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特表2024-513262ＮＫＰ４６及びＣＤ３８を標的とする二重特異性抗体、並びにその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-22
(54)【発明の名称】ＮＫＰ４６及びＣＤ３８を標的とする二重特異性抗体、並びにその使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20240314BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240314BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240314BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46
C07K16/28 ZNA
C12N15/62
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024504910
(86)(22)【出願日】2022-04-05
(85)【翻訳文提出日】2023-11-22
(86)【国際出願番号】 US2022023501
(87)【国際公開番号】W WO2022216723
(87)【国際公開日】2022-10-13
(31)【優先権主張番号】63/170,917
(32)【優先日】2021-04-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523378918
【氏名又は名称】サイトヴィア セラピューティクス， エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ケイドーシェ， ジャン
(72)【発明者】
【氏名】リー， ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ティパー， ダニエル
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA23
4H045GA26
(57)【要約】
本開示は、ＮＫｐ４６及びＣＤ３８に特異的に結合する二重特異性抗体分子を提供する。本開示は、二重特異性抗体分子を含む併用療法に更に関する。二重特異性抗体分子は、ＮＫｐ４６及び／又はＣＤ３８を発現する細胞と関連するがん又は感染性状態若しくは障害を治療、予防、及び／又は診断するために使用され得る。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＮＫｐ４６及びＣＤ３８に特異的に結合する二重特異性抗体であって、ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）を含む第１の重鎖と、
配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、及び
配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）を含む第１の重鎖と、
ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）を含む第１の軽鎖と、
配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、及び
配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含む第１の軽鎖と、
ｉｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２を含む第２の軽鎖と、を含み、
配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む第２の軽鎖と、を含み、
ｉｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、
配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２を含む第２の軽鎖と、を含み、
配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む第２の軽鎖と、を含み、
ｉ）及びｉｉ）を含みＮＫｐ４６に特異的に結合する第１の抗原結合領域と、ｉｉｉ）及びｉｖ）を含みＣＤ３８に特異的に結合する第２の抗原結合領域と、を含む、二重特異性抗体。
【請求項2】
前記第１の重鎖が、配列番号２３、２５、２７、又は２９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号２４、２６、２８、又は３０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含み、
前記第２の重鎖が、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域を含み、
前記第２の軽鎖が、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項3】
前記第１の抗原結合領域が、ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含む第１の重鎖、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含む第１の軽鎖、
ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含む第１の重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含む第１の軽鎖、
ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含む第１の重鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含む第１の軽鎖、又は
ｄ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含む第１の重鎖、及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含む第１の軽鎖を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項4】
前記第２の抗原結合領域が、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域を含む第２の重鎖、及び配列番号３９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域を含む第２の軽鎖を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項5】
ａ）前記第１の重鎖が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含み、前記第２の重鎖が、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域を含み、前記第２の軽鎖が、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域を含むか、ｂ）前記第１の重鎖が、配列番号２５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号２６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含み、前記第２の重鎖が、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域を含み、前記第２の軽鎖が、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域を含むか、
ｃ）前記第１の重鎖が、配列番号２７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号２８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含み、前記第２の重鎖が、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域を含み、前記第２の軽鎖が、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域を含むか、又は
ｄ）前記第１の重鎖が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号３０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含み、前記第２の重鎖が、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域を含み、前記第２の軽鎖が、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項6】
前記二重特異性抗体が、配列番号４１のアミノ酸配列を含む融合重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と、を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項7】
前記二重特異性抗体が、配列番号４６のアミノ酸配列と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と、を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項8】
前記二重特異性抗体が、異なるＣＨ１及びＣＬドメインを有する少なくとも２つのＦａｂ断片を含み、前記Ｆａｂ断片が、ａ）ｉ．ＮＫｐ４６に特異的に結合する、前記ＶＨ領域及びＶＬ領域と、
ｉｉ．ヒト免疫グロブリンのＣＨ１ドメインであって、前記ＣＨ１ドメインの１９２位でのスレオニン残基が、グルタミン酸残基で置換されている、ＣＨ１ドメインと、
ｉｉｉ．ヒト免疫グロブリンのＣＬ－カッパドメインであって、前記ＣＬドメインの１３７位でのアスパラギン残基が、リジン残基で置換されており、前記ＣＬドメインの１１４位でのセリン残基が、アラニン残基で置換されている、ＣＬ－カッパドメインと、からなる、第１のＦａｂ断片と、
ｂ）免疫グロブリンの野生型ヒトＣＨ１及び野生型ヒトＣＬドメインと、ＣＤ３８に特異的に結合する、ＶＨ領域及びＶＬ領域と、からなる、第２のＦａｂ断片と、を含み、
前記ＣＨ１及びＣＬドメインのために使用される前記配列位置番号が、Ｋａｂａｔ番号付けを指し、Ｆａｂ断片が、任意の順序でタンデムに配置されており、
前記第１のＦａｂ断片の前記ＣＨ１ドメインのＣ末端が、ポリペプチドリンカーを介して、後続のＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端に連結されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項9】
前記ポリペプチドリンカーが、配列番号９又は４４のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の二重特異性抗体。
【請求項10】
ｃ）免疫グロブリンの二量体化ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインと、ｄ）前記抗原結合領域の前記ＣＨ１ドメインの前記Ｃ末端を、前記ＣＨ２ドメインのＮ末端に連結する、ＩｇＡ、ＩｇＧ、又はＩｇＤのヒンジ領域と、を更に含む、請求項８に記載の二重特異性抗体。
【請求項11】
ＩｇＧ１のＦｃドメイン又はＩｇＧ４のＦｃドメインに由来するＦｃドメインを更に含む、請求項８に記載の二重特異性抗体。
【請求項12】
前記Ｆｃドメイン領域が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
【請求項13】
前記Ｆｃドメイン領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
【請求項14】
前記二重特異性抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項15】
ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項をコードする核酸配列。
【請求項17】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の前記抗原結合領域を含む、多重特異性抗体。
【請求項18】
異常なＣＤ３８発現又は活性と関連する病態を治療する、予防する、又はその進行を遅延させることを必要としている対象においてそれを行う方法であって、有効量の、請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項１７に記載の多重特異性抗体を投与することを含む、方法。
【請求項19】
前記病態が、がんである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記がんが、多発性骨髄腫である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記がんが、リンパ腫である、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
前記がんが、白血病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項23】
ＮＫ細胞応答をリダイレクトすることを必要としている対象においてそれを行う方法であって、有効量の、請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項１７に記載の多重特異性抗体を投与することを含む、方法。
【請求項24】
前記ＮＫ細胞応答が、ＮＫ媒介性細胞傷害又は抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による、ＣＤ３８を発現する細胞（ＣＤ３８＋細胞）の特異的溶解を促進する方法であって、前記ＣＤ３８＋細胞を、有効量の請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と接触させることを含み、前記有効量が、前記ＮＫ細胞による前記ＣＤ３８＋細胞の前記特異的溶解を促進するのに十分な量である、方法。
【請求項26】
前記ＣＤ３８＋細胞が、多発性骨髄腫細胞又はリンパ腫細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記接触させるステップが、多発性骨髄腫若しくはリンパ腫を患う又はそのリスクがある対象に、前記二重特異性抗体を投与することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体で治療されている対象における多発性骨髄腫細胞、リンパ腫細胞、又はＣＤ３８＋がん細胞の増殖を阻害する方法であって、有効量のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を投与することを含む、方法。
【請求項29】
前記方法が、有効量のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を投与することを含む、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
多発性骨髄腫、リンパ腫、又はＣＤ３８＋がんの治療のための併用療法又はキットであって、ＮＫ細胞と、請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と、を含む、併用療法又はキット。
【請求項31】
ＮＫ細胞との組み合わせでの使用のための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項32】
多発性骨髄腫、白血病（例えば、急性骨髄性白血病）、リンパ腫、又はＣＤ３８＋がんの治療のための、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
【請求項33】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む、キット。
【請求項34】
前記ＮＫ細胞が、誘導性多能性幹細胞由来ナチュラルキラー（ｉＰＳＣ－ＮＫ）細胞である、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記ＮＫ細胞が、ドナー由来ＮＫ細胞である、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記ＮＫ細胞が、照射された不死化ＮＫ細胞である、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記ＣＤ３８＋がんが、血液悪性腫瘍又は固形腫瘍である、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月５日に出願された米国仮出願第６３／１７０，９１７号の優先権及び利益を主張し、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年４月５日に出願された米国仮出願第６３／１７０，９１７号の優先権及び利益を主張し、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
電子的に提出された配列表の言及
２０２２年４月５日に作成された、４４，２１３バイトのサイズである「ＣＹＴＴ－００２＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と称される提出されたテキストの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
２０２２年４月５日に作成された、４４，２１３バイトのサイズである「ＣＹＴＴ－００２＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と称される提出されたテキストの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
がん免疫療法は、例えば、腫瘍細胞上の抗原に特異的な抗体での治療、腫瘍細胞との抗原提示細胞の融合、又は抗腫瘍ＮＫ細胞若しくはＴ細胞の特異的活性化によって、抗腫瘍免疫応答を生成及び増強するために利用される。患者における腫瘍細胞に対して免疫細胞を動員する能力は、これまで不治と考えられたタイプのがん及び転移と闘うための治療モダリティを提供する。
【0004】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ球は、自然及び適応免疫において重要な役割を果たす強力な抗腫瘍エフェクターである。ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６の３つの活性化受容体が、ＮＫ細胞上で見出され、これらは、総括して、自然細胞傷害受容体（ＮＣＲ）として既知である。ＮＫｐ４６は、ＮＫ細胞の特定のための確立されたマーカーである。ＮＫｐ４６は、休止及び活性化ＮＫ細胞の両方上で見出されるＮＫ細胞特異的誘発分子である。ＮＫｐ４６は、腫瘍及びウイルス感染細胞を含む多数の標的に対するＮＫ細胞活性化における重要な媒介物質である。
【0005】
養子細胞療法のための免疫細胞の使用は、依然として困難であり、改善の必要性が満たされていない。養子免疫療法におけるＮＫ細胞又は他のリンパ球の全潜在性を使用するための重要な機会が依然としてある。単独で、免疫学的構築物の一部として、若しくは他の薬剤との組み合わせで、ＮＫ細胞などの免疫系の細胞を強化して腫瘍細胞を攻撃する、より有効でありより特異的でありより安全でありかつ／又はより安定した追加の薬剤を提供する必要性が満たされていない。したがって、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６及び腫瘍細胞上のＣＤ３８を二重標的とすることを可能にする、多発性骨髄腫及びリンパ腫などのがんの治療のための新規の抗体及び治療薬の必要性が存在する。
【発明の概要】
【0006】
本開示は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６及び腫瘍細胞上のＣＤ３８を標的とすることが可能である、多発性骨髄腫（ＭＭ）、リンパ腫、及び白血病（例えば、急性骨髄性白血病）を含むがこれらに限定されないがんの治療のための抗体を提供する。
【0007】
本開示は、ＮＫｐ４６及びＣＤ３８に特異的に結合する二重特異性抗体であって、ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）を含む第１の重鎖と、ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含む第１の軽鎖と、ｉｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む第２の重鎖と、ｉｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む第２の軽鎖と、を含み、ｉ）及びｉｉ）を含みＮＫｐ４６に特異的に結合する第１の抗原結合領域と、ｉｉｉ）及びｉｖ）を含みＣＤ３８に特異的に結合する第２の抗原結合領域と、を含む、二重特異性抗体を提供する。
【0008】
いくつかの実施形態では、第１の重鎖は、配列番号２３、２５、２７、又は２９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含み、第１の軽鎖は、配列番号２４、２６、２８、又は３０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含み、第２の重鎖は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域を含み、第２の軽鎖は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含む第１の重鎖、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含む第１の軽鎖、ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含む第１の重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含む第１の軽鎖、ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含む第１の重鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含む第１の軽鎖、又はｄ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含む第１の重鎖、及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含む第１の軽鎖を含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合領域は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域を含む第２の重鎖、及び配列番号３９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域を含む第２の軽鎖を含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、ａ）第１の重鎖は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含み、第１の軽鎖は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含み、第２の重鎖は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域を含み、第２の軽鎖は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域を含むか、ｂ）第１の重鎖は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含み、第１の軽鎖は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含み、第２の重鎖は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域を含み、第２の軽鎖は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域を含むか、ｃ）第１の重鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含み、第１の軽鎖は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含み、第２の重鎖は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域を含み、第２の軽鎖は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域を含むか、又はｄ）第１の重鎖は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域を含み、第１の軽鎖は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域を含み、第２の重鎖は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域を含み、第２の軽鎖は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域を含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む融合重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と、を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、異なるＣＨ１及びＣＬドメインを有する少なくとも２つのＦａｂ断片を含み、当該Ｆａｂ断片は、ａ）ｉ．ＮＫｐ４６に特異的に結合する、ＶＨ領域及びＶＬ領域と、ｉｉ．ヒト免疫グロブリンのＣＨ１ドメインであって、当該ＣＨ１ドメインの１９２位でのスレオニン残基が、グルタミン酸残基で置換されている、ＣＨ１ドメインと、ｉｉｉ．ヒト免疫グロブリンのＣＬ－カッパドメインであって、当該ＣＬドメインの１３７位でのアスパラギン残基が、リジン残基で置換されており、当該ＣＬドメインの１１４位でのセリン残基が、アラニン残基で置換されている、ＣＬ－カッパドメインと、からなる、第１のＦａｂ断片と、ｂ）免疫グロブリンの野生型ヒトＣＨ１及び野生型ヒトＣＬドメインと、ＣＤ３８に特異的に結合する、ＶＨ領域及びＶＬ領域と、からなる、第２のＦａｂ断片と、を含み、ＣＨ１及びＣＬドメインのために使用される配列位置番号は、Ｋａｂａｔ番号付けを指し、Ｆａｂ断片は、任意の順序でタンデムに配置されており、第１のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、ポリペプチドリンカーを介して、後続のＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端に連結されている。
【0014】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、配列番号９又は４４のアミノ酸配列を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ｃ）免疫グロブリンの二量体化ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインと、ｄ）抗原結合領域のＣＨ１ドメインのＣ末端を、ＣＨ２ドメインのＮ末端に連結する、ＩｇＡ、ＩｇＧ、又はＩｇＤのヒンジ領域と、を更に含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１のＦｃドメイン又はＩｇＧ４のＦｃドメインに由来するＦｃドメインを更に含む更に含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン領域は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体である。
【0017】
本開示はまた、本開示の二重特異性抗体のうちのいずれか１つをコードする核酸配列を提供する。
【0018】
本開示はまた、本開示の二重特異性抗体の抗原結合領域を含む多重特異性抗体を提供する。
【0019】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、サイトカインに融合又はコンジュゲートしている。
【0020】
本開示は、異常なＣＤ３８発現又は活性と関連する病態を治療する、予防する、又はその進行を遅延させることを必要としている対象においてそれを行う方法であって、有効量の、本開示の二重特異性抗体又は多重特異性抗体を投与することを含む、方法を更に提供する。
【0021】
いくつかの実施形態では、病態は、がんである。いくつかの実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、がんは、リンパ腫である。いくつかの実施形態では、がんは、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病）である。
【0022】
本開示は、ＮＫ細胞応答をリダイレクトすることを必要としている対象においてそれを行う方法であって、有効量の、本開示の二重特異性抗体又は多重特異性抗体を投与することを含む、方法を更に提供する。
【0023】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞応答は、ＮＫ媒介性細胞傷害又は抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。
【0024】
本開示は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による、ＣＤ３８＋細胞）を発現する細胞の特異的溶解を促進する方法であって、ＣＤ３８＋細胞を、有効量の、本開示の二重特異性抗体又は多重特異性抗体と接触させることを含み、有効量が、ＮＫ細胞によるＣＤ３８＋細胞の特異的溶解を促進するのに十分な量である、方法を更に提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８＋細胞は、多発性骨髄腫細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８＋細胞は、リンパ腫細胞である。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、多発性骨髄腫若しくはリンパ腫を患う又はそのリスクがある対象に、二重特異性抗体を投与することを含む。
【0025】
本開示は、請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体で治療されている対象における多発性骨髄腫若しくはリンパ腫細胞又はＣＤ３８＋がん細胞の増殖を阻害する方法であって、有効量のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を投与することを含む、方法を更に提供する。いくつかの実施形態では、方法は、有効量のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を投与することを含む。
【0026】
本開示は、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病（例えば、急性骨髄性白血病）、又はＣＤ３８＋がんの治療のための併用療法又はキットであって、ＮＫ細胞と、本開示の二重特異性抗体と、を含む、併用療法又はキットを更に提供する。
【0027】
本開示は、ＮＫ細胞との組み合わせでの、二重特異性抗体の使用を更に提供する。
【0028】
本開示はまた、多発性骨髄腫、リンパ腫、又はＣＤ３８＋がんの治療のための、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び二重特異性抗体の使用を提供する。
【0029】
本開示はまた、本開示の二重特異性抗体を含む、キットを提供する。
【0030】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、誘導性多能性幹細胞由来ナチュラルキラー（ｉＰＳＣ－ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８＋がんは、多発性骨髄腫又はリンパ腫である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ドナー由来ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、照射された不死化ＮＫ細胞である。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1A】マウス抗ＮＫｐ４６モノクローナル抗体での、ヒトＮＫｐ４６を発現する細胞の染色を示す一連のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図１Ａは、ＢＷ親細胞対ＮＫｐ４６を発現するＢＷトランスフェクト細胞の、抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ（９Ｅ２、４６１－Ｇ１、０２、０９、１２）を使用するＦＡＣ染色を示す。塗りつぶし灰色ヒストグラムは、ＢＷ親細胞のみの、二次抗体での染色を表す。ＢＷ ＮＫｐ４６トランスフェクタントのバックグラウンドは、同様であった。これは、図示されない。これらのヒストグラムは、実行された６つの実験のうちの１つの代表的な実験に対応する。図１Ｂは、一次活性化バルクヒトＮＫ細胞の、抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ（９Ｅ２、４６１－Ｇ１、０２、０９、１２）を使用するＦＡＣ染色を示す。塗りつぶし灰色ヒストグラムは、二次抗体のみでのＮＫ細胞の染色を表す。これらのヒストグラムは、実行された６つの実験のうちの１つの代表的な実験に対応する。
【図1B】同上。
【図2】３つの細胞型上のＮＫｐ４６の検出を示す一連のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＮＫｐ４６－Ｉｇは、単独で、又は抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ（９Ｅ２、４６１－Ｇ１、０２、０９、１２）とともに、４℃でプレインキュベートされ、続いて、ＢＪＡＢ、ＭＣＦ７、及びＣ１Ｒ細胞は、予め処理されたＮＫｐ４６－ＩｇでＦＡＣ染色された。塗りつぶし灰色ヒストグラムは、二次抗体のみでの細胞の染色を表す。これらのヒストグラムは、実行された２つの実験のうちの１つの代表的な実験に対応する。
【図3】抗ＮＫｐ４６抗体の結合後のＮＫｐ４６の表面発現の下方調節を示す一連のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。活性化バルクＮＫ細胞培養物は、示される抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ（９Ｅ２、４６１－Ｇ１、０２、０９、１２）とともに、４℃でインキュベートされた。３７℃で処置された細胞のバックグラウンドは、同様であった。これは、図示されない。これらのヒストグラムは、実行された５つの実験のうちの１つの代表的な実験に対応する。
【図4】２つの一次活性化一次ＮＫ細胞上への、これらの抗体での用量反応ＦＡＣＳ染色を示す。２つのドナーであるＮＫ１及びＮＫ２からの一次活性化バルクヒトＮＫ細胞の、抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ（９Ｅ２、４６１－Ｇ１、０２、０９、１２）を使用するＦＡＣ染色。塗りつぶし灰色ヒストグラムは、二次抗体のみでのＮＫ細胞の染色を表す。
【図5】ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって決定された、マウス抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ ０９の結合親和性を示す。
【図6】ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって決定された、マウス抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ １２の結合親和性を示す。
【図7A】マウス抗ＮＫｐ４６抗体の可変領域のアミノ酸配列アラインメントを、ヒト化抗ＮＫｐ４６抗体と比較して示す。図７Ａは、重鎖可変領域のアミノ酸配列アラインメントを示す。図７Ｂは、カッパ軽鎖可変領域のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図7B】同上。
【図8】完全長ヒトＮＫｐ４６、ＮＫｐ４６ドメインＩ（Ｄ１）、及びＮＫｐ４６ドメインＩＩ（Ｄ２）を示す。
【図9】抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ抗体を使用する、ＢＷ細胞、ＢＷ ＮＫｐ４６細胞、及びＮＫ Ｆｉｊｉ細胞上のＮＫｐ４６の検出を示す一連のヒストグラムを示す。市販の抗ＮＫｐ４６抗体（黒線）が試験された（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄｓ（カタログ番号３３１７０２））。
【図10-1】ヒト化ＮＫｐ４６ハイブリドーマ抗体を使用する、ＢＷ細胞、ＢＷ ＮＫｐ４６細胞、及びＮＫ Ｆｉｊｉ細胞上のＮＫｐ４６の検出を示す一連のヒストグラムを示す。
【図10-2】同上。
【図10-3】同上。
【図10-4】同上。
【図11】抗ＮＫｐ４６抗体及びヒト化ＮＫｐ４６ハイブリドーマ抗体とともにインキュベートされた細胞の活性化及びヒトＮＫ細胞死滅の百分率を示すグラフを示す。ＰＡＲ－Ｒは、対照抗体である。ＧＰＣ３は、抗ＧＰＣ３対照抗体である。９Ｅ２は、市販の抗ＮＫｐ４６抗体である。
【図12】抗ＮＫｐ４６抗体及びヒト化ＮＫｐ４６ハイブリドーマ抗体とともにインキュベートされた後のＨｅｐＧ２細胞のヒトＮＫ細胞死滅の百分率を示すグラフを示す。
【図13A】本開示の二重特異性抗体分子又はＮＫエンゲージャー二重特異性抗体の概略図を示す。図１３Ａは、二重特異性抗体の構造の概略図を示す。いくつかの事例では、Ｍａｂ１は、抗ＮＫｐ４６ Ｆａｂであり、Ｍａｂ２は、抗ＣＤ３８ Ｆａｂであり、リンカーは、ポリペプチドリンカーであり、ヒンジ１及びヒンジ２は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４ヒンジであり、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４のＦｃ領域である。Ｆａｂ断片は、（円で示される）変異を、ＣＨ１及びＣＬドメインの界面において有し、変異は、重鎖及び軽鎖の不対合形成を防止する。図１３Ｂは、ＮＫ細胞上で発現されたＮＫｐ４６、及び腫瘍細胞の表面上で発現された腫瘍抗原（ＴＡ）、例えば、ＣＤ３８に結合する、二重特異性抗体分子又はＮＫエンゲージャー二重特異性抗体の概略図を示す。両方の表面抗原への二重特異性抗体の結合は、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害を引き起こす。
【図13B】同上。
【図14】多発性骨髄腫細胞株へのＮＫＥ２の用量依存性結合を示す。
【図15A】それぞれ、ＢＷ親細胞及びヒトＮｋｐ４６トランスフェクトＢＷ細胞へのＮＫＥ２の結合を示す。
【図15B】同上。
【図16】ＣＤ３８アラニンスキャニング変異誘発によるＮＫＥ２エピトープマッピング分析の結果を示す。
【図17B】同上。
【図17C】同上。
【図18A】多発性骨髄腫ＭＭ．１Ｓ細胞に対するＰＢ－ＮＫ細胞リダイレクト細胞溶解、脱顆粒、及びサイトカイン産生を示す。図１８Ａは、ＮＫＥ２、ダラツムマブ、又は単一のＣＤ３８及びＮＫｐ４６ ｍＡｂでの、多発性骨髄腫ＭＭ．１Ｓ細胞に対するＰＢ－ＮＫ細胞リダイレクト細胞溶解及び脱顆粒を示す。図１８Ｂは、ＮＫＥ２、ダラツムマブ、並びに単一のＣＤ３８及びＮＫｐ４６ ｍＡｂでの、ＩＦＮ－ｙ及びＴＮＦ－ａ産生ＰＢＮＫ細胞の割合を示す。
【図18B】同上。
【図19A】インビトロでのヒトＰＢＭＣにおける、野生型及び変異型ＮＫＥ２での、免疫サブセット枯渇の欠如、並びに低いレベルのＮＫ細胞フラトリサイド及びサイトカイン放出を示す。図１９Ａは、ＮＫＥ２、ダラツムマブ、又はヒトＩｇＧの存在下でのＰＢＮＫのＮＫ細胞フラトリサイドを示す。図１９Ｂは、ＮＫＥ２、ダラツムマブ、又はｈＩｇＧ１でのヒトＰＢＭＣ免疫細胞サブセット枯渇を示す。図１９Ｃは、ＮＫＥ２、抗ＣＤ３若しくはＣＤ２８ ｍＡｂ（ＴＧＮ１４１２）、又はｈＩｇＧ１とともにインキュベートされた後のヒトＰＢＭＣからのサイトカイン放出を示す。
【図19B】同上。
【図19C-1】同上。
【図19C-2】同上。
【発明を実施するための形態】
【0032】
本開示は、ヒトナチュラルキラー受容体ＮＫｐ４６及びＣＤ３８に結合する、二重特異性抗体及びその抗原結合断片を提供する。具体的には、二重特異性抗体は、ＮＫ細胞の表面上で発現されるＮＫｐ４６に特異的に結合する第１の抗原結合領域と、腫瘍細胞上で発現されるＣＤ３８に特異的に結合する第２の抗原結合領域と、を含む。本開示の文脈において、以下の定義が提供される。
【0033】
定義
別途定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。更に、別途文脈によって要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含む。概して、本明細書に記載される、細胞及び組織培養、分子生物学、並びにタンパク質及びオリゴ又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法及びそれらの技法は、当該技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。標準的な技法が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用される。酵素反応及び精製技法は、製造業者の仕様に従って、又は当該技術分野で一般的に達成されるように、又は本明細書に記載されるように実行される。上記の技法及び手順は、概して、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、かつ本明細書全体にわたって引用及び考察される様々な一般的かつより具体的な参照文献に記載されているように実行される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。本明細書に記載される、分析化学、合成有機化学、並びに医薬品及び製薬化学に関連して利用される命名法、並びにそれらの実験手順及び技法は、当該技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。標準的な技法は、化学合成、化学分析、製薬調製、製剤、及び送達、並びに患者の治療のために使用される。
別途定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。更に、別途文脈によって要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含む。概して、本明細書に記載される、細胞及び組織培養、分子生物学、並びにタンパク質及びオリゴ又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法及びそれらの技法は、当該技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。標準的な技法が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用される。酵素反応及び精製技法は、製造業者の仕様に従って、又は当該技術分野で一般的に達成されるように、又は本明細書に記載されるように実行される。上記の技法及び手順は、概して、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、かつ本明細書全体にわたって引用及び考察される様々な一般的かつより具体的な参照文献に記載されているように実行される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。本明細書に記載される、分析化学、合成有機化学、並びに医薬品及び製薬化学に関連して利用される命名法、並びにそれらの実験手順及び技法は、当該技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。標準的な技法は、化学合成、化学分析、製薬調製、製剤、及び送達、並びに患者の治療のために使用される。
【0034】
本開示により利用される場合、以下の用語は、別途示されない限り、以下の意味を有すると理解される。
【0035】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈により明らかに指定されない限り、複数の言及を含む。例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」という用語は、複数の細胞を含み、複数の細胞は、それらの混合物を含む。
【0036】
本明細書で使用される場合、対象又は対象への薬剤（例えば、抗ＮＫｐ４６及び抗ＣＤ３８二重特異性抗体）の「投与」は、対象に、化合物を導入又は送達して、その意図された機能を実行する任意の経路を含む。好適な投与用製剤、及び薬剤を投与する方法は、当該技術分野で既知である。また、投与経路が決定され得、最も有効な投与経路を決定する方法は、当業者に既知であり、治療のために使用される組成物、治療の目的、治療されている対象の健康状態又は疾患段階、及び標的細胞又は組織で変動する。投与経路の非限定的な例としては、非経口、経腸、及び局所投与経路が挙げられる。
【0037】
投与は、自己投与及び他者による投与を含む。また、記載される医学的状態の治療又は予防の様々な様式は、「実質的な」ものを意味することが意図されており、これは、全治療又は予防のみでなく、それ未満のものも含み、ある程度の生物学的又は医学的に適切な結果が達成されることを理解されたい。
【0038】
本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、例えば、哺乳類及び鳥類を含む分類である生存多細胞脊椎動物生物を指す。「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒト哺乳動物の両方を含む。同様に、「対象」又は「患者」という用語は、ヒト及び獣医学的対象の両方、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマ、及びウシを含む。
【0039】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（それと免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。「特異的に結合する」又は「と免疫反応する」又は「免疫特異的に結合する」とは、抗体が、所望の抗原の１つ以上の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドと反応しないか又ははるかにより低い親和性（ＫＤ＞１０－６Ｍ）で結合することを意味する。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、並びにＦａｂ発現ライブラリを含むが、これらに限定されない。高い親和性を有する抗体、例えば、本明細書に記載される抗体は、約０．０１～２５ｎＭ以下の親和性（ＫＤを有する。
【0040】
塩基性抗体構造単位は、四量体を含むことが既知である。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成されており、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と、１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）と、を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を画定する。概して、ヒトから得られる抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤのクラスのうちのいずれかに関連し、これらは、分子内に存在する重鎖の性質によって互いに異なる。あるクラスはまた、サブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及び他のものを有する。更に、ヒトにおいて、軽鎖は、カッパ鎖又はラムダ鎖であり得る。
【0041】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、固有の軽鎖遺伝子産物及び固有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の１つの分子種のみを含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団の全ての分子において同一である。ＭＡｂは、抗原の特定のエピトープと免疫反応することが可能である抗原結合部位を含有し、抗原結合部位は、それへの固有の結合親和性によって特徴付けられる。
【0042】
「抗原結合領域」又は「抗原結合部位」又は「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する、免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）及び軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成されている。重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多岐にわたるストレッチは、「超可変領域」と称され、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」として既知のより保存された隣接するストレッチの間に介在する。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンにおける超可変領域間にかつそれらに隣接して自然に見出されるアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間において互いに対して配置されており、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と称される。抗体のアミノ酸配列を番号付けし、相補性決定領域を特定するための様々な方法が、当該技術分野で既知である。例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．（１９９１）を参照されたい）、又はＩＭＧＴ番号付けシステム（ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）。ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇにおいてオンラインで入手可能）。ＩＭＧＴ番号付けシステムは、コード配列におけるアミノ酸位置、アレルのアラインメントを決定するための、かつ全ての脊椎動物種からの免疫グロブリン（ＩＧ）及びＴ細胞受容体（ＴＲ）における配列を容易に比較するための信頼できる正確なシステムとして、当該技術分野で通例に使用され、認められている。ＩＭＧＴデータの正確性及び一貫性は、免疫遺伝学及び免疫情報学のための最初のかつ今までに固有のオントロジーであるＩＭＧＴ－ＯＮＴＯＬＯＧＹに基づく（Ｌｅｆｒａｎｃ．Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１４ Ｄｅｃ；４（４），１１０２－１１３９）。ＩＭＧＴツール及びデータベースは、配列の大きいリポジトリから構築されたＩＭＧＴリファレンスディレクトリに対して実行される。ＩＭＧＴシステムにおいて、ＩＧ Ｖ－ＤＯＭＡＩＮ及びＩＧ Ｃ－ＤＯＭＡＩＮは、適切なときに、エクソン区切りを考慮して区切られている。したがって、ＩＭＧＴデータベースへのより多くの配列の使用可能性、ＩＭＧＴエクソン番号付けシステムは、コード配列におけるアミノ酸位置を決定するために、かつアレルのアラインメントのために、当業者によって信頼して使用され得、「使用される」。加えて、ＩＭＧＴ固有番号付けと他の番号付け（すなわち、Ｋａｂａｔ）との間の対応は、ＩＭＧＴ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃチャートにおいて入手可能である（Ｌｅｆｒａｎｃ．Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１４ Ｄｅｃ；４（４），１１０２－１１３９）。
【0043】
「超可変領域」又は「可変領域」という用語は、抗体のアミノ酸残基であって、典型的には、抗原結合に関与する、アミノ酸残基を指す。超可変領域は、概して、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされたときに、ＶＬ内の約残基２４～３４（ＬＩ）、５０～５６（Ｌ２）、及び８９～９７（Ｌ３）の周辺、並びにＶＨ内の約３１～３５（ＨＩ）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）の周辺；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ（１９９１））を含み、かつ／又は「超可変ループ」からの残基（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムに従って番号付けされたときに、ＶＬ内の残基２４～３４（ＬＩ）、５０～５６（Ｌ２）、及び８９～９７（Ｌ３）、並びにＶＨ内の２６～３２（ＨＩ）、５２～５６（Ｈ２）、及び９５～１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））を含み、かつ／又は「超可変ループ」ＶＣＤＲからの残基（例えば、ＩＭＧＴ番号付けシステムに従って番号付けされたときに、ＶＬ内の残基２７～３８（ＬＩ）、５６～６５（Ｌ２）、及び１０５～１２０（Ｌ３）、並びにＶＨ内の２７～３８（ＨＩ）、５６～６５（Ｈ２）、及び１０５～１２０（Ｈ３）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２０９－２１２（１９９９）、Ｒｕｉｚ，Ｍ．ｅ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２１９－２２１（２０００））を含む。任意選択で、抗体は、ＡＨｏ；Ｈｏｎｎｅｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ Ｐｌｕｎｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７－６７０（２００１））に従って番号付けされたときに、ＶＬ内の点２８、３６（ＬＩ）、６３、７４～７５（Ｌ２）、及び１２３（Ｌ３）、並びにＶＨ内の点２８、３６（ＨＩ）、６３、７４～７５（Ｈ２）、及び１２３（Ｈ３）のうちの１つ以上における対称的な挿入を有する。
【0044】
「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、タンパク質分解抗体断片（例えば、当該技術分野で既知である、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片、及びＦａｂ断片）、組換え抗体断片（例えば、（当該技術分野で既知である）ｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異性ｓＦｖ断片、二重特異性ｄｓＦｖ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、ダイアボディ、及びトリアボディ、並びにラクダ類抗体を含む（例えば、米国特許第６，０１５，６９５号、同第６，００５，０７９号、同第５，８７４，５４１号、同第５，８４０，５２６号、同第５，８００，９８８号、及び同第５，７５９，８０８号を参照されたい）。ｓｃＦｖタンパク質は、融合タンパク質であり、融合タンパク質においては、免疫グロブリンの軽鎖可変領域及び免疫グロブリンの重鎖可変領域は、リンカーによって結合されているが、ｄｓＦｖにおいては、鎖は、ジスルフィド結合を導入して鎖の会合を安定化させるように変異している。
【0045】
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、特定の体液性又は細胞性免疫の産物、例えば、抗体分子又はＴ細胞受容体によって特異的に結合され得る、化合物、組成物、又は物質を指す。抗原は、任意のタイプの分子であり得、この分子は、例えば、ハプテン、単純な中間代謝産物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質、及びホルモン、並びに巨大分子、例えば、複合糖質（例えば、多糖）、リン脂質、及びタンパク質を含む。抗原の一般的な分類は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫及び他の寄生虫抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患に関与する抗原、アレルギー及び移植片拒絶、毒素、並びに他の多岐にわたる抗原を含むが、これらに限定されない。
【0046】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、又はＴ細胞受容体に特異的に結合することが可能である任意のタンパク質決定基を含む。「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合することが可能である任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面群化からなり、通常、特定の三次元構造特徴及び特定の電荷特徴を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端ペプチドに対して生じ得る。
【0047】
本明細書で使用される場合、「免疫学的結合」及び「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間に発生するタイプの非共有結合相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）に関して表され得、より小さいＫｄは、より大きい親和性を表す。選択されるポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該技術分野で周知の方法を使用して定量化され得る。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成及び解離の速度を測定することを含み、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方の方向での速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。したがって、「会合速度定数」（Ｋｏｎ）及び「解離速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度、並びに会合及び解離の実際の速度の計算によって決定され得る。（Ｎａｔｕｒｅ ３６１：１８６－８７（１９９３）を参照されたい）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関連しない全てのパラメータの取り消しを可能にし、解離定数Ｋｄに等しい。（概して、Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５９：４３９－４７３を参照されたい）。本発明の抗体は、バイオレイヤー干渉法アッセイ又は当業者に既知の同様のアッセイなどのアッセイによって測定された場合、平衡結合定数（Ｋｄ）が、１μＭ以下、例えば、１００ｎＭ以下、好ましくは、１０ｎＭ以下、より好ましくは、１ｎＭ以下であるときに、その標的に特異的に結合するためのである。
【0048】
本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、１つの分子が、別の分子と（典型的には非共有結合的に）結合する傾向、例えば、特異的結合対のメンバーが、特異的結合対の別のメンバーについて有する傾向を指す。結合親和性は、解離定数として測定され得、解離定数は、特異的結合対（例えば、抗体／抗原対）について、１×１０－５Ｍ未満、１×１０－６Ｍ未満、１×１０－７Ｍ未満、１×１０－８Ｍ未満、１×１０－９Ｍ未満、１×１０－１０Ｍ未満、１×１０－１１Ｍ未満、又は１×１０－１２Ｍ未満であることができる。一態様では、結合親和性は、Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１０１－１０６，１９７９によって記載されているＳｃａｔｃｈａｒｄ方法の修正形態によって計算される。別の態様では、結合親和性は、結合定数によって測定される。別の態様では、結合親和性は、抗原／抗体解離速度によって測定される。更に別の態様では、高い結合親和性は、競合ラジオイムノアッセイによって測定される。
【0049】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、若しくは合成起源のポリヌクレオチド、又はそれらのある組み合わせを意味し、その起源によって、「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が自然において見出されるポリヌクレオチドの全て又は一部分と会合していないか、（２）単離されたポリヌクレオチドが自然において連結されていないポリヌクレオチドに動作可能に連結されているか、又は（３）より大きい配列の一部として自然において発生しない。本発明によるポリヌクレオチドは、本明細書に記載される、重鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、及び軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を含む。
【0050】
本明細書で言及される「単離されたタンパク質」という用語は、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、若しくは合成起源のタンパク質、又はそれらのある組み合わせを意味し、その起源又は由来源によって、「単離されたタンパク質」は、（１）自然において見出されるタンパク質と会合していないか、（２）同じ源からの他のタンパク質、例えば、海洋性タンパク質を含まないか、（３）異なる種からの細胞によって発現されるか、又は（４）自然において発生しない。
【0051】
「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド配列の天然タンパク質、断片、又は類似体を指す一般的な用語として本明細書で使用される。したがって、天然タンパク質断片及び類似体は、ポリペプチド属の種である。本発明によるポリペプチドは、本明細書に記載される、重鎖免疫グロブリン分子及び軽鎖免疫グロブリン分子、並びに重鎖免疫グロブリン分子をカッパ軽鎖免疫グロブリン分子などの軽鎖免疫グロブリン分子とともに含む組み合わせ又はその逆によって形成された抗体分子、並びにそれらの断片及び類似体を含む。
【0052】
本明細書で使用される場合、物体に適用される場合、「自然発生の」という語句は、物体が、自然において見出され得ることを指す。例えば、（ウイルスを含む）生物において存在し、自然における源から単離され得、実験室で人間によって又は別法で意図的に修飾されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、自然発生のものである。
【0053】
本明細書で使用される場合、「動作可能に連結された」という用語は、そのように記載される構成要素の位置が、構成要素がそれらの意図された様式で機能することを可能にする関係にあることを指す。コード配列に「動作可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合する条件下で達成されるかかる方式でライゲーションされている。
【0054】
本明細書で使用される場合、「制御配列」という用語は、ポリヌクレオチド配列であって、それらがライゲーションされているコード配列の発現及びプロセシングを行うために必要である、ポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、原核生物における宿主生物に依存して異なり、そのような制御配列は、概して、真核生物における、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含み、概して、そのような制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、少なくとも、存在が発現及びプロセシングのために必須である全ての構成要素を含むことが意図されており、また、その存在が有利である追加の構成要素、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列を含むことができる。本明細書で言及される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドのポリマーボロン、リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのいずれか、又はいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態を意味する。この用語は、ＤＮＡの一本鎖及び二本鎖形態を含む。
【0055】
本明細書で使用される場合、２０個の従来のアミノ酸及びそれらの略語は、従来の使用に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ－Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたい。また、２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ－アミノ酸）、α－、α－二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非従来のアミノ酸は、本発明のポリペプチドに好適な構成要素であり得る。非従来のアミノ酸の例としては、４ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、ε－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリシン、ε－Ｎ－アセチルリシン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリシン、σ－Ｎ－メチルアルギニン、並びに他の同様のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表記において、標準的な使用及び慣例に従って、左方向は、アミノ末端方向であり、右方向は、カルボキシ末端方向である。
【0056】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、例えば、ＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴのプログラムによってデフォルトギャップ重みを使用して最適にアライメントされたときに、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５パーセントの配列同一性、最も好ましくは、少なくとも９９パーセントの配列同一性を共有することを意味する。
【0057】
好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【0058】
保存的アミノ酸置換とは、同様の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、及びアスパラギン－グルタミンである。
【0059】
本明細書で考察されるように、抗体又は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における小さい変動は、本発明に包含されるとして企図され、ただし、アミノ酸配列における変動は、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、９０％、９５％、最も好ましくは、９９％を維持する。特に、保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換は、側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で起こるものである。遺伝的にコードされたアミノ酸は、概して、以下のファミリー、（１）酸性アミノ酸が、アスパルテート、グルタメートである、ファミリー、（２）塩基性アミノ酸が、リジン、アルギニン、ヒスチジンである、ファミリー、（３）非極性アミノ酸が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンである、ファミリー、及び（４）非荷電極性アミノ酸が、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである、ファミリーに分けられる。親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパルテート、グルタミン、グルタメート、ヒスチジン、リジン、セリン、及びトレオニンを含む。疎水性アミノ酸は、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、及びバリンを含む。アミノ酸の他のファミリーは、（ｉ）脂肪族ヒドロキシファミリーである、セリン及びスレオニン、（ｉｉ）アミド含有ファミリーである、アスパラギン及びグルタミン、（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーである、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、並びに（ｉｖ）芳香族ファミリーである、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンを含む。例えば、ロイシンの、イソロイシン又はバリンでの単離された置換、アスパルテートの、グルタメートでの単離された置換、スレオニンの、セリンでの単離された置換、又はアミノ酸の、構造的に関連するアミノ酸での同様の置換は、特に、置換が、フレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合、得られる分子の結合又は特性への大きい効果を有さないと予想することは合理的である。アミノ酸変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の特異的活性をアッセイすることによって容易に決定され得る。アッセイは、本明細書に詳細に記載される。抗体又は免疫グロブリン分子の断片又は類似体は、当業者によって容易に調製され得る。断片又は類似体の好ましいアミノ及びカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界の近くで発生する。構造的及び機能的ドメインは、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データを公共又は専有の配列データベースと比較することによって特定され得る。好ましくは、コンピュータ化された比較方法は、既知の構造及び／又は機能の他のタンパク質において発生する、配列モチーフ又は予測タンパク質コンフォメーションドメインを特定するために使用される。既知の三次元構造にフォールドするタンパク質配列を特定するための方法は既知である。Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４（１９９１）。したがって、上記の例は、当業者が、本発明による構造的及び機能的ドメインを定義するために使用され得る、配列モチーフ及び構造的コンフォメーションを認識することができることを実証する。
【0060】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解への感受性を低減するもの、（２）酸化への感受性を低減するもの、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を改変するもの、（４）結合親和性を改変するもの、及び（４）そのような類似体の他の物理化学的又は機能的特性を付与又は修正するものである。類似体は、自然発生のペプチド配列以外の配列の様々なムテインを含むことができる。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）は、自然発生の配列において（好ましくは、分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分において）なされ得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させるべきでない（例えば、置換アミノ酸は、親配列において発生するヘリックスを破壊する傾向、又は親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊する傾向があるべきでない）。当該技術分野で認識されているポリペプチド二次及び三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））、及びＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｔ．Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載されている。
【0061】
本明細書で使用される場合、「標識」又は「標識された」という用語は、検出可能なマーカーの組み込み、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組み込み、あるいはマークされたアビジン（例えば、光学又は熱量測定方法によって検出され得る、蛍光マーカー又は酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出され得る、ポリペプチドへのビオチニル部分の結合を指す。ある状況では、標識又はマーカーはまた、治療的なものであることができる。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が、当該技術分野で既知であり、使用され得る。ポリペプチドのための標識の例としては、以下、放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｐ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体についての結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサアームによって結合する。本明細書で使用される場合、「医薬品又は薬物」という用語は、患者に適切に投与されたときに、所望の治療効果を誘導することが可能である化学的化合物又は組成物を指す。
【0062】
本明細書での他の化学用語は、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））によって例示されているように、当該技術分野での従来の使用に従って使用される。
【0063】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」とは、目的の種が、存在する優勢な種である（すなわち、モル基準で、目的の種が、組成物内の任意の他の個々の種よりも豊富である）ことを意味し、好ましくは、実質的に精製された画分は、目的の種が、存在する全ての巨大分子種の（モル基準で）少なくとも約５０パーセントを含む、組成物である。
【0064】
概して、実質的に純粋な組成物は、組成物内に存在する全ての巨大分子種の約８０％超、より好ましくは、約８５％、９０％、９５％、及び９９％超を含む。最も好ましくは、目的の種は、本質的に均質性（混入種が、従来の検出方法によって、組成物内で検出されることがない）に精製され、組成物は、単一の巨大分子種から本質的になる。
【0065】
互換的にかつ単数形又は複数形のいずれかで使用される「がん」、「新生物」、及び「腫瘍」という用語は、悪性形質転換し、それによって、宿主生物にとって病的になる細胞を指す。本開示の方法により治療され得るがんの非限定的な例としては、血液悪性腫瘍及び固形腫瘍が挙げられる。がんの非限定的な例としては、多発性骨髄腫。リンパ腫、及び白血病（例えば、ＡＭＬ）が挙げられる。
【0066】
本明細書で使用される場合、対象における疾患を「治療すること」又はその「治療」とは、（１）症状又は疾患が、疾患の素因がある又はその症状を依然として示さない対象において発生することを予防すること、（２）疾患を阻害するか、又はその発症を阻止すること、あるいは（３）疾患若しくは疾患の症状を寛解させるか、又はその退行を引き起こすことを指す。当該技術分野で理解されるように、「治療」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るための手法である。本開示の目的で、有益な又は所望の結果は、検出可能又は検出不能であるかにかかわらず、１つ以上の症状の軽減又は寛解、（疾患を含む）状態の程度の減弱、（疾患を含む）状態の安定化された（すなわち、悪化していない）状況、（疾患を含む）状態の遅延又は減速、進行、（疾患を含む）状態の寛解又は緩和、状況、及び（部分的又は完全であるかにかかわらず）緩解、１つ以上を含むことができるが、これらに限定されない。強力であり、非常に低い用量で局所投与され得、したがって、全身性有害作用を最小にする化合物が好ましい。
【0067】
抗ＮＫｐ４６及び抗ＣＤ３８二重特異性抗体
本開示の二重特異性抗体は、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄなどの他のＮＫ細胞マーカーではなく、ＮＫｐ４６を標的にしてＮＫ細胞に関与するため、当該技術分野のものよりも有利である。重要なことに、ＮＫｐ４６発現は、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄが下方調節された固形腫瘍において頻繁に維持される。したがって、本開示の二重特異性抗体は、他のより低い発現マーカーを標的とする、当該技術分野で既知の他の二重特異性抗体療法よりも有効であり得る。更に、ＮＫｐ４６は、ＮＫ細胞により特異的である。対照的に、ＮＫＧ２Ｄは、Ｔ細胞によって広く発現され、二重特異性抗体を使用して標的とされたときに、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）などの毒性をもたらす。したがって、本開示の二重特異性抗体は、他のＮＫ細胞マーカーを標的とする、当該技術分野で既知の他の二重特異性抗体よりも良好な安全性プロファイルを有する。
本開示の二重特異性抗体は、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄなどの他のＮＫ細胞マーカーではなく、ＮＫｐ４６を標的にしてＮＫ細胞に関与するため、当該技術分野のものよりも有利である。重要なことに、ＮＫｐ４６発現は、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄが下方調節された固形腫瘍において頻繁に維持される。したがって、本開示の二重特異性抗体は、他のより低い発現マーカーを標的とする、当該技術分野で既知の他の二重特異性抗体療法よりも有効であり得る。更に、ＮＫｐ４６は、ＮＫ細胞により特異的である。対照的に、ＮＫＧ２Ｄは、Ｔ細胞によって広く発現され、二重特異性抗体を使用して標的とされたときに、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）などの毒性をもたらす。したがって、本開示の二重特異性抗体は、他のＮＫ細胞マーカーを標的とする、当該技術分野で既知の他の二重特異性抗体よりも良好な安全性プロファイルを有する。
【0068】
本開示の二重特異性抗体は、ＮＫｐ４６膜近位ドメイン（Ｄ２ドメイン）に特異的に結合し、これは、ＮＫｐ４６とそのリガンドとの相互作用を遮断しないため、有利である。二重特異性抗体は、ＮＫｐ４６受容体のインターナリゼーション又は分解をもたらさず、したがって、様々な療法において、ＮＫ細胞を動員するために使用され得る。
【0069】
したがって、二重特異性抗体は、がん免疫療法において有用であり、また、がん診断のために使用され得る。
【0070】
ヒトナチュラルキラー受容体ＮＫｐ４６
本明細書で使用される場合、「ＮＫｐ４６」という用語は、自然細胞傷害誘発受容体１（ＮＣＲ１）又はＣＤ３３５としても既知のナチュラルキラータンパク質４６を指す。ＮＫｐ４６は、休止及び活性化ＮＫ細胞の両方上で見出されるＮＫ細胞特異的誘発分子である（Ｓｉｖｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＮＫｐ４６は、腫瘍及びウイルス感染細胞を含む多数の標的に対するＮＫ細胞活性化における重要なメディエータである（Ｍｏｒｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＮＫｐ４６は、マウスオルソログを有する、ＮＫ細胞上の唯一の受容体であり、この受容体は、ＮＣＲ１と称される（Ｂｉａｓｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＮＫｐ４６は、ＮＫ細胞の特定のための確立されたマーカーである（Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
本明細書で使用される場合、「ＮＫｐ４６」という用語は、自然細胞傷害誘発受容体１（ＮＣＲ１）又はＣＤ３３５としても既知のナチュラルキラータンパク質４６を指す。ＮＫｐ４６は、休止及び活性化ＮＫ細胞の両方上で見出されるＮＫ細胞特異的誘発分子である（Ｓｉｖｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＮＫｐ４６は、腫瘍及びウイルス感染細胞を含む多数の標的に対するＮＫ細胞活性化における重要なメディエータである（Ｍｏｒｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＮＫｐ４６は、マウスオルソログを有する、ＮＫ細胞上の唯一の受容体であり、この受容体は、ＮＣＲ１と称される（Ｂｉａｓｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＮＫｐ４６は、ＮＫ細胞の特定のための確立されたマーカーである（Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
【0071】
ＮＫｐ４６は、２つのＩｇ様細胞外ドメイン（Ｄ１及びＤ２）、続いて、約４０個の残基の茎領域、Ｉ型膜貫通ドメイン、及び短い細胞質尾部を有する。ＮＫｐ４６は、ＨＣＶ及び他のウイルス感染細胞の排除に関与する主要なＮＫ細胞活性化受容体であり、Ｔ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）を含む他の免疫細胞とのＮＫ細胞の相互作用を調節することが示されている。本発明による例示的なＮＫｐ４６は、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＧｅｎＢａｎｋ記号又は受託番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ７６０３６（ＮＣＴＲ１＿ＨＵＭＡＮ）及び遺伝子ＩＤ：９４３７に記載されている。ＮＫｐ４６は、２つのＩｇ様細胞外ドメイン（Ｄ１及びＤ２）、続いて、約４０個の残基の茎領域、Ｉ型膜貫通ドメイン、及び短い細胞質尾部を有する。（アイソフォームａの完全長タンパク質の残基１２１～２５４に対応する）１３４個のアミノ酸残基を含むＤ２ドメイン（又はＮＫｐ４６Ｄ２）。
【0072】
本発明による二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、ＮＫｐ４６におけるエピトープに結合する。具体的には、抗体は、ＮＫｐ４６タンパク質のＤ２ドメイン内のエピトープに結合する。
【0073】
ＣＤ３８
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３８」及び「ＣＤ３８抗原」という用語は、互換的に使用され、細胞によって自然に発現されるか、又はＣＤ３８遺伝子でトランスフェクトされた細胞上で発現される、ヒトＣＤ３８の任意のバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を含む。当該技術分野で認識されている、ＣＤ３８の同義語は、ＡＤＰリボシルシクラーゼ１、ｃＡＤＰｒヒドロラーゼ１、Ｃｄ３８－ｒｓ１、サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼ１、Ｉ－１９、ＮＩＭ－Ｒ５抗原を含む。例示的なヒトＣＤ３８の完全なアミノ酸配列 Ｇｅｎｂａｎｋ／ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１７６６．２（ＵｎｉＰｒｏｔＩＤ番号Ｐ２８９０７）。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３８」及び「ＣＤ３８抗原」という用語は、互換的に使用され、細胞によって自然に発現されるか、又はＣＤ３８遺伝子でトランスフェクトされた細胞上で発現される、ヒトＣＤ３８の任意のバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を含む。当該技術分野で認識されている、ＣＤ３８の同義語は、ＡＤＰリボシルシクラーゼ１、ｃＡＤＰｒヒドロラーゼ１、Ｃｄ３８－ｒｓ１、サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼ１、Ｉ－１９、ＮＩＭ－Ｒ５抗原を含む。例示的なヒトＣＤ３８の完全なアミノ酸配列 Ｇｅｎｂａｎｋ／ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１７６６．２（ＵｎｉＰｒｏｔＩＤ番号Ｐ２８９０７）。
【0074】
ＣＤ３８は、受容体媒介性接着及びシグナル伝達、並びにその外酵素活性を介するカルシウム動員の媒介、サイクリックＡＤＰリボース（ｃＡＤＰＲ）及びＡＤＰＲの形成の触媒における機能を有する多機能タンパク質である。ＣＤ３８は、サイトカイン分泌、並びにリンパ球の活性化及び増殖を媒介する（Ｆｕｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ １４５：２３９０－６，１９９０、Ｔｅｒｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７７１－８０，１９８１、Ｇｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９８：７０－３，１９９９）。ＣＤ３８はまた、そのＮＡＤグリコヒドロラーゼ活性を介して、調節性Ｔ細胞区画の調節に関与している細胞外ＮＡＤ＋レベルを調節する（Ａｄｒｉｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，１４：１２８４－９２，２０１２、Ｃｈｉａｒｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １２：７４１－５２，２０１２）。Ｃａ２＋を介するシグナル伝達に加えて、ＣＤ３８シグナル伝達は、Ｔ及びＢ細胞上の抗原受容体複合体又は他のタイプの受容体複合体、例えば、ＭＨＣ分子とのクロストークを介して発生し、ＣＤ３８は、いくつかの細胞応答に関与するのみでなく、ＩｇＧ１のスイッチング及び分泌にも関与する。
【0075】
ＣＤ３８は、造血細胞、例えば、髄様胸腺細胞、活性化Ｔ及びＢ細胞、休止ＮＫ細胞及び単球、リンパ節胚中心リンパ芽球、形質Ｂ細胞、濾胞内細胞、並びに樹状細胞上で発現されるＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。正常な骨髄細胞の一部分、特定の前駆細胞及び臍帯細胞は、ＣＤ３８陽性である。リンパ球系前駆細胞に加えて、ＣＤ３８は、赤血球及び血小板上で発現され、発現はまた、いくつかの固形組織、例えば、腸、脳、前立腺、骨、及び膵臓において見出される。成熟した休止Ｔ及びＢ細胞は発現する 表面ＣＤ３８なしに制限される。
【0076】
ＣＤ３８はまた、様々な悪性血液疾患において発現し、悪性血液疾患は、多発性骨髄腫、白血病、及びリンパ腫、例えば、Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病、Ｔ及びＢ細胞急性リンパ球性白血病、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、原発性全身性アミロイドーシス、マントル細胞リンパ腫、前リンパ球性／骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、大顆粒リンパ球性（ＬＧＬ）白血病、ＡＭＬ、ＮＫ細胞性白血病、並びに形質細胞性白血病を含む。ＣＤ３８の発現は、前立腺における腺上皮、膵臓における島細胞、耳下腺を含む腺における管上皮、気管支上皮細胞、睾丸及び卵巣における細胞、並びに結腸直腸腺がんにおける腫瘍上皮を含む異なる起源の上皮／内皮細胞上の発現が記載されている。ＣＤ３８発現が関与し得る他の疾患は、例えば、肺の気管支上皮がん、（乳房の管及び小葉における上皮内層の悪性増殖から発生する）乳がん、β細胞（インスリノーマ）から発生する膵臓腫瘍、腸における上皮から発生する腫瘍（例えば、腺がん及び扁平上皮がん）、前立腺におけるがん腫、並びに精巣におけるセミノーマ及び卵巣がんを含む。中枢神経系において、神経芽細胞腫は、ＣＤ３８を発現する。
【0077】
二重特異性抗体
本開示の二重特異性抗体は、ＮＫｐ４６に特異的である１つの抗原結合領域と、ＣＤ３８に特異的である第２の抗原結合領域と、を有する。
本開示の二重特異性抗体は、ＮＫｐ４６に特異的である１つの抗原結合領域と、ＣＤ３８に特異的である第２の抗原結合領域と、を有する。
【0078】
以下の抗体配列は、例として本明細書で提供されるが、これらの配列は、当該技術分野で認識されている様々な技法のうちのいずれかを使用して二重特異性抗体を生成するために使用され得ることを理解されたい。二重特異性フォーマットの例としては、Ｆａｂアーム交換に基づく二重特異性ＩｇＧ（Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３ ＭＡｂｓ．５（６））；ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマット（Ｋｌｅｉｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２０１２ ＭＡｂｓ ４（６））；強制ヘテロ二量体化手法に基づく複数のフォーマット、例えば、ＳＥＥＤ技術（Ｄａｖｉｓ ＪＨ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２３（４）：１９５－２０２）、静電ステアリング（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１０ ２８５（２５）：１９６３７－４６．）、若しくはノブインホール（Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９６ ９（７）：６１７－２１．）、又はホモ二量体形成を防止する変異の他のセット（Ｖｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ ＴＳ ｅｔ ａｌ．，２０１３ ＭＡｂｓ．５（５）：６４６－５４．）；断片ベースの二重特異性フォーマット、例えば、タンデムｓｃＦｖ（例えば、ＢｉＴＥ）（Ｗｏｌｆ Ｅ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １０（１８）：１２３７－４４．）；二重特異性四価抗体（Ｐｏｒｔｎｅｒ ＬＭ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６１（１０）：１８６９－７５．）；二重親和性リターゲティング分子（Ｍｏｏｒｅ ＰＡ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｂｌｏｏｄ．１１７（１７）：４５４２－５１）、ダイアボディ（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７ １５（７）：６２９－３１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0079】
二重特異性又は多重特異性エンゲージャーは、異なる抗体の２つ以上の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる融合タンパク質であり、少なくとも一方のｓｃＦｖは、エフェクター細胞表面分子に結合し、少なくとも他方のｓｃＦｖは、腫瘍特異的表面分子を介して腫瘍細胞に結合する。
【0080】
二重又は多重特異性エンゲージャー認識又はカップリングのために使用され得る例示的なＮＫ細胞表面分子としては、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。
【0081】
二重特異性又は多重特異性エンゲージャー認識のための例示的な腫瘍細胞表面分子としては、ＧＰＣ３、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、ＲＯＲ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【0082】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、エフェクター細胞と腫瘍細胞抗原結合ドメインとの間のリンカーを更に含み、例えば、エフェクター細胞増殖を容易にするために、修飾されたＩＬ１５を、エフェクターＮＫ細胞のためのリンカーとして更に含む（いくつかの刊行物では、これは、ＴｒｉＫＥ又は三重特異性キラーエンゲージャーと称される）。一実施形態では、ＴｒｉＫＥは、ＮＫｐ４６－ＩＬ１５－ＣＤ３８である。
【0083】
いくつかの実施形態では、二重又は多重特異性エンゲージャーのための表面誘発受容体は、しばしば、細胞型に依存して、エフェクター細胞に内因性であり得る。いくつかの他の実施形態では、１つ以上の外因性表面誘発受容体は、本明細書で提供される方法及び組成物を使用して、すなわち、ｉＰＳＣの更なる操作を介して、エフェクター細胞に導入され得、次いで、ｉＰＳＣが、源のｉＰＳＣと同じ遺伝子型及び表面誘発受容体を含むＴ、ＮＫ、又は任意の他のエフェクター細胞に分化することを指示する。
【0084】
いくつかの実施形態では、二重特異性フォーマットは、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１３／００５１９４号、並びに米国特許第９，６３１，０３１号及び同第１０，８１５，３１０号に記載されている二重特異性抗体フォーマットを含むが、これらに限定されず、これらの文献の各々は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。ＣＨ１及びＣＬドメインのために本明細書で使用される配列位置番号は、Ｋａｂａｔ番号付けを指す（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ－ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎ°９１－３２４２，ｐｐ ６６２，６８０，６８９，１９９１）本発明の二重特異性抗体は、変異したＦａｂ断片であり、変異したＦａｂ断片は、ａ）目的の抗体のＶＨ及びＶＬドメインと、免疫グロブリンのＣＨ１ドメインに由来するＣＨ１ドメインであって、当該ＣＨ１ドメインの１９２位でのトレオニン残基が、グルタミン酸残基で置換されていることによる、ＣＨ１ドメインと、免疫グロブリンのＣＬドメインに由来するＣＬドメインであって、当該ＣＬドメインの１３７位でのアスパラギン残基が、リジン残基で置換されており、当該ＣＬドメインの１１４位でのセリン残基が、アラニン残基で置換されていることによる、ＣＬドメインと、からなる、Ｆａｂ断片、ｂ）目的の抗体のＶＨ及びＶＬドメインと、免疫グロブリンのＣＨ１ドメインに由来するＣＨ１ドメインであって、当該ＣＨ１ドメインの１４３位でのロイシン残基が、グルタミン残基で置換されており、当該ＣＨ１ドメインの１８８位でのセリン残基が、バリン残基で置換されていることによる、ＣＨ１ドメインと、免疫グロブリンのＣＬドメインに由来するＣＬドメインであって、当該ＣＬドメインの１３３位でのバリン残基が、トレオニン残基で置換されており、当該ＣＬドメインの１７６位でのセリン残基が、バリン残基で置換されていることによる、ＣＬドメインと、からなる、Ｆａｂ断片、ｃ）目的の抗体のＶＨ及びＶＬドメインと、ＩｇＧ免疫グロブリンのＣＨ１ドメインに由来するＣＨ１ドメインであって、当該ＣＨ１ドメインの１２４位でのロイシン残基が、アラニン残基で置換されており、当該ＣＨ１ドメインの１４３位でのロイシン残基が、グルタミン酸残基で置換されていることによる、ＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ免疫グロブリンのＣＬドメインに由来するＣＬドメインであって、当該ＣＬドメインの１３３位でのバリン残基が、トリプトファン残基で置換されていることによる、ＣＬドメインと、からなる、Ｆａｂ断片、ｄ）目的の抗体のＶＨ及びＶＬドメインと、免疫グロブリンのＣＨ１ドメインに由来するＣＨ１ドメインであって、当該ＣＨ１ドメインの１９０位でのバリン残基が、アラニン残基で置換されていることによる、ＣＨ１ドメインと、免疫グロブリンのＣＬドメインに由来するＣＬドメインであって、当該ＣＬドメインの１３５位でのロイシン残基が、トリプトファン残基で置換されており、当該ＣＬドメインの１３７位でのアスパラギン残基が、アラニン残基で置換されていることによる、ＣＬドメインと、からなる、Ｆａｂ断片のうちから選択される。
【0085】
好ましい実施形態によれば、ＣＨ１ドメインは、ＩｇＧ免疫グロブリンに由来する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ免疫グロブリンは、ＩｇＧ１アイソタイプ又はＩｇＧ４アイソタイプからのものである。いくつかの実施形態では、ＣＬドメインは、カッパタイプである。ヒト療法における使用のために、変異したＣＨ１及びＣＬドメインが由来する免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。
【0086】
任意の順序でタンデムに配置されているＦａｂ断片、ポリペプチドリンカーを介して、後続のＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端に連結された、第１のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端。概して、当該ポリペプチドリンカーは、少なくとも２０、好ましくは、少なくとも２５、更により好ましくは、少なくとも３０、最大８０、好ましくは、最大６０、更により好ましくは、最大４０アミノ酸長を有するべきである。
【0087】
ポリペプチドリンカーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＤのうちから選択される１つ以上の免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全て又は一部を含む。抗体が、ヒト療法において使用される場合、ヒト起源のヒンジ配列が好ましい。
【0088】
ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＤのヒンジ領域の配列は、以下に示される。
【0089】
ＩｇＡ１（配列番号１）：ＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ
【0090】
ＩｇＡ２（配列番号２）：ＶＰＰＰＰＰ
【0091】
ＩｇＤ（配列番号３）：
ＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＧＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰ
ＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＧＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰ
【0092】
ＩｇＧ１（配列番号４）：ＥＰＫＳＣＤＫＴＫＴＣＰＰＣＰ
【0093】
ＩｇＧ２（配列番号５）：ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ
【0094】
ＩｇＧ３：（配列番号６）ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ
【0095】
続いて、以下の０又は１～４つのリピート
【0096】
（配列番号７）ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ．
【0097】
ＩｇＧ４：（配列番号８）ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ
【0098】
当該ポリペプチドリンカーは、１つの免疫グロブリンのみのヒンジ領域の配列の全て又は一部を含み得る。この場合では、当該免疫グロブリンは、隣接するＣＨ１ドメインが由来する免疫グロブリンと同じアイソタイプ及びサブクラスに属してもよく、又は異なるアイソタイプ若しくはサブクラスに属してもよい。
【0099】
代替として、当該ポリペプチドリンカーは、異なるアイソタイプ又はサブクラスの少なくとも２つの免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全て又は一部を含み得る。この場合では、ＣＨ１ドメインに直接続く、ポリペプチドリンカーのＮ末端部分は、好ましくは、当該ＣＨ１ドメインが由来する免疫グロブリンと同じアイソタイプ及びサブクラスに属する免疫グロブリンのヒンジ領域の全て又は一部からなる。
【0100】
任意選択で、当該ポリペプチドリンカーは、免疫グロブリンのＣＨ２ドメインの２～１５個、好ましくは、５～１０個のＮ末端アミノ酸の配列を更に含み得る。
【0101】
いくつかの場合では、天然ヒンジ領域からの配列が使用され得、他の場合では、望ましくない鎖内又は鎖間ジスルフィド結合を回避するために、点変異が、これらの配列にもたらされ得、特に、天然ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３ヒンジ配列における１つ以上のシステイン残基が、アラニン又はセリンによって置換されていることがもたらされ得る。
【0102】
本発明の多重特異性抗原結合断片において使用され得るポリペプチドリンカーの非限定的な例は、配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＧＧ（配列番号９）若しくはＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＧＧＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧ（配列番号４４）、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を有するポリペプチドである。配列番号９は、ヒトＩｇＧ１ヒンジの完全長配列（配列番号４）、続いて、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２の９つのＮ末端アミノ酸（ＡＰＥＬＬＧＧＰＳ、配列番号１０）、続いて、ヒトＩｇＡ１ヒンジの配列の一部分（ＴＰＰＴＰＳＰＳ、配列番号１１）、続いて、補足の柔軟性をリンカーに提供するために添加されるジペプチドＧＧからなる。他の柔軟なリンカーが使用され得、これらのリンカーは、ＧＳタイプのリンカー、例えば、（ＧＧＧＳ）ｎ若しくは（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎが、整数である）、又は非反復リンカー、例えば、ＳＰＮＳＡＳＨＳＧＳＡＰＱＴＳＳＡＰＧＳＱ（配列番号４５）、あるいはそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。
【0103】
任意選択で、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインのＮ末端配列のより短い部分が使用され得る。また、最大ヒトＩｇＡ１ヒンジの完全長配列までの（好ましくは、Ｎ末端バリン残基を除く）そのより長い部分が使用され得る。特定の実施形態によれば、当該ヒトＩｇＡ１ヒンジ配列は、トレオニン、セリン、及びプロリン残基の改変を含有する人工配列によって置換され得る。
【0104】
例えば、配列番号９のポリペプチドのバリアントはまた、本発明の多重特異性抗原結合断片における使用に好適であり、以下の配列、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＰＳＴＰＰＳＰＳＴＰＧＧ（配列番号１２）、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を有するポリペプチドである。このポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１ヒンジの完全長配列、続いて、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２の５つのＮ末端アミノ酸（ＡＰＥＬＬ、配列番号１３）、続いて、配列ＰＳＴＰＰＳＰＳＴＰ（配列番号１４）が存在する。
【0105】
３つ以上の異なるＦａｂ断片を含む本発明の多重特異性抗原結合断片の場合、Ｆａｂ断片を分離するポリペプチドリンカーは、同一であってもよく又は異なってもよい。
【0106】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ免疫グロブリンに由来する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ免疫グロブリンは、ＩｇＧ１アイソタイプ又はＩｇＧ４アイソタイプからのものである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃドメインは、Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａ変異（ＥＵ番号付け）を含む。ヒト療法における使用のために、変異したＦｃドメインが由来する免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。
【0107】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、Ｓ２２８Ｐ変異（ＥＵ番号付け）を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。
【0108】
＞ＩｇＧ４アイソタイプのｍｕｔＩＧＨＧ４ Ｓ２２８Ｐ変異体
【化1】
【0109】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃドメインは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異（ＥＵ番号付け）を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。
【0110】
＞ＩＧＨＧ１＊０１－Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ｜Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
【化2】
【0111】
＞いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃドメインは、野生型ＩｇＧ１のＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃドメインは、配列番号４２の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。
【0112】
＞ＩＧＨＧ１＊０１野生型（ヒト）：
【化3】
【0113】
本開示の例示的な二重特異性抗体は、重鎖及び軽鎖対形成を制御するためのＣＲ３変異を含む。（Ｇｏｌａｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６）。二重特異性抗体は、ＣＨ１ドメインを有する ＩｇＧ１アイソタイプのものであり、Ｔ１９２ＥのＣＲ３変異、カッパアイソタイプの軽鎖を含み、Ｓ１１４Ａ及びＮ１３７ＫのＣＲ３変異と、ＧＳタイプのペプチドリンカーと、ヒンジドメインと、Ｓ２２８Ｐ（ＥＵ番号付け）変異を有する、ＩｇＧ４のＦｃドメインと、を含む。
【0114】
本開示の例示的な二重特異性抗体は、重鎖及び軽鎖対形成を制御するためのＣＲ３変異を含む。（Ｇｏｌａｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６）。二重特異性抗体は、ＣＨ１ドメインを有する ＩｇＧ１アイソタイプのものであり、Ｔ１９２ＥのＣＲ３変異、カッパアイソタイプの軽鎖を含み、Ｓ１１４Ａ及びＮ１３７ＫのＣＲ３変異と、ＧＳタイプのペプチドリンカーと、ヒンジドメインと、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＥＵ番号付け）変異を有する、ｈｕＩｇＧ１のＦｃドメインと、を含む（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｖｅ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＯＫＴ３ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｖａｒｉａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００，１６－２６（２０００）。Ｈｅｚａｒｅｈ ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ Ｐａｎｅｌ ｏｆ Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ａ Ｂｒｏａｄｌｙ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００１，１２１６１－１２１６８（７５）。
【0115】
ＮＫｐ４６及びＣＤ３８に特異的に結合する例示的な二重特異性抗体
本開示の二重特異性抗体は、ＮＫｐ４６に特異的である１つの抗原結合領域と、ＣＤ３８に特異的である第２の抗原結合領域と、を有する。
本開示の二重特異性抗体は、ＮＫｐ４６に特異的である１つの抗原結合領域と、ＣＤ３８に特異的である第２の抗原結合領域と、を有する。
【0116】
ＮＫｐ４６抗原結合領域が由来し得る例示的なＮＫｐ４６抗体は、０２抗体、（「Ｋ３＿Ｐ４」又は「Ｐ４」とも称される）０９抗体、（「Ｋ３ｂ」又は「Ｋ３」とも称される）１２抗体、ヒト化０９抗体、ヒト化１２抗体、Ｂ３４１００１抗体、Ｂ３４１００２抗体、Ｂ３４１００３抗体、及びＢ３４１００４抗体を含む。
【0117】
ＣＤ３８抗原結合領域が由来し得る例示的なＣＤ３８抗体は、「抗ＣＤ３８」抗体を含む。加えて、ＣＤ３８抗原結合領域が由来し得る例示的なＣＤ３８抗体は、米国特許第９，７５８，５９０号、同第９，９４４，７１１号、及び同第１０，７６６，９６５号に開示されているものを含むが、これらに限定されない。
【0118】
いくつかの実施形態では、ＮＫｐ４６に結合する少なくとも第１の抗原結合領域と、ＣＤ３８に結合する第２の抗原結合領域と、を含む本発明の例示的な二重特異性抗体は、表１、２、３、及び４に示されるＣＤＲ配列から選択される、重鎖及び相補性決定領域と軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）との組み合わせを含む。表１、２、３、及び４に示されるＣＤＲは、ＩＭＧＴ命名法に従って定義される（ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）を参照されたい。オンラインで入手可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）。
【0119】
いくつかの実施形態では、表１に示されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列から選択される重鎖ＣＤＲアミノ酸配列の組み合わせを含む第１の重鎖を含み、表２に示されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列から選択される第１の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のセットを有する第１の軽鎖において、表３に示されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列から選択される重鎖ＣＤＲアミノ酸配列の組み合わせを含む第２の重鎖と、表４ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３配列から選択される第２の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のセットを有する第２の軽鎖と、を含む、本発明の例示的な二重特異性抗体。
【0120】
いくつかの実施形態では、ＮＫｐ４６に結合する第１の抗原結合領域と、ＣＤ３８に結合する第２の抗原結合領域と、を含む、本発明の例示的な二重特異性抗体であって、第１の抗原結合領域が、表１に示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の組み合わせと、表２に示されるＣＤＲ配列から選択される軽鎖ＣＤＲの組み合わせと、を含み、第２の抗原結合領域が、表３に示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の組み合わせと、表４に示されるＣＤＲ配列から選択される軽鎖ＣＤＲの組み合わせと、を含む、二重特異性抗体。
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【0121】
以下に記載される例示的な抗ＮＫｐ４６及び抗ＣＤ３８二重特異性抗体の各々は、以下に列挙するアミノ酸及び対応する核酸配列において示されるように、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、第２の重鎖可変ドメインと、第２の軽鎖可変ドメインと、を含む。
【0122】
抗ＮＫｐ４６抗体
例示的な抗ＮＫｐ４６抗体配列は、以下に示される。表５は、本開示による抗ＮＫｐ４６抗体についての例示的な重鎖可変及び軽鎖可変アミノ酸配列を提供する。表６は、本開示による抗ＮＫｐ４６抗体をコードする例示的な重鎖可変及び軽鎖可変核酸配列を提供する。
例示的な抗ＮＫｐ４６抗体配列は、以下に示される。表５は、本開示による抗ＮＫｐ４６抗体についての例示的な重鎖可変及び軽鎖可変アミノ酸配列を提供する。表６は、本開示による抗ＮＫｐ４６抗体をコードする例示的な重鎖可変及び軽鎖可変核酸配列を提供する。
【表5】
【0123】
抗ＣＤ３８抗体
例示的な抗ＣＤ３８抗体配列は、以下に示される。表６は、本開示による抗ＣＤ３８抗体についての例示的な重鎖可変及び軽鎖可変アミノ酸配列を提供する。
例示的な抗ＣＤ３８抗体配列は、以下に示される。表６は、本開示による抗ＣＤ３８抗体についての例示的な重鎖可変及び軽鎖可変アミノ酸配列を提供する。
【表6】
【0124】
例示的な抗ＮＫｐ４６及び抗ＣＤ３８二重特異性抗体
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８／抗ＮＫｐ４６二重特異性抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む第１の重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む第１の軽鎖と、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む第２の重鎖と、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む第２の軽鎖と、を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８／抗ＮＫｐ４６二重特異性抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む第１の重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む第１の軽鎖と、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む第２の重鎖と、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む第２の軽鎖と、を含む。
【0125】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８／抗ＮＫｐ４６二重特異性抗体は、配列番号２５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む第１の重鎖可変領域と、配列番号２６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む第１のカッパ軽鎖可変領域と、配列番号３８のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む第２の重鎖可変領域と、配列番号３９のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む第２のカッパ軽鎖可変領域と、を含む。
【0126】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８／抗ＮＫｐ４６二重特異性抗体は、配列番号４１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む融合重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む第１のカッパ軽鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む第２のカッパ軽鎖と、を含む。シグナル配列は、配列番号４１、３１、４０、及び４６において太字で示され、必ずしも全ての実施形態で存在するわけではない。
【0127】
＞融合重鎖ＣＤ３８／ＮＫｐ４６／ｈｕＩｇＧ１－Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
＞融合重鎖ＣＤ３８／ＮＫｐ４６／ｈｕＩｇＧ１－ｗｔ
＞軽鎖１抗ＮｋＰ４６
＞軽鎖２抗ＣＤ３８
【化4】
＞融合重鎖ＣＤ３８／ＮＫｐ４６／ｈｕＩｇＧ１－ｗｔ
【化5】
＞軽鎖１抗ＮｋＰ４６
【化6】
＞軽鎖２抗ＣＤ３８
【化7】
【0128】
抗体は、上記の単鎖抗体をコードするＤＮＡセグメントを含有するベクターによって発現され得る。
【0129】
これらは、ベクター、リポソーム、ネイキッドＤＮＡ、アジュバントで支援されたＤＮＡ。遺伝子銃、カテーテルなどを含むことができる。ベクターは、化学コンジュゲート、例えば、標的部分（例えば、細胞表面受容体へのリガンド）及び核酸結合部分（例えば、ポリリジン）を有する、ＷＯ９３／６４７０１に記載されているもの；ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスベクター）；融合タンパク質、例えば、標的部分（例えば、標的細胞に特異的な抗体）及び核酸結合部分（例えば、プロタミン）を含有する融合タンパク質である、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０（ＷＯ９５／２２６１８）に記載されているもの；プラスミド；ファージなどを含む。ベクターは、染色体であってもよく、非染色体であってもよく、又は合成であってもよい。
【0130】
好ましいベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質、及び化学コンジュゲートを含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスを含む。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらのベクターは、ポックスベクター、例えば、オルトポックスベクター又はトリポックスベクター；ヘルペスウイルスベクター、例えば、単純ヘルペスＩ型ウイルス（ＨＳＶ）ベクター（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６４：４８７（１９９５）、Ｌｉｍ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）、Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７６０３（１９９３）、Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：１１４９（１９９０）を参照されたい；アデノウイルスベクター（ＬｅＧａｌ ＬａＳａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：９８８（１９９３）、Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ ３：２１９（１９９３）、Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）を参照されたい；及びアデノ随伴ウイルスベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）を参照されたいを含む。
【0131】
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質内に導入する。トリポックスウイルスベクターは、核酸の短期間の発現のみをもたらす。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、核酸を神経細胞内に導入するのに好ましい。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（約４か月）よりも短期間の発現（約２か月）をもたらし、次いで、アデノ随伴ウイルスは、ＨＳＶベクターよりも短い。選択される特定のベクターは、標的細胞及び治療されている状態に依存する。導入は、標準的な技法、例えば、感染、トランスフェクション、形質導入、又は形質転換によるものであることができる。遺伝子移入の様式の例としては、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、及びウイルスベクターが挙げられる。
【0132】
ベクターは、本質的にいずれもの所望の標的細胞を標的とするために用いられ得る。例えば、定位固定注射は、ベクター（例えば、アデノウイルス、ＨＳＶ）を所望の位置に向けるために使用され得る。加えて、粒子は、脳室内（ｉｃｖ）注入によって、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ注入システムなどのミニポンプ注入システムを使用して送達され得る。対流と称されるバルク流に基づく方法はまた、脳の広範な領域への大きい分子の送達において有効であることが証明されており、標的細胞へのベクターの送達において有用であり得る。（Ｂｏｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２０７６－２０８０（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：２９２－３０５（１９９４）を参照されたい）。使用され得る他の方法は、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内、及び皮下注射、並びに経口、又は他の既知の投与経路を含む。
【0133】
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原への結合特異性を有する抗体である。本発明の場合では、結合特異性のうちの１つは、ＮＫｐ４６又はその任意の断片などの標的へのものである。第２の結合標的は、ＣＤ３８又はその任意の断片である。
【0134】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該技術分野で既知である。従来、二重特異性抗体の組換え体産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づき、２つの重鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７－５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の非選択組み合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、それらのうちの１つのみが、正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィーステップによって達成される。同様の手順は、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５－３６５９（１９９１）に開示されている。
【0135】
二重特異性抗体は、当該技術分野で認識されている様々な技法のうちのいずれかを使用して作製され得、これらの技法は、ＷＯ２０１２／０２３０５３に開示されているものを含み、それらの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＷＯ２０１２／０２３０５３に記載されている方法は、ヒト免疫グロブリンと同一の構造である二重特異性抗体を生成する。このタイプの分子は、固有の重鎖ポリペプチドの２つのコピーと、定常カッパドメインに融合した第１の軽鎖可変領域と、定常ラムダドメインに融合した第２の軽鎖可変領域と、から構成されている。各結合部位は、重鎖及び軽鎖の両方が寄与する異なる抗原特異性を示す。軽鎖可変領域は、ラムダ又はカッパファミリーのものであることができ、好ましくは、それぞれ、ラムダ及びカッパ定常ドメインに融合している。これは、非天然ポリペプチド接合部の生成を回避するために好ましい。しかしながら、本発明の二重特異性抗体を、第１の特異性のために、カッパ軽鎖可変ドメインが定常ラムダドメインに融合することと、第２の特異性のために、ラムダ軽鎖可変ドメインが定常カッパドメインに融合することとによって得ることも可能である。ＷＯ２０１２／０２３０５３に記載されている二重特異性抗体は、ＩｇＧκλ抗体又は「κλ体」と称され、これは、新しい完全ヒト二重特異性ＩｇＧフォーマットである。このκλ体フォーマットは、標準的なＩｇＧ分子と区別不能である二重特異性抗体であり、標準的なモノクローナル抗体と区別不能である特徴を有する、二重特異性抗体のアフィニティー精製を可能にし、したがって、以前のフォーマットと比較して好都合である。
【0136】
方法の必須ステップは、同じ重鎖可変ドメインを共有する異なる抗原特異性を有する２つの抗体Ｆｖ領域（各々は、可変軽鎖及び可変重鎖ドメインによって構成されている）の特定である。モノクローナル抗体及びその断片の生成のための多数の方法が記載されている。（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ Ｅ，ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ，１９８８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたく、これは、参照により本明細書に組み込まれる）。完全ヒト抗体は、ＣＤＲ１及び２を含む軽鎖及び重鎖の両方の配列がヒト遺伝子から生じる、抗体分子である。ＣＤＲ３領域は、ヒト起源のものであってもよく、又は合成手段によって設計されてもよい。そのような抗体は、本明細書で「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」と称される。ヒトモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体を産生するための、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２を参照されたい）、及びＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８５ Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６を参照されたい）によって産生されてもよい。ヒトモノクローナル抗体が、利用され得、ヒトモノクローナル抗体は、ヒトハイブリドーマを使用すること（Ｃｏｔｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２０２６－２０３０を参照されたい）によって産生されてもよく、又はヒトＢ細胞をエプスタインバーウイルスでインビトロで形質転換すること（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８５ Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６を参照されたい）によって産生されてもよい。
【0137】
モノクローナル抗体は、例えば、動物を、標的抗原、若しくはその免疫原性断片、誘導体、又はバリアントで免疫化することによって生成される。代替として、動物は、標的抗原をコードする核酸分子を含有するベクターでトランスフェクトされた細胞で免疫化され、これにより、標的抗原が、発現され、トランスフェクトされた細胞の表面と会合する。異種間の非ヒト動物を産生するための様々な技法が、当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0138】
代替として、抗体は、標的抗原への結合のための抗体又は抗原結合ドメイン配列を含有するライブラリをスクリーニングすることによって得られる。このライブラリは、例えば、アセンブルされたファージ粒子の表面上で発現されるバクテリオファージコートタンパク質へのタンパク質又はペプチド融合としてのバクテリオファージと、ファージ粒子内に含有されるコードＤＮＡ配列とにおいて調製される（すなわち、「ファージディスプレイライブラリ」）。
【0139】
次いで、骨髄腫／Ｂ細胞融合からもたらされたハイブリドーマは、標的抗原への反応性についてスクリーニングされる。モノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されているものなどのハイブリドーマ法を使用して調製される。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物は、典型的には、免疫化剤で免疫化されて、リンパ球が誘発され、リンパ球は、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するか、又はそれを産生することが可能である。代替として、リンパ球が、インビトロで免疫化され得る。
【0140】
厳密には不可能でないが、同じ重鎖可変ドメインを有するが、異なる抗原に対して向けられる異なる抗体の偶然の特定の可能性は、非常に低い。実際、ほとんどの場合、重鎖は、抗原結合表面に大きく寄与し、また、配列において最も可変である。特に、重鎖上のＣＤＲ３は、配列、長さ、及び構造において最も多様なＣＤＲである。したがって、異なる抗原に特異的な２つの抗体は、ほぼ不変に、異なる重鎖可変ドメインを保有する。
【0141】
同時係属国際出願第２０１２／０２３０５３号に開示されている方法は、この制限を克服し、同じ重鎖可変ドメインを有する抗体の単離を、抗体ライブラリの使用によって大きく容易にし、抗体ライブラリにおいて、重鎖可変ドメインは、全てのライブラリメンバーについて同一であり、したがって、多様性が、軽鎖可変ドメインに制限される。そのようなライブラリは、例えば、同時係属国際出願第２０１０／１３５５５８号及び同第２０１１／０８４２５５号に記載されており、それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインとともに発現されるため、両方のドメインが、抗原結合に寄与することができる。プロセスを更に促進するために、同じ重鎖可変ドメインと、多様なラムダ可変軽鎖又はカッパ可変軽鎖のいずれかと、を含有する、抗体ライブラリは、異なる抗原に対する抗体のインビトロ選択のために並行して使用され得る。この手法は、共通の重鎖を有する２つの抗体であるが、一方が、ラムダ軽鎖可変ドメインを保有し、他方が、本発明の完全免疫グロブリンフォーマットでの二重特異性抗体の生成のための建築ブロックとして使用され得る、カッパ軽鎖可変ドメインを保有する、その２つの抗体の特定を可能にする。
【0142】
共通の重鎖及び２つの異なる軽鎖は、単一の細胞内に共発現されて、本発明の二重特異性抗体のアセンブリを可能にする。全てのポリペプチドが、同じレベルで発現され、同等に良好にアセンブルされて、免疫グロブリン分子を形成する場合、単一特異性（同じ軽鎖）及び二重特異性（２つの異なる軽鎖）の比は、５０％であるべきである。しかしながら、異なる軽鎖が、異なるレベルで発現され、かつ／又は同じ効率でアセンブルされない可能性がある。したがって、異なるポリペプチドの相対的発現を調節するための手段は、それらの内在性発現特徴又は共通の重鎖とアセンブルする異なる傾向を補償するために使用される。この調節は、プロモーターの強度、異なる効率を特徴とする内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の使用、又は転写若しくは翻訳レベルで作用することができ、かつｍＲＮＡ安定性に作用する他のタイプの調節エレメントを介して達成され得る。異なる強度の異なるプロモーターは、ＣＭＶ（最初期サイトメガロウイルスウイルスプロモーター）、ＥＦ１－１α（ヒト伸長因子１α－サブユニットプロモーター）、Ｕｂｃ（ヒトユビキチンＣプロモーター）、ＳＶ４０（サルウイルス４０プロモーター）を含むことができる。また、哺乳類及びウイルス起源からの異なるＩＲＥＳが記載されている。（例えば、Ｈｅｌｌｅｎ ＣＵ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ Ｐ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２００１ １５：１５９３－６１２を参照されたい）。これらのＩＲＥＳは、それらの長さ及びリボソーム動員効率において大きく異なり得る。更に、活性を、ＩＲＥＳの複数のコピーを導入することによって更に調節することが可能である（Ｓｔｅｐｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：１５３６－１５４１）。発現の調節はまた、細胞の複数の順次トランスフェクションによって、一方又は他方の軽鎖を発現する個々の遺伝子のコピー数を増加させ、したがって、それらの相対的発現を修正して達成され得る。本明細書で提供される実施例は、異なる鎖の相対的発現を制御することが、二重特異性抗体のアセンブリ及び全体的な収率を最大にするのに重要であることを実証する。
【0143】
重鎖及び２つの軽鎖の共発現は、２つの単一特異性二価抗体及び１つの二重特異性二価抗体の３つの異なる抗体の混合物を、細胞培養上清中に生成する。後者は、目的の分子を得るために、混合物から精製されなければならない。本明細書に記載される方法は、この精製手順を、カッパ又はラムダ軽鎖定常ドメインと特異的に相互作用するアフィニティークロマトグラフィー媒体、例えば、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｆａｂ Ｋａｐｐａ及びＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｆａｂ Ｌａｍｂｄａアフィニティーマトリックス（ＢＡＣ ＢＶ、Ｈｏｌｌａｎｄ）の使用によって大いに容易にする。この多段階アフィニティークロマトグラフィー精製手法は、効率的であり、概して、本発明の抗体に適用可能である。これは、クアドローマ又は抗体混合物を発現する他の細胞株に由来する各二重特異性抗体について展開及び最適化される必要がある特異的精製方法とは際立って対照的である。実際、混合物内の異なる抗体の生化学的特徴が同様である場合、標準的なクロマトグラフィー技法、例えば、イオン交換クロマトグラフィーを使用するそれらの分離は、困難であり得るか、又はまったく可能でないことがある。
【0144】
他の好適な精製方法は、２０１２年１０月１９日に出願されＷＯ２０１３／０８８２５９として公開された同時係属出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１２／００３０２８号に開示されているものを含み、それらの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0145】
二重特異性抗体を産生する他の実施形態では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体－抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましく、ＣＨ１は、融合のうちの少なくとも１つにおいて存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する。免疫グロブリン重鎖融合、及び所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクター内に挿入され、好適な宿主生物内に共トランスフェクトされる。二重特異性抗体の生成の更なる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【0146】
ＷＯ９６／２７０１１に記載されている別の手法によれば、一対の抗体分子間の界面が、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の百分率を最大にするように操作され得る。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さいアミノ酸側鎖が、より大きい側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置換される。大きい側鎖と同一又は同様のサイズの代償性「キャビティ」は、大きいアミノ酸側鎖を、より小さいもの（例えば、アラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子の界面上に作製される。これは、ヘテロ二量体の収率を、ホモ二量体などの他の望ましくない最終産物よりも増加させるための機構を提供する。
【0147】
二重特異性抗体を抗体断片から生成するための技法は、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学連結を使用して調製され得る。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【0148】
また、二重特異性抗体断片を組換え細胞培養物から直接作製及び単離するための様々な技法が記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。抗体ホモ二量体は、ヒンジ領域において還元されて、モノマーを形成し、次いで、再酸化して、抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ二量体の産生のために利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）によって記載されている「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替機構を提供している。断片は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、リンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続されており、リンカーは、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるものである。したがって、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、別の断片の相補性ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成され、それによって、２つの抗原結合部位を形成する。また、二重特異性抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって作製するための別の戦略が報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【0149】
３つ以上の結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【0150】
例示的な二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合することができ、それらのうちの少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原起源のものである。代替として、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームは、細胞防御機構を、特定の抗原を発現する細胞に集中させるように、白血球上の誘発分子、例えば、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７）、又はＩｇＧについてのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと組み合わされ得る。二重特異性抗体はまた、細胞傷害性薬剤を、特定の抗原を発現する細胞に向けるために使用され得る。これらの抗体は、抗原結合アームと、細胞傷害性薬剤又は放射性核種キレート剤、例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡに結合するアームと、を有する。目的の別の二重特異性抗体は、本明細書に記載されるタンパク質抗原に結合し、組織因子（ＴＦ）に更に結合する。
【0151】
本明細書に開示される抗体はまた、イムノリポソームとして製剤化され得る。抗体を含有するリポソームは、当該技術分野で既知の方法、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）、並びに米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載されているものによって調製される。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【0152】
特に有用なリポソームは、逆相蒸発法によって、脂質組成物で生成され得、脂質組成物は、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む。リポソームは、規定された孔径のフィルタを介して押し出されて、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６－２８８（１９８２）に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介して、リポソームにコンジュゲートすることができる。
【0153】
コンジュゲート
ヘテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合的に結合した抗体から構成されている。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞が、望ましくない細胞を標的とするようにするために提案されており（米国特許第４，６７６，９８０号を参照されたい）、ＨＩＶ感染の治療のために提案されている（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、ＥＰ０３０８９を参照されたい）。抗体は、合成タンパク質化学において既知の方法を使用してインビトロで調製され得、これらの方法は、架橋剤を含む方法を含むことが企図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、又はチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的での好適な試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル－４－メルカプトブチリミデート、並びに例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが挙げられる。
ヘテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合的に結合した抗体から構成されている。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞が、望ましくない細胞を標的とするようにするために提案されており（米国特許第４，６７６，９８０号を参照されたい）、ＨＩＶ感染の治療のために提案されている（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、ＥＰ０３０８９を参照されたい）。抗体は、合成タンパク質化学において既知の方法を使用してインビトロで調製され得、これらの方法は、架橋剤を含む方法を含むことが企図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、又はチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的での好適な試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル－４－メルカプトブチリミデート、並びに例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが挙げられる。
【0154】
本発明はまた、抗体を含むイムノコンジュゲートであって、抗体が、細胞傷害性薬剤、例えば、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素活性毒素、又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち、ラジオコンジュゲート）にコンジュゲートしている、イムノコンジュゲートに関する。
【0155】
使用され得る酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含む。様々な放射性核種が、ラジオコンジュゲート抗体の産生のために使用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが挙げられる。
【0156】
抗体及び細胞傷害性薬剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタレルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６－ジイソシアネート）、及びビス－活性フルオリン化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製され得る。炭素１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。（ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい）。
【0157】
多種多様な可能な部分は、本発明の得られた抗体にカップリングすることができることが、当業者には認識されよう。（例えば、“Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ（ｅｄｓ），Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）を参照されたく、その全容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【0158】
カップリングは、抗体及び他方の部分がそれらのそれぞれの活性を保持する限り、２つの分子を結合する任意の化学反応によって達成され得る。この連結は、多くの化学機構、例えば、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、及び複合体形成を含むことができる。しかしながら、好ましい結合は、共有結合である。共有結合は、存在する側鎖の直接縮合又は外部架橋分子の組み込みのいずれかによって達成され得る。多くの二価又は多価連結剤が、他の分子へのタンパク質分子、例えば、本発明の抗体のカップリングにおいて有用である。例えば、代表的なカップリング剤は、有機化合物、例えば、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン、及びヘキサメチレンジアミンを含むことができる。この列挙は、当該技術分野で既知の様々なクラスのカップリング剤の網羅的な列挙であることは意図されておらず、むしろ、より一般的なカップリング剤の例示である。（Ｋｉｌｌｅｎ ａｎｄ Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：１３３５－２５４９（１９８４）、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６２：１８５－２１６（１９８２）、及びＶｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）を参照されたい。
【0159】
好ましいリンカーは、文献に記載されている。（例えば、ＭＢＳ（Ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記載している、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４４：２０１－２０８（１９８４）を参照されたい）。また、オリゴペプチドリンカーによって抗体にカップリングしたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を記載している米国特許第５，０３０，７１９号を参照されたい。特に好ましいリンカーは、（ｉ）ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノ－プロピル）カルボジイミドヒドロクロリド、（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－アルファ－メチル－アルファ－（２－プリジル－ジチオ）－トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ（２１５５８Ｇ）、（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル－６［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ番号２１６５１Ｇ）、（ｉｖ）スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３－（２－ピリジルジチオ）－プロピアンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．カタログ番号２１６５－Ｇ）、及び（ｖ）ＥＤＣにコンジュゲートしたスルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスルホ－スクシンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ番号２４５１０）を含む。
【0160】
上記のリンカーは、異なる属性を有する構成要素を含有し、したがって、異なる生理化学的特性を有するコンジュゲートをもたらす。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ－ＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホ－ＮＨＳエステルよりも安定している。ＮＨＳエステル含有リンカーは、スルホ－ＮＨＳエステルよりも可溶性でない。更に、リンカーＳＭＰＴは、立体障害型ジスルフィド結合を含有し、増加した安定性を有するコンジュゲートを形成することができる。ジスルフィド連結は、インビトロで切断されて、使用可能なコンジュゲートをより少なくするため、概して、他の連結よりも安定していない。スルホ－ＮＨＳは、特に、カルボジミドカップリングの安定性を増強することができる。カルボジミドカップリング（例えば、ＥＤＣ）は、スルホ－ＮＨＳとともに使用されたときに、カルボジミドカップリング反応単独よりも加水分解に対して抵抗性があるエステルを形成する。
【0161】
Ｆｃ修飾抗体
本発明の二重特異性抗体は、異なるアイソタイプのものであることができ、それらのＦｃ部分は、異なるＦｃ受容体への結合特性を改変し、このようにして、抗体のエフェクター機能及びその薬物動態特性を修正するために修飾され得る。Ｆｃ部分の修飾のための多数の方法が、記載されており、本発明の抗体に適用可能である。（例えば、Ｓｔｒｏｈｌ，ＷＲ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００９（６）：６８５－９１、米国特許第６，５２８，６２４号、２００９年１月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００９／０１９１１９９を参照されたい）。本発明の方法はまた、Ｆｃ部分を欠くＦ（ａｂ’）２フォーマットでの二重特異性抗体及び抗体混合物を生成するために使用され得る。
本発明の二重特異性抗体は、異なるアイソタイプのものであることができ、それらのＦｃ部分は、異なるＦｃ受容体への結合特性を改変し、このようにして、抗体のエフェクター機能及びその薬物動態特性を修正するために修飾され得る。Ｆｃ部分の修飾のための多数の方法が、記載されており、本発明の抗体に適用可能である。（例えば、Ｓｔｒｏｈｌ，ＷＲ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００９（６）：６８５－９１、米国特許第６，５２８，６２４号、２００９年１月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００９／０１９１１９９を参照されたい）。本発明の方法はまた、Ｆｃ部分を欠くＦ（ａｂ’）２フォーマットでの二重特異性抗体及び抗体混合物を生成するために使用され得る。
【0162】
例えば、異常なＮＫｐ４６及び／又はＣＤ３８発現及び／又は活性に関連するがん並びに／又は他の疾患及び障害の治療における本発明の抗体の有効性を増強するように、抗体を、エフェクター機能に関して修飾することが望ましいことがある。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域内に導入され得、それによって、鎖間ジスルフィド結合が、この領域内に形成されることを可能にする。このように生成されたホモ二量体抗体は、改善されたインターナリゼーション能力、並びに／又は増加した補体媒介性細胞死滅及び抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有することができる。（Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１７６：１１９１－１１９５（１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８－２９２２（１９９２）を参照されたい）。代替として、抗体は、二重Ｆｃ領域を有し、それによって、増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能力を有するように操作され得る。（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９－２３０（１９８９）を参照されたい）。
【0163】
抗体のエフェクター機能を増強する変異は、当該技術分野で既知であり、例えば、本明細書に記載される抗体内に導入され得るＦｃ修飾の例について、Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１２９６及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ９（１）：６３－７３を参照されたく、それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。別途示されない限り、この項におけるＦｃ変異は、免疫グロブリンのためのＫａｂａｔ番号付けスキームを参照して記載される。
【0164】
例えば、Ｌｙｓ３２６Ｔｒｐ／Ｇｌｕ３３３Ｓｅｒ及びＳｅｒ２６７Ｇｌｕ／Ｈｉｓ２６８Ｐｈｅ／Ｓｅｒ３２４Ｔｈｒ Ｆｃ変異体は、減少したＡＤＣＣを示し、Ｌｙｓ３２６Ｔｒｐ／Ｇｌｕ３３３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３２６Ａｌａ／Ｇｌｕ３３３Ａｌａ、Ｌｙｓ３２６Ｍｅｔ／Ｇｌｕ３３３Ｓｅｒ、Ｃｙｓ２２１Ａｓｐ／Ａｓｐ２２２Ｃｙｓ、Ｓｅｒ２６７Ｇｌｕ、Ｈｉｓ２６８Ｐｈｅ、及びＳｅｒ３２４Ｔｈｒ、並びにＧｌｕ３４５Ａｒｇ Ｆｃ変異体は、増加したＣ１ｑ結合を示す。一方、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ及びＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ Ｆｃ変異体は、増加したＡＤＣＣ活性に関連する。
【0165】
Ｆｃ領域内の他の変異は、抗体循環半減期を改善することができ、例えば、Ａｒｇ４３５Ｈｉｓ、Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ／Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ／Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ（「ＹＴＥ」）、Ｍｅｔ４２８Ｌｅｕ／Ａｓｎ４３４Ｓｅｒ、及びＴｈｒ２５２Ｌｅｕ／Ｔｈｒ２５３Ｓｅｒ／Ｔｈｒ２５４Ｐｈｅ変異体は、未変異のバージョンと比較して延長された半減期を示す。
【0166】
他の実施形態では、Ｆｃ変異は、エフェクター機能の損失、例えば、Ｆｃ受容体結合の切断をもたらし得る。１つ以上のＦｃ受容体への結合を減少させるＦｃ変異体の例としては、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ／Ｌｅｕ２３５Ａｌａ（「ＬＡＬＡ」）、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ／Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ／Ｌｅｕ２３５Ａｌａ／Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ／Ｌｅｕ２３４Ｇｌｕ／Ｌｅｕ２３５Ｐｈｅ、Ａｓｐ２６５Ａｌａ、及びＡｌａ３３０Ｌｅｕが挙げられる。
【0167】
更に、Ｆｃ受容体への結合は、糖鎖工学によって達成され得る。糖鎖工学は、免疫グロブリンのＣＨ２ドメインのアミノ酸Ｎ２９７でのグリコシル化部位の修飾を含み得る。代替として又は加えて、組換えで産生された抗体は、抗体を産生する細胞培養物を、グリコシル化阻害剤に曝露することによって、翻訳後に修飾され得る。翻訳後修飾 グリコシル化、カルボキシル化、脱アミド化、酸化、ヒドロキシル化、Ｏ－硫酸化、アミド化、グリシル化、グリケーション、アルキル化、アシル化、アセチル化、リン酸化、ビオチン化、ホルミル化、脂質化、ヨウ素化、プレニル化、酸化、パルミトイル化、ホスファチジルイノシトール化、ホスホパンテテイニル化、シアリル化、及びセレノイル化、Ｃ末端リジン除去。例示的なグリコシル化阻害剤は、例えば、米国特許第９，８６８，９７３号Ｉ記載されており、これは、本明細書に記載される抗体の産生において使用され得るグリコシル化阻害剤の例について、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0168】
ＮＫ細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫療法のための方法であって、有効量の、本開示の二重特異性抗体及び免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫療法のための方法であって、有効量の、本開示の二重特異性抗体及び免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）を投与することを含む、方法を提供する。
【0169】
ＮＫ細胞は、様々な腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、並びに骨髄及び胸腺におけるいくつかの正常細胞に対して自発性細胞傷害を有するリンパ球の亜集団である。ＮＫ細胞は、形質転換細胞及びウイルス感染細胞への早期自然免疫応答の重要なエフェクターである。ＮＫ細胞は、ヒト末梢血中のリンパ球の約１０％を構成する。リンパ球が、ＩＬ－２の存在下で培養されたときに、強い細胞傷害性反応性が生じる。ＮＫ細胞は、それらの大きいサイズ、及びそれらの細胞質における特徴的なアズール親和性顆粒の存在のため、大きい顆粒リンパ球として既知のエフェクター細胞である。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、及び胸腺において分化及び成熟する。ＮＫ細胞は、特異的表面マーカー、例えば、ヒトにおけるＣＤ１６、ＣＤ５６、及びＣＤ８によって検出され得る。ＮＫ細胞は、Ｔ細胞抗原受容体、ｐａｎ ＴマーカーＣＤ３、又は表面免疫グロブリンＢ細胞受容体を発現しない。
【0170】
ＮＫ細胞の刺激は、細胞表面活性化及び阻害受容体に由来するシグナルのクロストークを介して達成される。ＮＫ細胞の活性化状態は、生殖細胞系列にコードされた活性化及び阻害受容体のアレイから受信された細胞内シグナルのバランスによって調節される（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，２００６）。ＮＫ細胞が、異常な細胞（例えば、腫瘍又はウイルス感染細胞）に遭遇し、活性化シグナルが優勢であるときに、ＮＫ細胞は、パーフォリン及びグランザイムを含有する細胞溶解性顆粒の分泌の指示を介して、又は死ドメイン含有受容体の会合を介して、標的細胞のアポトーシスを迅速に誘導することができる。活性化ＮＫ細胞はまた、Ｉ型サイトカイン、例えば、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子ａ、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を分泌することができ、これらは、自然及び適応免疫細胞の両方、並びに他のサイトカイン及びケモカインを活性化する（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２００３）。早期自然免疫応答におけるＮＫ細胞によるこれらの可溶性因子の産生は、他の造血細胞の動員及び機能に著しく影響する。また、物理的接触及びサイトカインの産生を介して、ＮＫ細胞は、免疫応答を促進又は制限するための、樹状細胞及び好中球との調節クロストークネットワークにおける中心的なプレーヤーである。
【0171】
ある実施形態では、ＮＫ細胞は、当該技術分野で周知の方法によって、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、非刺激白血球アフェレーシス産物（ＰＢＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、骨髄、ＣＤ３４＋細胞、又は臍帯血（ＣＢ）から得られる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＰＢＭＣから単離される。いくつかの実施形態では、臍帯ＣＢが、ＮＫ細胞を得るために使用される。ある態様では、ＮＫ細胞は、以前に記載されている、ＮＫ細胞のエクスビボ増殖の方法によって、単離され増殖する（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ，２０１３）。この方法において、ＣＢ単核細胞は、フィコール密度勾配遠心分離によって単離され、バイオリアクター内で、ＩＬ－２及び人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）とともに培養される。７日後に、細胞培養物は、ＣＤ３を発現するいずれもの細胞が枯渇し、更に７日間再培養される。細胞は、再び、ＣＤ３が枯渇し、ＣＤ５６＋／ＣＤ３＋細胞又はＮＫ細胞の百分率を決定するために特徴付けられる。いくつかの実施形態では、臍帯ＣＢは、ＣＤ３４＋細胞の単離と、ＳＣＦ、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２を含有する培地中での培養によるＣＤ５６＋／ＣＤ３＋細胞への分化とによって、ＮＫ細胞を得るために使用される。
【0172】
ＮＫ細胞を単離し得る例示的な方法は、米国特許第９，２６０，６９６号に記載されているものを含むが、これらに限定されない。ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞を生成する例示的な方法はまた、Ｚｈｕ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏ，２０１９、Ｙａｎｇ ｅｔ．Ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ：Ｍｅｔｈ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ，２０２０、及びＭｏｓｅｍａｎ ｅｔ．ａｌ．，２０２０に記載されている。
【0173】
使用方法
本発明による治療実体の投与は、好適な担体、賦形剤、及び他の薬剤とともに投与され、これらは、改善された移入、送達、及び耐容性などを提供するために製剤内に組み込まれていることが理解されよう。多数の適切な製剤が、全ての薬剤師に既知の処方集、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１５ｔｈ ｅｄ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９７５））、特に、Ｂｌａｕｇ，ＳｅｙｍｏｕｒによるそのＣｈａｐｔｅｒ ８７に見出され得る。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質（複数）、脂質、（カチオン性又はアニオン性）脂質含有ベシクル（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油及び油中水エマルション、エマルションｃａｒｂｏｗａｘ（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びｃａｒｂｏｗａｘを含有する半固体混合物を含む。上記の混合物のうちのいずれも、製剤内の活性成分が、製剤によって不活性化されず、製剤が、生理学的に適合し、投与経路に耐容性である限り、本発明による治療及び療法において適切であり得る。また、Ｂａｌｄｒｉｃｋ Ｐ．“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｕｉｄａｎｃｅ．”Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０－８（２０００）、Ｗａｎｇ Ｗ．“Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１－２）：１－６０（２０００）、Ｃｈａｒｍａｎ ＷＮ“Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ－ｓｏｍｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｐｔｓ．”Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．８９（８）：９６７－７８（２０００）、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８－３１１（１９９８）、並びに薬剤師に周知の製剤、賦形剤、及び担体に関する追加の情報についてのそれらの引用を参照されたい。
本発明による治療実体の投与は、好適な担体、賦形剤、及び他の薬剤とともに投与され、これらは、改善された移入、送達、及び耐容性などを提供するために製剤内に組み込まれていることが理解されよう。多数の適切な製剤が、全ての薬剤師に既知の処方集、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１５ｔｈ ｅｄ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９７５））、特に、Ｂｌａｕｇ，ＳｅｙｍｏｕｒによるそのＣｈａｐｔｅｒ ８７に見出され得る。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質（複数）、脂質、（カチオン性又はアニオン性）脂質含有ベシクル（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油及び油中水エマルション、エマルションｃａｒｂｏｗａｘ（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びｃａｒｂｏｗａｘを含有する半固体混合物を含む。上記の混合物のうちのいずれも、製剤内の活性成分が、製剤によって不活性化されず、製剤が、生理学的に適合し、投与経路に耐容性である限り、本発明による治療及び療法において適切であり得る。また、Ｂａｌｄｒｉｃｋ Ｐ．“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｕｉｄａｎｃｅ．”Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０－８（２０００）、Ｗａｎｇ Ｗ．“Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１－２）：１－６０（２０００）、Ｃｈａｒｍａｎ ＷＮ“Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ－ｓｏｍｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｐｔｓ．”Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．８９（８）：９６７－７８（２０００）、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８－３１１（１９９８）、並びに薬剤師に周知の製剤、賦形剤、及び担体に関する追加の情報についてのそれらの引用を参照されたい。
【0174】
本発明の抗体を含む本発明の治療製剤は、がん、例えば、非限定的な例として、白血病、リンパ腫、乳がん、結腸がん、卵巣がん、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺がん、神経膠腫、肺及び気管支がん、結腸直腸がん、膵臓がん、食道がん、肝臓がん、膀胱がん（ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓及び腎盂腎がん、口腔及び咽頭がん、子宮体がん、並びに／又は黒色腫に関連する症状を治療又は軽減するために使用される。本発明はまた、がんに関連する症状を治療又は軽減する方法を提供する。治療計画は、がんを患う（又はそれを発症するリスクがある）対象、例えば、ヒト患者を、標準的な方法を使用して特定することによって実施される。
【0175】
治療の効能は、特定の免疫関連障害を診断又は治療するための任意の既知の方法に関連して決定される。免疫関連障害の１つ以上の症状の軽減は、抗体が臨床的利益を付与することを示す。
【0176】
所望の特異性を有する抗体をスクリーニングするための方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び当該技術分野内で既知の他の免疫学的に媒介される技法を含むが、これらに限定されない。
【0177】
標的、例えば、ＮＫｐ４６、ＣＤ３８に対して向けられる抗体、又はそれらの組み合わせ（又はそれらの断片）は、これらの標的の局在化及び／又は定量化に関する当該技術分野内で既知の方法において使用され得、例えば、適切な生理学的試料内のこれらの標的のレベルの測定、診断方法、及びタンパク質の撮像など）において使用され得る。所与の実施形態では、これらの標的のうちのいずれか特異的な抗体、又は抗体由来抗原結合ドメインを含有する、それらの誘導体、断片、類似体、若しくは相同体は、（以下、「治療薬」と称される）薬理学的に活性な化合物として利用される。
【0178】
本発明の抗体は、特定の標的を、標準的な技法、例えば、免疫親和性、クロマトグラフィー、又は免疫沈降を使用して単離するために使用され得る。本発明の抗体（又はそれらの断片）は、例えば、所与の治療計画の効力を決定するための臨床試験手順の一部として、組織におけるタンパク質レベルを監視するために診断的に使用され得る。検出は、検出可能な物質への抗体のカップリング（すなわち、物理的連結）によって容易され得る。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生体発光材料、及び放射性材料が挙げられる。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン、及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリトリンが挙げられ、発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ、生体発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、好適な放射性材料の例としては、１２５Ｉ、１３３Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈが挙げられる。
【0179】
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、及び完全ヒト抗体を含む本発明の抗体は、治療剤として使用され得る。そのような薬剤は、概して、対象における所与の標的の異常な発現又は活性化に関連する疾患又は病態を治療又は予防するために用いられる。抗体調製物、好ましくは、その標的抗原への高い特異性及び高い親和性を有するものが、対象に投与され、概して、標的へのその結合に起因して効果を有する。抗体の投与は、標的のシグナル伝達機能を抑止してもよく、又はそれを阻害してもよく、又はそれに干渉してもよい。抗体の投与は、標的が自然に結合する内因性リガンドへのその結合を抑止してもよく、又はそれを阻害してもよく、又はそれに干渉してもよい。例えば、抗体は、標的に結合し、ＣＤ３８とその内因性リガンドとの間の相互作用を中和するか又は別法で阻害する。例えば、抗体は、標的に結合し、ＮＫｐ４６とその内因性リガンドとの間の相互作用を中和するか又は別法で阻害する。
【0180】
本発明の抗体の治療有効量は、概して、治療目的を達成するために必要とされる量に関する。上記のように、これは、抗体とその標的抗原との間の結合相互作用であり得、ある場合では、この結合相互作用は、標的の機能に干渉する。投与されるために必要とされる量は、抗体の特異的抗原へのその結合親和性に更に依存し、また、投与される抗体が、それが投与された他の対象 自由体積で枯渇する速度に依存する。本発明の抗体又は抗体断片の治療有効投与量についての一般的な範囲は、非限定的な例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。一般的な投与頻度は、例えば、１日２回～１週間に１回の範囲であり得る。
【0181】
本発明の抗体又はそれらの断片は、様々な疾患及び障害の治療のために、薬学的組成物の形態で投与され得る。そのような組成物の調製に関与する原理及び考慮事項、並びに構成要素の選択におけるガイダンスは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ １９ｔｈ ｅｄ．（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：１９９５、Ｄｒｕｇ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４、及びＰｅｐｔｉｄｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４），１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋで提供されている。
【0182】
抗体断片が使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、ペプチド分子は、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するように設計され得る。そのようなペプチドは、化学的に合成され得、かつ／又は組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９－７８９３（１９９３）を参照されたい）。製剤はまた、治療されている特定の適応症のために必要に応じて、２つ以上の活性化合物、好ましくは、互いに不利に影響しない相補的活性を有するものを含有することができる。代替として又は加えて、組成物は、その機能を増強する薬剤、例えば、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、又は増殖阻害剤を含むことができる。そのような分子は、好適には、組み合わせで存在し、意図された目的に有効である量で存在する。
【0183】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技法によって若しくは界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル、及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に封入されてもよく、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）内に封入されてもよく、又はマクロエマルション内に封入されてもよい。
【0184】
インビボ投与のために使用される製剤は、滅菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を介する濾過によって容易に達成される。
【0185】
持続放出調製物が調製され得る。持続放出調製物の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形物品の形態、例えば、フィルム又はマイクロカプセルである。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーと、ロイプロリドアセテートと、から構成された注射可能なマイクロスフェア）、及びポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニル及び乳酸－グリコール酸などのポリマーは、１００日間超にわたる分子の放出を可能にし、あるヒドロゲルは、タンパク質をより短い期間放出する。
【0186】
本発明による抗体は、試料における所与の標的（又はそのタンパク質断片）の存在を検出するための薬剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識を含有する。抗体は、ポリクローナル、又はより好ましくは、モノクローナルである。インタクトな抗体又はその断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、又はＦ（ａｂ）２）が使用される。プローブ又は抗体に関して、「標識された」という用語は、プローブ又は抗体への検出可能な物質のカップリング（すなわち、物理的連結）による、プローブ又は抗体の直接標識、並びに直接標識された別の試薬との反応性による、プローブ又は抗体の間接標識を包含することが意図されている。間接標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を使用する、一次抗体の検出、及び蛍光標識されたストレプトアビジンで検出され得るビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。「生体試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞、及び生体液、並びに対象内に存在する組織、細胞、及び流体を含むことが意図されている。したがって、血液、及び血液の画分又は構成要素が、「生体試料」という用語の使用に含まれ、血液の画分又は構成要素は、血清、血漿、又はリンパを含む。すなわち、本発明の検出方法は、生体試料における分析物であるｍＲＮＡ、タンパク質、又はゲノムＤＮＡをインビトロ及びインビボで検出するために使用され得る。例えば、分析物であるｍＲＮＡを検出するためのインビトロ技法は、ノーザンハイブリダイゼーション及びインサイツハイブリダイゼーションを含む。分析物であるタンパク質を検出するためのインビトロ技法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、及び免疫蛍光を含む。分析物であるゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技法は、サザンハイブリダイゼーションを含む。イムノアッセイを実施するための手順は、例えば、“ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．４２，Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ（Ｅｄ．）Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５、“Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，Ｅ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ａｎｄ Ｔ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６、及び“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５に記載されている。更に、分析物であるタンパク質を検出するためのインビボ技法は、標識された抗分析物タンパク質抗体を対象内に導入することを含む。例えば、抗体は、放射性マーカーで標識され得、対象における放射性マーカーの存在及び位置は、標準的な撮像技法によって検出され得る。
【0187】
疾患及び障害
いくつかの実施形態では、医学的疾患又は障害は、免疫応答を誘発する免疫細胞集団の移入によって治療される。本開示のある実施形態では、がん又は感染は、免疫応答を誘発する免疫細胞集団の移入によって治療される。個体におけるがんを治療する又はその進行を遅延させるための方法であって、個体に、有効量の抗原特異性細胞療法を投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。本方法は、免疫障害、固形がん、血液がん、及びウイルス感染の治療に適用され得る。
いくつかの実施形態では、医学的疾患又は障害は、免疫応答を誘発する免疫細胞集団の移入によって治療される。本開示のある実施形態では、がん又は感染は、免疫応答を誘発する免疫細胞集団の移入によって治療される。個体におけるがんを治療する又はその進行を遅延させるための方法であって、個体に、有効量の抗原特異性細胞療法を投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。本方法は、免疫障害、固形がん、血液がん、及びウイルス感染の治療に適用され得る。
【0188】
本治療方法が有用である腫瘍は、任意の悪性細胞型、例えば、固形腫瘍又は血液腫瘍において見出されるものを含む。例示的な固形腫瘍は、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺、及び乳房からなる群から選択される臓器の腫瘍が挙げられ得るが、これらに限定されない。例示的な血液腫瘍は、骨髄の腫瘍、Ｔ又はＢ細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、及び骨髄腫などが挙げられる。本明細書で提供される方法を使用して治療され得るがんの更なる例としては、（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、及び肺扁平上皮がんを含む）肺がん、腹膜のがん、（消化器がん及び消化管間質がんを含む）胃（ｇａｓｔｒｉｃ）又は胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）又は腎臓（ｒｅｎａｌ）がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、様々なタイプの頭頸部がん、及び黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【0189】
がんは、具体的には、以下の組織学的タイプのもの、新生物、悪性；がん腫；がん腫、未分化；巨細胞及び紡錘細胞がん；小細胞がん；乳頭状がん；扁平上皮がん；リンパ上皮がん；基底細胞がん；悪性石灰化上皮腫（ｐｉｌｏｍａｔｒｉｘ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；移行上皮がん；乳頭状移行上皮がん；腺がん；ガストリノーマ、悪性；胆管がん；肝細胞がん；複合肝細胞がん及び胆管がん；索状がん；腺様嚢胞がん；腺腫様ポリープの腺がん；腺がん、家族性大腸ポリポーシス；固形がん；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞腺がん；乳頭状腺がん；色素嫌性がん；好酸性がん；好酸性腺がん；塩基好性がん；明細胞腺がん；顆粒細胞がん；濾胞性腺がん；乳頭状及び濾胞性腺がん；非被包性硬化性がん；副腎皮質がん；エンドメトロイドがん腫；皮膚付属器がん；アポクリン腺がん；皮脂腺がん；耳垢腺がん；粘膜表皮がん；嚢胞腺がん；乳頭状嚢胞腺がん；乳頭状漿液嚢胞腺がん；粘液性嚢胞腺がん；粘液性腺がん；印環細胞がん；浸潤性導管がん；髄様がん；小葉がん；炎症性がん；パジェット病、乳房；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；扁平上皮化生随伴腺がん；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞腫；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；パラガングリオーマ、悪性；乳房外パラガングリオーマ、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；悪性黒子型黒色腫；肢端黒子型黒色腫；結節型黒色腫；巨大色素性母斑中の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；がん肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性がん腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛がん；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル芽細胞歯牙肉腫；エナメル芽細胞腫、悪性；エナメル芽細胞線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起神経膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉症；他の特定の非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症；悪性組織球症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；ヘアリー細胞白血病；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；慢性骨髄芽球性白血病；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）；又は未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、がんは、リンパ腫である。いくつかの実施形態では、がんは、ＡＭＬである。
【0190】
本開示のある実施形態では、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）は、それを必要としている個体、例えば、がん又は感染を有する個体に送達される。次いで、細胞は、個体の免疫系を増強して、それぞれのがん細胞又は病原性細胞を攻撃するか又は直接攻撃する。いくつかの場合では、個体に、免疫細胞の１回以上の用量が提供される。個体に、免疫細胞の２回以上の用量が提供される場合、投与間の期間は、個体における増殖のための時間を可能にするのに十分であるべきであり、具体的な実施形態では、用量間の期間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２週間以上である。
【0191】
本開示のある実施形態は、免疫媒介性障害を治療又は予防するための方法を提供する。一実施形態では、対象は、自己免疫疾患を有する。自己免疫疾患の非限定的な例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫性疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎及び精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスパテ皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集疾患、クローン病、円板状ループス、本態性混合性クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパチー、若年性関節炎、扁平苔癬、ループスエルテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、１型又は免疫媒介性糖尿病、重症筋無力症、ネフローゼ症候群（例えば、微小変化型ネフローゼ症候群、巣状糸球体硬化症、又はメブラナス腎症）、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎（例えば、結節性多発性動脈炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、又は疱疹状皮膚炎血管炎）、白斑、並びにウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。したがって、本明細書に開示される方法を使用して治療され得る自己免疫疾患のいくつかの例としては、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、血管炎、又は乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。対象はまた、アレルギー障害、例えば、喘息を有し得る。
【0192】
更に別の実施形態では、対象は、移植臓器又は幹細胞のレシピエントであり、免疫細胞は、拒絶を予防及び／又は治療するために使用される。特定の実施形態では、対象は、移植片対宿主病を有するか、又はそれを発症するリスクがある。ＧＶＨＤは、血縁又は非血縁ドナーのいずれかからの幹細胞を使用又は含有するいずれかの移植片の可能性合併症である。急性及び慢性の２つの種類のＧＶＨＤがある。急性ＧＶＨＤは、移植後の最初の３か月以内に出現する。急性ＧＶＨＤの徴候は、手足上の赤色の皮疹を含み、皮疹は、皮膚の剥離又は水疱形成とともに広がり、より重度になり得る。急性ＧＶＨＤはまた、胃及び腸に影響し得、この場合、腹痛、嘔気、及び下痢が存在する。皮膚及び眼の黄変（黄疸）は、急性ＧＶＨＤが肝臓に影響していることを示す。慢性ＧＶＨＤは、その重症度に基づいてランク付けされ、段階／グレード１は、軽度であり、段階／グレード４は、重度である。慢性ＧＶＨＤは、移植後の３か月以降に発症する。慢性ＧＶＨＤの症状は、急性ＧＶＨＤのものと同様であるが、加えて、慢性ＧＶＨＤはまた、目における粘液腺、口における唾液腺、並びに胃の内壁及び腸を潤滑する腺に影響し得る。本明細書に開示される免疫細胞の集団のうちのいずれも利使用され得る。移植臓器の例としては、実質臓器移植片、例えば、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、肺、及び／又は心臓、あるいは細胞移植片、例えば、島、肝細胞、筋芽細胞、骨髄、又は造血若しくは他の幹細胞が挙げられる。移植片は、複合移植片、例えば、顔の組織であることができる。免疫細胞は、移植前に、移植と同時に、又は移植後に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、移植前に、例えば、移植の少なくとも１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、又は少なくとも１か月前に投与される。具体的な非限定的な一例では、治療有効量の免疫細胞の投与は、移植の３～５日前に発生する。
【0193】
いくつかの実施形態では、対象は、免疫細胞療法前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法を投与され得る。骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法は、任意の好適な経路によって投与され得る任意の好適な療法であり得る。骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法は、例えば、シクロホスファミド及びフルダラビンの投与を含むことができる。シクロホスファミド及びフルダラビンを投与する例示的な経路は、静脈内である。同様に、シクロホスファミド及びフルダラビンの任意の好適な用量が投与され得る。特定の態様では、約６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドが、２日間投与され、その後、約２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンが、５日間投与される。
【0194】
いくつかの実施形態では、対象は、免疫細胞療法前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇免疫療法を投与され得る。骨髄非破壊的リンパ球枯渇免疫療法は、任意の好適な経路によって投与され得る任意の好適な療法であり得る。骨髄非破壊的リンパ球枯渇免疫療法は、例えば、抗ＣＤ５２剤又は抗ＣＤ２０剤の投与を含むことができる。いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇免疫療法は、抗ＣＤ５２抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ５２抗体は、アレムツズマブである。いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇免疫療法は、抗ＣＤ２０抗体である。例示的な抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、又はヨウ素ｉ１３１トシツモマブを含むが、これらに限定されない。抗ＣＤ５２剤又は抗ＣＤ２０剤を投与する例示的な経路は、静脈内である。同様に、抗ＣＤ５２剤又は抗剤の任意の好適な用量が投与され得る。
【0195】
ある実施形態では、免疫細胞の増殖及び活性化を促進する増殖因子が、対象に、免疫細胞と同時又は免疫細胞後のいずれかで投与される。免疫細胞増殖因子は、免疫細胞の増殖及び活性化を促進する任意の好適な増殖因子であることができる。好適な免疫細胞増殖因子の例としては、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１２が挙げられ、これらは、単独で、又は様々な組み合わせで、例えば、ＩＬ－２及びＩＬ－７、ＩＬ－２及びＩＬ－１５、ＩＬ－７及びＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５、ＩＬ－１２及びＩＬ－７、ＩＬ－１２及びＩＬ－１５、若しくはＩＬ－１２及びＩＬ２で使用され得る。
【0196】
治療有効量の免疫細胞は、いくつかの経路によって投与され得、これらの経路は、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、又は関節内注射又は注入を含む。
【0197】
養子細胞療法における使用のための免疫細胞の治療有効量は、治療されている対象において所望の効果を達成する量である。例えば、これは、自己免疫若しくは同種免疫疾患の進行を阻害する若しくはその後退を引き起こすために必要である、免疫細胞の量、又は自己免疫疾患によって引き起こされる症状、例えば、疼痛及び炎症を和らげることが可能である、免疫細胞の量であることができる。これは、炎症に関連する症状、例えば、疼痛、浮腫、及び体温上昇を和らげるために必要である量であることができる。これはまた、移植臓器の拒絶を減弱又は予防するために必要である量であることができる。
【0198】
免疫細胞集団は、疾患と一貫する治療計画において投与され得、例えば、疾患状況を寛解するために、１週間～数週間にわたって単回若しくは数回の用量で投与されてもよく、又は疾患の進行を阻害し、疾患の再発を予防するために、長期間にわたって定期的な用量で投与されてもよい。製剤内で用いられる正確な用量はまた、投与経路、及び疾患又は障害の重篤度に依存する。免疫細胞の治療有効量は、治療されている対象、苦痛の重症度及びタイプ、並びに投与様式に依存する。いくつかの実施形態では、ヒト対象の治療において使用され得る用量は、少なくとも３．８×１０４、少なくとも３．８×１０５、少なくとも３．８×１０６、少なくとも３．８×１０７、少なくとも３．８×１０８、少なくとも３．８×１０９、又は少なくとも３．８×１０１０個の免疫細胞／ｍ２の範囲である。ある実施形態では、ヒト対象の治療において使用される用量は、約３．８×１０９～約３．８×１０１０個の免疫細胞／ｍ２の範囲である。追加の実施形態では、免疫細胞の治療有効量は、体重１ｋｇ当たり約５×１０６個の細胞～体重１ｋｇ当たり約７．５×１０８個の細胞、例えば、体重１ｋｇ当たり約２×１０７個の細胞～約５×１０８個の細胞、又は体重１ｋｇ当たり約５×１０７個の細胞～約２×１０８個の細胞、又は体重１ｋｇ当たり約５×１０６個の細胞～体重１ｋｇ当たり約１×１０７個の細胞で変動することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞の治療有効量は、体重１ｋｇ当たり約１×１０５個の細胞～体重１ｋｇ当たり約１０×１０９個の細胞の範囲である。免疫細胞の正確な量は、対象の年齢、体重、性別、及び生理学的状態に基づいて、当業者によって容易に決定される。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験システムから得られる用量反応曲線から外挿され得る。
【0199】
免疫細胞は、免疫媒介性障害の治療のための１つ以上の他の治療剤との組み合わせで投与され得る。併用療法は、１つ以上の抗菌剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、及び抗真菌剤）、抗腫瘍剤（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、パクリタキセル、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシン、又はビンクリスチン）、免疫枯渇剤（例えば、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシン、又はビンクリスチン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、又はグルコルチコイド、例えば、デキサメタゾン若しくはプレドニゾン）、抗炎症剤（例えば、グルコルチコイド、例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン若しくはプレドニゾン、又は非ステロイド性抗炎症剤、例えば、アセチルアリチル酸、イブプロフェン、若しくはナプロキセンナトリウム）、サイトカインアンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦ及び抗ＩＬ－６）、サイトカイン（例えば、インターロイキン１０又は形質転換増殖因子β）、ホルモン（例えば、エストロゲン）、又はワクチンを含むことができるが、これらに限定されない。加えて、免疫抑制又は免疫寛容誘発剤が、投与され得、これは、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン及びタクロリムス）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）、ミコフェノール酸モフェチル、抗体（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＩＶＩＧ、又はＢ細胞を認識する抗体）、化学療法剤（例えば、メトトレキサート、トレオスルファン、ブスルファン）、照射、又はケモカイン、インターロイキン、若しくはそれらの阻害剤（例えば、ＢＡＦＦ、ＩＬ－２、抗ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＪＡＫキナーゼ阻害剤）を含むが、これらに限定されない。そのような追加の医薬品は、所望の効果に依存して、免疫細胞の投与前に、その投与中に、又はその投与後に投与され得る。細胞及び薬剤のこの投与は、同じ経路によるものであってもよく又は異なる経路によるものであってもよく、同じ部位又は異なる部位のいずれかでのものであることができる。
【0200】
併用療法
いくつかの実施形態では、本実施形態の組成物及び方法は、免疫細胞集団を、少なくとも１つの追加の療法との組み合わせで含む。追加の療法は、放射線療法、手術（例えば、乳腺腫瘍摘出術及び乳房切除術）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、又はそれらの組み合わせであり得る。追加の療法は、アジュバント又はネオアジュバント療法の形態であり得る。
いくつかの実施形態では、本実施形態の組成物及び方法は、免疫細胞集団を、少なくとも１つの追加の療法との組み合わせで含む。追加の療法は、放射線療法、手術（例えば、乳腺腫瘍摘出術及び乳房切除術）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、又はそれらの組み合わせであり得る。追加の療法は、アジュバント又はネオアジュバント療法の形態であり得る。
【0201】
いくつかの実施形態では、追加の療法は、小分子酵素阻害剤又は抗転移剤の投与である。いくつかの実施形態では、追加の療法は、副作用制限剤（例えば、治療の副作用の発生及び／又は重症度を減らすことが意図された薬剤、例えば、抗嘔気剤など）の投与である。いくつかの実施形態では、追加の療法は、放射線療法である。いくつかの実施形態では、追加の療法は、手術である。いくつかの実施形態では、追加の療法は、放射線療法及び手術の組み合わせである。いくつかの実施形態では、追加の療法は、ガンマ線照射である。いくつかの実施形態では、追加の療法は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的とする療法、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤、及び／又は化学予防剤である。追加の療法は、当該技術分野で既知の化学療法剤のうちの１つ以上であり得る。
【0202】
免疫細胞療法は、免疫チェックポイント療法などの追加のがん療法前に、その療法中に、その療法後に、又は様々な組み合わせで投与され得る。投与は、同時～数分～数日～数週間の範囲の間隔のものであり得る。免疫細胞療法が、患者に、追加の治療剤とは別個に提供される実施形態では、概して、２つの化合物が、患者に、有利に組み合わされた効果を依然としてもたらすことができるように、著しい期間が、各送達の時間間で経過しないことが確実にされる。そのような事例では、患者に、抗体療法及び抗がん療法が、互いに約１２～２４又は７２時間以内、特に、互いに約６～１２時間以内に提供され得ることが企図される。いくつかの状況では、治療のための期間を著しく延長することが望ましいことがあり、この場合、数日（２、３、４、５、６、又は７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、又は８週間）が、それぞれの投与間で経過する。
【0203】
様々な組み合わせが用いられ得る。以下の例について、免疫細胞療法が、「Ａ」であり、抗がん療法が、「Ｂ」である。
Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【0204】
患者への本実施形態の任意の化合物又は療法の投与は、薬剤のいずれかの毒性がある場合、それを考慮して、そのような化合物の投与のための一般的なプロトコルに従う。したがって、いくつかの実施形態では、併用療法に起因し得る毒性を監視するステップがある。
【0205】
化学療法
多種多様な化学療法剤が、本実施形態により使用され得る。「化学療法」という用語は、がんを治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」とは、がんの治療において投与される化合物又は組成物を意味するために使用される。これらの薬剤又は薬物は、細胞内のそれらの活性モード、例えば、それらが細胞周期に影響するかによって、かつどの段階でそれらがそれに影響するかによって分類される。代替として、薬剤は、ＤＮＡに直接架橋結合するその能力、ＤＮＡ内にインターカレートするその能力、又は核酸合成に影響することによって染色体及び有糸分裂異常を誘導するその能力に基づいて特徴付けられ得る。
多種多様な化学療法剤が、本実施形態により使用され得る。「化学療法」という用語は、がんを治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」とは、がんの治療において投与される化合物又は組成物を意味するために使用される。これらの薬剤又は薬物は、細胞内のそれらの活性モード、例えば、それらが細胞周期に影響するかによって、かつどの段階でそれらがそれに影響するかによって分類される。代替として、薬剤は、ＤＮＡに直接架橋結合するその能力、ＤＮＡ内にインターカレートするその能力、又は核酸合成に影響することによって染色体及び有糸分裂異常を誘導するその能力に基づいて特徴付けられ得る。
【0206】
化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパ及びシクロスファミド；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボクオン、メトレドーパ、及びウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンエチオホスホラミド、及びトリメチロロメラミンを含む、エチレンイミン及びメチルアメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体であるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビセレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体であるＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、チョロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、及びウラシルマスタード；ニトロスウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムヌスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマｌｌ及びカリケアマイシンオメガｌｌ）；ジネミシンＡを含むジネミシン；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラルニシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラルニイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾトシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、及びゾルビシン；抗代謝剤、例えば、メソトレキセート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、及びトリメトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、デシタビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、及びフロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、及びテストラクトン；抗副腎抗体、例えば、ミトタン及びトリロスタン；葉酸補液、例えば、フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルミチン；エリプチニウムアセテート；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシノイド、例えば、マイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ－２毒素、ベルカリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセルゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ｘｅｌｏｄａ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメルヒルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質タンフェラーゼ阻害剤、トランス白金、並びに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、アザシチジンは、７５ｍｇ／ｍ２で皮下投与される。
【0207】
放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし広く使用されている他の因子は、腫瘍細胞への、γ線、Ｘ線として一般的に既知であるもの、及び／又は放射性同位体の指向性送達を含む。また、ＤＮＡ損傷因子の他の形態、例えば、マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号及び同第４，８７０，２８７号）、及びＵＶ照射が企図される。これらの因子の全てが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、並びに染色体のアセンブリ及び維持への広範囲の損傷に影響する可能性が最もある。Ｘ線についての線量範囲は、長期間（３～４週間）にわたる５０～２００レントゲンの１日線量から２０００～６０００レントゲンの単一線量までの範囲である。放射性同位体についての線量範囲は、大きく変動し、同位体の半減期、放出される放射線の強度及びタイプ、並びに新生物細胞による取り込みに依存する。
ＤＮＡ損傷を引き起こし広く使用されている他の因子は、腫瘍細胞への、γ線、Ｘ線として一般的に既知であるもの、及び／又は放射性同位体の指向性送達を含む。また、ＤＮＡ損傷因子の他の形態、例えば、マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号及び同第４，８７０，２８７号）、及びＵＶ照射が企図される。これらの因子の全てが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、並びに染色体のアセンブリ及び維持への広範囲の損傷に影響する可能性が最もある。Ｘ線についての線量範囲は、長期間（３～４週間）にわたる５０～２００レントゲンの１日線量から２０００～６０００レントゲンの単一線量までの範囲である。放射性同位体についての線量範囲は、大きく変動し、同位体の半減期、放出される放射線の強度及びタイプ、並びに新生物細胞による取り込みに依存する。
【0208】
免疫療法
追加の免疫療法が、実施形態の方法との組み合わせで使用されてもよく、又はそれとともに使用されてもよいことが、当業者には理解されよう。がん治療の文脈において、免疫療法は、概して、がん細胞を標的とし破壊するために、免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））は、そのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は、単独で、療法のエフェクターとして機能してもよく、又は実際に細胞死滅に影響するために他の細胞を動員してもよい。抗体はまた、薬物又は毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲートし得、標的剤として機能し得る。代替として、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接又は間接的に相互作用する表面分子を保有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む。
追加の免疫療法が、実施形態の方法との組み合わせで使用されてもよく、又はそれとともに使用されてもよいことが、当業者には理解されよう。がん治療の文脈において、免疫療法は、概して、がん細胞を標的とし破壊するために、免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））は、そのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は、単独で、療法のエフェクターとして機能してもよく、又は実際に細胞死滅に影響するために他の細胞を動員してもよい。抗体はまた、薬物又は毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲートし得、標的剤として機能し得る。代替として、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接又は間接的に相互作用する表面分子を保有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む。
【0209】
抗体－薬物コンジュゲートは、がん治療薬の開発への画期的な手法として出現している。がんは、世界において主要な死因のうちの１つである。抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞死滅薬物に共有結合的に連結されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。この手法は、ＭＡｂの抗原標的に対するそれらの高い特異性を、非常に強力な細胞傷害性薬物と組み合わせて、「武装」ＭＡｂをもたらし、これは、ペイロード（薬物）を、高いレベルの抗原を有する腫瘍細胞に送達する。薬物の標的送達はまた、正常な組織におけるその曝露を最小にし、減少した毒性及び改善された治療指数をもたらす。ＦＤＡによる、２０１１年のＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）及び２０１３年のＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシン又はＴ－ＤＭ１）の２つのＡＤＣ薬物の承認は、この手法を検証した。現在、がん治療のための臨床試験の様々な段階における３０個超のＡＤＣ薬物候補がある（Ｌｅａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。抗体工学及びリンカーペイロード最適化がますます成熟するにつれて、新しいＡＤＣの発見及び開発は、この手法に好適である新しい標的の特定及び検証、並びに標的ＭＡｂの生成にますます依存している。ＡＤＣ標的についての２つの基準は、腫瘍細胞における上方調節された／高レベルの発現、及び堅牢なインターナリゼーションである。
【0210】
免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的に適するあるマーカー、すなわち、他の細胞の大部分上に存在しないあるマーカーを保有しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのうちのいずれかが、本実施形態の文脈における標的に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーは、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ Ｂ、及びｐｌ５５を含む。免疫療法の代替態様は、抗がん効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。また、免疫刺激分子が存在し、これは、サイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ガンマ－ＩＦＮ；ケモカイン、例えば、ＭＩＰ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８；及び増殖因子、例えば、ＦＬＴ３リガンドを含む。
【0211】
現在調査されている又は使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼン、及び芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号及び同第５，７３９，１６９号、Ｈｕｉ ａｎｄ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，１９９８、Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ，１９９８）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、及びγ、ＩＬ－１、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ，１９９８、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９８、Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ，１９９８）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、及びｐ５３（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９８、Ａｕｓｔｉｎ－Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｖｉｌｌａｓｅｃａ，１９９８、米国特許第５，８３０，８８０号及び同第５，８４６，９４５号）；並びにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、及び抗ｐｌ８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，２０１２、Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，１９９８、米国特許第５，８２４，３１１号）である。１つ以上の抗がん療法が、本明細書に記載される抗体療法とともに用いられ得ることが企図される。
【0212】
いくつかの実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントは、シグナル（例えば、共刺激分子）を上げるか、又はシグナルを下げるかのいずれかである。免疫チェックポイント遮断によって標的とされ得る阻害免疫チェックポイントは、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、（ＣＤ２７６としても既知の）Ｂ７－Ｈ３、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）、（ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５２としても既知の）細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ－１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、並びにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）を含む。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１軸及び／又はＣＴＬＡ－４を標的とする。
【0213】
免疫チェックポイント阻害剤は、薬物、例えば、低分子、組換え形態のリガンド若しくは受容体であってもよく、又は特に、抗体、例えば、ヒト抗体（例えば、国際特許公開第２０１５／０１６７１８、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，１２（４）：２５２－６４，２０１２；両方は、参照により本明細書に組み込まれる）であってもよい。免疫チェックポイントタンパク質又はその類似体の既知の阻害剤が使用され得、特に、キメラ化、ヒト化、又はヒト形態の抗体が使用され得る。当業者には既知であるように、代替及び／又は均等な名称が、本開示に記載されるある抗体のために使用され得る。そのような代替及び／又は均等な名称は、本開示の文脈において互換的である。例えば、ランブロリズマブはまた、代替及び均等な名称であるＭＫ－３４７５及びペンブロリズマブで既知である。
【0214】
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のリガンド結合パートナーへのその結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１及び／又はＰＤＬ２である。別の実施形態では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１の結合パートナーへのその結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ－１及び／又はＢ７－１である。別の実施形態では、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２の結合パートナーへのその結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤＬ２結合パートナーは、ＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、米国特許第８７３５５５３号、同第８３５４５０９号、及び同第８００８４４９号に記載されており、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で提供される方法における使用のための他のＰＤ－１軸アンタゴニストは、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許出願第２０１４／０２９４８９８号、同第２０１４／０２２０２１号、及び同第２０１１／０００８３６９号に記載されており、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
【0215】
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びＣＴ－０１１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合した、ＰＤＬ１又はＰＤＬ２の細胞外又はＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ－２２４である。ＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても既知のニボルマブは、ＷＯ２００６／１２１１６８に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、及びＳＣＨ－９００４７５としても既知のペムブロリズマブは、ＷＯ２００９／１１４３３５に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。ｈＢＡＴ又はｈＢＡＴ－１としても既知のＣＴ－０１１は、ＷＯ２００９／１０１６１１に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。Ｂ７－ＤＣＩｇとしても既知のＡＭＰ－２２４は、ＷＯ２０１０／０２７８２７及びＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されているＰＤＬ２－Ｆｃ融合可溶性受容体である。
【0216】
本明細書で提供される方法において標的とされ得る別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても既知の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である。ヒトＣＴＬＡ－４の完全なｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞の表面上に見出され、抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０又はＣＤ８６に結合したときに「オフスイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、これは、ヘルパーＴ細胞の表面上で発現され、阻害シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質であるＣＤ２８と同様であり、両方の分子は、抗原提示細胞上の、それぞれＢ７－１及びＢ７－２とも称されるＣＤ８０及びＣＤ８６に結合する。ＣＴＬＡ４は、阻害シグナルをＴ細胞に伝達し、ＣＤ２８は、刺激シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４はまた、調節性Ｔ細胞において見出され、それらの機能に重要であり得る。Ｔ細胞受容体及びＣＤ２８を介するＴ細胞活性化は、Ｂ７分子についての阻害受容体であるＣＴＬＡ－４の発現の増加をもたらす。
【0217】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドである。
【0218】
本方法における使用に好適な抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体（又はそれに由来するＶＨ及び／又はＶＬドメイン）は、当該技術分野で周知の方法を使用して生成され得る。代替として、当該技術分野で認識されている抗ＣＴＬＡ－４抗体が使用され得る。例えば、ＵＳ８，１１９，１２９、ＷＯ０１／１４４２４、ＷＯ９８／４２７５２、ＷＯ００／３７５０４（トレメリムマブ、以前には、チシリムマブとしても既知のＣＰ６７５，２０６）、米国特許第６，２０７，１５６号、Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５（１７）：１００６７－１００７１、Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）／Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２５０５（ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＰ－６７５２０６）、及びＭｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８：５３０１－５３０４に開示されている抗ＣＴＬＡ－４抗体が、本明細書に開示される方法において使用され得る。上記の刊行物の各々の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。当該技術分野で認識されているこれらの抗体のうちのいずれかと、ＣＴＬＡ－４への結合を競合する抗体が使用され得る。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ－４抗体は、国際特許出願第２００１／０１４４２４号、同第２０００／０３７５０４号、及び米国特許第８，０１７，１１４号に記載されており、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
【0219】
例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、（１０Ｄ１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、及びＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても既知の）イピリムマブ、又はその抗原結合断片及びバリアントである（例えば、ＷＯ０１／１４４２４を参照されたい）。他の実施形態では、抗体は、イピリムマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又はＶＲを含む。したがって、一実施形態では、抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインと、イピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインと、を含む。別の実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ－４上の、上記の抗体と同じエピトープとの結合を競合し、かつ／又はそれに結合する。別の実施形態では、抗体は、上記の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％、又は９９％の可変領域同一性）を有する。
【0220】
ＣＴＬＡ－４を調節するための他の分子は、ＣＴＬＡ－４リガンド及び受容体、例えば、全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５８４４９０５号、同第５８８５７９６号、並びに国際特許出願第１９９５／００１９９４号及び同第１９９８／０４２７５２号に記載されているものを含み、イムノアドヘシン、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８３２９８６７号に記載されているものを含む。
【0221】
腎臓がん又は腎細胞がんの治療における使用のための免疫療法の例としては、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（エベロリムス）、Ａｆｉｎｉｔｏｒ Ｄｉｓｐｅｒｚ（エベロリムス）、アルデスロイキン、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、アベルマブ、アキシチニブ、Ｂａｖｅｎｃｉｏ（アベルマブ）、ベバシズマブ、Ｃａｂｏｍｅｔｙｘ（カボザンチニブ－Ｓ－マレート）、カボザンチニブ－Ｓ－マレート、エベロリムス、ＩＬ－２（アルデスロイキン）、Ｉｎｌｙｔａ（アキシチニブ）、インターロイキン２（アルデスロイキン）、イピリムマブ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（ペンブロリズマブ）、レンバチニブメシレート、Ｌｅｎｖｉｍａ（レンバチニブメシレート）、Ｍｖａｓｉ（ベバシズマブ）、Ｎｅｘａｖａｒ（ソラフェニブトシレート）、ニボルマブ、Ｏｐｄｉｖｏ（ニボルマブ）、パゾパニブ、ヒドロクロリド、ペンブロリズマブ、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（アルデスロイキン）、ソラフェニブトシレート、スニチニブマレート、Ｓｕｔｅｎｔ（スニチニブマレート）、テムシロリムス、Ｔｏｒｉｓｅｌ（テムシロリムス）、Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（パゾパニブヒドロクロリド）、Ｙｅｒｖｏｙ（イピリムマブ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0222】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療における使用のための免疫療法の例としては、アザシチジン、三酸化ヒ素、セルビジン（ダウノルビシンヒドロクロリド）、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシンヒドロクロリド、ダウノルビシンヒドロクロリド及びシタラビンリポソーム、Ｄａｕｒｉｓｍｏ（グラスデギブマレエート）、デキサメタゾン、ドキソルビシンヒドロクロリド、エナシデニブメシレート、ゲムツズマブオゾガマイシン、ギルテリチニブフマレート、グラスデギブマレエート、Ｉｄａｍｙｃｉｎ ＰＦＳ（イダルビシンヒドロクロリド）、イダルビシンヒドロクロリド、Ｉｄｈｉｆａ（エナシデニブメシレート）、イボシデニブ、ミドスタウリン、ミトキサントロンヒドロクロリド、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオゾガマイシン）、Ｒｕｂｉｄｏｍｙｃｉｎ（ダウノルビシンヒドロクロリド）、Ｒｙｄａｐｔ（ミドスタウリン）、Ｔａｂｌｏｉｄ（チオグアニン）、チオグアニン、Ｔｉｂｓｏｖｏ（イボシデニブ）、Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（三酸化ヒ素）、Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ（ベネトクラクス）、ベネトクラクス、ビンクリスチンサルフェート、Ｖｙｘｅｏｓ（ダウノルビシンヒドロクロリド及びシタラビンリポソーム）、Ｘｏｓｐａｔａ（グラスデギブマレエート）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0223】
手術
がんを有する人の約６０％は、あるタイプの手術を受け、手術は、予防手術、診断的又は病期診断手術、治癒的手術、及び緩和手術を含む。治癒的手術は、がん組織の全て又は一部が物理的に除去、切除、及び／又は破壊される切除術を含み、他の療法、例えば、本実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、及び／又は代替療法とともに使用され得る。腫瘍切除術とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除術に加えて、手術による治療は、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡下手術（モース手術）を含む。
がんを有する人の約６０％は、あるタイプの手術を受け、手術は、予防手術、診断的又は病期診断手術、治癒的手術、及び緩和手術を含む。治癒的手術は、がん組織の全て又は一部が物理的に除去、切除、及び／又は破壊される切除術を含み、他の療法、例えば、本実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、及び／又は代替療法とともに使用され得る。腫瘍切除術とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除術に加えて、手術による治療は、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡下手術（モース手術）を含む。
【0224】
がん細胞、組織、又は腫瘍の一部又は全ての切除後に、空洞が、体内に形成され得る。治療は、追加の抗がん療法でのその領域の灌流、直接注射、又は局所適用によって達成され得る。そのような治療は、例えば、１、２、３、４、５、６、若しくは７日ごとに繰り返されてもよく、又は１、２、３、４、及び５週間ごとに繰り返されてもよく、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２か月ごとに繰り返されてもよい。これらの治療はまた、様々な投与量のものであり得る。
【0225】
他の薬剤
他の薬剤が、治療の治療効力を改善するために、本実施形態のある態様との組み合わせで使用され得ることが企図される。これらの追加の薬剤は、細胞表面受容体及びＧＡＰ接合部の上方調節に影響する薬剤、細胞増殖抑制及び分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導因子への過剰増殖細胞の感受性を増加させる薬剤、又は他の生物学的薬剤を含む。ＧＡＰ接合部の数を上げることによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖細胞集団への抗過剰増殖効果を増加させる。他の実施形態では、細胞増殖抑制又は分化剤は、治療の抗過剰増殖効力を改善するために、本実施形態のある態様との組み合わせで使用され得る。細胞接着の阻害剤が、本実施形態の効力を改善するために企図される。細胞接着阻害剤の例は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンである。更に、アポトーシスへの過剰増殖細胞の感受性を増加させる他の薬剤、例えば、抗体ｃ２２５が、治療効力を改善するために、本実施形態のある態様との組み合わせで使用され得ることが企図される。
他の薬剤が、治療の治療効力を改善するために、本実施形態のある態様との組み合わせで使用され得ることが企図される。これらの追加の薬剤は、細胞表面受容体及びＧＡＰ接合部の上方調節に影響する薬剤、細胞増殖抑制及び分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導因子への過剰増殖細胞の感受性を増加させる薬剤、又は他の生物学的薬剤を含む。ＧＡＰ接合部の数を上げることによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖細胞集団への抗過剰増殖効果を増加させる。他の実施形態では、細胞増殖抑制又は分化剤は、治療の抗過剰増殖効力を改善するために、本実施形態のある態様との組み合わせで使用され得る。細胞接着の阻害剤が、本実施形態の効力を改善するために企図される。細胞接着阻害剤の例は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンである。更に、アポトーシスへの過剰増殖細胞の感受性を増加させる他の薬剤、例えば、抗体ｃ２２５が、治療効力を改善するために、本実施形態のある態様との組み合わせで使用され得ることが企図される。
【0226】
薬学的組成物
（本明細書で「活性化合物」とも称される）本発明の抗体、並びにそれらの誘導体、断片、類似体、及び相同体は、投与に好適な薬学的組成物内に組み込まれ得る。そのような組成物は、典型的には、抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与と適合するあらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張化剤、及び吸収遅延剤などを含むことが意図されている。好適な担体は、当該技術分野での標準的な参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。そのような担体又は希釈剤の好ましい例としては、水、食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び５％のヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。また、リポソーム及び非水系ビヒクル、例えば、固定油が使用され得る。薬学的に活性な物質のための、そのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。あらゆる従来の媒体又は薬剤が、活性化合物と不適合でない限り、組成物内でのそれらの使用が企図される。また、補足の活性化合物が、組成物内に組み込まれ得る。
（本明細書で「活性化合物」とも称される）本発明の抗体、並びにそれらの誘導体、断片、類似体、及び相同体は、投与に好適な薬学的組成物内に組み込まれ得る。そのような組成物は、典型的には、抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与と適合するあらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張化剤、及び吸収遅延剤などを含むことが意図されている。好適な担体は、当該技術分野での標準的な参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。そのような担体又は希釈剤の好ましい例としては、水、食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び５％のヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。また、リポソーム及び非水系ビヒクル、例えば、固定油が使用され得る。薬学的に活性な物質のための、そのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。あらゆる従来の媒体又は薬剤が、活性化合物と不適合でない限り、組成物内でのそれらの使用が企図される。また、補足の活性化合物が、組成物内に組み込まれ得る。
【0227】
また、本明細書において、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物及び製剤が提供される。
【0228】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約１×１０５個のＮＫ細胞～約１×１０９個のＮＫ細胞の範囲の用量を含む。いくつかの実施形態では、用量は、約１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、又は１×１０９個のＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約５×１０５個のＮＫ細胞～約１０×１０１２個のＮＫ細胞の範囲の用量を含む。
【0229】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、凍結保存されている。
【0230】
本明細書に記載される薬学的組成物及び製剤は、所望の純度を有する活性成分（例えば、抗体又はポリペプチド）を、１つ以上の任意選択の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製され得る。薬学的に許容される担体は、概して、用いられる投与量及び濃度で、レシピエントに無毒であり、緩衝液、例えば、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル、若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０個の残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシン；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；並びに／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むが、これらに限定されない。本明細書での例示的な薬学的に許容される担体は、インスティスティシャル薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと組み合わせられる。
【0231】
本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、及び直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の構成要素、滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝液、例えば、アセテート、シトレート、又はホスフェート；及び浸透圧の調整のための薬剤、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロースを含むことができる。ｐＨは、酸又は塩基、例えば、塩酸又は水酸化ナトリウムで調整され得る。非経口調製物は、ガラス又はプラスチックから作製された、アンプル、ディスポーザブルシリンジ、又は複数回用量バイアル内に封入され得る。
【0232】
注射可能用途に好適な薬学的組成物は、（水溶性の場合）滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与については、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合で、組成物は、滅菌でなければならず、容易なシリンジアビリティが存在する程度に流体であるべきである。組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定していなければならず、微生物、例えば、細菌及び真菌の混入作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合、必要とされる粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどによって達成され得る。多くの場合では、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを、組成物内に含めることが好ましい。注射組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物内に含めることによってもたらされ得る。
【0233】
滅菌注射溶液は、必要とされる量の活性化合物を、必要に応じて、上記の成分のうちの１つ又はそれらの組み合わせを有する適切な溶媒中に組み込み、続いて、濾過滅菌することによって調製され得る。概して、分散液は、活性化合物を、基礎分散媒及び上記のものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これにより、活性成分と、任意の追加の所望の成分との粉末が、予め滅菌濾過されたその溶液から得られる。
【0234】
経口組成物は、概して、不活性希釈剤又は食用担体を含む。これらは、ゼラチンカプセル内に封入されてもよく、又は錠剤に圧縮されてもよい。治療的経口投与の目的で、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての使用のための流体担体を使用して調製され得、流体担体中の化合物は、経口的に適用され、スウィッシュされ、喀痰又は嚥下される。薬学的に適合する結合剤及び／又はアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル剤、及びトローチ剤などは、以下の成分、結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガントガム、又はゼラチン；賦形剤、例えば、デンプン若しくはラクトース；崩壊剤、例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、若しくはトウモロコシデンプン；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム若しくはＳｔｅｒｏｔｅｓ；滑剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロース若しくはサッカリン；又は香味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ香味剤のうちのいずれか、又は同様の性質の化合物を含有することができる。
【0235】
吸入による投与のために、化合物は、好適な推進剤、例えば、二酸化炭素などのガスを収容する加圧容器若しくはディスペンサー、又はネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【0236】
全身性投与はまた、経粘膜又は経皮手段によるものであることができる。経粘膜又は経皮投与のために、浸透するバリアに適切な浸透剤が、製剤内で使用される。そのような浸透剤は、概して、当該技術分野で既知であり、例えば、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻スプレー又は坐剤の使用を介して達成され得る。経皮投与のために、活性化合物は、概して、当該技術分野で既知であるように、軟膏剤、膏薬、ゲル剤、又はクリーム剤に製剤化される。
【0237】
化合物はまた、直腸送達のために、（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの従来の坐剤ベースでの）坐剤又は保持浣腸剤の形態で調製され得る。
【0238】
一実施形態では、活性化合物は、化合物を体からの急速な排出から保護する担体で調製され、例えば、制御放出製剤で調製され、制御放出製剤は、埋込剤及びマイクロカプセル化送達システムを含む。生分解性生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸が使用され得る。そのような製剤を調製するための方法は、当業者には明らかである。材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されているものから得られ得る。また、（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で、感染細胞を標的とするようにされたリポソームを含む）リポソーム懸濁液が、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、当業者に既知の方法に従って、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように調製され得る。
【0239】
投与の容易さ及び投与量の均一性のために、経口又は非経口組成物を単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される場合、単位剤形とは、単位投与量として治療されている対象に好適である物理的に別々の単位であって、各単位が、所定の量の活性化合物を含有し、その所定の量が、所望の治療効果がもたらされるように、必要とされる薬学的担体に関連して計算された量である、単位を指す。本発明の単位剤形についての仕様は、活性化合物の固有の特徴、及び達成される特定の治療効果、及びこのような活性化合物を個体の治療のために配合する技術において内在する制限によって決められ、それらに直接依存する。
【0240】
薬学的組成物は、投与についての使用説明書と一緒に、容器、パック、又はディスペンサー内に収容され得る。
【0241】
製造物品又はキット
また、二重特異性抗体と、免疫細胞と、を含む、製造物品又はキットが、本明細書で提供される。製造物品又はキットは、添付文書を更に含むことができ、添付文書は、免疫細胞を使用して、個体におけるがんを治療する若しくはその進行を遅延させること、又はがんを有する個体の免疫機能を増強することについての使用説明書を含む。本明細書に記載される抗原特異性免疫細胞のうちのいずれかが、製造物品又はキット内に含まれ得る。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、バッグ、及びシリンジを含む。容器は、様々な材料、例えば、ガラス、プラスチック（例えば、ポリ塩化ビニル又はポリオレフィン）、又は金属合金（例えば、ステンレス鋼又はハステロイ）から形成され得る。いくつかの実施形態では、容器は、製剤を保持し、容器上の又は容器に伴うラベルは、使用法を示し得る。製造物品又はキットは、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含み得、これらの材料は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、及び使用のための説明書を有する添付文書を含む。いくつかの実施形態では、製造物品は、別の薬剤のうちの１つ以上（例えば、化学療法剤及び抗新生物剤）を更に含む。この１つ以上の薬剤のための好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、バッグ、及びシリンジを含む。
また、二重特異性抗体と、免疫細胞と、を含む、製造物品又はキットが、本明細書で提供される。製造物品又はキットは、添付文書を更に含むことができ、添付文書は、免疫細胞を使用して、個体におけるがんを治療する若しくはその進行を遅延させること、又はがんを有する個体の免疫機能を増強することについての使用説明書を含む。本明細書に記載される抗原特異性免疫細胞のうちのいずれかが、製造物品又はキット内に含まれ得る。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、バッグ、及びシリンジを含む。容器は、様々な材料、例えば、ガラス、プラスチック（例えば、ポリ塩化ビニル又はポリオレフィン）、又は金属合金（例えば、ステンレス鋼又はハステロイ）から形成され得る。いくつかの実施形態では、容器は、製剤を保持し、容器上の又は容器に伴うラベルは、使用法を示し得る。製造物品又はキットは、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含み得、これらの材料は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、及び使用のための説明書を有する添付文書を含む。いくつかの実施形態では、製造物品は、別の薬剤のうちの１つ以上（例えば、化学療法剤及び抗新生物剤）を更に含む。この１つ以上の薬剤のための好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、バッグ、及びシリンジを含む。
【実施例】
【0242】
実施例１：ヒトＮＫｐ４６に結合するマウスモノクローナル抗体の生成
ＮＫｐ４６発現細胞へのマウス抗ＮＫｐ４６モノクローナル抗体の結合
ＮＫｐ４６に対する抗体を産生するために、ＮＫｐ４６欠損マウス（Ｎｃｒ１ｇｆｐ／ｇｆｐ（Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．，２００６））に、ヒトＩｇＧに融合したＮＫｐ４６の細胞外部分からなる融合タンパク質（ＮＫｐ４６－Ｉｇ）を注射した。新たに生成された抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂを、ＮＫｐ４６に結合する能力について評価した。クローン０２、０９、及び１２についてのデータを示す。結合を、ＮＫｐ４６を発現するマウス胸腺腫ＢＷトランスフェクタント細胞（ＢＷ ＮＫｐ４６）上で調査した。（９Ｅ２と示される）市販の抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ、及び抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ（４６１－Ｇ１）（Ａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００１）を、対照として使用した。フローサイトメトリー実験に基づいて、試験された全ての抗体は、ＢＷ ＮＫｐ４６と特異的に相互作用したが、親ＢＷ細胞と相互作用しなかった（図１Ａ）。この実験を、ＩＬ－２活性化一次バルクヒトＮＫ細胞（活性化ＮＫ細胞）で繰り返して、抗体が、ヒトＮＫ細胞によって自然に発現されるＮＫｐ４６を認識することを実証した（図１Ｂ）。実験全体にわたって使用された活性化ＮＫ細胞を、ＰＢＭＣから単離した。精製後に、ＮＫ細胞は、約９７％純粋であり、ＮＫ細胞を、ＣＤ５６＋ＣＤ３－表面マーカーについて検証した。全ての抗体（９Ｅ２、４６１－Ｇ１、０２、０９、及び１２）は、活性化ＮＫ細胞を陽性染色した。同様の結果を、追加のドナーに由来するＰＢＭＣで得た。
ＮＫｐ４６発現細胞へのマウス抗ＮＫｐ４６モノクローナル抗体の結合
ＮＫｐ４６に対する抗体を産生するために、ＮＫｐ４６欠損マウス（Ｎｃｒ１ｇｆｐ／ｇｆｐ（Ｇａｚｉｔ ｅｔ ａｌ．，２００６））に、ヒトＩｇＧに融合したＮＫｐ４６の細胞外部分からなる融合タンパク質（ＮＫｐ４６－Ｉｇ）を注射した。新たに生成された抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂを、ＮＫｐ４６に結合する能力について評価した。クローン０２、０９、及び１２についてのデータを示す。結合を、ＮＫｐ４６を発現するマウス胸腺腫ＢＷトランスフェクタント細胞（ＢＷ ＮＫｐ４６）上で調査した。（９Ｅ２と示される）市販の抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ、及び抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ（４６１－Ｇ１）（Ａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００１）を、対照として使用した。フローサイトメトリー実験に基づいて、試験された全ての抗体は、ＢＷ ＮＫｐ４６と特異的に相互作用したが、親ＢＷ細胞と相互作用しなかった（図１Ａ）。この実験を、ＩＬ－２活性化一次バルクヒトＮＫ細胞（活性化ＮＫ細胞）で繰り返して、抗体が、ヒトＮＫ細胞によって自然に発現されるＮＫｐ４６を認識することを実証した（図１Ｂ）。実験全体にわたって使用された活性化ＮＫ細胞を、ＰＢＭＣから単離した。精製後に、ＮＫ細胞は、約９７％純粋であり、ＮＫ細胞を、ＣＤ５６＋ＣＤ３－表面マーカーについて検証した。全ての抗体（９Ｅ２、４６１－Ｇ１、０２、０９、及び１２）は、活性化ＮＫ細胞を陽性染色した。同様の結果を、追加のドナーに由来するＰＢＭＣで得た。
【0243】
マウス抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂを使用する、内因性ＮＫｐ４６リガンド結合の阻害
抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂが、ＮＫｐ４６とそのリガンドとの相互作用を遮断するかを決定するために、ＮＫｐ４６についての未知のリガンドを発現する、ＢＪＡＢ、ＭＣＦ７、及びＣ１Ｒ腫瘍細胞を使用した（図２）。ＮＫｐ４６－Ｉｇを、単独で、又は抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ及び対照抗体とともに、氷上でインキュベートした。その後、処理されたＮＫｐ４６－Ｉｇ融合タンパク質を使用して、腫瘍細胞をＦＡＣＳ染色した。抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂのうちのいずれも、細胞へのＮＫｐ４６－Ｉｇの結合を遮断することができなかった（図２）。
抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂが、ＮＫｐ４６とそのリガンドとの相互作用を遮断するかを決定するために、ＮＫｐ４６についての未知のリガンドを発現する、ＢＪＡＢ、ＭＣＦ７、及びＣ１Ｒ腫瘍細胞を使用した（図２）。ＮＫｐ４６－Ｉｇを、単独で、又は抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ及び対照抗体とともに、氷上でインキュベートした。その後、処理されたＮＫｐ４６－Ｉｇ融合タンパク質を使用して、腫瘍細胞をＦＡＣＳ染色した。抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂのうちのいずれも、細胞へのＮＫｐ４６－Ｉｇの結合を遮断することができなかった（図２）。
【0244】
マウス抗ＮＫｐ４６抗体を使用する、ＮＫ細胞上での表面発現ＮＫｐ４６の下方調節
抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂが、ＮＫ細胞の表面上でのＮＫｐ４６発現の低減をもたらすかを試験するために、ヒト抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂを、活性化ＮＫ細胞とともに、８時間４℃又は３７℃のいずれかでインキュベートした。次いで、細胞を、コンジュゲート二次抗マウス抗体でＦＡＣＳ染色した。試験されたｍＡｂのうちの１つである０２のみが、ＮＫｐ４６のレベルの低減をもたらした（図３）。インターナリゼーションアッセイを、９Ｅ２対照、４６１－Ｇ１対照、及び０２のみで実行した。インターナリゼーションアッセイは、（Ｂｅｒｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）に記載されている。０２での活性化ＮＫ細胞の処置は、ＮＫｐ４６の平均表面下方調節を、６０％のみでもたらした（Ｂｅｒｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＮＫｐ４６への０２の結合は、リソソーム経路を介する受容体インターナリゼーション及び分解をもたらした（Ｂｅｒｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。１２及び０９抗ＮＫｐ４６抗体は、ＮＫ細胞の表面からのＮＫｐ４６の下方調節をもたらさなかった。
抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂが、ＮＫ細胞の表面上でのＮＫｐ４６発現の低減をもたらすかを試験するために、ヒト抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂを、活性化ＮＫ細胞とともに、８時間４℃又は３７℃のいずれかでインキュベートした。次いで、細胞を、コンジュゲート二次抗マウス抗体でＦＡＣＳ染色した。試験されたｍＡｂのうちの１つである０２のみが、ＮＫｐ４６のレベルの低減をもたらした（図３）。インターナリゼーションアッセイを、９Ｅ２対照、４６１－Ｇ１対照、及び０２のみで実行した。インターナリゼーションアッセイは、（Ｂｅｒｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）に記載されている。０２での活性化ＮＫ細胞の処置は、ＮＫｐ４６の平均表面下方調節を、６０％のみでもたらした（Ｂｅｒｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＮＫｐ４６への０２の結合は、リソソーム経路を介する受容体インターナリゼーション及び分解をもたらした（Ｂｅｒｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。１２及び０９抗ＮＫｐ４６抗体は、ＮＫ細胞の表面からのＮＫｐ４６の下方調節をもたらさなかった。
【0245】
まとめると、これらのアッセイは、新しい抗体である０２が、ＮＫｐ４６表面発現を下方調節する固有の能力を有することを明らかにした。２つの他の抗体である０９及び１２を使用して、二重特異性又は三重特異性抗体を生成することができる。これらの抗体は、ＮＫｐ４６に特異的に結合し、ＮＫｐ４６の同族リガンドへのその結合に干渉しない。
【0246】
２つの一次活性化一次ＮＫ細胞上への、これらの抗体での用量応答ＦＡＣＳ染色を使用して、知見を確認した（図４）。試験された抗体の濃度が減少するにつれて、ＦＡＣ染色における蛍光シグナルも減少する。したがって、０９及び１２抗体は、強い用量応答を示す。これは、市販の抗ＮＫｐ４６対照抗体及び４６１－Ｇ１対照抗体を使用して判明された結果と同様である。
【0247】
これらの結果は、０９及び１２抗ＮＫｐ４６抗体が、二重特異性及び三重特異性抗体の生成に好適であり、これらが、ＮＫ細胞と腫瘍細胞との間を橋渡し、したがって、腫瘍細胞死滅をもたらすことを実証する。
【0248】
ＢＩＡｃｏｒｅ結合親和性
２つのマウス抗ＮＫｐ４６（０９及び１２）の結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイを使用して決定した。図５及び表９は、０９抗体の結合親和性を示す。図６及び表１０は、１２抗体の結合親和性を示す。
２つのマウス抗ＮＫｐ４６（０９及び１２）の結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイを使用して決定した。図５及び表９は、０９抗体の結合親和性を示す。図６及び表１０は、１２抗体の結合親和性を示す。
【表9】
【表10】
【0249】
実施例２：ヒトＮＫｐ４６に結合するヒト化抗体の生成
マウス抗ＮＫｐ４６抗体（０９抗体、１２抗体）を使用して、ＩｇＧ４フレームワークを有するヒト化抗ＮＫｐ４６抗体ヒト化０９抗体、ヒト化１２抗体）を生成した。図７Ａ及び図７Ｂは、それぞれ、重鎖可変領域アミノ酸配列アラインメント及び軽鎖可変領域アミノ酸配列アラインメントを示す。得られたヒト化配列は、配列番号２５（１２の重鎖のヒト化）、配列番号２９（０９の重鎖のヒト化）、配列番号２６（０９の軽鎖のヒト化）、及び配列番号３０（１２の軽鎖のヒト化）に記載される。Ｂ３４１００１、Ｂ３４１００２、Ｂ３４１００３、及びＢ３４１００４の４つのヒト化クローンを調製した。
マウス抗ＮＫｐ４６抗体（０９抗体、１２抗体）を使用して、ＩｇＧ４フレームワークを有するヒト化抗ＮＫｐ４６抗体ヒト化０９抗体、ヒト化１２抗体）を生成した。図７Ａ及び図７Ｂは、それぞれ、重鎖可変領域アミノ酸配列アラインメント及び軽鎖可変領域アミノ酸配列アラインメントを示す。得られたヒト化配列は、配列番号２５（１２の重鎖のヒト化）、配列番号２９（０９の重鎖のヒト化）、配列番号２６（０９の軽鎖のヒト化）、及び配列番号３０（１２の軽鎖のヒト化）に記載される。Ｂ３４１００１、Ｂ３４１００２、Ｂ３４１００３、及びＢ３４１００４の４つのヒト化クローンを調製した。
【0250】
＞配列番号２５（０９の重鎖のヒト化）
ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＥＹＳＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＳＬＥＷＦＧＧＩＳＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＦＨＳＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＥＹＳＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＳＬＥＷＦＧＧＩＳＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＦＨＳＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【0251】
＞配列番号２６（０９の軽鎖のヒト化）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨＷＦＱＱＫＰＨＥＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＮＧＨＳＦＰＬＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨＷＦＱＱＫＰＨＥＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＮＧＨＳＦＰＬＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ
【0252】
配列番号２９（１２の重鎖のヒト化）：
ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＥＹＳＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＳＬＥＷＦＧＧＩＳＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＦＨＳＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＥＹＳＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＳＬＥＷＦＧＧＩＳＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＦＨＳＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【0253】
＞配列番号３０（１２の軽鎖のヒト化）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨＷＦＱＱＫＰＨＥＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＮＧＨＳＦＰＬＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦ
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨＷＦＱＱＫＰＨＥＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＮＧＨＳＦＰＬＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦ
【0254】
ＮＫｐ４６へのヒト化抗体の結合を、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞上に発現されたヒトＮＫｐ４６抗原（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して試験した。
【0255】
１．最適なシグナルを見出すために、３つの濃縮対３つの緩衝液のマトリックスにおいて試験された抗原コート。
【0256】
２．ＥＬＩＳＡトレイをコーティングするために使用された最適な信号条件。標準的なブロッキングステップ及び洗浄ステップ。
【0257】
３．一次抗体を、１０個の希釈での濃度範囲で適用した。（ＭＭＴヒト化可変及び変異したＩｇＧ４を有するＭＡｂ）
【0258】
４．結合を検出するために使用された二次抗体（ＨＲＰ、ＴＭＢ基質を有する抗抗Ｈｕカッパ）
【0259】
５．４５０ｎｍで測定された吸光度
【0260】
ヒト化０９抗ＮＫｐ４６抗体についての結合データを、表１１に示す。正規化された結合曲線を使用して、推定ＫＤ値は、２７ｐＭである。
【表11】
【0261】
ヒト化１２抗ＮＫｐ４６抗体についての結合データを、表１２に示す。正規化された結合曲線を使用して、推定ＫＤ値は、２５ｐＭである。
【表12】
【0262】
ＢＩＡＣｏｒｅアッセイ
ＮＫｐ４６ドメインへのヒト化抗ＮＫｐ４６抗体（Ｂ３４１００１、Ｂ３４１００２、Ｂ３４１００３、及びＢ３４１００４）の結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイを使用して決定した。図８は、これらの研究において試験された、完全長ＮＫｐ４６ポリペプチド、Ｄ１ドメイン、及びＤ２ドメインを示す。
ＮＫｐ４６ドメインへのヒト化抗ＮＫｐ４６抗体（Ｂ３４１００１、Ｂ３４１００２、Ｂ３４１００３、及びＢ３４１００４）の結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイを使用して決定した。図８は、これらの研究において試験された、完全長ＮＫｐ４６ポリペプチド、Ｄ１ドメイン、及びＤ２ドメインを示す。
【0263】
このアッセイにおいて、本発明者らは、ＢＷ細胞、及びＮＫｐ４６を発現するようにトランスフェクトされたＢＷ細胞（ＢＷ ＮＫｐ４６）を、マウスＮＫｐ４６抗体９及び１２、市販のマウスＮＫｐ４６抗体９Ｅ９、並びにヒト化ＮＫｐ４６抗体（Ｂ２４１００１、Ｂ３４１００２、Ｂ３４１００３、及びＢ３４１００４）とともにインキュベートした。抗体は、トランスフェクトされたＢＷ ＮＫｐ４６細胞を染色したが、親ＢＷ細胞を染色せず、これは、ヒト化ＮＫｐ４６抗体及びマウス抗体が特異的であることを示した。したがって、抗体は、発現されたＮＫｐ４６に特異的に結合する。
【0264】
５０，０００個の、親ＢＷ細胞、ＮＫｐ４６を発現するようにトランスフェクトされたＢＷ細胞、又は一次ＩＬ－２活性化ＮＫ細胞（ＮＫ Ｆｉｊｉ）を、ＮＫｐ４６の発現のために、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、及び１０μｇ／ｍｌの濃度の様々なヒト化抗ＮＫｐ４６抗体を使用して染色した。抗ＰＡＦＲ抗体を、陰性対照として使用した。図９は、これらの実験の結果を示す。
【0265】
５０，０００個の、親ＢＷ細胞、ＮＫｐ４６を発現するようにトランスフェクトされたＢＷ細胞、又は一次ＩＬ－２活性化ＮＫ細胞（ＮＫ Ｆｉｊｉ）を、ＮＫｐ４６の発現のために、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、及び１０μｇ／ｍｌの濃度の様々なヒト化抗ＮＫｐ４６抗体を使用して染色した。抗ＰＡＦＲ抗体を、陰性対照として使用した。図１０は、これらの実験の結果を示す。
【0266】
表１３に示されるように、ヒト化抗体は、ＮＫｐ４６ポリペプチドのＤ２ドメインに結合した。０９及び１２マウス抗ＮＫｐ４６モノクローナル抗体を、対照として含め、これらもまた、Ｄ２ドメインに結合した。０９抗ＮＫｐ４６モノクローナル抗体はまた、Ｄ１ドメインへの結合を示す。
【表13】
【0267】
実施例３：ヒトＮｋｐ４６に結合する、ヒト化抗体及びマウスモノクローナル抗体の機能的特徴付け
ヒト化抗体を、ＮＫ細胞死滅を活性化するそれらの能力について調査した。２５００個のマウスマスト細胞腫細胞株Ｐ８１５を、０．０５μｇの抗体とともに、１時間氷上でインキュベートし、次いで、１０，０００個のＮＫ細胞を添加し、細胞を、５時間３７℃でインキュベートした。ＰＡＲ－Ｒを、対照抗体として使用した。抗ＧＰＣ３抗体を、対照として使用した。両方の対照抗体を使用して、ＮＫ細胞死滅は観察されなかった。９Ｅ２は、市販の抗ＮＫｐ４６抗体である。図１１は、ヒト化抗体がＮＫ細胞死滅を活性化したことを示す。
ヒト化抗体を、ＮＫ細胞死滅を活性化するそれらの能力について調査した。２５００個のマウスマスト細胞腫細胞株Ｐ８１５を、０．０５μｇの抗体とともに、１時間氷上でインキュベートし、次いで、１０，０００個のＮＫ細胞を添加し、細胞を、５時間３７℃でインキュベートした。ＰＡＲ－Ｒを、対照抗体として使用した。抗ＧＰＣ３抗体を、対照として使用した。両方の対照抗体を使用して、ＮＫ細胞死滅は観察されなかった。９Ｅ２は、市販の抗ＮＫｐ４６抗体である。図１１は、ヒト化抗体がＮＫ細胞死滅を活性化したことを示す。
【0268】
次に、ヒト化抗体を、ＮＫ細胞によるＨｅｐＧ２細胞（ＧＰＣ３を発現する細胞）の死滅に影響するそれらの能力について調査した。５０００個のＨｅｐＧ２細胞を、１μｇ又は５μｇのマウスＮＫｐ４６抗体０９及び１２、市販のマウスＮＫｐ４６抗体９Ｅ９、並びにヒト化ＮＫｐ４６抗体Ｂ２４１００１、Ｂ３４１００２、Ｂ３４１００３、及びＢ３４１００４とともに、１時間氷上でインキュベートした。次いで、１００，０００個のＮＫ細胞を添加し、細胞を、５時間３７℃でインキュベートした。図１２は、抗ＮＫｐ４６抗体のいずれも、ＨｅｐＧ２細胞の死滅に影響しないことを示す。
【0269】
実施例４－ヒト化ＣＤ３８抗体の生成 ヒトＣＤ３８に結合する
ＣＤ３８に結合する２つのヒト化抗体を生成した（ＣＤ３８－ＩｇＧ１ Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び野生型ＣＤ３８－ＩｇＧ１）。ヒトＣＤ３８へのヒト化抗体の結合を試験した。ＥＬＩＳＡプレートを、０．１ｍｇ／ウェルのヒトＣＤ３８タンパク質でコーティングした。第１の抗体（ヒト化抗ａＮＫｐ４６抗体又はヒト化抗ＣＤ３８抗体）を、０．１ｍｇ／ウェルで添加した。二次抗体を、１：７５００で希釈した。ストレプトアビジン－ＨＲＰ及びＴＭＢ基質の添加後に、光学吸光度を、６５０ｎｍで測定した。抗ＣＤ３８抗体は、ヒトＣＤ３８に特異的に結合するが、ヒト化抗ＮＫｐ４６対照抗体は、それに特異的に結合しない。
ＣＤ３８に結合する２つのヒト化抗体を生成した（ＣＤ３８－ＩｇＧ１ Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び野生型ＣＤ３８－ＩｇＧ１）。ヒトＣＤ３８へのヒト化抗体の結合を試験した。ＥＬＩＳＡプレートを、０．１ｍｇ／ウェルのヒトＣＤ３８タンパク質でコーティングした。第１の抗体（ヒト化抗ａＮＫｐ４６抗体又はヒト化抗ＣＤ３８抗体）を、０．１ｍｇ／ウェルで添加した。二次抗体を、１：７５００で希釈した。ストレプトアビジン－ＨＲＰ及びＴＭＢ基質の添加後に、光学吸光度を、６５０ｎｍで測定した。抗ＣＤ３８抗体は、ヒトＣＤ３８に特異的に結合するが、ヒト化抗ＮＫｐ４６対照抗体は、それに特異的に結合しない。
【0270】
実施例５：ヒトＮＫｐ４６及びヒトＣＤ３８に結合する二重特異性抗体分子の生成
ヒトＮＫｐ４６及びＣＤ３８に結合する二重特異性抗体分子を構築した（ＮＫＥ２）。図１３Ａは、二重特異性抗体分子の概略図を示し、二重特異性抗体分子において、ｍＡｂ １は、抗ＮＫｐ４６抗原認識領域を有し、ｍＡｂ ２は、抗ＣＤ３８抗原認識領域を有する。いくつかの場合では、これらの二重特異性抗体分子は、ＮＫ細胞エンゲージャー二重特異性抗体分子である（図１３Ｂ）。ＮＫ細胞エンゲージャー二重特異性抗体は、ＮＫ細胞及び腫瘍細胞の両方に結合することができ、ＮＫ媒介性細胞傷害を媒介することができる。
ヒトＮＫｐ４６及びＣＤ３８に結合する二重特異性抗体分子を構築した（ＮＫＥ２）。図１３Ａは、二重特異性抗体分子の概略図を示し、二重特異性抗体分子において、ｍＡｂ １は、抗ＮＫｐ４６抗原認識領域を有し、ｍＡｂ ２は、抗ＣＤ３８抗原認識領域を有する。いくつかの場合では、これらの二重特異性抗体分子は、ＮＫ細胞エンゲージャー二重特異性抗体分子である（図１３Ｂ）。ＮＫ細胞エンゲージャー二重特異性抗体は、ＮＫ細胞及び腫瘍細胞の両方に結合することができ、ＮＫ媒介性細胞傷害を媒介することができる。
【0271】
ＮＫｐ４６及びＣＤ３８を発現する細胞への二重特異性抗体の結合
３つの異なる細胞型を使用して、ＮＫｐ４６及びＣＤ３８のいずれも発現しないＮＫｐ４６及びＣＤ３８－ＢＷ細胞、ＮＫｐ４６を発現するＢＷ細胞、並びにＣＤ３８を発現するＫＭＳ１１及びＭＭ１．Ｓ ＭＭ細胞株への二重特異性抗体分子の結合を試験した。５０，０００個の細胞を、０．５μｇの抗ＣＤ３８及びＮＫｐ４６二重特異性抗体とともに、又は抗ＣＤ３８抗体とともに、又は抗体なし（対照）で、１時間氷上でインキュベートし、次いで、ＡＦ－６４７コンジュゲート抗ヒト抗体を、更に３０分間添加した。この実験は、二重特異性抗体が、（ＢＷ ＮＫｐ４６アームを使用して）ＮＫｐ４６に結合し、抗ＣＤ３８アームを使用してＫＭＳ１１又はＭＭ１．Ｓ ＭＭ細胞に結合することを示す。
３つの異なる細胞型を使用して、ＮＫｐ４６及びＣＤ３８のいずれも発現しないＮＫｐ４６及びＣＤ３８－ＢＷ細胞、ＮＫｐ４６を発現するＢＷ細胞、並びにＣＤ３８を発現するＫＭＳ１１及びＭＭ１．Ｓ ＭＭ細胞株への二重特異性抗体分子の結合を試験した。５０，０００個の細胞を、０．５μｇの抗ＣＤ３８及びＮＫｐ４６二重特異性抗体とともに、又は抗ＣＤ３８抗体とともに、又は抗体なし（対照）で、１時間氷上でインキュベートし、次いで、ＡＦ－６４７コンジュゲート抗ヒト抗体を、更に３０分間添加した。この実験は、二重特異性抗体が、（ＢＷ ＮＫｐ４６アームを使用して）ＮＫｐ４６に結合し、抗ＣＤ３８アームを使用してＫＭＳ１１又はＭＭ１．Ｓ ＭＭ細胞に結合することを示す。
【0272】
用量依存性結合が、ＭＭ１Ｓ及びＫＭＳ１１多発性骨髄腫細胞へのＮＫＥ２ ＷＴ又はＭｕｔ Ｆｃ（Ｆｃサイレント）の結合で観察され、ＣＤ３８ノックアウトＭＭ．１Ｓ細胞株への結合は観察されなかった（図１４）。同様の結合が、ＢＷ細胞へのＮＫＥ２ ＷＴ及びＭｕｔ Ｆｃの結合で観察された（図１５Ａ及び１５Ｂ）。
【0273】
実施例６：ヒトＮＫｐ４６及びヒトＣＤ３８に結合する二重特異性抗体分子の機能的特徴付け
ＮＫ細胞によるＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１細胞殺滅－放射性アッセイ
ＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１細胞は、ＣＤ３８を発現する。ＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１ ＭＭ細胞が、ＮＫｐ４６及びＣＤ３８に結合する二重特異性抗体の存在下で、ＮＫ細胞によって死滅し得るかを決定するために、ＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１ ＭＭ細胞を、３５Ｓ－メチオニンで放射性標識し、９６プレート内に、５０００個の細胞／ウェルで蒔いた。一次活性化ヒトＮＫ細胞を、ウェルに、異なる量で、異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比（１ウェル当たり１００，０００、５０，０００、２５，０００、及び１２，５００個の細胞、２０：１、１０：１、５：１、及び２．５：１比）で添加した。細胞を、５時間３７℃でインキュベートし、培地を採取し、放射能を、ベータカウンタを使用して決定した。ＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１ ＭＭ細胞を、様々なＥ：Ｔ比での二重特異性抗体の存在下で測定した。
ＮＫ細胞によるＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１細胞殺滅－放射性アッセイ
ＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１細胞は、ＣＤ３８を発現する。ＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１ ＭＭ細胞が、ＮＫｐ４６及びＣＤ３８に結合する二重特異性抗体の存在下で、ＮＫ細胞によって死滅し得るかを決定するために、ＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１ ＭＭ細胞を、３５Ｓ－メチオニンで放射性標識し、９６プレート内に、５０００個の細胞／ウェルで蒔いた。一次活性化ヒトＮＫ細胞を、ウェルに、異なる量で、異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比（１ウェル当たり１００，０００、５０，０００、２５，０００、及び１２，５００個の細胞、２０：１、１０：１、５：１、及び２．５：１比）で添加した。細胞を、５時間３７℃でインキュベートし、培地を採取し、放射能を、ベータカウンタを使用して決定した。ＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１ ＭＭ細胞を、様々なＥ：Ｔ比での二重特異性抗体の存在下で測定した。
【0274】
ＮＫ細胞によるＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１ ＭＭ細胞死滅－脱顆粒アッセイ
異なる量のＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１ ＭＭ細胞を、９６プレート内に蒔いた（５００，０００、２５０，０００、１２５，０００、６２，５００、３１，２５０、１５，６２５、及び７，８００個の細胞／ウェル）。次いで、５０００個の一次活性化ヒトＮＫ細胞を、ａＣＤ５６及びａＣＤ１０７Ａ抗体と一緒に添加した。細胞を、３７℃で２時間インキュベートした。ＮＫ脱顆粒を、ＣＤ５６陽性細胞上のＣＤ１０７のフローサイトメトリー染色によって計算した。細胞を、抗ＮＫｐ４６及び抗ＣＤ３８二重特異性抗体、抗ＮＫｐ４６抗体対照、並びに抗ＣＤ３８抗体対照とともにインキュベートした。示された脱顆粒の百分率は、様々なＥ：Ｔ比での二重特異性抗体において測定された。脱顆粒は、ＮＫ細胞によるＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１ ＭＭ細胞死滅の代理である。したがって、これは、ＮＫｐ４６及びＣＤ３８の両方に結合する二重特異性抗体が、単一特異性抗体単独よりも、ＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１ ＭＭ細胞死滅への増加した機能的効果を有することを示す。
異なる量のＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１ ＭＭ細胞を、９６プレート内に蒔いた（５００，０００、２５０，０００、１２５，０００、６２，５００、３１，２５０、１５，６２５、及び７，８００個の細胞／ウェル）。次いで、５０００個の一次活性化ヒトＮＫ細胞を、ａＣＤ５６及びａＣＤ１０７Ａ抗体と一緒に添加した。細胞を、３７℃で２時間インキュベートした。ＮＫ脱顆粒を、ＣＤ５６陽性細胞上のＣＤ１０７のフローサイトメトリー染色によって計算した。細胞を、抗ＮＫｐ４６及び抗ＣＤ３８二重特異性抗体、抗ＮＫｐ４６抗体対照、並びに抗ＣＤ３８抗体対照とともにインキュベートした。示された脱顆粒の百分率は、様々なＥ：Ｔ比での二重特異性抗体において測定された。脱顆粒は、ＮＫ細胞によるＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１ ＭＭ細胞死滅の代理である。したがって、これは、ＮＫｐ４６及びＣＤ３８の両方に結合する二重特異性抗体が、単一特異性抗体単独よりも、ＫＭＳ１１及びＭＭＳ．１ ＭＭ細胞死滅への増加した機能的効果を有することを示す。
【0275】
実施例７：ヒトＮＫｐ４６及びヒトＣＤ３８に結合する二重特異性抗体分子のインビボ機能的特徴付け
ヒトＭＭ異種移植モデルにおける、ヒトＮＫｐ４６及びＣＤ３８に結合する二重特異性抗体の効果
ルシフェラーゼを発現するＭＭ１．Ｓ細胞（ＭＭ１．Ｓｌｕｃ）を、免疫不全（ＮＳＧ）マウスの尾静脈内に注射し、ルシフェラーゼレベルを、ＩＶＩＳイメージングシステムによって、３又は４日ごとに測定する。ＭＭ１．Ｓ注射の１３日後、精製ヒトＴ細胞を、抗ＮＫｐ４６及びＣＤ３８二重特異性抗体とともに又はなしで、静脈内移植する。腫瘍サイズを低減するために必要とされる、二重特異性抗体の安全量を決定するための用量応答実験を実施する。漸増濃度の二重特異性抗体及び単一特異性抗体（ヒト化ＮＫｐ４６及び抗ＣＤ３８）を、腫瘍を保有するマウス内に注射する。抗体注射は、１週間に２回投与される。４週間の期間、マウスを、毎日監視し（マウスの体重、及び全般的な外観）、それらの腫瘍を、デジタルバーニヤキャリパーによって測定する。人道的エンドポイントは、１ｃｍ３の腫瘍体積又は初期体重から２０％の体重損失に設定される。４週間後に、マウスを屠殺し、腫瘍を、除去し秤量する。腫瘍増殖の有意な阻害（より低い腫瘍体積及び重量）が観察される処置は、成功と考えられる。
ヒトＭＭ異種移植モデルにおける、ヒトＮＫｐ４６及びＣＤ３８に結合する二重特異性抗体の効果
ルシフェラーゼを発現するＭＭ１．Ｓ細胞（ＭＭ１．Ｓｌｕｃ）を、免疫不全（ＮＳＧ）マウスの尾静脈内に注射し、ルシフェラーゼレベルを、ＩＶＩＳイメージングシステムによって、３又は４日ごとに測定する。ＭＭ１．Ｓ注射の１３日後、精製ヒトＴ細胞を、抗ＮＫｐ４６及びＣＤ３８二重特異性抗体とともに又はなしで、静脈内移植する。腫瘍サイズを低減するために必要とされる、二重特異性抗体の安全量を決定するための用量応答実験を実施する。漸増濃度の二重特異性抗体及び単一特異性抗体（ヒト化ＮＫｐ４６及び抗ＣＤ３８）を、腫瘍を保有するマウス内に注射する。抗体注射は、１週間に２回投与される。４週間の期間、マウスを、毎日監視し（マウスの体重、及び全般的な外観）、それらの腫瘍を、デジタルバーニヤキャリパーによって測定する。人道的エンドポイントは、１ｃｍ３の腫瘍体積又は初期体重から２０％の体重損失に設定される。４週間後に、マウスを屠殺し、腫瘍を、除去し秤量する。腫瘍増殖の有意な阻害（より低い腫瘍体積及び重量）が観察される処置は、成功と考えられる。
【0276】
実施例８：新規の多機能四価ＣＤ３８ ＮＫｐ４６ ＦＬＥＸ－ＮＫ（商標）エンゲージャーの特徴付け
ＣＤ３８は、多発性骨髄腫におけるＮＫ細胞媒介性細胞傷害のための臨床的に検証された標的である。ＮＫＥ２は、標的がん細胞及びＮＫ細胞の両方に同時に結合する新規のＦＬＥＸリンカーを有する四価ＩｇＧ１様多機能ＮＫエンゲージャー抗体である。ＮＫ会合及び活性化は、自然細胞傷害受容体ＮＫｐ４６に対して向けられる結合剤を介して媒介される。ＮＫＥ２は、抗ＣＤ３８結合ドメインと、ヒト化０９抗体のＮＫｐ４７結合ドメインと、を含む（配列については、表１～６を参照されたい）。この実施例において、野生型（ＷＴ）Ｆｃを有するもの及び変異型ヌルＦｃを有するものの２つのバージョンのＮＫＥ２を特徴付けた。
ＣＤ３８は、多発性骨髄腫におけるＮＫ細胞媒介性細胞傷害のための臨床的に検証された標的である。ＮＫＥ２は、標的がん細胞及びＮＫ細胞の両方に同時に結合する新規のＦＬＥＸリンカーを有する四価ＩｇＧ１様多機能ＮＫエンゲージャー抗体である。ＮＫ会合及び活性化は、自然細胞傷害受容体ＮＫｐ４６に対して向けられる結合剤を介して媒介される。ＮＫＥ２は、抗ＣＤ３８結合ドメインと、ヒト化０９抗体のＮＫｐ４７結合ドメインと、を含む（配列については、表１～６を参照されたい）。この実施例において、野生型（ＷＴ）Ｆｃを有するもの及び変異型ヌルＦｃを有するものの２つのバージョンのＮＫＥ２を特徴付けた。
【0277】
ＮＫＥ２は、多発性骨髄腫細胞株への用量依存性結合を示した
多発性骨髄腫細胞株ＭＭ１Ｓ及びＫＭＳ１１を発現するＣＤ３８、並びにＣＤ３８ノックアウトＭＭ．１Ｓ細胞株へのＮＫＥ２の結合を決定した。用量依存性結合が、ＭＭ１Ｓ及びＫＭＳ１１多発性骨髄腫細胞へのＮＫＥ２ ＷＴ又はＭｕｔ Ｆｃ（Ｆｃサイレント）の結合で観察され、ＣＤ３８ノックアウトＭＭ．１Ｓ細胞株への結合は観察されなかった（図１４）。
多発性骨髄腫細胞株ＭＭ１Ｓ及びＫＭＳ１１を発現するＣＤ３８、並びにＣＤ３８ノックアウトＭＭ．１Ｓ細胞株へのＮＫＥ２の結合を決定した。用量依存性結合が、ＭＭ１Ｓ及びＫＭＳ１１多発性骨髄腫細胞へのＮＫＥ２ ＷＴ又はＭｕｔ Ｆｃ（Ｆｃサイレント）の結合で観察され、ＣＤ３８ノックアウトＭＭ．１Ｓ細胞株への結合は観察されなかった（図１４）。
【0278】
ＮＫＥ２は、ＮＫ細胞への用量依存性結合を示した
ＢＷ細胞へのＮＫＥ２結合を決定した。ＢＷ親細胞又はヒトＮｋｐ４６トランスフェクトＢＷ細胞を、ＮＫＥ２又は対照ＩｇＧ１とともに、１時間、室温でインキュベートした。次いで、細胞を、二次抗ＩｇＧ１ ＰＥ Ａｂで染色し、結合（抗ＩｇＧ１ ＰＥのＭＦＩ）を、フローサイトメトリーによって測定した。結果を、図１５Ａ及び１５Ｂに示す。同様の結合が、ＢＷ細胞へのＮＫＥ２ ＷＴ及びＭｕｔ Ｆｃの結合で観察された。
ＢＷ細胞へのＮＫＥ２結合を決定した。ＢＷ親細胞又はヒトＮｋｐ４６トランスフェクトＢＷ細胞を、ＮＫＥ２又は対照ＩｇＧ１とともに、１時間、室温でインキュベートした。次いで、細胞を、二次抗ＩｇＧ１ ＰＥ Ａｂで染色し、結合（抗ＩｇＧ１ ＰＥのＭＦＩ）を、フローサイトメトリーによって測定した。結果を、図１５Ａ及び１５Ｂに示す。同様の結合が、ＢＷ細胞へのＮＫＥ２ ＷＴ及びＭｕｔ Ｆｃの結合で観察された。
【0279】
エピトープマッピング研究は、ＮＫＥ２が、ダラツムマブとは異なる部位に結合することを示す
ＣＤ３８アラニンスキャニング変異誘発によるＮＫＥ２エピトープマッピング分析は、ＮＫＥ２が、ダラツムマブとは異なる部位に結合することを示す。結果を、図１６に示す。ＮＫＥ２結合に影響するアラニン変異体は、緑色でハイライトされ、ダラツムマブ結合に影響することが既知の残基は、赤色でハイライトされる（残基Ｓ２３２は、リーダー配列を有するＳ２７４に対応する）。これらのデータは、異なるエピトープがＮＫＥ２によって検出されたことを示唆する。
ＣＤ３８アラニンスキャニング変異誘発によるＮＫＥ２エピトープマッピング分析は、ＮＫＥ２が、ダラツムマブとは異なる部位に結合することを示す。結果を、図１６に示す。ＮＫＥ２結合に影響するアラニン変異体は、緑色でハイライトされ、ダラツムマブ結合に影響することが既知の残基は、赤色でハイライトされる（残基Ｓ２３２は、リーダー配列を有するＳ２７４に対応する）。これらのデータは、異なるエピトープがＮＫＥ２によって検出されたことを示唆する。
【0280】
ＮＫＥ２は、多発性骨髄腫細胞株の用量依存性ＰＢＮＫリダイレクト細胞溶解を示した。
ＰＢＮＫ細胞傷害アッセイを、漸増ＮＫＥ２濃度で、５の固定Ｅ／Ｔ比で２０時間評価し、標的細胞溶解を、フローサイトメトリーによって評価した。結果を、図１７Ａ～１７Ｃに示す。ＫＭＳ１１及びＭＭ１Ｓ多発性骨髄腫細胞のＮＫＥ２用量依存性ＰＢＮＫリダイレクト細胞溶解は、最小の細胞溶解がＭＭ１ＳＣＤ３８ＫＯ細胞で観察されたため、ＣＤ３８発現に依存した。ＮＫＥ２ ＷＴ－Ｆｃは、ＮＫＥ２ Ｆｃ変異体比較してわずかにより高い細胞溶解を示した。
ＰＢＮＫ細胞傷害アッセイを、漸増ＮＫＥ２濃度で、５の固定Ｅ／Ｔ比で２０時間評価し、標的細胞溶解を、フローサイトメトリーによって評価した。結果を、図１７Ａ～１７Ｃに示す。ＫＭＳ１１及びＭＭ１Ｓ多発性骨髄腫細胞のＮＫＥ２用量依存性ＰＢＮＫリダイレクト細胞溶解は、最小の細胞溶解がＭＭ１ＳＣＤ３８ＫＯ細胞で観察されたため、ＣＤ３８発現に依存した。ＮＫＥ２ ＷＴ－Ｆｃは、ＮＫＥ２ Ｆｃ変異体比較してわずかにより高い細胞溶解を示した。
【0281】
多発性骨髄腫ＭＭ１Ｓ細胞に対するＮＫＥ２ ＰＢ－ＮＫ細胞リダイレクト細胞溶解、脱顆粒、及びサイトカイン産生
ＰＢ－ＮＫ細胞溶解を、様々な濃度のＮＫＥ２で、１の固定Ｅ／Ｔ比で２４時間決定し、標的溶解を、フローサイトメトリーによって分析した。ＰＢＮＫ脱顆粒を、１のＥ／Ｔ比で５時間評価し、フローサイトメトリーによって、抗ＣＤ１０７ａ抗体を使用して評価した。結果を、図１８Ａに示す。ＮＫＥ２は、ダラツムマブ又は単一のＣＤ３８及びＮＫｐ４６ ｍＡｂと比較して、多発性骨髄腫ＭＭ１Ｓ細胞に対する著しくより高い用量依存性ＰＢ－ＮＫ細胞リダイレクト細胞溶解及び脱顆粒を示した。これらの結果は、ＮＫＥ２による、対向するＮＫ及びＭＭ細胞上のＮＫｐ４６及びＣＤ３８の共会合が、このＮＫ細胞エンゲージャーによって観察されるより高い効力に寄与することを示す。興味深いことに、機能的Ｆｃを有さないＮＫｐ４６ ｍＡｂ単独は、多発性骨髄腫細胞の末梢血ＮＫ細胞細胞溶解を誘導し、これは、ＮＫｐ４６が骨髄腫細胞のＮＫ細胞媒介性死滅において重要な役割を果たすという以前の報告と一致した。
ＰＢ－ＮＫ細胞溶解を、様々な濃度のＮＫＥ２で、１の固定Ｅ／Ｔ比で２４時間決定し、標的溶解を、フローサイトメトリーによって分析した。ＰＢＮＫ脱顆粒を、１のＥ／Ｔ比で５時間評価し、フローサイトメトリーによって、抗ＣＤ１０７ａ抗体を使用して評価した。結果を、図１８Ａに示す。ＮＫＥ２は、ダラツムマブ又は単一のＣＤ３８及びＮＫｐ４６ ｍＡｂと比較して、多発性骨髄腫ＭＭ１Ｓ細胞に対する著しくより高い用量依存性ＰＢ－ＮＫ細胞リダイレクト細胞溶解及び脱顆粒を示した。これらの結果は、ＮＫＥ２による、対向するＮＫ及びＭＭ細胞上のＮＫｐ４６及びＣＤ３８の共会合が、このＮＫ細胞エンゲージャーによって観察されるより高い効力に寄与することを示す。興味深いことに、機能的Ｆｃを有さないＮＫｐ４６ ｍＡｂ単独は、多発性骨髄腫細胞の末梢血ＮＫ細胞細胞溶解を誘導し、これは、ＮＫｐ４６が骨髄腫細胞のＮＫ細胞媒介性死滅において重要な役割を果たすという以前の報告と一致した。
【0282】
サイトカイン産生を、フローサイトメトリーによるＩＦＮ－ｇ及びＴＮＦ－ａについての細胞内染色によって評価した。結果を、図１８Ｂに示す。ＮＫＥ２はまた、ＭＭ細胞とともに、１のＥ／Ｔ比で５時間インキュベートされた後に、ダラツムマブ並びに単一のＣＤ３８及びＮＫｐ４６ ｍＡｂと比較してより高い％のＩＦＮ－ｇ及びＴＮＦ－ａ産生ＰＢＮＫ細胞を誘導した。
【0283】
ＮＫＥ２は、インビトロでのヒトＰＢＭＣにおいて、著しい免疫サブセット枯渇を示さず、低いレベルのＮＫ細胞フラトリサイド及びサイトカイン放出を示した
ＮＫ細胞フラトリサイドを、精製ＰＢＮＫを使用して、ＮＫＥ２又はダラツムマブ又はヒトＩｇＧの存在下で、フローサイトメトリーによって、ｌｉｖｅ ｄｅａｄ細胞染料を使用して評価した。結果を、図１９Ａに示す。ダラツムマブは、ＮＫＥ２ ＷＴ及びＮＫＥ２ ＭＵＴと比較して、ＰＢＮＫ細胞のより高いフラトリサイドを示した。
ＮＫ細胞フラトリサイドを、精製ＰＢＮＫを使用して、ＮＫＥ２又はダラツムマブ又はヒトＩｇＧの存在下で、フローサイトメトリーによって、ｌｉｖｅ ｄｅａｄ細胞染料を使用して評価した。結果を、図１９Ａに示す。ダラツムマブは、ＮＫＥ２ ＷＴ及びＮＫＥ２ ＭＵＴと比較して、ＰＢＮＫ細胞のより高いフラトリサイドを示した。
【0284】
ヒトＰＢＭＣ免疫細胞サブセット枯渇へのＮＫＥ２の効果を、ＮＫＥ２又はダラツムマブ又はｈＩｇＧ１とともに、２４時間インキュベートし、続いて、フローサイトメトリーによる免疫サブセット分析を行うことによって評価した。結果を、図１９Ｂに示す。ダラツムマブは、ＮＫ細胞及び単球の枯渇を示したが、最小の免疫細胞枯渇が、ＮＫＥ２ ＷＴ及びＮＫＥ２ ＭＵＴで観察された。
【0285】
ＮＫＥ２がサイトカイン放出を誘導する潜在性を、ヒトＰＢＭＣアッセイにおいて、ＮＫＥ２、又は抗ＣＤ３若しくはＣＤ２８ ｍＡｂ（ＴＧＮ１４１２）、又はｈＩｇＧ１とともに、４８時間インキュベートし、続いて、上清を、サイトカインの存在について、多重ＥＬＩＳＡアッセイによって試験することによって評価した。結果を、図１９Ｃに示す。堅牢なサイトカイン放出が、抗ＣＤ３及びＣＤ２８（ＴＧＮ１４１２）ｍＡｂで観察されたが、最小のサイトカイン放出が、ＮＫＥ２で観察された。
【0286】
結論
この実施例において考察される結果は、ＣＤ３８ ＮＫｐ４６エンゲージャーが、ダラツムマブとは異なる、多発性骨髄腫を発現するＣＤ３８を標的とするのに好都合なＮＫ細胞エンゲージャープロファイルを有することを示唆する。
この実施例において考察される結果は、ＣＤ３８ ＮＫｐ４６エンゲージャーが、ダラツムマブとは異なる、多発性骨髄腫を発現するＣＤ３８を標的とするのに好都合なＮＫ細胞エンゲージャープロファイルを有することを示唆する。
【0287】
参照による組み込み
本明細書に記載される全ての刊行物、特許、及び受託番号は、各個々の刊行物又は特許が、具体的かつ個々に、参照により組み込まれることが示されるかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される全ての刊行物、特許、及び受託番号は、各個々の刊行物又は特許が、具体的かつ個々に、参照により組み込まれることが示されるかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0288】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明とともに記載されているが、上記の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を例示しかつ限定しないことが意図されている。他の態様、利点、及び修正形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明は、その詳細な説明とともに記載されているが、上記の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を例示しかつ限定しないことが意図されている。他の態様、利点、及び修正形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図10-4】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図19B】
【図19C-1】
【図19C-2】
【配列表】
【国際調査報告】