ２０ペプチド（配列番号１）によって媒介されることを示す。Ａ２０は元々、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）カプシドタンパク質ＶＰ１に由来し、αｖβ６インテグリンに対して天然の高い親和性を有する。αｖβ６インテグリンは、卵巣がんの３分の１および様々な他の上皮がんで発現され、健康な成人組織では検出不可能である。したがって、当業者には理解されるように、改変ウイルスにおけるこの配列の発現および組み込みによって、改変ウイルスは、限定されないが、肺がん、乳がん、食道扁平上皮癌、卵巣がん、膵臓がん、子宮頸がん、頭頸部がん、口腔がん、喉頭がん、皮膚がん、腎臓がんおよび結腸直腸がん細胞などのがんにおいて、αｖβ６インテグリンを選択的に標的とすることができる。本発明者らはまた、本明細書において、αｖβ６インテグリンを発現しない細胞（例えば、Ａ５４９細胞）においてＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０による細胞殺傷がなく、したがって、αｖβ６インテグリン組換え結合特徴の選択性を実証することを示す。この点で、本発明者らの研究は、肝臓、肺、心臓、腎臓および脾臓におけるレベルと比較して、腫瘍においてＨＡｄＶ－Ｄ．Ａ２０の有意な増加が観察されたことを示した（ｐ＝＜０．０５）。
【0015】
本発明のさらに好ましい実施形態では、上記改変Ｄ種ヒトアデノウイルス、ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０は、０．００２μｇ／１０５細胞を超える、より好ましくは約０．００３μｇ／１０５細胞、すなわち０．００２９８５μｇ／１０５細胞である、コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）についてのＩＣ５０を有し、すなわち、ＨＡｄＶ－Ｄ１０は、コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）に対する結合パートナーを有し、細胞形質導入を促進するＨＡｄＶ－Ｃ５よりも明らかに１０倍低い親和性、または１５倍低い親和性、または１６．５倍低い親和性でＣＡＲに結合する。これは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０がαｖβ６インテグリン結合を通じて優先的に作用することを意味する。
【0016】
本発明のさらに好ましい実施形態では、上記改変Ｄ種ヒトアデノウイルス、ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０は、ＦＸ相互作用のための重要な結合残基を欠いており、したがって細胞侵入の手段としてＦＸに係合して利用することができず、肝毒性を誘発することも疑われない。これは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０がより安全な治療薬であることを意味する。
【0017】
多くのアデノウイルスに基づく治療の有効性低下の一因となる主な障害は、そのようなアデノウイルスに対する既存の免疫を呈する患者の割合である。代替的な単離されることが稀な血清型であるＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０の使用は、より広い集団に有効な治療法を提供するが、患者がその疾患治療レジメンの経過にわたってＨＡｄＶ－Ｃ５ベースのウイルス療法などのＨＡｄＶ療法に対する免疫を発達させた場合には、有益な第２の治療ラインも提供する。
【0018】
なおさらなる好ましい実施形態では、上記アデノウイルスは、限定されないが、治療剤などの薬剤をコードする導入遺伝子である分子を含むようにさらに改変される。したがって、この実施形態は、標的がん細胞に対して治療作用を発揮するため薬剤の細胞内送達に関する。薬剤の例としては、免疫応答を直接刺激する薬剤、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２；免疫系を間接的に刺激する薬剤、例えば、抗体（または抗体の断片）、共抑制因子を阻害する免疫チェックポイント阻害剤、例えばＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１またはＬａｇ３；二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）抗体構築物；二重特異性ナチュラルキラー細胞誘導（ＢｉＫＥ）抗体構築物；例えばＣＤ１９をコードする細胞ベースの免疫療法に対して腫瘍を感作する薬剤；腫瘍微小環境内の調節性Ｔ細胞を枯渇させる薬剤、抗ＣＤ２５抗体；放射線療法またはイメージングのために、例えばナトリウム／ヨウ化物共輸送体（ＮＩＳ）またはソマトスタチン受容体２型（ＳＳＴＲ２）をコードすることによって腫瘍を感作する薬剤が挙げられる。代替的に、導入遺伝子は、例えば導入遺伝子Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ（ＲＥＩＣ／ＤＫＫ３）、または非毒性プロドラッグの毒性薬物への変換によってがん細胞を感作する酵素、例えばシトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、チミジンキナーゼをコードすることによって、腫瘍細胞に直接毒性である治療剤をコードすることができる。当技術分野で知られている、がんの治療に有用な他の導入遺伝子を、本発明の実施において使用してもよい。
【0019】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、上記改変アデノウイルスは、本明細書に記載の少なくとも１つの導入遺伝子をコードする分子を含み、理想的には上記分子はｃＤＮＡである。
【0020】
なおさらなる好ましい実施形態では、上記アデノウイルスは、ウイルス複製を制限するために、アクセッション番号ＡＢ７２４３５１．１に記載されるように、Ｅ１Ａ遺伝子の位置１０３～１１０（ＬＲＣＹＥＥＧＦ；配列番号２）に８アミノ酸欠失を含むようにさらに改変される。この欠失は、ＨＡｄＶ－５における対応する欠失と比較した図１２を考慮して最もよく示される。
【0021】
さらにより好ましくは、代替的に、上記アデノウイルスは、ウイルス複製を欠損させるために、Ｅ１および／またはＥ３遺伝子の１つ以上を欠失させるようにさらに改変される。しかしながら、理解されるように、がん溶解性ウイルス療法の目的のために、ウイルスは複製能があることが好ましい。
【0022】
なおさらなる好ましい実施形態では、上記アデノウイルスは、ｐＲＢ欠損細胞へのウイルス複製を制限するために、Ｅ１Ａ遺伝子に２４塩基対の欠失ｄｌ９２２－９４７（Δ２４変異）を含むようにさらに改変される。
【0023】
さらにより好ましくは、上記アデノウイルスは、腫瘍溶解効力を高めるために、Ｅ３／１９Ｋ（Ｔ１変異）の小胞体（ＥＲ）保持ドメイン内の位置４４５に単一アデニン塩基付加を含むようにさらに改変される。
【0024】
なおさらなる好ましい実施形態では、上記アデノウイルスは、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）を含むようにさらに改変される。当業者に知られているように、ＡＤＰは、最終的に感染細胞の核膜、小胞体およびゴルジに局在し、Ａｄ１（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号ＡＡＱ１０５６０．１）、Ａｄ２（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号ＡＡＡ９２２２２．１）、Ａｄ５（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号ＡＰ＿０００２２１．２）、Ａｄ６（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号ＡＣＮ８８１２１．１）、およびＡｄ５７（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号ＡＤＭ４６１６３．１）を含むいくつかのアデノウイルス血清型のＥ３転写単位にコードされるＩＩＩ型膜糖タンパク質である。ＡＤＰは、細胞周期調節、アポトーシス阻害、免疫回避およびウイルスＤＮＡ複製に影響を及ぼすウイルスタンパク質が発現される感染初期には、Ｅ３プロモーターから低レベルで天然に発現されるが、子孫ビリオンが組み立てられるウイルス複製サイクル後期には、ＡＤＰは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）から高レベルで発現され、膜破裂に寄与して組み立てられたビリオンを放出すると考えられている。したがって、ＡＤＰタンパク質を組み込むことによって、がん細胞選択性と組み合わせてがん細胞死を促進する治療用アデノウイルスの腫瘍溶解能が改善される。好ましくは、ＡＤＰは、Ａｄ１（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号ＡＡＱ１０５６０．１）、Ａｄ２（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号ＡＡＡ９２２２２．１）、Ａｄ５（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号ＡＰ＿０００２２１．２）、Ａｄ６（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号ＡＣＮ８８１２１．１）、およびＡｄ５７（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号ＡＤＭ４６１６３．１）を含む群から、より好ましくはＡｄ２（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号ＡＡＡ９２２２２．１）またはＡｄ５（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号ＡＰ＿０００２２１．２）を含む群から選択される。
【0025】
好ましい実施形態では、上記導入遺伝子および／またはＡＤＰは、Ｅ１および／またはＥ３領域に、理想的には、発現のための天然プロモーターの制御下で、または代替的には、限定されないが、ＣＭＶプロモーターなどの当技術分野で知られている非天然で強力な発現プロモーターを使用して挿入される。
【0026】
さらにより好ましくは、上記アデノウイルスはさらに改変され、ウイルス増殖を改善するためにＥ４ｏｒｆ６領域はＨＡｄＶ－Ｃ５ Ｅ４ｏｒｆ６で置き換えられる。
【0027】
上記から、本発明の改変アデノウイルスは、がん細胞を標的とし、がんに対する応答を、特に腫瘍環境において刺激するように操作されていることになる。
【0028】
したがって、さらなる態様では、本発明は、本発明による改変アデノウイルスと、薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【0029】
医薬に使用するための化合物は、一般に、医薬組成物または獣医用組成物で提供され、したがって、本発明のさらなる第５の態様によれば、本明細書で定義されるアデノウイルスと、薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
【0030】
適切な医薬賦形剤は、当業者に周知である。医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば、経口、頬側、経鼻または気管支（吸入）、経皮または非経口による投与のために製剤化することができ、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製することができる。
【0031】
組成物は、上記で定義されたアデノウイルスを担体と会合させることによって調製することができる。一般に、製剤は、アデノウイルスを液体担体または細かく分割された固体担体またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで必要に応じて産生物を成形することによって調製される。本発明は、上記で定義されたアデノウイルスを薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルと結合または会合させることを含む医薬組成物を調製するための方法に及ぶ。
【0032】
したがって、なおさらなる態様では、本発明は、本発明による改変アデノウイルスを含む有効量の組成物を患者に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法に関する。
【0033】
本明細書におけるアデノウイルスまたはそれを含む組成物の「有効量」への言及は、がん細胞死などの所望の生物学的効果を達成するのに十分な量に対するものである。有効投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態および体重、もしあれば併用治療の種類、治療の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存することが理解される。典型的には、有効量は、治療を施す者によって決定される。
【0034】
本発明のさらなる態様によれば、医薬品として使用するための本明細書で定義される改変アデノウイルスが提供される。
【0035】
本発明のなおさらなる態様によれば、がんの治療に使用するための本明細書で定義される改変アデノウイルスが提供される。
【0036】
本発明のなおさらなる態様によれば、がんを治療するための医薬品の製造における本明細書で定義される改変アデノウイルスの使用が提供される。
【0037】
上記から、本発明は、がん標的化に最適化され、驚くべきことに、ヒト凝固第Ｘ因子（ＦＸ）への結合の欠如および／または血清中和抗体、特に抗ＨＡｄＶ－Ｃ５抗体の存在下での形質導入能などの有利な特徴を有することが見出された改変アデノウイルスの使用に関する。
【0038】
最も好ましくは、本明細書で言及されるがんには、以下のがんのいずれか１つ以上が含まれる：鼻咽頭がん、滑膜がん、肝細胞がん、腎臓がん、結合組織のがん、黒色腫、肺がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、脳がん、咽喉がん、口腔がん、肝臓がん、骨がん、膵臓がん、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、尿管がん、脳がん、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨がん、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明のがん、カルチノイド、消化管のカルチノイド、線維肉腫、乳がん、パジェット病、子宮頸がん、結腸直腸がん、直腸がん、食道がん、胆嚢がん、頭部がん、眼がん、頸部がん、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肝臓がん、カポジ肉腫、前立腺がん、肺がん、精巣がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔がん、皮膚がん、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、内分泌膵臓がん、グルカゴノーマ、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体がん、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸がん、胃がん、胸腺がん、甲状腺がん、トロホブラストがん、胞状奇胎、子宮がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、聴神経腫、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉がん、心臓がん、口唇がん、髄膜がん、口こうがん、神経がん、口蓋がん、耳下腺がん、腹膜がん、咽頭がん、胸膜がん、唾液腺がん、舌がんおよび扁桃腺がん。
【0039】
より好ましくは、上記がんは、卵巣がん、膵臓がん、食道がん、肺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、口腔がん、喉頭がん、皮膚がん、乳がん、腎臓がん、および結腸直腸がんを含む群から選択される。
【0040】
さらなる態様によれば、アデノウイルスに対して、例えば、限定されないが、ＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－Ｅ４、ＨＡｄＶ－Ｂ１１、ＨＡｄＶ－Ｄ２６、ＨＡｄＶ－４８、キメラＨＡｄＶ－５／３およびＣｈｉｍｐアデノウイルスの１つ以上に対して既存の免疫を示す対象において、がんの治療に使用するためのアデノウイルス、およびその使用を含む方法が提供される。当業者に知られているように、既存の免疫は、目的のアデノウイルスに対する宿主血清中和アデノウイルス抗体の検出などの当業者に知られている多数の手段によって決定することができる。
【0041】
以下の特許請求の範囲および本発明の前述の説明では、文脈上、明示的な言語または必要な含意により他の意味に解釈すべき場合を除いて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は包括的な意味で使用され、すなわち、記載された特徴の存在を特定するが、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除するものではない。
【0042】
本明細書で引用される任意の特許または特許出願を含むすべての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる参考文献も先行技術を構成することを認めるものではない。さらに、先行技術のいずれかが当技術分野における共通の一般知識の一部を構成することを認めるものではない。
【0043】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかに関連して説明したとおりであり得る。
【0044】
本発明の他の特徴は、以下の例から明らかになるであろう。一般的に言えば、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲および図面を含む）に開示された特徴の任意の新規なもの、または任意の新規な組み合わせに及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施形態または例に関連して記載される特徴、整数、特性、化合物または化学部分は、それと矛盾しない限り、本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態または例に適用可能であると理解されるべきである。
【0045】
さらに、特に明記しない限り、本明細書に開示された任意の特徴は、同じまたは同様の目的を果たす代替的な特徴によって置き換えられてもよい。
【0046】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、文脈上他に示されない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈上他に示されない限り、複数および単数を企図するものとして理解されるべきである。
【0047】
以下を参照して、本発明の一実施形態を単なる例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【0048】
【図1】ＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブ（ＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋ）およびその結合受容体の特徴付けを示す。 Ａ）ＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブタンパク質の結晶構造。Ｂ）表面プラズモン共鳴データは、ＣＡＲ、ＣＤ４６およびＤＳＧ２へのＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋ結合を実証する（ｎｍ＝動態が速すぎるため測定されず、ｎｂ＝結合なし、緑色＝特異的結合を検出）。Ｃ）ｈＣＡＲ特異的一次抗体およびＡｌｅｘａ－４８８タグ付き二次抗体の滴定を使用したＣＨＯ－ＣＡＲ細胞における組換えＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋおよびＨＡｄＶ－Ｃ５ｋタンパク質結合。データは、ＳＤ値を有する平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示され、ＩＣ５０値が表に示される。Ｄ）ｈＣＡＲ受容体（白色）との複合体で示される三量体ＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブ（赤色）。Ｅ）ｈＡｄＶ－Ｃ５（青色）およびＨＡｄＶ－Ｄ４８（緑色）と比較した、ＨＡｄＶ－Ｄ１０（赤色）のｈＣＡＲ（白色）およびＤＧループ相互作用の予測モデリング。Ｆ）既知のＣＤ４６結合アデノウイルスであるＨＡｄＶ－Ｄ１０（シアン）およびｈＡｄＶ－Ｂ１１（緑色）についてのＣＤ４６結合部位の予測モデリング。赤色のダッシュは結合能を示す。Ｐｙｍｏｌを使用して行った構造解析。
【図2】ＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブによるＨＡｄＶ－Ｃ５偽型の形質導入を示す。 Ａ）ＣＡＲ（ＣＨＯ－ＣＡＲ）およびＣＤ４６（ＣＨＯ－ＢＣ１）を発現する細胞におけるＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０の形質導入。細胞を５０００ｖｐ／細胞のウイルス量で感染させ、ルシフェラーゼ産生を４８時間で測定した。Ｂ）ＣＡＲブロッキングのためのｈＡｄＶ－Ｃ５組換えノブタンパク質およびＣＡＲ結合を消失させる４７７ＹＴ変異を有するＨＡｄＶ－Ｃ５Ｋの存在下の両方におけるＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０偽型の形質導入。Ｃ）ノイラミニダーゼアッセイにより、Ａ５４９細胞においてシアル酸に結合するＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋを有するＨＡｄＶ－Ｃ５偽型を決定する。ｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図3】凝固第Ｘ因子（ＦＸ）へのＨＡｄＶ－Ｄ１０結合を示し、ベクターは細胞侵入のためにＤＳＧ２またはＣＤ４６を使用しない。 Ａ）ＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターの産生中に行われた改変を表す概略図。赤色のボックスで示すようにＥ１およびＥ３遺伝子を欠失させ、青色で強調されているようにＥ４ｏｒｆ６をＨＡｄＶ－Ｃ５ Ｅ４ｏｒｆ６で置き換え、緑色は、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーター下での導入遺伝子ＧＦＰおよびルシフェラーゼの挿入を表す。Ｂ）ＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０血清型におけるヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）のアミノ酸配列アラインメント。紫色の矢印で示されるＨＡｄＶ－Ｃ５における「ＨＶＲ７」ＦＸ結合変異の部位（５３）；点変異に関与する「元の」および「変異した」アミノ酸を太字の黒い文字で示す。Ｃ）ＣＨＯ－Ｋ１細胞にＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターを５０００ウイルス粒子／細胞で３時間形質導入し、４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。Ｄ）静脈内注射の７２時間後のインビボでのＨＡｄＶ－Ｄ１０の生体内分布。ＧＦＰレベルを、ＧＦＰ Ｓｉｍｐｌｅｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）を使用して５０μｇの総タンパク質中で測定し、二重平均から計算し、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して濃度を標準曲線から補間し、変換した。平均の対数（ｎ＝４）および平均の標準偏差を示した。統計学的有意性は、両側対応のないｔ検定を使用して決定した。ｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。Ｅ）ＤＳＧ２受容体使用について陽性染色されたＣＨＯ－ＤＳＧ２細胞株の割合を示すヒストグラム。Ｆ）ＨＡｄＶ－Ｃ５．３ｋをＤＳＧ２受容体使用の陽性対照として使用したＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０ ＧＦＰベクターによるＣＨＯ－Ｋ１およびＣＨＯ－ＤＳＧ２細胞の形質導入。Ｇ）感染の７２時間後に測定された、ＧＦＰ発現を伴うＨａｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０によるＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＢＣ１およびＣＨＯ－ＣＡＲ細胞の形質導入。データは３連値の平均として示されている。エラーバーは平均値の標準偏差を表し、倍率変化は各ウイルスの「ウイルスのみ」条件に対するものである。ｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図4】Ａ２０ペプチドの組み込みがαｖβ６標的化をもたらすことを示す。 Ａ）ＤＧ構造ループにＡ２０標的化ペプチドを挿入したＨＡｄＶ－Ｄ１０ノブドメインの予測構造モデリング。構造は、Ｄ種構造Ａｄ１９ｐ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＵＸＢ）に基づいていた。Ａ２０アミノ酸配列ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴを緑色で強調した。Ｂ）フローサイトメトリーによって決定されたＣＡＲおよびαｖβ６細胞表面受容体について陽性のＢＴ２０細胞の割合を示すヒストグラム。Ｃ）ＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０偽型のＢＴ２０細胞形質導入。ウイルス感染を、感染の４８時間後に導入遺伝子ルシフェラーゼの発現によって測定した。Ｄ）受容体ブロッキング抗体の存在下でのＢＴ２０細胞の形質導入。ＢＴ２０細胞を抗体（ＩｇＧおよび抗αｖβ６）と３０分間プレインキュベートした後、氷上で１時間感染させた。未結合のウイルスを洗浄によって除去し、感染の４８時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。データをｎ＝３の平均としてプロットし、エラーバーは標準偏差を示す。有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの多重比較検定を使用して決定した。ｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図5】Ａ２０ペプチドを有するＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターの形質導入を示す。 Ａ５４９、ＢＴ２０およびＫｙｓｅ ３０細胞を、ＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターならびにＡ２０改変ベクターの両方に、１００００ｖｐ／細胞のウイルス量で感染させた。ＧＦＰ導入遺伝子の発現を、感染の７２時間後にフローサイトメトリーを使用して測定した。表は、フローサイトメトリーによって決定された、細胞表面受容体、ＣＡＲおよびαｖβ６の発現の百分率を示す。示したデータは、３連値の平均であり、エラーバーは平均の標準誤差を表す。統計学的有意性は、テューキーの多重比較検定を使用して、二元配置７０２ ＡＮＯＶＡによって決定した。ｎｓ、ｐ＞０．０５。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図6】標識されたＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターのαｖβ６標的化を評価する顕微鏡法 Ａ）Ｋｙｓｅ－３０細胞におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０の細胞内輸送。緑色、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ＨＡｄＶ；青色、ＤＡＰＩで染色された核；灰色、反射。画像は、共焦点スタックの最大値投影である。代表的な共焦点画像を示す。スケールバーは１０μｍ。Ｂ）細胞あたりのウイルス粒子の数として表されるウイルス内在化効率の定量。水平バーは平均を表し、エラーバーは標準偏差を示し、分析した細胞の数を（Ｎ）に示す。＊＊＊ Ｐ＜０，００１；＊＊＊＊ Ｐ＜０，０００１。
【図7】血清の存在下でのＡ２０ペプチドを有するＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０の感染を示す。 Ａ）様々な濃度（４０％、７０６ ２０％、１０％、５％、２．５％および血清なし）の基礎培地で希釈した血清を用いてウイルスを１５分間プレインキュベートした。Ｋｙｓｅ ３０細胞を、各血清希釈液について３連で５０００ｖｐ／細胞で感染させた。ＧＦＰ導入遺伝子の発現を、感染の７２時間後にフローサイトメトリーを使用して測定した。Ｂ）表は、各血清希釈液について血清なしのウイルス感染と比較した場合の倍率変化を示す。示したデータは、３連値の平均であり、エラーバーは平均の標準偏差を表す。Ｃ）統計的差異を強調する個々のグラフ。統計学的有意性は、ダネットの多重比較検定を使用して、一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。Ｄ）インビボでのＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０Ａ２０の生体内分布を示すＧＦＰ ＥＬＩＳＡ。雌ＮＳＧマウスにＢＴ２０細胞を皮下接種し、異種移植片の成長をモニタリングした。ＧＦＰ発現ＨＡｄＶベクターを尾静脈への注射によって静脈内投与し、感染の７２時間後に腫瘍および肝臓を採取した。総タンパク質を抽出し、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して評価した。ＧＦＰレベルを、ＧＦＰ Ｓｉｍｐｌｅｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）を使用して５０μｇの総タンパク質中で測定し、二重平均から計算し、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して濃度を標準曲線から補間した。データは、平均（ｎ＝４）および平均の標準誤差を表す。統計は、ウイルスのみと有意に異なることを示した。ｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図8】野生型ＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０を用いた細胞生存率アッセイを示す。 Ａ）Ａ５４９（αｖβ６低）およびＢＴ２０（αｖβ６高）細胞を、野生型ＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０ならびにＡ２０改変を有する野生型ＨＡｄＶ－Ｄ１０に５０００ｖｐ／細胞のウイルス量で感染させた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、感染の数時間後に細胞殺傷を測定した。示したデータは、３連値の平均であり、エラーバーは標準偏差を表す。統計学的有意性は、テューキーの多重比較検定を使用して、二元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。ｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。Ｂ）ＢＴ２０異種移植片を有するマウスに、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０（１０×１０１０ｖｐ／側腹部）ならびにＰＢＳ対照を腫瘍内（ＩＴ）注射によって投与した。腫瘍成長を、投与後９日間にわたってノギスで定期的に測定した。データは平均（ｎ＝４）を表し、有意性はマン・ホイットニー検定によって決定した。
【図9】インビボでのＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０Ａ２０の生体内分布を示すＧＦＰ ＥＬＩＳＡを示す。 ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０の生体内分布をインビボで評価した。雌ＮＳＧマウスにＢＴ－２０細胞を皮下接種し、異種移植片の成長をモニタリングした。ＧＦＰ発現ＨＡｄＶベクターを尾静脈への注射によって静脈内投与し、感染の７２時間後に臓器を採取した。タンパク質を凍結肝臓、腫瘍、肺、腎臓、脾臓および心臓から抽出し、総タンパク質を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して評価し、ＧＦＰレベルを、ＧＦＰ Ｓｉｍｐｌｅｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）を製造者の説明書に従って使用して５０μｇの総タンパク質中で測定した。データは二重平均を表し、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して濃度を標準曲線から補間した。標準曲線範囲内に入らなかったデータはプロットされていない。統計学的有意性は、両側対応のあるｔ検定によって決定した。ｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図10】構造の選択された部分の周りの電子密度。観察された密度は、１Åの輪郭レベルで青色であり、正の差は＋３Åで緑色であり、負の差は－３Åで赤色である。
【図11】Ａｄ１０ファイバーノブタンパク質のタンパク質配列、アクセッション番号ＢＡＭ６６６９８。
【図12】ウイルス複製を制限するためのＥ１Ａタンパク質の位置１０３～１１０（ＬＲＣＹＥＥＧＦ）におけるＥ１Ａ（遺伝子）８アミノ酸欠失を示すタンパク質配列。
【図13】溶血によるＣＡＲ結合を実証するための赤血球凝集アッセイ。 ＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－Ｃ５．ＫＯ１、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｃ５／Ｄ１０Ｋを、ＰＢＳ中の１％赤血球溶液と２．５×１０８個のウイルス粒子の濃度で合わせた。
【図14】静脈内注射の７２時間後の脾臓におけるＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０の形質導入。ＧＦＰレベルを、ＧＦＰ Ｓｉｍｐｌｅｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）を使用して５０μｇの総タンパク質中で測定し、二重平均から計算し、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して濃度を標準曲線から補間し、変換した。平均の対数（ｎ＝４）および平均の標準偏差を示した。統計学的有意性は、両側対応のないｔ検定によって決定した。ｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図15】ＰＢＳ、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０で腫瘍内処置したマウス由来のＢＴ２０腫瘍切片を、細胞死のマーカーとしてのガンマＨ２ＡＸについて染色した。
【0049】
［表１］ＨＡｄｖ－Ｄ１０ファイバーノブタンパク質結晶統計値
［表２］ウイルスベクターの作製に使用されたプライマー
［表２］ウイルスベクターの作製に使用されたプライマー
【発明を実施するための形態】
【0050】
材料および方法
組換えファイバーノブタンパク質の作製
組換えＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブタンパク質を、ｐＲＥＰ－４プラスミドを有するＳＧ１３００９大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびＤＮＡ配列をコードする関連するファイバーノブを含むｐＱＥ－３０発現ベクターから作製した。グリセロールストックを使用して、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する２０ｍＬのＬＢブロスに接種し、一晩培養した。一晩培養物を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび８ｍＬのグリセロール（０．８％）を補充した１ＬのＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ、改変、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。培養物を、ＯＤ６００＝０．６が測定されるまで３７℃の振盪インキュベーター（２５０ｒｐｍ）に入れた。３７℃で４時間インキュベートする前に、ＩＰＴＧを０．５ｍＭの最終体積に添加することによって、ｐＱＥ－３０由来の組換えファイバーノブの発現を誘導した。４０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離することによって細菌を回収した。ペレットを精製前に－８０℃で保存した。解凍したペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ８．０］３００ｍＭのＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）のＮＰ４０、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、１ｍＭのβ－メルカプトエタノール）に再懸濁し、溶解を助けるために撹拌しながら室温で３０分間インキュベートした。溶解物を３０，０００ｇでの３０分間の遠心分離によって清澄化し、０．２２μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、英国、アビンドン）を使用して濾過した。ＡＫＴＡ ＦＰＬＣを使用して精製を行った。濾過した溶解物を５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＦＦニッケルアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７５２５５０１）に２．０ｍＬ／分で通し、５カラム容量で溶出緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ８．０］、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのβ－メルカプトエタノール）中に洗浄した。緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋４００ｍＭのイミダゾール）への３０分間の勾配溶出によってタンパク質を溶出した。画分を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、ファイバーノブを含む画分をプールし、結晶化緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、［ｐＨ８．０］および３０ｍＭのＮａＣｌ）中のｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＧＥ １０／３００ ＧＬ、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してさらに精製した。クロマトグラムピーク下の面積と相関する画分を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。純粋な画分を、結晶化を進めるＶｉｖａｓｐｉｎ １０，０００ ＭＷＣＯ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ、ゲッティンゲン）中での遠心分離によって濃縮した。
組換えファイバーノブタンパク質の作製
組換えＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブタンパク質を、ｐＲＥＰ－４プラスミドを有するＳＧ１３００９大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびＤＮＡ配列をコードする関連するファイバーノブを含むｐＱＥ－３０発現ベクターから作製した。グリセロールストックを使用して、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する２０ｍＬのＬＢブロスに接種し、一晩培養した。一晩培養物を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび８ｍＬのグリセロール（０．８％）を補充した１ＬのＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ、改変、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。培養物を、ＯＤ６００＝０．６が測定されるまで３７℃の振盪インキュベーター（２５０ｒｐｍ）に入れた。３７℃で４時間インキュベートする前に、ＩＰＴＧを０．５ｍＭの最終体積に添加することによって、ｐＱＥ－３０由来の組換えファイバーノブの発現を誘導した。４０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離することによって細菌を回収した。ペレットを精製前に－８０℃で保存した。解凍したペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ８．０］３００ｍＭのＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）のＮＰ４０、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、１ｍＭのβ－メルカプトエタノール）に再懸濁し、溶解を助けるために撹拌しながら室温で３０分間インキュベートした。溶解物を３０，０００ｇでの３０分間の遠心分離によって清澄化し、０．２２μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、英国、アビンドン）を使用して濾過した。ＡＫＴＡ ＦＰＬＣを使用して精製を行った。濾過した溶解物を５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＦＦニッケルアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７５２５５０１）に２．０ｍＬ／分で通し、５カラム容量で溶出緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ８．０］、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのβ－メルカプトエタノール）中に洗浄した。緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋４００ｍＭのイミダゾール）への３０分間の勾配溶出によってタンパク質を溶出した。画分を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、ファイバーノブを含む画分をプールし、結晶化緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、［ｐＨ８．０］および３０ｍＭのＮａＣｌ）中のｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＧＥ １０／３００ ＧＬ、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してさらに精製した。クロマトグラムピーク下の面積と相関する画分を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。純粋な画分を、結晶化を進めるＶｉｖａｓｐｉｎ １０，０００ ＭＷＣＯ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ、ゲッティンゲン）中での遠心分離によって濃縮した。
【0051】
ＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブ（ＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋ）の結晶化および構造決定
結晶化実験は、９６ウェルのシッティングドロッププレートで設定した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ（ＵＫ）製のＰＡＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ市販スクリーンを使用して、６０ｍＬのスクリーニング液滴に対して２００ｎＬのタンパク質液滴を平衡化した。最良の結晶は、０．２ＭのＣａＣｌ２、０．１のＭＥＳ、２０％ ｗ／ｖのＰＥＧ ６０００、ｐＨ６．０の条件で現れた。結晶を薄いプラスチックループに回収し、極低温冷却し、英国、ハーウェルのＤｉａｍｏｎｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅに移した。データ収集は、ＤＬＳ Ｂｅａｍｌｉｎｅ Ｉ０４－１で行った。ＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋの構造決定を以前に記載された方法（４８）に従って行った。反映データおよび最終モデルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ、ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）にエントリー６ＺＣ５として寄託した。低分解能形態の構造も決定し、エントリー６ＱＰＭとして寄託した。完全な結晶学的精密化統計値および条件を表１に示す。
結晶化実験は、９６ウェルのシッティングドロッププレートで設定した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ（ＵＫ）製のＰＡＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ市販スクリーンを使用して、６０ｍＬのスクリーニング液滴に対して２００ｎＬのタンパク質液滴を平衡化した。最良の結晶は、０．２ＭのＣａＣｌ２、０．１のＭＥＳ、２０％ ｗ／ｖのＰＥＧ ６０００、ｐＨ６．０の条件で現れた。結晶を薄いプラスチックループに回収し、極低温冷却し、英国、ハーウェルのＤｉａｍｏｎｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅに移した。データ収集は、ＤＬＳ Ｂｅａｍｌｉｎｅ Ｉ０４－１で行った。ＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋの構造決定を以前に記載された方法（４８）に従って行った。反映データおよび最終モデルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ、ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）にエントリー６ＺＣ５として寄託した。低分解能形態の構造も決定し、エントリー６ＱＰＭとして寄託した。完全な結晶学的精密化統計値および条件を表１に示す。
【0052】
表面プラズモン共鳴
ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（商標）を使用して結合分析データを取得した。ＣＤ４６、ＣＡＲおよびＤＳＧ２（約５００ＲＵ）を、１０μＬ／分の遅い流速を使用してＣＭ５センサーチップの表面にアミンカップリングさせた。測定はすべて、２５℃のＰＢＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ、英国）中、３０μＬ／分の流速で行った。ＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブタンパク質を精製し、１７８μＭに濃縮した。各試料について５×１：３段階希釈液を調製し、関連するセンサーチップに注入した。平衡結合定数（ＫＤ）値は、特異的平衡結合応答をタンパク質濃度に対してプロットし、続いてラングミュア結合方程式の非線形最小二乗フィッティングを行うことによって、１：１相互作用を仮定して計算した。単一サイクル動態分析のために、上位濃度の２００μＭのＨＡｄＶ－Ｄ１０Ｋを注入し、続いて段階１：３希釈液を使用して４回注入した。ラングミュア結合（ＡＢ＝Ｂ×ＡＢｍａｘ／（ＫＤ＋Ｂ））を仮定してＫＤ値を計算し、速度論的滴定アルゴリズム（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（商標）３．１）を使用してデータを分析した。受容体タンパク質は、以下のように商業的に供給された：
組換えヒトデスモグレイン－２ Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、９４７－ＤＭ－１００）。組換えヒトＣＸＡＤＲ Ｆｃキメラタンパク質（ＣＡＲ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３３３６－ＣＸ－０５０）。組換えヒトＣＤ４６タンパク質（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１２２３９－Ｈ０８Ｈ）。
ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（商標）を使用して結合分析データを取得した。ＣＤ４６、ＣＡＲおよびＤＳＧ２（約５００ＲＵ）を、１０μＬ／分の遅い流速を使用してＣＭ５センサーチップの表面にアミンカップリングさせた。測定はすべて、２５℃のＰＢＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ、英国）中、３０μＬ／分の流速で行った。ＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブタンパク質を精製し、１７８μＭに濃縮した。各試料について５×１：３段階希釈液を調製し、関連するセンサーチップに注入した。平衡結合定数（ＫＤ）値は、特異的平衡結合応答をタンパク質濃度に対してプロットし、続いてラングミュア結合方程式の非線形最小二乗フィッティングを行うことによって、１：１相互作用を仮定して計算した。単一サイクル動態分析のために、上位濃度の２００μＭのＨＡｄＶ－Ｄ１０Ｋを注入し、続いて段階１：３希釈液を使用して４回注入した。ラングミュア結合（ＡＢ＝Ｂ×ＡＢｍａｘ／（ＫＤ＋Ｂ））を仮定してＫＤ値を計算し、速度論的滴定アルゴリズム（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（商標）３．１）を使用してデータを分析した。受容体タンパク質は、以下のように商業的に供給された：
組換えヒトデスモグレイン－２ Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、９４７－ＤＭ－１００）。組換えヒトＣＸＡＤＲ Ｆｃキメラタンパク質（ＣＡＲ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３３３６－ＣＸ－０５０）。組換えヒトＣＤ４６タンパク質（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１２２３９－Ｈ０８Ｈ）。
【0053】
予測的相同性モデリング
ＣＡＲ結合用の既存のＨＡｄＶ－Ｃ５Ｋ（ＰＤＢ ６ＨＣＮ）またはＣＤ４６結合構造用のＨＡｄＶ－Ｂ１１Ｋ（ＰＤＢ ３Ｏ８Ｅ）のテンプレートを使用して、ファイバーノブタンパク質をＣＡＲまたはＣＤ４６と複合体化してモデリングした。非タンパク質成分および水素をテンプレートモデルおよび目的のファイバーノブタンパク質から欠失させた。各ファイバーノブタンパク質のＣα鎖を、可能な限り低いＲＭＳＤを達成するようにアラインメントした。ＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブタンパク質およびリガンドのみを含むモデルを保存し、ＹＡＳＡＲＡエネルギー最小化サーバを介してＹＡＳＡＲＡ自己パラメータ化エネルギー最小化アルゴリズムを使用してエネルギー最小化を行った。ＰｙＭｏＬ視覚化ソフトウェアを使用して、公開のために結果を視覚化し、適合させた。
ＣＡＲ結合用の既存のＨＡｄＶ－Ｃ５Ｋ（ＰＤＢ ６ＨＣＮ）またはＣＤ４６結合構造用のＨＡｄＶ－Ｂ１１Ｋ（ＰＤＢ ３Ｏ８Ｅ）のテンプレートを使用して、ファイバーノブタンパク質をＣＡＲまたはＣＤ４６と複合体化してモデリングした。非タンパク質成分および水素をテンプレートモデルおよび目的のファイバーノブタンパク質から欠失させた。各ファイバーノブタンパク質のＣα鎖を、可能な限り低いＲＭＳＤを達成するようにアラインメントした。ＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブタンパク質およびリガンドのみを含むモデルを保存し、ＹＡＳＡＲＡエネルギー最小化サーバを介してＹＡＳＡＲＡ自己パラメータ化エネルギー最小化アルゴリズムを使用してエネルギー最小化を行った。ＰｙＭｏＬ視覚化ソフトウェアを使用して、公開のために結果を視覚化し、適合させた。
【0054】
組換えノブタンパク質を使用したＩＣ５０アッセイ
ＣＨＯ－ＣＡＲ細胞を回収し、２０，０００細胞／ウェルを９６ウェルＶ底プレート（Ｎｕｎｃ（商標）；２４９６６２）に移した。播種前に細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、氷上に保った。組換え可溶性ノブタンパク質の段階希釈液を無血清ＲＰＭＩ－１６４０中で構成して、０．０００１～１００μｇ／１０５細胞の最終濃度範囲を得た。組換えファイバーノブタンパク質希釈液を３連で細胞に添加し、氷上で１時間インキュベートした。未結合のファイバーノブタンパク質を冷ＰＢＳ中で２回洗浄することによって除去し、一次ＣＡＲ ＲｍｃＢ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；０５－６４４）抗体を添加して利用可能なＣＡＲ受容体に結合させた。一次抗体を氷上での１時間のインキュベーション後に除去し、細胞をＰＢＳ中でさらに２回洗浄し、Ａｌｅｘａ－６４７標識ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ａ－２１２３７）と共に氷上で３０分間インキュベートした。抗体をＰＢＳ中２μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定し、染色をＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でフローサイトメトリーによって検出した。ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用して、細胞集団、シングレットおよびＡｌｅｘａ－６４７陽性細胞に対する連続ゲーティングによって分析を行った。各試料中のＡｌｅｘａ－６４７陽性単一細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を前述のように決定し、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して非線形回帰によってＩＣ５０曲線をフィッティングしてＩＣ５０濃度を決定した。
ＣＨＯ－ＣＡＲ細胞を回収し、２０，０００細胞／ウェルを９６ウェルＶ底プレート（Ｎｕｎｃ（商標）；２４９６６２）に移した。播種前に細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、氷上に保った。組換え可溶性ノブタンパク質の段階希釈液を無血清ＲＰＭＩ－１６４０中で構成して、０．０００１～１００μｇ／１０５細胞の最終濃度範囲を得た。組換えファイバーノブタンパク質希釈液を３連で細胞に添加し、氷上で１時間インキュベートした。未結合のファイバーノブタンパク質を冷ＰＢＳ中で２回洗浄することによって除去し、一次ＣＡＲ ＲｍｃＢ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；０５－６４４）抗体を添加して利用可能なＣＡＲ受容体に結合させた。一次抗体を氷上での１時間のインキュベーション後に除去し、細胞をＰＢＳ中でさらに２回洗浄し、Ａｌｅｘａ－６４７標識ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ａ－２１２３７）と共に氷上で３０分間インキュベートした。抗体をＰＢＳ中２μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定し、染色をＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でフローサイトメトリーによって検出した。ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用して、細胞集団、シングレットおよびＡｌｅｘａ－６４７陽性細胞に対する連続ゲーティングによって分析を行った。各試料中のＡｌｅｘａ－６４７陽性単一細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を前述のように決定し、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して非線形回帰によってＩＣ５０曲線をフィッティングしてＩＣ５０濃度を決定した。
【0055】
細胞表面受容体染色
細胞を回収し、９６ウェルＶ底プレート（Ｎｕｎｃ（商標）；２４９６６２）に１００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を冷ＦＡＣｓ緩衝液（ＰＢＳ中５％のＦＢＳ）で洗浄した後、１００μＬの一次抗体を添加した。抗ＣＡＲ（ＲｍｃＢ，３０２２４８７；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および抗αｖβ６（ＭＡＢ２０７７２；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を２μｇ／ｍＬの濃度で使用した。一次抗体を氷上での１時間のインキュベーション後に除去し、細胞をＦＡＣｓ緩衝液で２回洗浄し、Ａｌｅｘａ－６４７標識ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ａ－２１２３７）の１：５００希釈液と共に氷上で３０分間インキュベートした。染色された細胞を４％パラホルムアルデヒドを使用して固定した後、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリーによって測定した。ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用して、細胞集団、シングレットおよびＡｌｅｘａ－６４７陽性細胞に対する連続ゲーティングによって分析を行った。
細胞を回収し、９６ウェルＶ底プレート（Ｎｕｎｃ（商標）；２４９６６２）に１００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を冷ＦＡＣｓ緩衝液（ＰＢＳ中５％のＦＢＳ）で洗浄した後、１００μＬの一次抗体を添加した。抗ＣＡＲ（ＲｍｃＢ，３０２２４８７；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および抗αｖβ６（ＭＡＢ２０７７２；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を２μｇ／ｍＬの濃度で使用した。一次抗体を氷上での１時間のインキュベーション後に除去し、細胞をＦＡＣｓ緩衝液で２回洗浄し、Ａｌｅｘａ－６４７標識ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ａ－２１２３７）の１：５００希釈液と共に氷上で３０分間インキュベートした。染色された細胞を４％パラホルムアルデヒドを使用して固定した後、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリーによって測定した。ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用して、細胞集団、シングレットおよびＡｌｅｘａ－６４７陽性細胞に対する連続ゲーティングによって分析を行った。
【0056】
細胞培養
細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）または共同研究者のいずれかから供給された。細胞を、ヒト組織法（ＨＴＡ）認定細胞培養インキュベーター（ＨＥＲＡ Ｃｅｌｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、５％のＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で成長させた。哺乳動物細胞株を、細胞株特異的培地およびサプリメント中で必要に応じて継代培養した（８０～１００％コンフルエント）。Ｋｙｓｅ－３０およびＡ５４９は、ロズウェルパーク記念研究所１６４０（ＲＰＭＩ；Ｓｉｇｍａ、＃Ｒ０８８３）で維持した。ＢＴ２０細胞を最小必須培地イーグル（ＥＭＥＭ、α改変；Ｇｉｂｃｏ、＃１１０９５０８０）中で成長させた。ＣＨＯ由来細胞をダルベッコ改変イーグル培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２；Ｇｉｂｃｏ、＃１０５６５０１８）中で培養した。基礎培地に、１０％のウシ胎仔血清、熱不活性化（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ、＃１０５００－０６４）、１％のＬ－グルタミン（ストック２００ｍＭ；Ｇｉｂｃｏ、＃２５０３０－０２４）、２％のペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、＃１５０７０－０６３）を補充した。
細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）または共同研究者のいずれかから供給された。細胞を、ヒト組織法（ＨＴＡ）認定細胞培養インキュベーター（ＨＥＲＡ Ｃｅｌｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、５％のＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で成長させた。哺乳動物細胞株を、細胞株特異的培地およびサプリメント中で必要に応じて継代培養した（８０～１００％コンフルエント）。Ｋｙｓｅ－３０およびＡ５４９は、ロズウェルパーク記念研究所１６４０（ＲＰＭＩ；Ｓｉｇｍａ、＃Ｒ０８８３）で維持した。ＢＴ２０細胞を最小必須培地イーグル（ＥＭＥＭ、α改変；Ｇｉｂｃｏ、＃１１０９５０８０）中で成長させた。ＣＨＯ由来細胞をダルベッコ改変イーグル培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２；Ｇｉｂｃｏ、＃１０５６５０１８）中で培養した。基礎培地に、１０％のウシ胎仔血清、熱不活性化（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ、＃１０５００－０６４）、１％のＬ－グルタミン（ストック２００ｍＭ；Ｇｉｂｃｏ、＃２５０３０－０２４）、２％のペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、＃１５０７０－０６３）を補充した。
【0057】
ウイルスベクターの作製
偽型ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０およびＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．Ａ２０ベクターを、以前に記載された方法（３３、４９）を使用してＡｄＺ組換えによって作製した。ＨＡｄＶ－Ｄ１０ゲノムを含有するＢＡＣ ＤＮＡを作製するために、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ウイルスをＡＴＣＣから得て、Ａ５４９細胞で継代した。ウイルスストックを標準的な方法によって調製し、ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔを使用してＤＮＡを抽出した。Ａｄ１０ゲノムの各末端に相同性の５００ｂ．ｐ．を含む捕捉ＢＡＣを作製し、ＳＷ１０２細菌において組換えによってゲノムを捕捉するために使用した。これにより、さらなる組換えによってウイルスゲノムの迅速かつ効率的な操作が可能になった。Ｅ１およびＥ３遺伝子を欠失させてベクターを非複製性にし、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ Ｅ４ｏｒｆ６領域をＨＡｄＶ－Ｃ５ Ｅ４ｏｒｆ６で置き換えて２９３細胞における産生を増強した。ＧＦＰまたはルシフェラーゼ導入遺伝子を、Ｅ１領域を置き換えるＣＭＶプロモーターの制御下で挿入した。ＨＡｄＶ－Ｄ１０を、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブのＤＧループへのＡ２０ペプチドのαｖβ６挿入に再標的化した。使用したプライマーを表２に詳述する。
偽型ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０およびＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．Ａ２０ベクターを、以前に記載された方法（３３、４９）を使用してＡｄＺ組換えによって作製した。ＨＡｄＶ－Ｄ１０ゲノムを含有するＢＡＣ ＤＮＡを作製するために、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ウイルスをＡＴＣＣから得て、Ａ５４９細胞で継代した。ウイルスストックを標準的な方法によって調製し、ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔを使用してＤＮＡを抽出した。Ａｄ１０ゲノムの各末端に相同性の５００ｂ．ｐ．を含む捕捉ＢＡＣを作製し、ＳＷ１０２細菌において組換えによってゲノムを捕捉するために使用した。これにより、さらなる組換えによってウイルスゲノムの迅速かつ効率的な操作が可能になった。Ｅ１およびＥ３遺伝子を欠失させてベクターを非複製性にし、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ Ｅ４ｏｒｆ６領域をＨＡｄＶ－Ｃ５ Ｅ４ｏｒｆ６で置き換えて２９３細胞における産生を増強した。ＧＦＰまたはルシフェラーゼ導入遺伝子を、Ｅ１領域を置き換えるＣＭＶプロモーターの制御下で挿入した。ＨＡｄＶ－Ｄ１０を、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブのＤＧループへのＡ２０ペプチドのαｖβ６挿入に再標的化した。使用したプライマーを表２に詳述する。
【0058】
ウイルスの調製および精製
製造業者の説明書（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＢＡＣ １００、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）に記載されているようにマキシプレップキットを使用してＤＮＡを増幅した。ＤＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国）を使用して決定した。Ｔ－ＲＥＸ細胞または２９３β６細胞のＴ２５ ＣＥＬＬＢＩＮＤフラスコへのリポフェクタミントランスフェクションによってウイルス粒子を作製した。ＣＰＥが明らかになった時点で細胞を収集し、それぞれの細胞株を使用してウイルスを増幅した。塩化セシウム（ＣｓＣｌ）２段階精製法を使用して純粋なウイルスを抽出した。ＰＢＳへの透析を伴うＣｓＣｌ精製を使用して、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ウイルスを調製した。次いで、ウイルス粒子を、２０倍過剰のＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８－ＴＦＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共にＲＴで２時間インキュベートした。Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、標識ウイルス粒子を精製した。ウイルス力価を、ｍｉｃｒｏＢＣＡおよびＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）技術の両方を使用して決定した。ウイルスを長期保存のために－８０℃で維持した。
製造業者の説明書（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＢＡＣ １００、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）に記載されているようにマキシプレップキットを使用してＤＮＡを増幅した。ＤＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国）を使用して決定した。Ｔ－ＲＥＸ細胞または２９３β６細胞のＴ２５ ＣＥＬＬＢＩＮＤフラスコへのリポフェクタミントランスフェクションによってウイルス粒子を作製した。ＣＰＥが明らかになった時点で細胞を収集し、それぞれの細胞株を使用してウイルスを増幅した。塩化セシウム（ＣｓＣｌ）２段階精製法を使用して純粋なウイルスを抽出した。ＰＢＳへの透析を伴うＣｓＣｌ精製を使用して、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ウイルスを調製した。次いで、ウイルス粒子を、２０倍過剰のＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８－ＴＦＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共にＲＴで２時間インキュベートした。Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、標識ウイルス粒子を精製した。ウイルス力価を、ｍｉｃｒｏＢＣＡおよびＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）技術の両方を使用して決定した。ウイルスを長期保存のために－８０℃で維持した。
【0059】
ウイルス形質導入アッセイ
感染の２４時間前に、滅菌９６マイクロウェルＮｕｎｃ組織培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１６３３２０）に細胞を適切な密度で播種した。細胞をＰＢＳで洗浄し、無血清培地中で記載の濃度に希釈したウイルスを３連で添加した。プレートを３７℃で３時間インキュベートし、次いで、ウイルス希釈液を完全成長培地と交換した。ウイルス形質導入を感染後４８または７２時間のいずれかで測定した。ルシフェラーゼ発現を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍキットを製造者のプロトコルに従って使用して検出した（＃Ｅ１５０１；Ｐｒｏｍｅｇａ ＵＫ Ｌｔｄ、英国、サウサンプトン）。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（＃２３２２７；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国、ラフバラー）を使用して決定されたタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）および吸光度を、ｉＭａｒｋ（商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、英国、ハーフォードシャー）でλ５７０ｎｍにおいて測定した。ＧＦＰ発現を、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してフローサイトメトリーによって測定した。細胞をトリプシン処理し、ＦＡＣｓ緩衝液（ＰＢＳ中５％のＦＢＳ）に再懸濁し、９６ウェルＶ底プレート（Ｎｕｎｃ（商標）；２４９６６２）に移した。細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを使用して４℃で１０分間固定した。ＢＬ－１チャネルでＧＦＰを検出し、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用して、細胞集団、シングレットおよびＧＦＰ陽性細胞を連続的にゲーティングすることによって生データを分析した。ＧＦＰ発現を、非感染対照と比較したＧＦＰ陽性細胞の百分率によって定量した。
感染の２４時間前に、滅菌９６マイクロウェルＮｕｎｃ組織培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１６３３２０）に細胞を適切な密度で播種した。細胞をＰＢＳで洗浄し、無血清培地中で記載の濃度に希釈したウイルスを３連で添加した。プレートを３７℃で３時間インキュベートし、次いで、ウイルス希釈液を完全成長培地と交換した。ウイルス形質導入を感染後４８または７２時間のいずれかで測定した。ルシフェラーゼ発現を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍキットを製造者のプロトコルに従って使用して検出した（＃Ｅ１５０１；Ｐｒｏｍｅｇａ ＵＫ Ｌｔｄ、英国、サウサンプトン）。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（＃２３２２７；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国、ラフバラー）を使用して決定されたタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）および吸光度を、ｉＭａｒｋ（商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、英国、ハーフォードシャー）でλ５７０ｎｍにおいて測定した。ＧＦＰ発現を、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してフローサイトメトリーによって測定した。細胞をトリプシン処理し、ＦＡＣｓ緩衝液（ＰＢＳ中５％のＦＢＳ）に再懸濁し、９６ウェルＶ底プレート（Ｎｕｎｃ（商標）；２４９６６２）に移した。細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを使用して４℃で１０分間固定した。ＢＬ－１チャネルでＧＦＰを検出し、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用して、細胞集団、シングレットおよびＧＦＰ陽性細胞を連続的にゲーティングすることによって生データを分析した。ＧＦＰ発現を、非感染対照と比較したＧＦＰ陽性細胞の百分率によって定量した。
【0060】
ノイラミニダーゼアッセイ
Ａ５４９細胞を２０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、一晩接着させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａａ製のノイラミニダーゼ酵素（１１０８０７２５００１、Ｒｏｃｈｅ）５０μＬを、５０ｍＵ／ｍＬで使用して添加した。細胞を３７℃で１時間インキュベートした後、冷ＰＢＳで洗浄した。切断されたシアル酸が補充されないことを確実にするために、ウイルス形質導入を氷上で前述のように行った。
Ａ５４９細胞を２０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、一晩接着させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａａ製のノイラミニダーゼ酵素（１１０８０７２５００１、Ｒｏｃｈｅ）５０μＬを、５０ｍＵ／ｍＬで使用して添加した。細胞を３７℃で１時間インキュベートした後、冷ＰＢＳで洗浄した。切断されたシアル酸が補充されないことを確実にするために、ウイルス形質導入を氷上で前述のように行った。
【0061】
ＦＸ形質導入
生理学的濃度のヒト凝固ＦＸが形質導入効率に及ぼす影響を評価するために、ウイルス形質導入を、上記のルシフェラーゼアッセイについて記載したように行った。ウイルス希釈液を、１０μｇ／ｍＬのＦＸ（＃ＨＣＸ００５０、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、英国、ケンブリッジ）を補充した無血清培地中で３時間調製した。
生理学的濃度のヒト凝固ＦＸが形質導入効率に及ぼす影響を評価するために、ウイルス形質導入を、上記のルシフェラーゼアッセイについて記載したように行った。ウイルス希釈液を、１０μｇ／ｍＬのＦＸ（＃ＨＣＸ００５０、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、英国、ケンブリッジ）を補充した無血清培地中で３時間調製した。
【0062】
共焦点顕微鏡法
Ｋｙｓｅ－３０細胞を、２４ウェルプレート中のカバースリップ上に２００００細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、細胞に２５０００または５００００ｖｐ／細胞の濃度でＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ウイルスを感染させ、３７℃に３時間移した。ウイルスを除去し、プレートを３７℃に７２時間戻し、その後、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドによりＲＴで１０分間固定した。カバースリップを、核を染色するためにＤＡＰＩを含有するＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉａ（Ｈ－１００－１０）の１滴を使用してスライドに取り付けた。共焦点顕微鏡法を、Ｌｅｉｃａ ＴＣ ＳＰ２ ＡＯＢＳ走査型顕微鏡を使用して行い、画像を、Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ Ｘ（ＬＡＳＸ）を使用して処理した。
Ｋｙｓｅ－３０細胞を、２４ウェルプレート中のカバースリップ上に２００００細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、細胞に２５０００または５００００ｖｐ／細胞の濃度でＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ウイルスを感染させ、３７℃に３時間移した。ウイルスを除去し、プレートを３７℃に７２時間戻し、その後、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドによりＲＴで１０分間固定した。カバースリップを、核を染色するためにＤＡＰＩを含有するＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉａ（Ｈ－１００－１０）の１滴を使用してスライドに取り付けた。共焦点顕微鏡法を、Ｌｅｉｃａ ＴＣ ＳＰ２ ＡＯＢＳ走査型顕微鏡を使用して行い、画像を、Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ Ｘ（ＬＡＳＸ）を使用して処理した。
【0063】
血清の存在下でのウイルス形質導入
ウイルス形質導入に対する中和抗体の効果を決定するために、健康なドナーの血液から血清を採取した。血清を基礎培地で８０％～５％に連続的に半分希釈した。血清希釈液を、５０００ｖｐ／細胞を含有する基礎培地と共に１：１の比で添加して、４０％～２．５％の最終ウェル血清濃度範囲を得た。記載のようにフローサイトメトリーによってＧＦＰ発現を測定した。
ウイルス形質導入に対する中和抗体の効果を決定するために、健康なドナーの血液から血清を採取した。血清を基礎培地で８０％～５％に連続的に半分希釈した。血清希釈液を、５０００ｖｐ／細胞を含有する基礎培地と共に１：１の比で添加して、４０％～２．５％の最終ウェル血清濃度範囲を得た。記載のようにフローサイトメトリーによってＧＦＰ発現を測定した。
【0064】
細胞生存率アッセイ
細胞を、１０，０００細胞／ウェルの密度で、白色不透明底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）３９１５）に３連で播種した。ウイルス感染の２４時間前に細胞を播種した。野生型ＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０を５０００ｖｐ／細胞の濃度で細胞に添加した。プレートを３７℃でインキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して生存率を測定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬をマニュアルに従って調製し、５０μＬの試薬を細胞に添加した。プレートを光から保護し、振盪して細胞を完全に溶解した後、マルチモードプレートリーダー（ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、英国、アリスバーリー）を使用して発光を読み取った。
細胞を、１０，０００細胞／ウェルの密度で、白色不透明底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）３９１５）に３連で播種した。ウイルス感染の２４時間前に細胞を播種した。野生型ＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０を５０００ｖｐ／細胞の濃度で細胞に添加した。プレートを３７℃でインキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して生存率を測定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬をマニュアルに従って調製し、５０μＬの試薬を細胞に添加した。プレートを光から保護し、振盪して細胞を完全に溶解した後、マルチモードプレートリーダー（ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、英国、アリスバーリー）を使用して発光を読み取った。
【0065】
インビボ研究
雌ＮＳＧマウスに６×１０６個のＢＴ－２０細胞／側腹部を皮下移植し、異種移植片の成長をモニタリングした。腫瘍が確立された場合、合計１×１０１１個の複製欠損ウイルス粒子を静脈内尾静脈注射によって各マウス（ｎ＝５）に投与した。肝臓、肺、腎臓、脾臓、心臓および腫瘍を感染の７２時間後に採取した。組織を－８０度で保存した。組織を、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してホモジナイズした。ＧＦＰ ＳｉｍｐｌｅＳＴＥＰ ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ，ａｂ１７１５８１）に推奨されるように凍結組織からタンパク質を抽出し、キットプロトコルに従ってＧＦＰを測定した。総タンパク質を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定し、すべての試料をＥＬＩＳＡの前に５０μｇに希釈した。Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用してＯＤ４５０で吸光度を測定した。複製能のある野生型の分析のために、細胞の注射の１０日後、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０（１０×１０１０ｖｐ／側腹部）ならびにＰＢＳ対照を腫瘍内（ＩＴ）注射によって投与した。ノギスを用いて腫瘍成長を定期的に測定し、１５％以下の体重減少が観察されることを確かめた。投与の９日後にマウスを回収した。すべての動物実験は、カーディフ大学の動物倫理委員会によって承認された。
雌ＮＳＧマウスに６×１０６個のＢＴ－２０細胞／側腹部を皮下移植し、異種移植片の成長をモニタリングした。腫瘍が確立された場合、合計１×１０１１個の複製欠損ウイルス粒子を静脈内尾静脈注射によって各マウス（ｎ＝５）に投与した。肝臓、肺、腎臓、脾臓、心臓および腫瘍を感染の７２時間後に採取した。組織を－８０度で保存した。組織を、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してホモジナイズした。ＧＦＰ ＳｉｍｐｌｅＳＴＥＰ ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ，ａｂ１７１５８１）に推奨されるように凍結組織からタンパク質を抽出し、キットプロトコルに従ってＧＦＰを測定した。総タンパク質を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定し、すべての試料をＥＬＩＳＡの前に５０μｇに希釈した。Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用してＯＤ４５０で吸光度を測定した。複製能のある野生型の分析のために、細胞の注射の１０日後、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０（１０×１０１０ｖｐ／側腹部）ならびにＰＢＳ対照を腫瘍内（ＩＴ）注射によって投与した。ノギスを用いて腫瘍成長を定期的に測定し、１５％以下の体重減少が観察されることを確かめた。投与の９日後にマウスを回収した。すべての動物実験は、カーディフ大学の動物倫理委員会によって承認された。
【0066】
統計
特に明記しない限り、生データの分析はＧｒａｐｈＰａｄを使用して行った。データは、３連の平均として示され、標準誤差（ＳＥＭ）または平均の標準偏差（ＳＤ）を有する。示されているように統計分析を行い、統計学的有意性を以下のように示した；ｎｓ＝ｐ＞０．０５；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊２８７＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
特に明記しない限り、生データの分析はＧｒａｐｈＰａｄを使用して行った。データは、３連の平均として示され、標準誤差（ＳＥＭ）または平均の標準偏差（ＳＤ）を有する。示されているように統計分析を行い、統計学的有意性を以下のように示した；ｎｓ＝ｐ＞０．０５；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊２８７＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【0067】
結果
ＨＡｄＶ－Ｄ１０ノブは既知のアデノウイルス受容体に弱い親和性で結合する
本発明者らは、それぞれエントリー６ＺＣ５および６ＱＰＭとしてＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、ＰＤＢに寄託された、２．５Åおよび３．４Åの２つの形態のＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブ（ＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋ；図１Ａ）の結晶構造を決定した。結晶化条件、データ収集および精密化統計値を表１に含める。図１０の構造の選択された部分の周りに電子密度マップが示されている。Ｄ種アデノウイルスと細胞受容体との相互作用はあまり理解されていない。したがって、本発明者らは、いくつかの既知のアデノウイルス受容体へのＨＡｄＶ－Ｄ１０の結合を調べた。３つの十分に記載されたアデノウイルス受容体、ＣＡＲ（Ｃ種の一次受容体）ＣＤ４６およびＤＳＧ２（Ｂ種アデノウイルス相互作用に関連する）へのＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋの結合を、表面プラズモン共鳴を使用して定量した（図１Ｂ）。ＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋは３つすべての受容体に結合することができたが、相互作用はＣＤ４６およびＤＳＧ２の両方について弱かった（ＫＤ：２０μＭおよび１２５μＭ）。受容体－ノブ複合体の解離が速すぎて動態を測定することができなかったため、これらの受容体のオン／オフ速度は測定することができなかった。ＨＡｄＶ－Ｃ５ｋ、ＨＡｄＶ－Ｂ３５ｋおよびＨＡｄＶ－Ｂ３ｋの結合動態も示されており、これらは、それぞれＣＡＲ、ＣＤ４６およびＤＳＧ２に結合する対照である。本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＣＤ４６およびＤＳＧ２（０．４４μＭ）よりもＣＡＲと強い相互作用を形成し得ることを実証した。これは、ＨＡｄＶ－Ｃ５ノブ（０．７６ｎＭ）へのＣＡＲ結合と比較して弱い相互作用であると依然として考えられる。本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＣＡＲと相互作用する能力をさらに詳細に調べた。組換えＨＡｄＶ－Ｄ１０ノブタンパク質のＩＣ５０レベルを、ＣＨＯ－ＣＡＲ細胞を使用して計測した（図１Ｃ）。結合親和性を、抗ＣＡＲ抗体を使用して定量し、続いて蛍光標識二次抗体で染色した。フローサイトメトリーを使用して蛍光のレベルを測定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）としてＧｒａｐｈＰａｄにプロットした。データは、ＩＣ５０値によって示されるように、ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＨＡｄＶ－Ｃ５よりも明らかに１６．５倍低い親和性でＣＡＲに結合することを実証している。ＣＡＲとの複合体における三量体ＨＡｄＶ－Ｄ１０ノブの予測的相同性モデリングにより、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋがＣＡＲとの構造的界面を形成することができることが確認された（図１Ｄ）が、伸長されたＤＧループはＣＡＲへの結合を阻害し、立体障害の可能性のためにＨＡｄＶ－Ｃ５よりも全体的に低い親和性をもたらす（図１Ｅ）。
ＨＡｄＶ－Ｄ１０ノブは既知のアデノウイルス受容体に弱い親和性で結合する
本発明者らは、それぞれエントリー６ＺＣ５および６ＱＰＭとしてＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、ＰＤＢに寄託された、２．５Åおよび３．４Åの２つの形態のＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブ（ＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋ；図１Ａ）の結晶構造を決定した。結晶化条件、データ収集および精密化統計値を表１に含める。図１０の構造の選択された部分の周りに電子密度マップが示されている。Ｄ種アデノウイルスと細胞受容体との相互作用はあまり理解されていない。したがって、本発明者らは、いくつかの既知のアデノウイルス受容体へのＨＡｄＶ－Ｄ１０の結合を調べた。３つの十分に記載されたアデノウイルス受容体、ＣＡＲ（Ｃ種の一次受容体）ＣＤ４６およびＤＳＧ２（Ｂ種アデノウイルス相互作用に関連する）へのＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋの結合を、表面プラズモン共鳴を使用して定量した（図１Ｂ）。ＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋは３つすべての受容体に結合することができたが、相互作用はＣＤ４６およびＤＳＧ２の両方について弱かった（ＫＤ：２０μＭおよび１２５μＭ）。受容体－ノブ複合体の解離が速すぎて動態を測定することができなかったため、これらの受容体のオン／オフ速度は測定することができなかった。ＨＡｄＶ－Ｃ５ｋ、ＨＡｄＶ－Ｂ３５ｋおよびＨＡｄＶ－Ｂ３ｋの結合動態も示されており、これらは、それぞれＣＡＲ、ＣＤ４６およびＤＳＧ２に結合する対照である。本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＣＤ４６およびＤＳＧ２（０．４４μＭ）よりもＣＡＲと強い相互作用を形成し得ることを実証した。これは、ＨＡｄＶ－Ｃ５ノブ（０．７６ｎＭ）へのＣＡＲ結合と比較して弱い相互作用であると依然として考えられる。本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＣＡＲと相互作用する能力をさらに詳細に調べた。組換えＨＡｄＶ－Ｄ１０ノブタンパク質のＩＣ５０レベルを、ＣＨＯ－ＣＡＲ細胞を使用して計測した（図１Ｃ）。結合親和性を、抗ＣＡＲ抗体を使用して定量し、続いて蛍光標識二次抗体で染色した。フローサイトメトリーを使用して蛍光のレベルを測定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）としてＧｒａｐｈＰａｄにプロットした。データは、ＩＣ５０値によって示されるように、ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＨＡｄＶ－Ｃ５よりも明らかに１６．５倍低い親和性でＣＡＲに結合することを実証している。ＣＡＲとの複合体における三量体ＨＡｄＶ－Ｄ１０ノブの予測的相同性モデリングにより、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋがＣＡＲとの構造的界面を形成することができることが確認された（図１Ｄ）が、伸長されたＤＧループはＣＡＲへの結合を阻害し、立体障害の可能性のためにＨＡｄＶ－Ｃ５よりも全体的に低い親和性をもたらす（図１Ｅ）。
【0068】
本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋとＣＤ４６との間の予測された弱い相互作用が細胞の付着および感染をもたらすのに十分であるかどうかを調べた。本発明者らは、まず、予測的相同性モデリングを使用してＣＤ４６とＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋとの間の相互作用をモデリングした（図１Ｆ）。ＨＡｄＶ－Ｂ１１を、既知のＣＤ４６結合アデノウイルスとして比較として使用した。ＨＡｄＶ－Ｄ１０は、赤いダッシュで示された、ＨＡｄＶ－Ｂ１１よりもはるかに少ない潜在的結合部位を示した。したがって、本発明者らの相同性モデルは、表面プラズモン共鳴データを確認し、ＣＤ４６と形成されるいかなる潜在的な相互作用も弱いであろうことを確認する。
【0069】
本発明者らは次に、ウイルス形質導入アッセイにおけるこれらの受容体の使用を評価した。ＣＨＯ－Ｋ１細胞（既知のＨＡｄＶ受容体を発現しない）、ＣＨＯ－ＣＡＲおよびＣＨＯ－ＢＣ１細胞（それぞれＣＡＲおよびＣＤ４６を発現する）を偽型ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０ベクターに感染させた（図２Ａ）。ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞に形質導入することができなかったが、ＣＡＲ受容体の使用のためにＣＨＯ－ＣＡＲに感染することができた。ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０はＣＨＯ－ＢＣ１に形質導入することができず、やはりＨＡｄＶ－Ｄ１０によるＣＤ４６使用の重複性が強調された。これは、本発明者らのＳＰＲおよびモデリングデータの両方と一致し、ＣＤ４６の弱い結合が観察されたが、ＣＤ４６係合が生産性感染をもたらすほど十分に頑強ではないことを示唆している。したがって、ＨＡｄＶ－Ｄ１０は、細胞の付着または侵入のための機構としてＣＤ４６を使用することができない。
【0070】
ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＣＡＲに結合し、侵入受容体としてＣＡＲを使用することができることを確立した後、本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブを発現するＨＡｄＶ－Ｃ５（ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０偽型）がＣＡＲを使用して細胞に感染することができるかどうかを調べた（図２Ｂ）。ＣＨＯ－Ｋ１細胞およびＣＨＯ－ＣＡＲ細胞を、ＨＡｄＶ－Ｃ５組換えノブ（ｋｎ５）またはＹ４７７Ｔ ＣＡＲ結合変異を有するＨＡｄＶ－Ｃ５組換えノブ（ｋｎ５．ＣＡＲ－ｖｅ）のいずれかによるＣＡＲブロッキングの存在下で、ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０に感染させた。ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、付着のために利用可能な受容体の欠如のために限定的なウイルス形質導入を示した。ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０は、ブロッキングがない場合、およびｋｎ５．ＣＡＲ－ｖｅタンパク質の存在下の両方でＣＨＯ－ＣＡＲ細胞に形質導入することができたが、ｋｎ５タンパク質を使用してＣＡＲをブロックした場合、形質導入は有意に減少し、ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０がＣＡＲに結合すること、およびＣＡＲを使用することのいずれもできることが確認された。さらに、本発明者らは、赤血球凝集アッセイを行って、溶血を刺激する赤血球に対するＣＡＲの結合を評価した。ＨＡｄＶ－Ｃ５を溶血の陽性対照として使用し、消失したＣＡＲ結合を有するＨＡｄＶ－Ｃ５．ＫＯ１を陰性対照として使用した。予測されたように、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｃ５／Ｄ１０Ｋは、弱いＣＡＲ相互作用のために最小限の溶血を示した（図１３）。
【0071】
ＨＡｄＶ－Ｄ１０はＣＡＲ、ＣＤ４６およびＤＳＧ２と弱い相互作用を形成したので、それらが一次受容体として使用される可能性は低い。いくつかのＤ種アデノウイルスが、シアル酸と結合し、シアル酸を使用することが報告されている。ＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋがシアル酸を利用するかどうかを調べるために、本発明者らは、ノイラミニダーゼ処理Ａ５４９細胞をＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０に感染させた（図２Ｃ）。ノイラミニダーゼで処理した細胞は、ウイルス感染の有意な減少を示した（ｐ＝＜０．０５）。この実験は決定的ではないが、ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０が侵入受容体としてシアル酸を使用することができる可能性があることを示唆している。ＨＡｄＶ－Ｄ１０がシアル酸と結合することができるかどうかを確認するために、さらなる構造解析が必要である。
【0072】
ＨＡｄＶ－Ｄ１０は凝固第Ｘ因子（ＦＸ）と相互作用しない
ＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターを作製するために、ゲノムＤＮＡをＢＡＣ内に捕捉して、ウイルスゲノムの迅速かつ効率的な操作を可能にした（図３Ａ）。Ｅ１およびＥ３遺伝子を組換えによって欠失させてベクターを非複製性にし、Ｅ４ｏｒｆ６領域をＨＡｄＶ－Ｃ５バージョンで置き換えて２９３細胞における産生を増強した。ＧＦＰまたはルシフェラーゼマーカーをＨＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御下で挿入した。凝固第Ｘ因子（ＦＸ）は、ＨＡｄＶ－Ｃ５と相互作用し、肝臓への形質導入を媒介し、肝毒性、およびＨＡｄＶ－Ｃ５ベースのウイルス療法の治療効果の低下をもたらすことが知られている。Ａｌｂａら（５０）は、ＨＡｄＶ－Ｃ５ヘキソンのＦＸ結合領域およびこの相互作用に関与する重要なアミノ酸を、ＦＸに結合しないことが知られているＨＡｄＶ－Ｄ２６のヘキソンＨＶＲ７領域との比較によって同定した。この相互作用を消失させるための改変は、ＦＸと相互作用しないＨＡｄＶ－Ｃ５ベースの治療法を開発するために必要である。ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＦＸに結合することができるかどうかを確立するために、本発明者らは、ＦＸ結合に関与する重要なアミノ酸を強調するＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０ヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）のアラインメントを行った（図３Ｂ）。このアラインメントは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０が、ＦＸ結合を消失させると記載された変異と相同なＨＶＲ７領域内のアミノ酸を有することを実証する。したがって、本発明者らは、アミノ酸配列に基づいてＨＡｄＶ－Ｄ１０はＦＸと相互作用することができないと予測し、ウイルス形質導入アッセイを使用してこれを確認した。ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、ＦＸの存在下または非存在下でＨＡｄＶ－Ｃ５またはＨＡｄＶ－Ｄ１０のいずれかに感染させ（図３Ｃ）、ウイルスのみの対照と比較した。ＦＸの存在下でのＨＡｄＶ－Ｃ５について導入遺伝子ルシフェラーゼの産生に１３７倍の増加があったが（ｐ＝＜０．０００１）、この効果は、ＦＸの存在下での感染に有意差がなかったＨＡｄＶ－Ｄ１０感染では観察されなかった（０．８倍の変化）。これを、ＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０ ＧＦＰ発現ベクターの生体内分布によってインビボでさらに調べた（図３Ｄ）。マウスの肝臓で観察されたＧＦＰレベルは、静脈内投与の４８時間後に、ＨＡｄＶ－Ｄ１０と比較して、ＨＡｄＶ－Ｃ５で処置したマウスにおいて有意に高かった（Ｐ＝＜０．０００１）。有意に低いレベルのＧＦＰ発現もまた、ＨＡｄＶ－Ｄ１０を静脈内投与したマウスの脾臓において観察された（図１４）。まとめると、これらのデータは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＦＸ相互作用のための重要な結合残基を欠き、細胞侵入の手段としてＦＸに係合して利用することができないことを示している。
ＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターを作製するために、ゲノムＤＮＡをＢＡＣ内に捕捉して、ウイルスゲノムの迅速かつ効率的な操作を可能にした（図３Ａ）。Ｅ１およびＥ３遺伝子を組換えによって欠失させてベクターを非複製性にし、Ｅ４ｏｒｆ６領域をＨＡｄＶ－Ｃ５バージョンで置き換えて２９３細胞における産生を増強した。ＧＦＰまたはルシフェラーゼマーカーをＨＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御下で挿入した。凝固第Ｘ因子（ＦＸ）は、ＨＡｄＶ－Ｃ５と相互作用し、肝臓への形質導入を媒介し、肝毒性、およびＨＡｄＶ－Ｃ５ベースのウイルス療法の治療効果の低下をもたらすことが知られている。Ａｌｂａら（５０）は、ＨＡｄＶ－Ｃ５ヘキソンのＦＸ結合領域およびこの相互作用に関与する重要なアミノ酸を、ＦＸに結合しないことが知られているＨＡｄＶ－Ｄ２６のヘキソンＨＶＲ７領域との比較によって同定した。この相互作用を消失させるための改変は、ＦＸと相互作用しないＨＡｄＶ－Ｃ５ベースの治療法を開発するために必要である。ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＦＸに結合することができるかどうかを確立するために、本発明者らは、ＦＸ結合に関与する重要なアミノ酸を強調するＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０ヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）のアラインメントを行った（図３Ｂ）。このアラインメントは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０が、ＦＸ結合を消失させると記載された変異と相同なＨＶＲ７領域内のアミノ酸を有することを実証する。したがって、本発明者らは、アミノ酸配列に基づいてＨＡｄＶ－Ｄ１０はＦＸと相互作用することができないと予測し、ウイルス形質導入アッセイを使用してこれを確認した。ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、ＦＸの存在下または非存在下でＨＡｄＶ－Ｃ５またはＨＡｄＶ－Ｄ１０のいずれかに感染させ（図３Ｃ）、ウイルスのみの対照と比較した。ＦＸの存在下でのＨＡｄＶ－Ｃ５について導入遺伝子ルシフェラーゼの産生に１３７倍の増加があったが（ｐ＝＜０．０００１）、この効果は、ＦＸの存在下での感染に有意差がなかったＨＡｄＶ－Ｄ１０感染では観察されなかった（０．８倍の変化）。これを、ＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０ ＧＦＰ発現ベクターの生体内分布によってインビボでさらに調べた（図３Ｄ）。マウスの肝臓で観察されたＧＦＰレベルは、静脈内投与の４８時間後に、ＨＡｄＶ－Ｄ１０と比較して、ＨＡｄＶ－Ｃ５で処置したマウスにおいて有意に高かった（Ｐ＝＜０．０００１）。有意に低いレベルのＧＦＰ発現もまた、ＨＡｄＶ－Ｄ１０を静脈内投与したマウスの脾臓において観察された（図１４）。まとめると、これらのデータは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＦＸ相互作用のための重要な結合残基を欠き、細胞侵入の手段としてＦＸに係合して利用することができないことを示している。
【0073】
ＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターは、細胞侵入のためにＤＳＧ２またはＣＤ４６を使用しない
本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターがＤＳＧ２およびＣＤ４６受容体を使用する能力を評価した。ＣＨＯ－ＤＳＧ２と呼ばれる新たに作製されたＣＨＯ細胞株を所内で開発した。フローサイトメトリー分析は、ＩｇＧ対照と比較して、集団の９３％がＤＳＧ２発現について陽性であることを示した（図３Ｅ）。ＣＨＯ－Ｋ１およびＣＨＯ－ＤＳＧ２細胞を、ＤＳＧ２結合の陽性対照としてＨＡｄＶ－Ｃ５．３を有するＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターに感染させた。ＣＨＯ－Ｋ１と比較してＣＨＯ－ＤＳＧ２では有意な形質導入は観察されず、これにより、ＨＡｄＶ－Ｄ１０はＤＳＧ２を細胞侵入の受容体として使用することができないことが確認される（図３Ｆ）。
本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターがＤＳＧ２およびＣＤ４６受容体を使用する能力を評価した。ＣＨＯ－ＤＳＧ２と呼ばれる新たに作製されたＣＨＯ細胞株を所内で開発した。フローサイトメトリー分析は、ＩｇＧ対照と比較して、集団の９３％がＤＳＧ２発現について陽性であることを示した（図３Ｅ）。ＣＨＯ－Ｋ１およびＣＨＯ－ＤＳＧ２細胞を、ＤＳＧ２結合の陽性対照としてＨＡｄＶ－Ｃ５．３を有するＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターに感染させた。ＣＨＯ－Ｋ１と比較してＣＨＯ－ＤＳＧ２では有意な形質導入は観察されず、これにより、ＨＡｄＶ－Ｄ１０はＤＳＧ２を細胞侵入の受容体として使用することができないことが確認される（図３Ｆ）。
【0074】
最近の研究は、いくつかのＤ種ウイルスが、ヘキソンの直接係合を介してＣＤ４６と相互作用し得ることを示唆している。全血清型を使用して、本発明者らは、Ａｄ１０が侵入受容体としてＣＤ４６に係合することができるかどうかを調べた（図３Ｇ）。ＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０の両方を有するＣＨＯ－Ｋ１細胞と比較して、ＣＤ４６を発現するＣＨＯ細胞の感染の有意な増加はなかった。両方のウイルスベクターを用いたＣＨＯ－ＣＡＲ細胞で形質導入の増加が観察され（それぞれｐ＝＜０．０００１およびｐ＝＜０．００１）、Ａｄ１０が細胞受容体としてのＣＤ４６に係合しないことを示した。
【0075】
ＨＡｄＶ－Ｄ１０は、Ａ２０ペプチドの挿入によってαｖβ６インテグリンに再標的化され得る
次いで、ベクター化ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０偽型を、がんウイルス療法適用のための潜在的なベクターとして評価した。本発明者らは、選択的腫瘍標的化を操作するために、Ａ２０ペプチドを以前に記載されたＨＡｄＶ－Ｃ５ ＮＵＬＬベクターに組み込んだ（２７）。Ａ２０
（ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ；配列番号１）は、αｖβ６インテグリンに対して高い選択性および親和性を有する口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の２０ａａの長さのペプチドであり、正常な上皮細胞では発現されないが、激しく形質転換された上皮細胞、特に膵臓、乳房、食道および卵巣起源の悪性腫瘍の表面で一般的に発現される。Ａ２０ペプチドのアデノウイルスファイバーノブへの組み込みは、ウイルスをこれらのがん細胞に再標的化することが示されている。本発明者らは、このペプチドをＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブのＤＧループに挿入した。ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ相同性モデリングを使用して、構造を予測し、Ａ２０ペプチドを発現するＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブを比較した（図４Ａ）。このモデリングは、類似の配列同一性（９７．２４％）を共有するＨＡｄＶ－Ｄ１９ｐのファイバーノブ構造に基づいていた。ＤＧループへの組み込みは、腫瘍細胞の表面のαｖβ６インテグリンと相互作用することができる露出したＡ２０ペプチド（緑色）をもたらす。ＢＴ２０細胞は、高レベルのαｖβ６および比較的低いＣＡＲレベルを発現するので、ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０ベクターを評価するためのモデル細胞株として使用した（図４Ｂ）。ＢＴ２０細胞におけるルシフェラーゼアッセイを使用して、ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０の形質導入を測定した。細胞を５０００ｖｐ／細胞のＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－Ｄ１０、ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０またはＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０に感染させ、感染の４８時間後にルシフェラーゼ出力を測定した（図４Ｃ）。ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０は、この細胞株において低い感染性を有したＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０と比較して、有意に高いレベル（ｐ＝＜０．０００１）のルシフェラーゼを産生した。この形質導入データがαｖβ６インテグリンを介した侵入の結果であることを確認するために、ブロッキングアッセイを行った（図４Ｄ）。ＢＴ２０細胞を抗ＩｇＧおよび抗αｖβ６抗体と３０分間プレインキュベートし、ウイルス感染を氷上で１時間行って抗体が特異的受容体に結合したままであるようにしたことを除いて、実験条件は前述のように維持した。本発明者らは、ウイルスのみの条件でのＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０の形質導入が、以前のデータによるＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０と比較して有意に増加したことを示した（ｐ＝＜０．０００１）。抗αｖβ６抗体とのインキュベーションは、ウイルスのみおよびＩｇＧ対照と比較して、有意に低下した形質導入をもたらした（ｐ＝＜０．０００１）。本発明者らは、αｖβ６インテグリンをブロックするための特異的抗αｖβ６抗体の使用がウイルス結合を妨げることを観察した。これらの結果は、ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０が、Ａ２０ペプチドによって媒介される腫瘍選択的細胞侵入受容体としてαｖβ６インテグリンに係合して利用することができることを示している。
次いで、ベクター化ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０偽型を、がんウイルス療法適用のための潜在的なベクターとして評価した。本発明者らは、選択的腫瘍標的化を操作するために、Ａ２０ペプチドを以前に記載されたＨＡｄＶ－Ｃ５ ＮＵＬＬベクターに組み込んだ（２７）。Ａ２０
（ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ；配列番号１）は、αｖβ６インテグリンに対して高い選択性および親和性を有する口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の２０ａａの長さのペプチドであり、正常な上皮細胞では発現されないが、激しく形質転換された上皮細胞、特に膵臓、乳房、食道および卵巣起源の悪性腫瘍の表面で一般的に発現される。Ａ２０ペプチドのアデノウイルスファイバーノブへの組み込みは、ウイルスをこれらのがん細胞に再標的化することが示されている。本発明者らは、このペプチドをＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブのＤＧループに挿入した。ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ相同性モデリングを使用して、構造を予測し、Ａ２０ペプチドを発現するＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブを比較した（図４Ａ）。このモデリングは、類似の配列同一性（９７．２４％）を共有するＨＡｄＶ－Ｄ１９ｐのファイバーノブ構造に基づいていた。ＤＧループへの組み込みは、腫瘍細胞の表面のαｖβ６インテグリンと相互作用することができる露出したＡ２０ペプチド（緑色）をもたらす。ＢＴ２０細胞は、高レベルのαｖβ６および比較的低いＣＡＲレベルを発現するので、ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０ベクターを評価するためのモデル細胞株として使用した（図４Ｂ）。ＢＴ２０細胞におけるルシフェラーゼアッセイを使用して、ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０の形質導入を測定した。細胞を５０００ｖｐ／細胞のＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－Ｄ１０、ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０またはＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０に感染させ、感染の４８時間後にルシフェラーゼ出力を測定した（図４Ｃ）。ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０は、この細胞株において低い感染性を有したＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０と比較して、有意に高いレベル（ｐ＝＜０．０００１）のルシフェラーゼを産生した。この形質導入データがαｖβ６インテグリンを介した侵入の結果であることを確認するために、ブロッキングアッセイを行った（図４Ｄ）。ＢＴ２０細胞を抗ＩｇＧおよび抗αｖβ６抗体と３０分間プレインキュベートし、ウイルス感染を氷上で１時間行って抗体が特異的受容体に結合したままであるようにしたことを除いて、実験条件は前述のように維持した。本発明者らは、ウイルスのみの条件でのＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０の形質導入が、以前のデータによるＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０と比較して有意に増加したことを示した（ｐ＝＜０．０００１）。抗αｖβ６抗体とのインキュベーションは、ウイルスのみおよびＩｇＧ対照と比較して、有意に低下した形質導入をもたらした（ｐ＝＜０．０００１）。本発明者らは、αｖβ６インテグリンをブロックするための特異的抗αｖβ６抗体の使用がウイルス結合を妨げることを観察した。これらの結果は、ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０が、Ａ２０ペプチドによって媒介される腫瘍選択的細胞侵入受容体としてαｖβ６インテグリンに係合して利用することができることを示している。
【0076】
ＨＡｄＶ－Ｄ１０．ＤＧ．Ａ２０はαｖβ６インテグリンを介して複数のがん細胞株に感染する
偽型αｖβ６標的ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０ベクターの作製に加えて、本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０ベクターと同じ位置でＡ２０をＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターに挿入することによって、αｖβ６を標的とする全ＨＡｄＶ－Ｄ１０血清型を作製した。これらのベクターのがん選択性を決定するために、本発明者らは、様々なレベルのαｖβ６インテグリンおよびＣＡＲを発現するいくつかのがん細胞株における形質導入を評価した（図５）。Ａ５４９、ＢＴ２０およびＫｙｓｅ ３０細胞株は、それぞれ肺癌、乳癌および食道扁平上皮癌に由来している。αｖβ６インテグリンおよびＣＡＲの細胞表面レベルをフローサイトメトリーによって評価し、表に示した。Ａ５４９は、αｖβ６インテグリンについて陰性であり、ＣＡＲ陽性であると考えられ、Ｋｙｓｅ ３０細胞は、αｖβ６インテグリンおよびＣＡＲの両方を高レベルで発現する。
偽型αｖβ６標的ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０ベクターの作製に加えて、本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｃ５／ｋｎ１０．ＤＧ．Ａ２０ベクターと同じ位置でＡ２０をＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターに挿入することによって、αｖβ６を標的とする全ＨＡｄＶ－Ｄ１０血清型を作製した。これらのベクターのがん選択性を決定するために、本発明者らは、様々なレベルのαｖβ６インテグリンおよびＣＡＲを発現するいくつかのがん細胞株における形質導入を評価した（図５）。Ａ５４９、ＢＴ２０およびＫｙｓｅ ３０細胞株は、それぞれ肺癌、乳癌および食道扁平上皮癌に由来している。αｖβ６インテグリンおよびＣＡＲの細胞表面レベルをフローサイトメトリーによって評価し、表に示した。Ａ５４９は、αｖβ６インテグリンについて陰性であり、ＣＡＲ陽性であると考えられ、Ｋｙｓｅ ３０細胞は、αｖβ６インテグリンおよびＣＡＲの両方を高レベルで発現する。
【0077】
ＨＡｄＶ－Ｃ５．ＲＧＥ．ＫＯ１．Ａ２０は、ファイバーノブドメインのＨＩループにＡ２０ペプチドを提示するように改変されたＨＡｄＶ－Ｃ５ベクターを指し、これはまた、ペントンベースにＲＧＤ／Ｅ変異を有して細胞インテグリンへの結合を防止し、ファイバーノブドメイン（ＫＯ１）に変異を有してＣＡＲ結合を消失させ、したがって、このウイルスは、天然の細胞受容体に対して消失し、αｖβ６インテグリンを発現する細胞にのみ感染することができる。予想されたように、αｖβ６インテグリン係合ウイルスは、αｖβ６受容体の欠如のためにＡ５４９細胞に感染することができなかった。ＨＡｄＶ－Ｃ５．ＲＧＥ．ＫＯ１．Ａ２０は、αｖβ６発現ＢＴ２０細胞株およびＫｙｓｅ ３０細胞株の両方に容易に感染する。興味深いことに、ＨＡｄＶ－Ｄ１０は、３つすべての細胞株において限定的な感染力を示す。Ａ２０ペプチドの導入は、αｖβ６インテグリンを介してＢＴ２０細胞株およびＫｙｓｅ ３０細胞株の両方に感染するＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０の能力を有意に増加させた（ｐ＝＜０．０００１）。
【0078】
Ｋｙｓｅ ３０細胞における標識ＨＡｄＶ－Ｄ１０．ＤＧ．Ａ２０の増加した形質導入
Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８で標識したＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０を使用して、これらのウイルスの細胞内輸送を比較した。Ｋｙｓｅ－３０細胞を、感染前にカバースリップ上に２５０００ｖｐ／細胞および５００００ｖｐ／細胞で播種した。感染の７２時間後に細胞を固定して取り付けた。共焦点顕微鏡を使用して、ウイルス形質導入の差を評価した（図６Ａ）。以前に実証されたように、両方のウイルス濃度でＫｙｓｅ ３０細胞におけるＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０の取り込みの増加があった。このデータは、細胞あたりのウイルス粒子の数として定量されている（図６Ｂ）。ＨＡｄＶ－Ｄ１０は、ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０よりも有意に少ないウイルス／細胞（ｐ＝＜０．０００１）を含有することが示され、これは、図５に示される形質導入データを支持する。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８で標識したＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０を使用して、これらのウイルスの細胞内輸送を比較した。Ｋｙｓｅ－３０細胞を、感染前にカバースリップ上に２５０００ｖｐ／細胞および５００００ｖｐ／細胞で播種した。感染の７２時間後に細胞を固定して取り付けた。共焦点顕微鏡を使用して、ウイルス形質導入の差を評価した（図６Ａ）。以前に実証されたように、両方のウイルス濃度でＫｙｓｅ ３０細胞におけるＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０の取り込みの増加があった。このデータは、細胞あたりのウイルス粒子の数として定量されている（図６Ｂ）。ＨＡｄＶ－Ｄ１０は、ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０よりも有意に少ないウイルス／細胞（ｐ＝＜０．０００１）を含有することが示され、これは、図５に示される形質導入データを支持する。
【0079】
ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０は高度に中和する血清の存在下で中和されない
ＨＡｄＶ－Ｃ５ベースの腫瘍溶解薬の有効性の低下の一因となる主な障害は、ＨＡｄＶ－Ｃ５に対する既存の免疫を呈する患者の割合である。ＨＡｄＶ－Ｄ１０などの代替的な稀な血清型の使用は、より広い集団に有効な治療法を提供し得るが、患者がその疾患の経過にわたってＨＡｄＶ－Ｃ５ベースのウイルス療法に対する免疫を発達させた場合には、有益な第２の治療ラインも提供し得る。本発明者らは、ＫＹＳＥ－３０細胞の形質導入に関する、ＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターと、ＨＡｄＶ－Ｃ５に対して高度に中和することが知られている患者血清とのプレインキュベーション（図７Ａ）の効果を調べた。
ＨＡｄＶ－Ｃ５ベースの腫瘍溶解薬の有効性の低下の一因となる主な障害は、ＨＡｄＶ－Ｃ５に対する既存の免疫を呈する患者の割合である。ＨＡｄＶ－Ｄ１０などの代替的な稀な血清型の使用は、より広い集団に有効な治療法を提供し得るが、患者がその疾患の経過にわたってＨＡｄＶ－Ｃ５ベースのウイルス療法に対する免疫を発達させた場合には、有益な第２の治療ラインも提供し得る。本発明者らは、ＫＹＳＥ－３０細胞の形質導入に関する、ＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０ベクターと、ＨＡｄＶ－Ｃ５に対して高度に中和することが知られている患者血清とのプレインキュベーション（図７Ａ）の効果を調べた。
【0080】
ＨＡｄＶ－Ｃ５は、最低濃度の血清（２．５％）でも有効に中和された。ＨＡｄＶ－Ｃ５．ＲＧＥ．ＫＯ１．Ａ２０は、より高い濃度の血清を必要としたが、＞２０％の血清の存在によって有効に中和することができた。ＨＡｄＶ－Ｄ１０の場合、すべての濃度で感染性レベルが低いため、中和血清の効果を検出することはできなかった。しかしながら、ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０は、Ｋｙｓｅ ３０細胞に感染し、試験した血清の最高濃度（４０％）でさえ中和に抵抗することができた。倍率変化として定量した場合（図７Ｂ）、これは、４０％血清中のＨＡｄＶ－Ｃ５（６８７２倍）およびＨＡｄＶ－Ｃ５．ＲＧＥ．ＫＯ１．Ａ２０（２１００倍）の両方の感染における＞２０００倍の減少と比較して、ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０では０．７～１．５の倍率変化の変動をもたらした。これらの変化が統計学的に有意であることを確認するために、本発明者らは、各血清希釈液をウイルスのみに感染した細胞と比較する分析を行い、これを明瞭性のために別々にプロットした（図７Ｃ）。ＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｃ５．ＲＧＥ．ＫＯ１．Ａ２０は、あらゆる濃度の血清の存在下で感染の有意な低下を示した（ｐ＝＜０．０００１）。ＨＡｄＶ－Ｄ１０は、その基礎レベルの感染性のために、いかなる有意性も示さなかった。ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０は、２０％血清まで、中和抗体の結果として有効性の減少を示す有意性の変化を示さなかった。ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０感染は、最高濃度でのみウイルスと比較して低下したが（ｐ＝０．０５）、これはＨＡｄＶ－Ｃ５ベースのベクターで見られる効果と比較して小さい効果であった。これらのデータは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０が、ＨＡｄＶ－Ｃ５ベースのベクターで観察される中和を取り巻く問題を回避する有望なベクターを提供し得ることを示唆している。
【0081】
本発明者らは、インビボでのαｖβ６標的化を評価した。皮下ＢＴ２０異種移植片を有する雌ＮＳＧマウスに、静脈内注射によってＧＦＰ発現ＨＡｄＶベクターを全身接種した。肝臓および腫瘍を感染の７２時間後に採取した（図７Ｄ）。個々のコホート内で変動が観察された（ｎ＝５）。肝臓、肺および脾臓のＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０のＧＦＰレベルに有意な変化はなかったが、ＨＡｄＶ－Ｄ１０と比較して腫瘍で観察されたＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０によって媒介されるＧＦＰ発現の有意な増加があった（ｐ＝＜０．０５）。
【0082】
野生型複製能ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０ウイルス療法を使用したαｖβ６依存性腫瘍細胞殺傷の増強
本発明者らは、ウイルス療法として野生型複製能ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０の腫瘍細胞殺傷を調べた。２つの細胞株を５０００ｖｐ／細胞のＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０野生型に感染させた（図８）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、感染の７２時間後に細胞生存率を測定した。本発明者らは、野生型ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０がαｖβ６インテグリンを介してＢＴ２０細胞に感染し、有意な細胞死を引き起こすことができることを実証した（ｐ＝＜０．０００１）。ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０による細胞殺傷は、αｖβ６インテグリンを発現しないＡ５４９細胞では観察されなかった。野生型ＨＡｄＶ－Ｃ５感染Ａ５４９細胞は生存率の減少を引き起こした（ｐ＝＜０．０００１）が、低ＣＡＲ ＢＴ２０細胞株では有意な効果は観察されなかった。野生型ＨＡｄＶ－Ｄ１０は、７２時間でＡ５４９細胞またはＢＴ２０細胞のいずれにおいても有意な細胞死を引き起こさなかった。
本発明者らは、ウイルス療法として野生型複製能ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０の腫瘍細胞殺傷を調べた。２つの細胞株を５０００ｖｐ／細胞のＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０野生型に感染させた（図８）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、感染の７２時間後に細胞生存率を測定した。本発明者らは、野生型ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０がαｖβ６インテグリンを介してＢＴ２０細胞に感染し、有意な細胞死を引き起こすことができることを実証した（ｐ＝＜０．０００１）。ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０による細胞殺傷は、αｖβ６インテグリンを発現しないＡ５４９細胞では観察されなかった。野生型ＨＡｄＶ－Ｃ５感染Ａ５４９細胞は生存率の減少を引き起こした（ｐ＝＜０．０００１）が、低ＣＡＲ ＢＴ２０細胞株では有意な効果は観察されなかった。野生型ＨＡｄＶ－Ｄ１０は、７２時間でＡ５４９細胞またはＢＴ２０細胞のいずれにおいても有意な細胞死を引き起こさなかった。
【0083】
本発明者らは、次いで、インビトロ有効性に基づいて、これがインビボで有効であり得るかどうかを決定した。ＢＴ２０異種移植片を有するヌードマウスに、複製能ウイルス療法により腫瘍内注射し、腫瘍成長に対する効果をモニタリングした（図８Ｂ）。ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０の直接腫瘍内投与は、ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＰＢＳと比較した場合、８日後に腫瘍体積の有意な低下をもたらした。ＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ Ｄ１０．Ａ２０ウイルス療法で処置したマウスでは、予想外の毒性または体重減少の明白な徴候は観察されなかった。腫瘍切片を、細胞死のマーカーであるガンマＨ２ＡＸについて染色し、細胞死は、ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０処置腫瘍では観察されたが、ＨＡｄＶ－Ｄ１０またはＰＢＳ処置腫瘍では観察されなかった（図１５）。
【0084】
インビボでのＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０の生体内分布
最後に、本発明者らは、インビボでのＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０の生体内分布を評価した。皮下ＢＴ－２０異種移植片を有する雌ＮＳＧマウスに、ＧＦＰ発現ＨＡｄＶベクターを接種した。肝臓、肺、脾臓、心臓、腎臓および腫瘍を感染の７２時間後に採取した。ＧＦＰ ＳｉｍｐｌｅＳＴＥＰ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ）に従ってタンパク質を抽出し、総タンパク質５０μでＧＦＰレベルを測定した（図９）。ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０は心臓を除く各臓器でより優勢であった。上昇はあったが、肝臓、肺、心臓、腎臓および脾臓のＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０のＧＦＰレベルに有意な変化はなかった。ＨＡｄＶ－Ｄ１０と比較して、腫瘍においてＨＡｄＶ－Ｄ．Ａ２０の有意な増加が観察された（ｐ＝＜０．０５）。
最後に、本発明者らは、インビボでのＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０の生体内分布を評価した。皮下ＢＴ－２０異種移植片を有する雌ＮＳＧマウスに、ＧＦＰ発現ＨＡｄＶベクターを接種した。肝臓、肺、脾臓、心臓、腎臓および腫瘍を感染の７２時間後に採取した。ＧＦＰ ＳｉｍｐｌｅＳＴＥＰ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ）に従ってタンパク質を抽出し、総タンパク質５０μでＧＦＰレベルを測定した（図９）。ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０は心臓を除く各臓器でより優勢であった。上昇はあったが、肝臓、肺、心臓、腎臓および脾臓のＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０のＧＦＰレベルに有意な変化はなかった。ＨＡｄＶ－Ｄ１０と比較して、腫瘍においてＨＡｄＶ－Ｄ．Ａ２０の有意な増加が観察された（ｐ＝＜０．０５）。
【0085】
考察
本発明者らは、ウイルス療法として使用するための新規なＤ種アデノウイルス、ＨＡｄＶ－Ｄ１０の適合性を評価した。ＨＡｄＶ－Ｄ１０を取り巻く文献は極めて限定的であり、その病理学に主に焦点を当てている。したがって、本発明者らは、ファイバーノブ構造ならびにＣＡＲ、ＣＤ４６およびＤＳＧ２との結合を含むその結合能力を研究することによって、受容体相互作用のさらなる理解を目指した。ＤＳＧ２結合は、最も弱い相互作用を有するにもかかわらず、これまでにＢＩＩ種アデノウイルスの受容体としてのみ記載されているので、特に興味深い。十分に記載されたＤＳＧ２使用者であるＨＡｄＶ－Ｂ３もまた、低い親和性でＤＳＧ２に結合する。さらなる調査で、本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＣＨＯ－ＤＳＧ２細胞に感染することができないことを実証し、したがって、他のＤ種アデノウイルスと同様に、ＨＡｄＶ－Ｄ１０はＤＳＧ２を細胞受容体として使用しないと考えた。観察された最も高いＨＡｄＶ－Ｄ１０親和性相互作用はＣＡＲとのものであった。組換えＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋタンパク質を使用して、本発明者らは、ＩＣ５０値によって示されるように、ＨＡｄＶ－Ｃ５ｋよりも１６．５倍低い親和性でＣＡＲにインビトロで結合することを確認した。本発明者らは、結合は弱いが、ＨＡｄＶ－Ｄ１０はＣＡＲに結合し、それを侵入受容体として使用することができると結論付けた。さらに、本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＣＤ４６と弱い相互作用を形成するのみであり、細胞を感染させるのに十分ではないと決定した。予備実験は、ＨＡｄＶ－Ｄ１０が細胞侵入の機構としてシアル酸を利用することができることを示唆している。
本発明者らは、ウイルス療法として使用するための新規なＤ種アデノウイルス、ＨＡｄＶ－Ｄ１０の適合性を評価した。ＨＡｄＶ－Ｄ１０を取り巻く文献は極めて限定的であり、その病理学に主に焦点を当てている。したがって、本発明者らは、ファイバーノブ構造ならびにＣＡＲ、ＣＤ４６およびＤＳＧ２との結合を含むその結合能力を研究することによって、受容体相互作用のさらなる理解を目指した。ＤＳＧ２結合は、最も弱い相互作用を有するにもかかわらず、これまでにＢＩＩ種アデノウイルスの受容体としてのみ記載されているので、特に興味深い。十分に記載されたＤＳＧ２使用者であるＨＡｄＶ－Ｂ３もまた、低い親和性でＤＳＧ２に結合する。さらなる調査で、本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＣＨＯ－ＤＳＧ２細胞に感染することができないことを実証し、したがって、他のＤ種アデノウイルスと同様に、ＨＡｄＶ－Ｄ１０はＤＳＧ２を細胞受容体として使用しないと考えた。観察された最も高いＨＡｄＶ－Ｄ１０親和性相互作用はＣＡＲとのものであった。組換えＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋタンパク質を使用して、本発明者らは、ＩＣ５０値によって示されるように、ＨＡｄＶ－Ｃ５ｋよりも１６．５倍低い親和性でＣＡＲにインビトロで結合することを確認した。本発明者らは、結合は弱いが、ＨＡｄＶ－Ｄ１０はＣＡＲに結合し、それを侵入受容体として使用することができると結論付けた。さらに、本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＣＤ４６と弱い相互作用を形成するのみであり、細胞を感染させるのに十分ではないと決定した。予備実験は、ＨＡｄＶ－Ｄ１０が細胞侵入の機構としてシアル酸を利用することができることを示唆している。
【0086】
ＨＡｄＶ－Ｃ５およびＨＡｄＶ－Ｄ１０超可変領域のアラインメントは、ＨＡｄＶ－Ｃ５ ＨＶＲ７中に存在する重要なＦＸ結合領域がＨＡｄＶ－Ｄ１０ヘキソン中に存在しないことを同定した。ＨＡｄＶ－Ｄ１０はＦＸと相互作用せず、したがって、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ベースのウイルス療法は、ＨＡｄＶ－Ｃ５ベースの治療法を使用して観察される肝臓における「オフターゲット」分離を回避することができる。
【0087】
Ａ２０ペプチドをＨＡｄＶ－Ｄ１０のファイバーノブのＤＧループに挿入した。Ａ２０は、卵巣がん、膵臓がん、乳がんおよび食道がんを含むいくつかのがん種においてアップレギュレートされるαｖβ６インテグリンにＨＡｄＶ－Ｃ５を再標的化するためにこれまでに使用されている。
【0088】
本発明者らはまた、ウイルス形質導入に対する患者血清中に見られる中和抗体の効果を調べた。ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０は、４０％血清の存在下であっても中和されなかったことから、ＨＡｄＶ－Ｄ１０は、既存の免疫を回避するための、現在使用されているＨＡｄＶ－Ｃ５ベースのウイルス療法の魅力的な代替法を提供し得ることが示唆される。
【0089】
本発明者らは、野生型およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０を使用して腫瘍特異的細胞殺傷を調べた。ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０は、αｖβ６インテグリンの係合を介してＢＴ２０細胞に感染することができ、有意な細胞死をもたらした。
【0090】
本発明者らは、全身適用後のインビボでのＧＦＰ発現ベクターの腫瘍および肝臓取り込みを比較し、Ａ２０ペプチドの組み込みによる腫瘍選択的形質導入の増加を実証したが、標的組織の他の形質導入は増強されず、全身投与後のＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０のαｖβ６陽性腫瘍への標的化の成功を示した。
【0091】
最後に、本発明者らは、αｖβ６低／ＣＡＲ高 Ａ５４９およびαｖβ６高／ＣＡＲ低 ＢＴ２０細胞におけるＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０の殺腫瘍活性を調べた。ＨＡｄＶ－Ｃ５は、ＣＡＲを介してＡ５４９細胞を殺傷したが、ＢＴ２０細胞を殺傷しなかった。ＨＡｄＶ－Ｄ１０は、両方の細胞株において一貫して低レベルの活性を示した。ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０は、αｖβ６インテグリンの係合を介してＢＴ２０細胞に感染し、有意な細胞死をもたらした。本発明者らは、ＩＴ注射によってＢＴ２０異種移植片を有するマウスにＨＡｄＶ－Ｄ１０およびＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０を投与し、ＰＢＳおよびＨＡｄＶ－Ｄ１０と比較した場合、ＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０の投与の９日後に腫瘍体積の有意な減少を観察した。したがって、本発明者らは、がん特異的細胞殺傷が可能であり、さらなる脱標的化改変を必要とせずにインビボで有効性を示したＨＡｄＶ－Ｄ１０の高度に腫瘍選択的なバージョンを開発した。
【0092】
したがって、本発明者らは、がん特異的細胞殺傷が可能であり、さらなる脱標的化改変を必要とせずにインビボで有効性を示した高度に標的化されたバージョンのＨＡｄＶ－Ｄ１０を開発した。
【0093】
まとめ
本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブの最初に報告された構造を作製し、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋが、ＣＡＲ、ＣＤ４６、ＤＳＧ２およびシアル酸を含むいくつかの既知のアデノウイルス受容体と弱い相互作用を形成することができることを実証した。本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＦＸに結合しないこと、すなわち、全身送達した場合にＨＡｄＶ－Ｄ１０ベースのウイルス療法の薬物動態を改善し、肝臓における「オフターゲット」取り込みを減少させ得る特徴を実証した。本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０が細胞株にわたって限定的レベルの感染性を有することを同定した。これをプラットフォームとして使用して、本発明者らは、腫瘍選択性において操作し、本発明者らは、高度に中和する血清の存在下でさえ、アップレギュレートされたαｖβ６インテグリン発現を有するがん細胞に感染して殺傷するＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０ウイルスの作製に成功した。したがって、本発明者らの知見は、再標的化されたＨＡｄＶ－Ｄ１０ベースのベクターが、天然の受容体とのオフターゲット相互作用を低下させて、高親和性「オンターゲット」腫瘍関連受容体への向性を操作するためのプラットフォームを提供することと、集団中の既存の抗ＨＡｄＶ－Ｃ５免疫を回避する能力とを組み合わせて、高い治療能を提供し得ることを強調している。ＨＡｄＶ－Ｄ１０は、より広い集団に有効な治療法を提供し得るが、ＨＡｄＶ－Ｃ５ベースのウイルス療法に対する治療関連免疫を獲得した患者の場合には、有益な第２の治療ラインも提供し得る。
本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ファイバーノブの最初に報告された構造を作製し、ＨＡｄＶ－Ｄ１０ｋが、ＣＡＲ、ＣＤ４６、ＤＳＧ２およびシアル酸を含むいくつかの既知のアデノウイルス受容体と弱い相互作用を形成することができることを実証した。本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０がＦＸに結合しないこと、すなわち、全身送達した場合にＨＡｄＶ－Ｄ１０ベースのウイルス療法の薬物動態を改善し、肝臓における「オフターゲット」取り込みを減少させ得る特徴を実証した。本発明者らは、ＨＡｄＶ－Ｄ１０が細胞株にわたって限定的レベルの感染性を有することを同定した。これをプラットフォームとして使用して、本発明者らは、腫瘍選択性において操作し、本発明者らは、高度に中和する血清の存在下でさえ、アップレギュレートされたαｖβ６インテグリン発現を有するがん細胞に感染して殺傷するＨＡｄＶ－Ｄ１０．Ａ２０ウイルスの作製に成功した。したがって、本発明者らの知見は、再標的化されたＨＡｄＶ－Ｄ１０ベースのベクターが、天然の受容体とのオフターゲット相互作用を低下させて、高親和性「オンターゲット」腫瘍関連受容体への向性を操作するためのプラットフォームを提供することと、集団中の既存の抗ＨＡｄＶ－Ｃ５免疫を回避する能力とを組み合わせて、高い治療能を提供し得ることを強調している。ＨＡｄＶ－Ｄ１０は、より広い集団に有効な治療法を提供し得るが、ＨＡｄＶ－Ｃ５ベースのウイルス療法に対する治療関連免疫を獲得した患者の場合には、有益な第２の治療ラインも提供し得る。
【0094】
したがって、そのようなウイルス療法は、免疫ウイルス療法の全身送達を成功させるためのプラットフォームとして大きな将来性を有する。
【表1】
【表2】
【0095】
参考文献
２７．Ｈ．Ｕｕｓｉ－Ｋｅｒｔｔｕｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄ５ＮＵＬＬ－Ａ２０－ａ ｔｒｏｐｉｓｍ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ，αｖβ６ ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．２４，４２１５－４２２４（２０１８）
４８．Ａ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｉｂｅｒ ｋｎｏｂ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０，７４１（２０１９）
５０．Ｒ．Ａｌｂａ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（Ｆ）Ｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ５ ｈｅｘｏｎ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｎ ＦＸ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｂｌｏｏｄ １１４，９６５－９７１（２００９）
３３．Ｈ．Ｕｕｓｉ－Ｋｅｒｔｔｕｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ αｖβ６ ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７，２７９２６－２７９３７（２０１６）
４９．Ｒ．Ｊ．Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｂ．Ｐ．ＭｃＳｈａｒｒｙ，Ｍ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｐ．Ｔｏｍａｓｅｃ，Ｇ．Ｗ．Ｇ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｒｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｔｏ ｅｎａｂｌｅ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４５，６５９－６６８（２００８）
２７．Ｈ．Ｕｕｓｉ－Ｋｅｒｔｔｕｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄ５ＮＵＬＬ－Ａ２０－ａ ｔｒｏｐｉｓｍ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ，αｖβ６ ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．２４，４２１５－４２２４（２０１８）
４８．Ａ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｉｂｅｒ ｋｎｏｂ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０，７４１（２０１９）
５０．Ｒ．Ａｌｂａ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（Ｆ）Ｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ５ ｈｅｘｏｎ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｎ ＦＸ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｂｌｏｏｄ １１４，９６５－９７１（２００９）
３３．Ｈ．Ｕｕｓｉ－Ｋｅｒｔｔｕｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ αｖβ６ ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７，２７９２６－２７９３７（２０１６）
４９．Ｒ．Ｊ．Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｂ．Ｐ．ＭｃＳｈａｒｒｙ，Ｍ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｐ．Ｔｏｍａｓｅｃ，Ｇ．Ｗ．Ｇ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｒｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｔｏ ｅｎａｂｌｅ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４５，６５９－６６８（２００８）
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】