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▶ クリエイティブ バイオセラピューティクス エルエルシーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-25
(54)【発明の名称】クリングル５サブユニットを持つ抗ウイルスタンパク質
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240315BHJP
C07K 14/745 20060101ALI20240315BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240315BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240315BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240315BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240315BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240315BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240315BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240315BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240315BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240315BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240315BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
C07K14/745 ZNA
C07K19/00
C07K14/705
C07K16/00
A61P31/12
A61K38/16
A61K47/68
A61K39/395 Y
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023562275
(86)(22)【出願日】2021-10-16
(85)【翻訳文提出日】2023-12-05
(86)【国際出願番号】 US2021055329
(87)【国際公開番号】W WO2022216316
(87)【国際公開日】2022-10-13
(31)【優先権主張番号】17/235,652
(32)【優先日】2021-04-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523382155
【氏名又は名称】クリエイティブ バイオセラピューティクス エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】デヴィッドソン ドナルド
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076CC35
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF68
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA17
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA20
4C084BA23
4C084BA44
4C084CA59
4C084NA14
4C084ZB331
4C085AA33
4C085BB31
4C085CC22
4C085EE01
4H045AA11
4H045BA09
4H045CA01
4H045CA42
4H045DA76
4H045DA86
4H045EA53
(57)【要約】
COVID-19 は SARS-CoV-2 ウイルスの感染によって発生し、急速に広がり、文字通り世界中に感染しました。 コロナウイルスのスパイクタンパク質は広範囲の宿主細胞表面タンパク質を認識できますが、GRP78と呼ばれる生存因子へのスパイクタンパク質の結合を阻害すると、肺や腎臓の細胞におけるSARS-CoV-2の付着、侵入、複製が大幅に減少します。 この阻害は、SARS-CoV-2 スパイクタンパク質とウイルス全体の表面結合 GRP78 への結合を強力にブロックする新しいタイプの阻害剤によって実現されます。 これらの新規 GRP78 阻害剤は、サイトカイン (IL10、IL6)、免疫共抑制チェックポイントタンパク質 (PD-L1、B7H3、B7H4) を下方制御し、免疫共刺激タンパク質 (MHC-II、CD-86) を上方制御します。 感染した肺肺胞上皮細胞の免疫抑制性の in vitro および in vivo での減少。 最後に、これらの新規 GRP78 阻害剤は、細胞表面上のプラスミンの活性化を低下させることにより、感染した肺細胞の過剰線維素溶解を阻害します。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
SARS-CoV-2ウイルス、SARS-CoV-2ウイルス、SARS-CoV-2ウイルスなどの付着、侵入および複製に表面結合GRP78を使用するウイルスのウイルス感染を予防および阻害するための抗ウイルス剤の有効量を必要とする人に投与することを含む治療方法。 CoV ウイルス、MER-CoV ウイルス、日本脳炎ウイルス、コクサッキーウイルス、デングウイルス、およびインフルエンザ A&B ウイルス。
【請求項2】
請求項１に記載の抗ウイルス剤であって、GRP78アンタゴニストまたは薬学的に許容される塩：
ここで、ＧＲＰ７８アンタゴニストは、プラスミノーゲンクリングル５フラグメント、免疫グロブリンに結合したプラスミノーゲンクリングル５フラグメント、ＲＯＲ１クリングルフラグメント、免疫グロブリンに結合したＲＯＲ１クリングルフラグメント、ＲＯＲ２クリングルフラグメント、およびＲＯＲ２クリングルフラグメントからなる群から選択される 免疫グロブリンに結合します。
【請求項3】
前記プラスミノーゲンクリングル５断片が配列番号１およびそれらの組み合わせを含む、請求項２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項4】
免疫グロブリンに取り付けられたプラスミノーゲンクリングル5フラグメントのプラスミノーゲンクリングル5フラグメントの請求項2のアンチウイルス剤は、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seqで構成されるグループから選択されます 配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号: ：１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、およびそれらの組み合わせ。
【請求項5】
前記ＲＯＲ１クリングル断片が配列番号１９のもの、およびそれらの組み合わせである、請求項２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項6】
免疫グロブリンに付着したROR1クリングルフラグメントが免疫グロブリンに付着したROR1クリングルフラグメントの請求項2のアンチウイルス剤は、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：22、seq id no：23、seq idで構成されるグループから選択されます。 配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列番号: ３２、およびそれらの組み合わせ。
【請求項7】
前記ＲＯＲ２クリングル断片が配列番号３３およびそれらの組み合わせである、請求項２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項8】
免疫グロブリンに付着したROR2クリングルフラグメントが免疫グロブリンに付着したROR2クリングルフラグメントの請求項2のアンチウイルス剤は、seq id no：34、seq id no：35、seq id no：36、seq id no：37、seq idで構成されるグループから選択されます。 配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、およびそれらの組み合わせ。
【請求項9】
前記ＧＲＰ７８アンタゴニストがＮ末端ＧＲＰ７８ドメインに結合し、ＧＲＰ７８アンタゴニストと競合してＧＲＰ７８内部移行を誘導する、請求項２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項10】
以下を含む抗ウイルス剤：GRP78アンタゴニストまたは薬学的に許容される塩：
ここで、ＧＲＰ７８アンタゴニストは、プラスミノーゲンクリングル５フラグメント、免疫グロブリンに結合したプラスミノーゲンクリングル５フラグメント、ＲＯＲ１クリングルフラグメント、免疫グロブリンに結合したＲＯＲ１クリングルフラグメント、ＲＯＲ２クリングルフラグメント、およびＲＯＲ２クリングルフラグメントからなる群から選択される 免疫グロブリンに結合します。
【請求項11】
（現在修正中）プラスミノーゲンクリングル５フラグメントが配列番号１およびそれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載の抗ウイルス剤。
【請求項12】
免疫グロブリンに接続されたプラスミノーゲンクリングル5フラグメントのプラスミノーゲンクリングル5フラグメントの請求項１０のアンチウイルス剤は、seq no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seqで構成されるグループから選択されます 配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号: ：１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、およびそれらの組み合わせ。
【請求項13】
前記ＲＯＲ１クリングル断片が配列番号１９のもの、およびそれらの組み合わせである、請求項１０に記載の抗ウイルス剤。
【請求項14】
免疫グロブリンに結合したＲＯＲ１クリングルフラグメントが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２３、配列番号２３、配列番号２３からなる群から選択される、請求項１０に記載の抗ウイルス剤。 配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列番号: ３２、およびそれらの組み合わせ。
【請求項15】
前記ＲＯＲ２クリングル断片が配列番号３３およびそれらの組み合わせである、請求項１０に記載の抗ウイルス剤。
【請求項16】
免疫グロブリンに付着したROR2クリングルフラグメントが免疫グロブリンに付着したROR2クリングルフラグメントの請求項１０のアンチウイルス剤は、配列番号34、seq id no：35、seq id no：36、seq id no：37、seq id 配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、およびそれらの組み合わせ。
【請求項17】
前記ＧＲＰ７８アンタゴニストがＮ末端ＧＲＰ７８ドメインに結合し、ＧＲＰ７８アンタゴニストと競合してＧＲＰ７８内部移行を誘導する、請求項１０に記載の抗ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の主張と参照による組み込み
本出願は、2021年4月20日に出願された米国特許出願第17235652号の優先権を主張し、参照により本明細書に完全に記載されているかのように組み込まれる。
本出願は、2021年4月20日に出願された米国特許出願第17235652号の優先権を主張し、参照により本明細書に完全に記載されているかのように組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
関連技術の説明
新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) は、「コロナウイルス病 2019」の略語であり、SARS-CoV-2 と呼ばれるコロナウイルスによる感染の結果として発生します。 このウイルス感染症はWHOによってパンデミックと宣言されており、CDCによって深刻な公衆衛生上の問題と見なされています。 新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の感染者は世界中で爆発的に増加していますが、現時点では承認された治療法はありません。 新型コロナウイルス感染症は、既往症のある患者や高齢者に重度の呼吸器疾患を引き起こし、肺に永久的な損傷を与えて死に至る可能性があります。
新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) は、「コロナウイルス病 2019」の略語であり、SARS-CoV-2 と呼ばれるコロナウイルスによる感染の結果として発生します。 このウイルス感染症はWHOによってパンデミックと宣言されており、CDCによって深刻な公衆衛生上の問題と見なされています。 新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の感染者は世界中で爆発的に増加していますが、現時点では承認された治療法はありません。 新型コロナウイルス感染症は、既往症のある患者や高齢者に重度の呼吸器疾患を引き起こし、肺に永久的な損傷を与えて死に至る可能性があります。
【0003】
現在、クロロキンとヒドロキシクロロキンという 2 つの抗マラリア薬の使用は、どちらも実験室での SARS-CoV-2 ウイルスの細胞への感染を防ぐのに有望であることが示されています。 最近、ヒドロキシクロロキンと抗生物質を使用した新型コロナウイルス感染症（COVID-19）に対する少数の予備臨床試験で、治療を受けた患者の血液中のウイルス量が、治療を受けていない患者よりもはるかに早く減少したことが示された。 これらの結果は心強いものであり、心臓や神経の損傷や自殺念慮などの副作用は対処可能ではあるものの、依然として憂慮すべきものです。 これらの研究では、ヒドロキシクロロキンを使用した場合、患者の寿命が延びたり、回復する可能性が高かったりすることもまだ示されていません。 最後に、ごく最近の報告では、別の治療法である CCR5 に対する抗体である Leronlimab が 8 人の患者で良好な結果を示しました。 CCR5阻害剤は、新型コロナウイルス感染症によって刺激される肺の炎症性サイトカインストームを軽減し、回復までの時間を長くすることが示されています。 レロンリマブは治療薬やワクチンではありません。 繰り返しになりますが、新型コロナウイルス感染症を治療するための安全で効果的な新薬に対する緊急かつ満たされていないニーズがあります。
【0004】
上記の適応外療法は、新型コロナウイルス感染症患者の臨床現場で使用されていますが、SARS-CoV-2 ウイルスの付着、侵入、複製を特異的に阻害するように設計されたものではありません。 それにもかかわらず、これらの適応外治療はいくつかの望ましい反応を示しています。 一部の結果は有望に見えますが、多くの患者はこれらの治療法に反応せず、世界中で依然として多くの死亡が発生しています。 SARS-CoV-2 ウイルス感染を特に標的とする新薬が切実に必要とされています。 抗がんおよび抗免疫抑制のための新規 GRP78 阻害剤を作成するという私たちの研究は、切実に必要とされている、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の新しい標的および治療法の 1 つとなる可能性があります。
【0005】
ウイルスと宿主細胞表面タンパク質がどのように相互作用するかのメカニズムを理解することは、ウイルスの指向性や病原性を定義するのに役立ち、潜在的な新たな阻害標的につながる可能性があります。 たとえば、最近の出版物では、ウイルスの侵入と複製における表面結合 GRP78 の役割が説明されています。 GRP78 は、コクサッキー ウイルス A9 およびデング熱ウイルスの付着および侵入のための共受容体として同定されました。 さらに、日本脳炎ウイルス (JEV) の場合、細胞表面 GRP78 はウイルスの侵入に重要であり、ウイルスの複製にも重要です。 表面結合 GRP78 は、4 つのベータコロナウイルス、MERS-CoV、bCoV-HKU9、SARS-CoV、および SARS-CoV-2 の付着因子として機能することも知られています。 図1は、コロナウイルスが付着、内部移行、複製のための共受容体としてGRP78をどのように利用するかを示しています。 肺気道細胞のウイルス感染も GRP78 表面発現の上方制御をもたらし、これにより感染細胞のさらなる付着とウイルス侵入の強化が引き起こされます。
【0006】
コロナウイルスのスパイクタンパク質は広範囲の宿主細胞表面タンパク質を認識できますが、siRNA によるノックダウン、またはサブトキシン A または抗体による切断のいずれかによって GRP78 を阻害すると、ウイルスの付着、侵入、複製が大幅に減少します。 。 GRP78 の高発現は、ヒトの気道に沿ったストレスを受けた上皮細胞および内皮細胞の表面に存在することが示されました。 最近、タバコの煙がストレスを受けた気管支上皮細胞上の GRP78 の表面発現を増加させることが示されました。 新型コロナウイルス感染症は、喫煙者、電子タバコを吸う人、呼吸器疾患を患っている人、または高齢者で重症化することが示されているため、この集団では肺上皮細胞の表面 GRP78 の発現が著しく高いのではないかと考えられます。 GRP78 の発現だけでは、非許容細胞を MERS-CoV 感染の影響を受けやすくするのに十分ではありませんでしたが、GRP78 はウイルスの侵入と複製に重要であることが示されています。
【発明の概要】
【0007】
発明の簡単な概要
私は、A549 腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞および VERO 上皮細胞上の表面結合 GRP78 が、免疫共抑制チェックポイントタンパク質 PD-L1、B7H3、B7H4 を上方制御し、免疫共刺激タンパク質 MHC を下方制御することを発見しました。 IIとCD86。 また、表面結合 GRP78 が A549 腺癌ヒト肺胞上皮細胞上のサイトカイン IL-10、IL6 を上方制御し、その結果免疫応答が鈍化することも発見しました。 私は、GRP78 の N 末端ドメインに特異的に結合し、SARS-CoV-2 ウイルスの GRP78 への結合をブロックし、肺上皮 A549 細胞上のサイトカイン発現と免疫抑制表現型を完全に逆転させる、新規で強力な阻害剤のクラスを作成しました。 VERO 上皮細胞 (図 1B)。 ストレスを受けた上皮細胞は、SARS-COV-2 ウイルスの共受容体として作用して付着、侵入、複製を助けるだけでなく、SARS-COV-2 ウイルスや感染細胞に対する免疫応答を鈍化させる表面結合 GRP78 を上方制御します。 本発明のＧＲＰ７８阻害剤は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ウイルスの付着、進入および複製を有意に減少させることができ、さらにインビトロおよびインビボで感染した肺胞上皮細胞の免疫抑制性を減少させることができる。
私は、A549 腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞および VERO 上皮細胞上の表面結合 GRP78 が、免疫共抑制チェックポイントタンパク質 PD-L1、B7H3、B7H4 を上方制御し、免疫共刺激タンパク質 MHC を下方制御することを発見しました。 IIとCD86。 また、表面結合 GRP78 が A549 腺癌ヒト肺胞上皮細胞上のサイトカイン IL-10、IL6 を上方制御し、その結果免疫応答が鈍化することも発見しました。 私は、GRP78 の N 末端ドメインに特異的に結合し、SARS-CoV-2 ウイルスの GRP78 への結合をブロックし、肺上皮 A549 細胞上のサイトカイン発現と免疫抑制表現型を完全に逆転させる、新規で強力な阻害剤のクラスを作成しました。 VERO 上皮細胞 (図 1B)。 ストレスを受けた上皮細胞は、SARS-COV-2 ウイルスの共受容体として作用して付着、侵入、複製を助けるだけでなく、SARS-COV-2 ウイルスや感染細胞に対する免疫応答を鈍化させる表面結合 GRP78 を上方制御します。 本発明のＧＲＰ７８阻害剤は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ウイルスの付着、進入および複製を有意に減少させることができ、さらにインビトロおよびインビボで感染した肺胞上皮細胞の免疫抑制性を減少させることができる。
【0008】
説明
ドヴォルザーク博士は、腫瘍は治らない傷のようなものだと発表しました。 非常に一般的な類似点は、SARS-CoV-2 感染にも同様のメカニズムが存在し、肺の感染は治癒しない傷のようなものであるということです。 ウイルス感染は感染細胞に多大なストレスを引き起こし、腫瘍微小環境 (TME) で起こるように GRP78 の発現を増加させます。 TME は、標的細胞上のウイルス感染で観察されるものと同様に、炎症促進性で免疫抑制性の腫瘍細胞を誘導します。 同時係属中の GRP78 アンタゴニストのアプリケーションでは、GRP78 阻害剤、Kr1Fc、K5Fc、および K5 が GRP78 と細胞表面受容体との相互作用をブロックし、腫瘍細胞の免疫抑制性および炎症性の性質を低下させることができます。 今回、当社の GRP78 阻害剤である Kr1Fc、K5Fc、および K5 が、nM の効力で SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の GRP78 への結合をブロックできることを初めて示しました。 さらに、当社の GRP78 阻害剤である Kr1Fc および K5 は、生ウイルス全体、偽型 SARS-CoV-2、VERO 腎臓上皮細胞への付着および侵入を強力にブロックします。 具体的には、同時係属中の GRP78 アンタゴニストの出願では、次のことが教示されています。
ドヴォルザーク博士は、腫瘍は治らない傷のようなものだと発表しました。 非常に一般的な類似点は、SARS-CoV-2 感染にも同様のメカニズムが存在し、肺の感染は治癒しない傷のようなものであるということです。 ウイルス感染は感染細胞に多大なストレスを引き起こし、腫瘍微小環境 (TME) で起こるように GRP78 の発現を増加させます。 TME は、標的細胞上のウイルス感染で観察されるものと同様に、炎症促進性で免疫抑制性の腫瘍細胞を誘導します。 同時係属中の GRP78 アンタゴニストのアプリケーションでは、GRP78 阻害剤、Kr1Fc、K5Fc、および K5 が GRP78 と細胞表面受容体との相互作用をブロックし、腫瘍細胞の免疫抑制性および炎症性の性質を低下させることができます。 今回、当社の GRP78 阻害剤である Kr1Fc、K5Fc、および K5 が、nM の効力で SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の GRP78 への結合をブロックできることを初めて示しました。 さらに、当社の GRP78 阻害剤である Kr1Fc および K5 は、生ウイルス全体、偽型 SARS-CoV-2、VERO 腎臓上皮細胞への付着および侵入を強力にブロックします。 具体的には、同時係属中の GRP78 アンタゴニストの出願では、次のことが教示されています。
【0009】
表面結合 GRP78 阻害剤は、SARS-COV-2 スパイクタンパク質の付着と侵入をブロックします。 同時係属中の GRP78 アンタゴニストの出願は、内皮細胞および癌細胞に対する GRP78 の阻害剤を教示しています。 これらの阻害剤は現在、GRP78 およびヒト肺細胞に結合する SARS-COV-2 ウイルスに対して試験されています。 ヒト IgG1 Fc ドメイン (Kr1Fc) に融合した ROR1 のクリングル ドメインを含むリード阻害剤は、GRP78 の N 末端ドメインに高い親和性で結合します。 本発明は、Kr1Fc、K5FcおよびK5がSARS-COV-2スパイクタンパク質のGRP78への結合を強力にブロックすることを教示する。 開示されたＧＲＰ７８阻害剤は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２シュードタイプウイルスの付着、侵入、および複製を阻止するのに有効である。
【0010】
容易に標的にできる免疫寛容を促進する新しいメカニズム。 ストレスを受けた細胞における GRP78 の過剰発現は、表面結合 GRP78 の大幅な増加につながります。 本発明は、ヒトA549腺癌肺胞基底上皮細胞上の表面結合GRP78が、A)サイトカインIL-10およびIL-6、B)免疫共阻害チェックポイントタンパク質PD-L1、B7H3、B7H4、および C) 免疫共刺激タンパク質、MHC-II、および CD86 の発現を抑制します。 Kr1Fc で表面タンパク質への GRP78 の結合をブロックすることで、A549 細胞の免疫抑制表現型を逆転させることができます。 本発明において、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質へのＧＲＰ７８の結合の阻害は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染に関連するウイルス量、サイトカインストームおよび免疫抑制の減少をもたらすであろう。
【0011】
GRP78 の N 末端ドメインに結合する新規 GRP78 阻害剤は、正常細胞ではなくストレスを受けた細胞でのみ発現される表面 GRP78 発現を減少させ、現在承認されている他の抗ウイルス療法よりも安全な治療法につながります。 本発明は、GRP78のN末端ドメインにしっかりと結合し、SARS-CoV-2ウイルスの結合を阻害する強力な阻害剤を教示する。 本発明において、表面結合ＧＲＰ７８に対する阻害剤は、ＣＥＲＥＰ受容体結合および通常の線維芽細胞増殖アッセイにおいて安全である。 ヒドロキシクロロキンなど、これまでに新型コロナウイルス感染症に対して使用されてきた治療法は、肺上皮細胞上のSARS-CoV-2の受容体ACE2に弱く結合する。 ACE2 が他のいくつかの正常細胞でも発現していること、およびヒドロキシクロロキンの結合親和性が非常に弱いという事実は、臨床試験で見られたこの薬のオフターゲット副作用を裏付けています。 SARS-CoV-2 ウイルスの治療薬として承認されているもう 1 つの薬はレムデシビルです。 レムデシビルは、ウイルスの複製に不可欠なミトコンドリア RNA ポリメラーゼをブロックするアデノシン類似体です。 しかし、レムデシビルには腸や肺にいくつかのオフターゲット毒性があり、これも慎重に使用する必要があります。 本発明は、正常細胞の表面には発現しないGRP78が、新型コロナウイルス感染症に対する治療のより安全で効果的な標的であることを教示する。
【0012】
本発明はまた、N末端GRP78阻害剤が、プラスミン生成の阻害を通じてSARS-CoV-2ウイルス誘発性過剰線維素溶解およびcoagulopat+hy（「血餅嵐」）を阻止することを教示する（図2）。 重症の新型コロナウイルス感染症（COVID-19）患者は、高血圧、心臓病、糖尿病、がんなどの重篤な凝固障害を伴うことが知られている合併症を抱えている。 血清Dダイマーレベルの上昇を反映する線維素溶解亢進は、重症の新型コロナウイルス感染症患者の97％に死亡前に存在していた。 過剰線維素溶解およびそのような D ダイマーレベルの重要な役割を担うプラスミンも、エンベロープタンパク質上のフリン部位を切り取ることによって SARS-CoV-2 ウイルスの毒性と病原性を強化します。 Kr1Fc、K5Fc、および K5 はまた、肺上皮および内皮細胞表面上のプラスミンの活性化をブロックし、線維素溶解、D-ダイマー形成、およびフリン部位切断の減少につながります。 当社の GRP78 阻害剤は、SARS-CoV-2 ウイルスの付着、侵入、複製を大幅にブロックするだけでなく、サイトカインストームを軽減し、過剰線溶を阻害し、SARS-CoV-2 ウイルスに対する免疫監視を強化します (図 2)。 本発明は、Ｎ末端結合ＧＲＰ７８阻害剤が単独で、または他の治療法と組み合わせて、ＣＯＶＩＤ－１９の病原性を有意に低下させることを教示する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図 1 は、GRP78 阻害剤を使用した場合と使用しない場合の SARS-CoV-2 ウイルスの付着、侵入、複製の概略図です。
【図2】図 2 は、当社の新規クラスの GRP78 阻害剤による SARS-CoV-2 ウイルス阻害の概略図です。
【図7A】図７Ａは、Ｋｒ１ＦｃおよびＫ５が、ＶＥＲＯ細胞とのプレインキュベーションにより、またはスパイクタンパク質と同時に添加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の結合を妨げることを示す一連のグラフである。
【図7B】図７Ｂは、Ｋｒ１ＦｃおよびＫ５が、ＶＥＲＯ細胞とのプレインキュベーションにより、またはスパイクタンパク質と同時に添加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の結合を妨げることを示す２つのヒストグラムである。
【図11A】図１１Ａは、Ｎ末端ＧＲＰ７８結合タンパク質、Ｋｒ１ＦｃおよびＫ５によるＧＲＰ７８阻害が、ＶＥＲＯ細胞上での全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプウイルスの付着および内部移行を強力かつ有意に阻害することを実証するグラフである。
【図11B】図１１Ｂは、Ｎ末端ＧＲＰ７８結合タンパク質、Ｋｒ１ＦｃおよびＫ５によるＧＲＰ７８阻害が、ＶＥＲＯ細胞上での全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプウイルスの付着および内部移行を強力かつ有意に阻害することを実証するグラフである。
【図12A】図１２Ａは、Ｋ５が、Ａ５４９肺上の可溶性ＧＲＰ７８によって誘導される共抑制（ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７Ｈ４）チェックポイントタンパク質および共刺激（ＣＤ８６、ＭＨＣ－ＩＩ）タンパク質の発現を有意に増強することを示す一連のグラフである。 細胞。
【図12B】図１２Ｂは、Ｋ５が、Ａ５４９肺細胞上の可溶性ＧＲＰ７８によって誘導される共抑制（ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７Ｈ４）チェックポイントタンパク質および共刺激（ＣＤ８６、ＭＨＣ－ＩＩ）タンパク質の発現を有意に増強することを示すヒストグラムである。
【図13A】図１３Ａは、Ｋｒ１Ｆｃが、可溶性ＧＲＰ７８によって誘導される共抑制（ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７Ｈ４）チェックポイントタンパク質の発現および共刺激（ＣＤ８６、ＭＨＣ－ＩＩ）タンパク質の発現を有意に増強することを示す一連のグラフである。 A549 肺細胞。
【0014】
詳細な説明
私の以前の出版物は、ヒトプラスミノーゲン (K5) の 5 番目のクリングルドメインが表面 GRP78 に結合して、腫瘍血管新生と腫瘍増殖の阻害を誘導することを教示しています。 しかし、K5 は作用機序が不明であり、マウスやサルにおける半減期が短い (<20 分) ため、優れた薬剤候補とは考えられていませんでした。 可溶性 GRP78 が腫瘍細胞表面にどのように結合するかを決定することにより、新規 GRP78 結合タンパク質が同定され、これは受容体チロシンキナーゼ様受容体-1 (ROR1) と呼ばれます。 予想通り、ROR1 には K5 と非常によく似た (70% 以上) クリングル ドメインがあります。 ROR1 クリングルドメイン Kr1 は、K5 (Kd = 0.6 nM) よりも強く GRP78 100Xs (Kd = 0.005 nM) に結合します。 本発明はまた、ＲＯＲ２がＫ５に対して＞７０％の相同性を有し、ＲＯＲ１のクリングルドメインと同様の活性を有することを示す。 図３に示すように、本発明は、ＲＯＲ１クリングルドメイン、Ｋｒ１、およびヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む新規クリングル融合タンパク質を開示する。 IgG Fc ドメインをペプチドに追加すると、血漿半減期が増加することが示されています。 我々は現在、Expi293F HEK 細胞および ExpiCHO 細胞で融合タンパク質 Kr1Fc および K5Fc を発現させ、プロテイン A カラムで精製しました。 組換え Kr1Fc、Kr1、K5、および K5Fc タンパク質が 2 番目の精製カラムとしてのベンズアミジン アガロースに結合することは、クリングル ドメインが適切に折りたたまれていることを示唆しています。 この記事の執筆時点では、約 600 mg の Kr1Fc、2 mg の K5Fc、10 mg の Kr1、および 600 mg の K5 を発現および精製しました。 参照により組み込まれた参考文献は、抗癌剤として使用するための可溶性ＧＲＰ７８阻害剤Ｋｒ１Ｆｃ、Ｋ５Ｆｃ、Ｋｒ２ＦｃおよびＫｒ１を開示している。
私の以前の出版物は、ヒトプラスミノーゲン (K5) の 5 番目のクリングルドメインが表面 GRP78 に結合して、腫瘍血管新生と腫瘍増殖の阻害を誘導することを教示しています。 しかし、K5 は作用機序が不明であり、マウスやサルにおける半減期が短い (<20 分) ため、優れた薬剤候補とは考えられていませんでした。 可溶性 GRP78 が腫瘍細胞表面にどのように結合するかを決定することにより、新規 GRP78 結合タンパク質が同定され、これは受容体チロシンキナーゼ様受容体-1 (ROR1) と呼ばれます。 予想通り、ROR1 には K5 と非常によく似た (70% 以上) クリングル ドメインがあります。 ROR1 クリングルドメイン Kr1 は、K5 (Kd = 0.6 nM) よりも強く GRP78 100Xs (Kd = 0.005 nM) に結合します。 本発明はまた、ＲＯＲ２がＫ５に対して＞７０％の相同性を有し、ＲＯＲ１のクリングルドメインと同様の活性を有することを示す。 図３に示すように、本発明は、ＲＯＲ１クリングルドメイン、Ｋｒ１、およびヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む新規クリングル融合タンパク質を開示する。 IgG Fc ドメインをペプチドに追加すると、血漿半減期が増加することが示されています。 我々は現在、Expi293F HEK 細胞および ExpiCHO 細胞で融合タンパク質 Kr1Fc および K5Fc を発現させ、プロテイン A カラムで精製しました。 組換え Kr1Fc、Kr1、K5、および K5Fc タンパク質が 2 番目の精製カラムとしてのベンズアミジン アガロースに結合することは、クリングル ドメインが適切に折りたたまれていることを示唆しています。 この記事の執筆時点では、約 600 mg の Kr1Fc、2 mg の K5Fc、10 mg の Kr1、および 600 mg の K5 を発現および精製しました。 参照により組み込まれた参考文献は、抗癌剤として使用するための可溶性ＧＲＰ７８阻害剤Ｋｒ１Ｆｃ、Ｋ５Ｆｃ、Ｋｒ２ＦｃおよびＫｒ１を開示している。
【0015】
結合阻害の例 #1
GRP78 阻害剤 Kr1Fc、K5Fc、および K5 は、GRP78 への SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の結合を阻害します。
GRP78 阻害剤 Kr1Fc、K5Fc、および K5 は、GRP78 への SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の結合を阻害します。
【0016】
先行技術には、GRP78がSARS-CoV-2ウイルスのスパイクタンパク質に結合することが記載されている。 先行技術は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質とGRP78との結合親和性がどのようなものかについては開示していない。 ELISAアッセイを使用して、本発明は、GRP78-HRPがプレート結合SARS-CoV-2スパイクタンパク質に293±35nMのKdで結合することを調べる。 Kr1Fc、K5Fc、およびK5がこの結合をブロックできるかどうかを決定するために、本発明は、96ウェルプレートをSARS-CoV-2スパイクタンパク質(100nM)で4℃で一晩コーティングすることを教示する。 次いで、プレートをスキムミルクで室温で３０分間ブロックした。 次いで、ＨＲＰ標識ＧＲＰ７８（２００ｎＭ）を、様々な濃度のＫｒ１Ｆｃ、Ｋ５Ｆｃ、Ｋ５および陰性対照である折り畳まれていないＫｒ１Ｆｃとともにプレートに添加する。 次いで、プレートを室温で２時間インキュベートした。 最後に、ウェルを PBS で洗浄し、その後 1 ステップ ウルトラ TMB-ELISA 試薬を各ウェルに添加し、室温で 60 分間インキュベートし、分光光度計で 450 nM で読み取りました。 図4は、Kr1Fc、K5Fc、およびK5が、SARS-CoV-2スパイクタンパク質へのGRP78の結合をそれぞれ0.35 nM、28.5 nM、および460 nMのIC50値で阻害することを示しています。 折り畳まれていない Kr1Fc ネガティブコントロールは、GRP78 への SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の結合を阻害しませんでした。 本発明は、本発明のＧＲＰ７８ Ｎ末端結合阻害剤がＧＲＰ７８とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の結合を強力に遮断することを示す。
【0017】
結合阻害の例 #2
GRP78 阻害剤 Kr1Fc および K5 は、4℃で A549 肺胞上皮腺癌細胞への SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の結合を阻害します。
GRP78 阻害剤 Kr1Fc および K5 は、4℃で A549 肺胞上皮腺癌細胞への SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の結合を阻害します。
【0018】
図5では、本発明は、Kr1FcおよびK5がPE標識SARS-CoV-2スパイクタンパク質のA549肺細胞への結合をブロックできるかどうかを調べている。 A549細胞(50,000細胞/100μL)をPBS中のエッペンドルフチューブに加えた。 さまざまな濃度の GRP78 阻害剤と 50 nM PE 標識 SARS-CoV-2 スパイクタンパク質を細胞に添加し、4℃で一晩インキュベートして受容体の内部移行をブロックしました。 細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｇｕａｖａ ＰＣＡフローサイトメーターで分析した。 使用した陰性対照はヒト IgG1-PE 抗体でした。 フローサイトメトリー分析では、SARS-CoV-2-PE スパイクタンパク質が A549 細胞の 52% に結合したのに対し、対照 IgG1-PE 抗体は細胞の 23% に結合したことが示されました。 100 nMのKr1Fcは、A549肺上皮細胞へのSARS-CoV-2-PEスパイクタンパク質の結合を99%以上有意にブロックしたが、500nMのK5は、A549肺上皮細胞へのSARS-CoV-2-PEスパイクタンパク質の結合をブロックした。 70%くらい。 これらの結果は、GRP78 が SARS-CoV-2 ウイルスの A549 肺上皮細胞への結合に重要であることを示しています。
【0019】
結合阻害の例 #3
GRP78 阻害剤 Kr1Fc および K5 は、37℃で VERO 細胞への SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の結合を阻害します。
GRP78 阻害剤 Kr1Fc および K5 は、37℃で VERO 細胞への SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の結合を阻害します。
【0020】
本発明は、N末端GRP78阻害剤がVEROサル上皮腎細胞へのSARS-CoV-2スパイクタンパク質の結合をブロックできるかどうかを調べる。 VERO 細胞は、SARS-CoV-2 受容体 ACE2 の発現が高いことが知られているため、SARS-CoV-2 ウイルス感染に非常に敏感です。 本発明は、VERO細胞をGRP78阻害剤とプレインキュベートすること、およびSARS-CoV-2スパイクタンパク質と同時にGRP78阻害剤を添加することの両方により、スパイクタンパク質結合の有意かつ強力な阻害がもたらされることを教示する。 ＰＢＳ中のＶＥＲＯ細胞（５０，０００／１００μＬ）をエッペンドルフチューブに添加した。 １００ｎＭのＫｒ１Ｆｃまたは５００ｎＭのＫ５のいずれかを、６時間のプレインキュベーション時間の間、ＶＥＲＯ細胞のチューブの半分に添加した。 50 nM PE 標識 SARS-CoV-2 スパイクタンパク質を添加する前。 細胞の入ったチューブの残りの半分には、上記の GRP78 阻害剤と同時に PE 標識 SARS-CoV-2 スパイクタンパク質を添加しました。 細胞の入ったチューブを37℃で穏やかに振盪しながらインキュベートした。 24時間後、細胞を遠心し、PBSで2回洗浄した。 新鮮なPBSを細胞に添加し、VERO細胞に結合したPE標識SARS-CoV-2スパイクタンパク質のフローサイトメトリー分析をGuava PCAフローサイトメーターで検出した。 本発明において、GRP78阻害剤Kr1FcおよびK5は、GRP78阻害剤との6時間のプレインキュベーションまたはプレインキュベーションなしの両方で、SARS-CoV-2スパイクタンパク質結合の阻害を示した(図6および7)。 100 nMのKr1Fcは、VERO細胞へのSARS-CoV-2スパイクタンパク質の結合を90％以上阻害した。 500 nM の K5 は、VERO 細胞への SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の結合を >80% 阻害しました。 VERO 細胞上で GRP78 阻害剤をプレインキュベートすると、SARS-CoV-2 結合の阻害が増加します。
【0021】
表面結合 GRP78 の内部移行例 #4
表面結合 GRP78 は、Kr1Fc および K5 処理後に大幅に減少します。
本発明では、Ｋｒ１Ｆｃ（１００ｎＭ）およびＫ５（５００ｎＭ）を、５０，０００個のＡ５４９細胞または５０，０００個のＶＥＲＯ細胞を含むエッペンドルフチューブに３連で別々に添加した。 細胞とGRP78阻害剤を37℃で24時間インキュベートした。 細胞を遠心分離によりペレット化し、ＰＢＳで２回洗浄した。 次いで、ＰＥで標識した抗ＧＲＰ７８モノクローナル抗体（１ｍｇ／ｍｌ）をチューブ当たり１μｌ加えた。 ヒト IgG1-PE 抗体のネガティブコントロールも未処理細胞のチューブに添加しました。 抗GRP78-PE抗体を室温で1時間インキュベートした後、細胞をPBSで2回洗浄し、表面結合GRP78についてGuavaフローサイトメーターで分析した。 図８は、ＶＥＲＯ細胞をＧＲＰ７８阻害剤であるＫｒ１ＦｃおよびＫ５で処理すると、細胞表面上のＧＲＰ７８の発現が有意に減少したことを示している。 図９は、Ａ５４９肺細胞をＧＲＰ７８阻害剤であるＫｒ１ＦｃおよびＫ５で処理すると、表面結合ＧＲＰ７８の濃度が８０％を超えて有意に減少したことを示す。 A549 細胞と VERO 細胞の表面結合 GRP78 の発現を比較すると、VERO 細胞の方がはるかに高いレベルの表面結合 GRP78 を持っていることが明らかです。 これらの細胞はウイルス感染に対してより受容性が高いため、本発明およびデータは、表面ACE2のレベルだけでなくGRP78のレベルも感染力にとって重要であることを示している。 これらの GRP78 阻害剤は表面結合 GRP78 レベルを低下させるため、これはウイルス結合のみの低下をもたらすのでしょうか、それとも GRP78 は SARS-CoV-2 スパイク ウイルスの内部移行にも関与しているのでしょうか。
表面結合 GRP78 は、Kr1Fc および K5 処理後に大幅に減少します。
本発明では、Ｋｒ１Ｆｃ（１００ｎＭ）およびＫ５（５００ｎＭ）を、５０，０００個のＡ５４９細胞または５０，０００個のＶＥＲＯ細胞を含むエッペンドルフチューブに３連で別々に添加した。 細胞とGRP78阻害剤を37℃で24時間インキュベートした。 細胞を遠心分離によりペレット化し、ＰＢＳで２回洗浄した。 次いで、ＰＥで標識した抗ＧＲＰ７８モノクローナル抗体（１ｍｇ／ｍｌ）をチューブ当たり１μｌ加えた。 ヒト IgG1-PE 抗体のネガティブコントロールも未処理細胞のチューブに添加しました。 抗GRP78-PE抗体を室温で1時間インキュベートした後、細胞をPBSで2回洗浄し、表面結合GRP78についてGuavaフローサイトメーターで分析した。 図８は、ＶＥＲＯ細胞をＧＲＰ７８阻害剤であるＫｒ１ＦｃおよびＫ５で処理すると、細胞表面上のＧＲＰ７８の発現が有意に減少したことを示している。 図９は、Ａ５４９肺細胞をＧＲＰ７８阻害剤であるＫｒ１ＦｃおよびＫ５で処理すると、表面結合ＧＲＰ７８の濃度が８０％を超えて有意に減少したことを示す。 A549 細胞と VERO 細胞の表面結合 GRP78 の発現を比較すると、VERO 細胞の方がはるかに高いレベルの表面結合 GRP78 を持っていることが明らかです。 これらの細胞はウイルス感染に対してより受容性が高いため、本発明およびデータは、表面ACE2のレベルだけでなくGRP78のレベルも感染力にとって重要であることを示している。 これらの GRP78 阻害剤は表面結合 GRP78 レベルを低下させるため、これはウイルス結合のみの低下をもたらすのでしょうか、それとも GRP78 は SARS-CoV-2 スパイク ウイルスの内部移行にも関与しているのでしょうか。
【0022】
内部移行阻害の例 #5
Kr1Fc および K5 は、VERO 細胞における pHrodo-red 標識された SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の内部移行を阻害します。
Kr1Fc および K5 は、VERO 細胞における pHrodo-red 標識された SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の内部移行を阻害します。
【0023】
本発明は、表面結合GRP78阻害がSARS-CoV-2スパイクタンパク質の結合を阻害し、その内部移行をブロックできるかどうかを調べる。 図10Aに示すように、SARS-CoV-2スパイクタンパク質はpHrodo-red色素で標識されており、pH7（細胞表面）では弱い蛍光を発しますが、pH4（細胞内部）では強い蛍光を発するため、検出が可能です。 スパイクタンパク質の内部移行の様子。 VERO細胞をGRP78阻害剤、Kr1FcおよびK5とともに6時間プレインキュベートした。 6時間後、Rodo-red標識SARS-CoV-2スパイクタンパク質をVERO細胞に添加し、穏やかに振盪しながら37℃で24時間インキュベートした。 次いで、細胞をペレット化し、２回洗浄し、Ｇｕａｖａ ＰＣＡフローサイトメーターでフローサイトメトリー分析を行って、内部移行したスパイクタンパク質の阻害を検出した。 図10Bでは、本発明は、ロドレッド標識SARS-CoV-2スパイクタンパク質が48時間以内に約52%のVERO細胞に取り込まれることを示している。 37℃で。 VERO 細胞を GRP78 阻害剤、Kr1Fc、または K5 とプレインキュベートすると、Rodo-red 標識された SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の内在化は、Rodo-red 標識された IgG1 抗体陰性対照と同様に 90 ～ 95% 有意に阻害されます。 どちらの例でも、A549 細胞と VERO 細胞の GRP78 阻害剤は、SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の内部移行を防ぎます。
【0024】
SARS-CoV-2 ウイルス全体の中和例 #6
GRP78 阻害剤、Kr1Fc および K5 は、VERO 細胞の SARS-CoV-2 偽型ウイルス感染を中和します。
GRP78 阻害剤、Kr1Fc および K5 は、VERO 細胞の SARS-CoV-2 偽型ウイルス感染を中和します。
【0025】
本発明では、改良型SARS-CoV-2ウイルスアッセイがIBT Bioservices（メリーランド州ロックビル）によって実施された。 このアッセイでは、SARS-CoV-2 ウイルスの複製 RNA 断片を検出用のルシフェラーゼ酵素タンパク質をコードする RNA に置き換えることにより、SARS-CoV-2 シュードタイプウイルスが生成されました。 残りの構造タンパク質 (スパイクタンパク質、エンベロープタンパク質、マトリックスタンパク質およびヌクレオカプシドタンパク質) は無傷のまま残されました。 これにより、SARS-CoV-2 (rVSV-SARS-CoV-2 (D614G)) シュードタイプウイルスが付着して内部に取り込まれるが、複製はできなくなります。 本発明は、Kr1FcおよびK5が完全なSARS-CoV-2シュードタイプウイルスの付着およびVERO細胞への侵入を防止できることを教示する。 図１１Ａでは、２つの化合物が、Ｋｒ１Ｆｃについては３．５μＭ、Ｋ５については４７．４μＭのＩＣ５０値を有する強力な活性を示している。 アッセイは、K5については0.5 nM～500 uM、Kr1Fcについては0.01 nM～62 uMの8つの希釈を使用して実行されました。 これらの希釈液を、VERO 細胞を含む 96 ウェル プレートの 3 つのウェルに添加しました (ウェルあたり 1x105 細胞)。 本発明によるウェルは、各ウェルにおいて25,000～35,000相対光単位でSARS-CoV-2シュードタイプウイルスに感染する。 プレートを２４時間インキュベートし、付着した細胞を洗浄し、次にＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して各ウェルのルシフェラーゼ活性を測定した。 試験化合物の毒性も、ウイルスを含まないVERO細胞に対して並行して測定した(図10B)。 有効性を示すために、50% および 90% の有効中和濃度 (IC50、IC90) および 50% の細胞死濃度 (細胞毒性、CC50) の値が回帰分析によって計算されます。 1 log 阻害に対する細胞毒性と抗ウイルス活性の間の安全範囲を示す選択性指数 (SI90) (CC90 を IC90 で割ったもの) を計算し、図 17 に示しました。SI90 値が高いほど、阻害剤の有効性と安全性が高くなります。 。
【0026】
免疫抑制阻害の例 #7
Kr1Fc、K5Fc、および K5 は、sGRP78 結合によって誘導される腺癌肺胞肺上皮細胞 (A549) の免疫抑制表現型を逆転させます。 本発明は、ウイルス感染中に刺激されることが示されている可溶性および表面結合型ＧＲＰ７８が、樹状細胞で報告されているのと同様に、肺細胞上のチェックポイントタンパク質の発現を増強するかどうかを検討する。 これを決定するために、sGRP78 (5 ug/ml) を A549 細胞に添加し、37℃/5% CO2 で Kr1Fc を加えて 3 日間増殖させました。 3 日後、細胞を固定し (透過処理せず)、蛍光標識抗体で染色し、共阻害剤チェックポイントタンパク質 PD-L1、B7H3、B7H4 および共刺激タンパク質 MHC-II、CD86 についてフローサイトメトリー分析を実行しました。 本発明は、Ｋｒ１Ｆｃ、Ｋ５ＦｃおよびＫ５阻害剤を使用した場合と使用しない場合の表面ＧＲＰ７８の発現を調べる。 sGRP78が癌および関節リウマチ患者においてこの濃度付近で循環していることが示されているため、5μg/mlのsGRP78濃度を選択した。 図１２および１３は、ｓＧＲＰ７８が、Ａ５４９細胞上で免疫阻害チェックポイントタンパク質ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４の発現の有意な増加を誘導し、免疫刺激タンパク質ＭＨＣ－ＩＩおよびＣＤ８６の発現を減少させたことを示す。 Kr1Fc と K5 は、この免疫抑制表現型を完全に逆転させました。
Kr1Fc、K5Fc、および K5 は、sGRP78 結合によって誘導される腺癌肺胞肺上皮細胞 (A549) の免疫抑制表現型を逆転させます。 本発明は、ウイルス感染中に刺激されることが示されている可溶性および表面結合型ＧＲＰ７８が、樹状細胞で報告されているのと同様に、肺細胞上のチェックポイントタンパク質の発現を増強するかどうかを検討する。 これを決定するために、sGRP78 (5 ug/ml) を A549 細胞に添加し、37℃/5% CO2 で Kr1Fc を加えて 3 日間増殖させました。 3 日後、細胞を固定し (透過処理せず)、蛍光標識抗体で染色し、共阻害剤チェックポイントタンパク質 PD-L1、B7H3、B7H4 および共刺激タンパク質 MHC-II、CD86 についてフローサイトメトリー分析を実行しました。 本発明は、Ｋｒ１Ｆｃ、Ｋ５ＦｃおよびＫ５阻害剤を使用した場合と使用しない場合の表面ＧＲＰ７８の発現を調べる。 sGRP78が癌および関節リウマチ患者においてこの濃度付近で循環していることが示されているため、5μg/mlのsGRP78濃度を選択した。 図１２および１３は、ｓＧＲＰ７８が、Ａ５４９細胞上で免疫阻害チェックポイントタンパク質ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４の発現の有意な増加を誘導し、免疫刺激タンパク質ＭＨＣ－ＩＩおよびＣＤ８６の発現を減少させたことを示す。 Kr1Fc と K5 は、この免疫抑制表現型を完全に逆転させました。
【0027】
サイトカイン発現阻害の例 #8
以前に、我々は可溶性 GRP78 が腫瘍細胞上でサイトカイン発現を誘導することを示しました。 ウイルス感染は多くの点で腫瘍微小環境を模倣しているため、可溶性 GRP78 が A549 肺細胞上の IL10 および IL6 の発現を上方制御できることが判明しました。 図１４では、Ｋｒ１ＦｃおよびＫ５が、Ａ５４９肺細胞からのＩＬ１０およびＩＬ６の可溶性ＧＲＰ７８誘発サイトカイン発現を阻害することを示す。 A549細胞(50,000個)を完全DMEM培地中のエッペンドルフチューブに加えた。 チューブの半分に、可溶性ＧＲＰ７８（５μｇ／ｍｌ）をＫ５（５００ｎＭ）またはＫｒ１Ｆｃ（１００ｎＭ）とともに添加した。 IgG ヒト抗体をネガティブコントロールとして使用しました。 穏やかに振盪しながら３７℃で３日間インキュベートした後、細胞を遠心分離し、ＩＬ１０またはＩＬ６ ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかを使用して上清を試験した。 各キットのプロトコールは製造元の指示に従い、GRP78阻害剤を含むA549細胞およびGRP78阻害剤を含むA549細胞の各条件での各サイトカインのpg/mlを標準曲線から計算した。 Kr1Fc および K5 GRP78 阻害剤を使用すると、A549 細胞からのサイトカイン発現の用量依存的な有意な阻害が観察されました。
以前に、我々は可溶性 GRP78 が腫瘍細胞上でサイトカイン発現を誘導することを示しました。 ウイルス感染は多くの点で腫瘍微小環境を模倣しているため、可溶性 GRP78 が A549 肺細胞上の IL10 および IL6 の発現を上方制御できることが判明しました。 図１４では、Ｋｒ１ＦｃおよびＫ５が、Ａ５４９肺細胞からのＩＬ１０およびＩＬ６の可溶性ＧＲＰ７８誘発サイトカイン発現を阻害することを示す。 A549細胞(50,000個)を完全DMEM培地中のエッペンドルフチューブに加えた。 チューブの半分に、可溶性ＧＲＰ７８（５μｇ／ｍｌ）をＫ５（５００ｎＭ）またはＫｒ１Ｆｃ（１００ｎＭ）とともに添加した。 IgG ヒト抗体をネガティブコントロールとして使用しました。 穏やかに振盪しながら３７℃で３日間インキュベートした後、細胞を遠心分離し、ＩＬ１０またはＩＬ６ ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかを使用して上清を試験した。 各キットのプロトコールは製造元の指示に従い、GRP78阻害剤を含むA549細胞およびGRP78阻害剤を含むA549細胞の各条件での各サイトカインのpg/mlを標準曲線から計算した。 Kr1Fc および K5 GRP78 阻害剤を使用すると、A549 細胞からのサイトカイン発現の用量依存的な有意な阻害が観察されました。
【0028】
プラスミノーゲン活性化阻害の例 #9
Kr1Fc および K5 は、プラスミン形成によって誘発される線維素溶解亢進をブロックします。
Kr1Fc および K5 は、プラスミン形成によって誘発される線維素溶解亢進をブロックします。
【0029】
糖尿病、高血圧、肺がん、心臓病のある人は、SARS-CoV-2 ウイルスに感染するリスクが高く、死亡する可能性が高くなります。 新型コロナウイルス感染症による主な死亡原因は出血または出血性疾患であり、この病気の特徴の一つは血栓の除去を担うシステムの過剰活動（過剰線維素溶解）であるとされています。 この異常な凝固障害は、プラスミンを引き起こすプラスミノーゲンレベルの上昇によって引き起こされます。 最近の出版物では、新型コロナウイルス感染症患者のより悪い転帰を引き起こすすべての併存疾患において、プラスミンレベルの上昇が共通の要因であることが判明したことを示しています。 プラスミノーゲンは通常、不活性タンパク質として血液中を循環します。 損傷または病変が発生すると(図2、図15A(赤色))、プラスミノーゲンはプラスミンと呼ばれる活性型に活性化されます。 次に、プラスミンはフィブリノーゲンを切り取ることによって病変部の血栓を溶解し、D ダイマーと呼ばれるフィブリノーゲンの断片を生成します。 重症の新型コロナウイルス感染症（COVID-19）で入院した人の97％以上で、Dダイマーのレベルが上昇している。 D ダイマー レベルは体内で検出されるウイルスの量に関連しており、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の重症度が増すにつれて上昇し続けます。 COVID-19 生存者では、D ダイマーレベルが対照レベルまで減少しました。 プラスミンおよび D ダイマーのレベルが正常より高いと、重度の出血が発生する可能性があります。 いくつかの出版物は、プラスミノーゲンがそのクリングル ドメインの 1 つであるクリングル 5 (K5) を介して表面結合 GRP78 に結合することを示しています。 実際、GRP78 がプラスミノーゲンに結合すると、プラスミンに対する活性化速度が大幅に増加します。 当社の GRP78 阻害剤である Kr1Fc、K5Fc、および K5 は、プラスミノーゲン K5 クリングル ドメインまたは類似のクリングル ドメイン (Kr1) で構成されているため、これらの阻害剤が肺細胞上のプラスミノーゲンからプラスミンへの活性化を 70% 以上大幅に減少させることがわかります (図 15）。 このプラスミン形成の減少により、線維素溶解亢進とDダイマー形成が減少し、重篤な新型コロナウイルス感染症患者で観察される出血性疾患が軽減されるはずです。
【0030】
安全性プロファイルの例 #9
Kr1Fc および K5 は、受容体およびイオンチャネルタンパク質への有害な結合や初代ヒト細胞に対する毒性を示しません。
Kr1Fc および K5 は、受容体およびイオンチャネルタンパク質への有害な結合や初代ヒト細胞に対する毒性を示しません。
【0031】
考えられる毒性を特定するために、75 の受容体およびイオンチャネルを用いた受容体結合プロファイルアッセイ、および Kr1Fc (10 uM) または K5 (100 uM) を用いた 5 つのヒト初代細胞株 (単一ドナー供給源から検証済み) を用いた細胞毒性アッセイが行われました。 CEREP/Eurofins によって決定されます。 特異的結合または毒性は観察されず、Kr1Fc が安全で選択的な生化学的プロファイルを示し、生体内で悪影響を与える可能性が低いことを示しています。
【0032】
安全性プロファイルの例 #10
GRP78阻害剤Kr1FcおよびK5をそれぞれ60 mg/kgおよび90 mg/kgで処置したマウスでは、体重減少や明白な毒性は観察されなかった。
GRP78阻害剤Kr1FcおよびK5をそれぞれ60 mg/kgおよび90 mg/kgで処置したマウスでは、体重減少や明白な毒性は観察されなかった。
【0033】
本発明は、8週齢のBALB/cマウスにおけるGRP78阻害剤Kr1FcおよびK5の毒性を調べる。 ３群のマウスに、各動物の体重に合わせて１０ｍＬ／ｋｇの量を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。 治療グループは次のとおりです。
グループ１にはビヒクル（ＰＢＳ ｐＨ７．２）を与えた。
グループ 2 には、26 日目まで 1 日おき (qod) で 60 mg/kg の Kr1Fc を腹腔内投与しました。
グループ 3 には、26 日目まで 90 mg/kg の K5 を 1 日おき (qod) で投与しました。
グループ１にはビヒクル（ＰＢＳ ｐＨ７．２）を与えた。
グループ 2 には、26 日目まで 1 日おき (qod) で 60 mg/kg の Kr1Fc を腹腔内投与しました。
グループ 3 には、26 日目まで 90 mg/kg の K5 を 1 日おき (qod) で投与しました。
【0034】
動物の体重を1日目から5日目まで毎日測定し、その後26日目まで週に2回測定した。 マウスは、治療に関連した（TR）副作用の明白な兆候がないか頻繁に観察され、観察された際には臨床兆候が記録されました。 個々の体重はプロトコールに従ってモニタリングされ、体重減少が 1 回の測定で 30% を超えるか、または 3 回の連続測定で 25% を超える動物は、TR 死亡として安楽死させました。 Charles River Discovery Services プロトコルに従って、グループの平均体重減少もモニタリングしました。 許容可能な毒性は、研究中の群平均体重 (BW) 減少が 20% 未満、TR による死亡が 10% 未満であると定義されました。 臨床徴候および/または剖検によって証明されるように、死亡が治療の副作用に起因する場合、死亡はTRとして分類されました。
【0035】
図１６は、Ｋｒ１ＦｃおよびＫ５が、上に列挙したように投与されたマウスにおいて明白な毒性または体重減少を示さなかったことを示す。 これらの結果は、上記のＣＥＲＥＰ／ユーロフィンのインビトロ毒性試験を支持し、本発明で列挙した種類のＧＲＰ７８阻害剤が安全であり、臨床研究において毒性が低いことを示唆する。
【0036】
K5Fc、K5、および Kr1Fc の開発に関する化学、製造、および管理 (CMC) の側面。
本発明によれば、実施者は、Kr1Fc、K5Fc、K5を発現および精製し、CMCアッセイを実施して、インビトロおよびインビボのSARS-CoV-2ウイルスに対するKr1Fc、K5FcおよびK5ロットの純度、効力、および有効性を検証するであろう。 阻害の研究。 現在、Kr1Fc、K5Fc、および K5 は Expi293 および ExpiCHO 細胞で一時的に発現されています。 正しく折りたたまれたクリングルドメインと Fc ドメインのグリコシル化が必要なため、哺乳動物細胞での発現が必要です。 本発明によれば、Kr1Fc、K5Fc、およびK5を発現する安定したCHOクローンが作成され、規制当局への申請のために保管されるであろう。 本発明によれば、専門家は、Ｋｒ１Ｆｃ、Ｋ５Ｆｃ、およびＫ５のロットの純度、効力および同一性についてアッセイを検証するであろう。 Kr1Fc、K5Fc、および K5 のロット間の品質を検証するために、変性 Kr1Fc のネガティブ コントロールと Kr1Fc のポジティブ標準ロットがバンクされ、比較のために各アッセイで使用されます。
本発明によれば、実施者は、Kr1Fc、K5Fc、K5を発現および精製し、CMCアッセイを実施して、インビトロおよびインビボのSARS-CoV-2ウイルスに対するKr1Fc、K5FcおよびK5ロットの純度、効力、および有効性を検証するであろう。 阻害の研究。 現在、Kr1Fc、K5Fc、および K5 は Expi293 および ExpiCHO 細胞で一時的に発現されています。 正しく折りたたまれたクリングルドメインと Fc ドメインのグリコシル化が必要なため、哺乳動物細胞での発現が必要です。 本発明によれば、Kr1Fc、K5Fc、およびK5を発現する安定したCHOクローンが作成され、規制当局への申請のために保管されるであろう。 本発明によれば、専門家は、Ｋｒ１Ｆｃ、Ｋ５Ｆｃ、およびＫ５のロットの純度、効力および同一性についてアッセイを検証するであろう。 Kr1Fc、K5Fc、および K5 のロット間の品質を検証するために、変性 Kr1Fc のネガティブ コントロールと Kr1Fc のポジティブ標準ロットがバンクされ、比較のために各アッセイで使用されます。
【0037】
統計分析：
本発明によれば、化学、製造、および管理（ＣＭＣ）の側面におけるアッセイは、２人の異なる研究者によって２回の別々の機会に３回実行される。 吸光度、密度、および EC50 値の平均値と標準偏差をすべてのアッセイについて計算します。 対照標準ロットと有意に異なる化合物ロット（p<0.05、正規分布と等分散を仮定したスチューデントの両側 t 検定による）は、さらなる試験には使用されません。
本発明によれば、化学、製造、および管理（ＣＭＣ）の側面におけるアッセイは、２人の異なる研究者によって２回の別々の機会に３回実行される。 吸光度、密度、および EC50 値の平均値と標準偏差をすべてのアッセイについて計算します。 対照標準ロットと有意に異なる化合物ロット（p<0.05、正規分布と等分散を仮定したスチューデントの両側 t 検定による）は、さらなる試験には使用されません。
【0038】
ロット間の純度、効力、変動性:
本発明によれば、Kr1Fc、K5Fc、およびK5ロットの純度は、薬物濃度についての280nm OD測定、薬物純度についてのクーマシー染色SDSPAGEゲルの濃度測定分析(GelQuant)および質量分析分析(サービス料金)を実施することによって決定される。 医薬品の品質のために。 これらのアッセイは、Kr1Fc の望ましい品質が維持されていることを確認するために使用されます。 すべての in vitro 研究では、ネガティブ コントロールは、各アッセイの限界を定義するために、さまざまな比率 (10% ～ 90%) で変性死滅 Kr1Fc と混合された Kr1Fc であり、ポジティブ コントロールとして、Kr1Fc のマスター ロットが比較用に確保されます。 異なるロット間のすべてのアッセイ。
本発明によれば、Kr1Fc、K5Fc、およびK5ロットの純度は、薬物濃度についての280nm OD測定、薬物純度についてのクーマシー染色SDSPAGEゲルの濃度測定分析(GelQuant)および質量分析分析(サービス料金)を実施することによって決定される。 医薬品の品質のために。 これらのアッセイは、Kr1Fc の望ましい品質が維持されていることを確認するために使用されます。 すべての in vitro 研究では、ネガティブ コントロールは、各アッセイの限界を定義するために、さまざまな比率 (10% ～ 90%) で変性死滅 Kr1Fc と混合された Kr1Fc であり、ポジティブ コントロールとして、Kr1Fc のマスター ロットが比較用に確保されます。 異なるロット間のすべてのアッセイ。
【0039】
本発明によれば、Kr1Fc、K5Fc、およびK5ロットの効力は、Kr1Fc、またはK5Fc、またはK5とGRP78との間の直接結合ELISAアッセイを使用して決定される。 ＰＢＳ中１００ｎＭの全長ｈｉｓタグ付きＧＲＰ７８（ＳｔｒｅｓｓＭａｒｔ）を、ニッケルコーティングされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）に付着させる。 0.5 ～ 50 nM のさまざまな濃度の阻害剤が 4℃ で結合します。 メーカーの指示に従って (Pierce)、プレートを 10% BSA でブロックし、0.05% Tween(R)-20 洗剤を含む PBS で洗浄します。 最後に、マウス抗ヒト Fc HRP 標識抗体を添加し、結合した Kr1Fc、K5Fc、または K5 の検出を TMB ELISA (Sigma) 試薬で評価します。 結果で説明したように、Kr1Fc、K5Fc、および K5 ロットの二次結合アッセイを実行し、SARS-COV-2 スパイクタンパク質と GRP78 間の Kr1Fc 競合結合を測定します (図 4)。
【0040】
本発明によれば、Kr1Fcロットの機能的有効性は、免疫共抑制チェックポイント(PD-L1、B7H3、B7H4)および免疫共刺激(CD86、MHC-II)タンパク質の発現を調べることによって決定される。 図５に記載されているように、ｓＧＲＰ７８（５μｇ／ｍｌ）を肺上皮腺癌Ａ５４９細胞に添加し、３７℃／５％ＣＯ２でＫｒ１Ｆｃを加えて３日間増殖させた。 3 日後、細胞を Versene で取り出し、固定した後、蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を実行します。
【0041】
2 倍を超えるシグナル対ノイズ比を持ち、10% を超える不純物を検出できるアッセイ、および効力アッセイおよび機能アッセイの EC(50) 値が 200 nM 未満のアッセイは、有効であるとみなされます。
【0042】
薬物の純度と同一性に関しては、質量分析法は 5% 未満の不純物を確実に検出できます。 2 倍のシグナル対ノイズ要件は、機能的チェックポイントタンパク質発現アッセイを除くすべてのアッセイで満たされています。 別のアプローチは、Kr1Fc を使用して A549 細胞のシグナル伝達経路におけるタンパク質のリン酸化をテストすることです。 PI3K、SMAD2/3、STAT3を介するシグナル伝達経路を用いたタンパク質リン酸化アッセイは、従来技術において知られている。 これらのシグナル伝達経路アッセイは、多くの Kr1Fc の活性と機能をテストするための迅速かつ正確な方法につながります。
【0043】
本発明によれば、肺上皮A549細胞およびVERO細胞に対するSARS-CoV-2スパイクタンパク質の結合および内部移行効果を遮断するGRP78阻害剤Kr1Fc、K5Fc、およびK5の有効性が決定され、検証された。
【0044】
開示された Kr1Fc、K5Fc、および K5 阻害剤は、SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の GPR78 への結合を強力にブロックします (図 4A)。 腫瘍と同様に、ウイルス感染は炎症性の免疫回避微小環境を作り出します。 参照により組み込まれた参考文献は、ストレスを受けた細胞がGRP78を細胞表面に再配置することを示している。 表面結合 GRP78 は、共抑制チェックポイントタンパク質の発現を上方制御し、共刺激タンパク質の発現を下方制御することにより免疫抑制を誘導します。 GRP78 は、IL-10 や IL-6 などの炎症性サイトカインの発現も増加します。 当社の GRP78 阻害剤で GRP78 の活性と肺、腎臓上皮および内皮細胞表面への結合をブロックすることにより、本発明を実践する人は、ヒト肺胞肺上皮腺癌 A549 細胞、VERO 上皮細胞および内皮細胞の免疫抑制性、炎症性の性質を完全に逆転させることができます。 さらに、研究では、GRP78 の N 末端ドメインをブロックすると、ベータコロナウイルスを含むいくつかの種類のウイルスの付着、侵入、複製が減少することが示されています。 したがって、これらの研究では、GRP78のN末端ドメインに結合する当社のGRP78阻害剤が、SARS-CoV-2ウイルスに対してsiRNAまたはN末端GRP78抗体と同様の効果を生み出すことを示しています。
【0045】
本発明によれば、Kr1FcおよびK5の完全偽型SARS-CoV-2ウイルス（rVSV-SARS-CoV-2（D614G））に対する中和活性は、ウイルスが培養下で増殖したVERO細胞に付着して侵入するのを防ぐことができる 。 2 つの化合物は、Kr1Fc では 3.448 uM、K5 では 47.35 の IC(50) 値で強力な活性を示します。 Ｋ５については０．５ｎＭから５００μＭ、Ｋｒ１Ｆｃについては０．０１ｎＭから６２μＭの８つの希釈物を、細胞を含む３つのウェルに添加した。 本発明によるウェルは、各ウェルに対して25,000～35,000の相対光単位でSARS-CoV2シュードタイプウイルスに感染する。 プレートを２４時間インキュベートし、付着した細胞を洗浄し、次にＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して各ウェルのルシフェラーゼ活性を測定した。 試験化合物の毒性も、ウイルスを含まないVERO細胞に対して並行して測定した。 有効性を示すために、50% および 90% の有効中和濃度 (IC50、IC90) および 50% の細胞死濃度 (細胞毒性、CC50) の値が回帰分析によって計算されます。 細胞毒性と抗ウイルス活性の間の安全範囲を示す選択性指数 (SI50) (CC50 を IC50 で割った値) を計算し、表 1 に示しました。SI50 値が高いほど、阻害剤の有効性と安全性が高くなります。
【0046】
本発明によれば、ウイルス付着の強力な阻害が証明される。 ＧＲＰ７８はストレス細胞および腫瘍細胞において表面結合しているため、本発明によれば、医師はＧＲＰ７８をＡ５４９細胞およびＶＥＲＯ細胞の培地に添加して、ウイルス付着および内部移行のための細胞株を作製することができる。 本発明によれば、Ｋ５、Ｋ５ＦｃおよびＫｒ１Ｆｃは、表面結合ＧＲＰ７８を＞９０％減少させるであろう。 本発明によれば、Kr1Fcで処理したA549細胞で観察された免疫抑制の逆転は、インビボでのウイルス病理を軽減し得る応答を実証する。
【0047】
本発明によれば、Ｋｒ１Ｆｃは、急性呼吸窮迫症候群致死マウスモデル（ＢＡＬＢ／ｃマウス）において適応したＳＡＲＳコロナウイルスを阻害するであろう。 SARS-COV-2 ウイルスは、致死性の高い重篤な急性呼吸器症候群を引き起こします。 現在まで、ベータコロナウイルス感染症を治療するために直接承認された薬はありません。 その理由の一部は、薬物検査に適した動物モデルが不足していることです。 研究者らはマカク、マーモセット、ハムスター、ネコ、フェレットの複数の動物モデルをSARSウイルスで検査しているが、SARS-CoV-2ウイルスの病原性を模倣する動物モデルはほとんどない。 最近、デイら。 らは、肺を標的とし、BALB/c マウスにおいて致死性の高い SARS-CoV の新株 (v2163) を適応させ、特徴付けを行った。 このモデルは主にヒトの新型コロナウイルス感染症を模倣しています。 低コスト、取り扱いの容易さ、必要な薬剤の量が最小限であるため、このモデルは、本発明に従って実施された場合、ヒトSARS-CoVウイルスに対するGRP78阻害剤を実証する。 マウスとヒトの GRP78 は 98% 同一であるため、この性質の研究では、Kr1Fc 薬がヒトだけでなくマウスでも GRP78 の活性を遮断し、その結果肺細胞の感染が大幅に減少することが実証されています。
【0048】
実験
本発明によれば、Kr1FcおよびK5の抗ウイルス活性は、V2163と呼ばれるウルバニSARS-CoVのマウス適合株を使用して実証される。 半数の雄と半数の雌のBALB/cマウスに、104 CCID50（細胞培養感染量50％エンドポイント）を含む50μLのSARS-CoV-V2163ウイルスを鼻腔内（i.n.）送達によって接種する。 ４つのマウス群（各群１０匹のマウス）に、１００ｍｇ／ｋｇ／日のＫ５、５０ｍｇ／ｋｇ／日のＫｒ１Ｆｃ、およびＰＢＳ、ｐＨ７．４の陰性対照、および研究所の基準を満たすこのモデルの陽性対照を投与する。 抗ウイルス研究用。 Kr1FcおよびK5サンプルはすべて、i.n.投与の16時間前に、肩甲骨間にi.p.QD投与されます。 今後7日間は感染が続く可能性があります。 マウスは毎日観察され、研究全体を通じてグループの体重が測定されます。 ウイルス暴露後 21 日目までマウスの死亡を観察します。 最初の体重の 30% を超えて減少した動物は人道的に安楽死され、安楽死の日が死亡日として指定されます。 屠殺したマウスの肺の全体的な病理および変色を観察し、0 (正常に見える肺) から 4 (肺の 100% で最大のプラム色) までの範囲のスコアを割り当てます。 各試験グループからのマウス肺サンプルをプールし、MEM 溶液中でホモジナイズし、A) ウイルス収量アッセイを使用した感染性ウイルス、B) サイトカイン分析 (IL-6、IL-1、および IL-10) および免疫細胞浸潤物 (NK) についてアッセイします。 、マクロファージ、T細胞およびDC）。 ウイルス力価、サイトカイン濃度および免疫細胞数は、等分散および正規分布を仮定した対数変換値の分散分析によって対照と比較されます。 PBS陰性対照と比較したKr1FcまたはK5治療による生存率の有意な(p<0.05)改善および肺におけるウイルス誘発性CPEの有意な減少は、さらなる研究の基礎を提供する。
本発明によれば、Kr1FcおよびK5の抗ウイルス活性は、V2163と呼ばれるウルバニSARS-CoVのマウス適合株を使用して実証される。 半数の雄と半数の雌のBALB/cマウスに、104 CCID50（細胞培養感染量50％エンドポイント）を含む50μLのSARS-CoV-V2163ウイルスを鼻腔内（i.n.）送達によって接種する。 ４つのマウス群（各群１０匹のマウス）に、１００ｍｇ／ｋｇ／日のＫ５、５０ｍｇ／ｋｇ／日のＫｒ１Ｆｃ、およびＰＢＳ、ｐＨ７．４の陰性対照、および研究所の基準を満たすこのモデルの陽性対照を投与する。 抗ウイルス研究用。 Kr1FcおよびK5サンプルはすべて、i.n.投与の16時間前に、肩甲骨間にi.p.QD投与されます。 今後7日間は感染が続く可能性があります。 マウスは毎日観察され、研究全体を通じてグループの体重が測定されます。 ウイルス暴露後 21 日目までマウスの死亡を観察します。 最初の体重の 30% を超えて減少した動物は人道的に安楽死され、安楽死の日が死亡日として指定されます。 屠殺したマウスの肺の全体的な病理および変色を観察し、0 (正常に見える肺) から 4 (肺の 100% で最大のプラム色) までの範囲のスコアを割り当てます。 各試験グループからのマウス肺サンプルをプールし、MEM 溶液中でホモジナイズし、A) ウイルス収量アッセイを使用した感染性ウイルス、B) サイトカイン分析 (IL-6、IL-1、および IL-10) および免疫細胞浸潤物 (NK) についてアッセイします。 、マクロファージ、T細胞およびDC）。 ウイルス力価、サイトカイン濃度および免疫細胞数は、等分散および正規分布を仮定した対数変換値の分散分析によって対照と比較されます。 PBS陰性対照と比較したKr1FcまたはK5治療による生存率の有意な(p<0.05)改善および肺におけるウイルス誘発性CPEの有意な減少は、さらなる研究の基礎を提供する。
【0049】
参照により組み込まれる参考文献に記載されているように、Ｋ５は、マウスおよびサルにおいて約２０分の半減期および６６０ｍｇ／ｋｇを超えるＭＴＤを有する。 本発明および追加のＦｃドメインを有するタンパク質の出版物による、より強力なＧＲＰ７８阻害剤、Ｋｒ１ＦｃおよびＫ５Ｆｃは、半減期が改善されており、個々のクリングルドメインよりも有利である可能性がある。 さらに、ACE2 阻害剤と当社の GRP78 阻害剤との併用療法は、相乗効果を示す可能性があります。
【0050】
本発明によれば、記載された結論は統計分析によって実証される。 より具体的には、グラフ生成と統計分析は GraphPad Prism 7.0 ソフトウェアで行われます。 統計的比較は、正規分布と等分散を仮定し、スチューデントの両側 t 検定によるボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析を実行し、p<0.05 で差が有意であると見なされます。 必要なマウスの数を決定するために、G*Power 3.1.9.4 プログラムを使用した両側不対サンプル検出力分析の Wilcoxon-Mann-Whitney 検定による検出力分析が使用されます。 グループサイズ (n=10) は、変動係数が 1.5 に等しいと仮定して、対照群と 10 mg/kg Kr1Fc 治療群の間の転移数の少なくとも 30% の減少を検出するように検出されます (予測/予想によって示唆されるように)。 データ)、検出力 80%、有意水準 0.05 の対数正規データに対して 2 サンプル t 検定を使用します。 最大死亡日（MDD）、サイトカイン値、および総肺スコアは、マン-ホイットニーの一対比較またはクラスカル-ウォリス検定とそれに続くダンの多重比較検定によって分析されます（該当する場合）。 生の生存数はフィッシャーの直接確率検定によって比較されます。 生存曲線分析は、カプラン マイヤー法とログ ランク テストを使用して行われます。 その分析により治療群間の有意差が明らかになった場合、生存者曲線のペアごとの比較が Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定によって分析され、相対的有意性が治療比較の数についてボンフェローニ補正された有意しきい値に調整されます。 体重減少パーセントの差は、等分散と正規分布を仮定したニューマン・クール多重比較検定を用いた一元配置分散分析によって検定されます。 肺力価データについては、正規性について KS 検定を実行し、正規分布していないグループについてはノンパラメトリック クラスカル-ウォリス検定とダンの多重比較検定を使用し、ニューマン-クールスの多重比較検定を使用した一元配置分散分析を使用します。 正規分布するグループ。
【0051】
図面の詳細な説明
図 1 は、GRP78 阻害剤を使用した場合と使用しない場合の SARS-CoV-2 ウイルスの付着、侵入、複製の模式図です。 図 1A は、ストレスが GRP78 の細胞表面への移動を誘導することを示しています。 1) SARS-CoV-2 ウイルスは GRP78 と ACE2 に付着します。 2) GRP78 は、SARS-CoV-2 ウイルスの肺上皮細胞への侵入を促進します。 3) GRP78 は SARS-CoV-2 の複製と分泌を増加させます。 図1Bは、GRP78阻害剤がかなりの量のSARS-CoV-2ウイルス結合をブロックし、GRP78の表面発現を減少させ、それにより細胞へのSARS-CoV-2ウイルス侵入量の減少につながることを示しています。 最後に、細胞表面に GRP78 が存在しないと、SARS-CoV-2 ウイルスの付着、内部移行、複製が阻害されます。 赤い X は、細胞表面上の GRP78 結合をブロックするとウイルスの複製がブロックされることを示します
図 1 は、GRP78 阻害剤を使用した場合と使用しない場合の SARS-CoV-2 ウイルスの付着、侵入、複製の模式図です。 図 1A は、ストレスが GRP78 の細胞表面への移動を誘導することを示しています。 1) SARS-CoV-2 ウイルスは GRP78 と ACE2 に付着します。 2) GRP78 は、SARS-CoV-2 ウイルスの肺上皮細胞への侵入を促進します。 3) GRP78 は SARS-CoV-2 の複製と分泌を増加させます。 図1Bは、GRP78阻害剤がかなりの量のSARS-CoV-2ウイルス結合をブロックし、GRP78の表面発現を減少させ、それにより細胞へのSARS-CoV-2ウイルス侵入量の減少につながることを示しています。 最後に、細胞表面に GRP78 が存在しないと、SARS-CoV-2 ウイルスの付着、内部移行、複製が阻害されます。 赤い X は、細胞表面上の GRP78 結合をブロックするとウイルスの複製がブロックされることを示します
【0052】
図2は、我々のクラスのGRP78阻害剤によるSARS-CoV-2ウイルス阻害の概略図である。 本発明は、N末端GRP78阻害剤が、1) SARS-CoV-2ウイルスの付着と侵入を阻止すること、2) 肺細胞表面でのプラスミノーゲンからプラスミンへの変換を阻止することにより過剰線維素溶解を低減すること、3) 肺細胞表面でのチェックポイントタンパク質の発現を低減することにより免疫抑制を逆転させることを示す。 肺細胞および内皮細胞、4) IL10 および IL6 サイトカインの発現を低下させることにより、ウイルス誘発性のサイトカインストームを軽減します。
【0053】
図３は、Ｋｒ１Ｆｃ、Ｋ５Ｆｃ、Ｋｒ１およびＫ５タンパク質の純度、構造および結合の分析である。 図３Ａ～Ｄは、２９３Ｆ ＨＥＫ細胞において発現されたＡ）Ｋｒ１Ｆｃ、Ｂ）Ｋ５Ｆｃ、Ｃ）Ｋｒ１、およびＤ）Ｋ５タンパク質を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の画像である。 クリングルタンパク質は、プロテイン A アガロースまたはベンズアミジン アガロースのいずれかによって精製されました。 レーンマーカーは、Mw:タンパク質マーカー、レーン1:還元条件、レーン2:非還元条件、M:発現培地、F:フロースルー、W:洗浄、P:精製タンパク質です。 図３Ｅは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに融合された２つのクリングルドメインを有するＫｒ１－ＦｃおよびＫ５Ｆｃ融合タンパク質の図解である。 図３Ｆは、公開されたＧＲＰ７８タンパク質阻害剤と本発明のタンパク質が相互作用するヒトＧＲＰ７８領域の概略図である。 GRP78 タンパク質に対するウイルスの既知および予測結合部位は、GRP78 の概略図の下に示されています。 (ATPase ドメイン SBD: 基質結合ドメイン、KDEL; 4 残基 C 末端ペプチド)。
【0054】
図 4 は、N 末端 GRP78 阻害剤が SARS-CoV-2 スパイクタンパク質への GRP78 の結合をブロックすることを示しています。 図4Aは、96ウェルプレートにおける全長SARS-CoV-2スパイクタンパク質、HRP標識GRP78およびGRP78阻害剤を用いた結合アッセイの概略図である。 図４Ｂは、Ｎ末端ＧＲＰ７８阻害剤、Ｋｒ１Ｆｃ、Ｋ５Ｆｃ、およびＫ５が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質へのＧＲＰ７８の結合を強力にブロックできるというデータを示すグラフである。 全長SARS-CoV-2スパイクタンパク質を4℃で一晩96ウェルプレートに結合させた。 ブロッキングおよび洗浄後、HPR標識GRP78および様々な濃度のKr1Fc、K5Fc、K5および陰性対照である折り畳まれていないKr1Fcをプレートに添加し、2時間インキュベートした。 ウェルを洗浄し、TMB試薬を添加し、メーカーのプロトコールに従って吸光度を測定した。 各点は 3 つのウェルの平均です。
【0055】
図 5 は、GRP78 阻害剤が PE 標識 SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の A549 肺細胞への結合をブロックすることを示しています。 SARS-CoV-2 スパイクタンパク質 -PE (50 nM) を、Kr1Fc (100 nM) または K5 (500 nM) の有無にかかわらず、50,000 個の A549 肺細胞に添加しました。 細胞を4℃で一晩インキュベートして、SARS-CoV-2スパイクタンパク質-PEの内部移行をブロックした。 細胞をPBSで2回洗浄し、Guava PCAフローサイトメーターで分析しました。 コントロールはヒト IgG1-PE Ab でした。 図5Aは生のフローサイトメトリープロットを示し、図5BはGRP78阻害剤と競合したSARS-CoV-2スパイクタンパク質-PEが結合したA549細胞のヒストグラムオーバーレイ分析であり、Kr1FcとK5がSARS-CoV-2スパイクタンパク質-PEをブロックすることを示している A549 肺細胞への結合率はそれぞれ 99% および 65% 以上です。
【0056】
図6は、GRP78阻害剤がSARS-CoV-2スパイクタンパク質-PEのVERO細胞への結合を妨げることを示している。 VERO 細胞は、ACE2 の発現が高く、SARS-CoV-2 ウイルスの感染力に非常に敏感であるため、使用されました。 SARS-CoV-2 スパイクタンパク質 -PE (50 nM) を、Kr1Fc (100 nM) または K5 (500 nM) の有無にかかわらず、50,000 個の VERO 腎細胞に添加しました。 細胞を37℃で一晩インキュベートした。 次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｇｕａｖａ ＰＣＡフローサイトメーターで分析した。 コントロールはヒト IgG1-PE Ab でした。 図６Ａは、ドットブロットフローサイトメトリー分析であり、図６Ｂは、Ｋｒ１ＦｃおよびＫ５の有無にかかわらず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質－ＰＥに結合したＶＥＲＯ細胞のヒストグラムの重ね合わせである。 データから、Kr1Fc (100 nM) および K5 (500 nM) が、VERO 細胞の表面への SARS-CoV-2 スパイクタンパク質 - PE の結合を約 50% 大幅に減少させたことが明らかです。
【0057】
図 7 は、Kr1Fc および K5 が、VERO 細胞とのプレインキュベーションにより、またはスパイクタンパク質と同時に添加された SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の結合を防止することを示しています (図 6)。 図7Aは、Kr1Fc (100 nM)またはK5 (500 nM)の存在下または非存在下で6時間プレインキュベートしたVERO細胞に結合するSARS-CoV-2スパイクタンパク質-PE (50 nM)のドットブロットフローサイトメトリー分析およびヒストグラムオーバーレイ分析を示しています。 SARS-CoV-2 スパイクタンパク質と PE の結合の阻害は、Kr1 または K5 プレインキュベーションにより 60% を超えました。 これらのデータは、細胞を GRP78 阻害剤とプレインキュベートすると、スパイクタンパク質の結合がわずかに減少する可能性があることを示唆しています。
【0058】
図８は、Ｎ末端ＧＲＰ７８阻害剤がＶＥＲＯ細胞上の表面結合ＧＲＰ７８の発現を減少させることを実証している。 当社の GRP78 阻害剤が単に SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の GRP78 への結合をブロックするだけなのか、それとも実際に細胞表面から GRP78 を除去して、スパイクタンパク質の結合と内部移行のための表面結合 GRP78 が減少するのかを定義するために、表面の量を測定しました。 Kr1Fc (100 nM) および K5 (500 nM) 処理後の VERO 細胞上の GRP78 結合。 図８Ａは、Ｃ末端ＧＲＰ７８抗体－ＰＥを使用したＶＥＲＯ細胞表面結合ＧＲＰ７８のフローサイトメトリー分析を示す。 この抗体は、SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の結合を阻害することは示されていません。 図８Ｂは、フローサイトメトリーのドットブロットおよびヒストグラムオーバーレイ分析を示し、Ｋｒ１ＦｃおよびＫ５は、表面結合ＧＲＰ７８の５０％を超える減少を生じた。 これは、これらのN末端GRP78阻害剤がVERO細胞表面からGRP78を内部移行/除去し、その結果SARS-CoV-2スパイクタンパク質結合の結合部位が減少する可能性があることを示唆している。
【0059】
図９は、Ｎ末端ＧＲＰ７８阻害剤が、Ａ５４９肺細胞上の表面結合ＧＲＰ７８の発現を減少させることを実証する。 当社の GRP78 阻害剤が VERO 細胞のような A549 肺細胞表面から GRP78 を内部移行/除去できるかどうかを定義するために、Kr1Fc (100 nM) および K5 (500 nM) 処理後の A549 細胞上の表面結合 GRP78 の量を測定しました。 図９Ａは、Ａ５４９細胞の表面結合ＧＲＰ７８のフローサイトメトリー分析を示し、表面結合ＧＲＰ７８の発現がＶＥＲＯ細胞よりもはるかに低いことを示している。 これもまた、VERO 細胞が A549 細胞よりもはるかに感染しやすい理由を示唆しています。 図９Ｂは、フローサイトメトリーのドットブロットおよびヒストグラムオーバーレイ分析を示し、Ｋｒ１ＦｃおよびＫ５は、表面結合ＧＲＰ７８をそれぞれ８４％から６０％に減少させた。 これは、これらのN末端GRP78阻害剤がA540およびVERO細胞表面からGRP78を内部移行/除去し、その結果SARS-CoV-2スパイクタンパク質結合の結合部位が減少する可能性があることを示唆しています。
【0060】
図10は、VERO細胞上の表面結合GRP78発現が、Kr1FcおよびK5によって大幅に減少し、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の内部移行に不可欠であることを示している。 図10Aのアッセイでは、pHrodo red色素を使用してSARS-CoV-2スパイクタンパク質を標識し、内部移行を測定した。 pHrodo 色素は、pH 7 (細胞の外側または細胞に結合) では弱い蛍光を発しますが、細胞の内側では pH 5.5 ～ 4.5 付近で強い蛍光を発します。 これにより、VERO 細胞上の pHrodo red 標識 SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の内部移行の測定が可能になります。 図１０Ｂは、Ｋｒ１ＦｃおよびＫ５を含むおよび含まないＶＥＲＯ細胞上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質－ｐＨｒｏｄｏ内部移行のフローサイトメトリー分析を示す。 ドット ブロット分析および図 10 C のヒストグラム オーバーレイ プロットから、Kr1Fc (100 nM) および K5 (500 nM) は、VERO 細胞における SARS-CoV-2 スパイク タンパク質 - pHrodo の内部移行を 95% 以上大幅に減少させます。
【0061】
図11は、N末端GRP78結合タンパク質、Kr1FcおよびK5によるGRP78阻害が、完全なSARS-CoV-2シュードタイプウイルスの付着およびVERO細胞への内部移行を強力かつ有意に阻害することを実証する。 本発明では、改良されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスアッセイがＩＢＴ Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ（メリーランド州ロックビル）によって実施された。 このアッセイでは、SARS-CoV-2 ウイルスの複製 RNA 断片を検出用のルシフェラーゼ酵素タンパク質をコードする RNA に置き換えることにより、SARS-CoV-2 シュードタイプウイルスが生成されました。 残りの構造タンパク質 (スパイクタンパク質、エンベロープタンパク質、マトリックスタンパク質およびヌクレオカプシドタンパク質) は無傷のまま残されました。 これにより、SARS-CoV-2 (rVSV-SARS-CoV-2 (D614G)) シュードタイプウイルスが付着して内部に取り込まれるが、複製はできなくなります。 本発明は、Kr1FcおよびK5が、完全なSARS-CoV-2シュードタイプウイルスの付着およびVERO細胞への侵入を阻害できることを教示する。 図１１Ａは、Ｋｒ１Ｆｃについて３．５μＭ、Ｋ５について４７．４μＭのＩＣ５０値が観察された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプウイルス感染性の強力な、用量依存的かつ完全な中和（９９．９％）を示す。 アッセイは、K5については0.5 nM～500 uM、Kr1Fcについては0.01 nM～62 uMの8つの希釈を使用して実行されました。 これらの希釈液を、VERO 細胞を含む 96 ウェル プレートの 3 つのウェルに添加しました (ウェルあたり 1x105 細胞)。 本発明によるウェルは、各ウェルにおいて25,000～35,000相対光単位でSARS-CoV-2シュードタイプウイルスに感染する。 プレートを２４時間インキュベートし、付着した細胞を洗浄し、次にＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して各ウェルのルシフェラーゼ活性を測定した。 図１１Ｂに示すように、試験化合物の毒性も、ウイルスを含まないＶＥＲＯ細胞に対して並行して測定した。 Ｋｒ１Ｆｃは２ｍＭまで細胞毒性を示さず、Ｋ５は３７５μＭの５０％（ＣＣ５０）の細胞毒性細胞濃度でＶＥＲＯ細胞の増殖を阻害した。 これらの毒性数値はウイルス阻害濃度より少なくとも 10 倍高く、毒性がウイルスの付着および侵入阻害の作用機序ではないことを示しています。
【0062】
図１２ＡおよびＢは、Ｋ５が、Ａ５４９肺細胞上の可溶性ＧＲＰ７８によって誘導される共抑制（ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７Ｈ４）チェックポイントタンパク質および共刺激（ＣＤ８６、ＭＨＣ－ＩＩ）タンパク質の発現を有意に増強することを示す。 チェックポイントタンパク質発現 +/- sGRP78 (5 ug/m) および K5 (500 nM) のフローサイトメトリー ヒストグラム プロット。 A549細胞を3日間+/- sGRP78(5μg/ml)およびK5(500nM)とともにインキュベートした。 次に細胞を固定し、示されているように蛍光標識抗体で染色し、Guava PCA で FAC 分析を実行しました。 すべての抗体はマウス抗ヒトであり、PE標識されていました。 マウス IgG-PE 抗体 (灰色) をネガティブコントロールとして使用しました。 5～10の異なるA549細胞分割数を用いた3つの独立した分析の平均を使用した。 ns: 有意ではない、* p<0.05、** p<0.01、***p<0.005、****p<0.001。 文脈上特に説明がない限り、アスタリスク「*」は図中のアスタリスクに対応します。
【0063】
図１３ＡおよびＢは、Ｋｒ１Ｆｃが、Ａ５４９肺細胞上の可溶性ＧＲＰ７８によって誘導される共抑制（ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７Ｈ４）チェックポイントタンパク質の発現および共刺激（ＣＤ８６、ＭＨＣ－ＩＩ）タンパク質の発現を有意に増強することを示す。 チェックポイントタンパク質発現 +/- sGRP78 (5 ug/m) および Kr1Fc (100 nM) のフローサイトメトリー ヒストグラム プロット。 A549細胞を3日間+/- sGRP78(5μg/ml)およびKr1Fc(100nM)とともにインキュベートした。 次に細胞を固定し、示されているように蛍光標識抗体で染色し、Guava PCA で FAC 分析を実行しました。 すべての抗体はマウス抗ヒトであり、PE標識されていました。 マウス IgG-PE 抗体 (灰色) をネガティブコントロールとして使用しました。 5～10の異なるA549細胞分割数を用いた3つの独立した分析の平均を使用した。 ns: 有意ではない、* p<0.05、** p<0.01、***p<0.005、****p<0.001
【0064】
図１４ＡおよびＢは、Ｋｒ１ＦｃおよびＫ５が、Ａ５４９肺細胞からのＩＬ１０およびＩＬ６の可溶性ＧＲＰ７８誘導性サイトカイン発現を阻害することを実証する。 A549細胞(50,000個)を完全DMEM培地中のエッペンドルフチューブに加えた。 チューブの半分に、可溶性ＧＲＰ７８（５μｇ／ｍｌ）をＫ５（５００ｎＭ）またはＫｒ１Ｆｃ（１００ｎＭ）とともに添加した。 IgG ヒト抗体をネガティブコントロールとして使用しました。 穏やかに振盪しながら３７℃で３日間インキュベートした後、細胞を遠心分離し、ＩＬ１０またはＩＬ６ ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかを使用して上清を試験した。 各キットのプロトコールに従い、GRP78阻害剤を含むA549細胞およびGRP78阻害剤を含むA549細胞の各条件における各サイトカインのpg/mlを標準曲線から計算した。 各ラインは 3 つのウェルの平均です。 ****p<0.001
【0065】
図１５は、Ｋｒ１ＦｃおよびＫ５がＶＥＲＯ細胞表面上のヒトプラスミノーゲンの活性化を阻害することを示す。 図１５Ａは、有効かつスムーズな血流を有する左側の損傷を受けていない肺の概略図である。 右側は、SARS-CoV-2ウイルス感染により損傷した肺です。 感染は激しい炎症を引き起こし、微小血栓と高レベルの D ダイマーを誘発する過剰線維素溶解を引き起こします。 赤色のプラスミノーゲンからプラスミンへの反応は、GRP78 阻害剤が細胞表面プラスミンの活性化を阻害することで微小血栓と D ダイマーの形成をブロックする場所です。 図１５Ｂは、ＶＥＲＯ細胞上のＫｒ１およびＫ５によるプラスミン活性化の有意な阻害を示す。 96 ウェル プレートに VERO 細胞を添加し (ウェルあたり 50,000 個)、37℃、5% CO2 で一晩インキュベートしました。 翌日、培地を除去し、PBSを各ウェルに加えた。 次いで、ＧＲＰ７８阻害剤、Ｋｒ１Ｆｃ（１００ｎＭ、１０ｎＭ）およびＫ５（５００ｎＭ、５０ｎＭ）およびヒトプラスミノーゲン（１００ｎｇ）を各ウェルに添加した。 最後に、プラスミン基質VAL-Leu-Lys-pNA（S2251）を製造業者の指示に従って各ウェルに添加し、プレートを405nmで読み取って、プラスミンの酵素活性に比例するpNA形成を測定した。 グラフに示されているように、Kr1Fc および K5 は、VERO 細胞上のプラスミノーゲン活性化の Vmax を有意に阻害しました。
【0066】
図１６は、腹腔内にＫｒ１Ｆｃ（６０ｍｇ／ｋｇ）またはＫ５（９０ｍｇ／ｋｇ）で隔日処置したマウスが体重減少も明白な毒性も示さなかったことを示す。 Kr1FcおよびK5を8週齢のBALB/cマウスに投与した。 ３群のマウスに、各動物の体重に合わせて１０ｍＬ／ｋｇの量を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。 治療群は次のとおりです。 1 つのグループに PBS を腹腔内投与 22日目までは隔日。 1つのグループは、22日目まで60 mg/kgのKr1Fc、腹腔内、隔日（qod）で治療されました。 1 つのグループには 90 mg/kg の K5 を 22 日目まで隔日 (qod) で投与しました。動物の体重を 1 ～ 5 日目まで毎日測定し、その後 22 日目まで週に 2 回測定しました。マウスは、何らかの有害な兆候がないか頻繁に観察されました。 治療関連（TR）副作用と臨床徴候が観察されたときに記録されました。 個々の体重はプロトコールに従ってモニタリングされ、体重減少が 1 回の測定で 30% を超えるか、または 3 回の連続測定で 25% を超える動物は、TR 死亡として安楽死させました。 Charles River Discovery Services プロトコルに従って、グループの平均体重減少もモニタリングしました。 許容可能な毒性は、研究中の群平均体重 (BW) 減少が 20% 未満、TR による死亡が 10% 未満であると定義されました。 臨床徴候および/または剖検によって証明されるように、死亡が治療の副作用に起因する場合、死亡はTRとして分類されました。 図１６から、Ｋｒ１ＦｃおよびＫ５が、上に列挙したように投与されたマウスにおいて明らかな毒性または体重減少を示さなかったことは明らかである。
【0067】
図１７は、ＧＲＰ７８認識部位にわたる特定の配列に対する細胞毒性および抗ウイルス活性を示す表である。 以下により詳細に説明するように、ウイルスの配列アラインメントを既知の GRP78 結合クリングル配列と比較して、可能性のある GRP78 結合部位を同定し、GRP78 の N 末端ドメインのブロックによるウイルス阻害の本発明の治療方法にどのウイルスが応答するかを予測できるようにします。
【0068】
治療発明を使用する場合の治療パラメータ
重篤なウイルス性疾患は、宿主の免疫系を圧倒するウイルスレベルへの曝露、細胞感染、およびウイルスの複製の結果であり、疾患の兆候や症状を引き起こします。 ウイルスは自分自身で新しいウイルスを作ることができず、新しいウイルスを生成するには宿主細胞が必要です。 ウイルスへの曝露レベルが低い場合、通常、症状が発現する直前に体の免疫システムが活性化され、ウイルスを攻撃します。 これにより、ウイルスが宿主から排除されます。 免疫反応が限られている人やウイルスにさらされているレベルが高い人では、宿主の免疫系がウイルス量によって圧倒され、患者が病気になる可能性が高くなります。 ウイルス感染は、ウイルスが細胞表面に付着し、その際に細胞内に持ち込まれることで増殖します。 ウイルスは自身の DNA または RNA の指示を細胞に取り込んで複製し、最終的に放出しますが、このプロセスを何度も何度も繰り返し、感染率を高めます。これによりウイルス量が増加し、最終的には重篤な病気につながります。
重篤なウイルス性疾患は、宿主の免疫系を圧倒するウイルスレベルへの曝露、細胞感染、およびウイルスの複製の結果であり、疾患の兆候や症状を引き起こします。 ウイルスは自分自身で新しいウイルスを作ることができず、新しいウイルスを生成するには宿主細胞が必要です。 ウイルスへの曝露レベルが低い場合、通常、症状が発現する直前に体の免疫システムが活性化され、ウイルスを攻撃します。 これにより、ウイルスが宿主から排除されます。 免疫反応が限られている人やウイルスにさらされているレベルが高い人では、宿主の免疫系がウイルス量によって圧倒され、患者が病気になる可能性が高くなります。 ウイルス感染は、ウイルスが細胞表面に付着し、その際に細胞内に持ち込まれることで増殖します。 ウイルスは自身の DNA または RNA の指示を細胞に取り込んで複製し、最終的に放出しますが、このプロセスを何度も何度も繰り返し、感染率を高めます。これによりウイルス量が増加し、最終的には重篤な病気につながります。
【0069】
ウイルスは、細胞表面を探して付着する「スパイクタンパク質」と呼ばれるいくつかの細胞結合タンパク質を表面に持っていることが知られています。 SARS-CoV ウイルスおよび SARS-CoV-2 ウイルスの場合、この結合は、呼吸器肺および内皮細胞の細胞表面にある ACE2 受容体および GRP78 などの他の補助受容体に結合する可能性があります。 次に、これらの受容体はウイルス物質を細胞に輸送し、そこでウイルス物質が複製されて感染細胞から排出され、このプロセスが繰り返されます。
【0070】
GRP78認識部位でウイルスを選択し阻害する方法。
表面結合 GRP78 は、いくつかの異なる種類のウイルスの宿主細胞への付着と侵入に重要であることが報告されています。 Elfiky の出版物では、コロナウイルス SARS-CoV-2、NL63、229E、OC43、および HKU1 が同様の GRP78 認識/結合部位を持っていると予測しています。 他の出版物は、表面結合GRP78がジカウイルス、エボラウイルス、MERS-CoV、コクサッキーウイルスA9、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス（JEV）、インフルエンザウイルスの付着と侵入に重要であることを示しているが、それらが同じGRP78を持っているかどうかは調べていない。 バインディングシーケンス。 我々の以前の出版物から、我々はヒトプラスミノーゲンのクリングル5の配列であるCYTTNPRKLYDYCが表面結合GRP78にしっかりと結合することを実証した。
表面結合 GRP78 は、いくつかの異なる種類のウイルスの宿主細胞への付着と侵入に重要であることが報告されています。 Elfiky の出版物では、コロナウイルス SARS-CoV-2、NL63、229E、OC43、および HKU1 が同様の GRP78 認識/結合部位を持っていると予測しています。 他の出版物は、表面結合GRP78がジカウイルス、エボラウイルス、MERS-CoV、コクサッキーウイルスA9、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス（JEV）、インフルエンザウイルスの付着と侵入に重要であることを示しているが、それらが同じGRP78を持っているかどうかは調べていない。 バインディングシーケンス。 我々の以前の出版物から、我々はヒトプラスミノーゲンのクリングル5の配列であるCYTTNPRKLYDYCが表面結合GRP78にしっかりと結合することを実証した。
【0071】
Elfiky の予測では、K5 配列よりも弱い GRP78 結合配列、PEP42 (CTVALPGGYVRVC) を使用していますが、クリングル 5 構造フォールド領域での GRP78 結合について以前に示した重要なアミノ酸の一部がまだ保持されています。 図 17 では、可能性のある GRP78 結合部位を特定するために、ウイルスの配列アラインメントを既知の GRP78 結合クリングル配列と比較して示しています。 このアライメントを使用すると、GRP78 の N 末端ドメインをブロックすることによるウイルス阻害の治療方法にどのウイルスが反応するかを予測できます。 このアラインメントから、SARS-CoV-2、NL63、229E、OC43、HKU1、MERS-CoV、エボラ出血熱、ジカ熱、黄熱病、西ナイル熱、およびインフルエンザA、Bウイルスが、以下の理由により当社の治療法によって抑制されると予測できます。 GRP78 バインディングに影響します。 しかし、SARS-CoV には提案されている GRP78 結合配列が含まれていないため、当社の GRP78 阻害剤はこのウイルスに対して効果がないと予測されます。 この予測が正確である証拠として、実施例 6 では、当社の N 末端結合 GRP78 阻害剤 Kr1Fc が SARS-CoV-2 シュードウイルスの付着と侵入を強力にブロックすることを示すことができますが、当社の GRP78 阻害剤 Kr1Fc は、 SARS-CoVの致死性変異体に感染したマウスのウイルスによる死亡や体重減少は阻止できなかった。
【0072】
SARS-CoV-2 およびその他のウイルス感染に対する GRP78 阻害剤による予防または治療の対象集団を選択する方法
がん、肥満、心疾患、肺疾患、高血圧などの併存疾患のある65歳未満の人は、併存疾患がない人に比べてSARS-CoV-2ウイルスに感染するリスクが高い。 この同じグループの人々は、新型コロナウイルス感染症による死亡率もはるかに高くなります。 併存疾患の有無にかかわらず、65 歳以上の人が新型コロナウイルス感染症で死亡する可能性は、65 歳未満の人よりもはるかに高くなります。これらの併存疾患と一般的な老化プロセスによって内皮細胞、肺細胞、呼吸器細胞、免疫細胞にストレスがかかるため、 表面結合 GRP78 の存在は、老化と病気の進行に重要な役割を果たしていることが最近認識されています。
がん、肥満、心疾患、肺疾患、高血圧などの併存疾患のある65歳未満の人は、併存疾患がない人に比べてSARS-CoV-2ウイルスに感染するリスクが高い。 この同じグループの人々は、新型コロナウイルス感染症による死亡率もはるかに高くなります。 併存疾患の有無にかかわらず、65 歳以上の人が新型コロナウイルス感染症で死亡する可能性は、65 歳未満の人よりもはるかに高くなります。これらの併存疾患と一般的な老化プロセスによって内皮細胞、肺細胞、呼吸器細胞、免疫細胞にストレスがかかるため、 表面結合 GRP78 の存在は、老化と病気の進行に重要な役割を果たしていることが最近認識されています。
【0073】
加齢や併存疾患により、細胞はよりストレスを受け、細胞表面に結合した GRP78 の一貫したより高い発現をもたらします。 GRP78 のこのより高い発現により、より多くのウイルスの結合と細胞への侵入が可能になります (図 1)。 その後、ウイルスの複製とウイルス粒子の放出がはるかに高い速度で発生する可能性があります。 GRP78受容体の増加によりウイルスの結合、侵入、複製が増加するこのプロセスは、免疫系を圧倒し、罹患率と死亡率の増加につながる可能性があります。
【0074】
自己免疫疾患患者の治療
自己免疫疾患の患者は免疫系が完全に機能しておらず、表面結合型 GRP78 の発現が高いことが報告されている。 SARS-CoV-2のようなウイルスに対する免疫系を刺激するように設計された現在の治療法やワクチンは、ウイルスの望ましくない進行が増加する傾向にあるこれらの患者にはあまり効果がありません。 これらの患者に当社の GRP78 阻害剤による予防的および/または治療的サポートを提供すると、感染に対する一定レベルの保護が提供される可能性があり、感染した場合には、患者への新しいウイルスの付着、侵入、複製、および新しいウイルス粒子の放出がブロックされます。
自己免疫疾患の患者は免疫系が完全に機能しておらず、表面結合型 GRP78 の発現が高いことが報告されている。 SARS-CoV-2のようなウイルスに対する免疫系を刺激するように設計された現在の治療法やワクチンは、ウイルスの望ましくない進行が増加する傾向にあるこれらの患者にはあまり効果がありません。 これらの患者に当社の GRP78 阻害剤による予防的および/または治療的サポートを提供すると、感染に対する一定レベルの保護が提供される可能性があり、感染した場合には、患者への新しいウイルスの付着、侵入、複製、および新しいウイルス粒子の放出がブロックされます。
【0075】
がん患者の治療
癌患者、特に肺癌および血液媒介癌の患者は、内皮細胞だけでなく下気道細胞および上気道細胞でも表面結合GRP78の発現が高いことが示されている。 これらの患者は、化学療法を受けているため、通常、ワクチンや病原体に対する免疫反応が低下しています。 これらの患者をSARS-CoV-2ウイルスの予防的または感染後に当社のGRP78阻害剤で治療することにより、ウイルスの表面結合GRP78受容体へのアクセスをブロックすることで、感染の機会を減少させ、ウイルスの感染率を低下させることができる可能性があります。
癌患者、特に肺癌および血液媒介癌の患者は、内皮細胞だけでなく下気道細胞および上気道細胞でも表面結合GRP78の発現が高いことが示されている。 これらの患者は、化学療法を受けているため、通常、ワクチンや病原体に対する免疫反応が低下しています。 これらの患者をSARS-CoV-2ウイルスの予防的または感染後に当社のGRP78阻害剤で治療することにより、ウイルスの表面結合GRP78受容体へのアクセスをブロックすることで、感染の機会を減少させ、ウイルスの感染率を低下させることができる可能性があります。
【0076】
肥満患者の治療を行っています。
肥満患者は、高血圧、糖尿病、血行不良などのいくつかの併存疾患を抱えており、これらが肺や内皮細胞にストレスを与え、その結果、表面に発現する GRP78 が増加する可能性があります。 この表面発現 GRP78 の増加により、このグループの人々は SARS-CoV-2 感染と死亡のリスクが高くなります。 当社の GRP78 阻害剤を使用して、表面に結合した GRP78 によるウイルス感染力の量をブロックすると、ウイルス感染の症状と重症度を大幅に軽減できる可能性があります。
肥満患者は、高血圧、糖尿病、血行不良などのいくつかの併存疾患を抱えており、これらが肺や内皮細胞にストレスを与え、その結果、表面に発現する GRP78 が増加する可能性があります。 この表面発現 GRP78 の増加により、このグループの人々は SARS-CoV-2 感染と死亡のリスクが高くなります。 当社の GRP78 阻害剤を使用して、表面に結合した GRP78 によるウイルス感染力の量をブロックすると、ウイルス感染の症状と重症度を大幅に軽減できる可能性があります。
【0077】
糖尿病患者の治療
1型または2型糖尿病患者は、腎臓および内皮細胞上で表面結合GRP78の発現が高いことが示されている。 これらの患者に当社の GRP78 阻害剤を使用すると、ウイルス量と SARS-CoV-2 感染の可能性が大幅に減少し、通常の免疫攻撃とウイルス粒子の除去が可能になるはずです。
1型または2型糖尿病患者は、腎臓および内皮細胞上で表面結合GRP78の発現が高いことが示されている。 これらの患者に当社の GRP78 阻害剤を使用すると、ウイルス量と SARS-CoV-2 感染の可能性が大幅に減少し、通常の免疫攻撃とウイルス粒子の除去が可能になるはずです。
【0078】
心血管疾患患者の治療
心血管疾患患者の特徴は、心臓組織における小胞体ストレスの増加であり、その結果、血管系細胞上のACE2および表面結合GRP78の発現が増加する。 ACE2発現の増加によりSARS-CoV-2付着の増加が可能になるが、本発明は、SARS-CoV-2がウイルス侵入のために表面結合GRP78を必要とし、そのため、当社のGRP78阻害剤でGRP78の表面発現を低下させることにより、これが起こるはずであることを教示する ウイルス感染と死亡率が減少します。
心血管疾患患者の特徴は、心臓組織における小胞体ストレスの増加であり、その結果、血管系細胞上のACE2および表面結合GRP78の発現が増加する。 ACE2発現の増加によりSARS-CoV-2付着の増加が可能になるが、本発明は、SARS-CoV-2がウイルス侵入のために表面結合GRP78を必要とし、そのため、当社のGRP78阻害剤でGRP78の表面発現を低下させることにより、これが起こるはずであることを教示する ウイルス感染と死亡率が減少します。
【0079】
高血圧患者の治療
研究では、高血圧患者の動脈細胞内で小胞体発現 GRP78 が増加していることが示されています。 GRP78 発現のこの増加は、表面結合 GRP78 の増加につながります。 上に列挙したように、GRP78 の表面発現により、細胞内での SARS-CoV-2 ウイルスの付着、侵入、複製が促進されます。 当社の阻害剤で表面結合 GRP78 の発現を減らすことにより、ウイルス感染のリスクが減るだけでなく、慢性高血圧の影響も軽減されます。
研究では、高血圧患者の動脈細胞内で小胞体発現 GRP78 が増加していることが示されています。 GRP78 発現のこの増加は、表面結合 GRP78 の増加につながります。 上に列挙したように、GRP78 の表面発現により、細胞内での SARS-CoV-2 ウイルスの付着、侵入、複製が促進されます。 当社の阻害剤で表面結合 GRP78 の発現を減らすことにより、ウイルス感染のリスクが減るだけでなく、慢性高血圧の影響も軽減されます。
【0080】
65歳以上の患者の治療
加齢に伴い、炎症がより蔓延し、筋肉および動脈細胞のストレスが増大し、その結果、表面結合GRP78の一貫した発現がもたらされる。 SARS-CoV-2 感染症の重症度は年齢とともに大幅に増加することは明らかです。 このより高いレベルの GRP78 受容体により、SARS-CoV-2 ウイルスの細胞への付着と侵入が可能になります。 65 歳以上の患者を GRP78 阻害剤で治療すると、ストレスを受けた不健康な細胞の表面に結合する GRP78 が減少します。 SARS-CoV-2 ウイルス付着の受容体が少ないほど、SARS-CoV-2 感染の重症度は低くなります。
加齢に伴い、炎症がより蔓延し、筋肉および動脈細胞のストレスが増大し、その結果、表面結合GRP78の一貫した発現がもたらされる。 SARS-CoV-2 感染症の重症度は年齢とともに大幅に増加することは明らかです。 このより高いレベルの GRP78 受容体により、SARS-CoV-2 ウイルスの細胞への付着と侵入が可能になります。 65 歳以上の患者を GRP78 阻害剤で治療すると、ストレスを受けた不健康な細胞の表面に結合する GRP78 が減少します。 SARS-CoV-2 ウイルス付着の受容体が少ないほど、SARS-CoV-2 感染の重症度は低くなります。
【0081】
若年者（60歳未満）の健康な人がSARS-CoV-2感染により重篤な症状を示すことはまれです。 これは、若くて健康な人々の細胞の表面に結合する GRP78 が非常に少なく、ウイルス付着のリスクが減少するためであると私たちは考えています。 これにより、感染の重症度が制限され、子供や若者の死亡率が大幅に減少します。 したがって、この集団を GRP78 阻害剤で治療する必要はありません。
【0082】
ただし、この理論には例外もあります。 たとえば、インフルエンザ ウイルスは、ウイルスに GRP78 結合部位が含まれており、細胞の表面に結合した GRP78 がないにもかかわらず、若者と高齢者に感染します。 最近の出版物では、感染した細胞が表面 GRP78 発現を誘導し、それがさらなる感染を引き起こすことが示されています。 このような場合、GRP78 阻害剤による治療により表面に結合した GRP78 が減少し、ウイルス量が減少し、感染時間が短縮されます。
【0083】
治療の種類
我々のGRP78阻害剤について、本発明は2種類の治療選択肢を示す。 1 つ目は、SARS-CoV-2 感染後の上記の患者の治療法として、当社の GRP78 阻害剤を投与することです。 併存疾患のある感染患者は、表面結合 GRP78 の減少によりウイルスの付着と侵入が減少し、恩恵を受けることになります。
我々のGRP78阻害剤について、本発明は2種類の治療選択肢を示す。 1 つ目は、SARS-CoV-2 感染後の上記の患者の治療法として、当社の GRP78 阻害剤を投与することです。 併存疾患のある感染患者は、表面結合 GRP78 の減少によりウイルスの付着と侵入が減少し、恩恵を受けることになります。
【0084】
GRP78阻害剤に使用する2番目の方法は、それらを予防的に投与することです。 併存疾患のある上記の患者、および肺、呼吸器、動脈細胞の表面結合型 GRP78 発現が増加している 65 歳以上の患者の場合、当社の GRP78 阻害剤による予防的治療により、SARS-CoV-2 ウイルス感染と疾患の進行のリスクが軽減されます。 。 予防的に投与される当社の GRP78 阻害剤は、医療従事者、初期対応者、高感染地域に旅行する人々、教師を SARS-CoV-2 感染から守るのにも効果的である可能性があります。
【0085】
同時治療のオプション
本発明は、我々のGRP78阻害剤を他の種類の治療法と組み合わせて投与して、ウイルス感染とその結果生じる症状を軽減できることを示している。 例えば：
- デキサメタゾンのような抗炎症剤は、サイトカイン炎症などの症状を軽減し、生存率を高めることが示されています。
- レムデシビルのような抗ウイルス剤は、ウイルスの複製をブロックし、ウイルス疾患の減少につながることが示されています。
- バリシチニブ (JAK 阻害剤) やトシルズマブ (IL6 阻害剤) などの免疫抑制剤は、疾患の末期には効果が示されていませんが、疾患の初期から中期には効果が期待できます。
- SARS-CoV-2感染の結果として生じる血栓嵐の症状を大幅に軽減するヘパリンのような抗凝固剤。
- SARS-CoV-2 やインフルエンザに対するワクチンなどのワクチンは、主要な株には効果があるかもしれませんが、進化する変異株には効果がありません。 ワクチンと GRP78 阻害剤の両方を使用することで、治療効果がさらに高まる可能性があります。
SARS-CoV-2 ウイルスに対する現在の治療法とワクチンの問題点:
本発明は、我々のGRP78阻害剤を他の種類の治療法と組み合わせて投与して、ウイルス感染とその結果生じる症状を軽減できることを示している。 例えば：
- デキサメタゾンのような抗炎症剤は、サイトカイン炎症などの症状を軽減し、生存率を高めることが示されています。
- レムデシビルのような抗ウイルス剤は、ウイルスの複製をブロックし、ウイルス疾患の減少につながることが示されています。
- バリシチニブ (JAK 阻害剤) やトシルズマブ (IL6 阻害剤) などの免疫抑制剤は、疾患の末期には効果が示されていませんが、疾患の初期から中期には効果が期待できます。
- SARS-CoV-2感染の結果として生じる血栓嵐の症状を大幅に軽減するヘパリンのような抗凝固剤。
- SARS-CoV-2 やインフルエンザに対するワクチンなどのワクチンは、主要な株には効果があるかもしれませんが、進化する変異株には効果がありません。 ワクチンと GRP78 阻害剤の両方を使用することで、治療効果がさらに高まる可能性があります。
SARS-CoV-2 ウイルスに対する現在の治療法とワクチンの問題点:
【0086】
SARS-CoV-2 ウイルスに対するワクチンは、ウイルス表面のスパイクタンパク質または他のエンベロープタンパク質を通じて免疫系にウイルスを攻撃させるように設計されています。 これにより、体は SARS-CoV-2 ウイルスのスパイクタンパク質に対する抗体を作成できるようになり、SARS-CoV-2 ウイルスが宿主細胞に付着して内部に侵入するのをブロックします。 現在、SARS-CoV-2 ウイルスのスパイクタンパク質に対するワクチンが 3 種類承認されています。 併存疾患や他の薬物治療により免疫力が低下している人には、これらのワクチンが効果的でない可能性があります。 また、SARS-CoV-2変異体（B.1.351）感染症は、軽度から中等度の感染症に対するアストラゼネカ製新型コロナウイルス感染症ワクチンに耐性があることが示されている。 これは、進化する変異種に対抗するためにワクチンを毎年更新する必要があるという点で、抗ウイルス ワクチンの根本的な問題です。
【0087】
SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対するモノクローナル抗体は、FDAによって緊急使用が承認されている。 これらの抗体は、初期の SARS-CoV-2 感染症の患者に対して有効であることが示されています。 入院した患者には改善が見られなかった。 最後に、ワクチンと同様に、これらの治療法はウイルスのスパイクタンパク質を非常に標的としているため、変異体は阻害されない可能性があります。
【0088】
レムデシビルは、FDA によって使用が承認されているプロテアーゼ阻害剤です。 入院患者に対しても効果がなく、死亡を防ぐことはできなかった。 SARS-CoV-2ウイルス感染の初期に投与すると、入院期間と感染期間が短縮されることが示されています。
【0089】
上記に列挙したのは、本発明の執筆時点でFDAが承認した唯一のCOVID19疾患治療法である。 しかし、他のいくつかの研究では、ある程度の有望性を示す臨床研究が進んでいます。 バリシチニブは、免疫抑制剤であるヤヌスキナーゼ阻害剤です。 この治療法は、SARS-CoV-2 ウイルスに感染した患者に対して、酸素投与では効果があるが、換気では効果がないことが示されています。 繰り返しになりますが、新型コロナウイルス感染症（COVID19）の後期段階には対処していません。 トシリズマブは、IL-6 に対するモノクローナル抗体です。 IL-6 を阻害すると炎症が抑えられ、免疫系の機能が向上するため、SARS-CoV-2 感染症の症状が治療されます。 トシルズマブの投与を受けた後期患者の転帰は、人工呼吸器と酸素吸入を行っている患者の両方で退院までの時間が短縮されたというものでした。
【0090】
本発明は、N末端GRP78阻害剤を使用するSARS-CoV-2感染患者の治療方法を教示する。 ワクチンや現在のウイルス治療とは異なり、私たちの治療法はウイルス表面ではなく細胞表面での潜在的なウイルス感染に対処します。 ウイルスではなく宿主細胞の受容体を阻害することにより、変異体は GRP78 阻害剤療法に耐性がなくなります。 また、GRP78 阻害剤はウイルスの除去や阻害を免疫系に依存しないため、免疫が抑制された患者も治療できます。 そのため、後期の新型コロナウイルス感染症患者、免疫系が抑制されている患者、または併存疾患のある患者は依然として当社のGRP78阻害剤に対して感受性が高く、感染時間が短縮され、入院期間とウイルス量の減少につながります。
【0091】
図１７に示すように、図１７は、ＧＲＰ７８結合部位のタンパク質配列比較を示す表である。比較は、選択されたタンパク質配列（図１７において赤色で示される）がクリングル５配列と同一であることを示し、第２のタンパク質配列は、クリングル５配列と同一であることを示す。 カテゴリ (黄色) は類似した種類のアミノ酸です。 赤も黄色もない場合、類似性はないと結論付けられます。 すべてのクリングルおよびウイルスの配列比較はクリングル 5 と比較されます。図 17 のアスタリスク (*) は、列 3、8、12、および 18 の GRP78 結合に重要なアミノ酸を示します。 GRP78 結合部位のタンパク質配列の比較。 C はクリングル 5 配列と同一、黄色は類似した種類のアミノ酸、白色は類似性なし。 すべてのクリングル配列とウイルス配列の比較はクリングル 5 と比較されます。 * は GRP78 結合に重要なアミノ酸を示します。
【0092】
本発明をその特定の実施形態に関連して説明してきたが、さらなる修正が可能であり、本出願は、一般に以下の本発明のあらゆる変形、使用、または適応をカバーすることを意図していることが理解されるであろう。 本発明は、本発明の原理を含むものであり、本発明が属する技術分野における既知または慣例の範囲内にあり、上記の本質的な特徴に適用できるものとして、本開示からの逸脱を含むものであり、特許請求の範囲において以下の通りである。 を追加するものとする。
【図1A-1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C-3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-08-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
SARS-CoV-2ウイルス、SARS-CoVウイルス、MER-CoVウイルス、日本脳炎ウイルス、コクサッキーウイルス、デングウイルス、およびインフルエンザA&Bウイルスのように付着、侵入、および複製のために表面結合GRP78を使用するウイルスのウイルス感染を予防および阻害するための抗ウイルス剤の有効量を必要とする人に投与することを含む治療方法。
【請求項2】
GRP78アンタゴニストまたは薬学的に許容される塩を含み、GRP78アンタゴニストは、プラスミノーゲンクリングル5フラグメント、免疫グロブリンに結合したプラスミノーゲンクリングル5フラグメント、ROR1クリングルフラグメント、免疫グロブリンに結合したROR1クリングルフラグメント、ROR2クリングルフラグメント、および免疫グロブリンに結合したROR2クリングルフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
プラスミノーゲンクリングル5フラグメントが配列番号１およびその組み合わせを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
免疫グロブリンに結合したプラスミノーゲンクリングル5フラグメントが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
ROR1クリングルフラグメントが配列番号１９を有するもの、およびその組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
免疫グロブリンに結合したROR1クリングルフラグメントが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
ROR2クリングルフラグメントが配列番号３３およびその組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項8】
免疫グロブリンに結合したROR2クリングルフラグメントが、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項9】
GRP78アンタゴニストがN末端GRP78ドメインに結合し、GRP78アンタゴニストと競合してGRP78内部移行を誘導する、請求項２に記載の方法。
【請求項10】
以下を含む抗ウイルス剤：GRP78アンタゴニストまたは薬学的に許容される塩：
ここで、GRP78アンタゴニストは、プラスミノーゲンクリングル5フラグメント、免疫グロブリンに結合したプラスミノーゲンクリングル5フラグメント、ROR1クリングルフラグメント、免疫グロブリンに結合したROR1クリングルフラグメント、ROR2クリングルフラグメント、および免疫グロブリンに結合したROR2クリングルフラグメントからなる群から選択される。
【請求項11】
プラスミノーゲンクリングル5フラグメントが配列番号１およびその組み合わせを含む、請求項１０に記載の抗ウイルス剤。
【請求項12】
免疫グロブリンに結合するプラスミノーゲンクリングル5フラグメントが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の抗ウイルス剤。
【請求項13】
ROR1クリングルフラグメントが配列番号１９を有するもの、およびその組み合わせである、請求項１０に記載の抗ウイルス剤。
【請求項14】
免疫グロブリンに結合するROR1クリングルフラグメントが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の抗ウイルス剤。
【請求項15】
ROR2クリングルフラグメントが配列番号３３およびその組み合わせである、請求項１０に記載の抗ウイルス剤。
【請求項16】
免疫グロブリンに結合するROR2クリングルフラグメントが、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の抗ウイルス剤。
【請求項17】
GRP78アンタゴニストがN末端GRP78ドメインに結合し、GRP78アンタゴニストと競合してGRP78内部移行を誘導する、請求項１０に記載の抗ウイルス剤。
【国際調査報告】