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特表2024-513185野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための細菌株
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-22
(54)【発明の名称】野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための細菌株
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20240314BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20240314BHJP
A01N 63/27 20200101ALI20240314BHJP
A01N 63/22 20200101ALI20240314BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 E
C12N1/20 A
A01P3/00
A01N63/27
A01N63/22
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023558978
(86)(22)【出願日】2022-03-25
(85)【翻訳文提出日】2023-11-24
(86)【国際出願番号】 EP2022057862
(87)【国際公開番号】W WO2022207474
(87)【国際公開日】2022-10-06
(31)【優先権主張番号】2150385-9
(32)【優先日】2021-03-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523364368
【氏名又は名称】ビボプロテクト・アーベー
(74)【代理人】
【識別番号】110001737
【氏名又は名称】弁理士法人スズエ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】エリザヴェス、ウーリグ
(72)【発明者】
【氏名】アーサ、ハーカシソン
【テーマコード（参考）】
4B065
4H011
【Ｆターム（参考）】
4B065AA15X
4B065AA41X
4B065BA22
4B065CA47
4B065CA60
4H011AA01
4H011BB21
(57)【要約】
本発明は、種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４であるシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＣＲ１０ｂ、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）Ｈ７、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）Ｈ１０、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７であるシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）Ｙ１３．１からなる群から選択される食用葉から単離される細菌株に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４を有するシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７を有するシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）からなる群から選択される食用葉から単離される細菌株
【請求項2】
前記細菌株は、種子及び野菜におけるヒト病原体及び植物病原体の確立及び成長を防止するためのものである請求項1に記載の細菌株。
【請求項3】
種子及び野菜におけるヒト病原菌であるエシュリヒア属及び腸内細菌種の拡散を防止するためのものである請求項１又は２に記載の細菌株。
【請求項4】
前記野菜は、緑色葉物野菜である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項5】
アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４を有するシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７を有するシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）からなる群から選択された少なくとも１つの細菌株を含む組成物であって、種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための組成物。
【請求項6】
前記組成物は、種子及び野菜におけるヒト病原体及び植物病原体の確立及び成長を防止するためのものである請求項1に記載の組成物。
【請求項7】
前記組成物は、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４を有するシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７を有するシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）の組み合わせを含む請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項8】
種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための、請求項１ないし４のいずれか1項に記載の少なくとも１つの細菌株又は請求項５ないし７のいずれか1項に記載の組成物の使用。
【請求項9】
前記野菜は、緑色葉物野菜である請求項８に記載の使用。
【請求項10】
前記少なくとも１つの株は、パッケージング前に野菜を洗浄するための洗浄水に添加されるか、又は包装中の野菜のパッケージング前、パッケージング中、又はパッケージング後に野菜に噴霧される、請求項８又は９に記載の使用。
【請求項11】
前記少なくとも１つの株は、灌漑用水に添加されるか、又は水耕栽培システムで栄養溶液へと添加される請求項８又は９に記載の使用。
【請求項12】
前記少なくとも１つの株は、包装の内側に適用されるか、又は包装のライニング若しくは包装のパッケージング材料に適用される請求項８又は９に記載の使用。
【請求項13】
前記少なくとも１つの株は、播種前に種子へコーティングされる請求項８に記載の使用。
【請求項14】
前記少なくとも１つの株は、104 － 1012 cfu/mlの量で種子上へコーティングされる請求項１２に記載の使用。
【請求項15】
播種後に得られる葉野菜などの野菜における細菌多様性を増加させるための請求項１２又は１３に記載の使用。
【請求項16】
アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４を有するシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７を有するシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）からなる群から選択される、単離された株。
【請求項17】
ヒトの感染からの保護に使用するための、少なくとも１つの請求項１ないし４のいずれか1項に記載の少なくとも1つの単離された株又は請求項５ないし７のいずれか1項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、種子及び野菜上のヒト病原体の確立及び成長を防止するための細菌株に関する。本発明はまた、種々の用途における当該株の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
緑色葉物野菜（Ｌｅａｆｙ ｇｒｅｅｎ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ）は、世界中の多数の食事に含まれており、栄養価が高く健康的な食品成分と考えられている。しかしながら、新鮮で便利な野菜の需要が増加するにつれて、食品媒介疾患のアウトブレイクの数も増加する。ヒト病原体による汚染は、生産チェーン全体で発生する可能性があり、製品を生で食べるとき、微生物は水道水で除去又は洗浄することが困難である。細菌負荷を低減することを目的とした塩素処理の有効性は疑問視されており、健康及び環境上のリスクをもたらすものと考えられている。塩素の使用もまた多くの国で禁止されている。生体保存又は生物学的制御の原理は、病原体の成長及び生存を制御するために、代わりに拮抗細菌又はその代謝産物を使用することである。効果の背後に存在する機構は、例えば栄養素若しくは物理的空間の競合、又は拮抗化合物の生産である。以前の研究では、新鮮な農産物から単離された細菌を用いて生物学的制御を使用して、ピーマンディスク上のサルモネラ・チェスター（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｅｓｔｅｒ）及びリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を予防した。エンダイブの天然の微生物叢の混合単離株は、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）から保護することが見出され、乳酸菌の株は、エロモナス・ハイドロフィリア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）を阻害した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とは、緑色葉菜（ｌｅａｆｙ ｇｒｅｅｎ）で見られ得る最も一般的かつ重篤な病原体の１つであるが、生体保存によるその成長を防ぐための調査はごくわずかしか行われていない。しかしながら、生体保存では、ヒト及び植物の両方に関して、非病原性である拮抗細菌に焦点を合わせることが重要である。現在まで、ヒト病原体に対する拮抗性細菌株の効果は、生きている植物では試験されておらず、特に実際の生産環境では試験されておらず、これは、商業的使用のための細菌株の可能性を評価するのに重要である。以前の研究では天然の微生物叢が除去された滅菌葉系でのみ行われており、これは、実際の現場生産システムとは全く異なることが実現されている。
【0003】
すでに確立された生態系における空間及び共存についての競合は、潜在的な細菌株の生存及び成長にとって最も重要な課題の１つであるはずであり、これは、植物においてのみ測定することができる。
【0004】
国際公開第２０１６／００５９７４号パンフレットは、実生における種子関連疾患のバイオコントロールについて開示している。油及び細菌カクテル中に粒子状物質を含む製剤が記載される。当該文献の表５Ｂでは、この製剤が試験されているのは植物病原体のみである。植物病原体の例として腸内細菌科（ｆａｍｉｌｙ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）が挙げられる。腸内細菌科とは、細菌種の大きく多様な科である。一部の種はヒト疾患、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関連し、一部は植物関連疾患、例えばエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）に関連する。腸内細菌科内の多様性のために、例としては１つ又は少数に対して拮抗効果を有する場合、１つの拮抗株が全ての腸内細菌科種に対して作用するかどうかの結論を導くことは不可能である。たとえ病原体が同じ分類学的な細菌科に属する場合であっても、植物病原体に対するアンタゴニストがヒト病原体に対してもまた有効であることは示されていない。細菌の病原性は株特異的であり、植物病原体は、概して、ヒト病原体ではない。
【0005】
したがって、生きている植物に対するより高い病原体耐性、特にヒト病原体耐性の効果と、消費者にとってより健康な方向に植物の微生物叢を変化させる効果との両方を有する、新規かつ改善された細菌株を提供する必要がある。さらに、実生活の現場生産システムを取り扱うのに充分に堅牢であり、かつ経時的に安定している、すなわち改善された貯蔵能力を有する細菌株を得ることが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２０１６／００５９７４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記に照らして、本発明の概念の目的は、先行技術の前述した欠点の１つ以上が対処される、少なくとも１つの細菌株を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
第１の態様によれば、本発明は、種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４であるシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７であるシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）からなる群から選択される食用葉から単離される細菌株に関する。
【0009】
以下に詳細に記載されるように、上述の株は、驚くべきことに、商業的な現場環境において生きている植物に対する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの、潜在的なヒト病原体に対して拮抗効果を有することが示されている。
【0010】
上記の細菌株による種子コーティングを通して、消費者にとってより健康な方向で植物の微生物組成物に影響を及ぼすことが可能であることが示されている。このようにして、緑色葉物野菜への病原体の増殖及び拡散のリスクを低減することができ、将来のそれらの関連するアウトブレイクの結果を緩和することができる。また、一旦成長した葉野菜（ｌｅａｆｙ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ）などの野菜の細菌多様性の増加が播種後に得られることも観察されている。
【0011】
本発明は、別の態様では、種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４であるシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７であるシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）からなる群から選択される、少なくとも１つの細菌株を含む組成物を提供する。
【0012】
本発明は、更に別の態様では、種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を予防するための上記の少なくとも１つの細菌株の使用を提供する。
【0013】
本発明は、本発明の更に別の態様では、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４であるシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７であるシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）からなる群から選択される、単離された株を提供する。
【0014】
本明細書に開示される新規の株は、例えば、現場の植物においてインビボで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を緩和することができる、食用葉から単離された非病原性細菌株である。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】垂直画線培養法（ａ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する拮抗効果を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が成長しにくい勾配として示す。（ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する拮抗効果を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が成長できない測定可能な阻害ゾーンとして示す。（ｃ）陰性結果、阻害ゾーンを視覚化することができない。
【図2】科レベルでの細菌存在量。（ａ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）拮抗細菌でコーティングされた種子。ＮＳ＝未処理種子（ｎ＝２）、ＫＳ＝コーティング対照（ｎ＝２）、ＡＳ＝Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０７（ｎ＝２）、ＢＳ＝Ｐ．プノネンシス（Ｐ．ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０４（ｎ＝２）、ＣＳ＝Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０５（ｎ＝１）、及びＤＳ＝Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０６（ｎ＝２）。（ｂ）（ａ）における種子由来の植物。ＮＬ（ｎ＝５）、ＫＬ（ｎ＝６）、ＡＬ（ｎ＝５）、ＢＬ（Ｎ＝６）、ＣＬ（ｎ＝６）、及びＤＬ（ｎ＝６）。
【図3】０．００１でカットオフされたｐ値による、ＤＥＳｅｑ２によって群ごとに分析された、属レベルでの葉及び種子のＬｏｇ２倍数変化プロット。全ての群をコーティング対照（Ｋ）と比較する。ＮＳ＝未処理種子（ｎ＝２）、ＫＳ＝コーティング対照（ｎ＝２）、ＡＳ＝Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０７（ｎ＝２）、ＢＳ＝Ｐ．プノネンシス（Ｐ．ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０４（ｎ＝２）、ＣＳ＝Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０５（ｎ＝１）、及びＤＳ＝Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０６（ｎ＝２）。（ｂ）（ａ）における種子由来の植物。ＮＬ（ｎ＝５）、ＫＬ（ｎ＝６）、ＡＬ（ｎ＝５）、ＢＬ（Ｎ＝６）、ＣＬ（ｎ＝６）、及びＤＬ（ｎ＝６）。なお、ｙ軸は異なる間隔を示す。正のｌｏｇ２倍数変化値は、処置群においてより高いＡＳＶ存在量を示し、負の値は、コーティング対照群（Ｋ）においてより高い存在量を示す。同じ属内の複数の記号は、同じ属に割り当てられた異なるＡＳＶを表す。
【図4A】０．００１でカットオフされたｐ値による、ＤＥＳｅｑ２による同じ群内で比較した葉及び種子のＬｏｇ２倍数変化プロット。ＮＳ＝未処理種子（ｎ＝２）、ＫＳ＝コーティング対照（ｎ＝２）、ＡＳ＝Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０７（ｎ＝２）、ＢＳ＝Ｐ．プノネンシス（Ｐ．ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０４（ｎ＝２）、ＣＳ＝Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０５（ｎ＝１）、及びＤＳ＝Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０６（ｎ＝２）。（ｂ）（ａ）における種子由来の植物。ＮＬ（ｎ＝５）、ＫＬ（ｎ＝６）、ＡＬ（ｎ＝５）、ＢＬ（Ｎ＝６）、ＣＬ（ｎ＝６）、及びＤＬ（ｎ＝６）。正のｌｏｇ２倍数変化値は、種子においてより高いＡＳＶ存在量を示し、負の値は、葉においてより高い存在量を示す。同じ属内の複数の記号は、同じ属に割り当てられた異なるＡＳＶを表す。
【図4B】０．００１でカットオフされたｐ値による、ＤＥＳｅｑ２による同じ群内で比較した葉及び種子のＬｏｇ２倍数変化プロット。ＮＳ＝未処理種子（ｎ＝２）、ＫＳ＝コーティング対照（ｎ＝２）、ＡＳ＝Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０７（ｎ＝２）、ＢＳ＝Ｐ．プノネンシス（Ｐ．ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０４（ｎ＝２）、ＣＳ＝Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０５（ｎ＝１）、及びＤＳ＝Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０６（ｎ＝２）。（ｂ）（ａ）における種子由来の植物。ＮＬ（ｎ＝５）、ＫＬ（ｎ＝６）、ＡＬ（ｎ＝５）、ＢＬ（Ｎ＝６）、ＣＬ（ｎ＝６）、及びＤＬ（ｎ＝６）。正のｌｏｇ２倍数変化値は、種子においてより高いＡＳＶ存在量を示し、負の値は、葉においてより高い存在量を示す。同じ属内の複数の記号は、同じ属に割り当てられた異なるＡＳＶを表す。
【図5】重み付けされたｕｎｉｆｒａｃによって計算され、かつ順列多変量分散分析（Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ：ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ）と対で比較された、葉試料のβ多様性。群Ｎは、未処理種子由来の葉であり、凍結培地のみでコーティングした種子由来のＫ（コーティング対照）、Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０７でコーティングされた種子由来のＡ、Ｐ．プノネンシス（Ｐ．ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０４によるＢ、及びＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０５によるＣ、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０６によるＤである。コーティング対照と比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、Ｋ．ｎ＝比較数。
【図6】動物研究の実験設計。水消費量を毎日測定し、最後に飼料消費量を測定した。開始時、前処理後、及び終了時に、体重を記録した。
【図7A】フローサイトメトリーによって分析された、腸間膜リンパ節の免疫細胞集団。処置対照（Ｋ）と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図7B】フローサイトメトリーによって分析された、腸間膜リンパ節の免疫細胞集団。処置対照（Ｋ）と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図8A】示された細菌調製物で２４時間刺激した後に、フローサイトメトリーによって調査したＭｏＤＣ（ｎ＝５）上の活性化マーカ発現。ＰＢＳと比較して、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。ＣＤ８６及びＣＤ８０のデータは、試料中の陽性細胞の平均％／未染色の陽性細胞の平均％（標準偏差）として示された。ＨＬＡ－ＤＲデータは、試料のｙ中央値の蛍光強度の中央値（ｍｅｄｉａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）平均％／未染色のｙ中央値の平均％（標準偏差）として示された。
【図8B】示された細菌調製物で２４時間刺激した後に、フローサイトメトリーによって調査したＭｏＤＣ（ｎ＝５）上の活性化マーカ発現。ＰＢＳと比較して、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。ＣＤ８６及びＣＤ８０のデータは、試料中の陽性細胞の平均％／未染色の陽性細胞の平均％（標準偏差）として示された。ＨＬＡ－ＤＲデータは、試料のｙ中央値の蛍光強度の中央値（ｍｅｄｉａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）平均％／未染色のｙ中央値の平均％（標準偏差）として示された。
【図8C】示された細菌調製物で２４時間刺激した後に、フローサイトメトリーによって調査したＭｏＤＣ（ｎ＝５）上の活性化マーカ発現。ＰＢＳと比較して、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。ＣＤ８６及びＣＤ８０のデータは、試料中の陽性細胞の平均％／未染色の陽性細胞の平均％（標準偏差）として示された。ＨＬＡ－ＤＲデータは、試料のｙ中央値の蛍光強度の中央値（ｍｅｄｉａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）平均％／未染色のｙ中央値の平均％（標準偏差）として示された。
【図9】１０：１の細菌対ＭｏＤＣ比で、示された細菌調製物により２４時間刺激したＭｏＤＣ（ｎ＝３、反復実験）による、サイトカイン発現（異なるスケーリングに留意されたい）。範囲外の値及び高い変動に起因して、統計的評価は行わなかった。△は上限の範囲外における１つ以上の反復を示し、▽は下限の範囲外における１つ以上の反復を示す。ＯＯＲ－測定された全ての反復は検出限界未満である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
定義
本明細書で使用される「プロバイオティクス」という用語は、通常は消化管内で個体によって消費された場合に健康上の利益を提供する、生きている微生物を意味する。
本明細書で使用される「プロバイオティクス」という用語は、通常は消化管内で個体によって消費された場合に健康上の利益を提供する、生きている微生物を意味する。
【0017】
「ｃｆｕ」という用語はコロニー形成単位を意味し、試料中の生存細菌細胞の数を推定するために微生物学で一般的に使用される単位である。本出願では、ｃｆｕは、ｃｆｕ／ｍＬ、すなわちｃｆｕ／ｍＬに関連して使用される。
【0018】
本明細書で使用される「α多様性」という用語は、個々の試料内の豊富さ（種の数）及び／又は均等度（種の分布）を推定するための尺度を意味する。α多様性は、豊富さ及び均等度の両方を考慮して、シャノン・ウィナー指数（Ｈ’＝－Σ ｐｉ ｌｎ ｐｉ）によって計算することができる。
【0019】
本明細書で使用される「β多様性」という用語は、異なる群からの試料を比較して、全体的な群落の組成及び構造の違いを識別する尺度を意味する。ＵｎｉＦｒａｃ法はβ多様性の尺度であり、また、種の相対的な関連性も考慮に入れる。
【0020】
拮抗性細菌株に関連して本明細書で使用される「拮抗性」という用語は、ヒト及び／又は植物病原体を減少させる能力を有する株を意味する。
【0021】
発明の詳細な説明
本発明を、以下でより詳細に説明する。しかしながら、本発明は、多くの異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、徹底性及び完全性のために、並びに本発明の範囲を当業者へ充分に伝えるために提供される。異なる実施形態に個々の特徴が含まれてもよいが、これらはおそらく他の方法で組み合わされてもよく、異なる実施形態に含まれることは、特徴の組合せが実現不可能であることを意味しない。さらに、単数の参照は複数を除外しない。本発明の文脈において、「ａ」、「ａ」という用語は、複数を排除するものではない。
本発明を、以下でより詳細に説明する。しかしながら、本発明は、多くの異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、徹底性及び完全性のために、並びに本発明の範囲を当業者へ充分に伝えるために提供される。異なる実施形態に個々の特徴が含まれてもよいが、これらはおそらく他の方法で組み合わされてもよく、異なる実施形態に含まれることは、特徴の組合せが実現不可能であることを意味しない。さらに、単数の参照は複数を除外しない。本発明の文脈において、「ａ」、「ａ」という用語は、複数を排除するものではない。
【0022】
本発明の概念は、少なくとも部分的には、食用の葉から単離された特定の細菌株が、例えば、生きている植物に対するより高い病原体耐性の効果と、消費者のより健康的な方向に植物の微生物叢を変化させることと、を含む、望ましい特性を有するという予想外の認識に基づいている。
【0023】
上記のように、本発明は、種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４であるシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７であるシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）からなる群から選択される食用葉から単離される細菌株に関する。当該少なくとも１つの株は、緑色葉物野菜（ｌｅａｆｙ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ ｇｒｅｅｎｓ）などの種子及び野菜における、ヒト病原体エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌及び腸内細菌科種の確立及び成長を妨げ得る。腸内細菌の科内の病原体属の例は、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅｓｃｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及びパンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）である。エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エシェリヒア・アルベルティ（Ｅ．ａｌｂｅｒｔｉｉ）、エシェリヒア・ブラッテ（Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ）、エシェリヒア・フェルグソニ（Ｅ．ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）、エシェリヒア・ヘルマンニ（Ｅ．ｈｅｒｍａｎｎｉｉ）、及びエシェリヒア・ヴァルネリス（Ｅ．ｖｕｌｎｅｒｉｓ）である。
【0024】
上記で開示された細菌株は、以下に記載されるような産業現場生産システムで試験された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して拮抗性であることが示されている。ホウレンソウ種子は、当該細菌株である、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４であるシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７であるシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）でコーティングされる。本発明の細菌株がコーティングプロセスを生き延びることができるか、及び葉の天然の微生物叢で確立されることができるかどうかを試験した。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種の変化は豊富であり、種子及び葉の両方で、全ての試料において異なる種についてより高い存在量が観察された。
【0025】
より具体的には、２つの細菌株（シュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０７及びシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０４）について、種子から植物への大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の存在量の減少が見られた。より病原性の低い微生物叢組成物の他の徴候が存在した；２つの株（バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０５及びバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０６）を接種した種子は、ラクトバチルス科の存在量が増加しており、それらのうち１つはパンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）の存在量が低かった。更に、試験した全ての拮抗株は、葉上の植物病原体属エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）及び／又はペクトバクテリウム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の存在量を低下させた。
【0026】
一実施形態では、当該細菌株は、種子及び野菜におけるヒト病原体及び植物病原体の確立及び成長を防止するためのものである。したがって、細菌株は、ヒト病原体に加えて植物病原体に対してもまた効果を及ぼし得る。
【0027】
本発明は、別の態様では、種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４であるシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７であるシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）からなる群から選択される、少なくとも１つの細菌株を含む組成物を提供する。
【0028】
一実施形態では、当該組成物は、種子及び野菜上のヒト病原体及び植物病原体の確立及び成長を防止するためのものである。したがって、上記細菌株の少なくとも１つを含む組成物は、ヒト病原体に加えて、植物病原体に対してもまた効果を及ぼし得る。
【0029】
組成物は、少なくとも１つの細菌株及び形態と共に好適であり得る任意の他の従来公知の添加剤を含んでもよく、例えば、凍結乾燥形態で存在してもよい。
【0030】
上記に開示された少なくとも１つの株は、凍結乾燥形態、風乾形態、凍結形態、又は液体形態で存在し得る。少なくとも１つの株の前当該形態を調製するための方法は、当技術分野内で当業者に利用可能である。
【0031】
組成物は、同じ組成物中に１つ以上の細菌株、例として２つ以上の株、例えば３つの株などを含み得る。一実施形態では、４つ全ての株を、組成物で組み合わせて使用してもよい。そのような場合、各株の個々の特徴の全てが、全ての有益な特性を有する１つの組成物に組み合わされる。
【0032】
本明細書では、葉野菜などの種子及び野菜上のヒト病原体の確立及び成長を防止するための、少なくとも１つの細菌株又は組成物の使用もまた提供される。
【0033】
本明細書に記載の少なくとも１つの細菌株又は当該少なくとも１つの細菌株を含む組成物の使用もまた本明細書で提供され、ここで、当該少なくとも１つの株は、パッケージング前に野菜を洗浄するための洗浄水に添加されるか、又は包装中の野菜のパッケージング前、パッケージング中、又はパッケージング後に野菜に噴霧される。
【0034】
本明細書に記載の少なくとも１つの細菌株又は当該少なくとも１つの細菌株を含む組成物の使用もまた本明細書で提供され、ここで、当該少なくとも１つの株は、灌漑用水に添加されるか、又は水耕栽培システムで栄養溶液へと添加される。また、拮抗性細菌株を接種した種子を有する植物は、実生数の増加を示し、したがって、拮抗性細菌株が収量を増加させることを示していることが分かった。したがって、拮抗性細菌株は生物肥料として使用してもよい。
【0035】
本明細書に記載の少なくとも１つの細菌株又は当該少なくとも１つの細菌株を含む組成物の使用もまた本明細書で提供され、ここで、当該少なくとも１つの株は、包装の内側に適用されるか、又は包装のライニング若しくは包装のパッケージング材料に適用される。
【0036】
本明細書に記載の少なくとも１つの細菌株又は当該少なくとも１つの細菌株を含む組成物の使用もまた本明細書で提供され、ここで、当該少なくとも１つの株は、播種前に種子へコーティングされる。
【0037】
本明細書に記載の少なくとも１つの細菌株又は当該少なくとも１つの細菌株を含む組成物の上記で提供された異なる使用により、病原体の増殖及び緑色葉物野菜への拡散が低減され得、将来のそれらの関連したアウトブレイクの結果が低減され得る。
【0038】
少なくとも１つの株はまた、播種前に種子にコーティングされてもよい。少なくとも１つの株は、１０４～１０１２ｃｆｕ／ｍＬの量、例として１０６～１０１２ｃｆｕ／ｍＬの量、例えば１０４～１０１２ｃｆｕ／ｍＬの量又は約１０６～１０１０ｃｆｕ／ｍＬの量などで種子上にコーティングされ得る。本明細書に記載の細菌株による種子コーティングを通して、消費者にとってより健康な方向で植物の微生物組成物に影響を及ぼすことが可能であることが示されている。Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）の２つの株を接種した種子由来の植物ではβ多様性がより高く、これらの群の微生物存在量が、対照と比較して系統発生的に異なることを示していた。微生物の多様性が高い植物ほど、病原体の侵入抵抗が高いことが知られている。
【0039】
更に、本明細書に開示される当該少なくとも１つの株でコーティングされた種子の効果は、少なくとも６年間維持されることが示されており、これは、本発明の株の効果の強い堅牢性を示している。表１に見られるように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の成長の阻害は６年後に試験され、安定したままであった。
【0040】
播種後に得られる葉野菜などの野菜における細菌多様性を増加させるための、本明細書に記載の少なくとも１つの細菌株、又は当該少なくとも１つの細菌株を含む組成物の使用もまた本明細書で提供される。
【0041】
本明細書では、ヒトの感染からの保護に使用するための、上記の少なくとも１つの単離された株、又は当該少なくとも１つの単離された株を含む組成物もまた提供される。実験においてより詳細に記載されるように、本明細書に開示される細菌株の免疫調節効果が観察されている。
【0042】
株の定義
本明細書に開示される新規の株は、食用の葉から単離された非病原性細菌株である。
本明細書に開示される新規の株は、食用の葉から単離された非病原性細菌株である。
【0043】
全ての株は、２０２１年１月２６日に、ベルギーのヘントのＢＣＣＭ／ＬＭＧ（Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｉｓｍｓ／Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ ｖｏｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｇｅｎｔ（ＵＧｅｎｔ））に寄託されている。寄託者は発明者及び出願人の両方であるÅｓａ Ｈａｋａｎｓｓｏｎである。
【0044】
アクセッション番号は以下の通りである。
【0045】
シュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ） ＬＭＧ Ｐ－３２２０４、
バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ） ＬＭＧ Ｐ－３２２０５、
バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ） ＬＭＧ Ｐ－３２２０６、及び
シュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ） ＬＭＧ Ｐ－３２２０７。
バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ） ＬＭＧ Ｐ－３２２０５、
バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ） ＬＭＧ Ｐ－３２２０６、及び
シュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ） ＬＭＧ Ｐ－３２２０７。
【0046】
株は生物学的に純粋である。バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）はプロバイオティクス種であることが知られている。
【0047】
実験
細菌株の単離
この実験では、緑色葉物野菜に対する天然の微生物叢からの潜在的な大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）アンタゴニスト（特定の細菌株）を同定し、産業分野の生産環境におけるそれらの効果を評価することを目的とした。異なる種類の緑色葉物野菜から単離された２９５の細菌株のうち、３７がインビトロで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して効果を示した。拮抗株のサブセットをホウレンソウの種子にコーティングし、畑に植えた。種子及び植物の両方をＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）によって分析した。これは、植物の微生物叢が消費者にとってより健康的な方向に変化することが分かった。２つの細菌株で処理した試料ではより高いβ多様性が観察され、これは、植物のより高い病原体侵入耐性を示した。２つの細菌株（シュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０７及びシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０４）について、種子から植物への大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の存在量の減少が見られた。より病原性の低い微生物叢組成物の他の徴候が存在した；２つの株（バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０５及びバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０６）を接種した種子は、ラクトバチルス科の存在量が増加しており、それらのうち１つはパンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）の存在量が低かった。更に、試験した全ての拮抗株は、葉上の植物病原体属エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）及び／又はペクトバクテリウム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の存在量を低下させた。
細菌株の単離
この実験では、緑色葉物野菜に対する天然の微生物叢からの潜在的な大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）アンタゴニスト（特定の細菌株）を同定し、産業分野の生産環境におけるそれらの効果を評価することを目的とした。異なる種類の緑色葉物野菜から単離された２９５の細菌株のうち、３７がインビトロで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して効果を示した。拮抗株のサブセットをホウレンソウの種子にコーティングし、畑に植えた。種子及び植物の両方をＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）によって分析した。これは、植物の微生物叢が消費者にとってより健康的な方向に変化することが分かった。２つの細菌株で処理した試料ではより高いβ多様性が観察され、これは、植物のより高い病原体侵入耐性を示した。２つの細菌株（シュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０７及びシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０４）について、種子から植物への大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の存在量の減少が見られた。より病原性の低い微生物叢組成物の他の徴候が存在した；２つの株（バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０５及びバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０６）を接種した種子は、ラクトバチルス科の存在量が増加しており、それらのうち１つはパンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）の存在量が低かった。更に、試験した全ての拮抗株は、葉上の植物病原体属エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）及び／又はペクトバクテリウム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の存在量を低下させた。
【0048】
実験の説明
アンタゴニストの単離、インビトロ試験、及び同定
潜在的な拮抗細菌を単離するために、スウェーデンのルンドの現地スーパーで、玉レタス、フダンソウ、ホウレンソウ、及びルッコラ（各６５ｇ）を各５袋購入した。そのうえ、３０袋のルッコラを現地の葉物の緑色野菜生産者から収集した。微生物培養は、以下の増殖培地を用いて行った：トリプトンソイ寒天（ＴＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、カザミノ酸酵母エキスデキストロース寒天（ＹＣＥＤ：酵母エキス、０．３ｇ；カザミノ酸、０．３ｇ；Ｄ－グルコース、０．３ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、２．０ｇ；寒天、１８ｇ；蒸留水１０００ｍＬ）、水酵母エキス寒天（ＷＹＥ：酵母エキス、０．２５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ；寒天、１８ｇ；蒸留水１０００ｍＬ）、ラフィノース・ヒスチジン寒天（ラフィノース、１０ｇ；Ｌ－ヒスチジン、１ｇ；ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ；ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ；ＮａＣｌ、２０ｇ；寒天、１８ｇ；蒸留水、１０００ｍＬ）、カゼイン塩寒天（カゼイン、０．３ｇ；ＫＮＯ３、１、２５ｇ；ＮａＣｌ、４７．２５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、１、２５ｇ；ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ；ＣａＣＯ３、０．０２ｇ；ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ；寒天、１８ｇ；蒸留水、１０００ｍＬ）、ＩＳＰ２（酵母エキス、４ｇ；麦芽エキス、１０ｇ；Ｄ－グルコース、４ｇ；寒天、１８ｇ；蒸留水、１０００ｍＬ）、及び麦芽寒天（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）。インキュベーションを、ＴＳＡについては３０℃で３日間、ＹＣＥＤ、ＷＹＥ、ラフィノース、カゼイン、ＩＳＰ２、及びＩＳＰ５寒天については３０℃で７日間、麦芽寒天については２０℃で７日間進行させた。コロニーを単離し、精製のために画線培養し、凍結培地（Ｋ２ＨＰＯ４、０．８５ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．２；クエン酸三ナトリウム脱水物（Ｔｒｉ－ｓｏｄｉｕｍ－ｃｉｔｒａｔｅ－ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、１．５ｇ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ；グリセロール（９９．５％）、１２１．５ｍＬ；蒸留水、－８０℃で８７５ｍＬ中にて貯蔵した。ＴＳＡプレート上で垂直画線培養法により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＣＵＧ２９３００Ｔに対する拮抗作用について株を試験し、ここで、株をプレート上に一列に画線培養し、３０℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を株に対して垂直に画線培養し、プレートを３０℃で２４時間更にインキュベートした。拮抗効果は、３ｍｍより大きい阻害ゾーンの存在、又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の線上の勾配として読み取られた。同じ試験を６年後に繰り返して、効果が経時的に変化するかどうかを評価した。最近同じ研究室で食用植物から単離され、かつバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＤＳＭ１Ｔに最も近いタイプの株（同一性９９．７％）によって同定された２つの株を、Ｂａｌｏｕｉｒｉ、Ｓａｄｉｋｉ、及びＩｂｎｓｏｕｄａ（２０１６年）によって記載された寒天プラグ拡散法によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して試験した。手短に言えば、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）株をＭＲＳ寒天（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上の高密度マット中において３７℃で７日間、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をトリプトンソイ寒天（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）上において３７℃で２４時間成長させた。Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）の１ｃｍ２プラグを切り出し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プレートに移植した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の非存在形態の拮抗作用は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が成長できないＴＳＡプレート上で勾配の形態にて検出された。
アンタゴニストの単離、インビトロ試験、及び同定
潜在的な拮抗細菌を単離するために、スウェーデンのルンドの現地スーパーで、玉レタス、フダンソウ、ホウレンソウ、及びルッコラ（各６５ｇ）を各５袋購入した。そのうえ、３０袋のルッコラを現地の葉物の緑色野菜生産者から収集した。微生物培養は、以下の増殖培地を用いて行った：トリプトンソイ寒天（ＴＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、カザミノ酸酵母エキスデキストロース寒天（ＹＣＥＤ：酵母エキス、０．３ｇ；カザミノ酸、０．３ｇ；Ｄ－グルコース、０．３ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、２．０ｇ；寒天、１８ｇ；蒸留水１０００ｍＬ）、水酵母エキス寒天（ＷＹＥ：酵母エキス、０．２５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ；寒天、１８ｇ；蒸留水１０００ｍＬ）、ラフィノース・ヒスチジン寒天（ラフィノース、１０ｇ；Ｌ－ヒスチジン、１ｇ；ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ；ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ；ＮａＣｌ、２０ｇ；寒天、１８ｇ；蒸留水、１０００ｍＬ）、カゼイン塩寒天（カゼイン、０．３ｇ；ＫＮＯ３、１、２５ｇ；ＮａＣｌ、４７．２５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、１、２５ｇ；ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ；ＣａＣＯ３、０．０２ｇ；ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ；寒天、１８ｇ；蒸留水、１０００ｍＬ）、ＩＳＰ２（酵母エキス、４ｇ；麦芽エキス、１０ｇ；Ｄ－グルコース、４ｇ；寒天、１８ｇ；蒸留水、１０００ｍＬ）、及び麦芽寒天（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）。インキュベーションを、ＴＳＡについては３０℃で３日間、ＹＣＥＤ、ＷＹＥ、ラフィノース、カゼイン、ＩＳＰ２、及びＩＳＰ５寒天については３０℃で７日間、麦芽寒天については２０℃で７日間進行させた。コロニーを単離し、精製のために画線培養し、凍結培地（Ｋ２ＨＰＯ４、０．８５ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．２；クエン酸三ナトリウム脱水物（Ｔｒｉ－ｓｏｄｉｕｍ－ｃｉｔｒａｔｅ－ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、１．５ｇ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ；グリセロール（９９．５％）、１２１．５ｍＬ；蒸留水、－８０℃で８７５ｍＬ中にて貯蔵した。ＴＳＡプレート上で垂直画線培養法により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＣＵＧ２９３００Ｔに対する拮抗作用について株を試験し、ここで、株をプレート上に一列に画線培養し、３０℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を株に対して垂直に画線培養し、プレートを３０℃で２４時間更にインキュベートした。拮抗効果は、３ｍｍより大きい阻害ゾーンの存在、又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の線上の勾配として読み取られた。同じ試験を６年後に繰り返して、効果が経時的に変化するかどうかを評価した。最近同じ研究室で食用植物から単離され、かつバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＤＳＭ１Ｔに最も近いタイプの株（同一性９９．７％）によって同定された２つの株を、Ｂａｌｏｕｉｒｉ、Ｓａｄｉｋｉ、及びＩｂｎｓｏｕｄａ（２０１６年）によって記載された寒天プラグ拡散法によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して試験した。手短に言えば、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）株をＭＲＳ寒天（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上の高密度マット中において３７℃で７日間、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をトリプトンソイ寒天（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）上において３７℃で２４時間成長させた。Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）の１ｃｍ２プラグを切り出し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プレートに移植した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の非存在形態の拮抗作用は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が成長できないＴＳＡプレート上で勾配の形態にて検出された。
【0049】
拮抗株のＤＮＡ精製及びサンガー配列決定
インビトロで拮抗作用を示した株をＤＮＡ精製し、サンガー配列決定によって配列決定した。手短に言えば、精製株をビーズ破砕工程後に生理食塩水へと懸濁し、上清をＰＣＲに使用して、順方向プライマＥＮＶ１（５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＩＩＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’）及び逆方向プライマＥＮＶ２（５’－ＣＧＧ ＩＴＡ ＣＣＴ ＴＧＴ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＴ－３’）（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ）のおよそ１５００ｂｐ長の断片を増幅し、結果をゲル電気泳動によって確認した。ＰＣＲ産物を、配列決定プライマとしてＥＮＶ１を用いて、ＡＢＩ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）で、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にてサンガー配列決定のために送った。配列決定した遺伝子を、配列の質に応じて５９０～７８８ｂｐへとトリミングし、ＳｅｑｍａｔｃｈソフトウェアによってＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅプロジェクト（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ ｐｒｏｊｅｃｔ：ＲＤＰ）のタイプ株配列と比較した。
インビトロで拮抗作用を示した株をＤＮＡ精製し、サンガー配列決定によって配列決定した。手短に言えば、精製株をビーズ破砕工程後に生理食塩水へと懸濁し、上清をＰＣＲに使用して、順方向プライマＥＮＶ１（５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＩＩＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’）及び逆方向プライマＥＮＶ２（５’－ＣＧＧ ＩＴＡ ＣＣＴ ＴＧＴ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＴ－３’）（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ）のおよそ１５００ｂｐ長の断片を増幅し、結果をゲル電気泳動によって確認した。ＰＣＲ産物を、配列決定プライマとしてＥＮＶ１を用いて、ＡＢＩ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）で、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にてサンガー配列決定のために送った。配列決定した遺伝子を、配列の質に応じて５９０～７８８ｂｐへとトリミングし、ＳｅｑｍａｔｃｈソフトウェアによってＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅプロジェクト（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ ｐｒｏｊｅｃｔ：ＲＤＰ）のタイプ株配列と比較した。
【0050】
野外試験
インビトロで拮抗効果を示した４つの異なる株（Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０７、Ｐ．プノネンシス（Ｐ．ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０４、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０５、及びＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０６）を、ホウレンソウをモデル作物とする商業的な現場環境における種子及び葉の微生物群に対するそれらの影響によって評価した。１μＬの純粋培養物を、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株については５０ｍＬのトリプトンソイ・ブロス（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と３０℃で２４時間にわたり、及びバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）株については３８℃で６日間にわたり、ＭＲＳブロス（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）とインキュベートすることによって、種子接種物を調製した。インキュベーション後、株を生理食塩水で洗浄し、凍結培地で総体積４０ｍＬに希釈し、種子コーティング処理まで－８０℃で貯蔵した。
インビトロで拮抗効果を示した４つの異なる株（Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０７、Ｐ．プノネンシス（Ｐ．ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０４、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０５、及びＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０６）を、ホウレンソウをモデル作物とする商業的な現場環境における種子及び葉の微生物群に対するそれらの影響によって評価した。１μＬの純粋培養物を、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株については５０ｍＬのトリプトンソイ・ブロス（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と３０℃で２４時間にわたり、及びバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）株については３８℃で６日間にわたり、ＭＲＳブロス（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）とインキュベートすることによって、種子接種物を調製した。インキュベーション後、株を生理食塩水で洗浄し、凍結培地で総体積４０ｍＬに希釈し、種子コーティング処理まで－８０℃で貯蔵した。
【0051】
ホウレンソウの種子（ホウレンソウ「Ｙｕｍａ」Ｆ１／ＰＶ１２４５、バッチ番号３６６９４８ ２０１８／２０１９、Ｐｏｐ Ｖｒｉｅｎｄ Ｓｅｅｄｓ、Ａｎｄｉｊｋ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、以下のように各１１００ｇで６つの処理群に分けた；正常対照（Ｎ）は未処理種子を含有し、処置対照（Ｋ）は凍結培地のみでコーティングした種子を含有した；Ａ群はＰ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０７（４×１０１２ｃｆｕ／ｍＬ）で種子をコーティングし、Ｂ群はＰ．プノネンシス（Ｐ．ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０４（９×１０９ｃｆｕ／ｍＬ）で種子をコーティングし、Ｃ群はＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０５（１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ）で種子をコーティングし、Ｄ群はＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０６（１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ）で種子をコーティングした。種子を実験用コーティング機ＳＡＴＥＣ Ｃｏｎｃｅｐｔ ＭＬ ２０００（ＳＡＴＥＣ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ ＧｍｂＨ、Ｅｌｍｓｈｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で２分間コーティングし、実験用乾燥機ＳＵＥＴ ８１９２１４／００２（ＳＵＥＴ Ｓａａｔ－ｕｎｄ Ｅｒｎｔｅｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ、Ｅｓｃｈｗｅｇｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で室温にて４分間乾燥させた。微生物分析のための処理後に、各群から１００ｇの種子を取り出した。
【0052】
現場試験は、スウェーデン南部の産業パートナーと協力して実施された。天候は晴れで乾燥しており、昼間の温度は２３～２６℃、夜間の温度は１１～１６℃であった。作物を長さ１２０ｍ及び幅１．３ｍの１つの隆起床に播種し、ここで、各処理群は２０ｍ専用であり、１ｍ２の６つのプロットが均一に積み重ねられた。各１ｍ２プロットを１反復とみなした。収穫は、２０日後に無菌技術を用いて、土壌の１．５ｃｍ上のプロット内の植物をはさみで切断することで行い、それらをビニール袋に移し、実験室での分析まで直ちにクールボックスに入れた。全ての機器を反復の間で滅菌した。
【0053】
種子及び植物上の微生物叢の次世代シーケンシング
葉及び種子のＤＮＡ抽出を行った。２ｇの植物材料の試料を、２０ｍＬのＰＢＳ（Ｏｘｏｉｄ Ｌｔｄ．、Ｂｌａｓｔｉｎｇｓｔｏｋｅ、ＵＫ）を含む試験管に入れ、その後、１０分間にわたり超音波処理した。植物材料を除去し、残りの液体を１１６００×ｇで２０分間にわたり遠心分離した。上清を捨て、残りのペレットをＤＮＡ精製による更なる処理まで－１８℃で貯蔵した。ＤＮＡ精製を、Ｎｕｃｌｅｉｏｓｐｉｎ（登録商標）Ｓｏｉｌ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の指示に従って用いて行った。ＤＮＡ濃度は、Ｑｕｂｉｔ（商標）１ｘ ｄｓ ＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）を用いて測定した。ＰＣＲプライマＢ９６９Ｆ（ＡＣＧＣＧＨＮＲＡＡＣＣＴＴＡＣＣ）及びＢＡ１４０６Ｒ（ＡＣＧＧＧＣＲＧＴＧＷＧＴＲＣＡＡ）（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＰＣＲ試薬であるＫａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｔｙ（Ｌｔｄ）、Ｓａｌｔ Ｒｉｖｅｒ、Ｃａｐｅ Ｔｏｗｎ、Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａ）と共に使用して、以下のＰＣＲプログラムで１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の４７０ｂｐのＶ６－Ｖ８超可変領域を増幅した：９５℃で３０秒間、２５℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間を２５サイクル、７２℃で５分間の保持期間。ＰＣＲ産物を、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて精製した。インデックスＰＣＲを、９５℃で３分間実行した後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間の８サイクルを実行し、この生産物を再びＱｕｂｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で測定した。増幅された断片の長さは、両方のＰＣＲ実行後に製造業者の指示に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｄｂｒｕｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＡｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）を用いて、ランダム試料で測定した。インデックス付き試料を再懸濁緩衝液（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で４ｎＭまで希釈し、製造業者の指示に従って、Ｍｉｓｅｑ試薬キットｖ３を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した（６００サイクル）。ＰｈｉＸ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を内部対照として使用した。最終充填量は６００μＬであった。
葉及び種子のＤＮＡ抽出を行った。２ｇの植物材料の試料を、２０ｍＬのＰＢＳ（Ｏｘｏｉｄ Ｌｔｄ．、Ｂｌａｓｔｉｎｇｓｔｏｋｅ、ＵＫ）を含む試験管に入れ、その後、１０分間にわたり超音波処理した。植物材料を除去し、残りの液体を１１６００×ｇで２０分間にわたり遠心分離した。上清を捨て、残りのペレットをＤＮＡ精製による更なる処理まで－１８℃で貯蔵した。ＤＮＡ精製を、Ｎｕｃｌｅｉｏｓｐｉｎ（登録商標）Ｓｏｉｌ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の指示に従って用いて行った。ＤＮＡ濃度は、Ｑｕｂｉｔ（商標）１ｘ ｄｓ ＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）を用いて測定した。ＰＣＲプライマＢ９６９Ｆ（ＡＣＧＣＧＨＮＲＡＡＣＣＴＴＡＣＣ）及びＢＡ１４０６Ｒ（ＡＣＧＧＧＣＲＧＴＧＷＧＴＲＣＡＡ）（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＰＣＲ試薬であるＫａｐａ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｔｙ（Ｌｔｄ）、Ｓａｌｔ Ｒｉｖｅｒ、Ｃａｐｅ Ｔｏｗｎ、Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａ）と共に使用して、以下のＰＣＲプログラムで１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の４７０ｂｐのＶ６－Ｖ８超可変領域を増幅した：９５℃で３０秒間、２５℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間を２５サイクル、７２℃で５分間の保持期間。ＰＣＲ産物を、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて精製した。インデックスＰＣＲを、９５℃で３分間実行した後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間の８サイクルを実行し、この生産物を再びＱｕｂｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で測定した。増幅された断片の長さは、両方のＰＣＲ実行後に製造業者の指示に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｄｂｒｕｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＡｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）を用いて、ランダム試料で測定した。インデックス付き試料を再懸濁緩衝液（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で４ｎＭまで希釈し、製造業者の指示に従って、Ｍｉｓｅｑ試薬キットｖ３を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した（６００サイクル）。ＰｈｉＸ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を内部対照として使用した。最終充填量は６００μＬであった。
【0054】
生産されたリードをＩｌｌｕｍｉｎａ ＣＡＳＡＶＡ １．８（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって逆多重化し、Ｑｉｉｍｅ ２ ２０２０．６でＤＡＤＡ２を用いてフィルタリングし、次いでＲで更に処理した。フィルタリング後のリードの総数は３１２８９１３であり、試料あたりのリードの平均数は６５１８６であった。配列を、左は２５ｂｐ及び右は２７５ｂｐの末端でトリミングした。５０００個未満のリードを含有する試料を除去した。ＳＩＬＶＡ １３２データベースを用いて、残りのリードの分類学的分類を行った。真核生物、ミトコンドリア、又は葉緑体として同定されたリードを除去した。
【0055】
計算及び統計分析
ＮＧＳデータから、存在量レベルを、全ての複製物のＯＴＵの合計をＯＴＵの総数で割って計算した。Ｃｈａｏ１及びシャノン指数を用いてα多様性を計算した。クラスカル・ウォリスの順位に基づく一元配置分散分析により、及びウィルコクソン順位和検定によって２つの群により、群ごとに存在量レベル及びα多様性を比較した。重み付けされたＵｎｉＦｒａｃを用いてβ多様性を計算し、順列多変量分散分析（ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ）によって比較した。群間の差次的存在量を、０．００１でカットオフされたｐ値による、ＤＥＳｅｑ２によって属レベルで分析した。
ＮＧＳデータから、存在量レベルを、全ての複製物のＯＴＵの合計をＯＴＵの総数で割って計算した。Ｃｈａｏ１及びシャノン指数を用いてα多様性を計算した。クラスカル・ウォリスの順位に基づく一元配置分散分析により、及びウィルコクソン順位和検定によって２つの群により、群ごとに存在量レベル及びα多様性を比較した。重み付けされたＵｎｉＦｒａｃを用いてβ多様性を計算し、順列多変量分散分析（ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ）によって比較した。群間の差次的存在量を、０．００１でカットオフされたｐ値による、ＤＥＳｅｑ２によって属レベルで分析した。
【0056】
単離、インビトロ試験、及び同定
垂直画線培養法で試験した２９５株のうち、１８株は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が成長できなかった測定可能なクリアゾーン（＞３ｍｍ）を示し、１９株では大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）線上の勾配を観察することができた。拮抗効果を示した株を、それらの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子によって配列決定し、それらの推定同一性を、２０１４年及び２０２０年におけるそれらの拮抗効果と共に表１に提示する。拮抗株は、主にミクロコッカス科（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、及びシュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に属していた。バチルス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、ほとんどが、貯蔵中に消失しなかったクリアゾーンの形態で拮抗作用を呈した。単離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）は、ゾーン及び勾配の両方を示し、株の約半分は、６年間の貯蔵後にその容量を維持した。寒天プラグ拡散試験によって試験した２つのＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）株について、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プレート上の勾配が観察された。
垂直画線培養法で試験した２９５株のうち、１８株は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が成長できなかった測定可能なクリアゾーン（＞３ｍｍ）を示し、１９株では大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）線上の勾配を観察することができた。拮抗効果を示した株を、それらの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子によって配列決定し、それらの推定同一性を、２０１４年及び２０２０年におけるそれらの拮抗効果と共に表１に提示する。拮抗株は、主にミクロコッカス科（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、及びシュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に属していた。バチルス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、ほとんどが、貯蔵中に消失しなかったクリアゾーンの形態で拮抗作用を呈した。単離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）は、ゾーン及び勾配の両方を示し、株の約半分は、６年間の貯蔵後にその容量を維持した。寒天プラグ拡散試験によって試験した２つのＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）株について、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プレート上の勾配が観察された。
【0057】
【表1】
【0058】
拮抗株は、中断することなく－８０℃で６年間貯蔵した後に試験され、一部はその効果を失ったが、一方でクリアゾーンを示した１８株のうち８株は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対抗する同じ能力を維持し、それらのほとんどはバチルス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科に属した。アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）種及びリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種は、ほとんどがより弱い勾配形態の拮抗作用を呈し、それらのほとんどはまた、貯蔵後にそれらの拮抗作用を失っており、おそらくプラスミドが保有する形質を示している。これらの結果は、商業的適用のための株を考慮する場合、拮抗効果が経時的に安定であることを検証することが重要であることを強く示唆している。
【0059】
野外試験
現場でのインビボでの選択された細菌株の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）拮抗能を評価するために、ホウレンソウの種子を、別々の群で、Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０７、Ｐ．プノネンシス（Ｐ．ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０４、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０５、及びＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０６でコーティングした。収穫時の植物の目視検査では、いかなる品質上の欠陥も示されなかった。種子及び植物の両方から抽出された細菌ＤＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ ＮＧＳ配列決定によって配列決定した。種子及び葉の両方において、最も豊富な門はプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）であり、それぞれ、６７．６％及び６７．４％であった。種子において、２番目に豊富な門はバクテリオデテス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ）（１９．３％）であり、続いてアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）（９．２％）であったが、しかし葉において、２番目に豊富な門はフィルミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）（３１．１％）であり、続いてバクテリオドータ（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｏｔａ）（１．０％）であった。
現場でのインビボでの選択された細菌株の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）拮抗能を評価するために、ホウレンソウの種子を、別々の群で、Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０７、Ｐ．プノネンシス（Ｐ．ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０４、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０５、及びＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０６でコーティングした。収穫時の植物の目視検査では、いかなる品質上の欠陥も示されなかった。種子及び植物の両方から抽出された細菌ＤＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ ＮＧＳ配列決定によって配列決定した。種子及び葉の両方において、最も豊富な門はプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）であり、それぞれ、６７．６％及び６７．４％であった。種子において、２番目に豊富な門はバクテリオデテス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ）（１９．３％）であり、続いてアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）（９．２％）であったが、しかし葉において、２番目に豊富な門はフィルミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）（３１．１％）であり、続いてバクテリオドータ（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｏｔａ）（１．０％）であった。
【0060】
科レベルに関するデータは、図２のタクソン棒グラフで視覚化することができる。種子上に最も豊富に存在したタクソンは、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）（２２．４％）であり、次いでエルウィニア科（Ｅｒｗｉｎｉａｃｅａｅ）（１７．１％）、スプリンゴモナス科（Ｓｐｒｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）（１０．０％）、ウィクセルラ科（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａｃｅａｅ）（８．９％）、及びスフィンゴバクテリウム科（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（８．７％）であった。葉において、最も豊富なタクソンは、エルウィニア科（Ｅｒｗｉｎｉａｃｅａｅ）（３４．５％）、エグジゴバクテリア科（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（２８．６％）、及びシュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）（１３．２％）であった。コーティング対照（Ｋ）と比較して、種子又は葉について科レベルで統計的な差異は見られなかったが、注目すべきは、葉試料ＢＬ（０．２％）における腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｅｒｉａｃｅａｅ）の低濃度、並びにＡＬ（１２．６％）及びＣＬ（１３．５％）におけるより高い濃度である。種子上で最も豊富な属はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（２２．０％）であり、次いでパンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）（１１．９％）であり、葉上においては、最も豊富な属はエグジゴバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（２８．６％）パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）（２０．１％）、及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（１３．２％）であった。
【0061】
属レベルでのＮ、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ対Ｋの差次的存在量は、図３のｌｏｇ２倍数変化プロットで見ることができる。種子上のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属するアンプリコン配列変異体（ＡＳＶ）の存在量は、コーティング対照と比較して、非コーティング種子でより高かった（ＮＳ対ＫＳ）。Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０７及びＰ．プノネンシス（Ｐ．ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０４（ＡＳ及びＢＳ対ＫＳ）でコーティングされた種子は、より高いＡＳＶ存在量のエシェリヒア－赤痢菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ－Ｓｈｉｇｅｌｌａ）を有し、一方で、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０５及びＬＭＧ Ｐ－３２２０６株（ＣＳ及びＤＳ対ＫＳ）でコーティングすると、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）のＡＳＶ存在量が増加した。
【0062】
種子コーティングプロセスはまた、とりわけパンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）種及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種などの葉の微生物叢に多くの変化をもたらした。エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、デュガネラ（Ｄｕｇａｎｅｌｌａ）、及びエグジゴバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のより高いＡＳＶ存在量もまた観察された。葉上の全ての拮抗染色（ＡＬ－ＤＬ対ＫＬ）は、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）又はペクトバクテリウム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＡＳＶ存在量を低下させ、ＤＬ群（Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＬＭＧ Ｐ－３２２０６）は、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）のＡＳＶ存在量を低下させた。
【0063】
同じ群からの種子と葉とを比較する場合（図４）、葉と比較して、種子では広範囲の属の存在量が高かった。Ａ群及びＢ群では、エシェリヒア－赤痢菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ－Ｓｈｉｇｅｌｌａ）は、葉上よりも種子上の存在量が豊富であった。
【0064】
多様性
群のＣｈａｏ１ α多様性指数は、種子については２１７．０～３０３．３の間、植物については８２．０～９８．０の間であった。シャノン指数は、種子では４．３～４．７の間、葉では２．４～２．８の間であった。Ｃｈａｏ１指数及びシャノン指数は、種子群（ＮＳ、ＫＳ、ＡＳ、ＢＳ、ＣＳ、及びＤＳ）及び葉群（ＮＬ、ＫＬ、ＡＬ、ＢＬ、ＣＬ、及びＤＬ）内でも、同じ処理の葉試料と種子試料との間でも（ＮＬ対Ｎｓ、ＫＬ対ＫＳなど）、有意な差異はなかった。
群のＣｈａｏ１ α多様性指数は、種子については２１７．０～３０３．３の間、植物については８２．０～９８．０の間であった。シャノン指数は、種子では４．３～４．７の間、葉では２．４～２．８の間であった。Ｃｈａｏ１指数及びシャノン指数は、種子群（ＮＳ、ＫＳ、ＡＳ、ＢＳ、ＣＳ、及びＤＳ）及び葉群（ＮＬ、ＫＬ、ＡＬ、ＢＬ、ＣＬ、及びＤＬ）内でも、同じ処理の葉試料と種子試料との間でも（ＮＬ対Ｎｓ、ＫＬ対ＫＳなど）、有意な差異はなかった。
【0065】
図５で見ることができる葉試料のβ多様性は、コーティング対照Ｋと比較してＣ群及びＤ群でより高い。高い微生物多様性を有する植物は、より高い病原体侵入耐性を有することが知られている。
【0066】
したがって、商業的な現場環境における生きている植物上の潜在的なヒト病原体に対する拮抗性細菌株が本明細書に開示されている。拮抗細菌株による種子コーティングを通して、消費者にとってより健康な方向で植物の微生物組成物に影響を及ぼすことが可能であることが示されている。このようにして、緑色葉物野菜への病原体の増殖及び拡散のリスクを低減することができ、将来のそれらの関連するアウトブレイクの結果を緩和することができる。
【0067】
インビボ実験
上記の実験では、特定の細菌株が緑色葉物野菜上の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の成長を減少させることができることが分かった。商業的使用の可能性を評価するために、本実験は、炎症促進性マーカの形態での免疫学的応答、及びそれらの投与時の健康なマウスにおける微生物叢変化評価を測定することを目的とした。抗生物質及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で動物を処置した後、これらの拮抗細菌を投与して、微生物叢を均等化した。
上記の実験では、特定の細菌株が緑色葉物野菜上の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の成長を減少させることができることが分かった。商業的使用の可能性を評価するために、本実験は、炎症促進性マーカの形態での免疫学的応答、及びそれらの投与時の健康なマウスにおける微生物叢変化評価を測定することを目的とした。抗生物質及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で動物を処置した後、これらの拮抗細菌を投与して、微生物叢を均等化した。
【0068】
動物
７０匹の野生型雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、動物施設で標準化条件下において飼育し、実験プロトコルの開始前に７日間順応させた。水及び飼料の消費は自由に与えられた。水消費量を、実験を通して毎日測定し、飼料消費量を実験終了時に記録した。開始時、前処理後、及び終了時に、体重を記録した。動物を、７つの群（各１０匹、ケージあたり５匹）、正常対照（Ｎ）、処置対照（Ｋ）、及び５つの処置群（Ａ～Ｅ）に分けた。実験計画については図６を参照されたい。Ｋ群及びＡ群～Ｅ群は、最初の３日間は２％（ｖ／ｗ）フルクトースを補充した抗生物質で前処理し、その後、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＣＣＵＧ２９３００Ｔ（１０８ＣＦＵ／ｍＬ、ホグネス凍結培地で希釈）で２日間前処理して微生物叢を均等化した。５．２ｍｇのメトロニダゾール（Ｓａｎｏｆｉ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）、３．５ｍｇのアモキシシリン（Ｍｙｌａｎ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）、及び２．１ｍｇのクリンダマイシン（Ｏｒｉｆａｒｍ Ｇｅｎｅｒｉｃｓ Ａ／Ｓ、Ｏｄｅｎｓｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の平均用量を、各マウスによって消費した。群Ｎには、最初の３日間はフルクトースのみを投与し、次の２日間は凍結培地のみを投与した。前処理後、Ａ群～Ｅ群には、各一種類の細菌株（Ａ：シュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）、Ｂ：シュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｃ：ロドコッカス・セラスチイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｒａｓｔｉｉ）、Ｄ：バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｅ：バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ））、及び水中の凍結培地（１０８ＣＦＵ／ｍＬ）を投与し、Ｋ及びＮ群には凍結培地のみを１６日間投与した。
７０匹の野生型雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、動物施設で標準化条件下において飼育し、実験プロトコルの開始前に７日間順応させた。水及び飼料の消費は自由に与えられた。水消費量を、実験を通して毎日測定し、飼料消費量を実験終了時に記録した。開始時、前処理後、及び終了時に、体重を記録した。動物を、７つの群（各１０匹、ケージあたり５匹）、正常対照（Ｎ）、処置対照（Ｋ）、及び５つの処置群（Ａ～Ｅ）に分けた。実験計画については図６を参照されたい。Ｋ群及びＡ群～Ｅ群は、最初の３日間は２％（ｖ／ｗ）フルクトースを補充した抗生物質で前処理し、その後、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＣＣＵＧ２９３００Ｔ（１０８ＣＦＵ／ｍＬ、ホグネス凍結培地で希釈）で２日間前処理して微生物叢を均等化した。５．２ｍｇのメトロニダゾール（Ｓａｎｏｆｉ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）、３．５ｍｇのアモキシシリン（Ｍｙｌａｎ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）、及び２．１ｍｇのクリンダマイシン（Ｏｒｉｆａｒｍ Ｇｅｎｅｒｉｃｓ Ａ／Ｓ、Ｏｄｅｎｓｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の平均用量を、各マウスによって消費した。群Ｎには、最初の３日間はフルクトースのみを投与し、次の２日間は凍結培地のみを投与した。前処理後、Ａ群～Ｅ群には、各一種類の細菌株（Ａ：シュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）、Ｂ：シュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｃ：ロドコッカス・セラスチイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｒａｓｔｉｉ）、Ｄ：バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｅ：バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ））、及び水中の凍結培地（１０８ＣＦＵ／ｍＬ）を投与し、Ｋ及びＮ群には凍結培地のみを１６日間投与した。
【0069】
２１日目に、動物を、腹腔内注射によって、１．０ｍｇ／ｋｇ体重のメデトミジン（Ｄｏｒｍｉｔｏｒ（登録商標）Ｖｅｔ、Ｏｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）及び７５ｍｇ／ｋｇ体重のケタミン（Ｋｅｔａｌａｒ、Ｗｅｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ Ｎｏｒｄｉｃ ＡＢ、Ｓｏｌｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で麻酔した。動脈血を収集し、２時間凝固させ、遠心分離し（３０００ｒｐｍ、３分、４℃）、その後のサイトカイン分析のために血清を－８０℃で凍結した。無菌技術下において、正中切開によって開腹術を行い、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）及びパイエル板（ＰＰ）を、ＨＢＳＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｎｕａｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を含むチューブに移し、かつフローサイトメトリーによる分析まで氷上に保った。脾臓、小腸及び結腸の管腔内容物を、慎重に収集及び秤量し、小腸及び結腸組織を等張食塩水ですすいだ。ミエロペルオキシダーゼ及び微生物叢分析のために、全ての試料を滅菌チューブに移した。次いで、ペントバルビタール注射によって動物を安楽死させた。血液及び腸試料を－８１℃で凍結した。ＭＬＮ及びＰＰを氷上に保ち、直ちにフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって分析した。
【0070】
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）
ＭＰＯのレベル、好中球に見られる酵素、及び局所腸炎症のマーカを測定するために、小腸試料及び大腸試料を液体窒素中で凍結し、重量を測定した後、１ｍＬのリン酸カリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）中で６０秒間にわたり均質化した。その後、ホモジネートを遠心分離し（１４０００ｒｐｍ、１０分）、ペレットを、０．５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含む５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）中に再懸濁した。試料を凍結融解し、次いで９０秒間にわたり超音波処理し、６０Ｃの水浴中で２時間にわたり保持した。遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分）の後、４５μＬの上清を９６ウェルプレートに移し、１５０μＬのＴＭＢ基質（ＢＤ Ｏｐｔ ＥＩＡ（商標）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を各ウェルに添加し、暗所で１５分間インキュベートした。次いで、ウェルあたり１００μＬの０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止させ、試料を４５０ｎｍで分光光度法により分析した。ＭＰＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を標準として使用し、値を単位ＭＰＯ／ｇ組織として表した。
ＭＰＯのレベル、好中球に見られる酵素、及び局所腸炎症のマーカを測定するために、小腸試料及び大腸試料を液体窒素中で凍結し、重量を測定した後、１ｍＬのリン酸カリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）中で６０秒間にわたり均質化した。その後、ホモジネートを遠心分離し（１４０００ｒｐｍ、１０分）、ペレットを、０．５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含む５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．０）中に再懸濁した。試料を凍結融解し、次いで９０秒間にわたり超音波処理し、６０Ｃの水浴中で２時間にわたり保持した。遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分）の後、４５μＬの上清を９６ウェルプレートに移し、１５０μＬのＴＭＢ基質（ＢＤ Ｏｐｔ ＥＩＡ（商標）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を各ウェルに添加し、暗所で１５分間インキュベートした。次いで、ウェルあたり１００μＬの０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止させ、試料を４５０ｎｍで分光光度法により分析した。ＭＰＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を標準として使用し、値を単位ＭＰＯ／ｇ組織として表した。
【0071】
末端制限酵素断片多型、Ｔ－ＦＲＬＰ
Ｔ－ＲＦＬＰにより微生物多様性を決定するために、５００μＬのＰＢＳ緩衝液を５０ｍｇの試料に添加することによって大腸及び小腸の内容物からＤＮＡを抽出し、室温で１０分間インキュベートした。その後、遠心分離工程（３０秒、３０００ｒｐｍ）の後、エッペンドルフミキサ（Ｍｏｄｅｌ ５４３２、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で４℃にて４５分間にわたりビーズ破砕工程を行った。次いで、２００μＬの上清をＥＺ１ ＤＮＡ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）中の滅菌試料チューブに移し、Ｂｉｏｒｏｂｏｔ ＥＺ１ワークステーション（Ｑｉａｇｅｎ）の製造業者の指示に従ってＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ及び制限エンドヌクレアーゼ（ＭＳＰＩ）消化を行った。消化したアンプリコンを、ＤＮＡ ｌａｂ（ＳＵＳ、Ｍａｌｍｏ、Ｓｗｅｄｅｎ）で、内部サイズ標準ＧｅｎｅＳｃａｎ ＬＩＺ ６００（２０～６００塩基の範囲、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＡＢＩ ３１３０ ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分析した。データは、ローカル・サザン・アルゴリズム（ｌｏｃａｌ ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いてＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアバージョン４．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。未知のＴ－ＲＦの正確なサイジングには４つの内部標準が必要であることを考慮して、Ｔ－ＲＦを４０塩基と５８０塩基との間で分解した。相対面積率は、多様性指数の計算に使用した各Ｔ－ＲＦについて計算した。
Ｔ－ＲＦＬＰにより微生物多様性を決定するために、５００μＬのＰＢＳ緩衝液を５０ｍｇの試料に添加することによって大腸及び小腸の内容物からＤＮＡを抽出し、室温で１０分間インキュベートした。その後、遠心分離工程（３０秒、３０００ｒｐｍ）の後、エッペンドルフミキサ（Ｍｏｄｅｌ ５４３２、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で４℃にて４５分間にわたりビーズ破砕工程を行った。次いで、２００μＬの上清をＥＺ１ ＤＮＡ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）中の滅菌試料チューブに移し、Ｂｉｏｒｏｂｏｔ ＥＺ１ワークステーション（Ｑｉａｇｅｎ）の製造業者の指示に従ってＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ及び制限エンドヌクレアーゼ（ＭＳＰＩ）消化を行った。消化したアンプリコンを、ＤＮＡ ｌａｂ（ＳＵＳ、Ｍａｌｍｏ、Ｓｗｅｄｅｎ）で、内部サイズ標準ＧｅｎｅＳｃａｎ ＬＩＺ ６００（２０～６００塩基の範囲、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＡＢＩ ３１３０ ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分析した。データは、ローカル・サザン・アルゴリズム（ｌｏｃａｌ ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いてＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアバージョン４．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。未知のＴ－ＲＦの正確なサイジングには４つの内部標準が必要であることを考慮して、Ｔ－ＲＦを４０塩基と５８０塩基との間で分解した。相対面積率は、多様性指数の計算に使用した各Ｔ－ＲＦについて計算した。
【0072】
多重サイトカイン／ケモカイン分析
サイトカイン及びケモカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ１－β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｐ７０、ＴＮＦ－α）の定量的分析のために、血清試料を解凍し、製造業者の指示に従って９６ウェルＶ－ｐｌｅｘ炎症促進性パネル１（マウス）プレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）へ１：２希釈にて２連で添加した。プレートを、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｓ６００プレートリーダ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ）を用いて読み取った。
サイトカイン及びケモカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ１－β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｐ７０、ＴＮＦ－α）の定量的分析のために、血清試料を解凍し、製造業者の指示に従って９６ウェルＶ－ｐｌｅｘ炎症促進性パネル１（マウス）プレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）へ１：２希釈にて２連で添加した。プレートを、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｓ６００プレートリーダ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ）を用いて読み取った。
【0073】
フローサイトメトリー
パイエル板及び腸間膜リンパ節を湾曲したはさみで１ｍｍ片に切断し、上清及び脂肪を除去した。次いで、組織を、コラゲナーゼＰ（０．８ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、ディスパーゼＩＩ（３．２ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＤＮＡｓｅ（０、１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて３７℃で１０分間消化した。上清を収集し、全ての組織が消化されるまで消化を２回繰り返した。遠心分離（１４００ｒｐｍ、５分、４℃）の後、上清を除去し、１０％ウシ胎児血清（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＵＳＡ）及び濾過した（４０μｍのセルストレーナ（ＶＷＲ））を含むＨＢＳＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｎｕａｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）中に再懸濁した。フロースルーを遠心分離し（１４００ｒｐｍ、５分、４℃）、上清を除去し、ペレットをＨＢＳＳに再懸濁した。細胞の画分を、Ｔｕｒｋｓ’（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色し、計数した。懸濁液を、ＨＢＳＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ）で１０６細胞に希釈し、以下の抗体（ａｂ）の組合せで４℃にて一晩染色した：ＴＬＲ２／ＣＤ１１ｃ／Ｆ４：８０／ＴＬＲ４（パネル１）；ＣＣＲ９／ＣＤ４／ＣＤ６９／ＣＤ８ａ（パネル２）；ＣＤ４／ＣＤ６９／ＣＤ２５／ＦｏｘＰ３（パネル３）。全ての組合せは、非抗原特異的Ｆｃ結合を遮断し、ダンプチャネルとして使用するためのＣＤ１６／ＣＤ３２ａｂを含有した（全ての抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡからのものである）。核内ＦｏｘＰ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）染色のために、細胞を製造業者の指示に従って固定し、透過処理し、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁した。
パイエル板及び腸間膜リンパ節を湾曲したはさみで１ｍｍ片に切断し、上清及び脂肪を除去した。次いで、組織を、コラゲナーゼＰ（０．８ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、ディスパーゼＩＩ（３．２ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＤＮＡｓｅ（０、１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて３７℃で１０分間消化した。上清を収集し、全ての組織が消化されるまで消化を２回繰り返した。遠心分離（１４００ｒｐｍ、５分、４℃）の後、上清を除去し、１０％ウシ胎児血清（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＵＳＡ）及び濾過した（４０μｍのセルストレーナ（ＶＷＲ））を含むＨＢＳＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｎｕａｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）中に再懸濁した。フロースルーを遠心分離し（１４００ｒｐｍ、５分、４℃）、上清を除去し、ペレットをＨＢＳＳに再懸濁した。細胞の画分を、Ｔｕｒｋｓ’（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色し、計数した。懸濁液を、ＨＢＳＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ）で１０６細胞に希釈し、以下の抗体（ａｂ）の組合せで４℃にて一晩染色した：ＴＬＲ２／ＣＤ１１ｃ／Ｆ４：８０／ＴＬＲ４（パネル１）；ＣＣＲ９／ＣＤ４／ＣＤ６９／ＣＤ８ａ（パネル２）；ＣＤ４／ＣＤ６９／ＣＤ２５／ＦｏｘＰ３（パネル３）。全ての組合せは、非抗原特異的Ｆｃ結合を遮断し、ダンプチャネルとして使用するためのＣＤ１６／ＣＤ３２ａｂを含有した（全ての抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡからのものである）。核内ＦｏｘＰ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）染色のために、細胞を製造業者の指示に従って固定し、透過処理し、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁した。
【0074】
非染色細胞を対照として使用し、補償のために、ＶｅｒｓａＣｏｍｐ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）で実行した。Ｃｙｔｅｘｐｅｒｔ ２．０（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ソフトウェアを用いてデータ分析を行い、試料あたり５００００事象を評価した。ＰＰ及びＭＬＮの両方からのリンパ球集団を、前方散乱（ＦＳＣ）特性及び側方散乱（ＳＳＣ）特性に基づいて最初にゲーティングした。このゲートから、ＦＳＣ及びＦＳＣ－Ｗｉｄｔｈに基づいてシングレットを選択した。パネル１については、マクロファージ及び樹状細胞を、それぞれＦ４／８０及びＣＤ１１ｃに対する陽性染色によってシングレットから同定し、次いで、それらのゲートを更に使用してＴＬＲ２及び／又はＴＬＲ４の発現を分析した。パネル２については、ＣＤ８＋細胞及びＣＤ４＋細胞をシングレットから選択し、腸ホーミング及び活性化、ＣＣＲ９発現及びＣＤ６９発現について個別にゲーティングした。パネル３については、活性化及び休止制御性Ｔ細胞を、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ６９－及びＦｏｘｐ３＋ＣＤ６９＋によってシングレットから選択した。
【0075】
インビトロ試験
細菌溶液
動物試験（セクション２．１．１）で使用したのと同じ拮抗株を、ＰＢＳ １０＾９ＣＦＵ／ｍＬで調製し、７０℃で３０分間にわたり熱不活性化した。熱不活性化は５日間にわたり寒天上の生存率対照によって確認され、コロニー成長は検出されなかった。さらに、３つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の株（他の細菌溶液と同じ方法で調製）を比較のために使用した。
細菌溶液
動物試験（セクション２．１．１）で使用したのと同じ拮抗株を、ＰＢＳ １０＾９ＣＦＵ／ｍＬで調製し、７０℃で３０分間にわたり熱不活性化した。熱不活性化は５日間にわたり寒天上の生存率対照によって確認され、コロニー成長は検出されなかった。さらに、３つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の株（他の細菌溶液と同じ方法で調製）を比較のために使用した。
【0076】
単球の単離及びＭｏＤＣへの分化
末梢血単核細胞を、勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、末梢血対Ｆｉｃｏｌｌ比：１：１）を用いて、白血球濃縮物（Ｌｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から単離した。抗ヒトＣＤ１４磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂ．Ｖ．＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＣＤ１４＋細胞を単離し、結果をフローサイトメトリーによって確認した。次いで、６ウェルプレート中のＲ１０培地（ＲＰＭＩ １６４０（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標））、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン）中で細胞を成長させた。単球をＭｏＤＣへと分化させるために、サイトカインヒト組換えＧＭ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（１５０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍＬ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を培地に添加した。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２の存在下において８日間培養し、３日目及び６日目に、培地の半分を交換した。
末梢血単核細胞を、勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、末梢血対Ｆｉｃｏｌｌ比：１：１）を用いて、白血球濃縮物（Ｌｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から単離した。抗ヒトＣＤ１４磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂ．Ｖ．＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＣＤ１４＋細胞を単離し、結果をフローサイトメトリーによって確認した。次いで、６ウェルプレート中のＲ１０培地（ＲＰＭＩ １６４０（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標））、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン）中で細胞を成長させた。単球をＭｏＤＣへと分化させるために、サイトカインヒト組換えＧＭ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（１５０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍＬ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を培地に添加した。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２の存在下において８日間培養し、３日目及び６日目に、培地の半分を交換した。
【0077】
細菌調製物によるＭｏＤＣの刺激
培養７日目にＣＤ１４（Ｄａｋｏ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）とＣＤ１ａ（Ｄａｋｏ）で染色することによって、ＭｏＤＣへの分化を確認した（ＣＤ１４－ＣＤ１ａ＋が分化）。分化の８日目に、ＭｏＤＣを計数し、細菌調製物を添加した。細菌細胞とＭｏＤＣとの比は、ＦＡＣＳ分析では１：１であり、多重サイトカインアッセイでは１０：１であった。細胞の濃度は５００，０００細胞／ｍＬであり、細胞を２４ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルで播種した。ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）を陽性対照として使用し、ＰＢＳを陰性対照として使用した。次いで、細胞を、Ｒ１０培地を用いて５％ＣＯ２の存在下において、３７℃で２４時間培養した。
培養７日目にＣＤ１４（Ｄａｋｏ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）とＣＤ１ａ（Ｄａｋｏ）で染色することによって、ＭｏＤＣへの分化を確認した（ＣＤ１４－ＣＤ１ａ＋が分化）。分化の８日目に、ＭｏＤＣを計数し、細菌調製物を添加した。細菌細胞とＭｏＤＣとの比は、ＦＡＣＳ分析では１：１であり、多重サイトカインアッセイでは１０：１であった。細胞の濃度は５００，０００細胞／ｍＬであり、細胞を２４ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルで播種した。ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）を陽性対照として使用し、ＰＢＳを陰性対照として使用した。次いで、細胞を、Ｒ１０培地を用いて５％ＣＯ２の存在下において、３７℃で２４時間培養した。
【0078】
フローサイトメトリー
２４時間の刺激の後、細胞を、マウスＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｅｌｙ、ＵＫ）で遮断し、ＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、２ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄し、以下の抗体と４℃で１５分間インキュベートした：ＣＤ１４（Ｄａｋｏ）、ＣＤ１ａ（Ｄａｋｏ）、ＨＬＡ－ＤＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８６（ＢＤ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８０（ＢＤ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ５４（ＢＤ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ）、ＴＬＲ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＳ、ＵＳＡ）、ＴＬＲ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、１００００事象を収集した。データをＦＣＳ ｅｘｐｒｅｓｓ ４（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｇｌｅｎｄａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分析した。生存細胞をゲーティングした。前方散乱及び側方散乱を使用して生存細胞をゲーティングする（ゲート１）。ゲート１から、ＰＥ及びＦＩＴＣ陽性細胞を選択した。第２のプロットでは、ゲート１を使用してＡＰＣ及びＦＩＴＣ陽性細胞を選択した。細菌で処理した細胞の活性化度を、以下に従って各マーカについて計算した：
２４時間の刺激の後、細胞を、マウスＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｅｌｙ、ＵＫ）で遮断し、ＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、２ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄し、以下の抗体と４℃で１５分間インキュベートした：ＣＤ１４（Ｄａｋｏ）、ＣＤ１ａ（Ｄａｋｏ）、ＨＬＡ－ＤＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８６（ＢＤ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８０（ＢＤ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ５４（ＢＤ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ）、ＴＬＲ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＳ、ＵＳＡ）、ＴＬＲ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、１００００事象を収集した。データをＦＣＳ ｅｘｐｒｅｓｓ ４（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｇｌｅｎｄａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分析した。生存細胞をゲーティングした。前方散乱及び側方散乱を使用して生存細胞をゲーティングする（ゲート１）。ゲート１から、ＰＥ及びＦＩＴＣ陽性細胞を選択した。第２のプロットでは、ゲート１を使用してＡＰＣ及びＦＩＴＣ陽性細胞を選択した。細菌で処理した細胞の活性化度を、以下に従って各マーカについて計算した：
【0079】
【数1】
【0080】
ＨＬＡ－ＤＲでは、陽性細胞の割合は全ての試料においてほぼ９８％であるので、代わりに以下の式を使用することで、放出された蛍光色素光の強度を示した：
【0081】
【数2】
【0082】
多重サイトカインアッセイ（インビトロ試料）
１０：１の細菌細胞対ヒト細胞比での２４時間の細菌刺激の後に収集された細胞培養物からの上清を、製造業者の指示に従って（例外；ビーズを１０秒の代わりに６０秒ボルテックスした）、マルチプレックス免疫アッセイ（Ｈｕｍａｎ Ｃｕｓｔｏｍ ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ（商標）１０－ｐｌｅｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて、１０種の異なるサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ１－β、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｐ７０、ＴＮＦ－α）の濃度について分析した。次いで、サイトカインの濃度を、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ（商標）２００システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて反復実験で測定した。
１０：１の細菌細胞対ヒト細胞比での２４時間の細菌刺激の後に収集された細胞培養物からの上清を、製造業者の指示に従って（例外；ビーズを１０秒の代わりに６０秒ボルテックスした）、マルチプレックス免疫アッセイ（Ｈｕｍａｎ Ｃｕｓｔｏｍ ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ（商標）１０－ｐｌｅｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて、１０種の異なるサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ１－β、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｐ７０、ＴＮＦ－α）の濃度について分析した。次いで、サイトカインの濃度を、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ（商標）２００システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて反復実験で測定した。
【0083】
統計分析
飼料摂取量及び水分摂取量、ＭＰＯ活性サイトカイン／ケモカインのデータ、多様性指数、及びＦＡＣＳデータの統計学的計算を、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ ｖ１３．０ソフトウェア（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＵＳＡ）を用いて行った。全ての群間の差異をクラスカル・ウォリスの順位に基づく一元配置分散分析によって評価し、２つの実験群間の差をマン・ホイットニー順位和検定によって評価した。ｐ≦．０５である場合、結果は統計的に有意であるとみなした。値は２５パーセンタイル及び７５パーセンタイルの中央値として提示される。群内のＴ－ＲＦの発生頻度の統計的計算をフィッシャー検定で行った。細胞培養物からのＦＡＣＳデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いたフリードマン検定で評価した。
飼料摂取量及び水分摂取量、ＭＰＯ活性サイトカイン／ケモカインのデータ、多様性指数、及びＦＡＣＳデータの統計学的計算を、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ ｖ１３．０ソフトウェア（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＵＳＡ）を用いて行った。全ての群間の差異をクラスカル・ウォリスの順位に基づく一元配置分散分析によって評価し、２つの実験群間の差をマン・ホイットニー順位和検定によって評価した。ｐ≦．０５である場合、結果は統計的に有意であるとみなした。値は２５パーセンタイル及び７５パーセンタイルの中央値として提示される。群内のＴ－ＲＦの発生頻度の統計的計算をフィッシャー検定で行った。細胞培養物からのＦＡＣＳデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いたフリードマン検定で評価した。
【0084】
インビボ試験
動物
動物試験中の動物の体重並びに飼料摂取量及び水摂取量の記録は、表１で見ることができる。データは、実験期間全体にわたって分析され、また、２つの部へと分割される；動物が抗生物質及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を投与されたときの前処置期間、及び動物が飲料水で拮抗細菌を投与されたときの処置期間。３週間の全実験期間にわたって、動物は、１．０～１．９ｇの間で体重が増加し、６１．０～６３．９ｇの間で飼料を摂取した。水分摂取量は、１日あたり１８．５～２０．０ｍＬの間であった。処置対照群（Ｋ）と比較した群間の中央値の有意な変化は、体重、飼料、又は水分摂取量について開始から終了まで見られず、また処置期間中も見られなかった。処置前期間中、正常対照群（Ｎ）と比較した体重の増加が、Ｃ群を除く全ての群で観察された。
動物
動物試験中の動物の体重並びに飼料摂取量及び水摂取量の記録は、表１で見ることができる。データは、実験期間全体にわたって分析され、また、２つの部へと分割される；動物が抗生物質及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を投与されたときの前処置期間、及び動物が飲料水で拮抗細菌を投与されたときの処置期間。３週間の全実験期間にわたって、動物は、１．０～１．９ｇの間で体重が増加し、６１．０～６３．９ｇの間で飼料を摂取した。水分摂取量は、１日あたり１８．５～２０．０ｍＬの間であった。処置対照群（Ｋ）と比較した群間の中央値の有意な変化は、体重、飼料、又は水分摂取量について開始から終了まで見られず、また処置期間中も見られなかった。処置前期間中、正常対照群（Ｎ）と比較した体重の増加が、Ｃ群を除く全ての群で観察された。
【0085】
【表2】
【0086】
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）
好中球に見られる酵素であり、かつ局所腸炎症のマーカであるＭＰＯのレベルを、小腸及び大腸で測定した。群間のＭＰＯ濃度の中央値の統計学的に有意な差は、大腸又は小腸では見られなかったが、小腸にＲ．セラスチイ（Ｒ．ｃｅｒａｓｔｉｉ）を投与された動物では減少傾向が見られた（Ｃ群）。Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）の異なる株を投与されたＤ群及びＥ群については、減少傾向が小腸及び大腸の両方で見ることができる。
好中球に見られる酵素であり、かつ局所腸炎症のマーカであるＭＰＯのレベルを、小腸及び大腸で測定した。群間のＭＰＯ濃度の中央値の統計学的に有意な差は、大腸又は小腸では見られなかったが、小腸にＲ．セラスチイ（Ｒ．ｃｅｒａｓｔｉｉ）を投与された動物では減少傾向が見られた（Ｃ群）。Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）の異なる株を投与されたＤ群及びＥ群については、減少傾向が小腸及び大腸の両方で見ることができる。
【0087】
末端制限酵素断片多型、Ｔ－ＦＲＬＰ
小腸における１７個の末端制限断片（Ｔ－ＲＦ）が、群間及び処置対照（Ｋ）間で有意に異なる発生数で検出された（表２）。２～４個のＴ－ＲＦは、異なる処置群（Ａ～Ｅ）でのみ検出され、処置対照群（Ｋ）では検出されなかった。大腸では、対照と比較して有意に異なる発生数で２５個のＴ－ＲＦを検出することができ（表３）、対照群と比較して処置群でのみ３～６個のＴ－ＲＦが検出された。ほとんどの新しいピークは、Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）を投与したＡ群で検出され、最も少ない新しいピークは、小腸と大腸の両方でＰ．プノネンシス（Ｐ．ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）（Ｂ）を投与した動物で検出された。
小腸における１７個の末端制限断片（Ｔ－ＲＦ）が、群間及び処置対照（Ｋ）間で有意に異なる発生数で検出された（表２）。２～４個のＴ－ＲＦは、異なる処置群（Ａ～Ｅ）でのみ検出され、処置対照群（Ｋ）では検出されなかった。大腸では、対照と比較して有意に異なる発生数で２５個のＴ－ＲＦを検出することができ（表３）、対照群と比較して処置群でのみ３～６個のＴ－ＲＦが検出された。ほとんどの新しいピークは、Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）を投与したＡ群で検出され、最も少ない新しいピークは、小腸と大腸の両方でＰ．プノネンシス（Ｐ．ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）（Ｂ）を投与した動物で検出された。
【0088】
【表3】
【0089】
【表4】
【0090】
微生物多様性は、試料の総面積に比例した各試料のピーク面積を用いて、Ｔ－ＲＦＬＰパターンに基づいて計算された。これは、表５で見ることができる。シャノン・ウィナー多様性指数（Ｈ’）の中央値は、小腸における処置対照群（Ｋ）での１．２２と比較して、処置群では１．３１～１．４９の間で変動した。大腸では、シャノン・ウィナー多様性指数は、処置対照（Ｋ）と比較して、処置群で２．２０～２．５０の間で変動する。小腸のＢ群（Ｐ．プノネンシス（Ｐ．ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ））及び大腸のＥ群（Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ））は両方とも、処置対照群（Ｋ）と有意に異なる中央値を有した。シンプソン指数の中央値は、大腸では処置対照（Ｋ）と比較して処置群（Ａ～Ｅ）について０．７４～０．８９の間で変動し、小腸では処置対照と比較して処置群について０．５７～０．７０の間の範囲であった。大腸におけるＥ群のシンプソン指数の中央値は、処置対照群の中央値と有意に異なっていた。
【0091】
【表5】
【0092】
多重サイトカイン／ケモカイン分析
マウス血清中のサイトカイン／ケモカインのレベルを試験終了時に測定した。拮抗細菌の投与は、処置対照であるＫと比較して、Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）（Ａ）及びＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）（Ｄ，Ｅ）を投与された動物において、有意に高いレベルのＩＦＮ－γをもたらした。そのうえ、Ｋと比較して、群Ｃ（Ｒ．セラスチイ（Ｒ．ｃｅｒａｓｔｉｉ））、Ｄ及びＥでは、有意に高いレベルのＫＣ／ＧＲＯが観察された。
マウス血清中のサイトカイン／ケモカインのレベルを試験終了時に測定した。拮抗細菌の投与は、処置対照であるＫと比較して、Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）（Ａ）及びＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）（Ｄ，Ｅ）を投与された動物において、有意に高いレベルのＩＦＮ－γをもたらした。そのうえ、Ｋと比較して、群Ｃ（Ｒ．セラスチイ（Ｒ．ｃｅｒａｓｔｉｉ））、Ｄ及びＥでは、有意に高いレベルのＫＣ／ＧＲＯが観察された。
【0093】
フローサイトメトリー
パイエル板及び腸間膜リンパ節からの単核免疫細胞をフローサイトメトリーによって分析した。腸間膜リンパ節（図７）では、活性化ＣＤ４＋免疫細胞（Ｔ細胞、樹状細胞、及びマクロファージを含む）及びＣＤ８＋細胞（主に、細胞傷害性Ｔ細胞によって発現）の割合は、正常対照（Ｎ）と比較して、処置対照（Ｋ）で減少した。ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の両方について、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）（Ｄ，Ｅ）を投与された動物はＫよりも大きな集団を有し、Ａ群（Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ））及びＣ群（Ｒ．セラスチイ（Ｒ．ｃｅｒａｓｔｉｉ））はＫよりも小さな集団を有する。樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）及びマクロファージ（Ｆ４／８０＋）のグラム陽性細菌誘導調節（ＴＬＲ２＋）では、集団はＮからＫに増加する。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株及びＲ．セラスチイ（Ｒ．ｃｅｒａｓｔｉｉ）（Ａ～Ｃ）を投与された群は、ＣＤ１１ｃ（樹状細胞）のＫと同じレベルのままであるが、一方で、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）（Ｄ、Ｅ）を投与された群は、正常対照と同じレベルに戻る。Ｆ４／８０（マクロファージ）では、全ての群が処置対照と同じレベル以上である。活性化制御性Ｔ細胞（ＣＤ６９＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋）レベルは、正常対照から処置対照に減少し、全ての処置群において、処置対照と比較してより高いレベルのこれらの細胞が見出された。
パイエル板及び腸間膜リンパ節からの単核免疫細胞をフローサイトメトリーによって分析した。腸間膜リンパ節（図７）では、活性化ＣＤ４＋免疫細胞（Ｔ細胞、樹状細胞、及びマクロファージを含む）及びＣＤ８＋細胞（主に、細胞傷害性Ｔ細胞によって発現）の割合は、正常対照（Ｎ）と比較して、処置対照（Ｋ）で減少した。ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の両方について、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）（Ｄ，Ｅ）を投与された動物はＫよりも大きな集団を有し、Ａ群（Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ））及びＣ群（Ｒ．セラスチイ（Ｒ．ｃｅｒａｓｔｉｉ））はＫよりも小さな集団を有する。樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）及びマクロファージ（Ｆ４／８０＋）のグラム陽性細菌誘導調節（ＴＬＲ２＋）では、集団はＮからＫに増加する。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株及びＲ．セラスチイ（Ｒ．ｃｅｒａｓｔｉｉ）（Ａ～Ｃ）を投与された群は、ＣＤ１１ｃ（樹状細胞）のＫと同じレベルのままであるが、一方で、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）（Ｄ、Ｅ）を投与された群は、正常対照と同じレベルに戻る。Ｆ４／８０（マクロファージ）では、全ての群が処置対照と同じレベル以上である。活性化制御性Ｔ細胞（ＣＤ６９＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋）レベルは、正常対照から処置対照に減少し、全ての処置群において、処置対照と比較してより高いレベルのこれらの細胞が見出された。
【0094】
インビトロ試験
２４ウェルプレートでの細菌刺激の前に、細胞を顕微鏡で確認し、細胞が全てのウェルで同様の丸い形状を有し、少数の単一細胞のみがウェルに付着していることを見出した。２４時間の刺激後、細菌調製物Ｂ及び細菌調製物Ｃとインキュベートした細胞は、おそらく活性化を示す小さなクラスタを形成し、プレート表面に付着した。細菌であるＰ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）（Ａ）及びＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）（Ｄ，Ｅ）とインキュベートした細胞は、クラスタをほとんど有せず、プレート表面にもまたほとんど付着していなかった。未処理細胞及びＰＢＳで処理した細胞はクラスタ形成を示さず、また、少数の細胞が付着していた。細胞生存率は、使用した全てのドナーにおいて９５％超であった。
２４ウェルプレートでの細菌刺激の前に、細胞を顕微鏡で確認し、細胞が全てのウェルで同様の丸い形状を有し、少数の単一細胞のみがウェルに付着していることを見出した。２４時間の刺激後、細菌調製物Ｂ及び細菌調製物Ｃとインキュベートした細胞は、おそらく活性化を示す小さなクラスタを形成し、プレート表面に付着した。細菌であるＰ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）（Ａ）及びＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）（Ｄ，Ｅ）とインキュベートした細胞は、クラスタをほとんど有せず、プレート表面にもまたほとんど付着していなかった。未処理細胞及びＰＢＳで処理した細胞はクラスタ形成を示さず、また、少数の細胞が付着していた。細胞生存率は、使用した全てのドナーにおいて９５％超であった。
【0095】
フローサイトメトリーによって評価されるＭｏＤＣ活性化マーカ発現
５人の個体に由来するヒトＭｏＤＣを、対照及び異なる細菌調製物で２４時間にわたり刺激した。樹状細胞活性化マーカであるＣＤ８０／ＣＤ８６及びＨＬＡ－ＤＲを、フローサイトメトリーによって調査した。この結果を図８に示す。全体として、同様のパターンが観察され得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３、並びに細菌調製物Ａ２及び細菌調製物Ａ３で刺激した細胞は、未処理細胞及びＰＢＳで処理した細胞と比較して、ＭｏＤＣのより高い活性化を引き起こすようであった。全てのマーカについて同様のパターンが見られる。最も一貫した顕著な活性化は、異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株によって誘導された（ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現について対照と比較して有意）。シュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）（Ｂ）及びロドコッカス・セラスチイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｒａｓｔｉｉ）（Ｃ）もまた、ＣＤ８０の発現増加をもたらし、これは、ＣＤ８６発現のパターン及びＨＬＡ－ＤＲ発現の蛍光強度の中央値の増加によって反映される。対照的に、シュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）（Ａ）及びＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）株（Ｄ及びＥ）に曝露された細胞は、本明細書で観察されるＤＣ活性化マーカの変化を誘導しないようであった。
５人の個体に由来するヒトＭｏＤＣを、対照及び異なる細菌調製物で２４時間にわたり刺激した。樹状細胞活性化マーカであるＣＤ８０／ＣＤ８６及びＨＬＡ－ＤＲを、フローサイトメトリーによって調査した。この結果を図８に示す。全体として、同様のパターンが観察され得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３、並びに細菌調製物Ａ２及び細菌調製物Ａ３で刺激した細胞は、未処理細胞及びＰＢＳで処理した細胞と比較して、ＭｏＤＣのより高い活性化を引き起こすようであった。全てのマーカについて同様のパターンが見られる。最も一貫した顕著な活性化は、異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株によって誘導された（ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現について対照と比較して有意）。シュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）（Ｂ）及びロドコッカス・セラスチイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｒａｓｔｉｉ）（Ｃ）もまた、ＣＤ８０の発現増加をもたらし、これは、ＣＤ８６発現のパターン及びＨＬＡ－ＤＲ発現の蛍光強度の中央値の増加によって反映される。対照的に、シュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）（Ａ）及びＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）株（Ｄ及びＥ）に曝露された細胞は、本明細書で観察されるＤＣ活性化マーカの変化を誘導しないようであった。
【0096】
多重サイトカインプロファイリング
細菌細胞とＭｏＤＣとの１０：１の比での細菌刺激後の３名のドナーからの細胞培養上清を収集して、発現したサイトカインを定量化した。図９には、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１β、及びＩＦＮ－γの濃度が提示されており、残りのサイトカインデータは、高い変動及び明確な傾向がないため示されていない。反復回数が少ないことに起因して、統計的評価は行われなかった。
細菌細胞とＭｏＤＣとの１０：１の比での細菌刺激後の３名のドナーからの細胞培養上清を収集して、発現したサイトカインを定量化した。図９には、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１β、及びＩＦＮ－γの濃度が提示されており、残りのサイトカインデータは、高い変動及び明確な傾向がないため示されていない。反復回数が少ないことに起因して、統計的評価は行われなかった。
【0097】
ＭｏＤＣ活性化について観察されたのと同様のパターンが出現した：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、並びにＰ．プノネンシス（Ｐ．ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）（Ｂ）及びＲ．セラスチイ（Ｒ．ｃｅｒａｓｔｉｉ）（Ｃ）は、陰性対照（ＰＢＳ）と比較して、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１β、及びＩＦＮ－γの生産を刺激することができるようであった。ＩＬ－６レベルはまた、ＬＰＳ及びＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）刺激に応答して増加するように見えた（Ｄ及びＥ）。
【0098】
実験を結論付けるために、マウスにおける大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）拮抗性細菌株の免疫調節効果は、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）株を投与したＤ群及びＥ群が一貫して正常対照により類似していることを示しており、これは、抗生物質及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による前処理からの回復、及び腸内のより低い炎症状態を示している。これは、ＤＣ活性化マーカ発現及び炎症促進性サイトカイン発現の増加が全く見られないか、又はわずかしか見られないヒトＭｏＤＣを用いて、インビトロで得られた結果と一致している。Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）の２つの株はプラスの効果を生じるようである。本発明によれば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する生物的防除としてＢ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）を使用し、緑色葉物野菜に対する安全性を高めることについての大きな初期可能性が示されている。
【0099】
最後に、本発明によれば、商業的な現場環境での生きている植物におけるヒト病原体に対して潜在的能力を有する、４つの拮抗性細菌株、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４であるシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７であるシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）が提供された。上記の当該細菌株による種子コーティングを通して、消費者にとってより健康な方向で植物の微生物組成物に影響を及ぼすことが可能であることが示されている。このようにして、緑色葉物野菜への病原体の増殖及び拡散のリスクを低減することができ、将来のそれらの関連するアウトブレイクの結果を緩和することができる。さらに、インビボでの全ての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）拮抗株の投与は、処理対照と比較して微生物叢に対する回復効果を認め、株のうちの２つ（シュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）及びバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ））は、宿主の健康と相関して、シャノン・ウィナー多様性指数を増加させた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【手続補正書】
【提出日】2023-12-05
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項8】
種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための、又は生物肥料としての、請求項１ないし４のいずれか1項に記載の少なくとも１つの細菌株又は請求項５ないし７のいずれか1項に記載の組成物の使用。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0099】
最後に、本発明によれば、商業的な現場環境での生きている植物におけるヒト病原体に対して潜在的能力を有する、４つの拮抗性細菌株、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４であるシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６であるバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７であるシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）が提供された。上記の当該細菌株による種子コーティングを通して、消費者にとってより健康な方向で植物の微生物組成物に影響を及ぼすことが可能であることが示されている。このようにして、緑色葉物野菜への病原体の増殖及び拡散のリスクを低減することができ、将来のそれらの関連するアウトブレイクの結果を緩和することができる。さらに、インビボでの全ての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）拮抗株の投与は、処理対照と比較して微生物叢に対する回復効果を認め、株のうちの２つ（シュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）及びバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ））は、宿主の健康と相関して、シャノン・ウィナー多様性指数を増加させた。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４を有するシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７を有するシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）からなる群から選択される食用葉から単離される細菌株
［２］
前記細菌株は、種子及び野菜におけるヒト病原体及び植物病原体の確立及び成長を防止するためのものである［１］に記載の細菌株。
［３］
種子及び野菜におけるヒト病原菌であるエシュリヒア属及び腸内細菌種の拡散を防止するためのものである［１］又は［２］に記載の細菌株。
［４］
前記野菜は、緑色葉物野菜である［１］ないし［３］のいずれか１に記載の細菌株。
［５］
アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４を有するシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７を有するシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）からなる群から選択された少なくとも１つの細菌株を含む組成物であって、種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための組成物。
［６］
前記組成物は、種子及び野菜におけるヒト病原体及び植物病原体の確立及び成長を防止するためのものである［１］に記載の組成物。
［７］
前記組成物は、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４を有するシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７を有するシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）の組み合わせを含む［５］又は［６］に記載の組成物。
［８］
種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための、［１］ないし［４］のいずれか1に記載の少なくとも１つの細菌株又は［５］ないし［７］のいずれか1に記載の組成物の使用。
［９］
前記野菜は、緑色葉物野菜である［８］に記載の使用。
［１０］
前記少なくとも１つの株は、パッケージング前に野菜を洗浄するための洗浄水に添加されるか、又は包装中の野菜のパッケージング前、パッケージング中、又はパッケージング後に野菜に噴霧される、［８］又は［９］に記載の使用。
［１１］
前記少なくとも１つの株は、灌漑用水に添加されるか、又は水耕栽培システムで栄養溶液へと添加される［８］又は［９］に記載の使用。
［１２］
前記少なくとも１つの株は、包装の内側に適用されるか、又は包装のライニング若しくは包装のパッケージング材料に適用される［８］又は［９］に記載の使用。
［１３］
前記少なくとも１つの株は、播種前に種子へコーティングされる［８］に記載の使用。
［１４］
前記少なくとも１つの株は、10 4 － 10 12 cfu/mlの量で種子上へコーティングされる［１２］に記載の使用。
［１５］
播種後に得られる葉野菜などの野菜における細菌多様性を増加させるための［１２］又は［１３］に記載の使用。
［１６］
アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４を有するシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７を有するシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）からなる群から選択される、単離された株。
［１７］
ヒトの感染からの保護に使用するための、少なくとも１つの［１］ないし［４］のいずれか1に記載の少なくとも1つの単離された株又は［５］ないし［７］のいずれか1に記載の組成物。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４を有するシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７を有するシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）からなる群から選択される食用葉から単離される細菌株
［２］
前記細菌株は、種子及び野菜におけるヒト病原体及び植物病原体の確立及び成長を防止するためのものである［１］に記載の細菌株。
［３］
種子及び野菜におけるヒト病原菌であるエシュリヒア属及び腸内細菌種の拡散を防止するためのものである［１］又は［２］に記載の細菌株。
［４］
前記野菜は、緑色葉物野菜である［１］ないし［３］のいずれか１に記載の細菌株。
［５］
アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４を有するシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７を有するシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）からなる群から選択された少なくとも１つの細菌株を含む組成物であって、種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための組成物。
［６］
前記組成物は、種子及び野菜におけるヒト病原体及び植物病原体の確立及び成長を防止するためのものである［１］に記載の組成物。
［７］
前記組成物は、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４を有するシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７を有するシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）の組み合わせを含む［５］又は［６］に記載の組成物。
［８］
種子及び野菜におけるヒト病原体の確立及び成長を防止するための、［１］ないし［４］のいずれか1に記載の少なくとも１つの細菌株又は［５］ないし［７］のいずれか1に記載の組成物の使用。
［９］
前記野菜は、緑色葉物野菜である［８］に記載の使用。
［１０］
前記少なくとも１つの株は、パッケージング前に野菜を洗浄するための洗浄水に添加されるか、又は包装中の野菜のパッケージング前、パッケージング中、又はパッケージング後に野菜に噴霧される、［８］又は［９］に記載の使用。
［１１］
前記少なくとも１つの株は、灌漑用水に添加されるか、又は水耕栽培システムで栄養溶液へと添加される［８］又は［９］に記載の使用。
［１２］
前記少なくとも１つの株は、包装の内側に適用されるか、又は包装のライニング若しくは包装のパッケージング材料に適用される［８］又は［９］に記載の使用。
［１３］
前記少なくとも１つの株は、播種前に種子へコーティングされる［８］に記載の使用。
［１４］
前記少なくとも１つの株は、10 4 － 10 12 cfu/mlの量で種子上へコーティングされる［１２］に記載の使用。
［１５］
播種後に得られる葉野菜などの野菜における細菌多様性を増加させるための［１２］又は［１３］に記載の使用。
［１６］
アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０４を有するシュードモナス・プノネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｏｎｅｎｓｉｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、アクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０６を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ－３２２０７を有するシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）からなる群から選択される、単離された株。
［１７］
ヒトの感染からの保護に使用するための、少なくとも１つの［１］ないし［４］のいずれか1に記載の少なくとも1つの単離された株又は［５］ないし［７］のいずれか1に記載の組成物。
【国際調査報告】