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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-21
(54)【発明の名称】タンパク質の精製
(51)【国際特許分類】
C07K 1/30 20060101AFI20240313BHJP
C12N 9/26 20060101ALI20240313BHJP
C12N 9/20 20060101ALI20240313BHJP
C12N 9/50 20060101ALI20240313BHJP
C12N 9/48 20060101ALI20240313BHJP
C12N 9/42 20060101ALI20240313BHJP
C12N 9/80 20060101ALI20240313BHJP
C12N 9/24 20060101ALI20240313BHJP
C12N 9/64 20060101ALI20240313BHJP
C12N 15/56 20060101ALI20240313BHJP
C12N 15/57 20060101ALI20240313BHJP
C07K 1/34 20060101ALI20240313BHJP
A61P 1/14 20060101ALI20240313BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20240313BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240313BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240313BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20240313BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240313BHJP
A61K 35/68 20060101ALI20240313BHJP
A61K 38/48 20060101ALI20240313BHJP
A61K 38/47 20060101ALI20240313BHJP
A61K 38/46 20060101ALI20240313BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20240313BHJP
【ＦＩ】
C07K1/30
C12N9/26 A ZNA
C12N9/20
C12N9/50
C12N9/48
C12N9/42
C12N9/80
C12N9/24
C12N9/64
C12N15/56
C12N15/57
C07K1/34
A61P1/14
A61P1/18
A61P3/00
A61P37/02
A61P1/00
A61P35/00
A61K35/68
A61K38/48
A61K38/47
A61K38/46
C12N15/55
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023561617
(86)(22)【出願日】2022-04-11
(85)【翻訳文提出日】2023-12-01
(86)【国際出願番号】 EP2022059587
(87)【国際公開番号】W WO2022214705
(87)【国際公開日】2022-10-13
(31)【優先権主張番号】21167712.5
(32)【優先日】2021-04-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】323008187
【氏名又は名称】シリアン アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】ハートマン マルクス ヴォルフ ヴィリアム
(72)【発明者】
【氏名】アルダグ インゴ
(72)【発明者】
【氏名】ロスドルフ ヤン
(72)【発明者】
【氏名】ウトフ シュテファン
(72)【発明者】
【氏名】シューマッハー フロリアン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA01
4C084AA02
4C084BA44
4C084CA11
4C084DC02
4C084DC07
4C084DC22
4C084MA52
4C084NA20
4C084ZA66
4C084ZA69
4C084ZB07
4C084ZB26
4C084ZC21
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087AA05
4C087BB01
4C087MA52
4C087NA20
4C087ZA66
4C087ZA69
4C087ZB07
4C087ZB26
4C087ZC21
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA53
4H045CA20
4H045DA89
4H045EA20
4H045EA25
4H045FA74
4H045GA40
(57)【要約】
本発明は、クロマトグラフィーで精製されていない採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）から、繊毛虫宿主における同種または異種発現によって産生されたタンパク質を精製する方法に関する。この方法は、採取した細胞培養液をコスモトロピック剤とともにインキュベートする工程、結晶の形成によってタンパク質をエフロレッセンス化させる工程、および任意選択でエフロレッセンス化タンパク質を採取する工程を含む（図１）。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
繊毛虫宿主における同種または異種発現によって産生されたタンパク質を、クロマトグラフィーで精製されなかった採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）から精製する方法であって、ａ） 採取した細胞培養液をコスモトロピック剤とインキュベートする工程、
ｂ） 結晶の形成によりタンパク質をエフロレッセンス化する（ｅｆｆｌｏｒｅｓｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）工程、および
ｃ） 任意選択で、エフロレッセンス化タンパク質（ｅｆｆｌｏｒｅｓｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）を採取する工程
を含み、
エフロレッセンス化の前または後にタンパク質を架橋する工程を含まない、方法。
【請求項2】
タンパク質がグリコシル化タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
コスモトロピック剤が・硫酸アンモニウム、
・リン酸二水素ナトリウム、および／または
・ポリエチレングリコール
の少なくとも１つである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
採取された細胞培養液が、３以上から２００ｇ／ｌ以下のタンパク質を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
タンパク質をエフロレッセンス化するために、・培地中のｐＨが５以上から８以下に設定され、および／または
・温度が１０℃以上から４０℃以下に設定される、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
採取された細胞培養液のインキュベーションのために、コスモトロピック塩濃度が５０以上から２５００ｍＭ以下の範囲に設定される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
採取された細胞培養液のインキュベーションのために、多価アルコール濃度が２以上から２５ｗ／ｖ％以下の範囲に設定される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
採取された細胞培養液とコスモトロピック剤とのインキュベーションが、１０分以上３６時間以下の期間にわたって行われる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
採取前細胞培養液を、工程ａ）の前に１つ以上の濾過及び／又は遠心分離工程に供し、採取された細胞培養液を得る、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
繊毛虫宿主がＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｓｐ．である、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記同種または異種発現が、・メタロチオネイン遺伝子（ＭＴＴ１）誘導性プロモーター、および／または
・熱誘導性プロモーター
の制御下にある、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
タンパク質が酵素である、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
タンパク質が、・リパーゼ
・プロテアーゼ
・アミラーゼ
・グルテナーゼ
・グルタミン特異的システイン・プロテアーゼ
・プロリルエンドペプチダーゼ
・サッカラーゼ、および／または
・ラクターゼ
からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
酵素が、ａ） 配列番号１～３または８～１０のいずれか１つに記載のテトラヒメナ・リパーゼ、
ｂ） 配列番号４または１１に記載のテトラヒメナ・アミラーゼ、
ｃ） 配列番号５～７、１２～１４または１５～１７のいずれかに記載のテトラヒメナ・プロテアーゼ、または
ｄ） （ｉ）上記の酵素のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、上記の酵素のいずれか１つの変異体であって、ここで前記変異体は酵素機能を保持するもの、および／または（ｉｉ）上記の酵素のいずれか１つのＮ末端および／またはＣ末端で１から３個のアミノ酸残基が除去または付加された変異体
である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法であって、該方法は、エフロレッセンス化タンパク質を可溶化する工程をさらに含む、方法。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法で得られた医薬中間体。
【請求項17】
エフロレッセンス化タンパク質の可溶化形態またはエフロレッセンス化タンパク質自体を含む、請求項１６に記載の医薬中間体。
【請求項18】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法で得られた精製タンパク質。
【請求項19】
繊毛虫型グリコシル化パターンを含む精製され、結晶化されたタンパク質または医薬中間体。
【請求項20】
以下の少なくとも１つであるか、またはこれらを含む、請求項１６または１７のいずれか一項に記載の中間体または請求項１８または１９のいずれか一項に記載のタンパク質。ａ） 配列番号１～３または８～１０のいずれか１つに記載のテトラヒメナ・リパーゼ、
ｂ） 配列番号４または１１に記載のテトラヒメナ・アミラーゼ、
ｃ） 配列番号５～７、１２～１４または１５～１７のいずれかに記載のテトラヒメナ・プロテアーゼ、または
ｄ）（ｉ）上記の酵素のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、上記の酵素のいずれか１つの変異体であって、ここで前記変異体は酵素機能を保持するもの、および／または（ｉｉ）上記の酵素のいずれか１つのＮ末端および／またはＣ末端で１から３個のアミノ酸残基が除去または付加された変異体。
【請求項21】
結晶形態で提供される、請求項１６、１７もしくは２０のいずれか一項に記載の中間体または請求項１８～２０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項22】
純度が８０％以上である、請求項１６、１７、２０もしくは２１のいずれか一項に記載の中間体または請求項１８～２１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項23】
請求項１６、１７、または２０～２２のいずれか一項に記載の中間体、または請求項１８～２２のいずれか一項に記載のタンパク質であって、タンパク質結晶が長さ２以上から１０００μＭ以下である、タンパク質。
【請求項24】
請求項１６、１７、または２０～２３のいずれか一項に記載の中間体、または請求項１８～２２のいずれか一項に記載のタンパク質、および任意選択でさらに１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬製剤。
【請求項25】
タンパク質が酵素である、請求項２４に記載の医薬製剤。
【請求項26】
酵素が、・リパーゼ
・プロテアーゼ
・アミラーゼ
・グルテナーゼ
・グルタミン特異的システイン・プロテアーゼ
・プロリルエンドペプチダーゼ
・サッカラーゼ、および／または
・ラクターゼ
からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項２５に記載の医薬製剤。
【請求項27】
酵素は、以下のものであるか、または以下のものを含む、請求項２６に記載の医薬製剤ａ） 配列番号１～３または８～１０のいずれか１つに記載のテトラヒメナ・リパーゼ、
ｂ） 配列番号４または１１に記載のテトラヒメナ・アミラーゼ、
ｃ） 配列番号５～７、１２～１４または１５～１７のいずれかに記載のテトラヒメナ・プロテアーゼ、または
ｄ）（ｉ）上記の酵素のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、上記の酵素のいずれか１つの変異体であって、ここで前記変異体は酵素機能を保持するもの、および／または（ｉｉ）上記の酵素のいずれか１つのＮ末端および／またはＣ末端で１から３個のアミノ酸残基が除去または付加された変異体。
【請求項28】
請求項１８～２２のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項２６～２７のいずれか一項に記載の医薬製剤の、酵素欠乏もしくは機能不全によって引き起こされる障害の診断を受けているか、罹患しているか、もしくは発症する危険性があるヒトもしくは動物対象の治療のための、もしくはそのような状態の予防のための（医薬の製造のための）使用。
【請求項29】
酵素の欠乏または機能不全によって引き起こされる障害を治療または予防するための方法であって、ヒトまたは動物対象に、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の酵素、または請求項２６～２７のいずれか一項に記載の医薬製剤を、治療上十分な量で投与することを含む方法。
【請求項30】
酵素欠乏または機能不全によって引き起こされる障害が、・脂質消化不全および／または消化障害
・酵素の欠乏または機能不全による障害
・膵外分泌機能不全であって、次のような原因が考えられるもの：
・慢性膵炎
・嚢胞性線維症
・主膵管閉塞
・膵臓切除
・胃切除
・短腸症候群
・遺伝性ヘモクロマトーシス
・セリアック病
・ゾリンジャー・エリソン症候群
・セリアックスプルー
・スクロース不耐症または遺伝性スクロースイソマルターゼ欠損症（ＧＳＩＤ）、および／または
・乳糖不耐症
からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項２８に記載の使用のためのタンパク質または請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
請求項１８～２２のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項２６～２７のいずれか一項に記載の医薬製剤を含む投与ユニット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、タンパク質の精製に関する。
【背景技術】
【0002】
生物学的システムで生産されるタンパク質は、患者に投与する前に精製が必要である。この目的のためにさまざまなアプローチが存在し、それぞれに異なる長所と短所がある。多くの場合、純度を上げるとコストが上がり、処理能力が低下し、逆もまた同様である。
【0003】
さらに、製造方法や投与経路によって、純度に関して異なる要件が存在する。外用タンパク質は、静脈内投与用タンパク質よりも精製度を低くする必要がある。
【0004】
一般に、タンパク質の同種または異種発現において、どの宿主（細菌、酵母、哺乳動物細胞）を選択するかにかかわらず、細胞培養上清は、採取前の細胞培養液の成分および生産されるタンパク質の他に、エンドトキシン、抗生物質、残渣、代謝産物などのような不要な成分を含んでいる。
【0005】
タンパク質精製の標準的な方法のひとつにクロマトグラフィーがある。しかし、物質移動の制限により、大型のクロマトグラフィーカラムを設計する必要があり、それに伴って大量の樹脂が必要となる。樹脂の寿命には限りがあるため、消耗品となる。さらに、樹脂は高価であり、特にアフィニティークロマトグラフィー樹脂や固定化金属クロマトグラフィー樹脂の場合はそうである。
【0006】
一般に、クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー精製工程を用いたタンパク質精製は、高度な装置や消耗品、高価なバッファーを大量に必要とするため、コストがかかる。さらに、クロマトグラフィー精製工程の処理能力は制限されることが多く、十分な収量を得るためには並行処理が必要となり、その結果コストが上昇する。
【0007】
それでもなお、ヒトの消費や治療に使用されるタンパク質については、製品の純度に関する高い要求を満たすために、クロマトグラフィーが依然として選択される方法である。
【0008】
しかし、大量のタンパク質を必要とする治療用途も存在する。これは特に、膵酵素補充療法（ＰＥＲＴ）のようないくつかの酵素補充療法に当てはまるが、特に、他の経口酵素補充療法にも当てはまる。この場合、クロマトグラフィーによる精製は、許容限度を超えてコストを押し上げることになる。
【0009】
一方、繊毛虫の発現システムのように、生産される酵素１グラムあたりの生産コストが比較的低いタンパク質発現システムも存在する。生産された酵素のクロマトグラフィー精製は、これらのシステムが提供できる経済的利点に影響を与えるだろう。
【0010】
したがって、本発明の一つの目的は、上記の欠点を克服する精製方法を提供することである。
【0011】
これらおよび他の目的は、本発明の独立した請求項に記載の方法および手段によって達成される。従属請求項は、具体的な実施形態に関連する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明は、改変型リパーゼ酵素を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明及びその特徴の一般的な利点を以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】図１は、様々な分類群におけるＮ－グリコシル化パターンの概要を示している。一般に、「Ｎ－グリコシル化」という用語は、アミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）のグリコシル化を指す。ここで、オリゴ糖鎖はトリペプチド配列Ａｓｎ－Ｘ－ＳｅｒまたはＡｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒに存在するアスパラギン残基にオリゴ糖転移酵素によって結合される。原核生物がＮ－グリコシル化を全く持たないのに対し、繊毛虫は、哺乳類、酵母、トランスジェニック植物などの他の分類群に比べ、非常に単純で小さいＮ－グリコシル化パターンを特徴とすることは明らかである。
【図2】図２は、クロマトグラフィーで精製していない採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）を１０００ｍＭ 硫酸アンモニウムと１３０分間インキュベートした後に形成されたリパーゼ結晶の顕微鏡写真（４０倍）である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明を詳細に説明する前に、本発明は説明されたデバイスの特定の構成要素部分に限定されず、あるいはそのようなデバイスおよび方法は変化する可能性があるので、説明された方法のプロセス工程に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことを理解されたい。明細書および添付の請求項において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は文脈が明確に別途指示しない限り、単数形および／または複数形の参照を含むことに留意されたい。さらに、数値によって区切られるパラメータ範囲が与えられる場合、その範囲は、これらの限界値を含むものとみなされることを理解されたい。
【0016】
さらに、本明細書に開示される実施形態は、互いに関連しない個々の実施形態として理解されることを意味しないことを理解されたい。一実施形態で議論される特徴は、本明細書に示される他の実施形態に関連しても開示されることを意味する。１つの場合において、特定の特徴が１つの実施形態で開示されず、別の実施形態で開示される場合、当業者は、前記特徴が前記他の実施形態で開示されることを意味しないことを必ずしも意味しないことを理解するのであろう。当業者であれば、他の実施形態についても前記特徴を開示することが本出願の主旨であるが、単に明瞭にするため、及び本明細書を管理可能な量に維持するために、これが行われていないことを理解されよう。
【0017】
さらに、本明細書で参照される先行技術文献の内容は、参照により援用される。これは、特に、標準的または通常方法を開示する先行技術文献を指す。その場合、参照による援用は、主に、十分に実施可能な開示を提供し、長い繰り返しを回避する目的を有する。
【0018】
本発明の第一の態様によれば、タンパク質を精製する方法が提供され、タンパク質は、繊毛虫宿主における同種または異種発現によって産生され、クロマトグラフィー的に精製されなかった採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）から得られる。
【0019】
この方法は以下の工程を含む
ａ） 採取した細胞培養液をコスモトロピック剤とともにインキュベートする工程、
ｂ） 結晶の形成によりタンパク質をエフロレッセンス化する（ｅｆｆｌｏｒｅｓｃｉｎｇ）工程、および
ｃ） 任意選択で、エフロレッセンス化タンパク質（ｅｆｆｌｏｒｅｓｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）を採取する工程。
ａ） 採取した細胞培養液をコスモトロピック剤とともにインキュベートする工程、
ｂ） 結晶の形成によりタンパク質をエフロレッセンス化する（ｅｆｆｌｏｒｅｓｃｉｎｇ）工程、および
ｃ） 任意選択で、エフロレッセンス化タンパク質（ｅｆｆｌｏｒｅｓｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）を採取する工程。
【0020】
この方法は、エフロレッセンス化の前または後にタンパク質を架橋する工程を含まない。
【0021】
本発明者らは、このような方法は、クロマトグラフィーによる精製の工程もタンパク質の架橋の工程も含まないが、例えばクロマトグラフィーによる精製と比較して、純度および収率に関して優れた結果をもたらし、さらに、コスト面でも実質的な利点があることを示した。
【0022】
本明細書で使用する「繊毛虫宿主」という用語は、繊毛虫門という科学的な門（ｐｈｙｌｕｍ）を指すものとし、繊毛虫門は単細胞の真核生物（「原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａ）」または「原生生物（ｐｒｏｔｉｓｔｓ）」）であり、特に、比較的大きなサイズ（長さが２ｍｍに達する種もある）、繊毛で覆われた細胞表面、２種類の核、すなわち、小さな２倍体の小核と大きな倍体の大核（タンパク質の発現に使用される）を特徴とする。後者はゲノムの増幅と重編集（ｈｅａｖｙ ｅｄｉｔｉｎｇ）によって小核から生成される。繊毛虫、特にテトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）は、例えばＷｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．２００６やＥＰ１３５０８３８（ＵＳ６９６２８００）（その内容は参照により本明細書に援用される）に記載されているように、異種または同種タンパク質発現産生のための発現宿主として使用されてきた。
【0023】
本明細書で使用する場合、「採取前の細胞培養液（ＣＣＦ）」という用語は、繊毛虫宿主細胞を含む液体培地に関するものであり、特に同種発現または異種発現によって産生された酵素を含む培地に関するものである。
【0024】
本明細書で使用される場合、用語「採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）」は、遠心分離、濾過、および／または類似の分離方法によって採取前細胞培養液（ＣＣＦ）から得られる液体培地に関する。
【0025】
本明細書において、「クロマトグラフィーで精製されていない」という用語は、採取した細胞培養液がクロマトグラフィーに基づく精製を受けていないことを意味するものとする。これは、ろ過のような単なるサイズ排除精製工程や、遠心分離のような密度ベースの精製工程を除外するものではない。
【0026】
本明細書において、「エフロレッセンス化（ｅｆｆｌｏｒｅｓｃｉｎｇ）」という用語は、結晶の形成によってタンパク質が沈殿するプロセスに関する。「エフロレッセンス化（ｅｆｆｌｏｒｅｓｃｉｎｇ）」と「結晶の形成による沈殿」という用語は、同じ意味で使われることがある。本来、「エフロレッセンス（ｅｆｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）」という用語は、レンガ、コンクリート、石、漆喰、その他の建築物の表面に水が存在する場合に形成される結晶性の沈殿物に関するものである。しかし、本明細書では、その意味は上に記載したプロセスに関するものである。
【0027】
本明細書で使用する「エフロレッセンス化タンパク質」は、沈殿および結晶形成のようなプロセスによって得られたタンパク質である。
【0028】
つまり、エフロレッセンス化タンパク質とは、上記の方法に従って得られる、結晶の形で存在するタンパク質のことである。その意味で、本明細書では、「エフロレッセンス化タンパク質」および「結晶化タンパク質」という用語を互換的に使用する。
【0029】
本明細書において、「コスモトロピック剤」という用語は、溶液中の水－水相互作用の安定性と構造に寄与する薬剤に関する。コスモトロープは、水分子を有利に相互作用させ、タンパク質のような高分子の分子内相互作用を安定化させるが、カオトロープは逆に、水の構造を破壊し、非極性溶媒粒子の溶解度を高め、溶質の凝集体を不安定化させる。
【0030】
イオン性コスモトロープは小さいか、電荷密度が高い傾向がある。イオン性コスモトロープには、ＣＯ３
２－、ＳＯ４
２－、ＨＰＯ４
２－、Ｍｇ２＋、Ｌｉ＋、Ｚｎ２＋およびＡｌ３＋などがある。ホフマイスター系列を参照するか、塩の水素結合自由エネルギー（ΔＧＨＢ）を調べれば、水中でのイオンの水素結合の程度を定量化する尺度を確立できる。例えば、コスモトロープＣＯ３
２－、およびＯＨ－のΔＧＨＢは０．１～０．４Ｊ／ｍｏｌであるのに対し、カオトロープＳＣＮ－のΔＧＨＢは－１．１～－０．９である。
【0031】
他の適切なコスモトロープには、非イオン性コスモトロープがあり、これは正味の電荷を持たないが、非常に溶けやすく、非常に水和する。このようなコスモトロープには、トレハロースやグルコースなどの炭水化物、多価アルコール、プロリン、ｔｅｒｔ－ブタノールなどが含まれる。
【0032】
本発明者らは、驚くべきことに、同種または異種発現によって繊毛虫宿主で生産された酵素は、事前のクロマトグラフィー精製を必要とせず、コスモトロープで処理した後、エフロレッセンス化と結晶形成によって簡単かつ容易に精製できることを示した。
【0033】
これは非常に驚くべきことである。先行技術の文献では、タンパク質、特にリパーゼを結晶化させる前に、タンパク質は、必ずクロマトグラフィー精製などの精製工程を経ているからである。この点に関しては、精製と製剤化のためのタンパク質の大規模結晶化について論じたＨｅｋｍａｔ（２０１５）などを参照されたい。
【0034】
しかし、著者は、結晶化がタンパク質の精製プロセスにおける１つ以上のクロマトグラフィー工程を置き換えることができることを理解しているが、研究され、最終的に結晶化されるタンパク質はすべて精製されたもの、すなわち、使用される前にクロマトグラフィー精製工程を経たものである。
【0035】
さらに、本発明者らは、こうして生産された酵素は、例えばいくつかの先行技術文献で示唆されているように、架橋する必要がないことを驚くべきことに示した。
【0036】
例えばＵＳ６３５９１１８Ｂ２は、糖鎖架橋糖タンパク質結晶の製造と使用を開示している。架橋は、例えばヘキサメチレンジアミン、ジアミノオクタン、またはエチレンジアミンのようなジアミン架橋剤を使用することによって達成されるのが好ましい。糖タンパク質は、好ましくはリパーゼであり、より好ましくはカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼである。このような架橋糖タンパク質結晶は、
・糖タンパク質骨格の構造的および機能的完全性を維持しながら、
・過酷な環境条件に対してより優れた安定性を示す
と言われており、
一方、架橋法は、糖タンパク質の濃度が、所定の大きさの分子に対して達成可能な理論的充填限界に近く、濃厚溶液であっても達成可能な収量を大幅に提供すると言われている。
・糖タンパク質骨格の構造的および機能的完全性を維持しながら、
・過酷な環境条件に対してより優れた安定性を示す
と言われており、
一方、架橋法は、糖タンパク質の濃度が、所定の大きさの分子に対して達成可能な理論的充填限界に近く、濃厚溶液であっても達成可能な収量を大幅に提供すると言われている。
【0037】
理論に束縛されることなく、本発明による方法が酵素を事前に架橋することなく優れた結果をもたらす理由の一つは、適切なプロモーターを使用することにより、同種および異種の酵素、特にリパーゼを含むタンパク質を繊毛虫で大量に発現させることができるという事実にあるのかもしれない。このようにして、高い収率が得られ、架橋工程（エフロレッセンス化後の収率を上げるための工程）を不要にすることができる。
【0038】
さらに、理論に束縛されることなく、本発明による方法が酵素の事前のクロマトグラフィー精製なしに卓越した結果をもたらす理由の一つは、繊毛虫は大量のタンパク質を細胞フリーの上清に分泌する能力があり、事前のクロマトグラフィーおよび／または架橋なしでも結晶化が可能であるという事実にあるのかもしれない。
【0039】
さらに、理論に束縛されることなく、本発明による方法が酵素を事前にクロマトグラフィーで精製することなく卓越した結果をもたらす理由の一つは、繊毛虫が非常に単純で均一なグリコシル化パターンを特徴とするタンパク質を産生するという事実にあるのかもしれない。図解は図１を参照。
【0040】
したがって、一実施形態では、タンパク質はグリコシル化タンパク質である。
【0041】
一般に、酵素を含む多くのタンパク質は、活性と安定性を維持するためにグリコシル化を必要とする。テトラヒメナ・リパーゼ１２０（本明細書の別の箇所で論じる）には、例えば２つの潜在的なｎ－グリコシル化部位がある（Ｎ６１、モチーフはＮＶ；Ｎ６７、モチーフはＮＳＴ）。
【0042】
この点に関しては、例えばＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（２００７）が、構造ゲノム解析には特別な問題があり、なぜなら、正しく折り畳むためにはグリコシル化が必要であることが多く、一方、化学的および立体構造の不均一性は一般に結晶化を阻害するからであると論じている。
【0043】
興味深いことに、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌは、タンパク質の発現中にグリコシル化処理阻害剤を使用することで、グリコシル化を回避し、結晶化を促進することを提案している。このような処理は、処理された酵素の化学物理学的および生理学的特性に重大な影響を及ぼし、その結果、活性および／または安定性が望ましくない形で失われる可能性がある。
【0044】
もちろん、酵素は原核生物の発現系でも生産できる。これらの系はタンパク質を全くグリコシル化しないので、こうして生成されたタンパク質は結晶化する際にも問題が少ないと思われる。しかしながら、グリコシル化を完全に欠くことは、このようにして生産された酵素の化学的・物理的および生理学的特性に重大な影響を及ぼし、その結果、活性および／または安定性の望ましくない欠如をもたらす可能性がある。
【0045】
このような観点から、理論に縛られることなく、繊毛虫が非常に単純で均一なグリコシル化パターン（図１参照）を特徴とするタンパク質を産生するという事実は、確かに結晶化を促進し、以前のクロマトグラフィー精製工程やグリコシル化処理阻害剤の使用を不要にするかもしれない。
本発明の一実施形態によると、コスモトロピック剤は
・硫酸アンモニウム、
・リン酸二水素ナトリウム、および／または
・ポリエチレングリコール
の少なくとも１つを有する。
本発明の一実施形態によると、コスモトロピック剤は
・硫酸アンモニウム、
・リン酸二水素ナトリウム、および／または
・ポリエチレングリコール
の少なくとも１つを有する。
【0046】
本発明の一実施形態によれば、使用されるポリエチレングリコールは、５０以上から１００００ｇ／ｍｏｌ以下の間のサイズ範囲を有する。
【0047】
さらなる実施形態において、使用されるポリエチレングリコールは、５０ｇ／ｍｏｌ以上；１００ｇ／ｍｏｌ以上；２００ｇ／ｍｏｌ以上；３００ｇ／ｍｏｌ以上；４００ｇ／ｍｏｌ以上；５００ｇ／ｍｏｌ以上；６００ｇ／ｍｏｌ以上；７００ｇ／ｍｏｌ以上；８００ｇ／ｍｏｌ以上；９００ｇ／ｍｏｌ以上；１０００ｇ／ｍｏｌ以上；１２００ｇ／ｍｏｌ以上；１４００ｇ／ｍｏｌ以上；１６００ｇ／ｍｏｌ以上；１８００ｇ／ｍｏｌ以上；２０００ｇ／ｍｏｌ以上；２２００ｇ／ｍｏｌ以上；２４００ｇ／ｍｏｌ以上；２６００ｇ／ｍｏｌ以上；２８００ｇ／ｍｏｌ以上；３０００ｇ／ｍｏｌ以上；３２００ｇ／ｍｏｌ以上；３４００ｇ／ｍｏｌ以上；３６００ｇ／ｍｏｌ以上；３８００ｇ／ｍｏｌ以上；４０００ｇ／ｍｏｌ以上；４２００ｇ／ｍｏｌ以上；４４００ｇ／ｍｏｌ以上；４６００ｇ／ｍｏｌ以上；４８００ｇ／ｍｏｌ以上；５０００ｇ／ｍｏｌ以上；５２００ｇ／ｍｏｌ以上；５４００ｇ／ｍｏｌ以上；５６００ｇ／ｍｏｌ以上；５８００ｇ／ｍｏｌ以上；６０００ｇ／ｍｏｌ以上；６２００ｇ／ｍｏｌ以上；６４００ｇ／ｍｏｌ以上；６６００ｇ／ｍｏｌ以上；６８００ｇ／ｍｏｌ以上；７０００ｇ／ｍｏｌ以上；７２００ｇ／ｍｏｌ以上；７４００ｇ／ｍｏｌ以上；７６００ｇ／ｍｏｌ以上；７８００ｇ／ｍｏｌ以上；８０００ｇ／ｍｏｌ以上；８２００ｇ／ｍｏｌ以上；８４００ｇ／ｍｏｌ以上；８６００ｇ／ｍｏｌ以上；８８００ｇ／ｍｏｌ以上；９０００ｇ／ｍｏｌ以上；９２００ｇ／ｍｏｌ以上；９４００ｇ／ｍｏｌ以上；９６００ｇ／ｍｏｌ以上；９８００ｇ／ｍｏｌ以上および／または１００００ｇ／ｍｏｌ以上のサイズ範囲を有する。
【0048】
さらなる実施形態において、使用されるポリエチレングリコールは、１００００ｇ／ｍｏｌ以下；９８００ｇ／ｍｏｌ以下；９６００ｇ／ｍｏｌ以下；９４００ｇ／ｍｏｌ以下；９２００ｇ／ｍｏｌ以下；９０００ｇ／ｍｏｌ以下；８８００ｇ／ｍｏｌ以下；８６００ｇ／ｍｏｌ以下；８４００ｇ／ｍｏｌ以下；８２００ｇ／ｍｏｌ以下；８０００ｇ／ｍｏｌ以下；７８００ｇ／ｍｏｌ以下；７６００ｇ／ｍｏｌ以下；７４００ｇ／ｍｏｌ以下；７２００ｇ／ｍｏｌ以下；７０００ｇ／ｍｏｌ以下；６８００ｇ／ｍｏｌ以下；６６００ｇ／ｍｏｌ以下；６４００ｇ／ｍｏｌ以下；６２００ｇ／ｍｏｌ以下；６０００ｇ／ｍｏｌ以下；５８００ｇ／ｍｏｌ以下；５６００ｇ／ｍｏｌ以下；５４００ｇ／ｍｏｌ以下；５２００ｇ／ｍｏｌ以下；５０００ｇ／ｍｏｌ以下；４８００ｇ／ｍｏｌ以下；４６００ｇ／ｍｏｌ以下；４４００ｇ／ｍｏｌ以下；４２００ｇ／ｍｏｌ以下；４０００ｇ／ｍｏｌ以下；３８００ｇ／ｍｏｌ以下；３６００ｇ／ｍｏｌ以下；３４００ｇ／ｍｏｌ以下；３２００ｇ／ｍｏｌ以下；３０００ｇ／ｍｏｌ以下；２８００ｇ／ｍｏｌ以下；２６００ｇ／ｍｏｌ以下；２４００ｇ／ｍｏｌ以下；２２００ｇ／ｍｏｌ以下；２０００ｇ／ｍｏｌ以下；１８００ｇ／ｍｏｌ以下；１６００ｇ／ｍｏｌ以下；１４００ｇ／ｍｏｌ以下；１２００ｇ／ｍｏｌ以下；１０００ｇ／ｍｏｌ以下；９００ｇ／ｍｏｌ以下；８００ｇ／ｍｏｌ以下；７００ｇ／ｍｏｌ以下；６００ｇ／ｍｏｌ以下；５００ｇ／ｍｏｌ以下；４００ｇ／ｍｏｌ以下；３００ｇ／ｍｏｌ以下；２００ｇ／ｍｏｌ以下；１００ｇ／ｍｏｌ以下および／または５０ｇ／ｍｏｌ以下のサイズ範囲を有する。
【0049】
本発明の一実施形態によれば、採取された細胞培養液は、０．０５以上から２００ｇ／ｌ以下の間のタンパク質を含む。
【0050】
いくつかの実施形態において、採取された細胞培養液は、０．０５ｇ／ｌ以上；０．１ｇ／ｌ以上；０．１５ｇ／ｌ以上；０．２ｇ／ｌ以上；０．３ｇ／ｌ以上；０．４ｇ／ｌ以上；０．５ｇ／ｌ以上；０．６ｇ／ｌ以上；０．７ｇ／ｌ以上；０．８ｇ／ｌ以上；０．９ｇ／ｌ以上；１ｇ／ｌ以上；２ｇ／ｌ以上；３ｇ／ｌ以上；４ｇ／ｌ以上；５ｇ／ｌ以上；６ｇ／ｌ以上；７ｇ／ｌ以上；８ｇ／ｌ以上；９ｇ／ｌ以上；１０ｇ／ｌ以上；１５ｇ／ｌ以上；２０ｇ／ｌ以上；２５ｇ／ｌ以上；３０ｇ／ｌ以上；３５ｇ／ｌ以上；４０ｇ／ｌ以上；４５ｇ／ｌ以上；５０ｇ／ｌ以上；５５ｇ／ｌ以上；６０ｇ／ｌ以上；６５ｇ／ｌ以上；７０ｇ／ｌ以上；７５ｇ／ｌ以上；８０ｇ／ｌ以上；８５ｇ／ｌ以上；９０ｇ／ｌ以上；９５ｇ／ｌ以上；１００ｇ／ｌ以上；１１０ｇ／ｌ以上；１２０ｇ／ｌ以上；１３０ｇ／ｌ以上；１４０ｇ／ｌ以上；１５０ｇ／ｌ以上；１６０ｇ／ｌ以上；１７０ｇ／ｌ以上；１８０ｇ／ｌ以上；１９０ｇ／ｌ以上；または２００ｇ／ｌ以上のタンパク質を含む。
【0051】
いくつかの実施形態において、採取された細胞培養液は、２００ｇ／ｌ以下；１９０ｇ／ｌ以下；１８０ｇ／ｌ以下；１７０ｇ／ｌ以下；１６０ｇ／ｌ以下；１５０ｇ／ｌ以下；１４０ｇ／ｌ以下；１３０ｇ／ｌ以下；１２０ｇ／ｌ以下；１１０ｇ／ｌ以下；１００ｇ／ｌ以下；９５ｇ／ｌ；９０ｇ／ｌ以下；８５ｇ／ｌ以下；８０ｇ／ｌ以下；７５ｇ／ｌ以下；７０ｇ／ｌ以下；６５ｇ／ｌ以下；６０ｇ／ｌ以下；５５ｇ／ｌ以下；５０ｇ／ｌ以下；４５ｇ／ｌ以下；４０ｇ／ｌ以下；３５ｇ／ｌ以下；３０ｇ／ｌ以下；２５ｇ／ｌ以下；２０ｇ／ｌ以下；１５ｇ／ｌ以下；１０ｇ／ｌ以下；９ｇ／ｌ以下；８ｇ／ｌ以下；７ｇ／ｌ以下；６ｇ／ｌ以下；５ｇ／ｌ以下；４ｇ／ｌ以下；３ｇ／ｌ；２ｇ／ｌ以下；１ｇ／ｌ以下；０，９ｇ／ｌ以下；０，８ｇ／ｌ以下；０，７ｇ／ｌ以下；０，６ｇ／ｌ以下；０，５ｇ／ｌ以下；０，４ｇ／ｌ以下；０，３ｇ／ｌ以下；０，２ｇ／ｌ以下；０，１５ｇ／ｌ以下；０，１ｇ／ｌ以下；または０，０５ｇ／ｌ以下のタンパク質を含む。
【0052】
本発明のいくつかの実施形態によれば、タンパク質をエフロレッセンス化するために、
・培地中のｐＨが５以上から８以下の間に設定され、および／または
・１０℃以上から４０℃以下の間の温度に設定される。
・培地中のｐＨが５以上から８以下の間に設定され、および／または
・１０℃以上から４０℃以下の間の温度に設定される。
【0053】
本発明の一実施形態によれば、採取された細胞培養液のインキュベーションのために、コスモトロピック塩濃度は５０以上から２５００ｍＭ以下の範囲に設定される。
【0054】
いくつかの実施形態において、コスモトロピック塩濃度は、５０ｍＭ以上；１００ｍＭ以上；１５０ｍＭ以上；２００ｍＭ以上；２５０ｍＭ以上；３００ｍＭ以上；３５０ｍＭ以上；４００ｍＭ以上；４５０ｍＭ以上；５００ｍＭ以上；５５０ｍＭ以上；６００ｍＭ以上；６５０ｍＭ以上；および７００ｍＭ以上であるように設定される。
【0055】
いくつかの実施形態において、コスモトロピック塩濃度は、２５００ｍＭ以下；２３００ｍＭ以下；２１００ｍＭ以下；２０００ｍＭ以下；１９００ｍＭ以下；１８００ｍＭ以下；１７００ｍＭ以下；１６００ｍＭ以下；１５００ｍＭ以下；１４００ｍＭ以下；１３００ｍＭ以下；１２００ｍＭ以下；１１００ｍＭ以下；および１０００ｍＭ以下であるように設定される。
【0056】
いくつかの実施形態において、コスモトロピック塩濃度は、５０ｍＭ以上と２５００ｍＭ以下の間；１００ｍＭ以上と２３００ｍＭ以下の間；１５０ｍＭ以上と２１００ｍＭ以下の間；２００ｍＭ以上と２０００ｍＭ以下の間；２５０ｍＭ以上と１９００ｍＭ以下の間；３００ｍＭ以上と１８００ｍＭ以下の間；３５０ｍＭ以上と１７００ｍＭ以下の間；４００ｍＭ以上と１６００ｍＭ以下の間；４５０ｍＭ以上と１５００ｍＭ以下の間；５００ｍＭ以上と１４００ｍＭ以下の間；５５０ｍＭ以上と１３００ｍＭ以下；６００ｍＭ以上と１２００ｍＭ以下；６５０ｍＭ以上と１１００ｍＭ以下の間；７００ｍＭ以上と１０００ｍＭ以下の間に設定される。
【0057】
好ましくは、これらの濃度範囲は硫酸アンモニウムおよび／またはリン酸二水素ナトリウムに適用される。
【0058】
一実施形態では、アミラーゼの結晶化のために、１００ｍＭ以上のコスモトロピック塩濃度が使用される。一実施形態では、リパーゼの結晶化には、コスモトロピック塩濃度３００ｍＭ以上を使用する。好ましくは、これらの濃度範囲は硫酸アンモニウムおよび／またはリン酸二水素ナトリウムに適用される。
【0059】
いくつかの実施形態では、コスモトロピック塩濃度は７００ｍＭ以上１Ｍ以下の範囲に設定される。好ましくは、これらの濃度範囲は硫酸アンモニウムおよび／またはリン酸二水素ナトリウムに適用される。
【0060】
本発明の一実施形態によれば、採取された細胞培養液のインキュベーションのために、ポリアルコール濃度は、２以上から２５ｗ／ｖ％以下の範囲に設定される。
【0061】
いくつかの実施形態において、ポリアルコール濃度は、２ｗ／ｖ％以上；２，５％以上；３％以上；３，５％以上；４％以上；４，５％以上；５％以上；５，５％以上；６％以上；６，５％以上；７％以上；７，５％以上；８％以上；８，５％以上；９％以上；９，５％以上；１０％以上；１０．５％以上；１１％以上；１１．５％以上；１２％以上；１２．５％以上；１３％以上；１３．５％以上；１４％以上；１４．５％以上；１５％以上；１５．５％以上；１６％以上；１６．５％以上；１７％以上；１７．５％以上；１８％以上；１８．５％以上；１９％以上；１９．５％以上および／または２０ｗ／ｖ％以上である。
【0062】
いくつかの実施形態において、ポリアルコール濃度は、２５ｗ／ｖ％以下；２４，５％以下；２４％以下；２３，５％以下；２３％以下；２２，５％以下；２２％以下；２１，５％以下；２１％以下；２０，５％以下；２０％以下；１９，５％以下；１９％以下；１８，５％以下；１８％以下；１７，５％以下；１７％以下；１６，５％以下；１６％以下；１５，５％以下；１５％以下；１４，５％以下；１４％以下；１３，５％以下；１３％以下；１２，５％以下；１２％以下；１１，５％以下；１１％以下；１０，５％以下および／または１０ｗ／ｖ％以下であるように設定される。
【0063】
好ましくは、これらの濃度範囲はポリエチレングリコールに適用される。
【0064】
いくつかの実施形態において、多価アルコールはＰＥＧ４０００（４０００ｇ／ｍｏｌ）である。好ましくは、６ ｗ／ｖ ％の濃度を設定する。
【0065】
いくつかの実施形態において、多価アルコールはＰＥＧ６０００（６０００ｇ／ｍｏｌ）である。好ましくは、６ ｗ／ｖ ％の濃度を設定する。
【0066】
上記の濃度範囲は決して拘束力を持つものではない、なぜなら本発明者らは、培地中のタンパク質濃度が高ければ高いほど、必要なコスモトロピック剤の濃度が低くなることに気づいたからである。
【0067】
本発明の一実施形態によれば、採取された細胞培養液とコスモトロピック剤とのインキュベーションは、１０分以上３６時間以下の期間にわたって行われる。
【0068】
本発明の一実施形態によれば、採取前の細胞培養液は、工程ａ）の前に１つ以上の濾過及び／又は遠心分離工程に供され、採取された細胞培養液を得る。
【0069】
このような濾過には、以下の少なくとも１つが含まれる：
・ＣＣＦから細胞を除去するための精密ろ過、例えば中空糸クロスフローろ過システム（０．４～０．８μｍのサイズ排除）
・より小さなペプチドや不純物を除去するために、限外濾過と、任意選択により、それに続くダイアフィルトレーション。
・ＣＣＦから細胞を除去するための精密ろ過、例えば中空糸クロスフローろ過システム（０．４～０．８μｍのサイズ排除）
・より小さなペプチドや不純物を除去するために、限外濾過と、任意選択により、それに続くダイアフィルトレーション。
【0070】
このような遠心分離には、例えばＷｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒが提供するような遠心分離機または遠心分離器の使用が含まれる。一実施形態では、適用される少なくとも１つのフィルターは、精製されるそれぞれのタンパク質に適合する分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する。
【0071】
一実施形態では、適用される少なくとも一つのフィルターは、５０ｋｄ以下の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する。
【0072】
さらなる実施形態において、適用される少なくとも１つのフィルターは、４９ｋＤａ以下；４８ｋＤａ以下；４７ｋＤａ以下；４６ｋＤａ以下；４５ｋＤａ以下；４４ｋＤａ以下；４３ｋＤａ以下；４２ｋＤａ以下；４１ｋＤａ以下；４０ｋＤａ以下；３９ｋＤａ以下；３８ｋＤａ以下；３７ｋＤａ以下；３６ｋＤａ以下；３５ｋＤａ以下；３４ｋＤａ以下；３３ｋＤａ以下；３２ｋＤａ以下；３１ｋＤａ以下；３０ｋＤａ以下；２９ｋＤａ以下；２８ｋＤａ以下；２７ｋＤａ以下；２６ｋＤａ以下；２５ｋＤａ以下；２４ｋＤａ以下；２３ｋＤａ以下；２２ｋＤａ以下；２１ｋＤａ以下；２０ｋＤａ以下；１９ｋＤａ以下；１８ｋＤａ以下；１７ｋＤａ以下；１６ｋＤａ以下；１５ｋＤａ以下；１４ｋＤａ以下；１３ｋＤａ以下；１２ｋＤａ以下；１１ｋＤａ以下；１０ｋＤａ以下；９ｋＤａ以下、好ましくは８ｋＤａ以下の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する。
【0073】
この文脈では、分子量カットオフがシグナルペプチドを含まないタンパク質の分子量に適合していることを理解することが重要である。さらに、酵素は、例えばプロテアーゼＣＣＰ５（１２ｋＤａの活性断片を形成する）のように、酵素活性を保持する酵素活性断片を形成しうることが過去に示されている。
【0074】
本発明の一実施形態によれば、繊毛虫宿主はテトラヒメナ属の種（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｓｐ．）である。
【0075】
一実施形態では、繊毛虫宿主はテトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）である。この文脈において、テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）は、例えばＷｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．２００６やＥＰ１３５０８３８（ＵＳ６９６２８００）（その内容は参照により本明細書に援用される）に記載されているように、異種または同種タンパク質発現産生のための発現宿主として使用されてきた。
【0076】
一般に、本発明の文脈で使用することができる、テトラヒメナを含む繊毛虫の形質転換のための方法は、特にマイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよび微粒子銃からなり、例えば、Ｔｏｎｄｒａｖｉ ＆ Ｙａｏ （１９８６）， Ｇａｅｒｔｉｇ ＆ Ｇｏｒｏｖｓｋｙ （１９９２） ａｎｄ Ｃａｓｓｉｄｙ－Ｈａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ （１９９７） に記載されている。
【0077】
形質転換および異種タンパク質発現の方法は、少数の原生生物について記載されている（ＷＯ ００／５８４８３ および ＷＯ ００／４６３８１）。繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）の分裂安定形質転換体の作製は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、または微粒子銃による体細胞大核または生殖系小核（ｓｏｍａｔｉｃ ｍａｃｒｏｎｕｃｌｅｕｓ ｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅｕｓ）のいずれかのトランスフェクション後に達成することができる。
【0078】
形質転換体の選択は、ネオマイシン耐性（Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．２００６， ＢＭＣ）のような異なる選択マーカーを用いて行うことができ、相同ＤＮＡ組み換えによって異種遺伝子を組み込むことで、安定したチミジン栄養要求性のテトラヒメナ細胞を得ることができる（Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．２００６， ＢＭＣ）。また、ブラストサイジンＳ（Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．２００７， ＢＭＣ）またはパクリタキセル（ＷＯ ００／４６３８１ ）耐性も考慮されている。
【0079】
繊毛虫におけるタンパク質発現に適したプロモーターは、例えば、本発明の出願人に登録されているＵＳ２００８２６１２９０Ａ１に開示されており、その内容は参照することにより本明細書に援用される。そこでは、本発明の目的にも使用できる熱誘導性プロモーターとメタロチオネインプロモーターが開示されている。
【0080】
本発明の一実施態様によれば、同種発現または異種発現は、
・メタロチオネイン遺伝子（ＭＴＴ１）誘導性プロモーター、および／または
・熱誘導性プロモーター
の制御下にある。
・メタロチオネイン遺伝子（ＭＴＴ１）誘導性プロモーター、および／または
・熱誘導性プロモーター
の制御下にある。
【0081】
前記ＭＴＴ１誘導性プロモーターは、例えば、ＷＯ２００３００６４８０Ａ１（ＵＳ２００３００２７１９２Ａ１）に開示されており、その内容は、実施可能性の目的で本明細書に組み込まれる。
【0082】
前記熱誘導性プロモーターは、例えば、ＥＰ１９０２１３８Ｂ１（ＵＳ７７２３５０６Ｂ２）に開示されており、その内容は、実施可能性の目的で本明細書に組み込まれる。
【0083】
本発明の一実施形態によると、タンパク質は酵素である。
【0084】
さらなる実施形態によれば、酵素は、
・リパーゼ
・プロテアーゼ
・アミラーゼ
・グルテナーゼ
・グルタミン特異的システイン・プロテアーゼ
・プロリルエンドペプチダーゼ
・サッカラーゼ、および／または
・ラクターゼ
からなる群から選択される少なくとも１つである。
・リパーゼ
・プロテアーゼ
・アミラーゼ
・グルテナーゼ
・グルタミン特異的システイン・プロテアーゼ
・プロリルエンドペプチダーゼ
・サッカラーゼ、および／または
・ラクターゼ
からなる群から選択される少なくとも１つである。
【0085】
リパーゼ、アミラーゼまたはプロテアーゼは、例えば、膵外分泌機能不全の治療のための膵酵素補充療法（ＰＥＲＴ）に用いることができる。膵外分泌機能不全には以下のような原因がある：
【0086】
このような治療では、患者はしばしば大量の酵素を必要とし、経口投与される。標準的な治療法は、豚膵臓ホモジネート（すなわち，リパーゼ含量が変化する非常に複雑な製品）を顆粒状にしてカプセルとして提供するもので、患者は１日平均２．５ｇ（１カプセル３００ｍｇ×８カプセル）あるいはそれ以上（５０カプセルまで服用しなければならない患者もいるという報告もある）を服用しなければならない。これは、年間約１ｋｇの製品となり、クロマトグラフィーによる精製が製品コストを過度に押し上げるという事実を強調している。
本発明の一実施形態によると、酵素は以下である：
ａ） 配列番号１～３または８～１０のいずれか１つに記載のテトラヒメナ・リパーゼ、
ｂ） 配列番号４または１１に記載のテトラヒメナ・アミラーゼ、
ｃ） 配列番号５～７、１２～１４または１５～１７のいずれかに記載のテトラヒメナ・プロテアーゼ、または
ｄ） （ｉ）上記の酵素のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、上記の酵素のいずれか１つの変異体であって、ここで前記変異体は酵素機能を保持するもの、および／または
（ｉｉ）上記の酵素のいずれか１つのＮ末端および／またはＣ末端で１から３個のアミノ酸残基が除去または付加された変異体。
本発明の一実施形態によると、酵素は以下である：
ａ） 配列番号１～３または８～１０のいずれか１つに記載のテトラヒメナ・リパーゼ、
ｂ） 配列番号４または１１に記載のテトラヒメナ・アミラーゼ、
ｃ） 配列番号５～７、１２～１４または１５～１７のいずれかに記載のテトラヒメナ・プロテアーゼ、または
ｄ） （ｉ）上記の酵素のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、上記の酵素のいずれか１つの変異体であって、ここで前記変異体は酵素機能を保持するもの、および／または
（ｉｉ）上記の酵素のいずれか１つのＮ末端および／またはＣ末端で１から３個のアミノ酸残基が除去または付加された変異体。
【0087】
配列番号１はＵｎｉＰｒｏｔ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒで公開されているテトラヒメナ・リパーゼ１２０の配列である：Ｑ２３７Ｓ４（ＴＴＨＥＲＭ＿００３２０１２０）．これは、特にＷＯ２０１６１１６６００Ａ１（ＵＳ１０５９０４０２Ｂ２）ですでに議論されており、現在、膵酵素補充療法（ＰＥＲＴ）の前臨床評価中である。
【0088】
さらなる酵素について以下に詳述する。配列番号１～７の各々はシグナルペプチドを持つ酵素を示す。配列番号８－１４はシグナルペプチドを持たない酵素を指す。配列番号１５－１７はプロペプチドを持たないプロテアーゼ酵素を指す。
【0089】
本明細書中「配列同一性のパーセンテージ」は、比較窓上で２つの最適に並べられた生物配列（アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列）を比較することによって決定され、ここで、比較窓における対応する配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、付加または欠失を含まない参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致位置の数を得、一致位置の数を比較窓における位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【0090】
用語「同一」又はパーセント「同一性」は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して、同じ配列である２つ以上の配列若しくはサブ配列を指す。２つの配列が、下記の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または手動アラインメントと目視検査によって測定された比較ウィンドウ、または指定領域にわたって最大対応となるように比較およびアラインメントしたときに、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが指定された割合（すなわち、指定領域にわたって少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性、または指定しない場合は、参照配列全体）であれば「実質同一」であるとする。本開示は、本明細書に例示されるポリペプチドと実質的に同一であるポリペプチドを提供する。アミノ酸配列に関して、同一性または実質的同一性は、長さが少なくとも５、１０、１５または２０アミノ酸、場合によっては長さが少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５または１００アミノ酸、場合によっては長さが少なくとも約１５０、２００または２５０アミノ酸、または参照配列の全長にわたる領域にわたって存在することができる。より短いアミノ酸配列、例えば２０以下のアミノ酸配列に関しては、本明細書で定義される保存的置換に従って、１または２個のアミノ酸残基が保存的に置換された場合、実質的な同一性が存在する。
【0091】
一実施形態によれば、本方法は、エフロレッセンス化タンパク質を可溶化する工程をさらに含む。このようにして精製されたタンパク質は、再び溶液に移される。これは、非経口投与など、可溶性タンパク質が必要とされる用途に有用であろう。経腸投与などの他の用途では、タンパク質のエフロレッセンス化形態を使用することができる。
【0092】
本発明の別の態様によれば、上記の説明による方法で得られた医薬中間体が提供される。一般的な定義によれば、医薬中間体とは、合成または生物発酵によって得られる原料薬物またはプロドラッグのことで、患者に投与可能な医薬製剤を製造するための原料として使用される。そのためには、医薬中間体はさらなる分子変化や加工を受けなければならない。
【0093】
したがって、本発明の文脈では、このような中間体は、上記の説明による方法によって直接的または間接的に得られたが、それ自体はまだ患者に投与する準備ができていない製品として定義される。つまり、この中間体は、医薬製剤を製造するために使用される。ある面ではプロドラッグともいえる。このような中間体は、上記のように可溶化した形態や、エフロレッセンス化（＝結晶化）した形態をとることができる。
【0094】
したがって、一実施形態によれば、医薬中間体は、エフロレッセンス化タンパク質の可溶化形態またはエフロレッセンス化タンパク質そのものを含む。
【0095】
本発明の別の態様によれば、上記の説明による方法で得られた精製タンパク質または医薬中間体が提供される。
【0096】
本発明の別の側面によれば、繊毛虫型グリコシル化パターンを含む精製され、結晶化されたタンパク質または医薬中間体が提供される。本明細書で論じたように、繊毛虫は非常に単純で均一なグリコシル化パターンを特徴とするタンパク質を産生する。これは他の分類群に比べユニークである。
【0097】
特に、繊毛虫型グリコシル化パターンは、以下の少なくとも１つである。
・フコースなし
・キシロースなし
・マンノースに乏しい
・ガラクトースなし
・Ｎ－アセチルノイラミン酸なし、および／または
・Ｎ－グリクリルノイラミン酸（Ｎ－ｇｌｙｃｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）なし、
図解は図１を参照。このようなタンパク質は、例えば、上記の説明による方法で得ることができる。
・フコースなし
・キシロースなし
・マンノースに乏しい
・ガラクトースなし
・Ｎ－アセチルノイラミン酸なし、および／または
・Ｎ－グリクリルノイラミン酸（Ｎ－ｇｌｙｃｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）なし、
図解は図１を参照。このようなタンパク質は、例えば、上記の説明による方法で得ることができる。
【0098】
上記の酵素のいずれか１つの変異体であって、本発明の一実施形態によれば、中間体またはタンパク質は、以下の少なくとも１つであるか、またはこれらを含む：
ａ） 配列番号１～３または８～１０のいずれか１つに記載のテトラヒメナ・リパーゼ、
ｂ） 配列番号４または１１に記載のテトラヒメナ・アミラーゼ、
ｃ） 配列番号５～７、１２～１４または１５～１７のいずれかに記載のテトラヒメナ・プロテアーゼ、または
ｄ） （ｉ）上記の酵素のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、上記の酵素のいずれか１つの変異体であって、ここで前記変異体は酵素機能を保持するもの、および／または（ｉｉ）上記の酵素のいずれか１つのＮ末端および／またはＣ末端で１から３個のアミノ酸残基が除去または付加された変異体
ａ） 配列番号１～３または８～１０のいずれか１つに記載のテトラヒメナ・リパーゼ、
ｂ） 配列番号４または１１に記載のテトラヒメナ・アミラーゼ、
ｃ） 配列番号５～７、１２～１４または１５～１７のいずれかに記載のテトラヒメナ・プロテアーゼ、または
ｄ） （ｉ）上記の酵素のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、上記の酵素のいずれか１つの変異体であって、ここで前記変異体は酵素機能を保持するもの、および／または（ｉｉ）上記の酵素のいずれか１つのＮ末端および／またはＣ末端で１から３個のアミノ酸残基が除去または付加された変異体
【0099】
本発明の別の実施態様によれば、中間体またはタンパク質は、以下の表に示す群から選択される酵素であるか、またはそれらを含む：
【0100】
これらの酵素は経口酵素補充療法に使用され、膵臓酵素補充療法と同様に大量に必要とされるため、本明細書に記載した結晶化プロセスのように、費用対効果の高い発現・精製技術が有利となる。
【0101】
本発明の一実施形態によれば、中間体またはタンパク質は結晶形態で提供される。
【0102】
本発明の一実施形態によれば、中間体またはタンパク質は、８０％以上の純度等級を有する。
【0103】
本発明の一実施形態によれば、中間体またはタンパク質のタンパク質結晶は、２以上から１０００μｍ以下の間の長さを有する。
【0104】
本発明の一実施形態によれば、中間体またはタンパク質のタンパク質結晶は、０．０５μｍ以上から１０μｍ以下の間の直径を有する。
【0105】
本発明の別の態様によれば、上記の説明による中間体またはタンパク質を含み、任意にさらに１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬製剤が提供される。
【0106】
本発明のいくつかの実施形態によれば、タンパク質は酵素である。
【0107】
本発明のさらなる実施形態によれば、酵素は、以下からなる群から選択される少なくとも１つである。
・リパーゼ
・プロテアーゼ
・アミラーゼ
・グルテナーゼ
・グルタミン特異的システイン・プロテアーゼ
・プロリルエンドペプチダーゼ
・サッカラーゼ、および／または
・ラクターゼ。
・リパーゼ
・プロテアーゼ
・アミラーゼ
・グルテナーゼ
・グルタミン特異的システイン・プロテアーゼ
・プロリルエンドペプチダーゼ
・サッカラーゼ、および／または
・ラクターゼ。
【0108】
さらなる実施形態において、酵素は
ａ） 配列番号１～３または８～１０のいずれか１つに記載のテトラヒメナ・リパーゼ、
ｂ） 配列番号４または１１に記載のテトラヒメナ・アミラーゼ、
ｃ） 配列番号５～７、１２～１４または１５～１７のいずれかに記載のテトラヒメナ・プロテアーゼ、または
ｄ） （ｉ）上記の酵素のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、上記の酵素のいずれか１つの変異体であって、ここで前記変異体は酵素機能を保持するもの、および／または（ｉｉ）上記の酵素のいずれか１つのＮ末端および／またはＣ末端で１から３個のアミノ酸残基が除去または付加された変異体。
ａ） 配列番号１～３または８～１０のいずれか１つに記載のテトラヒメナ・リパーゼ、
ｂ） 配列番号４または１１に記載のテトラヒメナ・アミラーゼ、
ｃ） 配列番号５～７、１２～１４または１５～１７のいずれかに記載のテトラヒメナ・プロテアーゼ、または
ｄ） （ｉ）上記の酵素のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、上記の酵素のいずれか１つの変異体であって、ここで前記変異体は酵素機能を保持するもの、および／または（ｉｉ）上記の酵素のいずれか１つのＮ末端および／またはＣ末端で１から３個のアミノ酸残基が除去または付加された変異体。
【0109】
リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ活性をモジュール式に組み立てることが可能なため、さまざまな病態の患者、ひいてはさまざまな投薬が必要な患者に製剤を適応させることができる。例えば、ムコビシドースを持つ子供にとって、アミラーゼの含有量が多いことは望ましくない。プロテアーゼは急性膵炎または活動性の慢性膵炎の患者には禁忌である。そして第四に、真菌由来のリパーゼとは対照的に、この製剤は生理的濃度の胆汁酸によって活性化される。
【0110】
本発明の別の態様によれば、上記記載に係る酵素または医薬製剤は、酵素欠乏または機能不全によって引き起こされる障害と診断されているか、罹患しているか、または発症する危険性があるヒトまたは動物の対象の治療に使用するために（医薬品の製造のために）提供される。
【0111】
この文言は、一部の国で受け入れられているスイスタイプのクレーム文言（この場合、括弧はないものとみなされる）と、ＥＰＣ２０００の文言（この場合、括弧と括弧内の内容はないものとみなされる）の両方を包含するものとみなされる。
【0112】
本発明の別の態様によれば、酵素の欠乏または機能不全によって引き起こされる障害を処置または予防するための方法が提供され、この方法は、ヒトまたは動物対象に、治療上十分な用量の上記の説明による酵素または薬学的調製物を投与することを含む。
【0113】
さらなる実施形態によれば、酵素欠乏または機能不全によって引き起こされる障害は、
・脂質消化不全および／または消化障害
・酵素の欠乏または機能不全による障害。
・膵外分泌機能不全であって、次のような原因が考えられるもの：
・慢性膵炎
・嚢胞性線維症
・主膵管閉塞
・膵臓切除
・胃切除
・短腸症候群
・遺伝性ヘモクロマトーシス
・セリアック病
・ゾリンジャー・エリソン症候群
からなる群から選択される少なくとも１つである。
・脂質消化不全および／または消化障害
・酵素の欠乏または機能不全による障害。
・膵外分泌機能不全であって、次のような原因が考えられるもの：
・慢性膵炎
・嚢胞性線維症
・主膵管閉塞
・膵臓切除
・胃切除
・短腸症候群
・遺伝性ヘモクロマトーシス
・セリアック病
・ゾリンジャー・エリソン症候群
からなる群から選択される少なくとも１つである。
【0114】
一実施形態では、前記使用において、消化障害は膵外分泌機能不全（ＥＰＩ）である。このような膵外分泌機能不全は、特に嚢胞性線維症、膵管閉塞、膵臓切除術によって引き起こされることがある。
【0115】
他の１つの実施形態によれば、炎症状態は、膵臓の慢性炎症（膵炎）または炎症性腸疾患である。
【0116】
その他の消化器系疾患としては、脂肪便、セリアック病、消化障害などがある。
【0117】
ＥＰＩとは、膵臓で作られる消化酵素の不足により、食物を適切に消化できない状態を指す。ＥＰＩは、嚢胞性線維症やシュワックマン・ダイヤモンド症候群に罹患したヒトにみられ、消化酵素を作る膵臓の細胞が徐々に失われることによって引き起こされる；消化酵素が失われると、消化不良が起こり、正常な消化過程から栄養素が吸収されなくなる。慢性膵炎はヒトにおけるＥＰＩの最も一般的な原因である。
【0118】
脂肪便とは、便中に脂肪が過剰に含まれている状態をいう。便はまた、過剰な脂質のために浮遊し、油っぽく見え、特に悪臭を放つことがある。油性の肛門漏れやある程度の便失禁が起こることもある。脂肪排泄が増加し、これは糞便中の脂肪レベルを測定することでわかる。どの程度の糞便脂肪が脂肪便となるかの定義は標準化されていない。
【0119】
消化不良は、患者が高脂肪食の後に腹部膨満感、ガス、満腹感に悩まされる症状である。このような症状は、一般的に過敏性腸症候群（ＩＢＳ）と関連しているため、一部の研究者は、膵酵素がＩＢＳの症状の治療に役立つのではないかと推測している。しかし、研究は行われていない。
【0120】
一実施形態では、前記使用において、脂質消化不全はリポ蛋白リパーゼ欠損症であり、これはリポ蛋白リパーゼをコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされる状態である。
【0121】
本発明のさらに別の実施態様によれば、嚢胞性線維症の治療のための、上記の説明による２種以上のリパーゼ酵素の組み合わせ、または後者を含む医薬製剤の使用が提供される。
【0122】
嚢胞性線維症は、体内で異常に濃く粘り気のある粘液を産生する遺伝性の疾患である。粘液が膵酵素の腸への到達を阻害するため、患者はしばしば栄養不足に陥る。リパーゼを摂取することは、これらの患者が食物から摂取する栄養を改善するのに役立つ。
【0123】
さらなる実施形態によれば、酵素欠乏または機能不全によって引き起こされる障害は、
・セリアックスプルー
・スクロース不耐症または遺伝性スクロースイソマルターゼ欠損症（ＧＳＩＤ）、および／または
・乳糖不耐症
からなる群から選択される少なくとも１つである。
・セリアックスプルー
・スクロース不耐症または遺伝性スクロースイソマルターゼ欠損症（ＧＳＩＤ）、および／または
・乳糖不耐症
からなる群から選択される少なくとも１つである。
【0124】
本明細書の他の箇所で述べたように、これらの疾患は、本明細書に開示した方法で製造したそれぞれの酵素を用いた経口酵素補充療法によって有利に治療することができる。
【0125】
本発明の別の態様によれば、上記の説明によるタンパク質または薬学的調製物を含む投与ユニットが提供される。
【0126】
一実施形態では、このような投与ユニットは、経口投与に適した実体で提供される。
【0127】
いくつかの実施形態において、前記投与ユニットは、カプセル、錠剤、または小袋である。
【実施例】
【0128】
本発明は図面および前記の説明において詳細に図示および説明されてきたが、そのような図示および説明は例示または例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明は開示された実施形態に限定されない。開示される実施形態に対する他の変形形態は、図面、開示、及び添付の特許請求の範囲の研究から、請求される発明を実施する際に当業者によって理解され、実施され得る。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、他の要素又は工程を排除するものではなく、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」は複数形を除外するものではない。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組合せを使用して利益を得ることができないことを示すものではない。特許請求の範囲のどの引用符号も、範囲を限定すると解釈するべきではない。
【0129】
本明細書に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端まで示される；本明細書に開示される全ての核酸配列は、５′－＞３′で示される。
１．硫酸アンモニウムを用いたＴ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ由来リパーゼの結晶化
材料及び方法
培地
標準複合培地
発酵のためのパロモマイシン濃度：
２ μｇ／ｍｌ パロモマイシン
バッファー
硫酸アンモニウムのストック溶液
２０ｍＭリン酸－クエン酸塩
４Ｍ硫酸アンモニウム
ｐＨ６．０
洗浄バッファー
２０ｍＭリン酸－クエン酸塩
０．７Ｍ硫酸アンモニウム
ｐＨ７．０
クエン酸塩／リン酸塩バッファー
２０ｍＭリン酸－クエン酸塩
ｐＨ７．０
機械：
ソフトウェア
１．硫酸アンモニウムを用いたＴ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ由来リパーゼの結晶化
材料及び方法
培地
標準複合培地
発酵のためのパロモマイシン濃度：
２ μｇ／ｍｌ パロモマイシン
バッファー
硫酸アンモニウムのストック溶液
２０ｍＭリン酸－クエン酸塩
４Ｍ硫酸アンモニウム
ｐＨ６．０
洗浄バッファー
２０ｍＭリン酸－クエン酸塩
０．７Ｍ硫酸アンモニウム
ｐＨ７．０
クエン酸塩／リン酸塩バッファー
２０ｍＭリン酸－クエン酸塩
ｐＨ７．０
機械：
【0130】
トランスフォーメーション
細胞基質（Ｔｔ＿ｐＡＸ＿ｈｎ＿ＭＴＴ１＿Ｔｔｈｅｒｍ＿００３２０１２０＿Ｋ１２）の生成のために、エピソームベクターｐＡＸ＿ｈｎ＿ＭＴＴ１＿Ｔｔｈｅｒｍ＿００３２０１２０（Ｃｉｌｉａｎ ＡＧにより提供）を、Ｃａｓｓｉｄｙ－Ｈａｎｌｅｙら（１９９７）に以前に記載されたように行われた生物学的形質転換の方法によって、結合親細胞Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ Ｂ １８６８．７およびＴ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＳＢ １９６９に挿入した。
細胞基質（Ｔｔ＿ｐＡＸ＿ｈｎ＿ＭＴＴ１＿Ｔｔｈｅｒｍ＿００３２０１２０＿Ｋ１２）の生成のために、エピソームベクターｐＡＸ＿ｈｎ＿ＭＴＴ１＿Ｔｔｈｅｒｍ＿００３２０１２０（Ｃｉｌｉａｎ ＡＧにより提供）を、Ｃａｓｓｉｄｙ－Ｈａｎｌｅｙら（１９９７）に以前に記載されたように行われた生物学的形質転換の方法によって、結合親細胞Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ Ｂ １８６８．７およびＴ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＳＢ １９６９に挿入した。
【0131】
細胞培養／発酵
Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａのバッチ発酵は、Ｔｅｃｈｆｏｒｓ Ｔ９００ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ（Ｉｎｆｏｒｓ， Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ－Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用い、６００リットルのスケールで行った。発酵槽に１０×１０３細胞／ｍｌを接種し、ＳＰＰ培地で培養した。温度は３０℃に維持され、ｐＯ２は攪拌機の回転数（５０～１０５ｒｐｍ）と空気流量（０．１～０．３ｖｖｍ）によって空気飽和度の２０％に制御された。発酵中、ｐＨは７．０に調整された。対数期の培養に１０μｇ／ｍｌの塩化カドミウムを添加し、リパーゼ発現を誘導した。
Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａのバッチ発酵は、Ｔｅｃｈｆｏｒｓ Ｔ９００ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ（Ｉｎｆｏｒｓ， Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ－Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用い、６００リットルのスケールで行った。発酵槽に１０×１０３細胞／ｍｌを接種し、ＳＰＰ培地で培養した。温度は３０℃に維持され、ｐＯ２は攪拌機の回転数（５０～１０５ｒｐｍ）と空気流量（０．１～０．３ｖｖｍ）によって空気飽和度の２０％に制御された。発酵中、ｐＨは７．０に調整された。対数期の培養に１０μｇ／ｍｌの塩化カドミウムを添加し、リパーゼ発現を誘導した。
【0132】
採取とろ過／ＵＳＰ
誘導後２４時間後、中空糸モジュール（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＰＥＳ、内腔０．５ ｍｍ、面積２．９ｍ２、カットオフ０．５ μｍ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州ランチョ・ドミンゲス）を用いた濾過により、６００ ｌの培養液から５５０ ｌの上清を得た。Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔタンジェンシャルフローカセット（３０ ｋＤａカットオフ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、ドイツ、ゲッティンゲン）を用いて、濾液を６ ｌに濃縮した。濃縮終了後、濃縮液をバッファー（クエン酸－リン酸塩、ｐＨ７．０）で洗浄し、直ちに－８０℃で凍結した。
誘導後２４時間後、中空糸モジュール（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＰＥＳ、内腔０．５ ｍｍ、面積２．９ｍ２、カットオフ０．５ μｍ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州ランチョ・ドミンゲス）を用いた濾過により、６００ ｌの培養液から５５０ ｌの上清を得た。Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔタンジェンシャルフローカセット（３０ ｋＤａカットオフ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、ドイツ、ゲッティンゲン）を用いて、濾液を６ ｌに濃縮した。濃縮終了後、濃縮液をバッファー（クエン酸－リン酸塩、ｐＨ７．０）で洗浄し、直ちに－８０℃で凍結した。
【0133】
結晶化実験
リパーゼタンパク質の結晶化は、タンパク質濃縮液に適切な結晶化試薬を加えて行った。濃縮・ダイアフィルトレーションした発酵ブロスのタンパク質濃度は４６．６９ｍｇ／ｍｌであった。濃縮液を硫酸アンモニウムストック溶液と混合し、硫酸アンモニウムの最終濃度を０．３Ｍ （図１）とした。この懸濁液を室温で２０時間インキュベートした。その後、懸濁液の硫酸アンモニウム濃度を１Ｍに増やした。 調製した懸濁液をさらに室温で２時間インキュベートした。結晶化ブロスを１，９００ｘｇで１０分間遠心した（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｌｙｎｘ ６０００ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ； Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ）。上清を捨て、残った結晶ペレットをラミネートし洗浄バッファーでほぐした。この懸濁液を１，９００ｘｇで１０分間再度遠心した。全てにおいて、結晶ペレットは２回洗浄し、上清は廃棄した。最後の遠心分離は２，５００ ｘ ｇで２０分間行った。 湿った結晶ペレットは、さらなる調査のために－２０℃で保存した。
リパーゼタンパク質の結晶化は、タンパク質濃縮液に適切な結晶化試薬を加えて行った。濃縮・ダイアフィルトレーションした発酵ブロスのタンパク質濃度は４６．６９ｍｇ／ｍｌであった。濃縮液を硫酸アンモニウムストック溶液と混合し、硫酸アンモニウムの最終濃度を０．３Ｍ （図１）とした。この懸濁液を室温で２０時間インキュベートした。その後、懸濁液の硫酸アンモニウム濃度を１Ｍに増やした。 調製した懸濁液をさらに室温で２時間インキュベートした。結晶化ブロスを１，９００ｘｇで１０分間遠心した（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｌｙｎｘ ６０００ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ； Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ）。上清を捨て、残った結晶ペレットをラミネートし洗浄バッファーでほぐした。この懸濁液を１，９００ｘｇで１０分間再度遠心した。全てにおいて、結晶ペレットは２回洗浄し、上清は廃棄した。最後の遠心分離は２，５００ ｘ ｇで２０分間行った。 湿った結晶ペレットは、さらなる調査のために－２０℃で保存した。
【0134】
顕微鏡写真は、Ｍｏｔｉｃ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＡＥ２０００と対応する評価ソフトウェアＭｏｔｉｃ Ｉｍａｇｅｓ Ｐｌｕｓ ３．０を使用して実施した。結晶懸濁液２０μｌを顕微鏡用スライドグラスに移し、スライドグラスで覆った。調製した懸濁液を、数回の増幅（１０倍、２０倍、４０倍）を行って目視検査した。長さと幅は評価ソフトを使って測定した。
【0135】
ローダミンアッセイ
脂肪分解活性は、Ｊｅｔｔｅらによって発表されたローダミン－トリグリセリド－アガロースアッセイに基づいて測定された。 オリジナルのプロトコールとは対照的に、トリグリセリド－アガロース混合物は基質としてオリーブ油に置き換えられている。活性型リパーゼはトリグリセリドをグリセロールと遊離脂肪酸に分解する。これらの脂肪酸はローダミンＢと結合し、励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３５ｎｍで検出できる。試料は、許容可能な消光ができるように希釈しなければならない。こうして希釈されたサンプルは、マイクロタイタープレートでオリーブオイルのローダミン混合液と混合される。その後、サンプルをマイクロタイタープレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１； ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ）で３０℃で２０分間インキュベートした。蛍光は５０秒ごとに２０分間測定された。最後に、測定された活性を基準標準物質の活性に従って計算した。
脂肪分解活性は、Ｊｅｔｔｅらによって発表されたローダミン－トリグリセリド－アガロースアッセイに基づいて測定された。 オリジナルのプロトコールとは対照的に、トリグリセリド－アガロース混合物は基質としてオリーブ油に置き換えられている。活性型リパーゼはトリグリセリドをグリセロールと遊離脂肪酸に分解する。これらの脂肪酸はローダミンＢと結合し、励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３５ｎｍで検出できる。試料は、許容可能な消光ができるように希釈しなければならない。こうして希釈されたサンプルは、マイクロタイタープレートでオリーブオイルのローダミン混合液と混合される。その後、サンプルをマイクロタイタープレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１； ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ）で３０℃で２０分間インキュベートした。蛍光は５０秒ごとに２０分間測定された。最後に、測定された活性を基準標準物質の活性に従って計算した。
【0136】
ランバート・ビア アッセイ
リパーゼタンパク質の純度が高いと仮定し、タンパク質濃度はランバート・ビールの法則に基づいて決定された。吸光度を２８０ｎｍで測定し、式（ｉ）に基づいてタンパク質濃度を算出した。消衰係数は、インシリコ予測ツールＰｒｏｔｐａｒａｍを用いて求めた。
式１：ελ＝ モル吸光率； ｃ＝モル濃度； ｄ＝層の厚さ
リパーゼタンパク質の純度が高いと仮定し、タンパク質濃度はランバート・ビールの法則に基づいて決定された。吸光度を２８０ｎｍで測定し、式（ｉ）に基づいてタンパク質濃度を算出した。消衰係数は、インシリコ予測ツールＰｒｏｔｐａｒａｍを用いて求めた。
【0137】
２．ＰＥＧ ４０００を用いたＴ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ由来α－アミラーゼの結晶化
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ由来のａ－アミラーゼ（ＴＴＨＥＲＭ＿００４１１６１０）は、ＰＥＧ ４０００を用いた組換えＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａの発酵とその後のＤＳＰによって得られた２０ｍＭリン酸－クエン酸（ｐＨ ７）で緩衝化したアミラーゼリッチタンパク質濃縮物（９５ｇ／Ｌ）から結晶化した。
結晶化は、穏やかに撹拌したアミラーゼ濃縮液に、２５％（ｖ／ｖ）のＰＥＧ ４０００ストック溶液（２０ｍＭリン酸－クエン酸バッファー、ｐＨ ７中の４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ４０００）をゆっくりと加え、最終ＰＥＧ ４０００濃度を６％（ｗ／ｖ）にすることで開始した。溶液が適切に混合された後、混合物を室温（２０～２２℃）で９３時間、攪拌せずにインキュベートした。サンプルは毎日取り出され、結晶の形成について顕微鏡で検査された。最初の３日間では結晶化は見られなかったが、９３時間後には長さ約６５０μｍ、幅約５μｍまでの大きな針状結晶が確認された（図１１および１２）。
結晶は遠心分離（１０分、１５００ｒｃｆ、ＲＴ）でペレット化し、Ｈ２Ｏで再溶解した。結晶溶液および遠心分離上清は、Ｐｈａｄｅｂａｓ Ａｍｙｌａｓｅ Ｔｅｓｔ（Ｐｈａｄｅｂａｓ ＡＢ， Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｔａｄ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、製造元の推奨に従ってアミラーゼ活性を測定した。全アミラーゼ活性の約６７％が分解結晶ペレットに認められ、約３３％が上清に残った。
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ由来のａ－アミラーゼ（ＴＴＨＥＲＭ＿００４１１６１０）は、ＰＥＧ ４０００を用いた組換えＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａの発酵とその後のＤＳＰによって得られた２０ｍＭリン酸－クエン酸（ｐＨ ７）で緩衝化したアミラーゼリッチタンパク質濃縮物（９５ｇ／Ｌ）から結晶化した。
結晶化は、穏やかに撹拌したアミラーゼ濃縮液に、２５％（ｖ／ｖ）のＰＥＧ ４０００ストック溶液（２０ｍＭリン酸－クエン酸バッファー、ｐＨ ７中の４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ４０００）をゆっくりと加え、最終ＰＥＧ ４０００濃度を６％（ｗ／ｖ）にすることで開始した。溶液が適切に混合された後、混合物を室温（２０～２２℃）で９３時間、攪拌せずにインキュベートした。サンプルは毎日取り出され、結晶の形成について顕微鏡で検査された。最初の３日間では結晶化は見られなかったが、９３時間後には長さ約６５０μｍ、幅約５μｍまでの大きな針状結晶が確認された（図１１および１２）。
結晶は遠心分離（１０分、１５００ｒｃｆ、ＲＴ）でペレット化し、Ｈ２Ｏで再溶解した。結晶溶液および遠心分離上清は、Ｐｈａｄｅｂａｓ Ａｍｙｌａｓｅ Ｔｅｓｔ（Ｐｈａｄｅｂａｓ ＡＢ， Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｔａｄ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、製造元の推奨に従ってアミラーゼ活性を測定した。全アミラーゼ活性の約６７％が分解結晶ペレットに認められ、約３３％が上清に残った。
【0138】
３．リン酸二水素ナトリウムを用いたＴ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ由来リパーゼの結晶化
バッファー
ＮａＨ２ＰＯ４ ストック溶液
２０ ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４
２．５ Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４
ｐＨ７．０
溶解バッファー
１０ ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４
ｐＨ７．０
バッファー
ＮａＨ２ＰＯ４ ストック溶液
２０ ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４
２．５ Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４
ｐＨ７．０
溶解バッファー
１０ ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４
ｐＨ７．０
【0139】
過剰生産されたテトラヒメナ・リパーゼ１２０を含む採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）を濾過して未溶解成分を除去し、５５ｇ／Ｌ（アプローチ１）、４０ｇ／Ｌ（アプローチ２）、２５ｇ／Ｌ（アプローチ３）、１６ｇ／Ｌ（アプローチ４）に濃縮した。４つのサンプルは、最終濃度が０．３Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４（アプローチ１）、０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４（アプローチ２および３）、０．７Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４（アプローチ４）になるように調整された。２５時間後、ＮａＨ２ＰＯ４濃度を ０．５Ｍ（アプローチ１）、０．７５Ｍ（アプローチ２）、１Ｍ（アプローチ３および４）に上げた。４８時間後、アプローチ３と４の濃度を１．２５Ｍに上げた。最終サンプルは１１５時間後に採取した。結晶化リパーゼと未結晶化リパーゼの比率を測定するため、２５、４８、１１５時間後にサンプルを採取し、遠心分離した（１０，０００ｒｃｆ、５分間）。上清中の全リパーゼ活性は未結晶のリパーゼを表し，再溶解したペレット中の全リパーゼ活性は結晶化したリパーゼを表す。結果を図１３と図１４に示す。
【0140】
参考文献：
【0141】
配列
下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。ＷＩＰＯ ＳＴ ２５互換性のある電子化配列表もまた、この出願と共に提供される。疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子化配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列は正しいものとみなされるものとする。それぞれの 配列番号１～７はシグナルペプチドを持つ酵素を意味する。配列番号８～１４（このリストには表示されていないが、電子配列リストには表示されている）はシグナルペプチドなしの酵素を指す。 配列番号１５～１７（このリストには表示されていないが、電子配列リストには表示されている）はシグナルペプチドなしのプロテアーゼ酵素を指す。
下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。ＷＩＰＯ ＳＴ ２５互換性のある電子化配列表もまた、この出願と共に提供される。疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子化配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列は正しいものとみなされるものとする。それぞれの 配列番号１～７はシグナルペプチドを持つ酵素を意味する。配列番号８～１４（このリストには表示されていないが、電子配列リストには表示されている）はシグナルペプチドなしの酵素を指す。 配列番号１５～１７（このリストには表示されていないが、電子配列リストには表示されている）はシグナルペプチドなしのプロテアーゼ酵素を指す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】