特表 2024-513514 ＮＫ細胞およびＣＤ３８－標的抗体を用いた癌治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-25

(54)【発明の名称】ＮＫ細胞およびＣＤ３８－標的抗体を用いた癌治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20240315BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240315BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240315BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240315BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240315BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240315BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20240315BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240315BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240315BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17

A61K39/395 T

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/04

A61P43/00 121

C12N5/0783 ZNA

C12N15/13

C07K16/28

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023562500

(86)(22)【出願日】2022-04-06

(85)【翻訳文提出日】2023-12-11

(86)【国際出願番号】 US2022023676

(87)【国際公開番号】W WO2022216826

(87)【国際公開日】2022-10-13

(31)【優先権主張番号】63/172,424

(32)【優先日】2021-04-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/290,351

(32)【優先日】2021-12-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523383820

【氏名又は名称】アルティヴァ バイオセラピューティクス インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】522492967

【氏名又は名称】ジーシー・セル・コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】ＧＣ ＣＥＬＬ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】フリン、ピーター

(72)【発明者】

【氏名】リッテン、ジェイソン ビー．

(72)【発明者】

【氏名】ファレル、トーマス ジェームズ

(72)【発明者】

【氏名】リム、ジョン キン チュアン

(72)【発明者】

【氏名】マンダル、ミリ

(72)【発明者】

【氏名】ソマンチ、シュリーニヴァス サイ

(72)【発明者】

【氏名】キム、ユスン

(72)【発明者】

【氏名】チョ、スンユ

(72)【発明者】

【氏名】ファン、ユ キョン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065BA21

4B065BB12

4B065BB18

4B065BB19

4B065BB34

4B065BC03

4B065BC07

4B065BC11

4B065BC41

4B065BD14

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG04

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB59

4C087BB64

4C087BB65

4C087CA04

4C087MA17

4C087MA66

4C087NA05

4C087ZB02

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC75

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、特に、ＣＤ３８＋癌を患っている患者を治療する方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の集団およびヒトＣＤ３８を標的とする抗体を患者に投与する段階を含み、前記ＮＫ細胞が、患者に対して同種異系であり、ＫＩＲ－Ｂハプロタイプであり、患者に対してＣＤ１６ １５８Ｖ多形成がホモ接合性である、ＣＤ３８＋癌患者を治療する方法。

【請求項2】

前記癌が、神経膠腫、甲状腺癌、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、尿路上皮癌、前立腺癌、睾丸癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、黒色腫、リンパ腫、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記癌が、骨髄腫である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記癌が、多発性骨髄腫である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記多発性骨髄腫が、高危険骨髄腫またはレナリドミド（ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）－抵抗性多発性骨髄腫である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記患者は、抗－ＣＤ３８抗体を用いた治療後に再発した、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記患者は、自家幹細胞移植またはキメラ抗原受容体Ｔ－細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ）を用いた治療後に疾患の進行に移行した、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記患者は、ＮＫ細胞１×１０^８～１×１０^１０個が投与される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記患者は、ＮＫ細胞１×１０^９～８×１０^９個が投与される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記患者は、ＮＫ細胞４×１０^８、１×１０^９、４×１０^９または８×１０^９個が投与される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記抗体が、ダラツムマブ（ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イサツキシマブ（ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ）、またはこれらのバイオシミラーである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記抗体が、ダラツムマブである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記抗体が、イサツキシマブである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記患者は、治療する前、リンパ球除去化学療法が施される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記リンパ球除去化学療法が、非－骨髄破壊性化学療法である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記リンパ球除去化学療法が、シクロホスファミドおよびフルダラビンのうちの１つ以上を用いた治療を含む、請求項１４または１５に記載の方法。

【請求項17】

前記リンパ球除去化学療法が、シクロホスファミドおよびフルダラビンを用いた治療を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記シクロホスファミドは、１００－５００ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙで投与される、請求項１６または１７に記載の方法。

【請求項19】

前記シクロホスファミドは、２５０ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙで投与される、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記シクロホスファミドは、５００ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙで投与される、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記フルダラビンは、１０－５０ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙで投与される、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記フルダラビンは、３０ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙで投与される、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

ＩＬ－２の投与を追加的に含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記患者にＩＬ－２を１×１０^６ＩＵ／ｍ^２で投与する、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記患者にＩＬ－２を６，０００，０００ＩＵで投与する、請求項２３に記載の方法。

【請求項26】

前記ＩＬ－２の投与は、ＮＫ細胞の投与から１－４時間以内に行われる、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記ＮＫ細胞とヒトＣＤ３８を標的とする抗体の投与が、毎週行われる、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記ＮＫ細胞とヒトＣＤ３８を標的とする抗体の投与が、４－８週間毎週行われる、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記ＮＫ細胞の投与は、毎週または隔週で行われ、ヒトＣＤ３８を標的とする抗体の投与は、隔週でまたは毎月行われる、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記ＮＫ細胞およびヒトＣＤ３８を標的とする抗体の投与が、２週ごとに行われる、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記ＮＫ細胞および抗体の投与が、２週間隔の４回投与を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記ＮＫ細胞および抗体の投与が、２週間隔の８回投与を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

前記ＮＫ細胞およびヒトＣＤ３８を標的とする抗体の投与が、毎月行われる、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記ＮＫ細胞および抗体の投与が、１ヶ月間隔の８回投与を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記方法は、ＮＫ細胞およびヒトＣＤ３８を標的とする抗体を毎週、隔週または毎月投与する１次コースと、ＮＫ細胞およびヒトＣＤ３８を標的とする抗体を毎週、隔週、毎月または２ヶ月間隔で投与する２次コースと、で投与することを含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記２次投与コースは、ＣＤ３８＋癌が進行するまで、ＮＫ細胞、ヒトＣＤ３８を標的とする抗体またはこれら両方ともに対する患者の不耐性によって投与を中断するまで、または患者がＮＫ細胞、ヒトＣＤ３８を標的とする抗体またはこれら両方ともに対して毒性を経験するまで継続する、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記ＮＫ細胞は、遺伝子組換えされていない、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記ＮＫ細胞は、少なくとも７０％がＣＤ５６＋およびＣＤ１６＋である、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記ＮＫ細胞は、少なくとも８５％がＣＤ５６＋およびＣＤ３－である、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記ＮＫ細胞は、１％以下がＣＤ３＋であり、ＮＫ細胞は、１％以下がＣＤ１９＋であり、ＮＫ細胞は１％以下がＣＤ１４＋である、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記ＮＫ細胞の各投与が、ＮＫ細胞１×１０^９～５×１０^９個の投与である、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記患者は、ＮＫ細胞を１次投与する前、ＣＤ３８標的抗体の用量が投与される、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞が、増幅された臍帯血ナチュラルキラー細胞を含む、請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＣＤ１６＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＮＫＧ２Ｄ＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＮＫｐ４６＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＮＫｐ３０＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＤＮＡＭ－１＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＮＫｐ４４＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％でＣＤ３＋細胞を含む、請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％でＣＤ１４＋細胞を含む、請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％でＣＤ１９＋細胞を含む、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％でＣＤ３８＋細胞を含む、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記ナチュラルキラー細胞が、ＣＤ１６トランス遺伝子を含まない、請求項１～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記ナチュラルキラー細胞が、外因性ＣＤ１６タンパク質を発現しない、請求項１～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞は、遺伝子操作されていない、請求項１～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞は、同一の臍帯血供与体に由来する、請求項１～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記ＮＫ細胞の集団が、増幅されたナチュラルキラー細胞を少なくとも１億個含み、例えば、２億、２億５千万、３億、４億、５億、６億、７億、７億５千万、８億、９億、１０億、２０億、３０億、４０億、５０億、６０億、７０億、８０億、９０億、１００億、１５０億、２００億、２５０億、５００億、７５０億、８００億、９００億、１０００億、２０００億、２５００億、３０００億、４０００億、５０００億、６０００億、７０００億、８０００億、９０００億、１兆、２兆、３兆、４兆、５兆、６兆、７兆、８兆、９兆または１０兆個含む、請求項１～５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

前記ＮＫ細胞の集団が、以下を含む方法により生産された、請求項１～５８のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）臍帯血からナチュラルキラー細胞を含む種細胞（ｓｅｅｄ ｃｅｌｌ）を得る段階；
（ｂ）前記種細胞でＣＤ３＋細胞を枯渇処理する段階；
（ｃ）枯渇処理された種細胞を膜結合型ＩＬ－２１、ＴＮＦα突然変異および４－１ＢＢＬ遺伝子を発現するように操作された第１の複数のＨｕｔ７８細胞とともに培養することにより、ナチュラルキラー細胞を増幅させて、増幅されたナチュラルキラー細胞を生産し；
これによって増幅されたナチュラルキラー細胞の集団を生産する段階。

【請求項60】

前記ＮＫ細胞の集団が、以下を含む方法により生産された、請求項１～５９のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）臍帯血からナチュラルキラー細胞を含む種細胞を得る段階；
（ｂ）前記種細胞でＣＤ３＋細胞を枯渇処理する段階；
（ｃ）枯渇処理された種細胞を膜結合型ＩＬ－２１、ＴＮＦα突然変異および４－１ＢＢＬ遺伝子を発現するように操作された第１の複数のＨｕｔ７８細胞とともに培養することにより、ナチュラルキラー細胞を増幅させて、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団を生産する段階；および
（ｄ）膜結合型ＩＬ－２１、ＴＮＦα突然変異および４－１ＢＢＬ遺伝子を発現するように操作された第２の複数のＨｕｔ７８細胞とともに培養することにより、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団を増幅させて、増幅されたナチュラルキラー細胞を生産し；
これによって増幅されたナチュラルキラー細胞の集団を生産する段階。

【請求項61】

前記ＮＫ細胞の集団が、段階（ｃ）の後に、
（ｉ）前記増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団を複数の容器で冷凍する段階；および
（ｉｉ）前記増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団の分液が収容された容器を解凍する段階を追加的に含む方法により生産され、
段階（ｄ）において、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団の増幅が、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団の分液を増幅させることを含む、請求項５９または６０に記載の方法。

【請求項62】

前記臍帯血が、ＫＩＲ－Ｂハプロタイプであり、ＣＤ１６ １５８Ｖ多形成に対してホモ接合性である供与体に由来する、請求項５９～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

前記ＮＫ細胞の集団が、臍帯血からナチュラルキラー細胞を少なくとも１０，０００倍、例えば、１５，０００倍、２０，０００倍、２５，０００倍、３０，０００倍、３５，０００倍、４０，０００倍、４５，０００倍、５０，０００倍、５５，０００倍、６０，０００倍、６５，０００倍または７０，０００倍増幅することを含む方法により生産された、請求項５９～６２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項64】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、増幅後に濃縮または分類しない、請求項５９～６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項65】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＣＤ１６を発現するＮＫ細胞の百分率が、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い、請求項５９～６４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項66】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞の百分率が、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い、請求項５９～６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫｐ３０を発現するＮＫ細胞の百分率が、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い、請求項５９～６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項68】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫｐ４４を発現するＮＫ細胞の百分率が、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い、請求項５９～６７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項69】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞の百分率が、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い、請求項５９～６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項70】

前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＤＮＡＭ－１を発現するＮＫ細胞の百分率が、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い、請求項５９～６９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

患者にステロイドを投与することを追加的に含む、請求項１～７０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

前記ステロイドが、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、メチルプレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、トリアムシノロン（ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、ベタメタゾン（ｂｅｔｈａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記ステロイドが、デキサメタゾンおよび／またはメチルプレドニゾロンである、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記ステロイドの投与が、ＮＫ細胞の投与時点から１－４時間以内に行われる、請求項７１に記載の方法。

【請求項75】

前記ステロイドの投与が、ＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を低下させたり、または消去しない、請求項７１～７４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項76】

前記方法が、ＩＬ－２を、投与あたり、１×１０^６ＩＵ／ｍ^２または６×１０^６ＩＵで投与することを含む、請求項７１～７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項77】

ＩＬ－２の投与は、ＮＫ細胞の投与時点から１－４時間以内に投与する、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

増幅されたＣＤ１６^＋／ＣＤ３８^ｌｏｗＮＫ細胞の集団を含む組成物。

【請求項79】

前記ＮＫ細胞は、自然的に生成される異種的なＮＫ細胞の集団より低いレベルにＣＤ３８を発現する、請求項７８に記載の組成物。

【請求項80】

前記ＮＫ細胞が、ＣＤ３８－標的抗体の存在下でＣＤ３８＋腫瘍細胞に対してＡＤＣＣ活性を示す、請求項１または７９に記載の方法または組成物。

【請求項81】

前記ＮＫ細胞が、ＫＩＲ－ＡハプロタイプのＮＫ細胞またはＣＤ１６ １５８Ｖ多形成がないＮＫ細胞に比べて減少したフラトリサイド活性を示す、請求項１～８０のいずれか１項に記載の方法または組成物。

【請求項82】

前記ＮＫ細胞が、ＣＤ３８－標的抗体の存在下で自然的に生成される異種的なＮＫ細胞の集団に比べて減少したフラトリサイド活性を示す、請求項１～８１のいずれか１項に記載の方法または組成物。

【請求項83】

前記ＮＫ細胞が、ＣＤ３８＋癌治療時、ＮＫ細胞とＣＤ３８標的抗体との組み合わせの効能を減少させないレベルにフラトリサイドをＣＤ３８標的抗体の存在下で示す、請求項１～８２のいずれか１項に記載の方法または組成物。

【請求項84】

前記ＮＫ細胞が、ＣＤ３８^＋であり、ＮＫ細胞が抗－ＣＤ３８抗体の存在下でＣＤ３８＋癌細胞に対してＡＤＣＣ活性を示し、前記細胞は、抗体の存在下でＮＫ細胞に対してはＡＤＣＣ活性を実質的に示さない、請求項１～８３のいずれか１項に記載の方法または組成物。

【請求項85】

下記の段階を含む、ＣＤ１６^＋／ＣＤ３８^ｌｏｗＮＫ細胞の集団を生成する方法：
ＫＩＲ－ＢハプロタイプまたはＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｖ遺伝子型に対するホモ接合性を有する供与体からＮＫ細胞を含む臍帯血サンプルを得る段階；および
ＮＫ細胞をＣＤ４^＋Ｔ細胞株の存在下で試験管内で増幅する段階。

【請求項86】

下記の段階を含む、ＣＤ１６^＋／ＣＤ３８^ｌｏｗＮＫ細胞の集団を濃縮する方法：
ＫＩＲ－ＢハプロタイプまたはＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｖ遺伝子型に対するホモ接合性を有する供与体からＮＫ細胞を含む臍帯血サンプルを得る段階；および
ＮＫ細胞をＣＤ４^＋Ｔ細胞株の存在下で試験管内で増幅する段階。

【請求項87】

ＮＫ細胞を含む臍帯血サンプルが、ＣＤ３８^ｈｉｇｈＮＫ細胞の集団を含む、請求項８５または８６に記載の方法。

【請求項88】

ＮＫ細胞を含む臍帯血サンプルが、ＣＤ３８^ｌｏｗＮＫ細胞の集団を含む、請求項８５～８７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項89】

前記ＣＤ１６^＋／ＣＤ３８^ｌｏｗＮＫ細胞の集団は、遺伝子操作されていない、請求項８５～８７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項90】

前記ＣＤ１６^＋／ＣＤ３８^ｌｏｗＮＫ細胞の集団は、ＣＤ３８発現を変形するように遺伝子操作されていない、請求項８５～８７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項91】

ＮＫ細胞と、ＮＫ細胞および癌細胞に独立に結合する抗原結合部位を含む抗体を投与する段階を含み；
前記ＮＫ細胞が、抗体に結合したＮＫ細胞よりは抗体に結合した癌細胞を差別的に標的化する、癌を標的化する方法。

【請求項92】

ＮＫ細胞と、ＮＫ細胞および癌細胞に独立に結合する抗原結合部位を含む抗体を投与する段階を含み、前記抗原結合部位が、ＮＫ細胞よりは癌細胞に差別的に結合する、癌細胞を標的化する方法。

【請求項93】

下記の段階を含む、ＣＤ３８＋癌患者を治療する方法：
１）ＮＫ細胞の集団を投与する段階であって、
前記ＮＫ細胞は、ＣＤ３８^＋であり、
前記細胞は、抗－ＣＤ３８抗体の存在下でＣＤ３８^＋癌細胞に対するＡＤＣＣを媒介し、
前記細胞は、抗－ＣＤ３８抗体の存在下でＮＫ細胞の集団の他のＣＤ３８^＋ＮＫ細胞に対するＡＤＣＣを実質的に媒介しない、段階；および
２）抗－ＣＤ３８抗体を投与する段階。

【請求項94】

ＮＫ細胞が、患者に対して同種異系であり、ＫＩＲ－Ｂハプロタイプであり、患者に対するＣＤ１６ １５８Ｖ多形成がホモ接合性である、請求項９３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権主張
本出願は、２０２１年１２月１６日付の米国仮出願番号６３／２９０，３５１および２０２１年４月８日付の米国仮出願番号６３／１７２，４２４に対して優先権を主張する。これらの文献は全体内容として援用により本明細書に取り込まれる。

【背景技術】

【0002】

ナチュラルキラー細胞は、腫瘍細胞とウイルス－感染した細胞を細胞溶解する固有の能力を有する先天的な免疫システムの細胞溶解性細胞である。ＮＫ細胞が受容体にエンゲージング（ｅｎｇａｇｉｎｇ）すれば、細胞溶解性顆粒の脱顆粒、標的細胞上のプログラムされた細胞死滅受容体の活性化および免疫調節性サイトカインの分泌によりエフェクター機能が促される。ナチュラルキラー細胞のエフェクター機能は、受容体活性化シグナル伝達と受容体阻害性シグナル伝達との間の均衡により制御される。古典的に、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６^＋およびＣＤ３^－細胞と定義されるが、これはＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＣＤ１６^－サイトカイン－分泌細胞と、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ１６^＋細胞溶解性細胞とに細分される。ＣＤ１６と抗体オプソニン化された腫瘍細胞との間のエンゲージングは、休止中のＮＫ細胞による細胞毒性およびサイトカイン分泌反応を誘発するのに十分である。

【0003】

抗体－依存的な細胞毒性（ＡＤＣＣ）は、結合した抗体の不変領域を認知するＦｃ受容体を有する細胞によって抗体－コーティングされた標的細胞を殺す先天的な免疫システムの核心構成要素である。ＡＤＣＣは、ＮＫ細胞によって表面に発現したＦｃ受容体ＦＣγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を介して媒介される。ＡＤＣＣは、特に兔疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）およびＩＧ３サブクラスに属する抗体と組み合わせて、強力なＮＫ細胞の作用機序として認識されている。

【0004】

多発性骨髄腫は、長期間（数ヶ月～数年）骨髄で生存する最終分化された非－分裂細胞でかつ主要機能が抗原－特異的な免疫グロブリンを生産する形質細胞の蓄積、およびクローン増殖を特徴とするＢ細胞悪性腫瘍である。骨髄障害も多発性骨髄腫を定義する特徴である。この疾患の兆候および症状としては、貧血、感染の危険が増加した免疫麻痺、高カルシウム血症、腎機能不全、貧血および／または骨溶解性病変による広範囲な骨損傷に起因する骨折と骨の痛みを含む。多発性骨髄腫と診断するためにはこのような症状がなければならず、最近は予測バイオマーカーの存在が確認されなければならない。多発性骨髄腫において特徴的なクローン形質細胞でよく発見される遺伝子異常には、１４番染色体の重鎖遺伝子座（１４ｑ３２）に関連する再発性転座、遺伝物質の獲得（染色体１ｑ）または喪失（１ｐ、１３ｑ、１７ｐ）、そして奇数番染色体のトリソミーがある。

【0005】

多発性骨髄腫の診断は全体癌の～２％を占め、特に血液癌の～１０％を占める。２０２１年には３４，９２０人が多発性骨髄腫と新規診断され、約１２，４１０人がそれによって死亡したと推定された。この疾患は、女性（４２％）よりは男性（５８％）でより多く、白人またはアジア系よりは黒人で発病の可能性が（２～３倍）より高い。米国で平均診断年齢は６９歳であり、多発性骨髄腫の年齢標準化発生率（ａｇｅ－ａｄｊｕｓｔｅｄ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ）は約１００，０００件あたり６．６件で比較的安定している。

【0006】

多発性骨髄腫疾患はゆっくりかつ意図的に進行する。大部分の患者は５０代前半に未確定単クローン性免疫グロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ、ＭＧＵＳ）と称される無症状の基底病態が最初に発生する。ＭＧＵＳからその次に重大な病態である無症状多発性骨髄腫（ｓｍｏｌｄｅｒｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ、ＳＭＭ）に進行する比率は年間約１％と遅い。患者はＳＭＭに進行する前に最大１５年間ＭＧＵＳを患うことがある。ＳＭＭから症状性骨髄腫への進行も、最初の５年間年間約１０％、その後には５年間３％、その後には１％と、同じく遅い。そのため、ＭＧＵＳから多発性骨髄腫に進行する危険は２０年かけて約１８％と遅い。

【0007】

新規診断された患者は、自家造血幹細胞移植（ＡＳＣＴ）に対する適合性の有無によって分類することが多い。適格者に分類された患者は、疾患の負担を低減するために誘導療法を開始し、ＡＳＣＴを施した後、維持療法でフォローアップされる。ＡＳＣＴの不可能な患者は、ステロイド（例えば、デキサメタゾンまたはプレドニゾロン）、アルキル化剤およびアントラサイクリンなどの代替薬物で治療する。これらの製剤は最初は効果的であるが、患者に深刻な副作用を誘発しやすい。これとともに、これらの製剤は完治性ではなく、このような療法を受ける多発性骨髄腫患者のほとんどが再発する。現在、多発性骨髄腫に対する標準管理は、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、カルフィルゾミブ（ｃａｒｆｉｌｚｏｍｉｂ））、免疫調節剤（例えば、レナリドミド（ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ））およびステロイドの組み合わせを含む。

【0008】

単クローン抗体（ｍＡｂ）療法のような標的療法が癌治療を革新した。ダラツムマブ（ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）は、多発性骨髄腫を再発状況で治療するための単一療法として許可されたｍＡｂである。ダラツムマブは、プロテアソーム阻害剤または免疫調節剤およびコルチコステロイドと組み合わせて、非－治療の、再発性／難治性骨髄腫に対して許可された。このｍＡｂは悪性形質細胞上で広く発現するＣＤ３８を標的とする。ダラツムマブは細胞死滅を誘導する様々な作用機序を有している：補体－依存的な細胞毒性、抗体－依存的な細胞性食細胞作用、アポトーシスおよびＡＤＣＣ。ダラツムマブの効能は、あいにくにもＡＤＣＣ反応の低下によって多発性骨髄腫患者で阻止されることがあり、そのため、臨床結果に否定的に作用する。ＡＤＣＣ反応を減少させることができる１つの機序はＮＫ細胞の消失によるものである。

【0009】

しかし、ＮＫ細胞はＣＤ３８を発現し；もし、ダラツムマブが結合すれば、ＮＫ細胞は細胞溶解またはフラトリサイド（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）を受けることがある。したがって、ダラツムマブの存在下でも細胞溶解しないＮＫ細胞が必要である。このようなＮＫ細胞はダラツムマブのＡＤＣＣ活性を改善して、患者の転帰を改善するはずである。最近、いくつかの抗癌剤の発見と開発にもかかわらず、多発性骨髄腫の予後不良によって、依然として改善された方法および治療剤が要求されている。

【0010】

２００５年以来、同種異系ＮＫ細胞治療剤が臨床的に使用されているが、生産ソーシング（ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｏｕｒｃｉｎｇ）、拡張性および用量別の偏差による問題によってその活用性は限られている。同種異系ＮＫ細胞製品をダラツムマブと組み合わせれば、ＡＤＣＣ反応が経時的に消失する多発性骨髄腫患者において効能改善を達成できる。

【0011】

本発明は、当該技術分野における上記の問題とその他の問題を解決する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

ＮＫ細胞は、その細胞表面受容体の複合アレイを介してのみならず、ＡＤＣＣを介して腫瘍細胞とエンゲージングできる免疫細胞である。ＮＫ細胞は、ＡＤＣＣを開始するために、自身の表面ＣＤ１６受容体を介して抗体とエンゲージングできる。ＮＫ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法およびその他の細胞療法に用いられるＴ細胞のような他の免疫細胞より優れているという利点がある。一つの例示的な利点として、ＮＫ細胞は、同種異系療法として用いることができるが、ある供与体に由来するＮＫ細胞をＨＬＡマッチング、遺伝子編集またはその他の遺伝子操作なしに、１人または複数の患者に安全に使用可能である。抗－腫瘍活性を有する同種異系ＮＫ細胞は、重症サイトカイン放出症侯群（ＣＲＳ）および神経毒性または移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）のようなＴ細胞療法に関連する多くの危険性なく、患者への安全な投与が可能である。

【0013】

同種異系ＮＫ細胞は癌患者に重大な治療オプションを提供することができる。一つの例示的な利点として、ＮＫ細胞は、他の細胞ベースの療法に関連するＧＶＨＤ、神経毒性またはＣＲＳの発病なく、耐薬性（ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ）に優れている。他の例示的な利点として、ＮＫ細胞は、腫瘍細胞を識別して溶解するのに事前の抗原露出または特異的な抗原の発現を要求しない。他の例示的な利点として、ＮＫ細胞は、先天的な免疫を連結し、多重－クローン性適応免疫反応を起こして長期間の抗癌免疫記憶を構築する固有の能力を有している。このような特徴はすべて癌治療オプションとして潜在的なＮＫ細胞の効果に寄与する。

【0014】

例えば、ＮＫ細胞は、免疫システムの他の構成要素を動員して活性化することができる。活性化されたＮＫ細胞は、サイトカインおよびケモカイン、例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、およびシグナルを伝達してＴ細胞を腫瘍に動員するマクロファージ炎症性タンパク質１（ＭＩＰ１）を分泌する。ＮＫ細胞はまた、直接腫瘍細胞を殺すことにより、適応免疫システムによって認知されるように腫瘍抗原を露出する。

【0015】

これとともに、多様な臍帯血バンクをＮＫ細胞の供給源として用いることにより、臨床活性を強化するのに好ましい特徴（例えば、高親和性ＣＤ１６およびキラー細胞免疫グロブリン－様受容体（ＫＩＲ）Ｂ－ハプロタイプ）を有する臍帯血を選別することができる。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本願に記載されているように、同種異系ＮＫ細胞の投与は、例えば、単クローン抗体療法の進行中に患者のＡＤＣＣ反応を強化することができる。

【0017】

そこで、本発明は、何よりも、ＣＤ３８＋癌を患っている患者を治療する方法を提供する。

【0018】

本発明は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の集団およびヒトＣＤ３８を標的とする抗体を投与する段階を含み、ＮＫ細胞が、患者に対して同種異系であり、ＫＩＲ－Ｂハプロタイプであり、患者に対するＣＤ１６ １５８Ｖ多形成がホモ接合性（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｆｏｒ ａ ＣＤ１６ １５８Ｖ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）である、ＣＤ３８＋癌を患っている患者を治療する方法を提供する。

【0019】

一部の実施形態において、癌は、神経膠腫、甲状腺癌、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、尿路上皮癌、前立腺癌、睾丸癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、黒色腫、リンパ腫、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。

【0020】

一部の実施形態において、癌は、骨髄腫である。一部の実施形態において、癌は、多発性骨髄腫である。一部の実施形態において、多発性骨髄腫は、高危険骨髄腫またはレナリドミド（ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）－抵抗性多発性骨髄腫である。一部の実施形態において、患者は、抗－ＣＤ３８抗体を用いた治療後に再発した。一部の実施形態において、患者は、自家幹細胞移植またはキメラ抗原受容体Ｔ－細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ）を用いた治療後に疾患の進行を経験したことがある。

【0021】

一部の実施形態において、患者にＮＫ細胞を１×１０^８～１×１０^１０個投与する。一部の実施形態において、患者にＮＫ細胞を１×１０^９～８×１０^９個投与する。一部の実施形態において、患者にＮＫ細胞を４×１０^８、１×１０^９、４×１０^９または８×１０^９個投与する。

【0022】

一部の実施形態において、抗体は、ダラツムマブ（ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イサツキシマブ（ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ）またはそのバイオシミラーである。一部の実施形態において、抗体は、ダラツムマブである。一部の実施形態において、抗体は、イサツキシマブである。一部の実施形態において、患者は、治療する前にリンパ球除去化学療法（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）を受ける。一部の実施形態において、リンパ球除去化学療法は、非－骨髄破壊性化学療法（ｎｏｎ－ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）である。一部の実施形態において、リンパ球除去化学療法は、シクロホスファミドおよびフルダラビンのうちの１つ以上を用いた治療を含む。一部の実施形態において、リンパ球除去化学療法は、シクロホスファミドおよびフルダラビンを用いた治療を含む。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、１００－５００ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙで投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、２５０ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙで投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、５００ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙで投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１０－５０ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙで投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、３０ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙで投与される。

【0023】

一部の実施形態において、本方法は、ＩＬ－２の投与を追加的に含む。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、患者に１×１０^６ＩＵ／ｍ^２で投与される。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、患者に６，０００，０００ＩＵで投与される。一部の実施形態において、ＩＬ－２の投与は、ＮＫ細胞を投与した時点から１－４時間以内に行われる。

【0024】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞およびヒトＣＤ３８標的抗体の投与は、毎週行われる。一部の実施形態において、ＮＫ細胞およびヒトＣＤ３８標的抗体は、４－８週間毎週投与する。一部の実施形態において、ＮＫ細胞の投与は、毎週または隔週で行われ、ヒトＣＤ３８標的抗体の投与は、隔週または毎月行われる。一部の実施形態において、ＮＫ細胞およびヒトＣＤ３８標的抗体の投与は、２週ごとに行われる。

【0025】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞および抗体の投与は、２週間隔で４回投与を含む。一部の実施形態において、ＮＫ細胞および抗体の投与は、２週間隔で８回投与を含む。一部の実施形態において、ＮＫ細胞およびヒトＣＤ３８標的抗体の投与は、毎月行われる。一部の実施形態において、ＮＫ細胞および抗体の投与は、１ヶ月間隔で８回投与を含む。

【0026】

一部の実施形態において、本発明は、ＮＫ細胞およびヒトＣＤ３８標的抗体を毎週、隔週または毎月投与する１次コースと、ＮＫ細胞およびヒトＣＤ３８標的抗体を毎週、隔週、毎月または２ヶ月間隔で投与する２次コースと、で投与することを含む。一部の実施形態において、２次投与コースは、ＣＤ３８＋癌が進行するまで、またはＮＫ細胞、ヒトＣＤ３８標的抗体またはこれら両方ともに対する患者の不耐性（ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ）によって投与を中断するまで、または患者がＮＫ細胞、ヒトＣＤ３８標的抗体またはこれら両方ともに対して毒性を示すまで継続する。

【0027】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、遺伝子組換えされていない。一部の実施形態において、ＮＫ細胞の少なくとも７０％がＣＤ５６＋およびＣＤ１６＋である。一部の実施形態において、ＮＫ細胞の少なくとも８５％がＣＤ５６＋およびＣＤ３－である。一部の実施形態において、ＮＫ細胞の１％以下がＣＤ３＋であり、ＮＫ細胞の１％以下がＣＤ１９＋であり、ＮＫ細胞の１％以下がＣＤ１４＋である。一部の実施形態において、ＮＫ細胞の各投与は、ＮＫ細胞１×１０^９～５×１０^９個を投与することである。一部の実施形態において、ＮＫ細胞を１次投与する前、ＣＤ３８標的抗体の用量が患者に投与される。

【0028】

一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞は、増幅された臍帯血ナチュラルキラー細胞である。

【0029】

一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＣＤ１６＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＮＫＧ２Ｄ＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＮＫｐ４６＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＮＫｐ３０＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＤＮＡＭ－１＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＮＫｐ４４＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％でＣＤ３＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％でＣＤ１４＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％でＣＤ１９＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％でＣＤ３８＋細胞を含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１６トランス遺伝子を含まない。

【0030】

一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、外因性ＣＤ１６タンパク質を発現しない。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞は、遺伝子操作されていない。

【0031】

一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞は、同一の臍帯血供与体に由来する。

【0032】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞の集団は、増幅されたナチュラルキラー細胞を少なくとも１億個含み、例えば、２億、２億５千万、３億、４億、５億、６億、７億、７億５千万、８億、９億、１０億、２０億、３０億、４０億、５０億、６０億、７０億、８０億、９０億、１００億、１５０億、２００億、２５０億、５００億、７５０億、８００億、９００億、１０００億、２０００億、２５００億、３０００億、４０００億、５０００億、６０００億、７０００億、８０００億、９０００億、１兆、２兆、３兆、４兆、５兆、６兆、７兆、８兆、９兆または１０兆個含む。

【0033】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞の集団は、（ａ）臍帯血からナチュラルキラー細胞を含む種細胞（ｓｅｅｄ ｃｅｌｌ）を得る段階；（ｂ）種細胞でＣＤ３＋細胞を枯渇処理する段階；（ｃ）枯渇処理された種細胞を膜結合型ＩＬ－２１、ＴＮＦα突然変異および４－１ＢＢＬ遺伝子を発現するように操作された第１の複数のＨｕｔ７８細胞とともに培養することにより、ナチュラルキラー細胞を増幅させて、増幅されたナチュラルキラー細胞を生産し、これによって増幅されたナチュラルキラー細胞の集団を生産する段階を含む方法により生産される。

【0034】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞の集団は、（ａ）臍帯血からナチュラルキラー細胞を含む種細胞を得る段階；（ｂ）種細胞でＣＤ３＋細胞を枯渇処理する段階；（ｃ）枯渇処理された種細胞を膜結合型ＩＬ－２１、ＴＮＦα突然変異および４－１ＢＢＬ遺伝子を発現するように操作された第１の複数のＨｕｔ７８細胞とともに培養することにより、ナチュラルキラー細胞を増幅させて、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団を生産する段階；および（ｄ）膜結合型ＩＬ－２１、ＴＮＦα突然変異および４－１ＢＢＬ遺伝子を発現するように操作された第２の複数のＨｕｔ７８細胞とともに培養することにより、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団を増幅させて、増幅されたナチュラルキラー細胞を生産し；これによって増幅されたナチュラルキラー細胞の集団を生産する段階を含む方法により生産される。

【0035】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞の集団は、段階（ｃ）の後に、（ｉ）増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団を複数の容器で冷凍する段階；および（ｉｉ）増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団の分液が収容された容器を解凍する段階を追加的に含む方法により生産されるが、ここで、段階（ｄ）において、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団の増幅は、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団の分液を増幅させることを含む。

【0036】

一部の実施形態において、臍帯血は、ＫＩＲ－Ｂハプロタイプであり、ＣＤ１６ １５８Ｖ多形成に対してホモ接合性である供与体に由来する。

【0037】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞の集団は、臍帯血からナチュラルキラー細胞を少なくとも１０，０００倍、例えば、１５，０００倍、２０，０００倍、２５，０００倍、３０，０００倍、３５，０００倍、４０，０００倍、４５，０００倍、５０，０００倍、５５，０００倍、６０，０００倍、６５，０００倍または７０，０００倍増幅させることを含む方法により生産される。

【0038】

一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、増幅後に濃縮または分類しない。

【0039】

一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＣＤ１６を発現するＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫｐ３０を発現するＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫｐ４４を発現するＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＤＮＡＭ－１を発現するＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。

【0040】

一部の実施形態において、本方法は、ステロイドを患者に投与することを追加的に含む。一部の実施形態において、ステロイドは、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、トリアムシノロン（ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、ベタメタゾン（ｂｅｔｈａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態において、ステロイドは、デキサメタゾンおよび／またはメチルプレドニソルロンである。一部の実施形態において、ステロイドは、ＮＫ細胞を投与した時点から１－４時間以内に投与する。一部の実施形態において、ステロイドの投与は、ＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を低下させたり、または消去しない。

【0041】

一部の実施形態において、本方法は、ＩＬ－２を、投与あたり、１×１０^６ＩＵ／ｍ^２または６×１０^６ＩＵで投与することを含む。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、ＮＫ細胞を投与した時点から１－４時間以内に投与する。

【0042】

また、本発明は、増幅されたＣＤ^１６＋／ＣＤ３８^ｌｏｗＮＫ細胞の集団を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、自然的に生成される異種的なＮＫ細胞の集団より低いレベルにＣＤ３８を発現する。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＣＤ３８－標的抗体の存在下でＣＤ３８＋腫瘍細胞に対してＡＤＣＣ活性を発揮する。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＫＩＲ－ＡハプロタイプのＮＫ細胞またはＣＤ１６ １５８Ｖ多形成がないＮＫ細胞に比べて減少したフラトリサイド活性を示す。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＣＤ３８－標的抗体の存在下で自然的に生成される異種的なＮＫ細胞の集団に比べて減少したフラトリサイド活性を示す。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＣＤ３８＋癌を治療するにあたりＮＫ細胞およびＣＤ３８標的抗体の組み合わせの効能を減少させないレベルにフラトリサイドをＣＤ３８標的抗体の存在下で示す。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＣＤ３８＋であり、ここで、ＮＫ細胞は、抗－ＣＤ３８抗体の存在下でＣＤ３８＋癌細胞に対してＡＤＣＣ活性を発揮するが、抗体の存在下でＮＫ細胞に対してはＡＤＣＣ活性を実質的に示さない。

【0043】

また、本発明は、ＫＩＲ－ＢハプロタイプまたはＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｖ遺伝子型に対するホモ接合性を有する供与体に由来するＮＫ細胞を含む臍帯血サンプルを得る段階；およびＮＫ細胞をＣＤ４^＋Ｔ細胞株の存在下で試験管内で増幅する段階を含むＣＤ１６^＋／ＣＤ３８^ｌｏｗＮＫ細胞の集団を構築する方法を提供する。また、本発明は、ＫＩＲ－ＢハプロタイプまたはＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｖ遺伝子型に対するホモ接合性を有する供与体に由来するＮＫ細胞を含む臍帯血サンプルを得る段階；およびＮＫ細胞をＣＤ^４＋Ｔ細胞株の存在下で試験管内で増幅する段階を含むＣＤ１６^＋／ＣＤ３８^ｌｏｗＮＫ細胞の集団を濃縮する方法を提供する。

【0044】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞を含む臍帯血サンプルは、ＣＤ３８^ｈｉｇｈＮＫ細胞の集団を含む。一部の実施形態において、ＮＫ細胞を含む臍帯血サンプルは、ＣＤ３８^ｌｏｗＮＫ細胞の集団を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１６^＋／ＣＤ３８^ｌｏｗＮＫ細胞の集団は、遺伝子操作されていない。一部の実施形態において、ＣＤ１６^＋／ＣＤ３８^ｌｏｗＮＫ細胞の集団は、ＣＤ３８の発現を変形するように遺伝子操作されていない。

【0045】

また、本発明は、ＮＫ細胞および癌細胞に独立に結合する抗原結合部位を含む抗体；およびＮＫ細胞を投与することを含み、ＮＫ細胞が抗体に結合したＮＫ細胞よりは抗体に結合した癌細胞を差別的に標的化する、癌細胞を標的化する方法を提供する。

【0046】

また、本発明は、ＮＫ細胞；およびＮＫ細胞と癌細胞に独立に結合する抗原結合部位を含む抗体を投与することを含み、抗原結合部位がＮＫ細胞よりは癌細胞に差別的に結合する、癌細胞を標的化する方法を提供する。

【0047】

さらに、本発明は、１）ＮＫ細胞の集団を投与する段階であって、ＮＫ細胞は、ＣＤ３８^＋であり、前記細胞は、抗－ＣＤ３８抗体の存在下でＣＤ３８^＋癌細胞に対してＡＤＣＣを媒介し、前記細胞は、抗－ＣＤ３８抗体の存在下でＮＫ細胞の集団から他のＣＤ３８^＋ＮＫ細胞に対してはＡＤＣＣを実質的に媒介しない段階；および２）抗－ＣＤ３８抗体を投与する段階を含む、ＣＤ３８^＋癌を患っている患者を治療する方法を提供する。

【0048】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、患者に対して同種異系であり、ＫＩＲ－Ｂハプロタイプであり、患者に対するＣＤ１６ １５８Ｖ多形成に対してホモ接合性である。

【0049】

他に断らない限り、本発明で使用されたすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野における通常の当業者が共通して理解する意味と同一の意味を有する。本発明で利用するための方法および材料が本願に記載され；当該技術分野で公知の他の適切な方法および材料も利用可能である。材料、方法および例は例示したものに過ぎず、制限するものではない。本願に言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリおよびその他の参考文献は全体として援用により本願に取り込まれる。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書を優先する。

【0050】

下記の詳細な説明および図面から、そして請求項から、本発明の他の特徴および利点が明確になるであろう。

【0051】

援用による取り込み
本明細書に言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの個別刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別的に援用により取り込まれるもので、意図するものと同じ程度に援用により本願に取り込まれる。

【0052】

本発明の新規な特徴は、添付した請求項に詳細に記載される。特許または出願ファイルには有色で作成された１つ以上の図面が含まれている。有色の図面が含まれている本特許または特許出願公開公報の写本は、要求書と所定の手数料を支払えば特許庁から提供される。本発明の特徴および利点は、本発明の原理が適用された例示的な実施形態が記載された下記の詳細な説明と下記の添付した図面を参照してより良く理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1】ＮＫ細胞の増幅および刺激方法に対する例示的な実施形態を示す図である。

【図2】前臨床実験において臍帯血－由来ＮＫ細胞（ＣＢ－ＮＫ）が末梢血－由来ＮＫ細胞（ＰＢ－ＮＫ）に比べて培養増幅力が約１０倍高いことを示す図である。

【図3】臍帯血－由来医薬品において腫瘍－エンゲージングＮＫ活性化免疫受容体の発現が末梢血起源と比較してより高くて一定であることを示す図である。

【図4】増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団の表現型を示す図である。

【図5】臍帯血－由来ＮＫ細胞増幅集団の一例としてＡＢ－１０１医薬品を製造する核心的な段階を示す図である。

【図6】ＡＢ－１０１の純度（ｎ＝９）を示す図である。

【図7】ＧＭＰ条件で製造したＣＤ３－枯渇細胞、ＭＣＢおよびＤＰの純度を示す図である。

【図8】ＧＭＰ条件で製造したＣＤ３－枯渇細胞、ＭＣＢおよびＤＰでのＮＫ細胞受容体の発現を示す図である。

【図9】フローサイトメトリー測定によるＮＫ純度（ＣＤ５６＋／ＣＤ３－）を示す図である。

【図10】臍帯血供与体３種に由来する増幅されたＮＫ細胞のＣＤ３８＋発現を示す図である。

【図11】臍帯血供与体３種に由来するＣＤ３８＋ＮＫ細胞のＣＤ３８＋の平均蛍光強度を示す図である。

【図12】（記載なし）

【図13】解凍後ＡＢ－１０１の細胞生存性、純度およびＣＤ３８発現を示す図である。上左：解凍後ＡＢ－１０１の細胞生存性；上中央：ＣＤ５６＋ＣＤ３－によって定義されたＡＢ－１０１の純度；上右：ＣＤ５６＋細胞上でＣＤ１６発現が確認される；下左：ＡＢ－１０１ ＣＤ５６＋細胞は、ＧＭＰロット（ｌｏｔ）でＣＤ３８発現率が低く、２４時間培養した後に変化しない；下右：ＣＤ３８発現の低い蛍光強度幾何平均。

【図14】解凍後ＰＢ－ＮＫの細胞生存性、純度およびＣＤ３８発現。上左：解凍後ＰＢ－ＮＫの細胞生存性；上中央：ＣＤ５６＋ＣＤ３－として定義されるＰＢ－ＮＫの純度；上右：ＣＤ５６＋細胞上でＣＤ１６発現が確認される；下左：ＰＢ－ＮＫ ＣＤ５６＋細胞は、ＣＤ３８発現性が高い；下右：ＣＤ３８発現の高い蛍光強度幾何平均。

【図15】多様な濃度でダラツムマブとともにインキュベーションした場合、ＡＢ－１０１細胞がフラトリサイドを行わないことを示す図である。

【図16】ダラツムマブが補体－依存的な細胞毒性（ＣＤＣ）を誘発することを示す図である。上左、上右および下左：ＡＢ－１０１細胞は、多様な濃度のダラツムマブとインキュベーションした場合、補体媒介細胞溶解を行わない；下右：対照群の腫瘍細胞株Ｄａｕｄｉは、ダラツムマブの存在下でＣＤＣにより細胞溶解する。

【図17】Ｄａｕｄｉ細胞株でＡＢ－１０１＋ダラツムマブＡＤＣＣに対するデキサメタゾンの影響（供与体３個の平均）を示す図である。

【図18】ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞株でＡＢ－１０１＋ダラツムマブＡＤＣＣに対するデキサメタゾンの影響（供与体３個の平均）を示す図である。

【図19】ＲＰＭＩ８２２６細胞株でＡＢ－１０１＋ダラツムマブＡＤＣＣに対するデキサメタゾンの影響（供与体３個の平均）を示す図である。

【図20】Ｋ５６２細胞株でＡＢ－１０１＋ダラツムマブＡＤＣＣに対するデキサメタゾンの影響（供与体３個の平均）を示す図である。

【図21】ダラツムマブがＡＢ－１０１細胞による有意なＡＤＣＣをＤａｕｄｉに対して誘導することを示す図である。

【図22】ダラツムマブがＡＢ－１０１細胞による有意なＡＤＣＣをＮＣＩ－Ｈ９２９に対して誘導することを示す図である。

【図23】ダラツムマブがＡＢ－１０１細胞による有意なＡＤＣＣをＲＰＭＩ－８２２６に対して誘導することを示す図である。

【図24】ダラツムマブがＡＢ－１０１細胞による有意なＡＤＣＣをＭＭ．１Ｒに対して誘導することを示す図である。

【図25】ダラツムマブがＡＢ－１０１細胞による有意なＡＤＣＣをＭＭ．１Ｓに対して誘導することを示す図である。

【図26】ダラツムマブがＡＢ－１０１細胞による有意なＡＤＣＣをＫ５６２に対して誘導することを示す図である。

【図27】ダラツムマブがＡＢ－１０１細胞がサイトカインを分泌するように誘導することを示す図である。

【図28】ダラツムマブがＡＢ－１０１細胞がサイトカインを分泌するように誘導することを示す図である。

【図29】ダラツムマブがＡＢ－１０１細胞がサイトカインを分泌するように誘導することを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0054】

本発明は、特に、ＮＫ細胞、例えば、増幅および刺激されたＮＫ細胞、ＮＫ細胞の生産方法、ＮＫ細胞を含む薬学的組成物、およびＮＫ細胞を用いた癌患者を治療する方法を提供する。

【0055】

Ｉ．ナチュラルキラー細胞の増幅および刺激
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）を用いた培養および刺激によって、増幅および刺激される。

【0056】

ＮＫ細胞は、例えば、ＵＳ２０２０／０１０８０９６またはＷＯ２０２０／１０１３６１に記載されているように、増幅および刺激可能であり、これら２つの文献とも全体として援用により本明細書に取り込まれる。簡略に、供給源細胞（ｓｏｕｒｃｅ ｃｅｌｌ）は、ＵＳ２０２０／０１０８０９６に記載されているように、４－１ＢＢＬ、膜結合型ＩＬ－２１および突然変異ＴＮＦαを発現するように操作された、組換えられたＨｕＴ－７８（ＡＴＣＣ^（Ｒ） ＴＩＢ－１６１^ＴＭ）細胞上で培養することができる。

【0057】

適切なＮＫ細胞はまた、本願に記載されているように、増幅および刺激可能である。

【0058】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、（ａ）ＮＫ細胞、ＮＫ細胞を含む組成物、例えば、ＣＤ３（－）枯渇した細胞を提供する段階；および（ｂ）フィーダー細胞および／または刺激因子を含む培地で培養して、増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団を生産する段階を含む方法により、増幅および刺激される。

【0059】

Ａ．ナチュラルキラー細胞供給源
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源は、末梢血、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄまたはｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、単離されたＮＫ細胞、誘導された万能性幹細胞に由来するＮＫ細胞、胚幹細胞に由来するＮＫ細胞、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。

【0060】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源は、臍帯血単一ユニット（ｓｉｎｇｌｅ ｕｎｉｔ）である。

【0061】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、総有核細胞（ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｃｅｌｌ）を１×１０^７または約１×１０^７～１×１０^９または約１×１０^９個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、総有核細胞を１×１０^８または約１×１０^８～１．５×１０^８または約１．５×１０^８個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、総有核細胞を１×１０^８個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、総有核細胞を約１×１０^８個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、総有核細胞を１×１０^９個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、総有核細胞を約１×１０^９個含む。

【0062】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、ＣＤ１６＋細胞を約２０％～約８０％含む。一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、ＣＤ１６＋細胞を２０％または約２０％～８０％または約８０％、約２０％～７０％または約７０％、約２０％～６０％または約６０％、約２０％～５０％または約５０％、約２０％～４０％または約４０％、約２０％～３０％または約３０％、約３０％～８０％または約８０％、約３０％～７０％または約７０％、約３０％～６０％または約６０％、約３０％～５０％または約５０％、約３０％～４０％または約４０％、約４０％～８０％または約８０％、約４０％～７０％または約７０％、約４０％～６０％または約６０％、約４０％～５０％または約５０％、約５０％～８０％または約８０％、約５０％～７０％または約７０％、約５０％～６０％または約６０％、約６０％～８０％または約８０％、約６０％～７０％または約７０％、または約７０％～８０％または約８０％含む。一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、ＣＤ１６＋細胞を８０％以下含む。代案的に、一部のＮＫ細胞供給源は、ＣＤ１６＋細胞を８０％より高い濃度で含んでもよい。

【0063】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、ＭＬＧ２Ａ＋細胞を４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下含む。

【0064】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＮＫＧ２Ｃ＋細胞を含む。

【0065】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＮＫＧ２Ｄ＋細胞を含む。

【0066】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＮＫｐ４６＋細胞を含む。

【0067】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＮＫｐ３０＋細胞を含む。

【0068】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＤＮＡＭ－１＋細胞を含む。

【0069】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＮＫｐ４４＋細胞を含む。

【0070】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＣＤ２５＋細胞を含む。

【0071】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＣＤ６２Ｌ＋細胞を含む。

【0072】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＣＤ６９＋細胞を含む。

【0073】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＣＸＣＲ３＋細胞を含む。

【0074】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＣＤ５７＋細胞を含む。

【0075】

一部の実施形態において、ＮＫ供給源中のＮＫ細胞は、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子を含む。Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＫＩＲ）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｇｉｏｎ：Ｇｅｎｅ－Ｏｒｄｅｒ，Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ａｌｌｅｌｉｃ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ」，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ１９０：４０－５２（２００２）およびＰｙｏ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ ａｎｄ Ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｇｒｏｕｐ Ａ ａｎｄ Ｂ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｇ－ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｏｃｕｓ」，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ５：ｅ１５１１５（２０１０）を参照する。

【0076】

一部の実施形態において、ＮＫ供給源中のＮＫ細胞は、ＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体（すなわち、ホモ接合性ＣＤ１６ １５Ｖ多形成）を含む。Ｋｏｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，「ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｖ／Ｆ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＩｇＧ ｂｙ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ，Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ－４８Ｌ／Ｒ／Ｈ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ」，Ｂｌｏｏｄ９０：１１０９－１４（１９９７）を参照する。

【0077】

一部の実施形態において、細胞供給源中のＮＫ細胞は、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子およびＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体を両方とも含む。

【0078】

一部の実施形態において、細胞供給源中のＮＫ細胞は、遺伝子操作されていない。

【0079】

一部の実施形態において、細胞供給源中のＮＫ細胞は、ＣＤ１６トランス遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を含まない。

【0080】

一部の実施形態において、細胞供給源中のＮＫ細胞は、外因性ＣＤ１６タンパク質を発現しない。

【0081】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源は、ＣＤ３＋枯渇する。一部の実施形態において、本方法は、ＮＫ細胞供給源においてＣＤ３＋細胞を枯渇処理することを含む。一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源におけるＣＤ３＋細胞の枯渇処理は、ＮＫ細胞供給源をＣＤ３結合抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む。一部の実施形態において、ＣＤ３結合抗体またはその抗原結合断片は、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１およびＨＩＴ３ａ、およびこれらの断片からなる群より選択される。一部の実施形態において、ＣＤ３結合抗体またはその抗原結合断片は、ＯＫＴ３またはその抗原結合断片である。一部の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ビーズ、例えば、磁気ビーズに付着する。一部の実施形態において、組成物におけるＣＤ３＋細胞の枯渇は、組成物をビーズに付着したＣＤ３標的抗体またはその抗原結合断片と接触させてビーズ－結合したＣＤ３＋細胞を組成物から除去することを含む。組成物は、免疫磁気選別（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）によって、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｔ細胞枯渇セット（ＬＳ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｓｅｔ（１６２－０１）Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ３を枯渇処理することができる。

【0082】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源は、例えば、ＣＤ５６発現に対するゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）によってＣＤ５６＋濃縮される。

【0083】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源は、例えば、ＣＤ５６＋ＣＤ３－発現細胞を選別することにより、ＣＤ５６＋濃縮およびＣＤ３＋枯渇が行われる。

【0084】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源は、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子およびＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体を両方とも含み、例えば、ＣＤ５６＋ＣＤ３－発現細胞を選別することにより、ＣＤ５６＋濃縮およびＣＤ３＋枯渇が達成される。

【0085】

Ｂ．フィーダー細胞
本発明は、ＮＫ細胞を増幅させるためのフィーダー細胞を開示する。これらのフィーダー細胞は、有利には、ＮＫ細胞を本願に記載の薬学的組成物を製造するのに適した個数に増幅可能にする。場合によっては、フィーダー細胞は、ＣＤ１６の発現減少なく、よく他のタイプのフィーダー細胞上で細胞増幅を伴ったり、または他の方法を用いたＮＫ細胞の増幅を許容する。場合によっては、フィーダー細胞は、冷凍／解凍サイクルの後、ＮＫ細胞がより高い比率で生存可能な状態で残っているように、または細胞が凍結中により長期間生存可能な状態で残っているように、増幅されたＮＫ細胞を冷凍により良く耐えられるようにする。場合によっては、フィーダー細胞は、ＮＫ細胞がＡＤＣＣなどの細胞毒性を高いレベルに維持し、生存を延長し、存続性を高め、高いレベルのＣＤ１６を強化または維持できるように許容する。場合によっては、フィーダー細胞は、疲労（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）または老化を有意なレベルに誘発することなくＮＫ細胞を増幅できるように許容する。

【0086】

フィーダー細胞は、ＮＫ細胞を刺激し、この細胞がより速く増幅するように、例えば、基質、成長因子および／またはサイトカインを供給することにより補助するために用いることができる。

【0087】

ＮＫ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、エプスタイン・バール・ウイルス－形質転換されたＢ－リンパ芽球細胞（例えば、ＥＢＶ－ＬＣＬ）、骨髄性白血病細胞（例えば、Ｋ５６２）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば、ＨｕＴ）、およびこれらの派生物を含むが、これらに限定されない、多様なタイプのフィーダー細胞を用いて刺激することができる。

【0088】

一部の実施形態において、フィーダー細胞は、例えば、γ－放射線照射またはマイトマイシン－ｃ処理によって不活性化される。

【0089】

本願に記載の方法での使用に適したフィーダー細胞は、例えば、ＵＳ２０２０／０１０８０９６に記載されており、この文献は全体内容として援用により本明細書に取り込まれる。

【0090】

一部の実施形態において、フィーダー細胞は、不活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態において、不活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨｕＴ－７８細胞（ＡＴＣＣ^（Ｒ） ＴＩＢ－１６１ＴＭ）、またはその変異体または派生物である。一部の実施形態において、ＨｕＴ－７８誘導体は、Ｈ９（ＡＴＣＣ^（Ｒ） ＨＴＢ－１７６^ＴＭ）である。

【0091】

一部の実施形態において、不活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＯＸ４０Ｌを発現する。一部の実施形態において、不活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＯＸ４０Ｌ（配列番号４）、またはその変異体を発現するＨｕＴ－７８細胞、またはその変異体または派生物である。

【0092】

一部の実施形態において、フィーダー細胞は、４－１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ４１２７３、配列番号１）、膜－結合型ＩＬ－２１（配列番号２）および突然変異ＴＮＦα（配列番号３）（「ｅＨｕｔ－７８細胞」）、またはこれらの変異体からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を発現するように操作されたＨｕＴ－７８細胞である。

【0093】

一部の実施形態において、不活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨｕＴ－７８（ＡＴＣＣ^（Ｒ） ＴＩＢ－１６１^ＴＭ）細胞またはＯＸ４０Ｌのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、またはその変異体を発現する変異体または派生物である。一部の実施形態において、フィーダー細胞は、４－１ＢＢＬオルソログまたはその変異体、膜－結合型ＩＬ－２１オルソログまたはその変異体、および突然変異ＴＮＦαオルソログ、またはこれらの変異体からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を発現するように操作されたＨｕＴ－７８細胞である。

【0094】

一部の実施形態において、フィーダー細胞は、ＯＸ４０Ｌ（配列番号４）を発現し、４－１ＢＢＬ（配列番号１）、膜－結合型ＩＬ－２１（配列番号２）および突然変異ＴＮＦα（配列番号３）（「ｅＨｕｔ－７８細胞」）、またはこれらの変異体または派生物を発現するように操作された、ＨｕＴ－７８細胞である。

【0095】

一部の実施形態において、フィーダー細胞は、例えば、実施例２に記載されているように、ＮＫ細胞とともに培養する前に、例えば、冷凍原液から増幅される。

【0096】

Ｃ．刺激因子
ＮＫ細胞はまた、フィーダー細胞に加えて、またはフィーダー細胞の代わりに、フィーダー細胞以外の他の１つ以上の刺激因子、例えば、シグナル伝達因子を用いて刺激することができる。

【0097】

一部の実施形態において、刺激因子、例えば、シグナル伝達因子は、本願に記載されているように、培養培地の構成成分である。一部の実施形態において、刺激因子、例えば、シグナル伝達因子は、本願に記載されているように、培養培地に対する補充剤である。

【0098】

一部の実施形態において、刺激因子は、サイトカインである。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。

【0099】

一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２である。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２とＩＬ－１５との組み合わせである。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８の組み合わせである。

【0100】

一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－１２とＩＬ－１５との組み合わせである。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－１２とＩＬ－１８との組み合わせである。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－１５とＩＬ－１８との組み合わせである。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８の組み合わせである。

【0101】

一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１８およびＩＬ－２１の組み合わせである。

【0102】

Ｄ．培養
ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞供給源をフィーダー細胞および／またはその他の刺激因子と共培養することにより、増幅および刺激可能である。好適なＮＫ細胞供給源、フィーダー細胞および刺激因子は本願に記載されている。

【0103】

場合によっては、得られた増幅されたＮＫ細胞の集団は、増幅後に濃縮するか、および／または分類する。場合によっては、得られた増幅されたＮＫ細胞の集団は、増幅後に濃縮および／または分類しない。

【0104】

また、本発明は、本願に記載の多様な培養組成物を含む、例えば、ＮＫ細胞を含む、組成物を記載する。例えば、ＫＩＲ－ＢハプロタイプおよびＣＤ１６ １５８Ｖ多形成に対するホモ接合体を含む増幅された臍帯血－由来ナチュラルキラー細胞の集団と、複数の操作されたＨｕＴ７８細胞とを含む組成物を記載する。

【0105】

また、本発明は、得られた増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が収容された容器（ｖｅｓｓｅｌ）、例えば、バイアル、クライオバッグなどを記載する。場合によっては、複数の容器は、得られた増幅されたナチュラルキラー細胞の集団の一部を含み、例えば、容器を少なくとも１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、１１００個または１２００個含む。

【0106】

また、本発明は、本願に記載の多様な培養組成物、例えば、ＮＫ細胞を収容したバイオリアクタを記載する。例えば、本願に記載されているようなナチュラルキラー細胞供給源に由来するナチュラルキラー細胞と、例えば、本願に記載されているようなフィーダー細胞とを含む培養物を収容する。なお、本発明は、得られた増幅されたナチュラルキラー細胞の集団を収容したバイオリアクタを記載する。

【0107】

１．培養培地
本発明は、ＮＫ細胞を増幅するための培養培地を開示する。これらの培養培地は、有利には、ＮＫ細胞が本願に記載の薬学的組成物を製造するのに適した細胞数に増幅可能にする。場合によっては、培養培地は、よく他のヘルパー細胞上でまたは他の培地中に細胞増幅を伴って、ＣＤ１６発現の低下なく、ＮＫ細胞を増幅させることができる。

【0108】

一部の実施形態において、培養培地は、基本培養培地（ｂａｓａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）であり、選択的に、例えば、本願に記載されているように、追加的な構成成分が添加された基本培養培地である。

【0109】

一部の実施形態において、培養培地、例えば、基本培養培地は、無－血清培養培地である。一部の実施形態において、培養培地、例えば、基本培養培地は、ヒト血漿および／または血清が添加された無血清培養培地である。

【0110】

適切な基本培養培地としては、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＳＣＧＭ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ^（Ｒ）、２０８０２－０５００または２０８０６－０５００）、ＬＧＭ－３^ＴＭ（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－３２１１）、ＴｅｘＭＡＣＳ^ＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９７－１９６）、ＡＬｙＳ^ＴＭ ５０５ＮＫ－ＡＣ（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，０１６００Ｐ０２）、ＡＬｙＳ^ＴＭ ５０５ＮＫ－ＥＸ（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，０１４００Ｐ１０）、ＣＴＳ^ＴＭ ＡＩＭ－Ｖ^ＴＭ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ３８３０８０１）、ＣＴＳ^ＴＭ ＯｐＴｍｉｚｅｒ^ＴＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１０４８５０１、ＡＢＳ－００１、ＳｔｅｍＸｘＶｉｖｏ）、およびこれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。

【0111】

培養培地は、追加的な構成成分を含むか、または成長因子、シグナル伝達因子、営養分、抗原結合剤などのような追加的な構成成分が添加されてもよい。培養培地への添加は、培地を培養容器に投入する前に、投入と同時にまたは投入した後、それぞれの追加的な構成成分または構成成分を培養容器に投入することにより、行われる。追加的な構成成分または構成成分はともにまたは分離して添加されてもよい。分離して添加する場合、追加的な構成成分を同時に添加する必要はない。

【0112】

一部の実施形態において、培養培地は、血漿、例えば、ヒト血漿を含む。一部の実施形態において、培養培地に血漿、例えば、ヒト血漿を添加する。一部の実施形態において、血漿、例えば、ヒト血漿は、抗－凝固剤、例えば、トリソジウムシトレートを含む。

【0113】

一部の実施形態において、培地は、血漿、例えば、ヒト血漿を０．５％または約０．５％～１０％または約１０％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培地は、０．５％または約０．５％～９％または約９％、０．５％または約０．５％～８％または約８％、０．５％または約０．５％～７％または約７％、０．５％または約０．５％～６％または約６％、０．５％または約０．５％～５％または約５％、０．５％または約０．５％～４％または約４％、０．５％または約０．５％～３％または約３％、０．５％または約０．５％～２％または約２％、０．５％または約０．５％～１％または約１％、１％または約１％～１０％または約１０％、１％または約１％～９％または約９％、１％または約１％～８％または約８％、１％または約１％～７％または約７％、１％または約１％～６％または約６％、１％または約１％～５％または約５％、１％または約１％～４％または約４％、１％または約１％～３％または約３％、１％または約１％～２％または約２％、２％または約２％～１０％または約１０％、２％または約２％～９％または約９％、２％または約２％～８％または約８％、２％または約２％～７％または約７％、２％または約２％～６％または約６％、２％または約２％～５％または約５％、２％または約２％～４％または約４％、２％または約２％～３％または約３％、３％または約３％～１０％または約１０％、３％または約３％～９％または約９％、３％または約３％～８％または約８％、３％または約３％～７％または約７％、３％または約３％～６％または約６％、３％または約３％～５％または約５％、３％または約３％～４％または約４％、４％または約４％～１０％または約１０％、４％または約４％～９％または約９％、４％または約４％～８％または約８％、４％または約４％～７％または約７％、４％または約４％～６％または約６％、４％または約４％～５％または約５％、５％または約５％～１０％または約１０％、５％または約５％～９％または約９％、４％または約４％～８％または約８％、５％または約５％～７％または約７％、５％または約５％～６％または約６％、６％または約６％～１０％または約１０％、６％または約６％～９％または約９％、６％または約６％～８％または約８％、６％または約６％～７％または約７％、７％または約７％～１０％または約１０％、７％または約７％～９％または約９％、７％または約７％～８％または約８％、８％または約８％～１０％または約１０％、８％または約８％～９％または約９％、または９％または約９％～１０％または約１０％ｖ／ｖで血漿、例えば、ヒト血漿で補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ヒト血漿を０．８％～１．２％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ヒト血漿を１．０％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ヒト血漿を約１．０％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。

【0114】

一部の実施形態において、培養培地は、血清、例えば、ヒト血清を含む。一部の実施形態において、培養培地は、血清、例えば、ヒト血清で補充される。一部の実施形態において、血清は、不活性化され、例えば、熱によって不活性化される。一部の実施形態において、血清は濾過し、例えば、滅菌－濾過（ｓｔｅｒｉｌｅ－ｆｉｌｔｅｒｅｄ）する。

【0115】

一部の実施形態において、培養培地は、グルタミンを含む。一部の実施形態において、培養培地は、グルタミンで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルタミンを２．０または約２．０～６．０または約６．０ｍＭ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルタミンを２．０または約２．０～５．５または約５．５、２．０または約２．０～５．０または約５．０、２．０または約２．０～４．５または約４．５、２．０または約２．０～４．０または約４．０、２．０または約２．０～３．５または約３．５、２．０または約２．０～３．０または約３．０、２．０または約２．０～２．５または約２．５、２．５または約２．５～６．０または約６．０、２．５または約２．５～５．５または約５．５、２．５または約２．５～５．０または約５．０、２．５または約２．５～４．５または約４．５、２．５または約２．５～４．０または約４．０、２．５または約２．５～３．５または約３．５、２．５または約２．５～３．０または約３．０、３．０または約３．０～６．０または約６．０、３．０または約３．０～５．５または約５．５、３．０または約３．０～５．０または約５．０、３．０または約３．０～４．５または約４．５、３．０または約３．０～４．０または約４．０、３．０または約３．０～３．５または約３．５、３．５または約３．５～６．０または約６．０、３．５または約３．５～５．５または約５．５、３．５または約３．５～５．０または約５．０、３．５または約３．５～４．５または約４．５、３．５または約３．５～４．０または約４．０、４．０または約４．０～６．０または約６．０、４．０または約４．０～５．５または約５．５、４．０または約４．０～５．０または約５．０、４．０または約４．０～４．５または約４．５、４．５または約４．５～６．０または約６．０、４．５または約４．５～５．５または約５．５、４．５または約４．５～５．０または約５．０、５．０または約５．０～６．０または約６．０、５．０または約５．０～５．５または約５．５、または５．５または約５．５～６．０または約６．０ｍＭ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルタミンを３．２ｍＭ～４．８ｍＭ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルタミンを４．０ｍＭ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルタミンを約４．０ｍＭ含むか、および／またはそれで補充される。

【0116】

一部の実施形態において、培養培地は、１つ以上のサイトカインを含む。一部の実施形態において、培養培地は、１つ以上のサイトカインで補充される。

【0117】

一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびこれらの組み合わせから選択される。

【0118】

一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２を含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２を１５０または約１５０～２，５００または約２，５００ＩＵ／ｍｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２を２００または約２００～２，２５０または約２，２５０、２００または約２００～２，０００または約２，０００、２００または約２００～１，７５０または約１，７５０、２００または約２００～１，５００または約１，５００、２００または約２００～１，２５０または約１，２５０、２００または約２００～１，０００または約１，０００、２００または約２００～７５０または約７５０、２００または約２００～５００または約５００、２００または約２００～２５０または約２５０、２５０または約２５０～２，５００または約２，５００、２５０または約２５０～２，２５０または約２，２５０、２５０または約２５０～２，０００または約２，０００、２５０または約２５０～１，７５０または約１，７５０、２５０または約２５０～１，５００または約１，５００、２５０または約２５０～１，２５０または約１，２５０、２５０または約２５０～１，０００または約１，０００、２５０または約２５０～７５０または約７５０、２５０または約２５０～５００または約５００、５００または約５００～２，５００または約２，５００、５００または約５００～２，２５０または約２，２５０、５００または約５００～２，０００または約２，０００、５００または約５００～１，７５０または約１，７５０、５００または約５００～１，５００または約１，５００、５００または約５００～１，２５０または約１，２５０、５００または約５００～１，０００または約１，０００、５００または約５００～７５０または約７５０、７５０または約７５０～２，２５０または約２，２５０、７５０または約７５０～２，０００または約２，０００、７５０または約７５０～１，７５０または約１，７５０、７５０または約７５０～１，５００または約１，５００、７５０または約７５０～１，２５０または約１，２５０、７５０または約７５０～１，０００または約１，０００、１，０００または約１，０００～２，５００または約２，５００、１，０００または約１，０００～２，２５０または約２，２５０、１，０００または約１，０００～２，０００または約２，０００、１，０００または約１，０００～１，７５０または約１，７５０、１，０００または約１，０００～１，５００または約１，５００、１，０００または約１，０００～１，２５０または約１，２５０、１，２５０または約１，２５０～２，５００または約２，５００、１，２５０または約１，２５０～２，２５０または約２，２５０、１，２５０または約１，２５０～２，０００または約２，０００、１，２５０または約１，２５０～１，７５０または約１，７５０、１，２５０または約１，２５０～１，５００または約１，５００、１，５００または約１，５００～２，５００または約２，５００、１，５００または約１，５００～２，２５０または約２，２５０、１，５００または約１，５００～２，０００または約２，０００、１，５００または約１，５００～１，７５０または約１，７５０、１，７５０または約１，７５０～２，５００または約２，５００、１，７５０または約１，７５０～２，２５０または約２，２５０、１，７５０または約１，７５０～２，０００または約２，０００、２，０００または約２，０００～２，５００または約２，５００、２，０００または約２，０００～２，２５０または約２，２５０、または２，２５０または約２，２５０～２，５００または約２，５００ＩＵ／ｍｌ含むか、および／またはそれで補充される。

【0119】

一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２を６４μｇ／ｌ～９６μｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２を８０μｇ／ｌ（約１，３３３ＩＵ／ｍｌ）含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２を約８０μｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。

【0120】

一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２およびＩＬ－１５の組み合わせを含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８の組み合わせを含むか、および／またはそれで補充される。 一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－１８およびＩＬ－２１の組み合わせを含むか、および／またはそれで補充される。

【0121】

一部の実施形態において、培養培地は、グルコースを含むか、および／またはグルコースで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルコースを０．５または約０．５～３．５ｇ／ｌまたは約３．５ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、０．５または約０．５～３．０または約３．０、０．５または約０．５～２．５または約２．５、０．５または約０．５～２．０または約２．０、０．５または約０．５～１．５または約１．５、０．５または約０．５～１．０または約１．０、１．０または約１．０～３．０または約３．０、１．０または約１．０～２．５または約２．５、１．０または約１．０～２．０または約２．０、１．０または約１．０～１．５または約１．５、１．５または約１．５～３．０または約３．０、１．５または約１．５～２．５または約２．５、１．５または約１．５～２．０または約２．０、２．０または約２．０～３．０または約３．０、２．０または約２．０～２．５または約２．５、または２．５または約２．５～３．０または約３．０ｇ／ｌでグルコースを含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルコースを１．６～２．４ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルコースを２．０ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルコースを約２．０ｇ／ｌ含む。

【0122】

一部の実施形態において、培養培地は、ソジウムピルベートを含むか、および／またはソジウムピルベートで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ソジウムピルベートを０．１または約０．１～２．０または約２．０ｍＭ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、０．１または約０．１～１．８または約１．８、０．１または約０．１～１．６または約１．６、０．１または約０．１～１．４または約１．４、０．１または約０．１～１．２または約１．２、０．１または約０．１～１．０または約１．０、０．１または約０．１～０．８または約０．８、０．１または約０．１～０．６または約０．６、０．１または約０．１～０．４または約０．４、０．１または約０．１～０．２または約０．２、０．２または約０．２～２．０または約２．０、０．２または約０．２～１．８または約１．８、０．２または約０．２～１．６または約１．６、０．２または約０．２～１．４または約１．４、０．２または約０．２～１．２または約１．２、０．２または約０．２～１．０または約１．０、０．２または約０．２～０．８または約０．８、０．２または約０．２～０．６または約０．６、０．２または約０．２～０．４または約０．４、０．４または約０．４～２．０または約２．０、０．４または約０．４～１．８または約１．８、０．４または約０．４～１．６または約１．６、０．４または約０．４～１．４または約１．４、０．４または約０．４～１．２または約１．２、０．４または約０．４～１．０または約１．０、０．４または約０．４～０．８または約０．８、０．４または約０．４～０．６または約０．６、０．６または約０．６～２．０または約２．０、０．６または約０．６～１．８または約１．８、０．６または約０．６～１．６または約１．６、０．６または約０．６～１．４または約１．４、０．６または約０．６～１．２または約１．２、０．６または約０．６～１．０または約１．０、０．６または約０．６～０．８または約０．８、０．８または約０．８～２．０または約２．０、０．８または約０．８～１．８または約１．８、０．８または約０．８～１．６または約１．６、０．８または約０．８～１．４または約１．４、０．８または約０．８～１．４または約１．４、０．８または約０．８～１．２または約１．２、０．８または約０．８～１．０または約１．０、１．０または約１．０～２．０または約２．０、１．０または約１．０～１．８または約１．８、１．０または約１．０～１．６または約１．６、１．０または約１．０～１．４または約１．４、１．０または約１．０～１．２または約１．２、１．２または約１．２～２．０または約２．０、１．２または約１．２～１．８または約１．８、１．２または約１．２～１．６または約１．６、１．２または約１．２～１．４または約１．４、１．４または約１．４～２．０または約２．０、１．４または約１．４～１．８または約１．８、１．４または約１．４～１．６または約１．６、１．６または約１．６～２．０または約２．０、１．６または約１．６～１．８または約１．８、または１．８または約１．８～２．０または約２．０ｍＭでソジウムピルベートを含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ソジウムピルベートを０．８～１．２ｍＭ含む。一部の実施形態において、培養培地は、ソジウムピルベートを１．０ｍＭ含む。一部の実施形態において、培養培地は、ソジウムピルベートを約１．０ｍＭ含む。

【0123】

一部の実施形態において、培養培地は、炭酸水素ナトリウムを含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、炭酸水素ナトリウムを０．５または約０．５～３．５または約３．５ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、０．５または約０．５～３．０または約３．０、０．５または約０．５～２．５または約２．５、０．５または約０．５～２．０または約２．０、０．５または約０．５～１．５または約１．５、０．５または約０．５～１．０または約１．０、１．０または約１．０～３．０または約３．０、１．０または約１．０～２．５または約２．５、１．０または約１．０～２．０または約２．０、１．０または約１．０～１．５または約１．５、１．５または約１．５～３．０または約３．０、１．５または約１．５～２．５または約２．５、１．５または約１．５～２．０または約２．０、２．０または約２．０～３．０または約３．０、２．０または約２．０～２．５または約２．５、または２．５または約２．５～３．０または約３．０ｇ／ｌで炭酸水素ナトリウムを含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、炭酸水素ナトリウムを１．６～２．４ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、炭酸水素ナトリウムを２．０ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、炭酸水素ナトリウムを約２．０ｇ／ｌ含む。

【0124】

一部の実施形態において、培養培地は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミン、例えば、本願に記載のヒトアルブミン溶液を含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、２０％アルブミン溶液、例えば、２０％ヒトアルブミン溶液を０．５％または約０．５％～３．５％または約３．５％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、２０％アルブミン溶液、例えば、２０％ヒトアルブミン溶液を０．５または約０．５％～３．０または約３．０％、０．５％または約０．５％～２．５または約２．５％、０．５％または約０．５％～２．０または約２．０％、０．５％または約０．５％～１．５または約１．５％、０．５％または約０．５％～１．０または約１．０％、１．０または約１．０％～３．０または約３．０％、１．０または約１．０％～２．５または約２．５％、１．０または約１．０％～２．０または約２．０％、１．０または約１．０％～１．５または約１．５％、１．５または約１．５％～３．０または約３．０％、１．５または約１．５％～２．５または約２．５％、１．５または約１．５％～２．０または約２．０％、２．０％または約２．０％～３．０または約３．０％、２．０％または約２．０％～２．５または約２．５％、または２．５％または約２．５％～３．０または約３．０％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、２０％アルブミン溶液、例えば、２０％ヒトアルブミン溶液を１．６％～２．４％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、２０％アルブミン溶液、例えば、２０％ヒトアルブミン溶液を２．０％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、２０％アルブミン溶液、例えば、２０％ヒトアルブミン溶液を約２．０％ｖ／ｖ含む。

【0125】

一部の実施形態において、培養培地は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを２または約２～６または約６ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを２または約２～５．５または約５．５、２または約２～５．０または約５．０、２または約２～４．５または約４．５、２または約２～４または約４、２または約２～３．５または約３．５、２または約２～３または約３、２または約２～２．５または約２．５、２．５または約２．５～６または約６、２．５または約２．５～５．５または約５．５、２．５または約２．５～５．５または約５．５、２．５または約２．５～５．０または約５．０、２．５または約２．５～４．５または約４．５、２．５または約２．５～４．０または約４．０、２．５または約２．５～３．５または約３．５、２．５または約２．５～３．０または約３．０、３または約３～６または約６、３または約３～５．５または約５．５、３または約３～５または約５、３または約３～４．５または約４．５、３または約３～４または約４、３または約３～３．５または約３．５、３．５または約３．５～６または約６、３．５または約３．５～５．５または約５．５、３．５または約３．５～５または約５、３．５または約３．５～４．５または約４．５、３．５または約３．５～４または約４、４または約４～６または約６、４または約４～５．５または約５．５、４または約４～５または約５、４または約４～４．５または約４．５、４．５または約４．５～６または約６、４．５または約４．５～５．５または約５．５、４．５または約４．５～５または約５、５または約５～６または約６、５または約５～５．５または約５．５、または５．５または約５．５～６または約６ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを３．２～４．８ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを４ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、培養培地は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを約４ｇ／ｌ含む。

【0126】

一部の実施形態において、培養培地は、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８で補充される。一部の実施形態において、培養培地は、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８を０．１または約０．１～２．０または約２．０ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８を０．１または約０．１～１．８または約１．８、０．１または約０．１～１．６または約１．６、０．１または約０．１～１．４または約１．４、０．１または約０．１～１．２または約１．２、０．１または約０．１～１．０または約１．０、０．１または約０．１～０．８または約０．８、０．１または約０．１～０．６または約０．６、０．１または約０．１～０．４または約０．４、０．１または約０．１～０．２または約０．２、０．２または約０．２～２．０または約２．０、０．２または約０．２～１．８または約１．８、０．２または約０．２～１．６または約１．６、０．２または約０．２～１．４または約１．４、０．２または約０．２～１．２または約１．２、０．２または約０．２～１．０または約１．０、０．２または約０．２～０．８または約０．８、０．２または約０．２～０．６または約０．６、０．２または約０．２～０．４または約０．４、０．４または約０．４～２．０または約２．０、０．４または約０．４～１．８または約１．８、０．４または約０．４～１．６または約１．６、０．４または約０．４～１．４または約１．４、０．４または約０．４～１．２または約１．２、０．４または約０．４～１．０または約１．０、０．４または約０．４～０．８または約０．８、０．４または約０．４～０．６または約０．６、０．６または約０．６～２．０または約２．０、０．６または約０．６～１．８または約１．８、０．６または約０．６～１．６または約１．６、０．６または約０．６～１．４または約１．４、０．６または約０．６～１．２または約１．２、０．６または約０．６～１．０または約１．０、０．６または約０．６～０．８または約０．８、０．８または約０．８～２．０または約２．０、０．８または約０．８～１．８または約１．８、０．８または約０．８～１．６または約１．６、０．８または約０．８～１．４または約１．４、０．８または約０．８～１．４または約１．４、０．８または約０．８～１．２または約１．２、０．８または約０．８～１．０または約１．０、１．０または約１．０～２．０または約２．０、１．０または約１．０～１．８または約１．８、１．０または約１．０～１．６または約１．６、１．０または約１．０～１．４または約１．４、１．０または約１．０～１．２または約１．２、１．２または約１．２～２．０または約２．０、１．２または約１．２～１．８または約１．８、１．２または約１．２～１．６または約１．６、１．２または約１．２～１．４または約１．４、１．４または約１．４～２．０または約２．０、１．４または約１．４～１．８または約１．８、１．４または約１．４～１．６または約１．６、１．６または約１．６～２．０または約２．０、１．６または約１．６～１．８または約１．８、または１．８または約１．８～２．０または約２．０ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８を０．８～１．２ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、培養培地は、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８を１．０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、培養培地は、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８を約１．０ｇ／ｌ含む。

【0127】

一部の実施形態において、培養培地は、１つ以上の抗生剤を含むか、および／またはそれで補充される。

【0128】

例示的な第１培養培地を表１に示す。

【0129】

【表1】

【0130】

例示的な第２培養培地を表２に言及する。

【0131】

【表2】

【0132】

２．ＣＤ３結合抗体
一部の実施形態において、培養培地は、ＣＤ３結合抗体またはその抗原結合断片を含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、ＣＤ３結合抗体またはその抗原結合断片は、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１およびＨＩＴ３ａ、またはその変異体からなる群より選択される。一部の実施形態において、ＣＤ３結合抗体またはその抗原結合断片は、ＯＫＴ３またはその抗原結合断片である。

【0133】

一部の実施形態において、ＣＤ３結合抗体またはその抗原結合断片とフィーダー細胞は、ＮＫ細胞および／または培養培地を添加する前に培養容器に投入される。

【0134】

一部の実施形態において、培養培地は、５または約５ｎｇ／ｍｌ～１５または約１５ｎｇ／ｍｌでＯＫＴ３を含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、５または約５～１２．５または約１２．５、５または約５～１０または約１０、５または約５～７．５または約７．５、７．５または約７．５～１５または約１５、７．５または約７．５～１２．５または約１２．５、７．５または約７．５～１０または約１０、１０または約１０～１５または約１５、１０または約１０～１２．５または約１２．５、または１２．５または約１２．５～１５または約１５ｎｇ／ｍｌでＯＫＴ３を含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、１０ｎｇ／ｍｌでＯＫＴ３を含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、約１０ｎｇ／ｍｌでＯＫＴ３を含むか、および／またはそれで補充される。

【0135】

３．培養容器
様々な容器が本発明の内容に符合する。一部の実施形態において、培養容器は、フラスコ、ボトル、ディッシュ、マルチウェルプレート、ローラーボトル、バッグおよびバイオリアクタからなる群より選択される。

【0136】

一部の実施形態において、培養容器は、親水性になるように処理される。一部の実施形態において、培養容器は、付着および／または増殖を促進するように処理される。一部の実施形態において、培養容器の表面は、血清、コラーゲン、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、フィブロネクチン、細胞外マトリックスタンパク質、およびこれらの組み合わせでコーティングされる。

【0137】

一部の実施形態において、様々な培養段階に様々なタイプの培養容器が用いられる。

【0138】

一部の実施形態において、培養容器は、１００ｍｌまたは約１００ｍｌ～１，０００ｌまたは約１，０００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、培養容器は、１２５ｍｌまたは約１２５ｍｌ、２５０ｍｌまたは約２５０ｍｌ、５００ｍｌまたは約５００ｍｌ、１ｌまたは約１ｌ、５ｌまたは約５ｌ、１０ｌまたは約１０ｌ、または２０ｌまたは約２０ｌの体積を有する。

【0139】

一部の実施形態において、培養容器は、バイオリアクタである。

【0140】

一部の実施形態において、バイオリアクタは、ロッキングベッド（ｒｏｃｋｉｎｇ ｂｅｄ）（波動運動）バイオリアクタである。一部の実施形態において、バイオリアクタは、撹拌型タンクバイオリアクタ（ｓｔｉｒｒｅｄ ｔａｎｋ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）である。一部の実施形態において、バイオリアクタは、回転壁容器（ｒｏｔａｔｉｎｇ ｗａｌｌ ｖｅｓｓｅｌ）である。一部の実施形態において、バイオリアクタは、灌流バイオリアクタ（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）である。一部の実施形態において、バイオリアクタは、単離／増幅自動システム（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍ）である。一部の実施形態において、バイオリアクタは、自動または半自動バイオリアクタである。一部の実施形態において、バイオリアクタは、使い捨てバッグバイオリアクタである。

【0141】

一部の実施形態において、バイオリアクタは、約１００ｍｌ～約１，０００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、約１０ｌ～約１，０００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、約１００ｌ～約９００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、約１０ｌ～約８００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、約１０Ｌ～約７００ｌ、約１０ｌ～約６００ｌ、約１０ｌ～約５００ｌ、約１０ｌ～約４００ｌ、約１０ｌ～約３００ｌ、約１０ｌ～約２００ｌ、約１０ｌ～約１００ｌ、約１０ｌ～約９０ｌ、約１０ｌ～約８０ｌ、約１０ｌ～約７０ｌ、約１０ｌ～約６０ｌ、約１０ｌ～約５０ｌ、約１０ｌ～約４０ｌ、約１０ｌ～約３０ｌ、約１０ｌ～約２０ｌ、約２０ｌ～約１，０００ｌ、約２０ｌ～約９００ｌ、約２０ｌ～約８００ｌ、約２０ｌ～約７００ｌ、約２０ｌ～約６００ｌ、約２０ｌ～約５００ｌ、約２０ｌ～約４００ｌ、約２０ｌ～約３００ｌ、約２０ｌ～約２００ｌ、約２０ｌ～約１００ｌ、約２０ｌ～約９０ｌ、約２０ｌ～約８０ｌ、約２０ｌ～約７０ｌ、約２０ｌ～約６０ｌ、約２０ｌ～約５０ｌ、約２０ｌ～約４０ｌ、約２０ｌ～約３０ｌ、約３０ｌ～約１，０００ｌ、約３０ｌ～約９００ｌ、約３０ｌ～約８００ｌ、約３０ｌ～約７００ｌ、約３０ｌ～約６００ｌ、約３０ｌ～約５００ｌ、約３０ｌ～約４００ｌ、約３０ｌ～約３００ｌ、約３０ｌ～約２００ｌ、約３０ｌ～約１００ｌ、約３０ｌ～約９０ｌ、約３０ｌ～約８０ｌ、約３０ｌ～約７０ｌ、約３０ｌ～約６０ｌ、約３０ｌ～約５０ｌ、約３０ｌ～約４０ｌ、約４０ｌ～約１，０００ｌ、約４０ｌ～約９００ｌ、約４０ｌ～約８００ｌ、約４０ｌ～約７００ｌ、約４０ｌ～約６００ｌ、約４０ｌ～約５００ｌ、約４０ｌ～約４００ｌ、約４０ｌ～約３００ｌ、約４０ｌ～約２００ｌ、約４０ｌ～約１００ｌ、約４０ｌ～約９０ｌ、約４０ｌ～約８０ｌ、約４０ｌ～約７０ｌ、約４０ｌ～約６０ｌ、約４０ｌ～約５０ｌ、約５０ｌ～約１，０００ｌ、約５０ｌ～約９００ｌ、約５０ｌ～約８００ｌ、約５０ｌ～約７００ｌ、約５０ｌ～約６００ｌ、約５０ｌ～約５００ｌ、約５０ｌ～約４００ｌ、約５０ｌ～約３００ｌ、約５０ｌ～約２００ｌ、約５０ｌ～約１００ｌ、約５０ｌ～約９０ｌ、約５０ｌ～約８０ｌ、約５０ｌ～約７０ｌ、約５０ｌ～約６０ｌ、約６０ｌ～約１，０００ｌ、約６０ｌ～約９００ｌ、約６０ｌ～約８００ｌ、約６０ｌ～約７００ｌ、約６０ｌ～約６００ｌ、約６０ｌ～約５００ｌ、約６０ｌ～約４００ｌ、約６０ｌ～約３００ｌ、約６０ｌ～約２００ｌ、約６０ｌ～約１００Ｌ、約６０ｌ～約９０ｌ、約６０ｌ～約８０ｌ、約６０ｌ～約７０ｌ、約７０ｌ～約１，０００ｌ、約７０ｌ～約９００ｌ、約７０ｌ～約８００ｌ、約７０ｌ～約７００ｌ、約７０ｌ～約６００ｌ、約７０ｌ～約５００ｌ、約７０ｌ～約４００ｌ、約７０ｌ～約３００ｌ、約７０ｌ～約２００ｌ、約７０ｌ～約１００ｌ、約７０ｌ～約９０ｌ、約７０ｌ～約８０ｌ、約８０ｌ～約１，０００ｌ、約８０ｌ～約９００ｌ、約８０ｌ～約８００ｌ、約８０ｌ～約７００ｌ、約８０ｌ～約６００ｌ、約８０ｌ～約５００ｌ、約８０ｌ～約４００ｌ、約８０ｌ～約３００ｌ、約８０ｌ～約２００ｌ、約８０ｌ～約１００ｌ、約８０ｌ～約９０ｌ、約９０ｌ～約１，０００ｌ、約９０ｌ～約９００ｌ、約９０ｌ～約８００ｌ、約９０ｌ～約７００ｌ、約９０ｌ～約６００ｌ、約９０ｌ～約５００ｌ、約９０ｌ～約４００ｌ、約９０ｌ～約３００ｌ、約９０ｌ～約２００ｌ、約９０ｌ～約１００ｌ、約１００ｌ～約１，０００ｌ、約１００ｌ～約９００ｌ、約１００ｌ～約８００ｌ、約１００ｌ～約７００ｌ、約１００ｌ～約６００ｌ、約１００ｌ～約５００ｌ、約１００ｌ～約４００ｌ、約１００ｌ～約３００ｌ、約１００ｌ～約２００ｌ、約２００ｌ～約１，０００ｌ、約２００ｌ～約９００ｌ、約２００ｌ～約８００ｌ、約２００ｌ～約７００ｌ、約２００ｌ～約６００ｌ、約２００ｌ～約５００ｌ、約２００ｌ～約４００ｌ、約２００ｌ～約３００ｌ、約３００ｌ～約１，０００ｌ、約３００ｌ～約９００ｌ、約３００ｌ～約８００ｌ、約３００ｌ～約７００ｌ、約３００ｌ～約６００ｌ、約３００ｌ～約５００ｌ、約３００ｌ～約４００ｌ、約４００ｌ～約１，０００ｌ、約４００ｌ～約９００ｌ、約４００ｌ～約８００ｌ、約４００ｌ～約７００ｌ、約４００ｌ～約６００ｌ、約４００ｌ～約５００ｌ、約５００ｌ～約１，０００ｌ、約５００ｌ～約９００ｌ、約５００ｌ～約８００ｌ、約５００ｌ～約７００ｌ、約５００ｌ～約６００ｌ、約６００ｌ～約１，０００ｌ、約６００ｌ～約９００ｌ、約６００ｌ～約８００ｌ、約６００ｌ～約７００ｌ、約７００ｌ～約１，０００ｌ、約７００ｌ～約９００ｌ、約７００ｌ～約８００ｌ、約８００ｌ～約１，０００ｌ、約８００ｌ～約９００ｌ、または約９００ｌ～約１，０００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、約５０ｌの体積を有する。

【0142】

一部の実施形態において、バイオリアクタは、１００ｍｌ～１，０００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、１０ｌ～１，０００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、１００ｌ～９００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、１０ｌ～８００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、１０ｌ～７００ｌ、１０ｌ～６００ｌ、１０ｌ～５００ｌ、１０ｌ～４００ｌ、１０ｌ～３００ｌ、１０ｌ～２００ｌ、１０ｌ～１００ｌ、１０ｌ～９０ｌ、１０ｌ～８０ｌ、１０ｌ～７０ｌ、１０ｌ～６０ｌ、１０ｌ～５０ｌ、１０ｌ～４０ｌ、１０ｌ～３０ｌ、１０ｌ～２０ｌ、２０ｌ～１，０００ｌ、２０ｌ～９００ｌ、２０ｌ～８００ｌ、２０ｌ～７００ｌ、２０ｌ～６００ｌ、２０ｌ～５００ｌ、２０ｌ～４００ｌ、２０ｌ～３００ｌ、２０ｌ～２００ｌ、２０ｌ～１００ｌ、２０ｌ～９０ｌ、２０ｌ～８０ｌ、２０ｌ～７０ｌ、２０ｌ～６０ｌ、２０ｌ～５０ｌ、２０ｌ～４０ｌ、２０ｌ～３０ｌ、３０ｌ～１，０００ｌ、３０ｌ～９００ｌ、３０ｌ～８００ｌ、３０ｌ～７００ｌ、３０ｌ～６００ｌ、３０ｌ～５００ｌ、３０ｌ～４００ｌ、３０ｌ～３００ｌ、３０ｌ～２００ｌ、３０ｌ～１００ｌ、３０ｌ～９０ｌ、３０ｌ～８０ｌ、３０ｌ～７０ｌ、３０ｌ～６０ｌ、３０ｌ～５０ｌ、３０ｌ～４０ｌ、４０ｌ～１，０００ｌ、４０ｌ～９００ｌ、４０ｌ～８００ｌ、４０ｌ～７００ｌ、４０ｌ～６００ｌ、４０ｌ～５００ｌ、４０ｌ～４００ｌ、４０ｌ～３００ｌ、４０ｌ～２００ｌ、４０ｌ～１００ｌ、４０ｌ～９０ｌ、４０ｌ～８０ｌ、４０ｌ～７０ｌ、４０ｌ～６０ｌ、４０ｌ～５０ｌ、５０ｌ～１，０００ｌ、５０ｌ～９００ｌ、５０ｌ～８００ｌ、５０ｌ～７００ｌ、５０ｌ～６００ｌ、５０ｌ～５００ｌ、５０ｌ～４００ｌ、５０ｌ～３００ｌ、５０ｌ～２００ｌ、５０ｌ～１００ｌ、５０ｌ～９０ｌ、５０ｌ～８０ｌ、５０ｌ～７０ｌ、５０ｌ～６０ｌ、６０ｌ～１，０００ｌ、６０ｌ～９００ｌ、６０ｌ～８００ｌ、６０ｌ～７００ｌ、６０ｌ～６００ｌ、６０ｌ～５００ｌ、６０ｌ～４００ｌ、６０ｌ～３００ｌ、６０ｌ～２００ｌ、６０ｌ～１００Ｌ、６０ｌ～９０ｌ、６０ｌ～８０ｌ、６０ｌ～７０ｌ、７０ｌ～１，０００ｌ、７０ｌ～９００ｌ、７０ｌ～８００ｌ、７０ｌ～７００ｌ、７０ｌ～６００ｌ、７０ｌ～５００ｌ、７０ｌ～４００ｌ、７０ｌ～３００ｌ、７０ｌ～２００ｌ、７０ｌ～１００ｌ、７０ｌ～９０ｌ、７０ｌ～８０ｌ、８０ｌ～１，０００ｌ、８０ｌ～９００ｌ、８０ｌ～８００ｌ、８０ｌ～７００ｌ、８０ｌ～６００ｌ、８０ｌ～５００ｌ、８０ｌ～４００ｌ、８０ｌ～３００ｌ、８０ｌ～２００ｌ、８０ｌ～１００ｌ、８０ｌ～９０ｌ、９０ｌ～１，０００ｌ、９０ｌ～９００ｌ、９０ｌ～８００ｌ、９０ｌ～７００ｌ、９０ｌ～６００ｌ、９０ｌ～５００ｌ、９０ｌ～４００ｌ、９０ｌ～３００ｌ、９０ｌ～２００ｌ、９０ｌ～１００ｌ、１００ｌ～１，０００ｌ、１００ｌ～９００ｌ、１００ｌ～８００ｌ、１００ｌ～７００ｌ、１００ｌ～６００ｌ、１００ｌ～５００ｌ、１００ｌ～４００ｌ、１００ｌ～３００ｌ、１００ｌ～２００ｌ、２００ｌ～１，０００ｌ、２００ｌ～９００ｌ、２００ｌ～８００ｌ、２００ｌ～７００ｌ、２００ｌ～６００ｌ、２００ｌ～５００ｌ、２００ｌ～４００ｌ、２００ｌ～３００ｌ、３００ｌ～１，０００ｌ、３００ｌ～９００ｌ、３００ｌ～８００ｌ、３００ｌ～７００ｌ、３００ｌ～６００ｌ、３００ｌ～５００ｌ、３００ｌ～４００ｌ、４００ｌ～１，０００ｌ、４００ｌ～９００ｌ、４００ｌ～８００ｌ、４００ｌ～７００ｌ、４００ｌ～６００ｌ、４００ｌ～５００ｌ、５００ｌ～１，０００ｌ、５００ｌ～９００ｌ、５００ｌ～８００ｌ、５００ｌ～７００ｌ、５００ｌ～６００ｌ、６００ｌ～１，０００ｌ、６００ｌ～９００ｌ、６００ｌ～８００ｌ、６００ｌ～７００ｌ、７００ｌ～１，０００ｌ、７００ｌ～９００ｌ、７００ｌ～８００ｌ、８００ｌ～１，０００ｌ、８００ｌ～９００ｌ、または９００ｌ～１，０００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、５０ｌの体積を有する。

【0143】

４．細胞増幅および刺激
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットをフィーダー細胞と共培養して、増幅および刺激されたＮＫ細胞を生産する。

【0144】

一部の実施形態において、共培養は、本願に記載の培養培地、例えば、培養培地の例＃１（表１）または培養培地の例＃２（表２）で行われる。

【0145】

一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、増幅する前に、総有核細胞を１×１０^７または約１×１０^７～１×１０^９または約１×１０^９個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、増幅する前に、総有核細胞を１×１０^８または約１×１０^８～１．５×１０^８または約１．５×１０^８個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、増幅する前に、総有核細胞を１×１０^８個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、増幅する前に、総有核細胞を約１×１０^８個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、増幅する前に、総有核細胞を１×１０^９個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、増幅する前に、総有核細胞を約１×１０^９個含む。

【0146】

一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットとフィーダー細胞との共培養に由来する細胞は回収および冷凍し、例えば、本願に記載の冷凍保存組成物中に回収および冷凍する。一部の実施形態において、共培養物に由来する冷凍細胞は、注入用－完成医薬品（ｉｎｆｕｓｉｏｎ－ｒｅａｄｙ ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ）である。一部の実施形態において、共培養物に由来する冷凍細胞は、注入用－完成医薬品を生産するための、例えば、本願に記載されているように、１つ以上の追加的な共培養段階により生産するためのマスター細胞バンク（ＭＣＢ）として用いられる。このため、例えば、ナチュラルキラー細胞供給源は、本願に記載されているように増幅および刺激して、注入用－完成医薬品への使用に適した増幅および刺激されたＮＫ細胞をいかなる中間産物も作らずに生産可能である。ナチュラルキラー細胞供給源はまた、本願に記載されているように増幅および刺激して、中間産物、例えば、１次マスター細胞バンク（ＭＣＢ）を生産することができる。１次ＭＣＢは、注入用－完成医薬品への使用に適した増幅および刺激されたＮＫ細胞を生産するか、または代案的に、他の中間産物、例えば、２次ＭＣＢを生産するのに用いることができる。２次ＭＣＢは、注入用－完成医薬品への使用に適した増幅および刺激されたＮＫ細胞を生産するか、または代案的に、他の中間産物、例えば、３次ＭＣＢなどを生産するのに用いることができる。

【0147】

一部の実施形態において、共培養物に接種されるフィーダー細胞：ナチュラルキラー細胞供給源またはＭＣＢ細胞の比率は、１：１または約１：１～４：１または約４：１である。一部の実施形態において、フィーダー細胞：ナチュラルキラー細胞供給源またはＭＣＢ細胞の比率は、１：１または約１：１～３．５：１または約３．５：１、１：１または約１：１～３：１または約３：１、１：１または約１：１～２．５：１または約２．５：１、１：１または約１：１～２：１または約２：１、１：１または約１：１～１．５または約１．５：１、１．５：１または約１．５：１～４：１または約４：１、１．５：１または約１．５：１～３．５：１または約３．５：１、１．５：１または約１．５：１～３：１または約３：１、１．５：１または約１．５：１～２．５：１または約２．５：１、１．５：１または約１．５：１～２：１または約２：１、２：１または約２：１～４：１または約４：１、２：１または約２：１～３．５：１または約３．５：１、２：１または約２：１～３：１または約３：１、２：１または約２：１～２．５：１または約２．５：１、２．５：１または約２．５：１～４：１または約４：１、２．５：１または約２．５：１～３．５：１または約３．５：１、２．５：１または約２．５：１～３：１または約３：１、３：１または約３：１～４：１または約４：１、３：１または約３：１～３．５：１または約３．５：１、または３．５：１または約３．５：１～４：１または約４：１である。一部の実施形態において、共培養物に接種されるフィーダー細胞：ナチュラルキラー細胞供給源またはＭＣＢ細胞の比率は、２．５：１である。一部の実施形態において、共培養物に接種されるフィーダー細胞：ナチュラルキラー細胞供給源またはＭＣＢ細胞の比率は、約２．５：１である。

【0148】

一部の実施形態において、共培養は、使い捨て培養バッグで、例えば、１ｌ使い捨て培養バッグで行われる。一部の実施形態において、共培養は、バイオリアクタで、例えば、５０ｌバイオリアクタで行われる。一部の実施形態において、１次接種した後、共培養物に培養培地を添加する。

【0149】

一部の実施形態において、共培養は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、またはそれより長期間行う。一部の実施形態において、共培養は、最大１６日間行う。

【0150】

一部の実施形態において、共培養は、３７℃または約３７℃で行われる。

【0151】

一部の実施形態において、共培養は、ｐＨ７．９または約ｐＨ７．９で行われる。

【0152】

一部の実施形態において、共培養は、５０％以上の溶存酸素（ＤＯ）レベルで行われる。

【0153】

一部の実施形態において、例示的な培養培地＃１（表１）は、ＭＣＢを生産するために使用され、培養培地＃２（表２）は、注入用－完成医薬品に適した細胞を生産するために使用される。

【0154】

一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットとフィーダー細胞との共培養で細胞、例えば、ＭＣＢ細胞または注入用－完成医薬品細胞５０×１０^８または約５０×１０^８～５０×１０^１２または約５０×１０^１２個が作られる。一部の実施形態において、このような増幅で細胞、例えば、ＭＣＢ細胞または注入用－完成医薬品細胞５０×１０^８または約５０×１０^８～２５×１０^１０または約２５×１０^１０、１０×１０^８または約１０×１０^８～１×１０^１０または約１×１０^１０、５０×１０^８または約５０×１０^８～７５×１０^９または約７５×１０^９、５０×１０^８または約５０×１０^８～５０×１０^９または約５０×１０^９、５０×１０^８または約５０×１０^８～２５×１０^９または約２５×１０^９、５０×１０^８または約５０×１０^８～１×１０^９または約１×１０^９、５０×１０^８または約５０×１０^８～７５×１０^８または約７５×１０^８、７５×１０^８または約７５×１０^８～５０×１０^１０または約５０×１０^１０、７５×１０^８または約７５×１０^８～２５×１０^１０または約２５×１０^１０、７５×１０^８または約７５×１０^８～１×１０^１０または約１×１０^１０、７５×１０^８または約７５×１０^８～７５×１０^９または約７５×１０^９、７５×１０^８または約７５×１０^８～５０×１０^９または約５０×１０^９、７５×１０^８または約７５×１０^８～２５×１０^９または約２５×１０^９、７５×１０^８または約７５×１０^８～１×１０^９または約１×１０^９、１×１０^９または約１×１０^９～５０×１０^１０または約５０×１０^１０、１×１０^９または約１×１０^９～２５×１０^１０または約２５×１０^１０、１×１０^９または約１×１０^９～１×１０^１０または約１×１０^１０、１×１０^９または約１×１０^９～７５×１０^９または約７５×１０^９、１×１０^９または約１×１０^９～５０×１０^９または約５０×１０^９、１×１０^９または約１×１０^９～２５×１０^９または約２５×１０^９、２５×１０^９または約２５×１０^９～５０×１０^１０または約５０×１０^１０、２５×１０^９または約２５×１０^９～２５×１０^１０または約２５×１０^１０、２５×１０^９または約２５×１０^９～１×１０^１０または約１×１０^１０、２５×１０^９または約２５×１０^９～７５×１０^９または約７５×１０^９、２５×１０^９または約２５×１０^９～５０×１０^９または約５０×１０^９、５０×１０^９または約５０×１０^９～５０×１０^１０または約５０×１０^１０、５０×１０^９または約５０×１０^９～２５×１０^１０または約２５×１０^１０、５０×１０^９または約５０×１０^９～１×１０^１０または約１×１０^１０、５０×１０^９または約５０×１０^９～７５×１０^９または約７５×１０^９、７５×１０^９または約７５×１０^９～５０×１０^１０または約５０×１０^１０、７５×１０^９または約７５×１０^９～２５×１０^１０または約２５×１０^１０、７５×１０^９または約７５×１０^９～１×１０^１０または約１×１０^１０、１×１０^１０または約１×１０^１０～５０×１０^１０または約５０×１０^１０、１×１０^１０または約１×１０^１０～２５×１０^１０または約２５×１０^１０、または２５×１０^１０または約２５×１０^１０～５０×１０^１０または約５０×１０^１０個が生産される。

【0155】

一部の実施形態において、増幅で、細胞、例えば、ＭＣＢ細胞または注入用－完成医薬品細胞をそれぞれ６億または約６億～１０億または約１０億個ずつ収容する、バイアル６０または約６０～１００または約１００個が作られる。一部の実施形態において、増幅で細胞、例えば、ＭＣＢ細胞または注入用－完成医薬品細胞をそれぞれ８億または約８億個含むか、またはそれらで構成された、バイアル８０または約８０個が生産される。

【0156】

一部の実施形態において、増幅は、ナチュラルキラー細胞供給源中の細胞、例えば、ＮＫ細胞の細胞数に対して細胞、例えば、ＭＣＢ細胞の細胞数を１００倍または約１００倍～５００倍または約５００倍増加させる。一部の実施形態において、増幅は、ナチュラルキラー細胞供給源中の細胞、例えば、ＮＫ細胞の細胞数に対して細胞数、例えば、ＭＣＢ細胞の細胞数を１００倍または約１００倍～５００倍または約５００倍、１００倍または約１００倍～４００倍または約４００倍、１００倍または約１００倍～３００倍または約３００倍、１００倍または約１００倍～２００倍または約２００倍、２００倍または約２００倍～４５０倍または約４５０倍、２００倍または約２００倍～４００倍または約４００倍、１００倍または約１００倍～３５０倍または約３５０倍、２００倍または約２００倍～３００倍または約３００倍、２００倍または約２００倍～２５０倍または約２５０倍、２５０倍または約２５０倍～５００倍または約５００倍、２５０倍または約２５０倍～４５０倍または約４５０倍、２００倍または約２００倍～４００倍または約４００倍、２５０倍または約２５０倍～３５０倍または約３５０倍、２５０倍または約２５０倍～３００倍または約３００倍、３００倍または約３００倍～５００倍または約５００倍、３００倍または約３００倍～４５０倍または約４５０倍、３００倍または約３００倍～４００倍または約４００倍、３００倍または約３００倍～３５０倍または約３５０倍、３５０倍または約３５０倍～５００倍または約５００倍、３５０倍または約３５０倍～４５０倍または約４５０倍、または３５０倍または約３５０倍～４００倍または約４００倍増加させる。

【0157】

一部の実施形態において、増幅は、ナチュラルキラー細胞供給源中の細胞、例えば、ＮＫ細胞の細胞数に対して細胞、例えば、ＭＣＢ細胞の細胞数を１００倍または約１００倍～７０，０００倍または約７０，０００倍増加させる。一部の実施形態において、増幅は、ナチュラルキラー細胞供給源中の細胞、例えば、ＮＫ細胞の細胞数に対して細胞、例えば、ＭＣＢ細胞の細胞数を少なくとも１０，０００倍、例えば、１５，０００倍、２０，０００倍、２５，０００倍、３０，０００倍、３５，０００倍、４０，０００倍、４５，０００倍、５０，０００倍、５５，０００倍、６０，０００倍、６５，０００倍または７０，０００倍増加させる。

【0158】

一部の実施形態において、ＭＣＢ細胞とフィーダー細胞との共培養は、細胞を、例えば、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適したＮＫ細胞を５億または約５億～１５億または約１５億個生産する。一部の実施形態において、ＭＣＢ細胞とフィーダー細胞との共培養は、細胞を、例えば、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適したＮＫ細胞を５億または約５億～１５億または約１５億、５億または約５億～１２億５千または約１２億５千、５億または約５億～１０億または約１０億、５億または約５億～７億５千または約７億５千、７億５千または約７億５千～１５億または約１５億、５億または約５億～１２億５千または約１２億５千、７億５千または約７億５千～１０億または約１０億、１０億または約１０億～１５億または約１５億、１０億または約１０億～１２億５千または約１２億５千、または１２億５千または約１２億５千～１５億または約１５億個生産する。

【0159】

一部の実施形態において、ＭＣＢ細胞とフィーダー細胞との共培養は、細胞を、例えば、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適したＮＫ細胞をそれぞれ７億５千または約７億５千～１２億５千または約１２億５千個ずつ含む、細胞、例えば、注入型－完成医薬品細胞のバイアルを５０または約５０～１５０または約１５０個生産する。一部の実施形態において、ＭＣＢ細胞とフィーダー細胞との共培養は、細胞を、例えば、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適したＮＫ細胞をそれぞれ１０億または約１０億個含むか、またはそれらで構成された、バイアル１００個または約１００個を生産する。

【0160】

一部の実施形態において、増幅は、初期ＭＣＢ細胞数と比較して、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適した細胞数、例えば、ＮＫ細胞数を１００倍または約１００倍～５００倍または約５００倍増加させる。一部の実施形態において、増幅は、初期ＭＣＢ細胞数と比較して、細胞数を、例えば、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適したＮＫ細胞の細胞数を１００倍または約１００倍～５００倍または約５００倍、１００倍または約１００倍～４００倍または約４００倍、１００倍または約１００倍～３００倍または約３００倍、１００倍または約１００倍～２００倍または約２００倍、２００倍または約２００倍～４５０倍または約４５０倍、２００倍または約２００倍～４００倍または約４００倍、１００倍または約１００倍～３５０倍または約３５０倍、２００倍または約２００倍～３００倍または約３００倍、２００倍または約２００倍～２５０倍または約２５０倍、２５０倍または約２５０倍～５００倍または約５００倍、２５０倍または約２５０倍～４５０倍または約４５０倍、２００倍または約２００倍～４００倍または約４００倍、２５０倍または約２５０倍～３５０倍または約３５０倍、２５０倍または約２５０倍～３００倍または約３００倍、３００倍または約３００倍～５００倍または約５００倍、３００倍または約３００倍～４５０倍または約４５０倍、３００倍または約３００倍～４００倍または約４００倍、３００倍または約３００倍～３５０倍または約３５０倍、３５０倍または約３５０倍～５００倍または約５００倍、３５０倍または約３５０倍～４５０倍または約４５０倍、３５０倍または約３５０倍～４００倍または約４００倍増加させる。

【0161】

一部の実施形態において、増幅は、初期ＭＣＢ細胞数と比較して、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適した細胞数、例えば、ＮＫ細胞数を１００倍または約１００倍～７０，０００倍または約７０，０００倍増加させる。一部の実施形態において、増幅は、初期ＭＣＢ細胞数と比較して、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適した細胞数、例えば、ＮＫ細胞数を少なくとも１０，０００倍、例えば、１５，０００倍、２０，０００倍、２５，０００倍、３０，０００倍、３５，０００倍、４０，０００倍、４５，０００倍、５０，０００倍、５５，０００倍、６０，０００倍、６５，０００倍または７０，０００倍増加させる。

【0162】

本願に記載されているように増幅および刺激中に細胞を操作する実施形態において、増幅および刺激されたすべての細胞が必ずしもうまく操作されるわけではなく、例えば、うまく形質導入されるわけではなく、例えば、異種のタンパク質、例えば、本願に記載されているように、ＣＡＲおよび／またはＩＬ－１５を含む異種のタンパク質を含むベクターでうまく形質導入されたわけではない。このため、本願に記載の方法は、操作された細胞、例えば、本願に記載の操作された細胞を非－操作細胞から分類することを追加的に含むことができる。

【0163】

一部の実施形態において、操作された細胞、例えば、形質導入された細胞は、操作された細胞の抗原に特異的な試薬、例えば、操作された細胞の抗原を標的化するが、非－操作細胞を標的化しない抗体を用いて、非－操作細胞、例えば、非－形質導入細胞から分類する。一部の実施形態において、操作された細胞の抗原は、ＣＡＲの構成成分、例えば、本願に記載のＣＡＲの構成成分である。

【0164】

細胞を抗原に基づいて細胞分離するためのシステムは、商業的に入手可能であり、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ^（Ｒ）分類システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）がある。

【0165】

一部の実施形態において、操作された細胞、例えば、形質導入された細胞は、フローサイトメトリー測定を用いて非－操作細胞、例えば、非－形質導入細胞から分類する。

【0166】

一部の実施形態において、分類した操作された細胞は、ＭＣＢとして用いられる。一部の実施形態において、分類した操作された細胞は、注入用－完成医薬品の構成成分として用いられる。

【0167】

一部の実施形態において、操作された細胞、例えば、形質導入された細胞は、微細流体細胞の分類方法を用いて非－操作細胞、例えば、非－形質導入細胞から分類する。微細流体細胞の分類方法は、例えば、Ｄａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｓｏｒｔｉｎｇ，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」，Ａｎａｌｙｓｔ１４４：８７（２０１９）に言及されている。

【0168】

一部の実施形態において、増幅および刺激された細胞の１％または約１％～９９％または約９９％がうまく操作され、例えば、うまく形質導入され、例えば、異種のタンパク質、例えば、本願に記載されているように、ＣＡＲおよび／またはＩＬ－１５を含む異種のタンパク質を含むベクターでうまく形質導入される。一部の実施形態において、増幅および刺激された細胞の１％または約１％～９０％または約９０％、１％または約１％～８０％または約８０％、１％または約１％～７０％または約７０％、１％または約１％～６０％または約６０％、１％または約１％～５０％または約５０％、１％または約１％～４０％または約４０％、１％または約１％～３０％または約３０％、１％または約１％～２０％または約２０％、１％または約１％～１０％または約１０％、１％または約１％～５％または約５％、５％または約５％～９９％または約９９％、５％または約５％～９０％または約９０％、５％または約５％～８０％または約８０％、５％または約５％～７０％または約７０％、５％または約５％～６０％または約６０％、５％または約５％～５０％または約５０％、５％または約５％～４０％または約４０％、５％または約５％～３０％または約３０％、５％または約５％～２０％または約２０％、５％または約５％～１０％または約１０％、１０％または約１０％～９９％または約９９％、１０％または約１０％～９０％または約９０％、１０％または約１０％～８０％または約８０％、１０％または約１０％～７０％または約７０％、１０％または約１０％～６０％または約６０％、１０％または約１０％～５０％または約５０％、１０％または約１０％～４０％または約４０％、１０％または約１０％～３０％または約３０％、１０％または約１０％～２０％または約２０％、２０％または約２０％～９９％または約９９％、２０％または約２０％～９０％または約９０％、２０％または約２０％～８０％または約８０％、２０％または約２０％～７０％または約７０％、２０％または約２０％～６０％または約６０％、２０％または約２０％～５０％または約５０％、２０％または約２０％～４０％または約４０％、２０％または約２０％～３０％または約３０％、３０％または約３０％～９９％または約９９％、３０％または約３０％～９０％または約９０％、３０％または約３０％～８０％または約８０％、３０％または約３０％～７０％または約７０％、３０％または約３０％～６０％または約６０％、３０％または約３０％～５０％または約５０％、３０％または約３０％～４０％または約４０％、４０％または約４０％～９９％または約９９％、４０％または約４０％～９０％または約９０％、４０％または約４０％～８０％または約８０％、４０％または約４０％～７０％または約７０％、４０％または約４０％～７０％または約７０％、４０％または約４０％～６０％または約６０％、４０％または約４０％～５０％または約５０％、５０％または約５０％～９９％または約９９％、５０％または約５０％～９０％または約９０％、５０％または約５０％～８０％または約８０％、５０％または約５０％～７０％または約７０％、５０％または約５０％～６０％または約６０％、６０％または約６０％～９９％または約９９％、６０％または約６０％～９０％または約９０％、６０％または約６０％～８０％または約８０％、６０％または約６０％～７０％または約７０％、７０％または約７０％～９９％または約９９％、７０％または約７０％～９０％または約９０％、７０％または約７０％～８０％または約８０％、８０％または約８０％～９９％または約９９％、８０％または約８０％～９０％または約９０％または９０％または約９０％～９９％または約９９％がうまく操作され、例えば、うまく形質導入され、例えば、異種のタンパク質、例えば、本願に記載されているように、ＣＡＲおよび／またはＩＬ－１５を含む異種のタンパク質を含むベクターでうまく形質導入される。

【0169】

一部の実施形態において、１次ＭＣＢまたは２次ＭＣＢの冷凍細胞を解凍して培養する。一部の実施形態において、１次ＭＣＢまたは２次ＭＣＢの１つの冷凍細胞バイアル、例えば、細胞、例えば、１次ＭＣＢまたは２次ＭＣＢ細胞を８億または約８億個ずつ含む１つのバイアルを解凍して培養する。一部の実施形態において、冷凍した１次または２次ＭＣＢ細胞は、追加的なフィーダー細胞とともに培養して、２次または３次ＭＣＢとしてまたは注入型－完成医薬品への使用に適した細胞を生産する。一部の実施形態において、１次または２次ＭＣＢの共培養物から細胞を回収して冷凍する。

【0170】

一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、１次ＭＣＢまたは２次ＭＣＢの共培養物から細胞を回収し、冷凍保存組成物、例えば、本願に記載の冷凍保存組成物中に冷凍する。一部の実施形態において、細胞は、収穫した後に洗浄する。すなわち、本発明は、活性化および刺激されたＮＫ細胞を含む、例えば、本願に記載の方法により生産された活性化および刺激されたＮＫ細胞を含む、例えば、本願に記載の方法により生産された収獲および洗浄した活性化および刺激されたＮＫ細胞を含む、薬学的組成物、および冷凍保存組成物、例えば、本願に記載の冷凍保存組成物を提供する。

【0171】

一部の実施形態において、細胞は、冷凍保存組成物と、例えば、本願に記載されているように、冷凍する前に、混合する。一部の実施形態において、細胞は、クライオバッグ（ｃｒｙｏｂａｇ）で冷凍する。一部の実施形態において、細胞は、クライオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）で冷凍する。

【0172】

一部の実施形態において、本方法は、増幅および刺激したＮＫ細胞の集団からＮＫ細胞を単離することを追加的に含む。

【0173】

ＮＫ細胞を増幅および刺激する工程の一例を図１に示す。

【0174】

５．操作
一部の実施形態において、本方法は、ＮＫ細胞を、例えば、異種のタンパク質、例えば、本願に記載の異種のタンパク質、例えば、ＣＡＲおよび／またはＩＬ－１５を含む異種のタンパク質を発現するように操作することを追加的に含む。

【0175】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞を本願に記載の異種のタンパク質を発現するように操作することは、ＮＫ細胞を本願に記載の異種のタンパク質を暗号化するポリ核酸を含むベクターで形質転換、例えば、安定的に形質転換することを含む。適切なベクターは本願に記載される。

【0176】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞を本願に記載の異種のタンパク質を発現するように操作することは、異種のタンパク質を遺伝子編集（例、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集、ＡＲＣＵＳ遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集またはｍｅｇａＴＡＬ遺伝子編集）によりアデノ－随伴ウイルス（ＡＡＶ）技術と組み合わせて導入することを含む。

【0177】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、本願に記載の異種のタンパク質を発現するように、例えば、フィーダー細胞を含む培地で組成物を培養する間、または培養した後に、操作される。

【0178】

一部の実施形態において、本方法は、ＮＫ細胞を、例えば、遺伝子または遺伝子産物を発現するか、過剰発現、ノックアウトまたはノックダウンするように操作することを追加的に含む。

【0179】

一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、遺伝子操作されていない。

【0180】

Ａ．増幅および刺激されたＮＫ細胞の特性
例えば、本願に記載されているように、生体外増幅および刺激した後、増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団は、人体で自然的に生じ得ない数／密度（例、前述の通り）を有するだけでなく、その表現型特徴（例、遺伝子発現および／または表面タンパク質発現）も出発供給物質またはその他のＮＫ細胞の自然生成集団とは異なる。

【0181】

場合によっては、出発ＮＫ細胞供給源は、ただ１つの個体、例えば、生体外増幅しない単一の臍帯血ユニットに由来するサンプルである。このため、場合によっては、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、共通系統を共有し、すなわち、これらがすべて出発ＮＫ細胞供給源の増幅から生成され、よって、それ自体が単一有機体に由来する細胞集団のクローン増幅により遺伝子型を共有する。しかし、これらの細胞は、自然的には生体外増幅で達成される密度で発生できず、また、出発ＮＫ細胞供給源とは表現型特徴に差が存在する。

【0182】

場合によっては、増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団は、増幅されたナチュラルキラー細胞を少なくとも１億、例えば、２億、２億５千万、３億、４億、５億、６億、７億、７億５千万、８億、９億、１０億、２０億、３０億、４０億、５０億、６０億、７０億、８０億、９０億、１００億、１５０億、２００億、２５０億、５００億、７５０億、８００億、９００億、１０００億、２０００億、２５００億、３０００億、４０００億、５０００億、６０００億、７０００億、８０００億、９０００億、１兆、２兆、３兆、４兆、５兆、６兆、７兆、８兆、９兆または１０兆個含む。

【0183】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３－細胞を少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む。

【0184】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、遺伝子操作されていない。

【0185】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＤ１６トランス遺伝子を含まない。

【0186】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、外因性ＣＤ１６タンパク質を発現しない。

【0187】

増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、表面発現を、例えば、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ３８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ－１およびＮＫｐ４４のうちの１以上の表面発現を特徴とする。

【0188】

本願で言及される表面タンパク質の発現レベルは、場合によっては、言及された特定のタンパク質に対して陽性選別しなくても、達成される。例えば、場合によっては、ＮＫ細胞供給源、例えば、単一臍帯血ユニットは、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子およびＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体を両方とも含み、例えば、ＣＤ５６＋ＣＤ３－発現に対してゲーティングすることにより、ＣＤ５６＋濃縮およびＣＤ３（＋）枯渇処理されるが、増幅および刺激を行う間に他の表面タンパク質発現に対する選別は行わない。

【0189】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む。

【0190】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＮＫｐ４６＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む。

【0191】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＮＫｐ３０＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む。

【0192】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＤＮＡＭ－１＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む。

【0193】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＮＫｐ４４＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む。

【0194】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＤ９４＋（ＫＬＲＤ１）細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む。

【0195】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＤ３＋細胞を２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％含む。

【0196】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＤ１４＋細胞を２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％含む。

【0197】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＤ１９＋細胞を２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％含む。

【0198】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＸＣＲ＋細胞を２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％含む。

【0199】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＤ１２２＋（ＩＬ２ＲＢ）細胞を２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％含む。

【0200】

本願に記載されているように、本発明者らは、驚くべきことに、本願に記載の方法により増幅および刺激したＮＫ細胞が増幅および刺激工程によりＣＤ１６を高いレベルに発現して、ＣＤ１６発現レベルが高い細胞集団が構築されることを知るようになった。ＣＤ１６の高い発現性は、増幅された細胞がＡＤＣＣを開示するのに重要なＣＤ１６を発現するように操作する必要性を省き、これは本願に記載の増幅および刺激方法の驚くべき予想外の利点である。このため、一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞を５０％以上、例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％含む。

【0201】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子およびＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体を両方とも含み、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞を５０％以上、例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％含む。

【0202】

一部の実施形態において、ＣＤ１６を発現する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。

【0203】

一部の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを発現する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。

【0204】

一部の実施形態において、ＮＫｐ３０を発現する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。

【0205】

一部の実施形態において、ＤＮＡＭ－１を発現する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。

【0206】

一部の実施形態において、ＮＫｐ４４を発現する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。

【0207】

一部の実施形態において、ＮＫｐ４６を発現する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。

【0208】

本願に記載されているように、本発明者らは、驚くべきことに、本願に記載の方法により増幅および刺激されたＮＫ細胞がＣＤ３８を低いレベルに発現するということを知るようになった。ＣＤ３８は、特定の癌療法で（例えば、多発性骨髄腫および急性骨髄性白血病）有効な標的である。例えば、Ｊｉａｏ ｅｔ ａｌ．，「ＣＤ３８：Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｃａｎｃｅｒｒｓ」，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ２９（１１）：１２９５－１３０８（２０２０）を参照する。しかし、ダラツムマブのような抗－ＣＤ３８抗体をＮＫ細胞とともに投与する場合、ＮＫ細胞が天然的にＣＤ３８を発現するので、フラトリサイド（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）が増加する危険が存在する。しかし、本願に記載の方法により増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＤ３８を低いレベルに発現するので、よって、予想されるフラトリサイドが解消する。他のグループでは、ＣＤ３８発現を低下させるためにゲノム編集のような操作方法に依存していたが（例、Ｇｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，「ＣＤ３８ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＣＤ３８ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｕｔｅ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｗｉｔｈ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ」，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ｄｏｉ：１０．３３２４／ｈａｅｍａｔｏｌ．２０２０．２７１９０８（２０２０）参照）、本願に記載の方法により増幅および刺激されたＮＫ細胞は、遺伝子操作しなくてもＣＤ３８を低いレベルに発現するので、本願に記載されているように増幅および刺激されたＮＫ細胞を、例えば、ダラツムマブのようなＣＤ３８抗体と組み合わせて用いて、例えば、ＣＤ３８＋癌を治療するのに驚くべき予想外の利点を提供する。

【0209】

このため、一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＤ３８＋細胞を８０％以下で、例えば、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下または２０％以下でＣＤ３８＋細胞を含む。

【0210】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子およびＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体を両方とも含み、８０％以下でＣＤ３８＋細胞を、例えば、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下または２０％以下でＣＤ３８＋細胞を含む。

【0211】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子およびＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体を両方とも含み、ＣＤ３８＋細胞を８０％以下で、例えば、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下または２０％以下で、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞を５０％以上、例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％含む。

【0212】

一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子およびＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体を両方とも含み、以下を含む：ｉ）５０％以上、例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のＣＤ１６＋ＮＫ細胞；および／またはｉｉ）８０％以下のＣＤ３８＋細胞、例えば、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下または２０％以下のＣＤ３８＋細胞；および／またはｉｉｉ）少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のＮＫＧ２Ｄ＋細胞；および／またはｉｖ）少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のＮＫｐ４６＋細胞；および／またはｖ）少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のＮＫｐ３０＋細胞；および／またはｖｉ）少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のＤＮＡＭ－１＋細胞；および／またはｖｉｉ）少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のＮＫｐ４４＋細胞；および／またはｖｉｉｉ）少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のＣＤ９４＋（ＫＬＲＤ１）細胞；および／またはｉｘ）２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％のＣＤ３＋細胞；および／またはｘ）２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％のＣＤ１４＋細胞；および／またはｘｉ）２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％のＣＤ１９＋細胞；および／またはｘｉｉ）２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％のＣＸＣＲ＋細胞；および／またはｘｉｉｉ）２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％のＣＤ１２２＋（ＩＬ２ＲＢ）細胞。

【0213】

一部の実施形態において、フィーダー細胞の残留シグネチャー（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）が、例えば、残留細胞の存在によって（例えば、特定の表面タンパク質を発現する細胞を検出することにより）またはフィーダー細胞によって発現した残留核酸および／またはタンパク質によって検出されてもよいが、フィーダー細胞が増幅および刺激されたＮＫ細胞に存続するものではない。

【0214】

例えば、場合によっては、本願に記載の方法は、操作されたフィーダー細胞、例えば、ナチュラルキラー細胞などのナチュラルキラー細胞供給源中の細胞によって発現しない配列を発現するように操作された、前述のｅＨｕＴ－７８フィーダー細胞を用いて、ナチュラルキラー細胞を増幅および刺激することを含む。例えば、操作されたフィーダー細胞は、４－１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ４１２７３、配列番号１）、膜－結合型ＩＬ－２１（配列番号２）および突然変異ＴＮＦα（配列番号３）（「ｅＨｕｔ－７８細胞」）、またはこれらの変異体からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を発現するように操作できる。

【0215】

これらのフィーダー細胞が増幅および刺激されたＮＫ細胞で存続しなくてもよいが、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、フィーダー細胞に由来する細胞、タンパク質および／または核酸を検出可能な残留量で保有することができる。したがって、増幅および刺激されたＮＫ細胞においてこのような残留物の存在は、例えば、細胞自体（例えば、フローサイトメトリー測定によって）、これらの細胞によって発現したタンパク質、および／またはこれらの細胞によって発現した核酸を検出することにより、検出することができる。

【0216】

このため、本発明はまた、残留フィーダー細胞（生存細胞または死滅細胞）または残留フィーダー細胞の細胞性不純物（例えば、残留フィーダー細胞のタンパク質またはその一部、および／または核酸のような遺伝物質またはその一部）を含む増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団を記載する。場合によっては、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、残留フィーダー細胞、例えば、ｅＨｕＴ－７８フィーダー細胞を０％より高くかつ０．３％以下のレベルで含む。

【0217】

場合によっては、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、残留４－１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ４１２７３、配列番号１）、膜－結合型ＩＬ－２１（配列番号２）、および／または突然変異ＴＮＦα（配列番号３）、またはこれらの一部を暗号化する残留フィーダー細胞を含む。場合によっては、膜－結合型ＩＬ－２１は、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む。

【0218】

場合によっては、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、サンプルにおいてフィーダー細胞特異的なタンパク質または核酸配列（すなわち、ナチュラルキラー細胞によって発現しないタンパク質または核酸配列）の相対的な比率によって、例えば、ｑＰＣＲによって、例えば、本願に記載されているように測定したことによって、０％超過および０．２％以下のフィーダー細胞の残留率％を含む。

【0219】

一部の実施形態において、残留フィーダー細胞は、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞である。一部の実施形態において、残留フィーダー細胞は、操作されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞である。一部の実施形態において、残留フィーダー細胞は、４－１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ４１２７３、配列番号１）、膜－結合型ＩＬ－２１（配列番号２）および突然変異ＴＮＦα（配列番号３）（「ｅＨｕｔ－７８細胞」）、またはこれらの変異体からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を発現するように操作されたものである。このため、場合によっては、フィーダー細胞特異的なタンパク質は、４－１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ４１２７３、配列番号１）、膜－結合型ＩＬ－２１（配列番号２）および／または突然変異ＴＮＦα（配列番号３）である。したがって、フィーダー細胞特異的な核酸は、４－１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ４１２７３、配列番号１）、膜－結合型ＩＬ－２１（配列番号２）および／または突然変異ＴＮＦα（配列番号３）、またはその一部を暗号化する核酸である。場合によっては、膜－結合型ＩＬ－２１は、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む。

【0220】

非常に多様な種々の方法を用いて、生物学的サンプルにおいて核酸またはタンパク質遺伝子産物の存在を分析および検出することができる。本願に使用されているように、「検出」は、化合物および／または基質（例、細胞、タンパク質および／または核酸）の共存または存在を発見、確認または検証するために使用する方法を指すことができる。一部の実施形態において、検出方法を用いてタンパク質を検出することができる。一部の実施形態において、検出は、化学発光または蛍光手法を含むことができる。一部の実施形態において、検出は、抗体を用いてタンパク質全体またはタンパク質の特異的なエピトープと特異的に反応する免疫学に基づく方法（例えば、定量的酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティングまたはドットブロッティング）を含むことができる。一部の実施形態において、検出は、タンパク質の免疫沈降を含むことができる（Ｊｕｎｇｂｌｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１；４１（２－３）：１１１－２０（１９９５）；Ｆｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｍｏｒｐｈｏｌ．３９（１）：３－２５（２００１））。一部の実施形態において、検出方法を用いて核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を検出することができる。一部の実施形態において、検出は、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼ保護分析（ｎｕｃｌｅａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ、ＮＰＡ）、インサイチュー混成化または逆転写－重合酵素連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を含むことができる（Ｒａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ５，８７７－８７９（２００８）；Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ａｎａｌ．１１（１）：２－９（１９９７）；Ａｈｍｅｄ，Ｊ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｓｃｉ Ｈｅａｌｔｈ Ｃ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｃａｒｃｉｎｏｇ Ｅｃｏｔｏｘｉｃｏｌ Ｒｅｖ．２０（２）：７７－１１６（２００２））。

【0221】

このため、本発明はまた、操作されたフィーダー細胞、例えば、本願に記載のｅＨｕＴ－７８フィーダー細胞と共培養した、増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団、例えば、本願に記載の方法を用いて増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団を検出する方法を記載する。

【0222】

ＩＩ．ナチュラルキラー細胞の操作
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、ＣＡＲ－ＮＫおよび／またはＩＬ－１５を発現するＮＫを生産するように操作される。

【0223】

一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、増幅および刺激する間に、例えば、本願に記載の増幅および刺激する間に操作、例えば、形質導入される。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、増幅および刺激する間に、例えば、本願に記載されているように、ＭＣＢを生産する間に、操作される。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、増幅および刺激する間に、例えば、注射用－完成医薬品への使用に適したＮＫ細胞を生産する間に、および／または前述のようにＭＣＢを生産する間に、操作される。このため、一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、宿主細胞であり、本発明は、異種のタンパク質、例えば、前述のような異種のタンパク質を発現するＮＫ宿主細胞を提供する。

【0224】

一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、増幅および刺激する前に操作される。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、増幅および刺激した後に操作される。

【0225】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、ベクターを用いた形質導入によって操作される。好適なベクターは本願に記載されており、例えば、レンチウイルスベクター、例えば、異種のタンパク質、例えば、本願に記載の異種のタンパク質を含むレンチウイルスベクターがある。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、本願に記載されているように、第１ＭＣＢを生産する間に形質導入される。

【0226】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）１または約１～４０または約４０ウイルス粒子数／細胞で形質導入される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１または約１、５または約５、１０または約１０、１５または約１５、２０または約２０、２５または約２５、３０または約３０、３５または約３５、または４０または約４０ウイルス粒子数／細胞の感染多重度で形質導入される。

【0227】

Ａ．キメラ抗原受容体
一部の実施形態において、異種のタンパク質は、融合タンパク質であり、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む融合タンパク質は、ＮＫ細胞に、例えば、増幅および刺激工程中に導入される。

【0228】

一部の実施形態において、ＣＡＲは、以下の１つ以上を含む：シグナル配列、細胞外ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、および１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン配列。一部の実施形態において、ＣＡＲは、スペーサー配列を追加的に含む。

【0229】

一部の実施形態において、ＣＡＲは、（Ｎ－末端からＣ－末端方向に）シグナル配列、細胞外ドメイン、ヒンジ、スペーサー、膜貫通ドメイン、第１シグナル伝達ドメイン配列、第２シグナル伝達ドメイン配列および第３シグナル伝達ドメイン配列を含む。

【0230】

一部の実施形態において、ＣＡＲは、（Ｎ－末端からＣ－末端方向に）シグナル配列、細胞外ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、第１シグナル伝達ドメイン配列、第２シグナル伝達ドメイン配列および第３シグナル伝達ドメイン配列を含む。

【0231】

一部の実施形態において、細胞外ドメインは、抗体またはその抗原－結合部分を含む。

【0232】

一部の実施形態において、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン配列は、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達配列である。一部の実施形態において、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達配列は、配列番号５を含むか、または配列番号５で構成される。

【0233】

一部の実施形態において、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン配列は、ＯＸ４０Ｌシグナル伝達配列である。一部の実施形態において、ＯＸ４０Ｌシグナル伝達配列は、配列番号８を含むか、または配列番号８で構成される。

【0234】

一部の実施形態において、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン配列は、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン配列である。一部の実施形態において、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列は、配列番号１１を含むか、または配列番号１１で構成される。

【0235】

一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達配列（配列番号５）、ＯＸ４０Ｌ細胞内シグナル伝達配列（配列番号８）およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列（配列番号１１）を含む。

【0236】

一部の実施形態において、ＣＡＲは、配列番号１９を含むか、または配列番号１９で構成された細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

【0237】

一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＯＸ４０Ｌ細胞内シグナル伝達ドメイン配列を含まない。

【0238】

一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達配列（配列番号５）とＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列（配列番号１１）を含むが、ＯＸ４０Ｌ細胞内シグナル伝達ドメイン配列は含まない。

【0239】

Ｂ．ＩＬ－１５
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５、例えば、ヒトＩＬ－１５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ＃Ｐ４０９３３；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ＃３６００）、例えば、溶解性ヒトＩＬ－１５またはそのオルソログ、または前述の任意のものの変異体を発現するように操作される。一部の実施形態において、ＩＬ－１５は、切断部位を追加的に含む融合タンパク質の一部として発現する。一部の実施形態において、ＩＬ－１５は、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列部位（時々、自己－切断部位と言及される）を含むポリタンパク質の一部として発現する。

【0240】

一部の実施形態において、ＩＬ－１５は、配列番号１６を含むか、またはそれで構成される。

【0241】

一部の実施形態において、Ｔ２Ａ切断部は、配列番号１４を含むか、または配列番号１４で構成される。

【0242】

一部の実施形態において、ＩＬ－１５は、ＣＡＲ、例えば、本願に記載のＣＡＲを含む融合タンパク質の一部として発現する。

【0243】

一部の実施形態において、融合タンパク質は、（Ｎ－末端からＣ－末端方向に）ＣＡＲ、切断部位およびＩＬ－１５を含む。

【0244】

一部の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号２０を含む。

【0245】

Ｃ．阻害性受容体
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１つ以上の阻害性受容体遺伝子の発現を変更するように、例えば、低下させるように操作される。

【0246】

一部の実施形態において、阻害性受容体遺伝子は、ＨＬＡ－特異的な阻害性受容体である。一部の実施形態において、阻害性受容体遺伝子は、ＨＬＡ－非特異的な阻害性受容体である。

【0247】

一部の実施形態において、阻害性受容体遺伝子は、ＫＩＲ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＬＩＬＲＢ１、ＰＤ－１、ＩＲｐ６０、Ｓｉｇｌｅｃ－７、ＬＡＩＲ－１、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。

【0248】

Ｄ．ポリ核酸、ベクターおよび宿主細胞
また、本発明は、融合タンパク質またはその一部を暗号化するポリ核酸、例えば、本願に提供された配列の表に示しているように、本願に記載のポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド配列を提供する。

【0249】

さらに、本発明は、ポリ核酸を含むベクター、およびこのようなベクターを含む細胞、例えば、ＮＫ細胞を提供する。

【0250】

一部の実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ」，Ｌｅｕｋｅｍｉａ３２：１５２９－４１（２０１８）を参照する。一部の実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ガンマレトロウイルスベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、非－ウイルス性ベクター、例えば、ピギーバック非－ウイルスベクター（ＰＢトランスポゾン、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，「ｐｉｇｇｙｂａｃｋ ｉｓ ａ Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｎｄ Ｈｉｇｈｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ａｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ，Ｔｏｌ２，ａｎｄ Ｍｏｓ１ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」，ＰＮＡＳ１０３（４１）：１５００８－１３（２００６））、スリーピングビューティー非－ウイルス性ベクター（ＳＢ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ、例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｇｏｉｎｇ Ｎｏｎ－Ｖｉｒａｌ：ｔｈｅ Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｒｅａｋｓ ｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｄｅ」，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ５２（４）：３５５－３８０（２０１７）参照）、またはｍＲＮＡベクターである。

【0251】

ＩＩＩ．冷凍保存
Ａ．冷凍保存組成物
本発明は、冷凍保存組成物、例えば、静脈内投与に、例えば、ＮＫ細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞を静脈内投与するのに適した冷凍保存組成物を提供する。一部の実施形態において、薬学的組成物は、冷凍保存組成物および細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞を含む。

【0252】

１．アルブミン

【0253】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、アルブミンタンパク質、例えば、ヒトアルブミンタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｐ０２７８、配列番号２１）、またはその変異体を含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、アルブミンタンパク質、例えば、ヒトアルブミンタンパク質のオルソログ、またはその変異体を含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、アルブミンタンパク質、例えば、ヒトアルブミンの生物学的活性部分、またはその変異体を含む。

【0254】

一部の実施形態において、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンは、溶液として提供され、これはまた、本願においてアルブミン溶液またはヒトアルブミン溶液と称される。このため、一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、アルブミン溶液、例えば、ヒトアルブミン溶液であるか、またはこれを含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、無血清アルブミン溶液である。

【0255】

一部の実施形態において、アルブミン溶液は、静脈内使用に適合する。

【0256】

一部の実施形態において、アルブミン溶液は、アルブミンを４０または約４０～２００または約２００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを４０または約４０～５０または約５０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを約２００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを２００ｇ／ｌ含む。

【0257】

一部の実施形態において、アルブミン溶液は、９５％以上がアルブミンタンパク質、例えば、ヒトアルブミンタンパク質であるタンパク質組成物を含む。一部の実施形態において、タンパク質の９６％、９７％、９８％または９９％またはそれ以上がアルブミン、例えば、ヒトアルブミンである。

【0258】

一部の実施形態において、アルブミン溶液は、ソジウムを追加的に含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、ソジウムを１００または約１００～２００または約２００ｍｍｏｌ含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、ソジウムを１３０または約１３０～１６０または約１６０ｍｍｏｌ含む。

【0259】

一部の実施形態において、アルブミン溶液は、ポタシウムを追加的に含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、ポタシウムを３ｍｍｏｌ以下含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、ポタシウムを２ｍｍｏｌ以下で追加的に含む。

【0260】

一部の実施形態において、アルブミン溶液は、１つ以上の安定化剤を追加的に含む。一部の実施形態において、安定化剤は、ソジウムカプリレート、カプリル酸、（２Ｓ）－２－アセトアミド－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸（本願においてまた、次のように称される：アセチルトリプトファン、Ｎ－アセチル－Ｌ－トリプトファンおよびアセチル－Ｌ－トリプトファン）、２－アセトアミド－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸（また、次のように称される：Ｎ－アセチルトリプトファン、ＤＬ－アセチルトリプトファンおよびＮ－アセチル－ＤＬ－トリプトファン）からなる群より選択される。一部の実施形態において、溶液は、溶液中のタンパク質１ｇあたり、１つ以上の安定化剤をそれぞれ０．１ｍｍｏｌ未満で含む。一部の実施形態において、溶液中のタンパク質１ｇあたり、安定化剤をそれぞれ０．０５または約０．０５～０．１または約０．１、例えば、０．０６４または約０．０６４～０．０９６または約０．０９６ｍｍｏｌ含む。一部の実施形態において、溶液は、溶液中のタンパク質１ｇあたり、全体安定化剤を０．１ｍｍｏｌ未満で含む。一部の実施形態において、溶液は、溶液中のタンパク質１ｇあたり、全体安定化剤を０．０５または約０．０５～０．１または約０．１、例えば、０．０６４または約０．０６４～０．０９６または約０．０９６ｍｍｏｌ含む。

【0261】

一部の実施形態において、アルブミン溶液は、水中の、アルブミンタンパク質が９５％以上のタンパク質組成物、ソジウム、ポタシウムおよびソジウムカプリレート、カプリル酸、（２Ｓ）－２－アセトアミド－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸（本願においてまた、次のように称される：アセチルトリプトファン、Ｎ－アセチル－Ｌ－トリプトファンおよびアセチル－Ｌ－トリプトファン）、２－アセトアミド－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸（また、次のように称される：Ｎ－アセチルトリプトファン、ＤＬ－アセチルトリプトファンおよびＮ－アセチル－ＤＬ－トリプトファン）からなる群より選択される１つ以上の安定化剤で構成される。

【0262】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、アルブミン溶液、例えば、本願に記載のアルブミン溶液を１０％ｖ／ｖまたは約１０％ｖ／ｖ～５０％または約５０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、１０％または約１０％～５０％または約５０％、１０％または約１０％～４５％または約４５％、１０％または約１０％～４０％または約４０％、１０％または約１０％～３５％または約３５％、１０％または約１０％～３０％または約３０％、１０％または約１０％～２５％または約２５％、１０％または約１０％～２０％または約２０％、１０％または約１０％～１５または約１５％、１５％または約１５％～５０％または約５０％、１５％または約１５％～４５％または約４５％、１５％または約１５％～４０％または約４０％、１５％または約１５％～３５％または約３５％、１５％または約１５％～３０％または約３０％、１５％または約１５％～２５％または約２５％、１５％または約１５％～２０％または約２０％、２０％または約２０％～５０％または約５０％、２０％または約２０％～４５％または約４５％、２０％または約２０％～４０％または約４０％、２０％または約２０％～３５％または約３５％、２０％または約２０％～３０％または約３０％、２０％または約２０％～２５％または約２５％、２５％または約２５％～５０％または約５０％、２５％または約２５％～４５％または約４５％、２５％または約２５％～４０％または約４０％、２５％または約２５％～３５％または約３５％、２５％または約２５％～３０％または約３０％、３０％または約３０％～５０％または約５０％、３０％または約３０％～４５％または約４５％、３０％または約３０％～４０％または約４０％、３０％または約３０％～３５％または約３５％、３５％または約３５％～５０％または約５０％、３５％または約３５％～４５％または約４５％、３５％または約３５％～４０％または約４０％、４０％または約４０％～５０％または約５０％、４０％または約４０％～４５％または約４５％、または４５％または約４５％～５０％または約５０％ｖ／ｖで本願に記載のアルブミン溶液を含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％ｖ／ｖで本願に記載のアルブミン溶液を含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％ｖ／ｖで本願に記載のアルブミン溶液を含む。

【0263】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、２０または約２０～１００または約１００ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、２０または約２０～１００または約１００、２０または約２０～９０または約９０、２０または約２０～８０または約８０、２０または約２０～７０または約７０、２０または約２０～６０または約６０、２０または約２０～５０または約５０、２０または約２０～４０または約４０、２０または約２０～３０または約３０、３０または約３０～１００または約１００、３０または約３０～９０または約９０、３０または約３０～８０または約８０、３０または約３０～７０または約７０、３０または約３０～６０または約６０、３０または約３０～５０または約５０、３０または約３０～４０または約４０、４０または約４０～１００または約１００、４０または約４０～９０または約９０、４０または約４０～８０または約８０、４０または約４０～７０または約７０、４０または約４０～６０または約６０、４０または約４０～５０または約５０、５０または約５０～１００または約１００、５０または約５０～９０または約９０、５０または約５０～８０または約８０、５０または約５０～７０または約７０、５０または約５０～６０または約６０、６０または約６０～１００または約１００、６０または約６０～９０または約９０、６０または約６０～８０または約８０、６０または約６０～７０または約７０、７０または約７０～１００または約１００、７０または約７０～９０または約９０、７０または約７０～８０または約８０、８０または約８０～１００または約１００、８０または約８０～９０または約９０、または９０または約９０～１００または約１００ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。

【0264】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、２０ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、４０ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、７０ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、１００ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。

【0265】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、約２０ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、約４０ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、約７０ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、約１００ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。

【0266】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、安定化剤、例えば、アルブミン安定化剤を追加的に含む。一部の実施形態において、安定化剤は、ソジウムカプリレート、カプリル酸、（２Ｓ）－２－アセトアミド－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸（本願においてまた、次のように称される：アセチルトリプトファン、Ｎ－アセチル－Ｌ－トリプトファンおよびアセチル－Ｌ－トリプトファン）、２－アセトアミド－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸（また、次のように称される：Ｎ－アセチルトリプトファン、ＤＬ－アセチルトリプトファンおよびＮ－アセチル－ＤＬ－トリプトファン）からなる群より選択される。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、組成物中のタンパク質、例えば、アルブミンタンパク質１ｇあたり、１つ以上の安定化剤をそれぞれ．１ｍｍｏｌ未満で含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、組成物中のタンパク質、例えば、アルブミンタンパク質１ｇあたり、安定化剤をそれぞれ０．０５または約０．０５～０．１または約０．１、例えば、０．０６４または約０．０６４～０．０９６または約０．０９６ｍｍｏｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、冷凍保存組成物中のタンパク質、例えば、アルブミンタンパク質１ｇあたり、全体安定化剤を０．１ｍｍｏｌ未満で含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、冷凍保存組成物中のタンパク質、例えば、アルブミンタンパク質１ｇあたり、全体安定化剤を０．０５または約０．０５～０．１または約０．１、例えば、０．０６４または約０．０６４～０．０９６または約０．０９６ｍｍｏｌ含む。

【0267】

２．デキストラン
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストランまたはその誘導体を含む。

【0268】

デキストランは、約９５％がα－Ｄ－（１－６）連結で構成されたアンハイドログルコースポリマー（（Ｃ_６Ｈ_１０Ｏ_５）_ｎと名付けられる）である。デキストラン分画は、分子量約１，０００ダルトン～約２，０００，０００ダルトンで提供される。これは番号（デキストランＸ）で、例えば、デキストラン１、デキストラン１０、デキストラン４０、デキストラン７０などで表示し、ここで、Ｘは、平均分子量を１，０００ダルトンで割ったものである。そのため、例えば、デキストラン４０は、平均分子量が４０，０００ダルトンまたは約４０，０００ダルトンである。

【0269】

一部の実施形態において、デキストランの平均分子量は、１，０００ダルトンまたは約１，０００ダルトン～２，０００または約２，０００，０００ダルトンである。一部の実施形態において、デキストランの平均分子量は、４０，０００ダルトンまたは約４０，０００ダルトンである。一部の実施形態において、デキストランの平均分子量は、７０，０００ダルトンまたは約７０，０００ダルトンである。

【0270】

一部の実施形態において、デキストランは、デキストラン４０、デキストラン７０、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態において、デキストランは、デキストラン４０である。

【0271】

一部の実施形態において、デキストラン、例えば、デキストラン４０は、溶液として、また、本願で言及されるように、デキストラン溶液としてまたはデキストラン４０溶液として提供される。したがって、一部の実施形態において、組成物は、デキストラン溶液、例えば、デキストラン４０溶液を含む。

【0272】

一部の実施形態において、デキストラン溶液は、静脈内使用に適合する。

【0273】

一部の実施形態において、デキストラン溶液は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を約５％～約５０％ｗ／ｗ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、５％または約５％～５０％または約５０％、５％または約５％～４５％または約４５％、５％または約５％～４０％または約４０％、５％または約５％～３５％または約３５％、５％または約５％～３０％または約３０％、５％または約５％～２５％または約２５％、５％または約５％～２０％または約２０％、５％または約５％～１５または約１５％、５％または約５％～１０％または約１０％、１０％または約１０％～５０％または約５０％、１０％または約１０％～４５％または約４５％、１０％または約１０％～４０％または約４０％、１０％または約１０％～３５％または約３５％、１０％または約１０％～３０％または約３０％、１０％または約１０％～２５％または約２５％、１０％または約１０％～２０％または約２０％、１０％または約１０％～１５または約１５％、１５％または約１５％～５０％または約５０％、１５％または約１５％～４５％または約４５％、１５％または約１５％～４０％または約４０％、１５％または約１５％～３５％または約３５％、１５％または約１５％～３０％または約３０％、１５％または約１５％～２５％または約２５％、１５％または約１５％～２０％または約２０％、２０％または約２０％～５０％または約５０％、２０％または約２０％～４５％または約４５％、２０％または約２０％～４０％または約４０％、２０％または約２０％～３５％または約３５％、２０％または約２０％～３０％または約３０％、２０％または約２０％～２５％または約２５％、２５％または約２５％～５０％または約５０％、２５％または約２５％～４５％または約４５％、２５％または約２５％～４０％または約４０％、２５％または約２５％～３５％または約３５％、２５％または約２５％～３０％または約３０％、３０％または約３０％～５０％または約５０％、３０％または約３０％～４５％または約４５％、３０％または約３０％～４０％または約４０％、３０％または約３０％～３５％または約３５％、３５％または約３５％～５０％または約５０％、３５％または約３５％～４５％または約４５％、３５％または約３５％～４０％または約４０％、４０％または約４０％～５０％または約５０％、４０％または約４０％～４５％または約４５％、または４５％または約４５％～５０％または約５０％ｗ／ｗでデキストラン、例えば、デキストラン４０を含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％ｗ／ｗでデキストラン、例えば、デキストラン４０を含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％ｗ／ｗでデキストラン、例えば、デキストラン４０を含む。

【0274】

一部の実施形態において、デキストラン溶液は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を２５または約２５ｇ／ｌ～２００または約２００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を３５または約３５～２００または約２００、２５または約２５～１７５または約１７５、２５または約２５～１５０または約１５０、２５または約２５～１２５または約１２５、２５または約２５～１００または約１００、２５または約２５～７５または約７５、２５または約２５～５０または約５０、５０または約５０～２００または約２００、５０または約５０～１７５または約１７５、５０または約５０～１５０または約１５０、５０または約５０～１２５または約１２５、５０または約５０～１００または約１００、５０または約５０～７５または約７５、７５または約７５～２００または約２００、７５または約７５～１７５または約１７５、７５または約７５～１５０または約１５０、７５または約７５～１２５または約１２５、７５または約７５～１００または約１００、１００または約１００～２００または約２００、１００または約１００～１７５または約１７５、１００または約１００～１５０または約１５０、１００または約１００～１２５または約１２５、１２５または約１２５～２００または約２００、１２５または約１２５～１７５または約１７５、１２５または約１２５～１５０または約１５０、１５０または約１５０～２００または約２００、１５０または約１５０～１７５または約１７５、または１７５または約１７５～２００または約２００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５または２００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を１００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を約２５、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、または約２００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を約１００ｇ／ｌ含む。

【0275】

一部の実施形態において、デキストラン溶液は、グルコース（また、次のように称される：デキストロース）を追加的に含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、グルコースを１０または約１０ｇ／ｌ～１００または約１００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、グルコースを１０または約１０～１００または約１００、１０または約１０～９０または約９０、１０または約１０～８０または約８０、１０または約１０～７０または約７０、１０または約１０～６０または約６０、１０または約１０～５０または約５０、１０または約１０～４０または約４０、１０または約１０～３０または約３０、１０または約１０～２０または約２０、２０または約２０～１００または約１００、２０または約２０～９０または約９０、２０または約２０～８０または約８０、２０または約２０～７０または約７０、２０または約２０～６０または約６０、２０または約２０～５０または約５０、２０または約２０～４０または約４０、２０または約２０～３０または約３０、３０または約３０～１００または約１００、３０または約３０～９０または約９０、３０または約３０～８０または約８０、３０または約３０～７０または約７０、３０または約３０～６０または約６０、３０または約３０～５０または約５０、３０または約３０～４０または約４０、４０または約４０～１００または約１００、４０または約４０～９０または約９０、４０または約４０～８０または約８０、４０または約４０～７０または約７０、４０または約４０～６０または約６０、４０または約４０～５０または約５０、５０または約５０～１００または約１００、５０または約５０～９０または約９０、５０または約５０～８０または約８０、５０または約５０～７０または約７０、５０または約５０～６０または約６０、６０または約６０～１００または約１００、６０または約６０～９０または約９０、６０または約６０～８０または約８０、６０または約６０～７０または約７０、７０または約７０～１００または約１００、７０または約７０～９０または約９０、７０または約７０～８０または約８０、８０または約８０～９０または約９０、８０または約８０～１００または約１００、８０または約８０～９０または約９０、または９０または約９０～１００または約１００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、グルコースを１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、グルコースを５０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、グルコースを約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、グルコースを５０ｇ／ｌ含む。

【0276】

一部の実施形態において、デキストラン溶液は、水中の、デキストラン、例えば、デキストラン４０、およびグルコースで構成される。

【0277】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、本願に記載のデキストラン溶液を１０％または約１０％ｖ／ｖ～５０％または約５０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストラン溶液、例えば、本願に記載のデキストラン溶液を１０％または約１０％～５０％、１０％または約１０％～４５％または約４５％、１０％または約１０％～４０％または約４０％、１０％または約１０％～３５％または約３５％、１０％または約１０％～３０％または約３０％、１０％または約１０％～２５％または約２５％、１０％または約１０％～２０％または約２０％、１０％または約１０％～１５または約１５％、１５％または約１５％～５０％または約５０％、１５％または約１５％～４５％または約４５％、１５％または約１５％～４０％または約４０％、１５％または約１５％～３５％または約３５％、１５％または約１５％～３０％または約３０％、１５％または約１５％～２５％または約２５％、１５％または約１５％～２０％または約２０％、２０％または約２０％～５０％または約５０％、２０％または約２０％～４５％または約４５％、２０％または約２０％～４０％または約４０％、２０％または約２０％～３５％または約３５％、２０％または約２０％～３０％または約３０％、２０％または約２０％～２５％または約２５％、２５％または約２５％～５０％または約５０％、２５％または約２５％～４５％または約４５％、２５％または約２５％～４０％または約４０％、２５％または約２５％～３５％または約３５％、２５％または約２５％～３０％または約３０％、３０％または約３０％～５０％または約５０％、３０％または約３０％～４５％または約４５％、３０％または約３０％～４０％または約４０％、３０％または約３０％～３５％または約３５％、３５％または約３５％～５０％または約５０％、３５％または約３５％～４５％または約４５％、３５％または約３５％～４０％または約４０％、４０％または約４０％～５０％または約５０％、４０％または約４０％～４５％または約４５％、または４５％または約４５％～５０％または約５０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストラン溶液、例えば、本願に記載のデキストラン溶液を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストラン溶液、例えば、本願に記載のデキストラン溶液を約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％ｖ／ｖ含む。

【0278】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を１０または約１０～５０または約５０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を１０または約１０～５０または約５０、１０または約１０～４５または約４５、１０または約１０～４０または約４０、１０または約１０～３５または約３５、１０または約１０～３０または約３０、１０または約１０～２５または約２５、１０または約１０～２０または約２０、１０または約１０～１５または約１５、１５または約１５～５０または約５０、１５または約１５～４５または約４５、１５または約１５～４０または約４０、１５または約１５～３５または約３５、１５または約１５～３０または約３０、１５または約１５～２５または約２５、１５または約１５～２０または約２０、２０または約２０～５０または約５０、２０または約２０～４５または約４５、２０または約２０～４０または約４０、２０または約２０～３０または約３０、２０または約２０～２５または約２５、２５または約２５～５０または約５０、２５または約２５～４５または約４５、２５または約２５～４０または約４０、２５または約２５～３５または約３５、２５または約２５～３０または約３０、３０または約３０～５０または約５０、３０または約３０～４５または約４５、３０または約３０～４０または約４０、３０または約３０～３５または約３５、３５または約３５～５０または約５０、３５または約３５～４５または約４５、３５または約３５～４０または約４０、４０または約４０～５０または約５０、４０または約４０～４５または約４５、または４５または約４５～５０または約５０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を１０、１５、２０、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ｇ／ｌ含む。

【0279】

３．グルコース
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを含む。

【0280】

一部の実施形態において、本願に記載されているように、冷凍保存組成物は、グルコースを含むデキストラン溶液を含む。

【0281】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを含まないデキストラン溶液を含む。一部の実施形態において、例えば、デキストラン溶液にグルコースが含まれない場合、グルコースは、冷凍保存組成物に別途に添加される。

【0282】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを５または約５～２５または約２５ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを５または約５～２５または約２５、５または約５～２０または約２０、５または約５～１５または約１５、５または約５～１０または約１０、１０または約１０～２５または約２５、１０または約１０～２０または約２０、１０または約１０～１５または約１５、１５または約１５～２５または約２５、１５または約１５～２０または約２０、または２０または約２０～２５または約２５ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを５、７．５、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５または２５ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを１２．５ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを約５、約７．５、約１０、約１２．５、約１５、約１７．５、約２０、約２２．５、または約２５ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを約１２．５ｇ／ｌ含む。

【0283】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを２．７５％ｗ／ｖ未満で含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを２７．５ｇ／ｌ未満で含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを２％ｗ／ｖ未満で含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを１．５％ｗ／ｖ未満で含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、約１．２５％ｗ／ｖ以下含む。

【0284】

４．ジメチルスルホキシド
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、メチルスルホキシドおよびメチルスルフィニルメタンともいう）を含む。

【0285】

一部の実施形態において、ＤＭＳＯは、本願においてＤＭＳＯ溶液とも言及される溶液として提供される。このため、一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯ溶液を含む。

【0286】

一部の実施形態において、ＤＭＳＯ溶液は、静脈内使用に適合する。

【0287】

一部の実施形態において、ＤＭＳＯ溶液は、ＤＭＳＯを１．１ｇ／ｍｌ含む。一部の実施形態において、ＤＭＳＯ溶液は、ＤＭＳＯを約１．１ｇ／ｍｌ含む。

【0288】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯ溶液を１％または約１％～１０％または約１０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯ溶液を１％または約１％～１０％または約１０％、１％または約１％～９％または約９％、１％または約１％～８％または約８％、１％または約１％～７％または約７％、１％または約１％～６％または約６％、１％または約１％～５％または約５％、１％または約１％～４％または約４％、１％または約１％～３％または約３％、１％または約１％～２％または約２％、２％または約２％～１０％または約１０％、２％または約２％～９％または約９％、８％または約８％、２％または約２％～７％または約７％、２％または約２％～６％または約６％、２％または約２％～５％または約５％、２％または約２％～４％または約４％、２％または約２％～３％または約３％、３％または約３％～１０％または約１０％、３％または約３％～９％または約９％、３％または約３％～８％または約８％、３％または約３％～７％または約７％、３％または約３％～６％または約６％、３％または約３％～５％または約５％、３％または約３％～４％または約４％、４％または約４％～１０％または約１０％、４％または約４％～９％または約９％、４％または約４％～８％または約８％、４％または約４％～７％または約７％、４％または約４％～６％または約６％、４％または約４％～５％または約５％、５％または約５％～１０％または約１０％、５％または約５％～９％または約９％、５％または約５％～８％または約８％、５％または約５％～７％または約７％、５％または約５％～６％または約６％、６％または約６％～１０％または約１０％、６％または約６％～９％または約９％、６％または約６％～８％または約８％、６％または約６％～７％または約７％、７％または約７％～１０％または約１０％、７％または約７％～９％または約９％、７％または約７％～８％または約８％、８％または約８％～１０％または約１０％、８％または約８％～９％または約９％、または９％または約９％～１０％または約１０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯ溶液を１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯ溶液を５％含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯ溶液を約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯ溶液を約５％含む。

【0289】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯを１１または約１１～１１０または約１１０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯを１１または約１１～１１０または約１１０、１１または約１１～９９または約９９、１１または約１１～８８または約８８、１１または約１１～７７または約７７、１１または約１１～６６または約６６、１１または約１１～５５または約５５、１１または約１１～４４または約４４、１１または約１１～３３または約３３、１１または約１１～２２または約２２、２２または約２２～１１０または約１１０、２２または約２２～９９または約９９、２２または約２２～８８または約８８、２２または約２２～７７または約７７、２２または約２２～７７または約７７、２２または約２２～６６または約６６、２２または約２２～５５または約５５、２２または約２２～４４または約４４、２２または約２２～３３または約３３、３３または約３３～１１０または約１１０、３３または約３３～９９または約９９、３３または約３３～８８または約８８、３３または約３３～７７または約７７、３３または約３３～６６または約６６、３３または約３３～５５または約５５、３３または約３３～４４または約４４、４４または約４４～１１０または約１１０、４４または約４４～９９または約９９、４４または約４４～８８または約８８、４４または約４４～７７または約７７、４４または約４４～６６または約６６、４４または約４４～５５または約５５、５５または約５５～１１０または約１１０、５５または約５５～９９または約９９、５５または約５５～８８または約８８、５５または約５５～７７または約７７、５５または約５５～６６または約６６、６６または約６６～１１０または約１１０、６６または約６６～９９または約９９、６６または約６６～８８または約８８、６６または約６６～７７または約７７、７７または約７７～１１９または約１１９、７７または約７７～８８または約８８、８８または約８８～１１０または約１１０、８８または約８８～９９または約９９、または９９または約９９～１１０または約１１０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯを１１、２２、３３、４４、５５、６６、７７、８８、９９または１１０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯを５５ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯを約１１、約２２、約３３、約４４、約５５、約６６、約７７、約８８、約９９、または約１１０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯを約５５ｇ／ｌ含む。

【0290】

５．緩衝剤
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、緩衝剤溶液、例えば、静脈内投与に適した緩衝剤溶液を含む。

【0291】

緩衝剤溶液としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、Ｔｙｒｏｄｅの緩衝剤、Ｈａｎｋの平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｅａｒｌｅの平衡塩溶液、塩水およびトリスなどがあるが、これらに限定されるものではない。

【0292】

一部の実施形態において、緩衝剤溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。

【0293】

６．例示的な冷凍保存組成物
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、以下の構成成分を含むか、またはそれらで構成される：１）アルブミン、例えば、ヒトアルブミン、２）デキストラン、例えば、デキストラン４０、３）ＤＭＳＯ、および４）緩衝剤溶液。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを追加的に含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、１）アルブミン、例えば、ヒトアルブミン、２）デキストラン、例えば、デキストラン４０、３）グルコース、４）ＤＭＳＯ、および５）緩衝剤溶液で構成される。

【0294】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、１）本願に記載のアルブミン溶液、２）本願に記載のデキストラン溶液、３）本願に記載のＤＭＳＯ溶液、および４）緩衝剤溶液を含む。

【0295】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、１）本願に記載のアルブミン溶液、２）本願に記載のデキストラン溶液、３）本願に記載のＤＭＳＯ溶液、および４）緩衝剤溶液で構成される。

【0296】

一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、細胞培養培地を含まない。

【0297】

一実施形態において、冷凍保存組成物は、約４０ｍｇ／ｍｌヒトアルブミン、２５ｍｇ／ｍｌデキストラン４０、１２．５ｍｇ／ｍｌグルコースおよび５５ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯを含む。

【0298】

一実施形態において、冷凍保存組成物は、水中の、約４０ｍｇ／ｍｌヒトアルブミン、２５ｍｇ／ｍｌデキストラン４０、１２．５ｍｇ／ｍｌグルコース、５５ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯ、および０．５ｍｌ／ｍｌの１００％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むか、またはそれらで構成される。

【0299】

一実施形態において、冷凍保存組成物は、約３２ｍｇ／ｍｌヒトアルブミン、２５ｍｇ／ｍｌデキストラン４０、１２．５ｍｇ／ｍｌグルコースおよび５５ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯを含む。

【0300】

一実施形態において、冷凍保存組成物は、水中の、約３２ｍｇ／ｍｌヒトアルブミン、２５ｍｇ／ｍｌデキストラン４０、１２．５ｍｇ／ｍｌグルコース、５５ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯ、および０．５４ｍｌ／ｍｌの１００％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むか、またはそれらで構成される。

【0301】

冷凍保存組成物の例を表３に示す。

【0302】

【表3】

【0303】

【表4】

【0304】

【表5】

【0305】

Ｂ．冷凍保存法
本願に記載の冷凍保存組成物は、細胞、例えば、治療学的細胞、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞を冷凍保存するために用いることができる。

【0306】

一部の実施形態において、細胞は、動物細胞である。一部の実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。

【0307】

一部の実施形態において、細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態において、免疫細胞は、好塩球、好酸球、好中球、肥満細胞、単核球、大食細胞、好中球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびこれらの組み合わせから選択される。

【0308】

一部の実施形態において、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、本願に記載の方法により増幅および刺激される。

【0309】

一部の実施形態において、細胞の冷凍保存は、細胞を本願に記載の冷凍保存組成物またはその構成成分と混合して組成物、例えば、薬学的組成物を製造する段階、および混合物を冷凍する段階を含む。

【0310】

一部の実施形態において、細胞の冷凍保存は、細胞を含む組成物を、本願に記載の冷凍保存組成物またはその構成成分と混合して組成物、例えば、薬学的組成物を製造する段階；混合物を冷凍する段階を含む。一部の実施形態において、細胞を含む組成物は、細胞および緩衝剤を含む。好適な緩衝剤は本願に記載されている。

【0311】

一部の実施形態において、細胞の冷凍保存は、細胞および緩衝剤、例えば、ＰＢＳを含む組成物を、アルブミン、デキストランおよびＤＭＳＯ、例えば、本願に記載されているように含む組成物と混合する段階；混合物を冷凍する段階を含む。

【0312】

一部の実施形態において、細胞の冷凍保存は、細胞および緩衝剤、例えば、ＰＢＳを１：１で含む組成物を４０ｍｇ／ｍｌアルブミン、例えば、ヒトアルブミン、２５ｍｇ／ｍｌデキストラン、例えば、デキストラン４０、１２．５ｍｇ／ｍｌグルコースおよび５５ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯを含む組成物と混合する段階を含む。

【0313】

一部の実施形態において、細胞および緩衝剤、例えば、ＰＢＳを含む組成物は、細胞を２×１０^７または約２×１０^７～２×１０^９または約２×１０^９細胞／ｍｌ含む。一部の実施形態において、細胞および緩衝剤、例えば、ＰＢＳを含む組成物は、２×１０^８細胞／ｍｌを含む。一部の実施形態において、細胞および緩衝剤、例えば、ＰＢＳを含む組成物は、約２×１０^８細胞／ｍｌを含む。

【0314】

一部の実施形態において、細胞冷凍保存は、細胞、緩衝剤、例えば、ＰＢＳ、アルブミン、例えば、ヒトアルブミン、デキストラン、例えば、デキストラン４０およびＤＭＳＯを混合する段階；混合物を冷凍する段階を含む。

【0315】

一部の実施形態において、混合物は、１×１０^７または約１×１０^７～１×１０^９または約１×１０^９細胞／ｍｌを含む。一部の実施形態において、混合物は、１×１０^８細胞／ｍｌを含む。一部の実施形態において、混合物は、約１×１０^８細胞／ｍｌを含む。

【0316】

適切なアルブミン、デキストランおよびＤＭＳＯの範囲は上記に記載される。

【0317】

一部の実施形態において、組成物は、－１３５℃以下で冷凍する。

【0318】

一部の実施形態において、組成物は、制御された速度で冷凍する。

【0319】

ＩＶ．抗体
本願に記載の方法への使用に適したＣＤ２０標的抗体は、表６に記載された抗体およびこれらの組み合わせを含むが、これに限定されるものではない。

【0320】

【表6】

【0321】

一部の実施形態において、ＣＤ３８標的抗体は、ダラツムマブ（またはそのバイオシミラー）、イサツキシマブ（またはそのバイオシミラー）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。

【0322】

一部の実施形態において、抗体は、静脈内または皮下投与される。

【0323】

Ｖ．薬学的組成物
本発明は、本願に記載のナチュラルキラー細胞を含む薬学的組成物および本願に記載の薬学的組成物の投薬単位（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ）を提供する。

【0324】

場合によっては、投薬単位は、細胞を１億～１５億、例えば、１億、２億、３億、４億、５億、６億、７億、８億、９億、１０億、１１億、１２億、１３億、１４億または１５億個含む。

【0325】

薬学的組成物は、典型的に薬剤学的に許容可能な担体を含む。本願に使用されているように、用語「薬剤学的に許容可能な担体」は、薬学的投与に適した、食塩水、溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗細菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などがある。

【0326】

一部の実施形態において、薬学的組成物は、ａ）本願に記載のナチュラルキラー細胞；およびｂ）冷凍保存組成物を含む。

【0327】

好適な冷凍保存組成物は本願に記載される。

【0328】

一部の実施形態において、組成物は、冷凍する。一部の実施形態において、組成物は、少なくとも３ヶ月間、例えば、少なくとも６ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１５ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間または少なくとも３６ヶ月間冷凍保存する。

【0329】

一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞の少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％が解凍後に生存する。

【0330】

一部の実施形態において、薬学的組成物は、ａ）本願に記載の冷凍保存組成物；およびｂ）治療学的細胞を含む。

【0331】

一部の実施形態において、治療学的細胞は、動物細胞である。一部の実施形態において、治療学的細胞は、ヒト細胞である。

【0332】

一部の実施形態において、治療学的細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態において、免疫細胞は、好塩球、好酸球、好中球、肥満細胞、単核球、大食細胞、好中球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびこれらの組み合わせから選択される。

【0333】

一部の実施形態において、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、本願に記載の方法により増幅および刺激される。

【0334】

一部の実施形態において、薬学的組成物は、ｃ）緩衝剤溶液を追加的に含む。適切な緩衝剤溶液は、例えば、冷凍保存組成物について本願に記載された通りである。

【0335】

一部の実施形態において、薬学的組成物は、細胞を１×１０^７細胞／ｍｌまたは約１×１０^７～１×１０^９細胞／ｍｌまたは約１×１０^９細胞／ｍｌ含む。一部の実施形態において、薬学的組成物は、細胞を１×１０^８細胞／ｍｌ含む。一部の実施形態において、薬学的組成物は、細胞を約１×１０^８細胞／ｍｌ含む。

【0336】

一部の実施形態において、薬学的組成物は、抗体またはその抗原結合断片、例えば、本願に記載の抗体を追加的に含む。

【0337】

薬学的組成物は、典型的に意図した投与経路に合わせて剤形化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、真皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与などがある。

【0338】

適切な薬学的組成物を剤形化する方法が当該技術分野で公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ ｅｄ．，２００５；ａｎｄ ｔｈｅ ｂｏｏｋｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ ａｎｄ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ）を参照する。例えば、非経口、真皮内または皮下用途に使用される溶液剤または懸濁剤は、以下のような成分を含むことができる：無菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩水、固定オイル、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒；抗細菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝剤、例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェート、および緊張度調節剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを滴定可能である。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチックで作製されたアンプル、使い捨てシリンジまたは多重投薬バイアル内に封入することができる。

【0339】

注射用途に適した薬学的組成物は、無菌注射溶液剤または分散剤を即席製造するための無菌酸剤および無菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液を網羅することができる。静脈内投与する場合、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ^ＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などがある。いずれの場合も、組成物は無菌性でなければならず、容易に注射できるほど流動性でなければならない。これは製造および保管条件で安定的でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用から保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒質であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤を用いることにより、分散剤の場合、必要な粒子サイズを維持することにより、そして界面活性剤を用いることにより、維持することができる。微生物作用の防止は、多様な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に添加することが好ましい。組成物に、吸収を遅延する物質、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを含有させることにより、注射用組成物の吸収を遅らせることができる。

【0340】

無菌注射用溶液は、活性化合物を必要な量で適切な溶媒に前記列挙した成分の１つまたはその組み合わせとともに投入し、必要に応じて濾過滅菌を行うことにより、製造することができる。一般的に、分散剤は、活性化合物を基本分散媒質と前記列挙されたものに由来する他の必須成分を含む無菌ビヒクルに投入することにより製造する。無菌注射用溶液剤を製造するための無菌酸剤の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これによって活性成分と以前に滅菌－濾過した溶液に由来する任意の追加的な所望の成分の粉末が得られる。

【0341】

ＶＩ．治療方法
本願に記載のＮＫ細胞は、癌またはその他の増殖性障害の治療用途を有する。

【0342】

このため、また、本発明は、ＮＫ細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞、およびＣＤ３８標的抗体、例えば、本願に記載の抗体を投与することを含む、障害、例えば、癌、例えば、ＣＤ３８＋癌に関連する障害を患っている患者を治療する方法を提供する。

【0343】

また、本発明は、ＮＫ細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞、およびＣＤ３８標的抗体、例えば、本願に記載の抗体を投与することを含む、必要な個体において癌細胞または癌細胞集団の再発、生長、増殖、移動および／または転移を防止、減少および／または阻害する方法を提供する。

【0344】

さらに、本発明は、ＮＫ細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞、およびＣＤ３８標的抗体、例えば、本願に記載の抗体を投与することを含む、必要な個体において抗癌療法に対する反応を強化、改善および／または高める方法を提供する。

【0345】

また、本発明は、ＮＫ細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞、およびＣＤ３８標的抗体、例えば、本願に記載の抗体を投与することを含む、必要な個体において免疫システムを誘発する方法を提供する。

【0346】

本願に記載の方法は、異常なアポトーシス工程または分化工程に関連する障害、例えば、細胞増殖性障害または細胞性分化障害、例えば、固形腫瘍および造血癌のような癌を治療する方法を含む。一般的に、本方法は、本願に記載されているような治療剤を治療学的有効量で必要な個体または治療が必要と決定された個体に投与することを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＮＫ細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞およびＣＤ３８標的抗体、例えば、本願に記載の抗体を含む治療剤を治療学的有効量で投与することを含む。

【0347】

本願に使用されているように、用語「治療」、「治療する」および「治療する」は、異常なアポトーシス工程または分化工程に関連する障害の退行、緩和、開始遅延または進行阻害を意味する。例えば、治療は、腫瘍サイズまたは生長速度の減少を達成することができる。本願に記載の化合物を異常なアポトーシス工程または分化工程に関連する病態を治療するために治療学的有効量で投与すれば、特に腫瘍サイズの低下または生長速度の減少、再発危険または頻度減少、再発遅延、転移減少、生存性増加および／または罹患率および死亡率の減少が達成されるはずである。一部の実施形態において、治療剤は、１つ以上の症状が発現した後に投与することができる。他の実施形態において、治療剤は、症状がない状態で投与してもよい。例えば、治療剤は、症状が開始される前に（例えば、症状の病歴に照らしておよび／または遺伝学的またはその他の感受性要因に照らして）感受性個体に投与してもよい。治療剤はまた、症状が解消した後も、例えば、再発を防止または遅延するために引き続き投与可能である。

【0348】

本願に使用されているように、用語「阻害」は、癌および／または癌細胞の増殖に関連して、細胞毒性、営養分の枯渇またはアポトーシスの誘導によって、個別的にまたは他の癌細胞と集合的に癌細胞の生長、分裂、成熟または生存性の阻害および／または癌細胞の死滅誘発を意味する。

【0349】

本願に使用されているように、疾患または障害、またはその１つ以上の症状の進行「遅延」は、疾患、障害またはその症状の発生を遅らせたり、妨げたり、遅くしたり、遅滞させたり、安定化したりおよび／または延期することを意味する。遅延は、疾患の病歴および／または治療中の個体によって多様な時間の長さであってもよい。当該技術分野における当業者に自明なように、十分なまたは著しい遅延は、事実上、個体において疾患、障害またはその症状が発生しないという点で、予防を包括する。例えば、癌発生を「遅延する」方法は、当該方法を利用しない場合と比較して、所定の時間範囲の間疾患の発生確率を低下させたり、および／または所定の時間範囲の間疾患の程度を低下させる方法である。このような比較は、統計学的に有意な個体数を用いた臨床実験に基づくことができる。

【0350】

本願に使用されているように、「予防」または「予防する」は、疾患の臨床症状が発生しないように疾患または障害が開始されないように防止する用法を指す。したがって、「予防」は、疾患の兆候が個体から検出可能になる前に、および／または疾患の特定の病期に到達する前に（例えば、癌がまだ転移していない患者に治療学的物質の投与）個体に療法（例えば、治療学的物質の投与）を実施することに関連がある。個体は、疾患または障害発生の危険があったり、または疾患進行の危険がある、例えば、癌転移危険がある個体、例えば、疾患または障害の発生または開始に関連することが知られた１つ以上の危険因子を有する個体であってもよい。例えば、個体は、癌の発生または進行に関連する突然変異を保有することができる。さらに、予防は、疾患または障害の開始に対して完璧な防止が達成されないことが理解される。場合によっては、予防は、疾患または障害の発病危険の低下を含む。危険の低下は、疾患または障害の発病危険の完璧な消滅を達成しなくてもよい。

【0351】

（例えば、抗腫瘍反応、癌細胞の転移に関連して）「増加した」または「強化された」程度は、本願に言及された量または水準に対して１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれより高い倍数（例えば、１００倍、５００倍、１０００倍）の増加を指す（言及された整数間の１より大きいすべての整数および少数値を網羅する、例えば、２．１、２．２、２．３、２．４など）。これはまた、本願に言及された量または水準に対する少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％または少なくとも１０００％の増加を網羅することができる。

【0352】

（例えば、腫瘍サイズ、癌細胞の増殖または生長に関連して）「減少した」または「低下した」または「より少ない」量は、本願に言及された量または水準に対して１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれより高い倍数（例えば、１００倍、５００倍、１０００倍）の減少を指す（言及された整数間の１より大きいすべての整数および少数値を網羅する、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）。これはまた、本願に言及された量または水準に対する少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％または少なくとも１０００％の減少を網羅することができる。

【0353】

Ａ．障害
本願に開示された方法および製造された組成物は、細胞増殖性障害のような多数の障害を標的化する用途を有する。本発明において、このようなアプローチの利点は、同種異系細胞を、外因性抗体によって標的化される特定の増殖性細胞を標的とするために、外因性抗体の投与と組み合わせて用いることである。本発明のこのようなアプローチおよび薬学的組成物を用いることにより、化学療法または放射線療法のような既存の療法とは異なり、増殖性細胞に無差別的に影響を及ぼす全身薬物または毒素を投与しなくても、潜在的に有害な増殖活性を示す細胞を特異的に標的とすることができる。

【0354】

細胞増殖性障害および／または分化障害の例としては、癌、例えば、癌腫、肉腫、転移性障害または造血新生物障害、例えば、白血病などがある。転移性腫瘍は、非－制限的に前立腺、結腸、肺、乳房および肝起源などの多様な原発性腫瘍タイプに起源することができる。

【0355】

本願に使用されているように、用語「癌」、「過増殖性」および「新生物」は、自律的な生長能力、すなわち急速に増殖する細胞生長を特徴とする異常状態または病態を有する細胞を指す。過増殖性および新生物疾患状態は病的に、すなわち疾患状態が特徴的であるかまたは疾患状態であるものに分類することができるか、または非－病的であって、すなわち正常状態ではないが、疾患状態とは関連のないものに分類することができる。この用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲段階に関係なく、すべてのタイプの癌性生長または発癌過程、転移性組織または悪性に転換された細胞、組織、または臓器を網羅することを意味する。「病的過増殖性」細胞は、悪性腫瘍生長を特徴とする疾患状態で生ずる。非－病的過増殖性細胞に対する例としては、傷の回復に関連する細胞増殖を含む。

【0356】

用語「癌」または「新生物」は、肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸および泌尿生殖器で発生するなどの多様な臓器システムの悪性のみならず、腺癌腫、例えば、大部分の大腸癌、腎細胞癌腫、前立腺癌および／または睾丸腫瘍、非－小細胞性肺癌腫、小腸癌および食道癌のような悪性を網羅する。

【0357】

用語「癌腫」は、当該技術分野で理解され、呼吸系癌腫、胃腸系癌腫、泌尿生殖器系癌腫、睾丸癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫および黒色腫などの上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。一部の実施形態において、疾患は、腎臓癌または黒色腫である。癌腫の例としては、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織に起因する癌腫などがある。この用語はまた、例えば、癌腫組織および肉腫組織で構成された悪性腫瘍を含む、癌肉腫症を網羅する。「腺癌腫」は、腺組織に由来したり、または腫瘍細胞が認知可能な腺構造に起源する癌腫を指す。

【0358】

用語「肉腫」は、当該技術分野で理解され、間葉由来悪性腫瘍を指す。

【0359】

増殖性障害に対する追加的な例としては、造血新生物障害がある。本願に使用されているように、用語「造血新生物障害」は、造血起源の、例えば、骨髄、リンパ系または赤血球系統またはこれらの前駆細胞に起源する、過形成／新生物細胞を伴う疾病を含む。好ましくは、疾患は、ほとんど未分化された急性白血病（ｐｏｏｒｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ａｃｕｔｅ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）、例えば、赤血球芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から発生する。付加的な骨髄性障害の例としては、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）があるが、これらに限定されるものではなく（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ．ｉｎ Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７－９７）；リンパ系悪性としては、Ｂ－系急性リンパ芽性白血病（ＡＬＬ）およびＴ－系ＡＬＬをはじめとするＡＬＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ芽性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）があるが、これらに限定されるものではない。悪性リンパ腫の追加的な形態としては、非－ホジキンリンパ腫およびその変形形態、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン疾患およびリード・シュテルンベルグ疾患があるが、これらに限定されるものではない。

【0360】

一部の実施形態において、癌は、以下からなる群より選択される：急性リンパ芽性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌腫、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ－関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、典型的な奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド、心臓腫瘍、髄芽腫、生殖細胞腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、子宮頸癌、胆管癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌、胎児腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外生殖細胞腫、性腺外生殖細胞腫、眼癌（例えば、眼内黒色腫または網膜芽腫）、卵管癌、骨の線維性組織球腫、骨肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫、妊娠性絨毛性疾患、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓腫瘍、肝細胞癌、組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞腫、膵神経内分泌腫瘍、腎臓（腎細胞）癌腫、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、口唇および口腔癌、肝臓癌、肺癌（例えば、非－小細胞性肺癌、小細胞性肺癌、胸膜肺芽腫および気管気管支腫瘍）、リンパ腫、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞癌腫、中皮腫、転移性癌、転移性扁平上皮癌、正中線癌腫（ｍｉｄｌｉｎｅ ｔｒａｃｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、口腔癌、多発性内分泌腺腫症症侯群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、骨髄増殖性新生物、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非－ホジキンリンパ腫、口腔癌、口唇および口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、卵巣癌、膵臓癌、膵神経内分泌腫瘍、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、脳下垂体部腫瘍、形質細胞新生物、多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、姙娠性乳癌（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ａｎｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、中枢神経系原発悪性リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、再発癌、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（例えば、小児横紋筋肉腫、小児血管腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫、軟組織肉腫、子宮肉腫）、セザリー症侯群、皮膚癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平細胞癌腫、頸部扁平上皮癌、胃癌、Ｔ－細胞リンパ腫、睾丸癌、咽喉癌、鼻咽頭癌、口咽頭癌、下咽頭癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、気管気管支腫瘍、腎盂と尿管の移行上皮癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管腫瘍、外陰部癌およびウィルムス腫瘍。

【0361】

一部の実施形態において、癌は、固形腫瘍である。

【0362】

一部の実施形態において、癌は、転移性である。

【0363】

一部の実施形態において、癌は、ＣＤ３８＋癌である。

【0364】

一部の実施形態において、ＣＤ３８＋癌は、神経膠腫、甲状腺癌、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、尿路上皮癌、前立腺癌、睾丸癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、黒色腫、リンパ腫、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。

【0365】

一部の実施形態において、ＣＤ３８＋癌は、前立腺癌である。

【0366】

一部の実施形態において、ＣＤ３８＋癌は、リンパ腫である。

【0367】

一部の実施形態において、ＣＤ３８＋癌は、多発性骨髄腫である。

【0368】

Ｂ．患者
本発明において、組成物および方法に適した患者は、細胞増殖性および／または分化性障害、例えば、癌を患っていたり、診断されるか、または患っていると疑われる患者を含む。本発明に言及された施術を受けた患者は、一般的に本発明の方法および組成物により良く反応するが、その理由は部分的に薬学的組成物が同種異系であり、一般的に増殖する細胞を標的化するよりは抗体によって標的細胞を識別するからである。そのため、オフ－標的効果がほとんどなく、患者は実質的に有害なオフ－標的効果なしに治療用法を完了する可能性がより大きい。

【0369】

一部の実施形態において、本発明に提供された治療方法を用いて、細胞増殖性障害および／または分化障害、例えば、癌と診断されたか、または患っていると疑われる個体（例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス）を治療することができる。一部の実施形態において、個体は、哺乳類である。一部の実施形態において、個体は、ヒトである。

【0370】

本願に使用されているように、個体は、例えば、ヒトをはじめとする哺乳類を指す。

【0371】

一部の実施形態において、哺乳類は、アルマジロ、ロバ、コウモリ、クマ、ビーバー、ネコ、チンパンジー、ウシ、コヨーテ、シカ、イヌ、イルカ、ゾウ、キツネ、パンダ、テナガザル、キリン、ヤギ、ホリネズミ、ハリネズミ、カバ、ウマ、ザトウクジラ、ジャガー、カンガルー、コアラ、ヒョウ、シシ、リャマ、オオヤマネコ、モグラ、サル、マウス、イッカク、オランウータン、サカマタ、カワウソ、牡ウシ、ブタ、シロクマ、ヤマアラシ、ピューマ、ウサギ、ラクーン、ラット、サイ、ヒツジ、リス、トラ、セイウチ、イタチ、オオカミ、シマウマ、ヤギ、ウマ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。

【0372】

一部の実施形態において、哺乳類は、ヒトである。

【0373】

個体、例えば、ヒト個体は、子供、例えば、０歳または約０歳～１４歳または約１４歳であってもよい。個体は、若者、例えば、１５歳または約１５歳～２４歳または約２４歳であってもよい。個体は、成人、例えば、２５歳または約２５歳～６４歳または約６４歳であってもよい。個体は、高齢者、例えば、６５歳以上であってもよい。

【0374】

一部の実施形態において、個体は、細胞増殖性障害および／または分化障害、例えば、癌、例えば、腫瘍に関連する１つ以上の症状が発生したヒトであってもよい。本発明に提供された任意の治療方法を用いて多様な病期の癌を治療することができる。例えば、癌病期は、初期、進行した、局所進行、寛解、不応性、寛解後再発および進行性（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）を含むが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態において、個体は、癌の初期病期である。他の実施形態において、個体は、癌の進行した病期である。多様な実施形態において、個体は、１期、２期、３期または４期癌を患っている。本発明に記載の治療方法は、腫瘍の減少または縮小を促進したり、腫瘍生長または癌細胞の増殖を減少または阻害したり、および／または腫瘍細胞の殺傷を誘導、増加または促進することができる。一部の実施形態において、個体は、癌寛解状態である。本発明に記載の治療方法は、癌の転移または再発を防止したり、または遅延することができる。

【0375】

一部の実施形態において、個体は、診断されたか、または診断されていない細胞増殖性障害および／または分化障害、例えば、癌の発病危険があるか、または遺伝学的にまたは他のもの（例えば、危険因子）が存在する。

【0376】

本願に使用されているように、「危険がある」個体は、治療する病態、例えば、細胞増殖性障害および／または分化障害、例えば、癌の発病危険がある個体である。一般的に、「危険がある」個体は、検出可能な疾患があるか、または検出可能な疾患がなくてもよいし、本発明に記載の治療方法の前に検出可能な疾患が発現したか、または発現しなくてもよい。「危険がある」とは、個体が、疾患または病態の発病と関連性がある測定可能な媒介変数および当該技術分野で公知の、いわゆる１つ以上の危険因子を有することを意味する。例えば、危険がある個体は、癌の発病に関連する測定可能な媒介変数である１つ以上の危険因子を有することができる。このような１つ以上の危険因子を有する個体は、このような危険因子がない個体より癌発病確率がより高い。一般的に、危険因子は、例えば、年齢、性別、人種、規定食、以前疾患の病歴、前駆疾患の存在、遺伝学的（例、遺伝性）考慮事項および環境露出を含むことができる。一部の実施形態において、癌発病危険がある個体は、例えば、親戚の中で疾患を患ったことのある個体、および遺伝子または生化学マーカー分析により決定された危険を有する個体を網羅する。

【0377】

これとともに、個体は、化学療法、放射線療法、免疫療法、手術、またはこれらの組み合わせのような１つ以上の標準療法を施していてもよい。このため、化学療法、放射線療法、免疫療法、手術、またはこれらの組み合わせを施す前、施す間にまたは施した後に、１つ以上のキナーゼ阻害剤が投与されてもよい。

【0378】

特定の実施形態において、個体は、（ｉ）１つ以上の化学療法治療剤に対して実質的に不応性であるか、または（ｉｉ）化学療法で治療された後に再発した状態であるか、または（ｉ）および（ｉｉ）両方であるヒトであってもよい。一部の実施形態において、個体は（標準または実験的化学療法をはじめとする）化学療法治療剤２種以上、３種以上または４種以上に対して不応性である。

【0379】

一部の実施形態において、患者は、ＣＤ３８＋癌と診断されたことがあるか、またはＣＤ３８＋癌と診断された。

【0380】

一部の実施形態において、患者は、癌の生検または外科的サンプルに対する免疫組織化学的染色によってＣＤ３８＋癌と診断されたことがあるか、またはＣＤ３８＋癌と診断された。一部の実施形態において、患者は、発色性インサイチュー混成化によってＣＤ３８＋癌と診断されたか、または診断されたことがある。一部の実施形態において、患者は、癌の生検または外科的サンプルに対する蛍光インサイチュー混成化によってＣＤ３８＋癌と診断されたことがあるか、またはＣＤ３８＋癌と診断された。一部の実施形態において、患者は、遺伝子分析によって、例えば、ＣＤ３８突然変異癌、例えば、ＣＤ３８遺伝子の体細胞突然変異の識別によってＣＤ３８＋癌と診断されたことがあるか、またはＣＤ３８＋癌と診断された。

【0381】

一部の実施形態において、患者は、自家造血幹細胞移植（ＡＳＣＴ）の対象者ではない多発性骨髄腫患者である。一部の実施形態において、患者は、ＡＳＣＴ施術を受けた後、再発性または難治性である。

【0382】

場合によっては、患者は、１つ以上のステロイド、アルキル化剤、および／またはアントラサイクリン、プロテアソーム阻害剤または免疫調節剤からなる群より選択される治療剤が投与された後、再発性であるか、または難治性である癌を有する、多発性骨髄腫患者である。

【0383】

一部の実施形態において、患者は、表７に記載された１つ以上の突然変異セット、ＣＤ３８遺伝子に挿入または欠損多形成、ＣＤ３８遺伝子のコピー数変異、ＣＤ３８遺伝子のメチル化突然変異、またはこれらの組み合わせを含む癌を有している。

【0384】

一部の実施形態において、患者は、癌、例えば、ＣＤ３８＋癌に関連する染色体転座を有している。一部の実施形態において、患者は、癌、例えば、ＣＤ３８＋癌に関連する融合遺伝子を有している。

【0385】

一部の実施形態において、患者は、癌、例えば、ＣＤ３８＋癌に関連する染色体転座を有している。一部の実施形態において、患者は、癌、例えば、ＣＤ３８＋癌に関連する融合遺伝子を有している。

【0386】

【表7-1】

【0387】

【表7-2】

【0388】

Ｃ．リンパ球除去
一部の実施形態において、患者は、治療する前にリンパ球除去される。

【0389】

例示的なリンパ球除去性化学療法用法は、関連する有用なバイオマーカーに加えて、ＷＯ２０１６／１９１７５６およびＷＯ２０１９／０７９５６４に記載されており、これらの文献は全体として援用により本明細書に取り込まれる。特定の実施形態において、リンパ球除去化学療法用法は、患者にシクロホスファミド投与（２００ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙ～２０００ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙ）およびフルダラビン投与（２０ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙ～９００ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙ）を含む。

【0390】

一部の実施形態において、リンパ球除去は、シクロホスファミド２５０または約２５０～５００または約５００ｍｇ／ｍ^２投与、例えば、シクロホスファミド２５０または約２５０～５００または約５００、２５０、４００、５００、約２５０、約４００または約５００ｍｇ／ｍ^２の投与を含む。

【0391】

一部の実施形態において、リンパ球除去は、フルダラビン２０または約２０ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙ～４０または約４０ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙ、例えば、３０または約３０ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙの投与を含む。

【0392】

一部の実施形態において、リンパ球除去は、シクロホスファミドとフルダラビン両方の投与を含む。

【0393】

一部の実施形態において、患者は、シクロホスファミド（２５０ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙ）およびフルダラビン（３０ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙ）の静脈内投与によってリンパ球除去処理される。

【0394】

一部の実施形態において、患者は、シクロホスファミド（５００ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙ）およびフルダラビン（３０ｍｇ／ｍ^２／ｄａｙ）の静脈内投与によってリンパ球除去処理される。

【0395】

一部の実施形態において、リンパ球除去は、ＮＫ細胞を１次投与する前の最大５日以内に行われる。一部の実施形態において、リンパ球除去は、ＮＫ細胞を１次投与する前の最大７日以内に行われる。

【0396】

一部の実施形態において、リンパ球除去は、ＮＫ細胞を１次投与する５日前から始まり、連続３日間毎日（すなわち、－５日から－３日）行われる。

【0397】

一部の実施形態において、リンパ球除去は、－５日、－４日および－３日目に行われる。

【0398】

Ｄ．投与
１．ＮＫ細胞
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、薬学的組成物、例えば、本願に記載の薬学的組成物の一部として投与される。細胞は解凍した後、場合によっては、その凍結防止剤が即席投与に適した場合には、何らかの追加的な操作なく、投与する。所定の個体に対して、治療用法は、よく共通バッチまたは供与体に由来するＮＫ細胞の分液または用量を複数個経時的に投与することを含む。

【0399】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞は、投与あたり、ＮＫ細胞１×１０^８または約１×１０^８～８×１０^９または約８×１０^９個投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、投与あたり、細胞１×１０^８または約１×１０^８、１×１０^９または約１×１０^９、４×１０^９または約４×１０^９、または８×１０^９または約８×１０^９個投与される。

【0400】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、毎週投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、４週または約４週間毎週投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、８週間または約８週間毎週投与される。

【0401】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、４週または約４週間隔週で投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、８週または約８週間隔週で投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６、または約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、または約１６週間隔週で投与される。

【0402】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、４ヶ月または約４ヶ月間毎月投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、８ヶ月または約８ヶ月間毎月投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１２ヶ月または約１２ヶ月間毎月投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１６ヶ月または約１６ヶ月間毎月投与される。

【0403】

一部の実施形態において、１次投与コースは、前述のように、ＮＫ細胞の毎週、隔週または毎月投与を含み、２次投与コースは、ＮＫ細胞の毎週、隔週または毎月投与を含む。一部の実施形態において、２次投与コースは、患者が癌進行、毒性または不耐性を経験するまで継続する。

【0404】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、注入用－対応媒質（ｉｎｆｕｓｉｏｎ－ｒｅａｄｙ ｍｅｄｉａ）、例えば、本願に記載されているように、静脈内投与に適した冷凍保存組成物中に冷凍保存される。

【0405】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、バイアルあたり、細胞が１×１０^８または約１×１０^８～８×１０^９または約８×１０^９個収容されたバイアルで冷凍保存される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１回用量を収容するバイアルで冷凍保存される。

【0406】

一部の実施形態において、細胞は、投与する前、例えば、３７℃の水槽で解凍する。

【0407】

一部の実施形態において、解凍したバイアルのＮＫ細胞は、１回投与容器、例えば、投与バッグに、例えば、バイアルアダプダおよび無菌シリンジを用いて無菌的に移す。ＮＫ細胞は、容器からＹ型血液／溶液セットフィルタによりＩＶ注入として、重力によって患者に投与することができる。

【0408】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、解凍後できるだけ早く、好ましくは、９０分以内に、例えば、８０分以内、７０分以内、６０分以内、５０分以内、４０分以内、３０分以内、２０分以内または１０分以内に投与する。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、解凍後３０分以内に投与する。

【0409】

一部の実施形態において、薬学的組成物は、シリンジを通して静脈内投与する。

【0410】

一部の実施形態において、患者に医薬品１ｍｌ、４ｍｌまたは１０ｍｌをシリンジを通して静脈内投与する。

【0411】

２．抗体

【0412】

一部の実施形態において、本願に記載のＮＫ細胞、例えば、本願に言及されたＮＫ細胞を含む薬学的組成物は、抗体、例えば、本願に記載の抗体、例えば、ＣＤ３８抗体と組み合わせて投与される。一部の実施形態において、抗体は、薬学的組成物の一部としてＮＫ細胞とともに投与される。一部の実施形態において、抗体は、ＮＫ細胞と分離して、例えば、個別薬学的組成物の一部として投与される。抗体は、ＮＫ細胞を投与する前、投与した後、または投与と同時に投与されてもよい。

【0413】

一部の実施形態において、抗体の用量または投与は、患者に抗体１，８００ｍｇを投与することを含む。

【0414】

一部の実施形態において、抗体は、ＮＫ細胞を投与する前に投与される。一部の実施形態において、抗体は、ＮＫ細胞を投与した後に投与される。

【0415】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、抗体投与を完了した後、少なくとも３０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分または２４０分に投与される。

【0416】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、抗体を投与した後、翌日に投与される。

【0417】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、各投与時に投与され、抗体は、投与の一部でのみ投与される。例えば、一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１週あたり１回投与され、抗体は、隔週または１ヶ月あたり１回投与される。

【0418】

一部の実施形態において、抗体は、毎週投与される。一部の実施形態において、抗体は、４週または約４週間毎週投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、８週間または約８週間毎週投与される。

【0419】

一部の実施形態において、抗体は、４週または約４週間隔週で投与される。一部の実施形態において、抗体は、８週または約８週間隔週で投与される。一部の実施形態において、抗体は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６、または約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、または約１６週間隔週で投与される。

【0420】

一部の実施形態において、抗体は、４ヶ月または約４ヶ月間毎月投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、８ヶ月または約８ヶ月間毎月投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１２ヶ月または約１２ヶ月間毎月投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１６ヶ月または約１６ヶ月間毎月投与される。

【0421】

一部の実施形態において、抗体は、初期８回は毎週、次の８回は隔週、そして、その後の投与は４週間隔で伝達され、投与は疾患が進行するまで継続してもよい。

【0422】

一部の実施形態において、１次投与コースは、抗体の、前述したように、毎週、隔週または毎月投与を含み、２次投与コースは、抗体の毎週、隔週または毎月投与を含む。一部の実施形態において、１次投与コースは、前述のように、抗体およびＮＫ細胞の毎週、隔週または毎月投与を含み、２次投与コースは、抗体およびＮＫ細胞の毎週、隔週または毎月投与を含む。一部の実施形態において、２次投与コースは、患者が癌の進行、毒性または不耐性を経験するまで継続する。

【0423】

一部の実施形態において、抗体は、８週間毎週投与される。一部の実施形態において、抗体は、８週間２週ごとに投与される。

【0424】

一部の実施形態において、抗体の用量は、細胞を１次投与する前に提供される。一部の実施形態において、抗体の減量された用量が細胞を１次投与する前に提供される。

【0425】

３．サイトカイン
一部の実施形態において、サイトカインを患者に投与する。

【0426】

一部の実施形態において、サイトカインは、薬学的組成物の一部としてＮＫ細胞とともに投与される。一部の実施形態において、サイトカインは、ＮＫ細胞とは別に、例えば、別の薬学的組成物の一部として投与される。

【0427】

一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２である。

【0428】

一部の実施形態において、ＩＬ－２は、皮下投与する。

【0429】

一部の実施形態において、ＩＬ－２は、ＮＫ細胞の投与を終了した後、１－４時間または約１～約４時間で投与する。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、ＮＫ細胞の投与を完了した後、少なくとも１時間の時点で投与する。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、ＮＫ細胞の投与を完了した後、最大４時間以内に投与する。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、ＮＫ細胞の投与を完了した後、最小１時間経過時から最大４時間以内に投与する。

【0430】

一部の実施形態において、ＩＬ－２は、最大１０，０００，０００ＩＵ／ｍ^２、例えば、最大１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００または１０，０００，０００ＩＵ／ｍ^２で投与される。

【0431】

一部の実施形態において、ＩＬ－２は、１，０００，０００または約１，０００，０００、２，０００，０００または約２，０００，０００、または３，０００，０００または約３，０００，０００、または４，０００，０００または約４，０００，０００、または５，０００，０００または約５，０００，０００、または６，０００，０００または約６，０００，０００、または７，０００，０００または約７，０００，０００、または８，０００，０００または約８，０００，０００、または９，０００，０００または約９，０００，０００、または１０，０００，０００または約１０，０００，０００ＩＵ／ｍ^２で投与される。

【0432】

一部の実施形態において、ＩＬ－２は、１×１０^６ＩＵ／ｍ^２または約１×１０^６ＩＵ／ｍ^２で投与される。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、２×１０^６ＩＵ／ｍ^２または約２×１０^６ＩＵ／ｍ^２で投与される。

【0433】

一部の実施形態において、ＩＬ－２は、患者に１×１０^６ＩＵ／ｍ^２未満で投与される。

【0434】

一部の実施形態において、ＩＬ－２は、均一用量（ｆｌａｔ ｄｏｓｅ）で患者に投与される。一部の実施形態において、均一用量６，０００，０００ＩＵまたは約６，０００，０００ＩＵが患者に投与される。

【0435】

一部の実施形態において、ＩＬ－２は、患者に投与しない。

【0436】

Ｅ．投与
「有効量」は、有利なまたは所望の結果を達成するのに十分な量である。例えば、治療学的含有量は、所望の治療学的効果を達成する量である。このような量は、疾患または疾患症状の開始を防止するのに必要な量、すなわち予防学的有効量と同一であるか、または異なっていてもよい。有効量は、１回以上の投与、適用または投与量で投与される。治療学的化合物の治療学的有効量（すなわち、有効な投与量）は、選択した治療学的化合物によって決定される。組成物は、２日間隔で１回を含めて、１日あたり１回以上または１週間あたり１回以上投与することができる。当該技術分野における当業者であれば、非－制限的に疾患または障害の重症度、以前の治療、個体の一般的な健康状態および／または年齢および存在するその他の疾患を含めて、一部の因子が個体を効果的に治療するのに要求される投与量および時間に影響を及ぼしうることが分かるであろう。これとともに、本発明に記載の治療学的化合物を治療学的有効量で用いて個体を治療することは、単一治療または一連の治療を含むことができる。

【0437】

治療学的化合物の投与量、毒性および治療学的効能は、細胞培養物または実験動物において、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％で致命的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療学的に有効な用量）を決定するための標準薬学的手順によって決定可能である。毒性と治療学的効果との間の用量比率が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率で表現することができる。治療指数が高い化合物が好ましい。毒性副作用がある化合物を使用してもよいが、非－感染細胞に対する潜在的な損傷を最小化して副作用を低減するために、このような化合物が発病した組織部位に標的伝達するシステムを設計するのに注意しなければならない。

【0438】

ヒトに使用するための投与量範囲を公式化するのに細胞培養分析および動物実験から得られたデータを用いることができる。このような化合物の投与量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内であってもよい。投与量は、採用された投薬形態および活用された投与経路によってこのような範囲内で異なっていてもよい。本発明の方法に用いられる任意の化合物の場合、治療学的有効量は、まず、細胞培養分析で推定することができる。用量は、細胞培養で決定されたように、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の１／２を達成する試験化合物の濃度）を含む循環性血漿濃度範囲を達成するように動物モデルで公式化することができる。このような情報を用いてヒトに有用な用量をより正確に決定することができる。血漿内レベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定可能である。

【0439】

Ｆ．組み合わせ療法
一部の実施形態において、本方法は、本願に記載のＮＫ細胞およびＣＤ３８標的抗体を他の療法、例えば、抗体、ＮＫ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）、抗体薬物接合体（ＡＤＣ）、化学療法薬物、例えば、小分子薬物、免疫チェックポイント阻害剤、およびこれらの組み合わせと組み合わせ投与することを含む。

【0440】

１．小型分子／化学療法薬物
一部の実施形態において、追加的な療法は、小分子薬物である。一部の実施形態において、追加的な療法は、化学療法薬物である。一部の実施形態において、追加的な療法は、小分子化学療法薬物である。このような小分子薬物は、適応ＮＫ細胞療法が追加される現行の標準管理治療用法を含むことができる。場合によっては、本願に記載のＮＫ細胞の使用は、所望の効果を達成するのに必要な小分子薬物の効能を強化したり、小分子薬物の量を低減したり、または小分子薬物の毒性減少などによって、小分子薬物の効果を強化することができる。

【0441】

一部の実施形態において、薬物は、ステロイドである。場合によっては、ステロイドは、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ベタメタゾン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態において、薬物は、プロテアソーム阻害剤である。場合によっては、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、カルフィルゾミブ（ｃａｒｆｉｌｚｏｍｉｂ）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態において、薬物は、化学治療剤である。一部の実施形態において、化学治療剤は、メルファラン、レナリドミド（ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、サリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、ポマリドミド（ｐｏｍａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態において、追加的な療法は、任意のステロイド、プロテアソーム阻害剤、および前述の化学治療剤の組み合わせなどの、複数の小分子薬物の使用を含む。例えば、追加的な療法は、ボルテゾミブ、メルファランおよびプレドニゾンを投与することを含むことができる。他の例として、追加的な療法は、レナリドミドおよびデキサメタゾンを投与することを含むことができる。さらに他の例として、追加的な療法は、ボルテゾミブ、サリドマイドおよびデキサメタゾンを投与することを含むことができる。さらに他の例として、追加的な療法は、ボルテゾミブおよびデキサメタゾンを投与することを含むことができる。さらに他の例として、追加的な療法は、ポマリドミドおよびデキサメタゾンを投与することを含むことができる。さらに他の例として、追加的な療法は、カルフィルゾミブおよびデキサメタゾンを投与することを含むことができる。このような実施形態の一部は、例えば、本願に記載のチェックポイント阻害剤などの免疫調節剤を投与することを追加的に含むことができる。

【0442】

一部の実施形態において、薬物は、［（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，７Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１５Ｓ）－４－アセチルオキシ－１，９，１２－トリヒドロキシ－１５－［（２Ｒ，３Ｓ）－２－ヒドロキシ－３－［（２－メチルプロパン－２－イル）オキシカルボニルアミノ］－３－フェニルプロパノイル］オキシ－１０，１４，１７，１７－テトラメチル－１１－オキソ－６－オキサテトラシクロ［１１．３．１．０^３，１０．０^４，７］ヘプタデス－１３－エン－２－イル］ベンゾエート（ドセタキセル）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0443】

一部の実施形態において、薬物は、［（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，７Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１５Ｓ）－４，１２－ジアセチルオキシ－１５－［（２Ｒ，３Ｓ）－３－ベンズアミド－２－ヒドロキシ－３－フェニルプロパノイル］オキシ－１，９－ジヒドロキシ－１０，１４，１７，１７－テトラメチル－１１－オキソ－６－オキサテトラシクロ［１１．３．１．０^３，１０．０^４，７］ヘプタデス－１３－エン－２－イル］ベンゾエート（パクリタキセル）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0444】

一部の実施形態において、薬物は、６－Ｎ－（４，４－ジメチル－５Ｈ－１，３－オキサゾール－２－イル）－４－Ｎ－［３－メチル－４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル］キナゾリン－４，６－ジアミン（ツカチニブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0445】

一部の実施形態において、薬物は、ペンチルＮ－［１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－メチルオキソラン－２－イル］－５－フルオロ－２－オキソピリミジン－４－イル］カルバメート（カペシタビン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0446】

一部の実施形態において、薬物は、アザニド；シクロブタン－１，１－ジカルボン酸；プラチナ（２＋）（カルボプラチン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0447】

一部の実施形態において、薬物は、メチル（１Ｒ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｒ，１２Ｒ，１９Ｒ）－１１－アセチルオキシ－１２－エチル－４－［（１２Ｓ，１４Ｒ）－１６－エチル－１２－メトキシカルボニル－１，１０－ジアザテトラシクロ［１２．３．１．０^３，１１．０^４，９］オクタデカ－３（１１），４，６，８，１５－ペンタエン－１２－イル］－１０－ヒドロキシ－５－メトキシ－８－メチル－８，１６－ジアザペンタシクロ［１０．６．１．０^１，９．０^２，７．０^{１６，１９}］ノナデカ－２，４，６，１３－テトラエン－１０－カルボキシレート（ビノレルビン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0448】

一部の実施形態において、薬物は、Ｎ－［３－クロロ－４－［（３－フルオロフェニル）メトキシ］フェニル］－６－［５－［（２－メチルスルホニルエチルアミノ）メチル］フラン－２－イル］キナゾリン－４－アミン（ラパチニブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0449】

一部の実施形態において、薬物は、（Ｅ）－Ｎ－［４－［３－クロロ－４－（ピリジン－２－イルメトキシ）アニリノ］－３－シアノ－７－エトキシキノリン－６－イル］－４－（ジメチルアミノ）ｂｕｔ－２－エンアミド（ネラチニブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0450】

一部の実施形態において、薬物は、６－アセチル－８－シクロペンチル－５－メチル－２－［（５－ピペラジン－１－イルピリジン－２－イル）アミノ］ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－オン（パルボシクリブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0451】

一部の実施形態において、薬物は、７－シクロペンチル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－［（５－ピペラジン－１－イルピリジン－２－イル）アミノ］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－６－カルボキサミド（リボシクリブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0452】

一部の実施形態において、薬物は、Ｎ－［５－［（４－エチルピペラジン－１－イル）メチル］ピリジン－２－イル］－５－フルオロ－４－（７－フルオロ－２－メチル－３－プロパン－２－イルベンズイミダゾール－５－イル）ピリミジン－２－アミン（アベマシクリブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0453】

一部の実施形態において、薬物は、（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｅ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）－１，１８－ジヒドロキシ－１２－［（２Ｒ）－１－［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）－４－（２－ヒドロキシエトキシ）－３－メトキシシクロヘキシル］プロパン－２－イル］－１９，３０－ジメトキシ－１５，１７，２１，２３，２９，３５－ヘキサメチル－１１，３６－ジオキサ－４－アザトリシクロ［３０．３．１．０^４，９］ヘキサトリアコンタ－１６，２４，２６，２８－テトラエン－２，３，１０，１４，２０－ペントン（エベロリムス）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0454】

一部の実施形態において、薬物は、（２Ｓ）－１－Ｎ－［４－メチル－５－［２－（１，１，１－トリフルオロ－２－メチルプロパン－２－イル）ピリジン－４－イル］－１，３－チアゾール－２－イル］ピロリジン－１，２－ジカルボキサミド（アルペリシブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0455】

一部の実施形態において、薬物は、４－［［３－［４－（シクロプロパンカルボニル）ピペラジン－１－カルボニル］－４－フルオロフェニル］メチル］－２Ｈ－フタラジン－１－オン（オラパリブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0456】

一部の実施形態において、薬物は、（１１Ｓ，１２Ｒ）－７－フルオロ－１１－（４－フルオロフェニル）－１２－（２－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）－２，３，１０－トリアザトリシクロ［７．３．１．０^５，１３］トリデカ－１，５（１３），６，８－テトラエン－４－オン（タラゾパリブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0457】

一部の実施形態において、薬物は、Ｎ－［２－［２－（ジメチルアミノ）エチル－メチルアミノ］－４－メトキシ－５－［［４－（１－メチルインドール－３－イル）ピリミジン－２－イル］アミノ］フェニル］プロプ－２－エンアミド（オシメルチニブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0458】

一部の実施形態において、薬物は、Ｎ－（３－クロロ－４－フルオロフェニル）－７－メトキシ－６－（３－モルホリン－４－イルプロポキシ）キナゾリン－４－アミン（ゲフィチニブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0459】

一部の実施形態において、薬物は、Ｎ－（３－エチニルフェニル）－６，７－ビス（２－メトキシエトキシ）キナゾリン－４－アミン（エルロチニブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0460】

一部の実施形態において、薬物は、（Ｅ）－Ｎ－［４－（３－クロロ－４－フルオロアニリノ）－７－［（３Ｓ）－オキソラン－３－イル］オキシキナゾリン－６－イル］－４－（ジメチルアミノ）ｂｕｔ－２－エンアミド（アファチニブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0461】

一部の実施形態において、薬物は、アザン（ａｚａｎｅ）；ジクロロプラチナ（シスプラチン、プラチノール）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0462】

一部の実施形態において、薬物は、アザニド；シクロブタン－１，１－ジカルボン酸；プラチナ（２＋）（カルボプラチン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0463】

一部の実施形態において、薬物は、４－アミノ－１－［（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３，３－ジフルオロ－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）オキソラン－２－イル］ピリミジン－２－オン（ゲムシタビン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0464】

一部の実施形態において、薬物は、（２Ｓ）－２－［［４－［２－（２－アミノ－４－オキソ－３，７－ジヒドロピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル）エチル］ベンゾイル］アミノ］ペンタン二酸（ペメトレキセド）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0465】

一部の実施形態において、薬物は、Ｎ，Ｎ－ビス（２－クロロエチル）－２－オキソ－１，３，２λ^５－オキサザホスフィナン－２－アミン（シクロホスファミド）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0466】

一部の実施形態において、薬物は、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）－２－（６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル）－５－（ヒドロキシメチル）オキソラン－３，４－ジオール（フルダラビン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0467】

一部の実施形態において、薬物は、（７Ｓ，９Ｓ）－７－［（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｓ）－４－アミノ－５－ヒドロキシ－６－メチルオキサン－２－イル］オキシ－６，９，１１－トリヒドロキシ－９－（２－ヒドロキシアセチル）－４－メトキシ－８，１０－ジヒドロ－７Ｈ－テトラセン－５，１２－ジオン（ドキソルビシン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0468】

一部の実施形態において、薬物は、メチル（１Ｒ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｒ，１２Ｒ，１９Ｒ）－１１－アセチルオキシ－１２－エチル－４－［（１３Ｓ，１５Ｓ，１７Ｓ）－１７－エチル－１７－ヒドロキシ－１３－メトキシカルボニル－１，１１－ジアザテトラシクロ［１３．３．１．０^４，１２．０^５，１０］ノナデカ－４（１２），５，７，９－テトラエン－１３－イル］－８－ホルミル－１０－ヒドロキシ－５－メトキシ－８，１６－ジアザペンタシクロ［１０．６．１．０^１，９．０^２，７．０^{１６，１９}］ノナデカ－２，４，６，１３－テトラエン－１０－カルボキシレート（ビンクリスチン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0469】

一部の実施形態において、薬物は、（８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１７－ヒドロキシ－１７－（２－ヒドロキシアセチル）－１０，１３－ジメチル－６，７，８，９，１２，１４，１５，１６－オクタヒドロシクロペンタ［ａ］フェナントレン－３，１１－ジオン（プレドニゾン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0470】

一部の実施形態において、薬物は、Ｎ，３－ビス（２－クロロエチル）－２－オキソ－１，３，２λ^５－オキサザホスフィナン－２－アミン（イホスファミド）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0471】

一部の実施形態において、薬物は、（５Ｓ，５ａＲ，８ａＲ，９Ｒ）－５－［［（２Ｒ，４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，８ａＳ）－７，８－ジヒドロキシ－２－メチル－４，４ａ，６，７，８，８ａ－ヘキサヒドロピラノ［３，２－ｄ］［１，３］ジオキシン－６－イル］オキシ］－９－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメトキシフェニル）－５ａ，６，８ａ，９－テトラヒドロ－５Ｈ－［２］ベンゾフロ［６，５－ｆ］［１，３］ベンゾジオキソール－８－オン（エトプシド）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0472】

一部の実施形態において、薬物は、（８Ｓ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｒ）－９－フルオロ－１１，１７－ジヒドロキシ－１７－（２－ヒドロキシアセチル）－１０，１３，１６－トリメチル－６，７，８，１１，１２，１４，１５，１６－オクタヒドロシクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オン（デキサメタゾン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0473】

一部の実施形態において、薬物は、（８Ｓ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｒ）－９－フルオロ－１１，１７－ジヒドロキシ－１７－（２－ヒドロキシアセチル）－１０，１３，１６－トリメチル－６，７，８，１１，１２，１４，１５，１６－オクタヒドロシクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オン（シタラビン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。

【0474】

２．ＮＫ細胞エンゲージャー
一部の実施形態において、追加的な療法は、ＮＫ細胞エンゲージャー（ＮＫ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）、例えば、二重特異性または三重特異性抗体である。

【0475】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャーは、ＣＤ１６と、疾患－関連抗原、例えば、癌－関連抗原、例えば、本願に記載の癌抗原、例えば、ＣＤ３８に対する二重特異性抗体である。一部の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャーは、ＣＤ１６と、疾患－関連抗原２種、例えば、癌－関連抗原、例えば、本願に記載の抗原に対する三重特異性抗体である。

【0476】

３．チェックポイント阻害剤
一部の実施形態において、追加的な療法は、免疫チェックポイント阻害剤である。

【0477】

一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。

【0478】

一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＭ－３阻害剤、ＫＩＲ阻害剤、ＬＡＧ－３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＣＤ－９６阻害剤、ＳＩＲＰα阻害剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。

【0479】

一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）阻害剤、ＴＩＭ－３阻害剤、Ｂ７－Ｈ３阻害剤、Ｂ７－Ｈ４阻害剤、Ａ２ａＲ阻害剤、ＣＤ７３阻害剤、ＮＫＧ２Ａ阻害剤、ＰＶＲＩＧ／ＰＶＲＬ２阻害剤、ＣＥＡＣＡＭ１阻害剤、ＣＥＡＣＡＭ５阻害剤、ＣＥＡＣＡＭ６阻害剤、ＦＡＫ阻害剤、ＣＣＬ２阻害剤、ＣＣＲ２阻害剤、ＬＩＦ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＳＩＲＰα阻害剤、ＣＳＦ－１阻害剤、Ｍ－ＣＳＦ阻害剤、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤、ＩＬ－１阻害剤、ＩＬ－１Ｒ３阻害剤、ＩＬ－ＲＡＰ阻害剤、ＩＬ－８阻害剤、ＳＥＭＡ４Ｄ阻害剤、Ａｎｇ－２阻害剤、ＣＥＬＶＥＲ－１阻害剤、Ａｘｌ阻害剤、ホスファチジルセリン阻害剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。

【0480】

一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、表８に列挙された物質、またはこれらの組み合わせから選択される。

【0481】

【表8】

【0482】

一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体である。

【0483】

一部の実施形態において、ＰＤ－１ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、トリパリマブ（ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ）、セミプリマブ－ｒｗｌｃ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ－ｒｗｌｃ）、シンチリマブ（ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。

【0484】

一部の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。

【0485】

一部の実施形態において、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）である。

【0486】

一部の実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、表９に示した阻害剤の群より選択される。

【0487】

【表9-1】

【0488】

【表9-2】

【0489】

【表9-3】

【0490】

一部の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、表１０に示した阻害剤の群より選択される。

【0491】

【表10-1】

【0492】

【表10-2】

【0493】

一部の実施形態において、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、表１１に示した阻害剤の群より選択される。

【0494】

【表11】

【0495】

一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、小分子薬物である。小分子チェックポイント阻害剤は、例えば、ＷＯ２０１５／０３４８２０Ａ１、ＷＯ２０１５／１６０６４１Ａ２、ＷＯ２０１８／００９５０５Ａ１、ＷＯ２０１７／０６６２２７Ａ１、ＷＯ２０１８／０４４９６３Ａ１、ＷＯ２０１８／０２６９７１Ａ１、ＷＯ２０１８／０４５１４２Ａ１、ＷＯ２０１８／００５３７４Ａ１、ＷＯ２０１７／２０２２７５Ａ１、ＷＯ２０１７／２０２２７３Ａ１、ＷＯ２０１７／２０２２７６Ａ１、ＷＯ２０１８／００６７９５Ａ１、ＷＯ２０１６／１４２８５２Ａ１、ＷＯ２０１６／１４２８９４Ａ１、ＷＯ２０１５／０３３３０１Ａ１、ＷＯ２０１５／０３３２９９Ａ１、ＷＯ２０１６／１４２８８６Ａ２、ＷＯ２０１６／１４２８３３Ａ１、ＷＯ２０１８／０５１２５５Ａ１、ＷＯ２０１８／０５１２５４Ａ１、ＷＯ２０１７／２０５４６４Ａ１、ＵＳ２０１７／０１０７２１６Ａ１、ＷＯ２０１７／０７００８９Ａ１、ＷＯ２０１７／１０６６３４Ａ１、ＵＳ２０１７／０１７４６７９Ａ１、ＵＳ２０１８／００５７４８６Ａ１、ＷＯ２０１８／０１３７８９Ａ１、ＵＳ２０１７／０３６２２５３Ａ１、ＷＯ２０１７／１９２９６１Ａ１、ＷＯ２０１７／１１８７６２Ａ１、ＵＳ２０１４／１９９３３４Ａ１、ＷＯ２０１５／０３６９２７Ａ１、ＵＳ２０１４／０２９４８９８Ａ１、ＵＳ２０１６／０３４０３９１Ａ１、ＷＯ２０１６／０３９７４９Ａ１、ＷＯ２０１７／１７６６０８Ａ１、ＷＯ２０１６／０７７５１８Ａ１、ＷＯ２０１６／１００６０８Ａ１、ＵＳ２０１７／０２５２４３２Ａ１、ＷＯ２０１６／１２６６４６Ａ１、ＷＯ２０１５／０４４９００Ａ１、ＵＳ２０１５／０１２５４９１Ａ１、ＷＯ２０１５／０３３３０３Ａ１、ＷＯ２０１６／１４２８３５Ａ１、ＷＯ２０１９／００８１５４Ａ１、ＷＯ２０１９／００８１５２Ａ１およびＷＯ２０１９０２３５７５Ａ１に言及されている。

【0496】

一部の実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、２－［［４－アミノ－１－［５－（１－アミノ－２－ヒドロキシプロピル）－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル］－４－オキソブチル］カルバモイルアミノ］－３－ヒドロキシプロパン酸（ＣＡ－１７０）である。

【0497】

一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、（Ｓ）－１－（３－ブロモ－４－（（２－ブロモ－［１，１’－ビフェニル］－３－イル）メトキシ）ベンジル）ピペリジン－２－カルボン酸である。

【0498】

一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ペプチドである。例えば、Ｓａｓｉｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｉｎｓｐｉｒｅｄ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ８：１０００７３（２０２０）を参照する。

【0499】

ＶＩＩ．変異体
一部の実施形態において、本願に記載の融合タンパク質またはその構成要素、または本願に記載のＮＫ細胞遺伝子型は、（例、本願に提供された）例示的な配列のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または１００％同一であり、例えば、本願に記載の突然変異を含み、またはこれに加えて、例えば、保存的な突然変異で置換された例示的な配列の残基として最大１％、２％、５％、１０％、１５％または２０％の差を有する。好ましい実施形態において、変異体は、親配列の所望の活性を維持する。

【0500】

核酸配列２種の配列同一性を確認するために、配列を最適に比較するために整列する（例えば、最適に整列するために第１アミノ酸または核酸配列および第２アミノ酸または核酸配列のいずれか１つまたは両方にギャップが導入され、非－相同的な配列は比較の目的では無視できる）。比較の目的で整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％であり、一部の実施形態において、少なくとも９０％または１００％である。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でヌクレオチドを比較する。第１配列のある位置に第２配列の対応する位置と同一のヌクレオチドが存在すれば、その分子はその位置で同一である（本願に使用されているように、核酸の「同一性」は、核酸の「相同性」と同一である）。配列２種間の同一性％は、配列２個を最適に整列するために導入されるべき各ギャップの長さとギャップの個数を考慮した、配列に共有された同一の位置個数に対する関数である。

【0501】

対象ポリペプチドまたは核酸配列（すなわち、クエリ）および第２ポリペプチドまたは核酸配列（すなわち、標的）間の同一性％は、当該技術分野の技術内で多様な方式で、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ整列（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．ａｎｄ Ｍ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ１４７：１９５－７）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓ^ＴＭ、Ｓｃｈｗａｒｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆ（１９７９）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｄ，ｐｐ３５３－３５８に取り込まれているような「ＢｅｓｔＦｉｔ」（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２－４８９（１９８１））；ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｗ．Ｇｉｓｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ２１５：４０３－１０）、ＢＬＡＳＴ－２、ＢＬＡＳＴ－Ｐ、ＢＬＡＳＴ－Ｎ、ＢＬＡＳＴ－Ｘ、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、ＣＬＵＳＴＡＬまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのように公開的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて決定する。これとともに、当該技術分野における当業者は、比較中の配列の長さ全体に対して最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムなどの、整列を決定するための適切な媒介変数を決定することができる。一般的に、標的タンパク質または核酸の場合、比較の長さは、標的の任意の長さ、最大で、および標的の全長長さなど（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％）であってもよい。本発明の目的において、同一性％は、クエリ配列の全長長さを基準とする。

【0502】

本発明の目的において、配列２種の配列比較および同一性％の決定は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリクスを用い、ギャップペナルティ１２、ギャップ延長ペナルティ４およびフレームシフトギャップペナルティ５を適用して達成することができる。

【0503】

保存的な置換は、典型的に下記の群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。

【0504】

ＶＩＩＩ．定義

【0505】

他に断らない限り、本願に使用されたすべての技術用語、表記法およびその他の技術および科学用語または用語法は、請求内容の属する技術分野における当業者が通常理解する意味と同じ意味があると意図される。場合によっては、通常理解される意味を有する用語が明確性および／または容易な参照のために本願で定義されるが、本発明においてこのような定義を含むことが必ずしも当該技術分野で一般的に理解されるものと実質的な差異を意味すると解釈されてはならない。

【0506】

本出願全体において、多様な実施形態が範囲形式で提示される。範囲形式の記述は、主に便宜性および簡潔性のためのものに過ぎず、開示内容の範囲に変更できない制限として解釈されてはならない。このため、範囲の記述はできるだけすべての下位範囲のみならず、その範囲に属する個々の数値を具体的に言及するものと見なさなければならない。例えば、１～６のような範囲の記述は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などのような下位範囲のみならず、その範囲に属する個々の数値、例えば、１、２、３、４、５および６を具体的に言及するものと見なさなければならない。これは範囲の幅に関係なく適用される。

【0507】

本明細書および請求項に使用されているように、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈上、他に明示されない限り、複数の参照を包括する。例えば、用語「サンプル」は、サンプルの混合物をはじめとする複数のサンプルを包括する。

【0508】

用語「確認」、「測定」、「評価」、「判定」、「検定」および「分析」は、本発明において相互互換的にしばしば測定タイプを指すために使用される。これらの用語は、要素の存在または不在を決定（例、検出）することを含む。これらの用語は、定量的な、定性的なまたは定量および定性的な決定を網羅することができる。評価は、相対的または絶対的であってもよい。「の存在の検出」は、それが文脈によって存在の有無を確認すること以外にも、存在する何らかの量を決定することを包括することができる。

【0509】

用語「個体」、「個人」または「患者」は、本発明においてしばしば相互互換的に使用される。

【0510】

用語「生体内」は、個体の身体で行われる現象を示すために使用される。

【0511】

用語「生体外」は、個体の身体外部で行われる現象を示すために使用される。生体外分析は、個体で行われない。むしろ、これは個体から分離されたサンプルに対して行われる。サンプルに対して行われる生体外分析の一例が「試験管内」分析である。

【0512】

用語「試験管内」は、物質が得られる生物学的供給源から分離されるように実験試薬を収容するための容器内で行われる現象を指すために使用される。試験管内分析は、生きている細胞または死滅細胞を用いた細胞ベースの分析を網羅することができる。また、試験管内分析は、無傷の細胞を用いない無－細胞性分析を網羅することもできる。

【0513】

本願に使用されているように、数字の用語「約」は、当該数字の１０％がその数字から追加または控除されることを意味する。範囲の用語「約」は、その範囲から最低値の１０％を引いた値から最大値の１０％を加えた値までを意味する。

【0514】

本願に使用されているように、用語「緩衝剤溶液」は、弱酸とその対塩基、またはその逆で構成された混合物からなる水性溶液を指す。

【0515】

本願に使用されているように、用語「細胞培養培地」は、糖、アミノ酸、多様な営養分、無機物質などのように細胞の生長および増殖に必須の因子を含む、試験管内細胞生長および増殖のための混合物を指す。

【0516】

本願に使用されているような緩衝剤溶液は、細胞培養培地ではない。

【0517】

本願に使用されているように、用語「バイオリアクタ」は、溶存酸素濃度、溶存二酸化炭素濃度、ｐＨおよび温度などの細胞培養に影響を及ぼす一連の条件を引き続き統制可能な培養装置を指す。

【0518】

本願に使用されているように、用語「ベクター」は、これに連結された他の核酸を増幅させることができる核酸分子を意味する。この用語は、自己－複製性核酸構造としてベクターのみならず、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを網羅する。一部のベクターは、本発明の核酸分子またはポリヌクレオチドを伝達するのに適合する。一部のベクターは、それに作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本願において発現ベクターと言及される。

【0519】

用語「作動可能に連結された」は、２以上の核酸配列またはポリペプチド要素が通常物理的に連結されており、互いに機能的な関係で存在することを意味する。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写または発現を開始または調節できれば、そのプロモーターは、コーディング配列に作動するように連結されたものであり、この場合、コーディング配列は、プロモーター「の統制下」にあると理解されなければならない。

【0520】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互互換的に使用され、このような細胞の子孫を含めて外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞は、継代培養回数とは関係なく１次操作された（例、形質転換された）細胞およびこれに由来する子孫を網羅する、「操作された細胞」、「形質転換体」、および「形質転換された細胞」を包括する。子孫は、親細胞と核酸の構成が完全に同一でなくてもよいし、突然変異を含むことができる。本来形質転換された細胞から選別または選択されたものと同一の機能または生物学的活性を有する突然変異子孫も本発明に含まれる。

【0521】

適切な場合、宿主細胞は、本願に記載されているような融合タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドで安定的にまたは一時的に形質感染できる。

【0522】

本発明に使用されたセクションの見出しは単なる構成上の理由に過ぎず、記述した発明の内容を制限すると解釈されてはならない。

【実施例】

【0523】

ＩＸ．実施例
以下の実施例は単に例示的な目的として含まれるに過ぎず、本発明の範囲を制限すると意図されない。

【0524】

実施例１：規格品ＮＫ細胞療法プラットフォーム
ＮＫ細胞を増幅および刺激する方法の一例を図１に示す。

【0525】

受容体ＣＤ１６の高親和性変異体（１５８Ｖ／Ｖ変異体、例えば、Ｋｏｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，「ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｖ／Ｆ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＩｇＧ ｂｙ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ，Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ－４８Ｌ／Ｒ／Ｈ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ」，Ｂｌｏｏｄ９０：１１０９－１４（１９９７）参照）およびＫＩＲ－Ｂ遺伝子型（ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子、例えば、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＫＩＲ）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｇｉｏｎ：Ｇｅｎｅ－Ｏｒｄｅｒ，Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ａｌｌｅｌｉｃ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ」，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ１９０：４０－５２（２００２）；およびＰｙｏ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ ａｎｄ Ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｇｒｏｕｐ Ａ ａｎｄ Ｂ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｇ－ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｏｃｕｓ」，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ５：ｅ１５１１５（２０１０）参照）を有するＦＤＡ－許可された冷凍臍帯血単一ユニットをＮＫ細胞供給源として選択した。

【0526】

臍帯血ユニットを解凍し、遠心分離して冷凍媒質を除去した。その後、細胞調製物においてＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ細胞選別システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）およびＣＤ３（Ｔ細胞）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを用いてＴ細胞を枯渇処理した。総有核細胞（ＴＮＣ）６×１０^８個の集団をＭｉｃｒｏＢｅａｄｓで標識し、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ装置および緩衝剤を用いて分離した。Ｔ細胞を枯渇処理した後、主に単核球とＮＫ細胞である残りの細胞を洗った後、抗生剤－非含有媒質（ＣｅｌｌｇｒｏＳＣＧＭ）中に収集した。細胞調製物は、以後、総有核細胞数、生存性およびＣＤ３＋細胞％に対して分析した。図１に示されるように、臍帯血ＮＫ細胞はＣＤ３枯渇処理された。

【0527】

ＣＤ３－細胞調製物を増殖培地入りの気体透過性細胞増幅バッグに接種した。細胞は、複製不完全操作されたＨｕＴ－７８（ｅＨＵＴ－７８）フィーダー細胞と共培養してマスター細胞バンク（ＭＣＢ）集団に対して増幅を強化した。ＣｅｌｌｇｒｏＳＣＧＭ培養培地を最初に抗－ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）、ヒト血漿、グルタミンおよびＩＬ－２で補充した。

【0528】

図１に示すように、共培養段階のいずれかの段階中に、選択的にＮＫ細胞を、例えば、レンチウイルスベクターを用いてＮＫ細胞にＣＡＲを導入するように操作した。

【0529】

細胞は、静置培養として、５％ＣＯ_２平衡空気雰囲気下、３７℃で１２－１６日間、２－４日間隔で培地を追加的に交換しながら、培養した。培養物が１００倍以上に増幅されれば、培養された細胞を回収した後、冷凍媒質に懸濁してクライオバッグに充填した。この場合、このような共培養中にバッグまたはバイアルあたり細胞１０^８個のバッグまたはバイアル８０個が作られた。クライオバッグを速度制御型凍結器（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒａｔｅ ｆｒｅｅｚｅｒ）を用いて－１５０℃以下の気相液体窒素（ＬＮ_２）タンクで冷凍した。ＦＤＡ－許可された臍帯型ユニットに由来するこのような冷凍保存したＮＫ細胞をマスター細胞バンク（ＭＣＢ）として用いた。

【0530】

医薬品を製造するために、ＭＣＢから得られた冷凍細胞バッグを解凍した後、冷凍媒質を除去した。解凍した細胞は使い捨て培養バッグに接種し、フィーダー細胞、例えば、ｅＨＵＴ７８フィーダー細胞と共培養して医薬品を生産した。この場合、臍帯血ユニット１つあたり医薬品ロット数千個を生産するために細胞を５０ｌバイオリアクタで培養し（例えば、冷凍バイアル４，０００－８，０００個、それぞれ１０^９細胞／バイアル）、これを冷凍保存組成物と混合した後、冷凍バイアルのような複数の保管容器に入れて冷凍した。この医薬品は直接注入用に利用可能な規格品注入用対応製品（ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｒｅａｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔ）である。各医薬品ロット１つは患者数百～数千人に注入可能である（例えば、患者１００－１，０００人、例として、標的用量４×１０^９細胞）。

【0531】

実施例２：フィーダー細胞の増幅
一例として、適切なフィーダー細胞、例えば、ｅＨｕｔ－７８細胞を冷凍ストックから解凍し、１２５ｍｌフラスコでＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）８９％ｖ／ｖ、不活性化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（１０％ｖ／ｖ）およびグルタミン（ｈｙｃｌｏｎｅ）（２ｍＭ）を含む培養培地中に、３７℃または約３７℃で、３－７％ＣＯ_２または約３－７％ＣＯ_２下、１８－２４日または約１８－２４日間増幅および培養した。細胞は２－３日ごとに１２５ｍｌ－２ｌフラスコに分けた。細胞を遠心分離により回収し、ガンマ線を照射した。回収および放射線処理された細胞を２ｍｌ冷凍バイアルで冷凍保存媒質（Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０）と混合した後、速度制御型凍結器で５分あたり約１５℃の冷却速度で最終温度－９０℃または約－９０℃まで冷凍し、以後、液体窒素タンクまたは冷凍庫に移して、最終温度－１５０℃または約－１５０℃まで冷却した。

【0532】

冷凍した後、細胞生存率はオリジナル細胞数の７０％以上であり（ここで、少なくとも１．０×１０^８生存細胞／ｍｌ）、細胞の８５％以上がｔｍＴＮＦ－αを発現し、細胞の８５％以上がｍｂＩＬ－２１＋を発現し、細胞の８５％以上が４－１ＢＢＬを発現した。

【0533】

実施例３：ＮＫ細胞の増幅および刺激
一例として、好適なＮＫ細胞は４－１ＢＢＬ、膜結合型ＩＬ－２１および突然変異ＴＮＦα（「ｅＨｕｔ－７８Ｐ細胞」）を発現するように形質導入されたＨｕＴ－７８細胞をフィーダー細胞として用いて製造することができる。フィーダー細胞を１％（ｖ／ｖ）ＣｅｌｌＧｒｏ媒質に懸濁し、ガンマ線放射線装置で２０，０００ｃＧｙで照射した。種細胞（例えば、ＣＤ３－枯渇したＰＢＭＣまたはＣＤ３－枯渇した臍帯血細胞）をフィーダー細胞上でヒト血漿、グルタミン、ＩＬ－２およびＯＫＴ－３を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地中に静置培養として３７℃で培養した。２－４日間隔で細胞を分けた。総培養時間は１９日である。ＮＫ細胞を遠心分離により回収して冷凍保存した。解凍したＮＫ細胞を以下で構成された注入媒質中に患者に投与する：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ １ｘ、ＦｕｊｉＦｉｌｍ Ｉｒｖｉｎｅ）（５０％ｖ／ｖ）、アルブミン（ヒト）（２０％ｖ／ｖ ＯｃｔａＰｈａｒｍａアルブミン溶液：ヒトアルブミン≧９６％のタンパク質２００ｇ／ｌ、ソジウム１３０－１６０ｍｍｏｌ；≦２ｍｍｏｌポタシウム、０．０６４－０．０９６ｍｍｏｌ／ｇタンパク質Ｎ－アセチル－ＤＬ－トリプトファン、０．０６４－０．０９６ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、カプリル酸、ａｄ．１０００ｍｌの水）、デキストラン４０／デキストロース（２５％ｖ／ｖ Ｈｏｓｐｉｒａデキストラン４０／デキストロース注射液、以下を含むＵＳＰ：１０ｇ／１００ｍｌデキストラン４０および５ｇ／１００ｍｌ含水デキストロース（ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｈｙｄｒｏｕｓ）水溶液）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（５％ｖ／ｖ Ａｖａｎｔｏｒ ＤＭＳＬ溶液、密度１．１０１ｇ／ｃｍ^３、２０℃）。

【0534】

ある場合には、種細胞はＣＤ３－枯渇した臍帯血細胞である。細胞分画は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｔ細胞枯渇セット（（ＬＳ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｓｅｔ（１６２－０１）Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた免疫磁気選別によって、ＣＤ３細胞を枯渇させることができる。

【0535】

好ましくは、臍帯血種細胞はＦ１５８でＶ／Ｖ多形成（Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩＩＩａ－１５８ Ｖ／Ｖ遺伝子型）（Ｍｕｓｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．２００８Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ２６：１７８９）を有するＣＤ１６を発現するように選別する。好ましくは、臍帯血種細胞はＫＩＲ－Ｂハプロタイプである。

【0536】

実施例４：ＫＩＲ－ＢおよびＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｖに対して選別した臍帯血ＮＫ細胞は増幅後にＣＤ３８を低いレベルに発現する
ＫＩＲ－ＢおよびＣＤ１６ １５８ｖ／ｖに対して選別した互いに異なる供与者から得られた２種の臍帯血を用いて、実施例１に記載されているようにＮＫ細胞を増幅して、ＡＢ－１０１細胞を構築し、そして、１つの非－選別供与者臍帯血（対照群）でも構築した。フローサイトメトリー測定によって得られた細胞純度（ＣＤ５６＋ＣＤ３－％）を図９に示す。図１０および図１１に示しているように、ＣＤ３８発現は、非－選別ＮＫ細胞と比較して、ＫＩＲ－Ｂ／１５８Ｖ／Ｖ ＮＫ細胞で集団（陽性％、図１０）、そして個別的（陽性細胞の平均蛍光強度、図１１）にもより低かった。

【0537】

実施例５：増幅および刺激されたＮＫ－細胞の表現型
一例として、臍帯血ユニットに由来するＮＫ細胞は、実施例１に記載の増幅および刺激工程によりｅＨｕｔ－７８細胞を用いて増幅および刺激した。図４に示すように、得られた増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団は、一貫して高いＣＤ１６（１５８Ｖ）および活性化ＮＫ細胞受容体発現性を示した。

【0538】

実施例６：ＡＢ－１０１
ＡＢ－１０１は、患者、例えば、単クローン抗体またはＮＫ細胞エンゲージャーを用いて治療した患者においてＡＤＣＣ抗－腫瘍反応を強化するように考案された生体外増幅および活性化されたエフェクター細胞を含む、普遍的で、規格品の、冷凍保存された、同種異系臍帯血由来ＮＫ細胞療法製品である。ＡＢ－１０１は、Ｔリンパ球の枯渇処理によりＮＫ細胞に対して濃縮され、ＩＬ－２および抗－ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）が補充された操作済みの複製不完全性Ｔ細胞フィーダー細胞を用いて共培養された、臍帯血由来単核細胞（ＣＢＭＣ）で構成される。

【0539】

ＡＢ－１０１は、ＦＤＡ許可された臍帯血に由来する、特に治療学的単クローン抗体（ｍＡｂ）と組み合わせ使用して血液および固形腫瘍を治療するために考案された、同種異系ＮＫ－細胞製品である。ＡＢ－１０１製造工程は、以下の属性を有するＮＫ細胞生産物を作製する：

【0540】

・一貫性あるＮＫ細胞プロファイル。抗体が結合するＣＤ１６および腫瘍抗原－結合性／活性化受容体、例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、Ｎｋｐ３０およびＮＫｐ４４のような表面受容体の高い発現性。

【0541】

・ＫＩＲ－Ｂ－ハプロタイプ。ＫＩＲ－Ｂハプロタイプは、ハプロ同種移植状況（ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｓｅｔｔｉｎｇ）で臨床成果の改善および同種異系の状況でより高い治療学的潜在性に関連性がある。

【0542】

・ＣＤ１６ Ｆ１５８Ｖ多形成。ｍＡｂ Ｆｃ－結合する高親和性ＣＤ１６ Ｆ１５８Ｖ変異体は、改善された抗体依存的な細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を促進すると見られる。

【0543】

・非－変形のＮＫ細胞。遺伝子強化または遺伝子編集は、ＡＢ－１０１医薬品に必要でないか、またはその一部である。

【0544】

ＡＢ－１０１の構成成分および組成物を表１２に列挙する。ＡＢ－１０１は、成熟したＮＫ細胞を意味する自然細胞毒性受容体ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞（ＣＤ１６^＋、ＣＤ５６^＋）で構成される。ＡＢ－１０１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞および大食細胞（≦０．２％ＣＤ３^＋、≦１．０％ＣＤ１９^＋、≦１．０％ＣＤ１４^＋）を極少量含む。ＡＢ－１０１の培養に使用したｅＨｕＴ－７８Ｐフィーダー細胞の残留率はこの医薬品の≦０．２％である。

【0545】

【表12】

【0546】

初期安定性実験は、ＡＢ－１０１が、気相液体窒素下、最大６ヶ月間安定的であることを示す。６ヶ月後の期間で製品安定性を評価するための長期安定性実験は進行中であり、最新安定性情報は分析認証書に収録される。

【0547】

ＡＢ－１０１医薬品の作製は、以下のような核心的な段階で構成される（図５）：
・ＦＤＡ許可された臍帯血ユニット（Ｈｅｍａｃｏｒｄ、ＢＬＡ１２５９３７）解凍。
・臍帯血ユニット（ＣＢＵ）から冷凍－保存媒質の除去
・ＦＤＡ許可されたＶａｒｉｏ ＭＡＣＳ細胞選別システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いたＣＤ３枯渇
・操作されたフィーダー細胞（ｅＨｕＴ－７８細胞）を用いたバッグでの増幅および共培養
・ＡＢ－１０１マスター細胞バンク（約バッグ２００個）に対する検査および冷凍保存
・解凍（バッグ１個）、増幅および操作されたＨｕＴ－７８細胞を用いた共培養
・バイオリアクタで追加的な増幅
・回収および充填（１×１０^９ＮＫ細胞／バイアル）
・ＡＢ－１０１医薬品の冷凍保存（バイアル約１５０個）
・濃度、純度、効力および安定性を確認するための広範囲な特性究明。

【0548】

表１３に示すように、このような作製工程は高純度および活性のＡＢ－１０１医薬品ＮＫ細胞を大量に再現可能に生産する。データポイントは独立した臍帯血ユニット３個から得られた結果を示す。

【0549】

【表13】

【0550】

純度：ｅＨｕＴ－７８Ｐ残留物（ｅＨｕＴ－７８Ｐ細胞残留物）
ＡＢ－１０１医薬品においてｅＨｕＴ－７８Ｐ細胞残留物をフローサイトメトリー測定（ＦＡＣＳ）によって測定する。ＦＡＣＳを用いて生きているＣＤ３＋４－１ＢＢＬｈｉｇｈ＋ ｅＨｕＴ－７８Ｐを定量することにより、ＡＢ－１０１ ＤＰ内のｅＨｕＴ－７８残留物を検出する。ｅＨｕＴ－７８は、皮膚Ｔリンパ球としてＣＤ３を発現するＨｕＴ－７８細胞株に由来するものであるので、順次に、一重項、７－ＡＡＤおよびＣＤ３＋４－１ＢＢＬ＋をゲーティングするＦＡＣＳゲーティング戦略を利用する。ＨｕＴ－７８細胞株に４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、膜腫瘍壊死因子－α（ｍＴＮＦ－α）および膜結合型ＩＬ－２１（ｍｂＩＬ－２１）を形質導入した。遺伝子３種を強く発現するｅＨｕＴ－７８単一細胞を選別し、研究、マスターおよびワーキング細胞バンクを順次に確立した。これら遺伝子３種のうち、４－１ＢＢＬがＡＢ－１０１細胞バンクおよび最終医薬品において最も強く発現することが確認されたことから、ＦＡＣＳゲーティング戦略にこれを用いた。

【0551】

効力（ＡＢ－１０１ ＤＰ細胞：Ｋ５６２細胞１０：１での細胞毒性）
Ｋ５６２腫瘍細胞に対する細胞性細胞毒性能力を評価してＡＢ－１０１医薬品の効力を決定する。医薬品の細胞毒性は、蛍光測定分析で評価する。Ｋ５６２腫瘍細胞を３０μＭカルセイン－ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ）で３７℃で１時間染色する。医薬品サンプルと標識された腫瘍細胞を９６ウェルプレートで、３セットで３７℃および５％ＣＯ_２下、４時間光遮断下に共培養する。自発的な最大放出を提供するために、標的に１０％ＦＢＳまたは２％トリトン－Ｘ１００が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地を添加する。バックグラウンド蛍光を決定するために、それぞれのウェルに１０％ＦＢＳまたは２％トリトン－Ｘ１００が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地を添加する。蛍光リーダーを用いて励起４８５ｎｍおよび放出５３５ｎｍで蛍光を測定する。特異的な細胞毒性％を下記式によって計算する。

【0552】

【数1】

【0553】

効力（ＡＢ－１０１ ＤＰ細胞：Ｒａｍｏｓ細胞１０：１での細胞毒性）
前述の同一の方法および計算を用いてＲａｍｏｓ腫瘍細胞に対する細胞性細胞毒性能力を評価してＡＢ－１０１医薬品の効力を決定する。この検査に対する詳細事項は確認中である。

【0554】

実施例７：ＡＢ－１０１表現型特性の究明
様々なＡＢ－１０１バッチにおいて抗体－エンゲージングＣＤ１６および活性化、阻害性およびケモカイン受容体の発現だけでなく、純度をフローサイトメトリー測定により決定した。

【0555】

ＡＢ－１０１純度は細胞表面マーカーを用いて測定した：ＡＢ－１０１バッチは＞９９％ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞と＜０．１％ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋およびＣＤ１９＋細胞を含むことが観察された。ＡＢ－１０１でＣＤ１６発現を測定した。ＡＢ－１０１細胞のうち９５．１１±２．５１％がＣＤ１６＋であり、ＣＤ１６のＭＦＩ平均および中央値はそれぞれ１５３１１±６１８６および１３０９７±５５９２であった。ＮＫ細胞は多様なＮＫ特異的な活性化および阻害性受容体を発現することが知られている。検査した多様なＡＢ－１０１バッチにおいて、細胞の＞８０％がＣＤ１６、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ９４、ＮＫｐ３０、２Ｂ４、Ｔｉｍ－３、ＣＤ４４を発現し、細胞の４０～７０％はＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１を発現し、細胞の約３０％はＣＤ１６１およびＣＤ９６を発現し、細胞の１５％はＣＸＣＲ３を発現し、細胞の５％未満はその他の活性化阻害受容体を発現した。

【0556】

作製工程の互いに異なる３つの段階で細胞の表現型特徴を評価するために、本実験にＡＢ－１０１のＧＭＰバッチ２個を含めた：ＣＤ３＋細胞枯渇処理した後の臍帯血細胞；中間産物としてマスター細胞バンク（ＭＣＢ）、およびＡＢ－１０１最終医薬品（ＤＰ）。ＣＤ３枯渇した細胞、ＭＣＢおよびＤＰそれぞれで純度およびＮＫ細胞受容体を測定した。その結果によれば、まず、ＣＢに由来するＮＫ細胞は未成熟ＮＫ表現型を示すことが確認された。ＮＫ表現型は作製工程中に成熟した。ＭＣＢ段階では細胞の９０％以上がすでに成熟したＮＫ細胞で現れる表現型特徴を発現し、その他の細胞タイプマーカーは＜０．１％であった。ＣＤ３枯渇した細胞から、ＭＣＢまで、そして最終的にＤＰまで作製工程を通してＮＫ細胞－特異的な受容体のほとんどは発現レベルが増加した。

【0557】

略語リスト：ＮＫ：ナチュラルキラー細胞；ｍＡｂ：単クローン抗体；ＴＮＦ－α：腫瘍壊死因子α；ＣＸＣＲ：ＣＸＣケモカイン受容体；ＤＮＡＭ－１：ＤＮＡＸアクセサリー分子－１；ＣＲＡＣＣ：ＣＤ２－様受容体－活性化細胞毒性細胞；ＩＬＴ２：Ｉｇ－様転写体２；Ｔｉｍ－３：Ｔ－細胞免疫グロブリンムチン－３；７ＡＡＤ：７－アミノ－アクチノマイシンＤ；ＵＬＢＰ：ＵＬ１６－結合タンパク質；ＭＩＣＡ／Ｂ：ＭＨＣクラスＩチェーン－関連タンパク質ＡおよびＢ；ＲＡＥ１：リボ核酸流出１；Ｈ６０：ＮＫＧ２ＤはクラスＩ ＭＨＣ分子に関連する細胞表面リガンド２種と相互作用する；ＭＵＬＴ１：マウスＵＬ１６－結合タンパク質－様転写体１；ＭＨＣ：主組織適合性複合体；ＨＬＡ：ヒト白血球抗原。

【0558】

ＡＢ－１０１の純度は、ＮＫ細胞に対してはＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞、Ｔ細胞に対してはＣＤ３＋細胞、単核球に対してはＣＤ１４＋細胞、Ｂ細胞に対してはＣＤ１９＋細胞として表示する。ＡＢ－１０１バッチ計９個で純度を測定した。その結果、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞は９９．２７±０．５９％（平均±ＳＤ）、ＣＤ３＋細胞は０．０２±０．０３％、ＣＤ１４＋細胞は０．１０±０．１２％、そしてＣＤ１９＋細胞は０．０２±０．０４％であった（図６）。したがって、ＡＢ－１０１は高純度のＮＫ細胞で構成され、不純物として他のタイプの細胞はほとんど存在しないことが検証された。

【0559】

ＧＭＰ条件で作製したＣＤ３枯渇した細胞、ＭＣＢおよびＤＰの純度の比較
ＡＢ－１０１のＧＭＰバッチ２個を用いてＡＢ－１０１出発材料（ＣＤ３枯渇した細胞）、中間産物（マスター細胞バンク、ＭＣＢ）および最終医薬品（ＤＰ）の純度を分析した。ＣＤ３枯渇した細胞分画において細胞の５０～６０％はＮＫ細胞であり、その百分率はＭＣＢおよびＤＰで９０％以上に増加した。ＣＤ３枯渇した細胞分画の２０～３０％はＣＤ１４＋細胞およびＣＤ１９＋細胞であり、このような細胞百分率はＭＣＢおよびＤＰで０．１％未満に減少し、これはＡＢ－１０１ ＭＣＢおよびＡＢ－１０１の最終医薬品の純度を示す（図７、表１４）。

【0560】

【表14】

【0561】

ＧＭＰ条件で作製したＣＤ３枯渇した細胞、ＭＣＢおよびＤＰでのＮＫ細胞受容体の比較
ＡＢ－１０１のＧＭＰバッチをさらに用いて、ＡＢ－１０１出発材料（ＣＤ３枯渇した細胞）、中間産物（マスター細胞バンク、ＭＣＢ）および最終医薬品（ＤＰ）で多様なＮＫ細胞受容体の発現を分析した。ＡＢ－１０１出発材料（ＣＤ３枯渇した細胞）と比較した場合、いくつかのＮＫ細胞およびＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６およびＤＮＡＭ－１のような活性化受容体がＭＣＢおよび最終医薬品においてより高いレベルに発現したことが観察された。ＣＤ５７発現は、ＡＢ－１０１出発材料（ＣＤ３枯渇した細胞）と比較して、ＭＣＢおよび最終医薬品でより低かった（図８、表１５）。全般的に、データはＭＣＢおよび最終医薬品においてＮＫ細胞活性化受容体の発現増加を示し、これはＡＢ－１０１が腫瘍に対して効果的であることを意味する。

【0562】

【表15】

【0563】

結び
表面マーカー分析の使用で、ＡＢ－１０１製品の同一性および純度とバッチ間の一貫性が立証された。さらに、ＮＫ－特異的な活性化および阻害細胞表面マーカーに対する広範囲な評価により作製増幅工程後、ＡＢ－１０１製品の一貫したプロファイルが確立された。ＣＢ由来ＮＫ細胞は、末梢血（ＰＢ）由来ＮＫ細胞と比較して、ＮＫＧ２Ａの高発現およびＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ５７、ＩＬ－２Ｒ、ＣＤ１６、ＤＮＡＭ－１の低発現のような未成熟表現型を有するものであり、また、未成熟表現型を有するＣＢ由来ＮＫ細胞は、腫瘍細胞に対して細胞毒性が低いことが知られている。本実験のデータは、同種異系臍帯血（ＣＢ）に由来するＮＫ細胞製品、すなわちＡＢ－１０１が腫瘍細胞に対して潜在的により優れた細胞毒性を意味する主要活性化受容体を高いレベルに発現することを立証する。

【0564】

実施例８：ＡＢ－１０１毒性学
ＮＳＧマウスのＧＬＰ実験においてＡＢ－１０１の非－臨床的な毒性を評価した。本実験はＡＢ－１０１の急性および遅延性毒性プロファイルを評価するように設計した。ＡＢ－１０１を２つの用量水準、すなわち０．５×１０^７および２×１０^７細胞／動物で本実験で検査した。提案された検査用量範囲は最初のヒト実験（４×１０^９細胞／用量）で提供することを計画したヒト等価最高用量よりも多く露出する水準に製品を提供するように設計した。相対成長率（Ｎａｉｒ２０１６）に基づいて、０．５×１０^７細胞／マウスは１４×１０^９細胞／ヒトに相応し、２×１０^７細胞／マウスは５６×１０^９細胞／ヒトに相応するが、これは体重７０ｋｇの患者に対して推定したものである。ＡＢ－１０１は８週間毎週１回尾静脈を通して静脈内投与した。８次（すなわち、最後の投与）投与した後、３日目にＡＢ－１０１の急性毒性を評価した。８次投与後２８日の回復期間終了時点で遅延性毒性を評価した。各動物において生存性、体重、臨床観察結果および促進（ｐａｌｐａｔｉｏｎ）を本実験の生涯期間に記録した。すべての動物において安楽死の時点で肉眼剖検し、血液分析のためのサンプル収集、臨床化学および組織病理学的分析を行った。

【0565】

各群は、両性での所見を評価し、統計的検証力分析（ｐｏｗｅｒｅｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）のために、各性別あたり１０匹ずつ動物計２０匹で構成した。ＡＢ－１０１処理群と比較するために、ビヒクル処理対照群も含めた。処置の偏りを最小化するために、動物はコンピュータ－生成された（体重の順）ランダムな手順によって用量群に割り当て、雌および雄を別途にランダム割り当てた。本実験はデータ記録などを含めてＧＬＰ指針を守った。

【0566】

評価した用量水準のどの用量でもＡＢ－１０１の投与に関連する死亡および有害な臨床的な観察結果は記録されなかった。現れたすべての軽微な観察結果はマウスで一般的な結果であり、ＡＢ－１０１の投与に関連するものとは見なされなかった。体重および臓器重量の変化は用量群の間で類似しており、処置後評価した日付でも類似していた（急性毒性群の場合に５３日、遅延毒性群の場合に７８日）。急性または遅延性毒性群において安楽死の時点で動物から確認された血液学および臨床化学媒介変数または肉眼剖検所見でＡＢ－１０１－関連の変化はなかった。統計的有意性に関係なく、個体間および平均臨床化学数値間ですべての変動は散発的であり、生物学的および手順－関連偏差と一貫性があり、および／またはそのサイズがわずかであると見なされ、よって、ＡＢ－１０１の投与とは関係ないと見なされた。ＡＢ－１０１－関連の顕微鏡的所見はなかった。結論的に、ＧＬＰ毒性実験の結果は、最大２×１０^７細胞／投与／動物で繰り返し投与したＮＳＧマウスでＡＢ－１０１が十分な耐薬性であることを示唆する。

【0567】

実施例９：ＮＫ細胞の冷凍保存
図５に示された工程によりＡＢ－１０１細胞を準備した。培養期間終了時点で、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｋＳｅｐ^（Ｒ）４００の使い捨て自動遠心分離システムを用いて、相対遠心力（ＲＣＦ）：８００－１２００ｇ下、流速６０～１２０ｍｌ／ｍｉｎで細胞を回収し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗った。洗った後、（１）アルブミン（ヒト）；（２）デキストラン４０；（３）ＤＭＳＯ；および（４）ＰＢＳを用いて、標的濃度１×１０^８細胞／ｍｌで、ＡＢ－１０１細胞を剤形化した（冷凍保存組成物の例＃１、表４）。懸濁物剤形を１０ｍｌ ＡＴ－Ｃｌｏｓｅｄ ｖｉａｌ^（Ｒ）に目標体積１１ｍｌで充填した後、表示し、速度制御型冷凍庫に入れて、≦－１３５℃で冷凍保存した。

【0568】

初期放出検査データとして時間＝０に安定性実験を行った。安定性保存冷凍庫は温度を≦－１３５℃に維持するように設定された検証済みの気相ＬＮ_２保存冷凍庫である。無菌性時点で、バッチサイズの１０％または４個のバイアルのうちより大きい方を検査した。検査物は臨床的な解凍条件を模倣するために３７℃で解凍した。

【0569】

表１６に示すように、冷凍保存したＡＢ－１０１の生存性および活性が少なくとも９ヶ月間保存されることが確認された。

【0570】

【表16】

【0571】

投与する直前までの取扱時、ＡＢ－１０１の安定性特徴を把握するために、「ベッドサイド（ｂｅｄｓｉｄｅ）」短期安定性実験を行った。サンプルを解凍した後、１０ｍｌシリンジに移して濾過し、内容物はファルコン試験管で保管し、表示された指定時間に所定の温度でおいた。採取した産物を分析した。ＡＢ－１０１ロット２種に対する短期安定性データを表１７に示す。

【0572】

【表17】

【0573】

実施例１０：ＫＩＲ－ＢおよびＣＤ１６ １５８ｖ／ｖに対して選別した臍帯血ＮＫ細胞は増幅後にＣＤ３８発現性が低い
ＫＩＲ－ＢおよびＣＤ１６ １５８ｖ／ｖに対して選別した互いに異なる供与者から得られた２種の臍帯血を用いて、実施例６に記載されているようにＮＫ細胞を増幅して、ＡＢ－１０１細胞を構築し、そして、１つの非－選別供与者臍帯血（対照群）でも構築した。フローサイトメトリー測定により得られた細胞純度（ＣＤ５６＋ＣＤ３－％）を図９に示す。図１０および図１１に示すように、ＣＤ３８発現は、非－選別ＮＫ細胞と比較して、ＫＩＲ－Ｂ／１５８ ｖ／ｖ ＮＫ細胞で集団（陽性％、図１０）、そして個別的（陽性細胞の平均蛍光強度、図１１）にもより低かった。

【0574】

実施例１１：ＡＢ－１０１の表面タンパク質発現
実施例１に記載されているように、ＮＫ細胞を増幅させた。出発物質としてＮＫ細胞供給源（ＣＤ５６＋／ＣＤ３－発現に対してゲーティングした臍帯血、ｎ＝３）の表面タンパク質発現を、増幅して得られたＮＫ細胞（ｎ＝１６）と比較した。図１２に示すように、ＣＤ１６発現は得られた細胞で高く、出発細胞に比べて増加した。ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ９４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６の発現も増加したのに対し、ＣＸＣＲ４およびＣＤ１２２の発現は減少した。

【0575】

実施例１２：試験管内ＡＢ－１０１＋ダラツムマブ実験
互いに異なるロットのＡＢ－１０１と互いに異なるロットのＰＢ－ＮＫ細胞（末梢血由来ＣＤ５６＋ＮＫ細胞）を対象に解凍時の生存性、純度およびＣＤ３８発現について評価した。

【0576】

解凍時のＡＢ－１０１細胞は生存性が９４．８５％±０．９２％であり（図１３）、（ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－によって定義される）ＮＫ細胞の純度は９８．６０％±０．７６％、そしてＣＤ５６^＋ＣＤ１６^＋集団は８７．４３±８．６１％（平均±ＳＤ）であった。

【0577】

ＡＢ－１０１細胞上でＣＤ３８発現を解凍時、そして１０％ＦＢＳおよび１０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２４時間培養した後、調べた。解凍時、そして解凍後２４時間経過時、ＣＤ３８発現％（平均±ＳＤ）は、ＡＢ－１０１供与体ロット２１ＡＢ１０１ＰＧ００４（それぞれ２２．３％±０．８５％および２３．４±０．５７％）、２０ＡＢ１０１ＰＧ００５（それぞれ２１．５％±２．５５％および２１．２±０．７１）で低く、変化はないことが確認された。ＣＤ３８発現の蛍光強度幾何平均は、ＡＢ－１０１ロット、すなわち２１ＡＢ１０１ＰＧ００４（それぞれ９８０６±８６．２７および１０３４０±１４７６．４４）および２０ＡＢ１０１ＰＧ００５（それぞれ８９７９±９０．５１および９０５６±１４４３．９１）で低く、変化がなかった。ＡＢ－１０１ロット１９ＡＢ１０１ＰＮ００４の場合、ＣＤ３８発現強度はこれら２つの時点ともにおいて高くて変化がなく、ＭＦＩはそれぞれ３１７３５±７４７．５１および２８３９６．００±３１６２．１８であった。各供与体に対して２個のバイアルに由来する細胞を用いてデータを入手した（各供与体に対して２個のバイアルを調べる）。

【0578】

比較として、健康な供与体３人に由来するＰＢ－ＮＫ細胞は、生存性（９３．２７％±４．８２％）、純度（９３．８％±２．４３％）およびＣＤ１６発現性（９５．１３％±０．７４％）に優れていたが、ＡＢ－１０１細胞と比較してＣＤ３８発現性が高かった（図１４）。平均的に、ＣＤ５６＋ＰＢ－ＮＫ細胞は、解凍時に８８．４７％±７．９８％がＣＤ３８を発現し、２４時間培養した後、８７．６７％±８．６％がＣＤ３８を発現した。供与体全体におけるＣＤ３８発現のＭＦＩは、解凍時および培養後それぞれ２５，４６７．３３±６３１８．３および１９４２９．６７±３８７０．８７であった。

【0579】

ＮＫ生存性に及ぼすダラツムマブの影響をフラトリサイド分析および補体固定分析を利用して多様な濃度のダラツムマブの存在下で調べた。

【0580】

ＮＫ細胞フラトリサイドに対するダラツムマブの影響を確認するために、ＡＢ－１０１細胞を多様な濃度のダラツムマブの存在下で４時間培養した。細胞生存性は、３００μｇ／ｍｌ～０．４１μｇ／ｍｌの範囲の濃度でＩｇＧ１対照群抗体またはダラツムマブの存在下で影響なく維持された。本データは、ＡＢ－１０１細胞がダラツムマブの存在下でＡＤＣＣによってお互いに殺さなかったことを示す（図１５）。興味深いことに、ＡＢ－１０１供与体ロット１９ＡＢ１０１ＰＮ００４は、高いＣＤ３８表面発現性にもかかわらずフラトリサイドを示していなかった。

【0581】

補体媒介細胞溶解の影響を調べるために、ＡＢ－１０１細胞をＩｇＧ対照群抗体またはダラツムマブとともにヒト補体血清の存在下でインキュベーションした。バーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉを分析対照群に含めた。ＡＢ－１０１細胞は、ＣＤ３８発現にもかかわらずダラツムマブおよび補体の存在下で細胞溶解しないのに対し、腫瘍細胞株Ｄａｕｄｉは、本実験で検査した最も低いダラツムマブ濃度（０．４１μｇ／ｍｌ）で飽和レベルの細胞溶解に到達した（図１６）。

【0582】

結び
ダラツムマブ作用機序は、オプソニン化された腫瘍細胞に対するＡＤＣＣおよびＣＤＣ反応（ｄｅ Ｗｅｅｒｓ Ｍ，Ｔａｉ Ｙ－Ｔ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｅｒ ＭＳ，ｅｔ ａｌ．Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ，ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｈｕｍａｎ ＣＤ３８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎｄｕｃｅｓ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ２０１１（Ｆｅｂ１）；１８６（３）：１８４０－８）と、大食細胞媒介ＡＤＣＰ（Ｏｖｅｒｄｉｊｋ ＭＢ，Ｖｅｒｐｌｏｅｇｅｎ Ｓ，Ｂｏｇｅｌｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．ＭＡｂｓ２０１５；７（２）：３１１－２１）を誘発するものである。ナチュラルキラー細胞はＣＤ３８を発現するので、よって、ダラツムマブ投与患者において枯渇する。そのため、ダラツムマブ治療時に枯渇せずに耐える同種異系ＮＫ細胞療法を補うことが好ましい（Ｎａｅｉｍｉ Ｋａｒａｒｏｕｄｉ Ｍ，Ｎａｇａｉ Ｙ，Ｅｌｍａｓ Ｅ ｅｔ ａｌ．ＣＤ３８ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ ａｎｄ ｂｏｏｓｔｓ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ２０２０（Ｎｏｖ１９）；１３６（２１）：２４１６－２７；Ｇｕｒｎｅｙ Ｍ，Ｓｔｉｋｖｏｏｒｔ Ａ，Ｎｏｌａｎ Ｅ，ｅｔ ａｌ．ＣＤ３８ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＣＤ３８ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｔａｒｇｅｔ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ２０２０（Ｄｅｃ３０）；Ｏｎｌｉｎｅ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ．ｄｏｉ：１０．３３２４／ｈａｅｍａｔｏｌ．２０２０．２７１９０８；Ｗｏａｎ ＫＶ，Ｋｉｍ Ｈ，Ｂｊｏｒｄａｈｌ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ａｄａｐｔｉｖｅ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｉＰＳＣ ｄｅｒｉｖｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ２０２１（Ｄｅｃ２）；２８（１２）：２０６２ ２０７５．ｅ５）。ＡＢ－１０１とダラツムマブとの臨床組み合わせに対する適合性を評価するために、ＡＢ－１０１細胞上のＣＤ３８の発現を調べ、ＡＢ－１０１の生存性に対するダラツムマブの影響を調べた。

【0583】

本願に報告されたデータは、ＡＢ－１０１ ＧＭＰ ｌｏｔ細胞の＜２３％がＣＤ３８を低い強度で発現することを立証する。ＡＢ－１０１細胞上にＣＤ３８発現がダラツムマブの存在下でフラトリサイドまたはＣＤＣを誘導しなかった。このような結果は、以下のような臨床所見と一致する：

【0584】

・ＭＭ細胞上のＣＤ３８発現強度は、ＧＥＮ５０１およびＳＩＲＵＳ実験でダラツムマブに対する臨床反応と正の相関関係があることが立証された（Ｎｉｊｈｏｆ ＩＳ，Ｃａｓｎｅｕｆ Ｔ，ｖａｎ Ｖｅｌｚｅｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．ＣＤ３８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ２０１６（Ａｕｇ１８）；１２８（７）：９５ ７０）。

【0585】

・ＭＭ患者の大多数から回収した末梢血単核細胞は、ダラツムマブの存在下でＡＤＣＣを引き続き誘導し、これは活性ＮＫ細胞の存在を意味する（Ｃａｓｎｅｕｆ Ｔ，Ａｄａｍｓ ＩＩＩ ＨＣ，ｖａｎ ｄｅ Ｄｏｎｋ ＮＷＣＪ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｅｐ ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ ａｎｄ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ２０２１；３５：５７３ ５８４；Ｗａｎｇ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｈｕｇｈｅｓ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｂｙ ｅｘ ｖｉｖｏ－ｅｘｐａｎｄｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ２０１８（Ａｕｇ１５）；２４（１６）：４００６－１７）。

【0586】

・ダラツムマブで治療した後、ＭＭ患者に存在するＮＫ細胞レパートリーは、ＣＤ３８^ｌｏｗ／であった（Ｗａｎｇ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｈｕｇｈｅｓ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｂｙ ｅｘ ｖｉｖｏ－ｅｘｐａｎｄｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ２０１８（Ａｕｇ１５）；２４（１６）：４００６－１７）。

【0587】

・末梢血ＮＫ細胞の大部分が表面にＣＤ３８を非常に強く発現し、一部の下位セットはＣＤ３８^{ｌｏｗ／－}である。結果的に、ダラツムマブは、循環するＮＫ細胞の大部分に対して枯渇効果を有する。これとは対照的に、本発明では、ＡＢ－１０１ ＧＭＰ ｌｏｔ細胞の大部分は、ＣＤ３８発現に対して陰性であり、細胞の下位セット（＜２３％）はＣＤ３８^ｌｏｗであることが究明された。ＡＢ－１０１細胞の低いＣＤ３８陽性率％は、ダラツムマブと組み合わせるためにＣＤ３８ノックアウトして生産した末梢血－由来ＮＫ細胞に類似していた（Ｎａｅｉｍｉ Ｋａｒａｒｏｕｄｉ Ｍ，Ｎａｇａｉ Ｙ，Ｅｌｍａｓ Ｅ ｅｔ ａｌ．ＣＤ３８ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ ａｎｄ ｂｏｏｓｔｓ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ２０２０（Ｎｏｖ１９）；１３６（２１）：２４１６－２７；Ｇｕｒｎｅｙ Ｍ，Ｓｔｉｋｖｏｏｒｔ Ａ，Ｎｏｌａｎ Ｅ，ｅｔ ａｌ．ＣＤ３８ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＣＤ３８ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｔａｒｇｅｔ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ２０２０（Ｄｅｃ３０）；Ｏｎｌｉｎｅ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ．ｄｏｉ：１０．３３２４／ｈａｅｍａｔｏｌ．２０２０．２７１９０８）。

【0588】

興味深いことに、ＡＢ－１０１供与体のうちの１つ（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌｏｔ）は、ＣＤ３８を強く発現したが、この細胞はダラツムマブの存在下でフラトリサイドまたはＣＤＣ機序により細胞溶解しなかった。この供与体は、ＧＭＰ ｌｏｔとは異なり、ＫＩＲ－ＢハプロタイプまたはＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｖ対立遺伝子に対して選別したものではない。結論的に、ＡＢ－１０１ ＧＭＰ ｌｏｔ細胞は、ＣＤ３８発現性が低く、ダラツムマブ－誘導性フラトリサイドおよびＣＤＣに抵抗し、ＣＤ３８発現をノックアウトするための遺伝子編集なくてもダラツムマブと組み合わせるのに適合する。

【0589】

実施例１３：ＡＢ－１０１＋ダラツムマブＡＤＣＣにステロイドが及ぼす影響
互いに異なる３種のロットのＡＢ－１０１細胞にデキサメタゾンおよびメチルプレドニゾロンを４８時間以下のような濃度で、ＩＬ－２ ５０ＩＵ／ｍｌまたは５００ＩＵ／ｍｌの存在下で処理した：デキサメタゾン０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ；メチルプレドニゾロン０．０８μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ。ステロイド処理したＡＢ－１０１細胞を洗った後、以下のような細胞株と（また、＋およびＩｇＧ対照群）５：１のＥ：Ｔ比率で共培養した：Ｋ５６２、Ｄａｕｄｉ、ＲＰＭＩ－８２２６およびＮＣＩ－Ｈ９２９。

【0590】

Ｋ５６２の場合、デキサメタゾン処理時、１つの細胞ロットを除けば、検査したすべての濃度でＡＢ－１０１細胞の基底細胞毒性が減少した。ＡＢ－１０１と５００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２処理時に細胞毒性が回復した。ＡＢ－１０１細胞にデキサメタゾン処理時、ステロイド処理中に、特に５００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２と組み合わせる場合、ＤａｕｄｉおよびＮＣＩ－Ｈ９２９に対する基底細胞毒性が強化された。デキサメタゾン処理は、ＡＢ－１０１細胞のＡＤＣＣ潜在性を阻害しなかった。図１７、図１８、図１９および図２０を参照する。メチルプレドニゾロンも類似のパターンを示した。これはステロイド処理とＡＢ－１０１＋ダラツムマブとの組み合わせが有利であることを示す。

【0591】

実施例１４：ダラツムマブはサイトカイン分泌を誘導する
細胞株
本実験で使用した細胞株を表１８に列挙する。

【0592】

【表18】

【0593】

ＡＢ－１０１細胞による抗体依存的な細胞性細胞毒性反応に対するダラツムマブ濃度の影響
ダラツムマブ濃度がＡＤＣＣに及ぼす影響を調べるために、ＡＢ－１０１細胞をＣＤ３８＋多発性骨髄腫細胞株ＭＭ．１ＳおよびＣＤ３８－細胞株Ｋ５６２と５：１のＥ：Ｔ比率で共培養した。ダラツムマブまたは対照群ＩｇＧを共培養物に３００μｇ／ｍｌ～０．４μｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加した。共培養４時間後、サンプルをフローサイトメトリー測定によって分析した。ダラツムマブは、ＩｇＧ１対照群抗体と比較して、ＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞株に対してＡＤＣＣを誘発した。ピークＡＤＣＣはダラツムマブ１～１１μｇ／ｍｌで観察された。ＡＤＣＣ分析の対照群として用いたＫ５６２は、予想した通り、ダラツムマブまたはＩｇＧ対照群間でＡＢ－１０１細胞の細胞毒性には差がないことが観察された。

【0594】

本実験の観察結果に基づき、本実験において後続のＡＤＣＣ分析にはダラツムマブ濃度２μｇ／ｍｌを選択した。

【0595】

短期的な抗体依存的な細胞性細胞毒性
ダラツムマブと組み合わせたＡＢ－１０１細胞のＡＤＣＣ潜在性を多発性骨髄腫細胞株－ＲＰＭＩ８２２６、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＭＭ．１ＳおよびＭＭ．１Ｒに対して検査した。ＣＤ３８を高度に発現するバーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉと、ＣＤ３８発現が欠乏したＣＭＬ細胞株Ｋ５６２をそれぞれ陽性対照群および陰性対照群として用いた。ＡＢ－１０１および腫瘍標的をＥ：Ｔ比率１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１、０．６：１および０．３：１で２μｇ／ｍｌダラツムマブまたは対照群ＩｇＧ１抗体の存在下で共培養した。４時間共培養した後、サンプルをフローサイトメトリー測定によって分析した。

【0596】

各腫瘍細胞株に対するＡＢ－１０１供与体３種のＡＤＣＣを検査した。Ｄａｕｄｉの場合、ダラツムマブ－媒介ＡＤＣＣ平均は、１０：１のＥ：Ｔ比率で７９．４６％±４．７２％（平均±ＳＤ）から０．３１：１の比率で３６．９９％±１１．６８％の範囲であるのに対し、ＩｇＧ１対照群の場合、１０：１のＥ：Ｔ比率では４８．９６％±９．９８％であり、０．３１：１のＥ：Ｔ比率では１０．２％±３．５８％であった（図２１、図２２、図２３、図２４、図２５および図２６）。多発性骨髄腫細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９に対するＡＤＣＣは、１０：１のＥ：Ｔ比率で４６．４４％±１１．１９％から０．３１：１のＥ：Ｔ比率で３．３８％±０．７７％の範囲であり；ＲＰＭＩ８２２６の場合には、１０：１のＥ：Ｔ比率で５８．２２％±８．７１％から０．３１：１のＥ：Ｔ比率で８．７５％±２．３１％の範囲であり；ＭＭ．１Ｒの場合には、１０：１のＥ：Ｔ比率で４２．３６％±１１．０２％から０．３１：１のＥ：Ｔ比率で４．８８％±２．７７％の範囲であり；ＭＭ．１Ｓの場合には、１０：１のＥ：Ｔ比率で１９．８４％±７．３２％から０．３１：１のＥ：Ｔ比率で２．３４％±２．３３％の範囲であった。Ｋ５６２細胞株は、予想の通り、ＩｇＧ１対照群抗体と比較して、ダラツムマブの存在下でＡＢ－１０１媒介細胞溶解に差がなかった。Ｋ５６２に対する特異的な細胞溶解％は、１０：１のＥ：Ｔ比率でダラツムマブの存在下で３６．８８％±５．９８％であり、これと比較して、ＩｇＧ１対照群抗体の存在下では３７．５２％±８．５５％であった。

【0597】

ダラツムマブは、ＩｇＧ１対照群と比較して、ＡＢ－１０１細胞からより強いＡＤＣＣ反応を誘発した。ＡＤＣＣレベルはＥ：Ｔ比率に依存的であった。ダラツムマブの存在下で腫瘍細胞の細胞溶解の改善は、Ｄａｕｄｉ、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＲＰＭＩ８２２６の場合、すべてのＥ：Ｔ比率で、ＭＭ．１Ｒの場合、Ｅ：Ｔ比率上位３種でＩｇＧ１対照群よりも著しく高かった。ＭＭ．１Ｓは、１０：１のＥ：Ｔ比率を除けば、細胞溶解に有意な差を示していなかかった。予想の通り、Ｋ５６２細胞溶解は、ＩｇＧ１群とダラツムマブ群との間で類似していた。

【0598】

統計学的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍソフトウェアでＩｇＧ対照群とダラツムマブとの間にノンパラメトリックなウィルコクソン対応－対符号順位検定（ｎｏｎ－ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｍａｔｃｈｅｄ－Ｐａｉｒｓ Ｓｉｇｎｅｄ Ｒａｎｋ Ｔｅｓｔ）で行った。有意性は調整されたＰ値で示す。

【0599】

ダラツムマブによって誘導された試験管内サイトカイン分泌
ダラツムマブに対する反応でＡＢ－１０１細胞の活性化誘導サイトカイン分泌を多発性骨髄腫細胞株－ＲＰＭＩ８２２６、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｒに対して、そして陽性対照群および陰性対照群としてそれぞれＤａｕｄｉおよびＫ５６２とともに検査した。ＡＢ－１０１および腫瘍細胞の共培養は、２μｇ／ｍｌダラツムマブまたはＩｇＧ１対照群抗体の存在下で１：１のＥ：Ｔ比率（１００，０００エフェクター細胞／ウェル）に設定した。アレイの分析物をＥＬＩＳＡによってＩＦＮγおよびＴＮＦαを分析した。

【0600】

分析群は、（１）腫瘍細胞単独、（２）ＡＢ－１０１単独、（３）ＡＢ－１０１＋腫瘍細胞、（４）ＡＢ－１０１＋腫瘍細胞＋ＩｇＧ１対照群、および（５）ＡＢ－１０１＋腫瘍細胞＋ダラツムマブを含む（図２７、図２８、図２９）。供与体２１ＡＢ１０１ＰＧ００４によるＩＦＮγ分泌は、Ｄａｕｄｉ（９２０．３３±２４．４２ｐｇ／ｍｌ／１０^６細胞）およびＲＰＭＩ８２２６（５９５．３３±２５．９７ｐｇ／ｍｌ／１０^６細胞）に対して、ＩｇＧ１対照群に比べて、ダラツムマブの存在下で、より優れており（Ｄａｕｄｉ：２９８．００±１１．５３ｐｇ／ｍｌ／１０^６細胞およびＲＰＭＩ８２２６：２８４．３３±４８．９９ｐｇ／ｍｌ／１０^６細胞）；供与体１９ＡＢ１０１ＰＮ００４は、Ｄａｕｄｉ（５２５．３３±５４．５９ｐｇ／ｍｌ／１０^６細胞）に対してＩｇＧ１対照群（１３０．６７±１４．５７ｐｇ／ｍｌ／１０^６細胞）に比べて、ダラツムマブの存在下でＩＦＮγをより多く分泌した。その他の細胞株はこれらの供与体からダラツムマブ依存的なＩＦＮγ分泌を誘発することができなかった。

【0601】

同じく、供与体２１ＡＢ１０１ＰＧ００４は、Ｄａｕｄｉに対してＩｇＧ１対照群（２８１．３３±４８．７５ｐｇ／ｍｌ／１０^６細胞）に比べて、ダラツムマブ（７２６．００±３７４．０１ｐｇ／ｍｌ／１０^６細胞）の存在下でＴＮＦ－αをより多く分泌し、１９ＡＢ１０１ＰＮ００４は、ＭＭ．１Ｒ（６９７．６７±２２３．５５ｐｇ／ｍｌ／１０^６細胞）に対してＩｇＧ対照群（３０８．００±８０．５４ｐｇ／ｍｌ／１０^６細胞）と比較して、ＴＮＦ－αをより多く分泌した。

【0602】

供与体２０ＡＢ１０１ＰＧ００５は、ＩｇＧ１対照群と比較して、ダラツムマブの存在下で検査したすべての腫瘍細胞株に対してＩＦＮγを実質的により高い量で分泌した。２０ＡＢ１０１ＰＧ００５も、ＩｇＧ１対照群と比較して、ダラツムマブの存在下でＤａｕｄｉ（２００２．６７±６４５．３４ｐｇ／ｍｌ／１０^６細胞）、ＲＰＭＩ８２２６（１７９１．６７±５８６．２９ｐｇ／ｍｌ／１０^６細胞）およびＮＣＩ－Ｈ９２９（１７５２．６７±６３９．６６ｐｇ／ｍｌ／１０^６細胞）に対してＴＮＦ－αをより多く分泌した。

【0603】

Ｋ５６２は、ダラツムマブとは関係なく供与体３種ともにおいてＩＦＮγおよびＴＮＦαをより高いレベルで分泌させた。

【0604】

考察および結び
本発明で発表されたデータは、ＡＢ－１０１細胞がダラツムマブと組み合わせた場合、ＡＤＣＣを介して多発性骨髄腫細胞株を細胞溶解できることを立証する。抗－腫瘍機能は、ＡＢ－１０１とＩｇＧ１対照群との組み合わせよりも著しく優れていた。ＡＢ－１０１細胞はまた、前－炎症性／免疫調節性サイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαをより高いレベルで分泌することにより、ダラツムマブ媒介活性化に反応した。

【0605】

ＡＢ－１０１ ＧＭＰ ｌｏｔ細胞は、ＣＤ１６受容体発現率％が高く（２１ＡＢ１０１ＰＧ００４＝８６．３％および２０ＡＢ１０１ＰＧ００５＝９３．１％）、ＣＤ３８発現に対しては天然的に陰性であり、細胞の一部（＜２３％）はＣＤ３８^ｌｏｗであった。本実験で検査したＡＢ－１０１供与体３種は、ダラツムマブによって誘導されるフラトリサイドに鈍感であった。総合的に、これらのデータは、ＡＢ－１０１細胞が多発性骨髄腫適応症に対する臨床環境でダラツムマブと効果的に併用できるという仮説を裏付ける。

【0606】

【表19-1】

【0607】

【表19-2】

【0608】

【表19-3】

【0609】

その他の実施形態
本発明が詳細な説明とともに記述されたが、上述した説明は例示のためのものに過ぎず、添付した特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではないことが理解されなければならない。他の側面、利点および修正も添付した特許請求の範囲に属する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【配列表】

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【国際調査報告】