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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-26
(54)【発明の名称】遺伝性突然変異のための可動性エンドヌクレアーゼ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20240318BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240318BHJP
C12N 15/83 20060101ALI20240318BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240318BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240318BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240318BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 Z
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/83 Z
C12N15/09 110
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023562992
(86)(22)【出願日】2022-04-15
(85)【翻訳文提出日】2023-12-12
(86)【国際出願番号】 EP2022060160
(87)【国際公開番号】W WO2022219175
(87)【国際公開日】2022-10-20
(31)【優先権主張番号】21168638.1
(32)【優先日】2021-04-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508186875
【氏名又は名称】キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】ウィンド，ユリア ヨハンナ
(72)【発明者】
【氏名】クルースターマン，ビョルン アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】リュイシエ，フランク ジョルジュ ポール
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA11X
4B065AA88X
4B065AB03
4B065BA02
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は、植物細胞、好ましくは分裂組織細胞の標的ゲノム修飾に関する。より詳細には、本発明は、コード用ＲＮＡを発現するベクターであって、コード用ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列と、可動性エレメントとを含み、可動性エレメントは、コード用ＲＮＡの細胞間移行、好ましくは分裂組織細胞への細胞間移行を可能にする、ベクターに関する。本発明は、コード用ＲＮＡを含む編集用ＲＮＡであって、ガイドＲＮＡを更に含む編集用ＲＮＡに更に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
コード用ＲＮＡを発現するベクターであって、前記コード用ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列と、第１の可動性エレメントとを含み、前記可動性エレメントは、前記コード用ＲＮＡの細胞間移行を可能にし、好ましくは、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、核局在化シグナルを含む、ベクター。
【請求項2】
ａ）ウイルスであって、好ましくは、ｉ）機能性のコートタンパク質を発現せず、好ましくは前記コートタンパク質をコードする配列に欠失を有すること；及び
ｉｉ）タバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）又はソンクスイエローネットウイルス（ＳＹＮＶ）、好ましくはタバコモザイクウイルスＲＮＡベースの過剰発現ベクター（ＴＲＢＯ）であること
の少なくとも１つである、ウイルス；
ｂ）ネイキッドＤＮＡであって、好ましくは環状核酸分子であるネイキッドＤＮＡ；又は
ｃ）ＤＮＡ複合体であって、好ましくは担体に結合されており、前記担体は、好ましくは、リポプレックス、リポソーム、ポリマーソーム、ポリプレックス、ＰＥＧ、デンドリマー、無機ナノ粒子、ビロソーム及び細胞透過性ペプチドからなる群から選択される、ＤＮＡ複合体
である、請求項１に記載のベクター。
【請求項3】
前記可動性エレメントは、分裂組織細胞、好ましくは茎頂分裂組織細胞への細胞間移行を可能にする、請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項4】
前記可動性エレメントは、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及び遺伝子転写物の少なくとも１つであり、好ましくは、－ 前記ｔＲＮＡは、メチオニン、グリシン－、トレオニン－、アルギニン－、リジン－及びグルタミン－ｔＲＮＡの少なくとも１つであること；及び
－ 前記遺伝子転写物は、ＦＴ、ＧＡＩ、ＳＰ２Ｇ、ＳＰ３Ｄ、ＳＰ５Ｇ、ＳＰ９Ｄ、ＣＥＮ様タンパク質１、ＦＴ及びＴＦのタンパク質ＭＯＴＨＥＲ １、開花遺伝子座Ｔ－ａ、開花遺伝子座Ｔ－ｂ、ＰＰ１６－１、ＧＡＩＰ、スケアクロウ様（ＳＣＬ１４Ｐ）、シュートメリステムレス（ＳＴＭＰ）、エチレン応答因子（ＥＲＦＰ）及びＭｙｂ（ＭｙｂＰ）からなる群から選択される遺伝子の転写物であり、任意選択により、前記ＦＴ遺伝子転写物は、突然変異体ＦＴ及び／又はトランケート型ＦＴであること
の少なくとも１つである、請求項１～３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項5】
ガイドＲＮＡ及び任意選択により前記ガイドＲＮＡの細胞間移行を可能にする第２の可動性エレメントを更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項6】
請求項１、３又は４のいずれか一項に記載のコード用ＲＮＡを含む編集用ＲＮＡであって、請求項５に記載のガイドＲＮＡ及び任意選択により第２の可動性エレメントを更に含む編集用ＲＮＡ。
【請求項7】
前記コード用ＲＮＡと前記ガイドＲＮＡとの間に位置する切断可能なスペーサー配列を更に含む、請求項６に記載の編集用ＲＮＡ。
【請求項8】
前記第１及び第２の可動性エレメントの少なくとも１つは、前記編集用ＲＮＡの５’末端又は３’末端に位置する、請求項６又は７に記載の編集用ＲＮＡ。
【請求項9】
２つ以上のガイドＲＮＡを含み、好ましくは、切断可能なスペーサー配列は、前記２つ以上のガイドＲＮＡ間に位置する、請求項６～８のいずれか一項に記載の編集用ＲＮＡ。
【請求項10】
前記２つ以上のガイドＲＮＡは、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを同じ遺伝子に導く、請求項９に記載の編集用ＲＮＡ。
【請求項11】
請求項６～１０のいずれか一項に記載の編集用ＲＮＡを発現するベクター。
【請求項12】
ｉ）請求項１～５又は１１のいずれか一項に記載のベクター；及びｉｉ）請求項６～１０のいずれか一項に記載の編集用ＲＮＡ
の少なくとも１つを発現するアグロバクテリウム。
【請求項13】
標的ゲノム修飾を有する分裂組織細胞を作製する方法であって、ｉ）植物体を提供するステップ；及び
ｉｉ）前記植物体の細胞において、請求項１、３又は４のいずれか一項に記載のコード用ＲＮＡ、請求項５に記載のガイドＲＮＡ及び任意選択により第２の可動性エレメントを発現させるステップ
を含み、
前記コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、分裂組織細胞に移行し、
前記コード用ＲＮＡ及び前記ガイドＲＮＡは、請求項６～１０のいずれか一項に記載の編集用ＲＮＡ内に含まれ、及び／又は前記ガイドＲＮＡは、前記第２の可動性エレメントに連結され、
前記分裂組織細胞において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、前記コード用ＲＮＡから発現され、前記ガイドＲＮＡは、前記分裂組織細胞における標的ゲノム修飾を発生させるために、前記発現されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをゲノム中の位置に導き、
好ましくは、前記分裂組織細胞は、茎頂分裂組織細胞である、方法。
【請求項14】
前記コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、前記植物細胞に、－ 請求項１～５又は１１のいずれか一項に記載のベクター；及び
－ 請求項１２に記載のアグロバクテリウム
の少なくとも１つをトランスフェクトすることによって発現される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
標的ゲノム修飾を有する分裂組織細胞であって、請求項１３又は１４に記載の方法によって入手可能な分裂組織細胞。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分子植物生物学の分野に関する。本発明は、植物細胞の標的遺伝子修飾に関する。詳細には、本発明は、植物分裂組織細胞の標的修飾及びそれに由来する植物体に関する。
【背景技術】
【0002】
作物に定方向で遺伝性の突然変異を迅速且つ効率的に作り出すことは、形質の研究及び遺伝子検証に重要である。インタクトな分裂組織への編集の導入は、それが次世代への伝播を確実にするため、極めて望ましいと考えられている。分裂組織に編集を生じさせるには、２つの取り組み方がある：分裂組織に編集複合体（例えば、ガイドＲＮＡを伴うＣＡＳ９）を入れて、それらの細胞を直接編集することによるか、又は体細胞組織を編集し、後に分裂組織形成を惹起することによる。
【0003】
編集された体細胞は、編集された分裂組織に変換されるため、結果として、それらの編集が後代に伝えられることになる。しかしながら、ピーマンなどのように、インビトロ組織培養を通した分裂組織形成の惹起が難しいか又は不可能な作物では、この方法は、機能しない。
【0004】
残念ながら、トランス遺伝子を分裂組織に直接送達するのは困難であることが分かっており、これまでのところ、成功は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）及びその近縁種に限られている（Ｃｌｏｕｇｈ，ＳＪ ａｎｄ Ｂｅｎｔ，ＡＦ，“Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ：ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ”．Ｐｌａｎｔ Ｊ．１６，７３５－７４３（１９９８）及びＨａｍａｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．“Ａｎ ｉｎ ｐｌａｎｔａ ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｗｈｅａｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７，１１４４３（２０１７））。
【0005】
従って、当技術分野では、再生させる必要のない、植物体の効率的な遺伝性突然変異を実現する方法が依然として必要とされている。
【0006】
これまで、当技術分野では、１つ以上の可動性ガイドＲＮＡを発現するベクターをＣａｓ９トランスジェニックベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物体にトランスフェクトすることにより、遺伝性突然変異が実現され得ることが示されている。このようなガイドＲＮＡのトランスフェクションにより、遺伝性の遺伝子編集が生じた（Ｅｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｍｏｂｉｌｅ ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ，Ｎａｔ Ｐｌａｎｔｓ，２０２０；６（６）：６２０－６２４）。
【0007】
残念ながら、この手法は、遺伝性突然変異をもたらすために必然的にＣａｓ９トランスジェニック植物体の使用を伴うものであった。これは、かかるトランスジェニック植物体をもたらすために実験を入念に練ることを要求し得るか、又は全く実現不可能であり得る。その上、かかる植物体からもたらされる任意の種子は、遺伝性突然変異を含み得るが、トランスジェニックＣａｓ９タンパク質もなお発現し得る。とりわけ、かかるトランスジェニック植物体は、例えば、食用消費に向けた商品化が困難であり得る。
【0008】
このように、当技術分野では、遺伝性突然変異を含む非トランスジェニック植物体を効率的にもたらすための汎用性のある方法が依然として必要とされている。更に、かかる方法で使用される核酸及びベクターが必要とされている。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、以下の実施形態に要約することができる。
【0010】
実施形態１．コード用ＲＮＡを発現するベクターであって、コード用ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列と、第１の可動性エレメントとを含み、可動性エレメントは、コード用ＲＮＡの細胞間移行を可能にし、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、核局在化シグナルを含む、ベクター。
【0011】
実施形態２．ａ）ウイルスであって、好ましくは機能性のコートタンパク質を発現せず、好ましくはコートタンパク質をコードする配列に欠失を有するウイルス；
ｂ）ネイキッドＤＮＡであって、好ましくは環状核酸分子であるネイキッドＤＮＡ；又は
ｃ）ＤＮＡ複合体であって、好ましくは担体に結合されており、担体は、好ましくは、リポプレックス、リポソーム、ポリマーソーム、ポリプレックス、ＰＥＧ、デンドリマー、無機ナノ粒子、ビロソーム及び細胞透過性ペプチドからなる群から選択される、ＤＮＡ複合体
である、実施形態１に記載のベクター。
ｂ）ネイキッドＤＮＡであって、好ましくは環状核酸分子であるネイキッドＤＮＡ；又は
ｃ）ＤＮＡ複合体であって、好ましくは担体に結合されており、担体は、好ましくは、リポプレックス、リポソーム、ポリマーソーム、ポリプレックス、ＰＥＧ、デンドリマー、無機ナノ粒子、ビロソーム及び細胞透過性ペプチドからなる群から選択される、ＤＮＡ複合体
である、実施形態１に記載のベクター。
【0012】
実施形態３．タバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）又はソンクスイエローネットウイルス（ＳＹＮＶ）、好ましくはタバコモザイクウイルスＲＮＡベースの過剰発現ベクター（ＴＲＢＯ）である、実施形態２に記載のベクター。
【0013】
実施形態４．可動性エレメントは、分裂組織細胞、好ましくは茎頂分裂組織細胞への細胞間移行を可能にする、実施形態１～３のいずれか１つに記載のベクター。
【0014】
実施形態５．可動性エレメントは、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及び遺伝子転写物の少なくとも１つである、実施形態１～４のいずれか１つに記載のベクター。
【0015】
実施形態６．－ ｔＲＮＡは、メチオニン、グリシン－、トレオニン－、アルギニン－、リジン－及びグルタミン－ｔＲＮＡの少なくとも１つであること；及び
－ 遺伝子転写物は、ＦＴ、ＧＡＩ、ＳＰ２Ｇ、ＳＰ３Ｄ、ＳＰ５Ｇ、ＳＰ９Ｄ、ＣＥＮ様タンパク質１、ＦＴ及びＴＦのタンパク質ＭＯＴＨＥＲ １、開花遺伝子座Ｔ－ａ、開花遺伝子座Ｔ－ｂ、ＰＰ１６－１、ＧＡＩＰ、スケアクロウ様（ＳＣＬ１４Ｐ）、シュートメリステムレス（ＳＴＭＰ）、エチレン応答因子（ＥＲＦＰ）及びＭｙｂ（ＭｙｂＰ）からなる群から選択される遺伝子の転写物であり、任意選択により、ＦＴ遺伝子転写物は、突然変異体ＦＴ及び／又はトランケート型ＦＴであること
の少なくとも１つである、実施形態５に記載のベクター。
－ 遺伝子転写物は、ＦＴ、ＧＡＩ、ＳＰ２Ｇ、ＳＰ３Ｄ、ＳＰ５Ｇ、ＳＰ９Ｄ、ＣＥＮ様タンパク質１、ＦＴ及びＴＦのタンパク質ＭＯＴＨＥＲ １、開花遺伝子座Ｔ－ａ、開花遺伝子座Ｔ－ｂ、ＰＰ１６－１、ＧＡＩＰ、スケアクロウ様（ＳＣＬ１４Ｐ）、シュートメリステムレス（ＳＴＭＰ）、エチレン応答因子（ＥＲＦＰ）及びＭｙｂ（ＭｙｂＰ）からなる群から選択される遺伝子の転写物であり、任意選択により、ＦＴ遺伝子転写物は、突然変異体ＦＴ及び／又はトランケート型ＦＴであること
の少なくとも１つである、実施形態５に記載のベクター。
【0016】
実施形態７．ガイドＲＮＡ及び任意選択によりガイドＲＮＡの細胞間移行を可能にする第２の可動性エレメントを更に含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載のベクター。
【0017】
実施形態８．実施形態１及び４～６のいずれか１つに定義されるとおりのコード用ＲＮＡを含む編集用ＲＮＡであって、実施形態７に定義されるとおりのガイドＲＮＡ及び任意選択により第２の可動性エレメントを更に含む編集用ＲＮＡ。
【0018】
実施形態９．コード用ＲＮＡとガイドＲＮＡとの間に位置する切断可能なスペーサー配列を更に含む、実施形態８に記載の編集用ＲＮＡ。
【0019】
実施形態１０．第１及び第２の可動性エレメントの少なくとも１つは、編集用ＲＮＡの５’末端又は３’末端に位置する、実施形態８又は９に記載の編集用ＲＮＡ。
【0020】
実施形態１１．２つ以上のガイドＲＮＡを含む、実施形態８～１０のいずれか１つに記載の編集用ＲＮＡ。
【0021】
実施形態１２．切断可能なスペーサー配列は、２つ以上のガイドＲＮＡ間に位置する、実施形態１１に記載の編集用ＲＮＡ。
【0022】
実施形態１３．２つ以上のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを同じ遺伝子に導く、実施形態１１又は１２に記載の編集用ＲＮＡ。
【0023】
実施形態１４．実施形態８～１３のいずれか１つに定義されるとおりの編集用ＲＮＡを発現するベクター。
【0024】
実施形態１５．ｉ）実施形態１～７及び１４のいずれか１つに記載のベクター；及び
ｉｉ）実施形態８～１３のいずれか１つに記載の編集用ＲＮＡ
の少なくとも１つを発現するアグロバクテリウム。
ｉｉ）実施形態８～１３のいずれか１つに記載の編集用ＲＮＡ
の少なくとも１つを発現するアグロバクテリウム。
【0025】
実施形態１６．標的ゲノム修飾を有する分裂組織細胞を作製する方法であって、
ｉ）植物体を提供するステップ；及び
ｉｉ）植物体の細胞において、実施形態１及び４～６のいずれか１つに定義されるとおりのコード用ＲＮＡ、実施形態７に定義されるとおりのガイドＲＮＡ及び任意選択により第２の可動性エレメントを発現させるステップ
を含み、
コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、分裂組織細胞に移行し、
コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、実施形態８～１３のいずれか１つに記載の編集用ＲＮＡ内に含まれ、及び／又はガイドＲＮＡは、第２の可動性エレメントに連結され、
分裂組織細胞において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、コード用ＲＮＡから発現され、ガイドＲＮＡは、分裂組織細胞における標的ゲノム修飾を発生させるために、発現されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをゲノム中の位置に導く、方法。
ｉ）植物体を提供するステップ；及び
ｉｉ）植物体の細胞において、実施形態１及び４～６のいずれか１つに定義されるとおりのコード用ＲＮＡ、実施形態７に定義されるとおりのガイドＲＮＡ及び任意選択により第２の可動性エレメントを発現させるステップ
を含み、
コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、分裂組織細胞に移行し、
コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、実施形態８～１３のいずれか１つに記載の編集用ＲＮＡ内に含まれ、及び／又はガイドＲＮＡは、第２の可動性エレメントに連結され、
分裂組織細胞において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、コード用ＲＮＡから発現され、ガイドＲＮＡは、分裂組織細胞における標的ゲノム修飾を発生させるために、発現されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをゲノム中の位置に導く、方法。
【0026】
実施形態１７．コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、植物細胞に、
－ 実施形態１～７及び１４のいずれか１つに記載のベクター；及び
－ 実施形態１５に定義されるとおりのアグロバクテリウム
の少なくとも１つをトランスフェクトすることによって発現される、実施形態１６に記載の方法。
－ 実施形態１～７及び１４のいずれか１つに記載のベクター；及び
－ 実施形態１５に定義されるとおりのアグロバクテリウム
の少なくとも１つをトランスフェクトすることによって発現される、実施形態１６に記載の方法。
【0027】
実施形態１８．分裂組織細胞は、茎頂分裂組織細胞である、実施形態１６又は１７に記載の方法。
【0028】
実施形態１９．標的ゲノム修飾を有する分裂組織細胞であって、実施形態１６～１８のいずれか１つに記載の方法によって入手可能な分裂組織細胞。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】ＦＴ配列を有する（Ａ）及びＦＴ配列を有しない（Ｂ）Ｃａｓ９－ＧＦＰ融合体を含むベクターの概略図である。
【図2】ＦＴシグナルあり又はなしのＣａｓ９－ＧＦＰコンストラクトを葉に浸潤させた植物体の茎頂におけるＣａｓ９及びＧＦＰの、ｑＰＣＲにより決定したときの平均発現（ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）チューブリンｍＲＮＡの発現に対する相対的な任意単位）である。
【発明を実施するための形態】
【0030】
定義
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、本発明の方法、組成物、使用及び他の態様に関して様々な用語を使用する。かかる用語には、特に指示されない限り、本発明が関係する技術分野におけるその通常の意味が与えられるものとする。他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と矛盾しない方法で解釈されるものとする。
本発明を実施するために、本明細書に記載されるものと同様の又は均等な任意の方法及び材料を使用し得ることは、当業者に明らかである。
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、本発明の方法、組成物、使用及び他の態様に関して様々な用語を使用する。かかる用語には、特に指示されない限り、本発明が関係する技術分野におけるその通常の意味が与えられるものとする。他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と矛盾しない方法で解釈されるものとする。
本発明を実施するために、本明細書に記載されるものと同様の又は均等な任意の方法及び材料を使用し得ることは、当業者に明らかである。
【0031】
本発明の方法に使用される従来技術を実行する方法は、当業者に明らかであろう。分子生物学、生化学、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、シーケンシング及び関連する分野における従来技術の実施は、当業者に周知であり、例えば以下の参考文献で考察されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７及び定期更新；及びシリーズＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ。
【0032】
単数形の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈上特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「細胞」という表現には、２つ以上の細胞の組み合わせが含まれる等である。このように、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【0033】
用語「及び／又は」は、述べられている場合の１つ以上が単独で起こることも、又は述べられている場合の少なくとも１つとの組み合わせ、最大で述べられている場合の全てとの組み合わせで起こることもあるような状況を指す。
【0034】
本明細書で使用されるとき、用語「約」は、小さいばらつきを表現し、且つそれを考慮するために使用される。例えば、この用語は、±（＋又は－）１０％以下、例えば±５％以下、±４％以下、±３％以下、±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．１％以下又は±０．０５％以下を指し得る。加えて、本明細書では、量、比及び他の数値が範囲の形式で提示される。かかる範囲の形式は、簡便さ且つ簡潔さのために使用され、範囲の限界値として明示的に指定されている数値を含むが、その範囲内に包含されるあらゆる個々の数値又は部分的範囲も、あたかも各数値及び部分的範囲が明示的に指定されているかのように含むものと柔軟に理解されなければならないことが理解されるべきである。例えば、約１～約２００の範囲にある比は、約１及び約２００という明示的に記載されている限界値を含むが、約２、約３及び約４などの個々の比並びに約１０～約５０、約２０～約１００などの部分的範囲も含むものと理解されなければならない。
【0035】
用語「含む」は、包含的なオープンエンド形式であり、排他的ではないと解釈される。具体的には、この用語及びその変化形は、指定されている特徴、工程又は成分が包含されることを意味する。これらの用語は、他の特徴、工程又は成分の存在を除外するものと解釈されてはならない。
【0036】
用語「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、同義的に使用され、具体的な作用様式、サイズ、三次元構造又は起源に関係なく、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。このように、タンパク質の「断片」又は「一部分」は、なおも「タンパク質」と称することができる。「単離されたタンパク質」は、もはやその天然の環境にない、例えばインビトロにあるか、又は組換え細菌若しくは植物宿主細胞にあるタンパク質を指して使用される。
【0037】
「植物体」は、全植物体を指すか、又は植物体から入手可能な組織若しくは器官（例えば、花粉、種子、配偶子、根、葉、花、花芽、葯、果実等）など、植物体の一部並びにこれらのいずれかの誘導体及び自殖又は交配によるかかる植物体に由来する後代を指すかのいずれかである。植物体の非限定的な例としては、アフリカナス、ニンニク、チョウセンアザミ、アスパラガス、オオムギ、テンサイ、ピーマン、ゴーヤ、ホオズキ、ユウガオ、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、チコリー、インゲンマメ、コーンサラダ、ワタ、キュウリ、ナス、エンダイブ、ウイキョウ、ガーキン、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、アブラナ、オクラ、パセリ、パースニップ、ペピーノ、トウガラシ、ジャガイモ、カボチャ、ダイコン、コメ、トカドヘチマ、ロケット、ライムギ、ヘビウリ、モロコシ、ホウレンソウ、ヘチマ、カボチャ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トマティーヨ、トマト、トマト台木、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の野菜、スイカ、トウガン、コムギ及びズッキーニなど、作物植物体及び栽培植物体が挙げられる。
【0038】
「１つ又は複数の植物細胞」には、単離されているか、又は組織、器官若しくは生物体内にあるかのいずれかであるプロトプラスト、配偶子、浮遊培養物、小胞子、花粉粒等が含まれる。植物細胞は、例えば、カルス、分裂組織、植物器官又は外植体など、多細胞性構造体の一部であり得る。
【0039】
植物体／植物細胞の培養についての「同様の条件」とは、とりわけ、同様の温度、湿度、栄養及び光条件並びに同様の灌水及び明／暗周期の使用を意味する。
【0040】
用語「相同性」、「配列同一性」などは、本明細書では同義的に使用される。配列同一性は、本明細書では、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２つ以上のヌクレオチド（ポリヌクレオチド）配列間の、それらの配列を比較することにより決定したときの関係として定義される。当技術分野では、「同一性」は、場合により、かかる配列の一続き間の一致性により決定したときのアミノ酸配列間又は核酸配列間の配列関連性の程度も意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に計算することができる。配列同一性／類似性パーセンテージは、配列の全長にわたって決定することができる。
【0041】
本明細書で使用されるとき「配列同一性」は、２つの最適にアラインメントされたポリヌクレオチド又はペプチド配列が、構成要素、例えばヌクレオチド又はアミノ酸のアラインメントウィンドウ全体にわたってどの程度不変であるかを指す。試験配列と参照配列とのアラインメントされた区間についての「同一性率」とは、それらの２つのアラインメントされた配列が共有する同一の構成要素の数を、参照配列区間、即ち参照配列全体又は参照配列のうち、それより小さい決められた部分にある構成要素の総数で除したものである。「同一性パーセント」は、同一性率に１００を乗じたものである。
【0042】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列の長さに応じて大域的又は局所的アラインメントアルゴリズムを使用したそれらの２つの配列のアラインメントにより決定することができる。同様の長さの配列は、好ましくは、配列を全長にわたって最適にアラインメントする大域的アラインメントアルゴリズム（例えば、ニードルマン・ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ））を用いてアラインメントされる一方、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、局所的アラインメントアルゴリズム（例えば、スミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ））を用いてアラインメントされる。従って、配列は、それらが（例えば、プログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによりデフォルトパラメータを使用して最適にアラインメントしたとき）少なくともある一定の最小限の配列同一性パーセンテージ（本明細書に定義するとおり）を共有しているとき、「実質的に同一である」又は「本質的に類似している」と称し得る。配列同一性パーセントは、好ましくは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（商標）（バージョン１０；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の「ＢＥＳＴＦＩＴ」又は「ＧＡＰ」プログラムを用いて決定される。ＧＡＰは、ニードルマン・ブンシュの大域的アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４８：４４３－４５３，１９７０）を用いて、２つの配列をその長さ全体（完全長）にわたり、マッチ数が最大となり、且つギャップ数が最小となるようにしてアラインメントする。大域的アラインメントは、２つの配列が同様の長さを有するときの配列同一性の決定に好適に使用される。概して、ギャップ生成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）のＧＡＰデフォルトパラメータが使用される。ヌクレオチドについては、使用されるデフォルトスコアリング行列はｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質については、デフォルトスコアリング行列はＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ ８９，９１５－９１９）。配列同一性パーセンテージについての配列アラインメント及びスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２１－３７５２ ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３などのコンピュータプログラムを使用して決定するか、又はＥｍｂｏｓｓＷＩＮ、バージョン２．１０．０のプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（大域的ニードルマン・ブンシュのアルゴリズムを使用する）又は「ｗａｔｅｒ」（局所的スミス・ウォーターマンアルゴリズムを使用する）などのオープンソースソフトウェアを使用して、上記のＧＡＰと同じパラメータを使用するか、又はデフォルト設定を使用して決定し得る（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方について且つタンパク質及びＤＮＡアラインメントの両方について、デフォルトギャップ開始ペナルティは、１０．０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティは、０．５であり；デフォルトスコアリング行列は、タンパク質についてＢｌｏｓｓｕｍ６２及びＤＮＡについてＤＮＡＦｕｌｌである）。ギャップ伸長ペナルティは、０．５であり；デフォルトスコアリング行列は、タンパク質についてＢｌｏｓｓｕｍ６２及びＤＮＡについてＤＮＡＦｕｌｌである）。「ＢＥＳＴＦＩＴ」は、２つの配列間の最良の類似性区間の最適なアラインメントを実施し、スミス・ウォーターマンの局所的相同性アルゴリズムを用いてギャップを挿入してマッチ数を最大化する（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，２：４８２－４８９，１９８１、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：２２０５－２２２０，１９８３）。配列が実質的に異なる全長を有するとき、スミス・ウォーターマンのアルゴリズムを使用するものなど、局所的アラインメントが好ましい。
【0043】
配列同一性を決定する有用な方法については、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ（１９８８）４８：１０７３にも開示されている。より詳細には、配列同一性を決定する好ましいコンピュータプログラムとしては、国立医学図書館（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４の米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ）から公的に利用可能なＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムが挙げられ；ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ，ＮＬＭ，ＮＩＨ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）を参照されたく；バージョン２．０以上のＢＬＡＳＴプログラムでは、アラインメントへのギャップ（欠失及び挿入）の導入が可能であり；ペプチド配列については、配列同一性の決定にＢＬＡＳＴＸを使用することができ；及びポリヌクレオチド配列については、配列同一性の決定にＢＬＡＳＴＮを使用することができる。
【0044】
代わりに、類似性又は同一性パーセンテージは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等などのアルゴリズムを使用して公開データベースを検索することにより決定され得る。このように、本発明の核酸及びタンパク質配列を更に「問い合わせ配列」として使用して公開データベースの検索を実施し、例えば他のファミリーメンバー又は関連する配列を同定することができる。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施すると、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を入手することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施すると、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を入手することができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを入手するには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２に記載されるとおりのギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメータを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／の国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のホームページを参照されたい。
【0045】
タンパク質のドメイン、配列又は位置に関連して、参照タンパク質の指示されるドメイン、配列又は位置に対して「～と類似している」とは、本明細書では、ニードルマン・ブンシュなど、本明細書に記載されるとおりのアラインメントアルゴリズムを使用してそのタンパク質を参照タンパク質とアラインメントしたときに、参照タンパク質の指示されるドメイン、配列又は位置とアラインメントするドメイン、配列又は位置と理解されるものとする。
【0046】
核酸のドメイン、配列又は位置に関連して、参照核酸の指示されるドメイン、配列又は位置に対して「～と類似している」とは、本明細書では、ニードルマン・ブンシュなど、本明細書に記載されるとおりのアラインメントアルゴリズムを使用してその核酸を参照核酸とアラインメントしたときに、参照核酸の指示されるドメイン、配列又は位置とアラインメントするドメイン、配列又は位置と理解されるものとする。
【0047】
本発明に係る「核酸」又は「ポリヌクレオチド」には、ピリミジン及びプリン塩基、好ましくは、それぞれシトシン、チミン及びウラシル並びにアデニン及びグアニンの任意のポリマー又はオリゴマーが含まれ得る（Ａｌｂｅｒｔ Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｔ ７９３－８００（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂ．１９８２）（これは、あらゆる目的で本明細書に全体として参照により援用される）を参照されたい）。本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又は核酸成分並びにその任意の化学的変異体、例えばメチル化、ヒドロキシメチル化又はグリコシル化された形態のこれらの塩基などを企図する。ポリマー又はオリゴマーは、組成の点で異種又は同種であり得、天然に存在する供給源から単離され得るか、又は人工的若しくは合成的に作製され得る。加えて、核酸は、ＤＮＡ（任意選択によりｃＤＮＡ）若しくはＲＮＡ又はこれらの混合物であり得、ホモ二重鎖、ヘテロ二重鎖及びハイブリッド状態を含め、一本鎖又は二本鎖の形態で永久に又は過渡的に存在し得る。「単離された核酸」は、もはやその天然の環境にない、例えばインビトロにあるか又は組換え細菌若しくは植物細胞にある核酸を指して使用される。
【0048】
本発明の核酸及び／又はタンパク質は、組換え、合成又は人工核酸及び／又はタンパク質の少なくとも１つであり得る。
【0049】
用語「核酸コンストラクト」、「核酸ベクター」、「ベクター」及び「発現コンストラクト」は、本明細書では同義的に使用され、本明細書では、組換えＤＮＡ技術を用いた結果として生じる人為的に作り出された核酸分子として定義される。従って用語「核酸コンストラクト」及び「核酸ベクター」には、天然に存在する核酸分子は含まれないが、しかし、核酸コンストラクトは、天然に存在する核酸分子（の一部）を含み得る。
【0050】
ベクター骨格は、例えば、当技術分野で公知のとおり且つ本明細書の他の部分に記載されるとおりのバイナリー又はスーパーバイナリーベクター（例えば、米国特許第５，５９１，６１６号明細書、米国特許出願公開第２００２１３８８７９号明細書及び国際公開第９５／０６７２２号パンフレットを参照されたい）、共組込みベクター又はＴ－ＤＮＡベクターであり、そこにキメラ遺伝子が組み込まれるか、又は好適な転写調節配列が既に存在する場合、所望の核酸配列（例えば、コード配列、アンチセンス又は逆方向反復配列）のみが転写調節配列の下流に組み込まれるものであり得る。ベクターは、例えば、選択可能マーカー、多重クローニング部位など、分子クローニングでのその使用を容易にするための更なる遺伝学的エレメントを含み得る。
【0051】
用語「遺伝子」は、好適な調節領域（例えば、プロモーター）に作動可能に連結された、細胞内でＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は、通常、プロモーター、５’リーダー配列、コード領域及びポリアデニル化部位を含む３’非翻訳配列（３’末端）など、幾つかの作動可能に連結された断片を含むことになる。
【0052】
「遺伝子の発現」は、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されているＤＮＡ領域が、生物学的に活性なものであるＲＮＡ、例えば生物学的に活性なタンパク質又はペプチドに翻訳される能力を有するＲＮＡ又は例えば調節性非コード用ＲＮＡに転写される過程を指す。
【0053】
用語「作動可能に連結されている」は、機能的関係にあるポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれているとき、「作動可能に連結されている」。例えば、プロモーター又はむしろ転写調節配列は、コード配列に対し、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、作動可能に連結されている。作動可能に連結されているとは、それらの連結されているＤＮＡ配列が隣接していることを意味し得る。
【0054】
「プロモーター」は、１つ以上の核酸の転写を制御するように機能する核酸断片を指す。プロモーター断片は、好ましくは、遺伝子の転写開始部位から転写方向に対して上流（５’側）に位置し、構造的には、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位、１つ又は複数の転写開始部位の存在によって同定され、更に、限定されないが、転写因子結合部位、抑制因子及び活性化因子タンパク質結合部位及び直接又は間接的にプロモーターからの転写量を調節する働きをする当業者に公知の任意の他のヌクレオチド配列を含め、任意の他のＤＮＡ配列を含み得る。
【0055】
「構成的」プロモーターは、ほとんどの組織においてほとんどの生理的及び発生的条件下で活性のあるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理的に調節される（例えば、ある種の化合物を外部から適用することによる）又は発生的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定の種類の組織又は細胞においてのみ活性がある。
【0056】
任意選択により、用語「プロモーター」には、５’ＵＴＲ領域（５’非翻訳領域）も含まれ得る（例えば、本明細書ではプロモーターには、転写領域の翻訳開始コドンから上流にある１つ以上の部分が、転写及び／又は翻訳の調節においてその領域が役割を有し得ることに伴い含まれ得る）。
【0057】
「３’ＵＴＲ」又は「３’非翻訳配列」（３’非翻訳領域又は３’末端と称されることも多い）は、遺伝子のコード配列の下流に見られる核酸配列であり、例えば転写終結部位及び（全てではないが、ほとんどの真核生物ｍＲＮＡにおける）ポリアデニル化シグナル（例えば、ＡＡＵＡＡＡ又はその変異体など）を含むものを指す。転写終結後、ｍＲＮＡ転写物は、ポリアデニル化シグナルの下流で切断され得、且つ細胞質（翻訳が行われるところ）へのｍＲＮＡの輸送に関わるポリ（Ａ）テールが付加され得る。
【0058】
用語「ｃＤＮＡ」は、相補的ＤＮＡを意味する。相補的ＤＮＡは、ＲＮＡから相補的ＤＮＡ配列への逆転写によって作られる。ｃＤＮＡ配列は、このように、遺伝子から発現するＲＮＡ配列に対応する。ゲノムから発現するＲＮＡ配列は、スプライシングを受け得、即ちプレｍＲＮＡからスプライシングによりイントロンが除去され、エクソンが一体につなぎ合わされた後、それが細胞質においてタンパク質に翻訳されるため、ｃＤＮＡの配列は、ｍＲＮＡの配列に対応することが理解される。このように、ｃＤＮＡは、あるタンパク質についての、つなぎ合わされたエクソンからなる完全なオープンリーディングフレームのみをコードし得る一方、ゲノムＤＮＡ配列は、イントロン配列が間に入ったエクソン配列を含み得るため、ｃＤＮＡ配列は、それが対応するゲノムＤＮＡ配列と同一でないこともあり得る。タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子修飾するということは、このように、そのタンパク質をコードする配列を修飾することが関係し得るのみならず、ゲノムＤＮＡのイントロン配列及び／又はその遺伝子の他の遺伝子調節配列を突然変異させることも関わり得る。
【0059】
用語「再生」は、本明細書では、単一の植物細胞、カルス、外植体、組織又は器官からの新規組織及び／又は新規器官の形成として定義される。再生経路は、体細胞胚形成又は器官形成であり得る。体細胞胚形成とは、本明細書では体細胞胚の形成と理解され、これを成長させると全植物体を再生することができる。器官形成とは、本明細書では、（未分化）細胞からの新規器官の形成と理解される。好ましくは、再生は、異所性頂端分裂組織形成、シュート再生及び根再生の少なくとも１つである。
【0060】
本明細書に定義するとおりの再生とは、好ましくは、少なくともデノボのシュート形成に関し得る。例えば、再生とは、（伸長した）胚軸外植体から（花序）シュートに向かう再生であり得る。
【0061】
再生には、単一の植物細胞又は例えばカルス、外植体、組織若しくは器官からの新規植物体の形成が更に含まれ得る。再生プロセスは、親組織から直接行うか、又は間接的に例えばカルスの形成を経て行うことができる。
【0062】
用語「再生を許容する条件」は、本明細書では、植物細胞又は組織が再生できる環境と理解される。かかる条件には、最低でも、好適な温度（即ち０℃～６０℃）、栄養、昼夜周期、灌水並びに１つ以上の植物ホルモン及び／又は植物ホルモン様化合物が含まれる。更に、「再生を許容する最適条件」は、植物細胞の最大限の再生を許容するような環境条件である。
【0063】
用語「野生型」は、本発明との関連においてタンパク質又は核酸との組み合わせで使用されるとき、前記タンパク質又は核酸が、全体として自然界に存在するそれぞれアミノ酸又はヌクレオチド配列からなり、それ自体として自然界の生物から単離することができる、例えば標的又はランダム突然変異誘発などの修飾技法の結果でないことを意味する。野生型タンパク質は、特定の、例えばそれが自然界で存在するとおりの環境条件下において、少なくともある特定の発生段階で発現する。
【0064】
用語「内因性」は、本発明との関連においてタンパク質又は核酸と組み合わせて使用されるとき、前記タンパク質又は核酸がなおも植物体内に含まれる、即ちその天然の環境に存在することを意味する。多くの場合、内因性遺伝子は、植物体におけるその通常の遺伝的コンテクストで存在することになる。
【0065】
標的突然変異誘発とは、限定されないが、オリゴ特異的突然変異誘発、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ技術）、ＴＡＬＥＮ又はジンクフィンガー技術など、特異的なヌクレオチド又は核酸配列を改変するように設計することのできる突然変異誘発である。
【0066】
用語「目的の配列」には、限定されないが、例えば遺伝子、遺伝子の一部又は遺伝子内にあるか若しくは遺伝子に隣接する非コード配列など、好ましくは細胞内に存在する任意の遺伝子配列が含まれる。目的の配列は、染色体、エピソーム、ミトコンドリア若しくは葉緑体ゲノムなどの細胞小器官ゲノム又は例えば感染ウイルスゲノム、プラスミド、エピソーム、トランスポゾンなど、遺伝子材料の主体とは独立して存在し得る遺伝子材料に存在し得る。目的の配列は、遺伝子のコード配列内、転写された非コード配列内、例えばリーダー配列、トレーラー配列又はイントロンなどにあり得る。前記目的の配列は、二本鎖又は一本鎖核酸分子に存在し得る。核酸配列は、好ましくは、二本鎖核酸分子に存在する。目的の配列は、核酸内にある任意の配列、例えば遺伝子、遺伝子複合体、遺伝子座、偽遺伝子、調節領域、高度に反復性の領域、多型領域又はこれらの一部分であり得る。目的の配列は、表現型又は疾患の指標である遺伝的又は後成的変異を含む領域でもあり得る。好ましくは、目的の配列は、二重鎖ＤＮＡの小さい又はより長い一続きの隣接するヌクレオチド（即ちポリヌクレオチド）であり、前記二重鎖ＤＮＡは、前記二重鎖ＤＮＡの相補鎖に、標的配列に相補的な配列を更に含む。
【0067】
「対照植物体」は、本明細書において参照されるとき、本発明の植物体と同じ種及び好ましくは同じ遺伝的背景の植物体、即ち本明細書に教示されるとおりの方法に供された植物体である。好ましくは、対照植物体は、推定上の供試植物体と比べると、対照植物体が本明細書に詳述されるとおりの標的修飾を有しない点のみが異なる。
【0068】
好ましくは、対照植物体は、本発明の方法に供される植物体と同じ条件下で成長する。
【0069】
本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質編集複合体が既存の分裂組織に入り込むことができ、そのため再生の必要性を回避し得る手法を発見した。この目的で、本発明者らは、可動性エレメントをガイドＲＮＡ並びにＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする（ｍ）ＲＮＡと融合し、それにより植物体輸送システムを通して移動し、分裂組織に入り込むことのできるＲＮＡ分子を作り出した。
【0070】
可動性ＲＮＡは、このように、植物組織における任意のランダムな好適な位置に導入することができる。こうしたＲＮＡ分子は、続いて維管束組織に取り込まれ、例えば分裂組織に向けて輸送される。代わりに又は加えて、こうしたＲＮＡ分子は、プラスモデスムを通して例えば分裂組織に向けて輸送される。標的細胞に到達すると、ＣＲＩＳＰＲタンパク質コード用ＲＮＡはＣＲＩＳＰＲタンパク質に翻訳され、ガイドＲＮＡと組み合わせになって必要な編集複合体を形成する。分裂組織に編集が作られると、それらの編集は後続の１つ又は複数の世代に受け継がれることになる。
【0071】
第１の態様において、従って、本発明は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列と可動性エレメントとを含むか又はそれからなるコード用ＲＮＡに関する。このコード用ＲＮＡは合成又は組換えであり得る。コード用ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列と可動性エレメントとからなるか又はそれらを含む二本鎖又は一本鎖リボ核酸分子であり得る。任意選択により、コード用ＲＮＡは、ベクター、コンストラクト又は本明細書に定義するとおりの編集用ＲＮＡに含まれる。好ましくは、可動性エレメントはコード用ＲＮＡの細胞間移行を可能にする。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は核局在化シグナルを含む。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。
【0072】
細胞間移行とは、本明細書では、本明細書に定義するとおりのＲＮＡ分子など、分子の１つの細胞から別の細胞への長距離輸送と理解される。好ましい細胞間移動は、師部、木部及び／又はプラスモデスムを通したもの、好ましくは師部を通したものである。
【0073】
水及び無機栄養素は、植物体の根から木部を通して地上部に輸送される。師部は、例えばソース組織からシンク組織への光合成産物及び巨大分子の移動を支える。師部は、核のない生細胞である師要素が伴細胞に補助されたもので構成される。これらの師要素細胞が一体に積み重なって師管を形成し、それにより分子が植物体内を長距離にわたって速やかに流れることが可能になっている。タンパク質、ＲＮＡ及びリボ核タンパク質複合体を含めた巨大分子は、師部流に見出されている。興味深いことに、師部樹液にはＲＮアーゼ活性は検出不能である。実際、様々なＲＮＡ種は師部を通して離れた組織に輸送されるものと見られる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｐｌａｎｔｓ．２０１８；４（１１）：８６９－８７８）。
【0074】
コード用ＲＮＡ
コード用ＲＮＡは、第１の植物細胞に導入され得、可動性エレメントがコード用ＲＮＡを植物体の維管束組織内に導き入れる。コード用ＲＮＡは、維管束組織を通して別の第２の植物細胞に移動し、そこでコード用ＲＮＡからＣＲＩＳＰＲタンパク質が翻訳される。代わりに又は加えて、コード用ＲＮＡはプラスモデスムを通る細胞間輸送を用いて別の第２の植物細胞に移動する。
コード用ＲＮＡは、第１の植物細胞に導入され得、可動性エレメントがコード用ＲＮＡを植物体の維管束組織内に導き入れる。コード用ＲＮＡは、維管束組織を通して別の第２の植物細胞に移動し、そこでコード用ＲＮＡからＣＲＩＳＰＲタンパク質が翻訳される。代わりに又は加えて、コード用ＲＮＡはプラスモデスムを通る細胞間輸送を用いて別の第２の植物細胞に移動する。
【0075】
植物体の「維管束組織」という用語は当業者に周知であり、木部及び師部の両方を包含する。好ましい維管束組織は、師部である。このように、好ましくは、可動性エレメントは、ＲＮＡを植物体の師部に導き入れる。
【0076】
コード用ＲＮＡが第２の、即ち「標的」細胞に到達すると、ＣＲＩＳＰＲタンパク質が発現し、これはガイドＲＮＡと複合体を形成すると、第２の細胞の標的配列を修飾することができる。
【0077】
コード用ＲＮＡの配列は、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列と可動性エレメントの配列とを少なくとも含む。コード用ＲＮＡは、追加の配列を含み得る。非限定的な例として、ＣＲＩＳＰＲタンパク質コード配列には、５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲの少なくとも一方が隣接し得る。コード用ＲＮＡは、限定されないが、コード用ＲＮＡからのＣＲＩＳＰＲタンパク質の翻訳を増大させる又はそれに役立つ１つ以上の配列など、追加の配列を含み得る。コード用ＲＮＡは、翻訳の開始に役立つ及び／又は終結に役立つ配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲタンパク質コード配列は、その野生型３’－ＵＴＲ及び／又は野生型５’－ＵＴＲ配列を含み得る。加えて又は代わりに、ＣＲＩＳＰＲタンパク質コード配列は、その後ろに例えばＴリピート配列が続く。
【0078】
好ましくは、ＣＲＩＳＲタンパク質をコードする配列は、植物細胞での発現に最適化され、即ち植物細胞での発現にコドン最適化される。加えて又は代わりに、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列は、イントロン配列を含み得る。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列は、イントロン配列を欠いている。
【0079】
コード用ＲＮＡは、好ましくは、可動性エレメントとＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列とを少なくとも含む。コード用ＲＮＡは、単一のＣＲＩＳＰＲタンパク質コード配列及び／又は単一の可動性エレメントを含み得る。代わりに、コード用ＲＮＡは、複数のＣＲＩＳＰＲタンパク質コード配列及び／又は複数の可動性エレメントを含み得る。コード用ＲＮＡは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるＣＲＩＳＰＲタンパク質コード配列及び／又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える可動性エレメントを含み得る。好ましくは、コード用ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列に隣接する少なくとも２つの可動性エレメントを含む。
【0080】
コード用ＲＮＡは、２種類以上の異なるタンパク質のコード配列、限定されないが、２、３、４、５、６種又はそれを超える異なるタンパク質のコード配列などを含み得る。非限定的な例として、コード用ＲＮＡは、１つ以上のＣＲＩＳＰＲタンパク質コード配列と、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列など、１つ以上のレポータータンパク質コード配列とを含み得る。
【0081】
可動性エレメント
本発明において使用されるとおりの可動性エレメントは、好ましくは、本明細書に定義するとおりのコード用ＲＮＡ、編集用ＲＮＡ及びガイド用ＲＮＡの少なくとも１つに含まれるエレメントである。
本発明において使用されるとおりの可動性エレメントは、好ましくは、本明細書に定義するとおりのコード用ＲＮＡ、編集用ＲＮＡ及びガイド用ＲＮＡの少なくとも１つに含まれるエレメントである。
【0082】
編集用ＲＮＡとは、本明細書では、第１のエレメントが本明細書に定義するとおりのコード用ＲＮＡであり、且つ第２のエレメントがガイドＲＮＡである２つのエレメントを含むと理解されるべきである。任意選択により、第２のエレメントは、本明細書に定義するとおりのガイド用ＲＮＡである。編集用ＲＮＡは、合成又は組換えであり得る。編集用ＲＮＡは、コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡからなるか又はそれらを含む二本鎖又は一本鎖リボ核酸分子であり得る。任意選択により、編集用ＲＮＡは、ベクター又はコンストラクトに含まれる。
【0083】
ガイド用ＲＮＡとは、本明細書では、可動性エレメント及びガイドＲＮＡを含むか又はそれらからなると理解されるものとする。ガイド用ＲＮＡは、合成又は組換えであり得る。ガイド用ＲＮＡは、ガイドＲＮＡ及び可動性エレメントからなるか又はそれらを含む二本鎖又は一本鎖リボ核酸分子であり得る。任意選択により、ガイド用ＲＮＡは、ベクター、コンストラクト又は編集用ＲＮＡに含まれる。任意選択により、編集用ＲＮＡがコード用ＲＮＡとガイド用ＲＮＡとを含む。
【0084】
ＲＮＡ分子の細胞間移行を生じさせる任意の可動性エレメントが、本発明での使用に好適となる。可動性エレメントは、ＲＮＡ分子を第１の「産生」細胞から植物体の維管束組織に且つ維管束組織から第２の「標的」細胞に移行させることができる。可動性エレメントは、好ましくは、ＲＮＡ分子を植物体の木部及び／又は師部、好ましくは師部に移行させる。
【0085】
代わりに又は加えて、可動性エレメントは、プラスモデスムを通した細胞間輸送を用いてＲＮＡ分子を第２の「標的」植物細胞に移行させることができる。
【0086】
ＲＮＡ分子を分裂組織、根組織及び／又は葉などの特定の植物組織に輸送することのできる、当技術分野で公知の可動性ＲＮＡエレメントがある。好ましくは、可動性エレメントはＲＮＡ分子を分裂組織に移行させる。しかしながら、本発明は、ＲＮＡ分子を分裂組織に移行させる可動性エレメントに限定されない。非限定的な例として、可動性エレメントは、加えて又は代わりに、ＲＮＡ分子を植物体の配偶子、葉及び／又は花に移行させる。修飾を含む細胞は、続いて単離され、新規の植物体に再生され得る。
【0087】
好ましくは、可動性エレメントは、ＲＮＡ分子を分裂組織細胞に移行させる能力を有する。本発明における使用のための可動性エレメントは、このように好ましくはＲＮＡ分子を第１の「産生」細胞から第２の「標的」細胞に移行させ、第２の細胞は、好ましくは、分裂組織細胞である。興味深いことに、可動性ＲＮＡエレメントは植物輸送タンパク質によって認識されるため、そうした可動性エレメントと結び付いているＲＮＡは輸送時に分解から確実に保護されることが以前示されている（Ｈａｍ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ（２００９）；２１（１）：１９７－２１５）。
【0088】
分裂組織は、細胞分裂能力のある未分化細胞を含む組織である。こうした細胞は全能性であり、植物体に存在する他の全ての組織及び器官に発生することができる：根分裂組織細胞は根器官を形成し、茎分裂組織細胞は茎器官を形成する。可動性エレメントは、好ましくはＲＮＡ分子を分裂組織細胞に移行させ、分裂組織細胞は、好ましくは、頂端分裂組織細胞、介在分裂組織細胞及び花分裂組織細胞の少なくとも１つである。好ましくは、可動性エレメントはＲＮＡ分子を頂端分裂組織細胞に移行させる。頂端分裂組織細胞は、好ましくは茎頂分裂組織細胞又は根端分裂組織細胞である。好ましくは、可動性エレメントはＲＮＡ分子を茎頂分裂組織細胞（ＳＡＭ）に移行させる。茎頂分裂組織は、全ての地上にある器官、限定されないが、葉及び花などの供給源である。茎頂分裂組織は、植物体におけるほとんどの胚発生の部位でもある。分裂組織細胞、好ましくは茎頂分裂組織細胞は、卵細胞又は花粉へと発生し得る。本発明における使用のための可動性エレメントは、好ましくはＲＮＡ分子を分裂組織細胞、好ましくは茎頂分裂組織細胞に移行させ、茎頂分裂組織細胞は、好ましくは、卵細胞及び／又は花粉へと発生する。本明細書では、語句「可動性エレメントは、～を移行させる」は、語句「可動性エレメントは、移行を可能にする」と同義的に使用し得ることが理解される。
【0089】
好ましくは、本発明のコード用ＲＮＡは可動性エレメントを含み、可動性エレメントは、分裂組織細胞への細胞間移行を可能にする。好ましくは、本発明のコード用ＲＮＡは、茎頂分裂組織細胞への移行を可能にする可動性エレメントを含む。本発明のＲＮＡ分子が第２の細胞に移行する結果、第２の細胞に標的ゲノム修飾が生じる。非限定的な例では、標的ゲノム修飾を含む標的細胞は、卵細胞及び／又は花粉に発生する茎頂分裂組織細胞であり、このようにして卵細胞及び／又は花粉が標的ゲノム修飾を含み、それが次世代に受け継がれる。
【0090】
本発明における使用のための１つ又は複数の可動性エレメントは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列の５’側及び／又は３’側に位置し得る。加えて又は代わりに、可動性エレメントは、ガイドＲＮＡの５’側及び／又は３’側に位置し得る。
【0091】
当業者は、コード用ＲＮＡ並びに任意選択によりガイドＲＮＡ及び／又は編集用ＲＮＡの細胞間移行を可能にする可動性エレメントであればいずれでも、本発明での使用に好適となり得ることを理解する。可動性エレメントは、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及び遺伝子転写物の少なくとも１つ又はその機能性断片であり得る。かかる可動性エレメントの例は、例えば、Ｚｈａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ（２０１６）ｔＲＮＡ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．ｄｏｉ：１０．１１０５／ｔｐｃ．１５．０１０５６及びＥｌｌｉｓｏｎ ＥＥ ｅｔ ａｌ，（２０２０）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｍｏｂｉｌｅ ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ．Ｎａｔ Ｐｌａｎｔｓ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４７７－０２０－０６７０－ｙに開示されている。
【0092】
ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡ様構造体であり得る。好ましくは、ｔＲＮＡ又はｔＲＮＡ様構造体は、ｔＲＮＡＡｌａ、ｔＲＮＡＡｒｇ、ｔＲＮＡＡｓｎ、ｔＲＮＡＡｓｐ、ｔＲＮＡＣｙｓ、ｔＲＮＡＧｌｎ、ｔＲＮＡＧｌｕ、ｔＲＮＡＧｌｙ、ｔＲＮＡＨｉｓ、ｔＲＮＡＩｌｅ、ｔＲＮＡＬｅｕ、ｔＲＮＡＬｙｓ、ｔＲＮＡＭｅｔ、ｔＲＮＡｐｈｅ、ｔＲＮＡＰｒｏ、ｔＲＮＡＳｅｒ、ｔＲＮＡＴｈｒ、ｔＲＮＡＴｒｐ、ｔＲＮＡＴｙｒ及びｔＲＮＡＶａｌからなる群から選択される。代わりに、ｔＲＮＡ様構造体は、ｔＲＮＡＡｌａ、ｔＲＮＡＡｒｇ、ｔＲＮＡＡｓｎ、ｔＲＮＡＡｓｐ、ｔＲＮＡＣｙｓ、ｔＲＮＡＧｌｎ、ｔＲＮＡＧｌｕ、ｔＲＮＡＧｌｙ、ｔＲＮＡＨｉｓ、ｔＲＮＡＩｌｅ、ｔＲＮＡＬｅｕ、ｔＲＮＡＬｙｓ、ｔＲＮＡＭｅｔ、ｔＲＮＡｐｈｅ、ｔＲＮＡＰｒｏ、ｔＲＮＡＳｅｒ、ｔＲＮＡＴｈｒ、ｔＲＮＡＴｒｐ、ｔＲＮＡＴｙｒ及びｔＲＮＡＶａｌからなる群から選択することができ、ｔＲＮＡ様構造体は、Ｄステム－ループ、Ｄ及びＴステム－ループ並びにＤ及びＡステム－ループの少なくとも１つを欠いている。好ましくは、ｔＲＮＡ又はｔＲＮＡ様構造体は、ｔＲＮＡＡｒｇ、ｔＲＮＡＧｌｕ、ｔＲＮＡＧｌｙ、ｔＲＮＡＬｙｓ、ｔＲＮＡＭｅｔ及びｔＲＮＡＴｈｒからなる群から選択される。代わりに、ｔＲＮＡ様構造体は、ｔＲＮＡＡｒｇ、ｔＲＮＡＧｌｕ、ｔＲＮＡＧｌｙ、ｔＲＮＡＬｙｓ、ｔＲＮＡＭｅｔ及びｔＲＮＡＴｈｒからなる群から選択することができ、ｔＲＮＡ様構造体は、Ｄステム－ループ、Ｄ及びＴステム－ループ並びにＤ及びＡステム－ループの少なくとも１つを欠いている。
【0093】
ｔＲＮＡ又はｔＲＮＡ様構造体は、切断可能な可動性エレメントとして機能し得る。従ってある実施形態において、本明細書に定義するとおりのｔＲＮＡ又はｔＲＮＡ様構造体は、このように本明細書に定義するとおりの可動性エレメント並びに本明細書に定義するとおりの切断可能な配列として機能する。
【0094】
本発明における使用のためのｔＲＮＡ又はｔＲＮＡ様構造体は、可動性エレメント並びに切断可能な配列として機能する能力、即ち切断可能な可動性エレメントとして機能する能力を有する天然に存在するｔＲＮＡであり得る。任意の天然に存在する植物ｔＲＮＡが、切断可能な配列として機能する能力を有し得る。従って可動性エレメントとして機能する任意のｔＲＮＡ又はｔＲＮＡ様構造体が、加えて切断可能な配列として機能することができ、例えば切断可能な可動性エレメントとして機能する。当業者は、どうすればかかる植物ｔＲＮＡ又はｔＲＮＡ様構造体の配列を簡単に入手できるかを理解している。
【0095】
天然に存在するｔＲＮＡは、ＲＮアーゼＰ及びＲＮアーゼＺの少なくとも一方による切断の認識部位を含み得る。天然によるｔＲＮＡは、好ましくは３’末端及び／又は５’末端又はそのすぐ近くにリーダー配列ＡＡＣＡＡＡを含み得る。リーダー配列は、可動性エレメントのプロセシング又は「切断」を可能にし得る。好ましくは、ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡの５’末端又はそのすぐ近くにリーダー配列ＡＡＣＡＡＡを含む。好適なｔＲＮＡ切断可能エレメントについては、例えば、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ（“Ｂｏｏｓｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｅｄｉｔｉｎｇ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔＲＮＡ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ”，２０１５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；１１２（１１）：３５７０－５）（これは、参照により本明細書に援用される）に記載されている。これらの切断可能なｔＲＮＡ配列は、このように本明細書に定義するとおりの可動性エレメントとしても加えて機能し得る。好ましい切断可能なｔＲＮＡは、ｔＲＮＡＧｌｙである。
【0096】
代わりに又は加えて、本明細書に定義するとおりのｔＲＮＡ又はｔＲＮＡ様構造体は、切断可能な配列としても加えて機能するように修飾することができる。ｔＲＮＡ又はｔＲＮＡ様構造体は、ＲＮアーゼＰ及びＲＮアーゼＺの少なくとも一方による切断の認識部位を含むように修飾し得る。好ましくは、ｔＲＮＡ又はｔＲＮＡ様構造体は、好ましくは３’末端及び／又は５’末端又はそのすぐ近くにリーダー配列ＡＡＣＡＡＡを含むように修飾される。好ましくは、ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡの５’末端又はそのすぐ近くにリーダー配列ＡＡＣＡＡＡを含む。
【0097】
切断可能な可動性エレメントを含むコード用ＲＮＡ、ガイド用ＲＮＡ及び／又は編集用ＲＮＡは、好ましくは、初めに移行した後、第２の、即ち「標的」細胞で切断される。切断可能な可動性エレメントは、コード用ＲＮＡ内、前記コード用ＲＮＡの３’末端及び／又は５’末端又はそのすぐ近くに位置し得る。切断可能な可動性エレメントは、ガイド用ＲＮＡ内で、前記ガイド用ＲＮＡの３’末端及び／又は５’末端又はそのすぐ近くに位置し得る。任意選択により、切断可能な可動性エレメントは、本明細書に定義するとおりのガイド用ＲＮＡに含まれる２つ以上のガイドＲＮＡ間に位置し得る。切断可能な可動性エレメントは、編集用ＲＮＡ内で、編集用ＲＮＡの３’末端及び／又は５’末端又はそのすぐ近くに位置し得る。非限定的な例として、切断可能な可動性エレメントは、編集用ＲＮＡ内に含まれるガイドＲＮＡ、任意選択によりガイド用ＲＮＡと、コード用ＲＮＡとの間に位置し得る。加えて又は代わりに、切断可能な可動性エレメントは、本明細書に定義するとおりのガイド用ＲＮＡの１つ以上のガイドＲＮＡ間に位置し得る。
【0098】
可動性エレメントは、遺伝子転写物又はその機能性断片であり得る。好ましくは、遺伝子転写物は、ＦＴ、ＧＡＩ、ＳＰ２Ｇ、ＳＰ３Ｄ、ＳＰ５Ｇ、ＳＰ９Ｄ、ＣＥＮ様タンパク質１、ＦＴ及びＴＦのタンパク質ＭＯＴＨＥＲ １、開花遺伝子座Ｔ－ａ及び開花遺伝子座Ｔ－ｂ、ＰＰ１６－１、ＧＡＩＰ、スケアクロウ様（ＳＣＬ１４Ｐ）、シュートメリステムレス（ＳＴＭＰ）、エチレン応答因子（ＥＲＦＰ）及びＭｙｂ（ＭｙｂＰ）からなる群から選択される遺伝子の転写物である。遺伝子転写物は、天然に存在する遺伝子転写物、又は突然変異体、又はトランケート型遺伝子転写物であり得る。好ましくは、可動性エレメントは遺伝子転写物であり、遺伝子転写物は、ＦＴ、突然変異体ＦＴ及びトランケート型ＦＴの少なくとも１つである。遺伝子転写物は、天然に存在する遺伝子転写物であり得、例えば、転写物は、表１に列挙されるとおりの転写物又はそのホモログ若しくはオルソログである。
【0099】
遺伝子転写物又はその機能性断片は、ｔＲＮＡ様構造体（ＴＬＳ）モチーフ及びホスホチロシン結合（ＰＴＢ）モチーフの少なくとも１つを含み得る。
【0100】
遺伝子転写物又はその機能性断片は、ｔＲＮＡ様構造体（ＴＬＳ）モチーフを含み得る。こうした構造体は、当技術分野では、植物体におけるＲＮＡ分子の全身輸送を惹起することが公知である（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．２０１６；２８（６）：１２３７－４９。かかる可動性転写物の例が、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ｓｕｐｒａ，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｄａｔａｓｅｔ １－３（これらの転写物は、参照により本明細書に援用される）に列挙されている。可動性エレメントは、２シストロン性ｍＲＮＡ：ｔＲＮＡ遺伝子転写物であり得る。
【0101】
代わりに又は加えて、遺伝子転写物又はその機能性断片は、ホスホチロシン結合（ＰＴＢ）モチーフを含み得る。非限定的な例として、セイヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）栽培品種Ｂｉｇ Ｍａｘからの遺伝子：ＰＰ１６－１、ＧＡＩＰ、スケアクロウ様（ＳＣＬ１４Ｐ）、シュートメリステムレス（ＳＴＭＰ）、エチレン応答因子（ＥＲＦＰ）、Ｍｙｂ（ＭｙｂＰ）がＰＴＢ結合モチーフを含み、当技術分野において、可動性であり、カボチャ師部樹液に存在することが示された（Ｈａｍ ｅｔ ａｌ，ｓｕｐｒａ）。
【0102】
【表1】
【0103】
本発明における使用のための可動性エレメントは、配列番号１～１６のいずれか１つと少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性及び／又は配列番号１～１６及び２８のいずれか１つと少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。可動性エレメントは、配列番号１～１６のいずれか１つの機能性断片及び／又は配列番号１～１６及び２８のいずれか１つの機能性断片であり得る。
【0104】
ＣＲＩＳＰＲタンパク質
コード用ＲＮＡは、好ましくは、可動性エレメントに加えて、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列を含む。ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列は、本明細書に定義するとおりの可動性エレメントの３’側又は５’側に位置し得る。好ましくはＣＲＩＳＰＲタンパク質のコドン配列は、植物細胞での発現に最適化される。
コード用ＲＮＡは、好ましくは、可動性エレメントに加えて、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列を含む。ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列は、本明細書に定義するとおりの可動性エレメントの３’側又は５’側に位置し得る。好ましくはＣＲＩＳＰＲタンパク質のコドン配列は、植物細胞での発現に最適化される。
【0105】
ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼ及びＣＲＩＳＰＲデアミナーゼの少なくとも１つである。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。
【0106】
コード用ＲＮＡによってコードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質は、当技術分野で公知の任意の好適なＣＲＩＳＰＲタンパク質であり得る。好ましくは、コード用ＲＮＡによってコードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質は、発現したＣＲＩＳＰＲタンパク質を植物細胞の核に導く核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。ＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質のＣ末端及び／又はＮ末端に位置し得る。公知の核局在化シグナルであればいずれでも、本発明での使用に好適であり得る。好ましい核局在化シグナルとしては、限定されないが、ＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳ ＭＥＤＰＴＭＡＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１７）、単節型ＮＬＳ ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１８）及びヌクレオプラスミンのＮＬＳ ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１９）が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、２つ以上の核局在化シグナルを例えばＮ末端に１つ以上及びＣ末端に１つ以上含み得る。ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、２つ以上の異なる核局在化シグナルを含み得、例えばＣ末端のＮＬＳがＮ末端のＮＬＳと異なり得る。
【0107】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインと、ガイドＲＮＡと相互作用する少なくとも１つのドメインとを含む。ガイドＲＮＡと複合体化すると、ＣＲＩＳＰＲタンパク質複合体はガイドＲＮＡによって特異的な核酸配列に導かれる。ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用するとともに、標的特異的核酸配列とも相互作用し、そのため、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、標的核酸配列を含む部位にガイド配列を介して導かれると、標的部位に二本鎖切断を導入することが可能になる。
【0108】
ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである場合、ヌクレアーゼの両方のドメインに触媒活性があり、このタンパク質は、標的部位に二本鎖切断を導入することが可能である。ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＣＲＩＳＰＲニッカーゼである場合、ヌクレアーゼの一方のドメインに触媒活性があって、一方のドメインには触媒活性がなく、このタンパク質は標的部位に一本鎖切断を導入することが可能である。
【0109】
当業者は、ガイドＲＮＡがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲニッカーゼと組み合わせになったとき、核酸分子の所定の部位への一本鎖又は二本鎖切断の導入を達成するような方法でガイドＲＮＡを設計するにはどうすればよいかを十分に分かっている。
【0110】
ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、概して、６つの主要なタイプ（Ｉ～ＶＩ型）に分類することができ、これはコアエレメントの含有量及び配列に基づき更にサブタイプに細分される（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ，２０１１，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９：４６７－７７及びＷｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｃｅｌｌ １６４（１－２）：２９－４４）。一般に、ＣＲＩＳＰＲタンパク質複合体の２つの鍵となるエレメントは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質及びガイドＲＮＡである。
【0111】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質複合体は、単一のタンパク質（約１６０ＫＤａ）であるシグネチャＣａｓ９タンパク質であり、ｃｒＲＮＡを作成して二重鎖ＤＮＡを特異的に切断する能力を有する。Ｃａｓ９タンパク質は、典型的には、アミノ末端近傍にあるＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインと、タンパク質の中央近傍にあるＨＮＨ（又はＭｃｒＡ様）ヌクレアーゼドメインとの２つのヌクレアーゼドメインを含む。Ｃａｓ９タンパク質の各ヌクレアーゼドメインは、二重らせんの一方の差を切断することに特化している（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１）。Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／－ＣＡＳシステムのＣＲＩＳＰＲタンパク質の一例であり、ｃｒＲＮＡ及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる第２のＲＮＡと組み合わせになると、エンドヌクレアーゼを形成する。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは一緒になってガイドＲＮＡとして機能する。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体は、ｃｒＲＮＡによって定義されるゲノム中の位置にＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２０）は、ｃｒＲＮＡの不可欠な部分とｔｒａｃｒＲＮＡとを融合することによってもたらされた単鎖キメラガイドＲＮＡ（本明細書では「ｓｇＲＮＡ」又は「シングルガイドＲＮＡ」として定義される）が、Ｃａｓ９タンパク質との組み合わせで機能性のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体を形成可能であったことを実証した。
【0112】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質複合体、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）からのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート１又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１については記載されている。Ｃｐｆ１遺伝子はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に関連し、ｃｒＲＮＡがＤＮＡを標的化するのに使用するエンドヌクレアーゼをコードする。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９よりも小さいエンドヌクレアーゼであり、このことにより、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの限界の一部が克服され得る。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠くシングルＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり、これはＴリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用する。Ｃｐｆ１は、付着末端型のＤＮＡ二本鎖切断でＤＮＡを切断する（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９－７７１）。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質システムには、好ましくは、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１及びＣ２ｃ３の少なくとも１つが含まれる。
【0113】
本発明における使用のためのＣＲＩＳＰＲタンパク質は、本明細書において上記に定義したとおりの任意のＣＲＩＳＰＲタンパク質を含み得る。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、好ましくはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９（例えば、配列番号２１によってコードされる配列番号２０のタンパク質］又は配列番号２２のタンパク質）又はＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、好ましくはＶ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えばＣｐｆ１（例えば、配列番号２４によってコードされる配列番号２３のタンパク質）又はＭａｄ７（例えば、配列番号２５又は２６のタンパク質）又はこれらに由来する、好ましくはその長さ全体にわたって前記タンパク質と少なくとも約７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するタンパク質である。
【0114】
好ましくは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓ９ヌクレアーゼである。
【0115】
当業者は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列など、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列を含むコード用ＲＮＡをどのように見つけ出し、調製すればよいかを知っている。先行技術では、その設計及び使用に関して多くの報告が利用可能である。例えば、ガイドＲＮＡの設計及びＣＡＳタンパク質（元は化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から入手された）とのその組み合わせでの使用に関して、Ｈａｅｕｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌによるレビュー（Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．（２０１６）４３（５）：２３９－５０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｇｇ．２０１６．０４．００８．）を参照されたく、又はＬｅｅ ｅｔ ａｌ．によるレビュー（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１６）１４（２）４４８－４６２）を参照されたい。
【0116】
一般に、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、触媒活性のあるヌクレアーゼドメインを２つ含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインとＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインとを含み得る。ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインは一緒に働き、両方とも一本鎖を切断するものであり、ＤＮＡに二本鎖切断を作り出す（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６－８２１）。
【0117】
デッドＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインのいずれも切断活性を示さなくなるような修飾を含む。ＣＲＩＳＰＲニッカーゼは、ヌクレアーゼドメインの一方が突然変異していて、それがもはや機能しなくなっている（即ちヌクレアーゼ活性が存在しない）ようなＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの変異体であり得る。一例は、Ｄ１０Ａ又はＨ８４０Ａのいずれかの突然変異を有するＳｐＣａｓ９変異体である。好ましくは、コード用ＲＮＡによってコードされるヌクレアーゼは、デッドヌクレアーゼではない。
【0118】
好ましくは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ニッカーゼ又は（エンド）ヌクレアーゼのいずれかである。
【0119】
コード用ＲＮＡによってコードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＩＩ型若しくはＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質全体又はその変異体若しくは機能性断片を含み得るか又はそれからなり得る。好ましくは、かかる断片は、ガイドＲＮＡに結合するが、例えばヌクレアーゼ活性に必要な１つ以上の残基を欠き得る。
【0120】
好ましくは、本発明のコード用ＲＮＡによってコードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＳｐＣａｓ９；ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０１７０５３．１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９ＺＷ２）、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ａ１７８ＴＥＪ９）、コリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１５６８３．１、ＮＣ＿０１７３１７．１）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１６７８２．１、ＮＣ＿０１６７８６．１）；スピロプラズマ・シルフィディコーラ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０２１２８４．１）；プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１７８６１．１）；スピロプラズマ・タイワネンス（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０２１８４６．１）；ストレプトコッカス・イニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０２１３１４．１）；ベルリエラ・バルティカ（Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１８０１０．１）；サイクロフレクサス・トークイス（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１８７２１．１）；ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＮＣＢＩ参照：ＹＰ＿８２０８３２．１）；リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿４７２０７３．１）；カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）（ＮＣＢＩ参照：ＹＰ＿００２３４４９００．１）；又は髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＮＣＢＩ参照：ＹＰ＿００２３４２１００．１）といった細菌に由来し得る。これらからの、ＳｐＣａｓ９とのＨＮＨ若しくはＲｕｖＣドメイン不活性化ホモログを有するＣａｓ９変異体、例えばＳｐＣａｓ９＿Ｄ１０Ａ若しくはＳｐＣａｓ９＿Ｈ８４０Ａ又はＳｐＣａｓ９タンパク質のＤ１０若しくはＨ８４０に対応する位置に均等な置換を有することによってニッカーゼにされたＣａｓ９も包含される。
【0121】
コード用ＲＮＡによってコードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｃｐｆ１、例えばアシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ）からのＣｐｆ１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｕ２ＵＭＱ６であり得るか又はそれに由来し得る。変異体は、ＲｕｖＣ又はＮＵＣドメインがもはやヌクレアーゼ活性を有しないような、不活性化したＲｕｖＣ又はＮＵＣドメインを有するＣｐｆ１ニッカーゼであり得る。当業者は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介性突然変異誘発及び全遺伝子合成など、不活性化したＲｕｖＣ又はＮＵＣドメインなどの不活性化したヌクレアーゼを可能にする、当技術分野で利用可能な技法について十分に分かっている。ＮＵＣドメインが不活性化しているＣｐｆ１ニッカーゼの一例は、Ｃｐｆ１ Ｒ１２２６Ａである（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１６）２６：９０１－９１３、Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１６）１６５（４）：９４９－９６２を参照されたい）。この変異体では、ＮＵＣドメインにアルギニンからアラニンへの（Ｒ１２２６Ａ）変換があり、これがＮＵＣドメインを不活性化させる。
【0122】
コード用ＲＮＡによってコードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｃａｓ９のほぼ半分のサイズのヌクレアーゼであるＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓΦであり得るか又はそれに由来し得る。ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓΦは、例えば、Ｐａｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ（ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓΦ ｆｒｏｍ ｈｕｇｅ ｐｈａｇｅｓ ｉｓ ａ ｈｙｐｅｒｃｏｍｐａｃｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｏｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０２０）；３６９（６５０１）：３３３－３３７）に記載されるとおり、核酸の標的化及び切断に単一のｃｒＲＮＡを使用する。
【0123】
コード用ＲＮＡによってコードされる活性な、部分的に不活性な又はデッド型のＣＲＩＳＰＲタンパク質は、本明細書に詳述されるとおりの融合した機能性ドメインを、ガイドＲＮＡが決定するとおりのＤＮＡの特異的部位に誘導する働きをし得る。
【0124】
従って、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、機能性ドメインと融合され得る。任意選択により、かかる機能性ドメインは、後成的修飾のドメインであり、例えばヒストン修飾ドメインである。後成的修飾のドメインは、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、デアセチラーゼ、メチラーゼ、デアセチラーゼ、デオキシゲナーゼ、グリコシラーゼ及びアセチラーゼからなる群から選択することができる（Ｃａｎｏ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ Ｒｅｐ（２０１６）４：１７０－１７９）。メチルトランスフェラーゼは、Ｇ９ａ、Ｓｕｖ３９ｈ１、ＤＮＭＴ３、ＰＲＤＭ９及びＤｏｔ１Ｌからなる群から選択され得る。デメチラーゼは、ＬＳＤ１であり得る。デアセチラーゼは、ＳＩＲＴ６又はＳＩＲＴ３であり得る。メチラーゼは、ＫＹＰ、ＴｇＳＥＴ８及びＮＵＥの少なくとも１つであり得る。デアセチラーゼは、ＨＤＡＣ８、ＲＰＤ３、Ｓｉｒ２ａ及びＳｉｎ３ａからなる群から選択され得る。デオキシゲナーゼは、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２及びＴＥＴ３の少なくとも１つ、好ましくはＴＥＴ１ｃｄであり得る（Ｇａｌｌｅｇｏ－Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２０１８）；１１５（９）：Ｅ２１２５－Ｅ２１３４）。グリコシラーゼは、ＴＤＧであり得る。アセチラーゼは、ｐ３００であり得る。
【0125】
任意選択により、機能性ドメインは、デアミナーゼ又はその機能性断片であり、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼ、活性化誘導性シトシンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼ、アデニンデアミナーゼ及びＡＤＡＴファミリーデアミナーゼからなる群から選択される。代わりに又は加えて、デアミナーゼ又はその機能性断片は、ＡＤＡＲ１若しくはＡＤＡＲ２又はその変異体であり得る。
【0126】
シトシンデアミナーゼ酵素のアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーは、突然変異誘発を制御された有益な方法で開始させる働きをする１１個のタンパク質を包含する。好ましくは、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４及び活性化誘導性（シチジン）デアミナーゼからなる群から選択される。好ましくは、ＡＰＯＢＥＣファミリーのシトシンデアミナーゼは、活性化誘導性シトシン（又はシチジン）デアミナーゼ（ＡＩＤ）又はアポリポタンパク質Ｂ編集複合体３（ＡＰＯＢＥＣ３）である。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質に融合したデアミナーゼドメイン、ＡＰＯＢＥＣ１ファミリーデアミナーゼである。
【0127】
ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼと融合し得る別の例示的な好適な種類のデアミナーゼドメインは、アデニン又はアデノシンデアミナーゼ、例えばＡＤＡＴアデニンデアミナーゼファミリーである。更に、アデニンデアミナーゼは、好ましくはＧａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７（Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｎａｔｕｒｅ ５５１：４６４－４７１）に記載されるとおり、ＴａｄＡ又はその変異体であり得る。更に、ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼは、例えばＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２に由来するデアミナーゼドメインと融合し得る。本発明のデアミナーゼドメインは、全デアミナーゼタンパク質又は触媒活性を有するその断片を含み得るか又はそれからなり得る。好ましくは、デアミナーゼドメインは、デアミナーゼ活性を有する。任意選択により、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＵＤＧ阻害薬（ＵＧＩ）ドメインと更に融合される。
【0128】
本発明のコード用ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列を２つ以上含み得る。任意選択により、コード用ＲＮＡは、同じＣＲＩＳＰＲタンパク質を２倍以上の頻度でコードし得る。代わりに又は加えて、コード用ＲＮＡは、限定されないがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９とＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１など、２つ以上の異なるＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする。
【0129】
ガイド用ＲＮＡ
標的細胞では、コード用ＲＮＡが翻訳される結果、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現が生じる。このＣＲＩＳＰＲタンパク質がガイドＲＮＡと会合し、ガイドＲＮＡがＣＲＩＳＰＲタンパク質を植物細胞のゲノム中の特異的な位置に誘導することにより、標的ゲノム修飾が実現する。
標的細胞では、コード用ＲＮＡが翻訳される結果、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現が生じる。このＣＲＩＳＰＲタンパク質がガイドＲＮＡと会合し、ガイドＲＮＡがＣＲＩＳＰＲタンパク質を植物細胞のゲノム中の特異的な位置に誘導することにより、標的ゲノム修飾が実現する。
【0130】
ある態様において、従って、本発明は、本明細書に定義するとおりのコード用ＲＮＡと１つ以上のガイドＲＮＡとの組み合わせにも関する。ガイドＲＮＡは、ガイド用ＲＮＡに含まれ得る。ガイド用ＲＮＡは、ガイドＲＮＡと可動性エレメントとを含む。任意選択により、ガイド用ＲＮＡは、２つ以上の可動性エレメント及び／又は２つ以上のガイドＲＮＡを含む。従って、本発明は、本明細書に定義するとおりのコード用ＲＮＡと１つ以上のガイド用ＲＮＡとの組み合わせにも関する。
【0131】
ガイドＲＮＡは、プロトスペーサー配列とも呼ばれる二本鎖核酸分子中の決められた標的部位に複合体を導く。ガイドＲＮＡは、好ましくは、植物細胞のゲノム中で目的の配列の近くにあるか、そこにあるか又はその範囲内にあるプロトスペーサー配列にＣＲＩＳＰＲタンパク質複合体を標的化させるための配列を含む。
【0132】
ガイドＲＮＡは、シングルガイド（ｓｇ）ＲＮＡ分子、又は別個の分子としてのｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの組み合わせ（例えば、Ｃａｓ９について）、又はｃｒＲＮＡ分子のみ（例えば、Ｃｐｆ１及びＣａｓΦの場合）であることができる。好ましくは、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９について）又はｃｒＲＮＡのみ（例えば、Ｃｐｆ１及びＣａｓΦの場合）の少なくとも１つを含む。
【0133】
本発明の方法における使用のためのＣＲＩＳＰＲタンパク質複合体は、このようにガイドＲＮＡを含み得、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの組み合わせを含み、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｃａｓ９である。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、好ましくは、組み合わさってｓｇＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ）になる。代わりに、本発明の方法における使用のためのＣＲＩＳＰＲタンパク質複合体は、ガイドＲＮＡを含み得、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含み、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｃｐｆ１又はＣａｓΦである。
【0134】
本発明の方法における使用のためのガイドＲＮＡは、目的の配列、好ましくは本明細書に定義するとおりの目的の配列又はその近傍にハイブリダイズすることのできる配列を含み得る。ガイドＲＮＡは、目的の配列中の配列と完全に相補的なヌクレオチド配列を含み得、即ち、目的の配列は、プロトスペーサー配列を含む。代わりに又は加えて、本発明の方法における使用のためのガイドＲＮＡは、目的の配列の相補体又はその近傍にハイブリダイズすることのできる配列を含み得る。
【0135】
ｃｒＲＮＡのうち、プロトスペーサー配列に相補的な部分は、プロトスペーサー配列とハイブリダイズして複合体化したＣＲＩＳＰＲタンパク質の配列特異的結合を導くのに十分なプロトスペーサー配列との相補性を有するように設計される。プロトスペーサー配列は、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接していて、このＰＡＭ配列が、ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲタンパク質複合体のＣＲＩＳＰＲタンパク質と相互作用し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲタンパク質が化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である場合、ＰＡＭ配列は、好ましくは、５’－ＮＧＧ－３’（式中、Ｎは、Ｔ、Ｇ、Ａ又はＣのいずれか１つであり得る）である。
【0136】
当業者は、好ましくは任意の所望のプロトスペーサー配列と少なくとも部分的に相補的となって、それとハイブリダイズするように配列を操作することにより、ｃｒＲＮＡが任意の所望の配列を標的化するように操作する能力を有する。好ましくは、ｃｒＲＮＡ配列の部分とその対応するプロトスペーサー配列との間の相補性は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は１００％である。ｃｒＲＮＡ配列のうち、プロトスペーサー配列と相補的な部分は、少なくとも約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長又はそれを超え得る。一部の好ましい実施形態では、標的配列と相補的な配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０ヌクレオチド長未満である。好ましくは、標的配列と相補的な配列の長さは、少なくとも１７ヌクレオチドである。好ましくは相補的なｃｒＲＮＡ配列は、約１０～３０ヌクレオチド長、約１７～２５ヌクレオチド長又は約１５～２１ヌクレオチド長である。好ましくは、ｃｒＲＮＡのうち、プロトスペーサー配列と相補的な部分は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長、好ましくは２０又は２１ヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレオチドである。
【0137】
ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡとして好適な分子又は配列は、当技術分野で周知である（例えば、国際公開第２０１３１４２５７８号パンフレット及びＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７，８１６－８２１を参照されたい）。好ましくは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとは一体に連結されて、シングルガイド（ｓｇ）ＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、当技術分野で公知の任意の従来方法を用いて連結することができ、好ましくは共有結合的に連結することができる。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの共有結合性の連結については、例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（前掲）及び国際公開第１３／１７６７７２号パンフレット（これらは、参照により本明細書に援用される）に記載されている。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとは、例えばリンカーヌクレオチドを使用するか、又はｃｒＲＮＡの３’末端とｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端との直接的な共有結合性の連結を介して共有結合的に連結することができる。
【0138】
ガイドＲＮＡは、本明細書に定義するとおりの可動性エレメントに連結され得、これによりガイド用ＲＮＡが生じる。好ましくは、少なくともガイドＲＮＡが本明細書に定義するとおりの編集用ＲＮＡの一部でないとき、ガイドＲＮＡは、可動性エレメントに連結される。このように、ガイド用ＲＮＡは、可動性エレメントとガイドＲＮＡとの２つのエレメントを含む。可動性エレメントは、ガイドＲＮＡに直接連結され得る。代わりに、可動性エレメントとガイドＲＮＡとの間に１つ以上のヌクレオチド、例えば約１～５００、５～４００、１０～３００、１５～２００又は２０～１００ヌクレオチドが位置し得る。可動性エレメントは、ガイドＲＮＡの細胞間移行を可能にする。
【0139】
前記ガイド用ＲＮＡの可動性エレメントは、前記コード用ＲＮＡに存在する同じエレメント又は異なるエレメントであり得る。好ましくは、前記ガイド用ＲＮＡに存在する可動性エレメントと、前記コード用ＲＮＡに存在する可動性エレメントとは、両方のＲＮＡ分子を同じ標的組織に導く。好ましくは、前記ガイド用ＲＮＡ分子に存在する可動性エレメントと、前記コード用ＲＮＡ分子に存在する可動性エレメントとは、同じ可動性エレメント又は実質的に同じ可動性エレメントである。
【0140】
ガイド用ＲＮＡは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える可動性エレメントを含み得る。１つ又は複数の可動性エレメントは、ｓｇＲＮＡの上流及び／又は下流に位置し得る。加えて又は代わりに、１つ又は複数の可動性エレメントは、ｃｒＲＮＡの上流及び／又は下流に位置し得る。
【0141】
任意選択により、本明細書に定義するとおりのガイド用ＲＮＡは、２つ以上のｓｇＲＮＡ及び／又は２つ以上のｃｒＲＮＡを含み得、例えばそれにより２つ以上の異なる目的配列を標的化するか、又は同じ目的配列の２つ以上の位置を標的化する。
【0142】
ガイド用ＲＮＡは、２つ以上のガイドＲＮＡ配列を含み得る。ガイド用ＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるガイドＲＮＡ配列を含み得る。換言すれば、ガイド用ＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるシングルガイド（ｓｇ）ＲＮＡ及び／又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるｃｒＲＮＡを含み得る。
【0143】
ガイド用ＲＮＡ中の異なるガイドＲＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質を同じ遺伝子中の異なる位置に導き得る。代わりに又は加えて、ガイド用ＲＮＡ中の異なるガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質を植物細胞の異なる遺伝子に導き得る。
【0144】
ガイド用ＲＮＡ中の異なるガイドＲＮＡを分離する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５ヌクレオチド又はそれを超える配列があり得る。任意選択により、ガイド用ＲＮＡ中の異なるガイドＲＮＡは、切断可能なスペーサー配列、好ましくは本明細書に定義するとおりの切断可能なスペーサー配列によって分離される。ガイド用ＲＮＡは、複数の可動性エレメントを更に含み得、好ましくは、それらは、ガイド用ＲＮＡにおいて、スペーサー配列の切断後、切断されたＲＮＡ分子が可動性エレメントに加えてガイドＲＮＡをそれぞれ含むことになるような位置にある。
【0145】
編集用ＲＮＡ
ガイドＲＮＡ及びコード用ＲＮＡは、シングル編集用ＲＮＡに含まれ得、この編集用ＲＮＡは、少なくとも以下のエレメント：
ｉ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列；
ｉｉ）第１の可動性エレメント；及び
ｉｉｉ）ガイドＲＮＡ
を含む。
ガイドＲＮＡ及びコード用ＲＮＡは、シングル編集用ＲＮＡに含まれ得、この編集用ＲＮＡは、少なくとも以下のエレメント：
ｉ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列；
ｉｉ）第１の可動性エレメント；及び
ｉｉｉ）ガイドＲＮＡ
を含む。
【0146】
ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列及び第１の可動性エレメントは、本明細書に定義するとおりのコード用ＲＮＡの一部であり得る。代わりに又は加えて、ガイドＲＮＡは、本明細書に定義するとおりのガイド用ＲＮＡの一部であり得る。好ましくは、従って編集用ＲＮＡは、少なくとも以下の２つのエレメント：
ｉ）本明細書に定義されるコード用ＲＮＡ；及び
ｉｉ）ガイドＲＮＡ
を含む。
ｉ）本明細書に定義されるコード用ＲＮＡ；及び
ｉｉ）ガイドＲＮＡ
を含む。
【0147】
任意選択により、編集用ＲＮＡは、以下の２つのエレメント：
ｉ）本明細書に定義するコード用ＲＮＡ；及び
ｉｉ）本明細書に定義するとおりのガイド用ＲＮＡ
を含む。
ｉ）本明細書に定義するコード用ＲＮＡ；及び
ｉｉ）本明細書に定義するとおりのガイド用ＲＮＡ
を含む。
【0148】
ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列は、ガイドＲＮＡの５’側に位置し得る。代わりに、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列の５’側に位置し得る。ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列は、ガイド用ＲＮＡの５’側に位置し得る。代わりに、ガイド用ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列の５’側に位置し得る。本明細書に詳述されるとおり、ガイド用ＲＮＡは、任意選択により切断可能なスペーサー配列及び／又は可動性エレメントで分離された、複数のガイドＲＮＡを含み得る。ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列は、好ましくはそれらの複数のガイドＲＮＡの５’末端又は３’末端に位置する。
【0149】
編集用ＲＮＡは、好ましくは、少なくとも１つ以上の可動性エレメントを含む。これらの１つ以上の可動性エレメントは、編集用ＲＮＡの５’末端、編集用ＲＮＡの３’末端、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列とガイドＲＮＡとの間及び／又はガイド用ＲＮＡ内の複数のガイドＲＮＡ間に位置することができる。
【0150】
編集用ＲＮＡは、少なくとも２つの可動性エレメント、例えば第１及び第２の可動性エレメントを含み得る。好ましくは、第１及び第２の可動性エレメントの少なくとも一方が編集用ＲＮＡの５’末端又は３’末端に位置する。可動性エレメントの一方は、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列に直接隣接し、可動性エレメントの一方は、好ましくは、ガイドＲＮＡに直接隣接する。従って可動性エレメントの一方は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列の５’末端又は３’末端の近くにあって位置し、他方の可動性エレメントはガイドＲＮＡの５’末端又は３’末端の近くに位置する。
【0151】
編集用ＲＮＡは、１つ以上の切断可能なスペーサー配列を更に含み得る。好ましくは、切断可能なスペーサーは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列とガイドＲＮＡとの間に位置する。好ましくは、スペーサー配列は、コード用ＲＮＡとガイドＲＮＡとの間に位置する。
【0152】
編集用ＲＮＡが切断可能なスペーサー配列を含む場合、編集用ＲＮＡは、好ましくは、少なくとも２つの可動性エレメントも含む。好ましくは、これらの少なくとも２つの可動性エレメントは、ＲＮＡ分子を同じ標的組織に移行させる。好ましくは、少なくとも２つの可動性エレメントは、同じ可動性エレメントであるか又は実質的に同じ可動性エレメントである。
【0153】
好ましくは、切断可能なスペーサー配列は、編集用ＲＮＡにおいて、切断を受けると別個のＲＮＡ分子が生じるような位置にあり、分離されたＲＮＡ分子は、各々が可動性エレメントを含む。非限定的な例として、編集用ＲＮＡが切断を受けると、本明細書に定義するとおりのコード用ＲＮＡ分子と、本明細書に定義するとおりのガイド用ＲＮＡ分子とが生じ、ガイド用ＲＮＡ分子は、可動性エレメントを含む。
【0154】
編集用ＲＮＡが切断可能なスペーサー配列を含む場合、編集用ＲＮＡにおける種々のエレメントの向きは、以下のとおりであり得る：
ａ）第１の可動性エレメント；
ｂ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列；
ｃ）切断可能なスペーサー；
ｄ）第２の可動性エレメント；
ｅ）ガイドＲＮＡ。
ａ）第１の可動性エレメント；
ｂ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列；
ｃ）切断可能なスペーサー；
ｄ）第２の可動性エレメント；
ｅ）ガイドＲＮＡ。
【0155】
当業者は、編集用ＲＮＡにおいて、限定されないが、
－ ｂ）、ａ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）；
－ ａ）、ｂ）、ｃ）、ｅ）及びｄ）；
－ ｂ）ａ）、ｃ）、ｅ）及びｄ）；
－ ａ）、ｅ）、ｃ）、ｄ）、ｂ）；
－ ｅ）、ａ）、ｃ）、ｄ）及びｂ）；
－ ａ）、ｅ）、ｃ）、ｂ）及びｄ）；及び
－ ｅ）ａ）、ｃ）、ｂ）及びｄ）
など、別の再編成が等しく好適であることを容易に理解する。
－ ｂ）、ａ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）；
－ ａ）、ｂ）、ｃ）、ｅ）及びｄ）；
－ ｂ）ａ）、ｃ）、ｅ）及びｄ）；
－ ａ）、ｅ）、ｃ）、ｄ）、ｂ）；
－ ｅ）、ａ）、ｃ）、ｄ）及びｂ）；
－ ａ）、ｅ）、ｃ）、ｂ）及びｄ）；及び
－ ｅ）ａ）、ｃ）、ｂ）及びｄ）
など、別の再編成が等しく好適であることを容易に理解する。
【0156】
ガイドＲＮＡ及び可動性エレメントは、まとめて、本明細書に定義するとおりの「ガイド用ＲＮＡ」とアノテートすることもできる。当業者は、ガイド用ＲＮＡが、本明細書に詳述されるとおり１つ、２つ以上のガイドＲＮＡと更なる可動性エレメントと切断可能なスペーサー配列とを含み得ることを理解する。編集用ＲＮＡにおいて切断可能な配列は、このようにガイド用ＲＮＡの２つ以上のガイドＲＮＡ間に位置し得る。
【0157】
編集用ＲＮＡは、第１の（産生）細胞において且つ／又は第２の（標的）細胞において切断され得る。切断可能なスペーサー配列は、植物細胞におけるＲＮＡ分子の切断に好適な当業者に公知の任意の配列であり得る。かかる切断可能なスペーサー配列の非限定的な例としては、限定されないが、以下の配列：
ＵＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＵＡＣＧＵＧＵＵＧＡＧＣ（配列番号２７）
を有するスペーサーが挙げられる。
ＵＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＵＡＣＧＵＧＵＵＧＡＧＣ（配列番号２７）
を有するスペーサーが挙げられる。
【0158】
切断可能な配列は、配列番号２７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列であり得る。
【0159】
代わりに、切断可能なスペーサー配列は、任意の、好ましくは植物由来のｔＲＮＡ配列であり得る。切断可能なｔＲＮＡ配列は、天然に存在する配列であり得るか又は切断可能な配列を含むように修飾され得る。ｔＲＮＡ配列は、本明細書に定義するとおりのｔＲＮＡ様構造体であり得る。切断可能なｔＲＮＡ配列は、本明細書に定義するとおりの切断可能な可動性エレメントであり得る。切断可能なｔＲＮＡ配列は、ＲＮアーゼＰ及びＲＮアーゼＺの少なくとも一方による切断の認識部位を含み得る。切断可能なｔＲＮＡ配列は、好ましくは、３’及び／又は５’末端又はそのすぐ近くに、好ましくは５’末端又はそのすぐ近くにｔＲＮＡリーダー配列を有する。ｔＲＮＡリーダー配列は、好ましくは、配列ＡＡＣＡＡＡ又は前記配列と１若しくは２ヌクレオチドが異なる配列を含む。好適なｔＲＮＡ切断可能エレメントについては、例えば、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ（“Ｂｏｏｓｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｅｄｉｔｉｎｇ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔＲＮＡ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ”，２０１５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；１１２（１１）：３５７０－５）（これは、参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【0160】
１つ又は複数のＲＮＡの化学修飾
本発明のＲＮＡには、コード用ＲＮＡ、ガイド用ＲＮＡ及び編集用ＲＮＡの少なくとも１つが含まれる。
本発明のＲＮＡには、コード用ＲＮＡ、ガイド用ＲＮＡ及び編集用ＲＮＡの少なくとも１つが含まれる。
【0161】
本発明のＲＮＡの少なくとも１つは、修飾されていない又は天然に存在するヌクレオチドを含み得るか又はそれからなり得る。任意選択により、本発明の方法において使用される全てのＲＮＡが、修飾されていない又は天然に存在するヌクレオチドを含み得るか又はそれからなり得る。
【0162】
代わりに又は加えて、本発明のＲＮＡの少なくとも１つは、修飾された又は天然に存在しないヌクレオチドを含み得るか又はそれからなり得る。任意選択により、本発明の全てのＲＮＡが、修飾された又は天然に存在しないヌクレオチドを含み得るか又はそれからなり得る。かかる化学的に修飾されたヌクレオチドは、好ましくは、１つ又は複数のＲＮＡを分解から保護する。任意選択により、ＲＮＡの少なくとも１つ、即ちコード用ＲＮＡ、ガイド用ＲＮＡ及び編集用ＲＮＡの少なくとも１つは、リボヌクレオチドと非リボヌクレオチドとを含む。ＲＮＡの少なくとも１つは、１つ以上のリボヌクレオチドと１つ以上のデオキシリボヌクレオチドとを含み得る。
【0163】
任意選択により、ＲＮＡの少なくとも１つ、即ちコード用ＲＮＡ、ガイド用ＲＮＡ及び編集用ＲＮＡの少なくとも１つは、ホスホロチオエート結合のあるヌクレオチド、リボース環の２’炭素と４’炭素との間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、架橋型核酸（ＢＮＡ）、２’－Ｏ－メチル類似体、２’－デオキシ類似体、２’－フルオロ類似体又はこれらの組み合わせなど、１つ以上の天然に存在しないヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含む。修飾ヌクレオチドは、限定されないが、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、プソイドウリジン、イノシン及び７－メチルグアノシンからなる群から選択される修飾塩基を含み得る。
【0164】
ＲＮＡの少なくとも１つ、即ちコード用ＲＮＡ、ガイド用ＲＮＡ及び編集用ＲＮＡの少なくとも１つは、１つ以上の末端ヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ホスホノ酢酸塩）（ＭＳＰ）又はこれらの組み合わせの取込みにより化学的に修飾され得る。かかる化学的に修飾されたＲＮＡは、修飾されていないＲＮＡと比較すると、安定性の増加及び／又は活性の増加を含み得る（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）；９８５－９８９；Ｍａｒｕｇｇｉ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２０１９ Ａｐｒ １０；２７（４）：７５７－７７２）。本発明のある実施形態では、操作されたＲＮＡ構造体に、デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体が取り込まれ得る。
【0165】
植物体
任意の植物体が、本発明での使用に好適であり得る。本発明はこのように、いかなる具体的な植物体にも限定されることはない。好ましい植物体は、維管束系を有する植物、即ち維管束植物類である。
任意の植物体が、本発明での使用に好適であり得る。本発明はこのように、いかなる具体的な植物体にも限定されることはない。好ましい植物体は、維管束系を有する植物、即ち維管束植物類である。
【0166】
本発明における使用のための植物体は、単子葉類又は双子葉類であり得る。植物体は作物又は穀物植物体であり得る。本発明における使用のための穀物植物体の非限定的な例は、キャッサバ、コーン、モロコシ、ダイズ、コムギ、オートムギ又はコメである。作物植物体とは、人間によって栽培及び育種される植物種である。作物植物体は、食用目的（例えば、圃場作物）又は観賞目的（例えば、切り花、芝生用の草等の生産）で栽培され得る。本明細書に定義するとおりの作物植物体には、燃料用の油、プラスチックポリマー、医薬製品、コルクなど、非食用製品を回収するための植物体も含まれる。
【0167】
植物体は、樹木又は生産植物体、果実又は野菜（例えば、柑橘類樹木、例えばオレンジ、グレープフルーツ又はレモン樹木；モモ又はネクタリン樹木；リンゴ又はセイヨウナシ樹木；アーモンド又はクルミ又はピスタチオ樹木などの堅果類樹木などの樹木；ナス属植物体；アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物体；アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物体；ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物体；トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物体；ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）の植物体、好ましくはトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））でもあり得る。好ましくは、植物体は、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）の植物体である。本発明における使用のための好ましい植物体は、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物体である。
【0168】
別の好ましい実施形態において、細胞は、アスパラガス、オオムギ、クロイチゴ、ブルーベリー、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、チコリー、ココア、コーヒー、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、カボチャ、ラズベリー、コメ、ライムギ、モロコシ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、アマトウガラシ、タバコ、トマト、スイカ、コムギ及びズッキーニからなる群から選択される植物体から入手可能である。
【0169】
好ましくは、本発明における使用のための植物体は、ウイルス送達ベクターが到達できないか又は効率的に到達できない１つ以上の分裂組織を含む。好ましくは、本発明における使用のための植物体は、ウイルス送達ベクターが到達できないか又は効率的に到達できない１つ以上の茎頂分裂組織を含む。
【0170】
好ましくは、本発明における使用のための植物体は、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）ではなく、好ましくはベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＰＲＪＮＡ１７０５６６ではない。
【0171】
送達ベクター
本明細書に定義するとおりのコード用ＲＮＡ、ガイド用ＲＮＡ及び編集用ＲＮＡの少なくとも１つは、１つ又は複数のＲＮＡを植物体の維管束組織に直接注射することによって師部に導入し得る。この点で、コード用ＲＮＡ、ガイド用ＲＮＡ及び／又は編集用ＲＮＡは、例えばＲＮＡの安定性を増加させるため、化学修飾を含み得る。
本明細書に定義するとおりのコード用ＲＮＡ、ガイド用ＲＮＡ及び編集用ＲＮＡの少なくとも１つは、１つ又は複数のＲＮＡを植物体の維管束組織に直接注射することによって師部に導入し得る。この点で、コード用ＲＮＡ、ガイド用ＲＮＡ及び／又は編集用ＲＮＡは、例えばＲＮＡの安定性を増加させるため、化学修飾を含み得る。
【0172】
代わりに又は加えて、本明細書に定義するとおりのコード用ＲＮＡ、ガイド用ＲＮＡ及び編集用ＲＮＡの少なくとも１つは、１つ又は複数の前記ＲＮＡを発現するベクターを植物細胞に導入することによって植物細胞内に導入される。従ってある態様において、本発明は、本発明のＲＮＡを発現するベクターに関する。本発明はこのように、本明細書に定義するとおりのコード用ＲＮＡを発現するベクター、本明細書に定義するとおりのガイド用ＲＮＡを発現するベクター及び本明細書に定義するとおりの編集用ＲＮＡを発現するベクターの少なくとも１つに関する。本発明のベクターは、本発明のＲＮＡの組み合わせを発現し得る。例えば、ベクターは、コード用ＲＮＡ及びガイド用ＲＮＡを発現し得る。
【0173】
ベクターは、植物宿主細胞（第１の、産生細胞）で本発明のＲＮＡを発現させるために使用され得る。本発明のＲＮＡは、このように、ベクターに含まれる発現カセットから転写され得る。ベクター骨格は、例えば、発現カセットが組み込まれるか、又は好適な転写調節配列が既に存在する場合（例えば、（誘導性）プロモーター）、所望のヌクレオチド配列のみ（例えば、本発明のＲＮＡの１つ以上をコードする配列）がその転写調節配列の下流に組み込まれるプラスミドであり得る。
【0174】
好適なプロモーター、好ましくは、編集用ＲＮＡ、ガイドＲＮＡ及びコード用ＲＮＡの少なくとも１つの発現に好適なプロモーターとしては、限定されないが、ウイルス天然コートタンパク質プロモーターが挙げられる。本発明における使用のためのかかる天然コートタンパク質プロモーターは、例えば、タバコ茎えそウイルス（例えば、Ｄｅｎｇ Ｘ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｂａｃｃｏ ｒａｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ１ ｔｏ Ｓｅｒｖｅ ａｓ ａ ＶＩＧＳ Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｔｈａｔ ｔｈｅ ２９Ｋ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓ ａｎ ＲＮＡ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓ，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ－Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．ｄｏｉ：１０．１０９４／ＭＰＭＩ－１２－１２－０２８０－Ｒに記載されるとおり）、エンドウマメ早期褐変ウイルス（例えば、ＭａｃＦａｒｌａｎｅ ＳＡ ａｎｄ Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＡＨ（２０００）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｒｏｏｔｓ ｆｒｏｍ ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．ｄｏｉ：１０．１００６／ｖｉｒｏ．１９９９．００９８に記載されるとおり）、タバコ茎えそウイルス株ＴＣＭ、ＰＬＢ、ＰＳＧ及びＰＲＶのいずれか１つ（例えば、Ｇｏｕｌｄｅｎ ＭＧ ｅｔ ａｌ，１９９０，Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＰＥＢＶ ＲＮＡ２ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｏｂｒａｖｉｒａｌ ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／１８．１５．４５０７に記載されるとおり）に由来し得る。プロモーターは、ＰＥＢＶプロモーター、Ｕ６プロモーター又はｐｏｌ ＩＩＩプロモーターであり得る。
【0175】
本発明のベクターは、例えば、選択可能マーカー、多重クローニング部位など、分子クローニングにおけるその使用を促進する更なる遺伝子エレメントを含み得る。ベクター骨格は、例えば、当技術分野で公知のとおりのバイナリー又はスーパーバイナリーベクター（例えば、米国特許第５，５９１，６１６号明細書、米国特許出願公開第２００２１３８８７９号明細書及び国際公開第９５／０６７２２号パンフレットを参照されたい）、共組換えベクター又はＴ－ＤＮＡベクターであり得る。
【0176】
本発明に係るベクターは、特に本発明のＲＮＡの発現を植物細胞に導入するのに好適である。好ましい発現ベクターは、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体又はウイルスベクターである。
【0177】
好ましいネイキッドＤＮＡは、線状又は環状核酸分子、例えばプラスミドである。プラスミドとは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加的なＤＮＡセグメントを挿入することのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ＤＮＡ複合体は、ＤＮＡを細胞に送達するのに好適な任意の担体に結合されたＤＮＡ分子であり得る。好ましい担体は、リポプレックス、リポソーム、ポリマーソーム、ポリプレックス、ＰＥＧ、デンドリマー、無機ナノ粒子、ビロソーム及び細胞透過性ペプチドからなる群から選択される。
【0178】
ベクターは、好ましくはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、ＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスであり得る。ウイルスベクターは、トバモウイルス、トブラウイルス、ポテックスウイルスジェミニウイルス、アルファモウイルス、ククモウイルス、ポティウイルス、トンブスウイルス、ホルデイウイルス又はヌクレオラブドウイルスであるか又はそれをベースとし得る。
【0179】
トバモウイルスのウイルスベクターは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）及びサンヘンプモザイクウイルス（ＳＨＭＶ）の少なくとも１つであり得る。トブラウイルスのウイルスベクターは、タバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）であり得る。ポテックスウイルスのウイルスベクターは、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）及びパパイヤモザイクポテックスウイルス（ＰａｐＭＶ）の少なくとも１つであり得る。ジェミニウイルスのウイルスベクターは、コモウイルスササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）であり得る。好適なジェミニウイルスのウイルスベクターの更なる例としては、キャベツ巻葉ウイルス、トマトゴールデンモザイクウイルス、インゲン黄化萎縮ウイルス、アフリカキャッサバモザイクウイルス、コムギ萎縮ウイルス、オギ条斑マストレウイルス、タバコ黄化萎縮ウイルス、トマト黄化巻葉ウイルス、マメゴールデンモザイクウイルス、テンサイカーリートップウイルス、トウモロコシ条斑ウイルス及びトマトシュードカーリートップウイルスを挙げることができる。アルファモウイルスは、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）であり得る。ククモウイルスは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）であり得る。ポティウイルスは、プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）であり得る。トンブスウイルスは、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）であり得る。ホルデイウイルスは、ムギ斑葉モザイクウイルスであり得る。ヌクレオラブドウイルスは、ソンクスイエローネットウイルス（ＳＹＮＶ）であり得る（例えば、Ｈｅｆｆｅｒｏｎ Ｋ，Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｐｏｗｅｒｈｏｕｓｅ ｆｏｒ Ｇｌｏｂａｌ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．２０１７，５（３）：４４及びＬｉｃｏ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００８；２１６（２）：３６６－７７を参照されたい）。
【0180】
好ましくは、ウイルスベクターは、タバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、ソンクスイエローネットウイルス（ＳＹＮＶ）及びジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）からなる群から選択される。好ましくは、ウイルスベクターは、タバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）及びソンクスイエローネットウイルス（ＳＹＮＶ）の少なくとも１つである。
【0181】
本発明における使用のためのベクターは、好ましくは、機能性のコートタンパク質を発現しない。コートタンパク質をコードする配列は、機能性のコートタンパク質の発現を消失させるための突然変異を含み得る。この突然変異は、欠失、追加、置換又はこれらの組み合わせの少なくとも１つであり、好ましくは中途終止コドンを生じさせるものであり得る。好ましくは、コートタンパク質をコードする配列の少なくとも一部を欠失させる。好ましくは、ウイルスコートタンパク質をコードする配列の少なくとも２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％をウイルスゲノムから欠失させる。
【0182】
このように、本発明の１つ又は複数のＲＮＡを発現するウイルスベクターは、１つ以上の遺伝子の欠失を含み得、例えばそれによりウイルスのパッケージング容量が増加し、ゲノム安定性が向上し、且つ／又は遺伝子発現が増加し得る。好ましい実施形態において、ウイルスは、コートタンパク質（ＣＰ）をコードする遺伝子の少なくとも一部の突然変異、好ましくは欠失を含む。コートタンパク質をコードする配列の少なくとも一部の突然変異、好ましくは欠失を含む好ましいウイルスベクターは、トバモウイルスのウイルス又はトブラウイルスのウイルスである。好ましくはコートタンパク質の欠失を含むウイルスベクターは、トバモウイルス、好ましくはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）である。好ましいウイルスベクターは、例えば、Ｌｉｎｄｂｏ（ＴＲＢＯ：Ａ Ｈｉｇｈ－Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ－Ｂａｓｅｄ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００７；１４５（４）：１２３２－４０）に記載されるとおりのＴＭＶ ＲＮＡベースの過剰発現ベクター（ＴＲＢＯ）である。
【0183】
植物細胞を例えばＴＲＢＯ又は任意の他の好適なベクターに感染させると、好ましくは、第１の、産生植物細胞において本発明のＲＮＡの高度な発現が生じる。本発明のＲＮＡの高度な発現は、例えば、ウイルスコートタンパク質を欠失させること及び／又は強力なプロモーターの使用によって実現され得る。ウイルスベクターは、例えば、国際公開第２０１８／２２６９７２号パンフレット（これは、参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの自己複製性ＲＮＡであり得る。
【0184】
ベクター、好ましくはウイルスベクターは、最初にウイルスベクターを植物体の細胞に導入するため、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に含まれ得る。感染後、植物細胞中のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からウイルスベクターが発現する。ウイルスベクターは、本発明の１つ以上のＲＮＡを発現し得、加えて、周囲の植物細胞を複製し、且つ感染させ得る。ウイルスベクターは、例えば、コートタンパク質の欠失により修飾され得、それによりウイルスが全身に広がることが防止される。
【0185】
ある態様において、従って、本発明は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に関し、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、本明細書に定義するとおりのベクターを発現する。好ましくは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）である。
【0186】
更なる態様において、本発明は、標的ゲノム修飾を有する植物細胞を作製する方法に関する。好ましくは、植物細胞は分裂組織細胞である。植物細胞は、好ましくは、シュート、根又は葉細胞である。好ましくは本発明の方法における使用のための植物細胞は細胞壁を含む。好ましくは、植物細胞は植物細胞プロトプラストではない。この方法は、好ましくは、
ｉ）植物体を提供するステップ；及び
ｉｉ）植物体の細胞において、本明細書に定義するとおりのコード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡを発現させるステップ
を含む。任意選択により、ガイドＲＮＡはガイド用ＲＮＡに含まれる。任意選択により、コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡ又はガイド用ＲＮＡは編集用ＲＮＡに含まれる。発現した１つ又は複数のＲＮＡは、続いて第２の「標的」細胞に移行し得る。好ましくは、コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡは分裂組織細胞に移行する。好ましくは、コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡは茎頂分裂組織細胞に移行する。
ｉ）植物体を提供するステップ；及び
ｉｉ）植物体の細胞において、本明細書に定義するとおりのコード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡを発現させるステップ
を含む。任意選択により、ガイドＲＮＡはガイド用ＲＮＡに含まれる。任意選択により、コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡ又はガイド用ＲＮＡは編集用ＲＮＡに含まれる。発現した１つ又は複数のＲＮＡは、続いて第２の「標的」細胞に移行し得る。好ましくは、コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡは分裂組織細胞に移行する。好ましくは、コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡは茎頂分裂組織細胞に移行する。
【0187】
好ましくは、コード用ＲＮＡは編集用ＲＮＡ内に含まれる。好ましくは、コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、本明細書に定義するとおりの編集用ＲＮＡ内に含まれる。代わりに、コード用ＲＮＡ及びガイドＲＮＡは別個の実体である。この実施形態において、ガイドＲＮＡは、好ましくはガイド用ＲＮＡに含まれる。ある実施形態において、コード用ＲＮＡ及びガイド用ＲＮＡは別個の実体である。
【0188】
好ましくは第２の「標的」細胞において、コード用ＲＮＡからＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが発現し、ガイドＲＮＡが、標的細胞における標的ゲノム修飾を発生させようとするゲノム中の位置にまで、発現したＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを導く。好ましくは、標的細胞は分裂組織細胞である。従って好ましくは分裂組織細胞において、コード用ＲＮＡからＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが発現し、ガイドＲＮＡが、分裂組織細胞における標的ゲノム修飾を発生させようとするゲノム中の位置にまで、発現したＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを導く。
【0189】
好ましくは、コード用ＲＮＡ及びガイド用ＲＮＡは、植物細胞に本明細書に記載されるとおりのベクターをトランスフェクトすることにより、（第１の又は「標的」）細胞において別個の実体として又は編集用ＲＮＡ内で発現する。好ましくは、植物細胞には、本明細書に記載されるとおりの編集用ＲＮＡを発現するベクター及び／又は第１及び第２のベクターの組み合わせがトランスフェクトされ、第１のベクターは、本明細書に記載されるとおりのコード用ＲＮＡを発現し、第２のベクターは、本明細書に定義するとおりのガイド用ＲＮＡを発現する。
【0190】
ベクターは、本明細書に定義するとおりのベクターを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を細胞にトランスフェクトすることによって植物細胞に導入され得る。
【0191】
標的ゲノム修飾を含む細胞を続いて発生させると、ゲノム修飾を含む新規の植物体になり得る。本発明の方法は、このように、標的ゲノム修飾を含む細胞から、好ましくは分裂組織細胞から植物体を発生させるステップを含み得る。
【0192】
標的ゲノム修飾を含む植物細胞から植物体を発生させることは、当技術分野で公知の任意の従来方法を用いて行うことができる。非限定的な例として、標的ゲノム修飾を含む細胞を発生させると、花粉及び／又は卵細胞になり、続いてそれを自家受粉させるか、又は同じ又は異なる標的ゲノム修飾を有する細胞を含む第２の植物体を受粉させる。
【0193】
代わりに、標的ゲノム修飾を有する分裂組織細胞は、例えば、裁頭後に再生によって植物体に発生され得る。非限定的な例として、植物体の１つ以上の植物細胞、好ましくは子葉の１つ以上の細胞を本明細書に定義するとおりの方法を用いてトランスフェクトした後、続いて好ましくは茎頂分裂組織を裁頭し得る。続いて新しく形成された分裂組織細胞（即ち「第２の」又は「標的」細胞）は、標的ゲノム修飾を含み得、それらの新しく形成された分裂組織細胞を再生させると、標的ゲノム修飾を有する細胞を含む植物体になり得る。代わりに、植物体は、初めに裁頭した後、続いて第１の「産生株」細胞をトランスフェクトし、続いて新しく形成された分裂組織細胞（「第２の」細胞）をゲノム修飾し得る。新しく形成された分裂組織細胞を再生すると、標的ゲノム修飾を有する細胞を含む植物体になり得る。
【0194】
本発明は、本発明の方法によって入手可能な植物細胞又は植物体に更に関する。好ましくは、植物細胞は分裂組織細胞である。好ましくは、植物細胞及び／又は植物体は標的ゲノム修飾を含む。本発明の植物体は、好ましくは、少なくとも、自然界に存在する植物体と比べると、それが１つの目的遺伝子に少なくとも１つの突然変異を含む点が異なる。好ましくは、本発明の植物体は、本質的に生物学的過程によって入手されるのでないか、又はそれによってのみ入手されるのでない。
【0195】
植物体の全て又は実質的に全ての細胞が標的ゲノム修飾を含み得る。代わりに、植物体の一部のみが標的ゲノム修飾を含む。好ましくは、植物体の１つ以上の分裂組織細胞が標的修飾を含む。
【0196】
本発明は、上記に幾つもの例示的な実施形態を参照して記載された。幾つかの部分又は要素の変形形態及び代替的な実装形態が可能であり、添付の特許請求の範囲に定義されるとおりの保護範囲内に含まれる。
【0197】
（図面の説明）
（図１）ＦＴ配列を有する（Ａ）及びＦＴ配列を有しない（Ｂ）Ｃａｓ９－ＧＦＰ融合体を含むベクターの概略図である。
（図２）ＦＴシグナルあり又はなしのＣａｓ９－ＧＦＰコンストラクトを葉に浸潤させた植物体の茎頂におけるＣａｓ９及びＧＦＰの、ｑＰＣＲにより決定したときの平均発現（ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）チューブリンｍＲＮＡの発現に対する相対的な任意単位）である。
（図１）ＦＴ配列を有する（Ａ）及びＦＴ配列を有しない（Ｂ）Ｃａｓ９－ＧＦＰ融合体を含むベクターの概略図である。
（図２）ＦＴシグナルあり又はなしのＣａｓ９－ＧＦＰコンストラクトを葉に浸潤させた植物体の茎頂におけるＣａｓ９及びＧＦＰの、ｑＰＣＲにより決定したときの平均発現（ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）チューブリンｍＲＮＡの発現に対する相対的な任意単位）である。
【実施例】
【0198】
実施例１
本発明者らは、体細胞編集の誘導を目的として、植物体でＣＡＳ９及びガイドＲＮＡ配列を一過性に発現させるためのタバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）の使用について調べた。２つのベクター：ＴＲＶ１及びＴＲＶ２の一過性発現を通してＴＲＶ感染を生じさせる。配列はＴＲＶ２にクローニングすることができ、サブゲノムプロモーターを用いることにより、植物体においてそれらの配列の発現を生じさせる。この実験の目標は、２個（ｐＫＧ１１５８１）又は３個（ｐＫＧ１１５８０）のガイドＲＮＡ並びにＣＡＳ９を発現するＴＲＶ２プラスミドの感染を通した体細胞編集をトマト子葉に検出することであった。
本発明者らは、体細胞編集の誘導を目的として、植物体でＣＡＳ９及びガイドＲＮＡ配列を一過性に発現させるためのタバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）の使用について調べた。２つのベクター：ＴＲＶ１及びＴＲＶ２の一過性発現を通してＴＲＶ感染を生じさせる。配列はＴＲＶ２にクローニングすることができ、サブゲノムプロモーターを用いることにより、植物体においてそれらの配列の発現を生じさせる。この実験の目標は、２個（ｐＫＧ１１５８１）又は３個（ｐＫＧ１１５８０）のガイドＲＮＡ並びにＣＡＳ９を発現するＴＲＶ２プラスミドの感染を通した体細胞編集をトマト子葉に検出することであった。
【0199】
材料及び方法：
２つの配列の導入を通して２つのＴＲＶ２プラスミドを作製した。第１の配列には、２個（ｐＫＧ１１５８１）又は３個（ｐＫＧ１１５８０）のいずれかのガイドＲＮＡが含まれた。第２の配列はＮＬＳ：Ｓｐ－ＣＡＳ９の発現用であり、この配列をＴＲＶ２プラスミドにクローニングし、それによってＴＲＶコートタンパク質をコードする配列を置き換えた。ＴＲＶ１：ＴＲＶ２（ｐＫＧ１１５８０又はｐＫＧ１１５８１）を１：１比で含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）試料の混合物をトマト栽培品種Ｍｏｎｅｙｂｅｒｇ（Ｄｅ Ｒｕｉｔｅｒ Ｓｅｅｄｓ ＣＶ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の実生（発芽数日後）の両方の子葉に浸潤させた。浸潤から２日後、葉柄試料を採取してＣＡＳ９発現を検出した。浸潤から７日後、２つの別個の遺伝子を標的化するガイドＲＮＡによって作られる編集を検出するため、子葉試料を採取した。
２つの配列の導入を通して２つのＴＲＶ２プラスミドを作製した。第１の配列には、２個（ｐＫＧ１１５８１）又は３個（ｐＫＧ１１５８０）のいずれかのガイドＲＮＡが含まれた。第２の配列はＮＬＳ：Ｓｐ－ＣＡＳ９の発現用であり、この配列をＴＲＶ２プラスミドにクローニングし、それによってＴＲＶコートタンパク質をコードする配列を置き換えた。ＴＲＶ１：ＴＲＶ２（ｐＫＧ１１５８０又はｐＫＧ１１５８１）を１：１比で含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）試料の混合物をトマト栽培品種Ｍｏｎｅｙｂｅｒｇ（Ｄｅ Ｒｕｉｔｅｒ Ｓｅｅｄｓ ＣＶ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の実生（発芽数日後）の両方の子葉に浸潤させた。浸潤から２日後、葉柄試料を採取してＣＡＳ９発現を検出した。浸潤から７日後、２つの別個の遺伝子を標的化するガイドＲＮＡによって作られる編集を検出するため、子葉試料を採取した。
【0200】
結果：
浸潤から２日後、Ｑ－ＰＣＲでＣＡＳ９が検出された。浸潤から７日後、各実生につき１枚の子葉を回収し、凍結した。ＤＮＡを単離し、精製し、ＰＣＲを実施して標的配列の編集を検出した。対照試料には編集は見出されなかった。トランスフェクトした子葉には、様々な編集が検出された。従って、本発明者らは、ＣＡＳ９が発現し、翻訳され、且つ機能性であり、ＴＲＶウイルスにおけるカーゴとしてのＣＡＳ９及びガイドＲＮＡの配列で編集を作り出すことができると結論付ける。
浸潤から２日後、Ｑ－ＰＣＲでＣＡＳ９が検出された。浸潤から７日後、各実生につき１枚の子葉を回収し、凍結した。ＤＮＡを単離し、精製し、ＰＣＲを実施して標的配列の編集を検出した。対照試料には編集は見出されなかった。トランスフェクトした子葉には、様々な編集が検出された。従って、本発明者らは、ＣＡＳ９が発現し、翻訳され、且つ機能性であり、ＴＲＶウイルスにおけるカーゴとしてのＣＡＳ９及びガイドＲＮＡの配列で編集を作り出すことができると結論付ける。
【0201】
従って、ＴＲＶ２プラスミドは、可動性ＲＮＡの送達に使用可能であると考えることができる。こうした可動性ＲＮＡは、次に、分裂組織細胞にＣＡＳ９編集複合体を発生させることが可能であろう。
【0202】
実施例２
例示的可動性エレメント（ＦＴ）がＣＡＳ９－ＧＦＰ融合体ｍＲＮＡの可動性に及ぼす影響を試験した。ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）（Ｈｅｒｂａｌｉｓｔｉｃｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を１６時間明期（２２℃）、８時間暗期（２０℃）及び７０％相対湿度で５週間成長させた。５つの個別の植物体は、ＣＡＳ９－ＧＦＰ－ＮＬＳインサート（図１Ｂ）を含むｐＢＩＮｐｌｕｓベクターを保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を浸潤させた葉であった。別の５つの個別の植物体は、ＦＴ可動性配列を含むＣＡＳ９－ＧＦＰ－ＮＬＳ－ＦＴインサート（図１Ａ）を含むｐＢＩＮｐｌｕｓベクターを保有するＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を浸潤させた葉であった。浸潤から３日後、植物体毎に、いかなる認識できる葉もない２ｍｍ長さの茎頂試料を採取した。Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ機器（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＡＳ４５００）においてＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）ＲＳＣ植物ＲＮＡキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＡＳ１５００）でＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを測定し、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ、注文番号２０５３１１）で製造者の指示に従い各試料につき１μｇのＲＮＡをｃＤＮＡに合成した。全ての試料について、ＣＡＳ９及びＧＦＰ転写物及び参照としてのベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）チューブリンｍＲＮＡを検出するための定量的ＰＣＲ測定を行った（プライマーの一覧については、表２を参照されたい）。
例示的可動性エレメント（ＦＴ）がＣＡＳ９－ＧＦＰ融合体ｍＲＮＡの可動性に及ぼす影響を試験した。ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）（Ｈｅｒｂａｌｉｓｔｉｃｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を１６時間明期（２２℃）、８時間暗期（２０℃）及び７０％相対湿度で５週間成長させた。５つの個別の植物体は、ＣＡＳ９－ＧＦＰ－ＮＬＳインサート（図１Ｂ）を含むｐＢＩＮｐｌｕｓベクターを保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を浸潤させた葉であった。別の５つの個別の植物体は、ＦＴ可動性配列を含むＣＡＳ９－ＧＦＰ－ＮＬＳ－ＦＴインサート（図１Ａ）を含むｐＢＩＮｐｌｕｓベクターを保有するＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を浸潤させた葉であった。浸潤から３日後、植物体毎に、いかなる認識できる葉もない２ｍｍ長さの茎頂試料を採取した。Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ機器（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＡＳ４５００）においてＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）ＲＳＣ植物ＲＮＡキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＡＳ１５００）でＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを測定し、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ、注文番号２０５３１１）で製造者の指示に従い各試料につき１μｇのＲＮＡをｃＤＮＡに合成した。全ての試料について、ＣＡＳ９及びＧＦＰ転写物及び参照としてのベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）チューブリンｍＲＮＡを検出するための定量的ＰＣＲ測定を行った（プライマーの一覧については、表２を参照されたい）。
【0203】
ｍＲＮＡレベルは、ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）チューブリンｍＲＮＡの発現に対する相対的な任意単位で表した。平均ＣＡＳ９及びＧＦＰ転写物レベルは、ＦＴシグナルを欠くコンストラクトを浸潤させた植物体と比べて、ＦＴシグナルを含むＣＡＳ９－ＧＦＰコンストラクトを浸潤させた植物体のシュートにおいてより高かった（図２）。結論として、ＦＴ配列は、ＣＡＳ９－ＧＦＰ－ＮＬＳ－ＦＴインサートを有するｐＢＩＮｐｌｕｓベクターを浸潤させた葉である植物体の茎頂におけるＣＡＳ９転写物の量に正の影響を与える。
【0204】
トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物体が、前出の例にあるとおりのＣＡＳ９－ＧＦＰ－ＮＬＳ－ＦＴコンストラクトを有するｐＢＩＮｐｌｕｓベクターを保有する同じＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を浸潤させた葉であった関連する例において、完全長ＣＡＳ９－ＧＦＰ転写物のｃＤＮＡに対してｑＰＣＲを実施した。これは、表３に示すとおりのＣＡＳ９及びＧＦＰ特異的プライマーを使用することによって実現した。この結果、全転写物長さの７８％を網羅する３８８１ｂｐの断片が得られた。この転写物は、浸潤させた葉並びにＳＡＭの両方で検出されたことから、葉に適用したとき、インタクトな転写物がＳＡＭに到達することが確認された。
【0205】
【表2】
【0206】
【表3】
【図1】
【図2】
【配列表】
【国際調査報告】