特表2024-513474異種ポリペプチドを発現する細胞クローンを選択するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-25
(54)【発明の名称】異種ポリペプチドを発現する細胞クローンを選択するための方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20240315BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20240315BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D
C12Q1/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023561675
(86)(22)【出願日】2022-04-07
(85)【翻訳文提出日】2023-10-19
(86)【国際出願番号】 EP2022059173
(87)【国際公開番号】W WO2022214565
(87)【国際公開日】2022-10-13
(31)【優先権主張番号】21167535.0
(32)【優先日】2021-04-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21192298.4
(32)【優先日】2021-08-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】グロスコフ トビアス
(72)【発明者】
【氏名】ヴェッツラー クセニア
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ13
4B063QQ96
4B063QR48
4B063QR66
4B063QS33
4B063QX01
(57)【要約】
本明細書では、高力価及び低レベルの抗体関連副産物を有する二重特異性抗体を発現する組換え細胞クローンの特徴付け及び同定並びに選択のための新規でハイスループットな好適な方法を報告する。本発明による方法は、抗体のそれぞれの標的への個別の結合及び同時結合についての組換え細胞クローン培養上清のイムノアッセイに基づくスクリーニングの結合シグナルを使用する。このデータは、所望の産物プロファイルを有する高産生細胞クローンの選択を可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の抗原及び第２の抗原に結合する同じ組換え二重特異性抗体をすべてが発現する多数の組換え細胞クローンから１つ又は複数の組換え細胞クローンを選択するための方法であって、以下の工程：－ 前記多数の組換え細胞クローンの各単一沈着組換え細胞クローンを培養して、培養上清を産生する工程；
－ 以下を決定する工程：
ｉ）前記上清中の総抗体濃度；
ｉｉ）４つの異なる濃度の前記上清についてのイムノアッセイにおける前記二重特異性抗体の前記第１の抗原への結合についての、各上清の結合シグナル；
ｉｉｉ）ｉｉ）における場合と同じ４つの濃度の前記上清についてのイムノアッセイにおける前記二重特異性抗体の前記第２の抗原への結合についての、各上清の結合シグナル；
ｉｖ）ｉｉ）における場合と同じ４つの濃度の前記上清についてのイムノアッセイにおける前記二重特異性抗体の前記第１の抗原及び前記第２の抗原への同時結合についての、各上清の結合シグナル；
ｖ）１４の異なる濃度の前記二重特異性抗体についての、それぞれｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）における場合と同じイムノアッセイでの前記第１の抗原、前記第２の抗原、及び両方の抗原への結合についての単離された二重特異性抗体の結合シグナル；
ｖｉ）前記組換え細胞クローンによっても発現される第１の単離された二重特異性抗体関連副産物の結合シグナルであって、ｖ）における場合と同じ１４の濃度の前記第１の二重特異性抗体関連副産物の、それぞれｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）における場合と同じイムノアッセイでの前記第１の抗原、前記第２の抗原、及び両方の抗原への結合についての、結合シグナル；
ｖｉｉ）前記組換え細胞クローンによっても発現される第２の単離された二重特異性抗体関連副産物の結合シグナルであって、ｖ）における場合と同じ１４の濃度の前記第２の二重特異性抗体関連副産物の、それぞれｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）における場合と同じイムノアッセイでの前記第１の抗原、前記第２の抗原、及び両方の抗原への結合についての、結合シグナル；
－ 以下の値：
－ ｉ）の前記濃度、
－ ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）の前記結合シグナル、
－ ｉｉｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｉｉ）の前記イムノアッセイを用いてｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）の前記イムノアッセイを用いてｖ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの、
－ ｉｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｖ）の前記イムノアッセイを用いてｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）の前記イムノアッセイを用いてｖ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの、
－ ｉｉｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｉｉ）の前記イムノアッセイを用いてｖｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）の前記イムノアッセイを用いてｖｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの、並びに
－ ｉｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｖ）の前記イムノアッセイを用いてｖｉｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）の前記イムノアッセイを用いてｖｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの
に基づいて、前記多数の組換え細胞クローンの前記組換え細胞クローンをランク付けする工程であって、
前記ランク付けが、前記単離された二重特異性抗体について得られた値に対する各個々の細胞クローンについての上記の値のそれぞれの差によるものである、工程
を含み、
全体的な差が最も小さい組換え細胞クローンが選択される、方法。
【請求項2】
前記差がインシリコ法を用いて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記差が機械学習を用いて決定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記差が極端な勾配ブースティングモデルを用いて決定される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記選択が、前記濃度、前記結合シグナル、及び前記二重特異性抗体の除算した比に関する最小の差と、前記副産物の除算した比に関する最大の差との組み合わせに基づく、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記１つ又は複数の選択された細胞クローンが、前記多数の組換え細胞クローンの平均として抗体関連副産物の割合がより低い前記組換え二重特異性抗体を発現する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記二重特異性抗体が、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含み、一方のＦｃ領域ポリペプチドがノブ突然変異を含み、それぞれの他方のＦｃ領域ポリペプチドがホール突然変異を含み；前記第１の二重特異性抗体関連副産物が、前記二重特異性抗体のホール・ホールのホモ二量体であり；前記第２の二重特異性抗体関連副産物が、前記二重特異性抗体のノブ・ノブのホモ二量体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記イムノアッセイが酵素結合免疫吸着測定法である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
二重特異性抗体関連副産物が少ない二重特異性抗体を発現する組換え細胞クローンを同定するための、ｉ）前記二重特異性抗体をコードする核酸で組換え細胞クローンがトランスフェクトされた単一の組換え細胞クローン培養上清中で決定された総抗体濃度、
ｉｉ）前記二重特異性抗体の第１の抗原及び第２の抗原への前記上清の個別の結合についての結合シグナル、
ｉｉｉ）前記二重特異性抗体の前記第１の抗原及び前記第２の抗原への前記上清の同時結合についての結合シグナル
の使用。
【請求項11】
ｉｖ）単離された二重特異性抗体）のその第１の抗原及び第２の抗原への個別の結合及び同時結合についての結合シグナル、ｖ）前記二重特異性抗体の前記第１の抗原及び前記第２の抗原への第１の単離された二重特異性抗体関連副産物の個別の結合及び同時結合についての結合シグナル、
ｖｉ）前記二重特異性抗体の前記第１の抗原及び前記第２の抗原への第２の単離された二重特異性抗体関連副産物の個別の結合及び同時結合についての結合シグナル
が、二重特異性抗体関連副産物が少ない前記二重特異性抗体を発現する組換え細胞クローンを同定するためにさらに使用される、請求項１０に記載の使用。
【請求項12】
－ ｉｉｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｉｉ）の前記イムノアッセイを用いてｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）の前記イムノアッセイを用いてｖ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの、－ ｉｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｖ）の前記イムノアッセイを用いてｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）の前記イムノアッセイを用いてｖ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの、
－ ｉｉｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｉｉ）の前記イムノアッセイを用いてｖｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）の前記イムノアッセイを用いてｖｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの、並びに
－ ｉｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｖ）の前記イムノアッセイを用いてｖｉｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）の前記イムノアッセイを用いてｖｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの
が、二重特異性抗体関連副産物が少ない前記二重特異性抗体を発現する組換え細胞クローンを同定するためにさらに使用され、
ｉｖ）が、前記二重特異性抗体のその第１の抗原及び第２の抗原への個別の結合及び同時結合についての結合シグナルであり、
ｖ）が、前記二重特異性抗体の前記第１の抗原及び前記第２の抗原への第１の単離された二重特異性抗体関連副産物の個別の結合及び同時結合についての結合シグナルであり、
ｖｉ）が、前記二重特異性抗体の前記第１の抗原及び前記第２の抗原への第２の単離された二重特異性抗体関連副産物の個別の結合及び同時結合についての結合シグナルである、
請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項13】
コンピュータ又はコンピュータネットワーク上でプログラムが実行される場合に請求項１～９のいずれか一項に記載の方法を実施するためのコンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータプログラム。
【請求項14】
プログラムがコンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行される場合に請求項１～９のいずれか一項に記載の方法を実行するために、プログラムコード手段を有する、コンピュータプログラム製品。
【請求項15】
コンピュータ又はコンピュータネットワークの作業メモリ又はメインメモリなど、コンピュータ又はコンピュータネットワークへとロードされた後に、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法を実行し得る、そこに格納されたデータ構造を有するデータキャリア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞株作製の分野に関する。より正確には、本明細書では、ＥＬＩＳＡベースのデータを使用して、大量の正しく組み立てられ機能する異種ポリペプチドを発現する細胞クローンを選択する方法が報告される。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
近年、抗体及び抗体ベースの分子などの組換えポリペプチドは、疾患処置の分野で広く応用されている。
近年、抗体及び抗体ベースの分子などの組換えポリペプチドは、疾患処置の分野で広く応用されている。
【0003】
特に抗体に関して、天然に存在するＩｇＧフォーマットを含む抗体ベースの薬物の第１の波の後、次世代のフォーマットは現在ますます、古典的なＩｇＧ抗体フォーマットからの実質的な改変及び誘導体を有する分子がみられる。２つ以上の抗原を連続的に又は同時に標的化することが望まれると、ますます複雑な抗体フォーマットがもたらされる。フォーマットの複雑さが増すにつれて、例えば鎖の誤対合などの可能性のある抗体関連副産物の数が増加する。
【0004】
市場への途中の治療用抗体の１つの工程は、組換えタンパク質の良好な品質と組み合わせた高発現、すなわち抗体関連副産物の含有量が低いことを特徴とする安定な産生細胞株の開発である。一般に、複雑なフォーマットの抗体空間における新規な薬物分子の探索は、細胞株開発中の低容量での、特に単一クローンレベルでの産物品質及び機能を評価するためのハイスループットアッセイの欠如によってボトルネックとなっている。
【0005】
したがって、トランスフェクション後に得られた多数の細胞クローンのうち、正しく組み立てられた複雑な抗体を産生することができる稀な細胞クローンを同定するためには、必要なサンプル体積が少ないハイスループット法が必要である。そのような方法は、スクリーニングをより初期の段階に移行させる能力を提供し、それによって、より多くのモノクローナル細胞クローンを特徴付け、それによって評価することができる。これは、高品質グレードの複雑なフォーマットの抗体を産生することができる例外的な細胞クローンを同定する確率を高め、それによって技術的成功の確率を高め、同時に商品のコストを最小限に抑える。
【0006】
Ｓａｗｙｅｒ，Ｗ．Ｓ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１７（２０２０）９８５１－９８５６）（非特許文献１）は、インタクトタンパク質エレクトロスプレー質量分析を使用する複合マトリックスからのハイスループット抗体スクリーニングを報告した。
【0007】
国際公開第２０１６／１７２４８５号（特許文献１）は、多重特異性抗原結合タンパク質を報告した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開第２０１６／１７２４８５号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｓａｗｙｅｒ，Ｗ．Ｓ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１７（２０２０）９８５１－９８５６）
【発明の概要】
【0010】
本明細書では、高力価及び低レベルの抗体関連副産物を有する複雑な抗体フォーマットを発現する組換え細胞クローンの特徴付け及び同定並びに選択のための新規でハイスループットな好適な方法を報告する。本発明による方法は、抗体のそれぞれの標的への個別の結合及び同時結合についての組換え細胞クローン培養上清のイムノアッセイに基づくスクリーニングの結合シグナルを使用する。このデータは、初めて、５００以上のクローンの段階で所望の産物プロファイルを有する高産生細胞クローンの選択を可能にする。
【0011】
本発明の一態様は、少なくとも二重特異性であり、第１の抗原及び第２の抗原に（特異的に）結合する同じ（組換え）（治療用）抗体をすべてが発現する多数（一実施形態では少なくとも５００）の組換え細胞クローンから、１つ又は複数の組換え細胞クローンを同定及び／又は選択する方法であって、以下の工程：
－ 各単一沈着組換え細胞クローンを（少なくとも５日間）培養して、培養上清を産生する工程；
－ 以下を決定する工程：
ｉ）上清中の総タンパク質（特定の実施形態では、抗体）濃度（イムノアッセイを使用）；
ｉｉ）少なくとも２つ、好ましい一実施形態では（少なくとも）４つの異なる濃度の上清についてのイムノアッセイにおける（治療用）抗体の第１の抗原への結合についての、各上清の結合シグナル；
ｉｉｉ）ｉｉ）における場合と同じ少なくとも２つ、好ましい一実施形態では（少なくとも）４つの濃度の上清についてのイムノアッセイにおける（治療用）抗体の第２の抗原への結合についての、各上清の結合シグナル；
ｉｖ）ｉｉ）及びｉｉｉ）における場合と同じ少なくとも２つ、好ましい一実施形態では（少なくとも）４つの濃度の上清についての（架橋）イムノアッセイにおける（治療用）抗体の第１の抗原及び第２の抗原への同時結合についての、各上清の結合シグナル；
ｖ）少なくとも４つ、好ましい一実施形態では少なくとも１４の異なる濃度の（単離された）（治療用）抗体についての、それぞれｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）における場合と同じイムノアッセイでの第１の抗原及び第２の抗原への個別の結合並びに両方の抗原への同時結合についての（単離された）（治療用）抗体（質量分析によって決定して少なくとも９８％の純度を有する）についての結合シグナル；
ｖｉ）ｖ）における場合と同じ少なくとも４つ、好ましい一実施形態では少なくとも１４の濃度の第１の（主要／主な）（治療用）抗体関連副産物の、それぞれｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）における場合と同じイムノアッセイでの第１の抗原及び第２の抗原への個別の結合並びに両方の抗原への同時結合についての、前記細胞クローンによっても発現され得る／発現される第１の（主要／主な）（単離された）（治療用）抗体関連副産物（質量分析によって決定して少なくとも７０％の純度を有する）についての結合シグナル；
ｖｉｉ）ｖ）及びｖｉ）における場合と同じ少なくとも４つ、好ましい一実施形態では少なくとも１４の濃度の第２の（第２の主要）（治療用）抗体関連副産物の、それぞれｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）における場合と同じイムノアッセイでの第１の抗原及び第２の抗原への個別の結合並びに両方の抗原への同時結合についての、前記細胞クローンによっても発現され得る／発現される第２の（第２の主要）（単離された）（治療用）抗体関連副産物（質量分析によって決定して少なくとも７０％の純度を有する）についての結合シグナル；
－ 以下：
－ ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、及び
－ 同じ濃度についてｉｉｉ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値（この中央値は、同じ濃度についてｉｉｉ）のイムノアッセイを使用してｖ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを使用してｖ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値でさらに除算（正規化）される）、及び
－ 同じ濃度についてｉｖ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値（この中央値は、同じ濃度についてｉｖ）のイムノアッセイを使用してｖ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを使用してｖ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値でさらに除算（正規化）される）、及び
－ 同じ濃度についてｉｉｉ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値（この中央値は、同じ濃度についてｉｉｉ）のイムノアッセイを使用してｖｉ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを使用してｖｉ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値でさらに除算（正規化）される）、及び
－ 同じ濃度についてｉｖ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値（この中央値は、同じ濃度についてｉｉｉ）のイムノアッセイを使用してｖｉｉ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを使用してｖｉｉ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値でさらに除算（正規化）される）
（単一の個々の次元）
に基づいて多数の組換え細胞クローンの組換え細胞クローンをランク付けする工程であって、
ランク付けは、単離された（治療用）抗体について得られた値に対する各個々の細胞クローンについての上記の値のそれぞれの差によるものである、多数の組換え細胞クローンの組換え細胞クローンをランク付けする工程
を含み、
全体的な差が最も小さい組換え細胞クローンが選択される、方法である。
－ 各単一沈着組換え細胞クローンを（少なくとも５日間）培養して、培養上清を産生する工程；
－ 以下を決定する工程：
ｉ）上清中の総タンパク質（特定の実施形態では、抗体）濃度（イムノアッセイを使用）；
ｉｉ）少なくとも２つ、好ましい一実施形態では（少なくとも）４つの異なる濃度の上清についてのイムノアッセイにおける（治療用）抗体の第１の抗原への結合についての、各上清の結合シグナル；
ｉｉｉ）ｉｉ）における場合と同じ少なくとも２つ、好ましい一実施形態では（少なくとも）４つの濃度の上清についてのイムノアッセイにおける（治療用）抗体の第２の抗原への結合についての、各上清の結合シグナル；
ｉｖ）ｉｉ）及びｉｉｉ）における場合と同じ少なくとも２つ、好ましい一実施形態では（少なくとも）４つの濃度の上清についての（架橋）イムノアッセイにおける（治療用）抗体の第１の抗原及び第２の抗原への同時結合についての、各上清の結合シグナル；
ｖ）少なくとも４つ、好ましい一実施形態では少なくとも１４の異なる濃度の（単離された）（治療用）抗体についての、それぞれｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）における場合と同じイムノアッセイでの第１の抗原及び第２の抗原への個別の結合並びに両方の抗原への同時結合についての（単離された）（治療用）抗体（質量分析によって決定して少なくとも９８％の純度を有する）についての結合シグナル；
ｖｉ）ｖ）における場合と同じ少なくとも４つ、好ましい一実施形態では少なくとも１４の濃度の第１の（主要／主な）（治療用）抗体関連副産物の、それぞれｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）における場合と同じイムノアッセイでの第１の抗原及び第２の抗原への個別の結合並びに両方の抗原への同時結合についての、前記細胞クローンによっても発現され得る／発現される第１の（主要／主な）（単離された）（治療用）抗体関連副産物（質量分析によって決定して少なくとも７０％の純度を有する）についての結合シグナル；
ｖｉｉ）ｖ）及びｖｉ）における場合と同じ少なくとも４つ、好ましい一実施形態では少なくとも１４の濃度の第２の（第２の主要）（治療用）抗体関連副産物の、それぞれｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）における場合と同じイムノアッセイでの第１の抗原及び第２の抗原への個別の結合並びに両方の抗原への同時結合についての、前記細胞クローンによっても発現され得る／発現される第２の（第２の主要）（単離された）（治療用）抗体関連副産物（質量分析によって決定して少なくとも７０％の純度を有する）についての結合シグナル；
－ 以下：
－ ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、及び
－ 同じ濃度についてｉｉｉ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値（この中央値は、同じ濃度についてｉｉｉ）のイムノアッセイを使用してｖ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを使用してｖ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値でさらに除算（正規化）される）、及び
－ 同じ濃度についてｉｖ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値（この中央値は、同じ濃度についてｉｖ）のイムノアッセイを使用してｖ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを使用してｖ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値でさらに除算（正規化）される）、及び
－ 同じ濃度についてｉｉｉ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値（この中央値は、同じ濃度についてｉｉｉ）のイムノアッセイを使用してｖｉ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを使用してｖｉ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値でさらに除算（正規化）される）、及び
－ 同じ濃度についてｉｖ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値（この中央値は、同じ濃度についてｉｉｉ）のイムノアッセイを使用してｖｉｉ）で決定された結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを使用してｖｉｉ）で決定された結合シグナルとの比（すべて）の中央値でさらに除算（正規化）される）
（単一の個々の次元）
に基づいて多数の組換え細胞クローンの組換え細胞クローンをランク付けする工程であって、
ランク付けは、単離された（治療用）抗体について得られた値に対する各個々の細胞クローンについての上記の値のそれぞれの差によるものである、多数の組換え細胞クローンの組換え細胞クローンをランク付けする工程
を含み、
全体的な差が最も小さい組換え細胞クローンが選択される、方法である。
【0012】
特定の実施形態では、ランク付けは、ｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）のアッセイにおいてｖ）で使用される単離された（治療用）抗体について得られたそれぞれの値に対する各個々の細胞クローンについてのこれらの値のそれぞれの（絶対）差（距離）及びそれに由来する比によるものである。
【0013】
特定の実施形態では、ランク付けは、各個々の値（次元）についての個々の（絶対）距離を考慮に入れた（多次元ランク付け）、すなわち、第１（主要）の単離された（治療用）抗体関連副産物及び第２（第２の主要）の単離された（治療用）抗体関連副産物に対する非類似性（最大（絶対）差）と組み合わせた（単離された）（治療用）抗体についての値に対する類似性（最小（絶対）差）の組み合わせに基づく。
【0014】
特定の実施形態では、選択は、濃度、結合シグナル及び（治療用）抗体の除算した比に関する最小の差と、副産物の除算した比に関する最大の差との組み合わせに基づく。
【0015】
特定の実施形態では、全体的に、すなわちすべての個々の次元において、（絶対）差（距離）が最も小さい組換え細胞クローンが同定／選択され、すなわち、８個の差すべての合計が最も小さいクローンが同定／選択される。
【0016】
特定の実施形態では、１つ又は複数の同定／選択された細胞クローンは、多数の組換え細胞クローンの平均として抗体関連副産物の分率又は割合がより低い前記組換え（治療用）抗体を発現する。
【0017】
特定の実施形態では、差（距離）は、インシリコ法を用いて決定される。
【0018】
特定の実施形態では、差（距離）は、機械学習を用いて決定される。
【0019】
特定の実施形態では、差（距離）は、極端な勾配ブースティングモデルを用いて決定される。
【0020】
特定の実施形態では、結合シグナルは、ブランク補正された結合シグナル（それぞれのブランクシグナルによって減じた生の結合シグナル）である。
【0021】
特定の実施形態では、ｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）において、少なくとも４つの濃度が使用される。特定の実施形態では、ｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）において、４又は５又は６又は７の濃度が使用される。
【0022】
特定の実施形態では、ｖ）、ｖｉ）及びｖｉｉ）において、少なくとも１４の濃度が使用される。特定の実施形態では、ｖ）、ｖｉ）及びｖｉｉ）において、１４又は１５又は１６又は１７又は１８の濃度が使用される。
【0023】
特定の実施形態では、二重特異性（治療用）抗体は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含み、一方のＦｃ領域ポリペプチドがノブ突然変異を含み、それぞれの他方のＦｃ領域ポリペプチドがホール突然変異を含み；第１の（主要）二重特異性（治療用）抗体関連副産物は、前記二重特異性（治療用）抗体のホール・ホールのホモ二量体であり；第２の（第２の主要）二重特異性（治療用）抗体関連副産物は、前記二重特異性（治療用）抗体のノブ・ノブのホモ二量体である。
【0024】
特定の実施形態では、イムノアッセイは、酵素結合免疫吸着測定法である。
【0025】
特定の実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。
【0026】
好ましい一実施形態では、（治療用）抗体は二重特異性（治療用）抗体である。特定の実施形態では、二重特異性（治療用）抗体は、その重鎖に関してヘテロ二量体であり、重鎖の一方はホール突然変異を含み、それぞれの他方はノブ突然変異を含む。特定の実施形態では、第１の（主要／主な）（単離された）（治療用）抗体関連副産物は、それぞれがホール突然変異を有する２つの重鎖を含み、第２の（第２の主要）（単離された）（治療用）抗体関連副産物は、それぞれがノブ突然変異を有する２つの重鎖を含む。
【0027】
本発明のさらなる態様は、二重特異性抗体関連副産物が少ない前記二重特異性（治療用）抗体を発現する組換え細胞クローンを同定するための、
ｉ）二重特異性（治療用）抗体をコードする核酸で組換え細胞クローンがトランスフェクトされた単一の組換え細胞クローン培養上清中で決定された総抗体濃度、
ｉｉ）二重特異性（治療用）抗体の第１の抗原及び第２の抗原への上清の個別の結合についての結合シグナル、
ｉｉｉ）二重特異性（治療用）抗体の第１の抗原及び第２の抗原への上清の同時結合についての結合シグナル
の使用である。
ｉ）二重特異性（治療用）抗体をコードする核酸で組換え細胞クローンがトランスフェクトされた単一の組換え細胞クローン培養上清中で決定された総抗体濃度、
ｉｉ）二重特異性（治療用）抗体の第１の抗原及び第２の抗原への上清の個別の結合についての結合シグナル、
ｉｉｉ）二重特異性（治療用）抗体の第１の抗原及び第２の抗原への上清の同時結合についての結合シグナル
の使用である。
【0028】
特定の実施形態では、
ｉｖ）二重特異性（治療用）抗体のその第１の抗原及び第２の抗原への個別の結合及び同時結合についての結合シグナル、
ｖ）二重特異性（治療用）抗体の第１の抗原及び第２の抗原への第１の（主要）二重特異性抗体関連副産物の個別の結合及び同時結合についての結合シグナル、
ｖｉ）二重特異性（治療用）抗体の第１の抗原及び第２の抗原への第２の（第２の主要）二重特異性抗体関連副産物の個別の結合及び同時結合についての結合シグナル
が、二重特異性抗体関連副産物が少ない前記二重特異性（治療用）抗体を発現する組換え細胞クローンを同定するためにさらに使用される。
ｉｖ）二重特異性（治療用）抗体のその第１の抗原及び第２の抗原への個別の結合及び同時結合についての結合シグナル、
ｖ）二重特異性（治療用）抗体の第１の抗原及び第２の抗原への第１の（主要）二重特異性抗体関連副産物の個別の結合及び同時結合についての結合シグナル、
ｖｉ）二重特異性（治療用）抗体の第１の抗原及び第２の抗原への第２の（第２の主要）二重特異性抗体関連副産物の個別の結合及び同時結合についての結合シグナル
が、二重特異性抗体関連副産物が少ない前記二重特異性（治療用）抗体を発現する組換え細胞クローンを同定するためにさらに使用される。
【0029】
特定の実施形態では、
－ ｉｉｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｉｉ）のイムノアッセイを用いてｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを用いてｖ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの、
－ ｉｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｖ）のイムノアッセイを用いてｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを用いてｖ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの、
－ ｉｉｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｉｉ）のイムノアッセイを用いてｖｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを用いてｖｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの、並びに
－ ｉｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｖ）のイムノアッセイを用いてｖｉｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを用いてｖｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの
が、二重特異性抗体関連副産物が少ない前記二重特異性（治療用）抗体を発現する組換え細胞クローンを同定するためにさらに使用され、
ｉｖ）が、二重特異性（治療用）抗体のその第１の抗原及び第２の抗原への個別の結合及び同時結合についての結合シグナルであり、
ｖ）が、二重特異性（治療用）抗体の第１の抗原及び第２の抗原への第１の（主要）二重特異性抗体関連副産物の個別の結合及び同時結合についての結合シグナルであり、
ｖｉ）が、二重特異性（治療用）抗体の第１の抗原及び第２の抗原への第２の（第２の主要）二重特異性抗体関連副産物の個別の結合及び同時結合についての結合シグナルである。
－ ｉｉｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｉｉ）のイムノアッセイを用いてｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを用いてｖ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの、
－ ｉｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｖ）のイムノアッセイを用いてｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを用いてｖ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの、
－ ｉｉｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｉｉ）のイムノアッセイを用いてｖｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを用いてｖｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの、並びに
－ ｉｖ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値を、ｉｖ）のイムノアッセイを用いてｖｉｉ）で得られたそれぞれの濃度についての結合シグナルと、ｉｉ）のイムノアッセイを用いてｖｉｉ）で得られた同じ濃度についてのそれぞれの結合シグナルとの個々の比の中央値で割ったもの
が、二重特異性抗体関連副産物が少ない前記二重特異性（治療用）抗体を発現する組換え細胞クローンを同定するためにさらに使用され、
ｉｖ）が、二重特異性（治療用）抗体のその第１の抗原及び第２の抗原への個別の結合及び同時結合についての結合シグナルであり、
ｖ）が、二重特異性（治療用）抗体の第１の抗原及び第２の抗原への第１の（主要）二重特異性抗体関連副産物の個別の結合及び同時結合についての結合シグナルであり、
ｖｉ）が、二重特異性（治療用）抗体の第１の抗原及び第２の抗原への第２の（第２の主要）二重特異性抗体関連副産物の個別の結合及び同時結合についての結合シグナルである。
【0030】
本発明のさらなる態様は、コンピュータ又はコンピュータネットワーク上でプログラムが実行される場合に本発明による方法を実施するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータプログラムである。
【0031】
本発明のさらなる態様は、プログラムがコンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行される場合に本発明による方法を実行するために、プログラムコード手段を有するコンピュータプログラム製品である。
【0032】
本発明のさらなる態様は、コンピュータ又はコンピュータネットワークの作業メモリ又はメインメモリなどのコンピュータ又はコンピュータネットワークへとロードされた後に、本発明による方法を実行し得るデータ構造を格納したデータキャリアである。
【0033】
描写され、特許請求される様々な実施形態に加えて、本開示の主題は、本明細書に開示され、特許請求される特徴の他の組合せを有する他の実施形態も対象とする。したがって、本明細書に提示される、特に態様又は実施形態として提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組み合わせを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組み合わせられ得る。本開示の主題の特定の実施形態の前述の説明は、例示及び説明目的のために提示されている。包括的であるようにも本開示の主題を開示される実施形態に限定するようにも意図されていない。
【0034】
本明細書で使用される態様は、本発明の独立した主題に関し、本明細書で使用される実施形態は、１つ又は複数又はすべての独立した態様のより詳細な実現を提供する。
【発明を実施するための形態】
【0035】
発明の詳細な説明
本発明は、ＥＬＩＳＡに基づく力価及び結合特性評価を使用して、薬物開発の細胞株開発段階中の少なくとも５００クローン段階で個々のクローンの重要な品質属性を予測するために使用できるという知見に少なくとも部分的に基づく。
本発明は、ＥＬＩＳＡに基づく力価及び結合特性評価を使用して、薬物開発の細胞株開発段階中の少なくとも５００クローン段階で個々のクローンの重要な品質属性を予測するために使用できるという知見に少なくとも部分的に基づく。
【0036】
本発明はさらに、ＥＬＩＳＡに基づく力価及び結合特性評価とインシリコデータ分析との組み合わせを使用して、薬物開発の細胞株開発段階中の少なくとも５００クローン段階で個々のクローンの重要な品質属性を予測することができるという知見に少なくとも部分的に基づく。
【0037】
したがって、本発明による方法では、分析することができるクローンの数が増加し、分析時間が短縮され、同時に再現性及び適用の容易さが増加する。それにより、特に複雑な抗体フォーマットについて、細胞株開発中の早期に産物品質スクリーニングを実施することが初めて可能になる。
【0038】
一般的な定義
本発明を実施するための有用な方法及び技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉ～ＩＩＩ巻（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ巻及びＩＩ巻（１９８５），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ．），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。
本発明を実施するための有用な方法及び技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉ～ＩＩＩ巻（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ巻及びＩＩ巻（１９８５），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ．），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。
【0039】
組換えＤＮＡ技術を使用することにより、核酸の誘導体の作製が可能になる。このような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失又は挿入によって、個々の又はいくつかのヌクレオチド位置で修飾することができる。修飾又は誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって行うことができる。このような修飾は、当業者によって容易に行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照）。
【0040】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈において特に明白な規定がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のそのような細胞、及び当業者に公知であるその等価物を含み、他も同様である。同様に、用語「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ又は複数の」、及び「少なくとも１つの」も、本明細書において同義的に使用され得る。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」が同義的に使用され得ることにも留意すべきである。
【0041】
用語「約」は、その後に続く数値の±２０％の範囲を意味する。特定の実施形態では、「約」という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を意味する。特定の実施形態では、「約」という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を意味する。
【0042】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も含む。
【0043】
細胞特有の定義
本明細書で使用される「細胞クローン」という用語は、ポリペプチドを発現することができる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞、すなわち組換え哺乳動物細胞を意味する。そのような組換え哺乳動物細胞は、そのような細胞の子孫を含む、１つ以上の外因性核酸（複数可）が導入された細胞である。特定の実施形態では、細胞クローンが、異種ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞である。したがって、「異種ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞クローン」という用語は、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み、異種ポリペプチドを発現することができる組換え哺乳動物細胞を意味する。特定の実施形態では、細胞クローンは、細胞のゲノムの遺伝子座内の単一部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞である。好ましい一実施形態では、細胞クローンは、細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞であり、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列及び第２の組換え認識配列、並びに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列との間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なっている。
本明細書で使用される「細胞クローン」という用語は、ポリペプチドを発現することができる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞、すなわち組換え哺乳動物細胞を意味する。そのような組換え哺乳動物細胞は、そのような細胞の子孫を含む、１つ以上の外因性核酸（複数可）が導入された細胞である。特定の実施形態では、細胞クローンが、異種ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞である。したがって、「異種ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞クローン」という用語は、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み、異種ポリペプチドを発現することができる組換え哺乳動物細胞を意味する。特定の実施形態では、細胞クローンは、細胞のゲノムの遺伝子座内の単一部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞である。好ましい一実施形態では、細胞クローンは、細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞であり、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列及び第２の組換え認識配列、並びに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列との間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なっている。
【0044】
本明細書で使用される「組換え細胞」という用語は、遺伝子修飾後の細胞、例えば、目的の異種ポリペプチドを発現し、該目的のポリペプチドの任意の規模での生産のために使用できる細胞などを意味する。例えば、「細胞クローン」は、目的の異種ポリペプチドのコード配列がゲノムに導入されている細胞を示す。例えば、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）に供され、それによって目的のポリペプチドのコード配列が宿主細胞のゲノム中に導入された「外因性ヌクレオチド配列を含む組換え哺乳動物細胞」は、特定の「細胞クローン」である。
【0045】
本明細書で使用される「細胞クローン」は、「形質転換細胞」を示す。これは、継代の回数に関わらず、初代形質転換細胞も、それに由来する子孫も含む。子孫は、例えば、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではなくてもいが、突然変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物活性を有している突然変異子孫は、包含される。
【0046】
「単離された細胞クローン」は、その天然環境の構成要素から分離された細胞クローンを示す。
【0047】
「単離された核酸」は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を示す。
【0048】
「単離されたポリペプチド」又は「単離された抗体」又は「単離された副産物」は、それぞれ、その天然環境の構成要素から分離されたポリペプチド分子又は抗体分子を示す。特定の実施形態では、単離されたポリペプチド又は単離された抗体又は単離された副産物は、例えば、質量分析によって決定して７０％を超える純度まで精製される。特定の実施形態では、単離されたポリペプチド又は単離された抗体又は単離された副産物は、例えば、質量分析によって決定して９５％又は９８％を超える純度まで精製される。抗体の純度を評価するための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ ８４８（２００７）７９－８７を参照されたい。
【0049】
アッセイ
異なるイムノアッセイの原理は、例えば、Ｈａｇｅ，Ｄ．Ｓ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１（１９９９）２９４Ｒ－３０４Ｒ）に記載されている。Ｌｕ，Ｂ．ら（Ａｎａｌｙｓｔ １２１（１９９６）２９Ｒ－３２Ｒ）は、イムノアッセイに使用するための抗体の配向固定化を報告している。アビジン－ビオチン媒介イムノアッセイは、例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋ，Ｍ．，ａｎｄ Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８４（１９９０）４６７－４６９に報告されている。
異なるイムノアッセイの原理は、例えば、Ｈａｇｅ，Ｄ．Ｓ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１（１９９９）２９４Ｒ－３０４Ｒ）に記載されている。Ｌｕ，Ｂ．ら（Ａｎａｌｙｓｔ １２１（１９９６）２９Ｒ－３２Ｒ）は、イムノアッセイに使用するための抗体の配向固定化を報告している。アビジン－ビオチン媒介イムノアッセイは、例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋ，Ｍ．，ａｎｄ Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８４（１９９０）４６７－４６９に報告されている。
【0050】
「イムノアッセイ」という用語は、抗体などの特異的に結合する分子を利用して、定性分析又は定量分析のための特異的標的を捕捉及び／又は検出する任意の技術を表す。一般的に、イムノアッセイは、以下の工程を特徴とする。１）分析物の固定化又は捕捉の工程及び、２）分析物の検出及び測定の工程。分析物は、例えば膜、プラスチックプレート、又は他の何らかの固体表面などの任意の固体表面上に捕捉され得る、すなわち結合され得る。イムノアッセイの具体的な形態は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）である。
【0051】
一般に、イムノアッセイは、３つの異なるフォーマットで行うことができる。１つは直接検出によるもの、１つは間接検出によるもの、又はサンドイッチアッセイによるものである。
【0052】
直接検出イムノアッセイは、直接測定することができる検出（又はトレーサー）抗体を使用する。酵素又は他の分子は、シグナルを可視化又は測定することを可能にする色、蛍光又は発光を生成するシグナルの生成を可能にする（今日では一般的に使用されていないが、放射性同位元素も使用することができる。）。
【0053】
間接アッセイでは、分析物に結合する一次抗体を使用して、一次抗体によって提供される標的に特異的に結合する二次抗体（トレーサー抗体）のための定義された標的を提供する（検出器又はトレーサー抗体と呼ばれる）。二次抗体は、測定可能なシグナルを生成する。
【0054】
サンドイッチアッセイは、捕捉抗体及びトレーサー（検出器）抗体の２つの抗体を利用する。捕捉抗体は、溶液からの分析物に結合（固定化）するため、又は溶液中で分析物に結合するために使用される。これにより、検体をサンプルから特異的に除去することができる。トレーサー（検出器）抗体を第２の工程で使用して、シグナルを生成する（上記のように直接的又は間接的のいずれかで）。サンドイッチフォーマットは、それぞれが標的分子上に異なるエピトープを有する２つの抗体を必要とする。さらに、両方の抗体が同時に標的に結合しなければならないので、それらは互いに干渉してはならない。
【0055】
モノクローナル抗体及びそれらの定常ドメインは、ポリペプチド／タンパク質、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、セルロース又はポリスチロール）、又は酵素などの結合対のメンバーに結合するためのいくつかの反応性アミノ酸側鎖を含む。アミノ酸の化学反応性基は、例えば、アミノ基（リシン、アルファ－アミノ基）、チオール基（シスチン、システイン及びメチオニン）、カルボン酸基（アスパラギン酸、グルタミン酸）、及び糖アルコール基である。そのような方法は、例えば、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｒｅｆ．Ｌｔｄ．，１９９９，ｐａｇｅｓ ５０－１００に記載されている。
【0056】
抗体の最も一般的な反応基の１つは、アミノ酸リジンの脂肪族ε－アミンである。一般に、ほぼ全ての抗体は豊富なリジンを含有する。リジンアミンは、ｐＨ８．０（ｐＫａ＝９．１８）を超えると適度に良好な求核剤であるため、様々な試薬と容易かつ清浄に反応して安定な結合を形成する。アミン反応性試薬は、主にリシン及びタンパク質のα－アミノ基と反応する。反応性エステル、特にＮ－ヒドロキシ－スクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、アミン基の修飾のために最も一般的に使用される試薬の１つである。水性環境下での反応に最適なｐＨはｐＨ８．０～９．０である。イソチオシアネートはアミン修飾試薬であり、タンパク質とチオ尿素結合を形成する。それらは、水溶液中のタンパク質アミン（最適にはｐＨ９．０～９．５で）と反応する。アルデヒドは、穏やかな水性条件下で脂肪族及び芳香族アミン、ヒドラジン、及びヒドラジドと反応して、イミン中間体（シッフ塩基）を形成する。シッフ塩基は、穏やかな又は強い還元剤（水素化ホウ素ナトリウム又はシアノ水素化ホウ素ナトリウムなど）で選択的に還元されて、安定なアルキルアミン結合を誘導することができる。アミンを修飾するために使用されている他の試薬は、酸無水物である。例えば、ジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）は、２つのアミン反応性無水物基を含有する二官能性キレート剤である。これは、アミノ酸のＮ末端及びε－アミン基と反応してアミド結合を形成し得る。無水物環は開環して、配位錯体中の金属に強く結合することができる多価の金属キレート化アームを生成する。
【0057】
抗体における別の一般的な反応基は、硫黄含有アミノ酸シスチン及びその還元生成物システイン（又は半シスチン）からのチオール残基である。システインは、アミンよりも求核性であり、一般にタンパク質中で最も反応性の官能基である遊離チオール基を含有する。チオールは一般に中性ｐＨで反応性であるため、アミンの存在下で他の分子に選択的に結合することができる。遊離スルフヒドリル基は比較的反応性であるため、これらの基を有するタンパク質は、ジスルフィド基又はジスルフィド結合としてそれらの酸化形態で存在することが多い。そのようなタンパク質では、反応性遊離チオールを生成するためにジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの試薬によるジスルフィド結合の還元が必要である。チオール反応性試薬は、ポリペプチド上のチオール基に結合してチオエーテル結合生成物を形成する試薬である。これらの試薬は、わずかな酸性から中性のｐＨで迅速に反応し、したがってアミン基の存在下で選択的に反応することができる。文献は、トラウト試薬（２－イミノチオラン）、スクシンイミジル（アセチルチオ）アセテート（ＳＡＴＡ）及びスルホスクシンイミジル６－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏ－ＬＣ－ＳＰＤＰ）などのいくつかのチオール化架橋試薬の使用を報告して、反応性アミノ基を介して複数のスルフヒドリル基を導入する効率的な方法を提供する。ハロアセチル誘導体、例えばヨードアセトアミドは、チオエーテル結合を形成し、チオール修飾のための試薬でもある。さらなる有用な試薬はマレイミドである。マレイミドとチオール反応性試薬との反応は、ヨードアセトアミドと本質的に同じである。マレイミドは、わずかな酸性から中性のｐＨで迅速に反応する。
【0058】
抗体における別の一般的な反応基はカルボン酸である。抗体は、Ｃ末端位置及びアスパラギン酸及びグルタミン酸の側鎖内にカルボン酸基を含有する。水中のカルボン酸の比較的低い反応性は、通常、ポリペプチド及び抗体を選択的に修飾するためにこれらの基を使用することを困難にする。この際、カルボン酸基は、通常、水溶性カルボジイミドを用いて反応性エステルに変換され、アミン、ヒドラジド、ヒドラジン等の求核試薬と反応する。アミン含有試薬は、リジンのより高度に塩基性のε－アミンの存在下で活性化カルボン酸と選択的に反応して安定なアミド結合を形成するために、弱塩基性でなければならない。ｐＨが８．０を超えて上昇すると、タンパク質架橋が起こり得る。
【0059】
過ヨウ素酸ナトリウムを使用して、抗体に結合した炭水化物部分内の糖のアルコール部分をアルデヒドに酸化することができる。各アルデヒド基は、カルボン酸について記載されるように、アミン、ヒドラジド、又はヒドラジンと反応させることができる。炭水化物部分は主に抗体の結晶化可能な断片領域（Ｆｃ領域）上に見出されるので、抗原結合部位から離れた炭水化物の部位特異的修飾によってコンジュゲーションを達成することができる。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（穏やかで選択的）又は水素化ホウ素ナトリウム（強い）水溶性還元剤による中間体の還元によってアルキルアミンに還元することができるシッフ塩基中間体が形成される。
【0060】
トレーサー及び／又は捕捉及び／又は検出抗体とそのコンジュゲーションパートナーとのコンジュゲーションは、化学結合又は結合対を介した結合などの異なる方法によって行うことができる。本明細書で使用される「コンジュゲーションパートナー」という用語は、例えば固体支持体、ポリペプチド、検出可能な標識、特異的結合対のメンバーを示す。特定の実施形態では、捕捉及び／又はトレーサ及び／又は検出抗体とその結合パートナーとの結合は、Ｎ末端及び／又はε－アミノ基（リジン）、異なるリジンのε－アミノ基、抗体のアミノ酸骨格のカルボキシ－、スルフヒドリル－、ヒドロキシル－、及び／又はフェノール官能基、並びに／あるいは抗体の炭水化物構造の糖アルコール基を介して化学的に結合することによって行われる。特定の実施形態では、捕捉抗体は、結合対を介してそのコンジュゲーションパートナーにコンジュゲートされる。１つの好ましい実施形態では、捕捉抗体はビオチンにコンジュゲート化され、固体支持体への固定化は、アビジン又はストレプトアビジンが固定化された固体支持体を介して行われる。特定の実施形態では、トレーサー抗体は、結合対を介してそのコンジュゲーションパートナーにコンジュゲートされる。好ましい一実施形態では、トレーサー抗体は、検出可能な標識として共有結合によってジゴキシゲニンにコンジュゲートされる。
【0061】
「固相」は非流体物質を表し、ポリマー、金属（常磁性、強磁性粒子）、ガラス、及びセラミックなどの材料から作られた粒子（マイクロ粒子及びビーズを含む）；シリカ、アルミナ、及びポリマーゲルなどのゲル物質；ポリマー、金属、ガラス、及び／又はセラミックから作られていてもよい、キャピラリー；ゼオライト及び他の多孔性物質；電極；マイクロタイタープレート；固体ストリップ；並びにキュベット、チューブ又は他の分光計サンプル容器が挙げられる。固相成分は、「固相」がその表面にサンプル中の物質と相互作用することを意図した少なくとも１つの部分を含むという点で、不活性固体表面とは区別される。固相は、チップ、チューブ、ストリップ、キュベット、若しくはマイクロタイタープレートなどの静止した成分であってもよく、又はビーズ及びマイクロ粒子などの静止していない成分であってもよい。タンパク質及び他の物質の非共有結合又は共有結合の両方を可能にする様々な微小粒子が、使用されてよい。このような粒子には、ポリスチレン及びポリ（メチルメタクリレート）などのポリマー粒子が含まれ；金ナノ粒子、金コロイド等の金粒子；シリカ、ガラス、金属酸化物粒子などのセラミック粒子などが挙げられる。例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．Ｒ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ｎｅｗｓ＆Ｆｅａｔｕｒｅｓ，７０（１９９８）３２２Ａ－３２７Ａ、又はＢｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ２２（２０００）４－２３を参照されたい。
【0062】
色素原（蛍光又は発光基及び色素）、酵素、ＮＭＲ活性基又は金属粒子、ハプテン、例えばジゴキシゲニンは、「検出可能な標識」の例である。検出可能な標識はまた、光活性化可能な架橋基、例えばアジド又はアジリン基であり得る。電気化学発光によって検出することができる金属キレートもシグナル放出基であり、ルテニウムキレート、例えばルテニウム（ビスピリジル）３
２＋キレートが特に好ましい。適切なルテニウム標識基は、例えば、ＥＰ０５８０９７９、国際公開第９０／０５３０１号、国際公開第９０／１１５１１号及び国際公開第９２／１４１３８号に記載されている。直接検出のために、標識基は、任意の既知の検出可能なマーカー基、例えば色素、発光標識基、例えば化学発光基、例えばアクリジニウムエステル若しくはジオキセタン、又は蛍光色素、例えばフルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニン及びそれらの誘導体から選択し得る。標識基の他の例は、ルテニウム又はユーロピウム錯体などの発光金属錯体、例えばＥＬＩＳＡ又はＣＥＤＩＡ（クローニングされた酵素ドナーイムノアッセイ、例えば、ＥＰ－Ａ－００６１８８８）に使用される酵素、及び放射性同位体である。
【0063】
間接検出システムは、例えば、検出試薬、例えば検出抗体が結合対の第１のパートナーで標識されることを含む。適切な結合対の例は、抗原／抗体、ビオチン又はビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチン又はデスチオビオチン／アビジン又はストレプトアビジン、糖／レクチン、核酸又は核酸類似体／相補的核酸、及び受容体／リガンド、例えばステロイドホルモン受容体／ステロイドホルモンである。好ましい一実施形態では、第１の結合対メンバーは、ハプテン、抗原及びホルモンを含む。特定の実施形態では、ハプテンは、ジゴキシン、ジゴキシゲニン及びビオチン並びにそれらの類似体からなる群から選択される。そのような結合対の第２のパートナー、例えば抗体、ストレプトアビジンなどは、通常、例えば上記のような標識による直接検出を可能にするように標識される。
【0064】
抗体
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられる。
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられる。
【0065】
本明細書において使用される場合、重鎖及び軽鎖のすべての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）において説明されるＫａｂａｔナンバリングシステムによりナンバリングされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによるナンバリング」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔナンバリングシステム（６４７～６６０頁を参照）を、カッパアイソタイプ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３頁を参照）を、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、本明細書では、この場合には、「ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング」と称することによってさらに明確にしている）に使用する。
【0066】
本明細書での「抗体」という用語は、最も広義に使用され、完全長抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体－抗体断片－融合物並びにそれらの組み合わせを含む様々な抗体構造を包含するが、これらに限定されない。
【0067】
「天然抗体」という用語は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）とそれに続く３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有し、それにより、第１の重鎖定常ドメインと第２の重鎖定常ドメインとの間にヒンジ領域が配置される。同様に、ＮからＣ末端に、各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）とそれに続く軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。
【0068】
「完全長抗体」という用語は、天然抗体の構造と実質的に類似した構造を有する抗体を意味する。完全長抗体は、それぞれがＮ末端からＣ末端の方向に、軽鎖可変領域及び軽鎖定常ドメインを含む２つの完全長抗体軽鎖、並びにそれぞれがＮ末端からＣ末端の方向に、重鎖可変領域、第１の重鎖定常ドメイン、ヒンジ領域、第２の重鎖定常ドメイン、及び第３の重鎖定常ドメインを含む、２つの完全長抗体重鎖を含む。天然抗体とは対照的に、完全長抗体は、１つ若しくは複数の追加のｓｃＦｖ、又は重鎖若しくは軽鎖Ｆａｂ断片、又は、完全長抗体の異なる鎖の１つ若しくは複数の末端にコンジュゲートしているが各末端には１つの断片のみであるｓｃＦａｂなどのさらなる免疫グロブリンドメインを含んでもよい。これらのコンジュゲートもまた、完全長抗体という用語により包含される。
【0069】
「抗体結合部位」という用語は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの対を意味する。抗原への適切な結合を確実にするために、これらの可変ドメインは同族の可変ドメインであり、すなわち一緒に属する。抗体の結合部位は、少なくとも３つのＨＶＲ（例えば、ＶＨＨの場合）又は３～６つのＨＶＲ（例えば、天然に存在する、すなわち、ＶＨ／ＶＬペアを有する従来の抗体の場合）を含む。一般に、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基が、結合部位を形成している。これらの残基は通常、抗体重鎖可変ドメインと対応する抗体軽鎖可変ドメインのペアに含まれる。抗体の抗原結合部位は、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、ＮからＣ末端に向けて、領域ＦＲ１、ＨＶＲ１、ＦＲ２、ＨＶＲ２、ＦＲ３、ＨＶＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖可変ドメインのＨＶＲ３領域は、抗原結合に最も寄与し、抗体の結合特異性を定義する領域である。「機能的結合部位」は、その標的に結合することができる。「結合する」という用語は、インビトロアッセイにおいて、特定の実施形態では結合アッセイにおいて、その標的への結合部位の結合を表す。そのような結合アッセイは、結合イベントが検出され得る限り、任意のアッセイであり得る。「結合」は、例えばＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定することができる。
【0070】
「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、超可変的な配列（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）であり、及び／又は構造的に定義されるループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原に接触する残基（「抗原接触」）を含有するアミノ酸残基ストレッチを含む、抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、重鎖可変ドメインＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、軽鎖可変ドメインＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。
【0071】
ＨＶＲには、次のものが含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）９０１－９１７）、
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２）、
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）及び９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２～７４５（１９９６））；並びに
（ｄ）アミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）、及び９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組合せ。
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）９０１－９１７）、
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２）、
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）及び９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２～７４５（１９９６））；並びに
（ｄ）アミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）、及び９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組合せ。
【0072】
別段の指示がない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、上記のＫａｂａｔらに従ってナンバリングされている。
【0073】
抗体の「クラス」は、定常ドメイン又は定常領域、好ましくは重鎖が持つＦｃ領域の種類を指す。抗体には、以下の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかを、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【0074】
「重鎖定常領域」という用語は、定常ドメイン、すなわち、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖の領域を意味する。一実施形態において、ヒトＩｇＧ定常領域は、重鎖のＡｌａ１１８からカルボキシル末端に及ぶ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。しかし、定常領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、又は存在していなくてもよい（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。「定常領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる２つの重鎖定常領域を含む二量体を意味する。
【0075】
「重鎖Ｆｃ領域」という用語は、少なくともヒンジ領域の一部、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＡｓｐ２２１又はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０からカルボキシル末端に及ぶ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。したがって、Ｆｃ領域は定常領域よりも小さいが、Ｃ末端部分はそれと同一である。しかしながら、重鎖Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよく、又は存在しなくてもよい（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。「Ｆｃ領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる２つの重鎖Ｆｃ領域を含む二量体を意味する。
【0076】
「価数」という用語は、本出願内で使用される場合、抗体内の特定数の結合部位の存在を意味する。したがって、「二価」、「四価」及び「六価」との用語は、抗体内のそれぞれ２個の結合部位、４個の結合部位及び６個の結合部位の存在を示す。
【0077】
「単一特異性抗体」は、単一の結合特異性を有する、すなわち、１つの抗原に特異的に結合する抗体を意味する。単一特異性抗体を、完全長抗体若しくは抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）又はそれらの組合せ（例えば、完全長抗体と追加のｓｃＦｖ又はＦａｂ断片）として調製することができる。単一特異性抗体は、一価である必要はない。すなわち、単一特異性抗体は、１つの抗原に特異的に結合する１つを超える結合部位を含んでもよい。例えば、天然抗体は、単一特異性であるが二価である。
【0078】
「多重特異性抗体」は、同じ抗原又は２つの異なる抗原上の少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を表す。多重特異性抗体は、完全長抗体若しくは抗体断片（例えば、Ｆａｂ二重特異性抗体）又はそれらの組み合わせ（抗体－抗体断片－融合物、例えば、追加のｓｃＦｖ又はＦａｂ断片にコンジュゲートされた完全長抗体）として調製することができる。多重特異性抗体は、少なくとも二価であり、すなわち、２つの抗原結合部位を含む。さらに、多重特異性抗体は、少なくとも二重特異性である。したがって、二価の二重特異性抗体は、多重特異性抗体の最も単純な形態である。２つ、３つ又はより多く（例えば、４つ）の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体が報告されている（例えば、ＵＳ ２００２／０００４５８７を参照）。
【0079】
特定の実施形態では、細胞クローンは、多重特異性抗体を産生する。ある特定の実施形態において、結合特異性の一方は、第１の抗原に対するものであり、他方は、異なる第２の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、多重特異性抗体は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合する。特定の実施形態では、同じ抗原上の第２のエピトープは、重複しないエピトープである。特定の実施形態において、抗体は、二重特異性抗体である。好ましい一実施形態では、二重特異性抗体は、三価二重特異性抗体又は二価二重特異性抗体である。
【0080】
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．及びＣｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ３０５（１９８３）５３７－５４０、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０（１９９１）３６５５－３６５９を参照されたい）、及び「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の改変（国際公開第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体若しくは断片の架橋（例えば、米国特許第４６７６９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（１９８５）８１－８３を参照のこと）；ロイシンジッパーを使用した二重特異的抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（１９９２）１５４７－１５５３を参照のこと）；軽鎖のミスペアリング問題を回避するための、一般的な軽鎖技術の使用（例えば国際公開第９８／５０４３１号を参照のこと）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）６４４４－６４４８を参照のこと）；及び、例えばＴｕｔｔ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）６０－６９に記載されている三重特異的抗体の調製により作製することができる。
【0081】
例えば、「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む３つ以上の抗原結合部位を有する操作された抗体、又はＤＶＤ－Ｉｇも本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号及び国際公開第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、ＷＯ ２０１０／１１５５８９、ＷＯ ２０１０／１１２１９３、ＷＯ ２０１０／１３６１７２、ＷＯ ２０１０／１４５７９２、及びＷＯ ２０１３／０２６８３１に見出すことができる。二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、「二重作用Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」もまた含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号及び国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照のこと）。
【0082】
多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の１つ又は複数の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称の形で、すなわちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号及び国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（国際公開第２００９／０８０２５３号を参照）又は完全なＦａｂアーム（国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８（２０１１）１１８７－１１９１、及びＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－１０２０も参照）を交換することによっても提供され得る。
【0083】
１つの好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているＦａｂ断片を含み、すなわち、一方の鎖では、重鎖ＶＨ可変ドメインは、軽鎖ＣＬ定常ドメインに直接又はペプチドリンカーを介してコンジュゲートされており、それぞれの他方の鎖では、軽鎖ＶＬ可変ドメインは、重鎖ＣＨ１定常ドメインに直接又はペプチドリンカーを介してコンジュゲートされている。
【0084】
したがって、ドメイン交換されたＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域１（ＣＨ１）から構成されるポリペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるポリペプチド鎖とを含む。
【0085】
非対称Ｆａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸突然変異をドメインインターフェースに導入して正しいＦａｂペアリングを指示することによって操作することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照。
【0086】
抗体又は断片はまた、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号又は国際公開第２０１０／１４５７９３号に記載されている多重特異性抗体であり得る。
【0087】
抗体又はその断片はまた、国際公開第２０１２／１６３５２０号に開示されるような多重特異性抗体であってもよい。
【0088】
多重特異性抗体の様々なさらなる分子フォーマットが当技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）９５－１０６を参照のこと）。
【0089】
二重特異性抗体は、一般に、同じ抗原上の２つの異なる重複しないエピトープ又は異なる抗原上の２つのエピトープに特異的に結合する抗体分子である。
【0090】
特定の実施形態では、二重特異性抗体は、
ドメイン交換された１＋１二重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ）
（第１のＦａｂ断片を含む第１の軽鎖と第１重鎖との対、並びに第２のＦａｂ断片を含む第２の軽鎖と第２重鎖との対を含む二重特異性完全長ＩｇＧ抗体であって、
第１のＦａｂ断片において、
ａ）ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインのみが互いに置き換えられているか（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨドメイン及びＣＬドメインを含む）；
ｂ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインのみが互いに置き換えられているか（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨドメイン及びＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含む）；又は
ｃ）ＣＨ１とＣＬドメイン及びＶＨとＶＬドメインが互いに置き換えられており（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＬドメインを含む）；
第２のＦａｂ断片は、ＶＬ及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含み；
第１の重鎖及び第２重鎖は両方ともＣＨ３ドメインを含み、両方のＣＨ３ドメインは、第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために、それぞれのアミノ酸置換によって相補的に操作される（１つの好ましい実施形態では、一方ＣＨ３ドメインはノブ突然変異を含み、それぞれの他方のＣＨ３ドメインはホール突然変異を含む）、二重特異性完全長ＩｇＧ抗体；
Ｃ末端Ｆａｂドメイン融合２＋１二重特異性抗体（ＢＳ）
（以下：
ａ）完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体、及び
ｂ）１つの追加のＦａｂ断断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、１つの追加のＦａｂ断断片
を含む、二重特異性完全長ＩｇＧ抗体であって、
第２の抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片が、ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられているか、又はｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含む、二重特異性完全長ＩｇＧ抗体）；
二重特異性１アーム一本鎖抗体
（第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む二重特異性１アーム一本鎖抗体であって、個々の鎖は以下のとおり：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む）；
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ（Ｎ末端からＣ末端の順に、可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びノブ又はホール突然変異を有するＣＨ３を含む）
－ 重鎖（Ｎ末端からＣ末端の順に、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール又はノブ突然変異を有するＣＨ３ドメインを含む）である、二重特異性１アーム一本鎖抗体）；
二重特異性２アーム一本鎖抗体
（第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む二重特異性２アーム一本鎖抗体であって、個々の鎖は以下のとおり：
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ１（Ｎ末端からＣ末端の順に、可変軽鎖ドメイン１、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン１、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ノブ又はホール突然変異を有するＣＨ３ドメインを含む）；
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ２（Ｎ末端からＣ末端の順に、可変軽鎖ドメイン２、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン２、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール又はノブ突然変異を有するＣＨ３ドメインを含む）である、二重特異性２アーム一本鎖抗体）；
共通の軽鎖二重特異性抗体
（第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む共通の軽鎖二重特異性抗体であって、個々の鎖は以下のとおり：
－ 軽鎖（Ｎ末端からＣ末端の順に、可変軽鎖ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む）；
－ 重鎖１（Ｎ末端からＣ末端の順に、可変重鎖ドメイン１、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール又はノブ突然変異を有するＣＨ３ドメインを含む）；
－ 重鎖２（Ｎ末端からＣ末端の順に、可変重鎖ドメイン２、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ノブ又はホール突然変異を有するＣＨ３ドメインを含む）である、共通の軽鎖二重特異性抗体）；
Ｎ末端Ｆａｂドメインが挿入２＋１二重特異性抗体（ＴＣＢ）
（ドメイン交換を伴う追加の重鎖Ｎ末端結合部位を有する二重特異性完全長抗体であって、
－ 第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片であって、第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片の各結合部位が第１の抗原に特異的に結合する、第１及び第２のＦａｂ断片、
－ 第３のＦａｂ断片であって、第３のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合し、第３のＦａｂ断片が、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片、及び
－ Ｆｃ領域であって、第１のＦｃ領域のポリペプチドと第２のＦｃ領域のポリペプチドとを含む、Ｆｃ領域
を含み、
第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片は、それぞれ、重鎖断片及び完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている、二重特異性完全長抗体）；
抗体－多量体融合物
（融合ポリペプチドであって、
（ａ）抗体重鎖及び抗体軽鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメイン又は抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、又は第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドと
を含み、
（ｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ｂ）の第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ａ）の抗体軽鎖、及び（ｉｉｉ）（ｂ）の第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の第２の融合ポリペプチドが、それぞれ独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
抗体重鎖及び抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、融合ポリペプチド）。
からなる二重特異性抗体の群から選択される。
ドメイン交換された１＋１二重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ）
（第１のＦａｂ断片を含む第１の軽鎖と第１重鎖との対、並びに第２のＦａｂ断片を含む第２の軽鎖と第２重鎖との対を含む二重特異性完全長ＩｇＧ抗体であって、
第１のＦａｂ断片において、
ａ）ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインのみが互いに置き換えられているか（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨドメイン及びＣＬドメインを含む）；
ｂ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインのみが互いに置き換えられているか（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨドメイン及びＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含む）；又は
ｃ）ＣＨ１とＣＬドメイン及びＶＨとＶＬドメインが互いに置き換えられており（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＬドメインを含む）；
第２のＦａｂ断片は、ＶＬ及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含み；
第１の重鎖及び第２重鎖は両方ともＣＨ３ドメインを含み、両方のＣＨ３ドメインは、第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために、それぞれのアミノ酸置換によって相補的に操作される（１つの好ましい実施形態では、一方ＣＨ３ドメインはノブ突然変異を含み、それぞれの他方のＣＨ３ドメインはホール突然変異を含む）、二重特異性完全長ＩｇＧ抗体；
Ｃ末端Ｆａｂドメイン融合２＋１二重特異性抗体（ＢＳ）
（以下：
ａ）完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体、及び
ｂ）１つの追加のＦａｂ断断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、１つの追加のＦａｂ断断片
を含む、二重特異性完全長ＩｇＧ抗体であって、
第２の抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片が、ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられているか、又はｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含む、二重特異性完全長ＩｇＧ抗体）；
二重特異性１アーム一本鎖抗体
（第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む二重特異性１アーム一本鎖抗体であって、個々の鎖は以下のとおり：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む）；
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ（Ｎ末端からＣ末端の順に、可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びノブ又はホール突然変異を有するＣＨ３を含む）
－ 重鎖（Ｎ末端からＣ末端の順に、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール又はノブ突然変異を有するＣＨ３ドメインを含む）である、二重特異性１アーム一本鎖抗体）；
二重特異性２アーム一本鎖抗体
（第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む二重特異性２アーム一本鎖抗体であって、個々の鎖は以下のとおり：
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ１（Ｎ末端からＣ末端の順に、可変軽鎖ドメイン１、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン１、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ノブ又はホール突然変異を有するＣＨ３ドメインを含む）；
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ２（Ｎ末端からＣ末端の順に、可変軽鎖ドメイン２、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン２、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール又はノブ突然変異を有するＣＨ３ドメインを含む）である、二重特異性２アーム一本鎖抗体）；
共通の軽鎖二重特異性抗体
（第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む共通の軽鎖二重特異性抗体であって、個々の鎖は以下のとおり：
－ 軽鎖（Ｎ末端からＣ末端の順に、可変軽鎖ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む）；
－ 重鎖１（Ｎ末端からＣ末端の順に、可変重鎖ドメイン１、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール又はノブ突然変異を有するＣＨ３ドメインを含む）；
－ 重鎖２（Ｎ末端からＣ末端の順に、可変重鎖ドメイン２、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ノブ又はホール突然変異を有するＣＨ３ドメインを含む）である、共通の軽鎖二重特異性抗体）；
Ｎ末端Ｆａｂドメインが挿入２＋１二重特異性抗体（ＴＣＢ）
（ドメイン交換を伴う追加の重鎖Ｎ末端結合部位を有する二重特異性完全長抗体であって、
－ 第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片であって、第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片の各結合部位が第１の抗原に特異的に結合する、第１及び第２のＦａｂ断片、
－ 第３のＦａｂ断片であって、第３のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合し、第３のＦａｂ断片が、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片、及び
－ Ｆｃ領域であって、第１のＦｃ領域のポリペプチドと第２のＦｃ領域のポリペプチドとを含む、Ｆｃ領域
を含み、
第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片は、それぞれ、重鎖断片及び完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている、二重特異性完全長抗体）；
抗体－多量体融合物
（融合ポリペプチドであって、
（ａ）抗体重鎖及び抗体軽鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメイン又は抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、又は第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドと
を含み、
（ｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ｂ）の第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ａ）の抗体軽鎖、及び（ｉｉｉ）（ｂ）の第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の第２の融合ポリペプチドが、それぞれ独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
抗体重鎖及び抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、融合ポリペプチド）。
からなる二重特異性抗体の群から選択される。
【0091】
抗体の重鎖のＣＨ３ドメインを、「ノブ・イントゥー・ホール」技術によって改変することができる。例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１；及びＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１に、いくつかの例を伴って詳細に記載されている。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を改変して、これら２つのＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を増加させ、それによってそれらを含むポリペプチドのヘテロ二量体化を増加させる。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインのそれぞれは「ノブ」であり得、それぞれの他方は「ホール」である。ジスルフィドブリッジの導入はさらに、ヘテロ二量体を安定化させ（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１；Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６－３５）、収率を増加させる。
【0092】
（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの突然変異Ｔ３６６Ｗは、「ノブ突然変異」として表され、（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖは、「ホール突然変異」として表される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）。ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１）も、例えば、「ノブ突然変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ突然変異を導入（「ノブ－ｃｙｓ－突然変異」と表記）すること、及び「ホール突然変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ突然変異を導入（「ホール－ｃｙｓ－突然変異」と表記）することにより、使用できる（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）。
【0093】
「ドメインクロスオーバー」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１断片とその対応する同族の抗体軽鎖とのペアにおいて、すなわち抗体Ｆａｂ（断片－抗原結合）において、少なくとも１つの重鎖ドメインが、その対応する軽鎖ドメインによって置換されており、その逆も同様である、という点について、ドメイン配列が天然抗体の配列から逸脱していることを表す。ドメインクロスオーバーは、一般的に３種類あり、（ｉ）ＣＨ１及びＣＬドメインのクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列（又はＶＨ－ＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン配列を有する完全長抗体重鎖）がもたらされるもの、（ｉｉ）ＶＨ及びＶＬドメインのドメインクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされるもの、並びに（ｉｉｉ）完全な軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）及び完全なＶＨ－ＣＨ１重鎖断片のドメインクロスオーバー（「Ｆａｂクロスオーバー」）であって、ドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＨ１ドメイン配列を有する軽鎖がもたらされ、ドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＬドメイン配列を有する重鎖断片がもたらされるもの（上述のすべてのドメイン配列は、Ｎ末端からＣ末端への方向で示されている）がある。
【0094】
本明細書で使用される場合、対応する重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられた」という用語は、上述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、ＣＨ１及びＣＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目（ｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバー、並びに結果として生じる重鎖及び軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、ＶＨ及びＶＬが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目（ｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指し、またＣＨ１及びＣＬドメインが「互いに置き換えられ」、かつＶＨ及びＶＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指す。ドメインクロスオーバーを含む二重特異性抗体は、例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、及びＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８（２０１１）１１１８７－１１１９２において報告されている。このような抗体は、一般にＣｒｏｓｓＭａｂと呼ばれる。
【0095】
多重特異性抗体はまた、特定の実施形態では、上記の項目（ｉ）で述べたＣＨ１及びＣＬドメインのドメインクロスオーバー、又は上記の項目（ｉｉ）で述べたＶＨ及びＶＬドメインのドメインクロスオーバー、又は上記の項目（ｉｉｉ）で述べたＶＨ－ＣＨ１及びＶＬ－ＶＬドメインのドメインクロスオーバーのいずれかを含む、少なくとも１つのＦａｂ断片を含む。ドメインクロスオーバーを伴う多重特異性抗体の場合、同じ抗原に特異的に結合するＦａｂは、特定の実施形態では、同じドメイン配列であるように構築される。そのため、ドメインクロスオーバーを伴う１つを超えるＦａｂが、多重特異性抗体に含まれる場合、該Ｆａｂは、同じ抗原に特異的に結合する。
【0096】
「組換え抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、組換え細胞などの組換え手段により調製、発現、作製又は単離された全ての抗体（キメラ、ヒト化及びヒト）を表す。これには、ＮＳ０、ＨＥＫ、ＢＨＫ、羊膜細胞、ＣＨＯ細胞などの組換え細胞から単離された抗体が含まれる。
【0097】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指し、すなわちそれは、機能的な断片である。抗体断片の例としては、以下に限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性Ｆａｂ、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂ）が挙げられる。
【0098】
「正しく組み立てられた抗体」という用語及びその文法上の等価物は、重鎖及び軽鎖の同族対から組み立てられた抗体を指す。すなわち、正しく組み立てられた抗体は、各鎖に対してそれぞれの対合パートナーを含む。例えば、各重鎖はその同族軽鎖と対合され、各重鎖Ｆａｂ断片はその同族軽鎖と対合され、及び／又は各ｓｃＦａｂ断片はそれ自体と対合され、重鎖Ｆａｂ断片の異なる軽鎖とは対合されない。
【0099】
「抗体関連副産物」という用語は、正しく組み立てられた抗体ではないが、正しく組み立てられた抗体よりも少ない又は多い抗体鎖（ポリペプチド）を含む組換え抗体の発現中又は発現と同時に得られる分子を指す。抗体関連副産物は、例えば、軽鎖などの１つ若しくは複数の鎖が欠損しているか、又は１つ若しくは複数の重鎖若しくは重鎖Ｆａｂ断片が同族軽鎖ではない軽鎖と対になっているか、又は抗体が追加の軽鎖を含む抗体分子を包含する。抗体重鎖又は重鎖Ｆａｂ断片と軽鎖との「同族対」は、標的に対する正しい結合特性を有する結合部位を形成するように対合するために意図／選択／設計された鎖を示す。
【0100】
組換え方法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組換え方法及び組成物を使用して産生することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つ以上の単離された核酸（複数可）が提供される。
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組換え方法及び組成物を使用して産生することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つ以上の単離された核酸（複数可）が提供される。
【0101】
本発明の一態様では、抗体を産生する方法であって、抗体をコードする核酸（複数可）を含む細胞クローンを、抗体の発現に適した条件下で培養すること、及び任意に、抗体を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することを含み、細胞クローンが本発明による方法で選択されている方法が提供される。
【0102】
抗体の組換え産生のために、抗体をコードする核酸を生成／設計／合成し、細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入する。このような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができ、又は組換え方法によって産生することができ、又は化学合成によって得ることができる。
【0103】
通常、例えば治療用抗体のような目的のポリペプチドの組換え大量生産のためには、該ポリペプチドを安定に発現し分泌する細胞クローンが必要とされる。この細胞クローンは、「組換え細胞クローン」又は「組換え生産細胞クローン」と呼ばれ、このような細胞を作製するために使用される全体的なプロセスは「細胞株開発」と呼ばれる。細胞株開発プロセスの第１の工程において、例えば、特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞等の適切な宿主細胞に、当該目的のポリペプチドの発現に適した１つ又は複数の核酸配列をトランスフェクトする。第２の工程において、目的のポリペプチドを安定に発現する細胞クローンを、目的のポリペプチドをコードする核酸と共にコトランスフェクトしておいた選択マーカーの共発現に基づいて選択する。
【0104】
ポリペプチドをコードする核酸、すなわちコード配列は、構造遺伝子と呼ばれる。このような構造遺伝子は、純粋なコード情報である。したがって、その発現にはさらなる調節エレメントが必要である。したがって、通常、構造遺伝子はいわゆる発現カセットに組み込まれる。発現カセットが哺乳動物細胞において機能的となるために必要とされる最小限の制御エレメントは、構造遺伝子の上流、すなわち５’側に位置する、当該哺乳動物細胞において機能的なプロモーター、及び構造遺伝子の下流、すなわち３’側に位置する、当該哺乳動物細胞において機能的なポリアデニル化シグナル配列である。プロモーター配列、構造遺伝子配列、及びポリアデニル化シグナル配列は、作動可能に連結された形態で並べられる。
【0105】
目的のポリペプチドが、異なるポリペプチド、例えば、抗体又は複合体抗体フォーマットなどから構成されるヘテロ多量体ポリペプチドである場合、単一の発現カセットが必要であるだけでなく、それぞれ含まれる構造遺伝子が異なる多数の発現カセット、すなわち、ヘテロ多量体ポリペプチド（ヘテロ多量体抗体）の異なるポリペプチド（鎖）のそれぞれに対して少なくとも１つの発現カセットが必要である。例えば、完全長抗体は、軽鎖の２個のコピー及び重鎖の２個のコピーを含むヘテロ多量体ポリペプチドである。したがって、完全長抗体は、２つの異なるポリペプチドから構成される。したがって、完全長抗体の発現のためには２つの発現カセット、すなわち軽鎖のための１個及び重鎖のための１個が必要とされる。例えば、完全長抗体が二重特異性抗体である場合、すなわち、抗体が同じ抗原上の２つの異なる抗原／エピトープに特異的に結合する２つの異なる結合部位を含む場合、２つの軽鎖並びに２つの重鎖もまた互いに異なる。したがって、このような二重特異性完全長抗体は、４つの異なるポリペプチドで構成されているため、４つの発現カセットが必要となる。
【0106】
目的のポリペプチドのための発現カセットは、次に、１つ又は複数のいわゆる「発現ベクター」に組み込まれる。「発現ベクター」は、細菌細胞中で該ベクターを増幅し、かつ含まれる構造遺伝子を哺乳動物細胞中で発現させるのに必要とされるすべてのエレメントを提供する核酸である。典型的には、発現ベクターは、例えば大腸菌の場合、複製開始点及び原核生物選択マーカー、さらには真核生物選択マーカー、並びに目的の構造遺伝子の発現に必要とされる発現カセットを含む、原核生物プラスミド増殖単位を含む。「発現ベクター」は、ポリペプチド発現細胞クローンを作製するために発現カセットを哺乳動物宿主細胞に導入するための輸送運搬体である。
【0107】
以前のパラグラフで概説したように、発現しようとするポリペプチドが複雑であるほど、必要とされる異なる発現カセットの数もまた多くなる。本質的に、発現カセットの数と共に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる核酸のサイズも大きくなる。同時に、発現ベクターのサイズも大きくなる。しかし、ベクターのサイズの実用的な上限は約１５ｋｂｐの範囲にあり、それを上回ると、操作及び処理の効率が著しく落ちる。この問題は、２つ以上の発現ベクターを用いることによって対処することができる。それにより、発現カセットは、それぞれが発現カセットの一部のみを含む異なる発現ベクター間で分割することができ、その結果サイズの縮小をもたらす。
【0108】
多重特異性抗体などの異種ポリペプチドを発現する組換え細胞を生成するための細胞株開発（ＣＬＤ）は、目的の異種ポリペプチドの発現及び産生に必要なそれぞれの発現カセットを含む核酸のランダム組込み（ＲＩ）又は標的化組込み（ＴＩ）のいずれかを使用する。
【0109】
ＲＩを使用すると、一般に、複数のベクター又はその断片が、同一又は異なる遺伝子座で細胞のゲノムに組み込まれる。
【0110】
ＴＩを使用すると、一般に、異なる発現カセットを含む導入遺伝子の単一コピーが、宿主細胞のゲノムの所定の「ホットスポット」に組み込まれる。
【0111】
（グリコシル化された）抗体の発現のための細胞クローンの生成に適した宿主細胞は、一般に、例えば脊椎動物等の多細胞生物に由来する。
【0112】
宿主細胞
懸濁液中で増殖するように適合された任意の哺乳動物宿主細胞株を使用して、本発明による方法で処理することができる組換え細胞クローンを作製することができる。さらに、インテグレーション方法とは無関係に、すなわち、ＲＩ及びＴＩの場合、任意の哺乳動物宿主細胞を使用することができる。
懸濁液中で増殖するように適合された任意の哺乳動物宿主細胞株を使用して、本発明による方法で処理することができる組換え細胞クローンを作製することができる。さらに、インテグレーション方法とは無関係に、すなわち、ＲＩ及びＴＩの場合、任意の哺乳動物宿主細胞を使用することができる。
【0113】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ヒト羊膜細胞（例えば、Ｗｏｅｌｆｅｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｐｒｏｃ．５（２０１１）Ｐ１３３に記載されているＣＡＰ－Ｔ細胞）；ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９－７４）に記載されたＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３－２５２）に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頚癌腫細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばＭａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４－６８に記載のＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６－４２２０）、及び、骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．及びＷｕ，Ａ．Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻、Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編．）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００４）、２５５－２６８頁を参照されたい。
【0114】
特定の実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４等）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、リンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０細胞）、又はヒト羊膜細胞（例えば、ＣＡＰ－Ｔ等）である。好ましい一実施形態では、哺乳動物（宿主）細胞は、ＣＨＯ細胞である。したがって、同様に、細胞クローンはＣＨＯ細胞である。
【0115】
ＴＩに関して、ゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた、本明細書に記載のランディング部位を含む、ＴＩに適した任意の既知又は将来の哺乳動物宿主細胞を、本発明において使用することができる。このような細胞は、哺乳動物ＴＩ宿主細胞と呼ばれる。特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、本明細書に記載されるように、ランディング部位を含むハムスター細胞、ヒト細胞、ラット細胞、又はマウス細胞である。好ましい一実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、ゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた、本明細書に記載のランディング部位を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯ Ｋ１Ｓ細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞である。
【0116】
特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、組み込まれたランディング部位を含み、ランディング部位は、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含む。ＲＲＳは、リコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、又はφＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。ＲＲＳは、互いに独立して、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。複数のＲＲＳが存在しなければならない場合、同一でないＲＲＳが選択される限りにおいて、各配列の選択は他方に依存する。
【0117】
本発明は、以下ＣＨＯ細胞で例示されるが、これは本発明を例示するためにのみ提示され、限定として解釈されるべきではない。本発明の真の範囲は、特許請求の範囲に記載されている。
【0118】
標的化組込み
本発明による方法において処理される組換え哺乳動物細胞クローンを作製するための１つの方法は、コード核酸の導入のための標的化組込み（ＴＩ）を使用することによって作製される組換え細胞クローンである。
本発明による方法において処理される組換え哺乳動物細胞クローンを作製するための１つの方法は、コード核酸の導入のための標的化組込み（ＴＩ）を使用することによって作製される組換え細胞クローンである。
【0119】
標的化組込みでは、哺乳動物ＴＩ宿主細胞のゲノム中の特定の遺伝子座に外因性核酸を導入して組換え細胞クローンを作製するために部位特異的組換えが用いられる。これは、ゲノムにおけるインテグレーション部位の配列が外因性核酸と交換される酵素プロセスである。このような核酸交換を行うために使用される１つのシステムは、Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムである。交換を触媒する酵素はＣｒｅリコンビナーゼである。交換される配列は、ゲノム内並びに外因性核酸内の２つのｌｏｘ（Ｐ）部位の位置によって定義される。これらのｌｏｘ（Ｐ）部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識される。それ以上は必要なく、すなわちＡＴＰなどは不要である。元々Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムはバクテリオファージＰ１で発見された。
【0120】
Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムは、哺乳動物、植物、細菌、酵母等、様々な種類の細胞で機能する。
【0121】
特定の実施形態では、異種ポリペプチドをコードする外因性核酸は、単一又は二重リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）によって哺乳動物ＴＩ宿主細胞に組み込まれている。それにより、組換えＣＨＯ細胞クローンなどの組換え哺乳動物細胞クローンが得られ、その中で、定義された特異的な発現カセット配列が単一の遺伝子座でゲノムに組み込まれる。
【0122】
Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ部位特異的組換え系は、多くの生物学的実験系において広く使用されている。Ｃｒｅリコンビナーゼは、３４ｂｐのＬｏｘＰ配列を認識する３８ｋＤａの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。ＣｒｅリコンビナーゼはバクテリオファージＰ１に由来し、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼに属する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＬｏｘＰ配列間の分子内組換えと分子間組換えの両方を媒介することができる。ＬｏｘＰ配列は、２つの１３ｂｐ逆方向反復に挟まれた８ｂｐの非パリンドロームコア領域から構成される。Ｃｒｅリコンビナーゼは１３ｂｐの反復に結合し、それによって８ｂｐのコア領域内での組換えを媒介する。Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ媒介組換えは、高い効率で起こり、他のいかなる宿主因子も必要としない。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で同じ方向に配置されている場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えは、２つのＬｏｘＰ配列の間に位置するＤＮＡ配列が共有結合で閉じた環として切り取るであろう。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で逆方向の位置に配置されている場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えは、２つの配列の間に位置するＤＮＡ配列の向きを反転するであろう。２つのＬｏｘＰ配列が２つの異なるＤＮＡ分子上にあり、１つのＤＮＡ分子が環状である場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えにより、環状ＤＮＡ配列のインテグレーションをもたらすであろう。
【0123】
「組換え認識配列」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識され、リコンビナーゼに媒介された組換え事象のために必要かつ十分である、ヌクレオチド配列である。ＲＲＳを用いて、組換え事象が起こると考えられるヌクレオチド配列中の位置を定めることができる。
【0124】
用語「一致ＲＲＳ」とは、２つのＲＲＳ間で組換えが起こることを示す。特定の実施形態では、２つの一致するＲＲＳは、同じである。
【0125】
特定の実施形態では、ＲＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、ＦＬＰリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、Ｂｘｂ１インテグラーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、φＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。
【0126】
特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、変異体ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、野生型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、変異体ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、２つの一致ＲＲＳは、異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、第１の一致ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の一致ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、第１の一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列であり、第２の一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列である。
【0127】
「２プラスミドＲＭＣＥ」戦略又は「二重ＲＭＣＥ」は、２つのベクターの組み合わせを使用する場合、本発明による方法で用いられる。例えば、限定されるものではないが、組み込まれたランディング部位は、３つのＲＲＳ、例えば、第３のＲＲＳ（「ＲＲＳ３」）が第１のＲＲＳ（「ＲＲＳ１」）と第２のＲＲＳ（「ＲＲＳ２」）の間に存在する並びを含むことができ、第１のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含み、第２のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第３のＲＲＳ及び第２のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含む。
【0128】
２プラスミドＲＭＣＥ戦略では、３つのＲＲＳ部位を使用して、２つの独立したＲＭＣＥを同時に実行することを含む。したがって、２プラスミドＲＭＣＥ戦略を用いる哺乳動物ＴＩ宿主細胞のランディング部位は、第１のＲＲＳ部位（ＲＲＳ１）に対しても第２のＲＲＳ部位（ＲＲＳ２）に対しても交差活性を有していない第３のＲＲＳ部位（ＲＲＳ３）を含む。標的化される２つのプラスミドは、効率的な標的指向のために同じ隣接ＲＲＳ部位を必要とし、一方のプラスミド（フロント）にはＲＲＳ１及びＲＲＳ３が隣接し、他方（バック）にはＲＲＳ３及びＲＲＳ２が隣接している。さらに、２プラスミドＲＭＣＥでは、２つの選択マーカーも必要とされる。１つの選択マーカー発現カセットは、２つの部分に分割された。フロントプラスミドは、プロモーターとそれに続く開始コドン及びＲＲＳ３配列を含む。バックプラスミドは、開始コドン（ＡＴＧ）を欠き、選択マーカーコード化領域のＮ末端に融合されたＲＲＳ３配列を有する。融合タンパク質のインフレーム翻訳、すなわち動作可能な連結を確実にするために、ＲＲＳ３部位と選択マーカー配列の間に付加的なヌクレオチドを挿入する必要がある場合がある。両方のプラスミドが正確に挿入された場合にのみ、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、したがって、各選択剤に対する耐性が細胞に与えられる。
【0129】
２プラスミドＲＭＣＥは、リコンビナーゼによって触媒される、標的ゲノム遺伝子座内の２つの異種特異的ＲＲＳとドナーＤＮＡ分子の間の二重組換えクロスオーバー事象を伴う。２プラスミドＲＭＣＥは、フロントベクター及びバックベクターに由来する組み合わせられたＤＮＡ配列のコピーを、哺乳動物ＴＩ宿主細胞ゲノムの予め定められた遺伝子座に導入するように設計されている。ＲＭＣＥは、原核生物ベクターの配列が哺乳動物ＴＩ宿主細胞ゲノム中に導入されず、したがって、宿主の免疫又は防御機構の望まれない誘発を低減させ、及び／又は防ぐように、実行することができる。ＲＭＣＥ手順は、複数のＤＮＡ配列を用いて繰り返すことができる。
【0130】
特定の実施形態では、標的化組込みは、２回のＲＭＣＥによって実現され、その際、２つの異なるＤＮＡ配列が両方とも、哺乳動物ＴＩ宿主細胞に一致するＲＲＳのゲノムのあらかじめ定められた部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分及び／又は２つの異種特異的ＲＲＳが隣接する少なくとも１つの選択マーカー若しくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施形態では、標的化組込みは、複数回のＲＭＣＥによって実現され、その際、複数のベクターに由来するＤＮＡ配列がすべて、哺乳動物ＴＩ宿主細胞のゲノムのあらかじめ定められた部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分及び／又は２つの異種特異的ＲＲＳが隣接する少なくとも１つの選択マーカー若しくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施形態では、選択マーカーは、一部が第１のベクターにおいてコードされ、一部が第２のベクターにおいてコードされてよく、その結果、二重ＲＭＣＥによって両方が正確に組み込まれた場合にのみ、その選択マーカーの発現が可能になる。
【0131】
特定の実施形態では、リコンビナーゼに媒介された組換えによる標的化組込みにより、原核生物ベクターに由来する配列を含まずに、宿主細胞ゲノムの１つ又は複数のあらかじめ定められた組込み部位に、選択マーカー及び／又は多量体ポリペプチドの様々な発現カセットが組み込まれる。
【0132】
本発明による方法における使用に適した例示的な哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、そのゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれたランディング部位を有するＣＨＯ細胞であり、ランディング部位はＣｒｅリコンビナーゼを介したＤＮＡ組換えのための３つの異種特異的ｌｏｘＰ部位を含む。
【0133】
この例では、異種特異的ｌｏｘＰ部位は、Ｌ３、ＬｏｘＦａｓ、及び２Ｌであり（例えば、Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．７（２０１２）８９８－９０８；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７を参照）、その際、Ｌ３及び２Ｌはランディング部位の５’末端及び３’末端にそれぞれ隣接し、ＬｏｘＦａｓはＬ３部位と２Ｌ部位の間に位置している。
【0134】
先の段落で概説したようにランディング部位がこのように編成されていることによって、２つのベクター、例えば、いわゆる、Ｌ３部位及びＬｏｘＦａｓ部位を有するフロントベクター並びにＬｏｘＦａｓ部位及び２Ｌ部位を内部に持つバックベクターの同時インテグレーションが可能になる。ランディング部位に存在するものとは異なる、選択マーカー遺伝子の機能的エレメントは、両方のベクター間に分配させることができ：プロモーター及び開始コドンはフロントベクター上に位置することができるのに対し、コード化領域及びポリＡシグナルはバックベクター上に位置している。両方のベクターに由来する当該核酸の正しいリコンビナーゼ媒介性インテグレーションのみが、それぞれの選択剤に対する耐性を誘導する。
【0135】
通常、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内に組み込まれるランディング部位を含む哺乳動物細胞であって、該ランディング部位が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列及び第２の組換え認識配列、並びに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列が全て異なっている、ランディング部位を含む哺乳動物細胞である。
【0136】
外因性ヌクレオチド配列は、特定の細胞に由来しないが、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、又は形質転換法などによって前記細胞に導入することができるヌクレオチド配列である。特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中の１つ以上のインテグレーション部位に組み込まれた少なくとも１つのランディング部位を含む。特定の実施形態では、ランディング部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の１つ以上のインテグレーション部位に組み込まれる。
【0137】
特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ及び第３のＲＲＳ、並びに少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置している。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカーに隣接する。すなわち、第１のＲＲＳが選択マーカーの５’（上流）に位置し、第２のＲＲＳが選択マーカーの３’（下流）に位置している。特定の実施形態では、第１のＲＲＳは選択マーカーの５’末端と隣り合っており、第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’末端に隣り合っている。特定の実施形態では、ランディング部位は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、及び第３のＲＲＳ、並びに第１のＲＲＳと第３のＲＲＳの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含む。
【0138】
特定の実施形態では、選択マーカーは第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置しており、かつこれら２つの隣接ＲＲＳは互いに異なる。特定の好ましい実施形態では、第１の隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、第２の隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。特定の実施形態では、ＬｏｘＰ Ｌ３配列は、選択マーカーの５’に位置し、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は、選択マーカーの３’に位置する。特定の実施形態では、第１の隣接ＲＲＳは野生型ＦＲＴ配列であり、第２の隣接ＲＲＳは変異ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、同じ向きに位置決めされている。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、両方が順方向又は逆方向に向いている。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、反対の向きに位置決めされている。
【0139】
本発明の方法の具体的な実施形態の説明
本発明による方法は、４つのＥＬＩＳＡベースのアッセイ（１つは前記二重特異性抗体を発現する１つの細胞クローンの培養の上清中の抗体価を決定するためのものであり、２つは二重特異性抗体の抗原１及び抗原２へのそれぞれの個別の結合を決定するためのものであり、１つは抗原１及び抗原２への同時結合を決定するためのものである）のセットを使用する二重特異性抗体フォーマットについて以下に例示される。その読み出しは、本発明による方法に基づいて処理される。これにより、一方では、抗体主産物と抗体副産物との比に基づいて細胞クローンを区別することができ、他方では、細胞クローンをそれらの産物（抗体）関連副産物プロファイルに関して正確に分類することができる。両方とも、本発明の方法による改良されたクローン選択プロセスの基礎を提供する。この実施例は、本発明による方法の例示としてのみ提示され、その限定として解釈されるべきではない。本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
本発明による方法は、４つのＥＬＩＳＡベースのアッセイ（１つは前記二重特異性抗体を発現する１つの細胞クローンの培養の上清中の抗体価を決定するためのものであり、２つは二重特異性抗体の抗原１及び抗原２へのそれぞれの個別の結合を決定するためのものであり、１つは抗原１及び抗原２への同時結合を決定するためのものである）のセットを使用する二重特異性抗体フォーマットについて以下に例示される。その読み出しは、本発明による方法に基づいて処理される。これにより、一方では、抗体主産物と抗体副産物との比に基づいて細胞クローンを区別することができ、他方では、細胞クローンをそれらの産物（抗体）関連副産物プロファイルに関して正確に分類することができる。両方とも、本発明の方法による改良されたクローン選択プロセスの基礎を提供する。この実施例は、本発明による方法の例示としてのみ提示され、その限定として解釈されるべきではない。本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
【0140】
この実施例では、二重特異性抗体を産生する個々の細胞クローンの評価は、上清中の抗体価、抗原１及び２への個々の結合、並びに両方の抗原への同時結合を決定及び定量する４つのアッセイの結果に基づく。
【0141】
したがって、細胞株発達（ＣＬＤ）中の細胞クローン選択については、二重特異性抗体をコードする１つ又は複数の核酸での宿主細胞のトランスフェクションによって得られた異なる細胞クローンを、上に概説したように３つの結合ＥＬＩＳＡによって分析し、発現収率を考慮して所望の抗体主産物対所望でない抗体副産物量（＝抗体主産物品質）に従って評価する。これらのアッセイを組み合わせて読み出すことにより、高い割合の所望の抗体主産物（＝リード）を発現するクローンを、低い割合の所望の主産物のみを発現するクローンから区別することが可能になる。
【0142】
多くの二重特異性抗体フォーマットは、ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術に基づく。そのようなフォーマットは、例えば、ホール鎖－ホール鎖二量体、ノブ鎖－ノブ鎖二量体、又は１つの軽鎖を欠く３／４抗体などの鎖の誤対合に起因して、特徴的な産物関連副産物を形成し得る。異なる細胞クローンは、しばしば、抗体主産物（＝リード、すなわち正しく組み立てられた二重特異性抗体）と産物関連抗体副産物（例えば、ホール鎖－ホール鎖二量体（＝副産物Ｉ）及びノブ鎖－ノブ鎖二量体（＝副産物ＩＩ））との異なる混合物を発現する。組換え細胞クローンのこれらの分子の発現パターンの違いは、例えば、低い抗体主産物収率を有するものなどの不適切な産物プロファイルを有する細胞クローンを選択解除するために、早期かつ高スループットに適したスクリーニング方法を必要とする。この実施例で使用される抗体フォーマット及びそれらの副産物のいくつかを図１５に示す。
【0143】
本発明による方法のこの実施例で用いられるアッセイは、異なるアッセイ原理を利用する。これは、異なる発現産物が異なるＥＬＩＳＡシグナルを与えるという効果をもたらす。精製された主産物（すなわち、正しく組み立てられたノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体）及び最も一般的な副産物（すなわち、ホール・ホールのホモ二量体及びノブ・ノブのホモ二量体）を標準として使用する。それらは、ａ）フォーマット自体による結合活性効果及びｂ）使用される検出抗体に起因する結合活性効果に基づくアッセイにおいて特異的シグナルをもたらす。
【0144】
抗原結合を決定するために、この実施例では以下の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した：
－ ビオチン化抗原１又は２をそれぞれストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに固定した。プレートを洗浄した後、培養上清と検出抗体（ＰＯＤ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）にコンジュゲートした抗ヒトＦａｂ抗体）の混合物を適用し；３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を読み出しに使用し；
－ 抗原１及び抗原２への同時結合を架橋ＥＬＩＳＡで決定し；抗原１又は抗原２をマイクロタイタープレート上に直接コーティングした。プレートを洗浄した後、培養上清、それぞれの他のビオチン化抗原２又は１、及びストレプトアビジン－ＰＯＤコンジュゲートの混合物を適用し；ＴＭＢを読み出しに使用した。
－ ビオチン化抗原１又は２をそれぞれストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに固定した。プレートを洗浄した後、培養上清と検出抗体（ＰＯＤ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）にコンジュゲートした抗ヒトＦａｂ抗体）の混合物を適用し；３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を読み出しに使用し；
－ 抗原１及び抗原２への同時結合を架橋ＥＬＩＳＡで決定し；抗原１又は抗原２をマイクロタイタープレート上に直接コーティングした。プレートを洗浄した後、培養上清、それぞれの他のビオチン化抗原２又は１、及びストレプトアビジン－ＰＯＤコンジュゲートの混合物を適用し；ＴＭＢを読み出しに使用した。
【0145】
これらのＥＬＩＳＡ読み取り値を本発明による方法に従って組み合わせて、抗体主産物、すなわち単量体で正しく組み立てられた二重特異性抗体、及び抗体副産物を区別した。これにより、クローン選択の基礎としてのそれらの特性に関するそれぞれのクローンの分類が達成された。例えば、本発明による方法の適用に基づいて主産物を主に発現すると予測される場合、クローンは「リード」として分類される。そのようなクローンは、抗体関連副産物の含有量が低い二重特異性抗体を発現／産生するためのクローンとして適している。これらのクローンを同定する必要がある。
【0146】
参考として、３つの異なる二重特異性抗体フォーマット－ドメイン交換１＋１二重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ）、Ｎ末端Ｆａｂドメイン挿入２＋１二重特異性抗体（ＴＣＢ）及びＣ末端Ｆａｂドメイン融合２＋１二重特異性抗体（ＢＳ）－についてのＥＬＩＳＡ結果のカテゴリー化を図１～図３に可視化する。ＥＬＩＳＡの結果は、明確にするために、３つのＥＬＩＳＡのうちの２つについてのみ、及び４つの分析濃度のうちの１つについてのみ示されている。図において、抗原２（ＡＧ２）への結合は、抗原１（ＡＧ１）への結合に対してプロットされている。異なる陰影は、細胞クローンの質のカテゴリー化を示す。これは、抗体フォーマット並びに標的及び／又は標的の組み合わせ（＝プロジェクト）に応じて変動があることを示し、したがって、分析の複雑さを実証する。
【0147】
精製された抗体主産物（「主産物標準」と表記する；例えば、正しく会合したすべての軽鎖と対合している正しく組み立てられたノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体重鎖）及び最も一般的な望ましくない副産物（それぞれ「副産物Ｉ標準」及び「副産物ＩＩ標準」と表記する；例えば、それぞれホール・ホールのホモ二量体及びノブ・ノブのホモ二量体）を、希釈系列のすべてのアッセイにおいて標準として使用した（１４の異なる濃度）。５日間の培養後のそれぞれの単一細胞クローン培養上清を４つの異なる濃度で分析した。本発明による方法は、絶対シグナルの差とは無関係に実施することができる（これらの差が統計的に有意である限り）。これは、シグナルがアッセイの線形シグナル範囲内にあるか否かとは無関係である。特定の実施形態では、全ての標準、培養上清、コーティングされた抗原、検出抗体及び検出試薬は、抗体の主産物標準で得られたシグナルと抗体の副産物標準で得られたシグナルとの間に最大のシグナル差をもたらす濃度で使用される。当業者は、過度の負担なしに、当業者の知識に基づいてシグナル差のそのような最適化を容易に実行することができる。
【0148】
本発明は、少なくとも部分的には、単一細胞クローン培養上清中の二重特異性抗体の濃度及び単離された抗原への二重特異性抗体の結合並びに両方の抗原への同時結合を決定するイムノアッセイの結果に基づいて、二重特異性抗体を発現する組換え細胞クローンの選択を効率的に行うことができるという知見に基づく。さらに、目的のデータ処理が有利であることが分かった。
【0149】
本発明は、少なくとも部分的には、最も低い抗体関連副産物含有量を有する二重特異性抗体を産生する組換え細胞クローンの選択に対して、
－ 各抗原への個別の結合及び両方の抗原への同時結合についての結合イムノアッセイにおける培養上清の４つの測定濃度の中央ブランク補正データ（結合シグナル）と、
－ 各結合イムノアッセイにおける単離された二重特異性抗体及び２つの主要副産物の少なくとも５つの測定濃度の中央値ブランク補正データと
を組み合わせた単一細胞クローン培養上清（少なくとも５日間の培養後）における二重特異性抗体の濃度が使用することができるという知見に基づく。
－ 各抗原への個別の結合及び両方の抗原への同時結合についての結合イムノアッセイにおける培養上清の４つの測定濃度の中央ブランク補正データ（結合シグナル）と、
－ 各結合イムノアッセイにおける単離された二重特異性抗体及び２つの主要副産物の少なくとも５つの測定濃度の中央値ブランク補正データと
を組み合わせた単一細胞クローン培養上清（少なくとも５日間の培養後）における二重特異性抗体の濃度が使用することができるという知見に基づく。
【0150】
本明細書で互換的に使用される「ブランク補正データ」又は「ブランク補正結合シグナル」という用語は、試験サンプル又は標準サンプルについてのイムノアッセイで決定された結合シグナル、すなわち試験サンプル又は標準サンプルについて決定された生の結合シグナルから、ブランクサンプル（すなわち、標準、培養上清、（治療用）抗体及び任意の副産物を含まないがその他の点では試験サンプルと同一のサンプル）について同じイムノアッセイで決定されたバックグラウンドシグナルが差し引かれていることを示す。
【0151】
９つの可能な標準正規化結合比のうちの９つすべて又は４つのいずれか、及び任意に、吸光度補正されたＥＬＩＳＡシグナルの比を使用することによって、本発明による方法をさらに改善することができることが分かった。
【0152】
本発明は、少なくとも部分的には、特定の比の結合シグナルが特異的であり、組み合わせて使用され、標準（１００％精製抗体主産物、抗体副産物Ｉ及び抗体副産物ＩＩ）について計算された比で正規化される場合、個々の培養上清（＝サンプル）、及びそれにより、良好な（主に抗体主産物を産生／発現する）クローンと、低い（主に抗体副産物を産生／発現する）産物品質を有するクローンとの区別を可能にするという知見に基づく。
【0153】
標準の比は、濃度（好ましい一実施形態では、４つの濃度の培養上清及び１４の濃度の標準）について得られたシグナルの中央値として計算され、次いで互いに除算される（「正規化」）。これにより、合計９つの可能な比が得られる。
【0154】
本発明は、正しく組み立てられた二重特異性抗体を発現する細胞クローンの選択には、以下の４つの中央値のみが必要であるという知見に少なくとも部分的に基づく：
－ 抗原２への結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルと、抗原１への結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値であって、抗原２への結合についての少なくとも５つの濃度の抗体主産物（主産物標準）について得られたブランク補正された結合シグナルと、同じアッセイで求められた抗原１への結合についての同じ少なくとも５つの濃度の主産物標準について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値に対して正規化された（すなわち除算された）中央値、
－ 抗原１及び２への同時結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルと、抗原１への結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値であって、抗原１及び２への同時結合についての少なくとも５つの濃度の抗体主産物（主産物標準）について得られたブランク補正された結合シグナルと、同じアッセイで求められた抗原１への結合についての同じ少なくとも５つの濃度の主産物標準について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値に対して正規化された中央値、
－ 抗原２への結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルと、抗原１への結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値であって、抗原２への結合についての少なくとも５つの濃度の抗体関連副産物Ｉ（副産物Ｉ標準）について得られたブランク補正された結合シグナルと、同じアッセイで求められた抗原１への結合についての同じ少なくとも５つの濃度の副産物Ｉ標準について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値に対して正規化された中央値、及び
－ 抗原１及び２への同時結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルと、抗原１への結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値であって、抗原１及び２への同時結合についての少なくとも５つの濃度の抗体副産物ＩＩ（副産物ＩＩ標準）について得られたブランク補正された結合シグナルと、同じアッセイで求められた抗原１への結合についての同じ少なくとも５つの濃度の副産物ＩＩ標準について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値に対して正規化された中央値。
－ 抗原２への結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルと、抗原１への結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値であって、抗原２への結合についての少なくとも５つの濃度の抗体主産物（主産物標準）について得られたブランク補正された結合シグナルと、同じアッセイで求められた抗原１への結合についての同じ少なくとも５つの濃度の主産物標準について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値に対して正規化された（すなわち除算された）中央値、
－ 抗原１及び２への同時結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルと、抗原１への結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値であって、抗原１及び２への同時結合についての少なくとも５つの濃度の抗体主産物（主産物標準）について得られたブランク補正された結合シグナルと、同じアッセイで求められた抗原１への結合についての同じ少なくとも５つの濃度の主産物標準について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値に対して正規化された中央値、
－ 抗原２への結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルと、抗原１への結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値であって、抗原２への結合についての少なくとも５つの濃度の抗体関連副産物Ｉ（副産物Ｉ標準）について得られたブランク補正された結合シグナルと、同じアッセイで求められた抗原１への結合についての同じ少なくとも５つの濃度の副産物Ｉ標準について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値に対して正規化された中央値、及び
－ 抗原１及び２への同時結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルと、抗原１への結合についての同じ（４つの）濃度の細胞クローン培養上清について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値であって、抗原１及び２への同時結合についての少なくとも５つの濃度の抗体副産物ＩＩ（副産物ＩＩ標準）について得られたブランク補正された結合シグナルと、同じアッセイで求められた抗原１への結合についての同じ少なくとも５つの濃度の副産物ＩＩ標準について得られたブランク補正された結合シグナルとの比の中央値に対して正規化された中央値。
【0155】
特定の実施形態では、少なくとも１０の濃度のそれぞれの標準が使用される。好ましい一実施形態では、少なくとも１４の濃度のそれぞれの標準が使用される。
【0156】
少なくともこれらのパラメータを使用すると、細胞クローン特性評価の複雑さを低減することができる。したがって、本発明による得られた方法は、この改善されたデータ処理及び評価を包含する。
【0157】
インシリコ分析と組み合わせて上記のパラメータ選択を使用することにより、抗体フォーマット非依存性及び標的非依存性の方法が得られることが分かった。
【0158】
本発明による方法の有利な特性を示すために、８つの異なる例示的なデータ処理変形を比較した。これらを以下の表にまとめる。
【0159】
【0160】
異なるフォーマットの５つの異なる標的組み合わせに対する品質カテゴリ予測に関する極端な勾配ブースティング（ＸＧＢ）モデルを用いたインシリコ処理におけるこれらの８つの異なる処理変形のそれぞれの性能が、図４（ＴＣＢ－１、２＋１ヘッド－トゥ－テール、ＴＣＢ－２、ＴＣＢ－３）及びＣｒｏｓｓＭａｂ）に視覚化されている。ＸＧＢモデル予測品質は、モデル訓練に利用されていないプロジェクト全体の交差エントロピー損失によって評価された。前の表に示す異なる処理方法を実験条件として使用した。
【0161】
図５では、異なる処理変形の偽陰性率及び偽陽性率が示されている。入力パラメータと操作された特徴との様々な組み合わせの効果を明確に見ることができ、それにより、処理変形６、７、及び８が最良に機能する。
【0162】
したがって、本発明による方法を用いて、標的及びフォーマットに依存しない組換え細胞クローンのカテゴリー化を達成することができる。
【0163】
本発明による方法の品質を図６～図１０に示す。これらの図では、手動のみの方法を使用して評価されたデータセットが、本発明による方法で評価された同じデータセットと比較される。手動のみの評価方法と比較して本発明による方法の改善された性能を実証するために使用されたプロジェクトは、アルゴリズムの訓練には使用されていない。したがって、偏りを排除することができる。
【0164】
図６において、抗原２（ＡＧ２）への結合は、抗原１（ＡＧ１）への結合に対してプロットされている。手動のみの分析を上部に示し、本発明による方法で得られた結果を下部に示す。図７～図１０は、同じ配置で、主産物標準に正規化されたＡＧ２：ＡＧ１、主産物標準に正規化されたＡＧ１２：ＡＧ１、副産物Ｉ標準に正規化されたＡＧ２：ＡＧ１、及び副産物ＩＩ標準に正規化されたＡＧ１２：ＡＧ２の中央値を示し、それぞれクローン数に対してプロットされている。標準に対する正規化のために、それぞれのカテゴリー化に入るクローンは、１に近い値を有するべきである。本発明による方法で得られた結果の改善された精度は、これらのグラフに印象的に示されている。陰影は異なる品質カテゴリを示し、下部データセットのサイズは予測精度に比例するため、非常に容易かつ迅速に示され、このクローンは優れた産物品質を生み出す可能性が最も高い。
【0165】
本発明による方法は、次の実施例に示すようにアップスケーリングのための最良の特性を有するクローンを選択するためのクローン品質評価に使用することができる。
【0166】
図１１～図１４に、本発明による方法を用いたクローン選択の例を示す。本発明による方法で決定されたクローン品質カテゴリを、異なる陰影によって図１１及び図１２に示す。図１３及び図１４では、選択プロセスが示されている。６１０個のクローンのうち１６０個を、本発明による方法の結果に基づいて、所望の産物品質、すなわち抗体主産物収率を有するように選択した。
【0167】
交差エントロピー損失関数（対数損失、対数損失又はロジスティック損失）は、モデル内のデータをランク付けするための関数である。各予測クラス確率は、実際のクラス所望出力０又は１と比較され、実際の期待値からの距離に基づいて確率にペナルティを課すスコア／損失が計算される。ペナルティは、本質的に対数であり、１に近い大きな差については大きなスコアをもたらし、０の傾向がある小さな差については小さなスコアをもたらす。交差エントロピー損失は、訓練中にモデル重みを調整するときに使用される。目的は、損失を最小限に抑えることであり、すなわち、損失が小さいほど、モデルは良好である。完全なモデルは、０の交差エントロピー損失を有する。交差エントロピーは以下のように定義される。
【0168】
ｎ個のクラスについて、ｔｉは真理ラベルであり、ｐｉはｉ番目のクラスの確率である。
【0169】
中央値は、前記系列の中央にある一連の項の項である。Ｎが奇数であるＮ個の項を有する系列の場合、中央値は
項、すなわち系列の中央の項である。Ｎが偶数であるＮ個の項を有する系列の場合、中央値は
であり、すなわち、系列の中央の２つの項の平均である。系列は、数値（値）の昇順で個々の項を含む。
【0170】
本発明による方法を使用することにより、クローン選択の初期工程中に選択された低い産物品質を有する産物を産生するクローンの数が減少する、すなわち偽陽性の数が減少すると同時に、良好な産物品質を有する産物を産生するクローンの損失、すなわち選択解除も減少する、すなわち偽陰性の数が減少する。
【0171】
クローンの選択に産物品質属性を含まない最先端のスクリーニング方法を使用する場合、産物品質が低い産物を産生するクローンは、例えば、品質を分析クロマトグラフィによって分析することができるように十分な産物が利用可能になると、スクリーニングプロセスの後期にのみ認識される。
【0172】
したがって、偽陽性クローンの数を減らすことによって、より良好な産生クローン、すなわち真陽性が選択プロセスにおいてさらに運ばれる。これにより、高品質の産物を産生するクローンの潜在的損失が低減される。
【0173】
【0174】
図１６において、各バーは１つのクローンを表す。クローンを力価、すなわち産物濃度、バーのサイズによってランク付けする）。さらに、クローンを本発明による方法で特徴付けた。本発明による方法では選択されたであろうクローンを暗く示す。
【0175】
最新技術の力価に基づく選択を使用すると、明るいバーと暗いバーの組み合わせが選択されるが、本発明による方法を使用すると、暗いバーによって表されるクローンのみが選択される。
【0176】
したがって、最新技術を使用すると、高品質の産物を産生しない力価ベースの選択クローン（明るいバー）、すなわち偽陽性が含まれ、それによって選択された真陽性クローンの数が減少する。
【0177】
全てのクローン、すなわちそれらによって産生される産物を、モノマー含有量を決定するためにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、並びに主産物ピークを決定するためにキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）及び疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって分析した。
【0178】
図１７では、ＳＥＣによって決定されたモノマー含有量（ｘ軸）とＣＥ－ＳＤＳによって決定された主産物の量（ｙ軸）との関係が、図１６のクローンについて示されている。これは、早期クローン選択において分析されることである。本発明による方法では選択解除されたであろうクローン、すなわち図１６の明るいバーを太字で示す。太字の選択解除されたクローンの約半分が右上の象限に見られ、すなわちＣＥ－ＳＤＳ及びＳＥＣに基づいて、良好とされる産物品質を有することが分かる（図１７の丸）。しかし、これらは本発明による方法によれば偽陽性である。
【0179】
これは、ＨＩＣを使用して図１７の円からのクローンを再分析することで確認されている。結果を図１８に示す。図１７の右上象限の円で囲まれた太いクローンは、ここでは図１８の右下象限に見られ（円）、すなわち低い主産物ピークを有し、したがって偽陽性である。
【0180】
本発明による方法の有利な特性をさらに確認するために、本発明による方法によって選択されたクローンについて同じ分析を行った。ＣＥ－ＳＤＳと組み合わせたＳＥＣの対応する結果を図１９に、ＨＩＣと組み合わせたＳＥＣについては図２０に、それぞれ示す。
【0181】
本発明による方法で選択されたクローンは、両方の図において右上象限に位置し、したがって真陽性クローンであることが分かる。
【0182】
これは、本発明による方法では、選択された偽陽性クローンの数を減らすことができると同時に、選択解除された真陽性クローンの数を増やすことができることを示している。
【0183】
本発明の具体的なコンピュータによって実現される実施形態の説明
本発明の一態様は、コンピュータを含む適切なシステムであるイムノアッセイ測定装置上で実行された場合に、少なくとも以下の工程を実行させる命令を含むコンピュータプログラム製品である。
ｉ）異なる濃度の単一細胞クローン培養上清について、単一細胞クローン培養上清中の抗体濃度に比例するシグナルを決定する工程；
ｉｉ）異なる濃度の単一細胞クローン培養上清について、単一細胞培養上清中に含有される抗体のその第１の標的への個別の結合に比例するシグナルを決定する工程；
ｉｉｉ）異なる濃度の単一細胞クローン培養上清について、単一細胞培養上清中に含有される抗体のその第２の標的への個別の結合に比例するシグナルを決定する工程；
ｉｖ）異なる濃度の単一細胞クローン培養上清について、単一細胞培養上清中に含有される抗体のその第１の抗原及び第２の標的への同時結合に比例するシグナルを決定する工程；
ｖ）異なる濃度のそれぞれの標準について、抗体の第１の標的への抗体参照標準、抗体関連副産物Ｉ標準及び抗体関連副産物ＩＩ標準の個別の結合に比例するシグナルを決定する工程；
ｖｉ）異なる濃度のそれぞれの標準について、抗体の第２の標的への抗体参照標準、抗体関連副産物Ｉ標準及び抗体関連副産物ＩＩ標準の個別の結合に比例するシグナルを決定する工程；
ｖｉｉ）異なる濃度のそれぞれの標準について、抗体の第１の標的及び第２の標的への抗体参照標準、抗体関連副産物Ｉ標準及び抗体関連副産物ＩＩ標準の同時結合に比例するシグナルを決定する工程。
本発明の一態様は、コンピュータを含む適切なシステムであるイムノアッセイ測定装置上で実行された場合に、少なくとも以下の工程を実行させる命令を含むコンピュータプログラム製品である。
ｉ）異なる濃度の単一細胞クローン培養上清について、単一細胞クローン培養上清中の抗体濃度に比例するシグナルを決定する工程；
ｉｉ）異なる濃度の単一細胞クローン培養上清について、単一細胞培養上清中に含有される抗体のその第１の標的への個別の結合に比例するシグナルを決定する工程；
ｉｉｉ）異なる濃度の単一細胞クローン培養上清について、単一細胞培養上清中に含有される抗体のその第２の標的への個別の結合に比例するシグナルを決定する工程；
ｉｖ）異なる濃度の単一細胞クローン培養上清について、単一細胞培養上清中に含有される抗体のその第１の抗原及び第２の標的への同時結合に比例するシグナルを決定する工程；
ｖ）異なる濃度のそれぞれの標準について、抗体の第１の標的への抗体参照標準、抗体関連副産物Ｉ標準及び抗体関連副産物ＩＩ標準の個別の結合に比例するシグナルを決定する工程；
ｖｉ）異なる濃度のそれぞれの標準について、抗体の第２の標的への抗体参照標準、抗体関連副産物Ｉ標準及び抗体関連副産物ＩＩ標準の個別の結合に比例するシグナルを決定する工程；
ｖｉｉ）異なる濃度のそれぞれの標準について、抗体の第１の標的及び第２の標的への抗体参照標準、抗体関連副産物Ｉ標準及び抗体関連副産物ＩＩ標準の同時結合に比例するシグナルを決定する工程。
【0184】
特定の実施形態では、説明書は、工程ｖｉｉ）の後に、以下の工程をさらに含む。
ａ）抗原２への結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルと、抗原１への結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルとの比の中央値であって、抗体主産物（主産物標準）の少なくとも５つの濃度について得られたそれぞれの比の中央値シグナルに正規化された中央値を計算する工程、
ｂ）抗原１及び２への同時結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルと、抗原１への結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルとの比の中央値であって、抗体主産物（主産物標準）の少なくとも５つの濃度について得られたそれぞれの比の中央値シグナルに正規化された中央値を計算する工程、
ｃ）抗原２への結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルと、抗原１への結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルとの比の中央値であって、抗体関連副産物Ｉ（副産物Ｉ標準）の少なくとも５つの濃度について得られたそれぞれの比の中央値シグナルに正規化された中央値を計算する工程、及び
ｄ）抗原１及び２への同時結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルと、抗原１への結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルとの比の中央値であって、抗体関連副産物ＩＩ（副産物ＩＩ標準）の少なくとも５つの濃度について得られたそれぞれの比の中央値シグナルに正規化された中央値を計算する工程。
ａ）抗原２への結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルと、抗原１への結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルとの比の中央値であって、抗体主産物（主産物標準）の少なくとも５つの濃度について得られたそれぞれの比の中央値シグナルに正規化された中央値を計算する工程、
ｂ）抗原１及び２への同時結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルと、抗原１への結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルとの比の中央値であって、抗体主産物（主産物標準）の少なくとも５つの濃度について得られたそれぞれの比の中央値シグナルに正規化された中央値を計算する工程、
ｃ）抗原２への結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルと、抗原１への結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルとの比の中央値であって、抗体関連副産物Ｉ（副産物Ｉ標準）の少なくとも５つの濃度について得られたそれぞれの比の中央値シグナルに正規化された中央値を計算する工程、及び
ｄ）抗原１及び２への同時結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルと、抗原１への結合についての同じ４つの濃度の細胞クローン培養上清について得られたシグナルとの比の中央値であって、抗体関連副産物ＩＩ（副産物ＩＩ標準）の少なくとも５つの濃度について得られたそれぞれの比の中央値シグナルに正規化された中央値を計算する工程。
【0185】
特定の実施形態では、説明書は、ｉ）の計算された中央値及び決定された力価値を、二重特異性抗体を発現する組換え細胞クローンの品質カテゴリ予測のためのモデルに当てはめることをさらに含む。好ましい一実施形態では、モデルはＸＧＢモデルである。
【0186】
特定の実施形態では、システムは、クローン採取装置、並びに、濃度、結合シグナル及び二重特異性抗体の除算した比に関する最小の差と副産物の除算した比に関する最大の差との組み合わせに基づいてクローンを選択する工程である最終工程ｖｉｉｉ）をさらに含む。
【0187】
本発明のさらなる態様は、コンピュータ又はコンピュータネットワーク上でプログラムが実行される場合に、本明細書に添付された実施形態のうちの１つ又は複数において本発明による方法を実施するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータプログラムである。具体的には、コンピュータプログラムは、コンピュータ可読データ媒体に記憶され得る。したがって、具体的には、上記の方法工程ｉ）～ｖｉｉ）のうちの１つ、１つよりも多く、又はさらにすべて、任意に方法工程ａ）～ｄ）のうちの１つ、１つよりも多く、又はさらにすべて、さらに任意に工程ｖｉｉｉ）は、コンピュータ又はコンピュータネットワークを使用することによって、好ましくはコンピュータプログラムを使用することによって実行され得る。
【0188】
本発明のさらなる態様は、プログラムがコンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行される場合に、本明細書に添付された実施形態のうちの１つ又は複数において本発明による方法を実行するために、プログラムコード手段を有するコンピュータプログラム製品である。具体的には、プログラムコード手段は、コンピュータ可読データキャリアに記憶され得る。
【0189】
本発明のさらなる態様は、コンピュータ又はコンピュータネットワークの作業メモリ又はメインメモリなどのコンピュータ又はコンピュータネットワークへとロードされた後に、その実施形態の１つ又は複数において本発明による方法を実行し得るデータ構造を格納したデータキャリアである。
【0190】
本発明のさらなる態様は、プログラムがコンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行される場合に、その実施形態の１つ又は複数において本発明による方法を実行するために、マシン可読キャリアに格納されたプログラムコードを有するコンピュータプログラム製品である。
【0191】
本明細書中で用いられる場合、「コンピュータプログラム製品」は、取引可能な製品としてのプログラムを指す。製品は、一般的に、紙のフォーマットなどの任意のフォーマットで、又はコンピュータ可読データキャリア上に存在することができる。具体的には、コンピュータプログラム製品は、データネットワーク上で配信されてもよい。
【0192】
最後に、本発明によるさらなる態様は、その実施形態の１つ又は複数において本発明による方法を実行するための、コンピュータシステム又はコンピュータネットワークによって読み取り可能な命令を含む変調データシグナルである。
【0193】
コンピュータによって実現される本発明の態様に関して、本明細書に開示の実施形態のうちの１つ以上による方法の方法工程のうちの１つ以上又はすべての方法工程を、コンピュータ又はコンピュータネットワークを使用することによって実行し得る。したがって、一般に、データの提供及び／又は操作を含む方法工程のいずれかを、コンピュータ又はコンピュータネットワークを使用することによって実行し得る。一般に、これらの方法工程は、典型的にはサンプルの提供及び／又は実際の測定を実行する特定の態様などの手作業を必要とする方法工程を除いて、任意の方法工程を含み得る。
【0194】
具体的には、本明細書において、以下がさらに開示される。
－ 少なくとも１つのプロセッサを備え、プロセッサは、その実施形態のうちの１つにおいて本発明による方法を実行するように構成されるコンピュータ又はコンピュータネットワーク、
－ データ構造がコンピュータ上で実行されている間に、その実施形態のうちの１つにおいて本発明による方法を実行するように適合されるコンピュータロード可能データ構造、
－ プログラムがコンピュータ上で実行されている間に、その実施形態のうちの１つにおいて本発明による方法を実行するように適合されたコンピュータプログラム、
－ コンピュータプログラムがコンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行されている間に、その実施形態のうちの１つにおいて本発明による方法を実行するためのプログラム手段を含むコンピュータプログラム、
－ 本明細書に示される実施形態のいずれかによるプログラム手段をコンピュータにとって読み取り可能な記憶媒体上に格納して備えているコンピュータプログラム、
－ データ構造が記憶媒体に記憶され、データ構造が、コンピュータ若しくはコンピュータネットワークの主記憶装置及び／又は作業記憶装置にロードされた後、その実施形態のうちの１つにおいて本発明による方法を実行するように適合された、記憶媒体、及び
－ 記憶媒体上に格納可能又は格納されたプログラムコード手段を有しており、プログラムコード手段がコンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行された場合に、その実施形態のうちの１つにおいて本発明による方法が実行されるコンピュータプログラム製品。
－ 少なくとも１つのプロセッサを備え、プロセッサは、その実施形態のうちの１つにおいて本発明による方法を実行するように構成されるコンピュータ又はコンピュータネットワーク、
－ データ構造がコンピュータ上で実行されている間に、その実施形態のうちの１つにおいて本発明による方法を実行するように適合されるコンピュータロード可能データ構造、
－ プログラムがコンピュータ上で実行されている間に、その実施形態のうちの１つにおいて本発明による方法を実行するように適合されたコンピュータプログラム、
－ コンピュータプログラムがコンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行されている間に、その実施形態のうちの１つにおいて本発明による方法を実行するためのプログラム手段を含むコンピュータプログラム、
－ 本明細書に示される実施形態のいずれかによるプログラム手段をコンピュータにとって読み取り可能な記憶媒体上に格納して備えているコンピュータプログラム、
－ データ構造が記憶媒体に記憶され、データ構造が、コンピュータ若しくはコンピュータネットワークの主記憶装置及び／又は作業記憶装置にロードされた後、その実施形態のうちの１つにおいて本発明による方法を実行するように適合された、記憶媒体、及び
－ 記憶媒体上に格納可能又は格納されたプログラムコード手段を有しており、プログラムコード手段がコンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行された場合に、その実施形態のうちの１つにおいて本発明による方法が実行されるコンピュータプログラム製品。
【0195】
以下の実施例及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲において説明される。
【0196】
本発明の要旨から逸脱することなく、記載された手順に変更を加えることができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【0197】
【図1】単一濃度についてのＣｒｏｓｓＭａｂフォーマットにおける二重特異性抗体についての抗原結合ＥＬＩＳＡ読み出し（ＡＧ２対ＡＧ１）の例示的なカテゴリー化。
【図2】単一濃度についてのＴＣＢフォーマットにおける二重特異性抗体についての抗原結合ＥＬＩＳＡ読み出し（ＡＧ２対ＡＧ１）の例示的なカテゴリー化。
【図3】単一濃度についてのＢＳフォーマットにおける二重特異性抗体についての抗原結合ＥＬＩＳＡ読み出し（ＡＧ２対ＡＧ１）の例示的なカテゴリー化。
【図4】モデル訓練に利用されていないプロジェクト全体の交差エントロピー損失（ｙ軸）によって評価されるモデル予測品質。各前処理変形１～８について、左から右に、ＴＣＢ－１；２＋１ヘッド－トゥ－テール；ＴＣＢ－２；ＴＣＢ－３；ＣｒｏｓｓＭａｂ．
【図5】５つの分析されたプロジェクトすべてにわたって「正しく組み立てられた二重特異性抗体」としてカテゴリー化されるための偽陽性及び偽陰性の予測［％］。
【図6】手動のみの分析（上）と本発明による方法（下）の比較。上のグラフにおいて、抗原２（ＡＧ２）への結合は、抗原１（ＡＧ１）への結合に対してプロットされている。図は、アルゴリズムを訓練するために使用されていない、単一のプロジェクトからの６１０個のモノクローナル細胞株のデータを示す。サイズは、予測精度を示す。
【図7】手動のみの分析（上）と本発明による方法（下）の比較。クローン数に対してプロットされた主産物標準比ＡＧ２：ＡＧ１結合シグナルの中央値に対して正規化された比ＡＧ２：ＡＧ１結合シグナルの中央値。
【図8】手動のみの分析（上）と本発明による方法（下）の比較。クローン数に対してプロットされた主産物標準比ＡＧ１２：ＡＧ１結合シグナルの中央値に対して正規化された比ＡＧ１２：ＡＧ１結合シグナルの中央値。
【図9】手動のみの分析（上）と本発明による方法（下）の比較。クローン数に対してプロットされた副産物Ｉ標準比ＡＧ２：ＡＧ１結合シグナルの中央値に対して正規化された比ＡＧ２：ＡＧ１結合シグナルの中央値。
【図10】手動のみの分析（上）と本発明による方法（下）の比較。クローン数に対してプロットされた副産物ＩＩ標準比ＡＧ２：ＡＧ１結合シグナルの中央値に対して正規化された比ＡＧ１２：ＡＧ１結合シグナルの中央値。
【図11】産物品質に基づくクローンの選択のための本発明による方法の使用（パート１）。分析した２つの抗体濃度（５０ｎｇ／ｍＬ、１．９５ｎｇ／ｍＬ）のカテゴリー化を示す。多様な抗体品質を産生する合計６１０個のクローン（図１１及び図１２を合わせて）を表示する。
【図12】産物品質に基づくクローンの選択のための本発明による方法の使用（パート２）。分析した２つの抗体濃度（９．９ｎｇ／ｍＬ、０．３９ｎｇ／ｍＬ）のカテゴリー化を示す。多様な抗体品質を産生する合計６１０個のクローン（図１１及び図１２を合わせて）を表示する。
【図13】産物品質に基づくクローンの選択のための本発明による方法の使用（パート３）。分析した２つの抗体濃度（５０ｎｇ／ｍＬ、１．９５ｎｇ／ｍＬ）の結果を示す。抗体品質に基づいて本発明による方法で選択された合計１６０個のクローンが表示されている（図１３及び図１４を合わせて）。
【図14】産物品質に基づくクローンの選択のための本発明による方法の使用（パート４）。分析した２つの抗体濃度（９．９ｎｇ／ｍＬ、０．３９ｎｇ／ｍＬ）の結果を示す。抗体品質に基づいて本発明による方法で選択された合計１６０個のクローンが表示されている（図１３及び図１４を合わせて）。
【図15】二重特異性抗体フォーマット及びそれらの共通の副産物。
【図16】クローンに基づく産物力価。
【実施例】
【0198】
実施例１
一般的な技術
１）組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，（１９８９）において説明されるように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書に従って使用した。
一般的な技術
１）組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，（１９８９）において説明されるように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書に従って使用した。
【0199】
２）ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ ＧｍｂＨ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施された。
ＤＮＡ配列決定は、ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ ＧｍｂＨ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施された。
【0200】
３）ＤＮＡ及びタンパク質配列解析及び配列データ管理
ＥＭＢＯＳＳ（欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート）ソフトウェアパッケージ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン１１．５を、配列の作成、マッピング、解析、アノテーション、及び図示のために使用した。
ＥＭＢＯＳＳ（欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート）ソフトウェアパッケージ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン１１．５を、配列の作成、マッピング、解析、アノテーション、及び図示のために使用した。
【0201】
４）遺伝子及びオリゴヌクレオチド合成
所望の遺伝子セグメントは、Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）での化学合成によって調製された。合成された遺伝子断片を、増殖／増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって検証した。あるいは、短い合成ＤＮＡ断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングするか、ＰＣＲを介して組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドは、ｍｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ（Ｐｌａｎｅｇｇ－Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製された。
所望の遺伝子セグメントは、Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）での化学合成によって調製された。合成された遺伝子断片を、増殖／増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって検証した。あるいは、短い合成ＤＮＡ断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングするか、ＰＣＲを介して組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドは、ｍｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ（Ｐｌａｎｅｇｇ－Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製された。
【0202】
５）試薬
特に明記されていない限り、すべての市販の化学物質、抗体、及びキットは、製造元のプロトコルに従って提供されたとおりに使用した。
特に明記されていない限り、すべての市販の化学物質、抗体、及びキットは、製造元のプロトコルに従って提供されたとおりに使用した。
【0203】
６）宿主細胞株の培養
ＣＨＯ宿主細胞を、湿度８５％、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で３７℃で培養した。それらを、選択剤を含有する専売のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地中で培養した。細胞を３又は４日ごとに分割した。培養には、１２５ｍｌの非バッフル三角振盪フラスコを使用した。細胞を振盪振幅５ｃｍで１５０ｒｐｍで振盪した。細胞数はＣｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）で測定した。細胞は６０日齢に達するまで培養を続けた。
ＣＨＯ宿主細胞を、湿度８５％、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で３７℃で培養した。それらを、選択剤を含有する専売のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地中で培養した。細胞を３又は４日ごとに分割した。培養には、１２５ｍｌの非バッフル三角振盪フラスコを使用した。細胞を振盪振幅５ｃｍで１５０ｒｐｍで振盪した。細胞数はＣｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）で測定した。細胞は６０日齢に達するまで培養を続けた。
【0204】
７）クローニング
核酸のクローニングは、当業者に公知の手順に基づいて、又は製造業者のプロトコルに従って行われてきた。
核酸のクローニングは、当業者に公知の手順に基づいて、又は製造業者のプロトコルに従って行われてきた。
【0205】
一般に、Ｒ部位でのクローニングは、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の隣にあるＤＮＡ配列に依存し、これは次の断片にある配列と等しい配列である。このように、断片の組立ては、等しい配列の重なりと、それに続く、組み立てられたＤＮＡのニックのＤＮＡリガーゼによる封鎖によって可能になる。これらの予備ベクターのクローニングが成功した後、Ｒ部位で挟まれている目的の遺伝子は、Ｒ部位のすぐ隣を切断する酵素による制限消化を介して切り出される。一工程でのすべてのＤＮＡ断片の組み立てのために、５’－エキソヌクレアーゼは、重複領域（Ｒ部位）の５’末端を除去する。その後、Ｒ部位のアニーリングを行なうことができ、ＤＮＡポリメラーゼが３’末端を伸長して配列のギャップを埋める。最後に、ＤＮＡリガーゼはヌクレオチド間のニックを封鎖する。エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼのような異なる酵素を含むアセンブリマスターミックスを添加し、その後反応ミックスを５０℃でインキュベートすると、単一の断片の１つのプラスミドへの組み立てをもたらす。その後、コンピテント大腸菌細胞をプラスミドで形質転換する。
【0206】
一部のベクターでは、制限酵素を介したクローニング戦略を使用した。適切な制限酵素を選択することにより、望みの目的の遺伝子を切り出し、その後、ライゲーションによって別のベクターに挿入することができる。したがって、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）で切断する酵素を使用し、正しいアレイ内の断片のライゲーションを実行できるように選択することが好ましい。ベクターと断片が以前に同じ制限酵素で切断されている場合、断片とベクターの粘着末端は互いに適合し、その後ＤＮＡリガーゼでライゲーションすることができる。ライゲーション後、コンピテント大腸菌細胞を新しく作製されたプラスミドで形質転換する。
【0207】
形質転換のために、１０個のベータコンピテント大腸菌細胞を製造業者のプロトコルに従って使用した。プラスミドの組み込みに成功しアンピシリンに対する耐性遺伝子を持っている細菌だけが、それぞれのプレート上で増殖可能である。単一コロニーを採取し、その後のプラスミド調製のためにＬＢ－Ａｍｐ培地で培養した。
【0208】
細菌培養物
大腸菌の培養は、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉの略であるＬＢ培地で行い、１ｍｌ／Ｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを添加して、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリン濃度にした。
大腸菌の培養は、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉの略であるＬＢ培地で行い、１ｍｌ／Ｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを添加して、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリン濃度にした。
【0209】
１５ｍｌのチューブ（換気された蓋付き）に３．６ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地を充填し、細菌コロニーを均等に接種した。つまようじは取り除かずに、インキュベーションのあいだチューブ内に残した。チューブを３７℃、２００ｒｐｍで２３時間インキュベートした。１５ｍｌのチューブをインキュベーターから取り出し、３．６ｍｌの細菌培養物を２つの２ｍｌのエッペンドルフチューブに分割した。チューブを卓上マイクロ遠心機で６，８００×ｇで室温で３分間遠心分離した。その後、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎミニプレップ・キットを使用して、製造元の指示に従ってミニプレップを実行した。プラスミドＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。
【0210】
エタノール沈殿
ＤＮＡ溶液の容量を２．５倍容量のエタノール１００％と混合した。混合物を、－２０℃で１０分間インキュベートした。次に、ＤＮＡを１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上澄みを注意深く除去し、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。この場合も、チューブを１４，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上澄みをピペッティングにより注意深く除去し、ペレットを乾燥させた。エタノールが蒸発したら、適量のエンドトキシンフリーの水を加えた。ＤＮＡを４℃で一晩、水に再溶解する時間を与えた。少量のアリコートを採取し、ＮａｎｏｄｒｏｐデバイスでＤＮＡ濃度を測定した。
ＤＮＡ溶液の容量を２．５倍容量のエタノール１００％と混合した。混合物を、－２０℃で１０分間インキュベートした。次に、ＤＮＡを１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上澄みを注意深く除去し、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。この場合も、チューブを１４，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上澄みをピペッティングにより注意深く除去し、ペレットを乾燥させた。エタノールが蒸発したら、適量のエンドトキシンフリーの水を加えた。ＤＮＡを４℃で一晩、水に再溶解する時間を与えた。少量のアリコートを採取し、ＮａｎｏｄｒｏｐデバイスでＤＮＡ濃度を測定した。
【0211】
実施例２
プラスミドの作製
発現カセットの組成
抗体鎖の発現には、以下の機能的要素を含む転写単位を使用した：
－ イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
－ ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－ マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ それぞれの抗体鎖をコードする核酸、
－ ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）、及び
－ 任意に、ヒトガストリンターミネーター（ｈＧＴ）。
プラスミドの作製
発現カセットの組成
抗体鎖の発現には、以下の機能的要素を含む転写単位を使用した：
－ イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
－ ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－ マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ それぞれの抗体鎖をコードする核酸、
－ ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）、及び
－ 任意に、ヒトガストリンターミネーター（ｈＧＴ）。
【0212】
発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットのほかに、基本的／標準的な哺乳動物発現プラスミドは、
－ 大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、及び
－ 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子を含む。
－ 大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、及び
－ 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子を含む。
【0213】
フロント及びバックベクタークローニング
２プラスミド抗体構築物を構築するために、抗体ＨＣ及びＬＣを、Ｌ３及びＬｏｘＦＡＳ配列を含む前方ベクター骨格、並びにＬｏｘＦＡＳ及び２Ｌ配列並びに選択マーカーを含む後方ベクターにクローニングした。ＣｒｅリコンビナーゼプラスミドｐＯＧ２３１（Ｗｏｎｇ，Ｅ．Ｔ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１９９７）１４６０２－１４６０７）を、すべてのＲＭＣＥプロセスに使用した。
２プラスミド抗体構築物を構築するために、抗体ＨＣ及びＬＣを、Ｌ３及びＬｏｘＦＡＳ配列を含む前方ベクター骨格、並びにＬｏｘＦＡＳ及び２Ｌ配列並びに選択マーカーを含む後方ベクターにクローニングした。ＣｒｅリコンビナーゼプラスミドｐＯＧ２３１（Ｗｏｎｇ，Ｅ．Ｔ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１９９７）１４６０２－１４６０７）を、すべてのＲＭＣＥプロセスに使用した。
【0214】
それぞれの抗体鎖をコードするｃＤＮＡを、遺伝子合成（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）によって作製した。３７℃で１時間、遺伝子合成物及びバックボーンベクターをＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ及びＥｃｏＲＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）で消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離した。挿入断片及びバックボーンのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。製造業者のプロトコルに従って迅速ライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、３：１の挿入断片／バックボーン比で、精製した挿入断片及びバックボーン断片をライゲーションした。次いで、４２℃で３０秒間の熱ショックによってライゲーションアプローチをコンピテント大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、３７℃で１時間インキュベートした後、選択用のアンピシリンを含む寒天プレートに播種した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【0215】
翌日、クローンを採取し、調製のために振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。これは、ＥｐＭｏｔｉｏｎ（登録商標）５０７５（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、又はそれぞれＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）／ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ ＸｔｒａマキシＥＦキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ）を用いて、実施した。すべてのコンストラクトを配列決定して、いかなる不適切な突然変異も存在しないように徹底した（ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ ＧｍｂＨ）。
【0216】
第２のクローニング工程において、第１のクローニングの場合と同じ条件を用いて、あらかじめクローニングしたベクターをＫｐｎＩ－ＨＦ／ＳａｌＩ－ＨＦ及びＳａｌＩ－ＨＦ／ＭｆｅＩ－ＨＦで消化した。バックボーンベクターをＫｐｎＩ－ＨＦ及びＭｆｅＩ－ＨＦで消化した。分離及び抽出を、前述したようにして実施した。製造業者のプロトコルに従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、１：１：１の挿入断片／挿入断片／バックボーン比で、精製した挿入断片及びバックボーンのライゲーションを４℃で一晩実施し、６５℃で１０分間、不活性化した。前述したようにして、下記のクローニング工程を実施した。
【0217】
実施例３
培養、トランスフェクション、選択及び単一細胞クローニング
宿主細胞を、独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地中で、１５０ｒｐｍの一定の撹拌速度で、標準的な加湿条件下（９５％ｒＨ、３７℃、及び５％ＣＯ２）で、使い捨て１２５ｍｌベント・シェイク・フラスコ内にて増殖させた。３～４日ごとに、細胞を、選択マーカー１及び選択マーカー２を有効濃度で含む合成培地に、３ｘ１０Ｅ５細胞／ｍｌの濃度で播種した。培養物の密度と生存率を、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ細胞カウンタ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で測定した。
培養、トランスフェクション、選択及び単一細胞クローニング
宿主細胞を、独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地中で、１５０ｒｐｍの一定の撹拌速度で、標準的な加湿条件下（９５％ｒＨ、３７℃、及び５％ＣＯ２）で、使い捨て１２５ｍｌベント・シェイク・フラスコ内にて増殖させた。３～４日ごとに、細胞を、選択マーカー１及び選択マーカー２を有効濃度で含む合成培地に、３ｘ１０Ｅ５細胞／ｍｌの濃度で播種した。培養物の密度と生存率を、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ細胞カウンタ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で測定した。
【0218】
安定したトランスフェクションのために、等モル量のフロントベクターとバックベクターを混合した。１μｇのＣｒｅ発現プラスミドを、５μｇの混合物に添加した。
【0219】
トランスフェクションの２日前に、宿主細胞を、４ｘ１０Ｅ５細胞／ｍｌの密度で、新鮮な培地に播種した。トランスフェクションは、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＶ（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、製造元のプロトコルに従ってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイスで実施した。３ｘ１０Ｅ７の細胞を、３０μｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、選択剤を含まない３０ｍｌの培地に播種した。
【0220】
播種後５日目に細胞を遠心分離し、組換え細胞の選択のために６ｘ１０Ｅ５細胞／ ｍｌの有効濃度の選択剤１と選択剤２を含む合成培地８０ｍＬに移した。細胞を３７℃、１５０ｒｐｍでインキュベートした。この日から５％ＣＯ２、８５％湿度で、分割はしなかった。培養物の細胞密度及び生存率を定期的にモニターした。培養物の生存率が再び増加し始めたとき、選択剤１及び２の濃度を、以前に使用した量の約半分に減少させた。
【0221】
選択を開始してから１０日後、細胞内マーカー及び細胞表面に結合した二重特異性抗体の発現を測定するフローサイトメトリーによって、Ｃｒｅ媒介性カセット交換の成功を確認した。ＦＡＣＳ染色のために、ヒト抗体の軽鎖及び重鎖に対するＡＰＣ抗体（アロフィコシアニン標識Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ）を使用した。フローサイトメトリーは、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。サンプルあたり１万事象を測定した。生細胞を、側方散乱（ＳＳＣ）に対する前方散乱（ＦＳＣ）のプロットでゲートした。生細胞ゲートは、トランスフェクトされていない宿主細胞で定義され、ＦｌｏｗＪｏ ７．６．５ ＥＮソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、オルテン、スイス）を用いて、すべてのサンプルに適用された。細胞内マーカーの蛍光を、ＦＩＴＣチャネル（４８８ｎｍでの励起、５３０ｎｍでの検出）で定量化した。二重特異性抗体を、ＡＰＣチャネル（６４５ｎｍでの励起、６６０ｎｍでの検出）で測定した。ＣＨＯ親細胞、すなわち宿主細胞の作製に使用された細胞を、細胞内マーカー及び二重特異性抗体の発現に対するネガティブコントロールとして使用した。選択開始から１４日後、生存率は９０％を超え、選択は完了したとみなされた。
【0222】
実施例４
ＦＡＣＳスクリーニング
ＦＡＣＳ解析を実施して、トランスフェクション効率を調べた。トランスフェクトされたアプローチの４×１０Ｅ５細胞を遠心分離し（１２００ｒｐｍ、４分）、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを用いる洗浄工程の後、沈殿物を４００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳチューブ（セルストレーナーキャップ付きのＦａｌｃｏｎ（登録商標）丸底チューブ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩを用いて測定を実施し、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏを用いてデータを解析した。
ＦＡＣＳスクリーニング
ＦＡＣＳ解析を実施して、トランスフェクション効率を調べた。トランスフェクトされたアプローチの４×１０Ｅ５細胞を遠心分離し（１２００ｒｐｍ、４分）、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを用いる洗浄工程の後、沈殿物を４００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳチューブ（セルストレーナーキャップ付きのＦａｌｃｏｎ（登録商標）丸底チューブ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩを用いて測定を実施し、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏを用いてデータを解析した。
【0223】
実施例５
単一細胞のクローニング
耐性プールを、３８４ウェルプレートにおいて０．６細胞／ウェルで限界希釈することによって、単一細胞クローニングに供した。播種前に、プールを生細胞蛍光色素である５－クロロメチルフルオレセインジアセテート（ＣＭＦＤＡ）で染色した。播種後、プレートを遠心分離し、蛍光モード及び明視野モードの両方で各ウェルから画像を取得した。蛍光イメージングは、明視野画像で観察されるように、生細胞の検出及び細胞様アーチファクトに対する分化を可能にする。播種の約２週間後、明視野イメージングによってコンフルエンスを決定した。単一細胞に由来すると同定されたコロニーを９６ウェルプレートに拡大し、力価及び標的抗原への結合についてＥＬＩＳＡによって分析した。
単一細胞のクローニング
耐性プールを、３８４ウェルプレートにおいて０．６細胞／ウェルで限界希釈することによって、単一細胞クローニングに供した。播種前に、プールを生細胞蛍光色素である５－クロロメチルフルオレセインジアセテート（ＣＭＦＤＡ）で染色した。播種後、プレートを遠心分離し、蛍光モード及び明視野モードの両方で各ウェルから画像を取得した。蛍光イメージングは、明視野画像で観察されるように、生細胞の検出及び細胞様アーチファクトに対する分化を可能にする。播種の約２週間後、明視野イメージングによってコンフルエンスを決定した。単一細胞に由来すると同定されたコロニーを９６ウェルプレートに拡大し、力価及び標的抗原への結合についてＥＬＩＳＡによって分析した。
【0224】
実施例６
ＥＬＩＳＡに基づく力価決定
希釈緩衝液（＝１ｘＰＢＳ（０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．０）、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ＃ ９００５－６４－５））中の０．２５μｇ／ｍＬのビオチン化Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃｙ ｓｐｅｃ．；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃１０９－０６６－０９８）及び検出抗体ＰＯＤコンジュゲートＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃｙ ｓｐｅｃ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃１０９－０３６－０９８）の混合物を、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、３８４ウェル、＃８４００１０；２０μＬ／ウェル）に添加した。対照抗体（ＴＣＢ）を希釈緩衝液で０．２μｇ／ｍＬの出発濃度に希釈し、１２個の希釈液（希釈係数１：２）をアッセイプレートに移した（１０μＬ／ウェル）。培養上清をアッセイプレート（１０μＬ／ウェル）に添加し、プレートを撹拌なしで室温で１時間インキュベートした。ウェルを、それぞれ９０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（＝１ｘＰＢＳ（０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．０）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ＃ ９００５－６４－５））で６回洗浄した。その後、３０μＬ／ウェルの検出基質ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ，ＫＰＬ ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，Ｃａｔ＃ ５１２０－００８７）を添加し、撹拌なしで室温で５分間インキュベートした。吸光度測定は、Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ ＨＴリーダー（ＢｉｏＴｅＫ）を使用して３７０ｎｍの波長で行った。サンプル及び対照抗体のすべてのＥＬＩＳＡシグナル（生データ）を、希釈緩衝液のみを含有するウェルについて測定されたシグナルの減算によってブランク補正した（ブランク補正データ）。１２の濃度の対照抗体のブランク補正シグナルを使用して、標準曲線（線形回帰）を計算した。対照抗体の線形回帰式を用いて抗体力価を算出した。
ＥＬＩＳＡに基づく力価決定
希釈緩衝液（＝１ｘＰＢＳ（０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．０）、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ＃ ９００５－６４－５））中の０．２５μｇ／ｍＬのビオチン化Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃｙ ｓｐｅｃ．；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃１０９－０６６－０９８）及び検出抗体ＰＯＤコンジュゲートＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃｙ ｓｐｅｃ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃１０９－０３６－０９８）の混合物を、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、３８４ウェル、＃８４００１０；２０μＬ／ウェル）に添加した。対照抗体（ＴＣＢ）を希釈緩衝液で０．２μｇ／ｍＬの出発濃度に希釈し、１２個の希釈液（希釈係数１：２）をアッセイプレートに移した（１０μＬ／ウェル）。培養上清をアッセイプレート（１０μＬ／ウェル）に添加し、プレートを撹拌なしで室温で１時間インキュベートした。ウェルを、それぞれ９０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（＝１ｘＰＢＳ（０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．０）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ＃ ９００５－６４－５））で６回洗浄した。その後、３０μＬ／ウェルの検出基質ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ，ＫＰＬ ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，Ｃａｔ＃ ５１２０－００８７）を添加し、撹拌なしで室温で５分間インキュベートした。吸光度測定は、Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ ＨＴリーダー（ＢｉｏＴｅＫ）を使用して３７０ｎｍの波長で行った。サンプル及び対照抗体のすべてのＥＬＩＳＡシグナル（生データ）を、希釈緩衝液のみを含有するウェルについて測定されたシグナルの減算によってブランク補正した（ブランク補正データ）。１２の濃度の対照抗体のブランク補正シグナルを使用して、標準曲線（線形回帰）を計算した。対照抗体の線形回帰式を用いて抗体力価を算出した。
【0225】
実施例７
ＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ
希釈緩衝液（＝１ｘＰＢＳ（０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．０）、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ＃ ９００５－６４－５））中の０．０３μｇ／ｍＬビオチン化抗原１－ヒトＦｃ領域（ｈｕＦｃ）コンジュゲート又は０．２５μｇ／ｍＬビオチン化抗原２－ヒトＦｃ領域コンジュゲート及び検出抗体抗ヒトＦ（ａｂ）２－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃１０９－０３６－００６；１：５０００ ｉ．Ａ．）のプレミックスをストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ；３８４ウェル、＃８４００１０；２０μＬ／ウェル）に添加した。上清及び対照抗体を希釈緩衝液中０．０５μｇ／ｍＬの出発濃度に希釈し、ウェルに移し（５μＬ／ウェル）、撹拌なしで室温で１時間インキュベートした。精製された抗体主産物（ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体）及び２つの抗体副産物（ホール・ホール及びノブ・ノブ、それぞれホモ二量体）を、それぞれ１：１．５の希釈係数で１４希釈で添加し、サンプルをそれぞれ１：５．０６２５の希釈係数で４希釈で適用した。ウェルを、９０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（＝１ｘＰＢＳ（０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．０）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ＃ ９００５－６４－５））で６回洗浄した。その後、３０μＬ／ウェルの検出基質ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ，ＫＰＬ ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，Ｃａｔ＃ ５１２０－００８７）を添加し、撹拌なしで室温で５分間インキュベートした。吸光度測定は、ＥｎＶｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して３７０ｎｍの波長で行った。
ＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ
希釈緩衝液（＝１ｘＰＢＳ（０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．０）、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ＃ ９００５－６４－５））中の０．０３μｇ／ｍＬビオチン化抗原１－ヒトＦｃ領域（ｈｕＦｃ）コンジュゲート又は０．２５μｇ／ｍＬビオチン化抗原２－ヒトＦｃ領域コンジュゲート及び検出抗体抗ヒトＦ（ａｂ）２－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃１０９－０３６－００６；１：５０００ ｉ．Ａ．）のプレミックスをストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ；３８４ウェル、＃８４００１０；２０μＬ／ウェル）に添加した。上清及び対照抗体を希釈緩衝液中０．０５μｇ／ｍＬの出発濃度に希釈し、ウェルに移し（５μＬ／ウェル）、撹拌なしで室温で１時間インキュベートした。精製された抗体主産物（ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体）及び２つの抗体副産物（ホール・ホール及びノブ・ノブ、それぞれホモ二量体）を、それぞれ１：１．５の希釈係数で１４希釈で添加し、サンプルをそれぞれ１：５．０６２５の希釈係数で４希釈で適用した。ウェルを、９０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（＝１ｘＰＢＳ（０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．０）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ＃ ９００５－６４－５））で６回洗浄した。その後、３０μＬ／ウェルの検出基質ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ，ＫＰＬ ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，Ｃａｔ＃ ５１２０－００８７）を添加し、撹拌なしで室温で５分間インキュベートした。吸光度測定は、ＥｎＶｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して３７０ｎｍの波長で行った。
【0226】
実施例８
架橋ＥＬＩＳＡ ＡＧ１２
非ビオチン化抗原２－ｈｕＦｃコンジュゲートを希釈緩衝液中０．５μｇ／ｍＬの濃度でマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，ＭａｘｉＳｏｒｐ，＃４６４７１８）に直接コーティングし、撹拌なしで４°Ｃで一晩インキュベートした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液をそれぞれ含む３×９０μＬ／ウェル；１ｘＰＢＳ（０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．０）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ＃ ９００５－６４－５））、９０μＬブロッキング緩衝液（希釈緩衝液中２％ ＢＳＡ）で３０分間ブロッキングし、プレートを再度洗浄した後（洗浄緩衝液でそれぞれ３×９０μＬ／ウェル）、サンプル及び対照抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。精製された主産物（ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体）及び２つの主副産物（ホール・ホール及びノブ・ノブ、それぞれホモ二量体）を、それぞれ１：１．５の希釈係数で１４希釈で添加し、サンプルをそれぞれ１：５．０６２５の希釈係数で４希釈で適用した。プレートを洗浄した後（洗浄緩衝液で３×９０μＬ／ウェル）、ビオチン化抗原１－ｈｕＦｃコンジュゲートとストレプトアビジンＰＯＤコンジュゲート（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）との混合物２５μＬを適用した。ウェルをそれぞれ９０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で６回洗浄した。その後、３０μＬ／ウェルの検出基質ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ，ＫＰＬ ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，Ｃａｔ＃ ５１２０－００８７）を添加し、撹拌なしで室温で５分間インキュベートした。吸光度測定は、ＥｎＶｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して３７０ｎｍの波長で行った。
架橋ＥＬＩＳＡ ＡＧ１２
非ビオチン化抗原２－ｈｕＦｃコンジュゲートを希釈緩衝液中０．５μｇ／ｍＬの濃度でマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，ＭａｘｉＳｏｒｐ，＃４６４７１８）に直接コーティングし、撹拌なしで４°Ｃで一晩インキュベートした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液をそれぞれ含む３×９０μＬ／ウェル；１ｘＰＢＳ（０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．０）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ＃ ９００５－６４－５））、９０μＬブロッキング緩衝液（希釈緩衝液中２％ ＢＳＡ）で３０分間ブロッキングし、プレートを再度洗浄した後（洗浄緩衝液でそれぞれ３×９０μＬ／ウェル）、サンプル及び対照抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。精製された主産物（ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体）及び２つの主副産物（ホール・ホール及びノブ・ノブ、それぞれホモ二量体）を、それぞれ１：１．５の希釈係数で１４希釈で添加し、サンプルをそれぞれ１：５．０６２５の希釈係数で４希釈で適用した。プレートを洗浄した後（洗浄緩衝液で３×９０μＬ／ウェル）、ビオチン化抗原１－ｈｕＦｃコンジュゲートとストレプトアビジンＰＯＤコンジュゲート（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）との混合物２５μＬを適用した。ウェルをそれぞれ９０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で６回洗浄した。その後、３０μＬ／ウェルの検出基質ＴＭＢ（ＳｅｒａＣａｒｅ，ＫＰＬ ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，Ｃａｔ＃ ５１２０－００８７）を添加し、撹拌なしで室温で５分間インキュベートした。吸光度測定は、ＥｎＶｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して３７０ｎｍの波長で行った。
【0227】
実施例９
機械学習
入力データ
各細胞クローンについて、抗体価、抗原１への結合、抗原２への結合、並びに抗原１及び２への同時結合についてのＥＬＩＳＡアッセイからのブランク補正読み取り値を入力データとして使用した。
機械学習
入力データ
各細胞クローンについて、抗体価、抗原１への結合、抗原２への結合、並びに抗原１及び２への同時結合についてのＥＬＩＳＡアッセイからのブランク補正読み取り値を入力データとして使用した。
【0228】
標的変数（機械学習において、ラベルと呼ばれる）として、歴史的プロジェクトからのヒト専門家による細胞クローン上清の５つの異なる産物カテゴリ（リード、副産物Ｉ、副産物ＩＩ、非結合及び未定義）への分類を利用した。
【0229】
データのさらなる操作を実行し（特徴エンジニアリング）、入力データに加えてモデルに入力した。
【0230】
特徴の操作
予測モデルを構築するために、８つの異なるデータ処理変形が使用されている。したがって、ＥＬＩＳＡアッセイからのブランク補正読み取り値を、以下の表に示すように様々な方法で変換した。
予測モデルを構築するために、８つの異なるデータ処理変形が使用されている。したがって、ＥＬＩＳＡアッセイからのブランク補正読み取り値を、以下の表に示すように様々な方法で変換した。
【0231】
【0232】
詳細には、処理変形は以下の通りであった。
【0233】
処理変形番号１：上清の結合及び架橋ＥＬＩＳＡアッセイデータ（候補クローンの上清の吸光度補正ＥＬＩＳＡシグナル）及び決定された総抗体価のみを使用した；これはベースライン実験であり；利用したデータはすべての連続実験の一部であった。
【0234】
処理変形番号２～８：３つの標準リード（１００％精製された主産物）、副産物Ｉ（１００％精製副産物Ｉ、ホール・ホールホモ二量体）及び副産物ＩＩ（１００％精製副産物ＩＩ、ノブ・ノブホモ二量体）のアッセイ読み取り値をデータセットに追加したか（変形２）、又は改変形態で使用した（変形３～８）；各標準を１４の異なる濃度で決定した（標準曲線）；変形２～５については、線形アッセイ範囲内のこれらの濃度のうちの４つを計算のために選択した。
【0235】
変形６～８については、分析した１４の濃度のすべての中央値を使用したので、選択工程は必要としなかった。
【0236】
変形番号３～８は、１つ又は３つすべての標準からのデータに対して正規化されたデータを含んでいた。変形３は、リード標準に対して正規化されたサンプル値を利用したが、変形４は、３つすべての標準に対して正規化された値で機能した。
【0237】
変形番号５～８は、単純な値の代わりに比を含み、３つすべての標準に対して正規化された値として利用した。９つの可能な正規化された比のうち、変形７は９つすべてを含んでいたが、変形８は選択された４つのみを利用した。
【0238】
訓練
訓練のために、３つのプロジェクトをプールし、４番目のプロジェクトは最終モデル評価のために保留した（目に見えない試験データセット）。次いで、訓練データをモデル構築及びハイパーパラメータ最適化に使用した。Ｈ２Ｏ．ａｉのドライバレスＡＩツール形式を使用して、機械学習モデルを自動的に生成した。各処理変形（上記の表を参照）を使用してデータセットを生成し、その上で訓練及び評価を行った。
訓練のために、３つのプロジェクトをプールし、４番目のプロジェクトは最終モデル評価のために保留した（目に見えない試験データセット）。次いで、訓練データをモデル構築及びハイパーパラメータ最適化に使用した。Ｈ２Ｏ．ａｉのドライバレスＡＩツール形式を使用して、機械学習モデルを自動的に生成した。各処理変形（上記の表を参照）を使用してデータセットを生成し、その上で訓練及び評価を行った。
【0239】
試験
次いで、（最良のハイパーパラメータセットを有する）最終モデルのみを、目に見えない試験データセットに交差エントロピー損失関数を適用することによってスコア化した（プロジェクト４）。
次いで、（最良のハイパーパラメータセットを有する）最終モデルのみを、目に見えない試験データセットに交差エントロピー損失関数を適用することによってスコア化した（プロジェクト４）。
【0240】
参考文献
Ｓｃｉｋｉｔ－ｌｅａｒｎ：Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ｉｎ Ｐｙｔｈｏｎ，Ｐｅｄｒｅｇｏｓａ ｅｔ ａｌ．，ＪＭＬＲ １２，ｐｐ．２８２５－２８３０，２０１１．
Ｓｃｉｋｉｔ－ｌｅａｒｎ：Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ｉｎ Ｐｙｔｈｏｎ，Ｐｅｄｒｅｇｏｓａ ｅｔ ａｌ．，ＪＭＬＲ １２，ｐｐ．２８２５－２８３０，２０１１．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【国際調査報告】