特表 2024-513087 部位特異的改変のための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-21

(54)【発明の名称】部位特異的改変のための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240313BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240313BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240313BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240313BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20240313BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240313BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20240313BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240313BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20240313BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20240313BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/12

C12N5/10

C12N9/22

C12N15/11 Z

C12N15/55

C07K19/00

C07K14/47

C07K14/195

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023561238

(86)(22)【出願日】2022-04-06

(85)【翻訳文提出日】2023-10-04

(86)【国際出願番号】 EP2022059070

(87)【国際公開番号】W WO2022214522

(87)【国際公開日】2022-10-13

(31)【優先権主張番号】63/171,651

(32)【優先日】2021-04-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/292,144

(32)【優先日】2021-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】391008951

【氏名又は名称】アストラゼネカ・アクチエボラーグ

【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】リィ，ソンユエン

(72)【発明者】

【氏名】マレスカ，マルチェッロ

(72)【発明者】

【氏名】スヴィコヴィッチ，サーシャ

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA11

4H045CA40

4H045DA89

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本開示はまた、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼ、並びにガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。本開示は更に、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼ、及びＤＮＡポリメラーゼ動員部分を含む融合タンパク質を提供する。また、細胞の標的ＤＮＡにおいて標的挿入を提供するための方法も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）ＲＮＡガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ＤＮＡ鋳型配列が、前記ポリヌクレオチドの３’末端にある、ポリヌクレオチド。

【請求項2】

前記ＤＮＡ鋳型配列が、修飾ヌクレオチド、非Ｂ型ＤＮＡ構造体、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分、ＤＮＡリガーゼ動員部分、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項3】

前記修飾ヌクレオチドが、脱塩基部位、共有結合リンカー、異種核酸（ＸＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート結合、ＤＮＡ損傷体、ＤＮＡ光産物、修飾デオキシリボヌクレオシド、メチル化ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

前記共有結合リンカーが、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項5】

前記ＤＮＡ損傷体が、８－オキソグアニン、チミン－グリコール、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項6】

前記ＤＮＡ光産物が、シクロブタンピリミジン二量体（ＣＰＤ）、ピリミジン（６－４）ピリミドン光産物、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項7】

前記修飾デオキシリボヌクレオシドが、デオキシウリジンを含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項8】

前記メチル化ヌクレオチドが、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－メチルシトシン、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項9】

前記非Ｂ型ＤＮＡ構造体が、ヘアピン、十字形、Ｚ－ＤＮＡ、Ｈ－ＤＮＡ（三重らせんＤＮＡ）、グアニン四重鎖ＤＮＡ（四重らせんＤＮＡ）、スリップＤＮＡ、粘着性ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項10】

前記ＤＮＡポリメラーゼ動員部分が、前記ＤＮＡ鋳型配列に連結されたＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質を含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項11】

前記ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質が、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質（ＴＮＦＡＩＰ）、ポリメラーゼデルタ相互作用タンパク質（ＰｏｌＤＩＰ）、Ｘ線修復交差補完タンパク質（ＸＲＣＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン結合ＥＳ細胞特異的（ＨＭＣＥＳ）タンパク質、ＲＡＤ１、ＲＡＤ９、ＨＵＳ１、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項12】

前記ＤＮＡリガーゼ動員部分が、前記ＤＮＡ鋳型配列の５’アデニル化からなる、請求項２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項13】

（ｉ）ＲＮＡガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ＤＮＡ鋳型配列が前記ポリヌクレオチドの３’末端にあり、前記ＤＮＡ鋳型配列がホスホロチオエート結合を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項14】

前記ＤＮＡ鋳型配列が、プライマー結合配列及び目的配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項15】

前記Ｃａｓ結合領域がＲＮＡを含むか、又は前記Ｃａｓ結合領域がＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項16】

前記Ｃａｓ結合領域が、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項17】

前記Ｃａｓ結合領域が、ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズすることができる、請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項18】

前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、Ｃａｓヌクレアーゼに結合することができる、請求項１６又は１７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項19】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項20】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ＩＩ－Ｂ型Ｃａｓである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項21】

前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、Ｃａｓニッカーゼに結合することができる、請求項１６又は１７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項22】

前記Ｃａｓニッカーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、又はＩＩ－Ｂ型Ｃａｓニッカーゼである、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項23】

前記ＤＮＡ鋳型配列が、約８～約１００００ヌクレオチド長である、請求項１～２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項24】

前記プライマー結合配列が、約４～約３００ヌクレオチド長である、請求項１４～２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項25】

前記目的配列が、約４～約１００ヌクレオチド長である、請求項１４～２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項26】

前記ＲＮＡガイド配列が、約１５～約２５ヌクレオチド長である、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項27】

前記Ｃａｓ結合領域と前記ＤＮＡ鋳型配列との間に位置するスペーサーを更に含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項28】

前記スペーサーが、ＤＮＡポリメラーゼの停止配列を含む、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項29】

前記スペーサーが、２つ以上の停止配列を含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項30】

前記停止配列が、二次構造から構成される、請求項２８又は２９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項31】

前記二次構造が、ステムループから構成される、請求項３０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項32】

前記スペーサーが、約１０～約２００ヌクレオチド長である、請求項２７～３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項33】

請求項１～３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。

【請求項34】

Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、
（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ＤＮＡ鋳型配列が前記ポリヌクレオチドの３’末端にある、ポリヌクレオチドと、
を含む組成物。

【請求項35】

Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、
（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、前記第１のハイブリダイゼーション領域が前記第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、
（ｉ）前記第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含む、第２のポリヌクレオチドと、
を含む組成物。

【請求項36】

Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、
（ｉ）ガイド配列、及び（ｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、前記第１のハイブリダイゼーション領域が前記第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、
（ｉ）前記第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含む第２のポリヌクレオチドと、
を含む組成物。

【請求項37】

前記ＤＮＡ鋳型配列が、プライマー結合配列及び目的配列を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項38】

前記ＤＮＡ鋳型配列が、修飾ヌクレオチド、非Ｂ型ＤＮＡ構造体、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分、ＤＮＡリガーゼ動員部分、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項39】

前記修飾ヌクレオチドが、脱塩基部位、共有結合リンカー、異種核酸（ＸＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート結合、ＤＮＡ損傷体、ＤＮＡ光産物、修飾デオキシリボヌクレオシド、メチル化ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３８に記載の組成物。

【請求項40】

前記修飾ヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項41】

前記共有結合リンカーが、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）を含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項42】

前記ＤＮＡ損傷体が、８－オキソグアニン、チミン－グリコール、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項43】

前記ＤＮＡ光産物が、シクロブタンピリミジン二量体（ＣＰＤ）、ピリミジン（６－４）ピリミドン光産物、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項44】

前記デオキシリボヌクレオシドが、デオキシウリジンを含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項45】

前記メチル化ヌクレオチドが、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－メチルシトシン、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項46】

前記非Ｂ型ＤＮＡ構造体が、ヘアピン、十字形、Ｚ－ＤＮＡ、Ｈ－ＤＮＡ（三重らせんＤＮＡ）、グアニン四重鎖ＤＮＡ（四重らせんＤＮＡ）、スリップＤＮＡ、粘着性ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３８に記載の組成物。

【請求項47】

前記ＤＮＡポリメラーゼ動員部分が、前記ＤＮＡ鋳型配列に連結されたＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質から構成される、請求項３８に記載の組成物。

【請求項48】

前記ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質が、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質（ＴＮＦＡＩＰ）、ポリメラーゼデルタ相互作用タンパク質（ＰｏｌＤＩＰ）、Ｘ線修復交差補完タンパク質（ＸＲＣＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン結合ＥＳ細胞特異的（ＨＭＣＥＳ）タンパク質、ＲＡＤ１、ＲＡＤ９、ＨＵＳ１、又はこれらの組み合わせを含む、請求項４７に記載の組成物。

【請求項49】

前記ＤＮＡリガーゼ動員部分が、前記ＤＮＡ鋳型配列の５’アデニル化からなる、請求項３８に記載の組成物。

【請求項50】

前記ガイド配列がＲＮＡを含むか、又は前記ガイド配列がＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせを含む、請求項３４～４９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項51】

前記Ｃａｓ結合領域がＲＮＡを含むか、又は前記Ｃａｓ結合領域がＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせを含む、請求項３４～５０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項52】

前記Ｃａｓ結合領域が、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項３４～５１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項53】

前記Ｃａｓ結合領域が、ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズすることができ、前記組成物が、ｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む、請求項３４～５１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項54】

前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼに結合することができる、請求項５２又は５３に記載の組成物。

【請求項55】

前記組成物が、Ｃａｓヌクレアーゼを含む、請求項３４～５４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項56】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａである、請求項５５に記載の組成物。

【請求項57】

前記組成物がＣａｓヌクレアーゼを含み、前記ＣａｓヌクレアーゼがＩＩ－Ｂ型Ｃａｓである、請求項５５に記載の組成物。

【請求項58】

前記組成物が、Ｃａｓニッカーゼを含む、請求項３４～５４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項59】

前記Ｃａｓニッカーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、又はＩＩ－Ｂ型Ｃａｓニッカーゼである、請求項５８に記載の組成物。

【請求項60】

前記ＤＮＡ鋳型配列が、約８～約５００ヌクレオチド長である、請求項３４～５９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項61】

前記プライマー結合配列が、約４～約３０ヌクレオチド長である、請求項３４～６０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項62】

前記目的配列が、約４～約１００ヌクレオチド長である、請求項３４～６１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項63】

前記ガイド配列が、約１５～約２５ヌクレオチド長である、請求項３４～６２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項64】

前記第１のハイブリダイゼーション領域及び前記第２のハイブリダイゼーション領域がＲＮＡである、請求項３５～６３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項65】

前記第１のハイブリダイゼーション領域及び前記第２のハイブリダイゼーション領域が一本鎖ＤＮＡである、請求項３５～６３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項66】

前記第１のハイブリダイゼーション領域がＲＮＡであり、前記第２のハイブリダイゼーション領域が一本鎖ＤＮＡであるか、又は前記第１のハイブリダイゼーション領域が一本鎖ＤＮＡであり、前記第２のハイブリダイゼーション領域がＲＮＡである、請求項３５～６３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項67】

前記第１のハイブリダイゼーション領域が、約４～約５０００ヌクレオチド長である、請求項３６～６６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項68】

前記第２のハイブリダイゼーション領域が、約４～約５０００ヌクレオチド長である、請求項３６～６６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項69】

前記ポリヌクレオチドが、前記ＤＮＡ鋳型配列の５’に位置するスペーサーを更に含む、請求項３４又は３７～６３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項70】

前記第２のポリヌクレオチドが、前記ＤＮＡ鋳型配列の５’に位置するスペーサーを更に含む、請求項３５～６８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項71】

前記スペーサーが、ＤＮＡポリメラーゼの停止配列を含む、請求項６９又は７０に記載の組成物。

【請求項72】

前記スペーサーが、２つ以上の停止配列を含む、請求項７１に記載の組成物。

【請求項73】

前記停止配列が、二次構造から構成される、請求項７１又は７２に記載の組成物。

【請求項74】

前記二次構造が、ステムループから構成される、請求項７３に記載の組成物。

【請求項75】

前記スペーサーが、約１０～約２００ヌクレオチド長である、請求項６９～７４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項76】

前記Ｃａｓヌクレアーゼ又は前記Ｃａｓニッカーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質に融合されている、請求項３４～７５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項77】

前記ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質が、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質（ＴＮＦＡＩＰ）、ポリメラーゼデルタ相互作用タンパク質（ＰｏｌＤＩＰ）、Ｘ線修復交差補完タンパク質（ＸＲＣＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン結合、ＥＳ細胞特異的（ＨＭＣＥＳ）タンパク質、ＲＡＤ１、ＲＡＤ９、ＨＵＳ１、又はこれらの組み合わせを含む、請求項７６に記載の組成物。

【請求項78】

Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、
（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｖ）プライマー結合配列を含む第１のポリヌクレオチドであって、前記プライマー結合配列が前記第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、
（ｉ）前記第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む第２のポリヌクレオチドと、
を含む組成物。

【請求項79】

Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、
（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、前記第１のハイブリダイゼーション領域が前記第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、
（ｉ）前記第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）第３のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉｉ）プライマー結合配列を含む第２のポリヌクレオチドであって、前記プライマー結合配列が前記第２のポリヌクレオチドの３’末端にある、第２のポリヌクレオチドと、
（ｉ）前記第３のハイブリダイゼーション領域に相補的な第４のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む第３のポリヌクレオチドと、
を含む組成物。

【請求項80】

前記第１のポリヌクレオチド及び／又は前記第２のポリヌクレオチドが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む、請求項７８に記載の組成物。

【請求項81】

前記第１のポリヌクレオチド及び／又は前記第２のポリヌクレオチドが、相同配列を更に含む、請求項７８又は８０に記載の組成物。

【請求項82】

前記第１のポリヌクレオチドが、（ｖ）前記相同配列を更に含み、前記第２のポリヌクレオチドが、前記第２のハイブリダイゼーション領域と、前記ＳＯＩと、前記第１のポリヌクレオチドとハイブリダイズする更なるハイブリダイゼーション領域とを含み、前記第２のハイブリダイゼーション領域及び前記更なるハイブリダイゼーション領域が、前記ＳＯＩを挟んでいる、請求項８１に記載の組成物。

【請求項83】

前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチド、及び／又は前記第３のポリヌクレオチドのいずれかが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む、請求項７９に記載の組成物。

【請求項84】

前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチド、及び／又は前記第３のポリヌクレオチドのいずれかが、相同配列を更に含む、請求項７９又は８３に記載の組成物。

【請求項85】

前記修飾ヌクレオチドが、脱塩基部位、共有結合リンカー、異種核酸（ＸＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート結合、ＤＮＡ損傷体、ＤＮＡ光産物、修飾デオキシリボヌクレオシド、メチル化ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む、請求項８０又は８３に記載の組成物。

【請求項86】

前記ＳＯＩに相補的な配列から構成されるＳＯＩ相補的オリゴヌクレオチドを更に含む、請求項７８～８５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項87】

前記ＳＯＩ相補的オリゴヌクレオチドが、相同配列を更に含む、請求項８６に記載の組成物。

【請求項88】

前記Ｃａｓヌクレアーゼ又は前記Ｃａｓニッカーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ動員部分、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、又はこれらの組み合わせに融合されている、請求項７８～８７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項89】

前記ＤＮＡポリメラーゼ動員部分が、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質（ＴＮＦＡＩＰ）、ポリメラーゼデルタ相互作用タンパク質（ＰｏｌＤＩＰ）、Ｘ線修復交差補完タンパク質（ＸＲＣＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン結合、ＥＳ細胞特異的（ＨＭＣＥＳ）タンパク質、ＲＡＤ１、ＲＡＤ９、ＨＵＳ１、又はこれらの組み合わせを含む、請求項８８に記載の組成物。

【請求項90】

前記ＤＮＡリガーゼが、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、ＰＣＢＶ－１ ＤＮＡリガーゼ、ＬｉｇＤ、ヒトリガーゼタンパク質、又はこれらの組み合わせを含む、請求項８８に記載の組成物。

【請求項91】

前記ＤＮＡリガーゼ動員部分が、前記ＤＮＡ鋳型配列の５’アデニル化からなる、請求項８８に記載の組成物。

【請求項92】

前記ＤＮＡ結合タンパク質が、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）若しくはそのサブユニット、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、又はこれらの組み合わせを含む、請求項９１に記載の組成物。

【請求項93】

前記ＤＮＡ修復タンパク質が、チロシル－ＤＮＡホスホジエステラーゼ１（ＴＤＰ１）、アプラタキシン、トポイソメラーゼＩ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項８８に記載の組成物。

【請求項94】

前記Ｃａｓ結合領域が、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項７８～９３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項95】

前記Ｃａｓ結合領域が、ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズすることができ、前記組成物が、ｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む、請求項７８～９３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項96】

前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼに結合することができる、請求項９４又は９５に記載の組成物。

【請求項97】

前記組成物が、Ｃａｓヌクレアーゼを含む、請求項７８～９６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項98】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａである、請求項９７に記載の組成物。

【請求項99】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ＩＩ－Ｂ型Ｃａｓである、請求項９７に記載の組成物。

【請求項100】

前記組成物が、Ｃａｓニッカーゼを含む、請求項７８～９６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項101】

前記Ｃａｓニッカーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、又はＩＩ－Ｂ型Ｃａｓニッカーゼである、請求項１００に記載の組成物。

【請求項102】

前記目的配列が、約４～約１００ヌクレオチド長である、請求項７８～１０１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項103】

前記プライマー結合配列が、約４～約３０ヌクレオチド長である、請求項７８～１０２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項104】

前記ガイド配列が、約１５～約２５ヌクレオチド長である、請求項７８～１０３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項105】

前記第１のハイブリダイゼーション領域、及び／又は前記第２のハイブリダイゼーション領域が、それぞれ約４～約５０００ヌクレオチド長である、請求項７８～１０４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項106】

請求項３４～１０５のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞。

【請求項107】

外来性ＤＮＡポリメラーゼ、外来性ＤＮＡリガーゼ、又はその両方を更に含む、請求項１０６に記載の細胞。

【請求項108】

（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼ、及び（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ動員部分、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、又はこれらの組み合わせを含む、融合タンパク質。

【請求項109】

前記融合タンパク質が、Ｃａｓヌクレアーゼを含む、請求項１０８に記載の融合タンパク質。

【請求項110】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａである、請求項１０９に記載の融合タンパク質。

【請求項111】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ＩＩ－Ｂ型Ｃａｓである、請求項１０９に記載の融合タンパク質。

【請求項112】

前記融合タンパク質が、Ｃａｓニッカーゼを含む、請求項１０８に記載の融合タンパク質。

【請求項113】

前記Ｃａｓニッカーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、又はＩＩ－Ｂ型Ｃａｓニッカーゼである、請求項１１２に記載の融合タンパク質。

【請求項114】

前記ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質が、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質（ＴＮＦＡＩＰ）、ポリメラーゼデルタ相互作用タンパク質（ＰｏｌＤＩＰ）、Ｘ線修復交差補完タンパク質（ＸＲＣＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン結合ＥＳ細胞特異的（ＨＭＣＥＳ）タンパク質、ＲＡＤ１、ＲＡＤ９、ＨＵＳ１、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１０８～１１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項115】

前記ＤＮＡリガーゼが、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、ＰＣＢＶ－１ ＤＮＡリガーゼ、ＬｉｇＤ、ヒトリガーゼタンパク質、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１０８～１１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項116】

前記ＤＮＡリガーゼ動員部分が、前記ＤＮＡ鋳型配列の５’アデニル化からなる、請求項１０８～１１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項117】

前記ＤＮＡ結合タンパク質が、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）若しくはそのサブユニット、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１０８～１１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項118】

前記ＤＮＡ修復タンパク質が、チロシル－ＤＮＡホスホジエステラーゼ１（ＴＤＰ１）、アプラタキシン、トポイソメラーゼＩ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１０８～１１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項119】

請求項１０８～１１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

【請求項120】

請求項１１９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項121】

請求項１０８～１１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド、請求項１２０に記載のベクター、又はこれらの組み合わせを含む細胞。

【請求項122】

請求項１～３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを更に含む、請求項１２１に記載の細胞。

【請求項123】

細胞内の標的ＤＮＡにおいて標的挿入を提供する方法であって、請求項３４～７７のいずれか一項に記載の組成物を前記細胞に導入することを含み、前記ガイド配列が、前記標的ＤＮＡにハイブリダイズすることができる方法。

【請求項124】

前記方法が、ＤＮＡポリメラーゼを前記細胞に導入することを含まない、請求項１２３に記載の方法。

【請求項125】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、前記標的ＤＮＡに二本鎖開裂を生じさせ、前記細胞の内在性ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡ鋳型配列を伸長する、請求項１２４に記載の方法。

【請求項126】

前記方法が、外来性ＤＮＡポリメラーゼを前記細胞に導入することを更に含む、請求項１２３に記載の方法。

【請求項127】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、前記標的ＤＮＡに二本鎖開裂を生じさせ、前記外来性ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡ鋳型配列を伸長する、請求項１２６に記載の方法。

【請求項128】

前記ＤＮＡ鋳型配列が、プライマー結合配列及び目的配列を含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記目的配列に相補的なＤＮＡ鎖を合成し、前記目的配列を含む二本鎖配列を形成する、請求項１２５～１２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項129】

前記二本鎖配列が、前記開裂された標的ＤＮＡに挿入される、請求項１２８に記載の方法。

【請求項130】

前記二本鎖配列が、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）により、前記開裂された標的ＤＮＡに挿入される、請求項１２９に記載の方法。

【請求項131】

前記二本鎖配列が、ＤＮＡリガーゼにより、前記開裂された標的ＤＮＡに挿入される、請求項１３０に記載の方法。

【請求項132】

前記ＤＮＡリガーゼが、前記細胞の内在性ＤＮＡリガーゼである、請求項１３１に記載の方法。

【請求項133】

前記ＤＮＡリガーゼが、外来性ＤＮＡリガーゼである、請求項１３１に記載の方法。

【請求項134】

細胞内の標的ＤＮＡにおいて標的挿入を提供する方法であって、請求項７８～１０５のいずれか一項に記載の組成物を前記細胞に導入することを含み、前記ガイド配列が、前記標的ＤＮＡにハイブリダイズすることができる方法。

【請求項135】

前記方法が、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼを前記細胞に導入することを含まない、請求項１３４に記載の方法。

【請求項136】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、前記標的ＤＮＡに二本鎖開裂を生じさせ、前記細胞の内在性ＤＮＡリガーゼが、前記開裂された標的ＤＮＡに前記目的配列をライゲートする、請求項１３５に記載の方法。

【請求項137】

前記方法が、外来性ＤＮＡリガーゼを前記細胞に導入することを更に含む、請求項１３４に記載の方法。

【請求項138】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、前記標的ＤＮＡに二本鎖開裂を生じさせ、前記外来性ＤＮＡリガーゼが、前記開裂された標的ＤＮＡに前記目的配列をライゲートする、請求項１３７に記載の方法。

【請求項139】

前記目的配列が、前記細胞のＤＮＡ修復経路により二本鎖配列に変換される一本鎖配列である、請求項１３４～１３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項140】

標的ＤＮＡにおいて標的挿入を提供する方法であって、請求項７８～１０５のいずれか一項に記載の組成物を前記標的ＤＮＡと接触させることを含み、前記ガイド配列が、前記標的ＤＮＡにハイブリダイズすることができる方法。

【請求項141】

前記標的ＤＮＡをＤＮＡリガーゼと接触させることを更に含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項142】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、前記標的ＤＮＡに二本鎖開裂を生じさせ、前記ＤＮＡリガーゼが、前記開裂された標的ＤＮＡに前記目的配列をライゲートする、請求項１４１に記載の方法。

【請求項143】

前記標的ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ修復経路内のタンパク質、又はこれらの組み合わせと接触させることを更に含む、請求項１４０～１４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項144】

Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、
（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｖ）プライマー結合配列を含む第１のポリヌクレオチドであって、前記プライマー結合配列が前記第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、
（ｉ）前記第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む第２のポリヌクレオチドと、
（ｉ）前記第２のポリヌクレオチドと部分的に相補的な第３のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む第３のポリヌクレオチドと、
を含む組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本開示はまた、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼ、並びにガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。本開示は更に、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼ、及びＤＮＡポリメラーゼ動員部分を含む融合タンパク質を提供する。また、細胞の標的ＤＮＡにおいて標的挿入を提供するための方法も提供される。

【背景技術】

【0002】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのプログラム可能なヌクレアーゼは、標的部位に挿入と欠失との組み合わせ（インデル）を誘導することによって遺伝子を破壊することができる、部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることができる。しかしながら、鋳型依存性の相同性配向型修復（ＨＤＲ）に依拠するＤＳＢ修復では、頻度が低い可能性があるが、一方で、高効率の鋳型非依存性の非相同末端連結（ＮＨＥＪ）では、エラーが発生しやすく、所望の挿入が優先されない場合がある。

【0003】

非特許文献１では、Ｃａｓ９ニッカーゼ－逆転写酵素融合酵素を利用して開裂部位に短い配列を挿入するプライム編集の開発が記載されている。プライム編集は、ＲＮＡの除去と、標的部位への一本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションとの複雑なメカニズムに依拠するものであり、細胞平衡による重複する「フラップ」配列を除去することも必要とされる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ５７６；１４９－１５７（２０１９）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）ＲＮＡガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含むポリヌクレオチドであって、ＤＮＡ鋳型配列がポリヌクレオチドの３’末端にある、ポリヌクレオチドを提供する。

【0006】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、修飾ヌクレオチド、非Ｂ型ＤＮＡ構造体、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分、ＤＮＡリガーゼ動員部分、又はこれらの組み合わせを含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、脱塩基部位、共有結合リンカー、異種核酸（ＸＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート結合、ＤＮＡ損傷体、ＤＮＡ光産物、修飾デオキシリボヌクレオシド、メチル化ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、共有結合リンカーは、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷体は、８－オキソグアニン、チミン－グリコール、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ光産物は、シクロブタンピリミジン二量体（ＣＰＤ）、ピリミジン（６－４）ピリミドン光産物、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、修飾デオキシリボヌクレオシドは、デオキシウリジンを含む。いくつかの実施形態では、メチル化ヌクレオチドは、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－メチルシトシン、又はこれらの組み合わせを含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、非Ｂ型ＤＮＡ構造体は、ヘアピン、十字形、Ｚ－ＤＮＡ、Ｈ－ＤＮＡ（三重らせんＤＮＡ）、グアニン四重鎖ＤＮＡ（四重らせんＤＮＡ）、スリップＤＮＡ、粘着性ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分は、ＤＮＡ鋳型配列に連結されたＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質から構成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質（ＴＮＦＡＩＰ）、ポリメラーゼデルタ相互作用タンパク質（ＰｏｌＤＩＰ）、Ｘ線修復交差補完タンパク質（ＸＲＣＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン結合ＥＳ細胞特異的（ＨＭＣＥＳ）タンパク質、ＲＡＤ１、ＲＡＤ９、ＨＵＳ１、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼ動員部分は、ＤＮＡ鋳型配列の５’アデニル化からなる。

【0009】

いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）ＲＮＡガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含むポリヌクレオチドであって、ＤＮＡ鋳型配列がポリヌクレオチドの３’末端にあり、ＤＮＡ鋳型配列がホスホロチオエート結合を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＤＡＮ鋳型配列は、ポリヌクレオチドの５’末端にある。

【0010】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、プライマー結合配列及び目的配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域はＲＮＡを含むか、又はＣａｓ結合領域はＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズすることができる。

【0011】

いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼに結合することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ－Ｂ型Ｃａｓである。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓニッカーゼに結合することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、又はＩＩ－Ｂ型Ｃａｓニッカーゼである。

【0012】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約８～約１００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約４～約３００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、目的配列は、約４～約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイド配列は、約１５～約２５ヌクレオチド長である。

【0013】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ結合領域とＤＮＡ鋳型配列との間に位置するスペーサーを更に含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＤＮＡポリメラーゼの停止配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、２つ以上の停止配列を含む。いくつかの実施形態では、停止配列は、二次構造から構成される。いくつかの実施形態では、二次構造は、ステムループから構成される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約１０～約２００ヌクレオチド長である。

【0014】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。

【0015】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含むポリヌクレオチドとを含む組成物であって、ＤＮＡ鋳型配列がポリヌクレオチドの３’末端にある組成物を提供する。

【0016】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、第１のハイブリダイゼーション領域が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含む第２のポリヌクレオチドとを含む組成物を提供する。

【0017】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｉ）ガイド配列、及び（ｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、第１のハイブリダイゼーション領域が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含む第２のポリヌクレオチドとを含む組成物を提供する。

【0018】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、プライマー結合配列及び目的配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、修飾ヌクレオチド、非Ｂ型ＤＮＡ構造体、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分、ＤＮＡリガーゼ動員部分、又はこれらの組み合わせを含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、脱塩基部位、共有結合リンカー、異種核酸（ＸＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート結合、ＤＮＡ損傷体、ＤＮＡ光産物、修飾デオキシリボヌクレオシド、メチル化ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、共有結合リンカーは、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷体は、８－オキソグアニン、チミン－グリコール、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ光産物は、シクロブタンピリミジン二量体（ＣＰＤ）、ピリミジン（６－４）ピリミドン光産物、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、デオキシリボヌクレオシドは、デオキシウリジンを含む。いくつかの実施形態では、メチル化ヌクレオチドは、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－メチルシトシン、又はこれらの組み合わせを含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、非Ｂ型ＤＮＡ構造体は、ヘアピン、十字形、Ｚ－ＤＮＡ、Ｈ－ＤＮＡ（三重らせんＤＮＡ）、グアニン四重鎖ＤＮＡ（四重らせんＤＮＡ）、スリップＤＮＡ、粘着性ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分は、ＤＮＡ鋳型配列に連結されたＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質から構成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質（ＴＮＦＡＩＰ）、ポリメラーゼデルタ相互作用タンパク質（ＰｏｌＤＩＰ）、Ｘ線修復交差補完タンパク質（ＸＲＣＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン結合ＥＳ細胞特異的（ＨＭＣＥＳ）タンパク質、ＲＡＤ１、ＲＡＤ９、ＨＵＳ１、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼ動員部分は、ＤＮＡ鋳型配列の５’アデニル化からなる。

【0021】

いくつかの実施形態では、ガイド配列はＲＮＡを含むか、又はガイド配列はＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域はＲＮＡを含むか、又はＣａｓ結合領域はＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズすることができ、組成物はｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼに結合することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａである。いくつかの実施形態では、組成物はＣａｓヌクレアーゼを含み、ＣａｓヌクレアーゼはＩＩ－Ｂ型Ｃａｓである。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、又はＩＩ－Ｂ型Ｃａｓニッカーゼである。

【0023】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約８～約５００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約４～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、目的配列は、約４～約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイド配列は、約１５～約２５ヌクレオチド長である。

【0024】

いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域及び第２のハイブリダイゼーション領域は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域及び第２のハイブリダイゼーション領域は、一本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域がＲＮＡであり、第２のハイブリダイゼーション領域が一本鎖ＤＮＡであるか、又は第１のハイブリダイゼーション領域が一本鎖ＤＮＡであり、第２のハイブリダイゼーション領域がＲＮＡである。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域は、約４～約５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２のハイブリダイゼーション領域は、約４～約５０００クレオチド長である。

【0025】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ鋳型配列の５’に位置するスペーサーを更に含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ鋳型配列の５’に位置するスペーサーを更に含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＤＮＡポリメラーゼの停止配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、２つ以上の停止配列を含む。いくつかの実施形態では、停止配列は、二次構造から構成される。いくつかの実施形態では、二次構造は、ステムループから構成される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約１０～約２００ヌクレオチド長である。

【0026】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質に融合されている。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質（ＴＮＦＡＩＰ）、ポリメラーゼデルタ相互作用タンパク質（ＰｏｌＤＩＰ）、Ｘ線修復交差補完タンパク質（ＸＲＣＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン結合ＥＳ細胞特異的（ＨＭＣＥＳ）タンパク質、ＲＡＤ１、ＲＡＤ９、ＨＵＳ１、又はこれらの組み合わせを含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される組成物を含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、外来性ＤＮＡポリメラーゼ、外来性ＤＮＡリガーゼ、又はその両方を更に含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼ、及び（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。

【0029】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ－Ｂ型Ｃａｓである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、又はＩＩ－Ｂ型Ｃａｓニッカーゼである。

【0030】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質（ＴＮＦＡＩＰ）、ポリメラーゼデルタ相互作用タンパク質（ＰｏｌＤＩＰ）、Ｘ線修復交差補完タンパク質（ＸＲＣＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン結合ＥＳ細胞特異的（ＨＭＣＥＳ）タンパク質、ＲＡＤ１、ＲＡＤ９、ＨＵＳ１、又はこれらの組み合わせを含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、融合タンパク質、ベクター、又はポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）ＲＮＡガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含む本明細書に記載されるポリヌクレオチドであって、ＤＮＡ鋳型配列がポリヌクレオチドの３’末端にある、ポリヌクレオチドを更に含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の標的ＤＮＡにおいて標的挿入を提供する方法であって、本明細書に記載される組成物を細胞に導入することを含み、ガイド配列が標的ＤＮＡにハイブリダイズすることができる方法を提供する。

【0033】

いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡポリメラーゼを細胞に導入することを含まない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼが、標的ＤＮＡに二本鎖開裂を生じさせ、細胞の内在性ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ鋳型配列を伸長する。

【0034】

いくつかの実施形態では、本方法は、外来性ＤＮＡポリメラーゼを細胞に導入することを更に含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼが、標的ＤＮＡに二本鎖開裂を生じさせ、外来性ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ鋳型配列を伸長する。

【0035】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、プライマー結合配列及び目的配列を含み、ＤＮＡポリメラーゼが、目的配列に相補的なＤＮＡ鎖を合成し、目的配列を含む二本鎖配列を形成する。いくつかの実施形態では、二本鎖配列は、開裂された標的ＤＮＡに挿入される。いくつかの実施形態では、二本鎖配列は、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）により、開裂された標的ＤＮＡに挿入される。いくつかの実施形態では、二本鎖配列は、ＤＮＡリガーゼにより、開裂された標的ＤＮＡに挿入される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、細胞の内在性ＤＮＡリガーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、外来性ＤＮＡリガーゼである。

【0036】

いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｂ）（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｖ）プライマー結合配列を含む第１のポリヌクレオチドであって、プライマー結合配列が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む第２のポリヌクレオチドとを含む組成物に関する。

【0037】

いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｂ）（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、第１のハイブリダイゼーション領域が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）第３のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉｉ）プライマー結合配列を含む第２のポリヌクレオチドであって、プライマー結合配列が第２のポリヌクレオチドの３’末端にある、第２のポリヌクレオチドと、（ｄ）（ｉ）第３のハイブリダイゼーション領域に相補的な第４のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む第３のポリヌクレオチドとを含む組成物に関する。

【0038】

いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼ、及び（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ動員部分、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、又はこれらの組み合わせを含む融合タンパク質に関する。

【0039】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるような組成物を細胞に導入することを含み、ガイド配列が標的ＤＮＡにハイブリダイズすることができる、細胞内の標的ＤＮＡにおいて標的挿入を提供する方法を提供する。

【0040】

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、更に本発明の特定の態様の例示的な実施形態を実証するために含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】本明細書の実施形態に記載される例示的な方法を示す。Ｃａｓヌクレアーゼがガイド配列により細胞内の標的ＤＮＡに誘導され、標的ＤＮＡを開裂する。ＤＮＡ鋳型配列は、（ｉ）プライマーとしての役割を果たす、開裂されたＤＮＡとハイブリダイズする、プライマー結合配列、及び（ｉｉ）目的配列を含む。ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、細胞の内在性ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーに結合して目的配列と相補的なＤＮＡ鎖を合成し、それによって目的配列を含む二本鎖配列が形成される。二本鎖配列は、ＤＮＡ修復経路、例えば、ＮＨＥＪにより、開裂された標的ＤＮＡに挿入され得る。

【図2A-2D】本明細書に記載されるインビボでの標的挿入実験で試験された、例示的なポリヌクレオチド構築物（「ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ」）を示す。図２Ａは、ＲＮＡガイド配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＲＮＡ鋳型配列から構成された、ＲＮＡのみのポリヌクレオチドを示す。図２Ｂは、ＲＮＡガイド配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＤＮＡ鋳型配列（「ＤＮＡ」）又はホスホロチオエート結合を有するＤＮＡ鋳型配列（「ＰＳ－ＤＮＡ」）から構成された、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドポリヌクレオチドを示す。図２Ｃは、ＲＮＡガイド配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び脱塩基部位を有するＲＮＡ鋳型配列から構成された、ＲＮＡのみのポリヌクレオチドを示す。図２Ｄは、ＲＮＡガイド配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＴＥＧを有するＲＮＡ鋳型配列から構成された、ＲＮＡのみのポリヌクレオチドを示す。

【図3】実施例１に関連し、様々なｓｐｒｉｎｇＲＮＡ構築物による、ＳｐＣａｓ９単独又はＳｐＣａｓ９－逆転写酵素（ＳｐＣａｓ９－ＲＴ）融合タンパク質を使用した標的挿入の結果を示す。図３のパネルＡ～Ｅは、ＳｐＣａｓ９及び図２Ａ～２ＤのｓｐｒｉｎｇＲＮＡ構築物の各々による標的挿入を示す。図３のパネルＦ～Ｊは、ＳｐＣａｓ９－ＲＴ（「ＰＥ０」）及び図２Ａ～２ＤのｓｐｒｉｎｇＲＮＡ構築物の各々による標的挿入を示す。

【図4】実施例１に関連し、図２Ａ～２ＤのｓｐｒｉｎｇＲＮＡ構築物の各々と組み合わせた、ＳｐＣａｓ９又はＳｐＣａｓ９－ＲＴによる挿入の相対頻度を示す。各々の点は独立した複写物を表している。３回の実験の平均値及び標準偏差をウィスカープロットとして示す。

【図5A-5F】実施例２に関連し、ＳｐＣａｓ９単独又はＳｐＣａｓ９－ＲＴを使用した標的挿入の結果を示す。図５Ａ～５Ｃは、ＳｐＣａｓ９－ＲＴ（「ＰＥ０」）と、ＲＮＡのみのｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図５Ａ）、ＤＮＡテールを有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図５Ｂ）、及びＰＳ－ＤＮＡを有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図５Ｃ）とによる標的挿入を示す。図５Ｄ～５Ｆは、ＳｐＣａｓ９と、ＲＮＡのみのｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図５Ｄ）、ＤＮＡテールを有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図５Ｅ）、及びＰＳ－ＤＮＡを含むｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図５Ｆ）とによる標的挿入を示す。

【図6】本明細書に記載されるインビトロアッセイの概要を示す。２本の相補的なＤＮＡ鎖が、異なるフルオロフォアで標識される（６ ＦＡＭ標識非標的鎖及びＨＥＸ標識標的鎖）。ガイド配列は、Ｃａｓ９開裂によって長さの異なる２本の鎖が生成されるように設計されている。ＤＮＡポリメラーゼにより、ｓｐｒｉｎｇＲＮＡのプライマー結合配列にハイブリダイズした６ ＦＡＭ標識非標的鎖が伸長する。生成物を変性してキャピラリー電気泳動により分離し、フルオロフォアと結合した鎖を検出する。

【図7A-7F】実施例３に関連し、図６に示すインビトロアッセイの結果を示す。青色の線は非標的鎖に対応し、緑色の線は標的鎖に対応する。アスタリスクは開裂した合成標的ＤＮＡ基質を示し、黒い矢印はＤＮＡポリメラーゼによる伸長生成物を示す。図７Ａは、Ｃａｓ９及びｓｐｒｉｎｇＲＮＡによるアッセイ結果を示す。図７Ｂは、Ｃａｓ９、クレノウ断片、及びｓｐｒｉｎｇＲＮＡによるアッセイ結果を示す。図７Ｃ～７Ｆは、Ｃａｓ９、Ｂｓｔ ３．０ポリメラーゼ、及び、ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図７Ｃ及び７Ｄ）、脱塩基部位を有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図７Ｅ）、又はＴＥＧを有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図７Ｆ）によるアッセイ結果を示す。

【図8】Ｂｓｔ ３．０ポリメラーゼ及びクレノウ断片、実施例３のインビトロアッセイで使用したＤＮＡポリメラーゼの伸長反応のカイネティクスを示す。

【図9】Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼ）と、ガイド配列（「スペーサー」と称する）、Ｃａｓ結合領域（「ｇＲＮＡ足場」と称する）、第１のハイブリダイゼーション領域（「ランディングパッド」と称する）、及びプライマー結合配列（ＰＢＳ）から構成される第１のポリヌクレオチドと、第２のハイブリダイゼーション領域（「ハイブリダイゼーション配列」と称する）、ＳＯＩ（「挿入断片」と称する）、及び相同配列から構成される第２のポリヌクレオチドとを含む、本明細書の実施形態に記載される例示的な組成物を示す。図９の組成物の様々な構成成分に関する用語が、図９～２３の全体を通して使用されている。

【図10A-10C】本明細書の実施形態に記載される例示的な方法を示す。図１０Ａでは、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、第１のハイブリダイゼーション領域、及びプライマー結合部位が、第１のポリヌクレオチド上に位置している。ガイド配列によって標的ＤＮＡに誘導されたＣａｓヌクレアーゼにより、標的ＤＮＡに二本鎖切断が生じる。プライマー結合部位は、開裂されたＤＮＡにハイブリダイズされ、第２のポリヌクレオチドは、相補的配列を含む第１及び第２のハイブリダイゼーション領域を介して第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする。第２のポリヌクレオチドは目的配列を含み、この配列がリガーゼにより５’末端と３’末端の両方で開裂されたＤＮＡにライゲートされる（図１０Ａ）。第２のポリヌクレオチドは、更に相同配列を含むことができ、その５’末端が、開裂されたＤＮＡにリガーゼによってライゲートされ、その３’末端が、相同性媒介メカニズムによって組み込まれる（図１０Ｂ）。複合体は、ライゲーション及び／又は相同性媒介組み込みの後に二本鎖ＤＮＡへと変換され、それによって標的ＤＮＡに目的配列が組み込まれる（図１０Ｃ）。

【図11A-11J】本明細書に記載される組成物の例示的な実施形態を示す。図１１（Ａ）は、３つのエレメントである、第２のハイブリダイゼーション配列、目的配列、及び相同配列を全て含むドナーを示す。図１１（Ｂ）は、相同配列を含まないドナーを示す。図１１（Ｃ）は、第２のハイブリダイゼーション配列を含まないドナーを示す。図１１（Ｄ）は、５’と３’の両方にオーバーハングを有する二本鎖領域の目的配列を形成するように、目的配列に相補的な配列がハイブリダイズされている標準的なドナーを表す。この構成は「オーバーハング」と称される。図１１（Ｅ）は、図１１（Ａ）のようなドナーを示しているが、ｐｌｕｇＲＮＡが２つの核酸で構成されている。ｓｇＲＮＡは、３’末端に付加された、約３０ｎｔの長さの配列を有する。この３’配列は相補的なポリヌクレオチドと対合することができ、次いで第１のハイブリダイゼーション配列及びプライマー結合配列が続く。この構成は、「スプリットｐｌｕｇＲＮＡ」又は「スプリットシステム」と称される。図１１（Ｆ）は、図１１（Ａ）のような構成を示しているが、ハイブリダイゼーション配列が短く、プライミングされる標的部位の３’末端とドナーの５’末端との間にギャップが生じている。この構成は「ギャップ」と称される。図１１（Ｇ）は、図１１（Ａ）と同一であるが、ドナーは５’末端に追加のヌクレオチドを有しており、いくつかの実施形態ではＦＥＮ１及び他の修復機構に関与し得るフラップが生成されている。この構成は「フラップ」と称される。図１１（Ｈ）は、図１１（Ｂ）と同一であるが、目的配列に相補的な配列がアニーリングされ、ドナーの３’末端に平滑末端が生成されている。この構成は「平滑」と称される。図１１（Ｉ）では、ドナーが２つのポリヌクレオチドに分割されている。第１のドナー鎖は、第２のハイブリダイゼーション配列及び目的配列から構成される。第２の配列は、相同配列、及び目的配列に相補的な配列から構成される。この構成は「ブリッジ」と称される。図１１（Ｊ）では、相同配列が、ｇＲＮＡ足場のすぐ下流のｐｌｕｇＲＮＡに埋め込まれている。この相同配列は、Ｃａｓによって誘導された切断の３’側にアニーリングする。ドナーは、２つのハイブリダイゼーション配列：第２のハイブリダイゼーション配列及び更なるハイブリダイゼーション配列に挟まれた目的配列から構成され、第２のハイブリダイゼーション配列は第１のハイブリダイゼーション配列と相補的であり、更なるハイブリダイゼーションは相同配列に隣接する領域に相補的である。この構成により、ドナーの５’側と３’側の両方が二本鎖切断に近接する。この構成は「デュアルハイブリダイゼーション」と称される。

【図12A-12C】図１２Ａは、実施例８に記載されるような、例示的なインビトロアッセイの実験設計を示す。図１２Ｂ及び図１２Ｃは、アッセイの結果を示し、図１２Ｂはライゲーション生成割合を示し、図１２Ｃはライゲーション効率割合を示している。

【図13A-13C】図１３Ａは、実施例９に記載されるような、ＨｅＬａ核抽出物を使用した例示的なインビトロライゲーションアッセイの実験設計を示す。図１３Ｂ及び図１３Ｃは、アッセイのヒートマップ結果を示し、図１３Ｂはライゲーション生成割合を示し、図１３Ｃはライゲーション効率割合を示している。

【図14A-14B】図１４Ａは、実施例１０に記載されるような、得られたＤＮＡを増幅し、標的挿入について解析した、ＨｅＬａ核抽出物を使用した例示的なアッセイの実験設計を示す。図１４Ｂは、標的挿入配列の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）結果の表示を示す。

【図15】実施例１１に記載されるような、図１１Ａ～１１Ｊに示される様々な構成の組成物によって実施された例示的なアッセイの結果を示す。

【図16A-16B】図１６Ａは、本明細書に記載される組成物の例示的な実施形態を示す。図１６Ｂは、実施例１２に記載されるような、組成物の異なる構成成分の長さを変更して実施された例示的なアッセイの結果を示す。

【図17A-17B】図１７Ａは、本明細書に記載される組成物の例示的な実施形態を示す。図１７Ｂは、実施例１３に記載されるような、組成物の異なる構成成分の長さを変更して実施された例示的なアッセイの結果を示す。

【図18A-18B】図１８Ａは、本明細書に記載される組成物の例示的な実施形態を示す。図１８Ｂは、実施例１４に記載されるような、組成物の異なる構成成分の長さ及び／又は修飾を変更して実施された例示的なアッセイの結果を示す。

【図19A-19B】図１９Ａは、本明細書に記載される組成物の例示的な実施形態を示す。図１９Ｂは、実施例１５に記載されるような、組成物の異なる構成成分の長さを変更して実施された例示的なアッセイの結果を示す。

【図20A-20B】図２０Ａは、本明細書に記載される組成物の例示的な実施形態を示す。図２０Ｂは、実施例１６に記載されるような、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）阻害剤の存在下又は非存在下で、組成物の異なる構成成分の長さ及び／又は修飾を変更して実施された例示的アッセイの結果を示す。

【図21A-21B】図２１Ａは、本明細書に記載される組成物の例示的な実施形態を示す。図２１Ｂは、実施例１７に記載されるような、様々な組成物の構成で、且つ同時発現させたＤＮＡリガーゼの存在下で実施した例示的なアッセイの結果を示す。

【図22】実施例１８に記載されるような、本明細書に記載される組成物の異なる構成で実施したアッセイの結果をまとめたものである。

【図23A-23B】図２３Ａは、本明細書に記載される組成物の例示的な実施形態を示す。図２３Ｂは、実施例１９に記載されるような、組成物及び異なるリガーゼ又はＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質によって実施した例示的なアッセイの結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0042】

本開示は、改善されたＣＲＩＳＰＲシステム及びその構成成分、並びにそれらを使用する方法に関する。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的ポリヌクレオチド、例えば標的ＤＮＡ配列の部位で、ガイドポリヌクレオチド及びＣａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、細菌性免疫ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム）では、外来性ＤＮＡがＣＲＩＳＰＲアレイに組み込まれ、次いでＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を生成する。ｃｒＲＮＡは、外来性ＤＮＡ部位に相補的なＲＮＡガイド配列領域を含み、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とハイブリダイズするが、このＲＮＡはＣＲＩＳＰＲシステムにもコードされている。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ステムループなどの二次構造を形成し、Ｃａｓ９タンパク質に結合することができる。ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドは、Ｃａｓ９と会合し、このｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が、プロトスペーサー配列を有する外来性ＤＮＡを認識して開裂させることにより、侵入してくるウイルス又はプラスミドに対する免疫が付与される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、更に、例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－８２３（２０１３）；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８２３－８２６（２０１３）；及びＳａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２：３４７－３５５（２０１４）に記載されている。

【0043】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的ポリヌクレオチドへの挿入を導入するように操作されており、標的挿入としても知られている。典型的には、ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓタンパク質が標的ポリヌクレオチドで二本鎖開裂を生じさせ、目的配列を含む別個のドナー鋳型が、細胞のＤＮＡ修復機構、例えば、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）又は相同性配向型修復（ＨＤＲ）により、この開裂された標的ポリヌクレオチドに挿入されるように設計されている。挿入の効率は、ドナー鋳型、Ｃａｓタンパク質、及びガイドポリヌクレオチドのトランスフェクション比；ドナー鋳型の配列及びサイズ；並びに誘発されるＤＮＡ修復機構の種類を含む、いくつかの要因に依存する。例えば、ＨＤＲは、高い忠実度のＤＮＡ修復を提供するが、挿入頻度が低く、その一方で、ＮＨＥＪは、挿入頻度は高いが、標的ＤＮＡに突然変異を導入してしまう可能性もある。

【0044】

いくつかの実施形態では、本開示は、改良された標的挿入方法のための組成物、ポリヌクレオチド、及び／又は融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の組成物、ポリヌクレオチド、及び／又は融合タンパク質により、高度に正確な目的配列の挿入が提供される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物、ポリヌクレオチド、及び融合タンパク質により、高度に効率的な目的配列の挿入が提供される。

【0045】

本開示において使用される科学技術用語は、本明細書において特に定義しない限り、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」（１つの）は、１つ以上を意味し得る。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語と共に使用される場合の「ａ」又は「ａｎ」という語は、１つ又は２つ以上を意味し得る。本明細書で使用される場合、「別の」又は「更なる」は、少なくとも第２のもの以上を意味し得る。

【0046】

本明細書全体を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために利用される方法／装置に固有の誤差の変動、又は試験対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。典型的には、「約」という用語は、状況に応じておよそ又は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％未満の変動性を包含することを意味する。

【0047】

特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを指すものと明示されない限り、又はその代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ、及び「及び／又は」を指す定義を支持する。

【0048】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（及び含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の変形又は形態、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（及び有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の変形又は形態、例えば、「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（及び含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の変形又は形態、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）、又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（及び含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の変形又は形態、例えば、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」）という用語は、包含的であるか又はオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素又は方法の工程を排除しない。本明細書で説明される任意の実施形態は、本開示の任意のタンパク質、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、方法及び／又はキットに対して実行することができることが企図される。更に、本開示の組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞及び／又はキットを使用して、本開示の方法及びタンパク質を得ることができる。

【0049】

「例えば」という用語、及びその対応する略語である「例えば（ｅ．ｇ．（イタリック体かそうでないかを問わない）」の使用は、列挙される特定の用語が、別途明示されない限り、参照又は列挙された具体例に限定されることが意図されない本開示の代表的な例及び実施形態であることを意味する。

【0050】

本明細書で使用される場合、「～」とは、範囲の両端を含む範囲である。例えば、ｘ～ｙの数は、ｘとｙの数、及びｘとｙの範囲に入るあらゆる数が明示的に含まれる。

【0051】

「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、共有結合されたヌクレオチドを含むポリマー化合物を意味する。「核酸」という用語には、リボ核酸（ＲＮＡ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が含まれ、その両方が一本鎖又は二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドは、天然に存在する核酸塩基（例えば、グアニン、アデニン、シトシン、チミン、及びウラシル）、修飾核酸塩基（例えば、ヒポキサンチン、キサンチン、７－メチルグアニン、ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン）、並びに／又は人工核酸塩基（例えば、イソグアニン若しくはイソシトシン）を含み得る。核酸は、５’末端から３’末端に転写される。いくつかの実施形態では、本開示は、ＲＮＡ及びＤＮＡヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。ＲＮＡ及びＤＮＡヌクレオチドの両方を含むポリヌクレオチドを生成する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、ライゲーション法又はオリゴヌクレオチド合成法が挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるようなＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと複合体を形成することができるポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるタンパク質のいずれか一つ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0052】

「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集合体を指し、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ核酸分子が含まれる。いくつかの実施形態では、「遺伝子」はまた、コード配列の前（すなわち５’）及び後（すなわち３’）の調節配列として機能することができる非コード核酸断片を指す。

【0053】

温度及び溶液イオン強度の適切な条件下で一本鎖形態の核酸分子が別の核酸分子にアニーリングすることができる場合、核酸分子は、もう一方の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡに「ハイブリダイズ可能である」か、又は「ハイブリダイズされる」。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、特にその中の第１１章及び表１１．１に例示されている。温度及びイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決定される。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、潜在的に交差反応又は干渉する他のポリヌクレオチドの存在下で、２つの相補的なポリヌクレオチドの所望のハイブリダイゼーション産物の選択的な形成又は維持をもたらすように選択することができる。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、典型的には、相補的配列が長いほど、より短い相補的配列よりも高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、定義されたイオン強度、化学変性剤の濃度、ｐＨ、及びハイブリダイゼーションパートナーの濃度における特定のポリヌクレオチドの熱融解点Ｔ_ｍ（すなわち、配列の５０％が実質的に相補的な配列にハイブリダイズする温度）よりも約５℃～約１０℃低いものである。一般に、ヌクレオチド配列は、Ｇ塩基及びＣ塩基のパーセンテージが高いほど、Ｇ塩基及びＣ塩基のパーセンテージがより低いヌクレオチド配列よりも更にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。一般に、温度を上昇させること、ｐＨを上昇させること、イオン強度を低下させること、且つ／又は化学核酸変性剤（例えば、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、及び炭酸エチレン）の濃度を上昇させることによって、ストリンジェンシーを増大させることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、約１Ｍ、５００ｍＭ、２００ｍＭ、１００ｍＭ、又は５０ｍＭ未満の塩濃度又はイオン強度；約２０℃、３０℃、４０℃、６０℃、又は８０℃超のハイブリダイゼーション温度；及び約１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％を上回る化学変性剤濃度を含む。多くの要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす可能性があるため、任意のパラメータ単独の絶対値以上にパラメータの組み合わせがより重要となり得る。

【0054】

「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を説明するために使用される。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。２つの核酸が「相補的」である場合、第１の核酸又はその１つ以上の領域が、第２の核酸又はその１つ以上の領域と水素結合することができることを意味する。相補的な核酸は、各ヌクレオシドで相補性を有する必要はなく、１つ以上のヌクレオチドミスマッチ、すなわち水素結合が生じない点を含んでもよい。例えば、相補的なオリゴヌクレオチドは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のヌクレオチドの水素結合を有し得る。対照的に、オリゴヌクレオチドに関する「完全に相補的」又は「１００％相補的」は、いかなるヌクレオチドミスマッチもない状態で各ヌクレオシドが水素結合していることを意味する。

【0055】

「相同組換え」という用語は、外来性ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）の別の核酸（例えば、ＤＮＡ）分子への挿入、例えば染色体におけるベクターの挿入を指す。いくつかの場合では、ベクターは、相同組換えのために特異的な染色体部位を標的化する。特異的相同組換えのために、ベクターは、典型的には、ベクターが染色体に相補的に結合して組み込まれることができるように、染色体の配列と相同な十分に長い領域を含有する。相補性領域がより長く、配列類似性の程度がより大きいと、相同組換えの効率を増大させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド又は組成物は、核酸配列に切断、例えば二本鎖切断を生じさせることにより、相同組換えを促進する。

【0056】

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、目的のポリヌクレオチド、例えばヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドを発現させることができるような方法で調節エレメントに連結されていることを意味する。調節エレメントは、シス調節エレメントであってもよく、又はトランス調節エレメントであってもよい。調節エレメントとしては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ、インスレーター、サイレンサー、オペレーターなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、プロモーターである。いくつかの実施形態では、目的タンパク質を発現するポリヌクレオチドは、発現ベクター上のプロモーターに作動可能に連結される。

【0057】

本明細書で使用される場合、「プロモーター」、「プロモーター配列」、又は「プロモーター領域」は、ＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、下流コード配列又は非コード配列の転写の開始に関与するＤＮＡ調節領域又はポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、転写開始部位を含み、バックグラウンドを超えた検出可能なレベルで転写を開始するために使用される最小数の塩基又はエレメントを含むように上流に伸長している。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、転写開始部位、及びＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインを含む。真核生物のプロモーターは通常、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有する。種々のプロモーター、例えば誘導性プロモーターを使用して、本開示の種々のベクターの発現を駆動してもよい。

【0058】

「ベクター」は、宿主細胞に核酸をクローニング及び／又は導入するための任意の手段である。ベクターは、結合されたセグメントの複製が生じるように、別のＤＮＡセグメントが結合され得るレプリコンであってよい。「レプリコン」は、インビボにおけるＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製することができる、任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。いくつかの実施形態では、ベクターは、例えば、非対称分配によって多くの細胞世代後に細胞集団から除去／消去されるエピソーマルベクターである。「ベクター」という用語には、インビトロ、エクスビボ又はインビボで細胞に核酸を導入するための、ウイルス性及び非ウイルス性手段の両方が含まれる。当該技術分野で公知の多数のベクターを使用して核酸を操作し、応答エレメント及びプロモーターを遺伝子に組み込んだりすることができる。ベクターは、１つ以上の調節領域、並びに／又は、核酸導入結果（組織への導入、発現期間など）の選択、測定、及びモニタリングに有用な選択マーカーを含み得る。

【0059】

考えられるベクターとしては、例えば、プラスミド又は改変ウイルス、例として、例えば、バクテリオファージ、例えば、ラムダ誘導体、又はプラスミド、例えば、ＰＢＲ３２２若しくはｐＵＣプラスミド誘導体、又はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターが挙げられる。例えば、好適なベクターへの応答エレメント及びプロモーターに対応するＤＮＡ断片の挿入は、適切なＤＮＡ断片を相補的な付着端を有する選択されたベクターにライゲートすることによって達成することができる。或いは、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に改変してもよく、又はポリヌクレオチド（リンカー）をＤＮＡ末端にライゲートすることによって任意の部位を生成してもよい。このようなベクターは、細胞ゲノムにマーカーが組み込まれている細胞の選択を提供する選択マーカー遺伝子を含有するように改変してもよい。このようなマーカーにより、マーカーを組み込み、そのマーカーによりコードされるタンパク質を発現する宿主細胞を同定及び／又は選択することが可能となる。

【0060】

ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、細胞だけでなく、生きている動物対象においても、多種多様な遺伝子送達用途で使用されている。使用可能なウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアベクター、単純ヘルペスベクター、エプスタイン・バーベクター、アデノウイルスベクター、ジェミニウイルスベクター、及びカリモウイルスベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを提供するために、ウイルスベクターが利用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供するために、ウイルスベクターが利用される。

【0061】

ベクターは、トランスフェクション、形質導入、細胞融合、及びリポフェクションを含むがこれらに限定されない公知の方法により、所望の宿主細胞に導入され得る。ベクターは、プロモーターを含む種々の調節エレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターの設計は、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９５７－６３（２０１３）により設計された構築物をベースとすることができる。

【0062】

本明細書に提供されるポリヌクレオチド及び／又はベクターを増殖させるために、当該技術分野において公知の方法を使用してもよい。好適な宿主系及び増殖条件が確立されれば、組換え発現ベクターを増殖させ、大量に調製することが可能となる。本明細書に記載されるように、使用可能な発現ベクターとしては、以下のベクター又はそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト又は動物ウイルス、例えばワクシニアウイルス又はアデノウイルス、昆虫ウイルス、例えばバキュロウイルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、並びにプラスミド及びコスミドＤＮＡベクター。

【0063】

「プラスミド」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子をしばしば有し、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である外部染色体エレメントを指す。このようなエレメントは、多数のポリヌクレオチドが、適切な３’非翻訳配列と共に選択遺伝子を産生させるためのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能な独自の構築物に結合されるか、又は組換えられている、任意の源に由来する自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列、線状、環状、若しくはスーパーコイル状の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを提供するために、プラスミドが利用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供するために、プラスミドが利用される。

【0064】

本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」という用語は、ベクターを含む外来性核酸分子を細胞に導入することを意味する。例えば、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ組成物の構成成分のトランスフェクション法は、当業者に公知である。「トランスフェクト」細胞は、細胞内部に外来性核酸分子を含み、「形質転換」細胞は、細胞内の外来性核酸分子が細胞の表現型の変化を誘導する。トランスフェクトされた核酸分子は、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることができ、及び／又は一時的若しくは長期間にわたり染色体外で細胞により維持され得る。外来性核酸分子又は断片を発現する宿主細胞又は生物は、本明細書では、「組換え」生物、「形質転換」生物、又は「トランスジェニック」生物と称される。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される発現ベクターのいずれか、例えば、本明細書に記載されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0065】

「宿主細胞」という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すか、又は、そのような細胞の後代を指すこともある。例えば、突然変異又は環境の影響によって改変が後の世代に発生し得るため、そのような後代は、親細胞と同一ではない可能性があるが、それでもなお「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。

【0066】

「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、コード及び非コードアミノ酸、化学的若しくは生化学的に改変された又は誘導体化されたアミノ酸、並びに改変ペプチド骨格を有するポリペプチドを挙げることができる。

【0067】

タンパク質又はポリペプチドの始点は、「Ｎ末端」（及びアミノ末端、ＮＨ_２末端、Ｎ末端部、又はアミン末端とも称される）として公知であり、タンパク質又はポリペプチドの最初のアミノ酸残基の遊離アミン（－ＮＨ_２）基を指す。タンパク質又はポリペプチドの終点は、「Ｃ末端」（及びカルボキシ末端、カルボキシル末端、Ｃ末端部、又はＣＯＯＨ末端とも称される）として公知であり、タンパク質又はポリペプチドの最後のアミノ酸残基の遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を指す。

【0068】

本明細書で使用される場合、「アミノ酸」は、カルボキシル（－ＣＯＯＨ）基及びアミノ（－ＮＨ_２）基の両方を含む化合物を指す。「アミノ酸」は、天然アミノ酸と非天然（すなわち合成）アミノ酸との両方を指す。３文字及び１文字の略記を有する天然アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ；Ａ）；アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）；アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）；システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）；グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）；グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）；イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）；ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）；リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）；メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）；プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）；セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）；トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）；トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）；チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）；及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）が挙げられる。非天然又は合成アミノ酸としては、上記で提供される天然アミノ酸と異なる側鎖を含み、例えば、フルオロフォア、翻訳後修飾、金属イオンキレート剤、光ケージド部分及び光架橋部分、独自の反応性官能基、並びにＮＭＲ、ＩＲ、及びＸ線結晶プローブが挙げられ得る。例示的な非天然又は合成アミノ酸は、例えば、Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：２０４（２０１３）及びＷａｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｃｈｅｍ ２：１５（２０１４）に提供されている。非天然アミノ酸はまた、例えば、シトルリン（Ｃｉｔ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、及びピロリジン（Ｐｙｌ）などの、典型的にはタンパク質又はポリペプチドに組み込まれることのない、天然に存在する化合物を含み得る。

【0069】

「アミノ酸置換」は、そのアミノ酸残基において、野生型又は天然に存在するアミノ酸に対して異なるアミノ酸による、野生型又は天然に存在するアミノ酸の１つ以上の置換を含むポリペプチド又はタンパク質を指す。置換アミノ酸は、合成アミノ酸であってもよく、又は天然に存在するアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、置換アミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、置換アミノ酸は、非天然又は合成アミノ酸である。置換変異体は、略記方式を用いて記載され得る。例えば、５番目のアミノ酸残基が置換されている置換変異体は、「Ｘ５Ｙ」と略記することができ、「Ｘ」は、置き換えられる野生型又は天然に存在するアミノ酸であり、「５」は、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列内のアミノ酸残基位置であり、「Ｙ」は、置換アミノ酸、又は非野生型若しくは天然に存在しないアミノ酸である。

【0070】

「単離」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、又は核酸は、その天然環境から取り出された分子である。「単離」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、又は核酸は、希釈剤又は助剤などの賦形剤と配合されてもよく、それでもなお単離されているとみなされることも理解される。本明細書で使用される場合、「単離」は、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、又は核酸の任意の特定のレベルの純度を必ずしも意味するものではない。

【0071】

「組換え」という用語は、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に関して使用される場合、自然界に存在することが公知でない遺伝物質の新たな組み合わせを意味するか、又はその組み合わせから生じるものである。組換え分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、（例えば、制限エンドヌクレアーゼを使用する）遺伝子スプライシング、及び核酸分子、ペプチド又はタンパク質の固相合成を含むがこれらに限定されない、組換え技術の分野で利用可能な技術のいずれかによって産生することができる。

【0072】

「外来性」という用語は、宿主細胞に導入される参照分子又は活性を意味する。この分子は、例えば、宿主の遺伝物質にコード核酸を導入することによって、例えば、非染色体性遺伝物質、例えばプラスミドとして宿主の染色体に組み込むことによって導入することができる。「外来性」タンパク質は、このタンパク質をコードする「外来性」核酸を介して宿主細胞に導入することができる。「内在性」という用語は、宿主細胞内に自然に存在する参照分子又は活性を指す。「内在性」タンパク質は、宿主細胞内に含まれる核酸によって発現される。「異種」という用語は、参照生物／種以外の源に由来する分子又は活性を指す一方で、「相同」は、宿主生物／種に由来する分子又は活性を指す。従って、コード核酸の外来性発現は、異種コード核酸又は相同コード核酸の一方又はその両方を利用することができる。

【0073】

「ドメイン」という用語は、ポリペプチド又はタンパク質に関して使用される場合、タンパク質の別個の機能的単位及び／又は構造的単位を意味する。ドメインは、タンパク質の全体的な役割に寄与する特定の機能又は相互作用に関与する場合がある。ドメインは、種々の生物学的コンテクストにおいて存在し得る。類似のドメインは、異なる機能を有するタンパク質で見出され得る。或いは、配列同一性が低い（すなわち、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、又は約１％未満の配列同一性）ドメインは、同一の機能を有し得る。

【0074】

「モチーフ」という用語は、ポリペプチド又はタンパク質に関して使用される場合、一般に、典型的には２０アミノ酸長よりも短い保存アミノ酸残基の組を指し、タンパク質の機能に重要なものであり得る。特定の配列モチーフは、様々なタンパク質内の、特定の細胞内位置に対するタンパク質の結合又は標的化などの一般的な機能を媒介することができる。モチーフの例としては、核局在化シグナル、ミクロボディ標的化モチーフ、分泌を阻止又は促進するモチーフ、並びにタンパク質の認識及び結合を促進するモチーフが挙げられるが、これらに限定されない。モチーフのデータベース及び／又はモチーフ検索ツールは、当該分野で公知であり、例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＰＦＡＭ、ＰＲＩＮＴＳ、及びＭｉｎｉＭｏｔｉｆ Ｍｉｎｅｒが挙げられる。

【0075】

本明細書で使用される場合、「改変」タンパク質とは、所望の特性を得るために、タンパク質に１つ以上の改変を含むタンパク質を意味する。例示的な改変としては、挿入、欠失、置換、及び／又は別のドメイン若しくはタンパク質との融合が挙げられるが、これらに限定されない。「融合タンパク質」（「キメラタンパク質」とも称される）は、典型的には、単一のユニットとして転写及び翻訳されるように結合されている、２つの別個の遺伝子によってコードされる少なくとも２つのドメインを含むタンパク質であり、これによってドメインの各々の機能的特性を有する単一のポリペプチドが生成される。本開示の改変タンパク質には、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓニッカーゼ、並びにＣａｓタンパク質とＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、及び／又はＤＮＡポリメラーゼ結合タンパク質との融合体が含まれる。

【0076】

いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、野生型タンパク質から生成される。本明細書で使用される場合、「野生型」タンパク質又は核酸は、天然に存在する未改変タンパク質又は核酸である。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、生物であるストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離することができる。野生型は「変異型」と対比することができ、変異型は、タンパク質又は核酸のアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列に１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、野生型タンパク質と実質的に同一の活性、例えば、野生型タンパク質の約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％％超、又は約９９％超の活性を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓヌクレアーゼと実質的に同一の活性を有する。

【0077】

本明細書で使用される場合、「配列類似性」又は「％の類似性」という用語は、核酸配列間又はアミノ酸配列間の同一性又は一致性の程度を指す。ポリヌクレオチドの文脈における「配列類似性」は、１つ以上のヌクレオチド塩基の変化によって１つ以上のアミノ酸の置換が生じるが、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の機能的特性に影響しない核酸配列を指す場合がある。「配列類似性」はまた、結果として生じる転写産物の機能的特性に実質的に影響しないポリヌクレオチドの修飾、例えば、１つ以上のヌクレオチド塩基の欠失又は挿入を指す場合もある。従って、本開示は、特定の例示的な配列よりも多くのものを包含することが理解される。ヌクレオチド塩基の置換を形成する方法は、コードされるポリペプチドの生物活性の保持を判定する方法と同様に公知である。

【0078】

更に、当業者であれば、本開示に包含される類似のポリヌクレオチドが、ストリンジェントな条件下で本明細書に例示される配列とハイブリダイズする能力によって定義されることも認識する。本開示の類似のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリヌクレオチドと、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９９％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である。

【0079】

ポリペプチドの文脈における「配列類似性」は、アミノ酸の約４０％超が同一であり、又はアミノ酸の約６０％超が機能的に同一である２つ以上のポリペプチドを指す。「機能的に同一」又は「機能的に類似の」アミノ酸は、化学的に類似の側鎖を有する。例えば、アミノ酸は、機能的類似性に従って以下のようにグループ分けすることができる：（ｉ）正荷電側鎖：Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ；（ｉｉ）負荷電側鎖：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（ｉｉｉ）極性非電荷側鎖：Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（ｉｖ）疎水性側鎖：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ；及び（ｖ）その他：Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ。

【0080】

いくつかの実施形態では、本開示の類似のポリペプチドは、約４０％、少なくとも約４０％、約４５％、少なくとも約４５％、約５０％、少なくとも約５０％、約５５％、少なくとも約５５％、約６０％、少なくとも約６０％、約６５％、少なくとも約６５％、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、本開示の類似のポリペプチドは、約６０％、少なくとも約６０％、約６５％、少なくとも約６５％、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％、又は約１００％機能的に同一であるアミノ酸を有する。

【0081】

配列類似性は、当該分野において公知の方法を使用する配列アライメント、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＭＵＳＣＬＥ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ及びＣｌｕｓｔａｌＸを含む）、並びにＴ－Ｃｏｆｆｅｅ（例えば、Ｍ－Ｃｏｆｆｅｅ、Ｒ－Ｃｏｆｆｅｅ、及びＥｘｐｒｅｓｓｏなどの亜種を含む）などによって決定することができる。

【0082】

ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が指定された比較ウィンドウに対してアライメントされる場合に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの同一性パーセントを決定することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列の特定の部分のみをアライメントして、配列同一性を決定する。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列の特定のドメインのみをアライメントして、配列類似性を決定する。比較ウィンドウは、配列をアライメントして比較することが可能な、少なくとも１０～１０００個超の残基、少なくとも２０～約１０００個の残基、又は少なくとも５０～５００個の残基のセグメントであり得る。配列同一性を決定するためのアライメント方法はよく知られており、ＢＬＡＳＴなどの公的に利用可能なデータベースを使用して実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、２つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８（１９９０）（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７（１９９３）として修正されている）のアルゴリズムを用いて決定される。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴプログラム、例えばＢＬＡＳＴ＋又はＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質の検索は、本開示のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長さ＝３）などのプログラムによって実施することができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５（１７）：３３８９－３４０２（１９９７）に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。

【0083】

いくつかの実施形態では、ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、本明細書に提供される参照ポリペプチド若しくはポリヌクレオチド（又は参照ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの断片）と、７０％、少なくとも７０％、７５％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９５％、９７％、少なくとも９７％、９８％、少なくとも９８％、９９％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、本明細書に提供される参照ポリペプチド若しくはポリヌクレオチド（又は参照ポリペプチド若しくは核酸分子の断片）と、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。

【0084】

本明細書で使用される場合、「複合体」は、会合する２つ以上のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの群を指す。複合体形成の文脈における「会合する」又は「会合」という用語は、共有結合することなく、静電相互作用、疎水性／親水性相互作用、及び／又は水素結合相互作用によって互いに結合した分子を指す。互いに共有結合された異なる部分を含む分子は、公知である。いくつかの実施形態では、複合体は、複合体の全ての構成成分が共に存在する場合に形成され、すなわち自己集合複合体である。いくつかの実施形態では、複合体は、複合体の異なる構成成分間の化学的相互作用、例えば、水素結合などによって形成される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、タンパク質によるポリヌクレオチドの二次構造認識により、本明細書に提供されるタンパク質と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるポリヌクレオチドのＣａｓ結合領域は、本明細書に提供されるＣａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓニッカーゼ、又は融合タンパク質により認識される二次構造から構成される。

【0085】

組成物
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｉ）ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含むポリヌクレオチドとを含む組成物であって、ＤＮＡ鋳型配列がポリヌクレオチドの３’末端にある組成物を提供する。

【0086】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、第１のハイブリダイゼーション領域が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含む第２のポリヌクレオチドとを含む組成物を提供する。

【0087】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｉ）ガイド配列、及び（ｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、第１のハイブリダイゼーション領域が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含む第２のポリヌクレオチドとを含む組成物を提供する。

【0088】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｖ）プライマー結合配列を含む第１のポリヌクレオチドであって、プライマー結合配列が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む第２のポリヌクレオチドとを含む組成物を提供する。

【0089】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、第１のハイブリダイゼーション領域が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）第３のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉｉ）プライマー結合配列を含む第２のポリヌクレオチドであって、プライマー結合配列が第２のポリヌクレオチドの３’末端にある、第２のポリヌクレオチドと、（ｉ）第３のハイブリダイゼーション領域に相補的な第４のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む第３のポリヌクレオチドとを含む組成物を提供する。

【0090】

本明細書で使用される場合、「Ｃａｓタンパク質」は、ＣａｓヌクレアーゼとＣａｓニッカーゼの両方を包含する。Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一部である。Ｃａｓタンパク質及びポリヌクレオチド（「ガイドポリヌクレオチド」とも称される）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、部位特異的ゲノム改変に利用することができる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質と、Ｃａｓ結合領域（Ｃａｓタンパク質に結合し、及び／又はＣａｓタンパク質を活性化する）及びガイド配列（標的配列にハイブリダイズする）を含むガイドポリヌクレオチドとを含み、Ｃａｓタンパク質とガイドポリヌクレオチドとは、本明細書に記載されるように複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質と、ガイド配列を含む第１のポリヌクレオチドと、Ｃａｓ結合領域を含む第２のポリヌクレオチドとを含み、第１及び第２のポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成する。

【0091】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、システム内のＣａｓタンパク質に基づいて、Ｉ型～ＶＩ型に分類することができる。例えば、Ｃａｓ９はＩＩ型システムで見られるが、Ｃａｓ１２はＶ型システムで見られるものである。それぞれの型は、更にサブタイプに分類することができる。例えば、ＩＩ型はサブタイプＩＩ－Ａ、ＩＩ－Ｂ、及びＩＩ－Ｃを含むことができ、Ｖ型はサブタイプＶ－Ａ及びＶ－Ｂを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及びＣａｓヌクレアーゼの分類は、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３１１：４７－７５（２０１５）；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｃｔ ２０１８；３２５－３３６；及びＫｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｂ ３７４：２０１８００８７（２０１８）で更に説明されている。本明細書に記載されるＣａｓヌクレアーゼは、別段の指定がない限り、任意の型又は変異体を包含することができる。

【0092】

いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。一般に、Ｃａｓヌクレアーゼは、二本鎖ポリヌクレオチド開裂、例えば、二本鎖ＤＮＡ開裂を生じさせることができる。一般に、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ及びＨＮＨなどの１つ以上のヌクレアーゼドメインを含むことができ、二本鎖ＤＮＡを開裂させることができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含み、その各々が二本鎖ＤＮＡの１本の鎖を開裂させる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼにより、平滑末端が生成される。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼのＲｕｖＣ及びＨＮＨは、各ＤＮＡ鎖を同じ位置で開裂させ、それによって平滑末端が生成される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼにより、付着末端が生成される。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼのＲｕｖＣ及びＨＮＨが、異なる位置で各ＤＮＡ鎖を開裂させ（すなわち、「オフセット」で切断し）、それによって付着末端が生成される。本明細書で使用される場合、「付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄｓ）」、「付着末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｎｄｓ）」、又は「粘着末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄｓ）」という用語は、不均等な長さの鎖を有する核酸断片を指す。「平滑末端」とは対照的に、付着末端は、二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）を互い違いに切断することによって生成される。粘着末端又は付着末端は、不対ヌクレオチドによる突出した一本鎖、すなわち「オーバーハング」、例えば３’又は５’オーバーハングを有する。

【0093】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。例示的なＣａｓ９ヌクレアーゼとしては、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｉｓｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、及びその他多数の細菌由来のＣａｓ９が挙げられるが、これらに限定されない。更なる例示的なＣａｓ９ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，７７１，９４５号明細書、同第９，０２３，６４９号明細書、同第１０，０００，７７２号明細書、及び同第１０，４０７，６９７号明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のものである（ＳｐＣａｓ９）。

【0094】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼである（以前は「Ｃｐｆ１」又は「Ｃ２ｃ１」として知られている）。Ｃａｓ１２ヌクレアーゼは、一般にＣａｓ９ヌクレアーゼよりも小さく、典型的には付着末端を生成することができる。例示的なＣａｓ１２タンパク質としては、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、アシダミノコッカス種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ラクノスピラ種（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐ．）、プレボテラ種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）、及びその他多数の細菌由来のＣａｓ１２タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。更なるＣａｓ１２ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第９，５８０，７０１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３号明細書、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９－７７１（２０１５）、及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６０：４３６－４３９（２０１８）に記載されている。

【0095】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ－Ｂ型Ｃａｓヌクレアーゼである。ＩＩ－Ｂ型Ｃａｓヌクレアーゼは、本明細書に記載されるように付着末端を生成することができる。例示的なＩＩＢ型Ｃａｓ９タンパク質としては、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、パラサテレラ・エクスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）、サテレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、ウォリネラ・サクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、配列決定された腸メタゲノムであるＭＨ０２４５＿ＧＬ０１６１８３０．１、及びその他多数の細菌由来のＣａｓ９タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。更なるＩＩ－Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、国際公開第２０１９／０９９９４３号パンフレットに記載されている。いくつかの実施形態では、ＩＩ－Ｂ型Ｃａｓヌクレアーゼは、配列決定された腸メタゲノムであるＭＨ０２４５＿ＧＬ０１６１８３０．１由来のものである（ＭＨＣａｓ９）。

【0096】

いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓニッカーゼを含む。ニッカーゼは、二本鎖ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）に一本鎖開裂を生じさせるものであり、二本鎖ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）の両鎖を開裂させるヌクレアーゼとは区別される。本明細書で説明されるように、野生型Ｃａｓヌクレアーゼは、典型的には２つの触媒ヌクレアーゼドメインであるＲｕｖＣ及びＨＮＨを含み、各ヌクレアーゼドメインが二本鎖ＤＮＡの一方の鎖の開裂に関与する。従って、いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼと比較して触媒ドメインにアミノ酸変異を含んでいる。Ｃａｓニッカーゼは、例えば、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２４：１３２－１４１（２０１３）、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４：１３８０－１３８９（２０１３）、及びＭａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１：８３３－８３８（２０１３）に更に記載されている。

【0097】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ１２ａニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、ＩＩ－Ｂ型Ｃａｓニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼに突然変異をもたらすことによって生成される。例えば、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼは、野生型ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼと比較してＤ１０Ａ変異又はＨ８４０Ａ変異を含んでいる。本明細書に記載されるようなアライメント方法は、他のＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ１２ａ又はＩＩ－Ｂ型Ｃａｓヌクレアーゼ）の対応するアミノ酸残基を決定し、Ｃａｓニッカーゼを生成するために使用することができることが当業者には理解されるであろう。

【0098】

いくつかの実施形態では、組成物のＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、異種タンパク質ドメインに融合されていない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、又は逆転写酵素に融合されていない。

【0099】

いくつかの実施形態では、組成物のＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、異種タンパク質ドメインに融合されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ動員部分、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、又はこれらの組み合わせに融合されている。Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼを含む融合タンパク質は、更に本明細書に記載されている。

【0100】

ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含み、ＤＮＡ鋳型配列は、ポリヌクレオチドの３’末端にある。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、ＲＮＡガイド配列である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、ガイド配列（例えば、ＲＮＡガイド配列）、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含む。

【0101】

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、第１及び第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含み、第１のハイブリダイゼーション領域は、第１のポリヌクレオチドの３’末端にあり、第２のポリヌクレオチドは、（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及び第１のハイブリダイゼーション領域を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、第２のハイブリダイゼーション領域及びＤＮＡ鋳型配列を含む。

【0102】

いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、（ｉ）ガイド配列、及び（ｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含み、第１のハイブリダイゼーション領域は、第１のポリヌクレオチドの３’末端にあり、第２のポリヌクレオチドは、（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、ガイド配列及び第１のハイブリダイゼーション領域を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、第２のハイブリダイゼーション領域、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、第１及び第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｖ）プライマー結合配列を含み、プライマー結合配列は、第１のポリヌクレオチドの３’末端にあり、第２のポリヌクレオチドは、（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、第１のハイブリダイゼーション領域、及びプライマー結合配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、第２のハイブリダイゼーション領域及びＳＯＩを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び／又は第２のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されている。本明細書に記載されるような第１及び第２のポリヌクレオチドを含む組成物の限定されない例示的な図を、図１１（Ｂ）に示す。

【0104】

いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び／又は第２のポリヌクレオチドは、相同配列を更に含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、第１のハイブリダイゼーション領域、及びプライマー結合配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、第２のハイブリダイゼーション領域、ＳＯＩ、及び相同配列を含む。いくつかの実施形態では、相同配列は、（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼによって生じた）開裂された標的ポリヌクレオチドと近接する配列とハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、例えば、図９又は図１１（Ａ）に図示されるように、ガイド配列は開裂部位の一方の側の領域にハイブリダイズし、相同配列は開裂部位の他方の側の領域にハイブリダイズする。図９及び図１１（Ａ）では、第１のポリヌクレオチドは、ガイド配列（「スペーサー」と称する）、Ｃａｓ結合領域（「ｇＲＮＡ足場」と称する）、第１のハイブリダイゼーション領域（「ランディングパッド」と称する）、及びプライマー結合配列（ＰＢＳ）から構成され、第２のポリヌクレオチドは、第２のハイブリダイゼーション領域（「ハイブリダイゼーション配列」と称する）、ＳＯＩ（「挿入断片」と称する）、及び相同配列から構成される。

【0105】

いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、相同配列、第１のハイブリダイゼーション領域、及びプライマー結合配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、第２のハイブリダイゼーション領域、ＳＯＩ、及び更なるハイブリダイゼーション領域を含み、第２のハイブリダイゼーション領域及び更なるハイブリダイゼーション領域が、第１のハイブリダイゼーション領域の非重複部分でハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、例えば、図１１（Ｊ）で図示されるように、第２のハイブリダイゼーション領域及び更なるハイブリダイゼーション領域がＳＯＩを挟んでおり、第１のハイブリダイゼーション領域の隣接した一部とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、例えば、図１１（Ｊ）に図示されるように、ガイド配列は開裂部位の一方の側の領域にハイブリダイズし、相同配列は開裂部位の他方の側の領域にあり、この開裂部位の対向するＤＮＡ鎖にハイブリダイズする。

【0106】

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、第１、第２及び第３のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含み、第１のハイブリダイゼーション領域は、第１のポリヌクレオチドの３’末端にあり、第２のポリヌクレオチドは、（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）第３のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉｉ）プライマー結合配列を含み、プライマー結合配列は、第２のポリヌクレオチドの３’末端にあり、第３のポリヌクレオチドは、（ｉ）第３のハイブリダイゼーション領域に相補的な第４のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及び第１のハイブリダイゼーション領域を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、第２のハイブリダイゼーション領域、第３のハイブリダイゼーション領域、及びプライマー結合配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、第４のハイブリダイゼーション領域及びＳＯＩを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、及び／又は第３のポリヌクレオチドのいずれかは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されている。

【0107】

いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、及び／又は第３のポリヌクレオチドのいずれかは、例えば、図１１（Ｅ）に図示されるように、本明細書に記載されるような相同配列を更に含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及び第１のハイブリダイゼーション領域を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、第２のハイブリダイゼーション領域、第３のハイブリダイゼーション領域、及びプライマー結合配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、第４のハイブリダイゼーション領域、ＳＯＩ、及び相同配列を含む。

【0108】

いくつかの実施形態では、例えば、第１、第２及び／又は第３のポリヌクレオチドを含む本明細書の組成物は、ＳＯＩに相補的な配列から構成されるＳＯＩ相補的オリゴヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ＳＯＩ相補的オリゴヌクレオチドは、図１１（Ｄ）に図示されるように、５’末端及び３’末端の一方又は両方においてＳＯＩよりも長く、それによってオーバーハング末端を有する二本鎖配列が生成される。いくつかの実施形態では、ＳＯＩ相補的オリゴヌクレオチドは、例えば、図１１（Ｈ）に図示されるように、ＳＯＩと同じ長さであり、それによって平滑末端を有する二本鎖配列が生成される。いくつかの実施形態では、ＳＯＩ相補的オリゴヌクレオチドは、ＳＯＩとハイブリダイズして二本鎖ＳＯＩを形成する。いくつかの実施形態では、二本鎖ＳＯＩは、一本鎖ＳＯＩと比較して、より正確な挿入効率を有する。いくつかの実施形態では、ＳＯＩ相補的オリゴヌクレオチドは、例えば、図１１（Ｉ）に図示されるように、相同配列を更に含む。

【0109】

いくつかの実施形態では、第２のハイブリダイゼーション領域は、第１のハイブリダイゼーション領域の全長にわたってハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第２のハイブリダイゼーション領域は、第１のハイブリダイゼーション領域よりも、例えば、約１～約１０ヌクレオチド、又は約２～約８ヌクレオチド、又は約３～約６ヌクレオチド、又は約４～約５ヌクレオチドだけ短い。いくつかの実施形態では、例えば、図１１（Ｆ）で図示されるように、第２のハイブリダイゼーション領域は、第１のハイブリダイゼーション領域よりも、第２のハイブリダイゼーション領域の５’末端部分で短く、それによって第２のハイブリダイゼーション領域と開裂されたＤＮＡの間にギャップが残される。いくつかの実施形態では、第２のハイブリダイゼーション領域は、第１のハイブリダイゼーション領域よりも、例えば、約１～約１０ヌクレオチド、又は約２～約８ヌクレオチド、又は約３～約６ヌクレオチド、又は約４～約５ヌクレオチドだけ長い。いくつかの実施形態では、例えば、図１１（Ｇ）で図示されるように、第２のハイブリダイゼーション領域は、第１のハイブリダイゼーション領域よりも、第２のハイブリダイゼーション領域の５’末端部分で長く、それによってハイブリダイゼーション後に第１のハイブリダイゼーション領域と第２のハイブリダイゼーション領域の間にフラップがもたらされる。いくつかの実施形態では、フラップは、ＦＥＮ１などの修復機構を動員及び／又は結合させ、それによって目的配列の正確な挿入が容易となる。

【0110】

いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）ＲＮＡガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含むポリヌクレオチドであって、ＤＮＡ鋳型配列がポリヌクレオチドの３’末端にあるポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）ＲＮＡガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含むポリヌクレオチドであって、ＤＮＡ鋳型配列がポリヌクレオチドの３’末端にあり、ＤＮＡ鋳型配列がホスホロチオエート結合を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、ガイド配列（例えば、ＲＮＡガイド配列）、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含む。

【0111】

いくつかの実施形態では、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド、例えば、宿主細胞ゲノム内の標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼによって開裂させることが意図される標的ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、ＲＮＡを含み、すなわちＲＮＡガイド配列である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、ＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせを含む。ハイブリッドＲＮＡ－ＤＮＡガイド配列は、例えば、Ｒｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ８：１６１０（２０１７）に更に記載されている。

【0112】

いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１０～約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１２～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１５～約２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、又は約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするのに十分な長さである。

【0113】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、組成物中のＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼ）に結合することができ、それによってＣａｓタンパク質と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、ＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせを含む。Ｃａｓタンパク質に結合するか、及び／又はＣａｓタンパク質を活性化するハイブリッドＲＮＡ－ＤＮＡ配列は、例えば、Ｒｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ８：１６１０（２０１７）に更に記載されている。

【0114】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、Ｃａｓタンパク質に結合し、Ｃａｓタンパク質を活性化するｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることができ、組成物はｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼに結合することができる。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼを活性化させることができる。いくつかの実施形態では、活性化させることには、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼの開裂活性を惹起又は増大させることが含まれる。いくつかの実施形態では、活性化させることには、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼを（例えば、ガイド配列により誘導することで）標的ポリヌクレオチドに結合させることを促進することが含まれる。いくつかの実施形態では、活性化させることには、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼを標的ポリヌクレオチドに結合するのを促進すること、及びＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼの開裂活性を惹起又は増大させることの組み合わせが含まれる。Ｃａｓタンパク質（例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、又はＩＩ－Ｂ型Ｃａｓタンパク質）のＴｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＲＮＡｃｅｎｔｒａｌ及びＲｆａｍを含む公的データベースから入手可能であり、例えば、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ １０（５）：７２６－７３７（２０１３）及びＧａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ １１：５５１２（２０２０）に更に記載されている。

【0115】

いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの３’末端にＤＮＡ鋳型配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、一本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、目的配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、プライマー結合配列及び目的配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、ＤＮＡポリメラーゼにより増幅させるための鋳型を含む。いくつかの実施形態では、目的配列は、ＤＮＡポリメラーゼにより増幅させるための鋳型を含む。いくつかの実施形態では、組成物のＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、ガイド配列によって標的ポリヌクレオチドに誘導されて標的ポリヌクレオチドを開裂し、開裂された標的ポリヌクレオチドの一方の鎖が、プライマー結合配列にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとして機能する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、目的配列に相補的なＤＮＡ鎖を合成し、目的配列を含む二本鎖配列を形成することができる。いくつかの実施形態では、目的配列を含む二本鎖配列は、例えば、本明細書に記載されるライゲーション又はＤＮＡ修復経路により、開裂された標的ポリヌクレオチドに挿入される。Ｃａｓによって媒介される目的配列の標的挿入の例示的で限定されない概要を、図１に図示する。図１では、Ｃａｓヌクレアーゼがガイド配列によって細胞内の標的ＤＮＡに誘導され、標的ＤＮＡを開裂させている。ＤＮＡ鋳型配列は、（ｉ）プライマーとしての役割を果たす、開裂されたＤＮＡとハイブリダイズするプライマー結合配列、及び（ｉｉ）目的配列を含む。ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、細胞の内在性ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーに結合して目的配列と相補的なＤＮＡ鎖を合成し、それによって目的配列を含む二本鎖配列が形成される。この二本鎖配列を、ＤＮＡ修復経路、例えばＮＨＥＪにより、開裂された標的ＤＮＡに挿入することができる。

【0116】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡ鋳型配列の構成成分、例えば、目的配列及びプライマー結合配列は、別々の２つのポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載されるような第１及び第２のポリヌクレオチド上に位置する。目的配列とプライマー結合配列とが別々の２つのポリヌクレオチド上に位置している、例示的で限定されない一実施形態の概要を、図１０Ａ～１０Ｃに図示する。図１０Ａでは、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、第１のハイブリダイゼーション領域、及びプライマー結合部位が、第１のポリヌクレオチド上に位置している。ガイド配列によって標的ＤＮＡに誘導されたＣａｓヌクレアーゼにより、標的ＤＮＡに二本鎖切断が生じる。プライマー結合部位は、開裂されたＤＮＡにハイブリダイズし、第２のポリヌクレオチドは、相補的配列を含む第１及び第２のハイブリダイゼーション領域によって第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする。第２のポリヌクレオチドは目的配列を含み、この配列が、５’末端と３’末端の両方で開裂されたＤＮＡに、リガーゼによってライゲートされる（図１０Ａ）。第２のポリヌクレオチドは、更に相同配列を含むことができ、その５’末端は、開裂されたＤＮＡにリガーゼによってライゲートされ、その３’末端は、相同性媒介メカニズムによって組み込まれる（図１０Ｂ）。いくつかの実施形態では、相同性媒介メカニズムは、ＨＤＲ、合成依存的単鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、代替的末端連結（ａｌｔ－ＥＪ）、又はこれらの組み合わせを含む。複合体は、ライゲーション及び／又は相同性媒介組み込みの後に二本鎖ＤＮＡへと変換され、それによって標的ＤＮＡに目的配列が組み込まれる（図１０Ｃ）。

【0117】

いくつかの実施形態では、目的配列は、目的遺伝子を含む。本明細書で使用される場合、「目的遺伝子」という用語は、目的の生体分子（例えば、タンパク質又はＲＮＡ分子）をコードする遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、目的配列は、目的タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、細胞内タンパク質、膜タンパク質、細胞外タンパク質、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、核タンパク質、転写因子、核膜トランスポーター、細胞内小器官関連タンパク質、膜受容体、触媒タンパク質、酵素、治療用タンパク質、膜タンパク質、膜輸送タンパク質、シグナル伝達タンパク質、免疫学的タンパク質、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、免疫学的タンパク質は、抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、目的配列は、宿主細胞の在来遺伝子のコピーをコードする。いくつかの実施形態では、目的配列は、宿主細胞において欠損した在来遺伝子のコピーをコードする。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、遺伝子に突然変異を含み、目的配列は、その遺伝子の野生型コピーをコードする。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、野生型遺伝子を含み、目的配列は、目的の突然変異を含む遺伝子のコピーをコードする。いくつかの実施形態では、目的配列は、宿主細胞に天然に存在しない異種遺伝子をコードする。

【0118】

いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、目的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、目的ＲＮＡは、治療用ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、目的ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、セルフリーＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、目的配列は、目的の調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、目的配列は、目的配列上の調節エレメントが宿主細胞の在来遺伝子を調節することができるように、宿主細胞の標的ポリヌクレオチドに挿入される。調節エレメントは、本明細書に記載されており、例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、オペレーター、応答エレメント、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、インスレーターなどが挙げられる。

【0119】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約５ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約６ヌクレオチド～約１０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約７ヌクレオチド～約７５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約８ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約９ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約１５ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約２０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約２５ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約３０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約１０ヌクレオチド長より大きく、約１５ヌクレオチド長より大きく、約２０ヌクレオチド長より大きく、約２５ヌクレオチド長より大きく、約３０ヌクレオチド長より大きく、約３５ヌクレオチド長より大きく、約４０ヌクレオチド長より大きく、約４５ヌクレオチド長より大きく、又は約５０ヌクレオチド長より大きい。

【0120】

いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約３～約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約４～約４５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約５～約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約６～約３５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約７～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約８～約２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約１０～約２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約４～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、開裂された標的ＤＮＡ配列の領域とハイブリダイズするのに十分な長さを有する。

【0121】

いくつかの実施形態では、目的配列は、約３～約５００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、目的配列は、約４～約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、目的配列は、約５～約９０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、目的配列は、約６～約８０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、目的配列は、約７～約７０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、目的配列は、約８～約６０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、目的配列は、約９～約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、目的配列は、約１０～約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、目的配列は、約１１～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、目的配列は、約１２～約２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、目的配列は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、目的配列は、約１０ヌクレオチド長より大きく、約１５ヌクレオチド長より大きく、約２０ヌクレオチド長より大きく、約２５ヌクレオチド長より大きく、約３０ヌクレオチド長より大きく、約３５ヌクレオチド長より大きく、約４０ヌクレオチド長より大きく、約４５ヌクレオチド長より大きく、又は約５０ヌクレオチド長より大きい。

【0122】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、修飾ヌクレオチド、非Ｂ型ＤＮＡ構造体、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分、ＤＮＡリガーゼ動員部分、又はこれらの組み合わせを含む。

【0123】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、脱塩基部位、共有結合リンカー、異種核酸（ＸＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート結合、ＤＮＡ損傷体、ＤＮＡ光産物、修飾デオキシリボヌクレオシド、メチル化ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによる目的配列の過度な伸長を低減又は防止する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼによる目的配列の過度な伸長を低減又は防止することにより、目的配列を含む二本鎖配列の挿入の精度が向上する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基部位（ＡＰ部位）としても公知の脱塩基部位を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、共有結合リンカーを含む。いくつかの実施形態では、共有結合リンカーは、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーを含む。いくつかの実施形態では、共有結合リンカーは、アミノリンカーを含む。ＴＥＧリンカー及びアミノリンカーは、ポリメラーゼ伸長を阻害することが示されており、例えば、Ｓｔｒｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ：１０．１１０１／２０１９．１２．２６．８８８７４３（２３ Ｊａｎｕａｒｙ ２０２０）を参照されたい。

【0125】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、本開示のポリヌクレオチドのヌクレアーゼ分解を低減又は防止する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ゼノ核酸（ＸＮＡ）を含む。ＸＮＡは、ＤＮＡのデオキシリボース又はＲＮＡのリボースとは異なる糖基を有する合成ヌクレオチド類似体である。ＸＮＡの例示的な糖基としては、トレオース、シクロヘキセン、グリコール、又はロックドリボースが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＸＮＡは、１，５－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、架橋型核酸（ＢＮＡ）としても公知のロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。ＬＮＡは、リボース部分が２’酸素と４’炭素を接続する更なる架橋によって修飾されている修飾ＲＮＡヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ＤＮＡ又はＲＮＡのデオキシリボース骨格又はリボース骨格とは異なり、ＰＮＡポリマーの骨格は、ペプチド結合によって連結されたＮ－（２－アミノエチル）－グリシン単位から構成されており、メチレン架橋及びカルボニル基によってプリン塩基及びピリミジン塩基がＰＮＡ骨格に連結されている。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含む。ホスホロチオエート結合は、２つのヌクレオチドを連結するホスフェート基中の酸素の１つの代わりに硫黄原子を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中にＸＮＡ、例えばＬＮＡ若しくはＰＮＡ、又はホスホロチオエート結合が存在することにより、ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ分解に対する安定性が向上する。

【0126】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、本明細書で提供される組成物のポリヌクレオチド）中に修飾ヌクレオチドが存在することにより、ポリヌクレオチドにＤＮＡポリメラーゼを動員することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼを動員することには、例えば、ポリヌクレオチド中に修飾ヌクレオチドが存在することによりＤＮＡポリメラーゼがポリヌクレオチドを認識する可能性を増大させること；ＤＮＡポリメラーゼがポリヌクレオチドに結合することを促進すること；及び／又はＤＮＡポリメラーゼを活性化すること、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの活性を惹起又は増大させることが含まれる。いくつかの実施形態では、動員されたＤＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載されるように、開裂された標的ポリヌクレオチドの鎖に結合し、ＤＮＡ鋳型配列上の目的配列を伸長する。

【0127】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ＤＮＡ損傷体を含む。本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ損傷体」とは、ＤＮＡ損傷を典型的に示す塩基の変異、塩基の欠失、及び／又は糖の変異を含有するＤＮＡポリヌクレオチドの領域を指す。ＤＮＡ損傷体は、核酸塩基の加水分解、酸化、アルキル化、脱プリン化、脱ピリミジン化、及び／又は脱アミノ化によって生じる可能性のあるものである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷体は、ＤＮＡポリメラーゼを動員することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷体は、８－オキソグアニン、チミン－グリコール、Ｎ７－（２－ヒドロキシエチル）グアニン（７ＨＥＧ）、７－（２－オキソエチル）グアニン、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷体は、８－オキソグアニン、チミン－グリコール、又はこれらの組み合わせを含む。

【0128】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ＤＮＡ光産物を含む。ＤＮＡ光産物は、紫外線（ＵＶ）誘発性のＤＮＡ損傷体であり、例えば、Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １５（１１）：２０３２１－２０３３８（２０１４）に更に記載されている。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ光産物は、ＤＮＡポリメラーゼを動員することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ光産物は、ピリミジン二量体、シクロブタンピリミジン二量体（ＣＰＤ）、ピリミジン（６－４）ピリミドン光産物（「（６－４）光産物」とも称される）、アデニン－チミンヘテロ二量体、デュワーピリミジノン、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ光産物は、ＣＰＤ、（６－４）光産物、又はこれらの組み合わせを含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾デオキシリボヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾デオキシリボヌクレオシドは、ＤＮＡポリメラーゼを動員することができる。いくつかの実施形態では、修飾デオキシリボヌクレオシドは、ＤＮＡには典型的に存在しない塩基、すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、又はチミンを含む。いくつかの実施形態では、修飾デオキシリボヌクレオシドは、デオキシウリジン、アクロレイン－デオキシグアニン、マロンジアルデヒド－デオキシグアニン、デオキシイノシン、デオキシキサントシン、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、修飾デオキシリボヌクレオシドは、デオキシウリジンを含む。

【0130】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、メチル化ヌクレオチド、例えば、メチル化シトシンは、ＤＮＡポリメラーゼを動員することができる。いくつかの実施形態では、メチル化ヌクレオチドは、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－メチルシトシン、又はこれらの組み合わせを含む。

【0131】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、非Ｂ型ＤＮＡ構造体を含む。本明細書で使用される場合、「非Ｂ型ＤＮＡ構造体」とは、標準的な右巻きのＢ型ＤＮＡヘリックスではないＤＮＡの二次構造のコンフォメーションのことである。非Ｂ型ＤＮＡ構造体の非限定的な例としては、グアニン四重鎖、三重鎖ＤＮＡ（Ｈ－ＤＮＡ）、Ｚ－ＤＮＡ、十字形、スリップＤＮＡ鎖、Ａトラクトベンディング、粘着性ＤＮＡが挙げられる。非Ｂ型ＤＮＡ構造体は、例えば、Ｇｕｉｂｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４９（３）：１４９７－１５１６（２０２１）に更に記載されている。いくつかの実施形態では、非Ｂ型ＤＮＡ構造体は、ＤＮＡポリメラーゼを動員することができる。いくつかの実施形態では、非Ｂ型ＤＮＡ構造体は、ヘアピン、十字形、Ｚ－ＤＮＡ、Ｈ－ＤＮＡ（三重らせんＤＮＡ）、グアニン四重鎖ＤＮＡ（四重らせんＤＮＡ）、スリップＤＮＡ、粘着性ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む。

【0132】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分を含む。ＤＮＡポリメラーゼの動員は、本明細書に記載されている。ＤＮＡポリメラーゼ動員部分によって動員することができるＤＮＡポリメラーゼの非限定的な例としては、Ｐｏｌ Ｉ（そのクレノウ断片を含む）、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶ、若しくはＰｏｌ Ｖなどの細菌性ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｏｌ α、Ｐｏｌ β、Ｐｏｌ λ、Ｐｏｌ γ、Ｐｏｌ σ、Ｐｏｌ μ、Ｐｏｌ δ、Ｐｏｌ ε、Ｐｏｌ η、Ｐｏｌ ι、Ｐｏｌ κ、Ｐｏｌ ζ、Ｐｏｌ θ、ＲＥＶ１、若しくはＲＥＶ３などの真核生物ＤＮＡポリメラーゼ；Ｂｓｔ、Ｔ４、若しくはΦ２９（ｐｈｉ２９）ＤＮＡポリメラーゼなどの等温ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔａｑ、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｔｈ、若しくはＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ；又はそれらの変異体若しくは相同体が挙げられる。

【0133】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分は、修飾ヌクレオチド、例えば、本明細書に記載されるＤＮＡ損傷体、ＤＮＡ光産物、修飾デオキシリボヌクレオシド、及び／又はメチル化ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、損傷乗り越えＤＮＡ合成（ＴＬＳ）ポリメラーゼを動員する。ＴＬＳポリメラーゼは、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドを含むＤＮＡを伸長することができる。例示的なＴＬＳポリメラーゼとしては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＰｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶ、及びＰｏｌ Ｖ；Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＲｅｖ１ｐ、Ｒｅｖ３ｐ、及びＰｏｌ η；並びにヒトＲＥＶ１、ＲＥＶ３、Ｐｏｌ η、Ｐｏｌ ι、及びＰｏｌ κが挙げられるが、これらに限定されない。更なるＴＬＳポリメラーゼは、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ５（１０）；ａ０１０３６３（２０１３）及びＷａｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ７３（１）：１３４－１５４（２００９）に記載されている。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分は、本明細書に記載される非Ｂ型ＤＮＡ構造体を含む。いくつかの実施形態では、非Ｂ型ＤＮＡ構造体により動員されたＤＮＡポリメラーゼが、非Ｂ型ＤＮＡ構造体を介してＤＮＡを伸長することができる。いくつかの実施形態では、非Ｂ型ＤＮＡ構造体は、ＰｒｉｍＰｏｌ、ＲＥＶ１、ＲＥＶ３、Ｐｏｌ δ、Ｐｏｌ η、Ｐｏｌ ι、Ｐｏｌ κ、及びＰｏｌ θから選択されるＤＮＡポリメラーゼを動員する。

【0134】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分は、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質から構成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼを認識して結合することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質は、ＤＮＡ鋳型配列に連結されている。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質は、プライマー結合配列に架橋されている。タンパク質をポリヌクレオチドに連結する方法は、当業者に公知であり、例えば、銅触媒環化付加、ひずみ促進型アジド－アルキン付加環化、及び逆電子要請型ディールス－アルダー反応（例えば、シクロプロペンとテトラジンとの間の反応）などの共有結合方法；又は親和性に基づく方法、例えば、ビオチン部分を含むポリヌクレオチドをアビジン若しくはストレプトアビジン部分を含むタンパク質と連結させる方法が挙げられる。

【0135】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質（ＴＮＦＡＩＰ）、ポリメラーゼデルタ相互作用タンパク質（ＰｏｌＤＩＰ）、Ｘ線修復交差補完タンパク質（ＸＲＣＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン結合ＥＳ細胞特異的（ＨＭＣＥＳ）タンパク質、ＲＡＤ１、ＲＡＤ９、ＨＵＳ１、又はこれらの組み合わせを含む。

【0136】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、ＤＮＡリガーゼ動員部分を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、本明細書で提供される組成物のポリヌクレオチド）中にＤＮＡリガーゼ動員部分が存在することにより、ポリヌクレオチドにＤＮＡリガーゼを動員することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼを動員することには、例えば、ポリヌクレオチド中にＤＮＡリガーゼ動員部分が存在することによりＤＮＡリガーゼがポリヌクレオチドを認識する可能性を増大させること；ＤＮＡリガーゼがポリヌクレオチドに結合することを促進すること；及び／又はＤＮＡリガーゼを活性化すること、例えば、ＤＮＡリガーゼの活性を惹起又は増大させることが含まれる。いくつかの実施形態では、動員されたＤＮＡリガーゼは、本明細書に記載されるように、ＤＮＡポリメラーゼによって生成された目的配列を含む二本鎖配列に結合し、開裂された標的ポリヌクレオチドに二本鎖配列をライゲートする。

【0137】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼ動員部分は、ＤＮＡ鋳型配列の５’アデニル化からなる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼ動員部分は、ＤＮＡリガーゼ動員タンパク質から構成される。例示的なＤＮＡリガーゼ動員タンパク質としては、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、又はＸ線修復交差補完タンパク質１（ＸＲＣＣ１）が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡリガーゼ部分によって動員することができるＤＮＡリガーゼの非限定的な例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼなどの細菌性ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、若しくはＤＮＡリガーゼＩＶなどの哺乳類ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼなどの熱安定性ＤＮＡリガーゼ、又はこれらの変異体若しくは相同体が挙げられる。

【0138】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列は、組成物中の単一のポリヌクレオチド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、ガイド配列及びＣａｓ結合領域の３’に位置する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、ポリヌクレオチドの３’末端にある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの３’末端に位置するＤＮＡ鋳型配列は、本明細書に記載されるように、ＤＮＡポリメラーゼによる開裂された標的ポリヌクレオチドの結合及び／又は伸長を促進し、目的配列を含む二本鎖配列を形成する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの３’末端に位置するＤＮＡ鋳型配列は、本明細書に記載されるように、ＤＮＡリガーゼによる開裂された標的ポリヌクレオチドへの二重鎖配列のライゲーションを促進する。

【0139】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列は、組成物中の２つ以上のポリヌクレオチド上に存在する。いくつかの実施形態では、ガイド配列とＣａｓ結合領域が第１のポリヌクレオチド上にあり、ＤＮＡ鋳型配列が第２のポリヌクレオチド上にある。いくつかの実施形態では、ガイド配列が第１のポリヌクレオチド上にあり、Ｃａｓ結合領域とＤＮＡ鋳型配列が第２のポリヌクレオチド上にある。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１のハイブリダイゼーション領域を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域を含む。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域及び第２のハイブリダイゼーション領域は、ハイブリダイズ可能である。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域及び第２のハイブリダイゼーション領域は、ＲＮＡから構成される。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域及び第２のハイブリダイゼーション領域は、一本鎖ＤＮＡから構成される。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域がＲＮＡから構成され、第２のハイブリダイゼーション領域が一本鎖ＤＮＡから構成される。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域が一本鎖ＤＮＡから構成され、第２のハイブリダイゼーション領域がＲＮＡから構成される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び一本鎖ＤＮＡは、ハイブリダイズ可能である。

【0140】

いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域は、第１のポリヌクレオチドの３’末端にある。いくつかの実施形態では、第２のハイブリダイゼーション領域は、第２のポリヌクレオチドの５’末端にある。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域が第２のハイブリダイゼーション領域にハイブリダイズする際に、ＤＮＡ鋳型配列がガイド配列及びＣａｓ結合領域の両方の３’に位置する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、第２のポリヌクレオチドの３’末端にある。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドの３’末端に位置するＤＮＡ鋳型配列は、本明細書に記載されるように、ＤＮＡポリメラーゼによる開裂された標的ポリヌクレオチドの結合及び／又は伸長を促進し、目的配列を含む二本鎖配列を形成する。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドの３’末端に位置するＤＮＡ鋳型配列は、本明細書に記載されるように、ＤＮＡリガーゼによる開裂された標的ポリヌクレオチドへの二重鎖配列のライゲーションを促進する。

【0141】

いくつかの実施形態では、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、目的配列（ＳＯＩ）、及びプライマー結合配列は、本明細書に記載されるように、２つ以上のポリヌクレオチド上に存在する。いくつかの実施形態では、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びプライマー結合配列が第１のポリヌクレオチド上にあり、ＳＯＩが第２のポリヌクレオチド上にあり、第１及び第２のポリヌクレオチドは、互いにハイブリダイズすることが可能な第１及び第２のハイブリダイゼーション領域をそれぞれ含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、第１のポリヌクレオチドの３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドの３’末端に位置するプライマー結合配列は、本明細書に記載されるように、ＤＮＡリガーゼによる開裂された標的ポリヌクレオチドへのＳＯＩの結合及び／又はライゲーションを促進する。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドの３’末端に位置するプライマー結合配列は、本明細書に記載されるように、ＤＮＡポリメラーゼによる開裂された標的ポリヌクレオチドの結合及び／又は伸長を促進し、ＳＯＩを含む二本鎖配列を形成する。

【0142】

いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域は、約３～約１００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域は、約４～約５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域は、約５～約１０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域は、約１０～約８００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域は、約２０～約６００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域は、約３０～約５００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域は、約４０～約４００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域は、約５０～約３００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域は、約１００～約２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のハイブリダイゼーション領域は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、又は５０００ヌクレオチド長である。

【0143】

いくつかの実施形態では、第２のハイブリダイゼーション領域は、約３～約１００００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２のハイブリダイゼーション領域は、約４～約５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２のハイブリダイゼーション領域は、約５～約１０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２のハイブリダイゼーション領域は、約１０～約８００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２のハイブリダイゼーション領域は、約２０～約６００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２のハイブリダイゼーション領域は、約３０～約５００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２のハイブリダイゼーション領域は、約４０～約４００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２のハイブリダイゼーション領域は、約５０～約３００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２のハイブリダイゼーション領域は、約１００～約２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２のハイブリダイゼーション領域は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、又は５０００ヌクレオチド長である。

【0144】

いくつかの実施形態では、第１及び第２のハイブリダイゼーション領域は、実質的に同じ長さである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のハイブリダイゼーション領域は、約１ヌクレオチド未満、約２ヌクレオチド未満、約３ヌクレオチド未満、約４ヌクレオチド未満、約５ヌクレオチド未満、約６ヌクレオチド未満、約７ヌクレオチド未満、約８ヌクレオチド未満、約９ヌクレオチド未満、約１０ヌクレオチド未満、約１５ヌクレオチド未満、約２０ヌクレオチド未満、約２５ヌクレオチド未満、約３０ヌクレオチド未満、約３５ヌクレオチド未満、約４０ヌクレオチド未満、約４５ヌクレオチド未満、約５０ヌクレオチド未満、約５５ヌクレオチド未満、約６０ヌクレオチド未満、約６５ヌクレオチド未満、約７０ヌクレオチド未満、約７５ヌクレオチド未満、約８０ヌクレオチド未満、約８５ヌクレオチド未満、約９０ヌクレオチド未満、約９５ヌクレオチド未満、又は約１００ヌクレオチド未満だけ長さが異なる。いくつかの実施形態では、第１及び第２のハイブリダイゼーション領域は、第１のハイブリダイゼーション領域又は第２のハイブリダイゼーション領域のヌクレオチドの数の約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満、又は約１％未満だけ長さが異なる。いくつかの実施形態では、第１及び第２のハイブリダイゼーション領域は、長さが実質的に同一である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のハイブリダイゼーション領域は、完全に相補的である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のハイブリダイゼーション領域は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％相補的である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のハイブリダイゼーション領域は、例えば、Ｈｅｒｚｅｒ ａｎｄ Ｅｎｇｌｅｒｔ，“Ｃｈａｐｔｅｒ １４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，”ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｂｌｅｍ Ｓｏｌｖｅｒ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ，（２００１）ｅｄ．Ａｌａｎ Ｓ．Ｇｅｒｓｔｅｒｉｎ；Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃに記載されているように、標準的な核酸ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる。

【0145】

いくつかの実施形態では、ガイド配列が第１のポリヌクレオチド上にあり、Ｃａｓ結合領域が第２のポリヌクレオチド上にあり、ＤＮＡ鋳型配列が第３のポリヌクレオチド上にある。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、３’末端に第１のハイブリダイゼーション領域を含み、第２のポリヌクレオチドは、（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な５’末端の第２のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）第４のハイブリダイゼーション領域に相補的な３’末端の第３のハイブリダイゼーション領域を含み、第３のポリヌクレオチドは、５’末端に第４のハイブリダイゼーション領域を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、３’末端に第１のハイブリダイゼーション領域を含み、第１のポリヌクレオチドは、（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な５’末端の第２のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）第４のハイブリダイゼーション領域に相補的な３’末端の第３のハイブリダイゼーション領域を含み、第３のポリヌクレオチドは、５’末端に第４のハイブリダイゼーション領域を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び第４のハイブリダイゼーション領域がハイブリダイズする際に、ＤＮＡ鋳型配列がガイド配列及びＣａｓ結合領域の両方の３’に位置する。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び第４のハイブリダイゼーション領域の各々は、約３～約１００００ヌクレオチド長、又は約４～約５０００ヌクレオチド長、又は約５～約１０００ヌクレオチド長、又は約１０～約８００ヌクレオチド長、又は約２０～約６００ヌクレオチド長、又は約３０～約５００ヌクレオチド長、又は約４０～約４００ヌクレオチド長、又は約５０～約３００ヌクレオチド長、又は約１００～約２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のハイブリダイゼーション領域は実質的に同じ長さであり、第３及び第４のハイブリダイゼーション領域は実質的に同じ長さである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のハイブリダイゼーション領域は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％相補的である。いくつかの実施形態では、第３及び第４のハイブリダイゼーション領域は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％相補的である。

【0146】

いくつかの実施形態では、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＳＯＩ、及びプライマー結合配列は、本明細書に記載されるように、第１、第２、及び第３のポリヌクレオチド上に存在する。いくつかの実施形態では、ガイド配列及びＣａｓ結合領域が第１のポリヌクレオチド上に存在し、プライマー結合配列が第２のポリヌクレオチド上に存在し、ＳＯＩが第３のポリヌクレオチド上に存在し、第１及び第２のポリヌクレオチドは、互いにハイブリダイズすることが可能な第１及び第２のハイブリダイゼーション領域をそれぞれ含み、第２及び第３のポリヌクレオチドは、互いにハイブリダイズすることが可能な第３及び第４のハイブリダイゼーション領域をそれぞれ含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、第２のポリヌクレオチドの３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドの３’末端に位置するプライマー結合配列は、本明細書に記載されるように、ＤＮＡリガーゼによる開裂された標的ポリヌクレオチドへのＳＯＩの結合及び／又はライゲーションを促進する。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドの３’末端に位置するプライマー結合配列は、本明細書に記載されるように、ＤＮＡポリメラーゼによる開裂された標的ポリヌクレオチドの結合及び／又は伸長を促進し、ＳＯＩを含む二本鎖配列を形成する。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び第４のハイブリダイゼーション領域の各々は、約３～約１００００ヌクレオチド長、又は約４～約５０００ヌクレオチド長、又は約５～約１０００ヌクレオチド長、又は約１０～約８００ヌクレオチド長、又は約２０～約６００ヌクレオチド長、又は約３０～約５００ヌクレオチド長、又は約４０～約４００ヌクレオチド長、又は約５０～約３００ヌクレオチド長、又は約１００～約２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のハイブリダイゼーション領域は実質的に同じ長さであり、第３及び第４のハイブリダイゼーション領域は実質的に同じ長さである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のハイブリダイゼーション領域は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％相補的である。いくつかの実施形態では、第３及び第４のハイブリダイゼーション領域は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％相補的である。

【0147】

いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ鋳型配列の５’に位置するスペーサーを更に含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含み、スペーサーがＣａｓ結合領域とＤＮＡ鋳型配列との間に位置している。いくつかの実施形態では、本開示の第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ鋳型配列の５’に位置するスペーサーを更に含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第２のハイブリダイゼーション領域、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含み、スペーサーがＣａｓ結合領域とＤＮＡ鋳型配列との間に位置している。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第２のハイブリダイゼーション領域及びＤＮＡ鋳型配列を含み、スペーサーが第２のハイブリダイゼーション領域とＤＮＡ鋳型配列との間に位置している。

【0148】

いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＤＮＡポリメラーゼが目的配列の相補鎖を合成した後に停止するような、ＤＮＡポリメラーゼの停止配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、２つ以上の停止配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は５つを超える停止配列を含む。いくつかの実施形態では、停止配列が複数存在すると、ＤＮＡポリメラーゼを停止する際に冗長性がもたらされる。いくつかの実施形態では、停止配列は、ＤＮＡポリメラーゼの活性化を阻害する。いくつかの実施形態では、停止配列は、ＤＮＡ鋳型配列からのＤＮＡポリメラーゼの解離を促進する。

【0149】

いくつかの実施形態では、停止配列は、二次構造から構成される。いくつかの実施形態では、二次構造は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の阻害物質である。いくつかの実施形態では、二次構造は、ＤＮＡ鋳型配列からのＤＮＡポリメラーゼの解離を促進する。いくつかの実施形態では、二次構造は、ヘアピンループである（ステムループとしても公知である）。いくつかの実施形態では、二次構造は、シュードノットである。

【0150】

いくつかの実施形態では、スペーサーは、約５～約５００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約１０～約４００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約１０～約３００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約１０～約２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約２０～約１５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約３０～約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約５０～約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約７５、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、又は約２００ヌクレオチド長である。

【0151】

本明細書の開示は、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドの要素及び特徴を任意の組み合わせで組み合わせることができることを想定するものである。単なる例示的な目的のために、ポリヌクレオチドは表１に示すような特徴を含むことができる（５’～３’）：

【0152】

【表1】

【0153】

【表2】

【0154】

【表3】

【0155】

【表4】

【0156】

【表5】

【0157】

【表6】

【0158】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ結合領域のいずれかは、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａヌクレアーゼに結合する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼ結合領域のいずれかは、Ｃａｓ９ニッカーゼ又はＣａｓ１２ａニッカーゼに結合する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、上記に記載されるガイド配列（例えば、ＲＮＡガイド配列又はＲＮＡ／ＤＮＡガイド配列）、Ｃａｓ結合領域（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ結合領域又はＣａｓニッカーゼ結合領域）、及びＤＮＡ鋳型配列のいずれかの間にスペーサーを含む。

【0159】

本明細書の開示は、本明細書に記載される組成物が２つ以上のポリヌクレオチド、例えば２つのポリヌクレオチドを含み得ることを想定するものである。単なる例示的な目的のために、組成物は表又は表３に示すような特徴を含み得る２つのポリヌクレオチドを含むことができる（５’～３’）：

【0160】

【表7】

【0161】

【表8】

【0162】

【表9】

【0163】

【表10】

【0164】

【表11】

【0165】

【表12】

【0166】

【表13】

【0167】

【表14】

【0168】

【表15】

【0169】

【表16】

【0170】

【表17】

【0171】

いくつかの実施形態では、上記に記載される第２のポリヌクレオチドのいずれかのＤＮＡ鋳型配列は、プライマー結合配列及び目的配列を含む。いくつかの実施形態では、上記に記載される第２のポリヌクレオチドのいずれかのＤＮＡ鋳型配列は、プライマー結合配列、目的配列、及び修飾ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分、ＤＮＡリガーゼ動員部分の１つ以上を含む。

【0172】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ結合領域のいずれかは、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａヌクレアーゼに結合する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼ結合領域のいずれかは、Ｃａｓ９ニッカーゼ又はＣａｓ１２ａニッカーゼに結合する。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のポリヌクレオチドは、上記に記載されるガイド配列（例えば、ＲＮＡガイド配列又はＲＮＡ／ＤＮＡガイド配列）、Ｃａｓ結合領域（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ結合領域又はＣａｓニッカーゼ結合領域）、及びＤＮＡ鋳型配列のいずれかの間にスペーサーを含む。

【0173】

融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼを含み、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質に融合されている。いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼ、及び（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼ、及び（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ動員部分、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、又はこれらの組み合わせを含む融合タンパク質を提供する。

【0174】

本明細書で説明されるように、融合タンパク質は、典型的には異なる機能を有する少なくとも２つのドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。Ｃａｓヌクレアーゼは、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ－Ｂ型Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓニッカーゼを含む。Ｃａｓニッカーゼは、更に本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ１２ａニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、ＩＩ－Ｂ型Ｃａｓニッカーゼである。

【0175】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質を含む。ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質は、更に本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質（ＴＮＦＡＩＰ）、ポリメラーゼデルタ相互作用タンパク質（ＰｏｌＤＩＰ）、Ｘ線修復交差補完タンパク質（ＸＲＣＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン結合ＥＳ細胞特異的（ＨＭＣＥＳ）タンパク質、ＲＡＤ１、ＲＡＤ９、ＨＵＳ１、又はこれらの組み合わせを含む。

【0176】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼを動員することができ、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ Ｉ若しくはそのクレノウ断片、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶ、Ｐｏｌ Ｖ、Ｐｏｌ α、Ｐｏｌ β、Ｐｏｌ λ、Ｐｏｌ γ、Ｐｏｌ σ、Ｐｏｌ μ、Ｐｏｌ δ、Ｐｏｌ ε、Ｐｏｌ η、Ｐｏｌ ι、Ｐｏｌ κ、Ｐｏｌ ζ、Ｐｏｌ θ、ＲＥＶ１、ＲＥＶ３、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９（ｐｈｉ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、又はそれらの変異体若しくは相同体を含む。

【0177】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、パラメシウム・ブルサリア・クロレラウイルス１（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｂｕｒｓａｒｉａ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ １）（ＰＣＢＶ－１）ＤＮＡリガーゼ、マイコバクテリウムリガーゼＤ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｌｉｇａｓｅ Ｄ）（ＬｉｇＤ）、ヒトリガーゼ１（Ｌｉｇ１）、ヒトリガーゼ３（Ｌｉｇ３α）、ヒトリガーゼ４（Ｌｉｇ４）、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼ動員部分は、５’－アデニルピロホスホリルキャップを含む。

【0178】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）又はそのサブユニット、例えばＲＰＡ１、ＲＰＡ２、及びＲＰＡ３、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、例えばＳＳＢＰ１、ＳＳＢＰ２、ＳＳＢＰ３、及びＳＳＢＰ４、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復タンパク質は、チロシル－ＤＮＡホスホジエステラーゼ１（ＴＤＰ１）、アプラタキシン、トポイソメラーゼＩ、又はこれらの組み合わせを含む。

【0179】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドは、融合タンパク質に提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、標的ポリヌクレオチドに結合して開裂させることができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＤＮＡポリメラーゼ動員部分は、開裂された標的ポリヌクレオチドにＤＮＡポリメラーゼを動員する。いくつかの実施形態では、動員されたＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型配列上の目的配列に相補的なＤＮＡ鎖を合成し、それにより、開裂された標的ポリヌクレオチドに挿入することが可能な目的配列を含む二本鎖配列が生成される。

【0180】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、及び／又はＤＮＡ修復タンパク質を動員することにより、開裂された標的ポリヌクレオチドに二本鎖配列を挿入する効率が向上し、それによって二本鎖配列を生成する効率が向上する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ動員部分、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、又はこれらの組み合わせを含む融合タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ動員部分、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、又はこれらの組み合わせに融合されていないＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと比較して、より高い挿入効率を有する。

【0181】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む。本明細書で使用される場合、「核局在化シグナル」又は「核局在配列」（ＮＬＳ）は、核移行により細胞核に移送するためのタンパク質を「タグ付けする」ポリペプチドを指すものであり、すなわち、ＮＬＳを有するタンパク質は、細胞核に移行される。典型的には、ＮＬＳは、タンパク質表面に露出した、正電荷のＬｙｓ又はＡｒｇ残基を含む。例示的なＮＬＳとしては、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ヌクレオプラスミン、ＥＧＬ－１３、ｃ－Ｍｙｃ、及びＴＵＳ－タンパク質由来のＮＬＳが挙げられるが、これらに限定されない。

【0182】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼとＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質とを連結するリンカーを更に含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼがＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質から立体障害のない状態で位置することができるように、十分な長さ及び／又は可動性を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、約３～約１００アミノ酸長を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、約５～約８０アミノ酸長を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～約６０アミノ酸長を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、約２０～約５０アミノ酸長を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、約２５～約４０アミノ酸長を含む。

【0183】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌細胞中で発現するようにコドン最適化されたポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、真核細胞中で発現するようにコドン最適化されたポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞中で発現するようにコドン最適化されたポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒト細胞中で発現するようにコドン最適化されたポリヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「コドン最適化」は、組換え又は異種タンパク質発現の収量及び効率を向上させるために、発現を宿主ｔＲＮＡの存在量と一致するようにコドンを調整することを指す。コドン最適化方法は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のコドン最適化ツール、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ社のコドン使用表解析ツールなどのソフトウェアプログラムを使用して実施することができる。

【0184】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。様々な種類のベクター、例えば、ウイルス及び非ウイルスベクターが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、細菌発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳類発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ヒト発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、植物発現ベクターである。

【0185】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアベクター、単純ヘルペスベクター、エプスタイン・バー・ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ジェミニウイルスベクター、又はカリモウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターである。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、及びレンチウイルスベクターによるウイルス形質導入（この場合、投与は局所的、標的化、又は全身的であり得る）は、インビボでの遺伝子療法用の送達方法として使用されている。ウイルスベクターなどのベクターを細胞に導入する方法（例えば、トランスフェクション）は、本明細書に記載されている。

【0186】

いくつかの実施形態では、ベクターは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節エレメントを更に含む。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はこれらの組み合わせを含む。調節エレメントは、更に本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、細菌プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳類プロモーターである。

【0187】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される融合タンパク質を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キット内の融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター、例えば、本明細書に記載されるベクター上で提供される。

【0188】

いくつかの実施形態では、キットはポリヌクレオチドを更に含み、ポリヌクレオチドはＣａｓ結合領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼに結合することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、キットは、ｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む。Ｃａｓ結合領域を含むポリヌクレオチドは、更に本明細書に記載されている。

【0189】

いくつかの実施形態では、キットは、ＤＮＡポリメラーゼを更に含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼμ、ＤＮＡポリメラーゼδ、又はＤＮＡポリメラーゼεを含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＤＮＡリガーゼを更に含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、ＰＣＢＶ－１ ＤＮＡリガーゼ、ＬｉｇＤ、ヒトＬｉｇ１、ヒトＬｉｇ３α、又はヒトＬｉｇ４を含む。

【0190】

いくつかの実施形態では、キットは、融合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、及び／若しくはＤＮＡリガーゼのための反応緩衝液並びに／又は保存緩衝液を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＤＮＡ開裂反応、ＤＮＡポリメラーゼ反応、及び／又はＤＮＡリガーゼ反応を行うための試薬を更に含む。いくつかの実施形態では、試薬は、ＡＴＰ、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ_２、オリゴ（ｄＴ）、及び／又はＲＮアーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の対照、例えば、対照標的ＤＮＡを含む。例えば、対照標的ＤＮＡは、融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼによって一定の効率で特異的に開裂されるように設計することができ、それによってＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼの活性を較正することができる。

【0191】

細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される融合タンパク質を含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを更に含み、ポリヌクレオチドは、ガイド配列（例えば、ＲＮＡガイド配列）、Ｃａｓ結合タンパク質、及びＤＮＡ鋳型配列を含む。

【0192】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む細胞であって、ポリヌクレオチドが、ＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される組成物を含む細胞であって、組成物が、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドとを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される組成物を含む細胞であって、組成物が、（ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｂ）ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含むポリヌクレオチドとを含み、ＤＮＡ鋳型配列がポリヌクレオチドの３’末端にある細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される組成物を含む細胞であって、組成物が、（ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｂ）（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、第１のハイブリダイゼーション領域が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含む第２のポリヌクレオチドとを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される組成物を含む細胞であって、組成物が、（ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｂ）（ｉ）ガイド配列、及び（ｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、第１のハイブリダイゼーション領域が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含む第２のポリヌクレオチドとを含む細胞を提供する。ポリヌクレオチド及び組成物の構成成分は、更に本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質に融合されている。Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ動員タンパク質を含む融合タンパク質は、更に本明細書に記載されている。

【0193】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される組成物を含む細胞であって、組成物が、（ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｂ）（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｖ）プライマー結合配列を含む第１のポリヌクレオチドであって、プライマー結合配列が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む第２のポリヌクレオチドとを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される組成物を含む細胞であって、組成物が、（ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｂ）（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、第１のハイブリダイゼーション領域が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）第３のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉｉ）プライマー結合配列を含む第２のポリヌクレオチドであって、プライマー結合配列が第２のポリヌクレオチドの３’末端にある、第２のポリヌクレオチドと、（ｄ）（ｉ）第３のハイブリダイゼーション領域に相補的な第４のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む第３のポリヌクレオチドとを含む細胞を提供する。組成物の構成成分は、更に本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ動員部分、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、又はこれらの組み合わせに融合されている。融合タンパク質は、更に本明細書に記載されている。

【0194】

いくつかの実施形態では、細胞は、内在性ＤＮＡポリメラーゼ、内在性ＤＮＡリガーゼ、又はその両方を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、外来性ＤＮＡポリメラーゼを含まない。いくつかの実施形態では、細胞は、外来性ＤＮＡリガーゼを含まない。

【0195】

いくつかの実施形態では、細胞は、外来性ＤＮＡポリメラーゼ、外来性ＤＮＡリガーゼ、又はその両方を更に含む。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡポリメラーゼは、細胞に対して相同である。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡポリメラーゼは、細胞に対して異種である。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡポリメラーゼは、細胞とは異なる生物に由来するものである。例えば、細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞であってよく、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼであってよい。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ Ｉ若しくはそのクレノウ断片、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶ、Ｐｏｌ Ｖ、Ｐｏｌ α、Ｐｏｌ β、Ｐｏｌ λ、Ｐｏｌ γ、Ｐｏｌ σ、Ｐｏｌ μ、Ｐｏｌ δ、Ｐｏｌ ε、Ｐｏｌ η、Ｐｏｌ ι、Ｐｏｌ κ、Ｐｏｌ ζ、Ｐｏｌ θ、ＲＥＶ１、ＲＥＶ３、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９（ｐｈｉ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、又はそれらの変異体若しくは相同体を含む。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡリガーゼは、細胞に対して相同である。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡリガーゼは、細胞に対して異種である。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡリガーゼは、細胞とは異なる生物に由来するものである。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡリガーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、又はこれらの変異体若しくは相同体を含む。例えば、細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞であってよく、ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４リガーゼであってよい。

【0196】

いくつかの実施形態では、細胞は、細菌細胞である。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、実験室株である。このような細菌細胞の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｖ．コレラ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｂ．サブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．クレセンタス（Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、Ｍ．ジェニタリウム（Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、Ａ．フィシェリ（Ａ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、Ａ．ビネランジイ（Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、食品及び／又は飲料の調製に用いられる細菌の細胞である。このような細胞の限定されない例示的な属としては、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラキバクテリウム（Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、グルコナセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）、ハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）、Ｋｏｃｕｒｉａ（コクリア）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、（Ｌ．アセトトレランス（Ｌ．ａｃｅｔｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｌ．アシジピスシス（Ｌ．ａｃｉｄｉｐｉｓｃｉｓ）、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．アリメンタリウス（Ｌ．ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ブチェリ（Ｌ．ｂｕｃｈｅｒｉ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．カルバツス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．ヒルガルジイ（Ｌ．ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、Ｌ．ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、Ｌ．キムチイ（Ｌ．ｋｉｍｃｈｉｉ）、Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）及びＬ．サケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）を含む）、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ペジオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）、並びにザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0197】

いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、動物細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、動物若しくはヒト細胞、細胞系（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、又は細胞株（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎ）である。動物若しくは哺乳類細胞、細胞系、又は細胞株の例としては、限定されるものではないが、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＴ１０８０細胞、Ｈ９細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＭＣＦ７細胞、ＭＤＢＫ細胞、ジャーカット細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＰＣ１２細胞、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ＥＢＸ細胞、ＥＢ１４細胞、ＥＢ２４細胞、ＥＢ２６細胞、ＥＢ６６細胞、又はＥｂｖｌ３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＢ２／０細胞、Ｙ０細胞、Ｃ１２７細胞、Ｌ細胞、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１及びＣＯＳ７）細胞、ＱＣ１－３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨｅＬＡ細胞、ＥＢ１細胞、ＥＢ２細胞、ＥＢ３細胞、腫瘍溶解細胞又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｋ１ ＳＶ細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ ＦＵＴ８ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１ ＳＶ ＧＳノックアウト細胞であってよい。

【0198】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト幹細胞である。幹細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む多能性幹細胞であってよい。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれかの分化した形態である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、培養中の任意の初代細胞に由来する細胞である。

【0199】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト肝細胞、動物肝細胞、又は非実質細胞などの肝細胞である。例えば、真核細胞は、付着型代謝試験用ヒト肝細胞、付着型誘導試験用ヒト肝細胞、付着型ヒト肝細胞、懸濁液試験用ヒト肝細胞（１０ドナー及び２０ドナープール肝細胞を含む）、ヒト肝クッパー細胞、ヒト肝星細胞、イヌ肝細胞（単一及びプールビーグル肝細胞を含む）、マウス肝細胞（ＣＤ－１及びＣ５７ＢＩ／６肝細胞を含む）、ラット肝細胞（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎ及びＷｉｓｔａｒ肝細胞を含む）、サル肝細胞（カニクイザル又はアカゲザル肝細胞を含む）、ネコ肝細胞（ドメスティックショートヘア肝細胞を含む）、並びにウサギ肝細胞（ニュージーランドホワイト肝細胞を含む）であってよい。

【0200】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、植物細胞である。例えば、植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ又はイネなどの作物の細胞であってよい。植物細胞は、藻類、樹木又は野菜の細胞であってよい。植物細胞は、単子葉若しくは双子葉植物の細胞、又は作物若しくは穀類植物、生産植物、果実若しくは野菜の細胞であってよい。例えば、植物細胞は、樹木、例えば、オレンジ、グレープフルーツ又はレモン樹木などの柑橘樹木；モモ又はネクタリン樹木；リンゴ又はナシ樹木；アーモンド又はクルミ又はピスタチオ樹木などの堅果樹木；ナス属の植物、例えばジャガイモ、トマト、ナス、コショウ、パプリカ；ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物、ラクツカ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物、スピナシア属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物；カプシカム属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物；綿、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココアなどの細胞であってよい。

【0201】

方法
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の組成物を細胞に導入することを含む、細胞内の標的ポリヌクレオチドにおいて標的挿入を提供する方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｂ）ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含むポリヌクレオチドとを含み、ＤＮＡ鋳型配列はポリヌクレオチドの３’末端にある。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｂ）（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、第１のハイブリダイゼーション領域が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含む第２のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｂ）（ｉ）ガイド配列、及び（ｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、第１のハイブリダイゼーション領域が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ鋳型配列を含む第２のポリヌクレオチドとを含む。ポリヌクレオチド及び組成物の構成成分は、更に本明細書に記載されている。

【0202】

方法の例示的な限定されない概要を、図１に図示する。図１では、Ｃａｓヌクレアーゼがガイド配列により細胞内の標的ＤＮＡに誘導され、標的ＤＮＡを開裂する。ＤＮＡ鋳型配列は、（ｉ）プライマーとしての役割を果たす、開裂されたＤＮＡとハイブリダイズするプライマー結合配列、及び（ｉｉ）目的配列を含む。ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、細胞の内在性ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーに結合して目的配列と相補的なＤＮＡ鎖を合成し、それによって目的配列を含む二本鎖配列が形成される。二本鎖配列は、ＤＮＡ修復経路、例えば、ＮＨＥＪにより、開裂された標的ＤＮＡに挿入され得る。

【0203】

いくつかの実施形態では、細胞内の標的ＤＮＡにおいて標的挿入を提供する方法は、本明細書に記載される組成物を細胞に導入することを含み、ガイド配列は、標的ＤＮＡにハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、一本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、標的ＤＮＡにハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、ガイド配列及び標的ＤＮＡをハイブリダイズすることにより、標的ＤＮＡに誘導される。いくつかの実施形態では、方法は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼが標的ＤＮＡに開裂を生じさせるのに十分な条件下で行われる。

【0204】

いくつかの実施形態では、開裂された標的ＤＮＡの一方の鎖が、ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとなる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、プライマー結合配列及び目的配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、プライマーに結合することができる。いくつかの実施形態では、方法は、外来性ＤＮＡポリメラーゼを細胞に導入することを含まない。いくつかの実施形態では、方法は、細胞の内在性ＤＮＡポリメラーゼがプライマーに結合し、ＤＮＡ鋳型配列を伸長させるのに十分な条件下で行われる。いくつかの実施形態では、伸長することには、目的配列に相補的なＤＮＡ鎖を合成し、目的配列を含む二本鎖配列を形成することが含まれる。

【0205】

いくつかの実施形態では、方法は、外来性ＤＮＡポリメラーゼを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドにより、外来性ＤＮＡポリメラーゼが細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを含むベクターにより、外来性ＤＮＡポリメラーゼが細胞に導入される。外来性成分、例えば外来性ＤＮＡポリメラーゼを細胞に導入する方法は、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡポリメラーゼは、細胞に対して相同である。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡポリメラーゼは、細胞に対して異種である。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡポリメラーゼは、細胞とは異なる生物に由来するものである。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｏｌ Ｉ若しくはそのクレノウ断片、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶ、Ｐｏｌ Ｖ、Ｐｏｌ α、Ｐｏｌ β、Ｐｏｌ λ、Ｐｏｌ γ、Ｐｏｌ σ、Ｐｏｌ μ、Ｐｏｌ δ、Ｐｏｌ ε、Ｐｏｌ η、Ｐｏｌ ι、Ｐｏｌ κ、Ｐｏｌ ζ、Ｐｏｌ θ、ＲＥＶ１、ＲＥＶ３、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９（ｐｈｉ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、又はそれらの変異体若しくは相同体を含む。いくつかの実施形態では、方法は、外来性ＤＮＡポリメラーゼがプライマーに結合し、ＤＮＡ鋳型配列を伸長させるのに十分な条件下で行われる。いくつかの実施形態では、伸長することには、目的配列に相補的なＤＮＡ鎖を合成し、目的配列を含む二本鎖配列を形成することが含まれる。

【0206】

いくつかの実施形態では、二本鎖配列は、開裂された標的ＤＮＡに挿入される。いくつかの実施形態では、目的配列を含む二本鎖配列は、ＤＮＡ修復経路により、開裂された標的配列に挿入される。ＤＮＡ修復経路としては、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）経路、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路、相同性配向型修復（ＨＤＲ）経路、合成依存的単鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、及び代替的末端連結（Ａｌｔ－ＥＪ）が挙げられる。ＮＨＥＪは相同な鋳型を必要としない。一般に、ＮＨＥＪは、ＨＤＲと比較した場合に高い修復効率を有するが、忠実度が低い。しかし、二本鎖切断に適合可能な付着末端又はオーバーハングがある場合には、エラーが低減する。ＭＭＥＪは、二本鎖切断の両側に（例えば、約２～約１０塩基対の）マイクロホモロジーを有するものである。ＨＤＲは、修復を誘導するために相同な鋳型を必要とするものであり、ＨＤＲ修復は、典型的にはＮＨＥＪ及びＭＭＥＪと比較して忠実度は高いが、効率が低い。ＳＤＳＡ、ＳＳＡ、及びＡｌｔ－ＥＪは、ＨＤＲをベースとした修復経路である。ＳＤＳＡは、例えば、Ｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：７４１（２００６）に更に記載されている。ＳＳＡ及びＡｌｔ－ＥＪは、例えば、Ｂｈａｒｇａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ３２（９）：５６６－５７５（２０１６）に更に記載されている。いくつかの実施形態では、方法は、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）に十分な条件下で行われる。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪにより、目的配列を含む二本鎖配列が、開裂された標的配列に挿入される。いくつかの実施形態では、方法は、ＨＤＲ、ＳＤＳＡ、ＳＳＡ、Ａｌｔ－ＥＪ、又はこれらの組み合わせに十分な条件下で行われる。

【0207】

いくつかの実施形態では、ライゲーションにより、開裂された標的ＤＮＡに二本鎖配列が挿入される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼにより、開裂された標的配列に目的配列を含む二本鎖配列が挿入される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、細胞の内在性ＤＮＡリガーゼである。いくつかの実施形態では、方法は、外来性ＤＮＡリガーゼを細胞に導入することを含まない。

【0208】

いくつかの実施形態では、方法は、外来性ＤＮＡリガーゼを細胞に導入することを更に含み、この外来性ＤＮＡリガーゼが、開裂された標的ＤＮＡに二本鎖配列を挿入する。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡリガーゼをコードするポリヌクレオチドにより、外来性ＤＮＡリガーゼが細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを含むベクターにより、外来性ＤＮＡリガーゼが細胞に導入される。外来性成分、例えば、外来性ＤＮＡリガーゼを細胞に導入する方法は、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡリガーゼは、細胞に対して相同である。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡリガーゼは、細胞に対して異種である。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡリガーゼは、細胞とは異なる生物に由来するものである。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡリガーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、又はこれらの変異体若しくは相同体を含む。

【0209】

いくつかの実施形態では、二本鎖配列は、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、又はリコンビナーゼの認識部位を更に含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、又はリコンビナーゼにより、二本鎖配列が標的ＤＮＡに組み込まれる。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、又はリコンビナーゼは、細胞に内在するものである。エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、及びリコンビナーゼによる配列組み込みのメカニズムは、当業者には公知であり、例えば、Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２７（４）：６７１－６７６（１９９８）、Ｎｅｓｍｅｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ６２：１１８７－１１９５（２０１０）、及びＨａｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２１（２）：１５７－１７８（１９９７）に更に記載されている。

【0210】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、ガイド配列及びＣａｓ結合領域と同一のポリヌクレオチド上にあり、従って、標的ＤＮＡの開裂部位に近接している。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列、ガイド配列、及びＣａｓ結合領域を含む１つ以上のポリヌクレオチドがハイブリダイズし、従って、ＤＮＡ鋳型配列が標的ＤＮＡの開裂部位に近接している。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列が開裂部位に近接していることにより、ＤＮＡポリメラーゼによって形成される二本鎖配列の開裂された標的配列への挿入が促進される。

【0211】

いくつかの実施形態では、本方法は、開裂された標的ＤＮＡに近接した二本鎖配列を提供することにより、開裂された標的ＤＮＡに二本鎖配列を挿入する効率が向上する。いくつかの実施形態では、本方法は、開裂された標的ＤＮＡの再ライゲーションを減少させることにより、開裂された標的ＤＮＡに二本鎖配列を組み込む効率が向上する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ鋳型配列を開裂された標的ＤＮＡと近接させない方法と比較して、改善された効率を有する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ鋳型配列を開裂された標的ＤＮＡと近接させない方法と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、若しくは少なくとも２００倍、又はそれ以上の効率を有する。

【0212】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される組成物を標的ＤＮＡと接触させることを含む、標的ＤＮＡにおいて標的挿入を提供する方法であって、ガイド配列が標的ＤＮＡにハイブリダイズすることができる方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、プライマー結合配列、及び目的配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｂ）（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｖ）プライマー結合配列を含む第１のポリヌクレオチドであって、プライマー結合配列が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む第２のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｂ）（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、第１のハイブリダイゼーション領域が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）第３のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉｉ）プライマー結合配列を含む第２のポリヌクレオチドであって、プライマー結合配列が第２のポリヌクレオチドの３’末端にある、第２のポリヌクレオチドと、（ｄ）（ｉ）第３のハイブリダイゼーション領域に相補的な第４のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む第３のポリヌクレオチドとを含む。組成物の構成成分は、更に本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ動員部分、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、又はこれらの組み合わせに融合されている。融合タンパク質は、更に本明細書に記載されている。

【0213】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、ガイド配列及び標的ＤＮＡをハイブリダイズすることにより、標的ＤＮＡに誘導される。いくつかの実施形態では、方法は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼが標的ＤＮＡに開裂を生じさせるのに十分な条件下で行われる。いくつかの実施形態では、開裂された標的ＤＮＡの一方の鎖が、ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとなる。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のポリヌクレオチドのプライマー結合配列は、プライマーに結合することができる。

【0214】

いくつかの実施形態では、方法は、標的ＤＮＡをＤＮＡリガーゼと接触させることを更に含む。ＤＮＡリガーゼは、更に本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４リガーゼ、ＰＣＢＶ－１ ＤＮＡリガーゼ、ＬｉｇＤ、ヒトリガーゼタンパク質、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼにより、開裂された標的ＤＮＡに目的配列がライゲートされる。

【0215】

いくつかの実施形態では、方法は、標的ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ修復経路内のタンパク質、又はこれらの組み合わせと接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、目的配列は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ修復経路内のタンパク質、又はこれらの組み合わせにより、二本鎖配列に変換される一本鎖配列である。ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ修復経路は、本明細書に記載されている。

【0216】

いくつかの実施形態では、方法は、標的ＤＮＡを細胞抽出物と接触させることを含み、細胞抽出物は、本明細書に記載されるＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及び／又はＤＮＡ修復経路タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡを、組換えＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及び／又はＤＮＡ修復経路タンパク質と接触させる。

【0217】

いくつかの実施形態では、方法はインビボで行われる。いくつかの実施形態では、方法はインビトロで行われる。いくつかの実施形態では、方法はエクスビボで行われる。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、プラスミド、ＰＣＲ産物、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む。

【0218】

いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の組成物を細胞に導入することを含む、細胞内の標的ポリヌクレオチドにおいて標的挿入を提供する方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、プライマー結合配列、及び目的配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｂ）（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｖ）プライマー結合配列を含む第１のポリヌクレオチドであって、プライマー結合配列が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む第２のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと、（ｂ）（ｉ）ガイド配列、（ｉｉ）Ｃａｓ結合領域、及び（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーション領域を含む第１のポリヌクレオチドであって、第１のハイブリダイゼーション領域が第１のポリヌクレオチドの３’末端にある、第１のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ｉ）第１のハイブリダイゼーション領域に相補的な第２のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）第３のハイブリダイゼーション領域、及び（ｉｉｉ）プライマー結合配列を含む第２のポリヌクレオチドであって、プライマー結合配列が第２のポリヌクレオチドの３’末端にある、第２のポリヌクレオチドと、（ｄ）（ｉ）第３のハイブリダイゼーション領域に相補的な第４のハイブリダイゼーション領域、（ｉｉ）目的配列（ＳＯＩ）を含む、第３のポリヌクレオチドとを含む。組成物の構成成分は、更に本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ動員部分、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、又はこれらの組み合わせに融合されている。融合タンパク質は、更に本明細書に記載されている。

【0219】

方法の例示的な限定されない概要を、図１０Ａ～１０Ｃに図示する。図１０Ａでは、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、第１のハイブリダイゼーション領域、及びプライマー結合部位が、第１のポリヌクレオチド上に位置している。ガイド配列によって標的ＤＮＡに誘導されたＣａｓヌクレアーゼにより、標的ＤＮＡに二本鎖切断が生じる。プライマー結合部位は、開裂されたＤＮＡにハイブリダイズされ、第２のポリヌクレオチドは、相補的配列を含む第１及び第２のハイブリダイゼーション領域を介して第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする。第２のポリヌクレオチドは目的配列を含み、この配列がリガーゼにより５’末端と３’末端の両方で開裂されたＤＮＡにライゲートされる（図１０Ａ）。第２のポリヌクレオチドは、更に相同配列を含むことができ、その５’末端が、開裂されたＤＮＡにリガーゼによってライゲートされ、その３’末端が、相同性媒介メカニズムによって組み込まれる。いくつかの実施形態では、相同性媒介メカニズムは、ＨＤＲ、合成依存的単鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、代替的末端連結（ａｌｔ－ＥＪ）、又はこれらの組み合わせを含む（図１０Ｂ）。複合体は、ライゲーション及び／又は相同性媒介組み込みの後に二本鎖ＤＮＡへと変換され、それによって標的ＤＮＡに目的配列が組み込まれる（図１０Ｃ）。

【0220】

いくつかの実施形態では、細胞内の標的ＤＮＡにおいて標的挿入を提供する方法は、本明細書に記載される組成物を細胞に導入することを含み、ガイド配列は、標的ＤＮＡにハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、ガイド配列及び標的ＤＮＡをハイブリダイズすることにより、標的ＤＮＡに誘導される。いくつかの実施形態では、方法は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼが標的ＤＮＡに開裂を生じさせるのに十分な条件下で行われる。

【0221】

いくつかの実施形態では、開裂された標的ＤＮＡの一方の鎖が、ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとなる。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のポリヌクレオチドのプライマー結合配列は、プライマーに結合することができる。いくつかの実施形態では、方法は、外来性ＤＮＡポリメラーゼを細胞に導入することを含まない。いくつかの実施形態では、方法は、細胞の内在性ＤＮＡポリメラーゼがプライマーに結合し、目的配列を伸長させるのに十分な条件下で行われる。いくつかの実施形態では、伸長することには、目的配列に相補的なＤＮＡ鎖を合成し、目的配列を含む二本鎖配列を形成することが含まれる。いくつかの実施形態では、方法は、外来性ＤＮＡリガーゼを細胞に導入することを含まない。いくつかの実施形態では、方法は、細胞の内在性ＤＮＡリガーゼが、開裂された標的ＤＮＡに目的配列をライゲートするのに十分な条件下で行われる。

【0222】

いくつかの実施形態では、方法は、外来性ＤＮＡポリメラーゼを細胞に導入することを含む。外来性ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡポリメラーゼは、目的配列に相補的なＤＮＡ鎖を合成する。いくつかの実施形態では、方法は、外来性ＤＮＡリガーゼを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡリガーゼにより、開裂された標的ＤＮＡに目的配列がライゲートされる。いくつかの実施形態では、目的配列は、細胞のＤＮＡ修復経路により二本鎖配列に変換される一本鎖配列である。

【0223】

いくつかの実施形態では、方法は、細胞をＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）阻害剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－ＰＫを阻害することにより、ＮＨＥＪが減少してＨＤＲが促進される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物と接触させる前に、細胞をＤＮＡ－ＰＫ阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、ＡＺＤ７６４８である。

【0224】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物、ポリヌクレオチド、及び／又は融合タンパク質は、トランスフェクションによって細胞に導入される。トランスフェクション法は、更に本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、例えば、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はそれらの任意の組み合わせを含む本開示のポリヌクレオチドが、細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上のベクター上にある。

【0225】

いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質、例えば、融合タンパク質、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓニッカーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及び／又はＤＮＡリガーゼが、タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドによって細胞に導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドが、１つ以上のベクター上にある。いくつかの実施形態では、方法は、複数のタンパク質、例えば、融合タンパク質、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓニッカーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼの任意の組み合わせを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓニッカーゼ、又は融合タンパク質及びＤＮＡポリメラーゼを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓニッカーゼ、又は融合タンパク質及びＤＮＡリガーゼを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓニッカーゼ、又は融合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、単一のベクター上にある。いくつかの実施形態では、複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、２つ以上のベクター上にある。

【0226】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物の構成成分が、単一のベクター上にある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物の構成成分が、２つ以上のベクター上にある。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のベクターを細胞にトランスフェクトすることを含み、１つ以上のベクターは、融合タンパク質、Ｃａｓヌクレアーゼ、又はＣａｓニッカーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドと、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、方法は、第１のベクター及び第２のベクターを細胞にトランスフェクトすることを含み、第１のベクターは、融合タンパク質、Ｃａｓヌクレアーゼ、又はＣａｓニッカーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、第２のベクターは、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、方法は、単一のベクターを細胞にトランスフェクトすることを含み、単一のベクターは、（ｉ）融合タンパク質、Ｃａｓヌクレアーゼ、又はＣａｓニッカーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドと、（ｉｉ）ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドとを含む。

【0227】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物、ポリヌクレオチド、及び／又は融合タンパク質は、送達粒子によって細胞に導入される。いくつかの実施形態では、組成物の構成成分は、単一の送達粒子で送達される。いくつかの実施形態では、組成物の構成成分は、複数の送達粒子で送達される。送達粒子は、例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチド及びタンパク質などの外来性生体物質を送達するために使用することができる。いくつかの実施形態では、送達粒子は、固体、半固体、エマルション、又はコロイドである。いくつかの実施形態では、送達粒子は、脂質ベースの粒子、リポソーム、ミセル、小胞、又はエキソソームである。いくつかの実施形態では、送達粒子は、ナノ粒子である。送達粒子は、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２９３７０３号明細書、同第２０１２／０２５１５６０号明細書、同第２０１３／０３０２４０１号明細書、米国特許第５，５４３，１５８号明細書、米国特許第５，８５５，９１３号明細書、米国特許第５，８９５，３０９号明細書、米国特許第６，００７，８４５号明細書、及び米国特許第８，７０９，８４３号明細書に更に記載されている。

【0228】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物、ポリヌクレオチド、及び／又は融合タンパク質は、小胞によって細胞に導入される。いくつかの実施形態では、組成物の構成成分は、単一の小胞で送達される。いくつかの実施形態では、組成物の構成成分は、複数の小胞で送達される。いくつかの実施形態では、小胞は、エキソソーム又はリポソームから構成される。標的細胞への外来性生体物質を送達するように改変された小胞は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０２３４１８３号明細書；同第２０１９／０１６７８１０号明細書；同第２０２０／０２０７８３３号明細書；及びＡｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：３４１（２０１１）に記載されている。

【0229】

本明細書に引用される全ての参考文献、例えば特許、特許出願、論文、教科書など、及びこれらに引用される参考文献は、それらが既に引用されていない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0230】

実施例１．ポリヌクレオチドの標的挿入に関する評価
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）単独、又は逆転写酵素に融合させたＳｐＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９－ＲＴ）を、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするＲＮＡガイド配列、ＳｐＣａｓ９に結合するためのｔｒａｃｒＲＮＡ、及び３’末端の鋳型配列から構成されるガイドポリヌクレオチド（本明細書では「ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ」と称する）によりインビボ標的挿入について試験した。ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ構築物を５つ調製した：

【0231】

（１）ＲＮＡのみのｓｐｒｉｎｇＲＮＡ － ＲＮＡヌクレオチドからなり、ＲＮＡガイド配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ、６ｂｐの挿入配列（ＡＡＴＡＴＧ）、及びプライマー結合配列から構成されるポリヌクレオチド（図２Ａを参照されたい）；

【0232】

（２）ＤＮＡテールを有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（「ＤＮＡ」） － ＲＮＡのみのｓｐｒｉｎｇＲＮＡと同一の配列であり、ＤＮＡヌクレオチドからなる挿入配列及びプライマー結合配列を除く全てのＲＮＡヌクレオチドを含んでいる（図２Ｂを参照されたい）；

【0233】

（３）ＤＮＡテール及びホスホロチオエート結合を有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（「ＰＳ－ＤＮＡ」） － ＤＮＡ挿入断片を有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡと同一であるが、挿入配列及びプライマー結合配列がホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオエート結合を含むことを除く（図２Ｂを参照されたい）；

【0234】

（４）脱塩基部位を有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ － ＲＮＡのみのｓｐｒｉｎｇＲＮＡと同一であり、ＲＮＡヌクレオチドからなるが、挿入配列の３番目の塩基が脱塩基部位、ｄＳｐａｃｅｒヌクレオチドの１’２’－ジデオキシリボースで置換されていることを除く（図２Ｃを参照されたい）；

【0235】

（５）ＴＥＧリンカーを有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ － ＲＮＡのみのｓｐｒｉｎｇＲＮＡと同一であり、ＲＮＡヌクレオチドからなるが、挿入配列の３番目の塩基がトリエチレングリコール（ＴＥＧ）に共有結合されていることを除く（図２Ｄを参照されたい）。

【0236】

ＦＵＧＥＮＥＨＤ（登録商標）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＳｐＣａｓ９又はＳｐＣａｓ９－ＲＴのいずれかを発現するプラスミドでトランスフェクトした。２４時間後、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ^（商標）ＲＮＡｉＭＡＸを使用して、上記に列挙した２ｐｍｏｌのｓｐｒｉｎｇＲＮＡ構築物で細胞を更にトランスフェクトした。

【0237】

ｓｐｒｉｎｇＲＮＡをトランスフェクトして４８時間後に細胞を採取した。ＡＡＶＳ１遺伝子座をＰＣＲで増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンスプラットフォームを使用して配列決定した。結果を図３及び図４に示す。図３のパネルＡ～Ｅは、ＳｐＣａｓ９及び上記のｓｐｒｉｎｇＲＮＡ構築物の各々による標的挿入を示す。図３のパネルＦ～Ｊは、ＳｐＣａｓ９－ＲＴ（「ＰＥ０」）及び上記のｓｐｒｉｎｇＲＮＡ構築物の各々による標的挿入を示す。図４は、上記のｓｐｒｉｎｇＲＮＡ構築物の各々と組み合わせたＳｐＣａｓ９単独又はＳｐＣａｓ９－ＲＴによる挿入の相対頻度を示す。

【0238】

図３及び図４の結果は、ＤＮＡテール又はホスホロチオエート結合を有するＤＮＡテールを含有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（すなわち、上記の構築物（２）及び（３）に関して記載したようなＤＮＡヌクレオチドを含む挿入配列及びプライマー結合配列）と、ＳｐＣａｓ９発現プラスミドとをコトランスフェクトすることにより、ＳｐＣａｓ９に融合された逆転写酵素が存在しない場合であっても、挿入配列の標的挿入がもたらされたことを示している。従って、内在性の細胞性因子、例えば内在性の細胞性ＤＮＡポリメラーゼが、挿入配列をＤＮＡ合成の鋳型として使用することが可能となる。従って、標的挿入は、Ｃａｓ９単独並びにＤＮＡ挿入断片、すなわちＤＮＡ挿入配列及びＤＮＡプライマー結合配列を含むｓｐｒｉｎｇＲＮＡを使用して行うことができる。

【0239】

実施例２．ポリヌクレオチドの標的挿入に関する更なる評価
ＲＮＡのみのｓｐｒｉｎｇＲＮＡ、ＤＮＡテールを有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ、並びにＤＮＡテール及びホスホロチオエート結合を有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（ＰＳ－ＤＮＡ）を、ＳｐＣａｓ９単独、又はＳｐＣａｓ９－ＲＴ融合体により更に試験した。ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ構築物は、実施例１のように、ＡＡＶＳ１を標的とするガイド配列と、ＳｐＣａｓ９のｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを含むものであった。ｓｐｒｉｎｇＲＮＡの配列を表４に示す。挿入配列及びプライマー結合配列には下線が引かれており、二重下線はＤＮＡヌクレオチドを表している。ｓｐｒｉｎｇＲＮＡはＡｇｉｌｅｎｔにより合成した。

【0240】

【表18】

【0241】

ＳｐＣａｓ９又はＳｐＣａｓ９－ＲＴとｓｐｒｉｎｇＲＮＡとを細胞にトランスフェクトし、細胞を採取し、実施例１に記載されるようにＡＡＶＳ１遺伝子座を解析した。結果を図５Ａ～５Ｆに示す。図５Ａ～５Ｃは、ＳｐＣａｓ９－ＲＴ（「ＰＥ０」）と、ＲＮＡのみのｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図５Ａ）、ＤＮＡテールを有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図５Ｂ）、及びＰＳ－ＤＮＡを有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図５Ｃ）とによる標的挿入を示す。図５Ｄ～５Ｆは、ＳｐＣａｓ９と、ＲＮＡのみのｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図５Ｄ）、ＤＮＡテールを有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図５Ｅ）、及びＰＳ－ＤＮＡを有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図５Ｆ）とによる標的挿入を示す。

【0242】

この結果は、ＳｐＣａｓ９と、ＤＮＡテール又はＰＳ－ＤＮＡを有するＰＳ－ＤＮＡテールを含有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡとの組み合わせ、すなわちＤＮＡヌクレオチドを含む挿入配列及びプライマー結合配列が、ＳｐＣａｓ９－ＲＴとｓｐｒｉｎｇＲＮＡとの組み合わせと同様の挿入パターンを達成したことを示している。

【0243】

実施例３．インビトロアッセイ
Ｃａｓ９を使用した標的挿入におけるＤＮＡポリメラーゼの役割を評価するために、インビトロアッセイを実施した。アッセイの概要を図６に示す。インビトロアッセイでは、２本の相補的なＤＮＡ鎖が、異なるフルオロフォアで標識される（６ ＦＡＭ標識非標的鎖及びＨＥＸ標識標的鎖）。ガイド配列は、Ｃａｓ９開裂によって長さの異なる２本の鎖が生成されるように設計されている。ＤＮＡポリメラーゼにより、ｓｐｒｉｎｇＲＮＡのプライマー結合配列にハイブリダイズした６ ＦＡＭ標識非標的鎖が伸長する。生成物を変性してキャピラリー電気泳動により分離し、フルオロフォアと結合した鎖を検出する。

【0244】

２つの相補鎖である６ ＦＡＭ標識非標的鎖とＨＥＸ標識標的鎖とをアニーリングすることにより、合成標的ＤＮＡ基質を調製した。Ｃａｓ９とｓｐｒｉｎｇＲＮＡとを等モル比で混合すると、室温でリボ核タンパク質複合体が形成された。Ｃａｓ９：ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ複合体を１５倍モル過剰で合成標的ＤＮＡ基質に添加した。ＤＮＡポリメラーゼ（最適緩衝液中のＢｓｔ ３．０ ＤＮＡポリメラーゼ又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片のいずれか）を反応混合物に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プロテイナーゼＫ消化により反応を停止した。１μＬの反応混合物をＨＩＤＩ^（商標）ホルムアミドに添加し、９５℃で３分間変性させた。この変性生成物を、３７３０ ＤＮＡアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でキャピラリー電気泳動により分離し、解析を行った。

【0245】

結果を図７Ａ～７Ｆに示す。青色の線は非標的鎖に対応し、緑色の線は標的鎖に対応する。アスタリスクは開裂した合成標的ＤＮＡ基質を示し、黒い矢印はＤＮＡポリメラーゼによる伸長生成物を示す。図７Ａは、Ｃａｓ９及びｓｐｒｉｎｇＲＮＡによるアッセイ結果を示す。図７Ｂは、Ｃａｓ９、クレノウ断片、及びｓｐｒｉｎｇＲＮＡによるアッセイ結果を示す。図７Ｃ～７Ｆは、Ｃａｓ９、Ｂｓｔ ３．０ポリメラーゼ、及び、ｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図７Ｃ～７Ｄ）、脱塩基部位を有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図７Ｅ）、又はＴＥＧを有するｓｐｒｉｎｇＲＮＡ（図７Ｆ）によるアッセイ結果を示す。インビトロアッセイ結果は、ＤＮＡポリメラーゼがＣａｓ９と融合することなく標的挿入を行うことができることを示している。図８は、クレノウ断片又はＢｓｔ ３．０ポリメラーゼによる伸長反応のカイネティクスを示す。

【0246】

実施例４．ｇＲＮＡ上流の近接ライゲーション
以下の実施例５～１９は、ｇＲＮＡ上流の近接ライゲーション（「ｐｌｕｇＲＮＡ」）に関するものである。

【0247】

本開示及び実施例全体を通して記載されているように、ｐｌｕｇＲＮＡは、３’末端にポリヌクレオチドが付加されたｇＲＮＡ分子を含む。ポリヌクレオチドは、２つのエレメント：第１のハイブリダイゼーション領域（実施例及び図中では「ランディングパッド」とも称される）と、Ｃａｓタンパク質によって誘導された切断部の上流の配列にハイブリダイズするプライマー結合配列（ＰＢＳ）とから構成される。ｐｌｕｇＲＮＡは単一分子であってもよく、又は互いにアニーリングして二元、三元若しくは四元複合体を形成する複数のポリヌクレオチドから構成されてもよい。ｐｌｕｇＲＮＡの任意のエレメントは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、又は化学的に修飾されたヌクレオチドを含み得る。

【0248】

本開示及び実施例全体を通して記載されるように、Ｃａｓタンパク質は、ｐｌｕｇＲＮＡに結合することができる任意のＣａｓタンパク質であってよい。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓｃａｄｅ複合体を含むがこれらに限定されない、任意のＩ型又はＩＩ型Ｃａｓタンパク質であってよい。Ｃａｓタンパク質は、蛍光タグ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ（例えば、限定するものではないが、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、パラメシウム・ブルサリア・クロレラウイルス１（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｂｕｒｓａｒｉａ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ １）（ＰＢＣＶ－１）リガーゼ、マイコバクテリウムリガーゼＤ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｌｉｇａｓｅ Ｄ）（ＬｉｇＤ）、ヒトリガーゼ１、ヒトリガーゼ３、ヒトリガーゼ４）、リガーゼアダプタータンパク質（例えば、限定するものではないが、ＸＲＣＣ１、ＸＲＣＣ４、ＰＣＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＲＰＡ１／２／３、ＳＳＢＰ１－４など）、ＤＮＡ修復タンパク質（ＴＤＰ１、アプラタキシン、トポイソメラーゼＩ）、又はこれらの組み合わせに融合することができる。

【0249】

本明細書の実施例は更に、本開示において「第２のポリヌクレオチド」とも称される「ドナー」ポリヌクレオチドについて言及する。ドナーポリヌクレオチドは、ｐｌｕｇＲＮＡの第１のハイブリダイゼーション領域と相補的な第２のハイブリダイゼーション領域と、目的配列（実施例及び図中では「挿入断片」とも称される）と、標的開裂部位に近接する配列と相補的又は実質的に相補的な相同配列とから構成される。ドナー設計では、これらのエレメントのいずれかを省略することができ、互いにハイブリダイズする２つ以上のポリヌクレオチドから構成することができ、又は別のポリヌクレオチドと対合して二本鎖領域を形成することができる。ドナーの任意の部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、又は化学的に修飾されたヌクレオチドを含み得る。ドナーの５’末端及び３’末端は、リン酸化、アデニル化、ホスホロチオエート化などであってよい。

【0250】

本開示は、本明細書ではノックインヌクレオチド誘導（ｋｎｏｃｋ－ｉｎ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｇｕｉｄｅｄ）（「ＫＩＮＧ」）編集とも称される、部位特異的修飾を行う方法を提供する。ＫＩＮＧ編集の一般的な方式を図１０に示す。要約すると、Ｃａｓ９は、本明細書に記載されるように、ｐｌｕｇＲＮＡ及びドナーと三元（又はそれよりも高次の）複合体を形成する。Ｃａｓ９により、二本鎖切断が誘発される。ｐｌｕｇＲＮＡのＰＢＳが標的部位にアニーリングし、ドナーを切断部位に並列させる。内因性ＤＮＡリガーゼ又は外来的に提供されるＤＮＡリガーゼによって、ドナーを直接ライゲートすることができる（図１０Ａ及び１０Ｂ）。或いは、ＤＮＡリガーゼと、相同性に基づくメカニズム（相同組換え、一本鎖アニーリング［ＳＳＡ］、マイクロホモロジー媒介末端結合［ＭＭＥＪ］、合成依存的単鎖アニーリング［ＳＤＳＡ］、ＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型ＤＮＡ修復）との協働作用により、ドナーを組み込むことができる。ドナーが標的鎖に組み込まれると、内在性の細胞機構が中間体を分解し、標的ＤＮＡに所望の配列の挿入を生じさせることが可能となる。

【0251】

実施例５：ｐｌｕｇＲＮＡ及びドナーの設計
図９は、ドナー、及び関連するエレメントを含むｐｌｕｇＲＮＡの一般的な設計を示す。ｐｌｕｇＲＮＡは、ガイド配列（「特異配列標的化スペーサーＲＮＡ」）（１）からなり、その後にＣａｓ９タンパク質を結合して活性化させることができるｇＲＮＡ足場が続く。スペーサー－ｇＲＮＡ足場の３’末端は、ポリヌクレオチドへと伸長している。このポリヌクレオチド（様々な化学的方法で修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの組み合わせから作製される）は、２つのエレメント：第１のハイブリダイゼーション配列（「ランディングパッド」）（２）、及びＣａｓタンパク質によって誘導される切断部の上流の配列にハイブリダイズするプライマー結合配列（３）からなる。切断（すなわち、第１のハイブリダイゼーション配列とプライマー結合配列との間にある接合部）のすぐ近くのヌクレオチドは、ＤＮＡからなる。

【0252】

第１のハイブリダイゼーション配列は、ドナーの第２のハイブリダイゼーション配列（「ハイブリダイゼーション配列」）（４）にハイブリダイズし、ドナーの５’末端を切断部位に並列させる。この構成では、３つのポリヌクレオチドが、ＤＮＡリガーゼにとって絶妙な基質であるニック核酸となる。

【0253】

ハイブリダイゼーション配列は、リン酸化、アデニル化、タンパク質への共有結合、又は化学的に異なる方法で修飾することができる。ドナーは更に、目的配列（「挿入配列」）（５）と、切断部位に近接する配列と相同な相同配列（６）とからなる。相同配列は、相同性に基づくメカニズム（ＨＲ、ＳＳＡ又はＭＭＥＪ）に関与するために使用され、潜在的に編集効率を向上させる。

【0254】

ドナー及びｐｌｕｇＲＮＡのどちらもが、追加のエレメントを含むことができるか、いくつかのエレメントを省略することができるか、又は複数のオリゴヌクレオチドに分割することができる（図１１及び実施例７を参照されたい）。明確にするために、ドナーとｐｌｕｇＲＮＡ間の塩基対は示されていない。

【0255】

実施例６：リガーゼの活性により正確な挿入を生じさせる方法
図１０は、ノックインヌクレオチド誘導（「ＫＩＮＧ」）編集の一般的な方式を示す。ｐｌｕｇＲＮＡによって誘導されたＣａｓタンパク質は、特定のＤＮＡ配列で切断を誘発させることができる。プライマー結合配列（「ＰＢＳ」）が切断部位にハイブリダイズすることにより、ドナーが切断部位と並列する。ドナーは、５’末端と３’末端の両方で直接ライゲートされてもよく、又は一方の末端（ここでは５’で示されている）でライゲートされ、他方の末端で相同性媒介メカニズム（ＨＲ、ＳＤＳＡ、ＳＳＡ、ａｌｔ－ＥＪなど）により組み込まれてもよい。生成されたキメラ分子はｄｓＤＮＡに変換され、標的部位に所望の配列が組み込まれる。

【0256】

実施例７：異なるｐｌｕｇＲＮＡ：ドナー構成の例
図１１は、ＫＩＮＧ編集を行うための方式の一部を示す。図１１（Ａ）は、３つのエレメントである、第２のハイブリダイゼーション配列、目的配列、及び相同配列を全て含むドナーを示す。図１１（Ｂ）は、相同配列を含まないドナーを示す。図１１（Ｃ）は、第２のハイブリダイゼーション配列を含まないドナーを示す。図１１（Ｄ）は、５’と３’の両方にオーバーハングを有する二本鎖領域の目的配列を形成するように、目的配列に相補的な配列がハイブリダイズされている標準的なドナーを表す。この構成は「オーバーハング」と称される。図１１（Ｅ）は、図１１（Ａ）のようなドナーを示しているが、ｐｌｕｇＲＮＡが２つの核酸で構成されている。ｓｇＲＮＡは、３’末端に付加された、約３０ｎｔの長さの配列を有する。この３’配列は相補的なポリヌクレオチドと対合することができ、次いで第１のハイブリダイゼーション配列及びプライマー結合配列が続く。この構成は、「スプリットｐｌｕｇＲＮＡ」又は「スプリットシステム」と称される。図１１（Ｆ）は、図１１（Ａ）のような構成を示しているが、ハイブリダイゼーション配列が短く、プライミングされる標的部位の３’末端とドナーの５’末端との間にギャップが生じている。この構成は「ギャップ」と称される。図１１（Ｇ）は、図１１（Ａ）と同一であるが、ドナーは５’末端に追加のヌクレオチドを有しており、いくつかの実施形態ではＦＥＮ１及び他の修復機構に関与し得るフラップが生成されている。この構成は「フラップ」と称される。図１１（Ｈ）は、図１１（Ｂ）と同一であるが、目的配列に相補的な配列がアニーリングされ、ドナーの３’末端に平滑末端が生成されている。この構成は「平滑」と称される。図１１（Ｉ）では、ドナーが２つのポリヌクレオチドに分割されている。第１のドナー鎖は、第２のハイブリダイゼーション配列及び目的配列から構成される。第２の配列は、相同配列、及び目的配列に相補的な配列から構成される。この構成は「ブリッジ」と称される。図１１（Ｊ）では、相同配列が、ｇＲＮＡ足場のすぐ下流のｐｌｕｇＲＮＡに埋め込まれている。この相同配列は、Ｃａｓによって誘導された切断の３’側にアニーリングする。ドナーは、２つのハイブリダイゼーション配列：第２のハイブリダイゼーション配列及び更なるハイブリダイゼーション配列に挟まれた目的配列から構成され、第２のハイブリダイゼーション配列は第１のハイブリダイゼーション配列と相補的であり、更なるハイブリダイゼーションは相同配列に隣接する領域に相補的である。この構成により、ドナーの５’側と３’側の両方が二本鎖切断に近接する。この構成は「デュアルハイブリダイゼーション」と称される。

【0257】

実施例８：インビトロアッセイにおける概念実証
材料及び方法
ＨＥＸ標識ＤＮＡオリゴを、アニーリング緩衝液（ｐＨ ７．５の１０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ）中で、９５℃で２分間変性させ、次いで０．１℃／秒で４℃まで一定に低下させることにより、２００ｎＭの相補的配列とアニーリングさせた。ｐｌｕｇＲＮＡをドナーオリゴ（アニーリング緩衝液中、終濃度１μＭ）と等モル比で混合し、上記のようにアニーリングさせた。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを反応緩衝液（１Ｘ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液、ＮＥＢ）に等モル量で溶解し、混合した（終濃度１５０ｎＭ）。周囲温度で１０分間インキュベートすることにより、Ｃａｓ９－ｐｌｕｇＲＮＡ－ドナー複合体を組み立てた。組み立てられたＲＮＰに、蛍光二本鎖ＤＮＡ基質を添加した（１０ｎＭの終濃度）。標的ＤＮＡを切断するために、反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、２００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、反応を３７℃で１時間継続させた。反応を停止液（終濃度：０．１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ、０．１％のＳＤＳ、１２．５ｍＭのＥＤＴＡ）を添加することで終了させ、５６℃で３０分間インキュベートした。反応生成物をＧｅｎｅＳｃａｎ ＬＩＺ５００を用いてＨｉＤｉホルムアミドに溶解させ、９５℃で変性させ、次いでキャピラリー電気泳動で分離した。

【0258】

図１２Ａは、アッセイのレイアウトを表す。図１２Ｂ及び図１２Ｃは、ｐｌｕｇＲＮＡを、それぞれ異なる長さの第１及び第２のハイブリダイゼーション配列を含むドナーと組み合わせた、インビトロアッセイの定量化を表す。２つのパラメータ：ライゲートされたＤＮＡに相当する、アッセイで検出されたＤＮＡ全体の割合として算出されるライゲーション生成％；及びライゲートされた切断ＤＮＡの割合として算出されるライゲーション効率％について計算を行った。図１２Ｂは、ｐｌｕｇＲＮＡが２０ｂｐのランディングパッドと１５ｂｐのハイブリダイゼーション配列を含む場合、ライゲーション生成物が高頻度で生成され、最大量に達することを示している。ｐｌｕｇＲＮＡがランディングパッドを含まない場合、ライゲーションは観察されず、ドナーＤＮＡにｐｌｕｇＲＮＡをアニーリングすることが必要となることを示している。図１２Ｃは、組み合わせに関わらず、ライゲーションが極めて効率的であり、＞９０％のライゲーション効率に達することを示している。

【0259】

実施例９．ＨｅＬａ核抽出物を使用したインビトロライゲーション
材料及び方法
ＨＥＸ標識ＤＮＡオリゴを、アニーリング緩衝液（ｐＨ ７．５の１０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ）中で、９５℃で２分間変性させ、次いで０．１℃／秒で４℃まで一定に低下させることにより、２００ｎＭの相補的配列とアニーリングさせた。ｐｌｕｇＲＮＡをドナーオリゴ（アニーリング緩衝液中、終濃度１μＭ）と等モル比で混合し、上記のようにアニーリングさせた。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを反応緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭの酢酸マグネシウム、６０ｍＭの酢酸カリウム、及び０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）に等モル量で溶解し、混合した（終濃度１５０ｎＭ）。周囲温度で１０分間インキュベートすることにより、Ｃａｓ９－ｐｌｕｇＲＮＡ－ドナー複合体を組み立てた。組み立てられたＲＮＰに、蛍光二本鎖ＤＮＡ基質を添加した（１０ｎＭの終濃度）。標的ＤＮＡを切断するために、反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート中にＨｅＬａ核抽出物（Ｉｐｒａｃｅｌｌ）をｄＮＴＰ及びｒＮＴＰ混合物と予備混合し、室温で１０分間インキュベートした。インキュベート後、予備混合したＨｅＬａ核抽出物を、ＲＮＰ／基質混合物（２．５ｍｇ／ｍｌのＨｅＬａ核抽出物、５ｍＭのＡＴＰ、０．２ｍＭのＣＴＰ、０．２ｍＭのＧＴＰ、０．２ｍＭのＵＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＵＴＰ）に添加した。反応物を３７℃で更に１時間インキュベートした。反応を停止液（終濃度：０．１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ、０．１％のＳＤＳ、１２．５ｍＭのＥＤＴＡ）を添加することで終了させ、３７℃で３０分間インキュベートした。反応生成物をＧｅｎｅＳｃａｎ ＬＩＺ５００を用いてＨｉＤｉホルムアミドに溶解させ、９５℃で変性させ、次いでキャピラリー電気泳動で分離した。

【0260】

図１３Ａは、実験のレイアウトを表す。ＨｅＬａ核抽出物は、大部分のタンパク質の活性を保持しているため、生化学的研究に広く使用されており、様々な複雑なプロセス（複製、修復、及び転写を含む）を再構成するために使用することができる。ウイルス組換えリガーゼの使用に加えて、ＨｅＬａ核抽出物は、ヒト細胞に存在する酵素活性を使用するＫＩＮＧ編集の実現可能性に知見をもたらし得る。

【0261】

図１３Ｂ及び１３Ｃは、ＨｅＬａ核抽出物によるインビトロアッセイの定量化を示す。図１２及び実施例８のように、（ライゲーション生成物に相当するＤＮＡ全体の割合としての）生成物の存在量と、（ライゲートされた生成物に変換された切断ＤＮＡの割合としての）ライゲーションの効率との両方を定量化した。図１３Ｂ及び１３Ｃの結果のヒートマップにより、ＫＩＮＧ編集が効率的であることが実証された。第１のハイブリダイゼーション領域（「ランディングパッド」）と第２のハイブリダイゼーション領域（「ハイブリダイゼーション配列」）の大きさが増大するにつれて、ライゲーション生成物が多くなることが観察された。また、ＨｅＬａ核抽出物を使用した場合に、ライゲーションが例外的に効率的となることが観察された。

【0262】

実施例１０．核抽出物を使用したＫＩＮＧ編集の再構成
材料及び方法
ｐｌｕｇＲＮＡをドナーオリゴ（アニーリング緩衝液中、終濃度１μＭ）と等モル比で混合し、９５℃で２分間変性させ、次いで０．１℃／秒で４℃まで一定に低下させることによりアニーリングした。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを反応緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭの酢酸マグネシウム、６０ｍＭの酢酸カリウム、及び０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）に等モル量で溶解し、混合した（終濃度１５０ｎＭ）。周囲温度で１０分間インキュベートすることにより、Ｃａｓ９－ｐｌｕｇＲＮＡ－ドナー複合体を組み立てた。組み立てられたＲＮＰに、標的ＡＡＶＳ１配列を含むプラスミドを添加した（１０ｎＭの終濃度）。標的ＤＮＡを切断するために、反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート中にＨｅＬａ核抽出物（Ｉｐｒａｃｅｌｌ）をｄＮＴＰ及びｒＮＴＰ混合物と予備混合し、室温で１０分間インキュベートした。インキュベート後、予備混合したＨｅＬａ核抽出物を、ＲＮＰ／基質混合物（２．５ｍｇ／ｍｌのＨｅＬａ核抽出物、５ｍＭのＡＴＰ、０．２ｍＭのＣＴＰ、０．２ｍＭのＧＴＰ、０．２ｍＭのＵＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＵＴＰ）に添加した。反応物を３７℃で更に１時間インキュベートした。反応液のマイクロリットルの半分をＰＣＲ反応の鋳型として使用し、標的ＡＡＶＳ１配列を増幅した。ＰＣＲ産物をキャピラリー電気泳動を使用して分離した、又はＮｅｘｔＳｅｑ５００を使用して次世代シーケンシングにかけた。配列決定結果を参照配列とアライメントし、ＲＩＭＡによって編集を解析した（例えば、Ｔａｈｅｒｉ－Ｇｈａｈｆａｒｏｋｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＭＩＤ；３００３２２００を参照されたい）。

【0263】

図１４Ａは、手順のレイアウトを示す。図１４Ｂは、ＮＧＳ後の代表的な結果を示す。回収したＡＡＶＳ１標的部位で検出された挿入変異体の上位１０個を示す。＞７５％の編集されたリードを含む上位の変異体は、予測された所望の配列（ハイブリダイゼーション配列［ドット］及び挿入［クロスハッチ］）に相当するものであった。短縮された挿入も、はるかに低い頻度で検出された。エラーを伴う所望の配列の挿入も、０．５％より低い頻度で検出された。これらの結果は、ＫＩＮＧ反応全体が再構成され、高精度且つ高い忠実度で標的部位に所望の配列の挿入をもたらすことができることを示している。

【0264】

実施例１１．様々な基質を用いて再構成されたＫＩＮＧアッセイにおける挿入効率
材料及び方法
ｐｌｕｇＲＮＡをドナーオリゴ（アニーリング緩衝液中、終濃度１μＭ）と等モル比で混合し、９５℃で２分間変性させ、次いで０．１℃／秒で４℃まで一定に低下させることによりアニーリングした。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを反応緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭの酢酸マグネシウム、６０ｍＭの酢酸カリウム、及び０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）に等モル量で溶解し、混合した（終濃度１５０ｎＭ）。周囲温度で１０分間インキュベートすることにより、Ｃａｓ９－ｐｌｕｇＲＮＡ－ドナー複合体を組み立てた。組み立てられたＲＮＰに、標的ＡＡＶＳ１配列を含むプラスミドを添加した（１０ｎＭの終濃度）。標的ＤＮＡを切断するために、反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート中にＨｅＬａ核抽出物（Ｉｐｒａｃｅｌｌ）をｄＮＴＰ及びｒＮＴＰ混合物と予備混合し、室温で１０分間インキュベートした。インキュベート後、予備混合したＨｅＬａ核抽出物を、ＲＮＰ／基質混合物（２．５ｍｇ／ｍｌのＨｅＬａ核抽出物、５ｍＭのＡＴＰ、０．２ｍＭのＣＴＰ、０．２ｍＭのＧＴＰ、０．２ｍＭのＵＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＵＴＰ）に添加した。反応物を３７℃で更に１時間インキュベートした。反応液のマイクロリットルの半分をＰＣＲ反応の鋳型として使用し、標的ＡＡＶＳ１配列を増幅した。ＰＣＲ産物をキャピラリー電気泳動を使用して分離した、又はＮｅｘｔＳｅｑ５００を使用して次世代シーケンシングにかけた。配列決定結果を参照配列とアライメントし、ＲＩＭＡによって編集を解析した（ＰＭＩＤ；３００３２２００）。

【0265】

図１５は、異なる方式（図１１を参照されたい）を使用した場合の、（ＮＧＳによってアッセイされた）所望の挿入の頻度を示す。図１５に示すように、ハイブリダイゼーション配列及び相同配列、並びに／又は二本鎖ドナーが存在すると、正確なＫＩＮＧ編集の頻度が高くなった。これらのエレメントの構成が異なるｐｌｕｇＲＮＡ：ドナー複合体により、様々なレベルで挿入を生じさせることができた。

【0266】

実施例１２．正確な挿入のためのＫＩＮＧ編集成分の最適化
本実施例では、より正確な挿入を生じさせる能力について、様々なＫＩＮＧ編集成分を試験した（図１６Ａを参照されたい）。

【0267】

方法：
ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用して、Ｃａｓ９の発現を誘導するプラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。２４時間後、ｐｌｕｇＲＮＡ及びｓｓＤＮＡドナーを、以下の条件を用いて組み立てた：９５℃で２分間変性させ、次いで０．１℃／秒の速度で４℃まで一定に低下させた。ＲＮＡｉＭＡＸを使用して、２ｐｍｏｌの組み立てられたｐｌｕｇＲＮＡ及びｓｓＤＮＡドナーで細胞をトランスフェクトした。ｐｌｕｇＲＮＡ用の異なる長さの第１のハイブリダイゼーション領域（「ランディングパッド」）と、ｓｓＤＮＡドナー用の異なる長さの第２のハイブリダイゼーション領域（「ハイブリダイゼーション配列」）及びｓｓＤＮＡドナーの相同配列とを、様々なＡＡＶＳ部位を標的化して試験した。４８時間後のトランスフェクト細胞からゲノムＤＮＡを採取し、増幅してからＩＬＬＵＭＩＮＡ次世代シーケンシングによって解析した。

【0268】

結果：
ランディングパッド、相同配列、及びハイブリダイゼーション配列が、ｓｓＤＮＡドナーを使用したＫＩＮＧ編集による正確な挿入を導入するために使用されたことが観察された。図１６Ｂを参照されたい。ｐｌｕｇＲＮＡ１．２（＋ＡＡＶＳ６）、ｐｌｕｇＲＮＡ１．４（＋ＡＡＶＳ７）及びｐｌｕｇＲＮＡ１．５（＋ＡＡＶＳ７又は＋ＡＡＶＳ８）を使用すると、意図した正確な挿入が認められた。

【0269】

実施例１３．ｓｓＤＮＡドナーによるＫＩＮＧ編集
本実施例では、ＫＩＮＧ編集のためのｓｓＤＮＡドナー及び様々な長さの相同配列について試験した。

【0270】

方法：
ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用して、Ｃａｓ９の発現を誘導するプラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。２４時間後、ｐｌｕｇＲＮＡ及びｓｓＤＮＡドナーを、以下の条件を用いて組み立てた：９５℃で２分間変性させ、次いで０．１℃／秒の速度で４℃まで一定に低下させた。ＲＮＡｉＭＡＸを使用して、２ｐｍｏｌの組み立てられたｐｌｕｇＲＮＡ及びｓｓＤＮＡドナーで細胞をトランスフェクトした。ｓｓＤＮＡドナー、又はギャップ若しくはフラップを有するｓｓＤＮＡに対し、異なる長さの相同配列（図１７Ａ）を試験した。４８時間後のトランスフェクト細胞からゲノムＤＮＡを採取し、増幅してからＩＬＬＵＭＩＮＡ次世代シーケンシングによって解析した。

【0271】

結果：
ｓｓＤＮＡドナーの相同配列の長さを最適化することにより、ＫＩＮＧの絶対的及び相対的な正確な編集効率が更に改善されたことが観察された。図１７Ｂを参照されたい。ｐｌｕｇＲＮＡ１．５では、１０ｂｐ又は５０ｂｐの相同配列を含むｓｓＤＮＡドナーを使用すると、最も高い絶対的な正確な編集効率のＫＩＮＧ編集が認められた。ｐｌｕｇＲＮＡ１．４では、５０ｂｐの相同配列を含むｓｓＤＮＡドナーを使用すると、最も高い絶対的な正確な編集効率のＫＩＮＧ編集が認められた。図１７Ｂでは、更に、ギャップ又はフラップを含むドナーを使用したＫＩＮＧ編集により、正確な挿入を導入することが可能となることが実証された。

【0272】

実施例１４．ｄｓＤＮＡドナーによるＫＩＮＧ編集
本実施例では、図１８Ａに図示される様々な構成のｄｓＤＮＡドナーによってＫＩＮＧ編集を試験した。

【0273】

方法：
ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用して、Ｃａｓ９の発現を誘導するプラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。２４時間後、ｐｌｕｇＲＮＡ及びｓｓＤＮＡドナーを、以下の条件を用いて組み立てた：９５Ｃで２分間変性させ、次いで０．１℃／秒の速度で４℃まで一定に低下させた。ＲＮＡｉＭＡＸを使用して、２ｐｍｏｌの組み立てられたｐｌｕｇＲＮＡ及びｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡドナーで細胞をトランスフェクトした。異なる設計のｄｓＤＮＡ又は対照ｓｓＤＮＡ（図１８Ａ）を試験した。４８時間後のトランスフェクト細胞からゲノムＤＮＡを採取し、増幅してからＩＬＬＵＭＩＮＡ次世代シーケンシングによって解析した。

【0274】

結果：
平滑、オーバーハング、又はブリッジ設計のｄｓＤＮＡドナーを用いたＫＩＮＧ編集により、正確な挿入が導入されたことが観察された。平滑及びオーバーハング設計のドナーを使用する場合、ドナーオリゴのホスホロチオエート結合を修飾することにより、絶対的及び相対的な正確な編集効率が更に向上した（図１８Ｂ）。

【0275】

実施例１５．Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼによるＫＩＮＧ編集
本実施例では、Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼによってＫＩＮＧ編集を試験した。

【0276】

方法：
ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用して、ＳｐＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼの発現を誘導するプラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。２４時間後、ｐｌｕｇＲＮＡ及びｓｓＤＮＡドナーを、以下の条件を用いて組み立てた：９５Ｃで２分間変性させ、次いで０．１℃／秒の速度で４℃まで一定に低下させた。ＲＮＡｉＭＡＸを使用して、２ｐｍｏｌの組み立てられたｐｌｕｇＲＮＡ及びｓｓＤＮＡドナーで細胞をトランスフェクトした。異なる設計のｓｓＤＮＡ（図１９Ａ）を試験した。４８時間後のトランスフェクト細胞からゲノムＤＮＡを採取し、増幅してからＩＬＬＵＭＩＮＡ次世代シーケンシングによって解析した。

【0277】

結果：
ＳｐＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼを使用したＫＩＮＧ編集により、正確な挿入が導入されたことが観察された。ＳｐＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼを使用した場合、最大３６％の相対的な正確な編集効率が達成され（図１９Ｂ）、この編集効率はＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼで達成された正確な編集効率よりも高かった（５％未満）。

【0278】

実施例１６．ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）阻害剤で処理した際のＫＩＮＧ編集
本実施例では、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤によってＫＩＮＧ編集を試験した。ＤＮＡ－ＰＫは非相同末端連結（ＮＨＥＪ）修復経路の一部である。

【0279】

方法：
トランスフェクトする前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１μＭのＤＮＡＰＫ阻害剤（ＡＺＤ７６４８）で１時間前処理した。モック対照としてＤＭＳＯを使用した。１時間後、ＦｕｇｅｎｅＨＤ試薬を使用して、Ｃａｓ９及びＰＥｎの発現を誘導するプラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡｉＭＡＸを使用して、２ｐｍｏｌの合成ＲＮＡで細胞をトランスフェクトした。合成ｐｌｕｇＲＮＡを９５℃で２分間変性させることによりドナー配列にアニーリングさせ、次いで４℃となるまでゆっくりと冷却した。いくつかの異なるｐｌｕｇＲＮＡ及びドナー構成を試験した（図２０Ａを参照されたい）。

【0280】

ＲＮＡをトランスフェクトして４８時間後に細胞を採取し、ＡＡＶＳ１遺伝子座をＰＣＲで増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して配列決定した。リードを参照配列にアライメントすることによってデータを解析し、ＲＩＭＡによって編集頻度を解析した（ＰＭＩＤ：３００３２２００）。

【0281】

結果は、合成オリゴヌクレオチドと組み合わせたＣａｓ９及びＰＥｎにより、ＫＩＮＧ挿入が行われたことを示している。ＤＮＡＰＫ阻害剤で前処理することにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における正確な編集が改善された。

【0282】

図２０Ｂは、異なる組み合わせのトランスフェクトｐｌｕｇＲＮＡ：ドナーの絶対的な所望の編集割合を示す。ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤で前処理することにより、ＤＭＳＯ対照（濃い灰色）と比較して、絶対的な所望の編集が改善された（薄い灰色）。

【0283】

実施例１７．同時発現させたリガーゼの存在下におけるＫＩＮＧ編集
本実施例では、リガーゼ又はリガーゼアダプタータンパク質（「リガーゼ動員タンパク質」とも称される）の存在下でＫＩＮＧ編集を行った。

【0284】

方法：
ＦｕｇｅｎｅＨＤ試薬を使用して、Ｃａｓ９及びリガーゼ／リガーゼアダプターの発現を誘導するプラスミド（複数可）でＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。それぞれが異なる９つのリガーゼ条件を有する、異なる３つのドナー構成（図２１Ａ）のパネル：細菌起源のリガーゼ（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、ＬｉｇＤ及びＰＢＣＶ１）；ヒト起源のリガーゼ（Ｌｉｇ１、Ｌｉｇ３α、Ｌｉｇ４）；及びヒトＤＮＡ修復タンパク質（ＸＲＣＣ１、ＸＲＣＣ４、ＰＣＮＡ）を試験した。Ｃａｓ９及びリガーゼは、別々のプラスミドから発現させた。

【0285】

ＲＮＡをトランスフェクトして４８時間後に細胞を採取し、ＡＡＶＳ１遺伝子座をＰＣＲで増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して配列決定した。リードを参照配列にアライメントすることによってデータを解析し、ＲＩＭＡによって編集頻度を解析した（ＰＭＩＤ：３００３２２００）。

【0286】

図２１Ｂは、同時発現させたＣａｓ９と異なるリガーゼとの組み合わせに関する絶対的な所望の編集割合を示す。結果は、リガーゼの存在下のＣａｓ９によってＫＩＮＧ挿入が行われたことを示している。

【0287】

実施例１８．異なるドナーの組成物並びにそれらのインビトロアッセイ及び細胞内における能力のまとめ
図２２の表は、本明細書の実施例に示すようなｐｌｕｇＲＮＡ：ドナー複合体の構成と、各構成の編集効率とをまとめたものである。例えば、「－」はＫＩＮＧ編集が観察されなかったことを意味し、「＋＋＋＋」は非常に効率的な編集であったことを意味する。

【0288】

実施例１９．デュアルハイブリダイゼーション設計
本実施例では、デュアルハイブリダイゼーション構成（図２３Ａ）を試験した。

【0289】

方法：
ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用して、Ｃａｓ９の発現を誘導するプラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡｉＭＡＸを使用して、２ｐｍｏｌの合成ＲＮＡで細胞をトランスフェクトした。合成ｐｌｕｇＲＮＡを９５℃で２分間変性させることによりドナー配列にアニーリングさせ、次いで４℃となるまでゆっくりと冷却した。

【0290】

トランスフェクトして４８時間後に細胞を採取し、ＡＡＶＳ１遺伝子座をＰＣＲで増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して配列決定した。リードを参照配列にアライメントすることによってデータを解析し、ＲＩＭＡによって編集頻度を解析した（ＰＭＩＤ：３００３２２００）。

【0291】

結果：
プライム編集の挿入が観察された。図２３Ｂの結果は、全ての編集と正確な編集（ＰＥ）との挿入の頻度を示している。

【図1】

【図2A-2D】

【図3A-3B】

【図3C-3D】

【図3E-3F】

【図3G-3H】

【図3I-3J】

【図4】

【図5A-5B】

【図5C】

【図5D-5E】

【図5F】

【図6】

【図7A-7B】

【図7C-7D】

【図7E-7F】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B-12C】

【図13A】

【図13B-13C】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16A-16B】

【図17A-17B】

【図18A】

【図18B】

【図19A-19B】

【図20A】

【図20B】

【図21A-21B】

【図22】

【図23A-23B】

【配列表】

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【国際調査報告】