▶ センティ バイオサイエンシズ インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-22
(54)【発明の名称】薬物で調節可能な転写リプレッサー
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240314BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240314BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240314BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20240314BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240314BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/09 100
C07K19/00
C07K14/195
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023561277
(86)(22)【出願日】2022-04-06
(85)【翻訳文提出日】2023-11-09
(86)【国際出願番号】 US2022023735
(87)【国際公開番号】W WO2022216874
(87)【国際公開日】2022-10-13
(31)【優先権主張番号】63/171,551
(32)【優先日】2021-04-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519028678
【氏名又は名称】センティ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】ハン ミシェル エリザベス
(72)【発明者】
【氏名】コットマン レベッカ テイラー
(72)【発明者】
【氏名】ゴードリー ラッセル モリソン
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA11
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本明細書では、薬物で調節される転写抑制のためのキメラポリペプチドが提供される。また、目的の遺伝子の抑制を阻害する方法も提供される。本明細書では、（ｉ）転写リプレッサードメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）と、（ｉｉ）前記ＩＴＭに動作可能に連結されている、デグロンと、を含むキメラポリペプチドが提供される。本明細書に記述されるキメラポリペプチドは、小分子薬物に応答して転写抑制を阻害することによって可逆的な遺伝子オンスイッチを提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下：（ａ）転写リプレッサードメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）と、
（ｂ）デグロンと
を含むキメラポリペプチドであって、
前記デグロンが、前記ＩＴＭに動作可能に連結され、かつ
前記転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ抑制ドメイン、ＨＤＡＣ４ドメイン、ＳＣＸ ＨＬＨドメイン、ＩＤ１ ＨＬＨドメイン、ＨＥＲＣ２ Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ＴＷＳＴ１ ＨＬＨドメイン、ＮＫＸ２２ホメオドメイン、ＩＤ３ ＨＬＨドメイン、およびＴＷＳＴ２ ＨＬＨドメインからなる群から選択される、
キメラポリペプチド。
【請求項2】
前記転写リプレッサードメインが、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインを含み、任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、ｍｉｎＫＲＡＢを含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントを含み、かつＷ２７Ｌ、Ｋ２８Ｌ、Ｄ３１Ａ、Ｔ３２Ａ、Ｑ３４Ａ、Ｑ３５Ａ、Ｒ３９Ｅ、Ｌ４３Ｓ、Ｔ５７Ｃ、Ｋ５８Ｃ、Ｐ５９Ｃ、Ｖ６１Ｙ、Ｉ６２Ｙ、Ｉ６２Ａ、Ｌ６３Ｗ、Ｌ６３Ｙ、Ｌ６３Ｅ、Ｒ６４Ｆ、Ｒ６４Ｗ、Ｒ６４Ｅ、Ｌ６５Ｆ、Ｌ６５Ｅ、Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｋ６７Ｆ、Ｇ６８Ｆ、およびＥ６９Ｆからなる群から選択される一つ以上のアミノ酸置換を含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントを含み、かつＱ３４Ａ／Ｑ３５Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｔ５７Ｃ／Ｋ５８Ｃ／Ｐ５９Ｃ、Ｄ３１Ａ／Ｔ３２Ａ、Ｌ６３Ｗ／Ｒ６４Ｗ／Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｌ６３Ｅ／Ｒ６４Ｅ／Ｌ６５Ｅ、Ｒ６４Ｆ／Ｌ６５Ｆ、Ｗ２７Ｌ／Ｋ２８Ｌ ＫＲＡＢ、Ｒ３９Ｅ、Ｋ６７Ｆ／Ｇ６８Ｆ／Ｅ６９Ｆ、およびＶ６１Ｙ／Ｉ６２Ｙ／Ｌ６３Ｙから選択される一つ以上のアミノ酸置換を含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項3】
前記転写リプレッサードメインが、前記ＨＤＡＣ４抑制ドメインを含み、任意選択的に、前記ＨＤＡＣ４抑制ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項4】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、かつジンクフィンガーモチーフのジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）で構成され、
任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含み、
任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、６個のジンクフィンガーモチーフを含み、
任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、配列番号５を含む、
請求項１～３のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項5】
ａ．前記転写リプレッサードメインが、前記ＤＮＡ結合ドメインに対しＮ末端側または前記ＤＮＡ結合ドメインに対しＣ末端側であり、かつ／または、ｂ．前記転写リプレッサードメインおよび前記ＤＮＡ結合ドメインが、第１のペプチドリンカーによって隔てられ、
任意選択的に、前記第１のペプチドリンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＴ（配列番号６０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または、
ｃ．前記ＩＴＭが、合成転写調節因子である、
請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項6】
（ａ）前記デグロンが、ＨＣＶ ＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の二つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（ＳＰ２およびＮＢのタンデムリピート（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２）、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の四つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（ＳＰ１およびＳＰ２のタンデムリピート（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２）、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の三つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３ＡおよびＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１ Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２およびＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾体、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存的デグロン、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰ ＳＢＣドッキングモチーフ、ならびにＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスからなる群から選択され、かつ／または（ｂ）前記デグロンが、免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）に応答してＣＲＢＮに結合する能力を有するセレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメインを含み、
任意選択的に、前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、ＣＲＢＮの薬物誘導性結合の能力を有する、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＣＫｌａ、ＺＦＰ９１、ＧＳＰＴ１、ＭＥＩＳ２、ＧＳＳ Ｅ４Ｆ１、ＺＮ２７６、ＺＮ５１７、ＺＮ５８２、ＺＮ６５３、ＺＮ６５４、ＺＮ６９２、ＺＮ７８７およびＺＮ８２７、またはその断片からなる群から選択され、
任意選択的に、前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、天然ＣＲＢＮポリペプチド配列のキメラ融合産物を含み、
任意選択的に、前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、ＦＮＶＬＭＶＨＫＲＳＨＴＧＥＲＰＬＱＣＥＩＣＧＦＴＣＲＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬ（配列番号６）のアミノ酸配列を有するＩＫＺＦ３／ＺＦＰ９１／ＩＫＺＦ３キメラ融合産物を含み、かつ／または、
（ｃ）前記ＩＭｉＤが、ＦＤＡ承認薬物であり、
任意選択的に、前記ＩＭＩＤが、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドからなる群から選択され、
任意選択的に、前記ＩＴＭが、前記デグロンに対しＮ末端側または前記デグロンに対しＣ末端側であり、
任意選択的に、前記ＩＴＭが、第２のペプチドリンカーによって前記デグロンから隔てられ、
任意選択的に、前記第２のペプチドリンカーが、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７）、ＫＥＧＳ（配列番号８）、ＥＧＫ、ＥＡＡＡＫ（配列番号９）、およびＡＡＰＡＫＱＥ（配列番号１０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または前記第２のペプチドリンカーが、ＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＰＡＡＫＡＥＡＰＡＡＡＰＡＡＫＡ（配列番号１２）およびＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～５のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットであって、任意選択的に、前記プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターを含むか、または前記プロモーターが、誘導性プロモーターを含み、任意選択的に、前記誘導性プロモーターが、最小プロモーターと、ＮＦｋＢ応答要素、ＣＲＥＢ応答要素、ＮＦＡＴ応答要素、ＳＲＦ応答要素１、ＳＲＦ応答要素２、ＡＰ１応答要素、ＴＣＦ－ＬＥＦ応答要素プロモーター融合体、低酸素応答要素、ＳＭＡＤ結合要素、ＳＴＡＴ３結合部位、誘導因子分子応答性プロモーター、およびそのタンデムリピートからなる群から選択される応答要素と、を含み、
任意選択的に、前記プロモーターが合成プロモーターを含み、
任意選択的に、前記キメラポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡ不安定化要素を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらにコードし、
任意選択的に、前記ｍＲＮＡ不安定化要素が、ＡＵリッチ要素およびステムループ不安定化要素からなる群から選択される、
発現カセット。
【請求項8】
請求項７に記載の発現カセットと、目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む発現システムであって、任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターが、プロモーター配列および前記ＩＴＭの前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、一つ以上のジンクフィンガー結合部位を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、配列番号５４のアミノ酸配列を有する一つ以上のジンクフィンガー結合部位を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、四つのより多くのジンクフィンガー結合部位を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターの前記プロモーター配列が、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーター配列を含み、
任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターの前記プロモーター配列が、最小プロモーターを含み、
任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターが合成プロモーターを含み、
任意選択的に、目的の遺伝子が、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、細胞死制御因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子ａ、受容体、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、および酵素からなる群から選択される治療用ポリペプチドをコードし、
任意選択的に、前記発現システムが、（ｉ）請求項７に記載の発現カセットと、（ｉｉ）標的発現カセットと、の両方を含む異種構築物を含み、
任意選択的に、前記発現システムが、請求項７に記載の発現カセットを含む第１の異種構築物と、標的発現カセットを含む第２の異種構築物と、を含む、
発現システム。
【請求項9】
請求項７に記載の発現カセット、または請求項８に記載の発現システムを含む、単離された細胞。
【請求項10】
ａ．前記細胞が、ヒト細胞であり、かつ／または、ｂ．前記細胞が、幹細胞であり、かつ／または、
ｃ．前記細胞が、免疫細胞であり、かつ／または、
ｄ．前記細胞が、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、およびｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、
請求項９に記載の単離された細胞。
【請求項11】
目的の遺伝子の抑制を阻害するための遺伝子スイッチであって、請求項１～６のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドおよびリガンドを含み、
前記リガンドの前記デグロンへの結合が前記キメラポリペプチドの分解を誘導し、それによって、目的の遺伝子の抑制を阻害し、
前記目的の遺伝子が、ＩＴＭ応答性プロモーターに動作可能に連結され、
任意選択的に、前記リガンドが、ユビキチン経路を介したキメラポリペプチドの分解を促進する免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）を含み、
任意選択的に、前記ＩＭｉＤが、ＦＤＡ承認薬物であり、
任意選択的に、前記ＩＭｉＤが、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドからなる群から選択される、
遺伝子スイッチ。
【請求項12】
目的の遺伝子の抑制を阻害する方法であって、ａ．（ｉ）請求項１～６のいずれか一項に記載の前記キメラポリペプチドをコードする発現カセットと、（ｉｉ）目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む、発現システムを含む細胞を提供する工程と、
ｂ．前記形質転換細胞を、前記キメラポリペプチドの分解を促進するリガンドと接触させることによって、前記キメラポリペプチドの分解を誘導する工程と
を含む、方法。
【請求項13】
ａ．前記方法が、前記キメラポリペプチドの発現に適した条件下で前記細胞を培養する工程をさらに含み、かつ／または、ｂ．前記キメラポリペプチドをコードする前記発現カセットが、請求項７に記載の発現カセットを含み、かつ／または、
ｃ．前記発現システムが、請求項８に記載の発現システムを含む、
請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
薬物で調節される転写抑制の能力を有する細胞を産生する方法であって、請求項７に記載の発現カセットまたは請求項８に記載の発現システムを用いて前記細胞を形質転換する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、すべての目的のためにその全体で参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年４月６日に出願された米国仮特許出願第６３／１７１，５５１号の利益を主張する。
本出願は、すべての目的のためにその全体で参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年４月６日に出願された米国仮特許出願第６３／１７１，５５１号の利益を主張する。
【0002】
配列表
本出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出され、その全体が参照により本明細書に援用される配列表が含まれる。２０ＸＸ年、ＸＸ月に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと称され、サイズがＸ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。
本出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出され、その全体が参照により本明細書に援用される配列表が含まれる。２０ＸＸ年、ＸＸ月に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと称され、サイズがＸ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。
【背景技術】
【0003】
背景
現在利用可能な細胞および遺伝子療法製品は、発現制御を欠く可能性があり、これは、こうした療法を受ける対象において毒性などの安全性の懸念につながる可能性がある。したがって、これらの療法を発現制御および調節する追加の方法が必要である。
現在利用可能な細胞および遺伝子療法製品は、発現制御を欠く可能性があり、これは、こうした療法を受ける対象において毒性などの安全性の懸念につながる可能性がある。したがって、これらの療法を発現制御および調節する追加の方法が必要である。
【発明の概要】
【0004】
概要
本明細書では、（ｉ）転写リプレッサードメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）と、（ｉｉ）前記ＩＴＭに動作可能に連結されている、デグロンと、を含むキメラポリペプチドが提供される。前記転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ抑制ドメイン、ＨＤＡＣ４ドメイン、ＳＣＸ ＨＬＨドメイン、ＩＤ１ ＨＬＨドメイン、ＨＥＲＣ２ Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ＴＷＳＴ１ ＨＬＨドメイン、ＮＫＸ２２ホメオドメイン、ＩＤ３ ＨＬＨドメイン、およびＴＷＳＴ２ ＨＬＨドメインからなる群から選択される。
本明細書では、（ｉ）転写リプレッサードメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）と、（ｉｉ）前記ＩＴＭに動作可能に連結されている、デグロンと、を含むキメラポリペプチドが提供される。前記転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ抑制ドメイン、ＨＤＡＣ４ドメイン、ＳＣＸ ＨＬＨドメイン、ＩＤ１ ＨＬＨドメイン、ＨＥＲＣ２ Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ＴＷＳＴ１ ＨＬＨドメイン、ＮＫＸ２２ホメオドメイン、ＩＤ３ ＨＬＨドメイン、およびＴＷＳＴ２ ＨＬＨドメインからなる群から選択される。
【0005】
本明細書に記述されるキメラポリペプチドは、小分子薬物に応答して転写抑制を阻害することによって可逆的な遺伝子オンスイッチを提供する。
【0006】
一部の態様では、キメラポリペプチドの転写リプレッサードメインは、ＫＲＡＢ抑制ドメインを含む。一部の態様では、ＫＲＡＢ抑制ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＫＲＡＢ抑制ドメインは、ｍｉｎＫＲＡＢを含む。一部の態様では、ＫＲＡＢ抑制ドメインは、配列番号２のＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントであり、そしてＷ２７Ｌ、Ｋ２８Ｌ、Ｄ３１Ａ、Ｔ３２Ａ、Ｑ３４Ａ、Ｑ３５Ａ、Ｒ３９Ｅ、Ｌ４３Ｓ、Ｔ５７Ｃ、Ｋ５８Ｃ、Ｐ５９Ｃ、Ｖ６１Ｙ、Ｉ６２Ｙ、Ｉ６２Ａ、Ｌ６３Ｗ、Ｌ６３Ｙ、Ｌ６３Ｅ、Ｒ６４Ｆ、Ｒ６４Ｗ、Ｒ６４Ｅ、Ｌ６５Ｆ、Ｌ６５Ｅ、Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｋ６７Ｆ、Ｇ６８Ｆ、およびＥ６９Ｆｖからなる群から選択される一つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の態様では、ＫＲＡＢ抑制ドメインは、配列番号２のＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントであり、そしてＱ３４Ａ／Ｑ３５Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｔ５７Ｃ／Ｋ５８Ｃ／Ｐ５９Ｃ、Ｄ３１Ａ／Ｔ３２Ａ、Ｌ６３Ｗ／Ｒ６４Ｗ／Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｌ６３Ｅ／Ｒ６４Ｅ／Ｌ６５Ｅ、Ｒ６４Ｆ／Ｌ６５Ｆ、Ｗ２７Ｌ／Ｋ２８Ｌ ＫＲＡＢ、Ｒ３９Ｅ、Ｋ６７Ｆ／Ｇ６８Ｆ／Ｅ６９Ｆ、およびＶ６１Ｙ／Ｉ６２Ｙ／Ｌ６３Ｙから選択される一つ以上のアミノ酸置換を含む。
【0007】
一部の態様では、ＫＲＡＢ抑制ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、転写リプレッサードメインは、ＨＤＡＣ４抑制ドメインを含む。一部の態様では、ＨＤＡＣ４抑制ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【0008】
一部の態様では、キメラポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む。一部の態様では、ＺＦタンパク質ドメインは、モジュラー設計であり、ジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）で構成される。一部の態様では、ＺＦタンパク質ドメインは、１から１０個のＺＦＡを含む。一部の態様では、ＺＦタンパク質ドメインは、１０個のＺＦＡを含む。
【0009】
一部の態様では、転写リプレッサードメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対しＮ末端側である。その他の態様では、転写リプレッサードメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対しＣ末端側である。
【0010】
一部の態様では、転写リプレッサードメインおよびＤＮＡ結合ドメインは、第１のペプチドリンカーによって隔てられている。一部の態様では、第１のペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＴ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含む。
【0011】
一部の態様では、キメラポリペプチドのデグロンは、ＨＣＶ ＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の二つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（ＳＰ２およびＮＢのタンデムリピート（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２）、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の四つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（ＳＰ１およびＳＰ２のタンデムリピート（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２）、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の三つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３ＡおよびＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１ Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２およびＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾体、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存的デグロン、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰ ＳＢＣドッキングモチーフ、ならびにＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスからなる群から選択される。一部の態様では、デグロンは、免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）への応答においてＣＲＢＮに結合する能力を有し、それにより、キメラポリペプチドのユビキチン経路を介した分解を促進することができるセレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメインを含む。一部の態様では、ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインは、ＣＲＢＮの薬物誘導性結合の能力を有する、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＣＫｌａ、ＺＦＰ９１、ＧＳＰＴ１、ＭＥＩＳ２、ＧＳＳ Ｅ４Ｆ１、ＺＮ２７６、ＺＮ５１７、ＺＮ５８２、ＺＮ６５３、ＺＮ６５４、ＺＮ６９２、ＺＮ７８７およびＺＮ８２７、またはその断片からなる群から選択される選択される。一部の態様では、ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインは、天然ＣＲＢＮポリペプチド配列のキメラ融合産物である。一部の態様では、ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインは、ＦＮＶＬＭＶＨＫＲＳＨＴＧＥＲＰＬＱＣＥＩＣＧＦＴＣＲＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬ（配列番号６）のアミノ酸配列を有するＩＫＺＦ３／ＺＦＰ９１／ＩＫＺＦ３キメラ融合産物である。一部の態様では、ＩＭｉＤは、ＦＤＡ承認薬物である。一部の態様では、ＩＭｉＤは、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドからなる群から選択される。
【0012】
一部の態様では、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）は、デグロンに対しＮ末端側である。その他の態様では、ＩＴＭは、デグロンに対しＣ末端側である。
【0013】
一部の態様では、ＩＴＭは、第２のペプチドリンカーによってデグロンから隔てられている。一部の態様では、第２のペプチドリンカーは、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７）、ＫＥＧＳ（配列番号８）、ＥＧＫ、ＥＡＡＡＫ（配列番号９）、およびＡＡＰＡＫＱＥ（配列番号１０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のペプチドリンカーは、ＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＰＡＡＫＡＥＡＰＡＡＡＰＡＡＫＡ（配列番号１２）およびＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0014】
また、本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットも提供される。一部の態様では、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターは、構成的プロモーターを含む。一部の態様では、構成的プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂからなる群から選択される。
【0015】
一部の態様では、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターは、誘導性プロモーターを含む。一部の態様では、誘導性プロモーターは、最小プロモーターと、ＮＦｋＢ応答要素、ＣＲＥＢ応答要素、ＮＦＡＴ応答要素、ＳＲＦ応答要素１、ＳＲＦ応答要素２、ＡＰ１応答要素、ＴＣＦ－ＬＥＦ応答要素プロモーター融合体、低酸素応答性要素、ＳＭＡＤ結合要素、ＳＴＡＴ３結合部位、誘導因子分子応答性プロモーター、およびそのタンデムリピート、ＮＦｋＢ応答要素、ＣＲＥＢ応答要素、ＮＦＡＴ応答要素、ＳＲＦ応答要素１、ＳＲＦ応答要素２、ＡＰ１応答要素、ＴＣＦ－ＬＥＦ応答要素プロモーター融合体、低酸素応答性要素、ＳＭＡＤ結合要素、ＳＴＡＴ３結合部位、誘導因子分子応答性プロモーター、およびそのタンデムリピートからなる群から選択される応答要素と、を含む。
【0016】
一部の態様では、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターは、合成プロモーターである。
【0017】
一部の態様では、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ－不安定化要素を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらにコードする。一部の態様では、ｍＲＮＡ不安定化要素は、ＡＵリッチ要素およびステムループ不安定化要素からなる群から選択される。
【0018】
また、（ｉ）本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットと、（ｉｉ）目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む、発現システムが提供される。一部の態様では、ＩＴＭ応答性プロモーターは、プロモーター配列およびＩＴＭのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列を含む。一部の態様では、ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列は、一つ以上のジンクフィンガー結合部位を含む。一部の態様では、ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列は、より多くのジンクフィンガー結合部位の四つを含む。一部の態様では、ＩＴＭ応答性プロモーターのプロモーター配列は、構成的プロモーター配列を含む。一部の態様では、構成的プロモーター配列は、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂからなる群から選択される。一部の態様では、ＩＴＭ応答性プロモーターのプロモーター配列は、最小プロモーターを含む。一部の実施形態では、ＩＴＭ応答性プロモーターは、合成プロモーターを含む。
【0019】
一部の実施形態では、目的の遺伝子は、治療用ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、細胞死制御因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子ａ、受容体、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、および酵素からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。
【0020】
一部の実施形態では、発現システムは、（ｉ）本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットと、（ｉｉ）標的発現カセットとの両方を含む異種構築物を含む。
【0021】
一部の実施形態では、発現システムは、（ｉ）本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む第１の異種構築物と、（ｉｉ）標的発現カセットを含む第２の異種構築物とを含む。
【0022】
また、（ｉ）本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット、または（ｉｉ）本明細書に記述されるような発現システムを含む単離された細胞も提供される。一部の実施形態では、単離された細胞はヒト細胞である。一部の態様では、単離された細胞は、幹細胞である。一部の態様では、単離された細胞は、免疫細胞である。一部の態様では、細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、およびｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される。
【0023】
また、本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドおよびリガンドを含み、リガンドのデグロンへの結合がキメラポリペプチドの分解を誘導し、それによって目的の遺伝子の抑制を阻害する、目的の遺伝子の抑制を阻害するための遺伝子スイッチも提供される。一部の態様では、遺伝子スイッチのリガンドは、ユビキチン経路を介したキメラポリペプチドの分解を促進する免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）を含む。一部の態様では、ＩＭｉＤは、ＦＤＡ承認薬物である。一部の態様では、ＩＭｉＤは、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドからなる群から選択される。
【0024】
また、（ａ）（ｉ）本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードする発現カセットと、（ｉｉ）目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む発現システムを用いて細胞を形質転換することと、（ｂ）キメラポリペプチドの発現に適した条件下で形質転換細胞を培養することと、（ｃ）形質転換細胞を、キメラポリペプチドの分解を促進するリガンドと接触させることによって、キメラポリペプチドの分解を誘導することと、を含む、目的の遺伝子の抑制を阻害する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【0025】
本開示のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明および添付の図面に関してより良好に理解されるであろう。
【0026】
【図1】ポマリドミドを用いた処理後の様々なデグロン連結型ＤＮＡ結合剤の分解効率を示す。左の列は「薬物なし」を表し、右の列は「＋１ｕＭ Ｐｏｍ」を表す。
【図2】様々なデグロン連結型転写リプレッサーの分解後のレポーター発現の誘導を示す。左の列は「薬物なし」を表し、右の列は「＋１ｕＭ Ｐｏｍ」を表す。
【図3】様々なデグロン連結型転写リプレッサーを発現する細胞における、ポマリドミドを用いた処置後と比較した、ポマリドミドの非存在下でのレポーター発現の差を示す。
【図4A】ポマリドミドの存在下または非存在下で二つのデグロン連結型転写リプレッサー構築物（それぞれＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９）で形質導入された細胞について、非形質導入細胞（レポーターを欠く）およびリプレッサーで形質導入されていないレポーター細胞と比較した、レポーター発現のヒストグラムプロットを示す。
【図4B】ポマリドミドの存在下または非存在下で二つのデグロン連結型転写リプレッサー構築物（それぞれＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９）で形質導入された細胞について、非形質導入細胞（レポーターを欠く）およびリプレッサーで形質導入されていないレポーター細胞と比較した、レポーター発現のヒストグラムプロットを示す。
【図5】ポマリドミドを用いた処理後、各々がｍＲＮＡ不安定化タグを含む二つのデグロン連結型ＤＮＡ結合剤の分解効率を示す。左の列は「薬物なし」を表し、右の列は「１ｕＭ ポマリドミド」を表す。
【図6A】Ｎ末端にデグロンを有する様々なデグロン連結型転写リプレッサーを発現する細胞における、ポマリドミドの存在下または非存在下でのレポーター発現を示す。レポーターのみを発現するが、デグロン連結型転写リプレッサーを発現しない細胞と比較した、レポーターおよびデグロン連結型転写リプレッサーを発現する細胞におけるレポーター発現のための幾何学的平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）の倍率変化が示される。左の列は「薬物なし」を表し、右の列は「１ｕＭ Ｐｏｍ」を表す。
【図6B】Ｎ末端にデグロンを有する様々なデグロン連結型転写リプレッサーを発現する細胞における、ポマリドミドの存在下または非存在下でのレポーター発現を示す。図６Ａのデグロン連結型転写リプレッサーの各々を発現する細胞について、ポマリドミドの存在下での発現をポマリドミドの非存在下での発現と比較する、レポーター発現の倍率変化が示される。
【図7A】Ｃ末端にデグロンを有する様々なデグロン連結型転写リプレッサーを発現する細胞における、ポマリドミドの存在下または非存在下でのレポーター発現を示す。レポーターのみを発現するが、デグロン連結型転写リプレッサーを発現しない細胞と比較した、レポーターおよびデグロン連結型転写リプレッサーを発現する細胞におけるレポーター発現のための幾何学的平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）の倍率変化が示される。左の列は「薬物なし」を表し、右の列は「１ｕＭ Ｐｏｍ」を表す。
【図7B】Ｃ末端にデグロンを有する様々なデグロン連結型転写リプレッサーを発現する細胞における、ポマリドミドの存在下または非存在下でのレポーター発現を示す。図７Ａのデグロン連結型転写リプレッサーの各々を発現する細胞について、ポマリドミドの存在下での発現をポマリドミドの非存在下での発現と比較する、レポーター発現の倍率変化が示される。
【図8】デグロン連結型リプレッサーを含むシステムにおけるＩＬ－１２の発現を制御するＩＭｉＤ調節オンスイッチを示す。上のパネルは、薬物を含まない条件、またはポマリドミドの滴定（１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、および１ｕＭ）を用いた条件における三つの示されたデグロン連結型リプレッサーによって調節されるＩＬ－１２発現レベルを示す。下のパネルは、構成的ＩＬ－１２レポーターを用いて形質導入された細胞で定量されたＩＬ１２発現レベルの画分として表示されるＩＬ－１２レベルを示す。
【図9】１ｕＭのポマリドミドおよび１ｕＭのイベルドミドでのＩＭｉＤオンスイッチのオンからオフの動態を示す。１ｕＭのポマリドミド（上のパネル）または１ｕＭのイベルドミド（下のパネル）処理からの、示された経過時間で細胞から収集された上清中のＩＬ－１２発現レベルが示される。ＳＢ０４６４０のみ（右列）は、ＩＬ－１２発現が構成的であり、かつデグロン連結型リプレッサーによって調節されないレポーターのみの対照として機能する（左列）。
【図10】１ｕＭのポマリドミドでのＩＭｉＤオンスイッチのオンからオフへの動態を示し、１２時間および１６時間において追加の時点を有する。上清中のＩＬ－１２発現レベルは、１ｕＭのポマリドミド処理からの、示された経過時間において細胞から収集される。対照ＳＢ０４６４０のみであるレポーターを用いて形質導入された細胞におけるＩＬ－１２発現レベルに対して正規化されたＩＬ－１２の発現レベルが示され、ＩＬ－１２発現は構成的であり、かつデグロン連結型リプレッサーによって調節されない。
【発明を実施するための形態】
【0027】
詳細な説明
特許請求の範囲及び明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、以下に記載されるように定義される。
特許請求の範囲及び明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、以下に記載されるように定義される。
【0028】
「インビボ」という用語は、生体内で生じるプロセスを指す。
【0029】
本明細書で使用される場合、「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒトの両方を含み、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、及びブタを含むがこれらに限定されない。
【0030】
二つ以上の核酸またはポリペプチドの配列の文脈では「同一性」パーセントという用語は、最大の一致について比較および整列するときに、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ、または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの一つを使用して、または目視検査により測定される、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の割合を有する二つ以上の配列または部分配列を指す。アプリケーションに応じて、「同一性」パーセントは、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在することができ、または代替的に、比較される二つの配列の全長にわたって存在することができる。
【0031】
配列比較については、典型的に、一つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムのプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【0032】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似法の検索によって、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のコンピューター化された実装によって、または視覚的検査（一般的にＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，以下に記載、を参照のこと）によって、実施することができる。
【0033】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記述されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公開されている。
【0034】
「十分な量」という用語は、所望の効果を生み出すのに十分な量、例えば、細胞内の転写抑制を阻害するのに十分な量を意味する。
【0035】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【0036】
分解性転写リプレッサーキメラポリペプチド
本開示は、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）およびデグロンを含むキメラポリペプチドを提供する。一般に、デグロンは、ＩＴＭに動作可能に連結されて、キメラポリペプチドのデグロンベースの分解を可能にして、ＩＴＭの活性を調節する。
本開示は、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）およびデグロンを含むキメラポリペプチドを提供する。一般に、デグロンは、ＩＴＭに動作可能に連結されて、キメラポリペプチドのデグロンベースの分解を可能にして、ＩＴＭの活性を調節する。
【0037】
誘導性転写調節因子
本明細書に記述されるキメラポリペプチドは、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）を含む。ＩＴＭは、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写リプレッサードメインを含む。
本明細書に記述されるキメラポリペプチドは、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）を含む。ＩＴＭは、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写リプレッサードメインを含む。
【0038】
一部の実施形態では、転写リプレッサードメインとしては、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン、ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）ドメイン、スクレラキシス（ＳＣＸ）ＨＬＨドメイン、ＤＮＡ結合阻害剤１（ＩＤ１）ＨＬＨドメイン、ＨＥＣＴドメインおよびＲＣＣ１－ｌ様ドメイン含有タンパク質２（ＨＥＲＣ２）Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＳＴ１）ＨＬＨドメイン、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．２（ＮＫＸ２２）ホメオドメイン、ＤＮＡ結合阻害剤１（ＩＤ３）ＨＬＨドメイン、またはツイスト関連タンパク質２（ＴＷＳＴ２）ＨＬＨドメインを挙げることができるが、これらに限定されない。
【0039】
一部の実施形態では、転写リプレッサードメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「ＫＲＡＢ抑制ドメイン」は、ＤＮＡ結合ドメインに動作可能に連結されたときに転写を抑制する能力を有するＫＲＡＢドメインの野生型、バリアント、またはセグメントを指す。Ｃ２Ｈ２／クルッペル型ジンクフィンガー（ＺＮＦ）タンパク質は、ＫＲＡＢドメインおよびＤＮＡに結合するジンクフィンガーのＣ末端アレイを含む転写因子である。ＫＲＡＢドメインは、ＫＲＡＢ－Ｂ、ＫＲＡＢ－ＢＬ、ＫＲＡＢ－ｂ、またはＫＲＡＢ－Ｃなどの補助サブドメインを有する、または有しない、規範的なサブドメインＡ（ＫＲＡＢ－Ａ）で作製される。一部の実施形態では、ＫＲＡＢリプレッサードメインは、ジンクフィンガータンパク質ＺＮＦ１０のＫＲＡＢドメインを含む。例示的なＺＮＦ１０配列は、配列番号１として提供される。ＺＮＦ１０のＫＲＡＢドメインは、ＺＮＦ１０の残基２～８１を含み、配列番号２として提供される。一部の実施形態では、ＫＲＡＢリプレッサードメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【0040】
一部の実施形態では、ＫＲＡＢリプレッサードメインは、ｍｉｎＫＲＡＢを含む。「ＭｉｎＫＲＡＢ」は、ＫＲＡＢ抑制ドメインの４５アミノ酸セグメントが、ＫＲＡＢ抑制ドメイン内に存在する最小抑制ドメインとして特定されていることを指す。例示的なｍｉｎＫＲＡＢリプレッサードメインは、配列番号３として提供される。
【0041】
一部の実施形態では、ＫＲＡＢリプレッサードメインは、ＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントを含む。本明細書で使用される場合、「ＫＲＡＢリプレッサードメインバリアント」は、リプレッサー活性を保持するが、一つ以上のアミノ酸置換を有するＫＲＡＢドメイン（例えば、配列番号２または配列番号３）を指す。一部の実施形態では、ＫＲＡＢリプレッサードメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、そしてＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントであり、そしてＷ２７Ｌ、Ｋ２８Ｌ、Ｄ３１Ａ、Ｔ３２Ａ、Ｑ３４Ａ、Ｑ３５Ａ、Ｒ３９Ｅ、Ｌ４３Ｓ、Ｔ５７Ｃ、Ｋ５８Ｃ、Ｐ５９Ｃ、Ｖ６１Ｙ、Ｉ６２Ｙ、Ｉ６２Ａ，Ｌ６３Ｗ、Ｌ６３Ｙ、Ｌ６３Ｅ、Ｒ６４Ｆ、Ｒ６４Ｗ、Ｒ６４Ｅ、Ｌ６５Ｆ、Ｌ６５Ｅ、Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｋ６７Ｆ、Ｇ６８Ｆ、およびＥ６９Ｆから選択される一つ以上のアミノ酸置換が挙げられる。
【0042】
一部の実施形態では、ＫＲＡＢ抑制ドメインとしては、配列番号２のＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントが挙げられ、Ｑ３４Ａ／Ｑ３５Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｔ５７Ｃ／Ｋ５８Ｃ／Ｐ５９Ｃ、Ｄ３１Ａ／Ｔ３２Ａ、Ｌ６３Ｗ／Ｒ６４Ｗ／Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｌ６３Ｅ／Ｒ６４Ｅ／Ｌ６５Ｅ、Ｒ６４Ｆ／Ｌ６５Ｆ、Ｗ２７Ｌ／Ｋ２８Ｌ ＫＲＡＢ、Ｒ３９Ｅ、Ｋ６７Ｆ／Ｇ６８Ｆ／Ｅ６９Ｆ、およびＶ６１Ｙ／Ｉ６２Ｙ／Ｌ６３Ｙから選択される一つ以上のアミノ酸置換を含む。
【0043】
一部の実施形態では、転写リプレッサードメインは、ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）ドメインを含む。例示的なＨＤＡＣ４ドメインは、配列番号４として提供される。
【0044】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む。ＺＦタンパク質ドメインの含有は、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）による標的核酸結合を可能にする。
【0045】
一部の実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、モジュラー設計であり、ジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）で構成される。
【0046】
ジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）は、一緒に連結された複数のジンクフィンガータンパク質モチーフを含み、任意選択的に可撓性リンカー配列によって隔てられている。各ジンクフィンガーモチーフは、異なる核酸モチーフに結合する。これは、任意の所望の核酸配列に特異性を有するＺＦＡをもたらす。ＺＦモチーフは、互いに直接的に隣接することができ、または可撓性リンカー配列によって隔てることができる。一部の実施形態では、ＺＦＡは、タンデムに配置されたＺＦモチーフの配列、ストリング、または鎖を含む。ＺＦＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のジンクフィンガーモチーフを有することができる。ＺＦＡは、１～１０、１～１５、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、３～４、３～５ ３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、４～１０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、または５～１５個のジンクフィンガーモチーフを有することができる。
【0047】
ＺＦタンパク質ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれ以上のＺＦＡを有することができる。ＺＦドメインは、１～１０、１～１５、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、３～４、３～５ ３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、４～１０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１５、１０～１５、１０～２０、または１０～２５個のＺＦＡを有することができる。一部の実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、１から１０個のＺＦＡを含む。一部の実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも１個のＺＦＡを含む。一部の実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも２個のＺＦＡを含む。一部の実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも３個のＺＦＡを含む。一部の実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも４個のＺＦＡを含む。一部の実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも５個のＺＦＡを含む。一部の実施形態では、ＺＦタンパク質ドメインは、少なくとも１０個のＺＦＡを含む。
【0048】
一部の実施形態では、ＺＦＡは、６個のジンクフィンガーモチーフを含む。６個のジンクフィンガーモチーフを含むＺＦＡから構成される例示的なＺＦタンパク質ドメインは、配列：
ＳＲＰＧＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＲＨＧＬＤＲＨＴＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＨＳＳＬＫＲＨＬＲＴＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＶＲＨＮＬＴＲＨＬＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＨＳＮＬＳＲＨＬＫＴＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＲＳＳＬＶＲＨＬＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＥＳＧＨＬＫＲＨＬＲＴＨＬＲＧＳ（配列番号５）
で示される。
ＳＲＰＧＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＲＨＧＬＤＲＨＴＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＨＳＳＬＫＲＨＬＲＴＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＶＲＨＮＬＴＲＨＬＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＨＳＮＬＳＲＨＬＫＴＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＲＳＳＬＶＲＨＬＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＥＳＧＨＬＫＲＨＬＲＴＨＬＲＧＳ（配列番号５）
で示される。
【0049】
デグロン
一部の実施形態では、本明細書に記述されるキメラポリペプチドは、デグロンを含む。一部の実施形態では、デグロンは、ＩＴＭの分解を誘導する能力を有する。一部の実施形態では、デグロンとしては、ＨＣＶ ＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の二つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（ＳＰ２およびＮＢのタンデムリピート（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２）、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の四つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（ＳＰ１およびＳＰ２のタンデムリピート（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２）、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の三つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３ＡおよびＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１ Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２およびＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾体、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存的デグロン、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰ ＳＢＣドッキングモチーフ、またはＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスを挙げることができるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に記述されるキメラポリペプチドは、デグロンを含む。一部の実施形態では、デグロンは、ＩＴＭの分解を誘導する能力を有する。一部の実施形態では、デグロンとしては、ＨＣＶ ＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の二つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（ＳＰ２およびＮＢのタンデムリピート（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２）、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の四つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（ＳＰ１およびＳＰ２のタンデムリピート（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２）、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の三つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３ＡおよびＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１ Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２およびＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾体、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存的デグロン、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰ ＳＢＣドッキングモチーフ、またはＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスを挙げることができるが、これらに限定されない。
【0050】
一部の実施形態では、デグロンは、免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）への応答においてＣＲＢＮに結合する能力を有し、それにより、ＩＴＭのユビキチン経路を介した分解を促進することができるセレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインとしては、ＣＲＢＮの薬物誘導性結合の能力を有するＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＣＫｌａ、ＺＦＰ９１、ＧＳＰＴ１、ＭＥＩＳ２、ＧＳＳ Ｅ４Ｆ１、ＺＮ２７６、ＺＮ５１７、ＺＮ５８２、ＺＮ６５３、ＺＮ６５４、ＺＮ６９２、ＺＮ７８７またはＺＮ８２７、またはその断片を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインは、天然ＣＲＢＮポリペプチド配列のキメラ融合産物を含む。一部の実施形態では、ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインは、アミノ酸配列：
ＦＮＶＬＭＶＨＫＲＳＨＴＧＥＲＰＬＱＣＥＩＣＧＦＴＣＲＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬ（配列番号６）
を有するＩＫＺＦ３／ＺＦＰ９１／ＩＫＺＦ３キメラ融合産物を含む。デグロンは、国際出願公開第２０１９／０８９５９２Ａｌ号においてより詳細に記述され、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
ＦＮＶＬＭＶＨＫＲＳＨＴＧＥＲＰＬＱＣＥＩＣＧＦＴＣＲＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬ（配列番号６）
を有するＩＫＺＦ３／ＺＦＰ９１／ＩＫＺＦ３キメラ融合産物を含む。デグロンは、国際出願公開第２０１９／０８９５９２Ａｌ号においてより詳細に記述され、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0051】
ペプチドリンカー
一部の実施形態では、キメラポリペプチドは、少なくとも一つのペプチドリンカーを含む。
一部の実施形態では、キメラポリペプチドは、少なくとも一つのペプチドリンカーを含む。
【0052】
ペプチドリンカーは、ポリペプチドドメインの機能を妨げることなく、二つのポリペプチドドメイン（例えば、誘導性転写調節因子およびデグロン）を隔てる任意のポリペプチド配列とすることができる。ペプチドリンカーの例としては、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７）、ＫＥＧＳ（配列番号８）、ＥＧＫ、ＥＡＡＡＫ（配列番号９）、ＡＡＰＡＫＱＥ（配列番号１０）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＧＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１１、本明細書では「連結されたＭａｘ Ｊｅｎリンカー」または「ＣｏｎＭＪ」と称される）、ＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＰＡＡＫＡＥＡＰＡＡＡＰＡＡＫＡ（配列番号１２、本明細書では「ｅｃｐｄ」と称される）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１３）、およびＧＧＧＧＳＧＧＴ配列番号６０）が挙げられる。
【0053】
一部の実施形態では、転写リプレッサードメインおよびＤＮＡ結合ドメインは、ペプチドリンカーによって隔てられている。
【0054】
一部の実施形態では、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）およびデグロンは、ペプチドリンカーによって隔てられている。一部の実施形態では、ＩＴＭとデグロンとの間のペプチドリンカーは、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７）、ＫＥＧＳ（配列番号８）、ＥＧＫ、ＥＡＡＡＫ（配列番号９）、ＡＡＰＡＫＱＥ（配列番号１０）、およびＧＧＧＧＳＧＧＴ（配列番号６０）から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＴＭとデグロンとの間のペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＴ（配列番号６０）を含む。
【0055】
一部の実施形態では、ＩＴＭとデグロンとの間のペプチドリンカーとしては、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＧＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１１、本明細書では「連結されたＭａｘ Ｊｅｎリンカー」または「ＣｏｎＭＪ」と称される）、ＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＰＡＡＫＡＥＡＰＡＡＡＰＡＡＫＡ（配列番号１２、本明細書では「ｅｃｐｄ」と称される）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１３）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７）、ＫＥＧＳ（配列番号８）、およびＥＧＫから選択されるアミノ酸配列が挙げられる。
【0056】
一部の実施形態では、ＩＴＭとデグロンとの間のペプチドリンカーとしては、ＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＰＡＡＫＡＥＡＰＡＡＡＰＡＡＫＡ（配列番号１２、本明細書では「ｅｃｐｄ」と称される）およびＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列が挙げられる。
【0057】
一部の実施形態では、転写リプレッサードメイン、ＤＮＡ結合ドメインは、ペプチドリンカーによって隔てられ、またデグロンは、各々ペプチドリンカーによって隔てられる。一部の実施形態では、転写リプレッサードメイン、ＤＮＡ結合ドメインは、ペプチドリンカーによって隔てられ、またデグロンは、各々別個のペプチドリンカーによって隔てられる。
【0058】
遺伝子スイッチ
また、本明細書では、目的の遺伝子の抑制を阻害するための遺伝子スイッチも提供される。遺伝子スイッチは、（ａ）目的の遺伝子の転写を抑制する能力を有するデグロンおよび誘導性転写調節因子を含むキメラポリペプチド、および（ｂ）キメラポリペプチドのデグロンに結合し、かつキメラポリペプチドの分解を誘導するリガンドを含んでもよい。キメラポリペプチドの分解は、誘導性転写調節因子のリプレッサー活性を放出する。
また、本明細書では、目的の遺伝子の抑制を阻害するための遺伝子スイッチも提供される。遺伝子スイッチは、（ａ）目的の遺伝子の転写を抑制する能力を有するデグロンおよび誘導性転写調節因子を含むキメラポリペプチド、および（ｂ）キメラポリペプチドのデグロンに結合し、かつキメラポリペプチドの分解を誘導するリガンドを含んでもよい。キメラポリペプチドの分解は、誘導性転写調節因子のリプレッサー活性を放出する。
【0059】
一部の実施形態では、リガンドは、ユビキチン経路を介したキメラポリペプチドの分解を促進する免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）を含む。
【0060】
一部の実施形態では、ＩＭｉＤは、ＦＤＡ承認薬物である。
【0061】
一部の実施形態では、ＩＭｉＤとしては、サリドマイド、レナリドミド、またはポマリドミドを挙げることができるが、これらに限定されない。
【0062】
単離ポリヌクレオチド分子および発現カセット
ポリヌクレオチド分子（例えば、単離ポリヌクレオチド分子）および本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードする発現カセットも本明細書に提供される。一部の実施形態では、本開示は、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを提供する。
ポリヌクレオチド分子（例えば、単離ポリヌクレオチド分子）および本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードする発現カセットも本明細書に提供される。一部の実施形態では、本開示は、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを提供する。
【0063】
「単離」核酸分子またはポリヌクレオチドは、その天然環境から取り出されたＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチド分子を指す。例えば、異種構築物中に含有されるキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、単離されていると考えられる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中で維持される組み換えポリヌクレオチド、または溶液中の（部分的もしくは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離ポリヌクレオチドはまた、通常、ポリヌクレオチド分子を含有する細胞中に含有されるポリヌクレオチド分子も含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【0064】
単離ポリヌクレオチド分子としては、ｃＤＮＡポリヌクレオチド、ＲＮＡポリヌクレオチド、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡなど）、ｍＲＮＡポリヌクレオチド、環状プラスミド、直鎖状ＤＮＡ断片、ベクター、ミニサークル、ｓｓＤＮＡ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ならびにオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【0065】
一部の実施形態では、単離ポリヌクレオチド分子としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびネイキッドプラスミド（直鎖状または環状）挙げることができるが、これらに限定されない。
【0066】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００個のヌクレオチド当たり最大５個の点変異を含んでもよいことを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを取得するために、参照配列中のヌクレオチドの最大５％が、欠失される場合がある、もしくは別のヌクレオチドで置換される場合がある、または参照配列中の総ヌクレオチドの最大５％のヌクレオチドの数が、参照配列へと挿入されてもよい。参照配列のこれらの改変は、参照配列中残基の間で個々に、または参照配列内の一つ以上の連続基中のいずれかで点在して、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置において、またはそれらの末端位置の間のいずれかの場所で生じる場合がある。実用的な問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、知られているのコンピュータプログラムを使用して従来の方法で決定することができる。
【0067】
「発現カセット」という用語は、標的細胞における特定のポリヌクレオチドの転写を許容する一連の核酸要素を有する、組み換えによって、または合成的に生成されたポリヌクレオチドを指す。発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、または核酸断片の中へと組込むことができる。典型的に、発現ベクターの発現カセット部分は、数ある配列の中でもとりわけ、転写される核酸配列およびプロモーターを含む。
【0068】
一部の実施形態では、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたｍＲＮＡ不安定化要素を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらにコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ不安定化要素は、ＡＵリッチ要素および／またはステムループ不安定化要素（ＳＬＤＥ）を含む。
【0069】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ不安定化要素は、ＡＵリッチ要素を含む。一部の実施形態では、ＡＵリッチ要素は、配列ＡＴＴＴＡ（配列番号１４）の少なくとも二つの重複モチーフを含む。一部の実施形態では、ＡＵリッチ要素は、ＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡ（配列番号１５）を含む。
【0070】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ不安定化要素は、ステムループ不安定化要素（ＳＬＤＥ）を含む。一部の実施形態では、ＳＬＤＥは、ＣＴＧＴＴＴＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＣＡＧ（配列番号１６）を含む。
【0071】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ不安定化要素は、少なくとも一つのＡＵリッチ要素および少なくとも一つのＳＬＤＥを含む。本明細書で使用される場合、「ＡｕＳＬＩＤＥ」は、ステムループ不安定化要素（ＳＬＤＥ）に動作可能に連結されたＡＵリッチ要素を指す。例示的なＡｕＳＬＩＤＥ配列は、配列番号１７として提供される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ不安定化要素は、２Ｘ ＡｕＳＬＩＤＥを含む。例示的なＡｕＳＬＤＥ配列は、配列番号１８として提供される。
【0072】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを提供する。一部の実施形態では、本開示は、前述のようなキメラポリペプチドをコードする第１の発現カセット、および目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットを含む発現システムを提供する。
【0073】
「標的発現カセット」は、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）制御可能な発現を有する遺伝子を含む発現カセットを指す。発現は、リガンド（例えば、ポマリドミド）の存在に基づいてＩＴＭによって制御される。
【0074】
本明細書に記述されるような単離ポリヌクレオチド分子および異種構築物は、操作されたポリヌクレオチド分子である。「操作されたポリヌクレオチド」は、天然には生じないポリヌクレオチドである。しかし当然のことながら、操作されたポリヌクレオチドは、全体として天然には生じない一方で、それは、天然に生じるヌクレオチド配列を含む場合があることが理解されるべきある。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、異なる生命体からの（例えば、異なる種からの）ヌクレオチド配列を含む。例えば、一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、マウスヌクレオチド配列、細菌ヌクレオチド配列、ヒトヌクレオチド配列、および／またはウイルスヌクレオチド配列を含む。「操作されたポリヌクレオチド」という用語は、組み換え核酸及び合成核酸を含む。「組換えポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド分子を結合することによって構築され、一部の実施形態では、生細胞中で複製することができる分子を指す。「合成ポリヌクレオチド」は、増幅された、または化学的に、もしくは他の手段によって合成された分子を指す。合成ポリヌクレオチドは、化学的に修飾された、または別の方法で修飾されるが、天然に生じたヌクレオチド分子と塩基対合することができるものを含む。修飾としては、一つ以上の修飾されたヌクレオチド間連結および非天然核酸が挙げられるが、これらに限定されない。修飾は、米国特許第６，６７３，６１１号および米国特許出願公開２００４／００１９００１号にさらに詳細に記述され、それらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。修飾されたヌクレオチド間連結は、ホスホロジチオエートまたはホスホロチオエート連結とすることができる。非天然核酸は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯまたは「モルホリノ」）、およびトレオース核酸（ＴＮＡ）とすることができる。非天然核酸は、国際出願国際公開第１９９８／０３９３５２号、米国出願公開第２０１３／０１５６８４９号、および米国特許第６，６７０，４６１号；同第５，５３９，０８２号；同第５，１８５，４４４号にさらに詳細に記述され、各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。組み換えポリヌクレオチドおよび合成ポリヌクレオチドはまた、前述のうちのいずれかの複製からもたらされる分子も含む。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、単一の分子（例えば、同じプラスミドまたは他のベクターに含まれる）によって、または複数の異なる分子（例えば、複数の異なる独立して複製する分子）によってコードされてもよい。
【0075】
本開示の操作されたポリヌクレオチドは、標準的な分子生物学方法を使用して産生されてもよい（例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２０１２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。一部の実施形態では、操作された核酸構築物は、ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）クローニング（例えば、Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３４３－３４５，２００９；およびＧｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９０１－９０３，２０１０を参照のこと。その各々は、参照により本明細書に組み込まれる）を使用して産生される。ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）は、典型的に、単一チューブ反応において三つの酵素活性：５’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼのY伸長活性、およびＤＮＡリガーゼ活性を使用する。５’エキソヌクレアーゼ活性は、５’末端配列を噛み返し、アニーリングのために相補配列を曝露する。次いでポリメラーゼ活性は、アニーリングされた領域上のギャップを埋める。次いでＤＮＡリガーゼは、ニックを密閉し、ＤＮＡ断片を一緒に共有結合的に連結させる。隣接する断片の重複する配列は、ゴールデンゲートアセンブリにおいて使用されるものよりずっと長く、したがって、正しい組み立てのより高い割合がもたらされる。一部の実施形態では、操作された核酸構築物は、ＩＮ－ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）クローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して産生される。
【0076】
プロモーター
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される、核酸配列の制御領域を指す。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子など、調節タンパク質および分子が結合し得るサブ領域を含有する場合がある。プロモーターは、構成的、誘導的、抑制的、組織特異的、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、または転写を駆動する。本明細書では、プロモーターは、それが調節する核酸配列に関係して、正しい機能的位置および配向にある場合、その配列の転写開始および／または発現を制御する（駆動する）ために、「動作可能に連結されている」と考えられる。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される、核酸配列の制御領域を指す。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子など、調節タンパク質および分子が結合し得るサブ領域を含有する場合がある。プロモーターは、構成的、誘導的、抑制的、組織特異的、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、または転写を駆動する。本明細書では、プロモーターは、それが調節する核酸配列に関係して、正しい機能的位置および配向にある場合、その配列の転写開始および／または発現を制御する（駆動する）ために、「動作可能に連結されている」と考えられる。
【0077】
プロモーターは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られる場合があるような、遺伝子または配列と天然に関連付けられるプロモーターであってもよい。こうしたプロモーターは、「内因性」と呼ぶことができる。一部の実施形態では、コード核酸配列は、組み換えまたは異種プロモーターの制御下で位置付けられる場合があるが、それは、その天然の環境においてコードされた配列と通常は関連付けられないプロモーターを指す。こうしたプロモーターは、他の遺伝子のプロモーター；任意の他の細胞から単離されたプロモーター；ならびに「天然に生じた」ものではない合成プロモーターまたはエンハンサー、例えば、当技術分野において公知である遺伝子操作の方法を通じて発現を改変する異なる転写調節領域の異なる要素および／または変異を含むものなどを含んでもよい。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、配列は、組み換えクローニングおよび／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む核酸増幅技術を使用して産生されてもよい（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第５，９２８，９０６号を参照のこと）。
【0078】
本明細書で使用される場合、「誘導性プロモーター」は、シグナルの存在下にあるか、シグナルによる影響を受けたか、またはシグナルによって接触されたときに、転写活性を調節すること（例えば、開始または活性化すること）によって特徴付けられるプロモーターを指す。このシグナルは、誘導性プロモーターからの転写活性を調節する際に活性であるような方法において、誘導性プロモーターと接触する内因性または通常は外因性の状態（例えば、光）、化合物（例えば、化学的または非化学的化合物）、またはタンパク質（例えば、サイトカイン）であってもよい。転写の活性化は、プロモーターに直接的に作用して転写を駆動すること、またはプロモーターが転写を駆動することを防止しているリプレッサーの不活性化によりプロモーターに間接的に作用することを含んでもよい。反対に、転写の不活性化は、転写を防止するためにプロモーターに直接的に作用すること、または、その後プロモーターに作用するリプレッサーを活性化することによってプロモーターに間接的に作用することを含んでもよい。
【0079】
本明細書で使用される場合、プロモーターは、局所腫瘍状態（例えば、炎症もしくは低酸素）またはシグナルの存在下で、プロモーターからの転写が活性化もしくは不活化されるか、増加するか、または減少する場合に、その状態もしくはシグナル「に応答する」か、またはその状態もしくはシグナル「によって調節される」。一部の実施形態では、プロモーターは応答要素を含む。「応答要素」は、プロモーター領域内のＤＮＡの短い配列であり、それは、プロモーターから遺伝子発現を調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）（調節する（ｒｅｇｕｌａｔｅ））特定の分子（例えば、転写因子）に結合する。本開示に従って使用されてもよい応答要素としては、フロレチン調整可能制御要素（ＰＥＡＣＥ）、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、インターフェロンガンマ活性化配列（ＧＡＳ）（Ｄｅｃｋｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１９９７ Ｍａｒ；１７（３）：１２１－３４、参照により本明細書に組み込まれる）、インターフェロン刺激応答要素（ＩＳＲＥ）（Ｈａｎ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４ Ａｐｒ ９；２７９（１５）：１５６５２－６１、参照により本明細書に組み込まれる）、ＮＦ－カッパＢ応答要素（Ｗａｎｇ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１２；２（４）：８２４－８３９、参照により本明細書に組み込まれる）、およびＳＴＡＴ３応答要素（Ｚｈａｎｇ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１：９５０３－９５０９、参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。他の応答要素が本明細書に包含される。応答要素はまた、その同族結合分子に対する応答要素の感受性を概して増加させるために、タンデムリピート（例えば、応答要素をコードする同じヌクレオチド配列の連続リピート）も含むことができる。タンデムリピートは、２×、３×、４×、５×などとラベル付けして、存在するリピートの数を表示することができる。
【0080】
応答性プロモーター（また、「誘導性プロモーター」とも呼ばれる）の非限定的な例（例えば、ＴＧＦ－ベータ応答性プロモーター）を表１にリストし、これは、プロモーターおよび転写因子の設計を示すだけでなく、転写因子（ＴＦ）および導入遺伝子転写（Ｔ）に向かう誘導因子分子の効果も示す（Ｂ、結合；Ｄ、解離；ｎ．ｄ．、判定せず）（Ａ、活性化；ＤＡ、非活性化；ＤＲ、抑制解除）（Ｈｏｒｎｅｒ，Ｍ．＆ Ｗｅｂｅｒ，Ｗ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８６（２０１２）２０７８４－２０９６ｍ、およびその中で引用される参考文献を参照のこと）。誘導性プロモーターの構成成分の非限定的な例としては、表２に示すものが挙げられる。
【0081】
【表1】
【0082】
【表2】
【0083】
本明細書で使用される場合、「構成的プロモーター」は、連続的または調整されていない転写活性を可能にするプロモーターを指す。
【0084】
構成的プロモーターの他の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１－アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーターおよびＥＦ１ａバリアントｈＥＦ１ａＶ１およびｈＥＦ１ａＶ２、伸長因子（ＥＦＳ）プロモーター、ＭＮＤプロモーター（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを伴う修飾ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのＵ３領域を含む合成プロモーター）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ならびにユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターが挙げられる。構成的プロモーターアミノ酸配列の例を表３に示す。
【0085】
【表3】
【0086】
キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたプロモーター
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む異種構築物を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む異種構築物を提供する。
【0087】
一部の実施形態では、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および／または合成プロモーターを含む。
【0088】
一部の実施形態では、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたプロモーターは、構成的プロモーターを含む。構成的プロモーターの例が、表３に示される。一部の実施形態では、構成的プロモーターとしては、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＣＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ（例えば、野生型、またはｈＥＦ１ａＶ１もしくはｈＥＦ１ａＶ２などのバリアント）、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂを挙げることができるが、これらに限定されない。
【0089】
異種構築物
一部の実施形態では、本明細書に記述されるようなポリヌクレオチド分子は、異種構築物に含まれる。「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、「異種構築物」と同じ意味であり、標的細胞中の構築物と動作可能に関連付けられる一つ以上の遺伝子の発現を導入および誘導するために使用されるポリヌクレオチド分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としての構築物だけでなく、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本明細書に記載されるような異種構築物は、発現カセットを含む。一部の実施形態では、本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含む発現カセットを含む異種構築物が本明細書に提供される。一部の実施形態では、異種構築物は、誘導性転写調節因子応答（ＩＴＭ応答性）プロモーターを含む標的発現カセットをさらに含む。一部の実施形態では、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含む発現カセットを含む第１の異種構築物、および誘導性転写調節因子応答性（ＩＴＭ応答性）プロモーターを含む標的発現カセットを含む第２の異種構築物が本明細書に提供される。
一部の実施形態では、本明細書に記述されるようなポリヌクレオチド分子は、異種構築物に含まれる。「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、「異種構築物」と同じ意味であり、標的細胞中の構築物と動作可能に関連付けられる一つ以上の遺伝子の発現を導入および誘導するために使用されるポリヌクレオチド分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としての構築物だけでなく、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本明細書に記載されるような異種構築物は、発現カセットを含む。一部の実施形態では、本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含む発現カセットを含む異種構築物が本明細書に提供される。一部の実施形態では、異種構築物は、誘導性転写調節因子応答（ＩＴＭ応答性）プロモーターを含む標的発現カセットをさらに含む。一部の実施形態では、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含む発現カセットを含む第１の異種構築物、および誘導性転写調節因子応答性（ＩＴＭ応答性）プロモーターを含む標的発現カセットを含む第２の異種構築物が本明細書に提供される。
【0090】
誘導性転写調節因子応答性プロモーターを含む発現システム
一部の実施形態では、本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードする第１の発現カセットと、目的の遺伝子に動作可能に連結された誘導性転写調節因子応答（ＩＴＭ応答性）プロモーターを含む標的発現カセットとを含む発現システムが本明細書に提供される。
一部の実施形態では、本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードする第１の発現カセットと、目的の遺伝子に動作可能に連結された誘導性転写調節因子応答（ＩＴＭ応答性）プロモーターを含む標的発現カセットとを含む発現システムが本明細書に提供される。
【0091】
目的の遺伝子
一部の実施形態では、目的の遺伝子は、治療用タンパク質を含む。治療用タンパク質は、対象に提供される場合、臨床的利益を提供する任意のポリペプチドである。治療用タンパク質は、ポリペプチドを投与すること、ポリペプチドを発現する能力を有する細胞を投与すること、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって提供されてもよい。
一部の実施形態では、目的の遺伝子は、治療用タンパク質を含む。治療用タンパク質は、対象に提供される場合、臨床的利益を提供する任意のポリペプチドである。治療用タンパク質は、ポリペプチドを投与すること、ポリペプチドを発現する能力を有する細胞を投与すること、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって提供されてもよい。
【0092】
一部の実施形態では、目的の遺伝子は、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、細胞死制御因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子ａ、受容体、リガンド、抗体、ペプチド、および酵素から選択されるポリペプチドをコードする。
【0093】
一部の実施形態では、目的の遺伝子は、サイトカインを含む。一部の実施形態では、サイトカインとしては、ＩＬ１－ベータ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ７０融合タンパク質、ＩＬ１５、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２２、Ｉ型インターフェロン、インターフェロン－ガンマ、およびＴＮＦ－アルファを挙げることができるが、これらに限定されない。
【0094】
一部の実施形態では、目的の遺伝子は、細胞死制御因子を含む。細胞死制御因子としては、細胞死誘導ポリペプチドおよび細胞生存ポリペプチドが挙げられる。
【0095】
一部の実施形態では、目的の遺伝子は、細胞死誘導ポリペプチドを含む。細胞死誘導ポリペプチドの例としては、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ジフテリア毒素断片Ａ（ＤＴＡ）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ－ｘＳ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｃｌ－２－相互作用タンパク質３（ＢＮＩＰ３）、Ｆａｓ、死ドメインを有するＦａｓ関連タンパク質（ＦＡＤＤ）、腫瘍壊死因子受容体１型関連死ドメインタンパク質（ＴＲＡＤＤ）、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ－Ｒ）、ＡＰＡＦ－１、グランザイムＢ、カスパーゼの第２のミトコンドリア由来活性化因子（ＳＭＡＣ）、Ｏｍｉ、Ｂｍｆ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、ｐ５３－アポトーシスの上方制御された調節因子（ＰＵＭＡ）、Ｎｏｘａ、Ｂｌｋ、Ｈｒｋ、シトクロムｃ、Ａｒｔ、ＴＮＦ関連細胞死誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、水胞帯状ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＶＺＶ－ＴＫ）、ウイルススパイクタンパク質、カルボキシルエステラーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼＦｋｓｂ、カルボキシペプチダーゼＧ２、カルボキシペプチダーゼＡ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、リナマラーゼ、肝シトクロムＰ４５０－２Ｂ１、プリンヌクレオシドホスホリラーゼが挙げられる。一部の実施形態では、細胞死誘導ポリペプチドは、カスパーゼ９、またはその機能的切断である。一部の実施形態では、細胞死誘導ポリペプチドは、配列番号４９のカスパーゼ９アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞死誘導ポリペプチドはジフテリア毒素断片Ａ（ＤＴＡ）である。一部の実施形態では、細胞死誘導ポリペプチドは、配列番号５０のＤＴＡアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞死誘導ポリペプチドは、グランザイムＢである。一部の実施形態では、細胞死誘導ポリペプチドは、配列番号５１のグランザイムＢアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞死誘導ポリペプチドは、Ｂａｘである。一部の実施形態では、細胞死誘導ポリペプチドは、配列番号５２のＢａｘアミノ酸配列を含む。
【0096】
一部の実施形態では、目的の遺伝子は、細胞生存ポリペプチドを含む。細胞生存ポリペプチドの例としては、ＸＩＡＰ、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｃｌ－ｗ、Ｂｃｌ－２－関連タンパク質Ａ１（ＢＣＬ２Ａ１）、Ｍｃｌ－１、ＦＬＩＣＥ様阻害性タンパク質（ｃ－ＦＬＩＰ）、およびアデノウイルスＥ１Ｂ－１９Ｋタンパク質が挙げられる。一部の実施形態では、細胞生存ポリペプチドはＸＩＡＰである。一部の実施形態では、細胞生存ポリペプチドは、配列番号５３のＸＩＡＰアミノ酸配列を含む。
【0097】
誘導性転写調節因子応答性プロモーター
一部の実施形態では、本開示は、誘導性転写調節因子応答性プロモーター（ＩＴＭ応答性プロモーター）に動作可能に連結された目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。一部の実施形態では、ＩＴＭ応答性プロモーターは、ＩＴＭを含むキメラポリペプチドに応答する合成プロモーターであり、またＩＴＭによる目的の遺伝子の抑制は、ポマリドミドなどのリガンドの存在によって制御することができる。
一部の実施形態では、本開示は、誘導性転写調節因子応答性プロモーター（ＩＴＭ応答性プロモーター）に動作可能に連結された目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。一部の実施形態では、ＩＴＭ応答性プロモーターは、ＩＴＭを含むキメラポリペプチドに応答する合成プロモーターであり、またＩＴＭによる目的の遺伝子の抑制は、ポマリドミドなどのリガンドの存在によって制御することができる。
【0098】
一部の実施形態では、ＩＴＭ応答性プロモーターは、プロモーター配列と、本明細書に記述されるような誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）によって特異的に認識されるＩＴＭ結合ドメインとを含む。本明細書で使用される場合、「コアプロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用し、かつ転写を開始するのに十分であるコア（すなわち、「最小」）プロモーター配列を含むプロモーターの一部分を指す。一部の実施形態では、ＩＴＭ応答性プロモーターは、コアプロモーター配列（プロモーター配列によって提供されるような）と、プロモーター領域内で自然に共起しない転写調節因子応答配列（結合ドメインによって提供されるような）とを含む合成プロモーターを含む。
【0099】
結合ドメインは、一つ以上のジンクフィンガー結合部位を含んでもよい。ジンクフィンガー結合部位は、ジンクフィンガータンパク質ドメイン（例えば、配列番号５のジンクフィンガータンパク質ドメイン）に結合する能力を有するポリヌクレオチド配列である。結合ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上のジンクフィンガー結合部位を含むことができる。例示的なジンクフィンガー結合部位は、ＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧ（配列番号５４）を含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、一つのジンクフィンガー結合部位を含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、二つ以上のジンクフィンガー結合部位を含む。ジンクフィンガー結合部位は、ＤＮＡリンカーによって隔てられてもよい。ＤＮＡリンカーは、一部の実施形態では、５～４０、５～３０、１０～４０、１０～３０塩基対の長さであってもよい。一部の実施形態では、結合ドメインは、二つのジンクフィンガー結合部位を含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、三つのジンクフィンガー結合部位を含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、四つのジンクフィンガー結合部位を含む。ジンクフィンガー結合部位を含む例示的な結合ドメインは、配列：
ｃｇｇｇｔｔｔｃｇｔａａｃａａｔｃｇｃａｔｇａｇｇａｔｔｃｇｃａａｃｇｃｃｔｔｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃｔｃｃｃｇｔｃｔｃａｇｔａａａｇｇｔｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃａａｔｃｇｇａｃｔｇｃｃｔｔｃｇｔａｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃｇｔａｔｃａｇｔｃｇｃｃｔｃｇｇａａｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧ（配列番号５５）
で示される。配列番号５５の結合ドメインは、各々が配列番号５のジンクフィンガータンパク質ドメインに結合する四つの結合部位を含み、結合部位の各々はＤＮＡリンカーによって隔てられている。
ｃｇｇｇｔｔｔｃｇｔａａｃａａｔｃｇｃａｔｇａｇｇａｔｔｃｇｃａａｃｇｃｃｔｔｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃｔｃｃｃｇｔｃｔｃａｇｔａａａｇｇｔｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃａａｔｃｇｇａｃｔｇｃｃｔｔｃｇｔａｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃｇｔａｔｃａｇｔｃｇｃｃｔｃｇｇａａｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧ（配列番号５５）
で示される。配列番号５５の結合ドメインは、各々が配列番号５のジンクフィンガータンパク質ドメインに結合する四つの結合部位を含み、結合部位の各々はＤＮＡリンカーによって隔てられている。
【0100】
一部の実施形態では、コアプロモーター配列は、最小プロモーターを含む。一部の実施形態では、コアプロモーター配列は、ｍｉｎＰ、ｍｉｎＣＭＶ、ＹＢ＿ＴＡＴＡ、およびｍｉｎＴＫから選択されるプロモーターに由来する。例示的なコアプロモーター配列は、ＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡ（配列番号５６）を含む。
【0101】
一部の実施形態では、コアプロモーター配列は、構成的プロモーターの配列を含む。構成的プロモーター配列の例を、表３に示す。一部の実施形態では、構成的プロモーター配列としては、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＣＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂを挙げることができるが、これらに限定されない。
【0102】
例示的なＩＴＭ応答性プロモーターは、配列：
ｃｇｇｇｔｔｔｃｇｔａａｃａａｔｃｇｃａｔｇａｇｇａｔｔｃｇｃａａｃｇｃｃｔｔｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃｔｃｃｃｇｔｃｔｃａｇｔａａａｇｇｔｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃａａｔｃｇｇａｃｔｇｃｃｔｔｃｇｔａｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃｇｔａｔｃａｇｔｃｇｃｃｔｃｇｇａａｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃａｔｔｃｇｔａａｇａｇｇｃｔｃａｃｔｃｔｃｃｃｔｔａｃａｃｇｇａｇｔｇｇａｔａＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡ（配列番号５７）
を含む。
ｃｇｇｇｔｔｔｃｇｔａａｃａａｔｃｇｃａｔｇａｇｇａｔｔｃｇｃａａｃｇｃｃｔｔｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃｔｃｃｃｇｔｃｔｃａｇｔａａａｇｇｔｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃａａｔｃｇｇａｃｔｇｃｃｔｔｃｇｔａｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃｇｔａｔｃａｇｔｃｇｃｃｔｃｇｇａａｃＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧｃａｔｔｃｇｔａａｇａｇｇｃｔｃａｃｔｃｔｃｃｃｔｔａｃａｃｇｇａｇｔｇｇａｔａＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡ（配列番号５７）
を含む。
【0103】
別の例示的なＩＴＭ応答性プロモーターは、配列：cgggtttcgtaacaatcgcatgaggattcgcaacgccttcGGCGTAGCCGATGTCGCGctcccgtctcagtaaaggtcGGCGTAGCCGATGTCGCGcaatcggactgccttcgtacGGCGTAGCCGATGTCGCGcgtatcagtcgcctcggaacGGCGTAGCCGATGTCGCGcattcgtaagaggctcactctcccttacacggagtggataACTAGTGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC （配列番号６７）
を含む。
を含む。
【0104】
マルチシストロンシステムおよび複数プロモーターシステム
一部の実施形態では、本開示の操作されたポリヌクレオチドまたは構築物は、複数のポリペプチドを産生するように構成される。例えば、ポリヌクレオチドは、二つの異なるポリペプチドを産生するように構成されてもよい。ポリヌクレオチド分子は、本明細書に記述されるようなキメラタンパク質を含むポリペプチド、およびキメラタンパク質に応答するプロモーターの制御下で発現される目的のポリペプチドを産生するように構成されてもよい。
一部の実施形態では、本開示の操作されたポリヌクレオチドまたは構築物は、複数のポリペプチドを産生するように構成される。例えば、ポリヌクレオチドは、二つの異なるポリペプチドを産生するように構成されてもよい。ポリヌクレオチド分子は、本明細書に記述されるようなキメラタンパク質を含むポリペプチド、およびキメラタンパク質に応答するプロモーターの制御下で発現される目的のポリペプチドを産生するように構成されてもよい。
【0105】
一部の実施形態では、本明細書に記述されるようなキメラポリペプチド、およびキメラポリペプチドによって転写的に抑制することができる目的の遺伝子は、同じポリヌクレオチド分子または異種構築物によってコードされてもよい。
【0106】
一部の実施形態では、操作された核酸は、マルチシストロン性とすることができ、すなわち、二つ以上の別個のポリペプチド（例えば、複数の外因性ポリヌクレオチドまたはエフェクター分子）を単一の転写産物から産生することができる。操作された核酸は、様々なリンカーの使用を通してマルチシストロン性とすることができ、例えば、第１の外因性ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列は、５’から３’の配向で第１の遺伝子：リンカー：第２の遺伝子など、第２の外因性ポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列へと連結することができる。リンカーポリヌクレオチド配列は、Ｔ２Ａなどの一つ以上の２Ａリボソームスキッピング要素をコードすることができる。他の２Ａリボソームスキッピング要素としては、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ、およびＦ２Ａが挙げられるが、これらに限定されない。２Ａリボソームスキッピング要素は、第１および第２の遺伝子によってコードされる別個のポリペプチドの産生が翻訳中に産生されるのを可能にする。リンカーは、フューリン切断部位またはＴＥＶ切断部位などの切断可能なリンカーポリペプチド配列をコードすることができ、発現の後、切断可能なリンカーポリペプチドは切断され、これにより第１および第２の遺伝子によってコードされた別個のポリペプチドが産生される。切断可能なリンカーは、こうした可撓性リンカー（例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ配列）などのポリペプチド配列を含むことができ、これは切断をさらに促進する。
【0107】
リンカーは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードすることができ、これにより第１および第２の遺伝子によってコードされる別個のポリペプチドは、翻訳中に産生される。リンカーは、ウイルススプライスアクセプターなどのスプライスアクセプターをコードすることができる。
【0108】
リンカーは、２Ａリボソームスキッピング、それに続く、２Ａ残基の完全な除去を可能にするフューリン部位のさらなる切断を通して別個のポリペプチドを産生することができる、フューリン－２Ａリンカーなどのリンカーの組み合わせとすることができる。一部の実施形態では、リンカーの組み合わせとしては、フューリン配列、可撓性リンカー、および２Ａリンカーを挙げることができる。したがって、一部の実施形態では、リンカーは、フューリン－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－２Ａ融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、リンカーは、フューリン－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｔ２Ａ融合ポリペプチドを含む。
【0109】
一般に、マルチシストロン性システムは、任意の数または組み合わせのリンカーを使用して、任意の数の遺伝子またはその部分を発現することができる（例えば、操作された核酸は、各々がリンカーによって隔てられている第１、第２、および第３のエフェクター分子をコードすることができ、これにより第１、第２、および第３のエフェクター分子によってコードされた別個のポリペプチドが産生される）。
【0110】
本明細書で使用される場合、「リンカー」は、第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列を連結するペプチドリンカーを指すことができる、または上述のマルチシストロン性リンカーを指すことができる。
【0111】
転写後調節要素
一部の実施形態では、本開示の操作されたポリヌクレオチド分子は、転写後調節要素（ＰＲＥ）を含む。ＰＲＥは、例えば、ＲＮＡを不安定化することによって（例えば、前述したようなＡＵ－スライド）、またはＲＮＡを安定化することによって、ＲＮＡ安定性を調節することができる。一部の実施形態では、ＰＲＥは、三次ＲＮＡ構造の安定性および３’末端形成を可能にすることを介して遺伝子発現を強化することができる。ＰＲＥの非限定的な例としては、Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ（ＨＰＲＥ）およびウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）が挙げられる。一部の実施形態では、転写後調節要素としては、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）が挙げられる。一部の実施形態では、ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥ要素のアルファ、ベータ、およびガンマ成分を含む。一部の実施形態では、ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥ要素のアルファ成分を含む。ＷＰＲＥ配列の例としては、配列番号５８および配列番号５９が挙げられる。
一部の実施形態では、本開示の操作されたポリヌクレオチド分子は、転写後調節要素（ＰＲＥ）を含む。ＰＲＥは、例えば、ＲＮＡを不安定化することによって（例えば、前述したようなＡＵ－スライド）、またはＲＮＡを安定化することによって、ＲＮＡ安定性を調節することができる。一部の実施形態では、ＰＲＥは、三次ＲＮＡ構造の安定性および３’末端形成を可能にすることを介して遺伝子発現を強化することができる。ＰＲＥの非限定的な例としては、Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ（ＨＰＲＥ）およびウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）が挙げられる。一部の実施形態では、転写後調節要素としては、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）が挙げられる。一部の実施形態では、ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥ要素のアルファ、ベータ、およびガンマ成分を含む。一部の実施形態では、ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥ要素のアルファ成分を含む。ＷＰＲＥ配列の例としては、配列番号５８および配列番号５９が挙げられる。
【0112】
操作された細胞
本開示の一つ以上のポリヌクレオチド分子、発現カセット、または構築物を含む細胞および細胞を産生する方法も本明細書に提供される。これらの細胞は、本明細書では「操作された細胞」と呼ばれる。典型的に一つ以上の操作された核酸を含むこれらの細胞は、天然では生じない。一部の実施形態では、細胞は、一つ以上の操作されたポリヌクレオチドを組み換え発現する単離された細胞である。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、一つ以上のベクターまたは細胞のゲノム由来の選択された遺伝子座から発現される。一部の実施形態では、細胞は、ヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含むように操作される。
本開示の一つ以上のポリヌクレオチド分子、発現カセット、または構築物を含む細胞および細胞を産生する方法も本明細書に提供される。これらの細胞は、本明細書では「操作された細胞」と呼ばれる。典型的に一つ以上の操作された核酸を含むこれらの細胞は、天然では生じない。一部の実施形態では、細胞は、一つ以上の操作されたポリヌクレオチドを組み換え発現する単離された細胞である。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、一つ以上のベクターまたは細胞のゲノム由来の選択された遺伝子座から発現される。一部の実施形態では、細胞は、ヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含むように操作される。
【0113】
本開示の操作された細胞は、細胞のゲノムに組み込まれた一つ以上の操作されたポリヌクレオチド（例えば、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）応答性プロモーターを含む発現システム）を含むことができる。操作された細胞は、例えば、プラスミドまたはｍＲＮＡなどの一過性発現システムで操作された、細胞のゲノムに組み込まれることなく発現の能力を有する、一つ以上の操作されたポリヌクレオチドを含むことができる。
【0114】
操作された細胞型
本開示の操作された細胞は、ヒト細胞とすることができる。操作された細胞は、ヒトの初代細胞とすることができる。操作された初代細胞は、任意の体細胞とすることができる。操作された初代細胞は、任意の幹細胞とすることができる。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、対象由来である。一部の実施形態では、操作された細胞は、対象に関して同種異系である。
本開示の操作された細胞は、ヒト細胞とすることができる。操作された細胞は、ヒトの初代細胞とすることができる。操作された初代細胞は、任意の体細胞とすることができる。操作された初代細胞は、任意の幹細胞とすることができる。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、対象由来である。一部の実施形態では、操作された細胞は、対象に関して同種異系である。
【0115】
本開示の操作された細胞は、がんを有することが知られている、または疑われる対象などの対象から単離することができる。細胞単離方法は当業者に知られており、ＦＡＣＳソーティングなどの細胞表面マーカー発現に基づくソーティング技法、ポジティブ単離技法、およびネガティブ単離、磁気単離、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。操作された細胞は、治療が投与されている対象に関して同種異系とすることができる。同種異系の修正された細胞は、治療が投与されている対象にＨＬＡ適合させることができる。操作された細胞は、エクスビボ培養細胞などの、培養細胞とすることができる。操作された細胞は、対象から単離された初代細胞などの、エクスビボ培養細胞とすることができる。培養細胞は、一つ以上のサイトカインを用いて培養することができる。
【0116】
一部の実施形態では、本開示の操作された細胞としては、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはガンマデルタＴ細胞）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ（例えば、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージ）、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ニューロン、乏突起膠細胞、星状膠細胞、プラコード由来細胞、シュワン細胞、心筋細胞、内皮細胞、結節筋細胞、ミクログリア細胞、肝細胞、胆管細胞、ベータ細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、およびｉＰＳＣ由来細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。
【0117】
一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはガンマ－デルタＴ細胞）である。一部の実施形態では、本開示の操作されたのは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、調節性Ｔ細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、自然リンパ球細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、肥満細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、好酸球である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、好塩基球である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、好中球である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、骨髄細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、マクロファージ、例えば、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージである）。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、単球である。一部の実施形態では、本開示の操作されたまたは単離された細胞は、樹状細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、赤血球である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、血小板細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、ニューロンである。一部の実施形態では、本開示の細胞は、ミクログリア細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、乏突起膠細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、星状膠細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、プラコード由来細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、シュワン細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、心筋細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、内皮細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、結節筋細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、ミクログリア細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、胆管細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、ベータ細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、ＥＳＣ由来細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、多能性幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、ｉＰＳＣ由来細胞である。一部の実施形態では、操作された細胞は自己である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、同種異系である。一部の実施形態では、本開示の操作された細胞は、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ１６＋細胞、および／またはＣＤ４＋細胞である。
【0118】
一部の実施形態では、本開示の細胞は、腺がん細胞、膀胱腫瘍細胞、脳腫瘍細胞（例えば、グリオーマ細胞またはグリア芽腫細胞）、乳房腫瘍細胞、頚部腫瘍細胞、直腸結腸腫瘍細胞、食道腫瘍細胞、グリオーマ細胞、腎臓腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、メラノーマ細胞、中皮腫細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、皮膚腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、および子宮腫瘍細胞から選択される腫瘍細胞である。
【0119】
また、本開示の操作された細胞を培養することを含む方法も本明細書で提供される。本明細書に記述される操作された細胞を培養する方法は、知られている。当業者は、培養条件が、目的の特定の操作された細胞に依存することを認識するであろう。当業者は、培養条件が、操作された細胞の特定の下流での使用、例えば、対象に対する操作された細胞のその後の投与のための特定の培養条件に依存することを認識するであろう。
【0120】
細胞を操作する方法
本明細書に記述されるような任意のポリヌクレオチド分子または構築物を有する細胞を操作するための組成物および方法も本明細書で提供される。
本明細書に記述されるような任意のポリヌクレオチド分子または構築物を有する細胞を操作するための組成物および方法も本明細書で提供される。
【0121】
一般に、細胞は、本開示の一つ以上のポリヌクレオチドの導入（すなわち、送達）により操作される。送達方法としては、ウイルス媒介送達、脂質媒介導入、ナノ粒子送達、電気穿孔、超音波処理、および物理的手段による細胞膜変形が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、送達方法の選択は、操作されるべき特定の細胞型に依存する可能性があることを理解するであろう。
【0122】
ウイルス媒介送達
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームを使用して、細胞を操作することができる。一般に、ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、宿主細胞の中への導入（すなわち、送達）を通して細胞を操作する。例えば、ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、本明細書に記述される核酸のうちのいずれかの導入を通して細胞を操作することができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは核酸とすることができるが、このように、操作された核酸はまた、操作されたウイルス由来の核酸を包含することもできる。こうした操作されたウイルス由来の核酸はまた、組み換えウイルスまたは操作されたウイルスとも呼ぶことができる。
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームを使用して、細胞を操作することができる。一般に、ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、宿主細胞の中への導入（すなわち、送達）を通して細胞を操作する。例えば、ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、本明細書に記述される核酸のうちのいずれかの導入を通して細胞を操作することができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは核酸とすることができるが、このように、操作された核酸はまた、操作されたウイルス由来の核酸を包含することもできる。こうした操作されたウイルス由来の核酸はまた、組み換えウイルスまたは操作されたウイルスとも呼ぶことができる。
【0123】
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、同じ核酸内に二つ以上の操作された核酸、遺伝子、または導入遺伝子をコードすることができる。例えば、操作されたウイルス由来の核酸、例えば、組み換えウイルスまたは操作されたウイルスは、一つ以上のエフェクター分子をコードする本明細書に記載の操作された核酸のうちのいずれかが挙げられるがこれらに限定されない一つ以上の導入遺伝子をコードすることができる。一つ以上のエフェクター分子をコードする一つ以上の導入遺伝子を、一つ以上のエフェクター分子を発現するように構成することができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、ウイルス感染性および／またはウイルス産生に必要なウイルス遺伝子など（例えば、キャプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、ウイルスポリメラーゼ、ウイルスなど）の、一つ以上の導入遺伝子（例えば、一つ以上のエフェクター分子をコードする導入遺伝子）に加えて、シス作用要素またはシス作用遺伝子と呼ばれる一つ以上の遺伝子をコードすることができる。
【0124】
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、本明細書中に記述され、かつトランス作用性要素または遺伝子と呼ばれる、操作された核酸、遺伝子、または導入遺伝子をコードする別個のウイルスベクターなどの、二つ以上のウイルスベクターを含むことができる。例えば、ヘルパー依存性ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、一つ以上のエフェクター分子をコードするベクターに加えて、一つ以上の追加の別個のベクター上にウイルス感染性および／またはウイルス産生のために必要な追加の遺伝子を提供することができる。一つのウイルスベクターは、二つ以上のエフェクター分子を産生するように構成された操作された核酸を送達する一つのベクターなど、二つ以上の操作された核酸を送達することができる。二つ以上のウイルスベクターは、一つ以上のエフェクター分子を産生するように構成された一つ以上の操作された核酸を送達する二つ以上のベクターなどの、二つ以上の操作された核酸を送達することができる。使用されるウイルスベクターの数は、上述のウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング容量に依存することができ、また当業者は、適切な数のウイルスベクターを選択することができる。
【0125】
一般に、ウイルスベクターベースのシステムのうちのいずれかは、エフェクター分子などの分子のインビトロ産生のために使用することができ、または、例えば、一つ以上のエフェクター分子をコードする操作された核酸をインビボ送達するために、インビボおよびエクスビボ遺伝子療法手順に使用することができる。適切なウイルスベクターベースのシステムの選択は、カーゴ／ペイロードのサイズ、ウイルスシステムの免疫原性、目的の標的細胞、遺伝子発現の強度およびタイミング、ならびに当業者によって理解される他の要因などの、様々な要因に依存する。
【0126】
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、ＲＮＡベースのウイルスまたはＤＮＡベースのウイルスとすることができる。例示的なウイルスベクターベースの送達プラットフォームには、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、インディアナベシクロウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、粘液腫ウイルス、レオウイルス、ムンプスウイルス、マラバウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、肝炎ウイルス、風疹ウイルス、デングウイルス、チクングニアウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、モルビリウイルス、レンチウイルス、複製レトロウイルス、ラブドウイルス、セネカバレーウイルス、シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアント又は誘導体が含まれるが、これらに限定されない。ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６－６２９を参照のこと）、または特定の細胞型もしくは受容体を標的化するように設計された第２、第３またはハイブリッド第２／第３世代レンチウイルスおよび任意の世代の組み換えレンチウイルスが挙げられるがこれらに限定されないレンチウイルスなど（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５－６１、Ｓａｋｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃ ｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２）４４３（３）：６０３－１８、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２－６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３－９８８０を参照のこと）などの他の例示的なウイルスベクターベースの送達プラットフォームが、当技術分野において記述される。
【0127】
この配列は、細胞内コンパートメントを標的化する一つ以上の配列で先行されてもよい。宿主細胞への導入（すなわち、送達）に伴い、感染細胞（すなわち、操作された細胞）は、一つ以上のエフェクター分子を発現することができ、そしていくつかの事例では分泌することができる。免疫化プロトコルにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記述されている。別のベクターはＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０（１９９１））に記述されている。操作された核酸の導入（すなわち、送達）のために有用な多種多様な他のベクター、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉベクター、およびこれに類するものは、本明細書の記述から当業者には明らかであろう。
【0128】
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、腫瘍細胞を標的とするウイルスとすることができ、本明細書では腫瘍溶解性ウイルスと呼ばれる。腫瘍溶解性ウイルスの例としては、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性麻疹ウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性インディアナベシクロウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ムンプスウイルス、腫瘍溶解性マラバウイルス、腫瘍溶解性狂犬病ウイルス、腫瘍溶解性ロタウイルス、腫瘍溶解性肝炎ウイルス、腫瘍溶解性風疹ウイルス、腫瘍溶解性デングウイルス、腫瘍溶解性チクングニアウイルス、腫瘍溶解性呼吸器合胞体ウイルス、腫瘍溶解性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、腫瘍溶解性モルビリウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性複製レトロウイルス、腫瘍溶解性ラブドウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、およびそれらの任意のバリアントまたは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記述される腫瘍溶解性ウイルスのうちのいずれかは、一つ以上のエフェクター分子をコードするもう一つの導入遺伝子（例えば、操作された核酸）を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスとすることができる。一つ以上のエフェクター分子をコードする導入遺伝子は、一つ以上のエフェクター分子を発現するように構成することができる。
【0129】
一部の実施形態では、ウイルスとしては、レンチウイルス、レトロウイルス、腫瘍溶解性ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【0130】
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、レトロウイルスベースとすることができる。一般に、レトロウイルスベクターは、最大で６～１０ｋｂの外来配列に対するパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。最小のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングのために十分であり、これはその後、一つ以上の操作された核酸（例えば、一つ以上のエフェクター分子をコードする導入遺伝子）を標的細胞に組み込んで、永久的な導入遺伝子発現を提供するために使用される。レトロウイルスベースの送達システムとしては、ネズミ白血病、ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組み合わせに基づく送達システムが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号を参照のこと）。他のレトロウイルスシステムとしては、Ｐｈｏｅｎｉｘレトロウイルスシステムが挙げられる。
【0131】
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、レンチウイルスベースとすることができる。一般的に、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染させることができ、典型的に、高いウイルス力価を産生するレトロウイルスベクターである。レンチウイルスベースの送達プラットフォームは、ＶｉｒａＰｏｗｅｒシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはｐＬｅｎｔｉシステム（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）などの、ＨＩＶベースとすることができる。レンチウイルスベースの送達プラットフォームは、ＳＩＶまたはＦＩＶベースとすることができる。他の例示的なレンチウイルスベースの送達プラットフォームは、米国特許第７，３１１，９０７号、同第７，２６２，０４９号、同第７，２５０，２９９号、同第７，２２６，７８０号、同第７，２２０，５７８号、同第７，２１１，２４７号、同第７，１６０，７２１号、同第７，０７８，０３１号、同第７，０７０，９９３号、同第７，０５６，６９９号、同第６，９５５，９１９号に、より詳細に記述され、各々は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0132】
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、アデノウイルスベースとすることができる。一般に、アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率の能力を有し、細胞分裂を必要とせず、高い力価および発現のレベルを達成し、かつ比較的単純なシステムにおいて大量に産生することができる。一般に、アデノウイルスは、感染細胞内での導入遺伝子の一過性発現のために使用することができる。なぜなら、アデノウイルスは、典型的に、宿主のゲノム中に組み込まれないためである。アデノウイルスベースの送達プラットフォームは、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９、Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９、国際公開第９４／１２６４９号、同第９３／０３７６９号、同第９３／１９１９１号、同第９４／２８９３８、同第９５／１１９８４号、および同第９５／００６５５号に、より詳細に記述され、各々は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。他の例示的なアデノウイルスベースの送達プラットフォームは、米国特許第５５８５３６２号、同第６，０８３，７１６号、同第７，３７１，５７０号、同第７，３４８，１７８号、同第７，３２３，１７７号、同第７，３１９，０３３号、同第７，３１８，９１９号、および同第７，３０６，７９３号ならびに国際特許出願国際公開第９６／１３５９７号に、より詳細に記述され、各々は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0133】
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースとすることができる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、操作された核酸（例えば、本明細書に記述される操作された核酸のうちのいずれか）を用いて細胞を形質導入するために使用されてもよい。ＡＡＶシステムは、エフェクター分子のインビトロ産生のために使用することができ、またはインビボおよびエクスビボ遺伝子療法手順において、例えば、一つ以上のエフェクター分子をコードする操作された核酸のインビボ送達のために使用することができる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、同第５，４３６，１４６号、同第６，６３２，６７０号、同第６，６４２，０５１号、同第７，０７８，３８７号、同第７，３１４，９１２号、同第６，４９８，２４４号、同第７，９０６，１１１号、米国特許公開第２００３－０１３８７７２号、同第２００７／００３６７６０号、および同第２００９／０１９７３３８号、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７８（１２）：６３８１－６３８８（Ｊｕｎｅ ２００４）；Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１００（１０）：６０８１－６０８６（Ｍａｙ １３，２００３）、ならびに国際特許出願国際公開第２０１０／１３８２６３号および同第９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）、各々は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる） 組み換えＡＡＶベクターを構築するための例示的な方法が、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｈ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｈ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ａｍｐ；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｉｓｋｉ ｅｔ ａｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）に、さらに詳細に記述され、各々は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。一般に、ＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．Ｒｈ１０、ＡＡＶ１１およびそれらのバリアントのうちのいずれか一つに対応するアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む。
【0134】
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）プラットフォームとすることができる。一般に、ＶＬＰは、ウイルス構造タンパク質を産生し、結果として得られたウイルス粒子を精製することによって構築される。次いで、精製後、カーゴ／ペイロード（例えば、本明細書に記述される、操作された核酸のうちのいずれか）を、精製した粒子内にエクスビボで封入する。したがって、ＶＬＰの産生は、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸およびカーゴ／ペイロードをコードする核酸の分離を維持する。ＶＬＰ産生において使用されるウイルス構造タンパク質は、哺乳動物、酵母、昆虫、細菌、またはインビボ翻訳発現システムを含む、様々な発現システムにおいて産生することができる。精製されたウイルス粒子を、当業者に知られている方法を使用して、所望のカーゴの存在下で変性および再形成して、ＶＬＰを産生することができる。ＶＬＰの産生は、Ｓｅｏｗ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９ Ｍａｙ；１７（５）：７６７－７７７）に、より詳細に記述され、参照によりすべての目的のために本明細書に組み込まれる。
【0135】
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、ある範囲の細胞を標的化（すなわち、感染）する、細胞の狭いサブセットを標的化する、または特定の細胞を標的化するように操作することができる。一般に、ウイルスベクターベースの送達プラットフォーム用に選ばれたエンベロープタンパク質は、ウイルス親和性を決定する。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームにおいて使用されるウイルスは、目的の特定の細胞を標的化するように偽型化することができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、汎親和性とすることができ、かつある範囲の細胞に感染することができる。例えば、汎親和性ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、ＶＳＶ－Ｇエンベロープを含むことができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、両種指向性とすることができ、かつ哺乳動物細胞に感染することができる。したがって、当業者は、所望の細胞型を標的化するための適切な親和性、偽型、および／またはエンベロープタンパク質を選択することができる。
【0136】
脂質構造送達システム
本開示の操作された核酸（例えば、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子）は、脂質媒介送達システムを使用して細胞の中へと導入することができる。一般に、脂質媒介送達システムは、内部コンパートメントを包む外部脂質膜で構成される構造を使用する。脂質ベースの構造の例としては、脂質ベースのナノ粒子、リポソーム、ミセル、エキソソーム、小胞、細胞外小胞、細胞、または組織が挙げられるが、これらに限定されない。脂質構造送達システムは、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで、カーゴ／ペイロード（例えば、本明細書に記述される、操作された核酸のうちのいずれか）を送達することができる。
本開示の操作された核酸（例えば、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子）は、脂質媒介送達システムを使用して細胞の中へと導入することができる。一般に、脂質媒介送達システムは、内部コンパートメントを包む外部脂質膜で構成される構造を使用する。脂質ベースの構造の例としては、脂質ベースのナノ粒子、リポソーム、ミセル、エキソソーム、小胞、細胞外小胞、細胞、または組織が挙げられるが、これらに限定されない。脂質構造送達システムは、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで、カーゴ／ペイロード（例えば、本明細書に記述される、操作された核酸のうちのいずれか）を送達することができる。
【0137】
脂質ベースのナノ粒子としては、単層リポソーム、多層リポソーム、および脂質調製物を挙げることができるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「リポソーム」は、所望のカーゴ、例えば、例えば、本明細書に記述される、操作された核酸のうちのいずれかなどの操作された核酸を、脂質シェルまたは脂質凝集体内に封入することにより形成される脂質ビヒクルのインビトロ調製物を包含する総称である。リポソームは、一般的にリン脂質を含む二分子膜を有する小胞構造、および一般的に水性組成物を含む内部媒質を有するとして特徴付けられてもよい。リポソームとしては、エマルション、発泡体、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、層状層、およびこれに類するものが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームは単層リポソームとすることができる。リポソームは多層リポソームとすることができる。リポソームは多胞性リポソームとすることができる。リポソームは、正に荷電、負に荷電、または中性に荷電することができる。ある特定の実施形態では、リポソームは中性に荷電している。リポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成することができ、これは、一般的に、中性および負に荷電したリン脂質ならびにコレステロールなどのステロールを含む。脂質の選択は、一般的に、所望の目的、例えば、インビボ送達についての基準、例えばリポソームのサイズ、酸の不安定性、および血流中でのリポソームの安定性などの考慮により誘導される。例えば、Ｓｚｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９；４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号（各々は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）に記述されるような様々な方法が、リポソームを調製するために利用可能である。
【0138】
多層リポソームは、一般的に、リン脂質を含む脂質を過剰の水溶液中に懸濁した場合に自発的に生成され、これにより複数の脂質層が水性媒体によって分離される。水および溶解された溶質は、脂質成分の自己再構成後に、脂質二分子層の間の閉じた構造中に封入される。所望のカーゴ（例えば、ポリペプチド、核酸、小分子薬物、本明細書に記述される操作された核酸のいずれかなどの操作された核酸、ウイルスベクター、ウイルスベースの送達システムなど）は、リポソーム内部の水溶液中に封入するか、リポソームおよびポリペプチド／核酸の両方と会合する連結分子を介してリポソームに付着させるか、リポソームの脂質二分子層内に散在させるか、リポソーム内に取り込むか、リポソームと複合体化させるか、または別の方法で、リポソームと会合させることができ、これによりそれを標的実体へと送達することができる。親油性分子または親油性領域を有する分子はまた、脂質二分子層内に溶解されてもよく、またはそれと会合してもよい。
【0139】
本実施形態に従って使用されるリポソームは、当業者には知られているであろうように、異なる方法により作製することができる。リポソームの調製は、国際公開第２０１６／２０１３２３号、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１号および同第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０５０４０号、ならびに米国特許第４，７２８，５７８号、同第４，７２８，５７５号、同第４，７３７，３２３号、同第４，５３３，２５４号、同第４，１６２，２８２号、同第４，３１０，５０５号、および同第４，９２１，７０６号に、より詳細に記述され、各々は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0140】
リポソームはカチオン性リポソームとすることができる。カチオン性リポソームの例は、米国特許第５，９６２，０１６号、同第５，０３０，４５３号、同第６，６８０，０６８号、米国出願第２００４／０２０８９２１号、ならびに国際特許出願国際公開第０３／０１５７５７Ａ１号、同第０４０２９２１３Ａ２号、および同第０２／１００４３５Ａ１号に、より詳細に記述され、各々は、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【0141】
脂質媒介遺伝子送達方法は、例えば、国際公開第９６／１８３７２号、同第９３／２４６４０号、Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２－６９１（１９８８）、米国特許第５，２７９，８３３号Ｒｏｓｅ米国特許第５，２７９，８３３号、国際公開第９１／０６３０９、およびＦｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３－７４１４（１９８７）に記述され、各々は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0142】
エキソソームは、エンドサイトーシス起源の小さい膜小胞であり、それは、多胞性本体と原形質膜との融合後に細胞外環境へと放出される。エキソソームのサイズは、直径３０～１００ｎｍの範囲である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二分子層からなり、それらは、エキソソームを産生した細胞からのサイトゾルを含み、そして表面上に親細胞からの膜タンパク質を呈する。核酸の送達のために有用なエキソソームは、当業者に知られており、例えば、米国特許第９，８８９，２１０号においてより詳細に記述されるエキソソームであり、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0143】
本明細書で使用される場合、「細胞外小胞」または「ＥＶ」という用語は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小胞を指す。一般に、細胞外小胞は、それらが由来する細胞より小さい直径を有するすべての膜結合型小胞を含む。一般的に、細胞外小胞は、直径２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲であり、細胞外小胞の外部表面上に表示される、および／または膜にわたる内部空間内のいずれかで、様々な高分子カーゴを含むことができる。カーゴは、核酸（例えば、本明細書に記述される操作された核酸のうちのいずれか）、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、および／またはそれらの組み合わせを含むことができる。例として、限定されないが、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接または間接操作（例えば、連続的な押し出しまたはアルカリ溶液での処理による）によって細胞から由来する小胞、小胞化オルガネラ、および生細胞により産生される小胞（例えば、直接的な原形質膜の出芽または後期エンドソームと原形質膜との融合による）を含む。細胞外小胞は、生存生物または死滅生物、外植された組織もしくは器官、および／または培養細胞に由来することができる。
【0144】
本明細書で使用される場合、「エキソソーム」という用語は、内部空間を取り囲む膜を含み、直接的な原形質膜の出芽または後期エンドソームと原形質膜との融合により細胞から生成される細胞由来の小さい（直径２０～３００ｎｍ、より好ましくは直径４０～２００ｎｍの）小胞を指す。エキソソームは、脂質または脂肪酸およびポリペプチドを含み、そして任意選択的に、ペイロード（例えば、治療薬）、レシーバ（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、例えば、本明細書に記述される操作された核酸のうちのいずれかなど）、糖（例えば、単糖類、多糖類、またはグリカン）、または他の分子を含む。エキソソームは、産生細胞から由来することができ、またそのサイズ、密度、生化学的パラメーター、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離することができる。エキソソームは、細胞外小胞の一種である。一般的に、エキソソーム産生／生合成は、産生細胞の破壊をもたらさない。エキソソームおよびエキソソームの調製は、国際公開第２０１６／２０１３２３号にさらに詳細に記述され、それは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0145】
本明細書で使用される場合、「ナノ小胞」（また、「マイクロ小胞」とも呼ばれる）という用語は、内部空間を取り囲む膜を含み、直接または間接操作により細胞から生成される、細胞由来の小さい（直径２０～２５０ｎｍ、より好ましくは直径３０～１５０ｎｍの）小胞を指し、これにより当該ナノ小胞は、当該操作を有しないで、当該産生細胞によって産生されないことになる。一般に、ナノ小胞は、細胞外小胞の亜種である。産生細胞の適切な操作としては、連続押出、アルカリ性溶液を用いた処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ナノ小胞の産生は、一部の事例では、当該産生細胞の破壊をもたらす場合がある。好ましくは、ナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接出芽または後期エンドソームと原形質膜との融合により産生細胞から由来する小胞を実質的に含まない。ナノ小胞は、脂質または脂肪酸およびポリペプチドを含み、そして任意選択的に、ペイロード（例えば、治療薬）、レシーバ（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、例えば、本明細書に記述される操作された核酸のうちのいずれかなど）、糖（例えば、単糖類、多糖類、またはグリカン）、または他の分子を含む。ナノ小胞は、当該操作に従って産生細胞から誘導されると、そのサイズ、密度、生化学的パラメーター、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離される場合がある。
【0146】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、一般に、脂質の両親媒性の性質に依存して膜および小胞様の構造を形成する合成脂質構造である（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。一般に、これらの小胞は、標的細胞の膜中に吸収され、カーゴをサイトゾル中に放出することによって、本明細書に記述される、操作された核酸またはウイルスシステムのいずれかなどのカーゴ／ペイロードを送達する。ＬＮＰ形成において使用される脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性とすることができる。脂質は、合成または天然由来とすることができ、一部の事例では生分解性とすることができる。脂質としては、脂肪、コレステロール、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲート（ＰＥＧ化脂質）が挙げられるがこれらに限定されない脂質コンジュゲート、ワックス、油、グリセリド、および脂溶性ビタミンを含むことができる。脂質組成物は、一般的に、カチオン性、中性、アニオン性、および両親媒性脂質などの材料の定義された混合物を含む。一部の事例では、ＬＮＰ凝集を防止する、脂質酸化を防止する、または追加部分の付着を促進する機能的な化学基を提供するために、特定の脂質が含まれる。脂質組成物は、全体的なＬＮＰサイズおよび安定性に影響を与える可能性がある。一例では、脂質組成物は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＭＣ３）またはＭＣ３様分子を含む。ＭＣ３およびＭＣ３様脂質組成物は、ＰＥＧまたはＰＥＧコンジュゲート脂質、ステロール、または中性脂質などの一つ以上の他の脂質を含むように製剤化することができる。加えて、ＬＮＰをさらに操作または機能化して、特定の細胞型の標的化を促進することができる。ＬＮＰ設計における別の考慮事項は、標的化効率と細胞傷害性とのバランスである。
【0147】
ミセルは、一般に、単鎖脂質を使用して形成される球状の合成脂質構造であり、ここで、単鎖脂質の親水性の頭部は外層または膜を形成し、また単鎖脂質の疎水性の尾部はミセル中心を形成する。ミセルは、典型的に、脂質単層のみを含む脂質構造を指す。ミセルは、Ｑｕａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７ Ｊｕｌ ５；２５（７）：１５０１－１５１３）に、より詳細に記述され、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0148】
血清に直接曝露された発現ベクターなどの核酸ベクターは、血清ヌクレアーゼによる核酸の分解または遊離核酸による免疫系のオフターゲット刺激を含む、いくつかの望ましくない結果を有する可能性がある。同様に、血清に直接曝露されたウイルス送達システムは、望ましくない免疫応答および／またはウイルス送達システムの中和をトリガーする可能性がある。したがって、操作された核酸および／またはウイルス送達システムの封入を使用して、分解を回避することができ、一方で潜在的なオフターゲットの影響を回避することもできる。ある特定の例では、操作された核酸および／またはウイルス送達システムは、ＬＮＰの水性内部内などの送達ビヒクル内に完全に封入される。ＬＮＰ内での操作された核酸および／またはウイルス送達システムのカプセル化は、当業者に周知の技術、例えば、マイクロ流体混合およびマイクロ流体液滴生成デバイス上で行われる液滴生成などにより行うことができる。こうした装置デバイスとしては、標準的なＴジャンクションデバイスまたはフローフォーカシングデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。一例では、ＭＣ３またはＭＣ３様含有組成物などの所望の脂質製剤は、操作された核酸またはウイルス送達システムおよび任意の他の所望の薬剤と並行して液滴生成デバイスに提供され、これにより送達ベクターおよび所望の薬剤は、ＭＣ３またはＭＣ３様ベースのＬＮＰの内部内に完全に封入される。一例では、液滴生成デバイスは、産生されるＬＮＰのサイズ範囲およびサイズ分布を制御することができる。例えば、ＬＮＰは、直径の１～１０００ナノメートルの範囲、例えば、１、１０、５０、１００、５００、または１０００ナノメートルのサイズを有することができる。液滴生成の後、カーゴ／ペイロードをカプセル化する送達ビヒクル（例えば、操作された核酸および／またはウイルス送達システム）をさらに処理または操作して、投与用にそれらを調製することができる。
【0149】
ナノ粒子送達
ナノ材料は、操作された核酸（例えば、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子）を送達するために使用することができる。ナノ材料ビヒクルは、重要なことに、非免疫原性材料で作製することができ、また一般的に、その送達ベクター自体に対する免疫を引き出すことを回避することができる。これらの材料としては、脂質（前述したような）、無機ナノ材料、および他の高分子材料が挙げられるが、これらに限定されない。ナノ材料粒子は、Ｒｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ－－Ａ Ｒｅｖｉｅｗ． Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１７，７（５），９４）に、より詳細に記述され、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
ナノ材料は、操作された核酸（例えば、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子）を送達するために使用することができる。ナノ材料ビヒクルは、重要なことに、非免疫原性材料で作製することができ、また一般的に、その送達ベクター自体に対する免疫を引き出すことを回避することができる。これらの材料としては、脂質（前述したような）、無機ナノ材料、および他の高分子材料が挙げられるが、これらに限定されない。ナノ材料粒子は、Ｒｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ－－Ａ Ｒｅｖｉｅｗ． Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１７，７（５），９４）に、より詳細に記述され、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0150】
ゲノム編集システム
ゲノム編集システムを使用して、本開示のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子などの操作された核酸をコードするように宿主ゲノムを操作することができる。一般に、「ゲノム編集システム」は、外因性遺伝子を宿主細胞のゲノム中に組み込むための任意のシステムを指す。ゲノム編集システムとしては、トランスポゾンシステム、ヌクレアーゼゲノム編集システム、およびウイルスベクターベースの送達プラットフォームが挙げられるが、これらに限定されない。
ゲノム編集システムを使用して、本開示のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子などの操作された核酸をコードするように宿主ゲノムを操作することができる。一般に、「ゲノム編集システム」は、外因性遺伝子を宿主細胞のゲノム中に組み込むための任意のシステムを指す。ゲノム編集システムとしては、トランスポゾンシステム、ヌクレアーゼゲノム編集システム、およびウイルスベクターベースの送達プラットフォームが挙げられるが、これらに限定されない。
【0151】
トランスポゾンシステムを使用して、本開示の操作された核酸などの操作された核酸を宿主ゲノムに組み込むことができる。トランスポゾンは、一般的に、カーゴ／ペイロード核酸およびトランスポザーゼに隣接する末端逆位反復（ＴＩＲ）を含む。トランスポゾンシステムは、ＴＩＲ隣接カーゴとともに、シスにおいてまたはトランスにおいてトランスポゾンを提供することができる。トランスポゾンシステムは、レトロトランスポゾンシステムまたはＤＮＡトランスポゾンシステムとすることができる。一般に、トランスポゾンシステムは、カーゴ／ペイロード（例えば、操作された核酸）をランダムに宿主ゲノム中に組み込む。トランスポゾンシステムの例としては、スリーピングビューティートランスポゾンシステムなどのＴｃ１／マリナートランスポゾンスーパーファミリーのトランスポゾンを使用したシステムが挙げられ、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１７ Ａｕｇ；５２（４）：３５５－３８０）、ならびに米国特許第６，４８９，４５８号、同第６，６１３，７５２号、および同第７，９８５，７３９号に、より詳細に記述され、それらの各々は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。トランスポゾンシステムの別の例としては、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムが挙げられ、米国特許第６，２１８，１８５号および同第６，９６２，８１０号に、より詳細に記述され、それらの各々は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0152】
ヌクレアーゼゲノム編集システムを使用して、本開示の単離ポリヌクレオチドまたは異種構築物などの操作された核酸をコードするように宿主ゲノムを操作することができる。理論に拘束されることを望むものではないが、一般に、外因性遺伝子を導入するために使用されるヌクレアーゼ媒介遺伝子編集システムは、細胞の天然ＤＮＡ修復機構、特に相同的組み換え（ＨＲ）修復経路を利用する。簡潔に述べると、ゲノムＤＮＡへの損傷（典型的には二本鎖切断）の後、細胞は、損傷を修復するためのＤＮＡ合成時に、その５’と３’の両方の末端に同一または実質的に同一の配列を有する別のＤＮＡ供給源をテンプレートとして使用することにより、損傷を解消することができる。天然の状況では、ＨＤＲは、細胞中に存在するその他の染色体をテンプレートとして使用することができる。遺伝子編集システムでは、外因性ポリヌクレオチドを細胞中に導入し、相同的組み換えテンプレート（ＨＲＴまたはＨＲテンプレート）として使用する。一般に、ＨＲＴ（例えば、遺伝子または遺伝子の一部）内の５’および３’相補的末端の間に含まれる損傷を伴う、染色体内に本来は見出されない任意の追加の外因性配列を、テンプレート化されたＨＤＲ中に所与のゲノム遺伝子座中に組み込む（すなわち、統合する）ことができる。それ故に、所与のゲノム遺伝子座に対する典型的なＨＲテンプレートは、内因性ゲノム標的遺伝子座の第１の領域と同一のヌクレオチド配列、内因性ゲノム標的遺伝子座の第２の領域と同一のヌクレオチド配列、およびカーゴ／ペイロード核酸（例えば、一つ以上のエフェクター分子をコードする操作された核酸のうちのいずれかなどの本明細書に記載の操作された核酸のいずれか）をコードするヌクレオチド配列を有する。
【0153】
一部の例では、ＨＲテンプレートは直線状とすることができる。直線状ＨＲテンプレートの例としては、直線化されたプラスミドベクター、ｓｓＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＰＣＲ増幅ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。特定の例では、ＨＲテンプレートは、プラスミドなど、環状とすることができる。環状テンプレートは、スーパーコイル状のテンプレートを含むことができる。
【0154】
ＨＲテンプレートの５’および３’末端で見出される同一または実質的に同一の配列は、導入される外因性配列に関して、一般的にアーム（ＨＲアーム）と呼ばれる。ＨＲアームは、内因性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一（即ち、１００％同一）とすることができる。ＨＲアームは、一部の例では、内因性ゲノム標的遺伝子座の領域と実質的に同一とすることができる。実質的に同一のＨＲアームを使用することができる一方で、ＨＤＲ経路の効率は、１００％未満の同一性を有するＨＲアームによって影響を受ける場合があるため、ＨＲアームが同一であることは有利となる可能性がある。
【0155】
各ＨＲアーム、すなわち５’および３’ＨＲアームは、同じサイズまたは異なるサイズとすることができる。各ＨＲアームの長さは、各々、５０、１００、２００、３００、４００、もしくは５００塩基以上とすることができる。ＨＲアームは、一般に、任意の長さとすることができるが、全体的な編集効率に対するＨＲアームの長さおよび全体的なテンプレートサイズの影響などの実際的な考慮事項も考慮に入れることができる。ＨＲアームは、切断部位に直接隣接する内因性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一、または実質的に同一とすることができる。各ＨＲアームは、切断部位に直接隣接する内因性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一、または実質的に同一とすることができる。各ＨＲアームは、切断部位から、互いに１塩基対、１０塩基対以下、５０塩基対以下、または１００塩基対以下などのある特定の距離以内にある内因性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一、または実質的に同一とすることができる。
【0156】
ヌクレアーゼゲノム編集システムは、クラスター化した規則的な間隔の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼまたはその誘導体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはその誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはその誘導体、およびホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）またはその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない、様々なヌクレアーゼを使用して、標的ゲノム遺伝子座を切断することができる。
【0157】
ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集システムを使用して、本明細書に記述されるエフェクター分子のうちの一つ以上をコードする操作された核酸などの、操作された核酸をコードするように宿主ゲノムを操作することができる。ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｍ． Ａｄｌｉ（“Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｔｏｏｌ ｋｉｔ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ；ｖｏｌｕｍｅ ９（２０１８），Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１９１１）に、より詳細に記述され、それが教示するすべてのために、参照により本明細書に組み込まれる。一般に、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼおよび特定の標的配列に切断を方向付けるＲＮＡを含む。例示的なＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集システムは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼならびにＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）ドメインおよびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）ドメインを有するＲＮＡからなるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。ｃｒＲＮＡは、典型的に、二つのＲＮＡドメイン：塩基対ハイブリダイゼーションを通じて標的配列（「定義されたヌクレオチド配列」）、例えば、ゲノム配列に特異性を方向付けるガイドＲＮＡ配列（ｇＲＮＡ）と、ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡドメインと、を有する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）と相互作用し、そしてそれによって、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）のゲノム遺伝子座への動員を促進することができる。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡポリヌクレオチドは、別個のポリヌクレオチドとすることができる。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチドとすることができ、また単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれる。Ｃａｓ９システムが本明細書に例証されるが、Ｃｐｆ１システムなどの他のＣＲＩＳＰＲシステムを使用することができる。ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９機能性変異体などのその誘導体、例えば、Ｃａｓ９酵素により典型的に産生される完全な二本鎖切断とは対照的に、一般に、定義されたヌクレオチド配列の一本鎖のみの切断を媒介するＣａｓ９「ニッカーゼ」変異体を含むことができる。
【0158】
一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムの成分は、互いに相互作用してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成して、配列特異的な切断を媒介する。一部のＣＲＩＳＰＲシステムでは、各成分を別個に産生し、かつ使用して、ＲＮＰ複合体を形成することができる。一部のＣＲＩＳＰＲシステムでは、各成分をインビトロで別個に産生し、そしてインビトロで互いに接触させて（すなわち、「複合体化させて」）ＲＮＰ複合体を形成することができる。インビトロで産生されたＲＮＰは、次に、細胞のサイトゾルおよび／または核、例えば、Ｔ細胞のサイトゾルおよび／または核へと導入（すなわち、「送達」）することができる。インビトロで産生されたＲＮＰ複合体は、電気穿孔、脂質媒介導入、物理的手段による細胞膜変形、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、および超音波処理が挙げられるが、これらに限定されない、様々な手段により細胞に送達することができる。特定の例では、インビトロで産生されたＲＮＰ複合体を、Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ／Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（登録商標）電気穿孔ベースの送達システム（Ｌｏｎｚａ（登録商標））を使用して細胞に送達することができる。他の電気穿孔システムとしては、ＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔システム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ電気穿孔システム、Ｎｅｏｎ電気穿孔システム、およびＢＴＸ電気穿孔が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９は、当業者に知られている様々なタンパク質産生技法を使用して、インビトロで産生（すなわち、合成および精製）することができる。ＣＲＩＳＰＲシステムＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡは、当業者に公知の様々なＲＮＡ生成技術、例えばインビトロ転写または化学合成などを使用して、インビトロで産生（すなわち、合成および精製）することができる。
【0159】
インビトロで産生されたＲＮＰ複合体は、ヌクレアーゼとｇＲＮＡとの異なる比で複合体化することができる。インビトロで産生されたＲＮＰ複合体はまた、ＣＲＩＳＰＲ媒介編集システムにおいて異なる量で使用することもできる。例えば、編集されることが望ましい細胞の数に依存して、反応において多数の細胞を編集するときに加えられるＲＮＰ複合体の量の低減などのように、加えられるＲＮＰの総量を調整することができる。
【0160】
一部のＣＲＩＳＰＲシステムでは、各成分（例えば、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ）は、ポリヌクレオチドによって別個にコードすることができ、各ポリヌクレオチドは一緒にまたは別個に細胞中に導入される。一部のＣＲＩＳＰＲシステムでは、各成分は、単一のポリヌクレオチド（すなわち、マルチプロモーターまたはマルチシストロンベクター、以下の例示的なマルチシストロンシステムの説明を参照のこと）によってコードすることができ、また細胞中に導入することができる。細胞内での各ポリヌクレオチドにコードされたＣＲＩＳＰＲ成分の発現（例えば、ヌクレアーゼの翻訳およびＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの転写）後、ＲＮＰ複合体を細胞内で形成させることができ、そして次に、部位特異的切断に方向付けることができる。
【0161】
一部のＲＮＰは、核の中へのＲＮＰの送達を促進する部分を有するように操作することができる。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインを有することができ、これによりＣａｓ９ ＲＮＰ複合体が、細胞のサイトゾル中に送達される場合、またはＣａｓ９の翻訳およびその後のＲＮＰ形成後に、ＮＬＳは、核の中へのＣａｓ９ ＲＮＰのさらなる輸送を促進することができる。
【0162】
本明細書に記述される、細胞は、非ウイルス方法を使用して操作することができ、例えば、本明細書に記述されるヌクレアーゼおよび／またはＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集システムは、非ウイルス方法を使用して細胞に送達することができる。本明細書に記述される細胞は、ウイルス方法を使用して操作することができ、例えば、本明細書に記述されるヌクレアーゼおよび／またはＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集システムは、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、または本明細書に記述されるその他のウイルスベースの送達方法のいずれかなどのウイルス方法を使用して細胞に送達することができる。
【0163】
一部のＣＲＩＳＰＲシステムでは、二つ以上のＣＲＩＳＰＲ組成物を提供することができ、これにより各々が、同じ遺伝子または一般的なゲノム遺伝子座を、標的ヌクレオチド配列より多くで別個に標的化する。例えば、二つの別個のＣＲＩＳＰＲ組成物を提供して、互いのある特定の距離内の二つの異なる標的ヌクレオチド配列において切断を方向付けることができる。一部のＣＲＩＳＰＲシステムでは、二つ以上のＣＲＩＳＰＲ組成物を提供することができ、これにより各々は、同じ遺伝子または一般的なゲノム遺伝子座の逆ストランドを別個に標的化する。例えば、二つの別個のＣＲＩＳＰＲ「ニッカーゼ」組成物を提供して、逆ストランドにおける同じ遺伝子または一般的なゲノム遺伝子座において切断を方向付けることができる。
【0164】
一般に、本明細書に記述されるＣＲＩＳＰＲ媒介編集システムの特徴を、他のヌクレアーゼベースのゲノム編集システムに適用することができる。ＴＡＬＥＮは、操作された部位特異的ヌクレアーゼであって、これは、ＴＡＬＥ（転写アクチベーター様エフェクター）のＤＮＡ結合ドメインおよび制限エンドヌクレアーゼＦｏｋｌの触媒ドメインで構成される。ＤＮＡ結合ドメインの単量体の高度に可変的な残基領域中に存在するアミノ酸を変化させることにより、異なる人工ＴＡＬＥＮを作製して様々なヌクレオチド配列を標的化することができる。ＤＮＡ結合ドメインは、その後、ヌクレアーゼを標的配列に方向付け、そして二本鎖切断を作製する。ＴＡＬＥＮベースのシステムは、米国特許出願シリアル番号第１２／９６５，５９０号、米国特許第８，４５０，４７１号、米国特許第８，４４０，４３１号、米国特許第８，４４０，４３２号、米国特許第１０，１７２，８８０号、および米国特許出願シリアル番号第１３／７３８，３８１号に、より詳細に記述され、それらのすべてが、それらの全体で参照により本明細書に組み込まれる。ＺＦＮベースの編集システムは、米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，５０３，７１７号；第６，６８９，５５８号；第７，０３０，２１５号；第６，７９４，１３６号；第７，０６７，３１７号；第７，２６２，０５４号；第７，０７０，９３４号；第７，３６１，６３５号；第７，２５３，２７３号；および米国特許公開第２００５／００６４４７４号；第２００７／０２１８５２８号；第２００５／０２６７０６１号に、より詳細に記述され、すべてが、すべての目的のためにそれらの全体で参照により本明細書に組み込まれる。
【0165】
他の操作送達システム
操作された核酸（例えば、本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子）を、本明細書に記述される脂質構造のうちのいずれかなどの細胞または他の標的レシピエント実体の中へと導入するための様々な追加の手段。
操作された核酸（例えば、本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子）を、本明細書に記述される脂質構造のうちのいずれかなどの細胞または他の標的レシピエント実体の中へと導入するための様々な追加の手段。
【0166】
電気穿孔を使用して、ポリヌクレオチドをレシピエント実体へと送達することができる。電気穿孔は、電界を適用して、標的細胞または実体の外膜またはシェルを一時的に透過させることを通じて、カーゴ／ペイロードを標的細胞または実体の内部コンパートメントの中に内在化させる方法である。一般に、この方法は、目的のカーゴ（例えば、本明細書に記述される、操作された核酸のうちのいずれか）を含む溶液中の二つの電極の間に細胞または標的実体を定置することを含む。細胞の脂質膜を次に、一過性の設定電圧を印加することにより破壊、すなわち、透過し、これは、カーゴが、細胞の細胞質などの実体の内部、に入ることを可能にする。細胞の例では、細胞の大部分ではない場合でも、少なくとも一部は生存可能なままである。細胞および他の実体は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで電気穿孔することができる。電気穿孔条件（例えば、細胞の数、カーゴの濃度、回復条件、電圧、時間、静電容量、パルスタイプ、パルス長さ、容積、キュベット長さ、電気穿孔溶液の組成など）は、細胞または他のレシピエント実体の種類、送達されるカーゴ、所望の内在化の効率、および所望の生存率が挙げられるがこれらに限定されない、いくつかの要因に依存して変動する。こうした基準の最適化は、当業者の範囲内である。様々なデバイスおよびプロトコルを電気穿孔のために使用することができる。例としては、Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクションシステム、ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）Ｆｌｏｗ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（商標）、Ｌｏｎｚａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システム、およびＢｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）電気穿孔システムが挙げられるが、これらに限定されない。
【0167】
操作された核酸（例えば、本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子）を細胞または他の標的レシピエント実体の中に導入するための他の手段としては、超音波処理、遺伝子銃、流体力学的注射、および物理的手段による細胞膜変形が挙げられるが、これらに限定されない。
【0168】
ネイキッドプラスミドまたはｍＲＮＡなどの操作されたｍＲＮＡをインビボで送達するための組成物および方法は、Ｋｏｗａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１９ Ａｐｒ １０；２７（４）：７１０－７２８）およびＫａｃｚｍａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ．２０１７；９：６０）に、詳細に記述され、各々は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0169】
使用方法
本明細書に記述されるようなキメラポリペプチド、ポリヌクレオチド分子、または細胞を使用する方法も、本開示に包含される。
本明細書に記述されるようなキメラポリペプチド、ポリヌクレオチド分子、または細胞を使用する方法も、本開示に包含される。
【0170】
一部の実施形態では、方法は、目的の遺伝子の抑制を阻害することを含む。抑制を阻害する方法は、（ｉ）本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードする発現カセットと、（ｉｉ）目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む発現システムを含む形質転換細胞を提供することと、キメラポリペプチドの発現に適した条件下で形質転換細胞を培養することと、形質転換細胞を、キメラポリペプチドの分解を促進するリガンドと接触させることによって、キメラポリペプチドの分解を誘導することと、を含んでもよい。
【0171】
一部の実施形態では、抑制を阻害することは、形質転換細胞をリガンドと接触させた後、リガンドと接触していない同等の形質転換細胞における目的の遺伝子の発現と比較して、形質転換細胞においてＩＴＭ応答性プロモーターに動作可能に連結された目的の遺伝子の発現の少なくとも１．５倍の増加、少なくとも２倍の増加、少なくとも３倍の増加、少なくとも４倍の増加、または少なくとも５倍の増加として測定可能である。
【0172】
一部の実施形態では、リガンドの非存在下で、目的の遺伝子の発現レベルは、ＩＴＭの非存在下での発現レベルと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、または少なくとも１０倍だけ、ＩＴＭによって抑制される。
【0173】
インビボ方法
本明細書に提供される方法はまた、例えば、インビボでのキメラポリペプチドの分解を誘導するリガンドを送達することによって、インビボでの転写抑制を阻害することも含む。
本明細書に提供される方法はまた、例えば、インビボでのキメラポリペプチドの分解を誘導するリガンドを送達することによって、インビボでの転写抑制を阻害することも含む。
【0174】
一部の実施形態では、形質転換細胞は、ヒトまたは動物にあり、また形質転換細胞をガンドと接触させることは、薬理学的用量のリガンドをヒトまたは動物に投与することを含む。一部の実施形態では、対象に投与されたリガンドは、ユビキチン経路を介したキメラポリペプチドの分解を促進する免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）。一部の実施形態では、ＩＭｉＤとしては、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドを挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＩＭｉＤはポマリドミドであり、１日当たり約１ｍｇ～１日当たり約５０ｍｇの濃度で対象に投与される。特定の実施形態では、非内因性リガンドは、１日当たり約４ｍｇの濃度で対象に投与される。
【0175】
医薬組成物
本開示のキメラポリペプチド、単離ポリヌクレオチド、および細胞は、医薬組成物の状態に製剤化することができる。これらの組成物は、操作された核酸または操作された細胞のうちの一つ以上に加えて、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知の他の材料を含むことができる。こうした材料は、非毒性でなければならず、また活性成分の有効性と干渉してはならない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内の経路に依存することができる。
本開示のキメラポリペプチド、単離ポリヌクレオチド、および細胞は、医薬組成物の状態に製剤化することができる。これらの組成物は、操作された核酸または操作された細胞のうちの一つ以上に加えて、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知の他の材料を含むことができる。こうした材料は、非毒性でなければならず、また活性成分の有効性と干渉してはならない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内の経路に依存することができる。
【0176】
個体に投与されるものが、細胞、ポリペプチド、核酸、小分子、または本開示による他の薬学的に有用な化合物であるかどうかに関わらず、投与は、好ましくは「治療有効量」または「予防有効量」（場合によっては、予防は治療と考えることもできる）であり、これは個体に利益を示すのに十分である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間的経過は、治療されるタンパク質凝集疾患の性質および重症度に依存するであろう。治療の処方、例えば、用量の決定などは、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、典型的に、治療されるべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、および開業医に知られている他の要因を考慮する。上記の技法およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に見出すことができる。
【0177】
組成物は、治療されるべき状態に応じて、単独で、または他の治療と組み合わせて、同時投与または逐次投与のいずれかとすることができる。
【0178】
追加的な実施形態
以下の段落は、追加的な列挙された実施形態を提供する。
以下の段落は、追加的な列挙された実施形態を提供する。
【0179】
実施形態１：
以下：
（ａ）転写リプレッサードメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）と、
（ｂ）デグロンと
を含むキメラポリペプチドであって、
デグロンが、ＩＴＭに動作可能に連結され、かつ
転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ抑制ドメイン、ＨＤＡＣ４ドメイン、ＳＣＸ ＨＬＨドメイン、ＩＤ１ ＨＬＨドメイン、ＨＥＲＣ２ Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ＴＷＳＴ１ ＨＬＨドメイン、ＮＫＸ２２ホメオドメイン、ＩＤ３ ＨＬＨドメイン、およびＴＷＳＴ２ ＨＬＨドメインからなる群から選択される、
キメラポリペプチド。
以下：
（ａ）転写リプレッサードメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）と、
（ｂ）デグロンと
を含むキメラポリペプチドであって、
デグロンが、ＩＴＭに動作可能に連結され、かつ
転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ抑制ドメイン、ＨＤＡＣ４ドメイン、ＳＣＸ ＨＬＨドメイン、ＩＤ１ ＨＬＨドメイン、ＨＥＲＣ２ Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ＴＷＳＴ１ ＨＬＨドメイン、ＮＫＸ２２ホメオドメイン、ＩＤ３ ＨＬＨドメイン、およびＴＷＳＴ２ ＨＬＨドメインからなる群から選択される、
キメラポリペプチド。
【0180】
実施形態２：
転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ抑制ドメインを含む、実施形態１に記載のキメラポリペプチド。
転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ抑制ドメインを含む、実施形態１に記載のキメラポリペプチド。
【0181】
実施形態３：
ＫＲＡＢ抑制ドメインが、ｍｉｎＫＲＡＢを含む、実施形態２に記載のキメラポリペプチド。
ＫＲＡＢ抑制ドメインが、ｍｉｎＫＲＡＢを含む、実施形態２に記載のキメラポリペプチド。
【0182】
実施形態４：
ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施形態１～３のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施形態１～３のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
【0183】
実施形態５：
ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントを含み、かつＷ２７Ｌ、Ｋ２８Ｌ、Ｄ３１Ａ、Ｔ３２Ａ、Ｑ３４Ａ、Ｑ３５Ａ、Ｒ３９Ｅ、Ｌ４３Ｓ、Ｔ５７Ｃ、Ｋ５８Ｃ、Ｐ５９Ｃ、Ｖ６１Ｙ、Ｉ６２Ｙ、Ｉ６２Ａ、Ｌ６３Ｗ、Ｌ６３Ｙ、Ｌ６３Ｅ、Ｒ６４Ｆ、Ｒ６４Ｗ、Ｒ６４Ｅ、Ｌ６５Ｆ、Ｌ６５Ｅ、Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｋ６７Ｆ、Ｇ６８Ｆ、およびＥ６９Ｆからなる群から選択される一つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態４に記載のキメラポリペプチド。
ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントを含み、かつＷ２７Ｌ、Ｋ２８Ｌ、Ｄ３１Ａ、Ｔ３２Ａ、Ｑ３４Ａ、Ｑ３５Ａ、Ｒ３９Ｅ、Ｌ４３Ｓ、Ｔ５７Ｃ、Ｋ５８Ｃ、Ｐ５９Ｃ、Ｖ６１Ｙ、Ｉ６２Ｙ、Ｉ６２Ａ、Ｌ６３Ｗ、Ｌ６３Ｙ、Ｌ６３Ｅ、Ｒ６４Ｆ、Ｒ６４Ｗ、Ｒ６４Ｅ、Ｌ６５Ｆ、Ｌ６５Ｅ、Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｋ６７Ｆ、Ｇ６８Ｆ、およびＥ６９Ｆからなる群から選択される一つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態４に記載のキメラポリペプチド。
【0184】
実施形態６：
ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントを含み、かつＱ３４Ａ／Ｑ３５Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｔ５７Ｃ／Ｋ５８Ｃ／Ｐ５９Ｃ、Ｄ３１Ａ／Ｔ３２Ａ、Ｌ６３Ｗ／Ｒ６４Ｗ／Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｌ６３Ｅ／Ｒ６４Ｅ／Ｌ６５Ｅ、Ｒ６４Ｆ／Ｌ６５Ｆ、Ｗ２７Ｌ／Ｋ２８Ｌ ＫＲＡＢ、Ｒ３９Ｅ、Ｋ６７Ｆ／Ｇ６８Ｆ／Ｅ６９Ｆ、およびＶ６１Ｙ／Ｉ６２Ｙ／Ｌ６３Ｙから選択される一つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態４に記載のキメラポリペプチド。
ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントを含み、かつＱ３４Ａ／Ｑ３５Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｔ５７Ｃ／Ｋ５８Ｃ／Ｐ５９Ｃ、Ｄ３１Ａ／Ｔ３２Ａ、Ｌ６３Ｗ／Ｒ６４Ｗ／Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｌ６３Ｅ／Ｒ６４Ｅ／Ｌ６５Ｅ、Ｒ６４Ｆ／Ｌ６５Ｆ、Ｗ２７Ｌ／Ｋ２８Ｌ ＫＲＡＢ、Ｒ３９Ｅ、Ｋ６７Ｆ／Ｇ６８Ｆ／Ｅ６９Ｆ、およびＶ６１Ｙ／Ｉ６２Ｙ／Ｌ６３Ｙから選択される一つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態４に記載のキメラポリペプチド。
【0185】
実施形態７：
ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、実施形態１～３のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、実施形態１～３のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
【0186】
実施形態８：
転写リプレッサードメインが、ＨＤＡＣ４抑制ドメインを含む、実施形態１に記載のキメラポリペプチド。
転写リプレッサードメインが、ＨＤＡＣ４抑制ドメインを含む、実施形態１に記載のキメラポリペプチド。
【0187】
実施形態９：ＨＤＡＣ４抑制ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態８に記載のキメラポリペプチド。
【0188】
実施形態１０：
ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む、実施形態１～９のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含む、実施形態１～９のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
【0189】
実施形態１１：
ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、かつジンクフィンガーモチーフのジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）で構成される、実施形態１０に記載のキメラポリペプチド。
ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、かつジンクフィンガーモチーフのジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）で構成される、実施形態１０に記載のキメラポリペプチド。
【0190】
実施形態１２：
ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含む、実施形態１１に記載のキメラポリペプチド。
ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含む、実施形態１１に記載のキメラポリペプチド。
【0191】
実施形態１３：
ＺＦタンパク質ドメインが、１～６個のジンクフィンガーモチーフを含む、実施形態１１に記載のキメラポリペプチド。
ＺＦタンパク質ドメインが、１～６個のジンクフィンガーモチーフを含む、実施形態１１に記載のキメラポリペプチド。
【0192】
実施形態１４：
ＺＦタンパク質ドメインが、配列番号５を含む、実施形態１３に記載のキメラポリペプチド。
ＺＦタンパク質ドメインが、配列番号５を含む、実施形態１３に記載のキメラポリペプチド。
【0193】
実施形態１５：
転写リプレッサードメインが、ＤＮＡ結合ドメインに対しＮ末端側である、実施形態１～１４のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
転写リプレッサードメインが、ＤＮＡ結合ドメインに対しＮ末端側である、実施形態１～１４のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
【0194】
実施形態１６：
転写リプレッサードメインが、ＤＮＡ結合ドメインに対しＣ末端側である、実施形態１～１４のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
転写リプレッサードメインが、ＤＮＡ結合ドメインに対しＣ末端側である、実施形態１～１４のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
【0195】
実施形態１７：
転写リプレッサードメインおよびＤＮＡ結合ドメインが、第１のペプチドリンカーによって隔てられている、実施形態１～１６のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
転写リプレッサードメインおよびＤＮＡ結合ドメインが、第１のペプチドリンカーによって隔てられている、実施形態１～１６のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
【0196】
実施形態１８：
第１のペプチドリンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＴ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含む、実施形態１７に記載のキメラポリペプチド。
第１のペプチドリンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＴ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含む、実施形態１７に記載のキメラポリペプチド。
【0197】
実施形態１９：
ＩＴＭが、合成転写調節因子である、実施形態１～１８のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
ＩＴＭが、合成転写調節因子である、実施形態１～１８のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
【0198】
実施形態２０：
デグロンが、ＨＣＶ ＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の二つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（ＳＰ２およびＮＢのタンデムリピート（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２）、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の四つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（ＳＰ１およびＳＰ２のタンデムリピート（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２）、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の三つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３ＡおよびＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１ Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２およびＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾体、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存的デグロン、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰ ＳＢＣドッキングモチーフ、ならびにＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスからなる群から選択される、実施形態１～１９のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
デグロンが、ＨＣＶ ＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の二つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（ＳＰ２およびＮＢのタンデムリピート（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２）、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の四つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（ＳＰ１およびＳＰ２のタンデムリピート（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２）、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の三つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３ＡおよびＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１ Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２およびＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾体、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存的デグロン、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰ ＳＢＣドッキングモチーフ、ならびにＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスからなる群から選択される、実施形態１～１９のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
【0199】
実施形態２１：
デグロンが、免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）に応答してＣＲＢＮを結合する能力を有するセレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメインを含む、実施形態１～２０のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
デグロンが、免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）に応答してＣＲＢＮを結合する能力を有するセレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメインを含む、実施形態１～２０のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
【0200】
実施形態２２：
ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、ＣＲＢＮの薬物誘導性結合の能力を有する、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＣＫｌａ、ＺＦＰ９１、ＧＳＰＴ１、ＭＥＩＳ２、ＧＳＳ Ｅ４Ｆ１、ＺＮ２７６、ＺＮ５１７、ＺＮ５８２、ＺＮ６５３、ＺＮ６５４、ＺＮ６９２、ＺＮ７８７およびＺＮ８２７、またはその断片からなる群から選択される、実施形態２１に記載のキメラポリペプチド。
ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、ＣＲＢＮの薬物誘導性結合の能力を有する、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＣＫｌａ、ＺＦＰ９１、ＧＳＰＴ１、ＭＥＩＳ２、ＧＳＳ Ｅ４Ｆ１、ＺＮ２７６、ＺＮ５１７、ＺＮ５８２、ＺＮ６５３、ＺＮ６５４、ＺＮ６９２、ＺＮ７８７およびＺＮ８２７、またはその断片からなる群から選択される、実施形態２１に記載のキメラポリペプチド。
【0201】
実施形態２３：
ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、天然のＣＲＢＮポリペプチド配列のキメラ融合産物を含む、実施形態２１または実施形態２２に記載のキメラポリペプチド。
ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、天然のＣＲＢＮポリペプチド配列のキメラ融合産物を含む、実施形態２１または実施形態２２に記載のキメラポリペプチド。
【0202】
実施形態２４：
ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、ＦＮＶＬＭＶＨＫＲＳＨＴＧＥＲＰＬＱＣＥＩＣＧＦＴＣＲＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬ（配列番号６）のアミノ酸配列を有するＩＫＺＦ３／ＺＦＰ９１／ＩＫＺＦ３キメラ融合産物を含む、実施形態２１に記載のキメラポリペプチド。
ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、ＦＮＶＬＭＶＨＫＲＳＨＴＧＥＲＰＬＱＣＥＩＣＧＦＴＣＲＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬ（配列番号６）のアミノ酸配列を有するＩＫＺＦ３／ＺＦＰ９１／ＩＫＺＦ３キメラ融合産物を含む、実施形態２１に記載のキメラポリペプチド。
【0203】
実施形態２５：
ＩＭｉＤが、ＦＤＡ承認薬物である、実施形態２１～２４のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
ＩＭｉＤが、ＦＤＡ承認薬物である、実施形態２１～２４のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
【0204】
実施形態２６：
ＩＭｉＤが、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドからなる群から選択される、実施形態２１～２５のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
ＩＭｉＤが、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドからなる群から選択される、実施形態２１～２５のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
【0205】
実施形態２７：
ＩＴＭが、デグロンに対しＮ末端側である、実施形態１～２６のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
ＩＴＭが、デグロンに対しＮ末端側である、実施形態１～２６のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
【0206】
実施形態２８：
ＩＴＭが、デグロンに対しＣ末端側である、実施形態１～２６のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
ＩＴＭが、デグロンに対しＣ末端側である、実施形態１～２６のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
【0207】
実施形態２９：
ＩＴＭが、第２のペプチドリンカーによってデグロンから隔てられている、実施形態１～２８のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
ＩＴＭが、第２のペプチドリンカーによってデグロンから隔てられている、実施形態１～２８のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
【0208】
実施形態３０：
第２のペプチドリンカーが、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７）、ＫＥＧＳ（配列番号８）、ＥＧＫ、ＥＡＡＡＫ（配列番号９）、およびＡＡＰＡＫＱＥ（配列番号１０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２９に記載のキメラポリペプチド。
第２のペプチドリンカーが、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７）、ＫＥＧＳ（配列番号８）、ＥＧＫ、ＥＡＡＡＫ（配列番号９）、およびＡＡＰＡＫＱＥ（配列番号１０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２９に記載のキメラポリペプチド。
【0209】
実施形態３１：
第２のペプチドリンカーが、ＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＰＡＡＫＡＥＡＰＡＡＡＰＡＡＫＡ（配列番号１２）およびＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２９に記載のキメラポリペプチド。
第２のペプチドリンカーが、ＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＰＡＡＫＡＥＡＰＡＡＡＰＡＡＫＡ（配列番号１２）およびＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２９に記載のキメラポリペプチド。
【0210】
実施形態３２：
実施形態１～３１のいずれか一つに記載のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット。
実施形態１～３１のいずれか一つに記載のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット。
【0211】
実施形態３３：
プロモーターが構成的プロモーターを含む、実施形態３２に記載の発現カセット。
プロモーターが構成的プロモーターを含む、実施形態３２に記載の発現カセット。
【0212】
実施形態３４：
構成的プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂからなる群から選択される、実施形態３３に記載の発現カセット。
構成的プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂからなる群から選択される、実施形態３３に記載の発現カセット。
【0213】
実施形態３５：
プロモーターが誘導性プロモーターを含む、実施形態３２に記載の発現カセット。
プロモーターが誘導性プロモーターを含む、実施形態３２に記載の発現カセット。
【0214】
実施形態３６：
誘導性プロモーターが、最小プロモーターと、ＮＦｋＢ応答要素、ＣＲＥＢ応答要素、ＮＦＡＴ応答要素、ＳＲＦ応答要素１、ＳＲＦ応答要素２、ＡＰ１応答要素、ＴＣＦ－ＬＥＦ応答要素プロモーター融合体、低酸素応答要素、ＳＭＡＤ結合要素、ＳＴＡＴ３結合部位、誘導因子分子応答性プロモーター、およびそれらのタンデムリピートからなる群から選択される応答要素と、を含む、実施形態３５に記載の発現カセット。
誘導性プロモーターが、最小プロモーターと、ＮＦｋＢ応答要素、ＣＲＥＢ応答要素、ＮＦＡＴ応答要素、ＳＲＦ応答要素１、ＳＲＦ応答要素２、ＡＰ１応答要素、ＴＣＦ－ＬＥＦ応答要素プロモーター融合体、低酸素応答要素、ＳＭＡＤ結合要素、ＳＴＡＴ３結合部位、誘導因子分子応答性プロモーター、およびそれらのタンデムリピートからなる群から選択される応答要素と、を含む、実施形態３５に記載の発現カセット。
【0215】
実施形態３７：
プロモーターが合成プロモーターを含む、実施形態３６に記載の発現カセット。
プロモーターが合成プロモーターを含む、実施形態３６に記載の発現カセット。
【0216】
実施形態３８：
キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡ不安定化要素を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらにコードする、実施形態３２～３７のいずれか一つに記載の発現カセット。
キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡ不安定化要素を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらにコードする、実施形態３２～３７のいずれか一つに記載の発現カセット。
【0217】
実施形態３９：
ｍＲＮＡ不安定化要素が、ＡＵリッチ要素およびステムループ不安定化要素からなる群から選択される、実施形態３８に記載の発現カセット。
ｍＲＮＡ不安定化要素が、ＡＵリッチ要素およびステムループ不安定化要素からなる群から選択される、実施形態３８に記載の発現カセット。
【0218】
実施形態４０：
実施形態３２～３９に記載の発現カセットと、目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む発現システム。
実施形態３２～３９に記載の発現カセットと、目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む発現システム。
【0219】
実施形態４１：
ＩＴＭ応答性プロモーターが、プロモーター配列と、ＩＴＭのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列と、を含む、実施形態４０に記載の発現システム。
ＩＴＭ応答性プロモーターが、プロモーター配列と、ＩＴＭのＤＮＡ結合ドメインに結合する配列と、を含む、実施形態４０に記載の発現システム。
【0220】
実施形態４２：
ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列が、一つ以上のジンクフィンガー結合部位を含む、実施形態４１に記載の発現システム。
ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列が、一つ以上のジンクフィンガー結合部位を含む、実施形態４１に記載の発現システム。
【0221】
実施形態４３：
ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列が、配列番号５４のアミノ酸配列を有する一つ以上のジンクフィンガー結合部位を含む、実施形態４２に記載の発現システム。
ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列が、配列番号５４のアミノ酸配列を有する一つ以上のジンクフィンガー結合部位を含む、実施形態４２に記載の発現システム。
【0222】
実施形態４４：
ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列が、四つのより多くのジンクフィンガー結合部位を含む、実施形態４２または実施形態４３に記載の発現システム。
ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列が、四つのより多くのジンクフィンガー結合部位を含む、実施形態４２または実施形態４３に記載の発現システム。
【0223】
実施形態４５：
ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列が、配列番号５５のアミノ酸配列を含む、実施形態４４に記載の発現システム。
ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列が、配列番号５５のアミノ酸配列を含む、実施形態４４に記載の発現システム。
【0224】
実施形態４６：
ＩＴＭ応答性プロモーターのプロモーター配列が、構成的プロモーター配列を含む、実施形態４０～４５のいずれか一つに記載の発現システム。
ＩＴＭ応答性プロモーターのプロモーター配列が、構成的プロモーター配列を含む、実施形態４０～４５のいずれか一つに記載の発現システム。
【0225】
実施形態４７：
構成的プロモーター配列が、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂからなる群から選択される、実施形態４６に記載の発現システム。
構成的プロモーター配列が、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂからなる群から選択される、実施形態４６に記載の発現システム。
【0226】
実施形態４８：
ＩＴＭ応答性プロモーターのプロモーター配列が、最小プロモーターを含む、実施形態４０～４７のいずれか一つに記載の発現システム。
ＩＴＭ応答性プロモーターのプロモーター配列が、最小プロモーターを含む、実施形態４０～４７のいずれか一つに記載の発現システム。
【0227】
実施形態４９：
ＩＴＭ応答性プロモーターが、合成プロモーターを含む、実施形態４０～４８のいずれか一つに記載の発現システム。
ＩＴＭ応答性プロモーターが、合成プロモーターを含む、実施形態４０～４８のいずれか一つに記載の発現システム。
【0228】
実施形態５０：
目的の遺伝子が、治療用ポリペプチドをコードする、実施形態４０～４９のいずれか一つに記載の発現システム。
目的の遺伝子が、治療用ポリペプチドをコードする、実施形態４０～４９のいずれか一つに記載の発現システム。
【0229】
実施形態５１：
目的の遺伝子が、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、細胞死制御因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子ａ、受容体、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、および酵素からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、実施形態４０～５０のいずれか一つに記載の発現システム。
目的の遺伝子が、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、細胞死制御因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子ａ、受容体、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、および酵素からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、実施形態４０～５０のいずれか一つに記載の発現システム。
【0230】
実施形態５２：
（ｉ）実施形態２８～３５のいずれかの発現カセットおよび（ｉｉ）標的発現カセットの両方を含む異種構築物を含む、実施形態４０～５１のいずれか一つに記載の発現システム。
（ｉ）実施形態２８～３５のいずれかの発現カセットおよび（ｉｉ）標的発現カセットの両方を含む異種構築物を含む、実施形態４０～５１のいずれか一つに記載の発現システム。
【0231】
実施形態５３：
実施形態３２～３９のいずれかに記載の発現カセットを含む第１の異種構築物と、標的発現カセットを含む第２の異種構築物と、を含む、実施形態４０～５１のいずれか一つに記載の発現システム。
実施形態３２～３９のいずれかに記載の発現カセットを含む第１の異種構築物と、標的発現カセットを含む第２の異種構築物と、を含む、実施形態４０～５１のいずれか一つに記載の発現システム。
【0232】
実施形態５４：
実施形態３２～３９のいずれか一つに記載の発現カセットを含む、単離された細胞。
実施形態３２～３９のいずれか一つに記載の発現カセットを含む、単離された細胞。
【0233】
実施形態５５：
実施形態４０～５３のいずれか一つに記載の発現システムを含む、単離された細胞。
実施形態４０～５３のいずれか一つに記載の発現システムを含む、単離された細胞。
【0234】
実施形態５６：
細胞が、ヒト細胞である、実施形態５４または５５に記載の単離された細胞。
細胞が、ヒト細胞である、実施形態５４または５５に記載の単離された細胞。
【0235】
実施形態５７：
細胞が、幹細胞である、実施形態５４～５６のいずれか一つに記載の単離された細胞。
細胞が、幹細胞である、実施形態５４～５６のいずれか一つに記載の単離された細胞。
【0236】
実施形態５８：
細胞が、免疫細胞である、実施形態５４～５６のいずれか一つに記載の単離された細胞。
細胞が、免疫細胞である、実施形態５４～５６のいずれか一つに記載の単離された細胞。
【0237】
実施形態５９：
細胞が、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、およびｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、実施形態５４～５６のいずれか一つに記載の単離された細胞。
細胞が、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、およびｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、実施形態５４～５６のいずれか一つに記載の単離された細胞。
【0238】
実施形態６０：
実施形態１～３１のいずれか一つに記載のキメラポリペプチドと、リガンドとを含み、リガンドのデグロンへの結合がキメラポリペプチドの分解を誘導し、それによって、目的の遺伝子の抑制を阻害し、目的の遺伝子が、ＩＴＭ応答性プロモーターに動作可能に連結される、目的の遺伝子の抑制を阻害するための遺伝子スイッチ。
実施形態１～３１のいずれか一つに記載のキメラポリペプチドと、リガンドとを含み、リガンドのデグロンへの結合がキメラポリペプチドの分解を誘導し、それによって、目的の遺伝子の抑制を阻害し、目的の遺伝子が、ＩＴＭ応答性プロモーターに動作可能に連結される、目的の遺伝子の抑制を阻害するための遺伝子スイッチ。
【0239】
実施形態６１：
リガンドが、ユビキチン経路を介したキメラポリペプチドの分解を促進する免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）を含む、実施形態６０に記載の遺伝子スイッチ。
リガンドが、ユビキチン経路を介したキメラポリペプチドの分解を促進する免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）を含む、実施形態６０に記載の遺伝子スイッチ。
【0240】
実施形態６２：
ＩＭｉＤが、ＦＤＡ承認薬物である、実施形態６１に記載の遺伝子スイッチ。
ＩＭｉＤが、ＦＤＡ承認薬物である、実施形態６１に記載の遺伝子スイッチ。
【0241】
実施形態６３：
ＩＭｉＤが、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドからなる群から選択される、実施形態６１または６２に記載の遺伝子スイッチ。
ＩＭｉＤが、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドからなる群から選択される、実施形態６１または６２に記載の遺伝子スイッチ。
【0242】
実施形態６４：
目的の遺伝子の抑制を阻害する方法であって、
（ａ）（ｉ）実施形態１～３１のいずれか一つに記載のキメラポリペプチドをコードする発現カセットと、（ｉｉ）目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む、発現システムを含む細胞を提供する工程と、
（ｂ）形質転換細胞を、キメラポリペプチドの分解を促進するリガンドと接触させることによって、キメラポリペプチドの分解を誘導する工程と
を含む、方法。
目的の遺伝子の抑制を阻害する方法であって、
（ａ）（ｉ）実施形態１～３１のいずれか一つに記載のキメラポリペプチドをコードする発現カセットと、（ｉｉ）目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む、発現システムを含む細胞を提供する工程と、
（ｂ）形質転換細胞を、キメラポリペプチドの分解を促進するリガンドと接触させることによって、キメラポリペプチドの分解を誘導する工程と
を含む、方法。
【0243】
実施形態６５：
キメラポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養する工程をさらに含む、実施形態６４に記載の方法。
キメラポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養する工程をさらに含む、実施形態６４に記載の方法。
【0244】
実施形態６６：
キメラポリペプチドをコードする発現カセットが、実施形態３２～３９のいずれか一つに記載の発現カセットを含む、実施形態６４または実施形態６５または実施形態６５に記載の方法。
キメラポリペプチドをコードする発現カセットが、実施形態３２～３９のいずれか一つに記載の発現カセットを含む、実施形態６４または実施形態６５または実施形態６５に記載の方法。
【0245】
実施形態６７：
発現システムが、実施形態４０～５３のいずれか一つに記載の発現システムを含む、実施形態６４～６６のいずれか一つに記載の方法。
発現システムが、実施形態４０～５３のいずれか一つに記載の発現システムを含む、実施形態６４～６６のいずれか一つに記載の方法。
【0246】
実施形態６８：
薬物で調節される転写抑制の能力を有する細胞を産生する方法であって、実施形態３２～３９のいずれか一つに記載の発現カセットまたは実施形態４０～５６のいずれか一つに記載の発現システムを用いて細胞を形質転換する工程を含む、方法。
薬物で調節される転写抑制の能力を有する細胞を産生する方法であって、実施形態３２～３９のいずれか一つに記載の発現カセットまたは実施形態４０～５６のいずれか一つに記載の発現システムを用いて細胞を形質転換する工程を含む、方法。
【実施例】
【0247】
以下は、本開示を実行するための特定の実施形態の実施例である。実施例は、あくまで例示の目的のために提供されるものにすぎず、本開示の範囲をいかなるやり方でも限定することを意図しない。努力が、使用される数（例えば、量、温度など）に関する正確さを確実にするためになされてきたが、当然のことながら、一部の実験の誤差および逸脱が、許容されるべきである。
【0248】
本開示の実施では、別途指示のない限り、当該技術の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技法、および薬理学の従来の方法が用いられるであろう。こうした技法は、文献で完全に説明される。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）、Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照のこと。
【0249】
実施例１ デグロン連結型ＤＮＡ結合剤の効率的な分解
薬物処理後のデグロン連結型ＤＮＡ結合剤の分解効率を評価した。
薬物処理後のデグロン連結型ＤＮＡ結合剤の分解効率を評価した。
【0250】
材料および方法
Ｕ８７－ＭＧ細胞を、表４に示されるように、各構築物をコードするレンチウイルス（各５０，０００ｐｇ、ｐ２４アッセイにより力価決定した）を用いて形質導入した（５０，０００細胞／形質導入）。各構築物フォーマットは、表４に記述される配列を用いて、５’から３’へと（Ｎ末端からＣ末端へのＯＲＦ）記述される。
Ｕ８７－ＭＧ細胞を、表４に示されるように、各構築物をコードするレンチウイルス（各５０，０００ｐｇ、ｐ２４アッセイにより力価決定した）を用いて形質導入した（５０，０００細胞／形質導入）。各構築物フォーマットは、表４に記述される配列を用いて、５’から３’へと（Ｎ末端からＣ末端へのＯＲＦ）記述される。
【0251】
【表4】
【0252】
形質導入後２日目に、各細胞群を、１μＭのポマリドミドの存在下または薬物の非存在下で７日間培養し、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）発現を蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって評価した。各細胞群（薬物を伴うまたは伴わない）のＢＦＰ発現を図１に示す。
【0253】
結果
免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）ポマリドミドに応答するユビキチン経路を介した分解を、セレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメイン（表４では「デグロン」と呼ばれる）を含む構築物について、様々な向きで、かつ様々なリンカーを使用して評価した。図１に示すように、試験した各構築物について、細胞の少なくとも４０％が、薬物の非存在下でＢＦＰ陽性であったのに対し、ポマリドミドの存在下では、１０％以下の細胞がＢＦＰ陽性であった。各構築物について、薬物の存在下でのＢＦＰ陽性細胞の割合を、薬物の非存在下でのＢＦＰ陽性細胞の割合と比較して、分解パーセントを決定した。表５は、試験された構築物の各々について分解パーセントを示す。結果は、構築物のＩＭｉＤ依存性分解を実証する。
免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）ポマリドミドに応答するユビキチン経路を介した分解を、セレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメイン（表４では「デグロン」と呼ばれる）を含む構築物について、様々な向きで、かつ様々なリンカーを使用して評価した。図１に示すように、試験した各構築物について、細胞の少なくとも４０％が、薬物の非存在下でＢＦＰ陽性であったのに対し、ポマリドミドの存在下では、１０％以下の細胞がＢＦＰ陽性であった。各構築物について、薬物の存在下でのＢＦＰ陽性細胞の割合を、薬物の非存在下でのＢＦＰ陽性細胞の割合と比較して、分解パーセントを決定した。表５は、試験された構築物の各々について分解パーセントを示す。結果は、構築物のＩＭｉＤ依存性分解を実証する。
【0254】
【表5】
【0255】
実施例２ 転写を誘導するためのデグロン連結型リプレッサーの分解
レポーター細胞株は、コアプロモーター配列の上流の四つのＺＦ１０－１結合部位で構成されるジンクフィンガー結合ドメインを有するＥＦ１コアプロモーター配列を含む、配列番号５６のＩＴＭ応答性プロモーターに連結されたｍＣｈｅｒｒｙをコードするレンチウイルスを用いてＵ８７－ＭＧ細胞を形質導入することによって産生された。
レポーター細胞株は、コアプロモーター配列の上流の四つのＺＦ１０－１結合部位で構成されるジンクフィンガー結合ドメインを有するＥＦ１コアプロモーター配列を含む、配列番号５６のＩＴＭ応答性プロモーターに連結されたｍＣｈｅｒｒｙをコードするレンチウイルスを用いてＵ８７－ＭＧ細胞を形質導入することによって産生された。
【0256】
レポーターのタンパク質発現を調節するデグロン連結型リプレッサーの能力を、形質導入アッセイによって評価した。
【0257】
材料および方法
レポーター細胞株は、コアプロモーター配列の上流の四つのＺＦ１０－１結合部位で構成されるジンクフィンガー結合ドメインを有するＥＦ１ａコアプロモーター配列を含む、配列番号５６のＩＴＭ応答性プロモーターに連結されたｍＣｈｅｒｒｙをコードするレンチウイルスを用いてＵ８７－ＭＧ細胞を形質導入することによって産生された。レポーター細胞を、表６に示されるように、各構築物をコードするレンチウイルス（各５０，０００ｐｇ、ｐ２４アッセイにより力価決定した）を用いて形質導入した（５０，０００細胞／形質導入）。各構築物フォーマットは、５’から３’へと（Ｎ末端からＣ末端へのＯＲＦ）記述される。構築物ＳＢ０３７５７およびＳＢ０３７６０は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に最適化されたコドンであるｍｉｎＫｒａｂ抑制ドメイン、ならびに構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７６１を含む。構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７６１については、構築物全体を大腸菌に対してコドン最適化した。
レポーター細胞株は、コアプロモーター配列の上流の四つのＺＦ１０－１結合部位で構成されるジンクフィンガー結合ドメインを有するＥＦ１ａコアプロモーター配列を含む、配列番号５６のＩＴＭ応答性プロモーターに連結されたｍＣｈｅｒｒｙをコードするレンチウイルスを用いてＵ８７－ＭＧ細胞を形質導入することによって産生された。レポーター細胞を、表６に示されるように、各構築物をコードするレンチウイルス（各５０，０００ｐｇ、ｐ２４アッセイにより力価決定した）を用いて形質導入した（５０，０００細胞／形質導入）。各構築物フォーマットは、５’から３’へと（Ｎ末端からＣ末端へのＯＲＦ）記述される。構築物ＳＢ０３７５７およびＳＢ０３７６０は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に最適化されたコドンであるｍｉｎＫｒａｂ抑制ドメイン、ならびに構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７６１を含む。構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７６１については、構築物全体を大腸菌に対してコドン最適化した。
【0258】
【表6】
【0259】
形質導入後２日目に、細胞を、１μＭのポマリドミドの存在下または薬物の非存在下のいずれかでインキュベートした。薬物処理の５日目に、細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙ発現について蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によってアッセイした。
【0260】
結果
デグロン連結型プロモーター調節を、セレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメイン（ｄ９１３）を含む構築物について、様々な向きで、かつ様々なＫｒａｂ由来抑制ドメイン、リンカー、およびｍＲＮＡ不安定化要素を使用して評価した。各条件に対するｍＣｈｅｒｒｙの幾何学的平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、図２に示す。無薬物条件対ポマリドミド治療条件に対するｍＣｈｅｒｒｙの幾何学的ＭＦＩとの間の倍率差を、図３に示すように計算した。図３に示すように、抑制の薬物誘導性解放は、ポマリドミド治療に応答して、構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９を用いて可能であった。ＳＢ０３７５８で形質導入された細胞に対する、ポマリドミドの存在下または非存在下での、ならびに非形質導入細胞（レポーターを欠く）およびリプレッサーで形質導入されていないレポーター細胞と比較したｍＣｈｅｒｒｙ発現のヒストグラムプロットを、図４Ａに示す。ＳＢ０３７５９で形質導入された細胞に対する、ポマリドミドの存在下または非存在下での、ならびに非形質導入細胞（レポーターを欠く）およびリプレッサーで形質導入されていないレポーター細胞と比較したｍＣｈｅｒｒｙ発現のヒストグラムプロットを、図４Ｂに示す。図４Ａおよび図４Ｂに示すヒストグラムプロットは、ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９による抑制が、薬物依存的な様態で調節可能であることを実証する。
デグロン連結型プロモーター調節を、セレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメイン（ｄ９１３）を含む構築物について、様々な向きで、かつ様々なＫｒａｂ由来抑制ドメイン、リンカー、およびｍＲＮＡ不安定化要素を使用して評価した。各条件に対するｍＣｈｅｒｒｙの幾何学的平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、図２に示す。無薬物条件対ポマリドミド治療条件に対するｍＣｈｅｒｒｙの幾何学的ＭＦＩとの間の倍率差を、図３に示すように計算した。図３に示すように、抑制の薬物誘導性解放は、ポマリドミド治療に応答して、構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９を用いて可能であった。ＳＢ０３７５８で形質導入された細胞に対する、ポマリドミドの存在下または非存在下での、ならびに非形質導入細胞（レポーターを欠く）およびリプレッサーで形質導入されていないレポーター細胞と比較したｍＣｈｅｒｒｙ発現のヒストグラムプロットを、図４Ａに示す。ＳＢ０３７５９で形質導入された細胞に対する、ポマリドミドの存在下または非存在下での、ならびに非形質導入細胞（レポーターを欠く）およびリプレッサーで形質導入されていないレポーター細胞と比較したｍＣｈｅｒｒｙ発現のヒストグラムプロットを、図４Ｂに示す。図４Ａおよび図４Ｂに示すヒストグラムプロットは、ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９による抑制が、薬物依存的な様態で調節可能であることを実証する。
【0261】
実施例３ デグロン連結型リプレッサーの分解の最適化
抑制の薬物誘導性解放を最適化するように操作された構築物をアッセイして、分解効率を直接試験した。
抑制の薬物誘導性解放を最適化するように操作された構築物をアッセイして、分解効率を直接試験した。
【0262】
材料および方法
実施例２に記述されるようなレポーター細胞を、表７に示されるように、各構築物をコードするレンチウイルス（各５０，０００ｐｇ、ｐ２４アッセイにより力価決定した）を用いて形質導入した（５０，０００細胞／形質導入）、または陰性対照として形質導入しなかった。各構築物フォーマットは、５’から３’へと（Ｎ末端からＣ末端へのＯＲＦ）記述される。ＳＢ０３７４７およびＳＢ０３７５０の両方は、３’末端にｍＲＮＡ不安定化タグＡｕＳＬＤＥを含む。形質導入の７日後で、かつ１μＭのポマリドミドの存在下、または薬物の非存在下での５日間の処置で、ＢＦＰを蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析によって測定した。
実施例２に記述されるようなレポーター細胞を、表７に示されるように、各構築物をコードするレンチウイルス（各５０，０００ｐｇ、ｐ２４アッセイにより力価決定した）を用いて形質導入した（５０，０００細胞／形質導入）、または陰性対照として形質導入しなかった。各構築物フォーマットは、５’から３’へと（Ｎ末端からＣ末端へのＯＲＦ）記述される。ＳＢ０３７４７およびＳＢ０３７５０の両方は、３’末端にｍＲＮＡ不安定化タグＡｕＳＬＤＥを含む。形質導入の７日後で、かつ１μＭのポマリドミドの存在下、または薬物の非存在下での５日間の処置で、ＢＦＰを蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析によって測定した。
【0263】
【表7】
【0264】
結果
図５に示すように、構築物ＳＢ０３７４７およびＳＢ０３７５０は、１μＭのポマリドミドを用いた処理に伴い、それぞれ８１．３％および７２．５％の分解パーセントを示した。それ故に、両方の構築物は、ポマリドミド処理後に効率的に分解される。
図５に示すように、構築物ＳＢ０３７４７およびＳＢ０３７５０は、１μＭのポマリドミドを用いた処理に伴い、それぞれ８１．３％および７２．５％の分解パーセントを示した。それ故に、両方の構築物は、ポマリドミド処理後に効率的に分解される。
【0265】
実施例４ 転写を誘導する様々な構築物の向きを有するデグロン連結型リプレッサーの分解
レポーター発現を調節する様々な向きを有するデグロン連結型リプレッサーの能力を、形質導入アッセイによって評価した。
レポーター発現を調節する様々な向きを有するデグロン連結型リプレッサーの能力を、形質導入アッセイによって評価した。
【0266】
材料および方法
レポーター細胞株を、実施例２に記述されるように産生した。レポーター細胞を、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）に対するデグロンＮ末端を有する構築物（表８）、またはＩＴＭに対するデグロンＣ末端を有する構築物（表９）のいずれかをコードするレンチウイルス（各５０，０００ｐｇ、ｐ２４アッセイにより力価決定した）を用いて形質導入した（５０，０００細胞／形質導入）。実施例２で記述されるような構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９も、この実験に含まれた。各構築物フォーマットは、５’から３’へと（Ｎ末端からＣ末端へのＯＲＦ）記述される。
レポーター細胞株を、実施例２に記述されるように産生した。レポーター細胞を、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）に対するデグロンＮ末端を有する構築物（表８）、またはＩＴＭに対するデグロンＣ末端を有する構築物（表９）のいずれかをコードするレンチウイルス（各５０，０００ｐｇ、ｐ２４アッセイにより力価決定した）を用いて形質導入した（５０，０００細胞／形質導入）。実施例２で記述されるような構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９も、この実験に含まれた。各構築物フォーマットは、５’から３’へと（Ｎ末端からＣ末端へのＯＲＦ）記述される。
【0267】
【表8】
【0268】
【表9】
【0269】
形質導入後２日目に、各構築物を用いて遺伝子導入した細胞を、１μＭのポマリドミドの存在下または薬物の非存在下のいずれかでインキュベートした。薬物処理の５日目に、細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙ発現について蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によってアッセイした。各条件に対するｍＣｈｅｒｒｙの幾何学的平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、Ｎ末端にデグロンを有する各構築物について、図６Ａに示す。無薬物条件対ポマリドミド治療条件に対するｍＣｈｅｒｒｙの幾何学的ＭＦＩとの間の倍率差を、Ｎ末端にデグロンを有する各構築物について、図６Ｂに示すように計算した。各条件に対するｍＣｈｅｒｒｙの幾何学的平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、Ｃ末端にデグロンを有する各構築物について、図７Ａに示す。無薬物条件対ポマリドミド治療条件に対するｍＣｈｅｒｒｙの幾何学的ＭＦＩとの間の倍率差を、Ｃ末端にデグロンを有する各構築物について、図７Ｂに示すように計算した。
【0270】
結果
デグロン連結型プロモーター調節を、セレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメイン（ｄ９１３）を含む構築物について、様々な向きで、かつ様々な抑制ドメイン、リンカー、およびｍＲＮＡ不安定化要素を使用して評価した。図６Ａに示すように、ＨＤＡＣ４リプレッサードメインを有し、かつＮ末端にデグロンを有するデグロン連結型リプレッサーは、薬物の非存在下でレポーター発現を抑制する能力を有し、また薬物の存在下で誘導されたレポーター発現によって示されるように抑制が解放された。加えて、図６Ａは、実施例２で実証されるように、構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９による抑制の可逆性を確認する。図６Ｂに示すように、ＨＤＡＣ４リプレッサードメインを有し、かつＮ末端にデグロンを有するデグロン連結型リプレッサー、および構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９は、各々薬物の非存在と比較して、薬物の存在下でレポーター発現において少なくとも４倍の増加を実証する。図７Ａに示すように、ＨＤＡＣ４リプレッサードメインを有し、かつＣ末端にデグロンを有するデグロン連結型リプレッサーは、薬物の非存在下でレポーター発現を抑制する能力を有し、また薬物の存在下で誘導されたレポーター発現によって示されるように抑制は可逆的であった。加えて、図７Ａは、図６Ａに示すように構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９を構築する別の確認を提供し、また実施例２でも実証される。図７Ｂに示すように、ＨＤＡＣ４リプレッサードメインを有し、かつＣ末端にデグロンを有するデグロン連結型リプレッサー、および構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９は、各々薬物の非存在と比較して、薬物の存在下でレポーター発現において少なくとも４倍の増加を実証する。したがって、データは、薬物依存性の調節可能な様式で転写を抑制する能力を有する構築物を実証する。
デグロン連結型プロモーター調節を、セレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメイン（ｄ９１３）を含む構築物について、様々な向きで、かつ様々な抑制ドメイン、リンカー、およびｍＲＮＡ不安定化要素を使用して評価した。図６Ａに示すように、ＨＤＡＣ４リプレッサードメインを有し、かつＮ末端にデグロンを有するデグロン連結型リプレッサーは、薬物の非存在下でレポーター発現を抑制する能力を有し、また薬物の存在下で誘導されたレポーター発現によって示されるように抑制が解放された。加えて、図６Ａは、実施例２で実証されるように、構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９による抑制の可逆性を確認する。図６Ｂに示すように、ＨＤＡＣ４リプレッサードメインを有し、かつＮ末端にデグロンを有するデグロン連結型リプレッサー、および構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９は、各々薬物の非存在と比較して、薬物の存在下でレポーター発現において少なくとも４倍の増加を実証する。図７Ａに示すように、ＨＤＡＣ４リプレッサードメインを有し、かつＣ末端にデグロンを有するデグロン連結型リプレッサーは、薬物の非存在下でレポーター発現を抑制する能力を有し、また薬物の存在下で誘導されたレポーター発現によって示されるように抑制は可逆的であった。加えて、図７Ａは、図６Ａに示すように構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９を構築する別の確認を提供し、また実施例２でも実証される。図７Ｂに示すように、ＨＤＡＣ４リプレッサードメインを有し、かつＣ末端にデグロンを有するデグロン連結型リプレッサー、および構築物ＳＢ０３７５８およびＳＢ０３７５９は、各々薬物の非存在と比較して、薬物の存在下でレポーター発現において少なくとも４倍の増加を実証する。したがって、データは、薬物依存性の調節可能な様式で転写を抑制する能力を有する構築物を実証する。
【0271】
【表10】
【0272】
実施例５ ＩＭｉＤ－ＯｎシステムにおけるＩＬ－１２ペイロードのＩＭｉＤ調節された発現
ＩＬ－１２ペイロードのＩＭｉＤ調節された発現の効率を、ＩＭｉＤの添加が、デグロン連結型リプレッサーの分解を通してＩＬ－１２の発現を増加させるシステムで評価した。
ＩＬ－１２ペイロードのＩＭｉＤ調節された発現の効率を、ＩＭｉＤの添加が、デグロン連結型リプレッサーの分解を通してＩＬ－１２の発現を増加させるシステムで評価した。
【0273】
材料および方法
形質導入の１８～１４時間前に５０，０００個のＵ８７ＭＧ細胞を２４ｗ皿に播種し、次いで２５ｋｐｇのデグロン連結型リプレッサー（ＳＢ０３７５９、ＳＢ０３９３６、またはＳＢ０４３９７）および２５ｋｐｇのＩＬ１２レポーター構築物（ＳＢ０４６４０）で形質導入した（ウイルスはｐ２４ ＥＬＩＳＡによって定量された）。ＥＦＳプロモーター配列（配列番号６７）の上流の四つのＺＦ１０－１結合部位で構成されるジンクフィンガー結合ドメインを有するＥＦＳプロモーター配列を含むＩＴＭ応答性プロモーターに連結されたＩＬ－１２をコードする構築物が、レポーターとして使用された。
形質導入の１８～１４時間前に５０，０００個のＵ８７ＭＧ細胞を２４ｗ皿に播種し、次いで２５ｋｐｇのデグロン連結型リプレッサー（ＳＢ０３７５９、ＳＢ０３９３６、またはＳＢ０４３９７）および２５ｋｐｇのＩＬ１２レポーター構築物（ＳＢ０４６４０）で形質導入した（ウイルスはｐ２４ ＥＬＩＳＡによって定量された）。ＥＦＳプロモーター配列（配列番号６７）の上流の四つのＺＦ１０－１結合部位で構成されるジンクフィンガー結合ドメインを有するＥＦＳプロモーター配列を含むＩＴＭ応答性プロモーターに連結されたＩＬ－１２をコードする構築物が、レポーターとして使用された。
【0274】
ポマリドミド滴定実験については、形質導入の２日後、細胞を薬物を含まない培地条件または１ｕＭのポマリドミド条件へと分割した。次いで３日後、各条件の１００ｋの細胞を２４ｗプレートに播種し、２４時間後、上清を収集し、そしてＩＬ１２ ｐ７０ ＥＬＩＳＡキット（＃Ｄ１２００ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してアッセイして、ＩＬ－１２を定量した。
【0275】
動態実験研究については、形質導入細胞を、２４ｗプレートにウェル当たり１００ｋの細胞を播種した。次いで２４時間後、上清を、薬物を含まないもの、または１ｕＭのポマリドミドもしくはイベルドミドで置き換えた。上清を、薬物処理後の指示された経過時間（３時間、６時間、１２時間、１６時間、および２４時間）において採取した。
【0276】
評価した構築物を表１１に示す。各構築物フォーマットは、表１１に記述される配列を用いて、５’から３’へと（Ｎ末端からＣ末端へのＯＲＦ）記述される。構築物の配列を、表１２に示す。
【0277】
【表11】
【0278】
結果
免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）ポマリドミドに応答して調節されたＩＬ－１２発現を、様々な向きのｄ９１３デグロンを含む構築物について評価し、そしてＩＭｉＤの添加が、ペイロード（「ＩＭｉＤ ＯＮ」）の発現の増加をもたらすデグロン連結型リプレッサーの分解につながる薬物で調節可能なシステムのための様々なリンカーを使用した。
免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）ポマリドミドに応答して調節されたＩＬ－１２発現を、様々な向きのｄ９１３デグロンを含む構築物について評価し、そしてＩＭｉＤの添加が、ペイロード（「ＩＭｉＤ ＯＮ」）の発現の増加をもたらすデグロン連結型リプレッサーの分解につながる薬物で調節可能なシステムのための様々なリンカーを使用した。
【0279】
デグロン連結型リプレッサーは、転写リプレッサーおよび薬物の非存在下でＩＬ－１２に動作可能に連結されたプロモーターに結合するＤＮＡ結合ドメインを特徴とする誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）を通して、薬物を含まない条件下でペイロードＩＬ－１２の発現を抑制するように構築された。ＩＴＭは、転写抑制が、ＩＭｉＤポマリドミドの添加に伴いデグロン連結型ＩＴＭが分解されたときに放出されるように、デグロンに連結される。
【0280】
三つの異なるデグロン連結型リプレッサーを、薬物を含まない条件下で、またはポマリドミドの増加する濃度（１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、および１ｕＭ）でＩＬ－１２発現を調節するその能力について評価した。図８に示すように、ＩＬ－１２発現は、構築物ＳＢ０３９３６およびＳＢ０４３９７に対するＩＭＩＤの添加に伴い増加した。ＩＬ－１２レベルを上のパネルに示す。下のパネルには、増加する濃度のポマリドミドの添加を用いてデグロン連結型リプレッサーが分解されたときの、非抑制レベルへのＩＬ－１２回復発現の定量が示されている。ＩＬ－１２レベルは、構成的ＩＬ－１２レポーターを用いて形質導入された細胞内の定量されたＩＬ１２発現レベルの画分として表示される。ＩＬ－１２発現は、ＳＢ０４３９７デグロン連結型リプレッサーによって調節され、かつ１０ｎＭ以上の濃度のポマリドミドで処理された細胞においてレポーターのみのレベルに回復する。結果は、ＩＬ－１２産生のＩＭｉＤ依存性調節を実証し、ＩＭｉＤの添加は、デグロン連結型リプレッサーを特徴とする「ＩＭｉＤ－ＯＮ」システムにおけるＩＬ－１２の発現を増加させた。
【0281】
次いで、デグロン連結型リプレッサーＳＢ０４３９７について動態を評価した。ＩＭｉＤのポマリドミドおよびイベルドミドも比較した。図９に示すように、ＩＬ－１２発現レベルは、レポーターのみの対照（右の列）と比較して、ＩＬ－１２レポーターＳＢ０４６４０およびデグロン連結型リプレッサーＳＢ０４３９７（左の列）の両方を用いて導入された細胞に対して、１ｕＭのポマリドミド処理（上のパネル）および１ｕＭのイベルドミド処理（下のパネル）の両方について、細胞から収集された上清において経時的に増加した。デグロン連結型リプレッサーＳＢ０４３９７およびＩＭｉＤポマリドミドについて、追加の時点で動態をさらに評価した。図１０に示すように、ＩＬ－１２発現レベル（ＳＢ０４６４０レポーターのみを用いて形質導入された細胞内でＩＬ－１２発現レベルへと正規化して評価されたとして）は、１ｕＭのポマリドミドの添加に伴い、１２時間および１６時間でＩＬ－１２発現の増加を実証した。これらの結果は、ＩＭｉＤ ＯＮスイッチの迅速な活性化を示し、ＩＬ－１２の発現は、ＩＭｉＤを添加し、かつデグロン連結型リプレッサーの分解を開始してから２４時間以内に検出された。
【0282】
【表12】
【0283】
本開示は、好ましい実施形態および様々な代替的な実施形態を参照して特異的に示され、説明されているが、本開示および添付の請求項の趣旨および範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更が、その中に行うことができることは、当業者によって理解されるであろう。
【0284】
本明細書の本文内で引用されたすべての参考文献、取得済み特許および特許出願は、すべての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下：（ａ）転写リプレッサードメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）と、
（ｂ）デグロンと
を含むキメラポリペプチドであって、
前記デグロンが、前記ＩＴＭに動作可能に連結され、かつ
前記転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ抑制ドメイン、ＨＤＡＣ４ドメイン、ＳＣＸ ＨＬＨドメイン、ＩＤ１ ＨＬＨドメイン、ＨＥＲＣ２ Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ＴＷＳＴ１ ＨＬＨドメイン、ＮＫＸ２２ホメオドメイン、ＩＤ３ ＨＬＨドメイン、およびＴＷＳＴ２ ＨＬＨドメインからなる群から選択される、
キメラポリペプチド。
【請求項2】
前記転写リプレッサードメインが、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインを含み、任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、ｍｉｎＫＲＡＢを含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントを含み、かつＷ２７Ｌ、Ｋ２８Ｌ、Ｄ３１Ａ、Ｔ３２Ａ、Ｑ３４Ａ、Ｑ３５Ａ、Ｒ３９Ｅ、Ｌ４３Ｓ、Ｔ５７Ｃ、Ｋ５８Ｃ、Ｐ５９Ｃ、Ｖ６１Ｙ、Ｉ６２Ｙ、Ｉ６２Ａ、Ｌ６３Ｗ、Ｌ６３Ｙ、Ｌ６３Ｅ、Ｒ６４Ｆ、Ｒ６４Ｗ、Ｒ６４Ｅ、Ｌ６５Ｆ、Ｌ６５Ｅ、Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｋ６７Ｆ、Ｇ６８Ｆ、およびＥ６９Ｆからなる群から選択される一つ以上のアミノ酸置換を含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントを含み、かつＱ３４Ａ／Ｑ３５Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｔ５７Ｃ／Ｋ５８Ｃ／Ｐ５９Ｃ、Ｄ３１Ａ／Ｔ３２Ａ、Ｌ６３Ｗ／Ｒ６４Ｗ／Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｌ６３Ｅ／Ｒ６４Ｅ／Ｌ６５Ｅ、Ｒ６４Ｆ／Ｌ６５Ｆ、Ｗ２７Ｌ／Ｋ２８Ｌ ＫＲＡＢ、Ｒ３９Ｅ、Ｋ６７Ｆ／Ｇ６８Ｆ／Ｅ６９Ｆ、およびＶ６１Ｙ／Ｉ６２Ｙ／Ｌ６３Ｙから選択される一つ以上のアミノ酸置換を含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項3】
前記転写リプレッサードメインが、前記ＨＤＡＣ４抑制ドメインを含み、任意選択的に、前記ＨＤＡＣ４抑制ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項4】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、かつジンクフィンガーモチーフのジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）で構成され、
任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含み、
任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、６個のジンクフィンガーモチーフを含み、
任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、配列番号５を含む、
請求項１～３のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項5】
ａ．前記転写リプレッサードメインが、前記ＤＮＡ結合ドメインに対しＮ末端側または前記ＤＮＡ結合ドメインに対しＣ末端側であり、かつ／または、ｂ．前記転写リプレッサードメインおよび前記ＤＮＡ結合ドメインが、第１のペプチドリンカーによって隔てられ、
任意選択的に、前記第１のペプチドリンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＴ（配列番号６０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または、
ｃ．前記ＩＴＭが、合成転写調節因子である、
請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項6】
（ａ）前記デグロンが、ＨＣＶ ＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の二つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（ＳＰ２およびＮＢのタンデムリピート（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２）、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の四つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（ＳＰ１およびＳＰ２のタンデムリピート（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２）、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の三つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３ＡおよびＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１ Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２およびＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾体、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存的デグロン（「ＤＳＧｘｘＳ」は配列番号６８として記載）、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰ ＳＢＣドッキングモチーフ、ならびにＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスからなる群から選択され、かつ／または（ｂ）前記デグロンが、免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）に応答してＣＲＢＮに結合する能力を有するセレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメインを含み、
任意選択的に、前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、ＣＲＢＮの薬物誘導性結合の能力を有する、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＣＫｌａ、ＺＦＰ９１、ＧＳＰＴ１、ＭＥＩＳ２、ＧＳＳ Ｅ４Ｆ１、ＺＮ２７６、ＺＮ５１７、ＺＮ５８２、ＺＮ６５３、ＺＮ６５４、ＺＮ６９２、ＺＮ７８７およびＺＮ８２７、またはその断片からなる群から選択され、
任意選択的に、前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、天然ＣＲＢＮポリペプチド配列のキメラ融合産物を含み、
任意選択的に、前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、ＦＮＶＬＭＶＨＫＲＳＨＴＧＥＲＰＬＱＣＥＩＣＧＦＴＣＲＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬ（配列番号６）のアミノ酸配列を有するＩＫＺＦ３／ＺＦＰ９１／ＩＫＺＦ３キメラ融合産物を含み、かつ／または、
（ｃ）前記ＩＭｉＤが、ＦＤＡ承認薬物であり、
任意選択的に、前記ＩＭＩＤが、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドからなる群から選択され、
任意選択的に、前記ＩＴＭが、前記デグロンに対しＮ末端側または前記デグロンに対しＣ末端側であり、
任意選択的に、前記ＩＴＭが、第２のペプチドリンカーによって前記デグロンから隔てられ、
任意選択的に、前記第２のペプチドリンカーが、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７）、ＫＥＧＳ（配列番号８）、ＥＧＫ、ＥＡＡＡＫ（配列番号９）、およびＡＡＰＡＫＱＥ（配列番号１０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または前記第２のペプチドリンカーが、ＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＰＡＡＫＡＥＡＰＡＡＡＰＡＡＫＡ（配列番号１２）およびＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～５のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットであって、任意選択的に、前記プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターを含むか、または前記プロモーターが、誘導性プロモーターを含み、任意選択的に、前記誘導性プロモーターが、最小プロモーターと、ＮＦｋＢ応答要素、ＣＲＥＢ応答要素、ＮＦＡＴ応答要素、ＳＲＦ応答要素１、ＳＲＦ応答要素２、ＡＰ１応答要素、ＴＣＦ－ＬＥＦ応答要素プロモーター融合体、低酸素応答要素、ＳＭＡＤ結合要素、ＳＴＡＴ３結合部位、誘導因子分子応答性プロモーター、およびそのタンデムリピートからなる群から選択される応答要素と、を含み、
任意選択的に、前記プロモーターが合成プロモーターを含み、
任意選択的に、前記キメラポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡ不安定化要素を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらにコードし、
任意選択的に、前記ｍＲＮＡ不安定化要素が、ＡＵリッチ要素およびステムループ不安定化要素からなる群から選択される、
発現カセット。
【請求項8】
請求項７に記載の発現カセットと、目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む発現システムであって、任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターが、プロモーター配列および前記ＩＴＭの前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、一つ以上のジンクフィンガー結合部位を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、配列番号５４のアミノ酸配列を有する一つ以上のジンクフィンガー結合部位を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、四つのより多くのジンクフィンガー結合部位を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターの前記プロモーター配列が、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーター配列を含み、
任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターの前記プロモーター配列が、最小プロモーターを含み、
任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターが合成プロモーターを含み、
任意選択的に、目的の遺伝子が、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、細胞死制御因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子ａ、受容体、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、および酵素からなる群から選択される治療用ポリペプチドをコードし、
任意選択的に、前記発現システムが、（ｉ）請求項７に記載の発現カセットと、（ｉｉ）標的発現カセットと、の両方を含む異種構築物を含み、
任意選択的に、前記発現システムが、請求項７に記載の発現カセットを含む第１の異種構築物と、標的発現カセットを含む第２の異種構築物と、を含む、
発現システム。
【請求項9】
請求項７に記載の発現カセット、または請求項８に記載の発現システムを含む、単離された細胞。
【請求項10】
ａ．前記細胞が、ヒト細胞であり、かつ／または、ｂ．前記細胞が、幹細胞であり、かつ／または、
ｃ．前記細胞が、免疫細胞であり、かつ／または、
ｄ．前記細胞が、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、およびｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、
請求項９に記載の単離された細胞。
【請求項11】
目的の遺伝子の抑制を阻害するための遺伝子スイッチであって、請求項１～６のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドおよびリガンドを含み、
前記リガンドの前記デグロンへの結合が前記キメラポリペプチドの分解を誘導し、それによって、目的の遺伝子の抑制を阻害し、
前記目的の遺伝子が、ＩＴＭ応答性プロモーターに動作可能に連結され、
任意選択的に、前記リガンドが、ユビキチン経路を介したキメラポリペプチドの分解を促進する免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）を含み、
任意選択的に、前記ＩＭｉＤが、ＦＤＡ承認薬物であり、
任意選択的に、前記ＩＭｉＤが、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドからなる群から選択される、
遺伝子スイッチ。
【請求項12】
目的の遺伝子の抑制を阻害する方法であって、ａ．（ｉ）請求項１～６のいずれか一項に記載の前記キメラポリペプチドをコードする発現カセットと、（ｉｉ）目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む、発現システムを含む細胞を提供する工程と、
ｂ．前記形質転換細胞を、前記キメラポリペプチドの分解を促進するリガンドと接触させることによって、前記キメラポリペプチドの分解を誘導する工程と
を含む、方法。
【請求項13】
ａ．前記方法が、前記キメラポリペプチドの発現に適した条件下で前記細胞を培養する工程をさらに含み、かつ／または、ｂ．前記キメラポリペプチドをコードする前記発現カセットが、請求項７に記載の発現カセットを含み、かつ／または、
ｃ．前記発現システムが、請求項８に記載の発現システムを含む、
請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
薬物で調節される転写抑制の能力を有する細胞を産生する方法であって、請求項７に記載の発現カセットまたは請求項８に記載の発現システムを用いて前記細胞を形質転換する工程
を含む、方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0011】
一部の態様では、キメラポリペプチドのデグロンは、ＨＣＶ ＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の二つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（ＳＰ２およびＮＢのタンデムリピート（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２）、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の四つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（ＳＰ１およびＳＰ２のタンデムリピート（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２）、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の三つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３ＡおよびＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１ Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２およびＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾体、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存的デグロン（「ＤＳＧｘｘＳ」は配列番号６８として記載）、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰ ＳＢＣドッキングモチーフ、ならびにＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスからなる群から選択される。一部の態様では、デグロンは、免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）への応答においてＣＲＢＮに結合する能力を有し、それにより、キメラポリペプチドのユビキチン経路を介した分解を促進することができるセレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメインを含む。一部の態様では、ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインは、ＣＲＢＮの薬物誘導性結合の能力を有する、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＣＫｌａ、ＺＦＰ９１、ＧＳＰＴ１、ＭＥＩＳ２、ＧＳＳ Ｅ４Ｆ１、ＺＮ２７６、ＺＮ５１７、ＺＮ５８２、ＺＮ６５３、ＺＮ６５４、ＺＮ６９２、ＺＮ７８７およびＺＮ８２７、またはその断片からなる群から選択される選択される。一部の態様では、ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインは、天然ＣＲＢＮポリペプチド配列のキメラ融合産物である。一部の態様では、ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインは、ＦＮＶＬＭＶＨＫＲＳＨＴＧＥＲＰＬＱＣＥＩＣＧＦＴＣＲＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬ（配列番号６）のアミノ酸配列を有するＩＫＺＦ３／ＺＦＰ９１／ＩＫＺＦ３キメラ融合産物である。一部の態様では、ＩＭｉＤは、ＦＤＡ承認薬物である。一部の態様では、ＩＭｉＤは、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドからなる群から選択される。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0024】
また、（ａ）（ｉ）本明細書に記述されるようなキメラポリペプチドをコードする発現カセットと、（ｉｉ）目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む発現システムを用いて細胞を形質転換することと、（ｂ）キメラポリペプチドの発現に適した条件下で形質転換細胞を培養することと、（ｃ）形質転換細胞を、キメラポリペプチドの分解を促進するリガンドと接触させることによって、キメラポリペプチドの分解を誘導することと、を含む、目的の遺伝子の抑制を阻害する方法も提供される。
[本発明１００１]
以下：
（ａ）転写リプレッサードメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）と、
（ｂ）デグロンと
を含むキメラポリペプチドであって、
前記デグロンが、前記ＩＴＭに動作可能に連結され、かつ
前記転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ抑制ドメイン、ＨＤＡＣ４ドメイン、ＳＣＸ ＨＬＨドメイン、ＩＤ１ ＨＬＨドメイン、ＨＥＲＣ２ Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ＴＷＳＴ１ ＨＬＨドメイン、ＮＫＸ２２ホメオドメイン、ＩＤ３ ＨＬＨドメイン、およびＴＷＳＴ２ ＨＬＨドメインからなる群から選択される、
キメラポリペプチド。
[本発明１００２]
前記転写リプレッサードメインが、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインを含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、ｍｉｎＫＲＡＢを含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントを含み、かつＷ２７Ｌ、Ｋ２８Ｌ、Ｄ３１Ａ、Ｔ３２Ａ、Ｑ３４Ａ、Ｑ３５Ａ、Ｒ３９Ｅ、Ｌ４３Ｓ、Ｔ５７Ｃ、Ｋ５８Ｃ、Ｐ５９Ｃ、Ｖ６１Ｙ、Ｉ６２Ｙ、Ｉ６２Ａ、Ｌ６３Ｗ、Ｌ６３Ｙ、Ｌ６３Ｅ、Ｒ６４Ｆ、Ｒ６４Ｗ、Ｒ６４Ｅ、Ｌ６５Ｆ、Ｌ６５Ｅ、Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｋ６７Ｆ、Ｇ６８Ｆ、およびＥ６９Ｆからなる群から選択される一つ以上のアミノ酸置換を含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントを含み、かつＱ３４Ａ／Ｑ３５Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｔ５７Ｃ／Ｋ５８Ｃ／Ｐ５９Ｃ、Ｄ３１Ａ／Ｔ３２Ａ、Ｌ６３Ｗ／Ｒ６４Ｗ／Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｌ６３Ｅ／Ｒ６４Ｅ／Ｌ６５Ｅ、Ｒ６４Ｆ／Ｌ６５Ｆ、Ｗ２７Ｌ／Ｋ２８Ｌ ＫＲＡＢ、Ｒ３９Ｅ、Ｋ６７Ｆ／Ｇ６８Ｆ／Ｅ６９Ｆ、およびＶ６１Ｙ／Ｉ６２Ｙ／Ｌ６３Ｙから選択される一つ以上のアミノ酸置換を含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、
本発明１００１のキメラポリペプチド。
[本発明１００３]
前記転写リプレッサードメインが、前記ＨＤＡＣ４抑制ドメインを含み、
任意選択的に、前記ＨＤＡＣ４抑制ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、
本発明１００１のキメラポリペプチド。
[本発明１００４]
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、かつジンクフィンガーモチーフのジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）で構成され、
任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含み、
任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、６個のジンクフィンガーモチーフを含み、
任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、配列番号５を含む、
本発明１００１～１００３のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明１００５]
ａ．前記転写リプレッサードメインが、前記ＤＮＡ結合ドメインに対しＮ末端側または前記ＤＮＡ結合ドメインに対しＣ末端側であり、かつ／または、
ｂ．前記転写リプレッサードメインおよび前記ＤＮＡ結合ドメインが、第１のペプチドリンカーによって隔てられ、
任意選択的に、前記第１のペプチドリンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＴ（配列番号６０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または、
ｃ．前記ＩＴＭが、合成転写調節因子である、
本発明１００１～１００４のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明１００６]
（ａ）前記デグロンが、ＨＣＶ ＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の二つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（ＳＰ２およびＮＢのタンデムリピート（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２）、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の四つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（ＳＰ１およびＳＰ２のタンデムリピート（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２）、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の三つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３ＡおよびＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１ Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２およびＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾体、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存的デグロン、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰ ＳＢＣドッキングモチーフ、ならびにＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスからなる群から選択され、かつ／または
（ｂ）前記デグロンが、免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）に応答してＣＲＢＮに結合する能力を有するセレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメインを含み、
任意選択的に、前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、ＣＲＢＮの薬物誘導性結合の能力を有する、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＣＫｌａ、ＺＦＰ９１、ＧＳＰＴ１、ＭＥＩＳ２、ＧＳＳ Ｅ４Ｆ１、ＺＮ２７６、ＺＮ５１７、ＺＮ５８２、ＺＮ６５３、ＺＮ６５４、ＺＮ６９２、ＺＮ７８７およびＺＮ８２７、またはその断片からなる群から選択され、
任意選択的に、前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、天然ＣＲＢＮポリペプチド配列のキメラ融合産物を含み、
任意選択的に、前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、ＦＮＶＬＭＶＨＫＲＳＨＴＧＥＲＰＬＱＣＥＩＣＧＦＴＣＲＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬ（配列番号６）のアミノ酸配列を有するＩＫＺＦ３／ＺＦＰ９１／ＩＫＺＦ３キメラ融合産物を含み、かつ／または、
（ｃ）前記ＩＭｉＤが、ＦＤＡ承認薬物であり、
任意選択的に、前記ＩＭＩＤが、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドからなる群から選択され、
任意選択的に、前記ＩＴＭが、前記デグロンに対しＮ末端側または前記デグロンに対しＣ末端側であり、
任意選択的に、前記ＩＴＭが、第２のペプチドリンカーによって前記デグロンから隔てられ、
任意選択的に、前記第２のペプチドリンカーが、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７）、ＫＥＧＳ（配列番号８）、ＥＧＫ、ＥＡＡＡＫ（配列番号９）、およびＡＡＰＡＫＱＥ（配列番号１０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または前記第２のペプチドリンカーが、ＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＰＡＡＫＡＥＡＰＡＡＡＰＡＡＫＡ（配列番号１２）およびＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
本発明１００１～１００５のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明１００７]
本発明１００１～１００６のいずれかのキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットであって、
任意選択的に、前記プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターを含むか、または前記プロモーターが、誘導性プロモーターを含み、任意選択的に、前記誘導性プロモーターが、最小プロモーターと、ＮＦｋＢ応答要素、ＣＲＥＢ応答要素、ＮＦＡＴ応答要素、ＳＲＦ応答要素１、ＳＲＦ応答要素２、ＡＰ１応答要素、ＴＣＦ－ＬＥＦ応答要素プロモーター融合体、低酸素応答要素、ＳＭＡＤ結合要素、ＳＴＡＴ３結合部位、誘導因子分子応答性プロモーター、およびそのタンデムリピートからなる群から選択される応答要素と、を含み、
任意選択的に、前記プロモーターが合成プロモーターを含み、
任意選択的に、前記キメラポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡ不安定化要素を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらにコードし、
任意選択的に、前記ｍＲＮＡ不安定化要素が、ＡＵリッチ要素およびステムループ不安定化要素からなる群から選択される、
発現カセット。
[本発明１００８]
本発明１００７の発現カセットと、目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む発現システムであって、
任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターが、プロモーター配列および前記ＩＴＭの前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、一つ以上のジンクフィンガー結合部位を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、配列番号５４のアミノ酸配列を有する一つ以上のジンクフィンガー結合部位を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、四つのより多くのジンクフィンガー結合部位を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターの前記プロモーター配列が、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーター配列を含み、
任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターの前記プロモーター配列が、最小プロモーターを含み、
任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターが合成プロモーターを含み、
任意選択的に、目的の遺伝子が、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、細胞死制御因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子ａ、受容体、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、および酵素からなる群から選択される治療用ポリペプチドをコードし、
任意選択的に、前記発現システムが、（ｉ）本発明１００７の発現カセットと、（ｉｉ）標的発現カセットと、の両方を含む異種構築物を含み、
任意選択的に、前記発現システムが、本発明１００７の発現カセットを含む第１の異種構築物と、標的発現カセットを含む第２の異種構築物と、を含む、
発現システム。
[本発明１００９]
本発明１００７の発現カセット、または本発明１００８の発現システムを含む、単離された細胞。
[本発明１０１０]
ａ．前記細胞が、ヒト細胞であり、かつ／または、
ｂ．前記細胞が、幹細胞であり、かつ／または、
ｃ．前記細胞が、免疫細胞であり、かつ／または、
ｄ．前記細胞が、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、およびｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、
本発明１００９の単離された細胞。
[本発明１０１１]
目的の遺伝子の抑制を阻害するための遺伝子スイッチであって、
本発明１００１～１００６のいずれかのキメラポリペプチドおよびリガンドを含み、
前記リガンドの前記デグロンへの結合が前記キメラポリペプチドの分解を誘導し、それによって、目的の遺伝子の抑制を阻害し、
前記目的の遺伝子が、ＩＴＭ応答性プロモーターに動作可能に連結され、
任意選択的に、前記リガンドが、ユビキチン経路を介したキメラポリペプチドの分解を促進する免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）を含み、
任意選択的に、前記ＩＭｉＤが、ＦＤＡ承認薬物であり、
任意選択的に、前記ＩＭｉＤが、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドからなる群から選択される、
遺伝子スイッチ。
[本発明１０１２]
目的の遺伝子の抑制を阻害する方法であって、
ａ．（ｉ）本発明１００１～１００６のいずれかの前記キメラポリペプチドをコードする発現カセットと、（ｉｉ）目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む、発現システムを含む細胞を提供する工程と、
ｂ．前記形質転換細胞を、前記キメラポリペプチドの分解を促進するリガンドと接触させることによって、前記キメラポリペプチドの分解を誘導する工程と
を含む、方法。
[本発明１０１３]
ａ．前記方法が、前記キメラポリペプチドの発現に適した条件下で前記細胞を培養する工程をさらに含み、かつ／または、
ｂ．前記キメラポリペプチドをコードする前記発現カセットが、本発明１００７の発現カセットを含み、かつ／または、
ｃ．前記発現システムが、本発明１００８の発現システムを含む、
本発明１０１２の方法。
[本発明１０１４]
薬物で調節される転写抑制の能力を有する細胞を産生する方法であって、
本発明１００７の発現カセットまたは本発明１００８の発現システムを用いて前記細胞を形質転換する工程
を含む、方法。
[本発明１００１]
以下：
（ａ）転写リプレッサードメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む、誘導性転写調節因子（ＩＴＭ）と、
（ｂ）デグロンと
を含むキメラポリペプチドであって、
前記デグロンが、前記ＩＴＭに動作可能に連結され、かつ
前記転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢ抑制ドメイン、ＨＤＡＣ４ドメイン、ＳＣＸ ＨＬＨドメイン、ＩＤ１ ＨＬＨドメイン、ＨＥＲＣ２ Ｃｙｔ－ｂ５ドメイン、ＴＷＳＴ１ ＨＬＨドメイン、ＮＫＸ２２ホメオドメイン、ＩＤ３ ＨＬＨドメイン、およびＴＷＳＴ２ ＨＬＨドメインからなる群から選択される、
キメラポリペプチド。
[本発明１００２]
前記転写リプレッサードメインが、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインを含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、ｍｉｎＫＲＡＢを含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントを含み、かつＷ２７Ｌ、Ｋ２８Ｌ、Ｄ３１Ａ、Ｔ３２Ａ、Ｑ３４Ａ、Ｑ３５Ａ、Ｒ３９Ｅ、Ｌ４３Ｓ、Ｔ５７Ｃ、Ｋ５８Ｃ、Ｐ５９Ｃ、Ｖ６１Ｙ、Ｉ６２Ｙ、Ｉ６２Ａ、Ｌ６３Ｗ、Ｌ６３Ｙ、Ｌ６３Ｅ、Ｒ６４Ｆ、Ｒ６４Ｗ、Ｒ６４Ｅ、Ｌ６５Ｆ、Ｌ６５Ｅ、Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｋ６７Ｆ、Ｇ６８Ｆ、およびＥ６９Ｆからなる群から選択される一つ以上のアミノ酸置換を含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号２のＫＲＡＢリプレッサードメインバリアントを含み、かつＱ３４Ａ／Ｑ３５Ａ、Ｉ６２Ａ、Ｔ５７Ｃ／Ｋ５８Ｃ／Ｐ５９Ｃ、Ｄ３１Ａ／Ｔ３２Ａ、Ｌ６３Ｗ／Ｒ６４Ｗ／Ｌ６５Ｗ、Ｅ６６Ｖ、Ｌ６３Ｅ／Ｒ６４Ｅ／Ｌ６５Ｅ、Ｒ６４Ｆ／Ｌ６５Ｆ、Ｗ２７Ｌ／Ｋ２８Ｌ ＫＲＡＢ、Ｒ３９Ｅ、Ｋ６７Ｆ／Ｇ６８Ｆ／Ｅ６９Ｆ、およびＶ６１Ｙ／Ｉ６２Ｙ／Ｌ６３Ｙから選択される一つ以上のアミノ酸置換を含み、
任意選択的に、前記ＫＲＡＢ抑制ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、
本発明１００１のキメラポリペプチド。
[本発明１００３]
前記転写リプレッサードメインが、前記ＨＤＡＣ４抑制ドメインを含み、
任意選択的に、前記ＨＤＡＣ４抑制ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、
本発明１００１のキメラポリペプチド。
[本発明１００４]
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質ドメインを含み、
任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、モジュラー設計であり、かつジンクフィンガーモチーフのジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）で構成され、
任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、１～１０個のジンクフィンガーモチーフを含み、
任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、６個のジンクフィンガーモチーフを含み、
任意選択的に、前記ＺＦタンパク質ドメインが、配列番号５を含む、
本発明１００１～１００３のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明１００５]
ａ．前記転写リプレッサードメインが、前記ＤＮＡ結合ドメインに対しＮ末端側または前記ＤＮＡ結合ドメインに対しＣ末端側であり、かつ／または、
ｂ．前記転写リプレッサードメインおよび前記ＤＮＡ結合ドメインが、第１のペプチドリンカーによって隔てられ、
任意選択的に、前記第１のペプチドリンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＴ（配列番号６０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または、
ｃ．前記ＩＴＭが、合成転写調節因子である、
本発明１００１～１００４のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明１００６]
（ａ）前記デグロンが、ＨＣＶ ＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の二つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（ＳＰ２およびＮＢのタンデムリピート（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２）、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の四つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（ＳＰ１およびＳＰ２のタンデムリピート（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２）、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の三つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３ＡおよびＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１ Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２およびＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾体、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存的デグロン、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰ ＳＢＣドッキングモチーフ、ならびにＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスからなる群から選択され、かつ／または
（ｂ）前記デグロンが、免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）に応答してＣＲＢＮに結合する能力を有するセレブロン（ＣＲＢＮ）ポリペプチド基質ドメインを含み、
任意選択的に、前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、ＣＲＢＮの薬物誘導性結合の能力を有する、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＣＫｌａ、ＺＦＰ９１、ＧＳＰＴ１、ＭＥＩＳ２、ＧＳＳ Ｅ４Ｆ１、ＺＮ２７６、ＺＮ５１７、ＺＮ５８２、ＺＮ６５３、ＺＮ６５４、ＺＮ６９２、ＺＮ７８７およびＺＮ８２７、またはその断片からなる群から選択され、
任意選択的に、前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、天然ＣＲＢＮポリペプチド配列のキメラ融合産物を含み、
任意選択的に、前記ＣＲＢＮポリペプチド基質ドメインが、ＦＮＶＬＭＶＨＫＲＳＨＴＧＥＲＰＬＱＣＥＩＣＧＦＴＣＲＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＴＧＥＫＰＦＫＣＨＬＣＮＹＡＣＱＲＲＤＡＬ（配列番号６）のアミノ酸配列を有するＩＫＺＦ３／ＺＦＰ９１／ＩＫＺＦ３キメラ融合産物を含み、かつ／または、
（ｃ）前記ＩＭｉＤが、ＦＤＡ承認薬物であり、
任意選択的に、前記ＩＭＩＤが、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドからなる群から選択され、
任意選択的に、前記ＩＴＭが、前記デグロンに対しＮ末端側または前記デグロンに対しＣ末端側であり、
任意選択的に、前記ＩＴＭが、第２のペプチドリンカーによって前記デグロンから隔てられ、
任意選択的に、前記第２のペプチドリンカーが、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７）、ＫＥＧＳ（配列番号８）、ＥＧＫ、ＥＡＡＡＫ（配列番号９）、およびＡＡＰＡＫＱＥ（配列番号１０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または前記第２のペプチドリンカーが、ＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＫＱＥＡＡＡＰＡＰＡＡＫＡＥＡＰＡＡＡＰＡＡＫＡ（配列番号１２）およびＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
本発明１００１～１００５のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明１００７]
本発明１００１～１００６のいずれかのキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットであって、
任意選択的に、前記プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ｈＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーターを含むか、または前記プロモーターが、誘導性プロモーターを含み、任意選択的に、前記誘導性プロモーターが、最小プロモーターと、ＮＦｋＢ応答要素、ＣＲＥＢ応答要素、ＮＦＡＴ応答要素、ＳＲＦ応答要素１、ＳＲＦ応答要素２、ＡＰ１応答要素、ＴＣＦ－ＬＥＦ応答要素プロモーター融合体、低酸素応答要素、ＳＭＡＤ結合要素、ＳＴＡＴ３結合部位、誘導因子分子応答性プロモーター、およびそのタンデムリピートからなる群から選択される応答要素と、を含み、
任意選択的に、前記プロモーターが合成プロモーターを含み、
任意選択的に、前記キメラポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡ不安定化要素を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらにコードし、
任意選択的に、前記ｍＲＮＡ不安定化要素が、ＡＵリッチ要素およびステムループ不安定化要素からなる群から選択される、
発現カセット。
[本発明１００８]
本発明１００７の発現カセットと、目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む発現システムであって、
任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターが、プロモーター配列および前記ＩＴＭの前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する配列を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、一つ以上のジンクフィンガー結合部位を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、配列番号５４のアミノ酸配列を有する一つ以上のジンクフィンガー結合部位を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、四つのより多くのジンクフィンガー結合部位を含み、
任意選択的に、前記ＤＮＡ結合ドメインに結合する前記配列が、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターの前記プロモーター配列が、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、ＳＶ４０、ＭＮＤ、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａ、ｈＣＡＧＧ、ｈＡＣＴｂ、ｈｅＩＦ４Ａ１、ｈＧＡＰＤＨ、ｈＧＲＰ７８、ｈＧＲＰ９４、ｈＨＳＰ７０、ｈＫＩＮｂ、およびｈＵＢＩｂからなる群から選択される構成的プロモーター配列を含み、
任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターの前記プロモーター配列が、最小プロモーターを含み、
任意選択的に、前記ＩＴＭ応答性プロモーターが合成プロモーターを含み、
任意選択的に、目的の遺伝子が、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、細胞死制御因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子ａ、受容体、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、および酵素からなる群から選択される治療用ポリペプチドをコードし、
任意選択的に、前記発現システムが、（ｉ）本発明１００７の発現カセットと、（ｉｉ）標的発現カセットと、の両方を含む異種構築物を含み、
任意選択的に、前記発現システムが、本発明１００７の発現カセットを含む第１の異種構築物と、標的発現カセットを含む第２の異種構築物と、を含む、
発現システム。
[本発明１００９]
本発明１００７の発現カセット、または本発明１００８の発現システムを含む、単離された細胞。
[本発明１０１０]
ａ．前記細胞が、ヒト細胞であり、かつ／または、
ｂ．前記細胞が、幹細胞であり、かつ／または、
ｃ．前記細胞が、免疫細胞であり、かつ／または、
ｄ．前記細胞が、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、およびｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、
本発明１００９の単離された細胞。
[本発明１０１１]
目的の遺伝子の抑制を阻害するための遺伝子スイッチであって、
本発明１００１～１００６のいずれかのキメラポリペプチドおよびリガンドを含み、
前記リガンドの前記デグロンへの結合が前記キメラポリペプチドの分解を誘導し、それによって、目的の遺伝子の抑制を阻害し、
前記目的の遺伝子が、ＩＴＭ応答性プロモーターに動作可能に連結され、
任意選択的に、前記リガンドが、ユビキチン経路を介したキメラポリペプチドの分解を促進する免疫調節薬物（ＩＭｉＤ）を含み、
任意選択的に、前記ＩＭｉＤが、ＦＤＡ承認薬物であり、
任意選択的に、前記ＩＭｉＤが、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドからなる群から選択される、
遺伝子スイッチ。
[本発明１０１２]
目的の遺伝子の抑制を阻害する方法であって、
ａ．（ｉ）本発明１００１～１００６のいずれかの前記キメラポリペプチドをコードする発現カセットと、（ｉｉ）目的の遺伝子に動作可能に連結されたＩＴＭ応答性プロモーターを含む標的発現カセットと、を含む、発現システムを含む細胞を提供する工程と、
ｂ．前記形質転換細胞を、前記キメラポリペプチドの分解を促進するリガンドと接触させることによって、前記キメラポリペプチドの分解を誘導する工程と
を含む、方法。
[本発明１０１３]
ａ．前記方法が、前記キメラポリペプチドの発現に適した条件下で前記細胞を培養する工程をさらに含み、かつ／または、
ｂ．前記キメラポリペプチドをコードする前記発現カセットが、本発明１００７の発現カセットを含み、かつ／または、
ｃ．前記発現システムが、本発明１００８の発現システムを含む、
本発明１０１２の方法。
[本発明１０１４]
薬物で調節される転写抑制の能力を有する細胞を産生する方法であって、
本発明１００７の発現カセットまたは本発明１００８の発現システムを用いて前記細胞を形質転換する工程
を含む、方法。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0049】
デグロン
一部の実施形態では、本明細書に記述されるキメラポリペプチドは、デグロンを含む。一部の実施形態では、デグロンは、ＩＴＭの分解を誘導する能力を有する。一部の実施形態では、デグロンとしては、ＨＣＶ ＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の二つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（ＳＰ２およびＮＢのタンデムリピート（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２）、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の四つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（ＳＰ１およびＳＰ２のタンデムリピート（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２）、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の三つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３ＡおよびＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１ Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２およびＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾体、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存的デグロン（「ＤＳＧｘｘＳ」は配列番号６８として記載）、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰ ＳＢＣドッキングモチーフ、またはＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスを挙げることができるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に記述されるキメラポリペプチドは、デグロンを含む。一部の実施形態では、デグロンは、ＩＴＭの分解を誘導する能力を有する。一部の実施形態では、デグロンとしては、ＨＣＶ ＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の二つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（ＳＰ２およびＮＢのタンデムリピート（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２）、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の四つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（ＳＰ１およびＳＰ２のタンデムリピート（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２）、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の三つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３ＡおよびＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１ Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２およびＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾体、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存的デグロン（「ＤＳＧｘｘＳ」は配列番号６８として記載）、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰ ＳＢＣドッキングモチーフ、またはＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスを挙げることができるが、これらに限定されない。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0198】
実施形態２０：
デグロンが、ＨＣＶ ＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の二つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（ＳＰ２およびＮＢのタンデムリピート（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２）、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の四つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（ＳＰ１およびＳＰ２のタンデムリピート（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２）、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の三つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３ＡおよびＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１ Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２およびＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾体、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存的デグロン（「ＤＳＧｘｘＳ」は配列番号６８として記載）、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰ ＳＢＣドッキングモチーフ、ならびにＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスからなる群から選択される、実施形態１～１９のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
デグロンが、ＨＣＶ ＮＳ４デグロン、ＰＥＳＴ（ヒトＩκＢαの残基２７７～３０７の二つのコピー）、ＧＲＲ（ヒトｐ１０５の残基３５２～４０８）、ＤＲＲ（酵母Ｃｄｃ３４の残基２１０～２９５）、ＳＮＳ（ＳＰ２およびＮＢのタンデムリピート（Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのＳＰ２－ＮＢ－ＳＰ２）、ＲＰＢ（酵母ＲＰＢの残基１６８８～１７０２の四つのコピー）、ＳＰｍｉｘ（ＳＰ１およびＳＰ２のタンデムリピート（Ａ型インフルエンザウイルスＭ２タンパク質のＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２－ＳＰ１－ＳＰ２）、ＮＳ２（Ａ型インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の残基７９～９３の三つのコピー）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼの残基１０６～１４２）、Ｎｅｋ２Ａ、マウスＯＤＣ（残基４２２～４６１）、マウスＯＤＣ＿ＤＡ（Ｄ４３３ＡおよびＤ４３４Ａ点変異を含むｍＯＤＣの残基４２２～４６１）、ＡＰＣ／Ｃデグロン、ＣＯＰ１ Ｅ３リガーゼ結合デグロンモチーフ、ＣＲＬ４－Ｃｄｔ２結合ＰＩＰデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、ＫＥＡＰ１結合デグロン、ＫＬＨＬ２およびＫＬＨＬ３結合デグロン、ＭＤＭ２結合モチーフ、Ｎ－デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾体、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＳＣＦユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的ＳＣＦ－ＬＲＲ結合デグロン、ＤＳＧｘｘＳリン依存的デグロン（「ＤＳＧｘｘＳ」は配列番号６８として記載）、Ｓｉａｈ結合モチーフ、ＳＰＯＰ ＳＢＣドッキングモチーフ、ならびにＰＣＮＡ結合ＰＩＰボックスからなる群から選択される、実施形態１～１９のいずれか一つに記載のキメラポリペプチド。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】