特表2024-513205 | 知財ポータル「IP Force」

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特表2024-513205二重特異性抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ抗体およびその使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-22

(54)【発明の名称】二重特異性抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

C12N 15/62 20060101AFI20240314BHJP

C12N 15/13 20060101ALI20240314BHJP

C07K 16/46 20060101ALI20240314BHJP

C07K 16/28 20060101ALI20240314BHJP

C07K 16/22 20060101ALI20240314BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20240314BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20240314BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20240314BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20240314BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20240314BHJP

C12P 21/08 20060101ALI20240314BHJP

C12N 5/0783 20100101ALI20240314BHJP

C12N 5/09 20100101ALI20240314BHJP

A61K 47/65 20170101ALI20240314BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20240314BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240314BHJP

A61P 1/00 20060101ALI20240314BHJP

A61K 45/00 20060101ALI20240314BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20240314BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20240314BHJP

G01N 33/577 20060101ALI20240314BHJP

G01N 33/574 20060101ALI20240314BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/13

C07K16/46

C07K16/28

C07K16/22

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C12N5/0783

C12N5/09

A61K47/65

A61K48/00

A61P35/00

A61P1/00

A61K45/00

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K39/395 E

A61K39/395 D

A61K39/395 Y

A61P43/00 121

G01N33/577 B

G01N33/574 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023560435

(86)(22)【出願日】2022-03-30

(85)【翻訳文提出日】2023-10-23

(86)【国際出願番号】 CN2022084086

(87)【国際公開番号】W WO2022206843

(87)【国際公開日】2022-10-06

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/084447

(32)【優先日】2021-03-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518330176

【氏名又は名称】ウーシーバイオロジクスアイルランドリミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田達則

(72)【発明者】

【氏名】チンイー

(72)【発明者】

【氏名】ワンチュオチー

(72)【発明者】

【氏名】チェンユンイン

(72)【発明者】

【氏名】リーチン

(72)【発明者】

【氏名】クーチーチエ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA05

4B064DA14

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA95

4C076BB01

4C076BB13

4C076BB14

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB25

4C076BB29

4C076BB31

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF31

4C084AA13

4C084AA19

4C084MA02

4C084MA13

4C084MA16

4C084MA27

4C084MA28

4C084MA31

4C084MA34

4C084MA35

4C084MA37

4C084MA41

4C084MA43

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA57

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA63

4C084MA65

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA661

4C084ZA662

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC751

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB42

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C085GG08

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本開示は、二重特異性抗ＶＥＧＦ×ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合部分、該二重特異性抗体またはその抗原結合部分を産生する方法、該二重特異性抗体またはその抗原結合部分を使用して疾患または状態を治療する方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＶＥＧＦ抗原結合部分と結合したＰＤ－Ｌ１抗原結合部分を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合部分であって、ここで：
ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分は以下を含む：
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；および
ＶＥＧＦ抗原結合部分は以下を含む：
配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、
二重特異性抗体またはその抗原結合部分。

【請求項2】

前記ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分がｓｃＦｖであり、前記ＶＥＧＦ抗原結合部分がＦａｂである、請求項１に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分。

【請求項3】

請求項１または２に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分であって、ここで：
ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分は、配列番号１３のアミノ酸配列、または配列番号１３に対して少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１４のアミノ酸配列、または配列番号１４に対して少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み；および／または
ＶＥＧＦ抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列、または配列番号１５に対して少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１６に対して少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、
二重特異性抗体またはその抗原結合部分。

【請求項4】

ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分がＶＥＧＦ抗原結合部分のＮ末端に融合されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分。

【請求項5】

前記ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分が、必要に応じてリンカーを介して、ＶＥＧＦ抗原結合部分の重鎖のＮ末端に作動可能に連結されている、請求項４に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分。

【請求項6】

前記リンカーがペプチドリンカーであり、必要に応じて前記リンカーが１～４コピーのＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）を含むか、またはそれらからなる、請求項５に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分。

【請求項7】

重鎖および軽鎖を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分であって、ここで：
重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ｓｃＦｖ－ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－Ｆｃと同様に作動可能に連結されたドメインを含み、ここでｓｃＦｖはＰＤ－Ｌ１抗原結合部分に由来し、ＶＨ－ＣＨ１はＰＤ－Ｌ１抗原結合部分に由来する；および
軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬ－ＣＬと同様に作動可能に連結されたドメインを含み、ここでＶＬ－ＣＬはＶＥＧＦ抗原結合部分に由来する、
二重特異性抗体またはその抗原結合部分。

【請求項8】

前記Ｆｃ領域がヒトＩｇＧＦｃ領域、好ましくはヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域またはそのバリアントである、請求項７に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分。

【請求項9】

前記Ｆｃ領域が、ＥＵナンバリングによる（ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＥＵｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ置換を含む、請求項７または８に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分。

【請求項10】

前記重鎖が配列番号１７を含み、前記軽鎖が配列番号１８を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分。

【請求項11】

前記二重特異性抗体がヒト化抗体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。

【請求項13】

前記核酸配列が配列番号１９および／または配列番号２０を含む、請求項１２に記載の単離された核酸分子。

【請求項14】

請求項１２または１３に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項15】

請求項１２に記載の核酸分子または請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項16】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項17】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分を産生する方法であって、以下の工程を含む方法：
－二重特異性抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸配列を含む宿主細胞を適切な条件下で培養する工程；および
－二重特異性抗体またはその抗原結合部分を宿主細胞から単離する工程。

【請求項18】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合部分、または請求項１６に記載の医薬組成物を対象に投与することを含み、場合によって免疫応答はＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦに関連している、対象において免疫応答を調節するための方法。

【請求項19】

有効量の請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合部分、または請求項１６に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法。

【請求項20】

有効量の請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合部分、または請求項１６に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象におけるがんを予防または治療するための方法。

【請求項21】

前記がんがＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦに関連している、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記がんが結腸がんまたは結腸直腸がんである、請求項２０または２１に記載の方法。

【請求項23】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分が、がん免疫療法に使用するための化学療法剤、放射線、および／または他の薬剤と併用して投与される、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

ｉ）ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦに関連している免疫応答の調節において；
ｉｉ）Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン産生の増強において；および／または
ｉｉｉ）がん細胞に対する免疫応答の増強等の、免疫応答または機能の刺激において
使用するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分。

【請求項25】

がんの診断、治療、または予防に使用するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分。

【請求項26】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、その全体が参照により組み込まれる、２０２１年３月３１日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０８４４４７号の利益を主張する。

【0002】

配列表
本出願は、電子形式の配列表とともに提出される。配列表の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

分野
本開示は、概して、二重特異性抗ＰＤ－Ｌ１×ＶＥＧＦ抗体、その調製方法、およびその使用に関する。

【背景技術】

【0004】

血管新生は腫瘍の増殖および転移の進行に不可欠である。腫瘍関連血管新生の制御は、がん治療の有望な戦略である。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は血管新生の重要なメディエーターであり、様々な種類のヒトのがんで検証されている［１］。腫瘍細胞は近くの内皮細胞に結合するＶＥＧＦ等の成長因子を放出し、内皮細胞が分裂して新しい血管を形成するように刺激するシグナル伝達カスケードを開始する。受容体ＶＥＧＦＲを介したＶＥＧＦシグナル伝達は、多くの固形腫瘍の血管新生および増殖において重要な役割を果たす。ＶＥＧＦ経路を標的とするアバスチン（ベバシズマブ）等の抗血管新生薬は、臨床で成功を収めている。

【0005】

一方、プログラム死リガンド１［ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ１］（ＰＤ－Ｌ１）、またはその受容体であるプログラム死１［ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ１］（ＰＤ－１）等の免疫チェックポイント分子を標的とすることは、有望な臨床的成功を示している［２，３］。ＰＤ－Ｌ１発現は、様々な種類のがんにおける予後不良と強く相関している。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、腫瘍細胞および腫瘍浸潤免疫細胞に発現するＰＤ－Ｌ１を標的とし、Ｔ細胞表面のＰＤ－１およびＢ７．１への結合を阻止する。また、Ｔ細胞の活性化を可能にするだけでなく、腫瘍を攻撃するために他のＴ細胞の動員を可能にし、免疫系が複数の種類のがんと闘う力を強化する。

【0006】

抗ＶＥＧＦ療法は、確立された抗血管新生効果に加えて、ＶＥＧＦ関連の免疫抑制を阻害すること、Ｔ細胞腫瘍の浸潤を促進すること、ならびに腫瘍抗原に対するＴ細胞応答のプライミングおよび活性化を可能にすることにより、抗がん免疫を回復する抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法の能力をさらに強化し得る［４、５］。したがって、抗血管新生療法および免疫チェックポイント阻害を一緒に組み合わせたＶＥＧＦおよびＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体を開発すれば、がん治療において期待できる結果を達成できる可能性がある。

【0007】

ＶＥＧＦを標的にし、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療も標的とすることの明確な利点にもかかわらず、依然として満たされていない重要なニーズが存在する。１５％～２０％の患者は抗ＶＥＧＦ治療に反応せず、がん治療における抗ＶＥＧＦ薬の長期使用が腫瘍耐性を促進することを示す証拠が増えている。３％～９％の患者に治療の免疫原性が現れる。また、骨形態の変化、腎臓の炎症を伴う糸球体症、および副腎の炎症を伴う空胞形成の減少を含む、全生存期間の延長が限られ、安全性も限られているという問題もある。ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびアテゾリズマブ等のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断する免疫チェックポイント阻害剤は、多発がん患者の標準治療選択肢となる。しかし、これらの薬剤の奏効率は、選択されていない集団（ｕｎｓｅｌｅｃｔｅｄｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）では１４～２３％、ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍患者では１６～４８％であり、これらの薬剤は、すべての患者ではなく一部の患者で転帰の改善をもたらす。

【0008】

したがって、新規の抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体を開発するニーズが大きい。本開示では、ヒトＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦに高い親和性で同時に結合し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲシグナル伝達の両方を遮断し、優れた抗腫瘍効果を示すことができる二重特異性抗体が生成された。

【発明の概要】

【0009】

これらおよび他の目的は、広い意味で、改善された効果を示す抗体を提供する化合物、方法、組成物、および製品を対象とする本開示によって提供される。本開示によって提供される利点は、抗体医薬および診断の分野に広く適用可能であり、様々な標的と反応する抗体と併用することができる。

【0010】

一態様では、本開示は、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分およびＶＥＧＦ抗原結合部分を含む二重特異性抗体またはその抗原結合部分を提供する。

【0011】

一部の実施形態では、本開示は、ＶＥＧＦ抗原結合部分と結合したＰＤ－Ｌ１抗原結合部分を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで：
ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分は以下を含む：配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；および
ＶＥＧＦ抗原結合部分は以下を含む：配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３。

【0012】

特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分はｓｃＦｖであり、ＶＥＧＦ抗原結合部分はＦａｂである。

【0013】

特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分は、配列番号１３のアミノ酸配列、または配列番号１３に対して少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１４のアミノ酸配列、または配列番号１４に対して少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。

【0014】

特定の実施形態では、ＶＥＧＦ抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列、または配列番号１５に対して少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１６に対して少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。

【0015】

特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分がＶＥＧＦ抗原結合部分のＮ末端に融合されている。一部の他の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分がＶＥＧＦ抗原結合部分のＣ末端に融合されている。

【0016】

特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分が、必要に応じてリンカーを介して、ＶＥＧＦ抗原結合部分の軽鎖または重鎖のＮ末端に作動可能に連結されている。リンカーは、１～４コピーのＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）を含むか、またはそれらからなる。たとえば、リンカーは（Ｇ４Ｓ）_２であってもよい。

【0017】

特定の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体またはその抗原結合部分は、重鎖および軽鎖を含み、ここで：
重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ｓｃＦｖ－ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－Ｆｃと同様に作動可能に連結されたドメインを含み、ここでｓｃＦｖはＰＤ－Ｌ１抗原結合部分に由来し、ＶＨ－ＣＨ１はＰＤ－Ｌ１抗原結合部分に由来する；および
軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬ－ＣＬと同様に作動可能に連結されたドメインを含み、ここでＶＬ－ＣＬはＶＥＧＦ抗原結合部分に由来する。

【0018】

特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧＦｃ領域、好ましくはヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域またはそのバリアントである。具体的には、上記二重特異性抗体のＦｃ領域は、ＥＵナンバリングによる（ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＥＵｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ置換を含む。

【0019】

特定の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１７を含む重鎖、および配列番号１８を含む軽鎖を含む。

【0020】

特定の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体またはその抗原結合部分は、ヒト化抗体である。

【0021】

一態様では、本開示は、本明細書に開示される二重特異性抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子を提供する。

【0022】

一態様では、本開示は、本明細書に開示される核酸分子を含むベクターを提供する。一態様では、本開示は、本明細書に開示される核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0023】

一態様では、本開示は、本明細書に開示される二重特異性抗体またはその抗原結合部分、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0024】

一態様では、本開示は、本明細書に開示される二重特異性抗体またはその抗原結合部分を産生する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：
－二重特異性抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子またはベクターを含む宿主細胞において二重特異性抗体またはその抗原結合部分を発現させる工程；および
－二重特異性抗体またはその抗原結合部分を宿主細胞から単離する工程。

【0025】

一態様では、本開示は、二重特異性抗体もしくはその抗原結合部分、または本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を調節するための方法を提供し、場合によって免疫応答はＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦに関連している。

【0026】

一態様では、本開示は、有効量の二重特異性抗体もしくはその抗原結合部分、または本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。

【0027】

一態様では、本開示は、有効量の二重特異性抗体もしくはその抗原結合部分、または医薬組成物を対象に投与することを含む、対象におけるがんを予防または治療する方法を提供する。がんは、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦに関連している可能性がある。特定の実施形態では、治療されるがんは結腸がんまたは結腸直腸がんである。

【0028】

特定の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体またはその抗原結合部分は、がん免疫療法に使用するための化学療法剤、放射線、および／または他の薬剤と併用して投与することができる。

【0029】

一態様では、本開示は、以下における使用のための本明細書に開示される二重特異性抗体またはその抗原結合部分を提供する：
ｉ）ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦに関連している免疫応答の調節において；
ｉｉ）Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン産生の増強において；および／または
ｉｉｉ）がん細胞に対する免疫応答の増強等の、免疫応答または機能の刺激において。

【0030】

一態様では、本開示は、がんの診断、予防、または治療に使用するための、本明細書に開示の二重特異性抗体またはその抗原結合部分を提供する。

【0031】

一態様では、本開示は、一態様では、本開示は、対象における免疫応答を調節するか、または腫瘍細胞の増殖を阻害するための医薬の製造における、本明細書に開示される二重特異性抗体またはその抗原結合部分の使用を提供する。

【0032】

一態様では、本開示は、がんを診断、治療、または予防するための薬剤の製造における、本明細書に開示される二重特異性抗体またはその抗原結合部分の使用を提供する。

【0033】

一態様では、本開示は、本明細書に開示される二重特異性抗体またはその抗原結合部分を含むキットを提供する。このキットは、がん等の疾患または状態の検出、診断、予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）、または治療に使用することができる。

【0034】

上記は概要であるため、必然的に簡略化、一般化、および詳細の省略が含まれる；したがって、当業者であれば、この概要は例示のみを目的としており、決して限定することを意図したものではないことを理解するであろう。本明細書に記載の方法、組成物および／または装置および／または他の主題の他の態様、特徴、および利点は、本明細書に記載の教示で明らかになるであろう。この概要は、以下の発明の詳細な説明でさらに記載される概念の選択を簡略化した形で導入するために提供される。この概要は、請求された主題の主要な特徴または本質的な特徴を特定することを意図したものではなく、また、請求された主題の範囲を決定する際の補助として使用されることを意図したものでもない。さらに、本出願を通じて引用されるすべての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】Ｗ３２５３抗体のフォーマットの概略図を示す。

【図2】Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す（レーン１）。１：非還元状態、１’：ＮｕＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）ゲルにおける還元状態。Ｍ、ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）未染色タンパク質ラダー。

【図3】Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０のＨＰＬＣ－ＳＥＣの結果を示す。

【図4】ヒトＶＥＧＦ（カニクイザルＶＥＧＦと同じ）に対するＷ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０のＥＬＩＳＡ結合結果を示す。

【図5】ヒトＰＤ－Ｌ１に対するＷ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０のＦＡＣＳ結合結果を示す。

【図6】Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０のＶＥＧＦ、次いでＰＤ－Ｌ１への二重結合の結果を示す。

【図7】カニクイザルＰＤ－Ｌ１に対するＷ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０のＦＡＣＳ結合結果を示す。

【図8】図８Ａ、８Ｂおよび９は、ヒトＰＤ－Ｌ１（図８Ａ）、カニクイザルＰＤ－Ｌ１（図８Ｂ）およびヒトＶＥＧＦ（図９）に結合するＷ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０のＳＰＲセンサーグラムを示す。

【図9】図８Ａ、８Ｂおよび９は、ヒトＰＤ－Ｌ１（図８Ａ）、カニクイザルＰＤ－Ｌ１（図８Ｂ）およびヒトＶＥＧＦ（図９）に結合するＷ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０のＳＰＲセンサーグラムを示す。

【図10】図１０～１２は、ヒトＶＥＧＦ結合におけるヒトＶＥＧＦＲ１（図１０）およびＶＥＧＦＲ２（図１１）に対するＷ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０の競合、およびヒトＰＤ－Ｌ１結合（図１２）におけるヒトＰＤ－１に対するＷ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０の競合を示す。

【図11】図１０～１２は、ヒトＶＥＧＦ結合におけるヒトＶＥＧＦＲ１（図１０）およびＶＥＧＦＲ２（図１１）に対するＷ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０の競合、およびヒトＰＤ－Ｌ１結合（図１２）におけるヒトＰＤ－１に対するＷ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０の競合を示す。

【図12】図１０～１２は、ヒトＶＥＧＦ結合におけるヒトＶＥＧＦＲ１（図１０）およびＶＥＧＦＲ２（図１１）に対するＷ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０の競合、およびヒトＰＤ－Ｌ１結合（図１２）におけるヒトＰＤ－１に対するＷ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０の競合を示す。

【図13】ＨＵＶＥＣ細胞増殖に対する抗体による阻害を示す。

【図14】ＰＤ－Ｌ１レポーター遺伝子アッセイに対する抗体の効果を示す。

【図15】図１５Ａ～１５Ｂは、ＭＬＲアッセイにおけるｈＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ－２（図１５Ａ）およびＩＦＮ－γ（図１５Ｂ）分泌に対する抗体の効果を示す。

【図16】二重結合ＥＬＩＳＡによるヒト血清安定性試験における抗体の効果を示す。

【図17】Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０のＤＳＦプロファイルを示す。

【図18】異なる方法によって検出された、マウスにおけるＷ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０の薬物動態プロファイルを示す。

【図19】図１９～２０は、異なる抗体による処置後の混合ＲＫＯ－ＰＢＭＣモデルにおける各群の体重（図１９）および腫瘍体積（図２０）を示す。

【図20】図１９～２０は、異なる抗体による処置後の混合ＲＫＯ－ＰＢＭＣモデルにおける各群の体重（図１９）および腫瘍体積（図２０）を示す。

【図21】図２１～２２は、異なる抗体による処置後のヒトＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８＋ヒトＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１デュアルノックイントランスジェニックマウスモデルにおける各群の体重（図２１）および腫瘍体積（図２２）を示す。

【図22】図２１～２２は、異なる抗体による処置後のヒトＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８＋ヒトＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１デュアルノックイントランスジェニックマウスモデルにおける各群の体重（図２１）および腫瘍体積（図２２）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0036】

発明の詳細な説明
本開示は多くの異なる形態で具体化され得るが、本明細書では、本開示の原理を例示する特定の例示的な実施形態が開示される。本開示は、図示された特定の実施形態に限定されないことを強調すべきである。さらに、ここで使用されているセクションの見出しは、整理のみを目的としており、記載されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0037】

本明細書で別段の定義がない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、状況により別途要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。より具体的には、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、たとえば、「タンパク質」という表現は複数のタンパク質を含む。「細胞」という表現は、細胞の混合物等を含む。本出願では、別段の記載がない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」等の他の形式の使用は、限定的なものではない。さらに、明細書および添付の特許請求の範囲で提供される範囲は、エンドポイントおよびエンドポイント間のすべての点を含む。

【0038】

一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法およびその技術は、当技術分野でよく知られており、一般に使用されているものである。本開示の方法および技術は、一般に、当技術分野で周知の従来の方法に従って、また、別段の指示がない限り、本明細書全体にわたって引用および議論される様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているように実施される。たとえば、Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6^ｔｈ ed., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998);およびColigan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)を参照されたい。本明細書に記載される分析化学、有機合成化学、および医薬化学に関連して使用される命名法、ならびにそれらの実験手順および技術は、当技術分野でよく知られており、一般的に使用されているものである。

【0039】

定義
本開示をよりよく理解するために、関連する用語の定義および説明を以下に示す。

【0040】

本明細書における「抗体」または「Ａｂ」という用語は、最も広い意味で使用され、ポリクローナル抗体、単一特異性および多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）を含む様々な抗体構造を包含する。天然のインタクトな抗体は一般に、ジスルフィド共有結合および非共有結合相互作用によって結合された２本の重（Ｈ）ポリペプチド鎖および２本の軽（Ｌ）ポリペプチド鎖を含むＹ字型の四量体タンパク質である。抗体の軽鎖はκ軽鎖とλ軽鎖に分類することができる。重鎖はμ、δ、γ、α、およびεに分類することができ、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義する。軽鎖および重鎖では、可変領域が約１２アミノ酸以上の「Ｊ」領域を介して定常領域に連結されており、重鎖はさらに約３アミノ酸以上の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。重鎖定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、比較的保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）によって挟まれた超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に分割することができる。各ＶＨおよびＶＬは、Ｎ末端からＣ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される。各重鎖／軽鎖ペアの可変領域（Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ）は、それぞれ抗原結合部位を形成する。様々な領域またはドメインにおけるアミノ酸の分布は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)),またはChothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:878-883の定義に従う。抗体は、異なる抗体アイソタイプ、たとえば、ＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ)、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体であってもよい。

【0041】

抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」という用語は、本出願の状況において交換可能に使用することができ、完全長抗体が特異的に結合する抗原に特異的に結合する能力を保持する、および／または同じ抗原への結合に関して完全長抗体と競合する、完全長抗体の断片を含むポリペプチドを指す。一般的には、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれるFundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., the second edition, Raven Press, N.Y. (1989)を参照されたい。抗体の抗原結合断片は、たとえば、タンパク質分解消化または抗体可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を伴う組換え遺伝子工学技術等の任意の適切な標準技術を使用して、完全な抗体分子から誘導することができる。そのようなＤＮＡは既知であり、および／またはたとえば商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（たとえば、ファージ－抗体ディスプレイを含む）から容易に入手可能である、または合成することができる。ＤＮＡは、化学的に、または分子生物学技術を使用して配列決定および操作され、たとえば、一つまたは複数の可変ドメインおよび／または定常ドメインを適切な構成に配置したり、コドン導入、システイン残基の作成、アミノ酸の改変、追加または削除等することができる。

【0042】

抗原結合断片の非限定的な例は以下を含む：（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチド等の単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、または拘束性（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（たとえば、一価ナノボディ、二価ナノボディ等）、小モジュラー免疫薬（ｓｍａｌｌｍｏｄｕｌａｒｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインも、本明細書で使用する「抗原結合断片」という表現に含まれる。特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも一つの定常ドメインに共有結合した少なくとも一つの可変ドメインを含んでもよい。可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接結合していてもよく、または完全または部分的なヒンジまたはリンカー領域によって結合していてもよい。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子内の隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間にフレキシブルまたはセミフレキシブルな結合をもたらす少なくとも２個（たとえば、５、１０、１５、２０、４０、６０個またはそれ以上）のアミノ酸から構成されていてもよい。

【0043】

本明細書で使用される抗体に関する「可変ドメイン」という用語は、一つまたは複数のＣＤＲを含む抗体可変領域またはその断片を指す。可変ドメインはインタクトな可変領域（ＨＣＶＲまたはＬＣＶＲ等）を含む場合があるが、インタクトな可変領域を含みながらも抗原に結合する能力または抗原結合部位を形成する能力を依然として保持することも可能である。

【0044】

本明細書で使用される用語「抗原結合部分」は、一つまたは複数のＣＤＲを含む抗体の一部から形成される抗体断片、または抗原に結合するがインタクトな天然の抗体構造を含まない任意の他の抗体断片を指す。一般に可変ドメインを指す「抗原結合部位」という用語とは異なり、抗原結合部分は、可変ドメインに加えて定常ドメインを含み得る。抗原結合部分の例とは、可変ドメイン、可変領域、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）_２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、および二価ドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。抗原結合部分は、親抗体が結合するのと同じ抗原に結合することができる。特定の実施形態では、抗原結合部分は、Ｆａｂ断片またはＶＨＨ抗体であってもよい。一部の実施形態では、抗原結合部分は、一つまたは複数の異なるヒト抗体由来のフレームワーク領域に移植された特定のヒト抗体由来の一つまたは複数のＣＤＲを含んでもよい。抗原結合部分のより詳細な形式については、その全体が本明細書に組み込まれるSpiess et al., Molecular Immunology, 67(2), pp.95-106 (2015),および Brinkman et al., mAbs, 9(2), pp.182-212 (2017)に記載されている。

【0045】

抗体に関する「Ｆａｂ」は、ジスルフィド結合によって単一の重鎖の可変領域および第一の定常領域に結合する単一の軽鎖（可変領域および定常領域の両方）からなる抗体の部分を指す。

【0046】

本明細書で使用される「ＳｃＦｖ」または「単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎｆｒａｇｍｅｎｔｖａｒｉａｂｌｅ）」という用語は、一般に短いリンカーペプチド（たとえば、長さは約６～２５アミノ酸）によって連結された、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖（ＶＨおよびＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を指す。ｓｃＦｖのサイズが小さいことで、より高い負荷容量および標的リガンドの優れた配向が可能になり、全体的な有効性の向上につながることが見出された。

【0047】

抗体に関する「Ｆｃ」（断片の略、結晶化可能）は、第二の重鎖の第二および第三の定常領域にジスルフィド結合を介して結合した第一の重鎖の第二（ＣＨ２）および第三（ＣＨ３）の定常領域を含む抗体の部分を指す。Ｆｃ領域に言及する場合、状況に応じて、Ｆｃ領域の一方の鎖または両方の鎖を指し得る。抗体のＦｃ部分は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ等の様々なエフェクター機能を担っているが、抗原結合では機能しない。Ｆｃドメインを介してエフェクター機能を開始および制御する抗体の能力は、そのインビボ保護活性の重要な要素である。抗体の中和活性は、これまで単にＦａｂ抗原相互作用の結果であると考えられてきたが、そのインビボ活性は、エフェクター白血球の表面に発現する、ＩｇＧＦｃドメインおよびその同族受容体（ｃｏｇｎａｔｅｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用に大きく依存していることが明らかになった。

【0048】

「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、プログラム死リガンド１［ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ１］としても知られ、免疫系の適応アームの抑制に主要な役割を果たしていると推測されている４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質である。ＰＤ－Ｌ１は、骨髄細胞、リンパ細胞、正常上皮細胞、およびがんにおいて構成的に発現され、または誘導される共抑制受容体であるプログラム死１［ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ１］（ＰＤ－１）（ＰＤ－１）の主要なリガンドである。本明細書で使用される「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、全長ＰＤ－Ｌ１タンパク質、またはＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメイン（ＰＤ－Ｌ１ＥＣＤ）もしくはＰＤ－Ｌ１ＥＣＤを含む断片；ＰＤ－Ｌ１ＥＣＤの融合タンパク質を含むＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列を指す場合、たとえば、マウスまたはヒト由来のＩｇＧＦｃと融合した断片（ｍＦｃまたはｈＦｃ）も含まれる。さらに、当業者には理解されるように、ＰＤ－Ｌ１タンパク質には、生物学的機能に影響を与えることなく、アミノ酸配列の変異（置換、欠失および／または付加を含むがこれらに限定されない）が天然または人工的に導入されたものも含まれるであろう。

【0049】

本明細書で使用される「ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体」または「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」という用語は、ＰＤ－Ｌ１を特異的に認識する抗体およびその抗原結合断片を含む。本開示の抗体および抗原結合断片は、可溶性ＰＤ－Ｌ１タンパク質および／または細胞表面発現ＰＤ－Ｌ１に結合することができる。可溶性ＰＤ－Ｌ１は、天然のＰＤ－Ｌ１タンパク質、ならびに膜貫通ドメインを欠く、または細胞膜と結合していない組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質バリアントを含む。本明細書で使用される場合、「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」という表現は、単一の特異性を有する一価抗体、ならびにＰＤ－Ｌ１に結合する第一の抗原結合部位および第二の（標的）抗原に結合する第二の抗原結合部位を含む二重特異性抗体の両方を含む。ここで、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位は、本明細書の表Ａに記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列またはＣＤＲ配列のいずれかを含む。抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の例は、本明細書の他の場所に記載されている。「抗原結合分子」という用語は、たとえば二重特異性抗体を含む、抗体および抗体の抗原結合断片を含む。

【0050】

「ＶＥＧＦ」（血管内皮増殖因子、ＶＥＧＦ－Ａとしても知られる）という用語は、血管の形成を刺激する細胞によって産生されるシグナルタンパク質である。ＶＥＧＦは成長因子のサブファミリーであり、シスチンノット成長因子の血小板由来成長因子ファミリーである。これらは、脈管形成（胎児循環系の新規の形成）および血管新生（既存の脈管構造からの血管の成長）の両方に関与する重要なシグナル伝達タンパク質である。ＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＰｌＧＦ（胎盤成長因子）、ＶＥＧＦ－Ｅ（Ｏｒｆ－ＶＥＧＦ）、およびＴｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓｓｖＶＥＧＦを含む。

【0051】

本明細書で使用される「ＶＥＧＦ受容体」または「ＶＥＧＦＲ」という用語は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の受容体を指す。ＶＥＧＦＲには３つの主要なサブタイプがあり、１、２、３と番号付けされている。ＶＥＧＦ受容体は、選択的スプライシングに応じて、膜結合性または可溶性の場合がある。ＶＥＧＦ受容体の中で、ＶＥＧＦＲ－１はＶＥＧＦ－Ａ、ＰｌＧＦ、およびＶＥＧＦ－Ｂに結合する。

【0052】

本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」は、２つの異なるモノクローナル抗体に由来する断片を有し、２つの異なるエピトープに結合することができる人工抗体を指す。２つのエピトープは同じ抗原上に存在する場合もあれば、２つの異なる抗原上に存在する場合もある。

【0053】

「二重特異性抗原結合分子」という用語は、少なくとも第一の抗原結合ドメイン（本明細書では第一の抗原結合部位とも呼ばれる）および第二の抗原結合ドメイン（本明細書では第二の抗原結合部位とも呼ばれる）を含むタンパク質、ポリペプチド、または分子複合体を意味する。一部の実施形態では、「二重特異性抗原結合分子」は「二重特異性抗体」である。二重特異性抗体内の各抗原結合ドメインは、単独で、または一つまたは複数の追加のＣＤＲおよび／またはＦＲと組み合わせて、特定の抗原に特異的に結合する少なくとも一つのＣＤＲを含む。本開示の状況において、第一の抗原結合部位は第一の抗原（たとえば、ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合し、第二の抗原結合部位は第二の、異なる抗原（たとえば、ＶＥＧＦ）に特異的に結合する。

【0054】

本明細書において互換的に使用される「抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＶＥＧＦ抗体」、「抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体」、「ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦに対する抗体」、「抗ＰＤ－Ｌ１×ＶＥＧＦ二重特異性抗体」、「ＰＤ－Ｌ１×ＶＥＧＦ抗体」という用語は、ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦに特異的に結合する二重特異性抗体を指す。

【0055】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。

【0056】

本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含む場合、その定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（たとえば、インビトロでのランダムまたは部位特異的変異誘発、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含んでもよい。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図するものではない。

【0057】

「ヒト化抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を指すことを意図している。さらなるフレームワーク領域の改変がヒトフレームワーク配列内で行われてもよい。

【0058】

「作動可能に連結された」という用語は、スペーサーまたはリンカーの有無にかかわらず、目的の２つ以上の生物学的配列が、それらが意図した様式で機能することができるような関係にあるような方法で並置することを指す。ポリペプチドに関して使用される場合、「作動可能に連結された」は、連結生成物が意図した生物学的機能を有することを可能にするような方法でポリペプチド配列が連結されていることを意味することを意図している。たとえば、抗体可変領域は、抗原結合活性を有する安定な生成物を提供するために、定常領域に作動可能に連結することができる。この用語は、ポリヌクレオチドに関しても使用することができる。一例として、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが調節配列（たとえば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列等）に作動可能に連結されている場合、これは、ポリヌクレオチドからのポリペプチドの調節された発現を可能にするような方法でポリヌクレオチド配列が連結されていることを意味することを意図する。作動可能に連結されたという用語は、ポリペプチドを形成するために連結されたドメインを記述するために本明細書で使用される場合、「－」で表すことができ、ドメイン間の直接的な連結、または一連の (G4S)n リンカー（ｎ＝１～５（１、２、３、４、または５））等、長さ１～３０のアミノ酸を含むリンカーを介した連結を指すことができる。

【0059】

本明細書で使用される用語「Ｋａ」は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すことが意図され、一方、用語「Ｋｄ」は、本明細書で使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことが意図される。抗体のＫｄ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。本明細書で使用される「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離定数を指すことを意図しており、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫｄを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによるものであり、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム等のバイオセンサーシステムを使用することによる。

【0060】

本明細書で使用される、ＩｇＧ抗体に対する「高親和性」という用語は、標的抗原に対して、１×１０^－８Ｍ以下、より好ましくは５×１０^－９Ｍ以下、さらにより好ましくは１×１０^－９Ｍ以下、さらにより好ましくは５×１０^－１０Ｍ以下、さらにより好ましくは４×１０^－１０Ｍ以下（even more preferably 4 x 10^－１０M）、さらにより好ましくは３×１０^－１０Ｍ以下、さらにより好ましくは２×１０^－１０Ｍ以下、さらにより好ましくは１×１０^－１０Ｍ以下、さらにより好ましくは５×１０^－１１Ｍ以下、およびさらにより好ましくは３×１０^－１１Ｍ以下のＫ_Ｄを有する抗体を指す。

【0061】

本明細書で使用する「ＥＣ_５０」という用語は、「半数効果濃度（ｈａｌｆｍａｘｉｍａｌｅｆｆｅｃｔｉｖｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）」とも称され、特定の曝露時間後にベースラインと最大値との間の中間の反応を誘発する薬物、抗体、または毒物の濃度を指す。本出願の関連では、ＥＣ_５０は「ｎＭ」の単位で表される。

【0062】

本明細書で使用する「ＩＣ_５０」という用語は、「半数阻害濃度（ｈａｌｆｍａｘｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）」とも呼ばれ、特定の生物学的または生化学的機能を阻害する物質の効力の尺度である。本出願の関連では、ＩＣ_５０は「ｎＭ」の単位で表される。

【0063】

本明細書で使用される「結合を阻害する」という能力は、抗体またはその抗原結合断片が２つの分子（たとえば、ヒトＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦ）の結合を任意の検出可能なレベルまで阻害する能力を指す。特定の実施形態では、２つの分子の結合は、５０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、またはそれ以下のＩＣ_５０で抗体によって阻害され得る。

【0064】

本明細書で使用される「単離された」という用語は、自然状態から人工的手段によって得られた状態を指す。特定の「単離された」物質または成分が天然に存在する場合、またはその自然環境が変化するか、その物質が自然環境から分離されるか、またははその両方であるために、それは可能である。たとえば、ある未単離のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ある生きた動物体内に天然に存在し、そのような自然状態から単離された純度の高い同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを単離ポリヌクレオチドまたは単離ポリペプチドと呼ぶ。「単離された」という用語は、人工または合成された混合物質や、単離された物質の活性に影響を及ぼさないその他の不純物質を除外するものではない。

【0065】

本明細書で使用される「単離抗体（ｉｓｏｌａｔｅｄａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図する（たとえば、ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦタンパク質に特異的に結合する単離抗体は、ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦタンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）ただし、ヒトＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦタンパク質に特異的に結合する単離抗体は、他の種由来のＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦタンパク質等の他の抗原に対して交差反応性を有していてもよい。さらに、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。

【0066】

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドがその中に挿入され得る核酸ビヒクルを指す。ベクターが、その中に挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、そのベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、宿主細胞への形質転換、形質導入、またはトランスフェクションによって宿主細胞内で発現される、運搬された（ｃａｒｒｉｅｄ）遺伝物質要素を有していてもよい。ベクターは当業者に周知であり、プラスミド、ファージ、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体；λファージまたはM13ファージ等のファージおよび動物ウイルスを含むが、これらに限定されない。ベクターとして使用することができる動物ウイルスは、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス等）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（ＳＶ４０等）を含むが、これらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、およびレポーター遺伝子を含むがこれらに限定されない、発現を制御するための複数のエレメントを含んでもよい。さらに、ベクターは複製起点を含んでもよい。

【0067】

本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、目的のタンパク質、タンパク質断片、またはペプチドを生成するように操作することができる細胞系を指す。宿主細胞は、培養細胞、たとえば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０等のげっ歯類（ラット、マウス、モルモット、またはハムスター）由来の哺乳類培養細胞；または、ヒト組織またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、および昆虫細胞、ならびにトランスジェニック動物または培養組織内に含まれる細胞を含むが、これらに限定されない。この用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も包含する。変異または環境の影響により、後続の世代で特定の改変が発生する可能性があるため、そのような子孫は親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。

【0068】

本明細書で使用される「同一性」または「相同性」という用語は、配列を整列させて比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント（Ｐｅｒｃｅｎｔｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、比較される分子内のアミノ酸またはヌクレオチド間の同一残基の割合を意味し、比較される分子の最小サイズに基づいて計算される。これらの計算では、位置合わせのギャップ（存在する場合）は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処されることが好ましい。整列した核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用できる方法は、Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press;およびCarillo et al, 1988, SIAMJ. Applied Math. 48:1073に記載されている方法を含む。

【0069】

本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、生物体内での特異的抗体または感作リンパ球の形成を刺激する能力を指す。抗原が特定の免疫細胞を刺激して活性化、増殖、および分化させ、「免疫原性」は、最終的に抗体および感作リンパ球等の免疫エフェクター物質を生成する性質を指すだけでなく、また、生物体を抗原で刺激した後、生物体の免疫系で抗体または感作されたＴリンパ球が形成される特異的な免疫応答も指す。免疫原性は抗原の最も重要な特性である。抗原が宿主内で免疫応答の生成をうまく誘導できるかどうかは、抗原の性質、宿主の反応性、および免疫手段という３つの要素に依存する。

【0070】

本明細書で使用される「トランスフェクション」という用語は、核酸が真核細胞、特に哺乳動物細胞に導入されるプロセスを指す。トランスフェクションのプロトコールおよび技術は、脂質トランスフェクション、およびエレクトロポレーション等の化学的および物理的方法を含むが、これらに限定されない。多くのトランスフェクション技術が当技術分野で周知であり、本明細書に開示されている。たとえば、Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,前出; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene 13:197を参照されたい。本開示の特定の実施形態では、ヒトＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ遺伝子を２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。

【0071】

本明細書で使用される「ＳＰＲ」または「表面プラズモン共鳴」という用語は、たとえばＢＩＡｃｏｒｅシステム（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，ＳｗｅｄｅｎａｎｄＰｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより、リアルタイムの生体分子特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指し、そして含む。詳細については、実施例５、ならびにJoensson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Joensson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131;およびJohnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277を参照されたい。

【0072】

本明細書で使用される「蛍光活性化セルソーティング」または「ＦＡＣＳ」という用語は、特殊なタイプのフローサイトメトリーを指す。これは、各細胞の特定の光散乱および蛍光特性に基づいて、生体細胞の不均一混合物を２つ以上の容器に一度に１細胞ずつ仕分ける方法を提供する（FlowMetric. “Sorting Out Fluorescence Activated Cell Sorting”. Retrieved 2017-11-09.）。ＦＡＣＳを実行するための機器は当業者に知られており、一般に市販されている。このような機器の例は、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ（カリフォルニア州フォスターシティ）のＦＡＣＳＳｔａｒＰｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎおよびＦＡＣＳｏｒｔｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＣｏｕｌｔｅｒＥｐｉｃｓＤｉｖｉｓｉｏｎ（フロリダ州ハイアリーア）のＥｐｉｃｓＣ、およびＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（コロラド州コロラドスプリングス）のＭｏＦｌｏを含む。

【0073】

「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含み、好ましくはヒトである。

【0074】

本明細書で使用される「がん」という用語は、任意の腫瘍または悪性細胞の成長、増殖、または転移を介した固形腫瘍および白血病等の非固形腫瘍を指し、状態を引き起こす。

【0075】

状態の治療に関連して本明細書で使用される「治療」、「治療する」または「治療された」という用語は、一般に、ヒトまたは動物のいずれであっても、何らかの所望の治療効果（たとえば、状態の進行の阻害）が達成される治療および療法に関し、進行速度の低下、進行速度の停止、状態の退縮、状態の寛解、および状態の治癒を含む。がんの場合、「治療する」とは、腫瘍または悪性細胞の成長、増殖、もしくは転移、またはそれらの一部の組み合わせを弱めるかまたは遅らせることを指す場合がある。腫瘍の場合、「治療」は、腫瘍の全体または一部の除去、腫瘍の成長および転移の阻害または遅延、腫瘍の発生の予防または遅延、またはそれらの一部の組み合わせを含む。

【0076】

用語「予防する」、「予防」、または「予防すること」は、状態を予防するという状況で本明細書で使用される場合、一般に、（人間であろうと動物であろうと）対象における疾患の発症を予防もしくは遅延させること、またはその臨床症状もしくは亜臨床症状の発現を予防すること、たとえばその状態や病気にかかりやすいが、まだその病気であると診断されていない対象においてその病気が起こるのを防ぐことを指す。

【0077】

本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の治療レジメンに従って投与された場合に合理的な利益／リスク比に見合った、何らかの所望の治療効果を生み出すのに有効な、活性化合物、または活性化合物を含む材料、組成物もしくは剤形の量に関する。たとえば、「有効量」は、ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ関連疾患または状態の治療と関連して使用される場合、上記疾患または状態を治療するのに有効な量または濃度の抗体またはその抗原結合部分を指す。

【0078】

本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／またはそれらの塩が、製剤中の他の成分と化学的および／または物理的に適合し、レシピエントと生理学的に適合することを意味する。

【0079】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体および／または賦形剤」という用語は、対象および活性薬剤と薬理学的および／または生理学的に適合する担体および／または賦形剤を指し、これは当技術分野で周知である（たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995）。そして、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバントおよびイオン強度増強剤を含むが、これらに限定されない。たとえば、ｐＨ調整剤は、リン酸緩衝液を含むが、これに限定されない；界面活性剤は、カチオン性、アニオン性、または非イオン性界面活性剤、たとえばＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含むが、これらに限定されない；イオン強度増強剤は、塩化ナトリウムを含むが、これらに限定されない。

【0080】

本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、抗原と一緒に生物体に送達されるか、または生物体に先に送達されるときに、抗原に対する免疫応答を増強するか、または生物体内の免疫応答のタイプを変化させることができる、非特異的免疫増強剤を指す。アルミニウムアジュバント（たとえば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（たとえば、フロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバント）、コリネバクテリウムパルバム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍ）、リポ多糖、サイトカイン等を含むが、これらに限定されない、様々なアジュバントが存在する。フロイントアジュバントは、現在動物実験で最も一般的に使用されているアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは臨床試験でより一般的に使用される。

【0081】

二重特異性抗体およびその抗原結合部分
一態様では、二重特異性抗体およびその抗原結合部分が本明細書に提供される。一部の実施形態では、二重特異性抗体およびその抗原結合部分は、ＰＤ－Ｌ１に対して第一の特異性を有し、ＶＥＧＦに対して第二の特異性を有する。一部のさらなる実施形態では、本明細書で提供される抗体は多重特異性である。

【0082】

特定の例示的な実施形態によれば、本開示は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する第一の抗原結合部分、およびＶＥＧＦに特異的に結合する第二の抗原結合部分を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合部分を含む。このような抗体は、本明細書では、たとえば、「抗ＶＥＧＦ／抗ＰＤ－Ｌ１」または「抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ」または「抗ＰＤ－Ｌ１ｘＶＥＧＦ」または「ＰＤ－Ｌ１ｘＶＥＧＦ」二重特異性抗体、または他の同様の用語で呼ばれる場合がある。

【0083】

一部の実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＶＥＧＦ抗体に作動可能に連結された親抗ＰＤ－Ｌ１抗体に由来するＰＤ－Ｌ１結合部分を含む。一部の他の実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体に作動可能に連結された親抗ＶＥＧＦ抗体に由来するＶＥＧＦ結合部分を含む。一部の他の実施形態では、二重特異性抗体は、親抗ＶＥＧＦ抗体由来のＶＥＧＦ結合部分に作動可能に連結された親抗ＰＤ－Ｌ１抗体由来のＰＤ－Ｌ１結合部分を含む。

【0084】

本開示の二重特異性抗体は、高い親和性でヒトＰＤ－Ｌ１およびヒトＶＥＧＦに結合することができた。ＰＤ－Ｌ１またはＶＥＧＦに対する本開示の抗体の結合は、当技術分野で十分に確立されている一つまたは複数の技術、たとえばＥＬＩＳＡを使用して評価することができる。ＥＬＩＳＡアッセイでは、組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質を使用することもできる。本明細書に開示される抗体の結合特異性は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質またはＶＥＧＦタンパク質を発現する細胞への抗体の結合をモニタリングすることによって、たとえばフローサイトメトリーによって測定することもできる。たとえば、抗体は、細胞表面にＰＤ－Ｌ１を発現するようにトランスフェクトされたＣＨＯ細胞等、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現する細胞株と抗体を反応させるフローサイトメトリーアッセイによって試験することができる。さらに、または代替的に、結合動態（たとえば、Ｋ_Ｄ値等）を含む抗体の結合をＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで試験することができる。

【0085】

たとえば、本開示の抗体は、表面プラズモン共鳴で測定した場合、１×１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄ、５×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄ、２×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄ、１×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄ、５×１０^－１０Ｍ以下のＫ_Ｄ、４×１０^－１０Ｍ以下のＫ_Ｄ、３×１０^－１０Ｍ以下のＫ_Ｄ、２×１０^－１０Ｍ以下のＫ_Ｄ、１×１０^－１０Ｍ以下のＫ_Ｄ、５×１０^－１１Ｍ以下のＫ_Ｄ、または３×１０^－１１Ｍ以下のＫ_Ｄ、でヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質またはヒトＶＥＧＦタンパク質に結合する。

【0086】

実施例セクションで実証されるように、本開示の二重特異性抗体は、高い親和性でＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦに結合することができた；たとえばｎＭグレードのＩＣ５０で、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦＲ／ＶＥＧＦシグナル伝達経路の両方を効果的に遮断することができた；本開示の二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ誘導性のＨＵＶＥＣ増殖を遮断することができた；およびサイトカイン分泌に強いアゴニスト効果をもたらすことができた。

【0087】

一部の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体は、単一特異性抗ＰＤ－Ｌ１抗体（たとえば、アテゾリズマブ）、または他の抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体と比較して、ＰＤ－Ｌ１に対してより高い結合親和性を有する。一部の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体は、たとえばＫ_Ｄで測定したとき、単一特異性抗ＰＤ－Ｌ１抗体または他の抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％高い、ＰＤ－Ｌ１に対する結合親和性を有する。

【0088】

一部の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体は、単一特異性抗ＰＤ－Ｌ１抗体（たとえば、アテゾリズマブ）と比較してＰＤ－Ｌ１に対してより高い結合親和性を有し、および／または単一特異性抗ＶＥＧＦ抗体（たとえばアバスチン）と比較してＶＥＧＦに対してより高い結合親和性を有する。一部の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体は、アテゾリズマブと比較してＰＤ－Ｌ１に対してより高い結合親和性を有し、アバスチンと比較してＶＥＧＦに対してより高いまたは同等の結合親和性を有する。一部の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体は、単一特異性抗ＰＤ－Ｌ１抗体と単一特異性抗ＶＥＧＦ抗体との組み合わせ、たとえばアテゾリズマブとアバスチンとの組み合わせと比較して、抗腫瘍有効性が著しく改善された。

【0089】

一部の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体は、他の抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体と比較してＰＤ－Ｌ１に対してより高い結合親和性を有し、および／または他の抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体と比較してＶＥＧＦに対してより高い結合親和性を有する。

【0090】

ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分
本明細書で定義されるＰＤ－Ｌ１結合部分は、二重特異性抗体に適合し、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合できる限り、様々なフォーマット（たとえば、ＶＨＨ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）で提示され得る。一般に、二重特異性抗体に含まれるＰＤ－Ｌ１結合部分は、単一特異性抗ＰＤ－Ｌ１抗体に由来し、これは既知の抗体であっても、新規に開発された抗体であってもよい。本出願による一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合部分は完全ヒトモノクローナル抗体に由来する。特定の抗原に対する完全ヒト抗体を取得するための様々な方法は、当業者に知られており、たとえば、ヒト抗体レパートリーまたは他のヒト抗体コード配列を利用するトランスジェニック非ヒト動物（たとえば、ＯＭＴラット）を免疫化することによる。

【0091】

ＰＤ－Ｌ１結合部分は、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体に由来していてもよい。「に由来する」とは、本明細書において、ＰＤ－Ｌ１結合部分が、ＰＤ－Ｌ１の抗原結合部分または抗原結合能力を保持するそのバリアントを含むか、またはそれらから構成されることを意味する。たとえば、ＰＤ－Ｌ１結合部分は、抗ＰＤ－Ｌ１親抗体のｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはＶＨＨ断片であってもよい。

【0092】

一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合部分は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＶＬに作動可能に連結された抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＶＨを含む単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含む。ＶＨおよびＶＬは、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１～４）等のペプチドリンカーを介して連結されていてもよい。

【0093】

一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分は、以下からなる群から選択される一つまたは複数のＣＤＲを含む：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、または配列番号１とは、１、２または３個以下のアミノ酸の付加、欠失または置換によって異なるアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、または配列番号２とは、１、２または３個以下のアミノ酸の付加、欠失または置換によって異なるアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、または配列番号３とは、１、２または３個以下のアミノ酸の付加、欠失または置換によって異なるアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、または配列番号４とは、１、２または３個以下のアミノ酸の付加、欠失または置換によって異なるアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、または配列番号５とは、１、２または３個以下のアミノ酸の付加、欠失または置換によって異なるアミノ酸配列；および
（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、または配列番号６とは、１、２または３個以下のアミノ酸の付加、欠失または置換によって異なるアミノ酸配列。

【0094】

一部の実施形態では、ＶＨは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＨＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＨＣＤＲ３を含む；およびＶＬは、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＬＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＬＣＤＲ３を含む。

【0095】

一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分はＶＨおよびＶＬ領域を含み、ここでＶＨ領域は以下を含む：（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号１３と少なくとも８５％、９０％、または９５％の同一性（好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（たとえば、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性）を有するアミノ酸配列；または（ｉｉｉ）配列番号１３と比較して、一つ以上（たとえば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）のアミノ酸が付加、欠失および／または置換されたアミノ酸配列；および／または
ここでＶＬ領域は、以下を含む：（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号１４と少なくとも８５％、９０％、または９５％の同一性（好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（たとえば、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性）を有するアミノ酸配列；または（ｉｉｉ）配列番号１４と比較して、一つ以上（たとえば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）のアミノ酸が付加、欠失および／または置換されたアミノ酸配列。

【0096】

ＶＥＧＦ抗原結合部分
同様に、本明細書で提供されるＶＥＧＦ抗原結合部分は、親抗ＶＥＧＦ単一特異性抗体に由来していてもよい。本出願による一部の実施形態では、ＶＥＧＦ抗原結合部分は、抗ＶＥＧＦ完全抗体のＦａｂ断片であり、すなわち、重鎖にＶＨ領域およびＣＨ１領域、ならびに軽鎖にＶＬ領域およびＣＬ領域を含む。

【0097】

親抗体として使用される抗ＶＥＧＦ抗体は、当技術分野で既に知られているモノクローナル抗体（ベバシズマブ等）であっても、新規に開発されたモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は完全ヒト抗体またはヒト化抗体である。

【0098】

一部の実施形態では、ＶＥＧＦ結合部分は完全ヒトモノクローナル抗体に由来する。たとえば、ＶＥＧＦ結合部分は、抗ＶＥＧＦ親抗体のｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはＶＨＨ断片であってもよい。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ結合部分は、抗ＶＥＧＦ抗体のＶＬと結合した抗ＶＥＧＦ抗体のＶＨを含むＦａｂを含む。

【0099】

一部の実施形態では、ＶＥＧＦ抗原結合部分のＶＨ領域は、以下からなる群から選択される一つまたは複数の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）を含み：
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、または配列番号７とは、１、２または３個以下のアミノ酸の付加、欠失または置換によって異なるアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、または配列番号８とは、１、２または３個以下のアミノ酸の付加、欠失または置換によって異なるアミノ酸配列；および
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、または配列番号９とは、１、２または３個以下のアミノ酸の付加、欠失または置換によって異なるアミノ酸配列；および／または
ＶＬ領域は、以下からなる群から選択される一つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）を含む：
（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、または配列番号１０とは、１、２または３個以下のアミノ酸の付加、欠失または置換によって異なるアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、または配列番号１１とは、１、２または３個以下のアミノ酸の付加、欠失または置換によって異なるアミノ酸配列；および
（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、または配列番号１２とは、１、２または３個以下のアミノ酸の付加、欠失または置換によって異なるアミノ酸配列。

【0100】

一部の実施形態では、ＶＨは、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＨＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＨＣＤＲ３を含む；およびＶＬは、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＬＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるＬＣＤＲ３を含む。

【0101】

一部の実施形態では、ＶＥＧＦ抗原結合部分のＶＨ領域は以下を含む：（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号１５と少なくとも８５％、９０％、または９５％の同一性（好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（たとえば、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性）を有するアミノ酸配列；または（ｉｉｉ）配列番号１５と比較して、一つ以上（たとえば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）のアミノ酸が付加、欠失および／または置換されたアミノ酸配列。

【0102】

一部の実施形態では、ＶＥＧＦ抗原結合部分のＶＬ領域は以下を含む：（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号１６と少なくとも８５％、９０％、または９５％の同一性（好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（たとえば、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性）を有するアミノ酸配列；または（ｉｉｉ）配列番号１６と比較して、一つ以上（たとえば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）のアミノ酸が付加、欠失および／または置換されたアミノ酸配列。

【0103】

各ＣＤＲへのアミノ酸の割り当ては、特に断りのない限り、Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5^ｔｈ Ed.), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242; Chothia et al., 1987, PMID: 3681981; Chothia et al., 1989, PMID: 2687698; MacCallum et al.,1996, PMID: 8876650;またはDubel, Ed. (2007) Handbook of Therapeutic Antibodies, 3^ｒｄ Ed., Wily-VCH Verlag GmbH and Co. が提供するナンバリングスキームの１つに従うことができる。

【0104】

抗体配列中の可変領域およびＣＤＲは、当技術分野で開発された一般規則（たとえば、Kabatナンバリングシステム等、上記で示したもの）に従って、または既知の可変領域のデータベースに対して配列を整列させることによって同定することができる。これらの領域を同定する方法は、Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001およびDinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000に記載されている。抗体配列の例示的なデータベースは、www.bioinf.org.uk/absで「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト（英国ロンドンのユニバーシティ・カレッジ・ロンドン生化学・分子生物学科のＡ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎによって管理されている）に、およびRetter et al., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671 -D674 (2005)に記載されているようにwww.vbase2.orgに記載されており、そこからアクセスすることができる。好ましくは、配列は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴおよびタンパク質データバンク（ＰＤＢ）からの配列データをＰＤＢからの構造データと統合するＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して分析される。ウェブサイトbioinforg.uk/absでも入手可能なDr. Andrew C. R. Martin's book chapter Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547を参照されたい。Ａｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトは、本明細書の教示に関して使用することができるＣＤＲを識別するために開発された一般規則をさらに含む。特に明記しない限り、本明細書に記載されているすべてのＣＤＲは、ＫａｂａｔによるＡｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトに従って導出されている。

【0105】

２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０ｗｅｉｇｈｔｒｅｓｉｄｕｅｔａｂｌｅ、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))のアルゴリズムによって、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、およびギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４、およびレングスウェイト１、２、３、４、５、または６を使用して決定することができる。

【0106】

さらに、または代替的に、本開示のタンパク質配列はさらに、たとえば関連する配列を同定するために公的データベースに対して検索を実行するための「クエリ配列」として使用することができる。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. MoI. Biol. 215:403-10のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本開示の抗体分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行することができる。比較目的でギャップのあるアライメントを取得するには、Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402で記載されているようにＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（たとえば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。

【0107】

他の実施形態では、ＣＤＲアミノ酸配列は、上記のそれぞれの配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であってもよい。他の実施形態では、可変領域のアミノ酸配列は、上記のそれぞれの配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であってもよい。

【0108】

好ましくは、単離された抗体またはその抗原結合部分のＣＤＲは、２アミノ酸以下、または１アミノ酸以下の保存的置換を含む。本明細書で使用する「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性に不利な影響を与えたり、変化させたりしないアミノ酸置換を指す。たとえば、保存的置換は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲを介した変異誘発等の当技術分野で知られている標準的な技術によって導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、たとえば、対応するアミノ酸残基と物理的または機能的に類似した（たとえば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合等を形成する能力を含む化学的性質を有する）残基で置換する置換を含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、対応するアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換されることが好ましい。アミノ酸の保存的置換を同定する方法は当技術分野で周知である（たとえば、参照により本明細書に組み込まれるBrummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999);およびBurks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)を参照されたい。）。

【0109】

二重特異性抗体の生成
抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体を構築するために、上記のＰＤ－Ｌ１抗原結合部分およびＶＥＧＦ抗原結合部分を様々なフォーマットで融合させることができる。二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１抗原結合部分およびＶＥＧＦ抗原結合部分は、直接的または間接的に互いに結合していてもよい。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分およびＶＥＧＦ抗原結合部分は、リンカーによって互いに結合されていてもよい。リンカーは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）の１～４コピーを含むようなペプチドリンカーであってもよい。一実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）_２である。

【0110】

一部の特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分は、ＶＥＧＦ抗原結合部分のＮ末端に融合される。ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分がｓｃＦｖである場合、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分の一本鎖は、場合によりリンカーを介して、ＶＥＧＦ抗原結合部分の重鎖または軽鎖に作動可能に連結されていてもよい。好ましくは、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介してＶＥＧＦ抗原結合部分の重鎖に連結される。

【0111】

特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分とＶＥＧＦ抗原結合部分との融合物はさらにＦｃ領域に結合する。あるいは、ＰＤ－Ｌ１部分およびＶＥＧＦ部分はそれぞれＦｃ領域の一端に接続される。

【0112】

本明細書で提供される二重特異性抗体および抗原結合部分は、当技術分野で知られている任意の適切な方法で作製することができる。従来のアプローチでは、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアを宿主細胞内で共発現させて、組換え法で二重特異性抗体を産生し、続いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる（たとえば、Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)を参照）。異なる組換えアプローチも使用することができ、この場合、２つの特異性に対する抗体重鎖可変ドメインをコードする配列は、それぞれ免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され、続いて発現ベクターに挿入され、軽鎖配列の発現ベクターとともに二重特異性抗体の組換え発現に適した宿主細胞に同時トランスフェクトされる（たとえば、ＷＯ９４／０４６９０号；Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照）。同様に、ｓｃＦｖ二量体も組換えにより構築し、宿主細胞から発現させることができる（たとえば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）。

【0113】

Ｆｃ領域
特定の実施形態では、Ｆｃ領域はＶＥＧＦ抗原結合部分に作動可能に連結されている。本明細書に開示される二重特異性抗体のＦｃ領域は、好ましくはヒトＩｇＧＦｃ領域である。ＩｇＧＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない任意のアイソタイプであってよい。特定の実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＧ１アイソタイプのものである。具体的には、二重特異性抗体の重鎖は、ｓｃＦｖ－ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－Ｆｃのように作動可能に連結されたドメインを含んでもよく、ここで、ｓｃＦｖはＰＤ－Ｌ１抗原結合部分に由来し、ＶＨ－ＣＨ１はＶＥＧＦ抗原結合ドメインに由来する；および軽鎖は、ＶＬ－ＣＬのように作動可能に連結されたドメインを含み、ここで、ＶＬ－ＣＬはＶＥＧＦ抗原結合部分に由来する。

【0114】

本開示の二重特異性抗体の関連において、Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域の特定のキメラバージョンと比較して、一つまたは複数のアミノ酸変化（たとえば、挿入、欠失または置換）を含んでもよい。本開示は、ＦｃとＦｃＲｎまたはＦｃγＲとの間の結合相互作用が改変された改変Ｆｃ領域をもたらす、Ｆｃ領域に一つまたは複数の改変を含む二重特異性抗原結合分子を包含する。

【0115】

たとえば、Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または他のエフェクター機能を変化させる一つまたは複数のアミノ酸改変（たとえば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ／Ｌｅｕ２３５ＡｌａまたはＬＡＬＡ）を含んでもよい。

【0116】

特定の実施形態では、Ｆｃ改変は、ＫａｂａｔらのようなＥＵナンバリングによるＬＡＬＡ変異、すなわち、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａの変異を含む。ＬＡＬＡ変異は、おそらく、抗体エフェクター機能を破壊する、たとえば特定のＦｃγＲへのＦｃ結合を排除し、ＰＢＭＣおよび単球によって媒介されるＡＤＣＣ活性を低下させるために最も一般的に使用される変異である。「ＥＵナンバリングシステム」または「ＥＵインデックス」は、一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合に使用される（たとえば、Kabatら（前出）に報告されているＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにおけるＥＵナンバリング」または「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。本明細書において別段の記載がない限り、抗体の定常ドメインにおける残基番号への言及は、ＥＵナンバリングシステムによる残基ナンバリングを意味する。

【0117】

特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４に由来し得るヒンジ領域を介してＶＥＧＦ結合部分に作動可能に連結される。特定の実施形態では、ヒンジ領域はＦｃと同じアイソタイプを有し、またヒトＩｇＧ１に由来する。

【0118】

本開示の抗体をコードする核酸分子
一部の態様では、本開示は、本明細書に開示される二重特異性抗体または抗原結合部分をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子に関する。たとえば、核酸配列は二重特異性抗体の重鎖および／または軽鎖をコードしていてもよい。あるいは、核酸配列は、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分、またはＶＥＧＦ抗原結合部分の重鎖もしくは軽鎖可変領域をコードしていてもよい。核酸配列は、二重特異性抗体のＦｃ領域をさらにコードしていてもよい。

【0119】

一部の実施形態では、単離された核酸分子は、以下からなる群から選択される一つまたは複数の核酸配列を含む：
（Ａ）ＶＥＧＦ結合部分の重鎖配列または軽鎖配列をコードする核酸配列；
（Ｂ）ＰＤ－Ｌ１結合部分のアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（Ｃ）ＰＤ－Ｌ１結合部分のアミノ酸配列に作動可能に連結されたＶＥＧＦ結合部分の重鎖配列をコードする核酸配列；
（Ｄ）（Ａ）～（Ｃ）の任意の組み合わせ；および
（Ｅ）（Ａ）～（Ｄ）の拡散配列の相補鎖に高ストリンジェンシーな条件でハイブリダイズした核酸配列。

【0120】

一部の実施形態では、二重特異性抗体の重鎖をコードする核酸配列は配列番号１９に示されるとおりであり、二重特異性抗体の軽鎖をコードする核酸配列は配列番号２０に示されるとおりである。

【0121】

一部の態様では、本開示は、本明細書に開示される核酸配列を含むベクターに関する。さらなる実施形態では、発現ベクターは、二重特異性抗体、たとえばヒト化二重特異性抗体の定常領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。

【0122】

本開示の関連におけるベクターは、染色体、非染色体、および合成核酸ベクター（発現制御エレメントの適切なセットを含む核酸配列）を含む、任意の適切なベクターであってもよい。このようなベクターの例は、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、およびウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターを含む。一実施形態では、ＰＤ－Ｌ１またはＶＥＧＦ抗体をコードする核酸は、たとえば、線形発現エレメント（たとえば、Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)に記載）、圧縮核酸ベクター（たとえば米国特許第６，０７７，８３５号および／またはＷＯ００／７００８７号に記載）、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８、またはｐＵＣ１１８／１１９等のプラスミドベクター、「ミッジ」最小サイズの核酸ベクター（たとえば、Schakowski et al. , Mol Ther 3, 793-800 (2001)に記載）、またはＣａＰ０４沈降構築物［ＣａＰ０４－ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔ］等の沈降核酸ベクター構築物［ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔ］（たとえば、ＷＯ２０００４６１４７号、Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al. , Cell 14, 725 ( 1978),およびCoraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)に記載）を含む、ネイキッドなＤＮＡまたはＲＮＡベクターに含まれる。このような核酸ベクターおよびその使用法は当技術分野でよく知られている（たとえば、米国特許第５，５８９，４６６号および米国特許第５，９７３，９７２号を参照）。

【0123】

一実施形態では、ベクターは、細菌細胞における抗ＰＤ－Ｌ１抗体および／または抗ＶＥＧＦ抗体の発現に適している。このようなベクターの例は、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター(Van Heeke & Schuster、J Biol Chem 264、5503-5509 (1989))、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）等の発現ベクターを含む。ベクターはまた、もしくは代替的に、酵母系での発現に適したベクターであってもよい。酵母系での発現に適した任意のベクターを使用することができる。適切なベクターは、たとえば、アルファ因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ等の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを含む（F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987),およびGrant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)でレビューされてている）。

【0124】

ベクターはまた、または代替的に、哺乳動物細胞発現に適したベクター、たとえばBebbington (1992) Biotechnology (NY) 10: 169-175に記載されているベクター等、選択マーカーとしてグルタミンシンテターゼを含むベクターであってもよい。

【0125】

核酸および／またはベクターはまた、新生ポリペプチド鎖等のポリペプチドをペリプラズム空間または細胞培養培地に標的化することができる分泌／局在化配列をコードする核酸配列を含んでもよい。このような配列は当技術分野で知られており、分泌リーダーまたはシグナルペプチドを含む。

【0126】

ベクターは、任意の適切なプロモーター、エンハンサー、および他の発現促進エレメントを含むか、またはそれらと結合することができる。このようなエレメントの例は、強力な発現プロモーター（たとえば、ヒトＣＭＶＩＥプロモーター／エンハンサー、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＳＬ３－３、ＭＭＴＶ、およびＨＩＶＬＴＲプロモーター）、有効なポリ（Ａ）終結配列、大腸菌におけるプラスミド産物の複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、および／または便利なクローニングサイト（たとえば、ポリリンカー）を含む。核酸は、ＣＭＶＩＥ等の構成的プロモーターとは対照的に、誘導性プロモーターを含んでもよい。

【0127】

さらなる態様において、本開示は、本明細書において上記で特定されるベクターを含む宿主細胞に関する。したがって、本開示は、トランスフェクトーマ等、本開示の二重特異性抗体を産生する組換え真核生物または原核生物宿主細胞にも関する。

【0128】

ＰＤ－Ｌ１特異的抗体は、本明細書に定義される本開示の抗体または本明細書に定義される本開示の二重特異性抗体を産生する、トランスフェクトーマ等の組換え真核生物または原核生物宿主細胞において発現させることができる。ＶＥＧＦ特異的抗体は同様に、本明細書に定義される本開示の抗体または本明細書に定義される本開示の二重特異性抗体を産生する、トランスフェクトーマ等の組換え真核生物または原核生物宿主細胞において発現させることができる。

【0129】

宿主細胞の例は、酵母、細菌、植物、および哺乳動物の細胞、たとえばＣＨＯ、ＣＨＯ－Ｓ、ＨＥＫ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ－２９３Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、ＰＥＲ．Ｃ６もしくはＮＳＯ細胞またはリンパ球細胞を含む。たとえば、一実施形態では、宿主細胞は、細胞ゲノムに安定して組み込まれた第一および第二の核酸構築物を含んでいてもよい。別の実施形態では、本開示は、上記で特定した第一および第二の核酸構築物を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、または線状発現エレメント等の非組み込み核酸を含む細胞を提供する。

【0130】

本開示の抗体を発現するための哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（たとえば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. MoI. Biol. 159:601-621に記載のＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. ScL USA 77:4216-4220に記載のｄｈｆｒＣＨＯ細胞を含む）、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含むが、これらに限定されない。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞で使用するための別の発現系は、ＷＯ８７／０４４６２号、ＷＯ８９／０１０３６号、および欧州特許出願３３８，８４１号に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。ＳＶ４０（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞、または懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251）；サルの腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌの腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞、ＮＳＯ（たとえばＲＣＢ０２１３、1992, Bio/Technology 10:169）およびＳＰ２／０細胞（たとえばＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞、ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）等のマウス骨髄腫細胞；ＹＢ２／０細胞（たとえば、ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、ＡＴＣＣＣＲＬ１６６２）等のラット骨髄腫細胞；ＰＥＲ．Ｃ６細胞；およびヒト肝細胞腫株（ＨｅｐＧ２）も含む。ＣＨＯ細胞は、本明細書で使用できる細胞株の一つであり、ＣＨＯ－Ｋ１、ＤＵＫ－Ｂ１１、ＣＨＯ－ＤＰ１２、ＣＨＯ－ＤＧ４４（Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555 (1986)）、およびＬｅｃ１３が例示的な宿主細胞株である。ＣＨＯ－Ｋ１、ＤＵＫ－Ｂ１１、ＤＧ４４、またはＣＨＯ－ＤＰ１２宿主細胞の場合、これらは、その中で発現されるタンパク質をフコシル化する能力が欠損するように改変することができる。

【0131】

この目的に適した原核生物は、グラム陰性菌またはグラム陽性菌等の真正細菌、たとえば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、たとえばＥ．ｃｏｌｉ等の腸内細菌科、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ菌、たとえばサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア、たとえば、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）およびシゲラ、ならびにバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等の桿菌、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等のシュードモナス、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含む。

【0132】

原核生物に加えて、糸状菌または酵母菌等の真核微生物も、二重特異性抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現宿主として適している。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一般的なパン酵母は、下等真核生物の宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）；たとえばクルイベロミセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２，４２４）、クルイベロミセス・ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６，０４５）、クルイベロミセス・ウィケラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４，１７８）、クルイベロミセス・ワルチ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６，５００）、クルイベロミセス・ドロソフィラム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６，９０６）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびクルイベロミセス・マルシアナス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）等のクルイベロミセス宿主；ヤロウィア（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）；シュワンニオミセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）等のシュワンニオミセス；およびたとえばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム、等の糸状菌、およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）等のアスペルギルス宿主等の、他の多くの属、種、および株も一般に入手可能であり、本明細書において有用である。

【0133】

さらなる態様では、本開示は、１セットまたは２セットのヒト重鎖およびヒト軽鎖をコードする核酸を含むトランスジェニック非ヒト動物または植物に関し、ここで該動物または植物は、本開示の二重特異性抗体を産生する。

【0134】

さらなる態様では、本発明は、本明細書に定義される本発明の二重特異性抗体で使用するための抗体を産生するハイブリドーマに関する。

【0135】

一態様では、本開示は、以下を含む発現ベクターに関する：
（ｉ）ＰＤ－Ｌ１抗原結合部分をコードする核酸配列；
（ｉｉ）ＶＦＧＦ抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸配列；
（ｉｉｉ）Ｆｃ領域をコードする核酸配列；
（ｉｖ）二重特異性抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸配列。

【0136】

一態様では、本開示は、本明細書に開示される二重特異性抗体を発現する発現ベクターまたは複数の発現ベクターを含む本明細書に開示される宿主細胞を培養する工程、および培地から該抗体を精製する工程を含む、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つによる二重特異性抗体を産生する方法に関する。一態様では、本開示は、上で定義した発現ベクターを含む宿主細胞に関する。一実施形態では、宿主細胞は、組換え真核生物、組換え原核生物、または組換え微生物宿主細胞である。

【0137】

医薬組成物
一部の態様では、本開示は、本明細書に開示される二重特異性抗体またはその抗原結合部分および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を対象とする。

【0138】

組成物の成分

【0139】

医薬組成物は、場合により、別の抗体または薬物等の一つまたは複数の追加の薬学的活性成分を含有していてもよい。本開示の医薬組成物は、たとえば、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体がワクチンに対する免疫応答を強化するように別の免疫刺激剤、抗がん剤、抗ウイルス剤、またはワクチンとの併用療法で投与することもできる。薬学的に許容される担体は、たとえば、薬学的に許容される液体、ゲルまたは固体担体、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、麻酔剤、懸濁剤／分散剤、キレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤または非毒性補助物質、当技術分野で知られているその他の成分の様々な組み合わせ、またはそれ以上（ｏｔｈｅｒｋｎｏｗｎｉｎｔｈｅａｒｔｖａｒｉｏｕｓｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｏｆｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｒｍｏｒｅ）を含んでもよい。

【0140】

適切な成分は、たとえば、酸化防止剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤、滑沢剤、香料、増粘剤、着色剤、乳化剤または安定剤、たとえば糖およびシクロデキストリンを含んでもよい。適切な抗酸化剤は、たとえば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、メルカプトグリセロール、チオグリコール酸、メルカプトソルビトール、ブチルメチルアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または没食子酸プロピル（ｐｒｏｐｙｌｇａｌａｃｔｅ）を含んでもよい。本開示で開示されるように、本開示の抗体または抗原結合断片を含む溶媒中では、メチオニン等の一つまたは複数の抗酸化剤を含む組成物が開示され、還元抗体またはその抗原結合断片は酸化されていてもよい。酸化還元により結合親和性の低下が防止または軽減され、それによって抗体の安定性が向上し、保存期間が延長される可能性がある。したがって、一部の実施形態では、本開示は、一つまたは複数の抗体またはその抗原結合断片、およびメチオニン等の一つまたは複数の抗酸化剤を含む組成物を提供する。本開示はさらに、抗体またはその抗原結合断片をメチオニン等の一つまたは複数の抗酸化剤と混合して、抗体またはその抗原結合断片の酸化を防止し、その保存期間を延長することおよび／または活性の増加ができる様々な方法を提供する。

【0141】

さらに説明すると、薬学的に許容される担体は、たとえば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張ブドウ糖注射液、滅菌水注射液、またはブドウ糖および乳酸リンゲル注射液等の水性ビヒクル、植物由来の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油、またはピーナッツ油等の非水性ビヒクル、静菌または静真菌濃度の抗菌剤、塩化ナトリウムまたはブドウ糖等の等張剤、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液等の緩衝剤、重硫酸ナトリウム等の抗酸化剤、塩酸プロカイン等の局所麻酔薬、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドン等の懸濁剤および分散剤、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０）等の乳化剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）等の金属イオン封鎖剤またはキレート剤、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸を含んでもよい。担体として利用される抗菌剤は、フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムを含む複数回用量の容器内の医薬組成物に添加すてもよい。適切な賦形剤は、たとえば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、またはエタノールを含む。適切な非毒性補助物質は、たとえば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解促進剤、または酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンもしくはシクロデキストリン等の薬剤を含む。

【0142】

用法、製剤および用量
本開示の医薬組成物は、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、頭蓋内、心臓内、脳室内、気管内、バッカル、直腸内、腹腔内、皮内、局所、経皮、およびくも膜下腔内を含むがこれらに限定されない様々な経路によって、またはさもなければ移植または吸入により、それを必要とする対象に生体内で投与され得る。本発明の組成物は、固体、半固体、液体、または気体の形態（錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤、エアロゾル剤を含むが、これらに限定されない。）で製剤に配合することができる。適切な製剤および投与経路は、意図される用途および治療レジメンに従って選択することができる。

【0143】

経腸投与に適した製剤は、硬質または軟質ゼラチンのカプセル剤、丸剤、被覆錠剤を含む錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、または吸入剤およびそれらの制御放出剤形を含む。

【0144】

非経口投与（たとえば、注射による）に適した製剤は、水性または非水性、等張性、パイロジェンフリー、滅菌液（たとえば、溶液、懸濁液）を含み、その中に活性成分が溶解、懸濁、または他の方法で提供される（たとえば、リポソームまたは他の微粒子内）。このような液体は、抗酸化剤、緩衝剤、防腐剤、安定剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤、および製剤を対象のレシピエントの血液（または他の関連する体液）と等張にする溶質等の他の薬学的に許容される成分をさらに含有してもよい。賦形剤の例は、たとえば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油等を含む。このような製剤での使用に適した等張担体の例は、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、または乳酸リンゲル注射液を含む。同様に、用量、タイミング、および反復を含む特定の投与レジメンは、特定の個体およびその個体の病歴、ならびに薬物動態（たとえば、半減期、クリアランス率等）等の経験的考慮事項に依存する。

【0145】

投与頻度は、治療期間中に決定および調整することができ、増殖性細胞または腫瘍形成性細胞の数の減少、そのような腫瘍細胞の減少の維持、腫瘍細胞の増殖の減少、または転移の進行の遅延に基づいている。一部の実施形態では、潜在的な副作用および／または毒性を管理するために、投与量を調整または減量することができる。あるいは、主題の治療用組成物の徐放性連続放出製剤が適切な場合もある。

【0146】

適切な用量が患者ごとに変わり得ることは、当業者には理解されるであろう。最適な投与量の決定には、一般に、リスクまたは有害な副作用に対する治療効果のレベルのバランスが含まれる。選択される用量レベルは、特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、化合物の排泄速度、治療期間、組み合わせて使用されるその他の薬物、化合物、および／または材料、状態の重症度、患者の種、性別、年齢、体重、状態、一般的な健康状態、および以前の病歴を含むがこれらに限定されない様々な要因に依存するであろう。化合物の量および投与経路は、最終的には医師、獣医師、または臨床医の裁量に任されるが、一般的に投与量は、実質的な有害な（ｈａｒｍｆｕｌ）または有害な（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ）副作用を引き起こすことなく、所望の効果を達成する作用部位での局所濃度を達成するように選択される。

【0147】

一般に、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、様々な範囲で投与され得る。これらは、これらには、１回の用量当たり約５μｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重；１回の用量当たり約５０μｇ／ｋｇ体重～約５ｍｇ／ｋｇ体重；１回の用量当たり約１００μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重を含む。他の範囲は、１回の用量当たり約１００μｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、および１回の用量当たり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重を含む。特定の実施形態では、用量は、１回の用量あたり少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0148】

いずれにしても、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、必要に応じて、それを必要とする対象に投与されることが好ましい。投与頻度の決定は、治療される状態、治療される対象の年齢、治療される状態の重症度、対象の一般的な健康状態の考慮等に基づいて、主治医などの当業者によって行われ得る。

【0149】

特定の好ましい実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む一連の治療は、数週間または数ヶ月にわたる選択された医薬品の複数回投与を含むであろう。より具体的には、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、毎日、２日ごと、４日ごと、１週間ごと、１０日ごと、２週間ごと、３週間ごと、１カ月ごと、６週間ごと、２カ月ごと、１０週間ごと、または３カ月ごとに投与され得る。この点に関して、患者の反応および臨床実践に基づいて投与量を変更したり、間隔を調整したりできることが理解されるであろう。

【0150】

用量およびレジメンは、１回以上の投与を受けた個体における開示された治療組成物について経験的に決定することもできる。たとえば、本明細書に記載のように生産される治療組成物の増分用量を個体に与えてもよい。選択された実施形態では、用量は、それぞれ経験的に決定または観察された副作用または毒性に基づいて、徐々に増加または減少または減弱され得る。選択された組成物の有効性を評価するために、前述のように、特定の疾患、障害、または状態のマーカーを追跡することができる。がんの場合、これらには、触診または視覚的観察による腫瘍サイズの直接測定、Ｘ線またはその他のイメージング技術による腫瘍サイズの間接測定；直接的な腫瘍生検および腫瘍試料の顕微鏡検査によって評価される改善；間接的腫瘍マーカー（たとえば、前立腺がんのＰＳＡ）または本明細書に記載の方法に従って同定された腫瘍原性抗原の測定、痛みまたは麻痺の減少；腫瘍に関連する言語、視覚、呼吸、またはその他の障害の改善；食欲の増加；または、受け入れられた検査または生存期間の延長によって測定される生活の質の向上が含まれる。当業者には、用量が個体、腫瘍性状態のタイプ、腫瘍性状態の段階、腫瘍性状態が個体内の他の部位に転移し始めているかどうか、および過去および同時に使用されている治療法に応じて変化することは明らかであろう。

【0151】

非経口投与（たとえば、静脈内注射）に適合する製剤は、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合部分を約１０μｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含むだろう。特定の選択された実施形態では、抗体またはその抗原結合部分の濃度は、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌを含むだろう。他の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合部分の濃度は、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、または１００ｍｇ／ｍｌを含むであろう。

【0152】

開示の適用
一部の態様では、本開示は、治療を必要とする対象（たとえば、ヒト）に、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合部分の治療有効量を投与することを含む、対象における障害を治療する方法を提供する。たとえば、障害はがんである。

【0153】

ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦが関与する様々ながんは、悪性か良性か、原発性か続発性かを問わず、本開示によって提供される方法で治療または予防することができる。がんは固形がんまたは血液悪性腫瘍であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、結腸がんおよび結腸直腸がん等の、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦに関連するがんの予防、寛解、および治療に使用され得る。

【0154】

一部の他の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、血管新生に関連する障害の予防、寛解、および治療に使用され得る。

【0155】

一部の他の実施形態では、障害は自己免疫疾患である。抗体またはその抗原結合部分で治療できる自己免疫疾患の例は、自己免疫性脳脊髄炎、エリテマトーデス、および関節リウマチを含む。抗体またはその抗原結合部分は、感染症、炎症性疾患（アレルギー性喘息等）および慢性移植片対宿主病を治療または予防するために使用することもできる。

【0156】

化学療法との併用
抗体またはその抗原結合部分は、抗がん剤、細胞毒性剤、または化学療法剤と組み合わせて使用することができる。

【0157】

「抗がん剤」または「抗増殖剤」という用語は、がん等の細胞増殖性障害を治療するために使用できる任意の薬剤を意味し、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的抗がん剤、ＢＲＭ、治療用抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法および抗転移剤および免疫療法剤を含むが、これらに限定されない。上述の選択された実施形態において、そのような抗がん剤はコンジュゲートを含んでもよく、投与前に開示された部位特異的抗体と会合してもよいことが理解されるであろう。より具体的には、特定の実施形態では、選択された抗がん剤は、操作された抗体の不対システインに結合されて、本明細書に記載の操作されたコンジュゲートを提供する。したがって、そのような操作されたコンジュゲートは、本開示の範囲内にあることが明示的に企図される。他の実施形態では、開示された抗がん剤は、上記の異なる治療薬を含む部位特異的コンジュゲートと組み合わせて投与される。

【0158】

本明細書で使用される場合、用語「細胞毒性剤」は、細胞に対して有毒であり、細胞の機能を減少または阻害し、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。特定の実施形態では、物質は、生体に由来する天然に存在する分子である。細胞毒性剤の例は、細菌の（たとえば、ジフテリア毒素、シュードモナス属の内毒素および外毒素、ブドウ球菌のエンテロトキシンＡ）、真菌（たとえば、α－サルシン、レストリクトシン）、植物（たとえば、アブリン、リシン、モデクシン、ビスクミン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、大麦毒素、アレウライト・フォルディ）（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラッカ・メリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（モモルディカ・チャランティア［Ｍｏｍｏｒｄｉｃａｃｈａｒａｎｔｉａ］）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミテゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセン）、または動物（たとえば、細胞外膵臓ＲＮａｓｅ等の細胞傷害性ＲＮａｓｅ；ＤＮａｓｅＩ（その断片および／またはバリアントを含む）の小分子毒素または酵素活性毒素を含むが、これらに限定されない。

【0159】

本開示の目的のために、「化学療法剤」は、がん細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、および／または生存を非特異的に減少させるか阻害する化合物（たとえば、細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤）を含む。このような化学物質は、多くの場合、細胞の増殖または分裂に必要な細胞内プロセスを対象としており、したがって、一般に急速に増殖および分裂するがん性細胞に対して特に効果的である。たとえば、ビンクリスチンは微小管を脱重合し、細胞が有糸分裂に入るのを阻害する。一般に、化学療法剤は、がん性細胞またはがん性になりそうか、または腫瘍形成性の子孫（たとえば、ＴＩＣ）を生成する可能性のある細胞を阻害する、または阻害するように設計された任意の化学薬剤を含んでもよい。このような薬剤は、たとえばＣＨＯＰまたはＦＯＬＦＩＲＩ等のレジメンと組み合わせて投与されることが多く、最も効果的であることが多い。

【0160】

本開示の抗体と組み合わせて（部位特異的コンジュゲートの成分として、または非結合状態で）使用され得る抗がん剤の例は、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルアメルアミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、ＣＣ－１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）、サルコディクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン系抗生物質、ダイネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、アウトラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、アドリアマイシン（登録商標）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、エルロチニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸アナログ、プリンアナログ、アンドロゲン、抗副腎薬、フロリン酸等の葉酸補充剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルチン、ジアジクオン、エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃａｃｉｄ）、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ、オレゴン州ユージーン）、ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ジェムザール（登録商標）［ＧＥＭＺＡＲ］ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド; ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン（登録商標）［ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ］ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；イリノテカン（カンプトサール、ＣＰＴ－１１）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルロルニチン；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；細胞増殖を減少させるＰＫＣ－α、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲおよびＶＥＧＦ－Ａの阻害剤、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を含むが、これらに限定されない。この定義には、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター等、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害する抗ホルモン剤、副腎でのエストロゲン産生を調節するアロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害剤、および抗アンドロゲン；ならびにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ発現阻害剤およびＨＥＲ２発現阻害剤等のリボザイム；ワクチン、プロロイキン（登録商標）［ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ］ｒＩＬ－２；ルルトテカン（登録商標）［ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ］トポイソメラーゼ１阻害剤；アバレリクス（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビンおよびエスペラミシン、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。

【0161】

放射線治療との併用
本開示はまた、抗体またはその抗原結合部分と放射線療法（すなわち、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出等の、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘発する任意の機構）との組み合わせを提供する。腫瘍細胞への放射性同位体の指向性送達（ｄｉｒｅｃｔｅｄｄｅｌｉｖｅｒｙ）を使用する併用療法も企図されており、開示された抗体は、標的化抗がん剤または他の標的化手段と組み合わせて使用することができる。典型的には、放射線療法は、約１週間から約２週間の期間にわたってパルス的に施される。放射線療法は、頭頸部がんに罹患している対象に約６～７週間施される場合がある。任意選択で、放射線療法は、単回線量として、または複数回の連続線量として投与されてもよい。

【0162】

医薬品パックおよびキット
１回以上の用量の抗体またはその抗原結合部分を含む、１つ以上の容器を含む医薬パックおよびキットも提供される。特定の実施形態では、たとえば、一つまたは複数の追加の薬剤の有無にかかわらず、抗体またはその抗原結合部分を含む所定量の組成物を含む、単位用量が提供される。他の実施形態では、そのような単位用量は、注射用の単回使用のプレフィルドシリンジで供給される。さらに他の実施形態では、単位用量に含まれる組成物は、生理食塩水、スクロース等；リン酸塩等の緩衝液；を含んでもよく；および／または安定かつ有効なｐＨ範囲内で配合される。あるいは、特定の実施形態では、組成物は、適切な液体、たとえば滅菌水または生理食塩水の添加により再構成することができる凍結乾燥粉末として提供されてもよい。特定の好ましい実施形態では、組成物は、スクロースおよびアルギニンを含むがこれらに限定されない、タンパク質の凝集を阻害する一つまたは複数の物質を含む。容器上の、または容器に付随するラベルは、封入された組成物が選択された腫瘍性疾患状態の治療に使用されることを示す。

【0163】

本開示はまた、抗体の単回投与または複数回投与単位、および場合により一つまたは複数の抗がん剤を生成するためのキットを提供する。キットは、容器、および容器上の、または容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。適切な容器は、たとえば、ボトル、バイアル、注射器等を含む。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成することができ、結合型または非結合型のいずれかで、薬学的に有効量の開示された抗体を含有することができる。他の好ましい実施形態では、容器は滅菌アクセスポートを備える（たとえば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈注射用溶液（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）バッグまたはバイアルであってもよい）。このようなキットは一般に、適切な容器内に抗体の薬学的に許容される製剤を含み、場合により同じまたは異なる容器内に一つまたは複数の抗がん剤を含む。キットは、診断または併用療法のいずれかのために、他の薬学的に許容される製剤も含んでもよい。たとえば、本開示の抗体またはその抗原結合部分に加えて、そのようなキットは、化学療法剤または放射線療法剤（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｄｒｕｇ）；抗血管新生剤；抗転移剤；標的抗がん剤；細胞毒性剤；および／または他の抗がん剤等の一連の抗がん剤のうちの任意の一つまたは複数を含んでもよい。

【0164】

より具体的には、キットは、追加の成分の有無にかかわらず、開示された抗体またはその抗原結合部分を含む単一の容器を有してもよく、または所望の薬剤ごとに別個の容器を有してもよい。組み合わせ治療薬（ｃｏｍｂｉｎｅｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が結合のために提供される場合、単一の溶液を、モル当量の組み合わせで、または一方の成分を他方より過剰に混合して、事前に混合することができる。あるいは、キットの抗体および任意の抗がん剤は、患者に投与する前に別個の容器内に別々に維持されてもよい。キットはまた、滅菌した薬学的に許容される緩衝液、または静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液およびブドウ糖液等の他の希釈剤を収容するための第二／第三の容器手段を含んでもよい。

【0165】

キットの成分が一つまたは複数の溶液で提供される場合、溶液は好ましくは水溶液であり、滅菌水溶液または生理食塩水が特に好ましい。ただし、キットの成分は乾燥粉末として提供されてもよい。試薬または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は適切な溶媒を添加することによって再構成することができる。溶媒が別の容器に提供されてもよいことが想定される。

【0166】

上で簡単に示したように、キットはまた、抗体またはその抗原結合部分および任意の成分を患者に投与するための手段、たとえば、１本または複数の針、静脈注射用バッグ（Ｉ．Ｖ．ｂａｇ）または注射器、さらには点眼器、ピペット、または他の同様の装置であり、そこから製剤を動物に注射または導入する、または体の患部に塗布したりすることができる装置を含んでもよい。本開示のキットは、典型的には、バイアル等を収容するための手段、および、たとえば所望のバイアルおよび他の装置が配置され、保持される射出成形またはブロー成形プラスチック容器等に、商業販売のために密封（ｃｌｏｓｅｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）された他の成分を含む。

【0167】

配列表の概要
本願には、多数のアミノ酸配列を含む配列表が添付される。以下の表Ａは、含まれる配列の概要を示す。

【0168】

抗ＶＥＧＦ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体である、本明細書に開示される例示的な抗体の一つは、Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０（「Ｗ３２５３」と略記）と称される。

【0169】

【表1】

【実施例1】

【0170】

このように一般的に記載された本開示は、例示として提供され、本開示を限定することを意図するものではない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。実施例は、以下の実験が実施されたすべての実験または唯一の実験であることを示すことを意図したものではない。

【0171】

実施例１
材料、ベンチマーク抗体および細胞株の調製
１．１材料の準備
実施例で使用した市販の材料に関する情報を表１に示す。

【0172】

【表2】

【0173】

１．２抗原の調製
ヒトＶＥＧＦの配列（ＵｎｉｐｏｒｔＮｏ．：Ｐ１５６９２）、ヒトＰＤ－Ｌ１（ＵｎｉｐｏｒｔＮｏ．：Ｑ９ＮＺＱ７）、カニクイザルＰＤ－１（ＵｎｉｐｏｒｔＮｏ．：Ｑ１５１１６）、およびヒトＰＤ－１の（ＵｎｉｐｏｒｔＮｏ．：Ｑ１５１１６）の細胞外ドメイン配列をコードするＤＮＡ配列をＳａｎｇｏｎＢｉｏｔｈｅｃｈ（中国、上海）で合成し、次にＣ末端に異なるタグ（６×ｈｉｓ、ヒトＦｃ、またはマウスＦｃ等）を有する改変ｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターにサブクローニングした。

【0174】

Ｅｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１４５２７）を、精製した発現ベクターでトランスフェクトした。細胞を５日間培養し、Ｎｉ－ＮＴＡカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７５２４８）、プロテインＡカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７５４３８）またはプロテインＧカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７０６１８）を使用してタンパク質精製のために上清を収集した。得られたヒトＶＥＧＦ、ヒトＰＤ－Ｌ１、およびヒトＰＤ－１はＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣでＱＣ処理し、－８０℃で保存した。

【0175】

１．３ベンチマーク抗体（ＢＭＫＡｂ）の作製
ベバシズマブ（すなわち、アバスチン、ドラッグバンクからの配列、ＤｒｕｇＢａｎｋＮｏ．：ＤＢ００１１２）およびアテゾリズマブ（ロシュが開発した抗ＰＤ－Ｌ１抗体）の可変領域をコードするＤＮＡ配列を、ＳａｎｇｏｎＢｉｏｔｈｅｃｈ（中国、上海）またはＧｅｎｅｗｉｚ（中国蘇州）を使用して、ヒトＩｇＧ１の定常領域を含む改変型ｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターにサブクローニングした。

【0176】

重鎖および軽鎖をコードするプラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞に共トランスフェクトした。細胞を５日間培養し、プロテインＡカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７５４３８）を使用したタンパク質精製のために上清を収集した。得られた抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣで分析し、－８０℃で保存した。

【0177】

１．４安定した細胞株／細胞プールの確立
ＰＤ－Ｌ１発現細胞株
ヒトＰＤ－Ｌ１高発現安定細胞株（ＷＢＰ３１５．ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１）およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１高発現安定細胞株（ＷＢＰ３１５．２９３Ｆ．ｃＰｒｏ１．２Ａ）を限界希釈法により取得した。

【0178】

簡単に説明すると、ヒトＰＤ－Ｌ１またはカニクイザルＰＤ－Ｌ１の遺伝子をそれぞれ発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３に挿入した。次に、プラスミドをそれぞれＣＨＯ－Ｋ１／２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの６～８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、６ウェルプレートで３ｍｌの新鮮な非選択培地を与えた。トランスフェクションの２４～４８時間後にトリプシンを用いて細胞を回収し、選択培地（Ｆ１２－Ｋ、１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍｌブラストサイジン）中のＴ７５フラスコに播種した。限界希釈により高発現安定細胞株を得て、ＦＡＣＳにより発現レベルを測定した。

【0179】

不死の細胞株
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌ（カタログ番号：８０００）から購入し、基本培地、５％ＦＢＳ、１％内皮細胞成長因子（ＥＣＧＳ、ＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌ、カタログ番号：１０５２）を含む内皮細胞培地（ＥＣＭ、ＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌ、カタログ番号：１００１）で培養した。細胞を３７℃、および５％ＣＯ_２のインキュベーター内で培養した。長期保存の場合、細胞を５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを補充した完全増殖培地中で凍結し、液体窒素気相中で保存した。

【0180】

実施例２
ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体の生成
ＢｓＡｂ構築のために、ＯＭＴラット免疫化およびハイブリドーマ技術により抗ＰＤ－Ｌ１完全ヒトモノクローナル抗体をインハウスで生成し、得られた抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体を同定し、Ｗ３１５５－ｒ１．１４．４と命名した。重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１３および１４に示される通りであった。Ｗ３１５５－ｒ１．１４．４およびベバシズマブの可変領域を二重特異性抗体の構築に使用した。

【0181】

Ｗ３１５５－ｒ１．１４．４の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を一つの鎖に結合して、抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖを形成した。抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖ（ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）４－ＶＬ）をコードするＤＮＡ配列を（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより、そのＦｃ領域にはＦｃエフェクター機能を無効にするＬＡＬＡ変異が含まれているベバシズマブの重鎖のＮ末端に付加した。軽鎖はベバシズマブと同じであった。構築されたＢｓＡｂは、Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０（接尾辞「Ｖ３２０」は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換を含むＩｇＧ１Ｆｃ領域を意味する）またはＷ３２５３と名付けられた。次に、両方の鎖をコードするＤＮＡ配列を、改変されたｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターにクローン化した。

【0182】

重鎖および軽鎖発現プラスミドを、製造業者の指示に従ってＥｘｐｉ２９３発現システムキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－Ａ１４６３５）を使用してＥｘｐｉ２９３細胞に共トランスフェクトした。トランスフェクションの５日後、上清を収集し、プロテインＡカラムおよびＣＥＸカラムを使用したタンパク質精製に使用した。抗体濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。タンパク質の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ－ＳＥＣによって評価された（図２および３）。Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０抗体の特定の配列を以下の表２～４に列挙する。

【0183】

【表3】

【0184】

【表4】

【0185】

【表5】

【0186】

実施例３
二重特異性抗体のインビトロ特性評価
３．１ヒト／カニクイザルのＶＥＧＦ結合（ＥＬＩＳＡ）
カニクイザルＶＥＧＦのアミノ酸配列はヒトＶＥＧＦと同一である。ＥＬＩＳＡ結合の場合、非組織培養処理平底９６ウェルプレート（ＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｐ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を０．２５μｇ／ｍｌのＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌヒトＶＥＧＦタンパク質Ｗ３２５－ｈＰｒｏ１（Ｓｉｎｏ）で４℃で一晩プレコーティングした。２％ＢＳＡブロッキング後、２００ｎＭ～０．０００１９０７３５ｎＭの４倍滴定抗体１００μＬを各ウェルにピペットで移し、周囲温度で２時間インキュベートした。未結合物質の除去後、１：５０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＢｅｔｉｃＡ８０－３０４Ｐ）１００μＬをウェルに添加し、１時間インキュベートした。１００μＬのＴＭＢ基質を分注することで発色させ、１００μＬの２ＭＨＣｌで発色を停止した。マイクロプレート分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５^ｅ）を使用して、４５０ｎｍおよび５４０ｎｍで吸光度を読み取った。

【0187】

Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０は、ヒトＶＥＧＦ上で親抗体アバスチンと同等の結合能を示し、ＥＣ_５０は０．０１ｎＭである（図４）。

【0188】

３．２ヒトＰＤ－Ｌ１結合（ＦＡＣＳ）
ＦＡＣＳ結合のために、操作されたヒトＰＤ－Ｌ１発現細胞Ｗ３１５－ＣＨＯＫ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１を、Ｕ底９６ウェルプレート（ＣＯＳＴＡＲ３７９９）に１×１０^５細胞／ウェルで播種した。２００ｎＭ～０．０００７６２９３９ｎＭの１％ＢＳＡＤＰＢＳで４倍滴定したＡｂを細胞に添加した。プレートを４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、１：１５０に希釈したＰＥ標識ヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ１０９－１１５－０９８）１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。細胞への抗体の結合はフローサイトメトリーによって試験し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）はＦｌｏｗＪｏによって分析した。

【0189】

Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０も、ヒトＰＤ－Ｌ１上でアテゾリズマブと同等の結合能を示し、ＥＣ_５０は０．１２８ｎＭであった（図５）。

【0190】

３．３ヒトＶＥＧＦ／ヒトＰＤ－Ｌ１二重結合（ＥＬＩＳＡ）
二重特異性抗体がヒトＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦの両方に結合することができるかどうかを試験するために、以下のようにＥＬＩＳＡアッセイを開発した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｐ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、炭酸－重炭酸緩衝液中の１μg／ｍｌ抗原－１（ｈＶＥＧＦ．ｈｉｓ、Ｗ３２５－ｈＰｒｏ１．ｈｉｓ（インハウス））で４℃で一晩コーティングした。カゼイン緩衝液を用いたブロッキング工程では、カゼイン緩衝液中の異なるＰＤ－Ｌ１×ＶＥＧＦ二重特異性抗体の段階希釈（５倍希釈、１００ｎＭ～０．００１２８ｎＭ）をプレート上で室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートを、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＰＢＳ３００μＬ／ウェルで３回洗浄した。１μｇ／ｍｌの抗原－２（ｈＰＤ－Ｌ１－ＥＣＤ．ｍＦｃ、Ｗ３１５－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ（インハウス））をプレートに添加し、１時間インキュベートした（W315-hPro1.ECD.mFc (in house) was added to plates and incubation 1 hour）。プレートを３回洗浄した後、１：５０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢｅｔｈｙｌＡ９０－２３１Ｐ）１００μＬを添加し、プレート上で室温で１時間インキュベートした。０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ３００μＬ／ウェルで６回洗浄し、検出のためにＴＭＢ基質１００μＬ／ウェルを添加し（for the detection pre well）、約５分後に反応を停止した。ウェルの吸光度を、多層プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５^ｅ）を使用して４５０ｎｍおよび５４０ｎｍで測定した。

【0191】

Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０のヒトＶＥＧＦおよびヒトＰＤ－Ｌ１に対する二重結合活性をＥＬＩＳＡベースの結合アッセイによって測定した。結果は、Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０の結合がその後のＰＤ－Ｌ１の結合に影響を及ぼさないことを示していまる（図６）。

【0192】

３．４カニクイザルＰＤ－Ｌ１結合（ＦＡＣＳ）
ＦＡＣＳ結合のために、操作されたカニクイザルＰＤ－Ｌ１発現細胞Ｗ３１５－２９３Ｆ．ｃＰｒｏ１．２Ａ２（インハウス）をＵ底９６ウェルプレート（ＣＯＳＴＡＲ３７９９）に１×１０^５細胞／ウェルで播種した。２００ｎＭ～０．０００７６２９３９ｎＭの１％ＢＳＡＤＰＢＳで４倍滴定したＡｂを細胞に添加した。プレートを４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、１：１５０に希釈したＰＥ標識ヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ１０９－１１５－０９８）１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。細胞への抗体の結合はフローサイトメトリーによって試験し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）はＦｌｏｗＪｏによって分析した。

【0193】

カニクイザルＶＥＧＦのアミノ酸はヒトＶＥＧＦと同一であるため、Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０もカニクイザルＶＥＧＦに対する結合活性を有する。Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０は、カニクイザルＰＤ－Ｌ１に対してアテゾリズマブと同等の結合能力を示し、ＥＣ_５０は０．５９ｎＭであった（図７）。

【0194】

３．５ＶＥＧＦおよびＰＤ－Ｌ１（ＳＰＲ）に対する結合親和性
抗原に対する抗体結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋを使用するＳＰＲアッセイによって検出した。Ａｂは、抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体固定化ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ）上に捕捉された。異なる濃度の抗原を、会合段階で３０μＬ／分の流速でセンサーチップ上に注入し、続いて解離段階を行った。チップは各結合サイクル後に１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）によって再生した。ブランク表面および緩衝液チャネルのセンサーグラムは、テストセンサーグラムから差し引いた。実験データは、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｉｕｒ）解析を使用して１：１モデルによってフィッティングした。

【0195】

Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０の親和定数（Ｋ_Ｄ）は、ＳＰＲ技術に基づいて測定された。この間に、オン速度定数（ｋａ）およびオフ速度定数（ｋｄ）が測定される。各インタラクションの最終データは、参照チャネルおよびバッファチャネルのデータから差し引いた（ｄｅｄｕｃｔｅｄ）。実験データは、図８Ａ、図８Ｂ、および図９に示すように分析された。抗体の動的親和性の結果を表５に示す。

【0196】

【表6】

【0197】

３．６ヒトＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２競合アッセイ
二重特異性抗体がヒトＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２のヒトＶＥＧＦタンパク質への結合をブロックすることができるかどうかを試験するために、以下のようにリガンド競合アッセイを行った。

【0198】

ＥＬＩＳＡでは、平底９６ウェルプレート（ＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｐ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を０．５μｇ／ｍｌのＷ３２５－ｈｐｒｏ１Ｒ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＳＢ）または２μｇ／ｍｌのＷ３２５－ｈｐｒｏ１Ｒ２．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＳＢ）で４℃で一晩、事前にコーティングした。カゼイン緩衝液でブロッキングした後、０．０２μｇ／ｍｌヒトＶＥＧＦタンパク質Ｗ３２５－ｈＰｒｏ１．ｈｉｓ．ｂｉｏｔｉｎと結合した２００ｎＭ～０．０００１９０７３５ｎＭの２倍滴定Ａｂ１００μＬをピペットで各ウェルに入れ、周囲温度で２時間インキュベートした。インキュベート後、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む３００μＬ／ウェルのＰＢＳでプレートを3回洗浄した。１：１００００に希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ♯ＳＮＮ１００４）１００μＬをプレートプレウェルに添加し、１時間インキュベートした。６回洗浄した後、１００μＬのＴＭＢ基質を分注することによって発色させ、その後、１００μＬの２ＭＨＣｌによって発色を止めた。マイクロプレート分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５^ｅ）を使用して、４５０ｎｍおよび５４０ｎｍで吸光度を読み取った。

【0199】

Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０は、１．４７ｎＭのＩＣ_５０でＶＥＧＦに結合するｈＶＥＧＦＲ１に対して親抗体よりも優れた競合能力を示し（図１０）、１．０４ｎＭのＩＣ_５０でＶＥＧＦに結合するｈＶＥＧＦＲ２に対して親抗体よりも優れた競合能力を示す（図１１）。

【0200】

３．７ヒトＰＤ－１競合アッセイ
二重特異性抗体がＰＤ－Ｌ１発現細胞へのＰＤ－１タンパク質の結合をブロックすることができるかどうかを試験するために、次の競合アッセイを行った。

【0201】

ＦＡＣＳによってヒトＰＤ－１のヒトＰＤ－Ｌ１への結合をブロックするために、遺伝子操作されたヒトＰＤ－Ｌ１発現細胞Ｗ３１５－ＣＨＯＫ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１をＵ底９６ウェルプレート（ＣＯＳＴＡＲ３７９９）に１×１０^５細胞／ウェルで播種した。５μｇ／ｍｌのインハウスヒトＰＤ－１タンパク質Ｗ３０５－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃと結合した２００ｎＭ～０．０００７６２９３９ｎＭの４倍滴定Ａｂを細胞に添加した。プレートを４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、１：１５０に希釈したＰＥ標識ヤギ抗マウス抗体（ａｂｃａｍ９８７４２）１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。細胞への抗体の競合結合はフローサイトメトリーによって試験し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）はＦｌｏｗＪｏによって分析した。

【0202】

Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０は、ヒトＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間の結合のブロックにおいてアテゾリズマブと同等の競合能力を示し、ＩＣ_５０は０．３９ｎＭであった（図１２）。

【0203】

３．８ＨＵＶＥＣ細胞増殖アッセイ
ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖におけるＷ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０の生物学的活性を評価した。ＨＵＶＥＣ細胞を、ＥＣＭ＋５％ＦＢＳ＋１％ＥＣＧＳ中で日常的に培養した。サブコンフルエントな細胞をトリプシンによって回収し、ＥＣＭ＋１％ＦＢＳ＋０．０５％ＥＣＧＳで１×１０^５細胞／ｍＬに希釈した。細胞を９６ウェル透明底黒色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６５５０９０）に４０００細胞／ウェルの密度で播種した。段階希釈した抗体を、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦ（ＷＢＰ３２５－ｈＰｒｏ１、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１１０６６－ＨＮＡＢ）とともに添加した。プレートを５日間インキュベーターに戻し、その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７３）を使用して細胞生存率を評価した。リガンドを添加していないウェルは、リガンド刺激による細胞増殖の対照として機能した。リガンド刺激による細胞増殖の阻害に対する試験抗体の効果は、バックグラウンド（リガンドなし）の発光を差し引いた後、抗体添加（リガンドのみ）の有無にかかわらず発光値を比較することによって計算した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用して、４パラメーター非線形回帰分析を使用して増殖阻害ＩＣ_５０値を取得した。

【0204】

Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０は、０．９５ｎＭのＩＣ_５０および１１４．２％の最大阻害率で、濃度依存的にＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖を効果的に阻止した（図１３）。

【0205】

３．９レポーター遺伝子アッセイ
ＷＢＰ３２５３リード抗体が、Ｔ細胞応答の調節におけるＰＤ－Ｌ１の役割に機能的に対抗できるかどうかを試験するために、全長ＰＤ－１を発現し、ＮＦＡＴ－ＲＥ－Ｌｕｃ２ｐと統合されたＪｕｒａｋｔ細胞（効果細胞［ｅｆｆｅｃｔｃｅｌｌ］）および抗ＣＤ３（ＯＴＫ３）ＳｃＦｖＡｂを有するＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ－Ｌ１細胞（標的細胞）を、それぞれ２×１０^４細胞／５０μＬおよび４×１０^４細胞／５０μＬで播種した。次に、５０μＬのＷＢＰ３２５３Ａｂ（４倍希釈、３３．５ｎＭ～０．００２０４５ｎＭ）と３７℃で６時間共培養した。インキュベート後、発色のために５０μＬのｏｎｅ－ｇｌｏルシフェラーゼ基質を各ウェルに添加した。ウェルの蛍光強度はＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＮＯ．７９８１０４）により測定した。

【0206】

Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０は、ＰＤ－Ｌ１レポート遺伝子アッセイにおける機能性を示す（図１４）。

【0207】

３．１０混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ
ＭＬＲは、サイトカイン、ヒトＩＦＮ－γ分泌、および活性化ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖に対するＰＤ－Ｌ１抗体のアゴニスト効果を試験するために使用した。

【0208】

ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ勾配遠心分離を使用して健康なドナーから新たに単離された。単球は、製造者の指示に従ってヒト単球濃縮キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ－１３０－０５０－２０１）を使用して単離された。細胞濃度を、８００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦおよび５０μｇ／ｍｌのＩＬ－４を、６ウェルプレート中において２．５ｍｌ／ウェルで補充した完全ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ－２２４０００８９）中で２×１０^６細胞／ｍｌに調整した。細胞を５～７日間培養して樹状細胞（ＤＣ）に分化させた。サイトカインは、培地の半分をサイトカインを補充した新しい培地と交換することにより、２～３日ごとに補充された。ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞は、メーカーのプロトコールに従ってヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞濃縮キットを使用して単離された。

【0209】

ＭＬＲは、完全ＲＰＭＩ－１６４０培地を使用して９６ウェル丸底プレート（Ｎｕｎｃ、１６３３２０）にセットアップされた。ＣＤ４^＋Ｔ細胞、様々な濃度の抗体、および未成熟ＤＣをプレートに添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。ＩＦＮ－γ産生は５日目に測定した。

【0210】

ヒトＩＦＮ－γは、対応する抗体ペアを使用した酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。組換えヒトＩＦＮ－γ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、３００－０２）をそれぞれ標準として使用した。プレートは、ヒトＩＦＮ－γに特異的な捕捉抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｍ７００Ａ）で事前にコーティングした。ブロッキング後、標準または試料を各ウェルにピペットで移し、周囲温度で２時間インキュベートした。未結合物質の除去後、ＩＦＮ－γに特異的なビオチン結合検出抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｍ７０１Ｂ）をウェルに添加し、それぞれ１時間インキュベートした。次に、ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳＮＮ１００４）をウェルに添加し、周囲温度で３０分間インキュベートした。ＴＭＢ基質を分注することによって発色させ、その後２ＭＨＣｌによって発色を停止させた。マイクロプレート分光光度計を使用して、４５０ｎＭおよび５４０ｎＭでの吸光度を読み取った。

【0211】

Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０は、混合リンパ球反応アッセイにおいて濃度依存的にヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）およびヒトＩＦＮ－γ（ｈＩＦＮ－γ）分泌を誘導することができた（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。

【0212】

３．１１ヒト血清の安定性
抗体を、新たに単離したヒト血清（血清含量＞９０％）中で３７℃でインキュベートした。示された時点で、血清処理試料のアリコートをインキュベーターから取り出し、液体Ｎ２中で急速冷凍し、試験の準備が整うまで８０℃で保管した。試料は安定性試験の直前に急速に解凍した。簡単に言うと、プレートを１μｇ／ｍＬのＷ３２５－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈｉｓ（インハウス）で４℃で一晩、事前にコーティングした。１時間のブロッキング後、試験抗体を様々な濃度（２５ｎＭ～０．００１５ｎＭの４倍連続希釈）でプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む、３００μＬ／ウェルのＰＢＳでプレートを３回洗浄した。１μｇ／ｍｌのＷ３１５－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ（インハウス）をプレートに添加し、１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄した後、１：５０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢｅｔｈｙｌＡ９０－２３１Ｐ）１００μＬを添加し、プレート上で室温で１時間インキュベートした。０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む、３００μＬ／ウェルのＰＢＳで６回洗浄した後、検出プレウェルのために１００μＬのＴＭＢ基質を添加した。約５分後に、ウェル当たり１００μＬの２ＭＨＣｌを添加して反応を停止させた。ウェルの吸光度は、多層プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５ｅ）を使用して４５０ｎｍおよび５４０ｎｍで測定した。

【0213】

Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０の血清安定性を、ヒト血清下、３７℃で２週間評価した。ヒト血清で１日間、４日間、７日間、および１４日間処理した抗体結合能力は、０日間と同等であった（図１６）。

【0214】

３．１２熱安定性（ＤＳＦ）
抗体のＴｍは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して研究した。１９μＬの抗体溶液を１μＬの６２．５×ＳＹＰＲＯＯｒａｎｇｅ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、９６ウェルプレート（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に移した。プレートを２６℃から９５℃まで０．９℃／分の速度で加熱し、得られた蛍光データを収集した。異なる温度に対する蛍光変化の負の導関数を計算し、その最大値を融解温度Ｔｍとして定義した。タンパク質に複数のアンフォールディング遷移がある場合、最初の２つのＴｍがレポートされ、Ｔｍ１およびＴｍ２と名付けられる。データ収集およびＴｍ計算は、操作ソフトウェア（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）リアルタイムＰＣＲソフトウェアｖ１．３）によって自動的に行われた。

【0215】

ＤＳＦアッセイの結果は、Ｔｍ１値が６８．７℃であることを示す（図１７）。

【0216】

実施例４
二重特異性抗体のインビボ特性評価
４．１マウスＰＫ研究
ＷＢＰ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０の薬物動態をＣ５７ＢＬ／６メスマウスで試験した。生後６～８週のメスのＣ５７ＢＬ／６マウス（ＳｈａｎｇｈａｉＬｉｎｇｃｈａｎｇＢｉｏｔｅｃｈＣｏ．，ＬＴＤ）を研究に使用した。

【0217】

薬物動態研究では、３匹のＣ５７ＢＬ／６メスマウスに１３．３ｍｇ／ｋｇのＷＢＰ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０を静脈内注射した。抗体注射の前に、投与前の血液を採取した。抗体注射後、３０分、２時間、６時間、２４時間、２日間、３日間、５日間、７日間、および１０日間の間隔で、血液試料を目から採取し、ＥＤＴＡチューブに移した。チューブを４℃、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次に血漿を収集して－２０℃で保存した。

【0218】

血清抗体濃度はＥＬＩＳＡによる３つの方法で測定した。ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃまたはＷ３１５－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃを、それぞれ９６ＥＬＩＳＡプレートに１μｇ／ｍｌで４℃で一晩固定した。プレートを１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水ｔｗｅｅｎ（登録商標）（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、残りの結合部位を２％（ｗ／ｖ）ウシアルブミン（ＢＳＡ）で室温で１時間ブロッキングした。精製した組換え抗体、血清試料、およびＱＣ試料を２％ＢＳＡで希釈し、二重に滴定し、ＥＬＩＳＡプレート内で室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ－ビオチン（０．０６２５μｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦ．ｈｉｓ．ｂｉｏｔｉｎ（１μｇ／ｍｌ）を室温で１時間インキュベートした。検出は、５０μｌテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を使用して、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンで行った。反応を５０μｌの２ＭＨＣｌで停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５ｅにより４５０～５４０ｎｍで吸光度を測定した。標準曲線は、精製された組換え抗体によって計算した。血清抗体濃度は、標準曲線に基づいてＳｏｆｔＭａｘを使用して計算した。データは、Ｇｒａｐｈ－Ｐｒｉｓｍソフトウェア（米国カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して３つの独立した結合曲線からフィットした。血清抗体の濃度は、ＰｈｏｅｎｉｘＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（バージョン８．１、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用してノンコンパートメントモデルで分析した。ＰＫのパラメーターは線形対数台形公式（ｌｉｎｅａｒｌｏｇｔｒａｐｅｚｏｉｄｒｕｌｅ）であった。結果は平均値および標準偏差（平均値±ＳＤ）で表した。その方法をＰＫワークフローにまとめた。

【0219】

研究における動物の取り扱い、世話、および治療に関連するすべての手順は、実験動物管理評価認定協会（ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔａｎｄＡｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＣａｒｅ；ＡＡＡＬＡＣ）のガイダンスに従って、ＳｈａｎｇｈａｉＷｕＸｉｂｉｏｌｏｇｉｃｓＣｏ．，Ｌｔｄの施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたガイドラインに従って実行した。

【0220】

図１８に示すように、抗体がマウスにおいて安定であるという同様の結果が３つの検出方法で得られた。表６に示すように、ｔ_１／２は、それぞれ２９２時間（Ｆｃ＋Ｆｃ）、３４２時間（Ｆｃ＋ＰＤ－Ｌ１）、および３５６時間（ＰＤＬ１＋ＶＥＧＦ）であった。

【0221】

【表7】

【0222】

４．２異種移植された（Ｅｘｎｏｇｒａｆｔｅｄ）ＲＫＯ結腸がん腫瘍モデル
ＷＢＰ３２５３のインビボ有効性研究は、ＮＣＧメスマウスＲＫＯ結腸がん腫瘍モデルで試験された。この研究には、生後８～１０週のメスのＮＣＧマウス（ＮａｎｊｉｎｇＧａｌａｘｙＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．，ＬＴＤ）を使用した。ＲＫＯ細胞は、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＥＭＥＭ培地中で、３７℃、空気中５％ＣＯ_２の雰囲気下で単層培養物としてインビトロで維持された。腫瘍細胞は、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ処理により週に２回定期的に継代培養された。対数増殖期で増殖する細胞を採取し、腫瘍接種のために計数した。

【0223】

治療モデルでは、各マウスの右前脇腹に、ＲＫＯ腫瘍細胞およびｃｒｙｏＰＢＭＣの混合物（２００μｌＰＢＳ中の５０％のマトリゲルと混合した２．０×１０^６腫瘍細胞および２．０×１０^６ＰＢＭＣ）を接種した。接種後６日後に平均腫瘍体積が約１３７ｍｍ^３に達したとき、動物をランダムに５つの群に分類し、各群に７匹のマウスを含めた。５つのマウスの群にそれぞれ次の腹腔内注射を投与した：ＰＢＳ、アバスチン（３ｍｇ／ｋｇ）、アテゾリズマブ（３ｍｇ／ｋｇ）、アバスチン＋アテゾリズマブ（３ｍｇ／ｋｇ＋３ｍｇ／ｋｇ）、Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０（４．２ｍｇ／ｋｇ）。腹腔内注射の日を０日目とみなした。すべての腫瘍研究について、マウスの体重を量り、ノギスを使用して週に２回、腫瘍の増殖を測定した。研究における動物の取り扱い、世話、および治療に関連するすべての手順は、実験動物管理評価認定協会（ＡＡＡＬＡＣ）のガイダンスに従って、ＳｈａｎｇｈａｉＳＩＰＰＲ－ＢＫＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＣｏ．，Ｌｔｄの施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたガイドラインに従って実行した。

【0224】

腫瘍体積は式（１／２（長さ×幅^２）で計算された。ＴＧＩ（腫瘍増殖抑制率；ｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）は以下の式を使用して各群について計算された：ＴＧＩ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００。Ｔｉは、特定の日の治療群の平均腫瘍体積である。Ｔ０は、治療初日の治療群の平均腫瘍体積である。Ｖｉは、Ｔｉと同日のビヒクル対照群の平均腫瘍体積であり（Vi is the average tumor volume of the vehicle control group on the same day with Ti）、Ｖ０は、治療初日のビヒクルグループ群の平均腫瘍体積である。体重変化の相対変化（ＲＣＢＷ）は、式［（ＢＷｔ－ＢＷ０）／ＢＷ０］×１００で計算した。ＢＷ０は０日目の平均体重、ＢＷｔは測定日の平均体重である。結果は平均値および標準誤差（平均±ＳＥＭ）で表された。１７日目のデータは、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ６．０を使用した通常の二元配置分散分析Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を使用して分析された。そして、ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると見なされた。

【0225】

図１９に示すように、各群の他のすべての動物では明らかな体重減少は観察されず、これは動物が各試験物質（ｔｅｓｔａｒｔｉｃｌｅ）に対して耐容性がよいことを示した。

【0226】

図２０に示すように、１７日目のビヒクル対照群の平均腫瘍体積は２０１７ｍｍ^３であり、これはＲＫＯ異種移植結腸がん腫瘍モデルが十分に確立されていることを示した。各群の１７日目のＴＧＩは、アバスチンで６９．３７％、アテゾリズマブで３３．４２％、アバスチン＋アテゾリズマブの併用で７８．３７％、Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０で８６．５５％であった。ビヒクル対照群と比較して、すべての試験物質は腫瘍増殖の阻害を示した；２つのモノクローナル抗体と比較して、アバスチン＋アテゾリズマブの併用およびＷ３２５３二重特異性抗体は、より強力な抗腫瘍効果を示した（ｐ＜０．００１）。併用と比較して、Ｗ３２５３二重特異性抗体はより強力な抗腫瘍効果を示した（ｐ＜０．０５）。

【0227】

４．３ヒトＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１デュアルノックイントランスジェニックマウスモデルにおけるヒトＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８
ＷＢＰ３２５３のインビボ有効性研究は、Ｃ５７ＢＬ／６－ｈＰＤ１／ｈＰＤＬ１メスマウスのヒトＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１デュアルノックイントランスジェニックマウスモデルにおけるＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１で試験した。生後８～９週のメスのＣ５７ＢＬ／６－ｈＰＤ１／ｈＰＤ－Ｌ１マウス（ＮａｎｊｉｎｇＧａｌａｘｙＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．，ＬＴＤ）を研究に使用した。ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１細胞は、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で、３７℃、空気中５％ＣＯ_２の雰囲気下で単層培養物としてインビトロで維持された。腫瘍細胞は、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ処理により週に２回定期的に継代培養した。対数増殖期で増殖する細胞を採取し、腫瘍接種のために計数した。

【0228】

治療モデルでは、各マウスの右前脇腹にＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞（１００μｌＰＢＳ中１．０×１０^６腫瘍細胞）を皮下接種した。接種後６日後に平均腫瘍体積が約８６ｍｍ^３に達したとき、動物をランダムに６つの群に分け、各群に８匹のマウスを含めた。６つの群のマウスにそれぞれ次の腹腔内注射を投与した：ＰＢＳ、Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０（１３．３ｍｇ／ｋｇ）、Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０（３．９ｍｇ／ｋｇ）、Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０（１．３ｍｇ／ｋｇ）、アテゾリズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、アバスチン（１０ｍｇ／ｋｇ）。腹腔内注射の日を０日目とみなした。すべての腫瘍研究で、マウスの体重を量り、ノギスを使用して週に２回腫瘍の増殖を測定した。研究における動物の取り扱い、世話、および治療に関連するすべての手順は、実験動物管理評価認定協会（ＡＡＡＬＡＣ）のガイダンスに従って、ＳｈａｎｇｈａｉＳＩＰＰＲ－ＢＫＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＣｏ．，Ｌｔｄの施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたガイドラインに従って実行した。腫瘍体積は式（１／２（長さ×幅^２）で計算された。

【0229】

ＴＧＩ（腫瘍増殖抑制率；ｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）は、上記のように計算した。結果は平均値および標準誤差（平均±ＳＥＭ）で表された。３０日目のデータは、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ６．０を使用した通常の二元配置分散分析Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を使用して分析された。そして、ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると見なされた。

【0230】

図２１に示すように、各群の他のすべての動物では明らかな体重減少は観察されず、これは動物が各試験物質に対して耐容性がよいことを示した。

【0231】

図２２に示すように、３０日目のビヒクル対照群の平均腫瘍体積は２０３７ｍｍ^３であり、ヒトＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１デュアルノックイントランスジェニックマウスモデルにおけるＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１が十分に確立されたことを示した。各群の３０日目のＴＧＩは、Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０（１３．３ｍｇ／ｋｇ）で７８．２２％、Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０（３．９ｍｇ／ｋｇ）で７１．０６％、Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０（１．３ｍｇ／ｋｇ）で３０．９５％、アテゾリズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）で７３．７６％、アバスチン（１０ｍｇ／ｋｇ）で５２．９５％であった。ビヒクル対照群と比較して、すべての試験品物質は腫瘍増殖の阻害を示した。Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０二重特異性抗体は、等モル用量レベルでアテゾリズマブと同等の腫瘍阻害を示す；Ｗ３２５３－Ｕ９Ｔ２．Ｇ１７－１．ｕＩｇＧ１Ｖ３２０は用量依存的な腫瘍阻害を示した。

【0232】

当業者はさらに、本開示がその趣旨または中心的属性から逸脱することなく他の特定の形態で具体化され得ることを理解するであろう。本開示の上記の記載は、その例示的な実施形態のみを開示しているという点で、他の変形も本開示の範囲内であると考えられることを理解されたい。したがって、本開示は、本明細書で詳細に記載した特定の実施形態に限定されない。むしろ、本開示の範囲および内容を示すものとして、添付の特許請求の範囲を参照すべきである。

【0233】

参考文献
[1] Apte RS, Chen DS, Ferrara N. VEGF in Signaling and Disease: Beyond Discovery and Development. Cell. 2019 Mar 7;176(6):1248-1264.
[2] Alsaab HO, Sau S, Alzhrani R, et al. PD-1 and PD-L1 Checkpoint Signaling Inhibition for Cancer Immunotherapy: Mechanism, Combinations, and Clinical Outcome. Frontiers in Pharmacology 2017; 8: 561.
[3] Gong, Jun, Chehrazi-Raffle, Alexander et al. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for Immunotherapy of Cancer 2018; 6: 8.
[4] Kudo M. Scientific Rationale for Combined Immunotherapy with PD-1/PD-L1 Antibodies and VEGF Inhibitors in Advanced Hepatocellular Carcinoma. Cancers (Basel). 2020 Apr 27;12(5):1089.
[5] Chen DS, Hurwitz H. Combinations of Bevacizumab With Cancer Immunotherapy. Cancer J. 2018 Jul/Aug;24(4):193-204.

【図1】