特表 2024-513238 抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を発現する腫瘍溶解性ウイルス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-22

(54)【発明の名称】抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を発現する腫瘍溶解性ウイルス

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240314BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240314BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240314BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20240314BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240314BHJP

   C12N 15/38 20060101ALI20240314BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240314BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20240314BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240314BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240314BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20240314BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240314BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/46 ZNA

C07K16/28

C07K16/30

C12N15/63 Z

C12N15/38

C12N7/01

C12N15/24

C12N5/10

A61K39/395 N

A61K35/763

A61P35/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023561292

(86)(22)【出願日】2022-04-08

(85)【翻訳文提出日】2023-12-01

(86)【国際出願番号】 US2022024017

(87)【国際公開番号】W WO2022217048

(87)【国際公開日】2022-10-13

(31)【優先権主張番号】63/173,205

(32)【優先日】2021-04-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514291864

【氏名又は名称】ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ブレッソン， ダミアン

(72)【発明者】

【氏名】パワーズ， コリン

(72)【発明者】

【氏名】アレン， ロバート

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94Y

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA56

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ＲＯＲ１およびＣＤ３に結合する二重特異性抗体ならびにこのような二重特異性抗体をコードする核酸構築物をコードする腫瘍溶解性ウイルスを提供する。また、二重特異性抗体およびそれらをコードする腫瘍溶解性ウイルスを使用してがんを処置する方法も含まれる。本明細書で記載されるようなαＲＯＲ１／αＣＤ３ Ｂｓｐ Ａｂをコードする構築物を、機能的ＲＬ－１遺伝子を含まないＨＳＶ １７に由来する腫瘍溶解性ＨＳＶ－１ウイルス（「Ｓｅｐｒｅｈｖｅｃ」）中にクローニングし、ウイルス感染細胞を使用して、二重特異性抗体を含むウイルス不含細胞培地（ＶＦＣＭ）を生成し、ＲＯＲ１発現性腫瘍細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性を増強する能力について試験した。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＲＯＲ１に結合する単鎖可変断片抗体（ＳｃＦｖ）およびＣＤ３に結合する単鎖可変断片抗体（ＳｃＦｖ）を含む二重特異性抗体であって、抗ＲＯＲＩ ｓｃＦｖおよび抗ＣＤ３ ｓｃＦｖはリンカーを介して接合され、さらに
ＳｃＦｖ抗ＲＯＲ１抗体は、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号５に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する、
抗ＲＯＲ１ ＳｃＦｖは、配列番号１０に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号１４に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する、
抗ＲＯＲ１ ＳｃＦｖは、配列番号１９に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号２３に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する、
抗ＲＯＲ１ ＳｃＦｖは、配列番号５２に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号５６に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する、または
抗ＲＯＲ１ ＳｃＦｖは、配列番号６０に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号６４に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する、二重特異性抗体。

【請求項2】

前記抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖが、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号５に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項3】

前記抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖが、配列番号９に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の二重特異性抗体。

【請求項4】

前記抗ＲＯＲ１ ＳｃＦｖが、配列番号１０に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号１４に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項5】

前記抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖが、配列番号１８に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の二重特異性抗体。

【請求項6】

前記抗ＲＯＲ１ ＳｃＦｖが、配列番号１９に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号２３に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項7】

前記抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖが、配列番号２７に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の二重特異性抗体。

【請求項8】

前記抗ＣＤ３ ｓｃＦｖが、配列番号３２に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項9】

前記抗ＣＤ３ ｓｃＦｖが、配列番号３４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の二重特異性抗体。

【請求項10】

前記ｓｃＦｖ抗体の前記重鎖および軽鎖可変ドメインが、ＧＳリンカーによって接合される、前記の請求項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれかに記載の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体をコードする核酸構築物。

【請求項12】

前記抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体をコードする配列が、そのＮ末端にシグナルペプチドをコードする配列を含む、請求項１１に記載の核酸構築物。

【請求項13】

前記抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体をコードする配列が、プロモーターに作動可能に連結される、請求項１１に記載の核酸構築物。

【請求項14】

前記プロモーターが、ＥＦ１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＪＥＴプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ベータ－アクチンプロモーター、ＨＴＬＶプロモーターまたはＥＦ１α／ＨＴＬＶハイブリッドプロモーターである、請求項１３に記載の核酸構築物。

【請求項15】

前記抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体をコードする配列の３’末端に連結されたポリアデニル化配列をさらに含む、請求項１３に記載の核酸構築物。

【請求項16】

請求項１１～１５のいずれかに記載の核酸構築物を含む組換えウイルスゲノム。

【請求項17】

請求項１１～１５のいずれかに記載の核酸構築物を含む組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項18】

前記腫瘍溶解性ウイルスが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）である、請求項１７に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項19】

前記腫瘍溶解性ウイルスが、ＨＳＶ－１である、請求項１８に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項20】

前記腫瘍溶解性ＨＳＶが、ＩＬ－１２をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１９に記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項21】

前記ＩＬ－１２が、ヒトＩＬ－１２である、請求項２０に記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項22】

前記ＩＬ－１２が、配列番号４７のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項23】

前記腫瘍溶解性ＨＳＶが、抗ＶＥＧＦＲ抗体をコードする核酸配列を含む、請求項１９に記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項24】

前記抗ＶＥＧＦＲ抗体が、配列番号４９を含む、請求項２３に記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項25】

前記腫瘍溶解性ＨＳＶが、ＨＳＶ－１株１７、ＨＳＶ－１株Ｆ、ＨＳＶ－１株ＫＯＳまたはＨＳＶ－１株ＪＳ１に由来する、請求項１９に記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項26】

前記腫瘍溶解性ＨＳＶが、ＨＳＶ株１７に由来する、請求項２５に記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項27】

前記腫瘍溶解性ＨＳＶが、機能的ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子をコードしない、請求項１９～２６のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項28】

前記ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子のすべてまたは一部分が欠失している、請求項２７に記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項29】

前記抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体をコードする前記核酸構築物が、前記ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子座位中に挿入されている、請求項２７に記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項30】

がんを処置する方法において使用するための組換え腫瘍溶解性ウイルスであって、前記方法は、請求項１７～２９のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルスを、がんを有する対象に投与することを含む、組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項31】

前記腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍溶解性ＨＳＶである、請求項３０に記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項32】

前記方法が、前記腫瘍溶解性ＨＳＶを静脈内、腔内、腹腔内、腫瘍内または腫瘍周囲送達によって投与することを含む、請求項３１に記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項33】

前記送達が、カテーテル、注入または注射を介するものである、請求項３２に記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項34】

前記方法が、前記腫瘍溶解性ＨＳＶの１つより多い用量を前記対象に投与することを含む、請求項３０～３３のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項35】

前記がんが固形腫瘍である、請求項３０～３４のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項36】

前記対象がイヌ、ウマまたは霊長類である、請求項３０～３５のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項37】

前記対象がヒトである、請求項３６に記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ。

【請求項38】

請求項１７～３７のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ＨＳＶおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項39】

前記腫瘍溶解性ＨＳＶが、１ｍｌあたり少なくとも１０^６の濃度である、請求項３３に記載の医薬組成物。

【請求項40】

前記腫瘍溶解性ＨＳＶが、１ｍｌあたり少なくとも１０^７の濃度である、請求項３４に記載の医薬組成物。

【請求項41】

対象においてがんを処置する方法であって、請求項１７～４０のいずれかに記載の腫瘍溶解性ＨＳＶまたは医薬組成物を、がんを有する対象に投与することを含む、方法。

【請求項42】

前記対象がイヌ、ウマまたは霊長類である、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記対象がヒトである、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記腫瘍溶解性ＨＳＶを静脈内、動脈内、腔内、腫瘍内または腫瘍周囲送達によって投与することを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項45】

送達が、カテーテルによる、注入による、または注射によるものである、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記腫瘍溶解性ＨＳＶの１つより多い用量を前記対象に投与することを含む、請求項３２～３６のいずれかに記載の方法。

【請求項47】

前記がんが固形腫瘍である、請求項４１～４６のいずれかに記載の方法。

【請求項48】

請求項１７～２９のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルスに感染した宿主細胞。

【請求項49】

Ｖｅｒｏ細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはＢＨＫ細胞である、請求項４８に記載の宿主細胞。

【請求項50】

医薬ウイルス組成物を生成する方法であって、請求項４８に記載の宿主細胞を培養して、ウイルス上清を生成すること、および前記ウイルス上清からウイルスを単離して、医薬ウイルス組成物を生成することを含む、方法。

【請求項51】

請求項１～１０のいずれかに記載の二重特異性抗体を含むウイルス不含条件培地（ＶＣＦＭ）。

【請求項52】

がんを処置する方法であって、請求項１～１０のいずれかに記載の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む医薬組成物を用いて対象を処置することを含む、方法。

【請求項53】

がんを処置する方法であって、請求項５１に記載のＶＦＣＭを含む医薬組成物を用いて対象を処置することを含む、方法。

【請求項54】

前記対象が非ヒト対象である、請求項５３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、米国特許法第１１９条の下、２０２１年４月９日に出願された米国仮出願第６３／１７３，２０５号に基づく優先権の利益を主張し、その全内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

技術分野

【0003】

本開示は、ＲＯＲ１とＣＤ３の両方に同時に結合する二重特異性抗体を提供する。本開示は、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体をコードする核酸、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体をコードする構築物を含む腫瘍溶解性ウイルスおよびがんの処置における使用方法を提供する。

【背景技術】

【0004】

背景

【0005】

受容体チロシンキナーゼオーファン受容体－１および－２（ＲＯＲ１およびＲＯＲ２）は、特定のがんと特異的に関連していると記載されており（Rebagay et al., 2012, Front Oncol., 2(34)）、健康な組織での発現はいくつかの例外はあるもののほとんどない（Balakrishnan et al., 2017, Clin. Cancer Res., 23(12), 3061-3071）。ＲＯＲファミリーメンバーの極めて腫瘍選択的な発現のために、それらは標的化がん療法の関連標的に相当する。

【0006】

受容体チロシンキナーゼオーファン受容体－１（ＲＯＲ１）は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）およびマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）において異常に発現される。ＲＯＲ１は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）とほぼ１００％の関連を示し（Cui et al., 2016, Blood, 128(25), 2931）、一部の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫および一部の他の血液悪性腫瘍のマーカーとして確立されている。ＲＯＲ１はまた、ある特定の固形腫瘍、例えば、肺および乳がんのものにおいて発現される（Balakrishnan et al., 2017, Clin. Cancer Res., 23(12), 3061-3071）。ＲＯＲ１は、いくつかの固形腫瘍、例えば、神経芽細胞腫、肉腫、腎細胞癌、乳がん、肺がん、結腸がん、頭頸部がんおよび黒色腫の進行に関与しているとわかっており、アポトーシスを阻害し、ＥＧＦＲシグナル伝達を増強し、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘導し、カベオラ形成に寄与すると示されている。

【0007】

ＲＯＲ１は、主に胚組織において検出可能であり、一般に、成体組織には存在せず、タンパク質をがん療法の理想的な薬物標的にする。したがって、ＲＯＲ１は、ＲＯＲ１特異的抗体の開発のための標的として認識されている。しかし、ヒトとカニクイザルの間でアミノ酸レベルで１００％保存されており、ヒトとマウスの間で９６．７％相同であり、ヒトとウサギの間で９６．３％相同である、様々な哺乳動物種間のＲＯＲ１の高い相同性のために、動物免疫化などの標準技術によってこの標的に対する高親和性抗体を作製することは困難であった。

【0008】

腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に選択的に感染し、溶解するウイルスである。腫瘍溶解性ウイルスは、黒色腫、神経膠腫、頭頸部がん、卵巣がん、肺がん、肝臓がん、膀胱がん、前立腺がんおよび膵臓がんを含む多様ながんの処置のための臨床試験の対象であった（Aghi & Martuza (2005) Oncogene 24:7802-7816）。複数の臨床試験によって、ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーの欠失によって正常細胞において複製するその能力が減弱された腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の安全性が実証されている（Rampling et al. (2000) Gene Therapy 7:859-866； Papanastassiou et al. (2002) Gene Therapy 9:398-406； Makie et al. (2001) Lancet 357:525-526； Markert et al. (2000) Gene Therapy 7:867-874； Markert et al. (2009) Molecular Therapy 17:199-207； Senzer et al. (2009) J Clin Oncol 27:5763-5771）。

【0009】

がん細胞を溶解することによって腫瘍を直接的に攻撃することに加えて、腫瘍溶解性ＨＳＶは、ウイルス抗原が感染がん細胞上で発現され、がん細胞が溶解すると腫瘍抗原が放出されるので、患者において抗腫瘍免疫応答を誘導できる（Papanastassiou et al. (2002); Markert et al. (2009); Senzer et al. (2009)）。ウイルスはまた、ウイルス感染の宿主認識の一部として自然免疫応答のメディエーターに関与し、炎症反応をもたらす（Hu et al. (2006) Clin Cancer Res. 12:6737-6747）。腫瘍溶解性ウイルスを用いる処置に対するこれらの免疫応答は、がん患者に全身の利益を提供し、転移性腫瘍を含むウイルスに感染していない腫瘍の抑制もたらす場合があり、疾患再発を防ぐ場合がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Rebagay et al., 2012, Front Oncol., 2(34)

【非特許文献2】Balakrishnan et al., 2017, Clin. Cancer Res., 23(12), 3061-3071

【非特許文献3】Rampling et al. (2000) Gene Therapy 7:859-866

【非特許文献4】Papanastassiou et al. (2002) Gene Therapy 9:398-406

【非特許文献5】Makie et al. (2001) Lancet 357:525-526

【非特許文献6】Markert et al. (2000) Gene Therapy 7:867-874

【非特許文献7】Markert et al. (2009) Molecular Therapy 17:199-207

【非特許文献8】Senzer et al. (2009) J Clin Oncol 27:5763-5771

【非特許文献9】Hu et al. (2006) Clin Cancer Res. 12:6737-6747

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

要旨

【0012】

本出願は、ＲＯＲ１およびＣＤ３に同時に結合する二重特異性抗体（αＲＯＲ１／αＣＤ３ Ｂｓｐ Ａｂ）を記載する。本明細書で記載されるようなαＲＯＲ１／αＣＤ３ Ｂｓｐ Ａｂをコードする構築物を、機能的ＲＬ－１遺伝子を含まないＨＳＶ １７に由来する腫瘍溶解性ＨＳＶ－１ウイルス（「Ｓｅｐｒｅｈｖｅｃ」）中にクローニングした。ウイルス感染細胞を使用して、二重特異性抗体を含むウイルス不含細胞培地（ＶＦＣＭ）を生成し、ＲＯＲ１発現性腫瘍細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性を増強する能力について試験した。本明細書で開示されるαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂは、前臨床研究において特異的な抗腫瘍活性を有する強力なＴ細胞標的化を実証した。腫瘍溶解性Ｓｅｐｒｅｈｖｅｃ ＨＳＶによるαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂの発現は、ウイルス処置の抗腫瘍活性を抗原依存的に有意に増大した。

【0013】

第１の態様において、ＲＯＲ１に結合する第１の単鎖可変断片抗体（ＳｃＦｖ）およびＣＤ３に結合する第２の単鎖可変断片抗体（ＳｃＦｖ）を含む二重特異性抗体が本明細書で提供され、抗ＲＯＲＩ ｓｃＦｖおよび抗ＣＤ３ ｓｃＦｖがリンカーを介して接合される。リンカーは、例えば、ＧＳリンカー、例えば、それだけには限らないが、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（式中、ｎは、１～２０の、例えば、１～８の整数であり得る）であり得る。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体（αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ）は、単離されたタンパク質であり得、一部の例では、部分的に、または実質的に精製されている。

【0014】

二重特異性抗体の抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖは、リンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーによって接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を有し得、ＶＨおよびＶＬ配列は、ＲＯＲ１に結合する、例えば、ヒトＲＯＲ１タンパク質に結合するモノクローナル抗体に由来し得る。例えば、二重特異性抗体の抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖは、配列番号１に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するＶＨドメイン配列および配列番号５に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するＶＨドメイン配列を含み得る。別の例では、二重特異性抗体の抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖは、配列番号１０に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するＶＨドメイン配列および配列番号１４に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するＶＨドメイン配列を含み得る。さらなる例では、二重特異性抗体の抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖは、配列番号１９に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するＶＨドメイン配列および配列番号２３に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するＶＨドメイン配列を含み得る。

【0015】

さらなる例では、二重特異性抗体の抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖは、配列番号５２に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するＶＨドメイン配列および配列番号５６に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するＶＨドメイン配列を含み得る、あるいは二重特異性抗体の抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖは、配列番号６０に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するＶＨドメイン配列および配列番号６４に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するＶＨドメイン配列を含み得る。

【0016】

多様な実施形態では、本明細書で提供されるような抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体（αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ）の抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖは、配列番号９、配列番号１８または配列番号２７に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。

【0017】

本明細書で提供されるαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、限定されない実施形態では、配列番号３２に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号３３に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む抗ＣＤ３ ｓｃＦｖであり得る。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、配列番号３４に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0018】

本明細書で提供されるさらなる態様は、本明細書で開示されるαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂのいずれかをコードする核酸構築物である。核酸構築物によってコードされるαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂは、二重特異性抗体構築物のＮ末端にシグナルペプチド、例えば、配列番号２８のシグナルペプチドまたは任意の適したシグナルペプチドを含み得る。核酸構築物は、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂコード配列に作動可能に連結したプロモーターを含むＤＮＡ構築物であり得る。プロモーターは、限定されない例として、ＥＦ１ αプロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、配列番号４２）、ＪｅＴプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ベータ－アクチンプロモーター、ＨＴＬＶプロモーターまたはＥＦ１α／ＨＴＬＶハイブリッドプロモーター（例えば、配列番号４１）であり得る。核酸構築物は、ＢｓｐＡｂコード配列のポリアデニル化配列３’、例えば、ＳＶ４０ ３’配列などをさらに含み得る。核酸構築物は、ベクターで提供される場合があり、一部の例では、組換えウイルスゲノムにクローニングされ得る。

【0019】

本明細書で提供されるさらなる態様は、本明細書で開示される任意のものに従うαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂをコードする核酸配列を含む核酸構築物を含む組換え腫瘍溶解性ウイルスである。多様な実施形態では、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、例えば、ＨＳＶ－１ウイルス、例えば、ＨＳＶ－１株１７、ＨＳＶ－１株Ｆ、ＨＳＶ－１株ＫＯＳまたはＨＳＶ－１株ＪＳ１に由来するウイルスである。一部の実施形態では、本明細書で提供されるようなαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂを発現するための遺伝子構築物を含む組換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、機能的ＩＣＰ３４．５コード遺伝子を含まず、一部の例では、ＩＣＰ３４．５コード遺伝子のすべてまたは一部分が欠失されている場合がある。例えば、組換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ＨＳＶ １７株に由来する場合があり、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂをコードする核酸構築物は、ＩＣＰ３４．５コード遺伝子座位中に挿入され得る。

【0020】

ある特定の実施形態では、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂをコードする核酸配列を含む核酸構築物を含む組換え腫瘍溶解性ウイルスは、サイトカインをコードする核酸配列をさらに含み得る。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂをコードする遺伝子およびＩＬ－１２をコードする遺伝子を含み得る。本明細書で開示される特定の例では、腫瘍溶解性ウイルスは、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ、例えば、本明細書で開示されるいずれかおよびＩＬ－１２、例えば、配列番号４６に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するヒトＩＬ－１２などをコードする遺伝子を含む。一部の例では、腫瘍溶解性ウイルスは、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂをコードする遺伝子および増殖因子または増殖因子受容体、例えば、ＶＥＧＦＲ２に結合する異なる抗体、例えば、ｓｃＦｖをコードする遺伝子を含み得る。本明細書で開示される特定の例では、腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書で開示されるいずれかなどのαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂをコードする遺伝子および抗ＶＥＧＦＲ２ ｓｃＦｖ、例えば、配列番号４９に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するＶＥＧＦＲ２ ｓｃＦＶなどをコードする遺伝子を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示されるような腫瘍溶解性ウイルスは、１）αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ、２）ＩＬ－１２ポリペプチドおよび３）抗ＶＥＧＦＲ２ ｓｃＦｖをコードする。

【0021】

αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂを発現する遺伝子構築物および必要に応じて１つまたは複数のさらなる導入遺伝子を含む組換え腫瘍溶解性ＨＳＶであり得る組換え腫瘍溶解性ウイルスおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物がさらに含まれる。腫瘍溶解性ウイルスは、生理食塩水溶液、例えば、ＰＢＳ、リンゲルまたはＨＢＳＳなどの中で提供される場合があり、製剤は、必要に応じて、限定されない例として、１種または複数の保存料または凍結保護物質（例えば、ＤＭＳＯまたはグリセロール）をさらに含み得る。一部の実施形態では、医薬組成物中のウイルスの濃度は、１ｍｌあたり少なくとも１０^６、１ｍｌあたり少なくとも１０^７、１ｍｌあたり少なくとも５×１０^７、または１ｍｌあたり少なくとも１０^８である。

【0022】

さらに別の態様は、本明細書で提供されるような医薬組成物を含む、本明細書で提供されるようなαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂをコードする腫瘍溶解性ウイルスを投与することによってがんを処置する方法である。腫瘍溶解性ウイルスは、１つまたは複数のさらなる導入遺伝子、例えば、それだけには限らないが、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードする遺伝子および／またはＶＥＧＦＲ２に結合する抗体をコードする遺伝子を含み得る。対象は、血液がんまたは固形腫瘍であり得るがんを有すると診断された対象であり得る。対象は、限定されない例として、イヌ、ウマまたは霊長類であり得、ヒト対象であり得る。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ＨＳＶであり得、投与は、例えば、静脈内、動脈内、腔内、腹腔内、腫瘍内または腫瘍周囲送達であり得る。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、注射によって、注入によって、またはカテーテルの手段によって送達され得る。方法は、複投薬が数日、数週間または数カ月、離れている数回の投与を含み得る。

【0023】

また、本明細書で開示される腫瘍溶解性ウイルスのいずれかに感染した細胞を培養することによって生成されるＶＦＣＭを使用する対象を処置する方法も提供される。

【0024】

また、本明細書で提供されるようなαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂを発現する遺伝子構築物を含む腫瘍溶解性ウイルスに感染した宿主細胞も本明細書で提供される。宿主細胞は、例えば、哺乳動物宿主細胞であり得、細胞株であり得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｖｅｒｏ細胞、ＢＨＫ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である。また、本明細書で開示される腫瘍溶解性ウイルスのいずれかに感染した細胞を培養することによって生成されたＶＦＣＭを使用してがんを有する対象を処置する方法も提供される。ＶＣＦＭは、例えば、細胞上清の遠心分離および濾過によって調製でき、ＶＦＣＭは、腫瘍溶解性ウイルスによってコードされる１種または複数の組換えポリペプチド、例えば、本明細書で提供されるようなαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂなど、および必要に応じて、ＩＬ－１２および／または抗ＶＥＧＦＲ２抗体を含み得る。処置されるべき対象は、一部の実施形態では、非ヒト対象であり得る。

【0025】

さらなる態様において、二重特異性抗体を発現する遺伝子構築物を含む腫瘍溶解性ウイルスに感染した宿主細胞を培養して、二重特異性抗体を含むウイルス不含条件細胞培地（ＶＦＣＭ）を生成することおよびＶＦＣＭから二重特異性抗体を単離することによって、本明細書で開示されるαＲＯＲ１／αＣＤ３二重特異性抗体のいずれかを生成することを含む二重特異性抗体を生成する方法が提供される。ＶＦＣＭは、１種または複数のさらなるポリペプチドまたは抗体、例えば、それだけには限らないが、ＩＬ－１２ポリペプチドおよび／またはＶＥＧＦＲ２に結合する抗体を含み得る。本明細書で開示されるようなαＲＯＲ１／αＣＤ３二重特異性抗体を含む医薬組成物および本明細書で開示されるようなαＲＯＲ１／αＣＤ３二重特異性抗体を対象に投与することによってがんを有する対象を処置する方法がさらに含まれる。一部の実施形態では、方法は、対象、例えば、それだけには限らないが、非ヒト対象を、例えば、遠心分離および濾過を使用して細胞培養物から調製され得るＶＦＣＭで処置することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】図１は、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体をコードする構築物（右から左に転写される）の一例を示す概略図である。

【0027】

【図2】図２Ａは、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体のＥＬＩＳＡ検出アッセイの形式を例示する。図２Ｂは、ＨＳＶ ＳｅｐＧＩ－１８９、ＳｅｐＧＩ－２０１およびＳｅｐＧＩ－２０３に感染した細胞によって生成される抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体の結合曲線を提供する。細胞培養物のＶＦＣＭがアッセイされた。

【0028】

【図3A】図３Ａは、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体の細胞結合アッセイの形式を例示する。野生型Ａ５４９細胞はＲＯＲ１を発現し、ＲＯＲ１遺伝子についてノックアウトされたＡ５４９細胞も対照として試験された。

【0029】

【図3B】図３Ｂは、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体の細胞結合アッセイの結果を提供する。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３ ＢｓｐＡｂをコードするウイルスＳｅｐＧＩ－１８９、ＳｅｐＧＩ－２０１およびＳｅｐＧＩ－２０３に感染した細胞の培養物のＶＦＣＭがアッセイされた。

【0030】

【図4A】図４Ａは、Ｔ細胞腫瘍細胞相互作用アッセイの形式を例示する。

【0031】

【図4B】図４Ｂは、ＨＳＶ ＳｅｐＧＩ－１８９、ＳｅｐＧＩ－２０１およびＳｅｐＧＩ－２０３に感染した培養物のＶＦＣＭＳ中に存在するαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓＡｂによって媒介されるようなＴ細胞腫瘍細胞相互作用のフローサイトメトリー分析の結果を提供する。

【0032】

【図5A】図５Ａは、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体のルシフェラーゼベースの細胞シグナル伝達アッセイの形式を例示する。

【0033】

【図5B】図５Ｂは、ＨＳＶ ＳｅｐＧＩ－１８９、ＳｅｐＧＩ－２０１およびＳｅｐＧＩ－２０３に感染した培養物のＶＦＣＭＳを使用する細胞シグナル伝達アッセイの結果を提供する。

【0034】

【図6】図６は、Ｔ細胞およびＨＳＶ ＳｅｐＧＩ－１８９、ＳｅｐＧＩ－２０１およびＳｅｐＧＩ－２０３に感染した培養物のＶＦＣＭＳを含んでいた細胞傷害性アッセイにおける死滅パーセントを提供する。右のグラフにおいてＴ細胞によるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）分泌も提供される。

【0035】

【図7A】図７Ａは、抗ＲＯＲ１抗体のＡ５４９、Ａ５４９／ＲＯＲ１ ＫＯ、ＭＣＦ－７およびＨｅｐＧ２腫瘍細胞への結合のグラフを提供する。

【0036】

【図7B-1】図７Ｂは、Ｔ細胞およびαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓＡｂを発現するＳｅｐＧＩ－２０１ ＨＳＶに感染した培養物のＶＦＣＭを含んでいた、標的としてＡ５４９、ＭＣＦ－７およびＨｅｐＧ２腫瘍細胞を使用する細胞傷害性アッセイにおける死滅パーセントのグラフを提供する。対照は、Ｔ細胞の不在下でのアッセイおよびαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓＡｂを発現しなかったＳｅｐＧＩ－ヌルウイルスに感染した細胞から生成されたＶＦＣＭのアッセイを含んでいた。また、共培養物のＩＦＮγアッセイの結果も提供される。

【0037】

【図7B-2】図７Ｂは、Ｔ細胞およびαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓＡｂを発現するＳｅｐＧＩ－２０１ ＨＳＶに感染した培養物のＶＦＣＭを含んでいた、標的としてＡ５４９、ＭＣＦ－７およびＨｅｐＧ２腫瘍細胞を使用する細胞傷害性アッセイにおける死滅パーセントのグラフを提供する。対照は、Ｔ細胞の不在下でのアッセイおよびαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓＡｂを発現しなかったＳｅｐＧＩ－ヌルウイルスに感染した細胞から生成されたＶＦＣＭのアッセイを含んでいた。また、共培養物のＩＦＮγアッセイの結果も提供される。

【0038】

【図8A】図８Ａは、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓＡｂを発現するＨＳＶによるＡ５４９腫瘍細胞の死滅のアッセイの手順を提供する。

【0039】

【図8B】図８Ｂは、多様なＭＯＩで培養物に感染するように使用されたウイルスによるＲＯＲ１陽性腫瘍細胞およびＲＯＲ１ノックアウト細胞の死滅の増強を実証するグラフを提供する。

【0040】

【図9A】図９Ａは、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体によるマウスＲＯＲ１の結合についてのＥＬＩＳＡ検出アッセイの形式を例示する。

【0041】

【図9B】図９Ｂは、マウスＲＯＲ１に対する抗体ｓ１０およびｊｌｖ１０１１の結合曲線を提供する。

【0042】

【図10A】図１０Ａは、ＨＳＶ ＳｅｐＧＩ－１８９およびＳｅｐＧＩ－２０１を用いる腫瘍の処置のｉｎ ｖｉｖｏ研究の腫瘍接種および処置スケジュールを提供する。

【0043】

【図10B】図１０Ｂは、ＨＳＶ ＳｅｐＧＩ－１８９およびＳｅｐＧＩ－２０１を用いて処置された、Ａ５４９腫瘍接種マウスの腫瘍体積のグラフを提供する。

【0044】

【図10C】図１０Ｃは、ＨＳＶ ＳｅｐＧＩ－ヌル、ＳｅｐＧＩ－１８９およびＳｅｐＧＩ－２０１を用いて処置されたマウスの腫瘍成長阻害パーセントのグラフを提供する。

【0045】

【図10D】図１０Ｄは、図１０Ａ、ＢおよびＣに示される研究の過程にわたる体重のグラフを提供する。

【0046】

【図11A】図１１Ａは、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体（右から左に転写される）およびヒトＩＬ－１２ポリペプチド（左から右に転写される）をコードする構築物の例を示す概略図である。

【0047】

【図11B】図１１Ｂは、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体（右から左に転写される）および抗ＶＥＧＦＲ２ ｓｃＦｖおよびヒトＩＬ－１２ポリペプチドをコードする構築物の例を示す概略図である。抗ＶＥＧＦＲ２ ｓｃＦｖおよびヒトＩＬ－１２ポリペプチドは、同一プロモーターによって左から右に転写され、それらのコード配列は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドをコードする配列を介して接続される。

【0048】

【図12A】図１２Ａは、様々なＨＳＶに感染した細胞のＶＦＣＭにおける抗ＲＳＶ抗体を検出するためのＥＬＩＳＡの結果を提供する。グラフは、ＳｅｐＧＩ－２０７およびＳｅｐＧＩ－２１８ ＶＦＣＭが、抗ＲＳＶ抗体を含んでいたことを示す。

【0049】

【図12B】図１２Ｂは、様々なＨＳＶに感染した細胞のＶＦＣＭにおける抗ＲＯＲ１抗体を検出するためのＥＬＩＳＡの結果を提供する。グラフは、ＳｅｐＧＩ－２０１、ＳｅｐＧＩ－２１２およびＳｅｐＧＩ－２１６ ＶＦＣＭが抗ＲＯＲ１抗体を含んでいたことを示す。

【0050】

【図12C】図１２Ｃは、様々なＨＳＶに感染した細胞のＶＦＣＭにおけるヒトＩＬ－１２を検出するためのＥＬＩＳＡの結果を提供する。グラフは、ＳｅｐＧＩ－２１２、ＳｅｐＧＩ－２１６およびＳｅｐＧＩ－２１８ ＶＦＣＭがヒトＩＬ－１２を含んでいたことを示す。

【0051】

【図13】図１３は、様々なＨＳＶに感染した細胞のＶＦＣＭにおける抗ＶＥＧＦＲ２抗体を検出するためのＥＬＩＳＡの結果を提供する。グラフは、ＳｅｐＧＩ－２１２の分離株のＶＦＣＭが抗ＶＥＧＦＲ２抗体を含んでいたことを示す。

【0052】

【図14】図１４は、ＨＳＶ ＳｅｐＧＩ－ヌル、ＳｅｐＧＩ－２０１、ＳｅｐＧＩ－２０７、ＳｅｐＧＩ－２１２、ＳｅｐＧＩ－２１４、ＳｅｐＧＩ－２１６およびＳｅｐＧＩ－２１８に感染した細胞のＶＦＣＭにおけるＩＬ－１２の活性を検出するアッセイの結果を提供する棒グラフである。

【0053】

【図15A】図１５Ａは、非標識腫瘍細胞のフローサイトメトリーの結果を提供する。

【0054】

【図15B】図１５Ｂは、ｅＦｌｕｏｒ ４５０で標識された腫瘍細胞のフローサイトメトリーの結果を提供する。

【0055】

【図15C】図１５Ｃは、ｅＦｌｕｏｒ ６７０で標識されたヒトＴ細胞のフローサイトメトリーの結果を提供する。

【0056】

【図15D】図１５Ｄは、抗ＲＯＲ１－抗ＣＤ３二重特異性抗体を含んでいたＶＦＣＭと共培養された標識された腫瘍細胞および標識されたＴ細胞のフローサイトメトリーの結果を提供する。

【0057】

【図16A】図１６Ａは、腫瘍細胞がＨｅｐａ １－６、Ａ５４９およびＡ５４９ ＲＯＲ１ノックアウト細胞であった場合の、分析された細胞のパーセンテージとしての、ＳｅｐＧＩ－２１８ ＶＦＣＭ（αＲＳＶ－αＣＤ３ ｂｓｐ抗体およびＩＬ－１２）によって媒介される腫瘍細胞－Ｔ細胞相互作用のフローサイトメトリーアッセイの結果の棒グラフを提供する。

【0058】

【図16B】図１６Ｂは、腫瘍細胞が、Ｈｅｐａ １－６およびＡ５４９細胞であった場合の、分析された細胞のパーセンテージとしての、ＳｅｐＧＩ－２０１ ＶＦＣＭ（αＲＯＲ１－αＣＤ３ ｂｓｐ抗体）によって媒介される腫瘍細胞－Ｔ細胞相互作用のフローサイトメトリーアッセイの結果の棒グラフを提供する。

【0059】

【図16C】図１６Ｃは、腫瘍細胞がＨｅｐａ １－６およびＡ５４９細胞であった場合の、分析細胞のパーセンテージとしての、ＳｅｐＧＩ－２１６ ＶＦＣＭ（αＲＯＲ１－αＣＤ３ ｂｓｐ 抗体およびＩＬ－１２およびＶＥＧＦＲ２抗体）によって媒介される腫瘍細胞－Ｔ細胞相互作用のフローサイトメトリーアッセイの結果の棒グラフを提供する。

【0060】

【図17A-B】図１７Ａは、Ｔ細胞がＲＯＲ１ノックアウト腫瘍標的細胞の存在下でインキュベートされた場合の、３日にわたるＴ細胞活性化アッセイにおいて使用された生存ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージを示すグラフである（日毎に左から右に進行するバーの）：非感染細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－ヌルに感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０７に感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０１に感染した細胞のＶＦＣＭおよびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ。バーの各対の第１のものは、１０：１のＥ：Ｔ比で実施されたアッセイの値を提供し、バーの各対の第２のものは、５：１のＥ：Ｔ比で実施されたアッセイの値を提供する。図１７Ｂは、Ｔ細胞活性化アッセイの各々におけるＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞計数を提供するグラフである。アッセイＶＦＣＭおよびＥ：Ｔ比は、図１７Ａにおけるとおりである。

【0061】

【図17C-D】図１７Ｃは、Ｔ細胞がＲＯＲ１＋腫瘍標的細胞の存在下でインキュベートされている活性化アッセイにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞のパーセンテージとしてのＣＤ２５＋Ｔ細胞を提供する（日毎に左から右に進行するバーの）：非感染細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－ヌルに感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０７に感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０１に感染した細胞のＶＦＣＭおよびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ。バーの各対の第１のものは、１０：１のＥ：Ｔ比で実施されたアッセイの値を提供し、バーの各対の第２のものは、５：１のＥ：Ｔ比で実施されたアッセイの値を提供する。図１７Ｄは、Ｔ細胞がＲＯＲ１＋腫瘍標的細胞の存在下でインキュベートされている活性化アッセイにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞のパーセンテージとしてのＣＤ６９＋Ｔ細胞を提供する（日毎に左から右に進行するバーの）：非感染細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－ヌルに感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０７に感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０１に感染した細胞のＶＦＣＭおよびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ。バーの各対の第１のものは、１０：１のＥ：Ｔ比で実施されたアッセイの値を提供し、バーの各対の第２のものは、５：１のＥ：Ｔ比で実施されたアッセイの値を提供する。

【0062】

【図17E-F】図１７Ｅは、Ｔ細胞がＲＯＲ１＋腫瘍標的細胞の存在下でインキュベートされた場合の３日にわたるＴ細胞活性化アッセイにおいて使用された生存ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージを示すグラフ（日毎に左から右に進行するバーの）である：非感染細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－ヌルに感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０７に感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０１に感染した細胞のＶＦＣＭおよびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ。バーの各対の第１のものは、１０：１のＥ：Ｔ比で実施されたアッセイの値を提供し、バーの各対の第２のものは、５：１のＥ：Ｔ比で実施されたアッセイの値を提供する。図１７Ｆは、Ｔ細胞活性化アッセイの各々におけるＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞計数を提供するグラフである。アッセイＶＦＣＭおよびＥ：Ｔ比は、図１７Ｅにおけるとおりである。

【0063】

【図17G-H】図１７Ｇは、Ｔ細胞がＲＯＲ１＋腫瘍標的細胞の存在下でインキュベートされた活性化アッセイにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞のパーセンテージとしてのＣＤ２５＋Ｔ細胞を提供する（日毎に左から右に進行するバーの）：非感染細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－ヌルに感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０７に感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０１に感染した細胞のＶＦＣＭおよびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ。バーの各対の第１のものは、１０：１のＥ：Ｔ比で実施されたアッセイの値を提供し、バーの各対の第２のものは、５：１のＥ：Ｔ比で実施されたアッセイの値を提供する。図１７Ｈは、Ｔ細胞がＲＯＲ１＋腫瘍標的細胞の存在下でインキュベートされた活性化アッセイにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞のパーセンテージとしてのＣＤ６９＋Ｔ細胞を提供する（日毎に左から右に進行するバーの）：非感染細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－ヌルに感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０７に感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０１に感染した細胞のＶＦＣＭおよびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ。バーの各対の第１のものは、１０：１のＥ：Ｔ比で実施されたアッセイの値を提供し、バーの各対の第２のものは、５：１のＥ：Ｔ比で実施されたアッセイの値を提供する。

【0064】

【図18A】図１８Ａは、Ｔ細胞がＡ５４９野生型（ＲＯＲ１＋）腫瘍標的細胞の存在下でインキュベートされた場合の、３日にわたるＴ細胞活性化アッセイにおいて使用された生存ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージを示すグラフである（日毎に左から右に進行するバーの）：ＳｅｐＧＩ－ヌルに感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０７に感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０１に感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２１８に感染した細胞のＶＦＣＭおよびＳｅｐＧＩ－２１６に感染した細胞のＶＦＣＭ。５：１のＥ：Ｔ比で実施されたアッセイ。

【0065】

【図18B】図１８Ｂは、Ｔ細胞がＡ５４９ ＲＯＲ１ノックアウト腫瘍標的細胞の存在下でインキュベートされた場合の、３日にわたるＴ細胞活性化アッセイにおいて使用された生存ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージを示すグラフ（日毎に左から右に進行するバーの）である：ＳｅｐＧＩ－ヌルに感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０７に感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０１に感染した細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２１８に感染した細胞のＶＦＣＭおよびＳｅｐＧＩ－２１６に感染した細胞のＶＦＣＭ。５：１のＥ：Ｔ比で実施されたアッセイ。

【0066】

【図19A-B】図１９Ａは、標的がルシフェラーゼを発現するＡ５４９野生型細胞であり、アッセイが非感染細胞またはＳｅｐＧＩ－ヌル、ＳｅｐＧＩ－２０１、ＳｅｐＧＩ－２０７、ＳｅｐＧＩ－２１２、ＳｅｐＧＩ－２１４、ＳｅｐＧＩ－２１６およびＳｅｐＧＩ－２１８に感染した細胞のＶＦＣＭの存在下で実施された場合の、Ｔ細胞の不在下および存在下でのルシフェラーゼベースの毒性アッセイの結果を示すグラフである。図１９Ｂは、標的がルシフェラーゼを発現するＡ５４９ ＲＯＲ１ノックアウト細胞であり、アッセイが非感染細胞またはＳｅｐＧＩ－ヌル、ＳｅｐＧＩ－２０１、ＳｅｐＧＩ－２０７、ＳｅｐＧＩ－２１２、ＳｅｐＧＩ－２１４、ＳｅｐＧＩ－２１６およびＳｅｐＧＩ－２１８に感染した細胞のＶＦＣＭの存在下で実施された場合の、Ｔ細胞の不在下および存在下でのルシフェラーゼベースの毒性アッセイの結果を示すグラフである。

【0067】

【図19C-D】図１９Ｃは、図１７Ｃのアッセイの死滅パーセンテージを提供するグラフである。図１９Ｄは、図１７Ｂのアッセイの死滅パーセンテージを提供するグラフである。

【0068】

【図20】図２０は、標的としてＡ５４９野生型細胞を使用するインピーダンスベースの細胞傷害性アッセイにおける細胞の経時的な細胞指数を示す。実施例１８を参照されたい。

【0069】

【図21】図２１は、標的としてＡ５４９ノックアウト細胞を使用するインピーダンスベースの細胞傷害性アッセイにおける細胞の経時的な細胞指数を示す。実施例１８を参照されたい。

【発明を実施するための形態】

【0070】

詳細な説明

【0071】

本出願を通じて、多様な刊行物、特許および／または特許出願が参照される。刊行物、特許および／または特許出願の開示内容は、本開示が関係する最先端技術をより十分に説明するために、ここで参照によりその全体が本出願に組み込まれる。

【0072】

定義：

【0073】

別に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、別に定義されない限り、当業者に一般に理解される意味を有する。一般に、本明細書で記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、トランスジェニック細胞生成、タンパク質化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションの技術に関係する用語法は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されている。特に断りのない限り、本明細書で提供される方法および技術は、一般に、当技術分野で周知の、ならびに本明細書で引用され、論じられる多様な一般的なおよびより具体的な参考文献に記載されるような従来の手順に従って実施される。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)を参照されたい。Borrebaeck (ed) Antibody Engineering, 2nd Edition Freeman and Company, NY, 1995; McCafferty et al. Antibody Engineering, A Practical Approach IRL at Oxford Press, Oxford, England, 1996；およびPaul (1995) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, N.J., 1995; Paul (ed.), Fundamental Immunology, Raven Press, N.Y, 1993; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, Calif.およびそれに引用された参考文献； Coding Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed.) Academic Press, New York, N.Y., 1986, and Kohler and Milstein Nature 256: 495-497, 1975を含むいくつかの基本教本には、標準的な抗体生成プロセスが記載されている。本明細書で引用される参考文献のすべては、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。酵素反応および濃縮／精製技術も周知であり、当技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書で記載されるように、製造業者の仕様書に従って実施される。本明細書で記載される分析化学、合成有機化学および医薬品化学および製薬化学に関連して使用される技術用語ならびにその実験手順および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されている。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤化および送達および患者の処置のために使用され得る。

【0074】

本明細書で提供される見出しは、本開示の多様な態様の制限ではなく、それらの態様は、全体として本明細書を参照することによって理解され得る。

【0075】

本明細書の文脈によって別に必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」および任意の単語の単数形使用は、明示的に、明白に１つの指示対象に制限しない限り、複数形の指示対象を含む。

【0076】

本明細書における代替語（例えば、「または」）の使用は、代替語の一方または両方、またはそれらの任意の組合せのいずれかを意味すると解釈されることは理解される。

【0077】

本明細書で使用される「および／または」という用語は、特定の特徴または構成成分の各々の、他方の有無にかかわらず、特定の開示を意味すると解釈されるべきである。例えば、本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用されるような「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むように意図される。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの語句において使用されるような「および／または」という用語は、以下の態様の各々：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）を包含するように意図される。

【0078】

本明細書で使用される場合、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」および「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語ならびにそれらの文法的な異形は、本明細書で使用される場合、リスト中の１つの項目または複数の項目が、列挙される項目と置換され得る、またはそれに付加され得る他の項目を除外しないような限定されないように意図される。態様が「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉と共に本明細書で記載される場合は常に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の用語で記載されるそうではない類似の態様も提供されるということは理解される。

【0079】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者によって決定されるような特定の値または組成の許容される誤差範囲内である値または組成を指し、これは、幾分かは値または組成が測定または決定される方法、すなわち、測定システムの制限に応じて変わる。例えば、「約」または「およそ」は、当技術分野における慣行によって１以内または１より大きい標準偏差を意味する場合がある。あるいは、「約」または「およそ」は、測定システムの制限に応じて最大１０％（すなわち、±１０％）の範囲またはより多くを意味する場合がある。例えば、約５ｍｇは、４．５ｍｇから５．５ｍｇの間の任意の数字を含み得る。さらに、特に、生物システムまたはプロセスに関しては、この用語は、値の最大１桁または最大５倍を意味する場合がある。本開示において特定の値または組成が提供される場合は、別に明記されない限り、「約」または「およそ」の意味は、その特定の値または組成の許容される誤差範囲内であると想定されるべきである。

【0080】

「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語および本明細書で使用される他の関連用語は、同義的に使用され、アミノ酸のポリマーを指し、任意の特定の長さに制限されない。ポリペプチドは、天然および非天然アミノ酸を含み得る。ポリペプチドは、組換え形態または化学合成形態を含む。ポリペプチドはまた、切断、例えば、分泌シグナルペプチドによる、またはある特定のアミノ酸残基での非酵素的切断による切断にまだ付されていない前駆体分子も含む。ポリペプチドは、切断を起こしている成熟した分子を含む。これらの用語は、天然タンパク質および人工タンパク質、タンパク質断片およびタンパク質配列のポリペプチドアナログ（ムテイン、バリアント、キメラタンパク質および融合タンパク質など）ならびに翻訳後に、またはそうでなければ共有結合によって、もしくは非共有結合によって改変されたタンパク質を包含する。２つまたはそれより多いポリペプチド（例えば、３つのポリペプチド鎖）が、共有結合および／または非共有結合による会合によって互いに会合して、ポリペプチド複合体を形成する場合がある。ポリペプチド鎖の会合はまた、ペプチドフォールディングを含み得る。したがって、ポリペプチド複合体は、複合体を形成するポリペプチド鎖の数に応じて二量体、三量体、四量体または高次複合体であり得る。

【0081】

「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語および本明細書で使用される他の関連用語は、同義的に使用され、ヌクレオチドのポリマーを指し、任意の特定の長さに制限されない。核酸は、組換え形態および化学合成形態を含む。核酸は、ＤＮＡ分子（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログ（例えば、ペプチド核酸および天然に存在しないヌクレオチドアナログ）を使用して作製されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログおよびそれらのハイブリッドを含む。核酸分子は、一本鎖である場合も、二本鎖である場合もある。一実施形態では、本開示の核酸分子は、抗体またはその断片またはｓｃＦｖ、誘導体、ムテインまたはバリアントをコードする連続オープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、核酸は、１種類のポリヌクレオチドまたは２種またはそれより多い様々な種類のポリヌクレオチドの混合物を含む。二重特異性抗体をコードする核酸が本明細書で記載される。

【0082】

「回収する」または「回収」または「回収すること」という用語および他の関連用語は、宿主細胞培養培地から、または宿主細胞溶解物から、または宿主細胞膜からタンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合部分）を得ることを指す。一実施形態では、タンパク質は、宿主細胞によって宿主細胞から（例えば、哺乳動物宿主細胞から）の発現されたタンパク質の分泌を媒介する分泌シグナルペプチド（リーダーペプチド配列）配列に融合された組換えタンパク質として発現される。分泌されたタンパク質は、宿主細胞培地から回収できる。一実施形態では、タンパク質は、宿主細胞によって分泌シグナルペプチド配列を欠く組換えタンパク質として発現され、これは、宿主細胞溶解物から回収できる。一実施形態では、タンパク質は、宿主細胞によって膜結合タンパク質として発現され、これは、発現されたタンパク質を宿主細胞膜から放出するための界面活性剤を使用して回収できる。一実施形態では、タンパク質を回収するために使用される方法に関わらず、タンパク質は、回収されたタンパク質から細胞片を除去する手順に付される場合がある。例えば、回収されたタンパク質は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および／または透析に付される場合がある。一実施形態では、クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび／またはシリカでのクロマトグラフィーを含む手順のいずれか１つまたは任意の組合せまたは２つもしくはそれより多くを含む。一実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、プロテインＡまたはＧ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の細胞壁構成成分）を含む。

【0083】

「単離された」という用語は、他の細胞性材料を実質的に含まないタンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合部分）またはポリヌクレオチドを指す。タンパク質を、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用する単離によって、天然に関連している構成成分（または抗体を生成するために使用される細胞性発現システムまたは化学合成法と関連する構成成分）を実質的に含まないようにできる。単離されたという用語はまた、同一種の他の分子、例えば、それぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチド配列を有する他のタンパク質またはポリヌクレオチドを実質的に含まないタンパク質またはポリヌクレオチドを指す。所望の分子の均一性の純度は、ゲル電気泳動などの低分解能法およびＨＰＬＣまたは質量分析などの高分解能法を含む当技術分野で周知の技術を使用してアッセイできる。多様な実施形態では、本開示の二重特異性抗体は単離される。

【0084】

「シグナルペプチド」、「［ペプチド］シグナル配列」、「リーダー配列」、「リーダーペプチド」または「分泌シグナルペプチド」という用語は、ポリペプチドのＮ末端に位置するペプチド配列を指す。リーダー配列は、ポリペプチド鎖を細胞分泌経路に向かわせ、細胞膜の脂質二重層への膜タンパク質の組み込みおよび繋留を指示できる。通常、リーダー配列は、約１０～６０個のアミノ酸長であり、より一般的には、１５～５０個のアミノ酸長である。リーダー配列は、サイトゾルから小胞体への前駆体ポリペプチドの輸送を指示できる。多様な実施形態では、リーダー配列は、ＣＤ８α、ＣＤ２８もしくはＣＤ１６リーダー配列またはマウスもしくはヒトＩｇガンマ分泌シグナルペプチドを含むシグナル配列を含む。一実施形態では、リーダー配列は、マウスＩｇガンマリーダーペプチド配列ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号）を含む。

【0085】

「抗原結合タンパク質」および本明細書で使用される関連する用語は、抗原に結合する部分および必要に応じて抗原結合部分が、抗原への抗原結合タンパク質の結合を促進するコンホメーションを採ることを可能にする足場またはフレームワーク部分を含むタンパク質を指す。抗原結合タンパク質の例として、抗体、抗体断片（例えば、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体および抗体アナログが挙げられる。抗原結合タンパク質は、例えば、グラフトされたＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を有する代替タンパク質足場または人工足場を含み得る。このような足場として、それだけには限らないが、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化するために導入された突然変異を含む抗体由来足場ならびに例えば、生体適合性ポリマーを含む完全合成足場が挙げられる。例えば、Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654を参照されたい。さらに、ペプチド抗体ミメティクス（「ＰＡＭ」）ならびに足場としてフィブロネクチン構成成分を利用する抗体ミメティクスをベースとする足場を使用できる。

【0086】

抗原結合タンパク質は、例えば、天然に存在する免疫グロブリンの構造を有する場合がある。一実施形態では、「免疫グロブリン」とは、ポリペプチド鎖の２つの同一対から構成され、各対が１つの「軽」（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する天然に存在する四量体分子を指す。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００～１１０またはそれより多いアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。ヒト軽鎖はカッパまたはラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。軽および重鎖内で、可変および定常領域は、約１２個またはそれより多いのアミノ酸の「Ｊ」領域によって接合され、重鎖はまた約１０個またはそれより多いアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。全般的に、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))（すべての目的のためにその全体で参照によって組み込まれる）を参照されたい。重および／または軽鎖は、分泌のためのリーダー配列を含む場合も含まない場合もある。各軽／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成し、その結果、無傷免疫グロブリンは、２つの抗原結合部位を有する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、四量体免疫グロブリン分子とは異なるが、標的抗原に依然として結合する、または２つもしくはそれより多くの標的抗原に結合する構造を有する合成分子であり得る。例えば、合成抗原結合タンパク質は、抗体断片、１～６またはそれより多いポリペプチド鎖、ポリペプチドの非対称アセンブリーまたは他の合成分子を含み得る。多様な実施形態では、本開示の二重特異性抗体は、免疫グロブリン様特性を示し、２つの異なる標的抗原（ＲＯＲ１およびＣＤ３）に特異的に結合する。

【0087】

免疫グロブリン鎖の可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって接合されている相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般構造を示す。Ｎ末端からＣ末端に、軽および重鎖の両方がドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。

【0088】

１つまたは複数のＣＤＲを、共有結合的にまたは非共有結合的に分子中に組み込み、それを抗原結合タンパク質にできる。抗原結合タンパク質は、ＣＤＲ（複数可）を大きなポリペプチド鎖の一部として組み込むことができ、ＣＤＲ（複数可）を別のポリペプチド鎖に共有結合的に連結することができる、またはＣＤＲ（複数可）を非共有結合的に組み込むことができる。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が目的の特定の抗原に特異的に結合することを可能にする。

【0089】

各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991中のＫａｂａｔらの定義（「Ｋａｂａｔ番号付け」）に従う。免疫グロブリン鎖中のアミノ酸の他の番号付けシステムには、ＩＭＧＴ．ＲＴＭ．（国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム； Lefranc et al, Dev. Comp. Immunol. 29:185-203; 2005)およびＡＨｏ(Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-670; 2001)；Chothia(Al-Lazikani et al., 1997 Journal of Molecular Biology 273:927-948; Contact(Maccallum et al., 1996 Journal of Molecular Biology 262:732-745およびＡｈｏ(Honegger and Pluckthun 2001 Journal of Molecular Biology 309:657-670が含まれる。

【0090】

「抗体（単数および複数）」および本明細書で使用される関連用語は、抗原に特異的に結合する無傷免疫グロブリンまたはその抗原結合部分を指す。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生成され得る。抗原結合部分には、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドが含まれる。

【0091】

抗体は、組換えによって生成された抗体および抗原結合部分を含む。抗体には、非ヒト、キメラ、ヒト化および完全ヒト抗体が含まれる。抗体には、単一特異性、多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性および高次特異性）が含まれる。抗体には、四量体抗体、軽鎖単量体、重鎖単量体、軽鎖二量体、重鎖二量体が含まれる。抗体には、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ’断片およびＦａｂ断片が含まれる。抗体には、単一ドメイン抗体、一価抗体、単鎖抗体、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、アフィボディ、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）、ミニボディが含まれる。抗体には、モノクローナルおよびポリクローナル集団が含まれる。本明細書で記載される一部の実施形態では、二重特異性抗体は、２つの単鎖可変断片抗体を含み、これらはリンカーによって接合された二重特異性抗体分子の「ｓｃＦｖ部分」または簡単に「ｓｃＦｖ」として記載される場合がある。

【0092】

「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」または「抗原結合部位」および本明細書で使用される他の関連用語とは、抗原と相互作用し、抗原結合タンパク質の抗原に対する特異性および親和性に寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を含有する抗原結合タンパク質の一部分を指す。その抗原に特異的に結合する抗体について、これはそのＣＤＲドメインのうち少なくとも１つの少なくとも一部を含む。モノクローナル抗体および二重特異性抗体からの抗原結合ドメインが、本明細書で提供される。

【0093】

「特異的結合」、「特異的に結合する」または「特異的に結合すること」という用語および他の関連用語は、抗体または抗原結合タンパク質（例えば、ヘテロ二量体抗体）または抗体断片の文脈において本明細書で使用される場合、他の分子または部分と比べて抗原に対する非共有結合性または共有結合性優先的結合を指す（例えば、抗体は、他の利用可能な抗原と比べて特定の抗原に特異的に結合する）。一実施形態では、抗体は、１０^－５Ｍもしくはそれ未満または１０^－６Ｍもしくはそれ未満または１０^－７Ｍもしくはそれ未満または１０^－８Ｍもしくはそれ未満または１０^－９Ｍもしくはそれ未満または１０^－１０Ｍもしくはそれ未満または１０^－１１Ｍもしくはそれ未満の解離定数Ｋ_Ｄで抗原に結合する場合に、標的抗原に特異的に結合する。ＲＯＲ１およびＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体が、本明細書で記載される。

【0094】

一実施形態では、結合特異性は、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エレクトロケミルミネッセンスアッセイ（ＥＣＬ）、免疫放射線測定法（ＩＲＭＡ）または酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）によって測定され得る。

【0095】

一実施形態では、解離定数（Ｋ_Ｄ）は、ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して測定され得る。表面プラズモン共鳴とは、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪのＢｉａｃｏｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ部門）を使用するバイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変更の検出によるリアルタイム相互作用の分析が可能になる光学的現象を指す。

【0096】

「エピトープ」および関連用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合タンパク質によって（例えば、抗体またはその抗原結合部分によって）結合される抗原の一部分を指す。エピトープは、抗原結合タンパク質によって結合される２つまたはそれより多い抗原の部分を含み得る。エピトープは、抗原の、または２つもしくはそれより多い抗原の非連続部分（例えば、抗原の一次配列においては連続していないが、抗原の三次および四次構造の状況では、抗原結合タンパク質によって結合されるのに互いに十分に近接しているアミノ酸残基）を含み得る。一般に、抗体の可変領域、特に、ＣＤＲは、エピトープと相互作用する。ＲＯＲ１ポリペプチドのエピトープに結合し、ＣＤ３ポリペプチドのエピトープに結合する二重特異性抗体が、本明細書で記載される。

【0097】

「抗体断片」、「抗体部分」、「抗体の抗原結合断片」または「抗体の抗原結合部分」および本明細書で使用される他の関連用語は、無傷抗体が結合する抗原に結合する無傷抗体の一部分を含む無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、それだけには限らないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ＦｄおよびＦｖ断片ならびにｄＡｂ、ダイアボディ、線形抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、ポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分である抗体の少なくとも一部分を含有するポリペプチドが挙げられる。抗体の抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生成され得る。抗原結合部分には、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよび抗体断片に抗原結合特性を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドが含まれる。

【0098】

「Ｆａｂ」、「Ｆａｂ断片」という用語および他の関連用語とは、軽鎖可変鎖領域（Ｖ_Ｌ）、定常軽鎖領域（Ｃ_Ｌ）、重鎖可変鎖領域（Ｖ_Ｈ）および第１の定常領域（Ｃ_Ｈ１）を含む一価断片を指す。Ｆａｂは、抗原に結合可能である。Ｆ（ａｂ’）_２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片である。Ｆ（Ａｂ’）_２は、抗原結合能を有する。Ｆｄ断片は、Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１領域を含む。Ｆｖ断片は、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域を含む。Ｆｖは、抗原に結合できる。ｄＡｂ断片は、Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_ＬドメインまたはＶ_ＨもしくはＶＬドメインの抗原結合断片を有する（米国特許第６，８４６，６３４号および同６，６９６，２４５号；米国公開出願第２００２／０２５１２号、同２００４／０２０２９９５号、同２００４／００３８２９１号、同２００４／０００９５０７号、同２００３／００３９９５８号；およびWard et al., Nature 341:544-546, 1989）。

【0099】

単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域がリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して接合されて、連続タンパク質鎖を形成する抗体である。好ましくは、リンカーは、タンパク質鎖が折り畳まれて、一価抗原結合部位を形成することを可能にするのに十分に長い（例えば、Bird et al., 1988, Science 242:423-26およびHuston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83を参照されたい）。ＲＯＲ１に特異的に結合する単鎖抗体およびＣＤ３に特異的に結合する単鎖抗体が、本明細書で記載される。

【0100】

ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、各ポリペプチド鎖は、短すぎて同一鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にすることができず、したがって、各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対を形成するリンカーによって接合されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含む（例えば、Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48およびPoljak et al., 1994, Structure 2:1121-23を参照されたい）。ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一である場合には、その対形成に起因するダイアボディは、２つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖を使用して、２つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製できる。沿うように、トリアボディおよびテトラボディは、それぞれ３つおよび４つのポリペプチド鎖を含み、同一である場合も異なる場合もあるそれぞれ３つおよび４つの抗原結合部位を形成する抗体である。

【0101】

「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つまたは複数の可変および定常領域を有する抗体を指す。一実施形態では、可変および定常ドメインのすべては、ヒト免疫グロブリン配列（例えば、完全ヒト抗体）に由来する。これらの抗体は、種々の方法で調製でき、組換え方法論によって、またはヒト重および／もしくは軽鎖をコードする遺伝子に由来する抗体を発現するように遺伝子改変されているマウスの目的の抗原を用いる免疫化によってを含め、それらの例は以下に記載されている。

【0102】

「ヒト化」抗体とは、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失および／または付加によって非ヒト種に由来する抗体の配列とは異なる配列を有する抗体を指し、その結果、ヒト化抗体は、ヒト対象に投与された場合に非ヒト種抗体と比較して、免疫応答を誘導する可能性が低い、および／またはあまり重度ではない免疫応答を誘導する。一実施形態では、ヒト化抗体を生成するために、非ヒト種抗体の重および／または軽鎖のフレームワークおよび定常ドメイン中のある特定のアミノ酸が突然変異されている。別の実施形態では、ヒト抗体由来の定常ドメイン（複数可）が非ヒト種の可変ドメイン（複数可）に融合されている。別の実施形態では、ヒト対象に投与された場合の非ヒト抗体のあり得る免疫原性を低減するために、非ヒト抗体の１つまたは複数のＣＤＲ配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基が変更され、変更されるアミノ酸残基は、抗体のその抗原への免疫特異的結合にとって重要ではないか、またはヒト化抗体の抗原への結合が、非ヒト抗体の抗原への結合よりも大幅に悪化しないように、行われるアミノ酸配列への変更は保存的変化である。ヒト化抗体を作製する方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同５，８８６，１５２号および同５，８７７，２９３号に見出すことができる。

【0103】

「キメラ抗体」という用語および本明細書で使用される関連用語は、第１の抗体に由来する１つまたは複数の領域および１つまたは複数の他の抗体に由来する１つまたは複数の領域を含有する抗体を指す。一実施形態では、ＣＤＲのうち１つまたは複数が、ヒト抗体に由来する。別の実施形態では、ＣＤＲのすべてが、ヒト抗体に由来する。別の実施形態では、１つより多いヒト抗体に由来するＣＤＲが混合され、キメラ抗体に調和される。例えば、キメラ抗体は、第１のヒト抗体の軽鎖に由来するＣＤＲ１、第２のヒト抗体の軽鎖に由来するＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに第３の抗体からの重鎖に由来するＣＤＲを含み得る。別の例では、ＣＤＲは、ヒトおよびマウスまたはヒトおよびウサギまたはヒトおよびヤギなどの異なる種に起因する。当業者ならば、他の組合せがあり得ることは理解するであろう。

【0104】

さらに、フレームワーク領域は、同一抗体の１つに、１つまたは複数の異なる抗体、例えば、ヒト抗体に、またはヒト化抗体に由来し得る。キメラ抗体の一例では、重および／または軽鎖の一部分は、特定の種からの抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体と同一である、それと相同である、またはそれに由来し、鎖（複数可）の残部は、別の種からの抗体（複数可）または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体と同一である、それと相同である、またはそれに由来する。また、所望の生物活性（すなわち、標的抗原に特異的に結合する能力）を示すこのような抗体の断片も含まれる。

【0105】

本明細書で使用される場合、「バリアント」ポリペプチドおよびポリペプチドの「バリアント」という用語は、参照ポリペプチド配列と比べて、アミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸残基が挿入されている、欠失しているおよび／または置換されているアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。ポリペプチドバリアントは、融合タンパク質を含む。同じように、バリアントポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチド配列と比べて、ヌクレオチド配列に１つまたは複数のヌクレオチドが挿入されている、欠失しているおよび／または置換されているヌクレオチド配列を含む。ポリヌクレオチドバリアントは、融合ポリヌクレオチドを含む。

【0106】

本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「誘導体」という用語は、例えば、別の化学的部分、例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）などへのコンジュゲーション、リン酸化およびグリコシル化によって化学的に改変されているポリペプチド（例えば、抗体）である。特に断りのない限り、「抗体」という用語は、２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、バリアント、断片およびムテインを含み、それらの例は、以下に記載されている。

【0107】

「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒンジ領域中で始まるかヒンジ領域後に始まり、重鎖のＣ末端で終了する抗体重鎖定常領域の部分を指す。Ｆｃ領域は、ＣＨおよびＣＨ３領域の少なくとも一部分を含み、ヒンジ領域の一部分を含む場合も、含まない場合もある。各々、半分のＦｃ領域を保持する２つのポリペプチド鎖は二量体化して、Ｆｃ領域を形成できる。Ｆｃ領域は、Ｆｃ細胞表面受容体および免疫補体システムの一部のタンパク質に結合できる。Ｆｃ領域は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性食作用（ＡＤＰ）、オプソニン作用および／または細胞結合を含む２つまたはそれより多い活性のうちいずれか１つまたは任意の組合せを含むエフェクター機能を示す。Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩ（例えば、ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（例えば、ＣＤ３２）および／またはＦｃγＲＩＩＩ（例えば、ＣＤ１６ａ）を含むＦｃ受容体に結合できる。

【0108】

「標識された抗体」という用語または本明細書で使用される関連用語は、非標識である、または検出のための検出可能な標識もしくは部分に接合されている抗体およびその抗原結合部分を指し、検出可能な標識または部分は、放射活性、比色性、抗原性、酵素性の検出可能なビーズ（例えば、磁性または電子密度の高い（例えば、金）ビーズ）、ビオチン、ストレプトアビジンまたはプロテインＡである。それだけには限らないが、放射性核種、蛍光剤、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤およびリガンド（例えば、ビオチン、ハプテン）を含む種々の標識を利用できる。本明細書で記載される二重特異性抗体のいずれも非標識であり得る、または検出可能な標識もしくは部分に接合され得る。

【0109】

「同一性パーセント」または「相同性パーセント」および本明細書で使用される関連用語は、２つのポリペプチド間または２つのポリヌクレオチド配列間の類似性の定量的測定を指す。ポリペプチド配列間の同一性パーセントは、２つのポリペプチド配列のアラインメントを最適化するために導入される必要がある場合がある、ギャップ数および各ギャップの長さを考慮した、２つのポリペプチド配列間で共有されるアラインされた位置での同一アミノ酸数の関数である。同様の方法で、２つのポリヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、２つのポリヌクレオチド配列のアラインメントを最適化するために導入される必要がある場合がある、ギャップ数および各ギャップの長さを考慮した、２つのポリヌクレオチド配列間で共有されるアラインされた位置での同一ヌクレオチド数の関数である。配列間の比較および２つのポリペプチド配列間の、または２つのポリヌクレオチド配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。例えば、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列の「同一性パーセント」または「相同性パーセント」は、そのデフォルトパラメータを使用するＧＡＰコンピュータプログラム（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）の一部門）を使用して配列を比較することによって決定され得る。試験配列に関する「Ｙに対して少なくともＸ％の同一性を有する配列を含む」などの表現は、上記のように配列Ｙに対してアラインされた場合に、試験配列が、Ｙの残基の少なくともＸ％に対して同一の残基を含むことを意味する。

【0110】

一実施形態では、試験抗体のアミノ酸配列は、本明細書に記載される二重特異性抗体を構成するポリペプチドのアミノ酸配列のいずれかに対して同様であるが、同一ではない場合がある。試験抗体とポリペプチドの間の類似性は、本明細書に記載される二重特異性抗体を構成するポリペプチドのいずれかに対して、少なくとも９５％、または少なくとも９６％同一または少なくとも９７％同一または少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一であり得る。一実施形態では、同様のポリペプチドは、重および／または軽鎖内にアミノ酸置換を含有し得る。一実施形態では、アミノ酸置換は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変更しない。２つまたはそれより多いアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合には、配列同一性パーセントまたは類似性の程度を上向きに調整して、置換の保存的性質について補正できる。この調整を行う手段は、当業者に周知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331を参照されたい。同様の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例として、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニンおよびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸ならびに（７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。

【0111】

抗体は、抗原特異性が変更された免疫グロブリンを含有する血清または血漿などの供給源から得ることができる。このような抗体がアフィニティー精製に付される場合には、それらは、特定の抗原特異性について濃縮され得る。抗体のこのような濃縮調製物は普通、特定の抗原に対して特異的結合活性を有する約１０％未満の抗体で作られている。これらの調製物をアフィニティー精製の数ラウンドに付すことによって、抗原に対して特異的結合活性を有する抗体の割合を増大することができる。この方法で調製された抗体は、「単一特異性」と呼ばれることが多い。単一特異性抗体調製物は、特定の抗原に対して特異的結合活性を有する約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または９９．９％の抗体で構成される場合がある。抗体は、以下に記載されるような組換え核酸技術を使用して生成され得る。

【0112】

「ベクター」および本明細書で使用される関連用語は、外来遺伝物質（例えば、核酸導入遺伝子）に作動可能に連結され得る核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。ベクターは、外来遺伝物質を細胞（例えば、宿主細胞）中に導入するためのビヒクルとして使用され得る。ベクターは、ベクターへの導入遺伝子の挿入のための少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含み得る。ベクターは、ベクター－導入遺伝子構築物を有する宿主細胞の選択を補助する抗生物質耐性または選択可能な特徴を付与する少なくとも１つの遺伝子配列を含み得る。ベクターは、一本鎖核酸分子である場合も、二本鎖核酸分子である場合もある。ベクターは、線形核酸分子または環状核酸分子である場合もある。ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを利用する遺伝子編集法のために使用されるドナー核酸は、ベクターの１種であり得る。ベクターの１種として、「プラスミド」があり、これは、導入遺伝子に連結され得る線形または環状二重鎖染色体外ＤＮＡ分子を指し、宿主細胞において複製可能であり、導入遺伝子を転写および／または翻訳可能である。ウイルスベクターは通常、導入遺伝子に連結され得るウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ骨格配列を含有する。ウイルス骨格配列は、感染できないが、宿主細胞ゲノムへのウイルス骨格および共連結された導入遺伝子の挿入を保持するように改変され得る。ウイルスベクターの例として、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびエプスタインバーウイルスベクターが挙げられる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製可能である（例えば、細菌の複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。

【0113】

「発現ベクター」は、１つまたは複数の調節配列、例えば、誘導可能および／または構成的プロモーターおよびエンハンサーを含有し得るベクターの１種である。発現ベクターは、リボソーム結合部位および／またはポリアデニル化部位を含み得る。発現ベクターは、１つまたは複数の複製起点配列を含み得る。調節配列は、宿主細胞中に形質導入される発現ベクターに連結された導入遺伝子の転写、または転写および翻訳を指示する。調節配列（複数可）は、導入遺伝子の発現のレベル、タイミングおよび／または位置を制御できる。調節配列は、例えば、導入遺伝子に対して直接的に、または１つまたは複数の他の分子（例えば、調節配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を介してその効果を発揮できる。調節配列は、ベクターの一部であり得る。調節配列のさらなる例は、例えば、Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.およびBaron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-3606に記載されている。発現ベクターは、本明細書で記載される二重特異性抗体のいずれかの少なくとも一部分をコードする核酸を含み得る。

【0114】

導入遺伝子は、ベクター中に含有される導入遺伝子配列の機能または発現を可能にする、導入遺伝子とベクターの間の連結がある場合にベクターに「作動可能に連結される」。一実施形態では、調節配列が導入遺伝子の発現（例えば、発現のレベル、タイミングまたは位置）に影響を及ぼす場合に、導入遺伝子は調節配列に「作動可能に連結されている」。

【0115】

「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語または本明細書で使用される他の関連用語は、外因性核酸（例えば、導入遺伝子）が、宿主細胞中に移行されるまたは導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」宿主細胞とは、外因性核酸（導入遺伝子）を用いてトランスフェクトされている、形質転換されているまたは形質導入されているものである。宿主細胞は、一次対象細胞およびその後代を含む。本明細書で記載される二重特異性抗体のいずれかの少なくとも一部分をコードする外因性核酸は、宿主細胞中に導入され得る。本明細書で記載される二重特異性抗体のいずれかの少なくとも一部分を含む発現ベクターは、宿主細胞中に導入される場合があり、宿主細胞は、二重特異性抗体の少なくとも一部分を含むポリペプチドを発現し得る。

【0116】

「宿主細胞」または「宿主細胞の集団」という用語または本明細書で使用される関連用語は、外来（外因性または導入遺伝子）核酸が導入されている細胞（またはその集団）を指す。外来核酸は、導入遺伝子に作動可能に連結した発現ベクターを含む場合があり、宿主細胞は、外来核酸（導入遺伝子）によってコードされる核酸および／またはポリペプチドを発現するために使用され得る。宿主細胞（またはその集団）は、培養細胞であり得、または対象から抽出され得る。宿主細胞（またはその集団）は、継代数に関わらず、一次対象細胞およびその後代を含む。後代細胞は、親細胞と比較して同一遺伝物質を有する場合も有さない場合もある。宿主細胞は、後代細胞を包含する。一実施形態では、宿主細胞とは、本明細書で開示されるように、抗体を発現するためにいずれかの方法で改変、トランスフェクト、形質導入、形質転換および／またはマニピュレートされている任意の細胞（その後代を含む）を説明する。一例では、宿主細胞（またはその集団）には、本明細書で記載される所望の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸に作動可能に連結した発現ベクターが導入され得る。宿主細胞およびその集団は、宿主のゲノム中に安定に組み込まれている発現ベクターを有し得、または染色体外発現ベクターを有する場合がある。一実施形態では、宿主細胞およびその集団は、数回の細胞分裂後に存在するか、または一過性に存在し、数回の細胞分裂後に失われる染色体外ベクターを有する場合がある。

【0117】

トランスジェニック宿主細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮＳまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを含む周知のデザイナーヌクレアーゼを含む非ウイルス法を使用して調製できる。導入遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼなどのゲノム編集技術を使用して宿主細胞のゲノム中に導入され得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、キメラタンパク質の対を含み、各々は、操作されたジンクフィンガーモチーフからのＤＮＡ結合ドメインに融合された制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）の非特異的エンドヌクレアーゼドメインを含有する。ＤＮＡ結合ドメインを、宿主のゲノム中の特定の配列に結合するように操作することができ、エンドヌクレアーゼドメインは二本鎖切断を行う。ドナーＤＮＡは、導入遺伝子、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲまたはＤＡＲ構築物をコードする核酸のいずれかおよび宿主細胞のゲノム中の意図される挿入部位のいずれかの側の領域に対して相同である隣接する配列を保持する。宿主細胞のＤＮＡ修復機構によって、相同ＤＮＡ修復による導入遺伝子の正確な挿入が可能になる。トランスジェニック哺乳動物宿主細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して調製されている（米国特許第９，５９７，３５７号、同９，６１６，０９０号、同９，８１６，０７４号および同８，９４５，８６８号）。トランスジェニック宿主細胞は、正確な導入遺伝子挿入を遂行できるＤＮＡ結合ドメインに融合された非特異的エンドヌクレアーゼドメインを含む点でジンクフィンガーヌクレアーゼと同様であるＴＡＬＥＮ（転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ）を使用して調製できる。ジンクフィンガーヌクレアーゼのように、ＴＡＬＥＮも宿主のＤＮＡ中に二本鎖切断を導入する。トランスジェニック宿主細胞は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ））を使用して調製できる。ＣＲＩＳＰＲは、標的特異的ドナーＤＮＡ組み込みのためのガイドＲＮＡにカップリングされたＣａｓエンドヌクレアーゼを利用する。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ中のｇＲＮＡ結合領域の上流のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含有する保存されたマルチヌクレオチドを含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが二本鎖標的ＤＮＡを切断する宿主細胞標的部位にハイブリダイズする。ガイドＲＮＡは、特定の標的部位にハイブリダイズするように設計できる。ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、挿入部位に対して相同性を有する隣接する配列を有するドナーＤＮＡの部位特異的挿入を導入できる。ゲノムを改変するために使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの例は、例えば、米国特許第８，６９７，３５９号、同１０，０００，７７２号、同９，７９０，４９０号および米国特許出願公開番号ＵＳ２０１８／０３４６９２７に記載されている。一実施形態では、トランスジェニック宿主細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して調製でき、宿主標的部位は、ＴＲＡＣ遺伝子（Ｔ細胞受容体アルファ定常）であり得る。ドナーＤＮＡは、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲまたはＤＡＲ構築物をコードする核酸のいずれかを含み得る。エレクトロポレーション、ヌクレオフェクションまたはリポフェクションを使用して、宿主細胞中にドナーＤＮＡをジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと同時送達できる。

【0118】

宿主細胞は、原核生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉであり得、または真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞または昆虫細胞）またはハイブリドーマである場合もある。一実施形態では、宿主細胞に、所望の抗体をコードする核酸に作動可能に連結した発現ベクターを導入でき、それによって、トランスフェクトされた／形質転換された宿主細胞を生成し、これをトランスフェクトされた／形質転換された宿主細胞による抗体の発現に適した条件下で培養し、必要に応じて、トランスフェクトされた／形質転換された宿主細胞から抗体を回収する（例えば、宿主細胞溶解物から回収する）または培養培地から回収する。一実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０およびＹＢ２／０を含む非ヒト細胞を含む。一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＴ－１０８０、Ｈｕｈ－７およびＰＥＲ．Ｃ６を含むヒト細胞を含む。宿主細胞の例として、サル腎臓細胞のＣＯＳ－７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Gluzman et al., 1981, Cell 23: 175を参照されたい）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはそれらの誘導体、例えば、血清不含培地で増殖するＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯおよび関連細胞株（Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31を参照されたい）またはＤＨＦＲを欠損しているＣＨＯ株ＤＸ－Ｂ １１（Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20を参照されたい）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821を参照されたい）、ヒト胚腎臓細胞、例えば、２９３、２９３ ＥＢＮＡまたはＭＳＲ２９３、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長類細胞株、正常型２倍体細胞、一次組織、一次外植片のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に由来する細胞株、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。一実施形態では、宿主細胞は、リンパ系細胞、例えば、Ｙ０、ＮＳ０またはＳｐ２０を含む。一実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞であるが、ヒト宿主細胞ではない。通常、宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸で形質転換またはトランスフェクトされ得る培養細胞であり、次いで、ポリペプチドをコードする核酸は宿主細胞において発現され得る。「トランスジェニック宿主細胞」または「組換え宿主細胞」という語句は、発現されるべき核酸を用いて形質転換またはトランスフェクトされている宿主細胞を表すために使用され得る。宿主細胞はまた、核酸を含むが、調節配列が宿主細胞中に導入され、その結果、核酸と作動可能に連結されるようにならない限り、それを所望のレベルでは発現しない細胞であり得る。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代または潜在的な後代も指すということは理解される。ある特定の改変は例えば、突然変異または環境的影響のために続く世代で生じる場合があるので、このような後代は、親細胞に対して実際には同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。１つまたは複数の二重特異性抗体をコードする少なくとも１つの核酸に作動可能に連結したベクター（例えば、発現ベクター）を有する宿主細胞または宿主細胞の集団が、本明細書で記載される。

【0119】

本開示のポリペプチド（例えば、抗体および抗原結合タンパク質）は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して生成され得る。一例では、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を組換え発現ベクター中に挿入し、これを宿主細胞中に導入し、発現を促進する条件下で宿主細胞によって発現させることによる組換え核酸法によって生成される。

【0120】

組換え核酸マニピュレーションのための一般的な方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989中のＳａｍｂｒｏｏｋらまたはCurrent Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987)中のＦ．Ａｕｓｕｂｅｌらおよび定期的更新に記載されている。ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）は、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する１つまたは複数の適した転写または翻訳調節エレメントを保持する発現ベクターに作動可能に連結される。このような調節エレメントには、転写を制御するための転写プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。発現ベクターは、宿主細胞において複製能を付与する複製起点を含み得る。発現ベクターは、トランスジェニック宿主細胞（例えば、形質転換体）の認識を促進するための選択を付与する遺伝子を含み得る。

【0121】

組換えＤＮＡはまた、タンパク質を精製するのに有用であり得るタンパク質タグ配列の任意の種類もコードする場合がある。タンパク質タグの例として、それだけには限らないが、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＧＳＴタグが挙げられる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適当なクローニングおよび発現ベクターは、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, N.Y., 1985)に見出すことができる。

【0122】

発現ベクター構築物は、宿主細胞にとって適当な方法を使用して宿主細胞中に導入され得る。核酸を宿主細胞中に導入するための種々の方法が当技術分野で公知であり、それだけには限らないが、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストランまたは他の物質を利用するトランスフェクション、ウイルス性トランスフェクション、非ウイルス性トランスフェクション、微粒子銃、リポフェクションおよび感染（例えば、ベクターが感染剤である場合）が挙げられる。適した宿主細胞として、原核生物、酵母、哺乳動物細胞または細菌細胞が挙げられる。

【0123】

適した細菌として、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ種が挙げられる。酵母、好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種のもの、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅも、ポリペプチドの生成のために使用され得る。多様な哺乳動物または昆虫細胞培養システムも、組換えタンパク質を発現するために利用され得る。昆虫細胞における異種性タンパク質の生成のためのバキュロウイルスシステムは、Luckow and Summers, (Bio/Technology, 6:47, 1988)に総説されている。適した哺乳動物宿主細胞株の例として、内皮細胞、ＣＯＳ－７サル腎臓細胞、ＣＶ－１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胚腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。精製されたポリペプチドは、適した宿主／ベクターシステムを培養して、組換えタンパク質を発現させることによって調製される。多数の適用のために、本明細書で開示されるポリペプチドの多くの小さいサイズは、発現のための好ましい方法としてＥ．ｃｏｌｉにおける発現を行うであろう。次いで、タンパク質は培養培地または細胞抽出物から精製される。本明細書で開示される二重特異性抗体のいずれも、トランスジェニック宿主細胞によって発現され得る。

【0124】

本明細書で開示される抗体および抗原結合タンパク質はまた、細胞翻訳システムを使用して生成され得る。このような目的のために、ポリペプチドをコードする核酸は、ｍＲＮＡを生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を可能にするように、利用されている特定の無細胞システム（真核細胞のもの、例えば、哺乳動物もしくは酵母細胞不含翻訳システムまたは原核生物のもの、例えば、細菌細胞不含翻訳システム）においてｍＲＮＡの細胞不含翻訳を可能にするように改変されなければならない。

【0125】

本明細書で開示される多様なポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学合成され得る。コドン使用は、細胞における発現を改善するように選択され得る。このようなコドン使用は、選択された細胞種に応じて変わる。Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞のための特殊化されたコドン使用パターンが開発されている。例えば：Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003 100(2):438-42； Sinclair et al. Protein Expr. Purif. 2002 (1):96-105； Connell N D. Curr. Opin. Biotechnol. 2001 12(5):446-9； Makrides et al. Microbiol. Rev. 1996 60(3):512-38およびSharp et al. Yeast. 1991 7(7):657-78を参照されたい。

【0126】

本明細書で記載される抗体および抗原結合タンパク質はまた、化学合成によって（例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.に記載される方法によって）生成され得る。タンパク質への改変も化学合成によって生成され得る。

【0127】

本明細書で記載される抗体および抗原結合タンパク質は、タンパク質化学の分野で一般的に知られるタンパク質の単離／精製法によって精製され得る。限定されない例として、抽出、再結晶化、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用いる）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組合せが挙げられる。精製後、ポリペプチドは、それだけには限らないが、様々な緩衝液中に交換することができ、ならびに／または濾過および透析を含む当技術分野で公知の種々の方法のいずれかによって濃縮することができる。

【0128】

本明細書で記載される精製された抗体および抗原結合タンパク質は、好ましくは、少なくとも６５％純粋、少なくとも７５％純粋、少なくとも８５％純粋、より好ましくは、少なくとも９５％純粋および最も好ましくは、少なくとも９８％純粋である。純度の正確な数値に関わらず、ポリペプチドは、医薬製剤として使用するために十分に純粋である。本明細書で記載される二重特異性抗体のいずれも、任意の技術分野で公知の方法を使用して、トランスジェニック宿主細胞によって発現され、次いで、約６５～９８％の純度または高レベルの純度に精製され得る。

【0129】

ある特定の実施形態では、本明細書における抗体および抗原結合タンパク質は翻訳後改変をさらに含み得る。例示的翻訳後タンパク質改変として、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ－リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化またはポリペプチド側鎖のもしくは疎水基の付加が挙げられる。結果として、改変ポリペプチドは、非アミノ酸要素、例えば、脂質、ポリ－またはモノ－糖類およびリン酸を含有し得る。グリコシル化の好ましい形態として、シアリル化があり、これは１つまたは複数のシアル酸部分をポリペプチドにコンジュゲートする。シアル酸部分は、溶解度および血清半減期を改善し、一方で、タンパク質の潜在的な免疫原性を低減する。Raju et al. Biochemistry. 2001 31; 40(30):8868-76を参照されたい。

【0130】

一実施形態では、本明細書で記載される抗体および抗原結合タンパク質を、可溶性ポリペプチドになるように改変することができ、これは、抗体および抗原結合タンパク質を非タンパク質性ポリマーに連結することを含む。一実施形態では、非タンパク質性ポリマーは、米国特許第４，６４０，８３５号、同４，４９６，６８９号、同４，３０１，１４４号、同４，６７０，４１７号、同４，７９１，１９２号または同４，１７９，３３７号に示される方法でポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンを含む。

【0131】

本開示は、薬学的に許容される賦形剤との混合物中に本明細書で記載される二重特異性抗体のいずれかを含む治療用組成物を提供する。賦形剤には、担体、安定化剤および賦形剤が包含される。薬学的に許容される賦形剤の例として、例えば、不活性の希釈剤または充填剤（例えば、スクロースおよびソルビトール）、滑沢剤、流動促進剤および抗接着剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油またはタルク）が挙げられる。さらなる例として、緩衝化剤、安定化剤、保存料、非イオン性界面活性剤、抗酸化物質および等張化剤が挙げられる。

【0132】

治療用組成物および当技術分野で周知であるそれらを調製する方法は、例えば、“Remington: The Science and Practice of Pharmacy” (20th ed., ed. A. R. Gennaro A R., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)に見出される。治療用組成物は、非経口投与用に製剤化することができ、例えば、賦形剤、滅菌水、生理食塩水、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、植物起源のオイルまたは水素化ナフタレンを含有し得る。本明細書で記載される抗体（またはその抗原結合タンパク質）の放出を制御するために、生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマーを使用してもよい。抗体（またはその抗原結合タンパク質）の体内分布を制御するために、ナノ粒子状製剤（例えば、生分解性ナノ粒子、固形脂質ナノ粒子、リポソーム）を使用してもよい。他の潜在的に有用な非経口送達システムとして、エチレン－酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み可能な注入システムおよびリポソームが挙げられる。製剤中の抗体（またはその抗原結合タンパク質）の濃度は、投与されるべき薬物の投与量および投与経路を含むいくつかの因子に応じて変わる。

【0133】

二重特異性抗体（またはその抗原結合タンパク質）のいずれも、必要に応じて、医薬品産業において一般的に使用される薬学的に許容される塩、例えば、非毒性酸付加塩または金属錯体として投与され得る。酸付加塩の例として、有機酸、例えば、酢酸、乳酸、パモン酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸など；ポリマー酸、例えば、タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなど；および無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などが挙げられる。金属錯体として、亜鉛、鉄などが挙げられる。一例では、抗体（またはその抗原結合タンパク質）は、熱安定性を増大するために酢酸ナトリウムの存在下で製剤化される。

【0134】

二重特異性抗体（またはその抗原結合タンパク質）のいずれも、非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物中に有効成分（複数可）を含有する錠剤を含む経口使用のために製剤化され得る。経口使用のための製剤はまた、咀嚼錠として、または活性成分が不活性固形希釈剤と混合されているハードゼラチンカプセル剤として、または活性成分が水または油性媒体と混合されているソフトゼラチンカプセル剤としても提供され得る。

【0135】

「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトならびに脊椎動物、哺乳動物および非哺乳動物を含む非ヒト動物を指す。一実施形態では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネズミ科の動物（例えば、マウスおよびラット）、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、オオカミ、カエルまたは魚であり得る。

【0136】

「投与すること」、「投与された」という用語および文法上のバリアントは、当業者に公知の多様な方法および送達システムのいずれかを使用して対象に薬剤を物理的に導入することを指す。本明細書で開示される製剤の例示的投与経路として、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄または他の非経口経路の投与、例えば、注射または注入によるものが挙げられる。「非経口投与」という語句は、本明細書で使用される場合、経腸および局所投与以外の、普通、注射による投与の様式を意味し、制限するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、リンパ内、病巣内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入ならびにｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションが含まれる。一実施形態では、製剤は非経口ではない経路によって、例えば、経口的に投与される。他の非経口ではない経路として、局所、上皮または粘膜経路の投与、例えば、鼻腔内、膣内、直腸性、舌下または局所性が挙げられる。投与することはまた、例えば、１回、複数回および／または１もしくは複数の長期間にわたって実施され得る。本明細書で記載される二重特異性抗体（またはその抗原結合タンパク質）のいずれも、技術分野で公知の方法および送達経路を使用して対象に投与され得る。

【0137】

「有効量」、「治療上有効量」または「有効用量」という用語または関連用語は、同義的に使用でき、対象に投与された場合に、腫瘍もしくはがん抗原発現と関連する疾患もしくは障害の測定可能な改善または防止を達成するのに十分である抗体または抗原結合タンパク質（例えば、二重特異性抗体）の量を指す。本明細書で提供される抗体の治療上有効量は、単独または組合せて使用された場合に、抗体および組合せの相対活性（例えば、細胞成長の阻害における）に応じて、処置されている対象および疾患状態、対象の体重および齢および性別、対象における疾患状態の重症度、投与方法などに応じて変わり、それらは当業者によって容易に決定され得る。

【0138】

一実施形態では、治療上有効量は、処置されるべき対象のある特定の態様および処置されるべき障害に応じて変わり、当業者によって公知の技術を使用して確認され得る。一般に、ポリペプチドは、１日あたり約０．０１ｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１日あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは、１日あたり０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇで投与される。ポリペプチドは、毎日（例えば、１日１回、２回、３回または４回）または好ましくは、より少ない頻度で（例えば、毎週、２週間毎、３週間毎、毎月または３カ月毎）投与され得る。さらに、当技術分野で公知であるように、齢ならびに体重、全身の健康、性別、食事、投与の時間、薬物相互作用および疾患の重症度についての調整が必要である場合もある。

【0139】

本開示は、１つまたは複数の腫瘍関連抗原の発現と関連する疾患を有する対象を処置する方法を提供する。疾患は、腫瘍関連抗原、例えば、ＣＤ３８および／またはＣＤ３抗原などを発現するがんまたは腫瘍細胞を含む。一実施形態では、がんまたは腫瘍は、前立腺、乳房、卵巣、頭頸部、膀胱、皮膚、結腸直腸、肛門、直腸、膵臓、肺（非小細胞肺および小細胞肺がんを含む）、平滑筋腫、脳、神経膠腫、神経膠芽腫、食道、肝臓、腎臓、胃、結腸、子宮頸部、子宮、子宮内膜、外陰部、喉頭、膣、骨、鼻腔、副鼻腔、上咽頭、口腔、中咽頭、喉頭、下咽頭、唾液腺、尿管、尿道、陰茎および精巣のがんを含む。

【0140】

一実施形態では、がんは、白血病、リンパ腫、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫を含む血液がんを含む。血液系がんとして、多発性骨髄腫（ＭＭ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＢおよびＴ急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、へアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、形質細胞骨髄腫、前駆体Ｂ細胞リンパ性白血病／リンパ腫、形質細胞腫、巨大細胞骨髄腫、形質細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、軽鎖またはベンスジョーンズ骨髄腫、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節性障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少症紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェジナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、天然痘尋常性、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血および急速進行性糸球体腎炎、重鎖疾患、原発性または免疫細胞関連アミロイドーシスおよび意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症が挙げられる。
抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体をコードする組換え腫瘍溶解性ウイルス

【0141】

本開示は、とりわけ、ＲＯＲ１およびＣＤ３に結合する二重特異性抗体を発現する腫瘍溶解性ウイルス、このようなウイルスに感染した細胞、および二重特異性抗体を発現するウイルスを使用してがんを処置する方法を提供する。また、感染細胞によって生成されたウイルス不含条件培養培地（ＶＦＣＭ）およびＶＦＣＭを使用して医薬製剤を生成する方法が提供される。

【0142】

腫瘍溶解性ウイルスは、それらが腫瘍細胞において選択的に複製し、溶解するので、がん療法の標的化アプローチを提供する。多様な種類の腫瘍溶解性ウイルスが当技術分野で公知であり、パルボウイルス、粘液腫ウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）、アデノウイルス、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）が挙げられる。これらのウイルスは、腫瘍細胞において複製し、細胞溶解を引き起こし、および／またはそれらが感染する腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する。本開示は、本明細書で開示されるいずれかなどの抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体（αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ）をコードする異種性遺伝子構築物を含む組換え腫瘍溶解性ウイルスを提供する。構築物は、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂをコードする配列に作動可能に連結した哺乳動物細胞において活性なプロモーターを含むことができ、構築物は、腫瘍溶解性ウイルスのゲノム中に挿入され得る。

【0143】

種々の実施形態では、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂの発現のために改変された腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ヒトアルファヘルペスウイルス；ＨＳＶ）、例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２またはＨＳＶ－１またはＨＳＶ－２の両方の配列を有する組換えＨＳＶであり得る。例えば、ＨＳＶ－１またはＨＳＶ－２株の実験室株または臨床分離株を使用できる。ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２の複数の単離され、改変された株が、当技術分野で公知であり、本明細書で開示される組成物および方法において使用するために企図することができ、限定されない例として、ＨＳＶ－１株Ａ４４、ＨＳＶ－１株Ａｎｇｅｌｏｔｔｉ、ＨＳＶ－１株ＣＬ１０１、ＨＳＶ－１株ＣＶＧ－２、ＨＳＶ－１株Ｈ１２９、ＨＳＶ－１株ＨＦＥＭ、ＨＳＶ－１株ＨＺＴ、ＨＳＶ－１株ＪＳ１、ＨＳＶ－１株ＭＧＨ１０、ＨＳＶ－１株ＭＰ、ＨＳＶ－１株Ｐａｔｔｏｎ、ＨＳＶ－１株Ｒ１５、ＨＳＶ－１株Ｒ１９、ＨＳＶ－１株ＲＨ２、ＨＳＶ－１株ＳＣ１６、ＨＳＶ－１株ＫＯＳ、ＨＳＶ－１株Ｆ、およびＨＳＶ－１株１７、ＨＳＶ－２株１８６、ＨＳＶ－２株３３３、ＨＳＶ－２株Ｂ４３２７ＵＲ、ＨＳＶ－２株Ｇ、ＨＳＶ－２株Ｇ、ＨＳＶ－２株ＨＧ５２、ＨＳＶ－２株ＳＡ８、ＨＳＶ－２株ＳＤ９０、ＨＳＶ－２株ＳＮ０３、ＨＳＶ－２株ＳＳ０１およびＨＳＶ－２株ＳＴ０４が挙げられる。また、これらの株または当技術分野で公知であり得る、もしくは単離され得る他のものの誘導体または突然変異体も本明細書で提供される組成物および方法における使用のために企図される。

【0144】

ウイルス株の誘導体として、制限するものではないが、部分的もしくは完全に欠失している１つまたは複数の内因性遺伝子を含む、突然変異されている１つまたは複数の内因性遺伝子を有する可能性がある、ウイルスゲノム中に挿入された導入遺伝子（異種性遺伝子）（それだけには限らないが、１つまたは複数の選択マーカー、陰性選択マーカー（「自殺遺伝子」）および／もしくは検出可能なマーカー（例えば、蛍光タンパク質をコードする遺伝子もしくは検出可能な生成物を生成する酵素をコードする遺伝子）を含む）を有する可能性がある、および／または１つまたは複数の改変、例えば、それだけには限らないが、制限部位、組換え部位もしくは「ランディングパッド」、外因性プロモーターなどを有する可能性があるウイルスが挙げられる。誘導体は、他の改変、例えば、それだけには限らないが、非遺伝子配列、例えば、プロモーターまたは非コード配列などの遺伝子調節領域など、例えば、それだけには限らないが、直接または逆方向反復配列の欠失または突然変異を有する可能性がある。ウイルス株の誘導体は、他の改変に代わりに、またはそれに加えて、限定されない例として、ウイルスの成長または生存力を支持もしくは調節する１つもしくは複数の導入遺伝子、宿主細胞機能に影響を及ぼす１つもしくは複数の遺伝子または治療用タンパク質をコードする１つもしくは複数の導入遺伝子を含むウイルスであり得る。

【0145】

一部の限定されない実施形態では、ＨＳＶは、ＨＳＶ－１、例えば、ＨＳＶ－１株１７、ＨＳＶ－１株ＫＯＳもしくはＨＳＶ－１株ＦまたはＨＳＶ－１株１７、ＨＳＶ－１株ＫＯＳもしくはＨＳＶ－１株Ｆのいずれかの誘導体である。例えば、ＳｃＦｖ－Ｆｃ－ＴＧＦβｔｒａｐ構築物の導入のために使用される株は、ＨＳＶ－１株１７突然変異体１７１６、ＨＳＶ－１株Ｆ突然変異体Ｒ３６１６（Chou & Roizman (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 3266-3270）、ＨＳＶ－１株Ｆ突然変異体Ｇ２０７（Toda et al. (1995) Human Gene Therapy 9:2177-2185）、ＨＳＶ－１株Ｆ突然変異体Ｇ４７Δ（Todo et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:6396-6401）、ＨＳＶ－１突然変異体ＮＶ１０２０（Geevarghese et al. (2010) Human Gene Therapy 21:1119-28）、ＲＥ６（Thompson et al. (1983) Virology 131:171-179）、ＫｅＭ３４．５（Manservigi et al. (2010) The Open Virology Journal 4:123-156）、Ｍ０３２（Campadelli-Fiume et al. (2011) Rev Med. Virol 21:213-226）、Ｂａｃｏ（Fu et al. (2011) Int. J. Cancer 129:1503-10）、Ｍ０３２もしくはＣ１３４（Cassady et al. (2010) The Open Virology Journal 4:103-108）またはタリモジーンラハーパレプベック（「Ｔｖｅｃ」、以前はＯｎｃｏＶｅｘ（登録商標）；Liu et al. (2003) Gene Therapy 10:292-303）またはこれらのいずれかのさらなる誘導体または突然変異体であり得る。

【0146】

内因性ウイルス遺伝子の突然変異は、非がん性細胞におけるウイルスの複製もしくは増殖またはウイルスの宿主防御を避ける能力に影響を及ぼす遺伝子の突然変異または欠失を含み得る。例えば、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂを含むＨＳＶは、ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子、ＩＣＰ６をコードする遺伝子、ＩＣＰ０をコードする遺伝子、ｖｈｓをコードする遺伝子またはＩＣＰ２７をコードする遺伝子のいずれかにおいて欠失され得る。遺伝子または複数の遺伝子（遺伝子がマルチコピーである場合）によってコードされる機能的タンパク質を生成しない突然変異体は、本明細書において機能的に欠失した遺伝子を有すると言われる。ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子、ＩＣＰ６をコードする遺伝子、ＩＣＰ０をコードする遺伝子およびｖｈｓをコードする遺伝子のうち１つまたは複数の機能的欠失は、非がん性細胞における複製が損なわれたＨＳＶをもたらし得る。

【0147】

ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子ＲＬ１は、ＨＳＶ－１ゲノムの長い反復（ＲＬ）中に位置し、２つのコピーで存在する。一部の実施形態では、ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子の一方または両方のコピーが突然変異される、または部分的もしくは完全に欠失され、その結果、機能的タンパク質が作製されない。好ましい実施形態では、ＳｃＦｖ－Ｆｃ－ＴＧＦβｔｒａｐタンパク質をコードする導入遺伝子、および必要に応じてＩＬ１２遺伝子を含む腫瘍溶解性ＨＳＶは、神経毒性に関与するＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子について機能的に欠失している（Chou et al. (1990) Science 250:1262-1266）、例えば、ＨＳＶウイルスゲノムのＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子の両方のコピーが不活性化されている。例えば、ＳｃＦｖ－Ｆｃ－ＴＧＦβｔｒａｐ構築物の導入のために使用される腫瘍溶解性ＨＳＶは、ＨＳＶ－１株１７の突然変異体である可能性があり、ＨＳＶ１７１６（Brown et al. (1994) Journal of General Virology 75: 2367-2377； MacLean et al. (1991) Journal of General Virology 72:631-639）もしくはその突然変異体もしくは誘導体であり得る、またはＳｅｐｒｅｈｖｅｃ（商標）もしくはその誘導体もしくは突然変異体であり得る。ＨＳＶ１７１６およびＳｅｐｒｅｈｖｅｃ（商標）は両方とも、ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子の両方のコピー中に欠失を有し、その結果、それらは機能的遺伝子生成物を生成しないが、各々は、そうではなく、ＨＳＶ株１７のものと実質的に類似のゲノムを有し、これは、完全に配列決定されている（Pfaff et al. (2016) J Gen Virol 97:2732-2741；ncbi.nlm.nih.gov/genome、受託番号ＪＮ５５５５８５）。

【0148】

本明細書で提供されるような組換えＨＳＶは、ＩＣＰ３４．５座位、ＩＣＰ６座位、ＩＣＰ０座位またはｖｈｓ座位中に挿入された１つまたは複数の導入遺伝子を有し得る。一部の好ましい実施形態では、本明細書で提供されるような組換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、欠失されたＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子座位中に挿入されたαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ遺伝子を有し得る。一部の好ましい実施形態では、本明細書で提供されるような組換え腫瘍溶解性ＨＳＶは、ＩＣＰ３４．５について機能的に欠失しており（すなわち、ＩＣＰ３４．５ヌルであり）、ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子座位の両コピー中に挿入されたαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ遺伝子を有する。

【0149】

多数の腫瘍細胞種に感染できる本明細書で提供される組換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＲＯＲ１、多数の腫瘍細胞上に発現されるタンパク質、およびＴ細胞上に発現されるＣＤ３に結合する新規二重特異性抗体をコードする発現構築物を含み、二重特異性抗体は、それらをコードする組換えウイルスに感染した細胞によって発現および分泌され得る。αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ のＲＯＲ１ ｓｃＦｖ部分は、免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合し、ＣＤ３ ｓｃＦｖ部分は、Ｔ細胞に結合し、Ｔ細胞を標的腫瘍細胞と近接させて、腫瘍細胞の死滅を増強する。

【0150】

本明細書で記載されるαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂをコードする例示的構築物は、配列番号１の重鎖可変鎖領域またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有し、配列番号２、配列番号３および配列番号４の重鎖可変領域ＣＤＲを有する配列、ならびに配列番号５の軽鎖可変鎖領域またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有し、配列番号６、配列番号７および配列番号８の軽鎖可変領域ＣＤＲを有する配列を有するＲＯＲ１モノクローナル抗体ｏ１１に由来するｓｃＦｖを使用する。

【0151】

本明細書で記載されるαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂをコードするさらなる例示的構築物は、配列番号１０の重鎖可変鎖領域またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有し、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の重鎖可変領域ＣＤＲを有する配列ならびに配列番号１４の軽鎖可変鎖領域またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有し、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７の軽鎖可変領域ＣＤＲを有する配列を有するＲＯＲ１モノクローナル抗体ｓ１０に由来するｓｃＦｖを使用する。

【0152】

本明細書で記載されるαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂをコードするさらなる例示的構築物は、配列番号１９の重鎖可変鎖領域またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有し、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２の重鎖可変領域ＣＤＲを有する配列ならびに配列番号２３の軽鎖可変鎖領域またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有し、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６の軽鎖可変領域ＣＤＲを有する配列を有するＲＯＲ１モノクローナル抗体ｊｌｖ１０１１に由来するｓｃＦｖを使用する。

【0153】

特定の例では、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂは、配列番号３６、配列番号３８もしくは配列番号４０の配列を有し得る、または配列番号３６、配列番号３８もしくは配列番号４０のいずれかに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。

【0154】

αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂは、形式：重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域または軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域を有し得る。αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂの抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖは、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ部分のＮ末端であり得る、逆もまた同様である。

【0155】

αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ、ＩＬ－１２ポリペプチドまたは抗ＶＥＧＦＲ抗体（例えば、抗ＶＥＧＦＲ ｓｃＦｖ）をコードする構築物は、真核細胞における発現のためにプロモーターに作動可能に連結され得る。αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂの発現のために組換えウイルスにおいて使用できるプロモーターの例として、制限するものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、配列番号３３）、ハイブリッドＣＭＶプロモーター（例えば、Ｕ．Ｓ９，７７７，２９０）、ＨＴＬＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ハイブリッドＥＦ１α／ＨＴＬＶプロモーター（例えば、配列番号３２）、ＪｅＴプロモーター（米国特許第６，５５５，６７４号）、ＳＰＡＲＣプロモーター（例えば、ＵＳ８，４３６，１６０）、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはレトロウイルスＬＴＲプロモーター、例えば、ＭＭＬＶプロモーターまたはこれらのいずれかに由来するプロモーターが挙げられる。構築物はまた、ポリアデニル化配列、例えば、ＢＧＨ、ＳＶ４０、ＨＧＨまたはＲＢＧポリアデニル化配列などを含み得る。一部の実施形態では、ポリアデニル化配列は、配列番号３８の配列を有する。

【0156】

腫瘍溶解性ウイルス、例えば、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ、ＩＬ－１２および／または抗ＶＥＧＦＲ抗体をコードする導入遺伝子を含む本明細書に記載されるものなどを使用して、宿主細胞に感染させることができ、これを、ＶＦＣＭ、必要に応じて、二重特異性抗体または治療目的のために使用され得る他の組換えポリペプチドの生成のために培養できる。ＶＦＣＭは、例えば、細胞上清の遠心分離と、例えば、０．２２、０．２、および／または０．１ミクロンフィルターを使用するその後の濾過を使用して生成され得る。対象、例えば、がんを有する対象は、例えば、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂを含むＶＦＣＭを用いて処置され得る。対象は、一部の実施形態では、非ヒト動物である可能性があり、限定されない例として、イヌ、ウマ、ネコ、サル、類人猿、家畜動物または絶滅危惧種のメンバーであり得る。

【0157】

本開示は、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂをコードする組換えＨＳＶを使用してがんを処置する方法を提供する。方法は、本明細書で提供されるようなαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂをコードする核酸構築物を含む組換えＨＳＶを、がんを有する対象に投与することを含み得る。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍であり得る。組換えＨＳＶは、本明細書で開示される任意のもの、例えば、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂをコードする任意のものなどであり得る。対象は、ヒトであり得る、または非ヒト動物、例えば、イヌ、ネコ、雌ウシ、雄ウシもしくはウマなどであり得る。がんは、制限するものではないが、膀胱、骨、乳房、眼、胃、頭頸部、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚または子宮のがん、中皮腫、神経膠腫、神経細胞腫または軟骨肉腫であり得る。投与することは、任意の手段によるものであってよく、限定されない例として、非経口、全身、腔内（例えば、胸膜内、腹腔内）、腫瘍周囲または腫瘍内であり得、注射、静脈内または動脈内注入、または他の送達手段によるものであり得る。注射は、例えば、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、腫瘍内または腫瘍周囲である場合がある。処置レジメンは、ウイルスの１回より多い投与を含んでもよく、数日、数週間または数カ月の期間にわたる複数回の投薬を含む場合がある。

【0158】

一部の実施形態では、本方法において使用されるＨＳＶによってコードされるαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂは、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４０に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ（またはそうでなければ異なるシグナルペプチドを有するか、またはシグナルペプチドを欠く相同なαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ）である。ＨＳＶは、限定されない例として、配列番号４７に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するＩＬ－１２ポリペプチドまたは配列番号４９に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する抗ＶＥＧＦＲ ｓｃＦＶをコードし得る１つまたは複数のさらなる導入遺伝子（またはそうでなければ異なるシグナルペプチドを有するか、またはシグナルペプチドを欠く相同なポリペプチド）をさらに含み得る。

【実施例】

【0159】

（実施例１）
α－ＲＯＲ１／α－ＣＤ３ ＢｓｐＡｂ単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）構築物。
Ｎ末端からＣ末端に進行して：シグナルペプチド（配列番号２８）、ＲＯＲ１に特異的に結合するｓｃＦｖ抗体、ＧＳリンカー（配列番号２９）および抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ抗体（ｈｕｍ２９１、配列番号３４）を含んでいた二重特異性抗体（ＢｓｐＡｂ）を発現させるために３種の構築物を設計した。図１は、αＲＯＲ１／αＣＤ３二重特異性抗体（αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ）をコードする構築物を表す全体図を提供する。すべての構築物は、ＢｓｐＡｂをコードする配列に作動可能に連結したＥＦ１α／ＨＴＬＶハイブリッドプロモーター（配列番号４１）を含んでいた。ＲＯＲ１ ｓｃＦｖにおいてのみ異なっていた３種の異なるαＲＯＲ１／αＣＤ３ＢｓｐＡｂをコードする構築物を作製した：ｏ１１ ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ（配列番号９）を含んでいたαＣＤ３／αＲＯＲ１ ＢｓｐＡｂ、ｓ１０ ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ（配列番号１８）を含んでいたαＣＤ３／αＲＯＲ１ ＢｓｐＡｂ、およびｊｌｖ１０１１ ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ（配列番号２７）を含んでいたαＣＤ３／αＲＯＲ１ ＢｓｐＡｂ。

【0160】

これらの構築物をウイルスゲノム中にクローニングするために、ａｔｔＬ部位が隣接したＢｓｐＡｂ構築物をＰＣＲクローニングによって作製し、ＨＳＶ－１ Ｓｅｐｒｅｈｖｅｃ（登録商標）ゲノムの内部が欠失しているＲＬ１座位中に挿入した。Ｓｅｐｒｅｈｖｅｃ（登録商標）は、ＨＳＶ株１７由来のＨＳＶ－１ベクターであり、神経毒性に関与するγ３４．５ｋｄ（ＩＣＰ３４．５）ポリペプチドをコードするＲＬ１遺伝子の両コピーは、ＲＬ１遺伝子を不活性化する６９５ｂｐの欠失（ＲＬ１配列内のヌクレオチド１２５９７５～１２５２２１）によって破棄されている。ＲＬ１欠失部位は、ａｔｔＬ配列が隣接する目的の任意の遺伝子または構築物の挿入のためのａｔｔＲ組換え部位を含む。ａｔｔＬ配列が隣接する抗ＣＤ３／抗ＲＯＲ１ ＢｓｐＡｂ構築物を、Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｈｏｓｔ Ｆａｃｔｏｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）Ｐｌｕｓ酵素混合物を本質的に製造業者の使用説明書に従って使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えクローニングを使用して、欠失部位で両ＲＬ１遺伝子座中に挿入した。

【0161】

組換え反応後、組換えウイルスの生成のために、ウイルスゲノムＤＮＡをＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓線維芽細胞）細胞中にトランスフェクトした。ウイルスをトランスフェクトされたＢＨＫ細胞から回収し、次いで、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｓｐ．）腎臓上皮）細胞に感染させるために使用した。感染Ｖｅｒｏ細胞から個々のプラークを収集して、新規Ｖｅｒｏ細胞に継代した。このプロセスを合計４ラウンドのプラーク単離の間、反復した。次いで、約３．２×１０^５プラーク形成単位（ＰＦＵ）のウイルスを用いる約３．２×１０^７個ＢＨＫ細胞の感染および３日間培養によってウイルスストックを作製した。３日後、上清を２，１００ｇで２回回転して、細胞および細片をペレット化した。細胞をペレット化した後、ウイルスを含有する上清を１７，２００ｇで回転させて、ウイルスをペレット化した。ウイルスを再懸濁し、濾過し、Ｖｅｒｏ細胞で力価測定した。精製αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂウイルスＳｅｐＧＩ－１８９（ｏ１１ αＲＯＲ１ ｓｃＦｖ）、ＳｅｐＧＩ－２０１（ｓ１０ αＲＯＲ１ ｓｃＦｖ）およびＳｅｐＧＩ－２０３（ｊｌｖ１０１１ αＲＯＲ１ ｓｃＦｖ）からウイルスシードストックおよび研究ストックを生成した。

【表1】

（実施例２）
αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ構築物を発現するＨＳＶからのウイルス不含条件培地（ＶＦＣＭ）の生成。

【0162】

αＲＯＲ１／α－ＣＤ３ＢｓｐＡｂウイルスＳｅｐＧＩ－１８９、ＳｅｐＧＩ－２０１およびＳｅｐＧＩ－２０３からウイルス不含条件培地（ＶＦＣＭ）を作製するために、３７℃、５％ ＣＯ_２において１ｍＬの培地中の、３×１０^５個のＡ４３１細胞を１２ウェルプレートに、または別個のプレートに、ＨｅｐＧ２細胞を播種した。翌日、Ａ４３１細胞およびＨｅｐＧ２細胞に組換えＨＳＶをＭＯＩ（多重感染度）０．５で感染させ、１．２５ｍＬの培地中で３日間インキュベートした。３日後、細胞上清を除去し、０．１μｍのメンブラン（Ｐａｌｌ Ａｃｒｏｄｉｓｃ シリンジフィルターパート番号４６１１）を通して濾過して、ウイルスを除去した。次いで、ＶＦＣＭをアリコートにし、－８０℃で保存した。ＳｅｐＧＩ－ヌルのＶＦＣＭ、外因性導入遺伝子を含まないＳｅｐｒｅｈｖｅｃ（登録商標）ＨＳＶベクターも対照として調製した。
（実施例３）
ＶＦＣＭにおけるαＲＯＲ１／αＣＤ３二重特異性抗体の検出。

【0163】

９６ウェルプレートを、２μｇ／ｍＬの５０μＬ／ウェルの組換えヒトＲＯＲ１ Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９４９０－ＲＯ－０５０）を用いてコーティングした。次いで、プレートを密閉し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを１５０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（０．０５％ Ｖ／Ｖ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を有するＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水１×）で洗浄した。８０μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（２％ ＢＳＡ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を有するＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水）を使用して非特異的結合をブロッキングし、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。これらの洗浄後、ＳｅｐＧＩ－１８９、ＳｅｐＧＩ－２０１またはＳｅｐＧＩ－２０３のαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂを含有するウイルス不含培養培地（ＶＦＣＭ）ならびに対照ＶＦＣＭ（ＳｅｐＧＩ－ヌル）をブロッキング緩衝液で段階希釈し、５０μＬ／ウェルを低速振盪条件下で室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、５０μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液で希釈した抗ＣＤ３ Ｈｕｍ２９１抗イディオタイプクローン５Ａ２（１：８０希釈）を添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、５０μＬ／ウェルの、１：１２０，０００希釈でブロッキング緩衝液で希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ；カタログ番号ａｂ６７２１）を添加した。プレートを３７℃、暗所で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ウェルにＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ １－成分マイクロウェルペルオキシダーゼ基質溶液（ＳｅｒａＣａｒｅ、カタログ番号５１２０－００８２）を添加した（８０μＬ／ウェル）。プレートを室温、暗所で１０～１５分間インキュベートした。５０μＬ／ウェルのＴＭＢ Ｂｌｕｅ ＳＴＯＰ溶液（ＳｅｒａＣａｒｅ、カタログ番号５１５０－００２２）を添加することによってシグナル発生を停止し、その後、ＴｅｃａｎＳｐａｒｋまたは他のデバイスを使用してシグナルを４５０ｎｍ（ＳｅｒａＣａｒｅ ＴＭＢ ＢｌｕｅＳＴＯＰ溶液に対して特異的）で読み取った。図２Ａは、アッセイの概略図を提供する。図２Ｂは、操作されたＳｅｐＧＩ腫瘍溶解性ウイルスＳｅｐＧＩ－１８９、ＳｅｐＧＩ－２０１およびＳｅｐＧＩ－２０３によって３種の二重特異性構築物すべてが発現され、ＲＯＲ１に結合できたことを示す。
（実施例４）
ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞へのウイルス感染培養物のＶＦＣＭからのαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂの結合。

【0164】

Ａ５４９ヒト肺胞腺癌（非小細胞肺がん）細胞を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－９法を使用してＲＯＲ１遺伝子についてノックアウトした。Ａ５４９／ＲＯＲ１－ノックアウト（Ａ５４９／ＲＯＲ１－ＫＯ）細胞またはＡ５４９野生型（ＷＴ）細胞をＶ底９６ウェルプレート（ウェルあたり８０，０００個細胞）中に移行した。実施例２に記載されたように生成されたウイルス不含培養培地（ＶＦＣＭ）の調製物を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ １×＋２％ＦＣＳ／ＦＢＳ）で段階希釈し（１：５～１：３，１２５希釈）、ウェル（１００μＬ／ウェル）に添加し、細胞と共に室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、細胞を、１００μＬ／ウェルの、ＦＡＣＳ緩衝液で１０μｇ／ｍＬに希釈したモノクローナルウサギ抗ＣＤ３ Ｈｕｍ２９１抗イディオタイプ抗体（クローン５Ａ２）中に再懸濁した。プレートをプレートシールで覆い、３７℃で１時間インキュベートした。

【0165】

次いで、細胞を、１００μＬ／ウェルの、１：１０００希釈したロバ抗ウサギＡＰＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号６４４１－３１－３１、ロット番号Ｋ２９１６－Ｚ７７９Ｂ）を含有するＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、プレートを３７℃、暗所で１時間インキュベートした。細胞を、１２０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に最後に再懸濁し、シグナルをＡｔｔｕｎｅＮｘｔフローサイトメーターで分析した。図３Ａは、アッセイ形式を提供し、ＲＯＲ１を発現するＡ５４９ ＷＴ細胞は、ＶＦＣＭ中に存在するＢｓｐＡｂに結合し、これは、順に、抗イディオタイプ抗ＣＤ３抗体によって認識される。複合体はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識ロバ抗ウサギ抗体を使用して明らかにされる。ＶＦＣＭ中に存在するＢｓｐＡｂによるＡ５４９／ＲＯＲ１－ＫＯ細胞の結合は生じないと予測される。図３Ｂは、二重特異性構築物を含んでいたウイルスのすべてのＶＦＣＭが、ＲＯＲ１発現Ａ５４９腫瘍細胞に結合したαＲＯＲ１／αＣＤ３二重特異性抗体を含有していたが、Ａ５４９／ＲＯＲ１－ＫＯ細胞に結合できなかったことを示すフローサイトメトリー結果を提供する。二重特異性構築物を含んでいなかった対照ウイルス（ＳｅｐＧＩ－ヌル）に感染した細胞の培養物から調製したＶＦＣＭは、細胞に結合できた抗体および抗イディオタイプＣＤ３抗体を含有していなかった。
（実施例５）
ウイルス感染培養物のＶＦＣＭからのαＲＯＲ１／αＣＤ３二重特異性抗体のＲＯＲ１陽性腫瘍細胞への結合。

【0166】

Ａ５４９－ＷＴおよびＡ５４９－ＲＯＲ１ ＫＯ細胞をｅＦｌｕｏｒ４５０色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号５０－２４６－０９６）を用い、製造業者によって推奨されるように染色した。精製されたヒトＴ細胞を、汎Ｔ細胞単離キット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；カタログ番号１３０－０９６－５３５）を使用して健康血液ドナーから新たに単離し、ｅＦｌｕｏｒ６７０色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号６５－０８４０－８５）を用い、製造業者によって推奨されるように染色した。細胞を３７℃でＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ １×リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で１．０Ｅ＋０７個細胞／ｍＬに再懸濁した。ｅＦｌｕｏｒ４５０標識Ａ５４９－ＷＴまたはＡ５４９－ＲＯＲ１ ＫＯ腫瘍細胞を、精製されたｅＦｌｕｏｒ６７０標識Ｔ細胞と１：１の比（３０，０００個腫瘍細胞および３０，０００個Ｔ細胞／ウェル）で混合し、Ｕ底低付着性９６ウェルプレート中で精製した（１０％ ＦＢＳを含有する１００μＬ／ウェルの完全ＲＰＭＩ １６４０培地中）。細胞を１，５００ｒｐｍで３分遠心分離し、プレートを迅速にはじくことによって上清を除去した。細胞ペレットを５０μＬの、αＣＤ３／αＲＯＲ１二重特異性構築物（ＳｅｐＧＩ－１８９、ＳｅｐＧＩ－２０１またはＳｅｐＧＩ－２０３）を含有する未希釈ウイルス不含培養培地（ＶＦＣＭ）に再懸濁した。細胞を３７℃で１時間インキュベートした。その後、細胞を、ウェルに直接添加された１００μＬの固定化緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号４２０８０１、ロット番号Ｂ２９５９６５）を用いて固定化し、細胞および抗体を、細胞を破壊したり、ピペッティングすることなく室温、暗所で２０分間インキュベートした。試料を、洗浄またはピペッティングすることなく、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴサイトメーターで直ちに分析した。図４Ａは、ＲＯＲ１（ＷＴ Ａ５４９細胞上に発現される）およびＣＤ３（Ｔ細胞で発現された）の両方に結合するＢｓｐＡｂが、ｅＦｌｕｏｒ ４５０標識ＷＴ Ａ５４９細胞およびｅＦｌｕｏｒ ６７０標識Ｔ細胞の両方に結合できる（しかし、Ａ５４９／ＲＯＲ１－ＫＯ細胞に結合できない）アッセイ設計を示す。

【0167】

図４Ｂは、フローサイトメトリー後に標識Ｔ細胞（単独）および標識ＷＴ Ａ５４９細胞（単独）が見られる蛍光四分円を示す。最右のプロットは、細胞がＶＦＣＭの存在下で混合されると、細胞がプロットの新規領域に現れることを示し、これは、両フルオロフォアが空間的に密接に接触していることを示す。グラフは、各々αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ構築物を含む、ＳｅｐＧＩ－１８９ウイルス、ＳｅｐＧＩ－２０１ウイルスおよびＳｅｐＧＩ－２０３ウイルスに感染した培養物から作製されたＶＦＣＭについてのＴ細胞のＷＴ Ａ５４９細胞およびＡ５４９／ＲＯＲ１－ＫＯ細胞との相互作用パーセントを示す。各場合において、ＷＴ Ａ５４９細胞およびＣＤ３細胞の相互作用は、Ａ５４９／ＲＯＲ１－ＫＯ細胞およびＣＤ３細胞の相互作用よりも著しく高く、これは、３種の二重特異性抗体すべてが、抗原特異的に腫瘍およびＴ細胞に同時に結合できることを示す。
（実施例６）
ＶＦＣＭのαＲＯＲ１／αＣＤ３二重特異性抗体の機能活性。

【0168】

Ｔ細胞における二重特異性αＲＯＲ１／αＣＤ３抗体のシグナル伝達を誘導する能力を試験するために、ＮＦＡＴ応答エレメント（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ）の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を有するＪｕｒｋａｔ細胞を使用するアッセイを使用した。図５Ａは、ＲＯＲ１発現Ａ５４９細胞に結合しているＢｓｐＡｂが、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３にも結合し、ルシフェラーゼ発現および発光シグナルにつながるシグナル伝達をもたらすアッセイ設定を表す。αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂに結合しないＡ５４９／ＲＯＲ１－ＫＯ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞シグナル伝達を刺激しない。

【0169】

アッセイを実施するために、２０，０００個のＡ５４９－ＷＴまたはＡ５４９－ＲＯＲ１ ＫＯ細胞を、乳白色の平底９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３９１７）中に１００μＬの完全ＲＰＭＩ－１６４０（１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０）中でプレーティングした。プレートを１，５００ｒｐｍで１分間回転した後、３７℃で一晩インキュベートし、細胞を付着させた。次いで、プレートを１，５００ｒｐｍで３分間回転させ、プレートを迅速にはじくことによって、上清を廃棄した。次いで、ＮＦＡＴ応答エレメントの制御下でルシフェラーゼを発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ）を、ウェル中にプレーティングした（５０μＬの完全ＲＰＭＩ－１６４０培地／ウェル中の３０，０００個細胞）。５０μＬ／ウェルの、１：１，０００希釈したαＲＯＲ１／αＣＤ３（ＳｅｐＧＩ－１８９、ＳｅｐＧＩ－２０１またはＳｅｐＧＩ－２０３）または陰性対照ＶＦＣＭ（ＳｅｐＧＩ－ヌル）のいずれかを添加することによって、細胞活性化を誘導した。精製された抗ＣＤ３クローンＨｕｍ２９１抗体を、Ｔ細胞活性化の陽性対照として２μｇ／ｍＬで別個のウェルに添加した。プレートを、加湿細胞インキュベーター中で３７℃で５時間インキュベートした。１００μＬ／ウェルのＢｉｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ７９４０；ロット番号００００４２２４０４）を製造業者によって推奨されるとおりに添加し、プレートを低速振盪条件下で室温で５分間、暗所でインキュベートすることによって発光シグナルが示された。ＴＥＣＡＮデバイス（積分時間：５００ｍｓ）を用いて発光シグナルを読み取った。図５Ｂは、３種のＶＦＣＭすべてがＴ細胞活性化を誘導し、ＳｅｐＧＩ－２０１およびＳｅｐＧＩ－２０３ ＶＦＣＭがＲＯＲ１依存性に強力なＴ細胞活性化を誘導したことを示す。
（実施例７）
αＲＯＲ１／αＣＤ３二重特異性抗体を含有するＶＦＣＭを使用する細胞傷害性アッセイ。

【0170】

αＲＯＲ１／αＣＤ３二重特異性抗体の存在下でのＴ細胞によるＲＯＲ１発現腫瘍細胞の死滅を試験するために、細胞傷害性アッセイを以下のとおりに実施した。０日目、１０，０００個のＡ５４９－ＦＬｕｃ ＷＴおよびＡ５４９－ＦＬｕｃ ＲＯＲ１ ＫＯ細胞（標的細胞）を乳白色の平底９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３９１７）中に、１００μＬの完全ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＣＳを補給したＲＰＭＩ１６４０）中でプレーティングした。プレートを１，５００ｒｐｍで１分間回転し、３７℃で一晩インキュベートし、細胞を付着させた。

【0171】

１日目に、ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）をヒト健康全血から単離し、ヒトＴ細胞は、汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；カタログ番号１３０－０９６－５３５、ロット５１９１１５４３９）を製造業者によって推奨されるとおりに使用してｈＰＢＭＣから単離した。

【0172】

プレートを迅速にはじくことによって標的細胞を含有する９６ウェルプレートから上清を除去し、α－ＲＯＲ１／α－ＣＤ３二重特異性抗体を含有するＶＦＣＭを、完全ＲＰＭＩ１６４０で希釈し、標的細胞に１００μＬ／ウェルで添加した。その後、１００μＬ／ウェルの精製されたヒトＴ細胞（エフェクター細胞）を標的細胞の上部に添加して（５，０００個細胞／ウェル）、０．５：１のＥ：Ｔ比に到達した。対照として、一部のウェルには、エフェクター細胞を入れなかった。細胞を穏やかに混合し、１，５００ｒｐｍで１分間回転させ、３７℃で３日間インキュベートした。４日目に、上清（１００μＬ／ウェル）を収集して、各条件のＩＦＮγ発現レベルを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ；カタログ番号Ｋ１５０４９Ｄ）からの炎症促進性パネル１（ヒト）キットを使用し、製造業者の推奨に従うことによって測定した。１００μＬ／ウェルのＢｉｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ７９４０；ロット番号００００４２２４０４）を製造業者によって推奨されるとおりに添加し、低速振盪条件下で室温で８分間、暗所でインキュベートすることによって示された発光シグナルを測定することによって、殺活性を評価した。ＴＥＣＡＮデバイス（積分時間：５００ｍｓ）を用いて発光シグナルを読み取った。試料の死滅パーセントは、以下のとおりに算出した：１００－（［発光_試料／ベースライン発光_{ＶＦＣＭなし対照}］）×１００。

【0173】

図６において提供される結果は、ＳｅｐＧＩ－１８９およびＳｅｐＧＩ－２０１に感染した細胞のＶＦＣＭは、Ｔ細胞によるＲＯＲ１発現腫瘍細胞の死滅を刺激できたことおよびこの効率的な死滅がＲＯＲ１を発現する腫瘍細胞に特異的であったことを示す。αＲＯＲ１／αＣＤ３二重特異性抗体の存在下で標的細胞と共培養されたＴ細胞はまた、相当な量のインターフェロンガンマを分泌した。
（実施例８）
様々なレベルのＲＯＲ１発現を有する腫瘍株を使用するαＲＯＲ１／αＣＤ３二重特異性抗体を含有するＶＦＣＭを含む細胞傷害性アッセイ。

【0174】

腫瘍細胞株Ａ５４９－Ｆｌｕｃ ＷＴ、Ａ４５９－Ｆｌｕｃ／ＲＯＲ１ ＫＯ、ＭＣＦ－７－Ｆｌｕｃおよびホタルルシフェラーゼを発現するＨｅｐＧ２－Ｆｌｕｃ（Ｆｌｕｃ）でのＲＯＲ１発現は、フローサイトメトリーによって評価された。手短には、細胞を８０，０００個細胞／ウェルでＶ底９６ウェルプレート中にプレーティングし、１７０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ １×＋２％ＦＣＳ／ＦＢＳ＋０．１％ナトリウムアジド）を使用して２回洗浄した。精製されたヒト抗ヒトＲＯＲ１抗体を多様な濃度（１０～０．０００６１μｇ／ｍＬの範囲；希釈１：４）でＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、次いで、細胞を１００μＬ／ウェルの希釈抗体に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。１７０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞を８０μＬ／ウェルで、ＡＦ６４７がコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号２０４０－３１、ロットＫ４７１Ｘ８７３Ｃ；ＦＡＣＳ緩衝液で希釈１：２，０００）と共に４℃で２０分間インキュベートした。細胞ペレットを２回洗浄し、その後、１２０μＬの固定化緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号４２０８０１、ロット番号Ｂ３０６４９８）を用いて再懸濁し、室温、暗所で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を１，５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、プレートを迅速にはじくことによって上清を除去した。細胞を２回洗浄し、１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴでのフローサイトメトリーによって取得した。データはＦｌｏｗＪｏ ｖ１０を使用して分析した。図７Ａは、ヒト腫瘍細胞株、Ａ５４９（肺胞腺癌）のものが、ＲＯＲ１発現の最高レベルを有し、ＨｅｐＧ２（肝臓がん）は、ＲＯＲ１をほとんど発現せず、ＲＯＲ１抗体の検出された標識がＡ５４９－ＲＯＲ１ノックアウト細胞のものと同等であることを示す。ＭＣＦ－７（乳がん）細胞は、中間レベルのＲＯＲ１を発現した。

【0175】

死滅アッセイを実施するために、ヒト健康全血からヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を単離し、次いで、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；カタログ番号１７９５１、ロット１００００２４１３９）を製造業者によって推奨されるとおりに使用して、ヒトＴ細胞をｈＰＢＭＣから単離した。Ａ５４９－Ｆｌｕｃ ＷＴ、Ａ４５９－Ｆｌｕｃ／ＲＯＲ１ ＫＯ、ＭＣＦ－７－ＦｌｕｃおよびＨｅｐＧ２－Ｆｌｕｃ標的細胞を、乳白色の平底９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３９１７）中に１００μＬの完全培養培地中、１０，０００個細胞／ウェルでプレーティングした。プレートを１，５００ｒｐｍで１分間回転させ、３７℃で一晩インキュベートし、細胞を付着させた。標的細胞を含有する９６ウェルプレートから上清を、プレートを迅速にはじくことによって除去した。精製されたエフェクターＴ細胞（１００μＬ／ウェル）を標的細胞の上部に２：１ Ｅ：Ｔ比でプレーティングした。対照として、一部のウェルには、エフェクター細胞を入れなかった。ＳｅｐＧＩ－２０１感染培養物またはＳｅｐＧＩ－ヌル感染培養物のＶＦＣＭを完全ＲＰＭＩ１６４０で希釈し、１００μＬ／ウェルで細胞に添加した。ＳｅｐＧＩ－２０１ウイルスは、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ構築物を含み、ＳｅｐＧＩ－ヌルウイルスは、ＢｓｐＡｂ構築物を含まない。細胞を穏やかに混合し、１，５００ｒｐｍで１分間回転させ、３７℃で３日間インキュベートし、その後、上清（１００μＬ／ウェル）を収集した。上清中に存在するＩＦＮγレベルを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ；カタログ番号Ｋ１５０４９Ｄ）からの炎症促進性パネル１（ヒト）キットを使用し、製造業者の推奨に従うことによって測定した。殺活性は、製造業者によって推奨されるとおり、１００μＬ／ウェルのＢｉｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ７９４０；ロット番号００００４２２４０４）を添加することおよび低速振盪条件下で室温、暗所で５分インキュベートすることによってウェルからの発光シグナルを測定することによって評価した。ＴＥＣＡＮデバイス（積分時間：５００ｍｓ）を用いて発光シグナルを読み取った。試料の死滅パーセントは、以下のとおりに算出した：１００－（［発光_試料／ベースライン発光_{ＶＦＣＭなし対照}］）×１００。図７Ｂは、ＩＦＮγ発現の増大によって実証されるように、Ａ５４９およびＭＣＦ－７細胞はＳｅｐＧＩ－２０１ ＶＣＦＭの存在下でＴ細胞によって死滅したが、一方で、ＨｅｐＧ２細胞は、高いＶＦＣＭ濃度でＴ細胞が活性化された場合であっても保存された（低いＲＯＲ１発現のために）ことを実証する。
（実施例９）
二重特異性抗体を発現する腫瘍溶解性ウイルスＳｅｐＧＩ－１８９、ＳｅｐＧＩ－２０１およびＳｅｐＧＩ－２０３の殺活性。

【0176】

図８Ａは、それぞれ「ｏ１１」αＲＯＲ１／αＣＤ３、「ｓ１０」αＲＯＲ１／αＣＤ３および「ｊｌｖ１０１１」αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂ構築物を発現する、腫瘍溶解性ウイルスＳｅｐＧＩ－１８９、ＳｅｐＧＩ－２０１および ＳｅｐＧＩ－２０３によって、Ａ５４９腫瘍細胞を死滅させることを評価するための実験計画を提供する（表１）。０日目に、Ａ５４９－Ｆｌｕｃ ＷＴおよびＡ５４９－Ｆｌｕｃ ＲＯＲ１ ＫＯ標的細胞を、乳白色の平底９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３９１７）中に、１００μＬの完全ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＣＳ中、１０，０００個細胞／ウェルでプレーティングした。プレートを１，５００ｒｐｍで１分間回転させ、３７℃で一晩インキュベートして、細胞を付着させた。１日目に、標的細胞に、αＲＯＲ１／αＣＤ３ウイルス（ＳｅｐＧＩ－１８９、ＳｅｐＧＩ－２０１またはＳｅｐＧＩ－２０３、表１を参照されたい）または陰性対照ＳｅｐＧＩ－ヌルウイルスのいずれかを１、０．３３、０．１１、０．０４および０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。２日目に、汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；カタログ番号１３０－０９６－５３５、ロット５１９１１５４３９）を製造業者によって推奨されるとおりに使用して、新たに単離されたＰＢＭＣからＴ細胞を精製した。９６ウェルプレートを迅速にはじくことによって標的細胞から上清を除去し、２０，０００個のエフェクターＴ細胞を１００μＬ／ウェルでプレーティングして、２：１のＥ：Ｔ比に到達した。細胞を穏やかに混合し、１，５００ｒｐｍで１分間回転させ、３７℃で４日間インキュベートした。６日目に、１００μＬ／ウェルのＢｉｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ７９４０；ロット番号００００４２２４０４）を製造業者によって推奨されるとおりに使用し、低速振盪条件下で室温で５分間、暗所でインキュベートすることによって発光シグナルを測定することによって殺活性を評価した。ＴＥＣＡＮデバイス（積分時間：５００ｍｓ）を用いて発光シグナルを読み取った。試料の死滅パーセントは、以下のとおりに算出した：１００－（［発光_試料／ベースライン発光_{ウイルスなし}］）×１００。

【0177】

図８Ｂは、０．１１程度の低いＭＯＩでＢｓｐＡｂ発現ウイルスの各々に感染した腫瘍細胞が、ＳｅｐＧＩ－ヌルウイルスに感染した腫瘍細胞よりも有意なパーセンテージで死滅したことを示す。ＳｅｐＧＩ－２０１での腫瘍細胞の感染は、０．０４のＭＯＩで腫瘍細胞の有意に高い死滅につながり、一方で、ＳｅｐＧＩ－２０３での腫瘍細胞の感染は、０．０１のＭＯＩで腫瘍細胞の有意に高い死滅につながった。ＲＯＲ１ノックアウト腫瘍細胞がウイルスに感染し、標的として使用された場合には、同一効果は見られなかった。この場合には、ＳｅｐＧＩ－２０３ウイルスでの感染のみが、有意に高い死滅につながり、ＳｅｐＧＩ－２０３が０．１１より高いＭＯＩで、ある程度の非特異的死滅を示したことを実証した。これらのデータをすべて合わせると、αＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂと組み合わされた腫瘍溶解活性は、抗原特異的な依存的方法で抗腫瘍活性を有意に増大することが示された。
（実施例１０）
ｓ１０およびｊｌｖ１０１１モノクローナル抗体のマウス交差反応性。

【0178】

αＲＯＲ１／αＣＤ３二重特異性抗体の操作において使用されるｓ１０（ＲＯ６Ｄ８－ｓ１０）およびｊｌｖ１０１１（ＲＯ６Ｄ８－ｊｌｖ１０１１）モノクローナル抗体が、ヒトＲＯＲ１に加えてマウスＲＯＲ１を認識したか否かを試験するために、図９Ａに表されるアッセイを利用した。９６ウェルプレートを、２μｇ／ｍＬの５０μＬ／ウェルの組換えマウスＲＯＲ１ ＩｇＧ_２－Ｆｃ融合タンパク質でコーティングし（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９９１０－ＲＯ－０５０、ロット番号ＤＩＷＭ０１２０１２１）、次いで、プレートを密閉し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを１５０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（０．０５％ Ｖ／Ｖ Ｔｗｅｅｎ２０を有するＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水１×）で洗浄した。８０μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（２％ ＢＳＡ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を有するＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水）を使用することによって非特異的結合をブロックし、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、２種の抗ヒトＲＯＲ１抗体（ｓ１０およびｊｌｖ１０１１）をブロッキング緩衝液（８０μＬ／ウェル）で段階希釈し、低速で振盪しながら室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで、８０μＬ／ウェルの、ブロッキング緩衝液で希釈した（１：２，０００希釈）二次ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号２０８１－０５；ロット番号Ｌ５３１１－ＴＥ４０）を添加した。プレートを３７℃、暗所で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ウェルにＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ １－成分マイクロウェルペルオキシダーゼ基質溶液（ＳｅｒａＣａｒｅ、カタログ番号５１２０－００８２）を添加した（８０μＬ／ウェル）。プレートを室温、暗所で１０～１５分間インキュベートした。５０μＬ／ウェルのＴＭＢ Ｂｌｕｅ ＳＴＯＰ溶液（ＳｅｒａＣａｒｅ、カタログ番号５１５０－００２２）を添加することによってシグナル発生を停止し、その後、ＴｅｃａｎＳｐａｒｋまたは他のデバイスを使用してシグナルを４５０ｎｍ（ＳｅｒａＣａｒｅ ＴＭＢ ＢｌｕｅＳＴＯＰ溶液に対して特異的）で読み取った。図９Ｂは、ＳｅｐＧＩ－２０１およびＳｅｐＧＩ－２０３のＢｓｐＡｂ構築物を作製するために使用された両抗ＲＯＲ１抗体が、マウス交差反応性を示すことを示す。
（実施例１１）
ＢｓｐＡｂを発現するウイルスを用いる腫瘍処置のｉｎ ｖｉｖｏ研究。

【0179】

図１０Ａは、αＲＯＲ１／αＣＤ３二重特異性抗体を発現する腫瘍溶解性ウイルスの有効性を試験するために使用されたマウスの接種および処置スケジュールの図を提供する。－６日目に（Ｄ－６）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）１×中の１．０Ｅ＋０７個の新たに精製されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、雌のＮＳＧ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＩＬ－１５）マウス（６週齢）に腹膜内注射した（Ｉ．Ｐ．）。０日目（Ｄ０）、１００μＬのＤＰＢＳ １×で希釈した５．０Ｅ＋０６個のＡ５４９－ＷＴ腫瘍細胞を用いてマウスに右側腹部に皮下注射した（Ｓ．Ｃ．）。６日目（Ｄ６）に、マウスを４群に無作為化し（３つの「ウイルス処置」群および１つの「ウイルス処置なし」対照群）、６、１０および１２日目に、ウイルス処置を開始した：ＳｅｐＧ１－１８９、ＳｅｐＧ１－２０１、ＳｅｐＧＩ－ヌルのいずれかの５０μＬ／マウス／注射、またはウイルスなしを腫瘍周囲（Ｐ．Ｔ．）に送達した。腫瘍成長および体重を週に２回モニタリングした。腫瘍体積をノギスを使用して測定し、式Ｖ＝（長さ×幅^２）／２を使用して算出した。３１日目に研究を終了し、腫瘍成長阻害パーセント（ＴＧＩ）を以下のとおりに算出した：［１－（処置群の相対腫瘍体積）／（対照群の相対腫瘍体積）］×１００。

【0180】

図１０Ｂおよび１０Ｃは、処置群および非処置群の腫瘍体積および算出された腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を提供し、図１０Ｄは、各実験の過程にわたるマウス体重を提供する。αＲＯＲ１／αＣＤ３二重特異性抗体を発現するウイルス（ＳｅｐＧＩ－１８９およびＳｅｐＧＩ－２０１）を用いる処置は、処置なしまたはαＲＯＲ１／αＣＤ３ ＢｓｐＡｂを発現しなかったウイルス（ＳｅｐＧＩ－ヌル）を用いる処置のいずれかよりも腫瘍成長のより大きな阻害につながった。
（実施例１２）
ＲＯＲ１／ＣＤ３二重特異性抗体を、ＩＬ－１２またはＩＬ－１２および抗ＶＥＧＦＲ抗体をコードするさらなる遺伝子と一緒に発現するための構築物。

【0181】

ＲＯＲ１－ＣＤ３二重特異性抗体、さらにサイトカインＩＬ－１２をコードするＨＳＶの合成のためにさらなる構築物を作製した。ＳｅｐＧＩ－２１６構築物（二重遺伝子構築物、図１１Ａ）は、ＥＦ１α／ＨＴＬＶプロモーター（配列番号４１）の制御下のαＲＯＲ１（ｓ１０）－αＣＤ３二重特異性抗体（配列番号１８）およびＣＭＶプロモーター（配列番号４２）の制御下のヒトＩＬ－１２（配列番号４６）をコードする遺伝子を含んでいた。ヒトＩＬ－１２遺伝子は、２×エラスチンリンカー（配列番号６６）によって接続された、ＩＬ－１２のｐ４０およびｐ３５サブユニットを両方とも包含する単一ポリペプチド（配列番号４７）をコードしていた。ＳｅｐＧＩ－２１２構築物（三重遺伝子構築物、図１１Ｂ）は、ＥＦ１α／ＨＴＬＶプロモーター（配列番号４１）の制御下にαＲＯＲ１（ｓ１０）－αＣＤ３二重特異性抗体（配列番号３７）をコードする遺伝子およびＦｃ１領域（配列番号５０）に連結された抗ＶＥＧＦＲ２ ｓｃＦｖをコードする遺伝子およびヒトＩＬ－１２遺伝子（配列番号４６）を含み、αＶＥＧＦＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ１（配列番号４８）をコードする配列およびヒトＩＬ－１２（配列番号４６）をコードする配列は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド（配列番号５１）をコードする配列によって分けられており、ヒトＩＬ－１２ポリペプチドおよびＶＥＧＦＲ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ１ポリペプチドをコードする配列を包含する連続オープンリーディングフレームは、ＣＭＶプロモーター（配列番号４２）の制御下にある（図１１Ｂを参照されたい）。

【0182】

さらに、対照として使用するために、αＲＯＲ１（ｓ１０）－αＣＤ３二重特異性抗体をコードする遺伝子が、呼吸器合胞体ウイルスのＦタンパク質（配列番号４３）およびＣＤ３（本明細書において「αＲＳＶ－αＣＤ３二重特異性抗体」と呼ばれる）に結合したｓｃＦｖを含んでいた二重特異性抗体をコードする遺伝子によって置き換えられた類似の構築物を設計した。これらの構築物のクローニングならびに組換えウイルスの生成および単離は、本質的に実施例１に示されたように実施した。

【表2】

【0183】

導入遺伝子の発現についてＥＬＩＳＡによって評価するために、ウイルス（実施例２を参照されたい）から生成されたＶＦＣＭを、本質的に実施例３に記載されるように試験し、プレートのウェルをＲＯＲ１、ＲＳＶタンパク質またはヒトＶＥＧＦＲのいずれかでコーティングした。

【0184】

ＥＬＩＳＡの結果が図１２Ａ、ＢおよびＣに提供されている。第１のグラフ（図１２Ａ）は、ＲＳＶタンパク質抗体をコードする遺伝子を含んでいた３種のウイルス（ＳｅｐＧＩ－２０７、ＳｅｐＧＩ－２１４およびＳｅｐＧＩ－２１８）はすべて、ＲＳＶ抗体を生成したが、他のウイルス（ＲＳＶタンパク質抗体を欠く）のうち生成したものはなかったことを示す。図１２Ｂは、ウイルスＳｅｐＧＩ－２０１、ＳｅｐＧＩ－２１６およびＳｅｐＧＩ－２１２はすべて、予測されたようにＲＯＲ１抗体を発現したが、αＲＯＲ１（ｓ１０）－αＣＤ３二重特異性抗体をコードする遺伝子を欠く対照ウイルスは発現しなかったことを示す。図１２Ｃは、ＩＬ－１２を検出するために使用されたＥＬＩＳＡの結果を示す。この場合には、ＳｅｐＧＩ－２１２、ＳｅｐＧＩ－２１６およびＳｅｐＧＩ－２１８に感染した細胞からのＶＦＣＭはすべて、ＩＬ－１２タンパク質を含有するとわかったが、ＳｅｐＧＩ－２１４に感染した細胞の２つの分離株は含有しなかった（ＳｅｐＧＩ－２１４のその後の分離株は、後にＩＬ－１２を生成するとわかった）。予測されたように、ＩＬ－１２は、非感染培養物またはＳｅｐＧＩヌルウイルスもしくはＳｅｐＧＩ－２０７ウイルスに感染した培養物のＶＦＣＭでは検出されなかった。

【0185】

ＶＥＧＦＲ２ ｓｃＦｖ抗体を検出するためのＥＬＩＳＡの結果が図１３に示されており、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルは、組換えヒトＶＥＧＦＲ２（ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲタンパク質（ＥＣＤ、Ｈｉｓタグ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ））でコーティングされていた。抗原でコーティングされたウェルを洗浄した後、ＶＦＣＭをブロッキング緩衝液で８倍段階希釈し、５０μＬ／ウェルで添加し、プレートをシェーカー上で室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、５０μＬ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、ＨＲＰ（ブロッキング緩衝液で１：５，０００×希釈された）を添加し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した後、５０μＬ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ １－成分マイクロウェルペルオキシダーゼ基質溶液（カタログ番号５１２０－００８２、ＳｅｒａＣａｒｅ）を使用することによってシグナルを検出した。プレートを室温、暗所で１０～１２分インキュベートした。次いで、５０μＬ／ウェルのＴＭＢ ＢｌｕｅＳＴＯＰ溶液（カタログ番号５１５０－００２２、ＳｅｒａＣａｒｅ）を添加し、ＴｅｃａｎＳｐａｒｋを使用して吸光度を４５０ｎｍ（ＳｅｒａＣａｒｅ ＴＭＢ ＢｌｕｅＳＴＯＰ溶液に対して特異的）で読み取った。図１３のグラフは、三重遺伝子ウイルスＳｅｐＧＩ－２１２の１つの分離株のＶＦＣＭはαＶＥＧＦＲ２－Ｆｃ抗体の発現を実証したが、αＶＥＧＦＲ２－Ｆｃ抗体遺伝子を含まなかったウイルス（ＳｅｐＧＩ－ヌル、ＳｅｐＧＩ－２０１、ＳｅｐＧＩ－２０７、ＳｅｐＧＩ－２１６およびＳｅｐＧＩ－２１８）のＶＣＦＭのいずれかの結合はなかったことを示す。
（実施例１３）
ＩＬ－１２活性アッセイ。

【0186】

ＩＬ－１２の活性のアッセイを、本質的に実施例９に記載されるように実施し、ＳｅｐＧＩ－ヌル、ＳｅｐＧＩ－２０１、ＳｅｐＧＩ－２０７、ＳｅｐＧＩ－２１２、ＳｅｐＧＩ－２１４、ＳｅｐＧＩ－２１６およびＳｅｐＧ１－２１８に感染した細胞のＶＦＣＭを、ルシフェラーゼベースのアッセイで試験した。ヘテロ二量体ＩＬ－１２受容体を有し、ＩＬ－１２応答性プロモーター（ｉＬｉｔｅ（登録商標）ＩＬ－１２ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｄｙ Ｃｅｌｌ（Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＨ）））の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を有するように操作された細胞を組換えＨＳＶに感染した細胞の溶解物と共にインキュベートした、細胞ベースのアッセイを使用した。Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｓ Ｏｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼシステムを検出のために使用した。

【0187】

手短には、非感染細胞または多様なＨＳＶに感染した細胞からの希釈したＶＦＣＭを、９６ウェルプレートのウェルに添加することによってアッセイを実施した。感染細胞培養物の溶解物（ＶＦＣＭ）を、実施例２に記載されるように生成した。組換え型ＩＬ－１２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の希釈系列を、さらなるウェルに添加して、標準曲線を作製した。ＩＬ－１２リポーター細胞を本質的に製造業者の使用説明書に従って使用した。４０Ｋ ｉＬｉｔｅ細胞を解凍し、希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに４０μｌを添加した。次いで、ＶＦＣＭの４０μｌの希釈系列をアッセイウェルに添加し、ウェルの内容物を混合し、プレートを３７℃、５％ ＣＯ_２で５時間インキュベートした。標準曲線を作成するために、組換えＩＬ－１２を希釈系列で別個のウェルに添加した。次いで、各ウェルにＯｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を添加し（４０μＬ）、室温で１０分後に、ＴｅｃａｎＳｐａｒｋプレートリーダーを使用してホタルルシフェラーゼ発光を測定した。結果は、図１４に示されており、非感染細胞条件培地、外因性導入遺伝子を含まなかったウイルス（ＳｅｐＧＩ－ヌル）に感染した細胞からの条件培地、およびＩＬ１２遺伝子含有ウイルスＳｅｐＧＩ－２０１およびＳｅｐＧＩ－２０７（ＩＬ１２遺伝子なし）、ＳｅｐＧＩ－２１２およびＳｅｐＧＩ－２１４（ＩＬ－１２遺伝子を有する三重遺伝子ウイルス）ならびにＳｅｐＧＩ－２１６およびＳｅｐＧＩ－２１６（ＩＬ－１２遺伝子を有する二重遺伝子ウイルス）に感染した細胞からの条件培地を使用するアッセイからの発光のグラフを提供する。注目すべきことに、ＥＬＩＳＡにおいてＩＬ－１２タンパク質の生成もまた示さなかった（実施例１２）三重遺伝子ウイルスＳｅｐＧＩ－２１４の分離株を除いて、ＩＬ－１２遺伝子を含んでいたウイルスに感染したすべての細胞は、機能的ＩＬ－１２を発現した。
（実施例１４）
細胞－細胞相互作用アッセイ。

【0188】

操作されたＨＳＶによってコードされるαＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体の、標的ＲＯＲ１発現腫瘍細胞およびＴ細胞にコンジュゲートする能力を評価するために、フルオロフォアを用いてマウス腫瘍細胞およびヒトＴ細胞を別個に標識した。両方ともＲＯＲ１を発現するＨｅｐａ １－６細胞およびＡ５４９細胞を、ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて標識し（図１５Ｂ）、ＰＢＭＣから単離されたヒトＴ細胞を使用し、ｅＦｌｕｏｒ ６７０を用いて事前に標識し（図１５Ｃ）、本質的に実施例５に記載されたように、細胞－細胞相互作用をアッセイし、フローサイトメトリーによって分析した。図１５Ｄは、フローサイトメトリー結果の一例を示し、コンジュゲートされた細胞（両波長で蛍光を発する）がプロットの右上の象限に見られる。

【0189】

Ｔ細胞のＲＯＲ１発現腫瘍細胞とのαＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体媒介性コンジュゲーションのフローサイトメトリーアッセイの結果が、図１６Ａ、ＢおよびＣに図によって示されている。図１６Ａは、左から右に、αＲＳＶ－αＣＤ３二重特異性抗体ならびにＩＬ－１２をコードする構築物を発現するＳｅｐＧＩ－２１８ ＶＦＣＭの存在下での共インキュベーション後にＴ細胞にコンジュゲートされたＨｅｐａ １－６細胞、Ａ５４９野生型細胞およびＡ５４９ ＲＯＲ１ノックアウト細胞のパーセンテージを示す。図１６Ｂは、左から右に、αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体をコードする構築物を発現するＳｅｐＧＩ－２０１ ＶＦＣＭの存在下での共インキュベーション後のＨｅｐａ １－６細胞、次いでＡ５４９野生型細胞のパーセンテージを示す。図１６Ｃは、左から右に、αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体ならびにＩＬ－１２をコードする構築物を発現するＳｅｐＧＩ－２１６ ＶＦＣＭの存在下での共インキュベーション後のＨｅｐａ １－６細胞、次いでＡ５４９野生型細胞のパーセンテージを示す。ＳＲＯＲ１＋の存在下で最小の細胞－細胞相互作用が観察され、ＳｅｐＧＩ－２０１感染細胞およびＳｅｐＧＩ－２１６感染細胞のＶＦＣＭの存在下で腫瘍細胞－Ｔ細胞相互作用が観察され、ＳｅｐＧＩ－２０１感染細胞とＳｅｐＧＩ－２１６感染細胞の間では有意差は観察されなかった。
（実施例１５）
Ｔ細胞活性化アッセイ。

【0190】

Ｔ細胞活性化に対するαＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体の効果を決定するために、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞が、αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体をコードするウイルスに感染した細胞のＶＦＣＭの存在下でＴ細胞と共にインキュベートされ、その後、Ｔ細胞の表面上の活性化マーカーが評価されるアッセイを実施した。手短には、野生型Ａ５４９細胞を、または対照としてＲＯＲ１ノックアウトＡ５４９細胞を、ウェルあたり１０^４個細胞で９６ウェルプレートのウェル中にプレーティングした。翌日、ＣＦＳＥで染色された新たに単離されたＣＤ３＋Ｔ細胞を、１０：１または５：１のＥ：Ｔ比でウェルに添加した。ＶＦＣＭを１，０００倍希釈でウェルに添加し、または陽性対照としてＣＤ３／ＣＤ２８ビーズをウェルに添加した（１：２０のビーズ：細胞比）。１、２および３日後、活性化マーカーの発現についてのＴ細胞の染色およびフローサイトメトリーによる分析のために上清を除去した。

【0191】

図１７Ａ～Ｄは、標的としてＲＯＲ１ノックアウトＡ５４９細胞を用いるアッセイの結果を提供する。図１７Ａは、アッセイの１、２および３日目でのＣＤ３＋Ｔ細胞の生存力は、細胞が非感染培養物のＶＦＣＭと共に（第１の２つのバー）またはＳｅｐＧＩ－ヌルウイルス（第２の２つのバー）、ＳｅｐＧＩ－２０７ウイルス（第２の２つのバー）、ＳｅｐＧＩ－２０１ウイルス（第３の２つのバー）もしくはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（第４の２つのバー）に感染した細胞のＶＦＣＭと共に培養されたか否かに関わらず、１００％に近かったことを示す。図１７Ｂは、連続するアッセイ日での各アッセイ群のＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞計数を提供する。図１７Ｃは、フローサイトメトリーに基づいた、連続するアッセイ日での各アッセイ群のＣＤ２５＋細胞のパーセンテージを提供し、図１７Ｄは、連続するアッセイ日での各アッセイ群のＣＤ６９＋細胞のパーセンテージを提供する。ＣＤ３／ＣＤ３８ビーズは、アッセイの過程にわたるＣＤ２５およびＣＤ６９両方の発現の増大によって証明されるようにＴ細胞の活性化をもたらしたが、ＲＯＲ１ノックアウト細胞が標的として使用される場合には、ＶＦＣＭの存在に関わらずＣＤ２５およびＣＤ６９の発現によって評価されるように、Ｔ細胞の活性化は観察されなかった。

【0192】

図１７Ｅ～Ｈは、標的としてＲＯＲ１を発現する野生型Ａ５４９細胞を用いるアッセイの結果を提供する。図１７Ｅは、ＣＤ３＋Ｔ細胞の生存力が、細胞が非感染培養物のＶＦＣＭと共に（第１の２つのバー）またはＳｅｐＧＩ－ヌルウイルス（第２の２つのバー）、ＳｅｐＧＩ－２０７ウイルス（第２の２つのバー）、ＳｅｐＧＩ－２０１ウイルス（第３の２つのバー）またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（第４の２つのバー）に感染した細胞のＶＦＣＭと共に培養されたか否かに関わらず、アッセイの１、２および３日目に、１００％に近かったことを示す。図１７Ｆは、連続するアッセイ日での各アッセイ群のＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞計数を提供する。図１７Ｇは、フローサイトメトリーに基づいた、連続するアッセイ日での各アッセイ群のＣＤ２５＋細胞のパーセンテージを提供し、図１７Ｈは、連続するアッセイ日での各アッセイ群のＣＤ６９＋細胞のパーセンテージを提供する。注目すべきことに、αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体を発現するように操作されたＳｅｐＧＩ－２０１ウイルスに感染した培養物のＶＦＣＭの存在は、共培養においてＴ細胞によるＣＤ２５およびＣＤ６９両方の発現をもたらした。この誘導された発現は、代わりにＳｅｐＧＩ－２０７感染細胞のＶＦＣＭ、ＳｅｐＧＩ－２０７感染細胞のＶＦＣＭまたは非感染細胞のＶＦＣＭを含んでいた共培養物については観察されなかった。したがって、ＲＯＲ１を発現した標的細胞を使用する、共培養物中のＴ細胞の活性化は、Ｔ細胞に関与してその活性化を引き起こすことができる、αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体の存在に起因する可能性がある。
（実施例１６）
Ｔ細胞増殖／活性化アッセイ。

【0193】

単一および二重遺伝子発現ウイルスを用いてさらなる細胞培養アッセイを実施した。これらのアッセイではＡ５４９野生型またはＡ５４９ ＲＯＲ１ノックアウト細胞を、ウェルあたり１０^４個細胞で９６ウェルプレートのウェル中にプレーティングした。セルトレースバイオレット（ＣＴＶ）色素で染色された精製されたヒトＴ細胞を１０：１および５：１エフェクター：標的比でウェルに添加し、１：１，０００希釈のＶＦＣＭをウェルに添加した。ＶＦＣＭは、ＳｅｐＧＩ－２０７（αＲＳＶ－αＣＤ３二重特異性抗体遺伝子）、ＳｅｐＧＩ－２０１（αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体遺伝子）、ＳｅｐＧＩ－２１６（αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体遺伝子およびＩＬ－１２遺伝子）およびＳｅｐＧＩ－２１８（αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体遺伝子およびＩＬ－１２遺伝子）に感染した細胞のものであった。プレートを３日間インキュベートし、１、２または３日後にフローサイトメトリーを実施して、ＣＴＶ＋Ｔ細胞のパーセンテージによって細胞増殖を決定した。図１８は、５：１のエフェクター対標的比のアッセイの結果を示し、ＲＯＲ＋標的細胞についてのみ、およびＳｅｐＧＩ－２０１およびＳｅｐＧＩ－２１６感染培養物のαＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体含有ＶＦＣＭが培養物中に含まれた場合にのみ特異的Ｔ細胞増殖が観察された。
（実施例１７）
αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体を発現するように操作された、単一、二重および三重遺伝子ＨＳＶに感染した細胞のＶＦＣＭを使用する、ルシフェラーゼベースの死滅アッセイ。

【0194】

αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体を発現するように操作されたＨＳＶに感染した細胞のＶＦＣＭの、Ｔ細胞によるＲＯＲ１＋腫瘍細胞の死滅に対する効果を評価するアッセイを実施した。これらのアッセイのために、標的細胞（対照として使用するためのＡ５４９野生型細胞またはＡ５４９ ＲＯＲ１ノックアウト細胞）を、細胞にＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼを発現させるためにレトロウイルスを形質導入することによって標識した。ルシフェラーゼ発現標的細胞を、９６ウェルプレート中に１００μｌのＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＣＳ中でウェルあたり１０^４個細胞でプレーティングし、３７℃で２日間培養した。ＰＢＭＣから新たに単離した新たに単離したヒトＴ細胞を、次いで０．５：１の比でウェルに添加し、１，０００または１：８，０００の希釈のＶＦＣＭを各アッセイウェルに添加した。プレートを３７℃で４日間インキュベートし、その後、ルシフェラーゼ発現細胞数を、８０μｌのＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加すること、プレートを暗所で５分間インキュベートすること、およびＴＥＣＡＮデバイスで発光を読み取ること（積分時間、５００ｍｓ）によって評価した。図１９Ａは、Ｔ細胞（エフェクター）の不在下では、Ａ５４９野生型細胞数は、培養物に添加されるＶＣＦＭの存在または種類に関わらず、１０^７に近いことを示す。しかし、Ｔ細胞の存在下では、αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体を発現するように操作されたウイルス：ＳｅｐＧＩ－２０１、ＳｅｐＧＩ－２１２およびＳｅｐＧＩ－２１６（表２を参照されたい）のＶＦＣＭを含んでいた培養物におけるＡ５４９野生型標的細胞の低減が明らかである。図１９Ｃに示されるように死滅のパーセンテージを提供するグラフにおいて見られるように、標的細胞の死滅は、αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体を発現するように操作されなかったＳｅｐＧＩ－２０７、ＳｅｐＧＩ－２１４およびＳｅｐＧＩ２１８ウイルスのＶＦＣＭを含んでいた培養物では観察されなかった。図１９Ｂおよび１９Ｄは、ＲＯＲ１ノックアウトＡ５４９標的細胞が使用された場合の結果を提供し、共培養中のＶＣＦＭ（または二重特異性抗体）に関わらずＴ細胞エフェクターによるＲＯＲ１を発現しなかった細胞の死滅がないことを実証する。
（実施例１８）
単一、二重、三重遺伝子発現体（ＶＦＣＭ）を用いる５４９ＷＴ細胞を使用するＸｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ死滅アッセイ。

【0195】

ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）リアルタイム細胞アナライザー（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用する死滅アッセイも実施した。これらの実験のために、Ａ５４９野生型およびＡ５４９ ＲＯＲ１ノックアウト細胞を、５０μｌのＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＣＳ中で１０，０００個細胞／ウェルで９６ウェルＥプレート（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のウェル中に播種した。Ｔ細胞を０．５：１のエフェクター対標的比で添加し、ＨＳＶ ＳｅｐＧＩ－ヌル、ＳｅｐＧＩ－２０７、ＳｅｐＧＩ－２１２、ＳｅｐＧＩ－２１６およびＳｅｐＧＩ－２１８に感染した細胞培養物のＶＦＣＭの１：１，０００希釈も添加した。プレートを３日間連続的に読み取った。図２０は、αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体構築物を含まなかったＨＳＶ：ＳｅｐＧＩ－２０７、ＳｅｐＧＩ－２１４、ＳｅｐＧＩ－２１８およびＳｅｐＧＩ－１２３（ＩＬ－１２遺伝子のみ）のＶＦＣＭを含んでいたアッセイが、ＶＦＣＭを全体で欠く培養物と本質的に同じ程度に、同じパターンで増殖したことを示す。他方、αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体構築物を発現するように操作されたＨＳＶ：ＳｅｐＧＩ－２０１、ＳｅｐＧＩ－２１２およびＳｅｐＧＩ－２１６のＶＦＣＭを含んでいたアッセイは、増殖の低減を実証し、これは、これらの培養物におけるＲＯＲ１＋標的細胞の死滅を示した。図２１は、標的細胞がＲＯＲ１ノックアウト細胞であった並行アッセイの結果を示す。この場合には、増殖が損なわれることは観察されなかった。
（実施例１９）
ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ偽性ヒト化マウスモデルにおけるＳｅｐＧＩ－２０１ ＶＦＣＭの抗腫瘍活性のｉｎ ｖｉｖｏ研究。

【0196】

αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体を発現するように操作されたＳｅｐＧＩ－２０１ ＨＳＶに感染した細胞のＶＦＣＭを用いる、腫瘍保有ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ偽性ヒト化マウスの処置の効果を評価する研究を設計した。対照として、αＲＳＶ－αＣＤ３二重特異性抗体を発現するように操作されたＳｅｐＧＩ－２０７ ＨＳＶに感染した細胞のＶＦＣＭを用いて、一部の腫瘍保有マウスを処置した。表３に示される処置レジメンを用いる８匹のマウスの６群を確立した。

【表3】

【0197】

すべてのマウスにおいて、腫瘍細胞、Ａ５４９野生型またはＡ５４９ ＲＯＲ１ノックアウトいずれかを、皮下にヒトＰＢＭＣと同時注射した。４週間後、群２～６のマウスに、５０μｌのＶＦＣＭを合計５処置の間４日毎～５日毎、腫瘍周囲に注射する処置が始まる。腫瘍成長および体重を週に２回モニタリングする。腫瘍体積を、およそ９週間の研究の終了時にノギスを使用して測定し、腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を以下のとおりに算出する：［１－（処置群の相対腫瘍体積）／（対照群の相対腫瘍体積）］×１００。
（実施例２０）
ＮＳＧ－Ｂ２ｍ ＫＯ偽性ヒト化マウスモデルにおけるＳｅｐＧＩ－２０１ ＶＦＣＭの抗腫瘍活性のｉｎ ｖｉｖｏ研究。

【0198】

αＲＯＲ１－αＣＤ３二重特異性抗体を発現するように操作されたＳｅｐＧＩ－２０１ ＨＳＶを用いる、腫瘍保有ＮＳＧ－Ｂ２ｍノックアウト偽性ヒト化マウスの処置の効果を評価する研究を設計した。対照として、一部のマウス群をαＲＳＶ－αＣＤ３二重特異性抗体を発現するように操作されたＳｅｐＧＩ－２０７ ＨＳＶを用いて処置する。表４に示される処置レジメンを用いる８匹のマウスの６群を確立した。

【表4】

【0199】

すべてのマウスにおいて、腫瘍細胞、Ａ５４９野生型またはＡ５４９ ＲＯＲ１ノックアウトのいずれかを、皮下にヒトＰＢＭＣと同時注射した。４週間後、群２～５のマウスに、５０μｌの腫瘍溶解性ウイルスを合計３処置の間４日毎～５日毎、腫瘍周囲に注射する処置が始まる。腫瘍成長および体重を週に２回モニタリングする。腫瘍体積を、およそ９週間の研究の終了時にノギスを使用して測定し、腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を以下のとおりに算出する：［１－（処置群の相対腫瘍体積）／（対照群の相対腫瘍体積）］×１００。

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

【化6】

【化7】

【化8】

【化9】

【化10】

【化11】

【化12】

【化13】

【化14】

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B-1】

【図7B-2】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17A-B】

【図17C-D】

【図17E-F】

【図17G-H】

【図18A】

【図18B】

【図19A-B】

【図19C-D】

【図20】

【図21】

【配列表】

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【国際調査報告】